JP3973646B2

JP3973646B2 - 多重小胞リポソームからのｉｎｖｉｖｏ放出を改変するための中性脂質の利用方法

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Publication number: JP3973646B2
Application number: JP2004167412A
Authority: JP
Inventors: ウィリス，ランドール，シー．
Original assignee: スカイファーマインコーポレーテッド
Priority date: 1997-01-31
Filing date: 2004-06-04
Publication date: 2007-09-12
Anticipated expiration: 2018-01-29
Also published as: CA2277956C; EP2322143B1; AU731038B2; CA2851502C; EP2322143A1; EP0971699A4; JP3940177B2; NO993635D0; US5962016A; NO993635L; NO333827B1; CA2277956A1; CA2851502A1; AU6317898A; US5891467A; CA2692302C; IL131012A0; JP2004262946A; EP0971699B1; NZ336843A

Description

発明の背景
本発明は、薬物などの化合物のリポソーム製剤に関する。さらに特定すると、本発明は、リポソーム製剤中の中性脂質を選択することで、封入した化合物の多重小胞リポソーム(multivesicular liposome: MVL)からのin vivo放出速度を改変する方法に関する。

リン脂質や他の多くの両親媒性脂質を水性媒質中に穏やかに分散させると、それらは膨潤し、水和して、自然発生的に、水性媒質の層と脂質二重層とが分離している同心円状の多重ラメラ二重層小胞を形成する。こうした系は一般的に多重ラメラリポソームまたは多重ラメラ小胞(MLV)と呼ばれており、通常その直径は0.2〜５μmである。MLVを超音波にあてると、水溶液を含有する単一の脂質二重層により囲まれた、通常直径が20〜100nmの範囲にある小さな単ラメラ小胞(SUV)が形成される。多重小胞リポソームは、それらがリポソーム内部の水溶液含有チャンバーのランダムな非同心円状配置で製造され、かつMVLを形成するのに必要な中性脂質を含有するという点で、MLVやSUVと相違している。

上述した単ラメラ、多重ラメラおよび多重小胞リポソームを含めて、リポソーム製剤においては、多年にわたり、鎖長、飽和度およびヘッド基を異にする様々なタイプの脂質が使用されてきている。多重小胞リポソームの製造に用いられる中性脂質はこれまで主にトリオレインとトリカプリリンに限られていた。

当分野の主な目標の一つは、薬物や他の活性物質のin vivo放出を制御するためのリポソーム製剤を開発することである。いくつかの薬物は、リポソームデポー製剤を配置したとき、かなり急速に放出される必要があり、また他の薬物は持続した時間にわたって比較的遅い放出速度を必要とする。これまで、リポソーム製剤からの生物活性化合物の放出速度は、容認された膜生成脂質である両親媒性脂質の選択により、またはリン脂質／コレステロールのモル比の操作により変更されてきた。あるいはまた、封入した生物活性化合物の放出速度の変更を容易にするために、封入用の水溶液中にオスモラリティースペーサー(osmolality spacer)または酸のような化合物を添加してきた。

リポソーム製剤からの放出速度の制御は、タンパク質のような多くの生物活性物質が十分な活性を維持するために低温すなわち約４℃で保存する必要があるという事実により複雑なものとなる。残念ながら、生体温度で優れた放出速度を示すいくつかのリポソーム製剤はこうした保存温度でむしろ急速に崩壊してしまう。

したがって、封入された活性化合物の放出速度に対する制御を最大化し、同時に約４℃、例えば２〜10℃の保存温度で長期間にわたり貯蔵寿命安定性を示すリポソーム製剤を選択するためのより良い方法の必要性が存在している。

発明の概要
一般的に、本発明は、多重小胞リポソーム製剤において徐放性中性脂質と速放性中性脂質の所定のモル比を有する中性脂質成分を使用することにより、前記製剤中に封入される薬物などの生物活性化合物の放出速度を改変する方法を特徴とし、その際、生物活性化合物の放出速度を速めるために、前記モル比における速放性中性脂質の比率を高めるようにするものである。あるいはまた、生物活性化合物の放出速度を遅らせるために、前記モル比における徐放性中性脂質の比率を高めてもよい。一般に、遅延：高速中性脂質のモル比は約１：１〜０：１、例えば１：４〜１：100、または１：４〜１：27の範囲であり、総脂質成分（リポソーム中の全脂質）に対する中性脂質成分のモル比は約0.01〜約0.21の範囲である。

in vivo放出速度を改変するために、中性脂質成分の融点は、その製剤を使用すべき体内温度以下で、かつ、その製剤を保存すべき温度以下であることが好ましい。

本発明の新規方法において有用な徐放性中性脂質は、例えば、トリオレイン、トリパルミトレイン、トリミリストレイン、トリラウリンおよびトリカプリンであり、トリオレインが最も好ましいものである。有用な速放性中性脂質としては、例えばトリカプリリン、トリカプロインおよびこれらの混合物がある。しかし、トリカプロインと他の同様の脂質がin vivo使用を目的とした多重小胞リポソーム製剤中の唯一の中性脂質として通常用いられることはない。

別の実施形態において、本発明は、徐放性中性脂質：速放性中性脂質のモル比が約１：１〜１：100、例えば約１：３〜１：54、１：４〜１：27、または約１：４〜１：18である中性脂質成分を含有する多重小胞リポソーム製剤内に治療上有効な量の生物活性化合物を封入させてなるリポソーム組成物を提供する。

さらに他の実施形態において、本発明は、活性化合物の所望のin vitro放出速度プロフィールおよび／または所望のin vivo治療放出速度を得るように、所定の生物活性化合物を封入するための多重小胞リポソーム製剤を選択する方法を特徴とする。本発明のこの実施形態では、所定の生物活性化合物を封入するMVL製剤のファミリーが作製され、その場合、前記ファミリーの各メンバーは異なる遅延：高速中性脂質モル比（一般的には１：０〜０：１の範囲）を有する中性脂質成分を利用する。例えば、遅延：高速中性脂質モル比１：０、１：１、１：４、１：18、１：27、１：100、０：１を用いた前記製剤のファミリーを作製することができる。前記製剤のファミリーの各メンバーは、所望の放出速度を得ようとする媒質中で、すなわち、保存温度の保存媒質中か、またはヒト血漿、血漿に類似した媒質もしくは生物活性物質を放出すべき生理学的媒質、例えば体温の脳脊髄液(CSF)中でインキュベートされる。この手段により、各製剤についての放出速度プロフィールが得られる。その後、所定の生物活性物質のための所望の条件下で希望する放出速度プロフィールをもたらす遅延：高速中性脂質モル比を有する製剤が選択される。

ほかで特に定義しないかぎり、本明細書中で用いる技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者により通常理解される意味と同じ意味を有するものである。本発明の実施または試験には、本明細書中に記載した方法および材料と同様のまたは均等の方法および材料を使用することができるが、好適な方法および材料を以下に記載する。本明細書中に記載した全ての刊行物、特許出願、特許および他の文献はその全体を参照によりここに含めるものとする。コンフリクトの場合には、定義を含めた本明細書が優先するだろう。さらに、材料、方法および実施例は単なる例示であって、本発明を制限するものではない。

本発明の実施により、保存条件での徐放の望みを捨てることなく、in vivoで比較的急速な放出を示す多重小胞リポソーム製剤を選択できるという利点が得られる。したがって、本発明の方法は、前記製剤が保存条件で徐放を示すという理想をまげずに、MVLの製造において用いる中性脂質成分の選択を介して所望の放出速度を得るための論理的根拠を提供する。さらに、in vivo条件下での放出速度に対する制御が働くが、これは、多かれ少なかれ、封入される水相の組成または製剤の他の脂質の組合せとは無関係に行われる。

この知見は多重小胞リポソームに特有のものである。というのは、他のタイプのリポソームは脂質成分中に中性脂質を含まず、かつ/ また、密に詰め込まれた非同心円状の小胞中に中性脂質を配合することはないからである。

本発明の他の特徴および利点は以下の詳細な説明および請求の範囲から明らかになろう。

発明の詳細な説明
多重小胞リポソーム(MVL)を製造するのに用いる中性脂質または中性脂質の組み合わせを選択することによって多重小胞リポソーム製剤中に封入された生物学的に活性な化合物（例えば薬物）の放出速度を改変する方法が提供される。

リポソームには少なくとも３つの種類がある。本明細書および請求の範囲に用いる「多重小胞リポソーム(MVL)」という用語は、人工の、特に多数の非同心円状の水性チャンバー(chamber)を封じ込めた脂質膜から構成された1-200 μmの粒子を意味する。対照的に、「多重ラメラリポソームまたは小胞(MLV)」は、多数の「タマネギの皮」のような同心円状膜を有しており、この膜と膜の間には貝殻に似た同心円状の水性コンパートメントが存在する。多重ラメラリポソームは特徴的には通常0.5から25μmの平均直径を有する。本明細書中に用いる「単ラメラリポソームまたは小胞(ULV)」という用語は、通常平均直径範囲が20から500 nmである単一の水性チャンバーを有するリポソーム構造をさす。

多重ラメラおよび単ラメラリポソームは幾つかの比較的単純な方法によって作製することができる。先行技術はULVおよびMLVを作製するための多数の技法を記述している（例えば、Lenkの米国特許第4,522,803号; Baldeschweilerの米国特許第4,310,506号; Papahadjopoulosの米国特許第4,235,871号; Schneider の米国特許第4,224,179号; Papahadjopoulosの米国特許第4,078,052号; Taylorの米国特許第4,394,372号; Marchettiの米国特許第4,308,166号; Mezeiの米国特許第4,485,054号; およびRedziniakの米国特許第4,508,703号参照）。

対照的に、多重小胞リポソームの作製は幾つかのプロセス工程を必要とする。簡単に述べるとMVLの好ましい作製方法は以下の通りである。第１工程は「油中水型」エマルジョンの調製である。これは、脂質成分のための１以上の揮発性有機溶剤に溶解した少なくとも１つの両親媒性脂質および少なくとも１つの中性脂質からなる脂質成分中に、非混和性の第１水性成分および封入されるべき生物学的に活性な物質を捕獲し、そして場合により、封入された生物学的に活性な物質のMVLからの放出速度を調節するために脂質成分および第１の水性成分のどちらか又は両方に酸または他の賦形剤を添加することによって行なわれる。得られた混合物を乳化し、次に第２の非混和性水性成分と混合して第２エマルジョンを形成する。第２エマルジョン形成のために必要な乱れ(turbulence)を超音波エネルギー、ノズル噴霧化等によって、またはそれらの組み合わせによって機械的に供給し、第２水性成分中に懸濁された溶剤小球体を形成する。この溶剤小球体は、封入されるべき物質が溶解されている多数の水性小滴を含んでいる(Kimら，Biochem. Biophys. Acta, 728:339-348, 1983)。ULVおよびMLVの種々の調製方法に関する総論としては、Szokaら，Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:465-508, 1980を参照されたい。

本明細書および請求の範囲に用いる「溶剤小球体」という用語は、内部に多数のより小さい水溶液の小滴を含んだ、有機溶剤の微細な回転楕円面状の小滴を意味する。この溶剤小球体は、第２の水性溶液中に懸濁され、完全に浸漬している。

「中性脂質」という用語は、それ自身では膜形成能をもたず、かつ親水性「ヘッド(head）」基を欠く油または脂肪を意味する。

「両親媒性脂質」という用語は、親水性「ヘッド」基および疎水性「テイル(tail）」基を有し、かつ膜形成能を有する分子を意味する。

「双性イオン性脂質」という用語は、pH 7.4において実効電荷(net charge)がゼロ(0)である両親媒性脂質を意味する。

「アニオン性脂質」という用語は、pH 7.4において負の実効電荷を有する両親媒性脂質を意味する。

「カチオン性脂質」という用語は、pH 7.4において正の実効電荷を有する両親媒性脂質を意味する。

本明細書に用いるリポソーム製剤の「保存寿命(shelf-life)」とは、ある保存温度、例えば4 ℃における、保存溶液、例えば生理食塩水(0.9% 塩化ナトリウム）中にあるリポソーム製剤からの封入された物質の放出速度に関連している。

一般に、多重小胞リポソームを作製するためには、少なくとも、１つの両親媒性脂質および１つの中性脂質が脂質成分中に含まれている必要がある。両親媒性脂質は双性イオン性、アニオン性またはカチオン性脂質であることができる。双性イオン性両親媒性脂質の例は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、等である。アニオン性両親媒性脂質の例は、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、等である。カチオン性両親媒性脂質の例は、ジアシルトリメチルアンモニウムプロパンおよびエチルホスファチジルコリンである。中性脂質の例は、トリオレインおよびトリパルミトレイン、トリミリストレインおよびトリカプリリンである。新しい方法においては、多重小胞リポソームの製造に際して、そこでMVLが使用されるべき特定種類の流体において所望の放出速度をもたらす中性脂質成分を用いることによって、生物学的に活性な物質の放出速度が改変される。したがってin vivoでの使用のためには、MVLの放出速度を血漿中または血漿に類似した媒質中で測定しなければならない。なぜなら、ある種の中性脂質については、放出が生理食塩水中になされるか又は血漿中になされるかによって、MVLからの生物学的に活性な化合物の放出速度が大幅に違いうるからである。

本明細書に用いる「中性脂質成分」という用語は、多重小胞リポソームの製造に用いられる中性脂質、または中性脂質の混合物を意味する。

本明細書に用いる「血漿に類似した媒質」という用語は、生理食塩水に加えて、血漿のタンパク質もしくは脂質構成成分、または他の生物学的流体（例えば、脳脊髄液(CSF)もしくは間質液、等）の成分の少なくとも幾つかを含む合成溶液を意味する。例えば、クエン酸添加ヒト血漿またはウシ血清アルブミン(BSA)を含有する生理食塩水は本明細書に用いる「血漿に類似した媒質」の１例である。

「in vivo条件」という用語は、生体内にMVLを実際に注入または配置することを意味し、また血漿または血漿に類似した媒質中でのMVLの身体温度（ヒトの場合37℃）でのいわゆる「ex vivo」インキュベーションを含む。

中性脂質成分は単一の中性脂質からなることができるが、一般に中性脂質成分はモル比が約1:1から1:100の範囲（例えば、約1:4から1:18) にある徐放性(slow release)中性脂質および速放性(rapid release)中性脂質の混合物からなり、ここで生物学的に活性な化合物の放出速度は、速放性脂質に対する徐放性脂質の比が増大するのに比例して低下する。便宜上、速放性脂質に対する徐放性脂質のモル比を本明細書では「徐放性：速放性中性脂質モル比」という。

本発明の実施に用いる「徐放性中性脂質」は、アシル鎖に約14から18個の炭素原子を含むモノ不飽和脂肪酸エステル部分を有する、分子量がおおむね約725から885であるトリグリセリド；アシル鎖に約10から12個の炭素原子を含む飽和脂肪酸エステル部分を有する、分子量がおおむね約725から885であるトリグリセリド；およびそれらの混合物から選択することができる。コレステロールオレエート等のコレステロールエステルおよびプロピレングリコールのエステル。本発明の方法に使用するのに好ましい徐放性中性脂質は、トリオレイン、トリパルミトレイン、トリミリストレイン、トリラウリンおよびトリカプリンであり、最も好ましくはトリオレインまたはトリパルミトレインである。in vivoでの使用を考える場合は、トリラウリン（融点46.5℃）および融点が37℃以上の他の中性脂質が、他の１以上の中性脂質と混合した形でのみ本発明の実施において一般に使用される。ここで、上記混合物は37℃またはそれより低い、好ましくは37℃より低い融点を有する。当業者はトリグリセリド混合物等の脂質混合物の融点の測定法を知っているであろう。

本発明の実施に用いられる「速放性中性脂質」は、アシル鎖に約６から８個の炭素原子を含むモノ不飽和脂肪酸エステル部分を有する、分子量が約387から471であるトリグリセリド、およびそれらの混合物から選択することができる。しかし、驚くべきことに、炭素数が６以下のアシル鎖を有する１以上の中性脂質を含む中性脂質成分をMVLに用いると（特に唯一の中性脂質としてトリカプロインを用いると）、in vivo環境に接触した後に封入された化合物の迅速な放出をもたらすことが見いだされた。したがって炭素数が６以下のアシル鎖を有する中性脂質は、必ずより長鎖のアシル部分を有する１以上の中性脂質と組み合わせて使用しなければならない。好ましい速放性中性脂質はトリカプリリン；トリカプリリンとトリカプロインの混合物；または炭素数が６から８の混合鎖トリグリセリドである。炭素数が８または10のアシル部分を有するプロピレングリコールジエステル、コレステロールオレエートおよびコレステロールオクタノエートもまた中性脂質として用いることができる。

中性脂質のモル比と同等の重要性を有する因子は、MVLが保存および／または使用される温度を下回る融点を有する中性脂質成分の選択である。治療的用途に非常に望ましい多数の生物学的に活性な化合物は急速な劣化を防ぐために低い保存温度を必要とするので、中性脂質成分は所望の保存温度を下回るとともにMVL製剤がin vivoで使用される際の温度を下回る融点をもつように選択されなければならない。

保存温度テストの結果は、粒子を顕微鏡的に検査し、また放出された封入物質の量を化学的アッセイによって測定して決定された。これらの試験に見られるように（図20）、中性脂質成分の融点を下回る温度で保存されたMVLは、ある場合には封入する内容物の急速な放出（「ダンピング(dumping)」）を伴う、膜の構造的再編成を受ける。本明細書ではこの現象を「融点効果」という。融点効果の開始までの時間は、中性脂質の組成および封入された水相の成分に依存する。ある種の封入された化合物(IL-2等）は、おそらくMVLにおける中間の「準安定」状態の形成に影響を及ぼすことによって、中性脂質の融点を下回る温度において「凝固(freezing)」の開始を何時間も又は何日も遅らせるようにMVLと相互作用するように思われる。しかし、そのように開始が遅れたMVL製剤でもやがては融点効果に特徴的な形態変遷を受ける。後述の実施例15および16は、融点を下回る温度で保存されたMVLからの封入された生物学的に活性な化合物の放出速度に及ぼす融点効果を例証する（図19A-Dおよび20）。形態変遷の２つの状態を区別するため、遅延された開始効果を本明細書では「温度効果」という。

本発明の実施にしたがって中性脂質成分を選択する時には、（保存中またはin vivo使用中における封入された活性化合物の急速な減少を阻止するため）中性脂質成分はMVLが保存されるおよび／または使用される温度と同じかそれを上回る融点をもつことが融点効果ゆえに概して好ましい。中性脂質の混合物からなる中性脂質成分の融点温度、および該中性脂質成分を含むMVLに対する融点効果の温度は、関心のある脂質混合物を調製して、この混合物が「凝固」するのが観察されるまで徐々に温度を下げていくことにより容易に決定できる。この手順を実施する１つの方法は、J.B. Rossell, Advances in Lipid Research 5: 353-408, 1967に記述されている。当業者はこの情報を得るために用いることができる他のアプローチを知っているであろう。しかし、リポソーム製剤に及ぼす融点効果は全体として、MVL中の他の脂質および第１の水性溶液中の成分によって影響されうることを覚えておかなければならない。

下記の表１に、本発明の実施に用いることができる代表的中性脂質のアシル鎖における炭素数、分子量、および融点温度を列挙する。

本発明の１つの方法においては、多重小胞リポソームの製造にあたってトリオレインもしくはトリパルミトレイン、またはそれらの混合物からなる中性脂質成分を徐放性中性脂質として用いることによって、そして速放性中性脂質に対する該徐放性中性脂質のモル比を約1:0から0:1の範囲で選択することによって、生物学的に活性な化合物の放出速度が改変される。活性化合物の放出速度は、モル比において速放性中性脂質の比率が増大するにつれて増大する。一般に、MVL製剤中の全脂質の総量に対する中性脂質成分のモル比は約0.01から約0.21である。トリオレインおよび／またはトリパルミトレインを含むこのような製剤に用いるための好ましい速放性中性脂質は、トリカプリリンである。

中性脂質成分によって部分的に寄与される融点効果に加えて、MVL中に封入される水相の特徴、特に活性化合物とMVL中の脂質との化学的相互作用もまた生物学的に活性な化合物の放出速度に影響しうる。製剤化にあたってこの付加的因子を考慮に入れるため、本発明は１つの実施形態において中性脂質成分を関心のある水相に適合させる方法を提供する。

この方法の第１工程においては、中性脂質成分が任意の特異的水相（すなわち、関心のある生物学的に活性な化合物を含む水相）にどのように作用するかを確認するため、関心のある水相を含むMVL製剤のファミリーが作製される。ここで上記製剤ファミリーの各メンバーは、ファミリーが全体としてモル比の段階的前進、例えば1:1、1:2、1:4、1:9、1:18、1:27、1:100 等を表すように、選択された徐放性および速放性中性脂質を異なる徐放性：速放性中性脂質モル比で含む。

上記ファミリーの各メンバーを血漿または血漿に類似した媒質中でin vivo温度（すなわち、ヒトの場合は37℃）で数時間または数日間別々にin vitroでインキュベートすることによって、MVL製剤ファミリーの個々のメンバーにおいて具体化された種々の徐放性：速放性中性脂質モル比に対応するin vivo放出速度を測定する。

実施例に例証する方法、または当業者に公知の他の方法のうち任意のものを用いて、水相に封入された１以上の物質のインキュベーション中に放出された累積量を幾つかの時点で漸進的に測定することができる。この測定を容易にするため、封入時に水相に放射性物質（¹⁴C スクロース等）を含ませることが可能である。しかし、放出速度をモニターし記録する対象物質として、関心のある生物学的に活性な化合物を選択することが好ましい。製剤ファミリーの各メンバーについて、放出速度情報をこの方法で得ることを推奨する。

この方法によって測定された放出速度情報から、製剤ファミリーの各メンバーについて放出曲線を示すグラフ、すなわち「放出速度プロフィール」をプロットし、各メンバーのin vivo放出特性を示すことができる。ここでグラフの縦軸は放出された、または保持された関心のある生物学的に活性な化合物の累積量を示し、横軸は放出量または保持量を測定した漸進的時点を示す。その結果、対応するファミリーの放出曲線が作製される。このファミリーの各曲線は、それが対応する徐放性：速放性中性脂質モル比の、試験した水相と共に用いた場合の放出特性を示す。

次に、熟練した医師は関心のある特定の治療用途について最も望ましい放出特性を有する製剤を選択し、活性化合物の治療的有効量がMVL製剤を投与すべき患者に送達されるように、関心のある物質（すなわち生物学的に活性な化合物）の放出に対する所望の制御を得ることができる。したがって熟練した医師は、療法中に投与される薬物または他の生物学的に活性な化合物の治療効果を最大にするように、最適期間に渡って治療上有効な投与量を送達するためのMVL製剤、特に最も有利な徐放性：速放性中性脂質モル比を有する該製剤を選択することができる。

例えば、特定の活性化合物をin vivoで比較的短期間のうちに（すなわち投与後数時間で）放出するMVL製剤の作製が望まれる場合は、血漿または血漿に類似した媒質中にin vitroで約37℃で保存した時にそのような送達特性を示す放出曲線をもたらす中性脂質成分が選択されるであろう。この状況ではモル比における速放性中性脂質の比率は比較的大きいであろう。他方、活性化合物をin vivoで比較的長期間に渡って（すなわち投与後数十時間に渡って、時には投与後200時間までも）放出するMVL製剤の作製が望まれる場合は、in vivo条件下でインキュベートした時にそのような送達特性を示す放出曲線をもたらす中性脂質成分が選択されるであろう。この場合、モル比における徐放性中性脂質の比率は比較的大きいであろう。そして、ある場合には中性脂質成分は速放性中性脂質を全く含まないであろう。

適切な期間にわたって生物学的に活性な化合物の一体性(integrity)を確実に保つために、予定される保存媒質中で、要求されるあらゆる保存温度で、製剤をインキュベートすることによって製剤の保存寿命安定性もまた測定しなければならない。便宜上、保存寿命安定性テストもまた血漿または血漿に類似した媒質中で実施することが可能であるが、所望であれば当業者は関心のある生物学的に活性な化合物に用いるための異なる適切な保存媒質（生理食塩水、等）を代わりに使うことができるであろう。多数の生物学的に活性な化合物は約２から８℃の温度範囲での保存を要するため、保存寿命安定性テストをこの範囲の温度で実施することが推奨される。

これらの方法は本出願の実施例に例証されている。例えば、実施例14（図18）に示すように、トリオレインおよびトリカプリリンの混合物を含む製剤においては、中性脂質成分を一定に保ち、かつトリカプリリンに対するトリオレインの比を漸増的(incremental)に増大させていった場合、どんどん遅くなっていく放出によって特徴付けられるMVL製剤が得られた。実施例13においては、スクロースおよびリシン-HClを封入し、かつトリパルミトレインおよびトリカプリリンの混合物を含有する製剤の段階的ファミリーを調製した。トリパルミトレインの量を一定にし、かつトリカプリリンの量を漸増的に増大させることによって、トリパルミトレイン：トリカプリリンのモル比を0:1、1:0、1:9、1:4、1:2および1:1とした製剤の段階的ファミリーを作製した。この実施例においては、中性脂質成分中のトリカプリリンの比率の各漸増的増大に対して、ますますより速い放出が得られた。

他の種類のリポソームの大半とは異なり、MVL製剤に関する正確なin vivo放出特性は、生理食塩水を用いて行なうin vitro放出試験からは予測できないことに特に注意しなければならない。例えば、アシル部分に６個の炭素原子しかもたないトリグリセリドであるトリカプロインを唯一の中性脂質として製剤化したMVLは、in vivo条件下（37℃の血漿または血清アルブミンを含む溶液中）では不安定であったが、保存条件下（２〜８℃の生理食塩水中で１週間まで）では安定であった。しかし、4:1、9:1および18:1のモル比でトリカプロイン：トリオレインを含む製剤はin vivo条件下で少なくとも4 日間は安定であって、放出速度曲線の段階的セットをもたらした（図14）。

別の実施形態において、本発明は多重小胞リポソーム製剤に封入された治療的有効量の生物学的に活性な化合物を含んでなる、リポソーム組成物を提供する。ここで該製剤は、徐放性中性脂質：速放性中性脂質のモル比が約0:1から1:0の範囲内（例えば1:1から1:100）であり、一般的には約4:1から27:1である中性脂質成分を含む。MVL製剤中の脂質の総量に対する中性脂質成分のモル比は、一般に約0.01から約0.21の範囲内である。

多重小胞リポソームの調製に用いるのに好ましい両親媒性脂質は、炭素鎖中に偶数の炭素原子を有するリン脂質である。なぜなら、そのようなリン脂質は身体中に見いだされる天然脂質であって、毒性代謝物を生じないからである。本発明の実施に用いるのに好ましい両親媒性脂質の代表的リストを以下の掲げる。本出願において特定のリン脂質を指すのに用いられる略語もあわせて記載する。
DOPCまたはDC18:1PC = 1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン
DLPCまたはDC12:0PC = 1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン
DMPCまたはDC14:0PC = 1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン
DPPCまたはDC16:0PC = 1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン
DSPCまたはDC18:0PC = 1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン
DAPCまたはDC20:0PC = 1,2-ジアラキドイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン
DBPCまたはDC22:0PC = 1,2-ジベヘノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン
DC16:1PC = 1,2-ジパルミトレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン
DC20:1PC = 1,2-ジエイコセノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン
DEPCまたはDC22:1PC = 1,2-ジエルコイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン
DPPG = 1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホグリセロール
DOPG = 1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホグリセロール

本明細書に用いる「生物学的に活性な化合物」または「生物活性化合物」という用語は、生きている生物における望ましくない既存の状態の調節または治療において所望の効果（例えば、医学的、農業的または化粧的効果）を達成するように生物学的プロセスを調節するのに有用であることが当技術分野で知られた化学的化合物を意味する。したがって、生物学的に活性な化合物は一般に薬物、医薬品、放射性同位元素、農産物および化粧品という広い種類から選択される。

本発明の方法および組成物において封入するための生物学的に活性な治療的化合物または薬剤は、抗腫瘍剤、抗感染剤、ホルモン、抗うつ薬、抗ウイルス剤、抗痛覚剤(anti-nociceptive agent)、抗不安薬および生物工学製品(biologics)を含む。

本発明の組成物および方法に用いうる抗腫瘍剤の代表的例は、メトトレキセート、タキソール、腫瘍壊死因子、クロラムブシル、インターロイキン、エトポシド、シタラビン、フルオロウラシルおよびビンブラスチンを含む。

本発明の組成物および方法に用いうる抗感染剤の代表的例は、ペンタミジン、メトロニダゾール、ペニシリン、セファレキシン、テトラサイクリンおよびクロラムフェニコールを含む。

本発明の組成物および方法に用いうる抗ウイルス剤の代表的例は、ジデオキシシチジン、ジドブジン、アシクロビル、インターフェロン、ジデオキシイノシンおよびガンシクロビルを含む。

本発明の組成物および方法に用いうる抗不安薬および鎮静薬の代表的例は、ジアゼパム等のベンゾジアゼピン；フェノバルビタール等のバルビツレート；ならびにブスピロンおよびハロペリドール等の他の化合物を含む。

本発明の組成物および方法に用いうるホルモンの代表的例は、エストラジオール、プレドニゾン、インスリン、成長ホルモン、エリトロポエチンおよびプロスタグランジンを含む。

本発明の組成物および方法に用いうる抗うつ薬の代表的例は、フルオキセチン、トラゾドン、イミプラミンおよびドキセピンを含む。

本発明の組成物および方法に用いうる抗痛覚薬の代表的例は、ヒドロモルヒネ(hydromorphine)、オキシコドン、フェンタニル、モルヒネおよびメペリシンを含む。

「生物工学製品(biologics)」という用語は、核酸（DNAおよびRNA）、タンパク質およびペプチドを包含し、そしてサイトカイン、ホルモン（下垂体ホルモン）、増殖因子、ワクチン、等の化合物を含む。特に興味深いのは、インターロイキン-2、インスリン様増殖因子1 、インターフェロン、インスリン、ヘパリン、ロイプロリド(leuprolide)、顆粒球コロニー刺激因子(GCSF)、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、腫瘍壊死因子、インヒビン、腫瘍増殖因子αおよびβ、抗ミュラー管ホルモン、カルシトニン、およびＢ型肝炎ワクチンである。

生物学的に活性な化合物は、分子複合体または生物学的に許容される塩、等の種々の形態で本発明に使用することができる。そのような塩の代表的例は、コハク酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、ホウ酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、サリチル酸塩、金属塩（例えば、アルカリまたはアルカリ土類金属塩）、アンモニウムまたはアミン塩（例えば、第４級アンモニウム塩）、等である。さらに、所望の保持および放出特性を有するが、生理学的pHまたは酵素によってin vivoで容易に加水分解される活性物質の誘導体、例えば、エステル、アミドおよびエーテル等も用いることができる。

本明細書に用いる「治療的有効量」という用語は、所望の薬理学的効果を誘導するのに必要な生物学的に活性な化合物の量を意味する。この量は特定の活性物質の有効性、各宿主の年齢、体重および応答、ならびに宿主の症状の性質および重篤性によって大幅に変わりうる。したがって、活性物質の量について臨界上限または下限はない。本発明において採用すべき治療的有効量は、当業者であれば容易に決定することができる。

種々のリポソーム製剤のうちMVLに特有であるMVL中の中性脂質成分は、MVL中に封入されている化合物が放出される速度に影響を及ぼすような様式でin vivo環境と相互作用すると考えられる。特に、アシル部分に６個未満の炭素原子を有するトリグリセリドからなる中性脂質成分を有するMVLは、実質的に血漿と接触するとき完全に脱安定化するようにin vivo環境と相互作用する。この理由により、食塩水はMVLに特徴的な薬物放出に対するin vivo環境の作用を正確に模倣するものではない。しかし、血漿または血漿に類似した媒質を用いて行なったin vitro放出試験を用いてMVL製剤のin vivo放出特性を正確に測定できる、ということが判明した。

以下の実施例は本発明を実施することができる方法を例証する。しかし、これらの実施例は説明を目的とするものであって、本発明は実施例における具体的な材料または条件に限定されるものではないことが理解されねばならない。

G-CSF含有MVL
１．製造
顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF) を含有する多重小胞リポソーム(MVL)を製造するため、脂質混合溶液は以下のものを含んでいた（クロロホルムmlあたり）: DOPC 11 mg、DPPG 2.3 mg、コレステロール8.7 mgおよびトリオレイン2.4 mg (2.7 μmol)またはトリカプリリン1.3 mg (2.7 μmol)。それぞれトリオレインおよびトリカプリリンを含有する脂質溶液を適切な容量で混合することによって、中性脂質トリオレインおよびトリカプリリンを４つの異なるモル比で含有する脂質溶液を調製した。トリオレイン：トリカプリリンのモル比は100:0、50:50、25:75、10:90および0:100であった。

MVL製剤の第１の水相溶液は、174 mMグリシン、100 mM HCl、0.001% Tween80^TMおよび100 μg/ml G-CSFを含有していた。1 mlの脂質混合物を含むバイアルにこの溶液1 mlを加え、ふたをしたバイアルをボルテックスミキサー(Scientific Products)の頭部に水平配置に固定し、最大速度(2400振動／分）で６分間振とうすることによって乳化した。

最終的エマルジョン（2 ml)を分けて、2.5 mlの3.2%グルコースおよび40 mM リシンを含む２つのバイアルに移した。ふたをしたバイアルをボルテックスミキサーの頭部に水平配置に固定し、2400 振動／分の速度で３秒間振とうすることによってエマルジョンを微細な液滴に分散させた。5 mlの3.2%グルコースおよび40 mM リシンを含むフラスコにバイアルの中身を移した。フラスコを37℃のジャイロロータリー(gyrorotary)水浴に移し、懸濁物の表面を窒素ガスで流速10-15 cfhで10分間フラッシングすることによって、上記微細な小滴または小球体からクロロホルムを除去した。封入されたG-CSFを含む、懸濁された多重小胞リポソームを得た。

この粒子懸濁物を生理食塩水で1:4に希釈し、800 x gで10分間遠心することによって粒子を回収した。吸引によって上清液を除去した。粒子を新鮮な生理食塩水に再懸濁して遠心することによって２回洗浄した。最終洗浄産物を全容量あたり25% 充填粒子容量(packed-particle volume)の割合で再懸濁し、後の試験のために2-8℃で保存した。

２．In vitro放出速度
70%クエン酸添加ヒト血漿および0.1%アジ化ナトリウムを含む食塩水中で37℃でインキュベートすることによって、上記のように調製したMVLのin vitro放出速度を測定した。G-CSFは、遠心によって回収した粒子画分を用いて、50% IPA中でサンプルを可溶化し、公知の方法を用いて高速液体クロマトグラフィーおよびUV検出によって定量することによって測定した。

図１に、G-CSFのin vitro放出速度の、多重小胞リポソームの製造に使用した中性脂質成分組成への依存を示す。トリカプリリンに対するトリオレインのモル比が増大するにつれて、多重小胞リポソームからのG-CSFの放出速度が低下した。

３．In vivo放出速度
Syrian Goldenハムスターを用いた薬力学モデルを使ってG-CSFのトリオレインおよびトリカプリリン含有MVL製剤を評価した。外因性G-CSFは好中球（顆粒球）の生成を刺激するが、これは末梢血における好中球数の増加、および対応的に末梢血における白血球数の増加について血液サンプルをアッセイすることによって評価することができる。

したがって、トリカプリリンまたはトリオレインを含む製剤を、薬力学ハムスターモデルにおける放出について評価した。このモデルの、組換えヒトG-CSF によって引き起こされた過剰な白血球（顆粒球）生成のピークおよび持続時間を測定した(Cohenら，1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:2484-2488)。これらの試験においては、封入されたタンパク質の生体等価性のための対照としてG-CSF溶液の皮下注射が用いられた。トリカプリリンを含む速放性製剤もまた、封入されたタンパク質の生体等価性のための対照として使用された。第１に、ハムスターにトリカプリリンのみを含む製剤（徐放：速放モル比が0:100)を皮下注射した後の顆粒球増加のピークおよび持続時間を、未封入G-CSF溶液およびより長く放出が持続するトリオレイン製剤（徐放：速放モル比が100:0)によって引き起こされたそれと比較した。各製剤について、３から５匹のハムスターにkgあたり75-100μg のG-CSFを投与した。結果（図２参照）はin vitro放出試験によって予測された通りであった。トリカプリリン製剤はG-CSFの迅速な放出をもたらし、未封入G-CSF溶液による顆粒球生成に類似した顆粒球生成を刺激した。トリオレイン製剤はより低く（かつ遅れてくる）ピークおよびより長い持続時間を有していた。

さらなる対照として、１グループのハムスターに注射の直前に界面活性剤（Tween 20^TM)を用いて可溶化したトリオレイン製剤を注射した。この可溶化製剤投与の24時間後に見いだされた顆粒球の数は、G-CSF 溶液または中性脂質としてトリカプロインのみを含む製剤を投与した結果観察された顆粒球の数と類似していた（図２）。

１．製造
顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)を含む多重小胞リポソームを実施例１に記述するように製造した。ただし、トリオレイン：トリカプリリンの中性脂質モル比を100:0、25:75および10:90とした。

２．37℃のヒト血漿中におけるin vitro放出
実施例１に記述するように懸濁物を調製し、ヒト血漿中で37℃でインキュベートした。粒子画分を50% IPA中で可溶化し、公知の方法を用いて高速液体クロマトグラフィーおよびUV検出によって定量することによって封入されたまま残存しているGM-CSFを測定した。

In vitro放出アッセイの結果（図３参照）は、トリカプリリンによるトリオレインの段階的置換は放出速度の段階的増大をもたらすことを示している。

３．In vitro薬物速度論
100%トリオレイン、またはトリオレイン：トリカプリリンを25:75の比で用いて製造したGM-CSFを含むリポソームをBALBcマウス(7-8週齢、体重約20 g)に皮下注射した。注射前、および注射後１、２、４および７日目に血液サンプルを採取し、ELISAキットを用いて血漿をGM-CSF濃度についてアッセイした。25:75のトリオレイン：トリカプリリンを用いて製造した製剤は、中性脂質としてトリオレインのみを用いて製造した製剤と比較して、検出可能な組換えヒトGM-CSFのより高いピークレベルおよびより短い持続時間をもたらした（図４）。これらの結果は37℃のヒト血漿を用いたin vitroアッセイによって予測された通りであった。そして、封入されたGM-CSFの放出速度は、中性脂質成分にトリカプリリンを加えることによって増大することを示している。

Depo/IGF-1
１．製造
rhu IGF（組換えヒトインスリン様増殖因子）、浸透圧性スペーサーとして¹⁴C-スクロースおよび緩衝剤としてクエン酸アンモニウムを用いて多重小胞リポソームを製造した。脂質混合液は以下のものを含んでいた（リットルあたり）: DOPC 10.4 g、DPPG 2.1 g、コレステロール7.7 g。そしてトリグリセリド成分はトリオレイン2.1 g、トリパルミトレイン1.9 g、トリラウリン1.5 g、トリカプリン1.3g、またはトリカプリリン1.1 gのいずれかであった（モル比 0.34:0.07:0.52:0.06) 。

第１の水相溶液は（ミリリットルあたり）16 mgのrhu IGF-1 (Chiron)、7%スクロース、および20 mM クエン酸アンモニウム(pH 5)を含有していた。5 mlの上記脂質混合溶液を5 mlの該水相溶液と9000 rpmで9 分間25〜27℃で高速混合することによって、第１エマルジョンを調製した。30 mlの40 mMリシンおよび4%グルコースの溶液を混合容器に加えて6000 rpmで１分間混合することによってこのエマルジョンを微細な小滴（小球体）に剪断した。70 ml の40 mMリシンおよび3.2%グルコースの溶液を含むフラスコに得られた懸濁物を移し、フラスコを37℃のジャイロロータリー水浴中に置き、懸濁物の表面を窒素ガスで流速70 cfhで20分間フラッシュすることによって、上記微細な小滴すなわち小球体からクロロホルムを除去し、懸濁したMVL粒子を得た。

この懸濁物を生理食塩水で1:4に希釈し、800 x gで10分間室温で遠心することによって粒子を回収した。吸引によって上清液を除去し、粒子を新鮮な生理食塩水に再懸濁して遠心することによって２回洗浄した。

２．In vitro放出速度
最終洗浄産物を全容量あたり25% 充填粒子容量の割合で再懸濁し、2〜8、25、32または37℃で24または48時間保存した。25,000 x Gで２分間遠心して得たペレット画分を可溶化し、保持されたIGF-1 についてHPLCによってアッセイした。また、2〜8℃で保存したIGF-1 を含む各製剤を24時間以内に、実施例１に記載のin vitro放出アッセイによって評価した。結果を図５に要約して示す。トリオレイン（C18:1)またはトリパルミトレイン(C16:1)を用いて製造した製剤は、類似した放出速度プロフィールを示した。封入されたIGF-1 の70% 以上が７日間で放出された。トリカプリリン(C8)を用いて製造した製剤は、２日間でIGF-1 をほぼ完全に放出し、速い放出速度プロフィールを示した。トリカプリン(C10)またはトリラウリン(C12)を用いて製造した製剤は、標準的トリオレイン製剤よりも顕著に遅い速度でIGF-1 を放出し、７日間で50% 未満しか放出されなかった。これらの結果は、トリグリセリドのアシル鎖の長さは封入されたIGF-1 のin vitro放出速度に直接相関していないことを示唆する。なぜなら、トリカプリリン(C8)製剤の放出はトリカプリン(C10)またはトリラウリン(C12)製剤の放出よりも迅速だったからである。

トリラウリン製剤をほんの2〜3日間食塩水中に2〜8℃で保存したところ、粒子の形態的再編成およびそれに伴なう封入されていた物質の完全な放出が起こったことに注意しなければならない。この効果は、より高い温度で実施されたin vitro放出アッセイにおいて示された安定性からは予測されない。この破局的効果は、中性脂質の凝固点よりかなり低い温度での該製剤の保存に関連していた。この効果を後述の実施例16および17に示す。

３．In vivo薬物速度論
中性脂質としてトリカプリリンまたはトリパルミトレインを用いて製造した、IGF-1 を含む多重小胞リポソーム製剤を雄Sprague-Dawleyラット（体重250〜300 g)に皮下注射した。トリカプリリン製剤は、トリパルミトレインを用いて製造した製剤と比較して、rhu IGF-1の高い血漿中ピークレベルおよび短い放出持続時間を示した（図６）。この結果は、in vitro放出アッセイの結果に基づいた、トリカプリリンを用いて製造した多重小胞リポソームは速放性であるという予測を確認するものである。

１．製造
rhu-インスリンを含有する多重小胞リポソームを製造するため、脂質混合溶液は以下のものを含んでいた（クロロホルムmlあたり）: DOPC 11 mg、DPPG 2.3 mg、コレステロール8.7 mgおよびトリオレイン2.4 mg (2.7 μmol)またはトリカプリリン1.3 mg (2.7 μmol)。

第１の水相溶液組成物は、7.5%¹⁴C-スクロース、20 mM クエン酸、50 mM HCl および5 mg/ml rhu-インスリン（大腸菌、Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)を含有していた。4 mlの上記脂質混合溶液を4 mlの該水相溶液と9000 rpmで8 分間25〜27℃で高速混合することによって、第１エマルジョンを調製した。20mlの20 mMリシンおよび4%グルコースの溶液を混合容器に加えて3000 rpmで１分間混合することによってこのエマルジョンを微細な小滴（小球体）に剪断した。30 ml の20 mMリシンおよび4%グルコースの溶液を含むフラスコに得られた懸濁物を移し（37℃、ジャイロロータリー水浴中）、懸濁物の表面を窒素ガスで１時間あたり70立方フィートの流速で20分間フラッシュすることによって、上記微細な小滴すなわち小球体からクロロホルムを除去し、懸濁したMVL粒子を得た。

この懸濁物を生理食塩水で1:4に希釈し、800 x gで10分間遠心することによって粒子を回収した。吸引によって上清液を除去し、粒子を新鮮な生理食塩水に再懸濁して遠心することによって２回洗浄した。最終洗浄産物を全容量あたり25% 充填粒子容量の割合で再懸濁し、後続の試験のために2〜8℃で保存した。

２．In vitro放出速度
3.2容量のクエン酸添加ヒト血漿を用いて１容量の保存した懸濁物を希釈し、得られた懸濁物の0.6 mlを微量遠心管に入れ、遠心管に栓をして動的（dynamic)条件下で37℃でインキュベートすることによって「in vitro」放出アッセイを実施した。１、３、６および７日後に該遠心管を14,000 x gで2分間遠心し、上清液をバイオアッセイのため別の試験管に移した。遠心したサンプルのペレット画分を1% NonIdet（登録商標）NP-40 (CalBiochem, San Diego, CA)、50 mMトリフルオロ酢酸中で37℃で10分間インキュベートした。ペレット画分によって保持された¹⁴Cスクロースおよびインスリンを、公知の方法を用いてシンチレーションカウンティングおよび逆相HPLCによってそれぞれ測定した。これらの試験の結果から、中性脂質としてトリオレインを用いて製造した多重小胞リポソームは、スクロースおよびインスリンの両方を同等で直線的な様式で放出し、７日間でほぼ完全に放出することが示された。これに対して、トリカプリリンを用いて製造した製剤は、血漿中でたった１日インキュベーションした後で、封入されたスクロースおよびインスリンのわずか20から25%を保持するのみであった（図７）。

１．製造
モルヒネを含有する多重小胞リポソームを製造するため、GMPで確認できる(GMP-validatable)、計測可能なプロセスを用いた。中性脂質成分のトリオレイン：トリカプリリンのモル比は1:4または1:9とした。対照製剤は単一の中性脂質としてトリオレインまたはトリカプリリンを含んでいた。脂質混合溶液は以下のものを含んでいた（リットルあたり）: DOPC 10.2 g、DPPG 2.0 g、コレステロール7.6 g およびトリオレイン：トリカプリリンのモル比に依存してトリグリセリド2.1 gから1.1 g (モル比 0.34:0.07:0.52:0.06)。

第１の水相溶液は（リットルあたり）21 gの硫酸モルヒネ５水和物および0.01 N 塩酸を含んでいた。0.62 Lの脂質混合溶液を0.9 Lの水相溶液と8000 rpmで30分間25〜27℃で高速混合することによって、第１エマルジョンを調製した。15 L の4 mMリシンおよび5.9%グルコースの溶液を含む第２混合容器にこのエマルジョンを移し、1250〜1300 rpmで1.5 分間45℃で混合することによって、エマルジョンを微細な小滴（小球体）に剪断した。得られた懸濁物を飛び石的に間隔をあけて合計50分間45℃で噴霧する（15 L/分で17分、40 L/分で5分間、10 L/分で28分間）ことによって小球体からクロロホルムを除去した。その結果、懸濁したMVL粒子を得た。最終懸濁物中の粒子を濃縮し、25 Lの生理食塩水を用いて十字流-またはダイア-フィルトレーションによって未封入のモルヒネを洗い落とした。最終洗浄産物を後続の試験のために2〜8℃で保存した。

２．In vitro放出プロフィール
ミリリットルあたり8から15 mgの封入された硫酸モルヒネを含む懸濁物をヒト血漿中に1:9に希釈することによって、in vitro放出アッセイを実施した。懸濁物を動的条件下で37℃でインキュベートした。１、２、４および７日後に、生理食塩水を用いてサンプルを1:4に希釈し、800 x gで10分間遠心することによって粒子を沈殿させ、粒子画分をアッセイした。すなわち、50% IPAを用いてペレット画分を可溶化し、公知の方法を用いたUV分光測光によってアッセイすることにより保持されたモルヒネの量を測定した。

図８は、これらの製剤におけるモルヒネのヒト血漿中への放出速度プロフィールを示す。先の実施例に示したように、トリカプリリンに対するトリオレインの比が増大するにつれて、モルヒネ放出の速度および程度は低下する。

３．In vivo薬物速度論
トリオレインまたはトリカプリリンを単独で又は組み合わせて用いて製造した、モルヒネを含む多重小胞リポソーム製剤のin vivo放出を、ビーグル犬（薬物速度論モデル）において硬膜外注射を用いて評価した。これらの試験においては、硬膜外部位に注射したリポソーム製剤からのモルヒネ放出レベルを、血漿中で、および脳脊髄膜によって硬膜外部位から隔てられている隣接のクモ膜下部位（CSF、脳脊髄液）で測定した。CSFの結果のみを示す（図９）。

図８にまとめたin vitro放出の結果とイヌモデルにおいて観察された放出速度プロフィール（図９）の間には相関性が見いだされる。トリカプリリン含有製剤はin vivoにおいて非常に迅速に放出し、24時間でほぼ完全に放出する。100%トリカプリリン製剤を用いた場合の平均滞留時間(MRT)は、未封入のモルヒネを注射した場合のMRTに類似していた。すなわち、2.3 時間対1.6 時間であった。製造の際に少量のトリオレインを含める（すなわち、トリオレイン：トリカプリリンのモル比を1:9または1:4とする）ことは、放出速度を遅くし、放出持続時間を４から５日以上延ばす。そしてMRTはそれぞれ13.2時間および15.3時間となる。トリカプリリン含有製剤はすべて、唯一の中性脂質としてトリオレインを用いた製剤（このモデルにおいて69時間というMRTを有した）よりも迅速に放出する。

４．保存安定性
生物活性化合物の放出速度プロフィールにおいて段階的増大を有する製剤ファミリーを提供するためのMVLの中性脂質組成における段階的変更は、中性脂質混合物の融点の近く又はそれ以上の温度で製剤が保存されるならば、製剤の保存安定性を損なわないように思われる。上に記述された、そしてin vitroおよびin vivoの両方で迅速に放出する、10:90 トリオレイン：トリカプリリンおよびモルヒネを含むMVL製剤のバッチを、放出速度の保存温度への依存について評価した。食塩水（保存溶液）中のMVL懸濁物を通常の保存温度である2〜8℃（公称4℃) およびそれより高い温度である26、37および41℃でインキュベートした。これらの試験結果を図10に示す。図10は1/温度(°K)に対する放出速度の対数をプロットしたArrheniusプロットである。プロットの勾配は連続的であるように思われる。高温における放出速度プロフィールによって、食塩水中に2〜8℃で保存したMVLの放出は非常にゆっくりしており(100日につき封入されたモルヒネの約1%)、それゆえもし封入された物質の５または10% 放出という基準を保存寿命の限界とするならば１年を越す保存寿命をもつことが期待できる、という観察が裏付けられる。さらに、血漿等の生理的マトリックス（図９）または硬膜外スペースのin vivo環境（図９）は、37℃の食塩水中における放出に較べた場合、放出を大幅に速める、ということもまた明白である。すなわち、前者では１日あたり封入されたモルヒネの50% が放出され、他方、後者では１日あたり封入されたモルヒネの1%未満が放出される。

シトシンアラビノシド
１．製造
脂質有機相溶液のホスファチジルコリン成分を様々に置換して、シトシンアラビノシド（AraC) を含む多重小胞リポソームを製造した。この置換は、中性脂質としてトリオレインまたはトリカプリリンを含むMVL製剤中の主要リン脂質においてアシル成分を変化させることの、放出速度プロフィールに及ぼす効果を確認するために実施した。

この第１例では、水相にAraC/HClを含むMVL製剤からの生理的媒質中における放出速度は、トリカプリリンに対するトリオレインの比を調節することによって改変できることを示すためにDOPCが用いられる。脂質混合物は、濃度が100 mg/mlであるDOPCを122.4 ml、2.4 gのDPPG、9.12 gのコレステロール、2.5 gのトリオレインまたは1.3 gのトリカプリリン、またはトリオレイン：トリカプリリンのモル比が1:4、1:9、1:18または1:27となるそれらの混合物を含んでいた(1200 mlあたり)。

第１の水相溶液は20 mg/mlのシトシンアラビノシドおよび0.1 N HClを含んでいた。10 mlの上記脂質混合物と10 mlの該第１水相溶液とを9000 rpmで9分間高速混合することによって、第１エマルジョンを調製した。200 mlの3.2%グルコース、40 mMリシン溶液を含む第２混合容器に第１エマルジョンを移し、2100 rpmで2.5分間混合することによって、エマルジョンを微細な小滴に剪断した。得られた懸濁物を２個の1 L容フラスコに移し、70 cfhでフラッシュすることによってクロロホルムを除去した。食塩水を用いて最終懸濁物を1:2に希釈し、800 x gで10分間遠心して粒子を回収し、３回洗浄し、33%リポクリット(lipocrit)中に再懸濁し、そしてミリリットルあたり10 mgの濃度に調整した。

２．ヒト血漿中へのin vitro放出
上記懸濁物をヒト血漿中に1:9に希釈し、そしてサンプルを動的条件下で37℃でインキュベートすることによって、シトシンアラビノシド(AraC) MVL製剤のin vitro放出速度プロフィールを得た。１、２、４および７日後の時点において、1.2 mlの食塩水を３組の0.3 mlサンプルに添加し、16,000 x gで２分間遠心することにより粒子画分を回収した。吸引によって上清画分を除去し、粒子画分を1 mlの50% イソプロピルアルコール中に再懸濁し、ボルテックス攪拌し、37℃で10分間インキュベートし、遠心し、つぎに0.06または0.2 mlの上清を1.0 mlの0.1 N HClに加えた。UVサンプルを用いて280 nmでシトシンアラビノシドを測定した。

多重小胞リポソーム製剤に保持されているAraCを測定したin vitro放出プロフィールを図11に示す。中性脂質としてトリカプリリンのみを有する製剤からの放出は迅速であった。MVL製剤の製造に用いられたトリオレインに対するトリカプリリンの比が増大するにつれ、血漿中でインキュベートされたMVLによるシトシンアラビノシドの放出速度は低下する。したがって、トリオレイン：トリカプリリン比におけるトリオレインの量の漸増的増加によって、予測可能に増大していく放出速度を有する放出速度曲線のファミリーが創成される。

トリカプリリンを含有する製剤中のDOPCの代わりにより高転移温度ホスファチジルコリンまたはより長鎖長を使用した場合の影響
実施例６の製剤中のDOPCの代わりにより高相転移温度またはより長鎖のホスファチジルコリンを使用した場合、トリオレインに対するトリカプリリンのモル比が大きくなるとin vivoおよびin vitroモデル（37℃の血漿）の両方で放出が速くなるというin vitro放出速度プロフィールのファミリーの順位（実施例６で得られた）は、変わらない。この例では、ジステアロイルホスファチジルコリン（DSPC、融点55℃）をDOPC（融点０℃）の代わりに使用した。

１．製造
50℃で乳化することにより、より融点の高いDSPCを許容できるように製造パラメータを調整した。DOPC対照製剤について使用したエマルジョンの製造を、周囲温度で行なった。さらに第１の水相溶液のHCl濃度を、実施例６の場合より36％上昇させた。

脂質混合溶液は（１リットル当たり）、10.2ｇのDOPCまたは10.3ｇのDSPC、2.1ｇのDPPG、7.7ｇのコレステロールを含有し、トリグリセリド成分は1.1ｇトリカプリリンまたは2.1ｇトリオレインであった（モル比は0.34：0.07：0.52：0.06）。トリオレインとトリカプリリンの混合物を混合して、製剤で使用するためにトリオレイン対トリカプリリン比１：４、１：９、１：18、１：２を得た。

第１の水相は（１ml当たり）、20mgのシトシンアラビノシドと136mMのHClを含有した。10mlの上記脂質混合溶液と10mlの該水相溶液をステンレス製容器中で直径２cmの刃を使用して、室温（DOPCを含有する製剤用）または55℃（DSPCを含有する製剤用）で、9000rpmで８分間高速混合することによりエマルジョンを調整した。エマルジョンを200mlの５％グルコースおよび40mMのリシンを含有する400mlのガラス製Masonジャー中に移して、直径４cmの刃を使用して、第１の乳化で使用したものと同じ温度で4000rpmで1.5分混合して、エマルジョンを剪断して微小液滴にした。容器を37℃のジャイロロータリー水浴中に入れ、懸濁物の表面を窒素ガスで流速70cfhで20分フラッシュして、クロロホルムを除去した。

懸濁物を生理食塩水で１：４に希釈し、800×ｇで室温で10分間遠心分離して粒子を回収した。上清を吸引して除去し、次に粒子を、生理食塩水溶液に再懸濁し遠心分離することにより２回洗浄した。最後の洗浄ペレットを生理食塩水溶液に再懸濁し、ml当たりシトシンアラビノシドが10mgとなるように調整した。

２．in vitro放出プロフィール
上記実施例６に記載のように、ヒト血漿で、MVLからのAraCのin vitro放出アッセイを行なった。図12に示すように、DOPCの代わりに高融点DSPCを使用したMVL中で、トリオレインに対して高モル比のトリカプリリンを含有する高速放出製剤を用いて、トリカプリリン対トリオレインのモル比を変化させることにより、段階的放出速度プロフィールのファミリーを得た。すでにMVLの他の製剤で証明されているように、水相溶液中の塩酸濃度を（実施例６のMVL中に含有されるものと比較して）上昇させることにより、in vitroでの活性物質の放出を遅らせる。

スクロース
１．製造
本例では、18炭素鎖長のホスファチジルコリンであるジオレオリホスファチジルコリン（DOPC、融点＜０℃）の代わりに、22炭素鎖長のホスファチジルコリンであるジエウクリルホスファチジルコリン（DEPC、融点＜０℃）を有する製剤中に、４％スクロースを活性物質として含有する製剤について、放出速度に及ぼすトリカプリリンの影響を試験した。

この脂質溶液は（１リットル当たり）、10.2ｇのDOPCまたは11.0ｇのDEPCおよび2.1ｇのDPPG、7.7ｇのコレステロールを含有し、トリグリセリド成分は1.1ｇのトリカプリリンまたは2.1ｇのトリオレインであった（モル比0.34：0.07：0.52：0.06）。中性脂質の混合物のために、トリオレイン含有およびトリカプリリン含有脂質の組合せを混合して、これらのトリオレイン対トリカプリリンのモル比を得た。

第１の水相は４％のスクロース（Spectrum USP/NF, Los Angeles, CA）を含有し、40μｌの^１４Ｃスクロースでスパイクした。５mlの上記脂質混合溶液と５mlの該水相溶液をステンレス製容器中で直径２cmの刃を使用して、室温で9000rpmで10分間高速混合することにより第１のエマルジョンを調製した。エマルジョンを200mlの４％グルコースおよび４mMリシンを含有する400ml容のガラス製Masonジャーに移して、直径４cmの刃を使用して、3500rpmで２分混合して、エマルジョンを剪断して微小液滴にした。懸濁物を37℃のジャイロロータリー水浴中の１リットル容の培養フラスコに移し、懸濁物の表面を窒素ガスで流速70cfhで20分フラッシュして、該液滴からクロロホルムを除去した。

この粒子懸濁液を生理食塩水で１：２に希釈し、800×ｇで室温で１０分間遠心分離して粒子を回収した。上清を吸引して除去し、次に粒子を、生理食塩水溶液に再懸濁し遠心分離することにより２回洗浄した。最後の洗浄ペレットを生理食塩水溶液に再懸濁し、約33％リポクリットに調整した。

２．in vitro血漿放出試験
in vitro血漿放出試験のために、上記懸濁物を0.1％アジ化ナトリウムを含有するヒト血漿で１：10に希釈した。300μｌの３組のアリコートを1.5mlのスクリューキャップ付きエッペンドルフチューブ中でインキュベートし、０、１、２、３、および４日目に採取した。インキュベーターからチューブをランダムに引き出し、引き出した日をチューブに記録し、内容物を１．２mlの生理食塩水溶液で希釈し、マイクロフュージ中で27,000×ｇで５分間遠心分離することによりサンプルを採取した。粒子ペレットから上清を注意深く吸引して除去した。ペレット画分を１mlの50％IPAにボルテックス混合することにより再懸濁し、37℃で10分間インキュベートし、次にボルテックス混合した。次に50μｌのサンプルを、シンチレーションバイアル中で３mlのシンチレーション液で希釈し、バイアルを激しく振盪し、シンチレーション計測によりスクロースを測定した。

図13に記載のデータから明らかなように、トリカプリリンのみを含有する製剤はすべて、血漿中でインキュベートした場合には、１日以内にスクロースを封入した。DOPCの代わりにDEPCを使用した場合、この水相を有するMVL製剤について中間的な放出速度を達成するのには、トリオレイン：トリカプリリンの比１：18が必要であった。

本例では、放出速度調節性中性脂質としてトリカプリリン（Ｃ８）の代わりにトリカプロイン（Ｃ６）を使用した。
１．製造
この脂質混合溶液は（１リットル当たり）10.2ｇ、2.1ｇのDPPG、7.7ｇのコレステロールを含有し、トリグリセリド成分は0.9ｇトリカプロインまたは2.1ｇトリオレインであった（モル比0.34：0.07：0.52：0.06）。トリオレインとトリカプロインを含有する中性脂質の混合物を混合して、トリオレイン対カプロインのモル比１：４、１：９、および１：18を含有する脂質溶液を得た。これらの製剤を製造し、実施例８に記載のように試験した。

第１の水相は４％のスクロース（Spectrum USP/NF）を含有し、40μｌの^１４Ｃスクロース（ICN ロット＃54661027）でスパイクした。５mlの上記脂質混合溶液と５mlの該水相溶液をステンレス製容器中で直径２cmの刃を使用して、室温で9000rpmで10分間高速混合することにより第１のエマルジョンを調製した。200mlの４％グルコースおよび４mMリシンを含有する400ml容のガラス製Masonジャー中で、直径４cmの刃を使用して、3500rpmで２分混合して、第２の乳化を行なった。ジャーの内容物を37℃のジャイロロータリー水浴中の１リットル容の培養フラスコに移し、懸濁物の表面を窒素ガスで流速70cfhで20分フラッシュして、クロロホルムを除去した。

懸濁物を生理食塩水で１：２に希釈し、800×ｇで室温で10分間遠心分離して粒子を回収した。上清を吸引して除去し、次に粒子を、生理食塩水溶液に再懸濁し遠心分離して２回洗浄した。最後の洗浄ペレットを生理食塩水溶液に再懸濁し、約33％リポクリットに調整した（ここで、リポクリットのパーセントは、このリポソームがしめる容量をリポソーム懸濁物の総容量で割って100を掛けたものである）。中性脂質中の各種類についての収率は５０％より大きかった。製造後、33％リポクリットの遊離スクロース濃度は、総スクロース濃度の約３％であった。

２．in vitro放出プロフィール
in vitro血漿放出試験のために、上記懸濁物をヒト血漿で１：10に希釈した。300μｌの３組のアリコートを1.5mlのスクリューキャップ付きエッペンドルフチューブ中で動的にインキュベートし、０、１、２、３、および４日目に採取した。インキュベーターからチューブをランダムに引き出し、引き出した日をチューブに記録し、内容物を1.2mlの生理食塩水溶液で希釈し、マイクロフュージ中で27,000×ｇで５分間遠心分離することによりサンプルを採取した。ペレットから上清を注意深く吸引して除去した。ペレット画分を１mlの50％IPAでボルテックス混合し、37℃で10分間インキュベートし、次に再度ボルテックス混合することにより再懸濁した。次に50μｌのサンプルを、シンチレーションバイアル中で３mlのシンチレーション液で希釈し、バイアルを激しく振盪し、シンチレーション計測により14Ｃ−スクロースの放射能を測定した。

図14から明らかなように、放出速度調節性中性脂質組合せとしてトリオレインを含有する混合物中でトリカプリリンの代わりにトリカプロインを使用すると、種々のトリオレイン：トリカプロインのモル比に対する放出速度の段階的ファミリーが得られる。トリオレインに対するトリカプロインのモル比が大きいほど、スクロースの放出速度は速かった。トリカプロイン含有製剤とトリカプリリン含有製剤との間には、区別可能な差がある。この水相では（すなわち、封入された活性物質としてスクロースを含有する）、トリカプロインのみを用いて製造された多重小胞粒子は物性が変化し、室温でヒト血漿で希釈すると５分以内にその内容物が放出された。0.5％ウシ血清アルブミンを含有する食塩水で希釈しても同じ作用が見られた。これに対して、中性脂質としてトリカプリリンのみを含有する製剤は、概して、活性物質が完全に放出されるためには血漿中で37℃で１２時間またはそれ以上インキュベートする必要があった。ヒトの血漿または食塩水中の室温でのトリカプロインのみの製剤の不安定性にもかかわらず。この製剤は、食塩水中で２〜８℃の保存で少なくとも１週間安定であった。

アンチセンスオリゴヌクレオチド
本例は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを封入するための本発明の方法の使用を例示する。
１．製造
第１の水相溶液は（１ml当たり）、５、10または20mgのIL-6アンチセンスオリゴヌクレオチド（Leu Nechers（NIH, Bethesda, MD）により供与された）（これはいくつかの試験ではビオチン化されていた）と５％マンニトールを含有させた。

実施例１の脂質混合物１mlを含有するバイアルに塩酸（１Ｎを0.1ml）を加え、この混合物を、キャップをしたバイアルを水平にしてボルテックスミキサー（Scientific Products）のヘッド部に固定して、2400振動／分で１分間振盪することにより乳化した。第１の水相溶液の残り（10mgのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する５％マンニトール0.9ml）をバイアルに加え、乳化を５分間続けた。

最後のエマルジョン（２ml）を分割し、2.5mlの3.2％グルコースと40mMリシンを含有する２つのバイアルに移した。キャップをしたバイアルを水平にしてボルテックスミキサーのヘッド部に固定して、約1200rpmで３秒間振盪することにより、エマルジョンを分散して微小液滴とした。バイアルの内容物を、５mlの3.2％グルコースおよび40mMリシンを含有するフラスコに移し、37℃のジャイロロータリー水浴にフラスコを移し、懸濁物の表面を窒素ガスで流速15立方フィート／時間で10分間フラッシュして、微小液滴すなわち小球からクロロホルムを除去した。

懸濁物を生理食塩水で１：４に希釈し、800×ｇで10分間遠心分離して粒子を採取した。上清溶液を吸引により除去し、新鮮な生理食塩水溶液に再懸濁し遠心分離することにより粒子を２回洗浄した。最後の洗浄産物を全容量当たり25％充填粒子容量の割合で再懸濁し、後続の試験のために２〜８℃で保存した。

懸濁物サンプルを0.1％SDSで１：１に希釈し、該サンプルを沸騰水中で２分間インキュベートし、次に該サンプルを0.1Ｎ NaOHに希釈（典型的には１／20）して、320nmから212nmまで波長をスキャンしてＵＶ吸収を測定して、封入されたオリゴヌクレオチドの回収率を測定した。サンプル中のオリゴヌクレオチドの濃度は、測定したＡ320吸光度値をＡ257吸光度値から差し引いて算出した。第１の水相溶液のサンプルを標準［17.6（Ａ257−１cm）単位／mg／ml］とした。

２．in vitro放出プロフィール
ラットの髄液（CSF）中で37℃でインキュベートした時、粒子画分中に残存するオリゴヌクレオチドの量を測定することにより、オリゴヌクレオチドを含有する多重小胞粒子のin vitro放出特性を決定した。生理食塩水中で保存したサンプルを保存溶液に再懸濁し、750×ｇで10分間遠心分離した。吸引して食塩水上清溶液を除去し、粒子を0.25〜５mgオリゴヌクレオチド／ml CSFの濃度になるようにラットCSFに再懸濁した。サンプルを静的な条件下で37℃でインキュベートした。０、１、２、３、および７日後、粒子／CSF懸濁物のサンプルを取り出し、食塩水で10倍希釈し、遠心分離し、そして上清を吸引して粒子画分から除去した。粒子画分を0.1％SDS中でインキュベートし、0.1Ｎ NaOHで希釈し、340〜210nmの範囲でオリゴヌクレオチドのＵＶ吸収スペクトルを得た。粒子画分により保持されたオリゴヌクレオチドの量を上記のように決定した。

図15に示すように、トリカプリリン製剤はin vitroでより速く放出することはなかったが、全体的放出はかなり速かった。トリオレイン含有製剤は、約2.5日後にラットCSF中の薬物の放出を停止させたが、トリカプリリン含有製剤では放出が続いた。

３．in vivo薬物速度論
トリカプリリンを中性脂質として製造したアンチセンスMVL製剤を、ラットに髄膜内投与してin vivo試験し、次に採取したCSFのサンプルを顕微鏡で観察すると、２日後のCSF中に粒子は見られなかった。トリオレインを用いて製造したMVL粒子は２日後には認められたが、「縮んだ」外観を有していた。３’末端標識アッセイにより遊離した本来のオリゴヌクレオチドを示す証拠は得られなかった。

CSF中のオリゴヌクレオチド濃度のin vivoアッセイの感度を改良するために、オリゴヌクレオチドをビオチン化し、そのビオチン化オリゴヌクレオチドを上記したようにトリオレインまたはトリカプリリンを中性脂質として使用してMVL中で調製した。封入したビオチン化オリゴヌクレオチドの回収率は、トリオレイン含有MVLについては78％であり、トリカプリリン含有MVLについては82％であった。in vivoで試験すると、トリカプリリン含有リポソームから放出されたCSF中に遊離の状態で見いだされたビオチン化オリゴヌクレオチドは、２日後には検出限界以下であった。トリオレイン含有製剤を約0.5μＭの濃度で投与した４日後には、ラットサンプルCSF中に遊離のビオチン化オリゴヌクレオチドは存在しなかった（結果は示してない）。このin vivoデータは、in vivoでアンチセンスオリゴヌクレオチドを急速に放出するトリカプリリンMVLと一致し、オリゴヌクレオチドのより除放性を提供するトリオレイン製剤と一致する。

プラスミド含有ＭＶＬ
１．製造
大腸菌（E. coli ）ｐＢＲ３２２プラスミドを封入した多重小胞リポソームの製造のために、脂質混合溶液は（１リットル当たり）、１０．４ｇのＤＯＰＣ、２．１ｇのＤＰＰＧ、７．７ｇのコレステロール、２．１６ｇのトリオレイン（分子量８８５．４０）、または１．１５ｇのトリカプリリン（分子量４７０．７）（ＤＯＰＣ：ＤＰＰＧ：コレステロール：トリグリセリドのモル比、０．３４：０．０７：０．５２：０．０６）を含有した。

第１の水相溶液は（１リットル当たり）、４２ｇの^１４Ｃ−スクロース（０．６μCi／ml）、１００mmolリシン、８４mmol塩酸、ｐＨ７．４および２０μg/ml ｐＢＲ３２２プラスミド（Promega, Madison WI）を含有した。３mlの脂質混合溶液を３mlの水相溶液とともに、９０００rpmで２５〜２７℃で９分間高速混合して、第１のエマルジョンを調整した。２０mlの２０mMリシン、４％グルコース溶液を混合容器に加え、さらに４０００rpmで２分間混合して、エマルジョンを剪断して微小液滴（小球）にした。旋回水浴中の３０mlの２０mMリシン、４％グルコース溶液を含有するフラスコに懸濁液を３７℃で移し、懸濁液の表面を窒素ガスで流速７０リットル／時間で２０分間吹き流して、微小液滴または小球からクロロホルムを除去して、ＭＶＬを調整した。

ＭＶＬ懸濁液を生理食塩水で１：４希釈し、８００×ｇで１０分間遠心分離して粒子を集めた。上清溶液を吸引して除去し、粒子を新鮮な生理食塩水溶液に再懸濁し遠心分離して２回洗浄した。最後の洗浄ペレットを２５％充填粒子容量／総容量に再懸濁し、以後の試験のために２〜８℃で保存した。

２．in vitro放出プロフィール
ｐＢＲ３２２プラスミドと^１４Ｃ−スクロースを封入した多重小胞リポソームを含有する懸濁液をヒト血漿中に１：２．５希釈して、in vitro放出アッセイを行なった。先の実験で、^１４Ｃ−スクロース放出は、ＭＶＬからのｐＢＲ３２２プラスミドの放出を推定するための充分な代用物であることが確立された。懸濁液を静的条件下で３７℃でインキュベートした。０、１、２、３、６、１０、および１７日目に、試料を生理食塩水で１：４希釈し、粒子を８００×ｇ×１０分間遠心分離して沈降させ、試料をシンチレーション計測溶液に溶解し、粒子画分が保持する^１４Ｃ−スクロースの量をシンチレーション液計測して、粒子画分をアッセイした。

図１６に示すこの試験の結果は、中性脂質としてトリオレインを使用するｐＢＲ３２２プラスミド製剤は、in vivo刺激条件下で安定であり、１７日間にわたり封入された^１４Ｃ−スクロースの約３０％を放出し、一方、トリカプリリンで調製した粒子は、３７℃でヒト血漿と接触すると急速にその内容物を放出することを示した。

以下の実施例において、ｐＢＲ３２２プラスミド製剤中の賦形剤として使用したスクロースとリシン−ＨＣｌは、中性脂質としてトリパルミトレイン：トリカプリリンモル比を使用して、追加の活性物質無しで封入され、段階化されたスクロース放出製剤の「賦形剤のみ」のファミリーが得られた。
１．製造
スクロース−リシンＨＣｌのみを封入した多重小胞リポソームの製造のために、脂質混合溶液は（１リットル当たり）１０．４ｇのＤＯＰＣ、２．１ｇのＤＰＰＧ、７．７ｇのコレステロール、トリパルミトレイン（分子量８０１、Ｃ１６：１９Ｃ）：トリカプリリンのモル比に依存して１．９ｇ〜１．０ｇのトリグリセリドを含有して、ＤＯＰＣ：ＤＰＰＧ：コレステロール：トリグリセリドモル比０．３４：０．０７：０．５２：０．０６を産生した。本実施例の製剤で調製されるトリパルミトレイン対トリカプリリンのモル比は、０：１、１：０、１：９、１：４、１：２、および１：１であった。

第１の水相溶液は（１リットル当たり）、４２ｇの^１４Ｃ−スクロース（１．０μCi／ml）、１００mmolリシン、９０mmol塩酸、ｐＨ５．７を含有した。５mlの脂質混合溶液を５mlの水相溶液とともに、９０００rpmで２５〜２７℃で９分間高速混合して、第１のエマルジョンを調整した。２０mlの２０mMリシン、４％グルコース溶液を混合容器に加え、５０００rpmで１．５分間混合して、エマルジョンを剪断して微小液滴（小球）にした。懸濁液を、３７℃の旋回水浴中の３０mlの２０mMリシン、４％グルコース溶液を含有するフラスコに移し、懸濁液の表面を窒素ガスで流速７０立法フィート／時間で２０分間吹き流して、微小液滴または小球からクロロホルムを除去して、多重小胞リポソーム懸濁液を得た。

懸濁液を生理食塩水で１：４希釈し、８００×ｇで１０分間遠心分離して粒子を集めた。上清溶液を吸引して除去し、粒子を新鮮な生理食塩水溶液に再懸濁し遠心分離して２回洗浄した。最終的な洗浄産物を２５％充填粒子容量／総容量に再懸濁し、以後の試験のために２〜８℃で保存した。

２．in vitro放出プロフィール
^１４Ｃ−スクロースを封入した多重小胞リポソームを含有する懸濁液をヒト血漿中に１：９希釈して、「in vitro」放出アッセイを行なった。懸濁液を動的な穏やかな混合条件下で３７℃でインキュベートした。０、１、３、５、８、および１２日目に、試料を生理食塩水で１：４希釈し、粒子を８００×ｇで１０分間遠心分離して沈降させ、粒子試料をシンチレーション計測溶液に溶解し、粒子中に保持された^１４Ｃ−スクロースの量をシンチレーション液計測して、粒子画分をアッセイした。これらの試験の結果（図１７）は、トリパルミトレイン対トリカプリリンの１：１モル比が、トリパルミトレイン単独よりやや遅い放出速度をもたらすことを示す。中性脂質成分中のトリカプリリンの比率を上げることにより、より速い放出を有する放出速度の段階的ファミリーが得られた。

麻酔薬
１．テトラカインＭＶＬ製剤
テトラカインを封入したＭＶＬの製造のために、脂質混合溶液は（１mlのクロロホルム当たり）、１５．６mgのＤＯＰＣ、３．１mgのＤＰＰＧ、１１．５mgのコレステロール、およびトリオレイン：トリカプリリンのモル比に依存して１２．６mg〜６．６mgのトリグリセリドを含有した。テトラカインの親油性は、満足できるＭＶＬ製剤を得るためには、脂質混合物中に脂質の濃度（６８μmol／ml）を２〜１．５倍上昇させることが必要であることがわかった。トリグリセリドも濃縮した。ＤＯＰＣ：ＤＰＰＧ：コレステロール：トリグリセリドのモル比は、０．２９：０．０６：０．４４：０．２１であった。本実施例の製剤で調製したトリオレイン対トリカプリリンのモル比は、１：０、１：１０、０．５：１０、０．２：１０、０．１：１０、０．０５：１０、および０：１であった。テトラカインの封入のための第１の水相溶液は（１ml当たり）１５mgのテトラカインホスフェートと２００mgのアルファ−シクロデキストリンポリマーを含有した。

第１の水相溶液のアリコート（１ml）を、１mlの脂質混合物を含有するバイアルに加え、キャップをしたバイアルを水平にしてボルテックスミキサー（Scientific Products）の頭部に固定して、２４００振動／分で１２分間振盪して乳化した。

最終エマルジョン（１ml）を分割し、２．５mlの３．２％グルコースと５mMリシンの溶液を含有する２つのバイアルに移した。キャップをしたバイアルを水平にしてボルテックスミキサーの頭部に固定して、６００〜８００振動／分で３秒間振盪して、エマルジョンを分散させて微小液滴とした。バイアルの内容物を、５０mlの３．２％グルコースと５mMリシンの溶液を含有するフラスコに移し、３７℃の旋回水浴にフラスコを移し、懸濁液の表面に窒素ガスを流速１リットル／分で２０分間吹き付けることにより、微小液滴または小球からクロロホルムを除去した。

懸濁液を生理食塩水で１：４希釈し、８００×ｇで１０分間遠心分離して粒子を採取した。上清溶液を吸引して除去し、粒子を新鮮な生理食塩水溶液に再懸濁し遠心分離して２回洗浄した。

２．in vivo薬物動態
多重小胞粒子のin vivo放出特性を、Ｂａｌｂ／ｃマウス（７〜８週令；体重約２０グラム）の腹部に皮下注射（１００μｌ）して測定した。注射後０、５、および２４時間の時点で、マウスを屠殺し、皮下組織を採取し、ホモジナイズし、抽出し、抽出物をＨＰＬＣによりＵＶ検出を使用して、保持されたテトラカインの量についてアッセイした。

テトラカインＭＶＬの所望のin vivo放出持続時間は、２４時間であった。中性脂質としてトリオレインのみを含有する製剤は、in vivoで安定であり、放出時間はあまりにも長すぎた。

トリカプリリンを中性脂質成分中に含有させることにより、持続時間がより短く好ましい薬物動態プロフィールを有する製剤が得られた（図１８）。この麻酔薬の所望の２４時間放出持続時間は、１トリオレイン：１００トリカプリリン比を有する製剤により得られた。

中性脂質の選択と意図する保存温度との関係
以下の実施例に示されるように、中性脂質の融点は、速度調節性の中性脂質の選択において重要な考慮事項である。しかし、例えば第１の水相溶液の組成のような他の要因も考慮するべきである。これらの実施例に対する結論は、中性脂質または中性脂質混合物の凍結点（融点または曇り点）は、保存安定性を確保するために保存温度より高いまたはまたはこの温度近くであるべきであるということである。中性脂質または中性脂質混合物の凍結点より優位に低い温度で製剤を保存すると、ＭＶＬ粒子は物理的形態的変化を受け、このため内部構造が失われ封入された物質が放出される。この変化は、第１の水相組成物の組成に依存して、数時間以内または数日もしくは数週間にわたって発生する。

以下の実施例において、ＭＶＬは中性脂質成分としてトリカプリリンまたはトリカプリンを用いて製造した。トリカプリリンの凍結点は８℃であり、トリカプリンの凍結点は３１℃である。第１の水相は、０．１ＮＨＣｌ中にシトシンアラビノシドまたは硫酸モルヒネを含有した。最終産物のアリコートを食塩水中で２〜８、２５、３２、および３７℃で保存した。封入された物質の放出を、保存の期間にわたって測定した。
１．製造
ＭＶＬの製造のために、脂質混合溶液は(１リットル当たり)１０．４ｇのＤＯＰＣ、２．１ｇのＤＰＰＧ、７．７ｇのコレステロールを含有し、トリグリセリド成分は０．９３ｇトリカプリリン（Ｃ８）または１．１ｇトリカプリン（Ｃ１０）であった（モル比は０．３４：０．０７：０．５２：０．０６）。第１の水相溶液は（１ml当たり）、０．１ＮＨＣｌ中２０mgのシトシンアラビノシドまたは０．１ＮＨＣｌ中２０mgの硫酸モルヒネ５水和物を含有した。

シトシンアラビノシドを封入した製剤については、１０mlの脂質混合溶液と１０mlの水相溶液を９０００rpmで２５〜２７℃で１４分間、高剪断性の刃を用いて高速混合することにより第１のエマルジョンを調整した。モルヒネを封入した製剤については、１２．５mlの脂質混合溶液と７．５mlの水相溶液を９０００rpmで２５〜２７℃で１４分間高速混合することにより第１のエマルジョンを調整した。第１のエマルジョンを２００mlの４０mMリシンと３．２％グルコース溶液とを含有する混合チャンバー中に移して、２１００rpmで２．５分混合することにより、第１のエマルジョンを剪断して微小液滴（小球）にした。懸濁液をフラスコに移し、フラスコを３７℃の旋回水浴中に入れ、懸濁液の表面を窒素ガスで流速７０cfhで２０分間吹き流して、微小液滴または小球からクロロホルムを除去した。

懸濁液を生理食塩水で１：４容量希釈し、８００×ｇで室温で１０分間遠心分離して粒子を集めた。上清溶液を吸引して除去し、粒子を新鮮な生理食塩水溶液に再懸濁し遠心分離して２回洗浄した。最終洗浄産物を３３％充填粒子容量で再懸濁し保存した。

製造後数時間にトリカプリリンおよびトリカプリンＭＶＬ製剤からの封入した遊離（上清）のシトシンアラビノシドとモルヒネの収率の性状解析を行なった（表２）。封入したシトシンアラビノシドとモルヒネの収率は許容できるものであり、シトシンアラビノシドとモルヒネの遊離（上清）の濃度は、トリカプリリンとトリカプリン製剤の両方で低かった。

２．保存放出プロフィール
上清を２〜８、２５、３２または３７℃で保存した。２４、４８および２００時間の時点で、懸濁液を２５，０００×ｇで２分間遠心分離し、上清溶液を、５０％イソプロピルアルコールで１：１容量希釈し、ボルテックス混合し、３７℃で１０分間インキュベートし、遠心分離して、シトシンアラビノシドまたはモルヒネの含量について解析した。上清試料を、０．１ＮＨＣｌに希釈して解析し、シトシンアラビノシドの濃度を、２８０nmの吸収により測定したか、または０．１ＮＮａＯＨに希釈し、モルヒネ濃度を２９８nmの吸収により測定した。

これらの保存−温度−作用試験の結果を図１９Ａ〜Ｄに示す。トリカプリリン（融点８℃）を含有するＭＶＬからの放出速度は、２〜８℃で非常に遅い。予測されるように温度の上昇とともに放出が加速されることに一致して（図１９Ａと１９Ｃ）、保存温度の上昇とともに放出速度が上昇した。しかしトリカプリン（融点３１℃）を含有するＡｒａＣ−ＭＶＬは、トリグリセリドの融点より低い温度で保存した時、非常に速い速度で活性物質を放出した。より高い温度である２５℃と３２℃でトリカプリンＭＶＬを保存すると、放出速度は低下したが、３７℃で保存すると再度上昇した（図１９Ｂ）。実際中性脂質であるトリカプリンの融点（３１℃）より低い温度で保存したトリカプリン含有ＡｒａＣ−ＭＶＬ粒子は、完全に不安定化され、数時間にわたって封入したモルヒネを放出した（図１９Ｂ）。

シトシンアラビノシド含有ＭＶＬの保存試験の結果を、アルレニウスプロットにより図２０に示す。トリカプリリンＭＶＬ製剤は、放出速度のｌｏｇを温度に対してプロットした時、予測された連続的直線関係を示し、放出に単一のプロセスが関与していることを示唆していた。一方、トリカプリリン製剤のデータのプロットは不連続であり、試験した温度範囲で放出に２つのプロセスが関与していることを示していた。トリカプリンの凍結点より高い温度では、傾きは予測通り保存温度の上昇とともに上昇した。第２のプロセスである融点作用は、トリカプリンの凍結点より低い温度で見られ、ここでは温度の低下とともに見かけの速度が上昇した。

第１の水相成分として封入されたシトシンアラビノシドを有する粒子と、封入された硫酸モルヒネを有する粒子との放出速度プロフィール（図１９Ａ〜Ｄ）を再度比較すると、中性脂質の融点より低い温度での製剤の保存により引き起こされる不安定化作用（ここでは「融点作用」と呼ぶ）の出現は、第１の水相溶液の組成に依存することを示す。保存中のトリカプリンＭＶＬ融点作用の出現は、シトシンアラビノシド含有製剤では急速であるが（図１９Ｂ）、硫酸モルヒネ含有製剤では数日必要であることが観察された（図１９Ｄ）。さらにこれらの試験の結果は、製剤を保存する温度が凍結点よりも低ければ低いほど、融点作用の出現が速くなることを示唆する。

本例では、水相は、浸透圧スペーサーとしてスクロース、シトシンアラビノシドおよび０．１ＮＨＣｌを含有した。トリオレイン（融点８℃）、トリカプリン（融点３１℃）、またはトリラウリン（融点４６℃）を中性脂質としてＭＶＬを製造した。最終産物を２〜８℃、２２℃、または３７℃で保存し、保存期間中の封入された物質の放出を記録した。

１．製造
０．１ＮＨＣｌの存在下で浸透圧スペーサーとしてスクロースを使用してシトシンアラビノシドを封入したＭＶＬを製造するために、脂質混合溶液は（１リットル当たり）１０．４ｇのＤＯＰＣ、２．１ｇのＤＰＰＧ、７．７ｇのコレステロールを含有し、トリグリセリド成分は１．１ｇのトリカプリン（Ｃ１０）、１．３ｇのトリラウリン（Ｃ１２）、または１．７ｇのトリオレイン（ＤＯＰＣ：ＤＰＰＧ：コレステロール：トリグリセリドのモル比、０．３４：０．０７：０．５２：０．０６）であった。

第１の水相溶液は（１リットル当たり）、０．１ＮＨＣｌ中に２０mgのシトシンアラビノシドと５１．３mgのスクロースを含有した。３mlの脂質混合溶液を３mlの水相溶液とともに、９０００rpmで２５〜２７℃で８分間高速混合して、第１のエマルジョンを調整した。２０mlの２０mMリシン、４％グルコース溶液を混合容器に加え、５０００rpmで１．５分間混合して、エマルジョンを剪断して微小液滴（小球）にした。懸濁液を、７０mlの４０mMリシン、３．２％グルコース溶液を含有するフラスコに移し、フラスコを３７℃の旋回水浴に入れ、懸濁液の表面を窒素ガスで流速７０cfhで２０分間吹き流して、微小液滴または小球からクロロホルムを除去して、ＭＶＬ粒子懸濁液を調整した。

懸濁液を生理食塩水で１：４容量希釈し、室温で８００×ｇで１０分間遠心分離して粒子を集めた。上清溶液を吸引して除去し、粒子を新鮮な生理食塩水溶液に再懸濁し遠心分離して２回洗浄した。最終洗浄産物を２５％充填粒子容量／総容量に再懸濁し、２〜８、２２、および３７℃で１〜６日間保存した（データは示していない）。懸濁液と２５，０００×ｇで２分間遠心分離して得られた上清画分とを、５０％イソプロピルアルコールで１：１容量希釈し、ボルテックス混合し、３７℃で１０分間インキュベートし、遠心分離して、シトシンアラビノシドの含量について解析した。次に、０．０６または０．２mlの試料を１．０mlの０．１ＮＨＣｌに加え、シトシンアラビノシドの濃度を、２８０nmでの吸収により測定した。

表３のデータにより示されるように、各中性脂質を使用して調製されたＭＶＬの生成物収率は、少なくとも３．０mg/mlであり、許容できる収率であった。白色光学顕微鏡により粒子を観察すると、製造直後の粒子は見かけが球状であり、多重小胞性であった。しかし、トリグリセリドの融点より低い温度で保存すると２４時間以内に、粒子の外観が変化した。表３のカラム３のデータから明らかなように、外観の変化とともに封入されたＡｒａＣが多量に保存溶液（上清）に失われていった。付記すべきは、３７℃で保存した時はトリカプリン（融点３１℃）で製造した製剤は外観の変化を示さず、ＡｒａＣの大きな喪失はなく、一方トリラウリン（融点４６℃）を用いた製剤は大きな形態の変化や封入された活性物質の喪失があったことである。すなわち封入された活性物質のin vivoで調節された徐放性送達のためのＭＶＬの調製において、選択された中性脂質は通常、目的の保存温度より低いかまたはこれに近い融点を有する。好適な製剤は、保存中に０．１０未満の上清／総量比を維持するであろう。

本例は、いくつかの水相溶液はＭＶＬの脂質層膜と相互反応し、中性脂質の融点より低い保存温度でのリポソームの凍結を防ぐことを例示する。このような場合、中性脂質の融点より低い温度での保存に伴う粒子の形態変化と封入された物質の喪失は、非常にゆっくり起きるかまたは消失する。その代わり、封入された物質の放出は、保存温度上昇による活性化に関連している。
１．製造
浸透圧スペーサーとして^１４Ｃ−スクロースを、および緩衝液としてクエン酸アンモニウムを用いてｒｈｕＩＧＦを封入したＭＶＬを製造するために、脂質混合溶液は（１リットル当たり）１０．４ｇのＤＯＰＣ、２．１ｇのＤＰＰＧ、７．７ｇのコレステロールを含有し、トリグリセリド成分は１．３ｇのトリカプリン（融点３１℃、Ｃ１０）（ＤＯＰＣ：ＤＰＰＧ：コレステロール：トリグリセリドのモル比は０．３４：０．０７：０．５２：０．０６であった）であった。

第１の水相溶液は（１ml当たり）、１６mgのｒｈｕＩＧＦ−１（Chiron, Foster City, CA）、７％^１４Ｃ−スクロース、および２０mMクエン酸アンモニウム、ｐＨ５を含有した。５mlの脂質混合溶液を５mlの水相溶液とともに、９０００rpmで２５〜２７℃で９分間高速混合して、第１のエマルジョンを調整した。３０mlの４０mMリシン、４％グルコース溶液を混合容器に加え、６０００rpmで１分間混合して、エマルジョンを剪断して微小液滴（小球）にした。懸濁液を、７０mlの４０mMリシン、３．２％グルコース溶液を含有するフラスコに移し、フラスコを３７℃の旋回水浴に入れ、懸濁液の表面を窒素ガスで流速７０cfhで２０分間吹き流して、微小液滴または小球からクロロホルムを除去して、ＭＶＬ粒子を調整した。

懸濁液を生理食塩水で１：４希釈し、室温で８００×ｇで１０分間遠心分離して粒子を集めた。上清溶液を吸引して除去し、粒子を新鮮な生理食塩水溶液に再懸濁し遠心分離して２回洗浄した。

２．in vitro放出速度
最終洗浄産物を２５％充填粒子容量／総容量に再懸濁し、２〜８、２５、３２、および３７℃で２４または４８時間保存した。２５，０００×ｇで２分間遠心分離して得られたペレットと上清画分を、ＩＧＦ−１（ペレット画分のみ）と^１４Ｃ−スクロース含量についてアッセイした。

表４に要約するこれらの試験の結果は、第１の水相溶液の内容物が、その融点である４６℃より低い温度での中性脂質としてトリラウリンを含有するＭＶＬの保存に関連していることが実施例１６で証明された凍結作用を防止または遅らせる得る、ことを示している。両方の製剤で使用した脂質と製造法は同じであるが、封入された水相成分は異なっていた。これは、第１の水相の組成がトリグリセリドの凍結点を調節するかまたは融点作用を調節すること、例えば中性脂質が不安定な構造体に移行することを防ぐか、または凍結を顕著に遅らせること、を示唆する。

表４および後の実施例に示すように、トリカプリン含有およびトリラウリン含有ＭＶＬ製剤の血漿での放出（実施例１６に示す）は、トリカプリリンで製造したＭＶＬよりは顕著に遅かった。３７℃で行なったすべての血漿放出アッセイは、製造後２４時間以内に開始されたことに注意されたい。トリラウリン（ただし、トリカプリン含有製剤ではない）を２〜８℃で数日以上長く保存すると、粒子の外観の形態変化を引き起こし、「融点作用」に一致して封入された物質が放出された。

その他の中性脂質
多重小胞リポソーム製剤を得るために使用される中性脂質の範囲を決定するために、中性脂質がデカン、ドデカン、スクアレン、およびアルファトコフェロールである一連の試験を行なった。
１．製造
脂質混合溶液は（１リットル当たり）１０．４ｇのＤＯＰＣ、２．１ｇのＤＰＰＧ、７．７ｇのコレステロールを含有し、トリオレイン成分（脂質の６モル％）の代わりにデカン、ドデカン、スクアレン、またはアルファトコフェロールを使用して（ＤＯＰＣ：ＤＰＰＧ：コレステロール：中性脂質のモル比、０．３４：０．０７：０．５２：０．０６）、グリシン、スクロース、およびトリス−ＥＤＴＡの組合せを封入した多重小胞リポソームを調整した。

第１の水相溶液は、２００mMグリシン、５０mMスクロース、１．８mMトリス塩基、および０．５mMのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４４、を含有し、浸透圧は２６８mOsmolであった。３mlの脂質混合溶液を３mlの水相溶液とともに、９０００rpmで２５〜２７℃で９分間高速混合して、第１のエマルジョンを調整した。２０mlの２０mMリシン、４％グルコース溶液を混合容器に添加し、４０００rpmで１．０分間混合することにより、エマルジョンを剪断して微小液滴（小球）にした。

顕微鏡で小球懸濁液を観察すると、これらの中性脂質のいずれかで調製した小球は、中性脂質成分としてトリオレイン、トリパルミトレイン、またはトリミリストレインで調製した対照と比較して、内部の様子は正常であった。

懸濁液を、３０mlの４０mMリシン、３．２％グルコース溶液を含有するフラスコに移し、フラスコを３７℃の旋回水浴中に入れ、懸濁液の表面を窒素ガスで流速７０ｃｆｈで２０分間吹き流して、微小液滴または小球からクロロホルムを除去して、ＭＶＬ粒子を得た。

スクアレンを中性脂質として用いて調製したＭＶＬのみが、溶媒除去工程または以後の粒子の洗浄にも耐えて、洗浄工程後に正常な外観を有するＭＶＬ粒子が得られた。溶媒除去工程の間、デカン、ドデカンおよびアルファトコフェロール小球は収縮し始め、その表面からわずかに光屈折性の物質の突出部が出てきた。突然粒子はつぶれてぎざぎざの構造体になった。ある場合には、洗浄工程からペレット（対照と比較すると小さいが）が回収され、粒子は多重小胞リポソーム組成物の外観を有していなかった。

他の実施態様
本発明の前記説明は、例示および説明のために例として記載されたものである。本発明の思想と範囲を逸脱することなく種々の変更が可能であることを理解されたい。従って、以下の請求の範囲は、そのようなすべての変更を包含するものと理解される。

図１は、生理食塩水中の60% ヒト血漿中において37℃でインキュベートしたときの、中性脂質としてのトリオレインとトリカプリリンのモル比を変えて（▽, 100:0;△, 50:50; ○, 25:75; □, 10:90; ◇, 0:100）製剤化した多重小胞リポソーム(MVL)からの組換え体ヒト顆粒球コロニー刺激因子(rhu G-CSF)の放出速度を比較したグラフである。図２は、生理食塩水（▽）、トリオレイン単独(100:0)MVL製剤（○）、Tween^TM20で可溶化したトリオレイン単独MVL製剤（△）、およびトリカプリリン単独(0:100)MVL製剤（□）中の100μg/kgのrhu G-CSFを皮下注射した後のゴールデン・シリアン・ハムスターの末梢血白血球数のrhu G-CSF依存的増加の持続時間を比較した薬力学的研究の結果を示すグラフである。図３は、生理食塩水中の60% ヒト血漿中において37℃でインキュベートしたときの、中性脂質としてのトリオレインとトリカプリリンのモル比を変えて（△, 100:0; ○, 25:75; □, 10:90 ）製剤化したMVLからのrhu GM-CSFの放出速度を比較したグラフである。図４は、トリオレイン単独(100:0)MVL製剤（○）およびトリオレイン：トリカプリリン 25:75 MVL製剤（□）中の１mg/kgのrhu GM-CSFを皮下注射した後のマウス静脈血の血漿サンプル中のrhu GM-CSFレベルの薬物速度論的研究を示すグラフである。EDTA-血漿中のrhu GM-CSFレベルはELISAで測定した。LOQは定量限界である。図５は、生理食塩水中の60% ヒト血漿中において37℃でインキュベートしたときの、中性脂質成分として種々のトリグリセリドを用いて製剤化した多重小胞リポソームからのrhu IGF-1の放出速度を示したグラフである。MVL製造の際に使用した中性脂質は、（□）トリオレイン、（○）トリパルミトレイン、（△）トリカプリリン、（▽）トリラウリンおよび（◇）トリカプリンであった。図６は、トリパルミトレインMVL製剤（○）およびトリカプリリンMVL製剤（△）中の6.25mg/kgのrhu IGF-1を皮下注射した後のラット血清中のrhu IGF-1レベルの薬物速度論的研究の結果を示すグラフである。血清中のrhu IGF-1レベルはELISAで測定した。図７は、60%のヒト血漿を含む生理食塩水中において37℃でインキュベートしたときの、中性脂質トリオレインまたはトリカプリリンを用いて製造したMVLからのrhu インスリンおよび共封入された¹⁴C-スクロースの放出を示すグラフである。（□）トリオレインMVL製剤により保持されたスクロース；（○）トリオレインMVL製剤により保持されたインスリン；（△）トリカプリリンMVL製剤により保持されたスクロース；および（▽）トリカプリリンMVL製剤により保持されたインスリン。図８は、60%のヒト血漿を含む生理食塩水中において37℃でインキュベートしたときの、中性脂質としてのトリオレインとトリカプリリンのモル比を変えて製剤化したMVLからのモルヒネの放出速度を比較したグラフである。（□）トリオレイン：トリカプリリン 10:0；（◎，○）トリオレイン：トリカプリリン 1:4、２バッチ；（△）トリオレイン：トリカプリリン 1:9；（▽）トリオレイン：トリカプリリン 0:10。図９は、トリオレインとトリカプリリンのモル比を変えて製造したモルヒネMVL製剤をビーグル犬の硬膜外空間に注入したときの薬物速度論的研究の結果を示す。MVLによるモルヒネ放出は、硬膜-分離された、隣接する脳脊髄液中のモルヒネのレベルを測定することにより調べた。（◇）生理食塩水中の５mgのモルヒネ（硫酸塩）；（▽）トリオレイン：トリカプリリン 10:0 MVL製剤中の40mgのモルヒネ；（○）トリオレイン：トリカプリリン 1:4 MVL製剤中の20mgのモルヒネ；（□）トリオレイン：トリカプリリン 1:9 MVL製剤中の20mgのモルヒネ；およびトリオレイン：トリカプリリン 0:10 MVL 製剤中の20mgのモルヒネ。図10は、２バッチのトリオレイン：トリカプリリン 1:9 MVL製剤からのモルヒネの放出速度に及ぼす保存温度の影響を調べる研究の結果を、アレニウス・ストップト・ヒアー(Arrhenius STOPPED HERE)変換でまとめたグラフである。MVLは４℃、26℃、37℃および41℃の生理食塩水中で保存した。縦軸はMVL懸濁液中のモルヒネの全量のパーセントとして１日あたりに放出された量により表された、MVLからのモルヒネの放出速度であり、横軸は１／保存温度×10^４(°K)^−１である。図11は、ヒト血漿中において37℃でインキュベートしたMVL中に保持されたシトシンアラビノシド(AraC)を示すグラフである。これらのMVL製剤は中性脂質成分として次のものを使用した。（□）トリオレイン単独；（○）トリオレイン：トリカプリリン 1:4；（▽）トリオレイン：トリカプリリン 1:9；（Ｘ）トリオレイン：トリカプリリン 1:18；（△）トリオレイン：トリカプリリン 1:27；および（◇）トリカプリリン単独。図12は、主要なリン脂質成分であるDOPCをDSPCで置き換えてMVL製剤を製造したときの、ヒト血漿中において37℃でインキュベートしたMVLからのシトシンアラビノシド放出に及ぼす中性脂質比の影響を示すグラフである。これらの製剤は（□）DOPCおよびトリオレイン単独；（△）DOPCおよびトリオレイン：トリカプリリン 1:9；（◇）DOPCおよびトリカプリリン単独；（○）DSPCおよびトリオレイン単独；（▽）DSPCおよびトリオレイン：トリカプリリン 1:9；および（＋）DSPCおよびトリカプリリン単独である。図13は、主要なリン脂質成分であるDOPCをDEPCで置き換えてMVL製剤を製造したときの、ヒト血漿中において37℃でインキュベートしたMVLからの¹⁴C-スクロース放出に及ぼす中性脂質比の影響を示すグラフである。DOPC製剤は（□）トリオレイン単独；（△）トリオレイン：トリカプリリン 1:9；および（○）トリカプリリン単独である。DSPC製剤は（▽）トリオレイン単独；（＋）トリオレイン：トリカプリリン 1:9；および（◇）トリカプリリン単独である。図14は、トリカプロインを唯一の中性脂質成分としてまたはトリオレインと組み合わせて用いるときの、ヒト血漿中において37℃でインキュベートしたMVLからの14C-スクロース放出に及ぼす影響を示すグラフである。これらの製剤は（○）トリオレイン単独；（△）トリオレイン：トリカプロイン 1:4；（▽）トリオレイン：トリカプロイン 1:9；（◇）トリオレイン：トリカプロイン 1:18；および（＋）トリカプロイン単独である。図15は、中性脂質としてトリオレイン（□）またはトリカプリリン（○）を用いて製造したMVLからの15-merオリゴヌクレオチドのin vitro放出を示したグラフである。MVLは37℃のラット脳脊髄液(CSF)中でインキュベートした。図16は、大腸菌プラスミドPBR 322およびリシン塩酸塩をさらに含むMVLからの、ヒト血漿中でのインキュベーションの間の¹⁴Cスクロースの放出を示したグラフである。スクロース放出はプラスミド放出の代理インジケーターとして用いた。MVLは中性脂質としてトリオレイン（○）またはトリカプリリン（△）のいずれかを用いて製造した。図17は、中性脂質成分としてトリパルミトレインおよびトリカプリリンを用いて製造したMVLからの、ヒト血漿中でのインキュベーションの間の14C-スクロースの放出を示したグラフである。MVL製剤において採用した中性脂質比は、（○）トリパルミトレイン単独；（＋）トリパルミトレイン：トリカプリリン 1:1；（◇）トリパルミトレイン：トリカプリリン 1:2；（▽）トリパルミトレイン：トリカプリリン 1:4；（△）トリパルミトレイン：トリカプリリン 1:9；および（□）トリカプリリン単独である。図18は、中性脂質成分として（＊）トリオレイン；（Ｘ）トリオレイン：トリカプリリン 10:90；（＋）トリオレイン：トリカプリリン 5:95 ；（◇）トリオレイン：トリカプリリン 2:98 ；（▽）トリオレイン：トリカプリリン 1:99；または（○）トリカプリリンのいずれかを用いて製造したテトラカイン含有MVLを注射したマウスの皮下注射部位に残存するテトラカインの量を示したグラフである。図19A-Dは、温度２〜８（通常４）℃、25℃、32℃および37℃の生理食塩水中に保存したときの、MVL-封入された生物活性化合物の放出を示したグラフである。MVLは中性脂質成分としてトリカプリリン（図19Aおよび19C）、そして生物活性化合物としてシトシンアラビノシド（図19Aおよび19B）を用いて製造した。図19A-Dは、温度２〜８（通常４）℃、25℃、32℃および37℃の生理食塩水中に保存したときの、MVL-封入された生物活性化合物の放出を示したグラフである。MVLは中性脂質成分としてトリカプリン（図19Bおよび19D）、そして生物活性化合物としてシトシンアラビノシド（図19Aおよび19B）を用いて製造した。図19A-Dは、温度２〜８（通常４）℃、25℃、32℃および37℃の生理食塩水中に保存したときの、MVL-封入された生物活性化合物の放出を示したグラフである。MVLは中性脂質成分としてトリカプリリン（図19Aおよび19C）、そして生物活性化合物としてモルヒネ（図19Cおよび19D）を用いて製造した。図19A-Dは、温度２〜８（通常４）℃、25℃、32℃および37℃の生理食塩水中に保存したときの、MVL-封入された生物活性化合物の放出を示したグラフである。MVLは中性脂質成分としてトリカプリン（図19Bおよび19D）、そして生物活性化合物としてモルヒネ（図19Cおよび19D）を用いて製造した。図20は、中性脂質成分として（□）融点(mp)８℃のトリカプリリンまたは（○）mp31.5℃のトリカプリンを用いて製造したMVLの保存温度に対するシトシンアラビノシド放出速度の依存性を示す図19Aおよび19Bのグラフのアレニウスプロットである。横軸は保存温度（°K）の逆数である。

Claims

封入された生物活性化合物の放出速度を制御することのできる多重小胞リポソームの製造方法であって、以下のステップ：
（1） a)有機溶媒、両親媒性脂質、および徐放性中性脂質：速放性中性脂質のモル比が１：１から１：１００である中性脂質成分を含む脂質成分と、b)不混和性の第１水性成分とからエマルジョンを形成し、その際、前記脂質成分または第１水性成分のいずれかまたは両方に少なくとも１種の生物活性化合物が添加するステップ；
（2）前記エマルジョンを第２水性成分と混合して溶剤小球体を形成するステップ；および
（3）前記溶剤小球体から有機溶媒を除去して、生物活性化合物を封入している多重小胞リポソームを調製するステップ；
を含み、
前記ステップ中、速放性中性脂質に対する徐放性中性脂質のモル比が、生物活性化合物の放出速度を増加または減少させるように選択され（ここで、前記モル比を増加させると、生物活性化合物の放出速度が減少する）、そして徐放性中性脂質はトリオレイン、トリパルミトレイン、トリミリストレイン、トリラウリン、トリカプリンおよびそれらの混合物よりなる群から選択され、速放性中性脂質はトリカプリリン、トリカプロインおよびそれらの混合物よりなる群から選択される、上記方法。
リポソーム中の総脂質に対する中性脂質成分のモル比が０．０１〜０．２１の範囲である、請求項１に記載の方法。
徐放性中性脂質：速放性中性脂質のモル比が１：１から１：５４の範囲である、請求項１に記載の方法。
徐放性中性脂質：速放性中性脂質のモル比が１：４から１：２７の範囲である、請求項１に記載の方法。
徐放性中性脂質がトリパルミトレインである、請求項１に記載の方法。
徐放性中性脂質がトリオレインである、請求項１に記載の方法。
徐放性中性脂質がトリカプリンである、請求項１に記載の方法。
速放性中性脂質がトリカプリリン、またはトリカプリリンとトリカプロインの混合物である、請求項６に記載の方法。
封入された生物活性化合物の放出速度を制御することのできる多重小胞リポソームの製造方法であって、該方法が、活性化合物を封入する多重小胞リポソーム製剤中の中性脂質成分として徐放性中性脂質と速放性中性脂質とのブレンドを利用することを含み、
その際、生物活性化合物の放出速度が徐放性中性脂質に対する速放性中性脂質のモル比に比例して増加し、徐放性中性脂質はトリオレイン、トリパルミトレイン、およびそれらの混合物よりなる群から選択され、速放性中性脂質はトリカプリリン、トリカプロインおよびそれらの混合物よりなる群から選択される、上記方法。
前記放出速度がin vivoでの放出速度であり、中性脂質成分がin vivo温度またはそれより低い融点を有する、請求項９に記載の方法。
前記放出速度が保存温度での放出速度であり、中性脂質成分の融点が保存温度またはそれより低い、請求項９に記載の方法。
速放性中性脂質がトリカプリリンであり、徐放性中性脂質：トリカプリリンのモル比が１：１から１：１００の範囲である、請求項９に記載の方法。
徐放性中性脂質：速放性中性脂質のモル比が１：１から１：２７の範囲である、請求項９に記載の方法。
前記放出速度がin vivoでの放出速度であり、速放性中性脂質がトリカプリリンである、請求項９に記載の方法。
所定の温度における封入された生物活性化合物の所望の放出速度を有する多重小胞リポソーム製剤を製造する方法であって、以下のステップ：
(1) 多重小胞リポソーム製剤のファミリーを作製するステップ；
（ただし、前記ファミリーの各メンバーは、
ａ．(i)有機溶媒、両親媒性脂質、および徐放性中性脂質：速放性中性脂質のモル比が１：１から１：１００である中性脂質成分を含む脂質成分と、（ii）不混和性の第１水性成分と、からエマルジョンを形成し、その際、前記脂質成分または第１水性成分のいずれかまたは両方に少なくとも１種の生物活性化合物が添加されており、
ｂ．前記エマルジョンを第２水性成分と混合して溶剤小球体を形成し、そして
ｃ．前記溶剤小球体から有機溶媒を除去して、生物活性化合物を封入している多重小胞リポソームを調製する、という方法によってつくられ、その際、前記ファミリーの各メンバーの中性脂質成分は徐放性中性脂質：速放性中性脂質のモル比が異なっている）
(2) 所定の温度で前記ファミリーの各メンバーをインキュベートして、放出速度プロフィールのファミリーを得るステップ；および
(3) 所望の放出速度プロフィールをもたらす中性脂質成分を有するファミリーメンバーを選択するステップ；
を含み、
前記ステップ中、徐放性中性脂質はトリオレイン、トリパルミトレイン、トリミリストレイン、トリラウリン、トリカプリンおよびそれらの混合物よりなる群から選択され、速放性中性脂質はトリカプリリン、トリカプロインおよびそれらの混合物よりなる群から選択される、上記方法。
両親媒性脂質が1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DSPC)、および1,2-ジエルコイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DEPC)よりなる群から選択され、徐放性中性脂質がトリオレインまたはトリパルミトレインである、請求項１５に記載の方法。
前記モル比が１：１から１：５４の範囲である、請求項１５に記載の方法。
脂質成分中の総脂質に対する中性脂質成分のモル比が０．０１〜０．２１の範囲である、請求項１５に記載の方法。
徐放性中性脂質：速放性中性脂質のモル比が１：１から１：５４の範囲である、請求項１８に記載の方法。
放出速度がin vivoでの放出速度であり、徐放性中性脂質がトリオレインである、請求項１５に記載の方法。
速放性中性脂質がトリカプリリンである、請求項２０に記載の方法。
両親媒性脂質が、
1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、
1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、
1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、
1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、
1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、
1,2-ジアラキドイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、
1,2-ジベヘノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、
1,2-ジパルミトレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、
1,2-ジエイコセノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、
1,2-ジエルコイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、
1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホグリセロール、および
1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホグリセロール、よりなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。