NO329401B1

NO329401B1 - Fremgangsmate for modifisering av frigjoringshastigheten av en biologisk aktiv forbindelse innkapslet i et multivesikulaert liposom, multivesikulaert liposom samt anvendelse derav.

Info

Publication number: NO329401B1
Application number: NO19993635A
Authority: NO
Inventors: Randall C Willis
Original assignee: Pacira Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1997-01-31
Filing date: 1999-07-27
Publication date: 2010-10-11
Also published as: CA2277956C; JP3973646B2; CA2277956A1; CA2851502C; IL131012A0; EP0971699A4; CA2692302A1; US5891467A; NO993635D0; CA2692302C; EP2322143B1; CA2851502A1; EP0971699A1; JP2004262946A; PT971699E; NO20100437L; NZ336843A; AU731038B2; DK0971699T3; JP3940177B2

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for modifisering av frigjøringshastigheten av en biologisk aktiv forbindelse innkapslet i et multivesikulært liposom, multivesikulært liposom samt anvedelse derav. Denne oppfinnelse vedrører følgelig liposomformuleringer av forbindelser slik som medikamenter.

Når fosfolipider og mange andre amfipatiske lipider blir forsiktig dispergert i et vandig medium, vil de svelle, hydratisere og spontant danne multilamellære konsentriske dobbeltsjikt vesikler med sjikt av vandig medium som skiller lipid dobbeltsjiktene fra hverandre. Disse systemer blir vanligvis referert til som multilamellære liposomer eller multilamellære vesikler (MLV) og vil vanligvis ha en diameter på fra 0,2 til 5 um. Ultralydbehandling av MLV resulterer i dannelse av små unilamellære vesikler (SUV) avgrenset av et enkelt lipid dobbeltsjikt med en diameter vanligvis i området fra 20 til 100 nm, og inneholdende en vandig løsning. Multivesikulære liposomer (MVL) adskiller seg fra MLV og SUV på den måte de blir fremstilt på, i det vilkårlige, ikke-konsentriske arrangement av vannholdige kammere inne i liposomet, og i inklusjonen av nøytrale lipider nødvendige for å danne MVL.

Forskjellige typer av lipider som varierer i kjedelengde, metning og hoved-gruppe er blitt anvendt i liposom medikamentformuleringer i mange år, innbefattet de unilamellære, multilamellære og multivesikulære liposomer nevnt ovenfor. De nøytrale lipider som anvendes til fremstilling av multivesikulære liposomer har inntil i dag først og fremst vært begrenset til triolein og trikaprylin.

Et av hovedmålene innenfor dette området er å utvikle liposomformuleringer for kontrollert in vivo frigjøring av medikamenter og andre aktive midler av interesse. Visse medikamenter må frigjøres ganske hurtig etter innplassering av liposom-depoet, og andre krever en relativ lav frigjøringshastighet over et forlenget tidsrom. Tidligere er frigjøringshastigheten av en biologisk aktiv forbindelse fra en liposomformulering blitt modifisert ved utvelgelse av det amfipatiske lipid, det aksepterte membrandannende lipid, eller ved manipulering av fosfolipid/kolesterol molforholdet. Alternativt er slike forbindelser som en syre eller en osmolalitetsspacer blitt inkludert i den vandige innkapslingsløsning for å hjelpe til å modifisere frigjøringshastigheten av den innkapslede biologisk aktive forbindelse.

Kontrollen av frigjøringshastigheten fra liposomformuleringer er komplisert på grunn av at mange biologisk aktive agenser, slik som proteiner, krever lagring ved redusert temperatur, dvs ca 4°C, for å beholde full aktivitet. Uheldigvis vil noen liposomformuleringer som har utmerkede frigjøringshastigheter ved in vivo temperaturer, disintegrere ganske hurtig ved slike lagringstemperaturer.

Det eksisterer således et behov for flere og bedre fremgangsmåter for utvelgelse av liposomformuleringer som maksimerer kontrollen over frigjørings-hastigheten av den innkapslede aktive forbindelse, samtidig som de gir lagringsstabilitet over lange tidsrom ved lagringstemperaturer på ca 4°C, f.eks 2-10°C.

Generelt gjelder denne oppfinnelse en fremgangsmåte for modifisering av frigjøringshastigheten av en biologisk aktiv forbindelse, slik som et medikament, som er innkapslet i en multivesikulær liposomformulering ved å anvende i formuleringen en nøytral lipidkomponent med et utvalgt molforhold av et nøytralt lipid med langsom frigjøring til et nøytralt lipid med hurtig frigjøring, hvori andelen av det nøytrale lipid med hurtig frigjøring i molforholdet blir øket for å øke frigjøringshastigheten av den biologiske aktive forbindelse.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig en fremgangsmåte for modifisering av frigjøringshastigheten av en biologisk aktiv forbindelse innkapslet i et multivesikulært liposom som har en nøytral lipidkomponent, kjennetegnet ved at den omfatter: (1) dannelse av en emulsjon fra a) en lipidkomponent omfattende et organisk løsningmiddel, et amfipatisk lipid og en nøytral lipidkomponent omfattende et nøytralt lipid med langsom frigjøringshastighet og et nøytralt lipid med hurtig frigjørings-hastighet og b) en ikke-blandbar første vandig komponent hvori minst én biologisk aktiv forbindelse er inkorporert i enten lipidkomponenten eller den første vandige komponent eller begge;

hvor det nøytrale lipidet med langsom frigjøring er valgt fra gruppen bestående av triolein, tripalmitoelin, trimyristolein, trilaurin, trikaprin og blandinger derav, triglycerider med monoumettede fettsyreester-grupper inneholdende fra 14 til 18 karbonatomer i acylkjeden, triglycerider med mettede fettsyreester-grupper inneholdende fra 10 til 12 karbonatomer i acylkjeden og blandinger derav, kolesterolester, kolesterol oleat og estere av propylenglykol; og

hvor det nøytrale lipidet med hurtig frigjøring er valgt fra gruppen bestående av trikaprylin, trikaproin og blandinger derav, triglycerider med monoumettede fettsyreester-grupper inneholdende fra 6 til 8 karbonatomer i acylkjeden, triglycerider

med en mettet fettsyreester inneholdende fra 6 til 8 karbonatomer i acylkjeden, blandet kjede C6 til C8 triglycerider, propylenglykol diestere med åtte eller ti karbonacylgrupper, kolesterol oleat og kolesterol oktanat; (2) blanding av emulsjonen med en andre vandig komponent under dannelse av løsningsmiddelsfæruler, og (3) fjerning av det organiske løsningsmiddel fra løsningsmiddelsfærulene under dannelse av multivesikulære liposomer som innkapsler den biologisk aktive forbindelse;

hvori molforholdet av det nøytrale lipid med langsom frigjøring til det nøytrale lipid med hurtig frigjøring blir nedsatt for å øke frigjøringshastigheten av den biologisk aktive forbindelse.

Alternativt kan andelen av det nøytrale lipid med langsom frigjøring i molforholdet bli øket for å nedsette frigjøringshastigheten av den biologisk aktive forbindelse. Generelt vil molforholdet langsomt:hurtig nøytralt lipid være i området fra ca 1:1 til 0:1, f.eks 1:4 til 1:100 eller 1:4 til 1:27, og molforholdet av den nøytrale lipidkomponent til den totale lipidkomponent (alle lipidene i liposomet) være i området fra ca 0,01 til ca 0,21.

For å modifisere in vivo frigjøringshastigheten vil smeltepunktet av den nøytrale lipidkomponent fortrinnsvis være ved eller under den in vivo temperatur hvor formuleringen skal anvendes, så vel som ved eller under den temperatur hvor formuleringen skal lagres.

Nøytrale lipider med langsom frigjøring anvendelige i den nye fremgangsmåte ifølge denne oppfinnelse vil f.eks være triolein, tripalmitolein, trimyristolein, trilaurin og trikaprin, hvorav triolein er det mest foretrukne. Anvendelige nøytrale lipider med hurtig frigjøring vil inkludere f.eks trikaprylin og trikaproin og blandinger derav. Trikaproin og andre lignende lipider anvendes imidlertid vanligvis ikke som det eneste nøytrale lipid i en formulering av multivesikulære liposomer ment for anvendelse in vivo.

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre multivesikulært liposom, kjennetegnet ved at den omfatter: en nøytral lipidkomponent med et nøytralt lipid med langsom frigjøring og et nøytralt lipid med hurtig frigjøring;

et amfipatisk lipid; og

en biologisk aktiv forbindelse innkapslet i vann i liposomet,

hvor det nøytrale lipidet med hurtig frigjøring er valgt fra gruppen bestående av trikaprylin, trikaproin og blandinger derav, triglycerider med monoumettede fettsyreester-grupper inneholdende fra 6 til 8 karbonatomer i acylkjeden, triglycerider med en mettet fettsyreester inneholdende fra 6 til 8 karbonatomer i acylkjeden, blandet kjede C6 til C8 triglycerider, propylenglykol diestere med åtte eller ti karbonacylgrupper, kolesterol oleat og kolesterol oktanat.

Den nøytrale lipidkomponenten omfatter et molforhold av nøytralt lipid med langsom frigjøring til nøytralt lipid med hurtig frigjøring fra ca 1:1 til 1:100, f.eks fra ca 1:3 til 1:54, 1:4 til 1:27 eller fra ca 1:4 til 1:18.

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre anvendelse av liposom ifølge krav 17 for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for administrering av en biologisk aktiv forbindelse ved en ønsket frigjøringshastighet til et individ med behov for den biologisk aktive forbindelse innkapslet deri.

Dersom de ikke er definert på annen måte skal alle tekniske og vitenskapelige betegnelser som anvendes heri, ha den samme betydning som vanligvis forstås av ordinære fagfolk på det område som denne oppfinnelse tilhører

Praktiseringen av denne oppfinnelse innebærer den fordel at det kan utvelges en formulering av multivesikulære liposomer som har relativt hurtig frigjøring in vivo og som ikke bringer i fare ønske om langsom frigjøring ved lagringsbetingelser. Fremgangsmåten ifølge denne oppfinnelse tilveiebringer derfor et rasjonale for å oppnå en ønsket frigjøringshastighet gjennom valg av den nøytrale lipidkomponent som anvendes til fremstilling av MVL uten å bringe i fare ønsket om at formuleringen skal ha en langsom frigjøring ved lagringsbetingelsene. Videre vil kontrollen over frigjøringshastigheten under in vivo betingelser operere mer eller mindre uavhengig av blandingen av den innkapslede vandige fase eller kombinasjonen av de andre lipider i formuleringene.

Dette funn er spesielt for multivesikulære liposomer, siden andre typer av liposomer ikke inneholder nøytrale lipider i lipidkomponenten og/eller ikke inkorporerer de nøytrale lipider i nært sammenpakkede, ikke-konsentriske vesikler. Andre trekk og fordeler ifølge denne oppfinnelse vil være åpenbare ut i fra følgende detaljerte beskrivelse og ut i fra kravene.

Kort beskrivelse av tegningene

Fig. 1 er et diagram som sammenligner frigjøringshastighetene av rekombinant, human granulocytt kolonistimulerende faktor (rhu G-CSF) fra multivesikulære liposomer (MVL) formulert med forskjellige molforhold av triolein til trikaprylin (V, 100:0; A 50:50; O, 25:75; □, 10:90; 0, 0:100) som det nøytrale lipid når de inkuberes ved 37°C i 60% humant plasma i saltløsning. Fig. 2 er et diagram som viser resultatene av en farmakodynamisk studie som sammenligner varigheten av den rhu G-CSF-avhengige forhøyelse i perifert blod leukocyttantall hos gyldne syriske hamsere etter subkutan injeksjon av 100 ug/kg av rhu G-CSF i saltløsning (V), i en utelukkende triolein, 100:0, MVL-formulering (O), i en utelukkende triolein MVL-formulering solubilisert pre-injeksjon med Tween™ 20

(A) og i en utelukkende trikaprylin, 0:100, MVL-formulering (□).

Fig. 3 er et diagram som sammenligner frigjøringshastighetene av rhu GM-CSF fra MVL formulert med forskjellige molforhold av triolein til trikaprylin (A), 100:0; O, 25:75; □, 10:90) som det nøytrale lipid når det inkuberes ved 37°C i 60% humant plasma i saltløsning. Fig. 4 er et diagram som viser en farmakokinetisk studie av nivået av rhu GM-CSF i veneblod, plasmaprøver av mus etter subkutan injeksjon av 1 mg/kg rhu GM-CSF i utelukkende triolein, 100:0, MVL formuleringen (O) og i 25:75, triolein:trikaprylin MVL formuleringen (□). Rhu GM-CSF nivået i EDTA-plasma ble bestemt ved ELISA. LOQ er grensen for kvantifiseringen. Fig. 5 er et diagram som viser frigjøringshastighetene av rhu IGF-1 fra multivesikulære liposomer formulert med forskjellige triglyserider som den nøytrale lipid-komponent når de inkuberes ved 37°C i 60% humant plasma i saltløsning. De nøytrale lipider anvendt ved MVL-fremstillingen var: (□) triolein, (O) tripalmitolein, (A) trikaprylin, (V) trilaurin og (0) trikaprin. Fig. 6 er et diagram som viser resultatene av en farmakokinetisk studie av nivået av rhu IGF-1 i serum fra rotter etter subkutan injeksjon av 6,25 mg/kg rhu IGF-1 i tripalmitolein MVL-formuleringen (O) og i trikaprylin MVL-formuleringen (A). Rhu IGF-1 nivået i serum ble bestemt ved ELISA. Fig. 7 er et diagram som viser frigjøringen av rhu insulin og koinnkapslings-middel 14C sukrose fra MVL fremstilt med det nøytrale lipid, triolein eller trikaprylin når det inkuberes ved 37°C i saltløsninger inneholdende 60% humant plasma. (□) sukrose holdt tilbake av triolein MVL-formuleringen; (O) insulin holdt tilbake av triolein MVL-formuleringen; (A) sukrose holdt tilbake av trikaprylin-formuleringen og (V) insulin holdt tilbake av trikaprylin MVL-formuleringen. Fig. 8 er et diagram som sammenligner frigjøringshastighetene av morfin fra MVL formulert med forskjellige molforhold av triolein til trikaprylin som det nøytrale lipid når det inkuberes ved 37°C i 60% humant plasma i saltløsning. (□) 10:0, triolein:trikaprylin, 10 satser; (0, O) 1:4, triolein:trikaprylin, 2 satser; (A) 1:9, triolein:trikaprylin; (V) 0:10, triolein:trikaprylin. Fig. 9 viser resultater av en farmakokinetisk studie av morfin MVL-formuleringer fremstilt med forskjellige molforhold av triolein til trikaprylin og injisert i epiduralrommet hos Beagle-hunder. Morfinfrigjøring av MVL ble bestemt ved å måle nivået av morfin i den nærliggende, duramembranseparerte, cerebralspinalvæske. (0 5 mg morfin (sulfat) i saltløsning; (V 40 mg morfin i 10:0, triolein:trikaprylin MVL-formuleringen; (O) 20 mg morfin i 1:4, trioelin:trikaprylin MVL-formuleringen; (□) 20 mg morfin i 1:9, triolein:trikaprylin MVL-formuleringen; og (A) 20 mg morfin i 0:10, triolein:trikaprylin MVL-formuleringen. Fig. 10 er et diagram som i en Arrhenius STOPPED HERE transformasjon sammenfatter resultatene av en studie som bestemmer effekten av lagringstemperatur på frigjøringshastigheten av morfin fra 2 satser av 1:9, triolein:trikaprylin MVL-formuleringen. MVL ble lagret i normal saltløsning ved 4°C, 26°C, 37°C og 41 °C. Ordinaten er hastigheten av morfinfrigjøring fra MVL uttrykt i form av mengde frigjort pr dag som en prosent av total mengde morfin i MVL-suspensjonen; abscissen er 1/lagringstemperatur x 104 (°K)"<1>. Fig. 11 er et diagram som viser cytosin arabinosid (AraC) som beholdes i MVL inkubert i humant plasma ved 37°C. MVL-formuleringene anvendt som den nøytrale lipidkomponent (□) utelukkende triolein; (O) 1:4, triolein:trikaprylin; (V) 1:9, triolein:tri-

kaprylin; (x) 1:18 triolein:trikaprylin; (A) 1:27, triolein:trikaprylin; og (0) utelukkende trikaprylin.

Fig. 12 er et diagram som viser effekten av det nøytrale lipidforhold på fri-gjøring av cytosin arabinosid fra MVL inkubert i humant plasma ved 37°C når MVL ble formulert med fosfolipid hovedkomponenten, DOPC, erstattet med DSPC. Formuleringene var (□) DOPC og utelukkende triolein; (A) DOPC 1:9, triolein:-trikaprylin; (0) DOPC og utelukkende trikaprylin; (O) DSPC og utelukkende triolein;

(V) DSPC 1:9, triolein:trikaprylin; og (+) DSPC og utelukkende trikaprylin.

Fig. 13 er et diagram som viser effekten av det nøytrale lipidforhold på frigjøring av 14C-sukrose fra MVL inkubert i humant plasma ved 37°C når MVL var formulert med fosfolipid hovedkomponenten, DOPC, erstattet med DEPC. DOPC-formuleringene var (□) utelukkende triolein; (A) 1:9; triolein:trkaprylin; og (O) utelukkende trikaprylin. DSPC-formuleringene var (V) utelukkende triolein; (+) 1:9, triolein:trikaprylin; og (0) utelukkende trikaprylin. Fig. 14 er et diagram som viser effekten av å bruke trikaproin som den nøytrale lipidkomponent alene eller i kombinasjon med triolein på frigjøringen av 14C-sukrose fra MVL inkubert i humant plasma ved 37°C. Formuleringene var (O) utelukkende triolein; (A) 1:4 triolein:trikaproin; (V) 1:9 triolein:trikaproin; (0) 1:18 triolein:trikaproin; og (+) utelukkende trikaproin. Fig. 15 er et diagram som viser in vitro frigjøringen av et 15-mer oligonukleotid fra MVL fremstilt med triolein (□) eller trikaprylin (O) som det nøytrale lipid. MVL ble inkubert i rotte cerebral spinal fluid (CSF) ved 37°C. Fig. 16 er et diagram som viser frigjøringen under inkubering i humant plasma av 14C-sukrose fra MVL også inneholdende E. Coli plasmid PBR 322 og lysinhydro-klorid. Sukrosefrigjøringen ble brukt som en surrogatindikator for plasmidfri-gjøringen. MVL ble fremstilt med enten (O) triolein eller (A) trikaprylin som det nøytrale lipid. Fig. 17 er et diagram som viser frigjøringen av 14C-sukrose under inkubering i humant plasma av MVL fremstilt med tripalmitolein og trikaprylin som den nøytrale lipidkomponent. Det anvendte nøytrale lipidforhold i MVL-formuleringene var (O) utelukkende tripalmitolein; (+) 1:1 tripalmitolein:trikaprylin; (0) 1:2 tripalmitolein:trikaprylin; (V) 1:4 tripalmitolein:trikaprylin; (A) 1:9 tripalmitolein:trikaprylin; og (□) utelukkende trikaprylin. Fig. 18 er et diagram som viser mengden av tetrakain som er tilbake på det subkutane injeksjonssted hos mus injisert med tetrakain inneholdende MVL fremstilt med en nøytral lipidkomponent av enten (<*>) triolein; (X) 10:90, triolein:trikaprylin; (+) 5:95, triolein:trikaprylin; (0) 2:98, triolein:trikaprylin; (V) 1:99, triolein:trikaprylin; eller (O) trikaprylin. Fig. 19A-D er diagrammer som viser frigjøringen av MVL-innkapslede, biolgisk aktive forbindelser under lagring i normal saltløsning ved temperaturer på 2-8 (nominelt 4), 25, 32 og 37°C. MVL ble fremstilt med enten trikaprylin (fig. 19A og 19C); eller trikaprin (fig. 19B og 19D); som den nøytrale lipidkomponent og med enten cytosin arabinosid (fig. 19A og 19B); eller morfin, fig. 19C og 19D) som den biologisk aktive forbindelse. Fig. 20 er et Arrhenius diagram av fig. 19A og 19B som viser avhengigheten av cytosin arabinosid frigjøringshastighet på lagringstemperaturen av MVL fremstilt med (□) trikaprylin, smeltepunkt (smp) 8°C; eller (O) trikaprin, smp 31,5°C, som den nøytrale lipidkomponent. Abscissen er den inverse av lagringstemperaturen, °K.

Det tilveiebringes en fremgangsmåte for modifisering av frigjøringshastigheten av en biologisk aktiv forbindelse, slik som et medikament, innkapslet i en multivesikulær liposomformulering ved utvelgelse av det nøytrale lipid, eller kombinasjon av nøytrale lipider, som anvendes til fremstilling av de multivesikulære liposomer

(MVL).

Det er minst tre typer av liposomer. Betegnelsen "multivesikulære liposomer (MVL)" som anvendt gjennom hele denne beskrivelse og kravene, betyr kunstig fremstilte, 1-200 ^m partikler delvis bestående av lipidmembraner som omslutter mangfoldige ikke-konsentriske vandige kammere. Derimot skal "multilamellære liposomer eller vesikler" (MLV) ha mangfoldige "løkhud" konsentriske membraner, hvor i mellom er skall-lignende konsentriske vandige kammere. Multilamellære liposomer vil karakteristisk ha en gjennomsnitts diameter i mikrometerområdet, vanligvis fra 0,5 til 25 um. Betegnelsen "unilamellære liposomer eller vesikler (ULV)" som anvendt heri skal referere til liposomstrukturer med et enkelt vandig kammer, vanligvis med et gjennomsnittlig diameterområde fra ca 20 til 500 nm.

Multilamellære og unilamellære liposomer kan lages ved flere relativt enkle fremgangsmåter. Tidligere teknologi beskriver flere teknikker for fremstilling av ULV og MLV (f.eks US-patent 4.522.803 til Lenk; 4.310.506 til Baldeschweiler; 4.235.871 til Papahadjopoulos; 4.224.179 til Schneider, 4.078.052 til Papahadjopoulos; 4.394.372 til Taylor, 4.308.166 til Marchetti; 4.485.054 til Mezei; og 4.508.703 til Redziniak).

Derimot vil fremstilling av multivesikulære liposomer kreve flere prosesstrinn. I korthet vil den foretrukne fremgangsmåte for fremstilling av MVL være som følger: Det første trinn er fremstilling av en "vann-i-olje" emulsjon ved å fange inn en lipid-komponent sammensatt av minst ett amfipatisk lipid og minst ett nøytralt lipid i ett eller flere organiske løsningsmidler for lipidkomponenten, en ikke-blandbar første vandig komponent og en biologisk aktiv substans som skal innkapsles, og evt å tilsette, til den ene eller både lipidkomponenten og den første vandige komponent, en syre eller annen eksipient for modulering av frigjøringshastigheten av de innkapslede biologisk aktive substanser fra MVL. Blandingen emulgeres og blandes deretter med en andre ikke-blandbar vandig komponent under dannelse av en andre emulsjon. Den nødvendige turbulens for dannelse av den andre emulsjon tilveiebringes enten mekanisk, ved ultralydenergi, dyseatomisering og lignende, eller ved kombinasjoner derav, for å danne løsningsmiddelsfæruler oppslemmet i den andre vandige komponent. Løsningsmiddelsfærulene inneholder mangfoldige vandige smådråper med substansen som skal innkapsles oppløst i dem (se Kim et al., Biochem. Biophys. Acta, 728:339-348, 1983). For en uttømmende oversikt over forskjellige fremgangsmåter for ULV og MLV fremstilling, refereres det til Szoka et al. Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:465-508, 1980.

Betegnelsen "løsningsmiddelsfærul" som anvendt gjennom hele denne beskrivelsen og kravene betyr en mikroskopisk sfæroid smådråpe av organisk løsningsmiddel, innenfor hvilken er mangfoldige mindre smådråper av vandig løsning. Løsningsmiddelsfærulene blir oppslemmet og fullstendig neddykket i en andre vandig løsning.

Betegnelsen "nøytralt lipid" betyr en olje eller et fett som ikke har noen membrandannende evne i seg selv og mangler en hydrofil "hode" gruppe.

Betegnelsen "amfipatisk lipid" betyr et molekyl som har en hydrofil "hode" gruppe og hydrofob "hale" gruppe og har membrandannende evne.

Betegnelsen "zwitterionisk lipid" betyr et amfipatisk lipid med en netto ladning på null ved pH 7,4.

Betegnelsen "anionisk lipid" betyr et amfipatisk lipid med en netto negativ ladning ved pH 7,4.

Betegnelsen "kationisk lipid" betyr et amfipatisk lipid med en netto positiv ladning ved pH 7,4.

Som anvendt heri skal "lagringstiden" for en liposomformulering være relatert til frigjøringshastigheten av den innkapslede substans fra en liposomformulering i en lagringsløsning, f.eks normal saltløsning (0,9% natriumklorid), ved en lagringstemperatur, f.eks ved 4°C.

For fremstilling av multivesikulære liposomer kreves generelt at minst ett amfipatisk lipid og ett nøytralt lipid blir inkludert i lipidkomponenten. De amfipatiske lipider kan være zwitterioniske, anioniske eller kationiske lipider. Eksempler på zwitterioniske amfipatiske lipider er fosfatidylkoliner, fosfatidyletanolaminer, sfingo-myeliner etc. Eksempler på anioniske amfipatiske lipider er fosfatidylglyseroler, fosfatidylseriner, fosfatidylinsitoler, fosfatidiske syrer etc. Eksempler på kationiske amfipatiske lipider er diacyltrimetylammoniumpropan og etylfosfatidylkolin. Eksempler på nøytrale lipider er triolein og tripalmitolein, trimyristolein og trikaprylin.

I den nye fremgangsmåte blir frigjøringshastigheten av den biologisk aktive forbindelse modifisert ved å anvende til fremstilling av de multivesikulære liposomer en nøytral lipidkomponent som tilveiebringer den ønskede frigjøringshastighet i den type av fluid hvori MVL skal anvendes. For in vivo anvendelse må frigjøringshastigheten av MVL derfor bestemmes i plasma eller et plasmalignende medium, fordi frigjøringshastigheten av den biologisk aktive forbindelse fra MVL for visse nøytrale lipider kan variere betydelig avhengig av hvorvidt frigjøringen er inn i saltløsning eller plasma.

Som anvendt heri skal betegnelsen "nøytral lipidkomponent" bety det nøytrale lipid, eller blanding av nøytrale lipider, anvendt til fremstilling av de multivesikulære liposomer.

Som anvendt heri skal betegnelsen "plasmalignende medium" betyr en syntetisk løsning som i tillegg til normal saltløsning inkluderer minst noen av protein eller lipid bestanddelene av blodplasma eller komponenter av andre biologiske fluider, slik som cerebrospinal fluid (CSF) eller interstitiale fluider. For eksempel vil normal saltløsning inneholdende citrert humant plasma eller bovint serumalbumin (BSA) være et eksempel på et "plasmalignende medium" som betegnelsen anvendes heri.

Uttrykket " in vivo betingelser" betyr aktuell injeksjon eller plassering av MVL i en levende kropp og inkluderer såkalt "ex vivo" inkubering av MVL i plasma eller et plasmalignende medium ved legemstemperatur (dvs 37°C for mennesker).

Selv om den nøytrale lipidkomponent kan omfatte et enkelt nøytralt lipid, vil den nøytrale lipidkomponent vanligvis omfatte en blanding av et nøytralt lipid med langsom frigjøring og et nøytralt lipid med hurtig frigjøring i et molforhold i området fra ca 1:1 til 1:100, for eksempel fra ca 1:4 til 1:18, hvori frigjøringshastigheten av den biologisk aktive forbindelse avtar i forhold til økningen i forholdet av det nøytrale lipid med langsom frigjøring til det nøytrale lipid med hurtig frigjøring. For letthets skyld blir molforholdet av det nøytrale lipid med langsom frigjøring til det nøytrale lipid med hurtig frigjøring referert heri som "molforholdet langsomthurtig nøytralt lipid.

Det "nøytrale lipid med langsom frigjøring" som anvendes ved praktiseringen av denne oppfinnelse kan velges fra triglyserider med monoumettede fettsyreester-grupper inneholdende fra ca 14 til 18 karbonatomer i acylkjeden og som vanligvis har en molekylvekt fra ca 725 til 885, og de med mettede fettsyreestergrupper inne-holdende fra ca 10 til 12 karbonatomer i acylkjeden og som vanligvis har en molekylvekt fra ca 725 til 885; og blandinger derav. Kolesterolestere slik som kolesterololeat og estere av propylenglykol. De foretrukne nøytrale lipider med langsom frigjøring for anvendelse i fremgangsmåten ifølge denne oppfinnelse er triolein, tripalmitolein, trimyrisolein, trilaurin og trikaprin, hvorav triolein eller tripalmitolein er de mest foretrukne. Når det overveies in vivo anvendelse blir trilaurin (smp 46,5°C) og andre nøytrale lipider med et smeltepunkt over 37°C vanligvis anvendt ved praktiseringen av denne oppfinnelse bare i blanding med ett eller flere andre nøytrale lipider hvori blandingen har en smeltepunktstemperatur ved eller under og fortrinnsvis under 37°C. Fagfolk på dette området vil vite hvordan man bestemmer smeltepunktet av en blanding av lipider, slik som en blanding av triglyserider.

Det "nøytrale lipid med hurtig frigjøring" som anvendes ved praktiseringen av denne oppfinnelse kan velges fra triglyserider med monoumettede fettsyreester-grupper inneholdende fra ca 6 til 8 karbonatomer i acylkjeden og som har en molekylvekt fra ca 387 til 471, og blandinger derav. Det er imidlertid overraskende blitt oppdaget at anvendelse av en nøytral lipidkomponent i MVL inneholdende ett eller flere nøytrale lipider med en acylkjede på seks eller færre karbonatomer (spesielt anvendelse av trikaproin som det eneste nøytrale lipid) vil resultere i hurtig frigjøring av de innkapslede forbindelser ved kontakt med in vivo miljøet. Nøytrale lipider med en acylkjede på seks eller færre karbonatomer bør derfor anvendes bare i kombinasjon med ett eller flere nøytrale lipider som har en acylgruppe med lengre kjede. De foretrukne nøytrale lipider med hurtig frigjøring er trikaprylin, og blandinger av trikaprylin og trikaproin, eller triglyserider med C6 til Ce blandet kjede. Propylenglykol diestere med åtte eller ti karbonacylgrupper, kolesterololeat og kolesteroloktanoat kan også anvendes som nøytrale lipider.

En faktor av like stor viktighet for molforholdet av nøytrale lipider er utvelgelse av en nøytral lipidkomponent med et smeltepunkt under den temperatur hvor MVL skal lagres og/eller anvendes. Ettersom mange biologisk aktive forbindelser er svært ønskelige i terapeutiske anvendelser, krever lav lagringstemperatur for å forebygge hurtig ødeleggelse, bør den nøytrale lipidkomponent velges til å ha et smeltepunkt under den ønskede lagringstemperatur så vel som under den temperatur hvorved formuleringen vil bli anvendt in vivo.

Resultatene av lagringstemperaturtester ble bestemt ved å inspisere partiklene mikroskopisk og måle mengdene av frigjort innkapslet materiale ved kjemisk analyse. Som det kan sees i disse studier (fig. 20), vil MVL lagret ved en temperatur under smeltepunktet av den nøytrale lipidkomponent undergå en strukturell reorganisering av membranene, som i noen tilfeller blir ledsaget av hurtig frigjøring ("dumping") av det innkapslede innhold. Dette fenomen blir referert heri som "smeltepunkteffekten". Tiden til denne smeltepunkteffekt setter inn vil avhenge av den nøytrale lipidblanding og bestanddelene av den innkapslede vandige fase. Visse innkapslede forbindelser, slik som IL-2, synes å virke sammen med MVL på en slik måte at de vil forsinke med timer eller endog dager, starten av "frysing" ved temperaturer under smeltepunktet av det nøytrale lipid, kanskje ved å påvirke dannelse i MVL av en midlertidig, "metastabil" tilstand. Endog formuleringer med slik forsinket start vil imidlertid til slutt gjennomgå den morfologiske overgang karakteristisk for smeltepunkteffekten. Eksemplene 15 og 16 nedenfor illustrerer smeltepunkteffekten på frigjøringshastigheten av innkapslede biolgisk aktive forbindelser fra MVL lagret ved en temperatur under smeltepunktet (fig. 19D-D og 20). For å skille mellom de to tilstander av morfologisk overgang blir den forsinkede start-effekt referert til heri som "temperatureffekten".

Ved utvelgelse av den nøytrale lipidkomponent ifølge praktiseringen av denne oppfinnelse blir det vanligvis foretrukket at den nøytrale lipidkomponent har et smeltepunkt ved eller over den temperatur hvorved MVL skal lagres og/eller anvendes (for å forhindre hurtig tap av den innkapslede aktive forbindelse enten under lagring eller under in vivo anvendelse) pga smeltepunkteffekten. Smeltepunkttemperaturen av en nøytral lipidkomponent omfattende en blanding av nøytrale lipider, og også temperaturen av smeltepunkteffekten på MVL inneholdende den nøytrale lipidkomponent, kan lett bestemmes ved å fremstille blandingen av interesse og underkaste den stadig lavere temperaturer inntil blandingen blir observert å "fryse". En metode til å gjennomføre denne fremgangsmåte er beskrevet i J.B. Rossell, Advances in Lipid Research 5:353-408, 1967. Fagfolk på dette området vil være oppmerksom på andre tilnærminger som kan anvendes for å oppnå denne informasjon. Det bør imidlertid huskes på at smeltepunkteffekten på liposomformuleringen i sin helhet kan påvirkes av de andre lipider i MVL så vel som av bestanddelene i den første vandige løsning.

I tabell 1 nedenfor er oppført antallet karbonatomer i acylkjedene, molekyl-vekten og smeltepunkttemperaturene av representative nøytrale lipider som kan anvendes ved praktiseringen av denne oppfinnelse.

I en fremgangsåte ifølge denne oppfinnelse blir frigjøringshastigheten av den biologisk aktive forbindelse modifisert ved å anvende til fremstilling av de multivesikulære liposomer en nøytral lipidkomponent omfattende triolein eller tripalmitolein, eller en blanding derav, som det nøytrale lipid med langsom frigjøring, og velge et molforhold av det nøytrale lipid med langsom frigjøring til et nøytralt lipid med hurtig frigjøring i området fra ca 1:0 til 0:1. Frigjøringshastigheten av den aktive forbindelse vil øke med økningen i andelen av det nøytrale lipid med hurtig frigjøring i molforholdet. Vanligvis vil molforholdet av den nøytrale lipidkomponent til summen av alle lipidene i MVL-formuleringen være i området fra ca 0,01 til ca 0,21. Det foretrukne nøytrale lipid med hurtig frigjøring for anvendelse i slike formuleringer med triolein og/eller tripalmitolein er trikaprylin.

I tillegg til smeltepunkteffekten, som den nøytrale lipidkomponent delvis bidrar til, kan egenskapene til den vandige fase innkapslet i MVL, spesielt den kjemiske interaksjon av den aktive forbindelse med lipidene i MVL, også påvirke frigjørings-hastigheten av den biologisk aktive forbindelse. For å ta hensyn til denne ytterligere faktor under formuleringen skal denne oppfinnelse i en utførelse tilveiebringe en fremgangsmåte til å skreddersy den nøytrale lipidkomponent til den vandige fase av interesse.

I det første trinn av denne fremgangsmåte, for å bestemme hvordan den nøytrale lipidkomponent fungerer med hvilken som helst vandig fase (dvs en som inneholder en biologisk aktiv forbindelse av interesse), blir det laget en familie av MVL-formuleringer inneholdende den vandige fase av interesse, hvori hvert medlem av familien av formuleringer inneholder et forskjellig nøytralt lipid molforhold langsom:hurtig frigjøring av de utvalgte nøytrale lipider med langsom og hurtig fri-gjøring, slik at familien som et hele representerer en gradert progresjon av slike forhold, f.eks 1:1, 1:2, 1:4, 1:9, 1:18, 1:27, 1:100 osv.

In vivo frigjøringshastighetene tilsvarende de forskjellige molforhold av langsomthurtigt nøytralt lipid som kommer til uttrykk i de enkelte medlemmer av familien av MVL-formuleringer blir bestemt ved separat å inkubere hvert medlem av familien in vitro i plasma eller et plasmalignende medium ved in vivo temperatur, dvs 37°C for mennesker, i et tidsrom på timer eller endog dager.

Hvilken som helst av fremgangsmåtene illustrert i eksemplene eller andre som er kjent for fagfolk på dette området, kan anvendes til å bestemme ved progressive tidspunkter den kumulative mengde av én eller flere substanser innkapslet med den vandige fase som er blitt frigjort under inkuberingen. For lett å kunne utføre denne bestemmelse kan en radioaktiv substans, slik som <14>C-sukrose, bli inkludert i den vandige fase ved tiden for innkapsling. Det foretrekkes imidlertid å velge ut den biologisk aktive forbindelse av interesse som den substans hvis frigjøringshastighet blir overvåket og registrert. Det anbefales at frigjøringshastighetsinformasjonen oppnås på denne måte for hvert medlem av familien av formuleringer som blir testet.

Ut i fra frigjøringshastighetsinformasjonen som bestemmes ved denne fremgangsmåte kan det lages et diagram som viser en frigjøringskurve, eller "frigjørings-hastighetsprofil" for hvert medlem av familien av formuleringer for å vise dets individuelle in vivo frigjøringsegenskaper, hvor ordinaten i diagrammet angir den kumulative mengde av substansen av interesse som enten er blitt frigjort eller holdt tilbake, og abscissen angir progressive tidspunkter hvorved den frigjorte eller tilbake-holdte mengde blir målt. Det dannes således en tilsvarende familie av frigjøringshastighetskurver, hvor hver kurve av familien illustrerer frigjøringsegen-skapene av dens tilsvarende molforhold langsomthurtig nøytralt lipid når den anvendes med den vandige fase som blir testet.

Den dyktige fagmann kan deretter velge ut den formulering som har de mest ønskelige frigjøringsegenskaper for den spesielle terapeutiske anvendelse av interesse, for å oppnå den ønskede kontroll over frigjøring av substansen av interesse (dvs en biologisk aktiv forbindelse) slik at det kan avgis en terapeutisk effektiv mengde av den aktive forbindelse til individet som MVL-formuleringen skal administreres til. En dyktig fagmann kan således velge ut en MVL-formulering, spesielt en som har det mest fordelaktige molforhold langsom:hurtig nøytralt lipid, for å avgi en terapeutisk effektiv dose over det optimale tidsrom for å maksimere den terapeutiske effekt av medikamentet eller en annen biologisk aktiv forbindelse administrert under terapien.

Dersom det f.eks er ønskelig å frembringe en MVL-formulering som frigjør en spesiell aktiv forbindelse in vivo i løpet av et relativt kort tidsrom, dvs over flere timer etter administrering, vil det bli utvalgt den nøytrale lipidkomponent som gir en fri-gjøringskurve som indikerer slike avgivelsesegenskaper når den lagres in vitro i plasma eller en plasmalignende blanding, ved ca 37°C. Andelen av det nøytrale lipid med hurtig frigjøring i forholdet vil være forholdsvis stor under disse omstendigheter. Når det på den annen side er ønskelig å frembringe en MVL-formulering som frigjør sin aktive forbindelse in vivo over et relativt langt tidsrom, dvs i løpet av flere titalls timer etter administrering, endog opp til 200 timer post-administrering, vil det bli utvalgt den nøytrale lipidkomponent som gir en frigjøringskurve som indikerer slike avgivelsesegenskaper når den inkuberes under in vivo betingelser. I dette tilfellet vil andelen av det nøytrale lipid med langsom frigjøring i molforholdet være forholdsvis høy, og i noen tilfeller vil den nøytrale lipidkomponent overhodet ikke inneholde noe nøytralt lipid med hurtig frigjøring.

Lagringsstabiliteten av formuleringene bør også bestemmes ved inkubering av formuleringene i det overveide lagringsmedium ved hvilken som helst lagringstemperatur som kreves for å sikre integriteten av den biologisk aktive forbindelse i et passende tidsrom. Av praktiske grunner kan lagringsstabilitetstestene også gjennomføres i plasma eller et plasmalignende medium, men fagfolk på dette området vil være i stand til å substituere et annerledes egnet lagringsmedium, slik som normal saltløsning, for anvendelse med den biologisk aktive forbindelse av interesse, om så ønsket. Siden mange biologisk aktive forbindelser krever lagring ved temperaturer i området fra ca 2 til 8°C, blir det anbefalt at lagringsstabilitetstestene gjennomføres ved en temperatur i dette området.

Disse fremgangsmåter er illustrert i eksemplene i denne søknad. For eksempel, i formuleringer inneholdende blandinger av triolein og trikaprylin, når den nøytrale lipidkomponent ble holdt konstant og det ble gjort gradvis økning i forholdet av triolein til trikaprylin, ble det oppnådd MVL-formuleringer karakterisert ved stadig langsommere frigjøring, som illustrert i eksempel 14 (fig. 18). I eksempel 13 ble det fremstilt en gradert familie av formuleringer for innkapsling av sukrose og lysin-HCI og inneholdende blandinger av tripalmitolein og trikaprylin. Det ble dannet en gradert familie av formuleringer med tripalmitolein:trikaprylin molforhold på 0:1,1:0,1:9, 1:4, 1:2 og 1:1 ved å holde konstant mengden av tripalmitolein og gjøre gradvise økninger i mengden av trikaprylin. I dette eksempel ble det oppnådd stadig hurtigere frigjøring for hver gradvise økning i andelen av trikaprylin i den nøytrale lipidkomponent.

Det bør spesielt bemerkes at i motsetning til de fleste andre typer av liposomer kan nøyaktige in vivo egenskaper med hensyn til MVL-formuleringer ikke forutsies ut i fra in vitro frigjøringsstudier gjennomført i saltløsning. For eksempel var MVL formulert med trikaproin, et triglyserid med bare 6 karbonatomer i sine acyl-grupper, som det eneste nøytrale lipid, ikke stabile under in vivo betingelser (i løsninger inneholdende plasma eller serumalbumin ved 37°C), men var stabile under lagringsbetingelser (i saltløsning ved 2-8°C i opp til en uke). Formuleringer inneholdende trikaproin:triolein molforhold på 4:1, 9:1 og 18:1 var imidlertid stabile under in vivo betingelser i minst 4 dager, og ga et gradert sett av frigjørings-hastighetskurver (fig. 14).

Liposomblandinger omfattende en terapeutisk effektiv mengde av en biologisk aktiv forbindelse innkapslet i en multivesikulær liposomformulering hvori formuleringen omfatter en nøytral lipidkomponent med et molforhold av nøytralt lipid med langsom frigjøring til nøytralt lipid med hurtig frigjøring i et område av molforhold fra ca 0:1 til 1:0, f.eks 1:1 til 1:100 og generelt fra ca 4:1 til 27:1 kan også dannes. Molforholdet av den nøytrale lipidkomponent til summen av lipidene i MVL-formuleringen vil vanligvis være i området fra ca 0,01 til ca 0,21.

De foretrukne amfipatiske lipider for anvendelse til fremstilling av de multivesikulære liposomer er fosfolipider med likt antall karbonatomer i karbonkjeden, fordi slike fosfolipider er naturlige lipider som finnes i kroppen og som ikke frem-bringer toksiske metabolitter. En representativ liste av amfipatiske lipider foretrukket for anvendelse ved praktiseringen av denne oppfinnelse er gitt i det følgende. Også inkludert er forkortelser som kan anvendes for å referere til spesielle fosfolipider i denne søknad.

DOPC eller DC18:1PC = 1,2-dioleoyl-sn-glysero-3-fosfokolin

DLPC eller DC12:0PC = 1,2 dilauroyl-sn-glysero-3-fosfokolin

DMPC eller DC14:0PC = 1,2-dimyristoyl-sn-glysero-3-fosfokolin

DPPC eller DC16:0PC = 1,2-dipalmitoyl-sn-glysero-3-fosfokolin

DSPC eller DC18:0PC = 1,2-distearoyl-sn-glysero-3-fosfokolin

DAPC eller DC20:0PC = 1,2-diarakidoyl-sn-glysero-3-fosfokolin

DBPC eller DC22=0PC = 1,2-dibehenoyl-sn-glysero-3-fosfokolin

DC16:1PC = 1,2-dipalmitoleoyl-sn-glysero-3-fosfokolin

DC20:1PC = 1,2-dieikosenoyl-sn-glysero-3-fosfokolin

DEPC eller DC22:1PC = 1,2-dierukoyl-sn-glysero-3-fosfokolin

DPPG = 1,2-dipalmitoyl-sn-glysero-3-fosfoglyserol

DOPG = 1,2-dioleoyl-sn-glysero-3-fosfoglyserol.

Betegnelsen "biologisk aktiv forbindelse" som anvendt heri betyr en kjemisk forbindelse som er kjent i teknologien for å ha anvendelse til modulering av biologiske prosesser som f.eks å oppnå en ønsket effekt ved modulering eller behandling av en uønsket eksisterende tilstand i et levende individ, slik som en medisinsk, jordbruksmessig eller kosmetisk effekt. Biologisk aktive forbindelser blir således vanligvis valgt fra de brede kategorier av medikamenter, farmasøytika, radioisotoper, jordbruksprodukter og kosmetika.

Terapeutisk biologisk aktive forbindelser, eller medikamenter for innkapsling i fremgangsmåtene og blandingene ifølge denne oppfinnelse skal inkludere anti-neoplastiske midler, anti-infeksjonsmidler, hormoner, anti-depressiva, anti-virusmidler, anti-nociseptive midler, anxiolytika og biologiske midler.

Representative eksempler på anti-neoplastiske midler anvendelige i blandingene og fremgangsmåtene ifølge den foreliggende oppfinnelse skal inkludere meto-treksat, taksol, tumor nekrosefaktor, klorambucil, interleukiner, etoposid, cytarabin, fluoruracil og vinblastin.

Representative eksempler på anti-infeksjonsmidler anvendelige i blandingene og fremgangsmåtene ifølge den foreliggende oppfinnelse skal inkludere pentamidin, metroidazol, penicillin, cefaleksin, tetracyklin og kloramfenikol.

Representative eksempler på anti-virusmidler anvendelige i blandingene og fremgangsmåtene ifølge den foreliggende oppfinnelse skal inkludere dideoksycytidin, zidovudin, acyklovir, interferoner, dideoksyinosin og ganciklovir.

Representative eksempler på anxiolytika og beroligende anvendelige i blandingene og fremgangsmåtene ifølge den foreliggende oppfinnelse skal inkludere benzodiazepiner slik som diazepam, barbiturater slik som fenobarbital og andre forbindelser slik som buspiron og haloperidol.

Representative eksempler på hormoner anvendelige i blandingene og fremgangsmåtene ifølge den foreliggende oppfinnelse skal inkludere østradiol, prednison, insulin, veksthormon, erytropoietin og prostaglandiner.

Representative eksempler på anti-depressiva anvendelige i blandingene og fremgangsmåtene ifølge den foreliggende oppfinnelse skal inkludere fluoxetin, trazodon, imipramin og doxepin.

Representative eksempler på anti-nociseptiva anvendelige i blandingene og fremgangsmåtene ifølge den foreliggende oppfinnelse skal inkludere hydromorfin, oksykodon, fentanyl, morfin og meperidin.

Betegnelsen "biologiske midler" omfatter nukleinsyrer (DNA og RNA), proteiner og peptider, og inkluderer forbindelser så som cytokiner, hormoner (hypofyse og hypofyseale hormoner), vekstfaktorer, vaksiner osv. Av spesiell interesse er interleukin-2, insulinlignende vekstfaktor-1, interferoner, insulin, heparin, leuprolid, granulocyttkoloni stimulerende faktor (GCSF), granulocytt-makrofag koloni stimulerende faktor (GM-CSF), tumor nekrosefaktor, inhibin, tumor vekstfaktor alfa og beta, Muller inhibitorisk substans, kalsitonin og hepatitt-B vaksine.

Den biologisk aktive forbindelse kan anvendes i den foreliggende oppfinnelse i forskjellige former, slik som molekylkomplekser eller biologisk akseptable salter. Representative eksempler på slike salter er suksinat, hydroklorid, hydrobromid, sulfat, fosfat, nitrat, borat, acetat, maleat, tartrat, salicylat, metallsalter (f.eks alkali eller jordalkali), ammonium- eller aminsalter (f.eks kvarternære ammonium) og lignende. Videre kan det også anvendes derivater av de aktive substanser slik som estere, amider og etere som har ønskelige retensjons- og frigjøringsegenskaper, mens som lett blir hydrolysert in vivo ved fysiologisk pH eller enzymer.

Som anvendt heri skal betegnelsen "terapeutisk effektiv mengde" bety den mengde av en biologisk aktiv forbindelse som er nødvendig for å indusere en ønsket farmakologisk effekt. Denne mengde kan variere betydelig i overensstemmelse med effektiviteten av en spesiell aktiv substans, alderen, vekten og responsen hos den enkelte vert så vel som karakteren og alvorlighetsgraden av vertens symptomer. Følgelig er det ingen øvre eller nedre kristisk begrensning på mengden av den aktive substans. Den terapeutiske effektive mengde som skal anvendes i den foreliggende oppfinnelse kan lett bestemmes av fagfolk på dette området.

Det blir antatt at den nøytrale lipidkomponent i MVL, som er unik for MVL blant liposomformuleringer, vil virke sammen med in vivo miljøet på en slik måte at den vil påvirke den hastighet hvormed forbindelsene innkapslet inne i MVL blir frigjort. MVL med en nøytral lipidkomponent sammensatt av triglyserider med mindre enn 6 karbonatomer i acylgruppen vil spesielt virke sammen med in vivo miljøet slik at de blir fullstendig destabilisert praktisk ved kontakt med blodplasma. Av denne grunn vil saltløsninger ikke nøyaktig etterligne effekten av in vivo miljøet på medikament frigjøringsegenskapene av MVL, men det er blitt oppdaget at in vitro frigjøringsstudier gjennomført ved anvendelse av blodplasma eller et plasmalignende medium kan anvendes til nøyaktig å bestemme in vivo frigjøringsegenskapene av en MVL formulering.

Følgende eksempler illustrerer den måten som oppfinnelsen kan praktiseres på.

Eksempel 1

G-CSF-holdig MVL

1. Fremstilling

For fremstilling av multivesikulære liposomer (MVL) inneholdende granulocytt-kolonistimulerende faktor (G-CSF), inneholdt lipidkombinasjonsløsningen (pr ml kloroform): 11 mg DOPC, 2,3 mg DPPG, 8,7 mg kolesterol og enten 2,4 mg (2,7 uitioI) triolein eller 1,3 mg (2,7 ^mol) trikaprylin. Lipidløsningene som inneholdt fire forskjellige molforhold av de nøytrale lipider triolein og trikaprylin ble fremstilt ved å blande hensiktsmessige volumer av de triolein- og trikaprylinholdige løsninger. Molforholdet av triolein til trikaprylin var 100:0, 50:50, 25:75, 10:90 og 0:100.

Den første vandige faseløsning for MVL-formuleringene inneholdt 174 med mer glysin, 100 med mer HCI, 0,001% Tween80™ og 100 ug/ml G-CSF, 1 ml ble tilsatt til en ampulle inneholdende 1 ml av lipidkombinasjonen og emulgert ved å plassere den lukkede ampulle i horisontal konfigurasjon til hodet av en polyolefinharpiks-gjenstand-blander (Scientific Products) og ryste ved maksimal hastighet (2400 svingninger/min) i 6 min.

Den endelige emulsjon (2 ml) ble oppdelt og overført til to ampuller inne-holdende 2,5 ml 3,2% glukose og 40 med mer lysin. Emulsjonen ble dispergert i mikroskopiske smådråper ved å plassere den lukkede ampulle i en horisontal konfigurasjon til hodet av en polyolefinharpiks-gjenstand-blander og ryste i 3 sek ved 2400 svingninger/min. Innholdet i ampullen ble overført til en kolbe inneholdende 5 ml av 3,2% glukose, 40 med mer lysin. Kloroform ble fjernet fra de mikroskopiske smådråper eller sfæruler ved overføring av kolben til et gyroroterende vannbad ved 37°C og gjennomspyling av overflaten av suspensjonen med nitrogengass ved en strømningshastighet på 10-15 kubikkfot/t i 10 min. Det ble oppnådd multivesikulære liposomer i suspensjonen inneholdende innkapslet G-CSF.

Partikkelsuspensjonene ble fortynnet 1:4 med normal saltløsning, og partiklene ble høstet ved sentrifugering ved 800 x g i 10 min. Supernatantløsningen ble fjernet ved aspirasjon, og partiklene ble vasket to ganger ved oppslemming på nytt i frisk, normal saltløsning og sentrifugering. Det endelige vaskede produkt ble slemmet opp igjen på nytt ved 25% pakket partikkelvolum pr total volum og lagret ved 2-8°C for påfølgende studier.

2. In vitro frigjøringshastighet

In vitro frigjøringshastigheten av MVL fremstilt som beskrevet ovenfor ble bestemt ved inkubering i saltløsninger inneholdende 70% eitrert humant plasma og 0,1% natriumazid ved 37°C. G-CSF ble bestemt i den sentrifugeoppsamlede partikkelfraksjon ved solubilisering av prøver i 50% I PA og kvantifisering ved høytrykks væskekromatografi og UV-deteksjon ved anvendelse av kjente fremgangsmåter.

Avhengigheten av in vitro frigjøringshastigheten av G-CSF av blandingen av den nøytrale lipidkomponent anvendt ved fremstilling av multivesikulære liposomer er vist i fig. 1. Ettersom triolein til trikaprylin molforholdet ble øket, ble frigjørings-hastigheten av G-CSF fra de multivesikulære liposomer nedsatt.

3. In vivo frigjøringshastighet

Triolein og trikaprylin MVL-formuleringene av G-CSF ble evaluert i en farmakodynamisk modell i syriske gyldne hamstere. Eksogen G-CSF stimulerer nøytrofil (granulocytt-produksjon) som kan evalueres ved å analysere blodprøver for en økning i nøytrofilantallet i perifert blod og tilsvarende en økning i leukocyttantallet i perifert blod.

Formuleringene inneholdende trikaprylin eller triolein ble derfor evaluert for frigjøring i en farmakodynamisk hamstermodell som målte toppen og varigheten av overskudd av leukocytt (granulocytt) fremstilling forårsaket av rhu G-CSF (Cohen et al. 1987, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 84:2484-2488). I disse studier ble det anvendt subkutan injeksjon av en løsning av G-CSF som kontroll for bioekvivalens av det innkapslede protein. Hurtig frigjøringsformuleringen inneholdende trikaprylin ble også anvendt som kontroll for bioekvivalens av det innkapslede protein. Først ble toppen og varigheten av granulocyttøkningen ved sukutan injeksjon av hamstere med formuleringer som alle inneholdt trikaprylin (langsom:hurtig molforhold på 0:100) sammenlignet mot den forårsaket av en løsning av ikke-innkapslet G-CSF og trioleinformuleringen med lengre frigjøringsvarighet (langsom:hurtig molforhold på 100:0). For hver formulering var det 3 til 5 hamstere som fikk 75-100 ug G-CSF pr kg. Resultatene (fig. 2) er som forutsagt av in vitro frigjøringsstudiene. Trikaprylin-formuleringen ga hurtig frigjøring av G-CSF og stimulerte granulocyttfremstilling i likhet med den av den ikke-kapslede G-CSF-løsning. Trioleinformuleringen hadde en lavere (og senere) topp og lengre varighet.

Som en ytterligere kontroll ble en gruppe hamstere injisert med trioleinformuleringen solubilisert med tensid (Tween 20™) umiddelbart før injeksjon. Granulocyttantallet funnet ved 241 for den solubiliserte formulering var lik det som ble observert som resultat av injeksjoner av G-CSF-løsningene eller formuleringen inneholdende bare trikaprylin som det nøytrale lipid (fig. 2).

Eksempel 2

1. Fremstilling

Multivesikulære liposomer inneholdende granulocytt/makrofag kolonistimulerende faktor (GM-CSF) ble fremstilt som beskrevet i eksempel 1, men ved anvendelse av nøytralt lipid molforhold av triolein til trikaprylin på 100:0, 25:75 og 10:90.

2. In vitro frigjøring i humant plasma ved 37°C.

Suspensjonene ble fremstilt og inkubert i humant plasma ved 37°C som beskrevet i eksempel 1. GM-CSF som holdt seg innkapslet ble bestemt ved solubilisering av partikkelfraksjonen i 50% I PA og kvantifisering ved høytrykks væskekromatografi og UV-deteksjon ved anvendelse av kjente fremgangsmåter.

Resultatene av in vitro frigjøringsanalysen (fig. 3) demonstrerer at den gradvise erstatning av triolein med trikaprylin resulterer i gradvis økning i frigjørings-hastigheten.

3. In vitro farmakokinetikk

BALBc mus (7-8 uker gamle og som veide ca 20 g) ble administrert subkutan injeksjon av liposomer inneholdende GM-CSF fremstilt med enten 100% triolein eller et 25:75 forhold av triolein til trikaprylin. Blodprøver ble oppsamlet før injeksjonen og ved 1, 2, 4 og 7 dager post-injeksjon, og plasma ble analysert for GM-CSF konsentrasjon ved anvendelse av en ELISA kit. Formuleringen fremstilt med 25:75 triolein til trikaprylin ga et høyere toppnivå og en kortere varighet av påvisbar rhu GM-CSF sammenlignet med formuleringen fremstilt med 100% triolein som det nøytrale lipid (fig. 4). Disse resultater er som forutsagt av in vitro analysen i humant plasma ved 37°C, og viser at frigjøringshastigheten av innkapslet GM-CSF blir øket ved tilsetning av trikaprylin til den nøytrale lipidkomponent.

Eksempel 3

Depo/IGF-1

1. Fremstilling

Multivesikulære liposomer ble fremstilt med rhu IGF (rekombinant human insulinlignende vekstfaktor), med <14>C-sukrose som osmotisk spacer, og ammoniumcitrat som buffer. Lipidkombinasjonsløsningen inneholdt (pr liter) 10,4 g DOPC, 2,1 g DPPG, 7,7 g kolesterol, og triglyseridkomponenten var enten 2,1 g triolein, 1,9 g tripalmitolein, 1,5 g trilaurin, 1,3 g trikaprin eller 1,1 g trikaprylin (molforhold 0,34:0,07:0,52:0,06).

Den første løsning med vandig fase inneholdt (pr ml) 16 mg rhu IGF-1 (Chiron), 7% sukrose og 20 med mer ammoniumcitrat, pH 5. Det ble laget en første emulsjon ved høyhastighetsblanding av 5 ml av lipidkombinasjonsløsningen med 5 ml av løsningen i vandig fase ved 9000 opm i 9 min ved 25-27°C. Emulsjonen ble skåret til mikrosmådråper (sfæruler) ved tilsetning av 30 ml 40 med mer lysin, 4% glukoseløsning til blandekaret og blanding ved 6000 opm i 1 min. Kloroform ble fjernet fra de mikroskopiske smådråper eller sfæruler ved overføring av suspensjonen til en kolbe inneholdende 70 ml av 40 med mer lysin, 3,2% glukoseløsning og plassering av kolben i gyroroterende vannbad ved 37°C, og spyling av overflaten av suspensjonen med nitrogen ved en strømningshastighet på 70 kubikkfot/t i 20 min for å oppnå MVL-partiklene i suspensjonen.

Suspensjonene ble fortynnet 1:4 med normal saltløsning, og partiklene ble høstet ved sentrifugering ved 800 x g i 10 min ved romtemperatur. Supernatant-løsningen ble fjernet ved aspirasjon, og partiklene ble vasket to ganger ved oppslemming på nytt i frisk, normal saltløsning og sentrifugering.

2. In vitro frigjøringshastigheter

Det endelige vaskede produkt ble slemmet opp igjen på nytt ved 25% pakket partikkelvolum pr total volum og lagret ved en temperatur på 2-8, 25, 32 eller 37°C i enten 24 eller 481. Pelletfraksjonen fra 25.000 x G x 2 min sentrifugering ble solubilisert og analysert ved HPLC for IGF-1 holdt tilbake. Hver av de IGF-1 holdige formuleringer lagret ved 2-8°C ble også evaluert i løpet av 241 i in vitro frigjørings-analysen beskrevet i eksempel 1, og resultatene er sammenfattet i fig. 5. Formuleringene fremstilt med triolein (C18:1) eller tripalmitolein (C16:1) viste en lignende frigjøringshastighetsprofil. Mer enn 70% av det innkapslede IGF-1 ble frigjort på 7 dager. Formuleringen fremstilt med trikaprylin (C8) demonstrerte en hurtig fri-gjøringshastighetsprofil med nesten fullstendig frigjøring av IGF-1 på 2 dager. Formuleringene fremstilt med trikaprin (C10) eller trilaurin (C12) frigjorde IGF-1 markert langsommere enn standard trioleinformuleringen, mindre enn 50% frigjort på 7 dager. Disse resultater antyder at acylkjedelengden av triglyseridet ikke er direkte korrelert med frigjøringshastigheten av innkapslet IGF-1 in vitro, fordi frigjøringen av trikaprylin (C8) formuleringene var hurtigere enn den for trikaprin (C10) eller trilaurin (C12) formuleringene.

Det skal bemerkes at lagring av trilaurinformuleringene i saltløsning i bare noen få dager ved 2-8°C resulterte i morfologisk reorganisering av partiklene og en ledsagende fullstendig frigjøring av innkapslede materialer. Denne effekt ville ikke være å vente ut i fra den stabilitet som fremkom i in vitro frigjøringsanalysen ved høyere temperaturer. Denne katastrofiske effekt var relatert til lagring av formuleringen ved temperaturer signifikant lavere enn frysepunktet av det nøytrale lipid. Denne effekt er demonstrert i eksemplene 16 og 17 nedenfor.

3. In vivo farmakokinetikk

Sprague-Dawley hannrotter (som veide 250 til 300 g) ble gitt subkutane injeksjoner av den multivesikulære liposomformulering inneholdende IGF-1 som ble fremstilt med enten trikaprylin eller tripalmitolein som det nøytrale lipid. Trikaprylin-formuleringen demonstrerte et høyere toppnivå av plasma rhu IGF-1 og en kort frigjøringsvarighet sammenlignet med formuleringen fremstilt med tripalmitolein (fig. 6). Dette resultat bekrefter forutsigelsen av hurtig frigjøring av multivesikulære liposomer fremstilt med trikaprylin basert på resultater av in vitro frigjøringsanalysen.

Eksempel 4

1. Fremstilling

For fremstilling av multivesikulære liposomer inneholdende rhu-insulin skal lipidkombinasjonsløsningen inneholde (pr ml kloroform): 11 mg DOPC, 2,3 mg DPPG, 8,7 mg kolesterol og enten 2,4 mg (2,7 uiriol) triolein eller 1,3 mg (2,7 umol) trikaprylin som angitt.

De første vandig fase løsningsformuleringer inneholdt 7,5% <14>C-sukrose, 20

med mer sitronsyre, 50 med mer HCI og 5 mg/ml rhu-insulin (E. Coli, Sigma chemical Co., St. Louis, MO). En første emulsjon ble laget ved høyhastighets blanding av 4 ml av lipidkombinasjonsløsningen med 4 ml av den vandige fase løsning ved 9000 opm i 8 min ved 25-27°C. Emulsjonen ble skåret i mikrosmådråper (sfæruler) ved tilsetning av en løsning til blandekaret av 20 ml 20 med mer lysin, 4% glukose og blanding ved 3000 opm i 1 min. Kloroformen ble fjernet fra de mikroskopiske smådråper eller sfæruler ved overføring av suspensjonen til en kolbe inneholdende 30 ml av en løsning av 20 med mer lysin, 4% glukose ved 37°C i et gyroroterende vannbad og spyling av overflaten av suspensjonen med nitrogengass ved en

strømningshastighet på 70 kubikkfot/t i 20 min for å oppnå MVL-partiklene i suspensjonen.

Suspensjonene ble fortynnet 1:4 med normal saltløsning og partiklene ble høstet ved sentrifugering ved 800 x g i 10 min. Supernatantløsningen ble fjernet ved aspirasjon, og partiklene ble vasket to ganger ved oppslemming på nytt i frisk, normal saltløsning og sentrifugering. Det endelige vaskede produkt ble slemmet opp igjen på nytt ved 25% pakket partikkelvolum pr total volum, og lagret ved 2-8°C for påfølgende studier.

2. In vitro frigjøringshastigheter

" ln vitro" frigjøringsanalysen ble gjennomført ved å fortynne et volum av lagret suspensjon med 3,2 volumer av citrert, humant plasma, og plassere 0,6 ml av denne suspensjon i mikrofugerør som ble gjenkorket og inkubert under dynamiske betingelser ved 37°C. Etter 1, 3, 6 og 7 dager ble rørene sentrifugert med 14.000 x g x 2 min, og supernatantløsningen ble overført til et annet rør for bioanalyse. Pellet-fraksjonene av sentrifugerte prøver ble inkubert i 1% Nonldet NP-40 (CalBiochem, San Diego, CA), 50 med mer trifluoreddiksyre i 10 min ved 37°C. <14>C-sukrosen og insulinet holdt tilbake av pelletfraksjonen ble bestemt, henholdsvis ved scintillasjonstelling og revers fase HPLC ved anvendelse av kjente fremgangsmåter. Resultatene av disse studier viste at de multivesikulære liposomer fremstilt med triolein som det nøytrale lipid frigjorde både sukrose og insulin på ekvivalent og lineær måte, med nesten fullstendig frigjøring på 7 dager. Derimot kunne formuleringen fremstilt med trikaprylin holde tilbake bare 20 til 25% av den innkapslede sukrose og insulin etter bare 1 dag med inkubering i plasma (fig. 7).

Eksempel 5

1. Fremstilling

For fremstilling av multivesikulære liposomer inneholdende morfin ble det anvendt en GMP-godkjentbar skalerbar fremgangsmåte. Molforholdene av nøytral lipidkomponent av triolein til trikaprylin var 1:4 eller 1:9. Kontrollformuleringen inneholdt triolein eller trikaprylin som det eneste nøytrale lipid. Lipid kombinasjons-løsningen inneholdt (pr liter) 10,2 g DOPC, 2,0 g DPPG, 7,6 g kolesterol, 2,1 g til 1,1 g triglyserid avhengig av molforholdet av triolein:trikaprylin, (molforhold, 0,34:0,07:0,52:0,06).

Den første vandige faseløsning inneholdt (pr liter) 21 g morfinsulfatpenta-hydrat, 0,01 N saltsyre. En første emulsjon ble laget ved høyhastighetsblanding av 0. 62 I av lipidkombinasjonsløsning med 0,9 I av vandig faseløsning ved 8000 opm i 30 min ved 25-27°C. Emulsjonen ble skåret i mikrosmådråper (sfæruler) ved over-føring til en andre blandebeholder inneholdende 1514 med mer lysin, 5,9% glukose-løsning; og blanding ved 1250-1300 opm i 1,5 min ved 45°C. Kloroform ble fjernet fra sfærulene ved finfordeling av suspensjonen i 50 min ved 45°C i trinnintervaller: 17 min ved 15 l/min, 5 min ved 40 l/min, 28 min ved 10 l/min. MVL-partiklene ble således oppnådd i suspensjonen. Partiklene i den endelige suspensjonen ble konsentrert og vasket fri for ikke-innkapslet morfin ved enten tverrstrøms- eller diafiltrering med 25 I normal saltløsning. Det endelig vaskede produkt ble lagret ved 2-8°C for påfølgende studier.

2. In vitro frigjøringsprofiler

In vitro frigjøringsanalysene ble gjennomført ved en 1:9 fortynning av suspensjoner som inneholdt 8 til 15 mg av innkapslet morfinsulfat pr ml i humant plasma. Suspensjonene ble inkubert ved 37°C under dynamiske betingelser. Etter 1, 2, 4 og 7 dager ble prøvene fortynnet 1:4 med normal saltløsning, partiklene ble sedimentert ved sentrifugering ved 800 x g x 10 min og partikkelfraksjonen ble analysert for å bestemme mengden av morfin holdt tilbake ved solubilisering av pelletfraksjonen med 50% IPA og analyse ved UV-spektrofotometri ved anvendelse av kjente fremgangsmåter.

Fig. 8 viser frigjøringshastighetsprofilen for morfinfrigjøring for disse formuleringer til humant plasma. Som vist i tidligere eksempler, ettersom forholdet av triolein til trikaprylin øker, vil hastigheten og graden av morfinfrigjøring gå ned.

3. In vivo farmakokinetikk

In vivo frigjøringen av de multivesikulære liposomer inneholdende morfin fremstilt med triolein og trikaprylin alene eller i kombinasjon ble evaluert i Beagle hund ved anvendelse av epiduralinjeksjon, farmakokinetisk modell. I disse studier ble nivået av morfin frigitt fra liposomformuleringen injisert på et epiduralsted, bestemt i plasma og på et nærliggende intratekalt sted (CSF, cerebral spinalfluid) adskilt fra epiduralstedet ved den spinal hjernehinnemembran. Bare CSF-resultatene er vist (fig. 9).

Det er funnet en korrelasjon mellom in vitro frigjøringsresultatene sammenfattet i fig. 8 og frigjøringshastighetsprofilene observert i hundemodellen (fig. 9). Den in vivo trikaprylinholdige formulering frigjøres svært hurtig, med nesten fullstendig frigjøring i løpet av 241. Den gjennomsnittlige oppholdstid (MRT: Mean Residence Time) for 100% trikaprylinformuleringen var den samme som den for injeksjon av ikke-kapslet morfin, dvs 2,3 t vs 1,6 t. Inklusjon av en liten mengde triolein under fremstillingen, dvs et molforhold på 1:9 eller 1:4 triolein:trikaprylin vil nedsette frigjøringshastigheten, og forlenge frigjøringsvarigheten over 4 til 5 dager, med en MRT på henholdsvis 13,2 og 15,3 t. De trikaprylinholdige formuleringer frigjøres alle hurtigere enn formuleringen ved anvendelse av triolein som det eneste nøytrale lipid, som hadde en MRT på 691 i denne modell.

4. Lagringsstabilitet

Den trinnvise forandring i den nøytrale lipidblanding av MVL for å tilveiebringe en familie av formuleringer med trinnvis økning i frigjøringshastighetsprofilene av bio-aktiv forbindelse, synes ikke å bringe i fare lagringsstabiliteten av formuleringene, forutsatt at formuleringene blir lagret nær eller over smeltepunktet av den nøytrale lipidkombinasjon. Satser av 10:90 triolein:trikaprylin morfin MVL formuleringen, beskrevet ovenfor og som frigjøres hurtig både in vitro og in vivo, ble evaluert for avhengighet av frigjøringshastigheten av lagringstemperaturen. MVL-suspensjonene i lagringsløsning bestående av saltløsning ble inkubert ved normal lagringstemperatur, 2-8°C (4°C nominelt) og ved forhøyet temperatur, 26, 37 og 41 °C. Resultatene av disse studier er vist i fig. 10, et Arrhenius-diagram, som avsetter logaritmen av frigjøringshastigheten mot 1/temperatur (°K). Helningen av kurven synes å være kontinuerlig. Frigjøringshastighetsprofilen ved høy temperatur under-støtter den observasjon at MVL lagret i saltløsning ved 2-8°C har en svært langsom frigjøring (ca 1% av det innkapslede morfin pr 100 dager) og kan derfor ventes å ha en lagringstid som overskrider et år, dersom et kriterium på 5 eller 10% frigjøring av innkapslet materiale er grensen for lagringstiden. Videre er det også åpenbart at en fysiologisk matriks slik som plasma (fig. 9) eller in vivo miljøet i epiduralrommet (fig. 9) i høy grad vil akselerere frigjøringen sammenlignet med frigjøringen i saltløsning ved 37°C, dvs 50% av det innkapslede morfin frigjort pr dag, sammenlignet med mindre enn 1% av innkapslet morfin pr dag i sistnevnte.

Eksempel 6

Cytosin arabinosid

1. Fremstilling

Multivesikulære liposomer inneholdende cytosin arabinosid (AraC) ble fremstilt med forskjellige substitusjoner for fosfatidylkolinkomponenten av lipidløsningen i organisk fase. Substitusjonene ble gjennomført for å bestemme effekten på frigjøringshastighetsprofilen av å forandre acylkomponenten i hovedfosfolipidet i en MVL-formulering inneholdende enten triolein eller trikaprylin som det nøytrale lipid.

I dette første eksempel anvendes DOPC for å demonstrere at frigjørings-hastigheten i et fysiologisk medium fra MVL-formuleringer inneholdende AraC/HCI i den vandige fase, kan modifiseres ved å justere triolein til trikaprylinforholdet. Lipid-kombinasjonene inneholdt (pr 1200 ml) 122,4 ml DOPC ved 100 mg/ml, 2,4 g DPPG, 9,12 g kolesterol, 2,5 g triolein eller 1,3 g trikaprylin eller en blanding derav som ga et molforhold av triolein til trikaprylin på 1:4, 1:9, 1:18 eller 1:27.

Den første løsning i vandig fase inneholdt 20 mg/ml cytosin arabinosid, 0,1 N HCI. En første emulsjon ble laget ved høyhastighetsblanding av 10 ml lipidkombinasjon og 10 ml av en første løsning i vandig fase ved 9000 opm i 9 min. Emulsjonen ble skåret til mikrosmådråper ved overføring av første emulsjon til et andre blandekar inneholdende 200 ml av 3,2% glukose, 40 med mer lysin og blanding ved 2100 opm i 2,5 min. Kloroform ble fjernet ved overføring av suspensjonen til to, 1-liter kolber og gjennomspyling ved 70 chf. Den endelige suspensjon ble fortynnet 1:2 med saltløsning, og partiklene oppsamlet ved sentrifugering ved 800 x g x 10 min, vasket 3 ganger, slemmet opp igjen på nytt til 33% lipokritt, og deretter justert til 10 m g/ml.

2. In vitro frigjøring til humant plasma

In vitro frigjøringshastighetsprofilene av cytosin arabinosid (AraC) MVL-formuleringene ble oppnådd ved fortynning av suspensjonen 1:9 i humant plasma og inkubering av prøver ved 37°C under dynamiske betingelser. Ved tidspunktene etter 1, 2, 4 og 7 dager ble tilsatt 1,2 ml saltløsning til triplikatet 0,3 ml prøver, og partikkelfraksjonen ble oppsamlet ved sentrifugering ved 1600 x g x 2 min. Supernatantfraksjonen ble fjernet ved aspirasjon, og partikkelfraksjonen ble slemmet opp igjen på nytt i 1 ml av 50% isopropylalkohol, polyolefinharpiks-gjenstandet, inkubert ved 37°C i 10 min, sentrifugert og deretter ble 0,06 eller 0,2 ml av supernatanten tilsatt til 1,0 ml av 0,1 N HCI. Cytosin arabinosid ble bestemt ved UV-prøver ved 280 nm.

In vitro frigjøringsprofilene som målte AraC holdt tilbake av formuleringene av multivesikulære liposomer er vist i fig. 11. Frigjøring fra formuleringen som har utelukkende trikaprylin som det nøytrale lipid var hurtig. Ettersom forholdet av trikaprylin til triolein anvendt ved fremstillingen av MVL-formuleringen blir øket, vil frigjøringshastigheten av cytosin arabinosid fra MVL inkubert i plasma gå ned. En familie av frigjøringshastighetskurver med forutsigbare økende frigjøringshastigheter blir således dannet ved trinnvis økning i mengden av triolein i triolein til trikaprylinforholdet.

Eksempel 7

Effekt av substitusjon av høyere overgangstemperatur fosfatidylkoliner eller lengre kjedelengde for DOPC i formuleringer inneholdende trikaprylin.

Rangeringen i en familie av in vitro frigjøringshastighetsprofiler (som oppnådd i eksempel 6) med det høyere molforhold av trikaprylin til triolein som resulterer i hurtigere frigjøring både in vivo og i in vitro modeller (plasma ved 37°C), holder seg konsistent når et fosfatidylkolin med høyere faseovergangstemperatur eller med øket kjedelengde blir substituert for DOPC i formuleringene i eksempel 6. I dette eksempel ble distearoylfosfatidylkolin (DSPC, smp 55°C) substituert for DOPC (smp 0°C).

1. Fremstilling

Fremstillingsparametrene ble justert for å passe til det høyere smp av DSPC ved å gjennomføre emulgeringen ved 50°C. Fremstillingen av emulsjoner anvendt for DOPC kontrollformuleringene ble gjennomført ved omgivende temperatur. I tillegg ble HCI-konsentrasjonen av den første løsning i vandig fase øket 36% sammenlignet med den i eksempel 6.

Lipidkombinasjonsløsningen inneholdt (pr liter) 10,2 g DOPC eller 10,3 g DSPC, 2,1 g DPPG, 7,7 g kolesterol og triglyseridkomponenten var enten 1,1 g trikaprylin eller 2,1 g triolein (molforhold på 0,34:0,07:0,52:0,06). Blandinger av triolein og trikaprylin ble laget for å gi forhold på 1:4, 1:9, 1:18, 1:2 triolein til trikaprylin for anvendelse i formuleringene.

Den første vandige fase inneholdt (pr ml) 20 mg cytosin arabinosid og 136 med mer HCI. En emulsjon ble laget ved høyhastighetsblanding av 10 ml av lipid-kombinasjonsløsningen med 10 ml av løsningen i vandig fase ved anvendelse av et 2 cm diameter blad i en rustfri stålbeholder ved 9000 opm i 8 min ved romtemperatur (for formuleringer med DOPC) eller 55°C (for formulering med DSPC). Emulsjonen ble skåret til mikrosmådråper ved overføring til en 400 ml glass Mason krukke inne-holdende 200 ml av 5% glukose og 40 med mer lysin og, ved anvendelse av et 4 cm diameter blad, blanding ved 4000 opm i 1,5 min ved den samme temperatur som anvendt for den første emulgering. Kloroform ble fjernet ved å plassere beholderen i et 37°C gyroroterende vannbad og spyling av overflaten av suspensjonen med nitrogengass ved en strømningshastighet på 70 cfh i 20 min.

Suspensjonene ble fortynnet 1:4 med normal saltløsning, og partiklene ble oppsamlet ved sentrifugering ved 800 x g i 10 min ved romtemperatur. Supernatanten ble fjernet ved aspirasjon, og deretter ble partiklene vasket 2 ganger ved oppslemming på nytt i normal saltløsning og sentrifugering. Den endelige vaskede pellet ble slemmet opp igjen på nytt i normal saltløsning og justert til 10 mg/ml av cytosin arabinosid.

2. In vitro frigjøringsprofiler

In vitro frigjøringsanalysen av AraC fra MVL ble gjennomført i humant plasma som beskrevet i eksempel 6 ovenfor. Som vist i fig. 12, i MVL hvori DSPC med høyere smeltepunkt ble substituert for DOPC, ble det oppnådd en familie av graderte frigjøringshastighetsprofiler ved å variere molforholdet av trikaprylin til triolein, hvor formuleringene med hurtigere frigjøring inneholdt et høyere molforhold av trikaprylin til triolein. Som tidligere vist for andre formuleringer av MVL kan en økning i saltsyre-konsentrasjonen i løsningen i vandig fase (sammenlignet med den som inneholdes i MVL i eksempel 6) senke frigjøringen av den aktive substans in vitro.

Eksempel 8

Sukrose

1. Fremstilling

I dette eksempel ble effekten av trikaprylin på frigjøringshastigheten testet for formuleringer inneholdende 4% sukrose som det aktive middel i formuleringer med dieukrylfosfatidylkolin (DEPC, smp <0°C), et fosfatidylkolin med en kjedelengde på 22 karbonatomer, substituert for dioleoylfosfatidylkolin (DOPC, smp <0°C), et fosfatidylkolin med en kjedelengde på 18 karbonatomer.

Lipidløsningen inneholdt (pr liter) enten 10,2 g DOPC eller 11,0 g DEPC og 2,1 g DPPG, 7,7 g kolesterol og triglyseridkomponenten var enten 1,1 g trikaprylin eller 2,1 g triolein (molforhold på 0,34:0,07:0,52:0,06). For blandinger av det nøytrale lipid ble triolein- og trikaprylinholdige lipidkombinasjoner blandet for å gi disse triolein til trikaprylin molforhold.

Den første vandige fase inneholdt 4% sukrose (Spectrum USP/NF, Los Angeles, CA) og ble anriket med 40 uJ av<14> C-sukrose. En første emulsjon ble laget ved høyhastighetsblanding av 5 ml av lipidkombinasjonsløsningen med 5 ml av løsningen i vandig fase ved anvendelse av et 2 cm diameter blad i en rustfri stålbeholder ved 9000 opm i 10 min ved romtemperatur. Emulsjonen ble skåret til mikrosmådråper ved overføring til en 400 ml glass Mason krukke inneholdende 200 ml av 4% glukose og 4 med mer lysin i 2 min, ved anvendelse av et 4 cm diameter blad og blanding ved 3500 opm. Kloroform ble fjernet fra smådråpene ved overføring av suspensjonen til en 1 I kulturkolbe plassert i 37°C gyroroterende vannbad og spyling av overflaten av suspensjonen med nitrogen ved en strømningshastighet på 70 cfh i 20 min.

Partikkelsuspensjonene ble fortynnet 1:2 med normal saltløsning, og partiklene ble oppsamlet ved sentrifugering ved 800 x g i 10 min ved romtemperatur. Supernatanten ble fjernet ved aspirasjon og partiklene ble vasket to ganger ved resuspensjon i normal saltløsning og sentrifugering. Den endelige, vaskede partikkelpellet ble resuspendert i normal saltløsning og justert til ca 33% lipokritt.

2. In vitro plasmafrigjøringsstudier

For in vitro plasmafrigjøringsstudier ble suspensjonene fortynnet 1:10 i humant plasma med 0,1% natriumazid. Triplikate alikvoter på 300 fal ble inkubert i 1,5 ml

skrulokk Eppendorf-rør og høstet på dagene 0, 1, 2, 3 og 4. Prøvene ble høstet ved vilkårlig å trekke rør fra inkubatoren, merke røret med dagen for trekkingen, fortynne innholdet med 1,2 ml normal saltløsning og sentrifugering ved 27.000 x g i 5 min i en mikrofuge. Supernatanten ble omhyggelig aspirert bort fra partikkelpelleten. Pelletfraksjonen ble resuspendert i 1 ml av 50% IPA ved polyolefinharpiks-gjenstanding, inkubering ved 37°C i 10 min og deretter polyolefinharpiks-gjenstanding. En 50 uJ prøve ble deretter fortynnet med 3 ml scintillasjonsvæske i et scintillasjonsglass, glasset ble rystet kraftig og sukrose ble bestemt ved scintillasjonstelling.

Som det kan sees ut i fra de data som inneholdes i fig. 13, frigjorde formuleringen inneholdende utelukkende trikaprylin all innkapslet sukrose i løpet av en dag når den ble inkubert i plasma. Forholdet av triolein:trikaprylin på 1:18 var nødvendig for å oppnå en mellomfrigjøringshastighet for en MVL-formulering med denne vandige fase når DEPC erstattet DOPC.

Eksempel 9

I dette eksempel ble trikaproin (C6) substituert for trikaprylin (C8) som et frigjøringshastighetsmodifiserende nøytralt lipid.

1. Fremstilling

Lipidkonsentrasjonsløsningen inneholdt (pr liter) en kombinasjon av 10,2 g, 2,1 g DPPG, 7,7 g kolesterol og triglyseridkomponenten var enten 0,9 g trikaproin eller 2,1 g triolein (molforhold på 0,34:0,07:0,52:0,06). For blandinger av lipidløsningene inneholdende triolein- og trikaproin ble blandet for å gi lipidløsninger inneholdende molforhold av triolein til trikaproin på 1:4, 1:9 og 1:18. Disse formuleringer ble fremstilt og testet som beskrevet i eksempel 8.

Den første vandige fase inneholdt 4% sukrose (Spectrum USP/NF) og ble anriket med 40 uJ av <14> C sukrose (ICN lot nr. 54661027). En første emulsjon ble laget ved høyhastighetsblanding av 5 ml av lipidkombinasjonsløsningen med 5 ml av løsningen i vandig fase ved anvendelse av et 2 cm diameter blad i en rustfri stålbeholder ved 9000 opm i 10 min ved romtemperatur. Den andre emulgering ble gjennomført i en 400 ml glass Mason krukke inneholdende 200 ml av 4% glukose og 4 med mer lysin, ved anvendelse av et 4 cm diameter blad og blanding ved 3500 opm i 2 min. Kloroform ble fjernet ved overføring av innholdet av krukken til en 1 I kulturkolbe plassert i 37°C gyroroterende vannbad og spyling av overflaten av suspensjonen med nitrogengass ved en strømningshastighet på 70 cfh i 20 min.

Suspensjonene ble fortynnet 1:2 med normal saltløsning, og partiklene ble høstet ved sentrifugering ved 800 x g i 10 min ved romtemperatur. Supernatanten ble fjernet ved aspirasjon og partiklene ble vasket to ganger ved resuspensjon i normal saltløsning og sentrifugering. Den endelige, vaskede pellet ble resuspendert i normal saltløsning og justert til ca 33% lipokritt hvori lipokritt i prosent er det volum som opptas av liposomene dividert med det totale volum av liposomsuspensjonen multiplisert med 100. Utbyttet for hver variasjon i det nøytrale lipid var større enn 50%. Etter fremstilling var den frie sukrosekonsentrasjonen ved 33% lipokritt ca 3% av den totale sukrosekonsentrasjonen.

2. In vitro frigjøringsprofiler

For in vitro plasmafrigjøringsstudier ble suspensjonene fortynnet 1:10 i humant plasma. Triplikate alikvoter på 300 uJ ble inkubert dynamisk i 1,5 ml skrulokk Eppendorf-rør og høstet på dagene 0, 1, 2, 3 og 4. Prøvene ble høstet ved å trekke rør fra inkubatoren vilkårlig, merke røret med dagen for trekkingen, fortynne innholdet med 1,2 ml normal saltløsning og sentrifugering ved 27.000 x g i 5 min i en mikrofuge. Supernatanten ble omhyggelig aspirert bort fra pelleten. Pelletfraksjonen ble resuspendert i 1 ml av 50% IPA ved polyolefinharpiks-gjenstanding, inkubering ved 37°C i 10 min og deretter polyolefinharpiks-gjenstanding igjen. En 50 uJ prøve ble deretter fortynnet med 3 ml scintillasjonsvæske i et scintillasjonsglass, glasset ble rystet kraftig, og <14>C-sukrose radioaktiviteten ble bestemt ved scintillasjonstelling.

Som vist i fig. 14, resulterer substitusjonen av trikaproin for trikaprylin i blandinger inneholdende triolein som en frigjøringshastighetsmodifiserende nøytral lipidkombinasjon i formuleringer med en gradert familie av frigjøringshastigheter for forskjellige triolein:trikaproin molforhold. Jo høyere molforhold av trikaproin til triolein, jo hurtigere frigjøring av sukrose. Det er en uttalt forskjell mellom trikaproin-og trikaprylinholdige formuleringer. Med denne vandige fase, dvs inneholdende sukrose som det innkapslede aktive middel, undergikk de multivesikulære partikler fremstilt ved anvendelse av utelukkende trikaproin, en fysisk omdanning og frigjorde sitt innhold i løpet av 5 min fortynning i humant plasma ved romtemperatur. Fortynning i saltløsning inneholdende 0,5% bovint serumalbumin hadde den samme effekt. Formuleringene inneholdende bare trikaprylin som det nøytrale lipid krevet derimot generelt 12 eller flere timers inkubering i plasma ved 37°C for fullstendig fri-gjøring av det aktive middel, til tross for ustabiliteten av trikaproinet bare formuleringer i humant plasma eller saltløsning ved romtemperatur. Formuleringene var stabile under lagring ved 2-8°C i saltløsning i minst en uke.

Eksempel 10

Antisens oligonukleotider

Dette eksempel illustrerer anvendelse av fremgangsmåten ifølge denne oppfinnelse til innkapsling av antisens oligonukleotider.

1. Fremstilling

Den første løsning i vandig fase inneholdt (pr ml) 5,10 eller 20 mg av et IL-6 antisens oligonukleotid (donert av Leu Neckers, NIH, Bethesda, MD), som i noen studier ble biotinylert, og 5% mannitol.

Saltsyre (0,1 ml av 1 N) ble tilsatt til en ampulle inneholdende 1 ml av lipidkombinasjonen i eksempel 1, og kombinasjonen ble emulgert ved å feste den lukkede ampulle i horisontal konfigurasjon til hodet av en polyolefinharpiks-gjenstandblander (Scientific Products) og rysting ved 2400 svingninger/min i 1 min. Resten av den første løsning i vandig fase (0,9 ml 5% mannitol inneholdende 10 mg antisens oligonukleotid) ble tilsatt til ampullen, og emulgeringen ble fortsatt i 5 min.

Den endelige emulsjon (2 ml) ble oppdelt og overført til to ampuller inne-holdende 2,5 ml 3,2% glukose, og 40 med mer lysin. Emulsjonen ble dispergert til mikroskopiske smådråper ved å feste den lukkede ampulle i horisontal konfigurasjon til hodet av en vortexblander og ryste i 3 sek ved ca 1200 opm. Innholdet av ampullen ble overført til en kolbe inneholdende 5 ml av 3,2% glukose, 40 med mer lysin, og kloroformen ble fjernet fra de mikroskopiske smådråper eller sfæruler ved overføring av kolben til et 37°C gyroroterende vannbad, og spyling av overflaten av suspensjonen med nitrogengass ved en strømningshastighet på 15 kubikkfot/time i 10 min.

Suspensjonene ble fortynnet 1:4 med normal saltløsning, og partiklene ble høstet ved sentrifugering ved 800 x g i 10 min. Supernatantløsningen ble fjernet ved aspirasjon, og partiklene ble vasket to ganger ved resuspensjon i frisk, normal salt-løsning og sentrifugering. Det endelige vaskede produkt ble resuspendert ved 25% pakket partikkelvolum pr totalvolum og lagret ved 2-8°C for påfølgende studier.

Gjenvinningen av innkapslet oligonukleotid ble bestemt ved å fortynne en prøve av suspensjonen 1:1 med 0,1% SDS, inkubere prøven i kokende vannbad i 2 min, og deretter fortynne prøven (typisk 1:20) i 0,1 N NaOH for bestemmelse av UV-absorpsjon ved anvendelse av bølgelengdescanning fra 320 til 212 nm. Konsentrasjonen av oligonukleotidprøven av beregnet ved å subtrahere den målte A320 absorbansverdi fra A257 absorbansverdien. En prøve av den første løsning i vandig fase tjente som standard, 17,6 (A257-1 cm) enheter pr mg/ml.

1. In vitro frigjøringsprofiler

In vitro frigjøringsegenskapene til multivesikulære partikler inneholdende oligonukleotider ble bestemt ved å måle mengden av oligonukleotid som er tilbake med partikkelfraksjonen etter inkubering ved 37°C i rotte cerebral spinalvæske (CSF). Prøver lagret i normal saltløsning ble slemmet opp igjen på nytt i lagringsløsningen, og sentrifugert ved 750 x g i 10 min. Supernatanten av saltløsningen ble fjernet ved aspirasjon, og partiklene ble resuspendert i rotte CSF til konsentrasjoner på 0,25 til 0,5 mg av oligonukleotidet pr ml av CSF. Prøvene ble inkubert ved 37°C under statiske betingelser. Etter 0, 1, 2, 3 og 7 dager ble prøvene av partikkel/CSF-suspensjonene fjernet, fortynnet 10 ganger i saltløsning, sentrifugert, og supernatanten ble aspirert bort fra partikkelfraksjonen. Partikkelfraksjonen ble inkubert i 0,1% SDS og fortynnet med 0,1 N NaOH, og et UV-absorbans spektrum av oligonukleotidet ble oppnådd over området 340 til 210 nm. Mengden av oligonukleotid holdt tilbake av partikkelfraksjonen ble bestemt som ovenfor.

Som vist i fig. 15 ville trikaprylinformuleringen ikke frigjøres in vitro mer hurtig, men hadde isteden en høyere total frigjøring; den trioleinholdige formulering stanset frigjøring av medikamentet i rotte CSF etter ca 2,5 dager sammenlignet med fortsatt frigjøring av den trikaprylinholdige formulering.

2. In vivo farmakokinetikk

Når antisens MVL-formuleringene fremstilt med trikaprylin som det nøytrale lipid ble testet in vivo ved intratekal injeksjon i rotter og prøver som deretter ble tatt av CSF ble undersøkt mikroskopisk, var ingen partikler åpenbare i CSF etter to dager. MVL-partiklene fremstilt med triolein var tydelige etter to dager, men hadde et "innskrumpet" utseende. Det var intet tegn til fritt, naturlig oligonukleotid ved en 3'-ende merkingsanalyse.

For å forbedre følsomheten av in vivo bestemmelsen for oligonukleotid-konsentrasjon i CSF ble oligonukleotid biotinylert, og det biotinylerte oligonukleotid ble formulert som beskrevet ovenfor i MVL ved anvendelse av enten triolein eller trikaprylin som det nøytrale lipid. Gjenvinningen av innkapslet biotinylert oligonukleotid var 78% for triolein og 82% for trikaprylinholdig MVL. Når det ble studert in vivo var biotinylert oligonukleotid funnet fritt i CSF frigjort fra de trikaprylinholdige liposomer, under påvisningsgrensen etter 2 dager. Fritt, biotinylert oligonukleotid var tilstede i rotteprøven CSF 4 dager etter administrering av de trioleinholdige formuleringer ved en konsentrasjon på ca 0,5 u.M (resultater ikke vist). Disse in vivo data er overensstemmende med det trikaprylin MVL hurtigfrigjørende antisens oligonukleotid in vivo og trioleinformuleringen ga en mer forsinket frigjøring av oligo-nukleotidene.

Eksempel 11

Plasmidholdig MVL

1. Fremstilling

For fremstilling av multivesikulære liposomer for innkapsling av E. Coli PBR322 plasmidet, inneholdt lipidkombinasjonsløsningen (pr liter) 10,4 g DOPC, 2,1 g DPPG, 7,7 g kolesterol, 2,16 g triolein (mw 885,40) eller 1,15 g trikaprylin (mw 470,7) (DOPC : DPPG : kolesterol: triglyserid molforhold, 0,34:0,07;0,52:0,06).

Den første løsning i vandig fase inneholdt (pr liter) 42 g <14>C-sukrose (0,6 uCi pr ml) 100 mmol lysin, 84 mmol saltsyre, pH 7,4 og 20 ug/ml PBR322 plasmid (Promega, Madison Wl). En første emulsjon ble laget ved høyhastighetsblanding av 3 ml av lipid kombinasjonsløsning med 3 ml av løsning i vandig fase ved 9000 opm i 9 min ved 25-27°C. Emulsjonen ble skåret til mikrosmådråper (sfæruler) ved tilsetning av 20 ml av en 20 med mer lysin, 4% glukoseløsning til blandekaret og ytterligere blanding ved 4000 opm i 2 min. Kloroformen ble fjernet fra de mikroskopiske smådråper eller sfæruler ved overføring av suspensjonen til en kolbe inneholdende 30 ml av 20 med mer lysin, 4% glukoseløsning ved 37°C i et gyroroterende vannbad, og spyling av overflaten av suspensjonen med nitrogengass ved en strømningshastighet på 70 I pr time i 20 min under dannelse av MVL. MVL-suspensjonene ble fortynnet 1:4 med normal saltløsning, og partiklene ble høstet ved sentrifugering ved 800 x g i 10 min. Supernatantløsningen ble fjernet ved utsuging, og partiklene ble vasket to ganger ved oppslemming på nytt i frisk, normal saltløsning og sentrifugering. Det endelig vaskede produkt ble slemmet opp igjen på nytt til 25% pakket partikkelvolum pr total volum, og lagret ved 2-8°C for påfølgende studier.

2. In vitro frigjøringsprofil

In vitro frigjøringsanalysene ble gjennomført ved en 1:2,5 fortynning av suspensjon som inneholdt de multivesikulære liposomer innkapslende PBR322 plasmid og <14>C-sukrose i humant plasma. Tidligere studier hadde etablert at 14C-sukrosefrigjøring var et tilfredsstillende surrogat for estimering av frigjøringen av PBR322 plasmidet fra MVL. Suspensjonene ble inkubert ved 37°C under statiske betingelser. Ved tidene for 0, 1, 2, 3, 6, 10 og 17 dager ble prøvene fortynnet 1:4 med normal saltløsning, partiklene ble sedimentert ved sentrifugering ved 800 x g x 10 min, og partikkelfraksjonen ble analysert ved å løse prøvene i en scintillasjons-telleløsning og gjennomføre scintillasjonstellingen av mengden av <14>C-sukrose holdt tilbake av partikkelfraksjonen.

Resultatene av denne studie vist i fig. 16 indikerer at PBR322 plasmidformuleringen som bruker triolein som det nøytrale lipid var stabil under simulerte in vivo betingelser, og frigjorde ca 30% av den innkapslede <14>C-sukrose over et spenn på 17 dager; mens de trikaprylinformulerte partikler hurtig frigjorde sitt innhold ved kontakt med humant plasma ved 37°C.

Eksempel 12

I det følgende eksempel ble sukrose og lysin-HCI anvendt som eksipienter i PBR322 plasmidformuleringen innkapslet uten ytterligere aktivt middel for å gi en "utelukkende eksipient" familie av graderte, sukrosefrigjøringsformuleringer som anvender tripalmitolein:trikaprylin molforhold som det nøytrale lipid.

1. Fremstilling

For fremstilling av multivesikulære liposomer som innkapsler bare sukrose-lysin HCI, inneholdt lipidkombinasjonsløsningen (pr liter) 10,4 g DOPC, 2,1 g DPPG, 7,7 g kolesterol, 1,9 g til 1,0 g triglyserid avhengig av molforholdet av tripalmitolein (mw 801, C16:1 9C): trikaprylin for gi et DOPC:DPPG:kolesterol:triglyserid molforhold på 0,34:0,07:0,52:0,06. Molforholdet av tripalmitolein til trikaprylin fremstilt i formuleringen i dette eksempel 0:1, 1:0, 1:9, 1:4, 1:2 og 1:1.

Den første løsning i vandig fase inneholdt (pr liter) 42 g <14>C-sukrose (1,0 uCi pr ml) 100 mmol lysin, 90 mmol saltsyre, pH 5,7. En første emulsjon ble laget ved høyhastighetsblanding av 5 ml av lipid kombinasjonsløsning med 5 ml av løsning i vandig fase ved 9000 opm i 9 min ved 25-27°C. Emulsjonen ble skåret til mikrosmådråper (sfæruler) ved tilsetning av 20 ml av en 20 med mer lysin, 4% glukoseløsning til blandekaret, og blanding ved 5000 opm i 1,5 min. Kloroformen ble fjernet fra de mikroskopiske smådråper eller sfæruler ved overføring av suspensjonen til en kolbe inneholdende 30 ml av 20 med mer lysinet, 4% glukoseløsningen i et 37°C gyroroterende vannbad, og spyling av overflaten av suspensjonen med nitrogengass ved en strømningshastighet på 70 kubikkfot/time i 20 min for å oppnå de multivesikulære partikler i suspensjonen.

Suspensjonene ble fortynnet 1:4 med normal saltløsning, og partiklene ble høstet ved sentrifugering ved 800 x g i 10 min. Supernatantløsningen ble fjernet ved avsuging, og partiklene ble vasket to ganger ved oppslemming på nytt i frisk, normal saltløsning og sentrifugering. Det endelig vaskede produkt ble slemmet opp igjen på nytt ved 25% pakket partikkelvolum pr total volum, og lagret ved 2-8°C for på-følgende studier.

1. In vitro frigjøringsprofil

In vitro frigjøringsanalysene ble gjennomført ved en 1:9 fortynning i humant plasma av suspensjoner som inneholdt multivesikulære liposomer som innkapsler <14>C-sukrose. Suspensjonene ble inkubert ved 37°C under dynamisk forsiktig blanding. Ved 0, 3, 5, 8 og 12 dager ble prøvene fortynnet 1:4 med normal salt-løsning, partiklene ble sedimentert ved sentrifugering ved 800 x g i 10 min, og partikkelfraksjonen ble analysert ved oppløsning i scintillasjonstelleløsning og scintillasjonstelling av mengden av <14>C-sukrose holdt tilbake i partiklene. Resultatene av disse studier (fig. 17) viser at et 1:1 molforhold av tripalmitolein til trikaprylin ga en noe langsommere frigjøringshastighet enn tripalmitolein alene. En gradert familie av frigjøringshastigheter ble oppnådd med hurtigere frigjøring ved å øke andelen av trikaprylin i den nøytrale lipidkomponent.

Eksempel 13

Anestetika

1. Tetrakain MVL-formuleringer

For fremstilling av MVL-innkapslende tetrakain inneholdt lipid kombinasjons-løsningen (pr ml kloroform) 15,6 mg DOPC, 3,1 mg DPPG, 11,5 mg kolesterol og 12,6 mg til 6,6 mg triglyserid avhengig av molforholdet av triolein:trikaprylin. Lipo-filisiteten av tetrakain ble funnet å kreve at konsentrasjonen av lipid (68 fam/ml) i lipidkombinasjonen måtte økes 2 til 1,5 ganger høyere for å oppnå tilfredsstillende MVL-formuleringer. Likeså ble triglyseridet anriket; molforholdet av DOPC:DPPG> kolesterol triglyserid var 0,29:0,06:0,44:0,21. Molforholdet av triolein til trikaprylin fremstilt i formuleringene i dette eksempel var 1:0; 1:10; 0,5:10; 0,2:10; 0,1:10; 0. 05:10 og 0:1. Den første løsning i vandig fase for innkapsling av tetrakain inneholdt (pr ml) 15 mg tetrakainfosfat og 200 mg av alfacyklodekstrinpolymer.

En alikvot av den første løsning i vandig fase (1 ml) ble tilsatt til en ampulle inneholdende 1 ml av lipidkombinasjonen, og emulgert ved å feste den lukkede ampullen i horisontal konfigurasjon til hodet av vortexblander (Scientific Products) og ryste ved 2400 svingninger/min i 12 min.

Den endelige emulsjon (1 ml) ble oppdelt og overført til 2 ampuller inne-holdende 2,5 ml av en løsning av 3,2% glukose, 5 med mer lysin. Emulsjonen ble dispergert til mikroskopiske smådråper ved å feste den lukkede ampulle i horisontal konfigurasjon til hodet av en polyolefinharpiks-gjenstandblander og ryste i 3 sek ved en setting på 600-800 svingninger/min. Innholdet av ampullen ble overført til en kolbe inneholdende 50 ml en løsning av 3,2% glukose, 5 med mer lysin, og kloroformen ble fjernet fra de mikroskopiske smådråper eller sfæruler ved overføring av kolben til et 37°C gyroroterende vannbad, og spyling av overflaten av suspensjonen med nitrogengass ved en strømningshastighet på 1 I pr min i 20 min.

Suspensjonene ble fortynnet 1:4 etter volum med normal saltløsning, og partiklene ble høstet ved sentrifugering ved 800 x g i 10 min. Supernatantløsningen ble fjernet ved avsuging, og partiklene ble vasket to ganger ved resuspensjon i frisk, normal saltløsning og sentrifugering.

1. In vivo farmakokinetikk

In vivo frigjøringsegenskapene av de multivesikulære partikler ble bestemt i BalbC-mus (7 til 8 uker gamle og som veide ca 20 g) ved subkutan injeksjon i buk-regionen (100 uJ). Ved tidspunktene 0, 5 og 24 t etter injeksjon ble musene avlivet, det subkutane vev ble høstet, homogenisert og ekstrahert, og ekstraktene ble analysert ved HPLC ved anvendelse av UV-deteksjon for mengden av tilbakeholdt tetrakain.

Den ønskede in vivo frigjøringsvarighet for tetrakain MVL var 24 t. Formuleringer som inneholdt utelukkende triolein som det nøytrale lipid ble funnet å være stabile in vivo og ble frigjort over altfor lang tid.

Ved å inkludere trikaprylin i den nøytral lipidkomponent ble det oppnådd formuleringer med kortere varighet og mer ønskelige farmakokinetiske profiler (fig. 18). Den ønskede 24 t frigjøringsvarighet for bedøvelsesmiddelet ble fremskaffet av en formulering med et forhold på 1 triolein:100 trikaprylin.

Forholdet mellom utvelgelse av nøytralt lipid og tilsiktet lagringstemperatur

Som vist i de følgende eksempler vil smeltepunktet av det nøytrale lipid være et viktig hensyn ved utvelgelse av det hastighetsmodifiserende nøytrale lipid. Andre faktorer må imidlertid også bli tatt i betraktning, f.eks sammensetningen av den første løsning i vandig fase. Konklusjonen av disse eksempler er at frysepunktet (smelte- eller tåkepunktet) av det nøytrale lipid eller den nøytrale lipidblanding bør være over eller nær lagringstemperaturen for å sikre lagringsstabilitet. Dersom formuleringene blir lagret ved temperaturer signifikant lavere enn frysepunktet av det nøytrale lipid eller blandingen derav vil MVL-partiklene undergå en fysisk, morfologisk omdannelse, som resulterer i tap av indre struktur og frigjøring av innkapslede materialer. Denne omdanning kan foregå i løpet av noen få timer eller over flere dager eller uker, avhengig av sammensetningen av den første blanding i vandig fase.

Eksempel 14

I det følgende eksempel ble det fremstilt MVUer med enten trikaprylin eller trikaprin som den nøytral lipidkomponent. Frysepunktet av trikaprylin er 8°C, og det for trikaprin er 31 °C. Den første vandige fase inneholdt enten cytosin arabinosid eller morfinsulfat i 0,1 N HCI. Alikvoter av det endelige produkt ble lagret i salt-løsning ved 2-8, 25, 32 og 37°C. Frigjøringen av innkapslede materialer ble bestemt over lagringstiden.

1. Fremstilling

For fremstilling av MVL inneholdt lipid kombinasjonsløsningen (pr liter) 10,4 g DOPC, 2,1 g DPPG, 7,7 g kolesterol og triglyseridkomponenten var enten 0,93 trikaprylin (C8) eller 1,1 g trikaprin (C10) (molforhold 0,34:0,07:0,52:0,06). Den første løsning i vandig fase inneholdt enten (pr ml) 20 mg cytosin arabinosid i 0,1 N HCI eller 20 mg morfinsulfat pentahydrat i 0,1 N HCI.

For formuleringer som innkapsler cytosin arabinosid ble den første emulsjon laget ved høyhastighetsblanding av 10 ml av lipid kombinasjonsløsning med 10 ml av løsning i vandig fase ved 9000 opm i 14 min ved 25-27°C med et blad med høy skjærpåkjenning. For formuleringer som innkapsler morfin ble den første emulsjon laget ved høyhastighetsblanding av 12,5 ml av lipidkombinasjonsløsningen med 7,5 ml av løsningen i vandig fase ved 9000 opm i 14 min ved 25-27°C. De første emulsjoner ble skåret til mikrosmådråper (sfæruler) ved overføring til et blande-kammer inneholdende 200 ml av 40 med mer lysin, 3,2% glukoseløsning og blanding ved 2100 opm i 2,5 min. Kloroformen ble fjernet fra de mikroskopiske smådråper eller sfæruler ved overføring av suspensjonen til en kolbe, plassering av kolben i 37°C gyroroterende vannbad, og spyling av overflaten av suspensjonen med nitrogengass ved en strømningshastighet på 70 cfh i 20 min.

Suspensjonene ble fortynnet 1:4 etter volum med normal saltløsning, og partiklene ble høstet ved sentrifugering ved 800 x g i 10 min ved romtemperatur. Supernatantløsningen ble fjernet ved avsug, og partiklene ble vasket to ganger ved resuspensjon i frisk, normal saltløsning og sentrifugering. Det endelige vaskede produkt ble resuspendert ved 33% pakket partikkelvolum og lagret.

Karakteriseringen av utbytter av innkapslet og fritt (supernatant) cytosin arabinosid og morfin fra trikaprylin og trikaprin MVL-formuleringene ble gjennomført noen få timer etter fremstilling (tabell 2). Utbytte av innkapslet cytosin arabinosid og morfin var akseptabelt, og de frie (supernatant) konsentrasjoner av cytosin arabinosid og morfin var lave for både trikaprylin- og trikaprinformuleringene.

1. Lagrings-frigjøringsprofiler

Suspensjonene ble lagret ved 2-8, 25, 32 eller 37°C. Ved tidspunktene 24, 48 og 2001 ble suspensjonene sentrifugert ved 25.000 x g i 2 min, og supernatant-løsningene ble analysert for innhold av cytosin arabinosid eller morfin ved 1:1 volumfortynning med 50% isopropylalkohol, vortexing, inkubering ved 37°C i 10 min og sentrifugering. Supernatantprøvene ble analysert ved fortynning i 0,1 N HCI, og konsentrasjonen av cytosin arabinosid ble målt ved absorbans bestemt ved 280 nm, eller fortynning i 0,1 N NaOH, og morfinkonsentrasjonen ble målt ved absorbans bestemt ved 298 nm.

Resultatene av disse lagringstemperatur-effektstudier er vist i fig. 19A-D. Fri-gjøringshastigheter fra MVL inneholdende trikaprylin (smeltepunkt 8°C) er svært langsomme ved 2-8°C. Frigjøringshastigheten økte med økende lagringstemperatur hvilket ville være ventet som overensstemmende med akselerasjon av frigjøringen med forhøyelse av temperaturen (fig. 19A og 19C). AraC-MVL inneholdende trikaprin (smeltepunkt 31 °C) frigjorde imidlertid det aktive middel ved en svært høy hastighet ved lagring under smeltepunktet av triglyseridet. Med lagring av trikaprin MVL ved høyere temperaturer 25° og 32°, gikk frigjøringshastigheten ned, men økte igjen med lagring ved 37° (fig. 19B). I trikaprinholdige AraC-MVL partikler lagret under smeltepunkttemperaturen for det nøytrale lipid trikaprin (31 °C), ble i virkelig-heten fullstendig destabilisert, og frigjorde det innkapslede morfin i løpet av noen få timer (fig. 19B).

Resultatene av lagringsstudien av cytosin arabinosidholdige MVL er vist i fig. 20 ved et Arrhenius-diagram. Trikaprylin MVL-formuleringen hadde et uventet kontinuerlig lineært forhold når log av frigjøringshastigheten blir avsatt mot temperaturen, hvilket antyder at en enkelt prosess er ansvarlig for frigjøringen. På den annen side var diagrammet av data for trikaprylinformuleringen diskontinuerlig, hvilket indikerer at to prosesser er ansvarlige for frigjøringen i det studerte temperaturområdet. Ved høyere temperaturer over frysepunktet for trikaprin var helningen som ventet, dvs at hastigheten økte med øket lagringstemperatur. Den andre prosess, smeltepunkteffekten, blir observert under frysepunktet av trikaprin, hvori den tilsynelatende hastighet økte med avtagende temperatur.

Sammenligning av frigjøringshastighetsprofilene (19A-D) av partikler med cytosin arabinosid innkapslet som en første komponent i vandig fase med partikler som har innkapslet morfinsulfat, indikerer igjen at starten av den destabiliserende effekt forårsaket ved lagring av formuleringer under smeltepunktet av det nøytrale lipid, heri kalt "smeltepunkteffekten" er avhengig av sammensetningen av den første løsning i vandig fase. Starten av smeltepunkteffekten av trikaprin MVL under lagring ble observert å være hurtig med cytosin arabinosidholdige formuleringer, (fig. 19B), men krevde flere dager for de morfinsulfatholdige formuleringer (fig. 19D). Resultatene av disse studier antyder videre at jo lengre under frysepunktet formuleringene blir lagret, jo hurtigere er starten av smeltepunkteffekten.

Eksempel 15

I dette eksemplet inneholdt den vandige fase sukrose, cytosin arabinosid og 0. 1 N HCI som osmotisk spacer. MVL ble fremstilt med triolein (smp 8°C), trikaprin (smp 31 °C) eller trilaurin (smp 46°C) som det nøytrale lipid. Det endelige produkt ble lagret ved en temperatur på 2-8°C, 22 eller 37°C, og frigjøringen av innkapslede materialer ble registrert under lagringstiden.

1. Fremstilling

For fremstilling av MVL som innkapsler cytosin arabinosid med sukrose som osmotisk spacer i nærvær av 0,1 N HCI, inneholdt lipid kombinasjonsløsningen (pr liter) 10,4 g DOPC, 2,1 g DPPG, 7,7 g kolesterol og triglyseridkomponenten var enten 1,1 g trikaprin (C10), 1,3 g trilaurin (C12) eller 1,7 g triolein (molforhold på DOPC:DPPG:kolesterol:triglyserid var 0,34:0,07:0,52:0,06.

Den første løsning i vandig fase inneholdt (pr ml) 20 mg cytosin arabinosid og 51,3 mg sukrose i 0,1 N HCI. En første emulsjon ble laget ved høyhastighets-blanding av 3 ml av lipid kombinasjonsløsning med 3 ml av løsning i vandig fase ved 9000 opm i 8 min ved 25-27°C. Emulsjonen ble skåret til mikrosmådråper (sfæruler) ved tilsetning av 20 ml av en 20 med mer lysin, 4% glukoseløsning til blandekaret, og blanding ved 5000 opm i 1,5 min. Kloroformen ble fjernet fra de mikroskopiske smådråper eller sfæruler ved overføring av suspensjonen til en kolbe inneholdende 70 ml av en 40 med mer lysin, 3,2% glukoseløsning, plassering av kolben i et 37°C gyroroterende vannbad, og spyling av overflaten av suspensjonen med nitrogengass ved en strømningshastighet på 70 cfh i 20 min under dannelse av MVL-partiklene i suspensjonen.

Suspensjonene ble fortynnet 1:4 etter volum med normal saltløsning, og partiklene ble høstet ved sentrifugering ved 800 x g i 10 min ved romtemperatur. Supernatantløsningen ble fjernet ved avsug, og partiklene ble vasket to ganger ved resuspensjon i frisk, normal saltløsning og sentrifugering. Det endelig vaskede produkt ble resuspendert ved 25% pakket partikkelvolum pr totalvolum, og lagret ved 2-8°C, 22 og 37°C i 1 eller 6 dager (data ikke vist). Suspensjonen og supernatantfraksjonen oppnådd ved sentrifugering ved 25.000 x g i 2 min ble analysert for innhold av cytosin arabinosid ved 1:1 volum fortynning med 50% isopropylalkohol, vortexing, inkubering ved 37°C i 10 min og sentrifugering. Deretter ble 0,06 eller 0,2 ml av prøven tilsatt til 1,0 ml av 0,1 N HCI, og cytosin arabinosidkonsentrasjonen ble målt ved absorbans bestemt ved 280 nm.

Som vist ved data i tabell 3 var produktutbyttet av MVL formulert ved anvendelse av hvert av de nøytrale lipider minst 3,0 mg/ml, et akseptabelt utbytte. Inspeksjon av partiklene med hvit lysmikroskopi viste at partiklene var sfæriske og mulitvesikulert i utseende umiddelbart etter fremstilling. I løpet av 241 lagring ved temperaturer under smeltepunktet av triglyseridet forandret imidlertid partiklene utseende. Samtidig med forandringen i utseende var det et signifikant tap av det innkapslede AraC til lagringsløsningen (supernatant) som det kan sees ut i fra data i kolonne 3 i tabell 3. Det er bemerkelsesverdig at formuleringen fremstilt med trikaprin (smp 31 °C) ikke forandret sitt utseende, og heller ikke tapte signifikant AraC ved lagring ved 37°C; mens formuleringen med trilaurin (smp 46°C) undergikk en signifikant morfologisk forandring og tap av innkapslet aktivt middel. Ved formulering av MVL for in vivo kontrollert og forsinket avgivelse av det innkapslede aktive middel bør det utvalgte nøytrale lipid således vanligvis ha et smeltepunkt under eller nær den tilsiktede lagringstemperatur. En foretrukket formulering bør opprettholde et supernatant/total forhold på mindre enn 0,10 under lagring.

Eksempel 16

Dette eksempel illustrerer at visse løsninger i vandig fase er interaktive med lipidsjiktmembranen av MVUer og forhindrer frysing av liposomene ved lagringstemperaturer under smeltepunktet av det nøytrale lipid. I slike tilfeller kan den morfologiske forandring av partiklene og tapet av innkapslede materialer i forbindelse med lagring under smeltepunktet av det nøytrale lipid foregå svært langsomt, eller forsvinne. Isteden vil frigjøringen av innkapslede materialer foregå i forbindelse med aktivering ved økning av lagringstemperaturen.

1. Fremstilling

For fremstilling av MVL for innkapsling av rhu IGF med <14>C-sukrose som osmotisk spacer og ammoniumcitrat som buffer, inneholdt lipid kombinasjons-løsningen (pr liter) 10,4 g DOPC, 2,1 g DPPG, 7,7 g kolesterol og triglyseridkomponenten var 1,3 g trikaprin (smp 31 °C, C10) (med et molforhold av DPOC:DPPG:kolesterol:triglyserid på 0,34:0,07:0,52:0,06).

Den første løsning i vandig fase inneholdt (pr ml) 16 mg rhu IGF-1 (Chiron, Foster City, CA), 7% <14>C-sukrose og 20 med mer ammoniumcitrat, pH 5. En første emulsjon ble laget ved høyhastighetsblanding av 5 ml av lipid kombinasjonsløsning med 5 ml løsning i vandig fase ved 9000 opm i 9 min ved 25-27°C. Emulsjonen ble skåret til mikrosmådråper (sfæruler) ved tilsetning av 30 ml av en 40 med mer lysin, 4% glukoseløsning til blandebeholderen og blanding ved 6000 opm i 1 min. Kloroformen ble fjernet fra de mikroskopiske smådråper eller sfæruler ved overføring av suspensjonen til en kolbe inneholdende 70 ml av 40 med mer lysin, 3,2% glukose-løsning, plassering av kolben i et gyroroterende vannbad ved 37°C, og spyling av overflaten av suspensjonen med nitrogengass ved en strømningshastighet på 70 cfh i 20 min for å oppnå MVL-partiklene.

Suspensjonene ble fortynnet 1:4 med normal saltløsning, og partiklene ble høstet ved sentrifugering ved 800 x g i 10 min ved romtemperatur. Supernatant-løsningen ble fjernet ved avsug, og partiklene ble vasket to ganger ved resuspensjon i frisk, normal saltløsning og sentrifugering.

2. In vitro frigjøringshastigheter

Det endelige vaskede produkt ble resuspendert ved 25% pakket partikkelvolum pr total volum og lagret ved temperaturer på 2-8, 25, 32 og 37°C i 24 eller 48 t. Pelleten og supernatantfraksjonen fra sentrifugeringen ved 25.000 x g i 2 min ble analysert for innhold av IGF-1 (bare pelletfraksjonen) og <14>C-sukrose.

Resultatene av disse studier sammenfattet i tabell 4 viser at innholdet av den første løsning i vandig fase kan forhindre eller nedsette den fryseeffekt som ble vist i eksempel 16 å være assosiert med lagring av MVUer inneholdende trilaurin som det nøytrale lipid ved en temperatur under dets smeltepunkt ved 46°C. De anvendte lipider og fremgangsmåten for fremstilling var identiske i begge formuleringer; komponentene innkapslet i vandig fase var imidlertid forskjellige. Dette antyder at sammensetningen av den første vandige fase kan modulere enten frysepunktet av triglyseridet eller smeltepunkteffekten, f.eks ved å forhindre det nøytrale lipid fra å gå over til en ustabil struktur eller markert forsinke frysingen.

Frigjøringen i plasma av de trikaprin- og trilaurinholdige MVL-formuleringer (vist i eksempel 16) var markert langsommere enn fra MVL fremstilt med trikaprylin, som vist i tabell 4 og i senere eksempler. Det skal bemerkes at alle plasma frigjør-ingsanalysene gjennomført ved 37°C ble startet i løpet av 241 etter fremstilling. Lagringen ved 2-8°C i lengre enn noen få dager av trilaurin, men ikke de trikaprinholdige formuleringer, resulterte i morfologisk forandring i utseende av partiklene og frigjøring av innkapslede materialer i overensstemmelse med "smeltepunkteffekten".

Eksempel 17

Andre nøytrale lipider

En studieserie ble gjennomført hvori de nøytrale lipider var dekan, dodekan, skvalen og alfatokoferol for å bestemme omfanget av nøytrale lipider som kan anvendes for å oppnå multivesikulære liposomformuleringer.

1. Fremstilling

Det ble laget multivesikulære liposomer som innkapsler en kombinasjon av glysin, sukrose og tris-EDTA og hvori lipidkombinasjonsløsningen inneholdt (pr liter) 10,4 DOPC, 2,1 g DPPG, 7,7 g kolesterol og trioleinkomponenten (6 mol% av lipid) var erstattet med enten dekan, dodekan, skvalen eller alfatokoferol (molforhold av DOPC:DPPG:kolesterol:nøytralt lipid var 0,34:0,07:0,52:0,06).

Den første løsning i vandig fase inneholdt 200 med mer glysin, 50 med mer sukrose, 1,8 med mer tris base og 0,5 med mer EDTA, pH 7,44, med en osmolaritet på 268 mOsmol. En første emulsjon ble laget ved høyhastighetsblanding av 3 ml lipid kombinasjonsløsning med 3 ml løsning i vandig fase ved 9000 opm i 9 min ved 25-27°C. Emulsjonen ble skåret til mikrosmådråper (sfæruler) ved tilsetning av 20 ml av en 20 med mer lysin, 4% glukoseløsning til blandekaret og blanding ved 4000 opm i 1,0 min.

Undersøkelse av sfærulsuspensjonen under mikroskopet indikerte at sfærulene fremstilt med hvert av disse nøytrale lipider var normale i indre utseende sammenlignet med kontroller fremstilt med triolein, tripalmitolein eller trimyristolein som den nøytrale lipidkomponent.

Kloroformen ble fjernet fra de mikroskopiske smådråper eller sfæruler ved overføring av suspensjonen til en kolbe inneholdende 30 ml av en 40 med mer lysin, 3,2% glukoseløsning, plassering av kolben i 37°C gyroroterende vannbad, og spyling av overflaten av suspensjonen med nitrogengass ved en strømningshastighet på 70 cfh i 20 min for å oppnå MVL-partiklene.

Bare MVL fremstilt med skvalen som det nøytrale lipid overlevet løsnings-middel fjerningstrinnet eller påfølgende vasking av partiklene, og ga opphav til normalt utseende MVL-partikler etter vasketrinnet. Under løsningsmiddel fjerningstrinnet begynt dekan, dodekan og alfatokoferolsfærulene å krympe, samtidig som fliker av lysbrytende materiale kom frem fra deres overflate. Partiklene falt brått sammen til en takket struktur. I noen tilfeller ble det gjenvunnet en pellet, selv om den var liten sammenlignet med kontrollene, fra vasketrinnet, og partiklene hadde ikke utseendet til multivesikulære liposomblandinger.

Claims

1. Fremgangsmåte for modifisering av frigjøringshastigheten av en biologisk aktiv forbindelse innkapslet i et multivesikulært liposom som har en nøytral lipid-komponent, karakterisert ved at den omfatter: (1) dannelse av en emulsjon fra a) en lipidkomponent omfattende et organisk løsningmiddel, et amfipatisk lipid og en nøytral lipidkomponent omfattende et nøytralt lipid med langsom frigjøringshastighet og et nøytralt lipid med hurtig frigjørings-hastighet og b) en ikke-blandbar første vandig komponent hvori minst én biologisk aktiv forbindelse er inkorporert i enten lipidkomponenten eller den første vandige komponent eller begge;

hvor det nøytrale lipidet med hurtig frigjøring er valgt fra gruppen bestående av trikaprylin, trikaproin og blandinger derav, triglycerider med monoumettede fettsyreester-grupper inneholdende fra 6 til 8 karbonatomer i acylkjeden, triglycerider med en mettet fettsyreester inneholdende fra 6 til 8 karbonatomer i acylkjeden, blandet kjede C6 til C8 triglycerider, propylenglykol diestere med åtte eller ti karbonacylgrupper, kolesterol oleat og kolesterol oktanat; (2) blanding av emulsjonen med en andre vandig komponent under dannelse av løsningsmiddelsfæruler, og (3) fjerning av det organiske løsningsmiddel fra løsningsmiddelsfærulene under dannelse av multivesikulære liposomer som innkapsler den biologisk aktive forbindelse;

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at molforholdet av den nøytrale lipidkomponent til alle lipidene i liposomet er i området fra 0,01 til 0,21.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det nøytrale lipid med langsom frigjøring er valgt fra gruppen bestående av triglyserider med en monoumettet fettsyreester inneholdende fra 14 til 18 karbonatomer i acylkjeden, de som har en mettet fettsyreester inneholdende fra 10 til 12 karbonatomer i acylkjeden og blandinger derav eller at det nøytrale lipid med hurtig frigjøring er valgt fra gruppen bestående av triglyserider med en monoumettet fettsyreester inne-holdende fra 6 til 8 karbonatomer i acylkjeden.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at molforholdet av det nøytrale lipid med langsom frigjøring til det nøytrale lipid med hurtig frigjøring er i området fra 1:1 til 1:100.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det nøytrale lipid med langsom frigjøring er valgt fra gruppen bestående triolein, tripalmitolein, trimyristolein, trilaurin, trikaprin og blandinger derav.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det nøytrale lipid med langsom frigjøring er tripalmitolein, triolein eller trikaprin.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det nøytrale lipid med hurtig frigjøring er valgt fra gruppen bestående av triglyserider med en mettet fettsyreester inneholdende fra 6 til 8 karbonatomer i acylkjeden, trikaprylin, trikaprin og blandinger derav eller at det nøytrale lipid med hurtig frigjøring er trikaprylin eller en blanding av trikaprylin og trikaproin.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det nøytrale lipid med langsom frigjøring er valgt fra gruppen bestående av C8, C10 blandede acylpropylenglykoldiestere og kolesterolestere og at det nøytrale lipid med hurtig frigjøring er trikaprylin eller trikaproin.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det amfipatiske lipid er valgt fra gruppen bestående av 1,2-dioleoyl-sn-glysero-3-fosfokolin (DOPC), 1,2-distearoyl-sn-glysero-3-fosfokolin (DSPC) og 1,2-dierukoyl-sn-glysero-3-fosfokolin (DEPC) og det nøytrale lipid med langsom frigjøring er triolein eller tripalmitolein.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det nøytrale lipid med hurtig frigjøring er trikaprylin.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at molforholdet mellom det nøytrale lipid med langsom frigjøring og det nøytrale lipid med hurtig frigjøring er valgt i området fra 1:1 til 1:54 eller at molforholdet av den nøytrale lipid-komponent til alle lipidene i lipidkomponenten er i området fra 0,01 til 0,21.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det nøytrale lipid med langsom frigjøring er valgt fra gruppen bestående av triolein, tripalmitolein, trimyristolein, trilaurin, trikaprin og blandinger derav, og det nøytrale lipid med hurtig frigjøring er valgt fra gruppen bestående av trikaprylin, trikaproin og blandinger derav.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 12, karakterisert ved at molforholdet av det nøytrale lipid med langsom frigjøring til det nøytrale lipid med hurtig frigjøring er i området fra 1:1 til 1:54.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at frigjørings-hastigheten er in vivo og at det nøytrale lipid med langsom frigjøring er triolein.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det nøytrale lipid med hurtig frigjøring er trikaprylin.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det amfipatiske lipid er valgt fra gruppen bestående av

1,2-dioleoyl-sn-glysero-3-fosfokolin 1,2 dilauroyl-sn-glysero-3-fosfokolin

1,2-dimyristoyl-sn-glysero-3-fosfokolin 1,2 -dipalmitoyl-sn-glysero-3-fosfokolin

1,2-distearoyl-sn-glysero-3-fosfokolin

1,2-diarakidoyl-sn-glysero-3-fosfokolin 1,2-dibehenoyl-sn-glysero-3-fosfokolin 1,2-dipalmitoleoyl-sn-glysero-3-fosfokolin 1,2-dieikosenoyl-sn-glysero-3-fosfokolin

1,2-dierukoyl-sn-glysero-3-fosfokolin 1,2-dipalmitoyl-sn-glysero-3-fosfoglyserol og 1,2-dioleoyl-sn-glysero-3-fosfoglyserol.

17. Multivesikulært liposom, karakterisert ved at det omfatter: en nøytral lipidkomponent med et nøytralt lipid med langsom frigjøring og et nøytralt lipid med hurtig frigjøring; et amfipatisk lipid; og en biologisk aktiv forbindelse innkapslet i vann i liposomet, hvor det nøytrale lipidet med langsom frigjøring er valgt fra gruppen bestående av triolein, tripalmitoelin, trimyristolein, trilaurin, trikaprin og blandinger derav, triglycerider med monoumettede fettsyreester-grupper inneholdende fra 14 til 18 karbonatomer i acylkjeden, triglycerider med mettede fettsyreester-grupper inneholdende fra 10 til 12 karbonatomer i acylkjeden og blandinger derav, kolesterolester, kolesterol oleat og estere av propylenglykol; og hvor det nøytrale lipidet med hurtig frigjøring er valgt fra gruppen bestående av trikaprylin, trikaproin og blandinger derav, triglycerider med monoumettede fettsyreester-grupper inneholdende fra 6 til 8 karbonatomer i acylkjeden, triglycerider med en mettet fettsyreester inneholdende fra 6 til 8 karbonatomer i acylkjeden, blandet kjede C6 til C8 triglycerider, propylenglykol diestere med åtte eller ti karbonacylgrupper, kolesterol oleat og kolesterol oktanat.

18. Liposom ifølge krav 17, karakterisert ved at smeltepunktet av den nøytrale lipidkomponent er omkring eller under 37°C.

19. Liposom ifølge krav 17, karakterisert ved at nøytrale lipid med langsom frigjøring er valgt fra gruppen bestående av triglyserider med en monoumettet fettsyreester med fra 14 til 18 karbonatomer i acylkjeden, de som har en mettet fettsyreester med fra 10 til 12 karbonatomer i acylkjeden, og blandinger derav eller fra gruppen bestående av triolein, tripalmitolein, trimyristolein, trilaurin, trikaprin og blandinger derav, og at det nøytrale lipid med hurtig frigjøring er valgt fra gruppen bestående av trikaprylin, trikaproin og blandinger derav.

20. Liposom ifølge krav 17, karakterisert ved at det nøytrale lipid med hurtig frigjøring er valgt fra gruppen bestående av triglyserider med en mettet fettsyreester med fra ca 6 til 8 karbonatomer i acylkjeden eller fra gruppen bestående av trikaprylin og trikaproin, og blandinger derav.

21. Liposom ifølge krav 17, karakterisert ved at molforholdet av den nøytrale lipidkomponent til alle lipidene i liposomet er i området fra 0,01 til 0,21.

22. Liposom ifølge krav 17, karakterisert ved at molforholdet av det nøytrale lipid med langsom frigjøring til det nøytrale lipid med hurtig frigjøring er i området fra 1:1 til 1:27.

23. Anvendelse av liposom ifølge krav 17 for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for administrering av en biologisk aktiv forbindelse ved en ønsket frigjøringshastighet til et individ med behov for den biologisk aktive forbindelse innkapslet deri.

24. Liposom ifølge krav 17, karakterisert ved at det molare forholdet mellom det nøytrale lipid med langsom frigjøring og det nøytrale lipid med hurtig frigjøring er i område 1:1 til 1:100.