NO325015B1 - Fremgangsmate for a oppna en isolert zinkfinger-nukleotidbindende polypeptidvariant samt zinkfinger-nukleotid-bindende polypeptidvariant fremstilt etter fremgangsmaten. - Google Patents

Fremgangsmate for a oppna en isolert zinkfinger-nukleotidbindende polypeptidvariant samt zinkfinger-nukleotid-bindende polypeptidvariant fremstilt etter fremgangsmaten. Download PDF

Info

Publication number
NO325015B1
NO325015B1 NO19962991A NO962991A NO325015B1 NO 325015 B1 NO325015 B1 NO 325015B1 NO 19962991 A NO19962991 A NO 19962991A NO 962991 A NO962991 A NO 962991A NO 325015 B1 NO325015 B1 NO 325015B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
finger
zinc
sequence
dna
binding
Prior art date
Application number
NO19962991A
Other languages
English (en)
Other versions
NO962991L (no
NO962991D0 (no
Inventor
Iii Carlos F Barbas
Joel M Gottesfeld
Peter E Wright
Original Assignee
Scripps Research Inst
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Scripps Research Inst filed Critical Scripps Research Inst
Publication of NO962991D0 publication Critical patent/NO962991D0/no
Publication of NO962991L publication Critical patent/NO962991L/no
Publication of NO325015B1 publication Critical patent/NO325015B1/no

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G01N33/56988—HIV or HTLV
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/09—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a nuclear localisation signal
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/24—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a MBP (maltose binding protein)-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C07K2319/42—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation containing a HA(hemagglutinin)-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/71—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing domain for transcriptional activaation, e.g. VP16
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/73—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing coiled-coiled motif (leucine zippers)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/735—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a domain for self-assembly, e.g. a viral coat protein (includes phage display)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/80—Fusion polypeptide containing a DNA binding domain, e.g. Lacl or Tet-repressor
    • C07K2319/81—Fusion polypeptide containing a DNA binding domain, e.g. Lacl or Tet-repressor containing a Zn-finger domain for DNA binding

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Diabetes (AREA)

Abstract

Det beskrives en bestemmelse som muliggjør identifikasjon av nye modulerende, nukleotid-bindende zink-finger-polypeptider. Slike proteiner kan benyttes for inhibering, aktivering eller forsterkning av genekspresjon fra et nukleotid-bindende zink-finger-motiv som inneholder promoter- eller andre transkripsjons-kontrollelementer, så vel som et strukturelt gen eller en RNA-sekvens. Det beskrives også nye nukleotid-bindende zink-finger-polypeptider.

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåte for å oppnå en isolert zinkfinger-nukleotidbindende polypeptidvariant samt zinkfinger-nukleotid-bindende polypeptidvariant fremstilt etter fremgangsmåten.
BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN
1. Oppfinnelsesområde
Denne oppfinnelse vedrører generelt feltet regulering av genekspresjon, nærmere bestemt fremgangsmåter for modulering av genekspresjon ved anvendelse av polypeptider avledet av nukleotid-bindende zink-finger-proteiner.
2. Beskrivelse av relevant teknikk
Transkripsjonsregulering oppnås primært gjennom den sekvensspesifikke binding av proteiner til DNA og RNA. Av de kjente proteinmotiver som er involvert i den sekvensspesifikke gjenkjenning av DNA, er zink-finger-proteinet unikt i sin modulære natur. Hittil er det påvist zink-finger-proteiner som inneholder mellom 2 og 37 moduler. Mer enn 200 proteiner, hvorav mange er transkripsjonsfaktorer, har vist seg å ha zink-finger-domener. Zink-fingre forbinder transkripsjonsfaktorer med deres målgener ved hovedsakelig å binde seg til spesifikke sekvenser av DNA-basepar - "trinnene" - i DNA-"stigen".
Zink-finger-moduler er ca. 30 aminosyre lange motiver som finnes innen et
stort utvalg transkripsjonsregulerende proteiner i eukaryote organismer. Som navnet tilsier er dette nukleinsyre-bindende protein-domenet foldet rundt et zink-ion. Zink-finger-domenet ble først registrert i transkripsjonsfaktoren TFIIIA fra Xenopus oocytter (Miller et al., EMBO, 4:1609-1614,1985; Brown et al., FEBS Lett., 186:271-274,1985). Dette protein består av ni ikke-perfekte repetisjoner av en konsensus-sekvens:
(Tyr, Phe)-X-Cys-X2-4-Cys-X3-Phe-X5-Leu-X2-His-X3.4-His-X2^ (SEKV. ID.
Nr.:1) hvor X er en hvilken som helst aminosyre.
I likhet med TFIIIA har de fleste zink-finger-proteiner konserverte cystein- og histidinrester som tetraedrisk koordinerer det ene zink-atom i hvert finger-domene. Strukturen av de enkelte zink-finger-peptidene av denne type (inneholdende to
cystein- og to histidingrupper) som f.eks. de som er funnet i gjærproteinet ADR1, proteinet ZFY som er assosiert med mannen, HIV-enhancer-proteinet og Xenopus proteinet Xfin, er fastslått ved hjelp av høyoppløsende NMR-metoder (Kochoyan, et
al., Biochemistry, 30:3371-3386, 1991; Omichinski, et al., Biochemistry, 29:9324-9334, 1990; Lee, et al., Science, 245:635-637,1989), og det er foreslått detaljerte modeller for interaksjonen mellom zink-fingre og DNA (Berg, 1988; Berg, 1990; Churchill, et al., 1990). Strukturen av et tre-fingers polypeptid-DNA-kompleks avledet av IE-proteinet (Immediate early protein) fra mus, zif268 (også kjent som Krox-24), er dessuten fastslått gjennom røntgenkrystallografi (Pavletich & Pabo, Science, 252:809-817,1991).. Hver finger inneholderen antiparallell-p-dreining, en fingerspiss-region og en kort amfipatisk oc-helix som, når det gjelder zif268 zink-fingre, binder seg til hovedgropen i DNA (major groove). Dessuten stabiliserer de konserverte hydrofobe aminosyrene og zink-koordinasjonen gjennom cystein- og histidinrestene, strukturen av det enkelte finger-domenet.
Mens zink-finger-protein-prototypen TFIIIA inneholder en rad av ni zink-fingre som binder en 43 bp sekvens innen 5S RNA-genene, inneholder regulerende proteiner av zif268-klassen (for eksempel Krox-20, Sp1) kun tre zink-fingre innenfor et meget større polypeptid. De tre zink-fingrene i zif268 gjenkjenner hver et 3 bp subsete innenfor en 9 bp gjenkjenningssekvens. De fleste av de DNA-kontakter som gjøres av zif268, er med fosfater og med guaninrester på en DNA-kjede i DNA-spiralens hovedgrop. Mekanismen for TFIIIA-binding til DNA er derimot mer kompleks. De aminoterminale 3 zink-fingre gjenkjenner en 13 bp sekvens og binder seg til hovedgropen. I likhet med zif268, skaper disse fingrene også guaninkontakter primært på den ene DNA-kjede. Til forskjell fra zif268-klassen av proteiner, binder zink-fingrene 4 og 6 i TFIIIA seg enten til eller gjennom minor groove og bringer fingrene 5 og 7 til og med 9 tilbake i kontakt med major groove (Clemens, et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 89:10822-10826,1992).
Krystallstrukturen av zif268 tyder på at bestemte histidin (ikke-zink koordinerende his-rester) og argihinrester på overflaten av a-spiralen deltar i DNA-gjenkjenning. Nærmere bestemt deltar de ladede aminosyrer umiddelbart forut for a-spiralen og i spiralposisjonene 2, 3 og 6 (umiddelbart forut for det konserverte histidin) i hydrogenbinding til DNA-guaniner. I likhet med finger 2 av det regulerende protein Krox-20 og finger 1 og 3 av Sp1, inneholder finger 2 av TFIIIA histidin- og argininrester i disse DNA-kontaktposisjonene, og dessuten gjenkjenner hver av disse zink-fingrene i det minste sekvensen GGG. Finger-utskiftningsforsøk mellom transkripsjonsfaktor Sp1 og Krox-20 har bekreftet 3 bp zink-finger-gjenkjenningskoden for denne klasse av finger-proteiner (Nardelli, et al., Nature, 349:175-178, 1989), Mutageneseforsøk har også vist betydningen av disse aminosyrene ved spesifisering av DNA-gjenkjenning. Det ville være ønskelig å få tak i en enkel kode som angir zink-finger-nukleotid-gjenkjenning. Dersom det kunne dechiffreres en slik kode, ville zink-finger-polypeptider kunne konstrueres slik at de binder seg til en hvilken som helst valgt DNA-sekvens. Komplekset mellom et slikt polypeptid og dets gjenkjenningssekvens ville i så fall kunne utnyttes for å modulere (opp eller ned) transkripsjonsaktiviteten av det gen som inneholder denne sekvens.
Det har også vært beskrevet zink-finger-proteiner som binder seg til RNA. Clemens, et al., (Science, 260:530,1993) fant at fingrene 4 til 7 i TFIIIA bidrar med 95% av den frie energi av TFIIIA-binding til 5S rRNA, mens fingrene 1 til 3 gir et lignende bidrag til bindingen av promoteren av 5S-genet. Sammenligning av de to kjente 5S RNA-bindingsproteinene, TFIIIA og p-43, oppviser få homologier utenom konsensus-zink-ligandene (C og H), hydrofobe aminosyrer og et treonin-tryptofan-treonin-triplettmotiv i finger 6.
US 5,198,346 beskriver fremstilling av et plasmidekspresjonsbibliotek for dannelse av variant DNA bindingsproteiner. Det beskrives videre en fremgangsmåte for oppnåelse av første og andre gener kodende for første og andre homologe DNA bindende proteiner som hibridiserer for å danne et hybrid heterooligomert DNA bindingsprotein. Det beskrives videre et DNA bindingsprotein som spesifikt bindes til en målnukleotidsekvens, men det verken beskrives eller foreslås at et modifisert eller mutert DNA bindingsprotein vil ha en bindingsspesifisitet som er forskjellig fra det opprinnelige proteinet før modifikasjon eller mutasjon.
Rauscher et al. Science 250:1259-62,1990 beskriver at Wilms tumor locus (WTL) protein zink-finger (WT-ZF) binder DNA sekvenser lignende sekvensen gjenkjent av tidlig vektrespons-1 (EGR-1) genproduktet. Varianter av WT-ZF som har redusert binding til EGF-1 gjenkjenningssekvensen er også beskrevet. Disse variantene inkluderer en variant som har et innskudd av et tripeptid i linkerregionen mellom tredje og fjerde zink-fingre og en variant hvor tredje eller fjerde zink-fingre er deletert.
Wright et al. Science 248:588-91,1990 identifiserer ekspresjon av et naturlig forekommende zink-fingergen som blir konstitutivt uttrykt i celler transformert med human T celle leukemi virus (HTLV) typene I og II.
Rollins et al. Mol Cellular Biol 13(8).4776-83,1993 undersøker rollen til hver av de ni zink-fingrene til Xenopus 5S RNA gen-spesifikk transkripsjonsfaktor (TFIIIA). Det beskrives konstruksjon av TRINA mutanter hvor en enkelt histidin-til-aspargin substitusjon ved tredje zink-ligand posisjon ble dannet i hver zink-finger individuelt. Effekten av disse mutasjonene på transkripsjonen aktivering av 5S RNA gener ble bestemt.
Katagiri et al. US Patent No. 4,990,607 beskriver kloning av et rekombinant cDNA klon (hb1) kodende for en trans-virkende DNA bindingsfaktor [ASF-1] som bindes til sekvensen til TGACG. Det beskrives videre endring av genekspresjonen i planter gjennom erstatning av aktiveringsdomenen til ASF-1 med aktiveringsdomenen til en annen trans-virkende faktor eller ved ekspresjon av DNA-bindende domene til ASF-1 uten aktiveringsdomenen.
Jacobs, EMBO J 11(12):4507-17, 1992 beskriver anvendelse av sekvensanalyse for bestemmelse av aminosyreposisjonene innenfor zink-fingrene som gjenkjenner DNA. Denne metoden involverer sammenligning av to typer av sekvensvariasjon: konservering av hver posisjon innenfor en zink-finger innenfor en rekke nabostilte zink-fingre og konservering av hver posisjon innenfor en zink-finger blant homologe proteiner fra forskjellige arter. Det konkluderes med at denne analysen foreslår at basegjenkjenningsposisjonene kan bli identifisert selv i fravær av en kjent struktur for en zink-finger.
Yu et al. (PNAS 90:6340-4,1993 beskriver anvendelse av ribozymer for å inhibere HIV og diskuterer ikke zink-fingerbindende proteiner.
Thukral et al., Molecular and Cellular Biology 12:2784-2792,1992 beskriver mutasjoner i ADR1, en gjær zink-finger transkripsjonsfaktor. Det beskrives mutasjoner av ADR1 zink-fingre som endrer bindingen av ADR1 til dets mål DNA gjenkjenningssekvens (UAS1) og modifiserte UAS1 sekvenser.
Nardelli et al., Nature 349:175-178 (1991), identifiserer aminosyrer som styrer DNA-bindingsspesifisiteten ved anvendelse av in vitro rettet mutagenese rettledet av likhetene mellom zink-fingrene til transkripsjonsfaktorer ved anvendelse av mutante Krox-20 proteiner hvor zink-fingrene inneholdt aminosyresubstitusjoner og bestemmelse av bindingsaffiniteten til mutantene for villtypen og modifisert Krox-20 bindingssete.
Nardelli et al., Nucleic Acids Res. 20:4137-4144,1992 beskriver identifikasjon av aminosyreresidier innenfor andre zink-finger til Krox-20 proteinet som er ansvarlig for den nukleotid-bindende spesifisiteten. Ni Krox-20 derivater ble konstruert med en til tre aminosyreendringer innenfor zink-finger 2 og deres affiniteter for et panel av 14 oligonukleotider hvor den sentrale tripletten av villtype bindingssete ble modifisert ble vurdert.
For å omforme zink-fingre, må det utvikles nye selektive strategier, og det fordres ytterligere informasjon angående det strukturelle grunnlag for sekvens-spesifikk nukleotid-gjenkjenning. De proteinkonstruksjonsforsøk som gjøres idag, anvender konstruksjonsstrategier som er basert på sekvens- og/eller struktur-analogi. Mens en slik strategi kan være tilstrekkelig for overføringen av motiver, begrenser den muligheten for å frembringe nye nukleotid-bindingsmotiver som ikke er kjent naturlig. Konstruksjon av zink-fingre under anvendelse av en analogibasert strategi, har faktisk bare hatt beskjeden suksess (Desjarlais & Berg, Proteins, 12:101, 1992).
Det er derfor behov for nye strategier for utvikling av ytterligere zink-fingre med spesifikke gjenkjenningsseter, så vel som nye zink-fingre for å forsterke eller undertrykke genekspresjon. Foreliggende oppfinnelse fyller dette behov.
SAMMENFATNING AV OPPFINNELSEN
Foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåte for å oppnå en isolert zinkfinger-nukleotidbindende polypeptidvariant som binder seg til en cellulær nukleotidsekvens og som omfatter: a) identifisering av aminosyrer i zinkfingre av et zinkfinger-nukleotidbindende polypeptid som binder seg til en første cellulær nukleotidsekvens, hvor polypeptidet omfatter minst to zinkfinger-moduler av et kjent zinkfinger-nukleotidbindende polypeptid hvori aminosyresekvensen til hver modul som binder den første nukleotidsekvensen omfatter to cystein residuer og to histidinresiduer hvor begge cysteinene er amino-proksimale til begge
histidinene;
b) etablering av et ekspresjonsbibliotek som koder for polypeptidvarianten, inneholdende randomisert substitusjon av i det minste én av aminosyrene
identifisert ovenfor i trinn a); ovenfor i minst en av dets zinkfingre;
c) ekspresjon av biblioteket i en passende vertscelle; og
d) isolering av en klon som produserer en polypeptidvariant som binder seg til en andre cellulær nukleotidsekvens for derigjennom å oppnå en zinkfinger-nukleotidbindende polypeptidvariant som binder seg til en cellulær nukleotidsekvens.
Det er videre beskrevet zinkf inger- nukleotidbindende polypeptidvariant fremstilt etter fremgangsmåten i krav 1.
Oppfinnélsen tilveiebringer følgelig en isolert variant av et nukleotid-bindende zink-finger-polypeptid som omfatter minst to zink-finger-moduler som binder seg til en cellulær nukleotidsekvens og modulerer funksjonen av den cellulære nukleotid-sekvens. Varianten binder seg enten til DNA eller RNA og kan forsterke eller undertrykke transkripsjon fra en promoter eller innen et strukturelt gen. Den cellulære nukleotidsekvens kan være en sekvens som er en naturlig forekommende sekvens i cellen, eller være en virusavledet nukleotidsekvens i cellen.
Ifølge en annen utførelsesform uttrykkes biblioteket i et fag-overflate-ekspresjonssystem.
I nok en utførelsesform innbefatter fag-ekspresjonssystemet et reduserende reagens som muliggjør folding av ekspresjonsproduktene på fag-overflaten.
Ifølge oppfinnelsen kan det reduserende reagens være ditiotreitol.
Biblioteket randomiseres videre ifølge oppfinnelsen ved PCR under bruk av primere som inneholder degenererte triplettkodoner i sekvensposisjoner som tilsvarer de bestemte aminosyrene.
KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE
FIGUR 1 viser en modell for interaksjonen mellom zink-fingrene til TFIIIA med den interne promoter av 5S RNA-genet. FIGUR 2A viser aminosyresekvensen av de første tre aminoterminale zink-fingrene til TFIIIA.
FIGUR 2B viser nukleotidsekvensen av det minimale bindingssetet for zf1-3.
FIGUR 3 viser en bestemmelse av gel-mobilitetsforskyvningen for bindingen av zf1-3 til et 23 bp <32>P-merket dobbeltkjedet oligonukleotid. FIGUR 4 viser et autoradiogram av in <y>itro transkripsjon som tyder på at zf1-3 blokkerer T7RNA-polymerase-transkripsjon. FIGUR 5 viser at binding av zf 1 -3 til dens gjenkjenningssekvens blokkerer transkripsjon fra en nært lokalisert T7RNA-polymerase-promoter. Et diagram av prosent DNA-molekyler bundet av zf 1 -3 ved en bestemmelse av en gelmobilitets-forskyvning (x-akse) er plottet mot prosentuell inhibering av T7RNA-polymerase-transkripsjon (y-akse). FIGUR 6 er et autoradiogram som viser at zf1-3 blokkerer eukaryot RNA-polymerase-lll-transkripsjon i et in vitro transkripsjonssystem avledet fra ikke-fertiliserte Xenopus-egg. FIGUR 7 viser nukleotidet og den deduserte aminosyresekvens for de zink-fingre av zif268 som ble klonet i pComb3.5. FIGUR 8 viser aminosyresekvensen av Zif268-proteinet og den håmåls-DNA some r benyttet for fag-seleksjon. (A) viser de konserverte trekk for hver zink-finger. (B) viser den håmåls-DNA som inneholder konsensus-bindingssetet på 9 bp. FIGUR 9 er en tabell med angivelse av de seks randomiserte rester i finger 1, 2 og 3. FIGUR 10 viser SDS-PAGE av Zif268 variant A14 før IPTG-induksjon (bane2); etter IPTG-induksjon (bane 3); cytoplasmatisk fraksjon etter fjerning av inklusjonslegemer (bane 4); inklusjonslegemer inneholdende zink-finger-peptid (bane 5), og mutant Zif268 (bane 6). Bane 1 er molekylvektstandarder (kD). FIGUR 11 er en tabell som angir kon, assosiasjonshastighet; og koff, dissosiasjonshastighet; og Kd likevektsdissosiasjonskonstant, for hvert protein. FIGUR 12 viser dissosiasjonshastigheten (koff) av villtype Zif268-protein (WT) (□) og dets variant C7 (o), ved sanntidsendringer i overflate-plasmon-resonans. FIGUR 13A og B viser nukleotid- og aminosyresekvensen for Zif268-Jun (SEKV. ID: Nr.:33og34). i i FIGUR 14A og B viser nukleotid-og aminosyresekvensen av Zif268-Fos (SEIjCV. ID. Nr.: 35 og 36). FIGUR 15 viser nukleotid- og aminosyresekvensen av tre finger-konstruksjonene av en C7-zink-finger (SEKV. ID. Nr.:41 og 42). FIGUR 16A og B viser nukleotid- og aminosyresekvensen av Zif268-Zif268-bundet med en TGEKP-linker (SEKV. ID. Nr.:43 og 44).
DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer følgelig fremgangsmåte for å oppnå en isolert nukleotid-bindende zink-finger polypeptidvariant, som omfatter minst to zink-finger-moduler som binder seg til en cellulær nukleotidsekvens og modulerer funksjonen av den cellulære nukleotid-sekvens. Polypeptidvarianten kan forsterke eller undertrykke transkripsjonen av et gen og kan binde seg til DNA eller RNA.
En nukleotid-bindende zink-finger-polypeptid-"variant" refererer seg til et polypeptid som er en mutagenisert form av et zink-finger-protein eller et sådant fremstillet gjennom rekombinasjon. En variant kan være en hybrid som inneholder zink-finger-domener fra ett protein bundet for eksempel til zink-finger-domener av et andre protein. Domenene kan være av villtype eller mutageniserte. Et "derivat" inkluderer en avkuttet form av et villtype-zink-finger-protein som inneholder færre enn det opprinnelige antall fingre i villtypeproteinet. Et derivat inkluderer også zink-finger-polypeptidvarianter. Eksempler på nukleotid-bindende zink-finger-polypeptider som det kan fremstilles et derivat eller en variant fra, inkluderer TFIIIA og zif268.
I denne sammenheng refererer et "nukleotid-bindende zink-finger-motiv" seg til enhver to- eller tredimensjonalt del av et nukleotidsegment som et nukleotid-bindende zink-finger-polypeptid-derivat binder seg spesifikt til. Inkludert i denne definisjon er nukleotidsekvenser, i alminnelighet på fem nukleotider eller færre, så vel som de tredimensjonale aspekter av DNA-dobbeltspiralen, så som major jog minor grooves, spiralens frontside og lignende. Det typiske motiv er en hvilken som helst sekvens av passende lengde som zink-finger-polypeptidet kan binde seg til. For eksempel binder et tre-fingers-polypeptid seg til et motiv som i alminnelighet tiar ca. 9 til ca. 14 basepar. Oppfinnelsen tilveiebringer derfor nukleotid-bindende zink-finger-polypeptider av en hvilken som helst spesifisitet, og det zink-finger-bindende motiv kan være en hvilken som helst sekvens utviklet gjennom forsøket, eller som zink-finger-proteinet binder seg til. Motivet kan forekomme i en hvilken som helst DNA- eller RNA-sekvens, inklusivt regulatorsekvenser, eksoner, introner eller en hvilken som helst ikke-kodende sekvens.
Ved praktisering av denne oppfinnelse er det for å oppnå en nukleotid-bindende zink-finger-polypeptidvariant, ikke nødvendig at det nukleotid-bindende zink-finger-motiv, er kjent. Selv om zink-finger-proteiner hittil bare har vært identifisert i eukaryoter, ansees det her som klart innenfor rammen av oppfinnelsen at de nukleotid-bindende zink-finger-motiver kan identifiseres i ikke-eukaryot DNA eller RNA, spesielt i de native promotere i bakterier og virus, ved at de genetisk modifiserte, isolerte konstruksjoner ifølge oppfinnelsen, som bibeholder de velkjente strukturelle karakteristika til zink-fingeren, men som ved deres produksjonsmåte så vel som deres aminosyresekvenser og tredimensjonale strukturer avviker fra zink-finger-proteiner som finnes i naturen, bindes til disse.
Den karakteristiske struktur av de kjente villtype zink-finger-proteiner utgjøres av fra to og helt opp til 37 modulære tandem repetisjoner, hvor hver repetisjon danner en "finger" som holder et zinkatom i tetraedrisk koordinasjon ved hjelp av et par av konserverte cysteiner og et par av konserverte histidiner. I alminnelighet inneholder hver finger også konserverte hydrofobe aminosyrer som virker sammen under dannelse av en hydrofob kjerne, som bidrar til at modulen opprettholder sin fasong.
Den nukleotid-bindende zink-finger-polypeptidvariant ifølge oppfinnelsen, omfatter minst to zink-finger-moduler som binder seg til en cellulær nukleotidsekvens og modulerer funksjonen til den cellulære nukleotidsekvensen. Betegnelsen! "cellulær nukleotidsekvens" refererer seg til en nukleotidsekvens som er tilstede i cellen. Det er ikke nødvendig at sekvensen er en naturlig forekommende sekvens i cellen. For eksempel ville et retroviralt genom som er integrert i en verts cellulære DNA, bli betraktet som en "cellulær nukleotidsekvens". Den cellulære nukleotidssekvens kan være DNA eller RNA og inkluderer både introner og eksoner. Cellen og/eller den cellulære nukleotidsekvens kan være prokaryot eller eukaryot, herunder en gjær-, virus- eller plantenukleotidsekvens.
Betegnelsen "modulere" refererer seg til undertrykking, forsterkning el er induksjon av en funksjon. For eksempel kan den nukleotid-bindende zink-finger-polypeptidvariant ifølge oppfinnelsen, modulere en promotersekvens ved å binde seg til et motiv innen promoteren, hvorved transkripsjon av et gen som operativt er bundet til promoter-nukleotidsekvensen, forsterkes eller undertrykkes. Alternativt kan modulering inkludere inhibering av transkripsjon av et gen hvor den nukleotid-bindende zink-finger-polypeptidvariant binder seg til det strukturelle gen og hindrer DNA-avhengig RNA-polymerase i å lese seg gjennom genet og derved inhibe11re transkripsjon av genet. Det strukturelle gen kan være et normalt cellulært gen eller for eksempel et onkogen.
Promoter-regionen av et gen inkluderer de regulerende elementer som typisk ligger 5' for et strukturelt gen. Dersom et gen skal aktiveres, fester proteiner kjent som transkripsjonsfaktorer seg til genets promoter-region. Denne kombinasjon ligner en "på-bryter" ved å muliggjøre at et enzym transkriberer et andre genetisk segment fra DNA til RNA. I de fleste tilfeller tjener det resulterende RNA-molekyl som templat for syntese av et spesifikt protein, men enkelte ganger er selve RNA sluttproduktet.
Promoter-regionen kan være en normal cellulær promoter eller for eksempel en onko-promoter. En onko-promoter er i alminnelighet en virus-avledet promoter. For eksempel er LTR (long terminal repeat) av retrovirus, en promoter-region som kan være et mål for en bindende zink-finger-polypeptidvariant ifølge oppfinnelsen. Promotere fra virus innen lentivirusgruppen som innbefatter slike patogener som HTLV (human T-cell lymphotrophic virus) 1 og 2 eller HIV (human immunodéficiency virus) 1 eller 2, er eksempler på virale promoter-regioner som kan være måljfor transkripsjonsmodulering av et bindende zink-finger-polypeptid ifølge oppfinnelsen.
De nukleotid-bindende zink-finger-polypeptid-derivater eller -varianter ifølge oppfinnelsen, inkluderer polypeptider som binder seg til en cellulær nukleotid-sekvens, som f.eks. DNA, RNA eller begge deler. Et nukleotid-bindende zink-finger-polypeptid som binder seg til DNA, nærmere bestemt det zink-finger-domené som binder seg til DNA, kan lett påvises ved eksaminering av "linker"-regionen mellom to zink-finger-domener. Linkerens aminosyresekvens TGEK(P) (SEKV. ID. Nr.:32) er en
i •
typisk indikasjon på zink-finger-domener som binder seg til en DNA-sekvens. Man
I
kan derfor bestemme hvorvidt et bestemt nukleotid-bindende zink-finger-polypeptid fortrinnsvis binder seg til DNA eller RNA ved undersøkelse av linker-aminosyrene.
Betegnelsen "effektiv mengde" innbefatter den mengde som resulterer i deaktivering av en tidligere aktivert promoter eller den mengde som resulterer i inaktivering av en promoter som inneholder et nukleotid-bindende zink-f inger-motiv, eller den mengde som blokkerer transkripsjon av et strukturelt gen eller translasjon av RNA. Den mengde av zink-finger-avledet nukleotid-bindende polypeptid som fordres, er den mengde som er nødvendig for enten å fortrenge et nativt nukleotid-bindende zink-finger-protein i et eksisterende protein/promoter-kompleks, eller den mengde som er nødvendig for å konkurrere med det native nukleotid-bindende zink-finger-protein for å danne et kompleks med promoteren som sådan. Tilsvarende er den mengde som fordres for å blokkere et strukturelt gen eller RNA, henholdsvis den mengde som binder seg til og hindrer RNA-polymerase i å avlese genet, eller den mengde som inhiberer translasjon. Fortrinnsvis foregår metoden intracellulært. Ved funksjonell inaktivering av en promoter eller et strukturelt gen, undertrykkes transkripsjon eller translasjon. Avgivelse av en effektiv mengde av det inhiberende protein for binding til eller "kontakting av" den cellulære nukleotidsekvens som
i inneholder det nukleotid-bindende zink-finger-proteinmotiv, kan oppnås gjennom en av de her beskrevne mekanismer, som f.eks. gjennom retrovirale vektorer eller liposomer eller andre velkjente metoder. j
Det nukleotid-bindende zink-finger-polypeptid-derivat er avledet eller j
fremstillet fra et zink-finger-protein av villtype ved avkutting eller ekspansjon,! i eller
i
som en variant av det villtype-avledede polypeptid gjennom en stedsrettet mutagenese-prosess eller ved en kombinasjon av fremgangsmåtene.
Betegnelsen "avkuttet" refererer seg til et nukleotid-bindende zink-finger-polypeptid-derivat som inneholder færre enn hele det zink-finger-antall som finnes i det native bindende zink-finger-protein, eller er blitt befridd for uønskede sekvenser.
For eksempel kan avkutting av det nukleotid-bindende zink-finger-protein TFIIIA,
i
som naturlig inneholder ni zink-fingre, være et polypeptid med kun zink-fingrene fra en til og med tre. Ekspansjon refererer seg til et zink-finger-polypeptid som det
t
addert ytterligere zink-finger-moduler til. For eksempel kan TFIIIA utvides til 12 fingre ved addering av tre zink-finger-domener. Dessuten kan et avkuttet nukleotid-i bindende zink-finger-polypeptid innbefatte zink-finger-moduler fra mer enn ett
i
polypeptid av villtype, noe som resulterer i en nukleotid-bindende zink-finger-; polypeptid-"hybrid".
Uttrykket "mutagenisert" refererer seg til et nukleotid-bindende zink-finger-avledet polypeptid som er oppnådd gjennom en hvilken som helst av de metpder som er kjent for å oppnå tilfeldig eller seterettet mutagenese av det DNA som koder
i
for proteinet. I TFIIIA kan for eksempel mutagenese foretas for å erstatte ikke-konserverte rester i én eller flere av repetisjonene av konsensussekvensen.: Avkuttede nukleotid-bindende zink-finger-proteiner kan også mutageniseres.'
Eksempler på kjente nukleotid-bindende zink-finger-proteiner som kan avkuttes, ekspanderes og/eller mutageniseres i henhold til foreliggende oppfinnelse, for å inhibere funksjonen av en cellulær sekvens som inneholder et nukleotid-bindende zink-finger-motiv, innbefatter TFIIIA og zif268. Andre nukleotid-bindende zink-finger-proteiner vil være kjent for fagmannen.
DNA-sekvenser som koder for det nukleotid-bindende zink-finger-polypeptid ifølge oppfinnelsen, inklusivt native, avkuttede og ekspanderte polypeptider, ikan oppnås etter flere metoder. For eksempel kan DNA isoleres ved å benytte velkjente hybridiseringsmetoder. Disse innbefatter, men er ikke begrenset til: (1) hybridisering av prober til genomiske eller cDNA-bibliotek for å påvise felles nukleotidsek<y>enser;
i
(2) antistoff-screening av ekspresjonsbibliotek for å påvise felles strukturelle trekk og (3) syntese ved PCR (polymerase chain reaction). RNA-sekvenser ifølge oppfinnelsen kan oppnås etter fremgangsmåter som er kjent på området (se for
i eksempel Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, et al., red. 1989).
Utviklingen av spesifikke DNA-sekvenser som koder for nukleotid-bindende zink-finger-proteiner ifølge oppfinnelsen, kan oppnås ved: (1) isolering av en dobbeltkjedet DNA-sekvens fra det genomiske DNA; (2) kjemisk fremstilling av en DNA-sekvens for å frembringe de nødvendige kodoner for det aktuelle polypeptid og (3) in vitro syntese av en dobbeltkjedet DNA-sekvens ved revers transkripsjon av mRNA isolert fra en eukaryot donorcelle. I sistnevnte tilfelle dannes tilslutt et dobbeltkjedet DNA-komplement av mRNA som i alminnelighet omtales somjcDNA. Av disse tre metodene for utvikling av spesifikke DNA-sekvenser for anvendelse i rekombinasjonsprosesser, er isoleringen av genomisk DNA minst vanlig. På grunn av intron-nærværet, er dette særlig tilfelle når det er ønskelig å oppnå mikrobiell ekspresjon av pattedyr-polypeptider.
i'
For å oppnå zink-finger-avledede DNA-bindende polypeptider, er syntesen av DNA-sekvenser ofte metoden som velges når hele sekvensen av aminosyrerester i det ønskede polypeptidprodukt er kjent. Når hele sekvensen av aminosyrerester i det ønskede polypeptid ikke er kjent, er den direkte syntese av DNA-sekvenser ikke
i
mulig, og dannelse av cDNA-sekvenser er da den metode som velges. Blant standardmetodene for å isolere aktuelle cDNA-sekvenser er dannelsen av plasmid-bærende cDNA-bibliotek, som er avledet gjennom revers transkripsjon av mRNA, som forekommer rikelig i donorceller som har et høyt genetisk ekspresjonsniyå. Benyttet i kombinasjon med PCR-teknologi, kan selv skjeldne ekspresjonsprodukter klones. I de tilfeller hvor en vesentlig del av polypeptidets aminosyresekvens er kjent, kan produksjonen av merkede enkelt- eller dobbeltkjedede DNA- eller RNA-j probesekvenser som dupliserer en sekvens som antas å forekomme i det aktuelle cDNA-mål, benyttes i DNA/DNA-hybridiseringsprosedyrer som foretas på klonede kopier av det cDNA som er denaturert til en enkeltkjedet form (Jay et al., Nucleic Acid Research, 11:2325, 1983).
Hybridiseringsprosedyrer kan benyttes for screeningen av rekombinaijitkloner ved å benytte merkede, blandede syntestiske oligonukleotid-prober, hvor hver probe potensielt er det fullstendige komplement av en spesifikk DNA-sekvens i
hybridiseringsprøven som innbefatter en heterogen blanding av denaturert
i dobbeltkjedet DNA. For slik screening foretas hybridiseringen fortrinnsvis på enten enkeltkjedet DNA eller denaturert dobbeltkjedet DNA. Hybridisering er særlig egnet ved påvisning av cDNA-kloner avledet fra slike kilder hvor ekstremt lave mengder av mRNA-sekvenser i forhold til det aktuelle polypeptid, foreligger. Ved å benytte stringente hybridiseringsbetingelser for å unngå uspesifikk binding, er det for eksempel mulig å oppnå autoradiografisk visualisering av en spesifikk cDNA-klon ved hybridisering av DNA-målet til den ene probe i blandingen som utgjør dets fullstendige komplement (Wallace, et al., Nucleic Acid Research, 9:879,1981;
Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982).
Screeningmetoder som er basert på nukleinsyrehybridisering, gjør det mulig å isolere en hvilken som helst gensekvens fra en hvilken som helst organisme forutsatt at det finnes en passende probe. Oligonukleotid-prober som tilsvarer en delj av den sekvens som koder for det aktuelle protein, kan syntetiseres kjemisk. Dette fordrer at korte oligopeptidstrekninger av aminosyresekvenser må være kjent. DNA-sekvensen l i som koder for proteinet kan deduseres fra den genetiske kode, men det må i imidlertid tas hensyn til kodens degenererthet. Det er mulig å foreta eh reaksjon med blandet tilsetning når sekvensen er degenerert. Det inngår her en heterogen!i blanding av denaturert dobbeltkjedet DNA. Ved slik screening foretas hybridiseringen fortrinnsvis enten på enkeltkjedet DNA eller på denaturert dobbeltkjedet DNA.
Siden DNA-sekvensene i det vesentlige koder for hele, eller for en dell av, et nukleotid-bindende zink-finger-protein, er det en rutinesak å fremstille, subklpne og uttrykke de avkuttede polypeptidfragmentene av DNA fra denne eller tilsvarende DNA-sekvenser. Alternativt er det ved å benytte de her omtalte DNA-fragmenter som definerer de nukleotid-bindende zink-finger-polypeptidene ifølge oppfinnelsen, mulig
i •
å bestemme de DNA-sekvenser som koder for hele det nukleotid-bindende zink-finger-protein, ved hjelp av kjente teknikker. Slike teknikker er beskrevet i US-patent 4.394.443 og US-patent 4.446.235 som herved med hele sitt innhold inkorporeres i
foreliggende beskrivelse. i
i
Et cDNA-ekspresjonsbibliotek, som lambda gt11, kan indirekte underkastes screening med henblikk på nukleotid-bindende zink-finger-proteiner eller på det zink-i finger-avledede polypeptid som har minst én epitop, ved å benytte antistoffer som er spesifikke for det nukleotid-bindende zink-finger-protein. Slike antistoffer karl være enten polyklonale eller monoklonale og benyttes for å påvise ekspresjons-prpdukter som indikerer nærværet av cDNA for det nukleotid-bindende zink-finger-protein. Binding av de oppnådde polypeptider til DNA-mål kan bestemmes ved alternativt å inkorporere radioaktivt merket DNA i målsetet og undersøke på retardering av elektroforetisk mobilitet i forhold til ubundet målsete. j
En foretrukket vektor benyttet for identifisering av avkuttede og/eller i mutageniserte nukleotid-bindende zink-finger-polypeptider er et rekombinant DNA-molekyl (rDNA) som inneholder en nukleotidsekvens som koder for, og er i stand til, å uttrykke et fusjonspolypeptid som i retning fra amino-til-karboksyenden inneholder (1) et prokaryot sekresjonssignal-domene, (2) et heterologt polypeptid og (3) et filamentært fagmembran-forankringsdomene. Vektoren inkluderer DNA-ekspresjons-kontrollsekvenser for å uttrykke fusjonspolypeptidet, fortrinnsvis prokaryote j kontrollsekvenser. j
Den filamentære fagmembran-forankring er fortrinnsvis et domene av cplll eller cpVIII-kappeproteinet som kan forbindes med matriks i en filamentær fagpartikkel, hvorved fusjonspolypeptidet inkorporeres på fag-overflaten.
i
Sekresjonssignalet er et lederpeptid-domene av et protein som bringer proteinet mot den periplasmatiske membran i gramnegative bakterier. Et foretrukket sekresjonssignal er et pelB-sekresjonssignal. De predikene aminosyresekvenser for sekresjonssignal-domenet fra to pelB-genproduktvarianter fra Erwinia carotova er beskrevet av Lei, et al., (Nature, 331:543-546,1988).
Ledersekvensen av pelB-proteinet har tidligere vært benyttet som i sekresjonssignal for fusjonsproteiner (Better, et al., Science, 240:1041-1043, 1988; Sastry, et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 86:5728-5732,1989; og Mullinax, et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 87:8095-8099,1990). Aminosyresekvenser for andre sekresjonssignal-polypeptid-domener fra E. coli og som er egnet for foreliggende oppfinnelse, er omtalt i Oliver, In Neidhard, F.C. (red.), Escherichia coli og Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1:56-69(1987).
Foretrukne membran-forankringer for vektoren kan oppnås fra de filamentære fag M13, f1, fd og likeverdige filamentære fag. Foretrukne membran-forankrings-domener finnes i de kappeproteiner som kodes av gen III og gen VIII. Membran-forankrings-domenet av en filamentær fags kappeprotein er en del åv det karboksyterminale området av kappeproteinet og inkluderer et område av hydrofobe aminosyrerester som strekker seg over en lipid dobbeltlag-membran, og en region av ladede aminosyrerester som normalt finnes på membranens cytoplasma-overflate og rager ut fra membranen. I fag f1 omfatter gen VIII kappeproteinets membran-omspennende region restene Trp-26 til Lys-40, og cytoplasma-regionen omfatter de 11 karboksyterminale restene fra 41 til 52 (Ohkawa, et al., J. Biol. Chem., 256:9951-9958, 1981). Aminosyresekvensen for et foretrukket membran-forankrings-domene avledes derfor fra den filamentære M13 fags gen for kappeprotein VIII (også betegnet cpVIII eller CP 8). Kappeprotein Vlll-genet forekommer på en modén filamentær fag over storparten av fagpartikkelen i typisk ca. 2500 til 3000 kopier av kappeproteinet.
I tillegg avledes aminosyresekvensen av et annet foretrukket membran-forankrings-domene fra det M13 filamentære fags gen for kappeprotein III (også betegnet cplll). Kappeprotein lll-genet forekommer på et modent filamentært fag i den ene enden av fagpartikkelen, typisk med ca. 4 til 6 kopier av kappeproteinet. Angående detaljerte beskrivelser av strukturen av filamentære fagpartikler, deres kappeproteiner og partikkelsammensetning, se oversiktsartikler av Rached, et al.,
I
(Microbiol, Rev., 50:401-427 1986; og Model, et al. i "The Bacteriophages: Vol. 2", R. Calendar, red. Plenum Publishing Co., s. 375-456,1988).
DNA-ekspresjons-kontrollsekvenser omfatter et sett av DNA-ekspresjpns-signaler til å uttrykke et strukturelt genprodukt og inkluderer som kjent både 5'- og 3'-elementer, operativt bundet til cistronet slik at cistronet er i stand til å uttrykke et strukturelt genprodukt. 5'-kontrollsekvensene definerer en promoter for transkripsjonsinitiering og et ribosom-bindingssete operativt bundet til 5'-enden av den oppstrøms translaterbare DNA-sekvens.
For å oppnå høy grad av genekspresjon i E. coli er det ikke bare nødvendig å benytte sterke promotere for å utvikle store menger av mRNA, men også ribosom-bindingsseter for å sikre at mRNA translateres effektivt. I E. coli inkluderer ribosom-bindingssetet et initieringskodon (AUG) og en 3-9 nukleotider lang sekvens lokalisert
i 3-11 nukleotider oppstrøms fra initieringskodonet (Shine, et al., Nature, 254:34, 1975). Sekvensen AGGAGGU, som betegnes Shine-Dalgarno- (SD)-sekvensen, er komplementær til 3'-enden av E. coli 16S rRNA. Binding av ribosomet til mRNA og sekvensen i 3'-enden av mRNA kan påvirkes av flere faktorer:
(i) Graden av komplementaritet mellom SD-sekvensen og 3'-enden av 16S rRNA. (ii) Mellomrommet og eventuelt den RNA-sekvens som ligger mellom SD-sekvensen og AUG (Roberts, et al. Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 76:760, 1979a; Roberts, et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 76:5596,1979b; Guarente, et al., Science, 209:1428,1980; og Guarente, et al., Cell, 20:543,1980). Optimalisering oppnås ved å måle ekspresjonsnivået av gener i plasmider hvor dette mellomrom endres systematisk.
Sammenligning av ulike mRNA viser at statistisk foretrukne sekvenser foreligger fra posisjonene -20 til +13 (hvor A av AUG er posisjon 0) (Gold et al. Annu. Rev. Microbiol., 35:365,1981). Ledersekvenser har vist seg dramatisk å påvirke translasjon (Roberts, et al., 1979a, b, supra). (iii) Nukleotidsekvensen som følger etter AUG som påvirker ribosombindingfTaniguchi, et al., J. Mol. Biol., 118:533,1978).
3'-kontrollsekvensene definerer minst ett terminerings-(stopp) kodon i ramme med, og operativt bundet til, det heterologe fusjonspolypeptid.
Den anvendte vektor inkluderer fortrinnsvis et prokaryot replikasjonsorigo eller replikon, dvs. en DNA-sekvens som har evnen til å styre autonom replikasjon og
opprettholdelse av det rekombinante DNA-molekyl ekstrakromosalt i en prokaryot
i vertscelle, f.eks. en bakteriell vertscelle, transformert med dette. Slike replikasjonsorigo er velkjente. Foretrukne replikasjonsorigo er slike som virker effektivt i vertsorganismen. En foretrukket vertscelle er E. coli. Ved anvendelse av en vektor i E. coli, er et foretrukket replikasjonsorigo ColE1 som forekommer i pBR322 og en rekke andre vanlige plasmider. Dessuten foretrekkes det p15A i replikasjonsorigo som forekommer på pACYC og derivater derav. ColE1- ogjp15A-replikonet har hatt utstrakt anvendelse innen molekylær-biologien, forekommer på en rekke plasmider, og er beskrevet i det minste av Sambrook, et al., MoleculariCloning: a Laboratory Manual, 2. utg., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
ColE1 - og p15A-replikonene er særlig foretrukket for anvendelse i henhold til foreliggende oppfinnelse siden de har evnen til å styre replikasjonen av plasmid i E. coli, mens det andre replikon forekommer i et andre plasmid i den samme E: coli-celle. Det vil med andre ord si at ColE1 og p15A er ikke-interfererende replikoner som gjør det mulig å opprettholde to plasmider i den samme vert (se for eksempel Sambrook, et al., supra, sidene 1.3-1.4).
Hvis et prokaryot replikon er innbefattet er også et gen som forårsaker en selektiv fordel, f.eks. medikamentresistens, i en bakteriell vert som transformeres med dette inkludert. Typiske bakterielle medikamentresistens-gener er slike som gir resistens mot ampicillin, tetracyklin, neomycin/kanamycin eller kloramfenikok Vektorer inneholder også i alminnelighet hensiktsmessige restriksjonsseter for insersjon av translaterbare DNA-sekvenser. Eksempler på vektorer er plasmidene pUC8, pUC9, pBR322 og pBR329, fra BioRad Laboratories (Richmond, CA); og pPL og pKK223 fra Pharmacia (Piscataway, NJ) samt pBS (Stratagene, La Jolla; CA).
Vektoren omfatter en første kassett som inkluderer oppstrøms- og nedstrøms-translaterbare DNA-sekvenser operativt bundet via en nukleotidsekvens tilpasset retningsbestemt ligering til et innskutt DNA. Den oppstrøms translaterbare sekvens koder for det her beskrevne sekresjonssignal. Den nedstrøms translaterbare sekvensen koder for den her beskrevne filamentære fag-membran-forankring* Kassetten inkluderer fortrinnsvis DNA-ekspresjons-kontrollsekvenser for å uttrykke det zink-finger-avledede polypeptid som fremstilles når en innskudds-translåterbar DNA-sekvens (insert DNA) retningsbestemt skytes inn i kassetten via nukleotidsekvensen tilpasset retningsbestemt ligering. Den filamentære fag-
membran-forankring er fortrinnsvis et domene av cplll- eller cpVIII-kappeproteinet
1
som er i stand til å binde en filamentær fag-partikkels matriks, hvorved fusjonspolypeptidet inkorporeres på fag-overflaten. ;
Den zink-finger-avledede polypeptid-ekspresjonsvektor inneholder ogsiå en andre kassett som uttrykker et andre reseptor-polypeptid. Denne kassett nummer to
i inkluderer en andre translaterbar DNA-sekvens som koder for et sekresjonssignal, som her definert, operativt bundet til dets 3'-terminal via en nukleotidsekvens
i tilpasset retningsbestemt ligering til en nedstrøms DNA-sekvens av vektoren som i alminnelighet definerer minst ett stoppkodon i kassettens leseramme. Den andre translaterbare DNA-sekvens er operativt bundet i dens 5'-terminal til DNA-ekspresjons-kontrollsekvenser som danner 5'-elementene. Kassett nummer to kan etter innføring av en translaterbar DNA-sekvens (innskutt DNA) uttrykke det andre fusjonspolypeptid som omfatter en reseptor for sekresjonssignalet med et polypeptid kodet av det innskutte DNA. Sekvensene i kassett nummer to er deleterte. I
I denne sammenheng refererer betegnelsen "vektor" seg til et nukleinsi y■re-molekyl som er i stand til, mellom forskjellige genetiske omgivelser, å overføre en annen nukleinsyre som den operativt er bundet til. Foretrukne vektorer er de som er i stand til autonom replikasjon og ekspresjon av strukturelle genprodukter som forekommer i de DNA-segmenter som de operativt er bundet til. Vektorer inneholder derfor fortrinnsvis de tidligere beskrevne replikoner og selekterbare markører.
Når det gjelder DNA-sekvenser eller segmenter betyr uttrykket "operativt bundet" at sekvensene eller segmentene er kovalent forbundet, fortrinnsvis ved konvensjonelle fosfodiester-bindinger, til en DNA-kjede, enten de er i enkelt- eller dobbeltkjedet form. Valget av vektor som en transkripsjonsenhet eller en kassett er operativt bundet til, avhenger som kjent direkte av de funksjonelle egenskaper som ønskes, f.eks. vektor-replikasjon og proteinekspresjon, og av den vertscelle som skal transformeres, begrensninger som naturlig ligger i konstruksjonen av rekombinante DNA-molekyler. I
En nukleotidsekvens tilpasset retningsbestemt ligering, dvs. en polylinker, er
i
et område av DNA-ekspresjonsvektoren som (1) operativt binder seg for replikasjon og transporterer de oppstrøms og nedstrøms translaterbare DNA-sekvenser, og (2) sørger for et sete eller anordninger for retningsbestemt ligering av en DNA-sekvens i vektoren. En retningsbestemt polylinker er i alminnelighet en nukleotidsekvens som definerer to eller flere gjenkjenningssekvenser eller restriksjonsseter for to eller flere restriksjons-endonukleaser. Etter restriksjonsspaltning fører de to setene til klebrige
i
ender som en translaterbar DNA-sekvens kan ligeres til DNA-ekspresjonsvektoren med. Fortrinnsvis fører de to restriksjonssetene etter restriksjonsspaltning, til iklebrige ender som er ikke-komplementære, hvorved de tillater retningsbestemt insersijo<n> av en translaterbar DNA-sekvens i kassetten. I en utførelsesform bevirkes de retningsbestemte ligeringsanordninger av nukleotider som forekommer i den! oppstrøms translaterbare DNA-sekvens, nedstrøms translaterbare DNA-sekvens eller begge. I en annen utførelsesform omfatter nukleotidet som er tilpasset retningsbestemt ligering, en nukleotidsekvens som definerer flere retningsbestemte kloningsanordninger. Når nukleotidsekvensen tilpasset retningsbestemt ligering definerer flere restriksjonsseter, omtales det som et polykloningssete.
I en foretrukket utførelsesform konstrueres en lett manipulerbar DNA-j ekspresjonsvektor i form av en filamentær fag-partikkel som innkapsler DNAjsom koder for de nukleotid-bindende zink-finger-polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse. I henhold til denne utførelsesform inneholderen DNA-ekspresjonsvektor dessuten en nukleotidsekvens som definerer replikasjonsorigo for en filamentær fag, slik at vektoren etter presentasjon av den passende genetiske komplementasjon, kan replikeres som en filamentær fag i enkeltkjedet, replikativ form og pakkes i filamentære fag-partikler. Dette trekk gjør det mulig for DNA-ekspresjonsvektoren å pakkes i fag-partikler for senere utskilling av partikkelen, og vektoren i denne, fra andre partikler som utgjør en fag-partikkel-populasjon, ved anvendelse av velkjent screeningteknikk.
En filamentær fags replikasjonsorigo er som kjent en region av fag-gehomet som definerer seter for replikasjonsinitiering, replikasjonsterminering og pakking av den replikative form fremstillet ved replikasjon (se for eksempel Rasched, et al., Microbiol. Rev., 50:401-427,1986; og Horiuchi, J. Mol. Biol., 188:215-223,1986).
i
Et foretrukket replikasjonsorigo for en filamentær fag for anvendelse ijhenhold til foreliggende oppfinnelse, er et M13-, f1- eller fd-fags replikasjonsorigo (Short, et al., Nucl. Acids Res., 16:7583-7600,1988). Foretrukne DNA-ekspresjonsvekWer er
ekspresjonsvektorene modifisert pCOMB3 nærmere bestemt pCOMB3.5.
i Fremstillingen av en DNA-sekvens som koder for et nukleotid-bindende zink-finger-polypeptid kan skje ved hjelp av oligonukleotider som er primere for amplifikasjon av det genomiske polynukleotid som koder for et nukleotid-bindende zink-finger-polypeptid. Disse unike oligonukleotid-primerne kan fremstilles på basis av de flankerende regioner som er sammenhengende med det polynukleotid som
koder for det nukleotid-bindende zink-finger-polypeptid. Disse oligonukleotid-primerne omfatter sekvenser som er i stand til å hybridisere med den flankerende nukleotidsekvens som koder for et nukleotid-bindende zink-finger-polypeptid og sekvenser som er komplementære med denne, og kan benyttes for å innføre' punktmutasjoner i amplifikasjonsproduktene.
Primerne anvendt heri inkluderer oligonukleotider av tilstrekkelig lengde og riktig sekvens, slik at det oppnås spesifikk polymeriserings-initiering av et betydelig antall nukleinsyrer i det polynukleotid som koder for det nukleotid-bindende zink-finger-polypeptid. Nærmere bestemt refererer betegnelsen "primer" i denne j sammenheng, seg til en sekvens som omfatter to eller flere, fortrinnsvis mer enn tre, deoksyribonukleotider eller ribonukleotider, hvor sekvensen er i stand til å initiere
i syntese av et primer-ekstensjonsprodukt som i det vesentlige er komplementært til en nukleotid-bindende zink-finger-proteinkjede, men som også kan innføre mutasjoner i amplifikasjonsproduktene i utvalgte restseter. Eksperimentelle i betingelser som fører til syntese, innbefatter nærvær av nukleosid-trifosfater og et middel for polymerisering og ekstensjon, som f.eks. DNA-polymerase, samt passende buffer, temperatur og pH. Primeren er for å oppnå maksimal
amplifiseringseffektivitet, fortrinnsvis enkeltkjedet, men kan også være dobbeltkjedet. Dersom den er dobbeltkjedet må primeren først behandles for å skille de to kjedene før anvendelsen for fremstilling av ekstensjonsprodukter. Fortrinnsvis er primeren et oligodeoksyribonukleotid. Primeren må være tilstrekkelig lang til å utløse syntese av ekstensjonsprodukter i nærvær av polymeriserings-induksjonsmidlet, og ekstensjon av nukleotidene. Den nøyaktige primerlengde vil avhenge av mange faktorer, inklusivt temperatur, buffer og nukleotid-sammensetning. Oligonukleotid-primere inneholder i alminnelighet 15-22 eller flere, nukleotider, men kan også inneholde færre. Som et velkjent alternativ kan blandingen av nukleosid-trifosfater være forfordelt for å påvirke dannelsen av mutasjoner, slik at det oppnås et bibliotek av cDNA som koder for antatte nukleotid-bindende zink-finger-polypeptider som kan underkastes screening i en funksjonsbestemmelse for binding til et nukleotid-bindende zink-finger-motiv, så som et i en promoter, hvor bindingen inhiberer transkripsjonsaktivering.
Primere anvendt heri er konstruert for å være "i det vesentlige" komplementære til et segment av hver polynukleotidkjede som koder for det
nukleotid-bindende zink-finger-protein som skal amplifiseres. Dette betyr at primerne i
må være tilstrekkelig komplementære til å hybridisere med deres respektive kjeder under betingelser som tillater midlet for polymerisering og nukleotid-ekstensjon å virke. Med andre ord må primerne ha tilstrekkelig komplementaritet med de i flankerende sekvenser til å hybridisere med disse, og muliggjøre amplifikasjdn av det polynukleotid som koder for det nukleotid-bindende zink-finger-protein. Fortrinnsvis har primerne eksakt komplementaritet med den flankerende sekvenskjede.
Oligonukleotidprimere benyttes i amplifikasjonsprosessen som er en enzymatisk kjedereaksjon som produserer eksponentielle mengder av polynukleotid som koder for det nukleotid-bindende zink-finger-polypeptid, i forhold til det antall reaksjonstrinn som inngår. Den ene primer er i alminnelighet komplementærjtil den negative (-)kjede av det polynukleotid som koder for det nukleotid-bindende zink-finger-protein, og den andre er komplementær til den positive (+)kjede. Hybridisering av primerne til denaturert nukleinsyre med påfølgende ekstensjon, med et enzym, så som det store fragment av DNA-polymerase I (Klenow) og nukleotider, resulterer i nysyntetiserte (+)- og (-)-kjeder som inneholder den nukleotid-bindende zink-jfinger-proteinsekvens. Siden disse nysyntetiserte sekvensene også er templater, resulterer gjentatte runder med denaturering, primer-hybridisering, og ekstensjon i eksponentiell produksjon av sekvensen (dvs. det nukleotid-bindende zink-finger-
proteins polynukleotidsekvens) definert av primeren. Produktet av kjedereaksjonen
i
er en enkelt nukleinsyre-dupleks med ender som tilsvarer endene av de spesifikt anvendte primere. Fagmannen vil kjenne til annen amplifikasjonsmetodikk som også kan benyttes for å øke kopiantallet av mål-nukleinsyren. Disse kan for eksempel være LAT (ligation activated transcription, LCR (ligase chain reaction) og SDA
(strand displacement activation) selv om PCR er en den foretrukne metode.'
Oligonukleotid-primerne kan fremstilles ved å benytte en hvilken som helst
l passende metode, som f.eks. konvensjonelle fosfotriester- og fosfodiester-rrietoder eller automatiserte utførelsesformer av disse. I en slik automatisert utførelsesform benyttes dietylfosforamiditter som utgangsmaterialer, og disse kan syntetiseres som beskrevet av Beaucage, et al., (Tetrahedron Letters, 22:1859-1862,1981). En metode for syntetisering av oligonukleotider på en modifisert fast bærer er beskrevet i US-patent 4.458.066. En amplifiseringsmetode som kan benyttes i henhold i til oppfinnelsen er den PCR (polymerase chain reaction) som er beskrevet i US-patent 4.683.202 og 4.683.195. ;
i ■
I
Fremgangsmåter for utnyttelse av filamentære fag-bibliotek for å oppnå mutasjoner av peptidsekvenser, er omtalt i US-patent 5.223.409 til Ladner, et al., som herved inkorporeres med hele sitt innhold i foreliggende beskrivelse,
Den randomiserte nukleotid-substitusjonen kan foretas på det DNA sqm koder for en eller flere fingre av et kjent zink-finger-protein for å oppnå et avledet polypeptid som modifiserer genekspresjon etter binding til et sete på det DNA som inneholder genet, så som et transkripsjonelt kontrollelement. I tillegg til modifikasjoner i ele aminosyrer som utgjør zink-fingeren, kan det zink-finger-avledede polypepti^ inneholde flere eller færre enn det antall fingre som inngår i det villtypeprotein som det er avledet f ra.
Selv om en hvilken som helst sete-rettet mutagenesemetode kan benyttes for å foreta mutagensen, utnytter den metode som fortrinnsvis benyttes for å randomisere det segment av zink-finger-proteinet som skal modifiseres, et forråd av degenererte oligonukleotid-primere som inneholder en pluralitet av triplett-kodoner
som har formelen NNS eller NNK (og dets komplement NNM), hvor S enten jer G
i
eller C, K enten er G eller T, M enten er C eller A (komplementet av NNK) og hvor N
l
kan være A, C, G eller T. I tillegg til de degenererte triplett-kodoner, inneholder de degenererte oligonukleotid-primerne også minst ett segment konstruert for å hybridisere til det DNA som koder for villtype-zink-finger-proteinet i det minste i en ende, og dette gjøres bruk av i suksessive runder av PCR-amplifisering, kjent på området som overlappsekstensjons-PCR, slik at det frembringer en spesifisert degenererthets-region, omsluttet av de ikke-degenererte primer-regionene i primer-forrådet.
Metodene for overlapps-PCR slik de benyttes til å randomisere spesifikke regioner av en cDNA, er velkjente på området og illustreres ytterligere i Eksempel 3 nedenfor. De degenererte produktene av overlapps-PCR-reaksjonene slås sammen og gelrenses, fortrinnsvis ved gelfiltrering eller gelelektroforese, før ligering inn i en overflate-presenterende fag-ekspresjonsvektor for å danne et bibliotek for ! påfølgende screening mot et kjent eller antatt nukleotid-bindende zink-fingerj-motiv.
De degenererte primerne benyttes i suksessive PCR-amplifiseringsruhder som på området er kjent som overlap extension PCR, slik at det frembringes et bibliotek av cDNA-sekvenser som koder for antatte zink-finger-avledede DNA-bindende polypeptider. Vanligvis inneholder de avledede polypeptider et omIråde av degenererthet som tilsvarer den region av fingeren som binder seg til DNA (vanligvis i ■
i
i fingerspiss- og i ct-helix-regionen) omsluttet av ikke-degenererte regioner som tilsvarer de konserverte finger-regioner som er nødvendige for å bibeholde fingerens tredimensjonale struktur.
En hvilken som helst nukleinsyreprøve, i renset eller urenset form, kari benyttes som utgangs-nukleinsyre for ovennevnte prosedyrer under forutsetning av at den inneholder eller antas å inneholde, den spesifikke nukleinsyresekvens av et nukleotid-bindende zink-finger-protein ifølge oppfinnelsen. Fremgangsmåten; kan for eksempel benytte DNA eller RNA, inklusivt mRNA, hvor DNA eller RNA kan være
enkeltkjedet eller dobbeltkjedet. Dersom RNA skal benyttes som templat, vil det bli
i<1 >benyttet enzymer og/eller betingelser som er optimale for revers transkribering av templatet til DNA. Dessuten kan det benyttes en DNA-RNA-hybrid som inneholder en kjede av hver. Det kan også anvendes en blanding av nukleinsyrer eller nukleinsyrer fremstillet gjennom en tidligere amplifikasjonsreaksjon, ved å benytte de samme eller forskjellige primere. Den spesifikke nukleinsyresekvens som skal amplifiseres, dvs. den nukleotid-bindende zink-finger-proteinsekvens, kan være en del av et større molekyl eller opprinnelig foreligge som et diskret molekyl, slik at den spesifikke sekvens utgjør hele nukleinsyren. Det er ikke nødvendig at sekvensen som skal amplifiseres i utgangspunktet foreligger i ren form, idet den kan være en mindre del av en kompleks blanding, f.eks. hele det humane DNA eller DNA fra en hvilken som helst organisme. Eksempelvis omfatter DNA-kilden prokaryoter, eukaryoter, virus og planter.
Når målnukleinsyresekvens av prøven inneholder to kjeder, er det nødvendig
å adskille nukleinsyrekjedene før anvendelsen som templat. Kjedeseparasjon kan foretas enten som et eget trinn eller samtidig med syntesen av primer-ekstensjonsproduktene. Denne kjedeseparasjon kan oppnås ved å benytte forskjellige egnede denatureringsbetingelser, inklusivt fysikalske, kjemiske eller enzymatiske anordninger, og ordet "denaturering" inkluderer alle disse. En fysikalsk metode for å separere nukleinsyrekjeder består i å oppvarme nukleinsyren inntil den er! denaturert. Typisk varmedenaturering skjer ved temperaturer fra ca. 80° til 105°C i tidsrom varierende fra 1 til 10 minutter. Kjedeseparasjon kan også induseres ved hjelp av et enzym av den enzymklasse som betegnes helicaser eller ved hjelp av enzymet RecA, som har helicaseaktivitet og som i nærvær av riboATP, er kjent for å denaturere DNA. De reaksjonsbetingelsene som er egnet for kjedeseparasjon av nukleinsyrer med helicaser, er beskrevet av Kuhn Hoffrhann-Berling (CSH- j
Quantitative Biology, 43:63,1978), og en oversikt over teknikker for bruk av RecA fremgår av C. Radding (Ann. Rev. Genetics, 16:405-437,1982).
Hvis nukleinsyren som inneholder sekvensen som skal amplifiseres, er enkeltkjedet, syntetiseres dens komplement ved tilsetning av en eller to i oligonukleotid-primere. Benyttes en enkelt primer, syntetiseres et primer- 1 ekstensjonsprodukt i nærvær av en primer, et polymeriseringsmiddel og de fire nedenfor beskrevne nukleosid-trifosfater. Produktet vil være delvis kompleméntært til den enkeltkjedede nukleinsyre og vil hybridisere med en enkeltkjedet nukleinsyre for å danne en dupleks av kjeder med ulik lengde og som deretter kan separeres i enkeltkjeder for å frembringe to enkle adskilte komplementære kjeder. Som et alternativ kan to primere tilsettes til den enkeltkjedede nukleinsyre og reaksjonen utføres som beskrevet.
Når komplementære kjeder av nukleinsyrer separeres, er de separerte kjedene, uansett hvorvidt nukleinsyren opprinnelig var dobbelt- eller enkeltkjedet, klar for anvendelse som templat for syntesen av ytterligere nukleinsyrekjeder. Denne syntese foretas under betingelser som muliggjør hybridisering av primere til templater. I alminnelighet foregår syntesen i en buffret, vandig løsning, fortrinnsvis ved pH 7-9, helst ved ca. 8. Fortrinnsvis tilsettes et molart overskudd (for genomisk nukleinsyre vanligvis ca. 10<8>:1 primentemplat) av de to oligonukleotid-primeme til bufferen som inneholder den fraskilte templatkjede. Det er imidlertid klart at mengden av komplementær kjede ikke nødvendigvis er kjent dersom fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen benyttes for diagnostiske anvendelser, og mengden av primer i forhold til mengden av komplementær kjede kan derfor ikke med sikkerhet bestemmes. I praksis vil imidlertid mengden av tilsatt primer generelt utgjøre et molart overskudd i forhold til mengden av komplementær kjede (templat) når den sekvens som skal amplifiseres inngår i en blanding av kompliserte langkjedede nukleinsyrekjeder. Et stort molart overskudd er å foretrekke for å forbedre prosesseffektiviteten.
Deoksyribohukleotid-trifosfatene dATP, dCTP, dGTP og dTTP tilsettes til synteseblandingen, enten hver for seg eller sammen med primerne, i passende mengder, hvorpå den resulterende løsning oppvarmes til ca. 90-100°C fra ca. 1 til 10 minutter, fortrinnsvis fra 1 til 4 minutter. Etter denne oppvarmingsperioden får løsningen avkjøles til en foretrukket temperatur for primerhybridiseringen. Den avkjølte blanding tilsettes et passende middel for å bevirke primer-ekstensjons-reaksjonen (her kalt "polymerisasjonsmiddel"), og reaksjonen får foregå under betingelser som er kjent på området. Polymerisasjonsmidlet kan også tilsettes sammen med de øvrige reagenser dersom det er varmestabilt. Denne syntese- (eller amplifikasjons-)reaksjon kan foregå ved romtemperatur og opp til en temperatur over det punkt hvor polymerisasjonsmidlet ikke lenger virker. Det er mest hensiktsmessig at reaksjonen foregår ved romtemperatur.
i Polymerisasjonsmidlet kan være en forbindelse eller et system som vil ha den virkning at syntesen av primer-ekstensjonsproduktene, inklusivt enzymer, oppnås. Passende ensymer for dette formål innbefatter for eksempel E. coli DNA-polymerase I, Klenow-fragment av E. coli DNA-polymerase I, T4 DNA-polymerase, andre tilgjengelige DNA-polymeraser, polymerase-muteiner, revers transkriptase såmt andre enzymer, inklusivt varmestabile enzymer (dvs. enzymer som forårsaker primer-ekstensjon etter å være utsatt for tilstrekkelige høye temperaturer til å forårsake denaturering. Egnede enzymer vil lette riktig kombinasjon av nukleotidene slik at primer-ekstensjonsprodukter som er komplementære til hver nukleotid-bindende zink-finger-proteins nukleinsyrekjede, dannes. I alminnelighet vil syntesen
bli startet i 3'-enden av hver av primerne og foregå i 5'-retningen langs templatkjeden inntil syntesen avsluttes under dannelse av molekyler av forskjellige lengder! Det kan imidlertid finnes polymerisasjonsmidler som initierer syntesen i 5'-enden og fortsetter i den motsatte retning under bruk av den ovenfor beskrevne prosess.
Den nysyntetiserte nukleotid-bindende zink-finger-polypeptidkjede og dens komplementære nukleinsyrekjede vil danne et dobbeltkjedet molekyl under ovenfor beskrevne hybridiseringsbetingelser, og denne hybrid benyttes i senere trinn av prosessen. I det neste trinn underkastes det nysyntetiserte dobbeltkjedede molekyl denatureringsbetingelser ved å benytte en hvilken som helst av de ovenfor beskrevne fremgangsmåter for å oppnå enkeltkjedede molekyler.
Den ovenfor beskrevne prosess gjentas på de enkeltkjedede molekylene. Om nødvendig kan det tilsettes mer av polymeriseringsmidler, nukleotider og primere for at reaksjonen skal fortsette under de ovenfor beskrevne betingelser. Syntesen vil også her bli initiert i hver ende av hver av oligonukleotid-primerne og vil skjej langs templatets enkle kjeder for å danne mer nukleinsyre. Etter dette trinn vil halvparten av ekstensjonsproduktet bestå av den bestemte nukleinsyresekvens bundet av de to
primerne.
i
Denatureringstrinnet og syntesen av ekstensjonsproduktet kan gjentas så
i mange ganger som det er behov for, for å amplifisere det nukleotid-bindende
i ■ proteins zink-finger-nukleinsyresekvens i tilstrekkelig grad for deteksjon. Mengden av den bestemte nukleinsyresekvens som dannes vil akkumuleres eksponentielt.
Sekvenser amplifisert etter fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen kan \
i ytterligere evalueres, påvises, klones .sekvenseres og lignende, enten i løsning eller
i
etter binding til en fast bærer, ved hjelp av en hvilken som helst metode som<1 >vanligvis benyttes for påvisning av en spesifikk DNA-sekvens, som f.eks. PCR, oligomer-restriksjon (Saiki, et al., Bio/Technology, 3:1008-1012,1985), allele-spesifikk oligonukleotid (ASO)-probe-analyse (Conner, et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 80:278,1983), oligonukleotidl-igerings-assays (OLAs) (Landegren, et al., Science, 241:1077,1988) og lignende. Molekylære teknikker for DNA-analyse er beskrevet i en oversikt av Landegren, et al., Science, 242:229-237,1988). Fortrinnsvis kan nye zink-finger-avledede DNA-bindende polypeptider ifølge oppfinnelsen isoleres ved å benytte ovennevnte teknikker, hvor primerne tillater modifikasjon, som f.eks. substitusjon, av nukleotider, slik at det dannes unike zink-fingre (angående ytterligere detaljer, se eksempler).
I forbindelse med foreliggende oppfinnelse kan nukleotidsekvensene som koder for det nukleotid-bindende zink-finger-polypeptid, skytes inn i en rekombinant ekspresjonsvektor. Betegnelsen "rekombinant ekspresjonsvektor" refererer seg til et plasmid, virus eller annen kjent bærer, som er blitt manipulert ved insersjon eller inkorporering av genetiske sekvenser for zink-fingér-avledede nukleotid-bindende proteiner. Slike ekspresjonsvektorer inneholder en promotersékvens som forenkler effektiv transkripsjon av den innskutte genetiske sekvens i verten. Ekspresjonsvektoren inneholder typisk et replikasjonsorigo, en promoter, så vel som spesifikke gener som tillater fenotypisk seleksjon av de transformerte celler. Vektorer egnet for bruk i forbindelse med foreliggende oppfinnelse, inkluderer, men er ikke begrenset til, den T7-baserte ekspresjonsvektor for ekspresjon i bakterier (Rosenberg, et al. Gene, 56:125,1987), pMSXND-ekspresjonsvektoren for ekspresjon i pattedyrceller (Lee & Nathans, J. Biol. Chem., 263:3521,1988) og baculovirus-avledede vektorer for ekspresjon i insektceller. DNA-segmentet kan i vektoren foreligge operativt knyttet til regulerende elementer som for eksempel en promoter (f.eks. T7-, metallotionein I-eller polyhedrin-promotere).
DNA-sekvenser som koder for nye nukleotid-bindende zink-finger-polypeptider i ifølge oppfinnelsen kan uttrykkes in vitro gjennom DNA-overføring til én passende vertscelle. "Vertsceller" er celler hvor en vektor kan frembringes og dens DNA uttrykkes. Betegnelsen inkluderer også et hvilket som helst avkom av angjeldende vertscelle. Det er underforstått at avkommet ikke må være identisk med opphavscellen, siden mutasjoner som inntrer under replikasjon kan forekomme. Denne type avkom er imidlertid inkludert når betegnelsen "vertscelle" benyttes. Metoder for stabil overføring, hvilket vil si at det fremmede DNA kontinuerlig , opprettholdes i verten, er kjent på området.
Transformasjon av en vertscelle med rekombinant DNA kan foretas véd hjelp av konvensjonelle, velkjente teknikker. Når verten er prokaryot, så som E. coli, kan det fremstilles kompetente celler som er i stand til DNA-opptak, fra celler høstet etter i
en eksponentiell vekstfase og som deretter behandles med CaCI2-metoden etter
i velkjente prosedyrer. Alternativt kan MgCI2 eller RbCI benyttes. Transformasjon kan også foretas etter dannelse av en protoplast av vertscellen eller ved elektroporering.
Når verten er en eukaryot, kan det benyttes slike metoder som transféksjon av DNA, som kalsiumfosfat-ko-presipitater, konvensjonelle mekaniske prosedyrer som mikroinjeksjon, elektroporering, innføring av et plasmid innelukket i liposomer, eller virusvektorer.
Et utvalg av verts-ekspresjonsvektorsystemer kan utnyttes for å uttrykke den zink-finger-avledede nukleotid-bindende kodende sekvens. Disse innbefatter, men er ikke begrenset til, mikroorganismer som f.eks. bakterier transformert med rekombinant bakteriofag-DNA-, plasmid-DNA- eller kosmid-DNA-ekspresjonsvektorer som inneholder en zink-finger-avledet nukleotid-bindende polypeptid-kodende sekvens; gjær transformert med rekombinant gjær-ekspresjonsvektorer som inneholder den kodende sekvens for den nukleotid-bindende zink-finger; plantecellesystemer infisert med rekombinante virusekspresjonsvektorer (f.eks. CaMV (cauliflower mosaic virus); TMV (tobakk mosaikkvirus)) eller transformert med rekombinante plasmid-ekspresjonsvektorer (f.eks. Ti-plasmid) inneholdende en zink-i finger-avledet DNA-bindende kodende sekvens; insektcellesystemer infisert, med
rekombinant virusekspresjonsvektorer (f.eks. baculovirus) inneholdende en
i nukleotid-bindende zink-finger-kodende sekvens; eller dyrecellésystemer infisert med rekombinante virusekspresjonsvektorer (f.eks. retrovirus, adenovirus, vaccinia-virus) inneholdende en zink-finger-avledet nukleotid-bindende kodende sekvens eller
I
transformerte dyrecellesystemer utviklet for stabil ekspresjon. I slike tilfeller Hvor glykosylering kan være viktig, kan det benyttes ekspresjonssystem som sørger for translasjonene og post-translasjonelle modifikasjoner, f.eks. pattedyr-, insekt-', gjær-eller plante-ekspresjonssystemer.
Avhengig av det anvendte vert/vektor-system kan ett av en rekke passende
i transkripsjons- og translasjons-elementer, inklusivt konstitutive og induserbare promotere, transkripsjons-forbedringselementer, transkripsjonsterminatorer ejtc, benyttes i ekspresjonsvektoren (se f.eks. Bitter, et al., Methods in Enzymology, 153:516-544,1987). Når kloningen for eksempel foregår i bakterielle systemer, kan det benyttes induserbare promotere så som pL av bakteriofag X, plac, ptrp, ptac (ptr-lac hybridpromotere) og lignende. Når kloningen foretas i pattedyrcellesystemer, kan promotere avledet fra genomet til pattedyrceller (f.eks. metallotionein-promoter) eller fra pattedyrvirus (f.eks. retrovirusets LTR (long terminal repeat); den serie promoter av adenovirus; vaccinia-virus 7,5K promotoren) benyttes. Promotere
fremstillet ved rekombinant DNA-teknikk eller ved syntese, kan også benyttes for å
i oppnå transkripsjon av det nukleotid-bindende zink-f inge r-polypeptids kodende sekvens.
I bakteriesystemer kan det med fordel velges en rekke ekspresjonsvektorer som avhenger av hvilken anvendelse det zink-finger-avledede uttrykte nukleotid-bindende polypeptid er ment for. Når det for eksempel skal produseres større mengder, kan det være ønskelig å velge vektorer som styrer ekspresjonen av større mengder fusjonsproteinprodukter som lett lar seg rense. De som er konstrueirt for å inneholde et spaltningssete for å bidra til gjenvinning av proteinet, foretrekkes. Slike vektorer innbefatter, men er ikke begrenset til, E. coli-ekspresjonsvektoren pUR278 (Ruther, et al., EMBO J., 2:1791,1983), hvor den kodende sekvens for det nukleotid-i bindende zink-finger-protein kan ligeres inn i vektoren i ramme med den lac jZ-kodende region, slik at det dannes et hybrid zink-finger-lac-Z-protein. pIN-vektorer
(Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res., 13:3101-3109,1985, Van Heeke & Sphuster, J. Biol. Chem., 264:5503-5509,1989) og lignende.
I gjær kan det benyttes en rekke vektorer som inneholder konstitutivei eller induserbare promotere. Angående en oversikt, se Current Protocols in Molecular Biology, Bd. 2,1988, Red. Ausubel, et al., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, kapittel 13: Grant, et al., 1987, Expression and Secretion Vectors for Yeast, i Metods in Enzymology, red. Wu & Grossman, 31987, Acad. Press, N.Y., Bd.
153, s. 516-544; Glover, 1986, DNA Cloning, Bd. II, IRL Press, Wash., D.C. kapittel 3; og Bitter, 1987, Heterologous Gene Expression in Yeast, Methods in Enzymology, red. Berger & Kimmel, Acad. Press. N.Y. Bd. 152, s. 673-684; og The Molecuiar Biology of the Yeast Saccharomyces, 1982, red. Strathem et al., Cold Spring Harbor Press, Bd. I og II. En konstitutiv gjær-promoter som f.eks. ADH eller LEU2 eller en induserbar promoter som f.eks. GAL, kan benyttes (Cloning in Yeast, kapittel 3, R. Rothstein: DNA Cloning Bd. II, A Practical Approach, red. DM Glover, 1986, (RL Press, Wash., D.C). Alternativt kan vektorer som fremmer integrasjon av frernmede DNA-sekvenser i gjærkromosomet, benyttes.
i I de tilfeller hvor det benyttes planter som ekspresjonsvektorer, kan ekspresjonen av et nukleotid-bindende zink-f inger-polypeptids kodende sekvens styres av én av en rekke promotere. For eksempel kan virale promotere så som
35S RNA- og 19S RNA-promotere av CaMV (Brisson, et al., Nature, 310:511-514, 1984) eller kappeprotein-promoteren til TMV (Takamatsu, et al., EMBO J„ 6:307-
i 311,1987) benyttes. Alternativt kan plantepromotere så som den lille subenheten av RUBISCO (Coruzzi, et al., EMBO J. 3:1671-1680,1984; Broglie, et al., Science, 224:838-843,1984) eller varmesjokk-promotere, f.eks. soyabønne hsp17.5-E eller hsp17.3-B (Gurley, et al., Mol. Cell. Biol., 6:559-565,1986) benyttes. Disse konstruksjonene kan innføres i planteceller ved å benytte Ti-plasmider, Ri-plasmider, plantevirusvektorer, direkte DNA-transformasjon, mikroinjeksjoh, eléktroporering, etc. Angående oversiktsartikler om slike teknikker, se for eksempel Weissbach & Weissbach, Methods for Plant Molecuiar Biology, Academic Press, NY. del VIII, s. 421-463,1988; og Grierson & Corey, Plant Molecuiar Biology, 2. utg., Blackie, London, kapittel 7-9,1988.
Et alternativt ekspresjonssystem som kan benyttes for å uttrykke et protein
ifølge oppfinnelsen er et insektsystem. I et slikt system benyttes det Autographa califomica nukleære polyhedrose-virus (AcNPV) som vektor for å uttrykke fremmede gener. Viruset dyrkes i Spodoptera frugiperda-celler. Det nukleotid-bindende zink-finger-polypeptids kodende sekvens kan klones inn i ikke-essensielle regioner (Spodoptera frugiperda, for eksempel polyhedrin-genet) av viruset og settes under kontroll av en AcNPV-promoter (for eksempel polyhedrin-promoteren). Vellykket innføring av det nukleotid-bindende zink-f inger-polypeptids kodende sekvens vil resultere i inaktivering av polyhedrin-genet og produksjon av ikke-okkludert rekombinant virus (dvs. virus som mangler proteinkappen som kodes av polyhedrin-
genet). Disse rekombinante virus benyttes deretter til å infisere celler som det innskutte gen uttrykkes i (se f.eks. Smith, et al., J. Biol. 46:584,1983; Smith, US-patent 4.215.051).
Eukaryote systemer, og fortrinnsvis pattedyr-ekspresjonssystemer, beyirker at det kan skje riktige post-translasjonelle modifikasjoner av uttrykte pattedyrproteiner. Eukaryote celler, så som pattedyrceller, som har det cellulære maskineri for riktig prosessering av det primære transkript, glykosylering, fosforylering og vellykket sekresjon av genproduktet, utgjør derfor foretrukne vertsceller for ekspresjoniav et zink-finger-avledet nukleotid-bindende polypeptid. Slike vertscelle-linjer kan innbefatte, men er ikke begrenset til CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, -293 og WI38.
Pattedyr-cellesystemer som benytter rekombinante virus eller viruselementer
i
for å styre ekspresjonen, kan konstrueres. Ved bruk av adenovirus-ekspresjonsvektorer kan den kodende sekvens av et zink-finger-avledet polypeptid for eksempel ligeres til transkripsjon/translasjon-kontrollkomplekset i et adenoIvirus, f.eks. den sene promoter- og den tredelte leder-sekvensen. Dette kimære gen kan deretter skytes inn i adenovirusets genom ved in vitro eller in vivo rekombinasjon. Insersjon i en ikke-essensiell region av det virale genom (f.eks. region E1 eller E3) vil resultere i et rekombinant virus som er levedyktig og i stand til å uttrykke zink-f inger-polypeptidet i infiserte verter (f.eks. se Logan & Shenk, Proe. Nati. Acad. Sei. USA , 81:3655-3659,1984). Alternativt kan vacciniavirusets 7,5K-promoter benyttes (f.eks. se Mackett, et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 79:7415-7419, 1982; Mackett, et al., J. Virol. 49:857-864,1984; Panicali, et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 79:4927-4931, 1982). Særlig interessante er vektorer basert på bovint papillomavirus som har evnen til replikasjon som ekstrakromosomale elementer (Sarver, et al. Mol. Geil. Biol. 486,1981). Kort tid etter at dette DNA er kommet inn i museceller, replikeres plasmidet til 100 til 200 kopier per celle. Transkripsjon av det innskutte cDNA fordrer ikke integrasjon av plasmidet i vertens kromosom, og fører derved til et høyt' ekspresjonsnivå. Disse vektorene kan benyttes til stabil ekspresjon ved å inkludere en selekterbar markør i plasmidet, som f.eks. neo-genet. Alternativt kan det retrovirale genom modifiseres for anvendelse som en vektor som er i stand til å innføre og styre ekspresjonen av genet for det nukleotid-bindende zink-finger-protein i vertsceller (Cone & Mulligan, Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 81:6349-6353,1984).
Høyt ekspresjonsnivå kan også oppnås ved å indusere promotere, inklusivt, men
ikke begrenset til, metallotionin IIA-promoteren og varmesjokk-promoterne. ',
i
For produksjon av rekombinante proteiner i et høyt utbytte over lang tid, foretrekkes stabil ekspresjon. Fremfor å benytte ekspresjonsvektorer som inneholder virale replikasjonsorigo, kan vertsceller transformeres med et cDNA som kontrolleres av passende ekspresjons-kontrollelementer (f.eks. promoter-, enhancer-sekvenser, transkripsjonsterminatorer, polyadenyleringsseter, etc.) og en selekterbar markør. Den selekterbare markør i det rekombinante plasmid, befordrer resistens mot seleksjon og lar celler stabilt integrere plasmidet i deres kromosomer og vokse for å danne foci som på sin side kan klones og ekspanderes i cellelinjer. Etter innføring av fremmed DNA, kan for eksempel manipulerte celler få vokse i 1-2 dager i et anriket medium og deretter overføres til et selektivt medium. Det kan benyttes en rekke
i seleksjonsystemer, inklusivt, men ikke begrenset til, herpes simplex-virusets thymidinkinase (Wigler, et al., Cell, 11:223,1977), hypoksantin-guanin-fosforibosyltransferase (Szybalska & Szybålski, Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 48:2026,1962) og aderiin-fosforibosyltransferase (Lowy, et al., Cell, 22:817,1980) gener som kan benyttes i henholdsvis tk-, hgpif- eller apif-celler. Også gener som fører til antimetabolitt-resistens kan benyttes som grunnlag for seleksjon, for
eksempel genene for dhfr, som gir resistens mot metotrexat (Wigler, et al. Nati. Acad. Sei. USA, 77:3567,1980; 0'Hare, et al. Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 78:1527, 1981); gpt som gir resistens mot mycophenolsyre (Mulligan & Berg, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 78:2072,1981); neo som gir resistens mot aminoglykosidet G-418 (Colberre-Garapin, et al., J. Mol. Biol., 150:1,1981); og hygro, som gir resistens mot
i hygromycin (Santerre, et al., Gene, 30:147,1984). Det er dessuten nylig beskrevet ytterligere selekterbare gener, nemlig trpB, som lar celler utnytte indol i stedet for tryptofan; hisD som lar celler utnytte histinol i stedet for histidin (Hartman & Mulligan, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 85:804,1988) og ODC (omitin-dekarboksylase) som gir resistens mot ornitin-dekarboksylaseinhibitoren, 2-(difluormetyl)-DL-ornitin, DFMO (McConlogue, L, i: Current Communications in Molecuiar Biology, Cold Spring Harbor Laboratory red. 1987).
Isolering og rensing av mikrobielt uttrykt protein, eller fragmenter derav, frembragt ifølge oppfinnelsen, kan foretas på konvensjonelle måter, herunder preparativ kromatografi og immunologiske separasjoner som involverer monioklonale
eller polyklonale antistoffer. Antistoffer oppnådd gjennom foreliggende oppfinnelse er i
immunoreaktive med det nukleotid-bindende zink-finger-protein ifølge oppfinnelsen. Antistoff som i det vesentlige består av sammenslåtte monoklonale antistoffeir med spesifisitet for ulike epitoper, så vel som egne monoklonale antistoffpreparater, tilveiebringes. Monoklonale antistoffer fremstilles fra antigen-holdige fragmenter av proteinet etter velkjente metoder (Kohler, et al., Nature, 256:495,1975; Currént Protocols in Molecuiar Biology, Ausubel, et al. red. 1989).
En genterapi for behandling av celleproliferasjons-forstyrrelser som er assosiert med en cellulær nukleotidsekvens som inneholder et nukleotid-bindende zink-finger-motiv er mulig. Slik terapi oppnår dens terapeutiske effekt ved å føre det nukleotid-bindende zink-finger-polypeptids polynukleotid inn i celler til dyr som har proliferasjonsforstyrrelsen. Avgivelse av et polynukleotid som koder for et nukleotid-bindende zink-finger-protein, kan oppnås ved å benytte en rekombinant ekspresjonsvektor som for eksempel et kimært virus eller et kolloidalt dispersjonssystem.
Betegnelsen "celleproliferasjonsforstyrrelse" er benyttet om maligne så vel som ikke-maligne cellepopulasjoner som morfologisk ofte synes å adskille seg fra det omgivende vev. Celleproliferasjonsforstyrrelsen kan være en transkripsjons-forstyrrelse som resulterer i en økning eller svekking av gen-ekspresjonsnivået. Årsaken til forstyrrelsen kan være av cellullær opprinnelse eller viral opprinnelse. Genterapi under bruk av et nukleotid-bindende zink-finger-polypeptid kan benyttes for å behandle en virusindusert celleproliferasjonsforstyrrelse for eksempel i et menneske så vel som i en plante. Behandlingen kan være profylaktisk, for eksempel for å gjøre en plantecelle resistent mot et virus, eller terapeutisk, for å lindre en etablert infeksjon i en celle ved å forhindre dannelsen av virale produkter.
Et polynukleotid som koder for det nukleotid-bindende zink-finger-polypeptid er anvendelig ved behandling av sykdommer av forskjellige organsystemer, som for eksempel lunge-, bryst-, lymfoid-, gastrointestinal- og urogenitaltrakten, så vel som adenokarsinomer som innbefatter slike sykdommer som de fleste tykktarmscancere, nyrecellekarsinomer, prostatacancer, ikke-småcellede lungekarsionomer, tynntarmskreft og spiserørskreft. Et polynukleotid som koder for det nukleotid-bindende zink-finger-polypeptid, er også egnet ved behandling av ikke-maligne celleproliferasjonssykdommer, som f.eks. psoriasis, pemfigus, Behcefs syndrom og lipid histiocytose. Stort sett kan en hvilken som helst sykdom som etiologisk er knyttet til aktiveringen av et nukleotid-bindende zink-finger-motiv, inneholdende
promoter, strukturgen eller RNA, kunne antas å påvirkes ved behandling med et
i polynukleotid som koder for et derivat eller en variant av et zink-finger-avledet
i nukleotid-bindende polypeptid. Forskjellige virale vektorer som kan benyttes ved genterapi som her j beskrevet, innbefatter adenovirus, herpes virus, vaccinia eller fortrinnsvis, et RNA-virus, så som retrovirus. Fortrinnsvis er den retrovirale vektor et derivat av et muse-eller fugle-retrovirus. Eksempler på retrovirale vektorer hvor det kan skytes inn et enkelt fremmed gen, inkluderer, men er ikke begrenset til: MoMuLV (Moleney murine
i leukemia virus), HaMuSV (Harvey murine sarcoma virus), MuMTV (murine mammary tumor virus og RSV (Rous Sarcoma Virus). En rekke ytterligere retrovirale vejktorer kan inkorporere multiple gener. Alle disse vektorene kan overføre eller inkorporere et gen for en selekterbar markør, slik at transduserte celler kan identifiseres og, frembringes. Ved å innføre en aktuell zink-finger-avledet DNA-bindende polypeptidsekvens i den virale vektor, sammen med et annet gen som koder for liganden for en reseptor på en bestemt målcelle, gjøres vektoren målspesifikk. Retrovirale vektorer kan gjøres målspesifikke ved for eksempel å sette inn et polynukleotid som koder for et protein. Foretrukket målretting oppnås ved å benytte et antistoff mot den retrovirale vektor. Fagmannen vil være kjent med, eller kan lett uten unødig eksperimentering, fastslå bestemte polynukleotidsekvenser som kan innføres i det retrovirale genom for å muliggjøre målrettet spesifikk avgivelse av den retrovirale vektor som inneholder det nukleotid-bindende zink-finger-proteins polynukleotid.
Siden rekombinante retrovirus er ufullstendige, fordrer de bistand for å produsere infeksiøse vektorpartikler. Denne bistand kan oppnås for eksempel ved å benytte hjelpercelle-linjer som inneholder plasmider som under kontroll av regulatorsekvenser i LTR, koder for alle retrovirusets strukturelle gener. Disse plasmidene mangler en nukleotidsekvens som gjør det mulig for pakkemekanismen å gjénkjenne et RNA-transkript for innkapsling. Hjelpercelle-linjer som har delesjoner i pakkesignalet, innbefatter, men er ikke begrenset til, \|/2, PA317 og PA12. Disse cellelinjene produserer tomme virioner siden intet genom pakkes. Dersom en retroviral vektor innføres i slike celler, hvor pakkesignalet er intakt, men de strukturelle genene er erstattet med andre aktuelle gener, kan vektoren pakkes og vektorvirionet produseres. De vektorvirioner som produseres på denne måte kan deretter benyttes til å infisere en vev-cellelinje, så som NIH 3T3-celler, for å fremstille større mengder av kimære retrovirale virioner. !
Et annet målsøkende avgivningssystem for polynukleotider som koderj for DNA-bindende zink-finger-polypeptider, er et kolloidalt dispersjonssystem. Kolloidale dispersjonssystemer inkluderer makromolekylkomplekser, nanokapsler, mikrpkuler, kuler og lipidbaserte systemer, inklusivt olje-i-vann-emulsjoner, miceller, blandede miceller og liposomer. Det foretrukne kolloidalsystem er et liposom. Liposomér er kunstige membranvesikler som kan benyttes som avgivningsbærere in vitro bg in vivo. Det har vært vist at store unilammelære vesikler (LUV) med en størrelse på 0,2-4,0 (im kan innkapsle en betydelig prosentandel av en vandig buffer inneholdende store makromolekyler. RNA, DNA og intakte virioner kan innkapsles i det vandige indre og avgis til celler i en biologisk aktiv form (Fraley, et al., Trends
i Biochem., Sei., 6:77,1981). Foruten til pattedyrceller har liposomer vært benyttet for avgivelse av polynukleotider til plante-, gjær- og bakterieceller. For at et liposom skal være en effektiv genoverføringsbærer bør følgende karakteristika forekomme: (1) innkapsling med høy effektivitet av de aktuelle gener uten å svekke deres biologiske aktivitet; (2) foretrukket og betydelig binding til en målcelle i forhold til ikke-tilsiktede celler; (3) avgivelse med høy effektivitet av vesikkelens vandige innhold til målcellens cytoplasma og (4) nøyaktig og effektiv ekspresjon av genetisk informasjon (rilannino, et al., Biotechniques, 6:682, 1988).
Sammensetningen av liposomet er vanligvis en kombinasjon av fosfolipider, særlig "high-phase-transition-temperature" fosfolipider, vanligvis i kombinasjon med steroider, spesielt kolesterol. Andre fosfolipider eller andre lipider kan også benyttes. Liposomenes fysiske karakteristika avhenger av pH, ionestyrke og nærværet av
i divalente kationer.
Eksempler på anvendelige lipider ved liposomfremstilling er bl.a. |
i fosfatidylforbindelser, så som fosfatidylglycerol, fosfatidylcholin, fosfotidylserin,
i fosfatidyletanolamin, sfingolipider, cerebrosider og gangliosider. Særlig anvendelige er diacylfosfatidylglyceroler, hvor lipiddelen inneholder 14-18 karbonatomer, jsærlig 16-18 karbonatomer, og er mettet. Som illustrasjon på fosfolipider kan nevnes egg-fosfatidylcholin, dipalmitoylfosfatidylcholin og disteraroylfosfatidylcholin.
Målrettingen av liposomer har vært klassifisert på basis av anatomiske og mekanistiske faktorer. Anatomisk klassifisering er basert på selektivitetsnivået, for eksempel hvorvidt det er organspesifikt, cellespesifikt eller organelle-spesifikt.
I
Mekanistisk målsøking kan inndeles på basis av hvorvidt den er passiv eller aktiv. Passiv målsøking gjør bruk av liposomers naturlige tendens til å fordele seg i; celler i det retikuloendoteliale system (RES) i organer som inneholder sinusoide kapillærer. Aktiv målsøking involverer derimot endringer av liposomet ved kobling av liposomet
til en spesifikk ligand som f.eks. et monoklonalt antistoff, sukker, glykolipid eller et protein, eller ved å endre sammensetningen eller størrelsen av liposomet forlå oppnå målretting mot andre organer og celletyper enn de naturlig forekommende
lokaliseringsseter.
i Overflaten av det målrettede avgivningssystem kan modifiseres på forskjellige måter. Når det gjelder et liposomalt målrettet avgivningssystem, kan lipidgrupper inkorporeres i liposomets lipide dobbeltlag for å holde den målsøkende ligand i stabil forening med det liposomale dobbeltlag. Det kan benyttes forskjellige sammenkoblende grupper for å forene lipidkjedene med den målsøkende ligand.
Generelt vil de forbindelsene som er bundet til overflaten av det målrettede avgivningssystem, være ligander og reseptorer som vil gjøre det mulig for det målrettede avgivningssystem å finne og "sikte inn" de ønskede celler. En ligand kan være en hvilken som helst aktuell forbindelse som vil binde seg til en annen forbindelse, som f.eks. en reseptor.
Generelt er overflatemembran-proteiner som binder seg til bestemte effektormolekyler, omtalt som reseptorer. I henhold til foreliggende oppfinnelse er antistoffer foretrukne reseptorer. Antistoffer kan benyttes for å rette liposomer mot spesifikke celleoverflateligander. For eksempel kan visse antigener som uttrykkes spesifikt på tumorceller, betegnet tumor-assosierte antigener (TAA), vurderes med henblikk på å rette liposomer som inneholder antistoff/nukleotid-bindende zink-finger-protein, direkte mot den maligne svulst. Siden genproduktet av det nukleotid-bindende zink-finger-protein i sin virkning kan være vilkårlig i forhold til celletype, kan et målrettet avgivningssystem by på en betydelig forbedring fremfor tilfeldig injisering av uspesifikke liposomer. En rekke fremgangsmåter kan benyttes for kovalent å knytte polyklonale eller monoklonale antistoffer til et liposom-dobbeltlag. Antistoff-målrettede liposomer kan innbefatte monoklonale eller polyklonale antistoffer, eller fragmenter derav, som f.eks. Fab eller F(ab')2 så lenge de effektivt binder seg til en antigen epitop på målcellene. Liposomer kan også være målrettet mot celler som uttrykker reseptorer for hormoner eller andre serumfaktorer.
Fortrinnsvis benyttes et makrofagoverflate-ekspresjonssystem, som beskrevet i Eksemplene i foreliggende beskrivelse, som bibliotek. Fag-biblioteket behandles med et reduserende reagens, så som ditiotreitol, som muliggjør riktig folding av
i ekspresjonsproduktet på fag-overflaten. Biblioteket fremstilles fra polynukleotidsekvenser som koder for en nukleotid-bindende zink-finger-polypeptidvariant og som er randomisert, fortrinnsvis ved PCR, under bruk ay primere som inneholder degenererte triplettkodoner i sekvensposisjoner som tilsvarer aminosyrene bestemt i fremgangsmåtens første trinn. De degenererte triplettkodonene har formelen NNS eller NNK, hvor S enten er G eller C, K enten er G eller T og hvor N uavhengig er valgt fra gruppen bestående av A, C, G eller T.
Moduleringen av funksjonen av den cellulære nukleotidsekvens inkluderer
i forsterkning eller suppresjon av transkripsjonen av et gen som operativt er knyttet til
i
den cellulære nukleotidsekvens, særlig når nukleotidsekvensen er en promoter. Moduleringen inkluderer også suppresjon av transkripsjon av en nukleotidsekvens som ligger innenfor et strukturelt gen eller en virus-DNA- eller RNA-sekvens.. Modulering inkluderer også translasjonsinhibering av en mRNA.
Det er mulig å behandle en celieproliferasjonsforstyrrelse, gjennom ex yivo innføring av en rekombinant ekspresjonsvektor som omfatter polynukleotidet som koder for et nukleotid-bindende zink-finger-polypeptid, i en celle for i cellen å modulere funksjonen av en nukleotidsekvens som omfatter et nukleotid-bindende zink-finger-motiv. Den celleproliferasjonsforstyrrelse omfatter de ovenfor beskrevne forstyrrelser som i alminnelighet er assosiert med nedsatte eller økede nivåer av gen-transkripsjon. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen byr på en teknikk for å modulere slik genekspresjon enten den foregår på promoter-, strukturelt gen1- eller RNA-nivå. Metoden innbefatter uttak av en vevsprøve fra et individ med forstyrrelsen, isolering av hematopoietiske eller andre celler fra vevsprøven, hvorpå isolerte celler bringes i kontakt med en rekombinant ekspresjonsvektor inneholdende det DNA som koder for det nukleotid-bindende zink-finger-protein og, eventuelt, et
målspesifikt gen. Eventuelt kan cellene behandles med en vekstfaktor for eksempel
i med et interlevkin 2, for å stimulere cellevekst før cellene igjen føres inn i vedkommende individ. Etter at cellene er ført inn igjen vil de søke seg til cellepopulasjonen som de opprinnelig ble isolert fra. På denne måte kan den trans-repressive virkning av det nukleotid-bindende zink-finger-polypeptid benyttes til å inhibere eller undertrykke uønsket celleproliferasjon i et individ. I enkelte tilfeller
refererer modulering av nukleotidsekvensene i en celle seg til suppresjon eller forsterkning av transkripsjonen av et gen som operativt er bundet til en celluljær nukleotidsekvens. Fortrinnsvis er individet et menneske.
En alternativ anvendelse for rekombinante retrovirale vektorer er innføringen av polynukleotidsekvenser i verten ved hjelp av hudtransplantering av celler som inneholder viruset. Langtidsekspresjon av fremmede gener i implantater kan;oppnås ved bruk av celler av fibroblastopprinnelse dersom det benyttes en sterk ! husholdningsgen-promoter for å styre transkripsjonen. For eksempel kan dihydrofolat-reduktase (DHFR) genpromoteren benyttes. Celler som f.eks. fibroblaster, kan infiseres med virioner som inneholder en retroviral konstruksjon inneholdende det aktuelle gen, for eksempel et avkuttet og/eller mutageniseijt nukleotid-bindende zink-finger-protein, sammen med et gen som muliggjør spesifikk målretting, så som et tumorassosiert antigen (TAA), og en sterk promoter. Dé
infiserte cellene kan innleires i en kollagenmatriks som kan podes inn i dermis-. bindevevet hos mottageren. Etter hvert som retroviruset prolifererer og unnslipper matriksen, vil det infisere målcellepopulasjonen spesifikt. På denne måte resulterer transplantasjonen i at det dannes økende mengder trans-represserende nukleotid-
bindende zink-finger-polypeptider i celler hvor celleproliferasjonsforstyrrelsen er
i manifestert..
De nye nukleotid-bindende zink-finger-proteiner ifølge oppfinnelsen som modulerer transkripsjonen aktivering eller translasjon enten på promoter-, strukturelt gen- eller RNA-nivå, har likeledes kunnet benyttes i plantearter. Dette vil kunne føre til transgene planter hvor planten er resistent for eksempel mot bestemte bakterie-eller viruspatogener. Metoder for overføring og ekspresjon av nukleinsyrer i planter er velkjente. (Se for eksempel Hiatt, et al., US-patent 5.202.422. som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse)..
Det er mulig å identifisere et nytt nukleotid-bindende zink-finger-polypeptid-derivat, eller variant derav, og den nukleotidsekvens som koder for polypeptidet. Metoden innebærer modifikasjon av fingrene av et zink-finger-protein av villtype slik
at de gjenkjenner en nukleotidsekvens, enten DNA eller RNA, som er forskjellig fra den sekvens som opprinnelig ble gjenkjent av proteinet. Det kan for eksempel være
i
ønskelig å modifisere et kjent zink-finger-protein slik at det fører til et nytt nukleotid-bindende zink-finger-polypeptid som gjenkjenner, binder seg til og inaktiverer promoter-regionen (LTR) for HIV (human immunodeficiency virus). Etter
i ■
identifisering av proteinet, fremstilles en avkuttet form a proteinet som undertrykker transkripsjon som normalt aktiveres fra dette sete. I HIV er målsetet for et nukleotid-bindende zink-finger-motiv i promoteren CTG-TTG-TGT. Eksempelvis mutageniseres de tre fingrene i zif268 som beskrevet i Eksemplene. Fingrene mutageniseres uavhengig av hverandre på det samme protein (det ene etter iIdet andre) eller uavhengig eller "stykkevis" på tre ulike zif268-molekyler og ligeres inn igjen etter mutagenisering. Selv om den ene av disse to metodene er å foretrekke, ville en alternativ metode gjøre det mulig å mutagenisere de tre fingrene samtidig. Etter mutagenese, konstrueres et fag-bibliotek som underkastes screening med de passende oligonukleotider som inkluderer det aktuelle bindingssete. Dersomji fingrene ble mutagenisert uavhengig på det samme protein, konstrueres sekvensielle
i' bibliotek, hvorpå "panning" foretas etter hver bibliotek-konstruksjon. I zif2681 konstrueres for eksempel et finger-3-bibliotek som "pannes" med et finger-3-spesifikt oligonukleotid. De positive kloner fra denne screening samles og benyttes til
fremstilling av et finger-2-bibliotek (ved å benytte finger-3-bibliotek-DNA soml
i templat); "panning" foretas med et finger-32-spesifikk oligonukleotid; DNA oppsamles fra positive kloner og benyttes som templat for finger-1 -bibliotek-konstruksjon; hvorpå seleksjon med henblikk på et protein med tre nye fingre tilslutt foretas med et finger-321-spesifikt oligonukleotid. Metoden resulterer i påvisning av et nytt zink-finger-avledet DNA-bindende protein som gjenkjenner, binder seg til og undertrykker transkripsjon fra HIV-promoteren. Senere avkutting, mutasjon eller ekspansjon av forskjellige fingre i det nye protein, vil resultere i et protein som undertrykker transkripsjon fra HIV-promoteren.
Oppfinnelsen gir i Eksempel 7-13 en illustrasjon av modifikasjoner av zif268 som beskrevet ovenfor. I henhold til en annen utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen således en ny nukleotid-bindende zink-finger-polypeptidvariant som
i omfatter minst to zink-finger-moduler som binder seg til en HIV-sekvens og modulerer virkningen av HIV-sekvensen, for eksempel HIV-promotersekvensen.
Påvisningen av nye nukleotid-bindende zink-finger-proteiner muliggjør modulering av genekspresjon fra promotere som disse proteinene binder seg til. Når for eksempel en celleproliferasjonsforstyrrelse er assosiert med overaktivering av en promoter som inneholder et nukleotid-bindende zink-finger-motiv, kan det i cellen innføres slike undertrykkende reagenser som antisense polynukleotidsekvens eller bindende antistoff som et alternativ til tilsetningen av et nukleotid-bindende zink-finger-proteinderivat. Når en celleproliferasjonsforstyrrelse derimot er assosiert med underaktivering av promoteren, kan en sense polynukleotidsekvens (den kodénde kjede av DNA) eller nukleotid-bindende zink-finger-polypeptid, innføres i cellen.
i Mindre modifikasjoner av den primære aminosyresekvens kan resultere i proteiner som i det vesentlige har likeverdig aktivitet i forhold til det her beskrevne zink-finger-avledede bindende protein. Slike modifikasjoner kan være tiltenkte, som ved målrettet mutagenese, eller spontane. Samtlige proteiner fremstillet av disse modifikasjoner er her inkludert i den utstrekning det forekommer zink-finger-nukleotid-bindende proteinaktivitet.
Zink-finger-proteiner som oppnås ifølge oppfinnelsen kan manipuleres1 til å gjenkjenne og binde seg til utvidede målsekvenser. For eksempel kan zink-finger-proteiner som inneholder fra ca. 2 til 20 zink-fingre Zif(2) til Zif(20), og fortrinnsvis fra
i
ca. 2 til 12 zink-fingre, fusjoneres til leucin-glidelåsdomene av Jun/Fos-proteinene, som er prototypiske medlemmer av bZIP-familien av proteiner (0'Shea, et al., Science, 254:539,1991). Alternativt kan zink-finger-proteiner fusjoneres til andre proteiner som er i stand til å danne hetero-dimerer og som inneholder dimeriseringsdomener. Slike proteiner vil være kjent for fagmannen.
Jun/Fos-leucin-glidelåsene beskrives av illustrasjonshensyn og danner fortrinnsvis heterodimerer, og muliggjør gjenkjenning av 12 til 72 basepar. I det følgende refererer Jun/Fos seg til disse proteiners leucin-glidelåsdomener. Zink-finger-proteiner fusjoneres til Jun og uavhengig til Fos etter metoder som vanligvis benyttes for å sammenkoble proteiner. Etter rensing blandes Zif-Jun- og Zif-Fos-konstruksjonene (SEKV. ID. Nr.: henholdsvis 33, 34 og 35, 36), for spontant å danne en Zif-Jun/Zif-Fos-heterodimer. Alternativt resulterer koekspresjon av de gener som koder for disse proteiner, i dannelse av Zif-Jun/Zif-Fos-heterodimerer in vivo.| Fusjon av heterodimeren med et N-terminalt nukleært lokaliseringssignal gjør det mulig å målrette ekspresjonen til kjernen (Calderon, et al., Cell, 41:499,1982). Aktiveringsdomener kan også inkorporeres i den ene eller begge leucjn-glidelås-fusjonskonstruksjonene for å danne transkripsjonsaktivatorer (Sadowski, et al., Gene, 118:137,1992). Disse dimere konstruksjonene muliggjør deretter spesifikk transkripsjonsaktivering eller -undertrykkelse. Disse heterodimere Zif-konstruksjonene er fordelaktige siden de muliggjør gjenkjenning av palindrom-sekvenser (dersom fingrene på både Jun og Fos gjenkjenner den samme DNA/RNA-sekvens) eller utvidede asymmetriske sekvenser (dersom fingrene på Jun og Fos gjenkjenner ulike DNA/RNA-sekvenser). For eksempel gjenkjennes palindromsekvensen
i
av Zif268-Fos/Zif268-Jun-dimeren (x er et hvilket som helst tall). Avstanden mellom subsetene avgjøres av setet for fusjonen av Zif med Jun- eller Fos-glidelåsdornenet og av lengden av linkeren mellom Zif- og glidelåsdomenene. Subsete-avstanden avgjøres av en bindingssete-seleksjon etter en metode som er kjent for fagmjannen (Thiesen, et al., Nucleic Acids Research, 18:3203,1990). Eksempel på gjenkjenningen av en utvidet asymmetrisk sekvens er vist av Zif(C7)6-Jun/Zif-268-Fos-dimeren. Dette protein består av 6 fingre av C7-type (Eksempel 11) bundet til Jun og 3 fingre av Zif268 bundet til Fos, og gjenkjenner den utvidede sekvens:
Oksydativ eller hydrolytisk spaltning av DNA eller RNA med metallchelat-komplekser kan foretas ved hjelp av kjente fremgangsmåter. I henhold til en annen utførelsesform forenkles tilknytningen av chelaterende grupper til Zif-proteiner fortrinnsvis ved inkorporering av en cysteinrest (Cys) mellom det initiale metionin (met) og den første tyrosinrest (Tyr) i proteinet. Cys-resten alkyleres deretter med kjente chelatorer som for eksempel EDTA-derivater som beskrevet (SigmanJ Biochemistry, 29:9097,1990). Alternativt kan sekvensen Gly-Gly-His gjøres til den mest aminoterminale rest, siden en aminoende bestående av restene har vært angitt å chelateré Cu<+2> (Mack, et al., J. Am. Chem., Soc, 110:7572,1988). Foretrukne metallioner innbefatter Cu<+2>, Ce<+3> (Takasaki & Chin., J. Am. Chem. Soc, 116:1121, 1994), Zn+2, Cd+2, Pb+2, Fe<+2> (Schnaith, et al., Proc.Natl. Acad. Sei., USA, 9l!:569, 1994), Fe<+3>, Ni<+2>, Ni<+3>, La<+3>, Eu<+3> (Hall, et al., Chemistry and Biology, 1:185,1994), Gd<+3>, Tb<+3>, Lu<+3>, Mn<+2>, Mg<+2.> Spaltning med chelaterte metaller foretas i alminnelighet i nærvær av oksydasjonsmidler som f.eks. O2, hydrogenperoksyd (H202) og reduksjonsmidler som tioler og ascorbat. Setet og kjeden (+ eller -sete) bestemmes empirisk (Mack, et al., J. Am. Chem. Soc, 110:7572,1988) og avhenger i
I
av posisjonen av Cys-resten mellom Met og den Tyr-rest som går forut for døn første finger. I proteinet Met (AA) Tyr-(Zif)M2 blir chelatet Met-(AA)x1 Cys-chélat-(AÅ)x2-Tyr-i (Zif)M2, hvor AA = en hvilken som helst aminosyre og x = antall aminosyrer. Dimere zif-konstruksjoner av typen Zif-Jun/Zif-Fos foretrekkes for spaltning ved to se;ter i det søkte oligonukleotid eller ved et enkelt langt målsete. I tilfelle det ønskes dobbelt-kjedspaltning, merkes både Jun- og Fos-holdige proteiner med chelatorer, og spaltning foretas etter kjente metoder. I dette tilfelle frembringes et forskjøvet dobbeltkjedet kutt analogt med det som dannes av restriksjonsenzymer.
Etter mutagenese og seleksjon av varianter av Zif268-proteinet hvor finger-1-spesifisiteten eller affiniteten er modifisert, kan det konstrueres proteiner som har flere kopier av fingeren ved å benytte TGEKP-linkersekvensen på kjent måte. For eksempel kan C7-fingeren konstrueres i henhold til skjemaet:
i
hvor sekvensen for den siste linker er gjenstand for forandring siden den befinner seg ved enden og ikke er involvert i sammenkoblingen av to fingre. Dette protein binder den konstruerte målsekvens GCG-GCG-GCG (SEKV. ID. Nr.:32) i oligonukleotid-håmålen
med en affinitet på 9 nM, sammenlignet med affinitet på 300 nm for et oligonukleotid som koder for GCG-TGG-GCG-sekvensen (bestemt ved overflate-plasmon-resonansundersøkelser). Det er ikke nødvendig at de fingrene som benyttes jer identiske, og de kan blandes og tilpasses for å frembringe proteiner som gjenkjenner en ønsket målsekvens. Disse kan også utnyttes sammen med leucin-glidelåser (f.eks. Fos/Jun) eller andre heterodimerer for å frembringe proteiner med utvidet sekvens-gjenkjenning.
I tillegg til å danne polymerer av finger-1, kan hele den trefingrede Zif268 og modifiserte versjoner i denne, fusjoneres ved å benytte konsensus-linkeren f GEKP, for å frembringe proteiner med utvidede gjenkjenningsseter. For eksempel kan proteinet Zif268-Zif268, hvor det naturlige protein er fusjonert til seg selv ved, å benytte TGEKP-linkeren, fremstilles. Dette protein binder nå sekvensen i GCG-TGG-GCG-GCG-TGG-GCG. Modifikasjoner innen de tre fingrene av Zif268 eller andre kjente zink-finger-proteiner, kan derfor fusjoneres sammen under dannelse av et protein som gjenkjenner utvidede sekvenser. Om ønskes, kan disse nye zink-proteinene også benyttes i kombinasjon med leucin-glidelåser.
i
Ut fra den her fullstendig beskrevne oppfinnelse vil det for fagmannen! være klart at det kan foretas forskjellige endringer og modifikasjoner uten derved å gå ut over oppfinnelsens ramme. ;
i
EKSEMPLER
Et rekombinant polypeptid inneholdende tre av de ni TFIliA zink-fingrene (Clemens, et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 89:10822,1992) er blitt utviklet ved PCR-amplifikasjon fra cDNA for TFIIIA og ekspresjon i E. coli. Det rekombinante protein betegnet zf 1 -3, ble renset ved ionebytterkromatografi og dets bindingssete innen 5S-genet ble bestemt ved en kombinasjon av DNase l-footprinting og binding til syntetiske oligonukleotider (Liao, et al., Mol. Biol., 223:857,1992). Eksemplene omtaler forsøk som viser at bindingen av dette polypeptid til dets gjenkjenningssekvens plassert nært en aktiv RNA-polymerase-promoter, kunne inhibere aktiviteten av vedkommende prormoter in vitro. For å tilveiebringe et slikt testsystem ble et
j
26 bp oligonukleotid som inneholdt den 13 bp lange gjenkjenningssekvens for zf1-3, klonet inn i polylinker-regionen til plasmid pUC19 nær promotersekvensen for T7-
i RNA-polymerase. Den DNA-bindende aktivitet av vårt preparat av rekombinant zf1-3 ble bestemt ved gel-mobilitetsforskyvning med det oligonukleotid som inneholder
bindingssetet. Dessuten ble det foretatt in vitro transkripsjon med T7-RNA-
t polymerase, med eller uten nærvær av de samme mengder av zf 1 -3-polypeptidet benyttet i DNA-bindingstitreringen. For hvert DNA-molekyl bundet av zf1-3 gjøres vedkommende DNA-molekyl transkripsjonsinaktivt. Det ble derfor i disse eksemplene
i fremstillet et zink-finger-polypeptid som fullstendig blokkerte virkningen av eh promoter ved å binde seg til en nærliggende målsekvens.
EKSEMPEL 1
SEKVENS-SPESIFIKK GENSØKING
MED ZINK-FINGER-PROTEINER
i
A. Ut fra krystallstrukturen av zif268 er det klart at bestemte histidin- (ikke-zink-koordinerende his-rester) og argininrester på overflaten av a-helixen, på fingerspissen og på helix-posisjonene 2, 3 og 6 (umiddelbart foran det konserverte histidin) deltar i hydrogen-binding til DNA-guaniner. Etterhvert som antallet av strukturer av zink-finger-komplekser fortsetter å øke, er det sannsynlig at forskjellige aminosyrer og forskjellige posisjoner kan delta i spesifikk base-gjenkjenning. Figur 2A viser sekvensen av de tre aminoterminale fingrene av TFIIIA med basiske aminosyrer i disse posisjonene understreket. I likhet med finger 2 av det regulerende protein zif258 (Krox-20) og fingrene 1 og 3 av Sp1, inneholder finger 2 av TFIIIA histidin- og argininrester i disse DNA-kontaktposisjoner. Dessuten gjenkjenner hver av disse zink-fingrene i det minste sekvensen GGG (Figur 2B) i 5S-genpromoteren.
Et rekombinant polypeptid som inneholder disse tre TFIIIA-zink-fingrene er frembrakt ved PCR-amplifikasjon fra cDNA for TFIIIA og ekspresjon i E. coli
(Clemens, et al., supra). Det ble anlagt et forsøk for å bestemme hvorvidt bindingen av dette polypeptid til dets gjenkjenningssekvens, plassert nær en aktiv RNA-polymerase-promoter, ville inhibere aktiviteten av vedkommende promoter in vitro. De etterfølgende forsøk ble foretatt for å komme frem til et slikt testsystem. Et 23 bp oligonukleotid (Liao, et al., 1992, supra) inneholdende den 13 bp gjenkjenningssekvens for zf 1 -3, ble klonet inn i polylinker-regionen til plasmidet pBuescript SK+
(Strategene, La Jolla, CA), nær promotersekvensen for T7 RNA-polymerase. Opphavsplasmidet ble kuttet med restiksjonsenzymet EcoRV og, etter defosforylering med intestinal alkalisk fosfatase fra kalv, ble det fosforylerte 23 bp oligonukleotid skutt in ved ligering med T4 DNA-ligase. Ligeringsproduktet ble benyttet for transformasjon av DH5a E. coli-celler. Kloner inneholdende innskuddene på 23 bp ble påvist ved restriksjonskutting av miniprep DNA. Vellykket kloning ble også verifisert ved DNA-sekvensanalyse. DNA-bindingsaktiviteten av preparatet av rekombinant zf1-3, ble også bestemt ved gelmobilitets-forskyvnings-analyse med et 56 bp radioaktivt merket EchoRI/Xhol-restriksjonsfragment avledet fra klonen som inneholdt bindingssetet for zf 1 -3, og med det radioaktivt merkede 23 bp oligonukleotid. Gelforskyvnings-bestemmelser ble foretatt som beskrevet (Liao, et al. supra; Fried, et al., Nucl. Acids. Res., 9:6505,1981). Resultatene av sistnevnte analyse er vist i Figur 3. Bindingsreaksjoner (20 uL) inneholdt også 1 ug umerket plasmid DNA inneholdende den samme 23 bp sekvens. I banene 2-12 ble også de angitte mengder av zf1-3 inkludert i reaksjonene. Etter inkubering ved romtemperatur i 30 min., ble prøvene underkastet elektroforese på en 6% ikke-denaturerende polyakrylamidgel i 88 mM Tris-boratbuffer, pH 8,3. For hver enkelt reaksjon ble
spormengder av det radioaktivt merkede oligonukleotid benyttet med en konstant mengde (1 |ig) av plasmid-DNA som inneholdt zf1-3-bindingssetet. Reaksjonene i
banene 2-12 inneholdt økende mengder av zf 1-3-polypeptidet. Autoradiogrammet av gelen er vist. Resultatene tyder på at binding av zf1-3 til det radioaktivt merkede DNA forårsaket en retardasjon av elektroforetisk mobilitet. Prosentandelen av radioaktivt merkede DNA-molekyler bundet av zf 1 -3, gjenspeiler også prosentandelen av bundne umerkede plasmid-DNA molekyler.
In vitro transkripsjonsforsøk ble foretatt med T7 RNA-polymerase med eller uten nærvær av de samme mengder av zf 1 -3-polypeptidet benyttet i DNA-bindingstitreringen med samme mengder av det plasmid-DNA som inneholdt zf 1 -3-bindingssetet. Hver reaksjonsblanding inneholdt, i et volum på 25 uL, 1 u.g Pvull-kuttet pBluescript SK+DNA som inneholdt 23 bp bindingssetet for zf 1 -3 innskutt i vektorens EcoRV-sete, 40 enheter RNasin, 0,6 mM ATP+UTP+CTP, 20 u.M GTP og 10 uCi av a-<32>P-GTP samt 10 enheter T7 RNA-polymerase (Stratagene). Reaksjonsbufferen ble anskaffet fra Stratagene. Etter inkubering ved 37C i 1 time, ble transkripsjonsproduktene renset ved fenolekstraksjon, konsentrert ved etanolutfelling og analysert på en denaturerende polyakrylamidgel. T7-transkripsjonen ble fulgt gjennom inkorporering av radioaktivt merkede nukleotider i et run-off transkript. Figur 4 viser et autoradiogram av de oppnådde transkripsjons-produkter ved analyse på en denaturerende polyakrylamidgel. I dette forsøket ble plasmid-DNA spaltet med restriksjonsenzymet Pvull, og den forventede lengde av run-off transkriptet var 245 baser. Tilsetning av zf 1 -3-polypeptid til reaksjonsblandingen undertrykket transkripsjon av T7 RNA-polymerase. Figur 5 er et diagram hvor prosentandelen DNA-molekyler bundet av zf 1 -3 i bestemmelsen ved DNA-gel-mobilitetsforskyvningen (x-akse) i forhold til prosentandelen inhibering av T7 RNA-polymerase-transkripsjon av de samme mengder zf1-3 (y-akse) er plottet inn. Det skal bemerkes at hvert datapunkt tilsvarer identiske mengder zf 1 -3 benyttet for to bestemmelser. En-til-en-overensstemmelsen mellom de to datasett er utvetydig. T7-transkripsjonen ble fulgt ved inkorporering av radioaktive nukleotider i et run-off transkript. Transkripsjonen ble kvantifisert ved gelelektroforese, autoradiografi og densitometri. Bestemmelser av gel-mobilitetsforskyvninger ble kvantifisert på lignende måte. For hvert DNA-molekyl bundet av zf1-3, gjøres vedkommende DNA-molekyl transkripsjons-inaktivt. I dette forsøk har derfor et zink-finger-polypeptid fullstendig blokkert aktiviteten av en promoter gjennom bindjng til en nærliggende målsekvens.
B. Siden foregående forsøk ble foretatt med en prokaryot RNA-polymerase, ble det følgende forsøk foretatt for å bestemme hvorvidt zink-finger-polypeptidet zf1-3 også kunne blokkere aktiviteten av en eukaryot RNA-polymerase. For å testej dette ble et transkripsjonsekstrakt fremstillet fra ufertiliserte Xenopus-egg (Hartl. etjal., J. Cell. Biol., 120:613,1993), og Xenopus 5S RNA -gentemplatet ble benyttet. Disse
i ekstraktene er sterkt virksomme ved transkripsjon av 5S RNA og tRNA ved hjelp av RNA-polymerase III. Som test-templat ble 5S RNA-genet som naturlig inneholder
i bindingssetet for TFIIIA og zfl-3, benyttet. I hver reaksjon inngikk 10 uL av en høy-hastighets supematant av egg-homogenatet, 9 ng TFIIIA, nukleosid-trifosfåtene (ATP, UTP, CTP) i 0,6 mM og 10 uCi av a-<32>P-GTP og GTP i 20 u.M, i en 25 \ iL reaksjonsblanding. Reaksjonsblandingené inneholdt alle 180 ng plåsmid-DNÅ som inneholdt en enkelt kopi av Xenopus somatisk type 5S RNA-genet, og reaksjonsblandingené i banene 2 og 3 inneholdt også 300 ng av et plasmid j inneholdende Xenopus tRNAmet-gen. Før tilsetningen av Xenopus-eggekstrakt og TFIIIA, ble 0,2 og 0,4 u.g zf1-3 tilsatt til reaksjonsblandingené for henholdsvis: bane 2 og 3. Mengden av zf1-3 benyttet i forsøket for bane 2, var tilstrekkelig til å binde hele det 5S gen-holdige DNA i en separat bindingsreaksjon. Etter 15 minutters inkubering for å muliggjøre binding av zf 1 -3 til dens gjenkjenningssekvens, ble de øvrige
reaksjonskomponentene tilsatt. Etter inkubering i 2 timer ble transkripsjonsproduktene renset ved fenolekstraksjon, konsentrert ved etanolutfelling og analysert på en denaturerende polyakrylamidgel. Autoradiogrammet er vist i Figur 6. Figur 6 viser også resultatene av en kontrollert reaksjon hvor intet zink-finger-protein; var tilsatt (bane 1). Som kontroll inneholdt bane 2 og 3 også et tRNA-gentemplat som mangler bindingssetet for TFIIIA og zf1-3. 5S RNA-transkripsjon ble undertrykket av zf 1 -3, mens tRNA-transkripsjonen var upåvirket. Disse resultatene viser at zf 1 -3 blokkerer sammensetningen av et eukaryot RNA-polymerase lll-transkripsjons-kompleks og viser at denne effekt er spesifikk for DNA-molekyler som inneholder bindingssetet for det rekombinante zink-finger-protein avledet fra TFIIIA.
Tredimensjonale løsningsstrukturer er blitt bestemt for et protein som inneholder de første tre zink-fingrene av TFIIIA, ved å benytte 2D, 3D,og 4D JMMR-metoder. For dette formål ble proteinet uttrykt og renset fra E. coli og merket jevnt
i
med <13>C og <15>N. NMR-strukturen viser at de enkelte zink-fingre folder seg inh i den sedvanlige fingerstruktur med en liten p-plate pakket mot en a-helix. Fingrene er ikke fullstendig uavhengige i løsning, snarere tyder visse tegn på innviklede interaksjoner mellom dem. Ved å benytte lignende teknikker bestemmes 3D-j strukturen av et kompleks mellom zf1-3 og et 13 bp oligonukleotid som tilsvarer dets spesifikke bindingssete på 5S RNA-genet, og denne benyttes til å gi viktig informasjon om den molekylære basis for sekvensspesifikk nukleotid-gjenkjehning av TFIIIA zink-fingrene. Denne informasjon benyttes i sin tur til å utvikle nye zink-finger-avledede nukleotid-bindende proteiner for regulering av de på forhånd valgte; målgener. Lignende NMR-metoder kan anvendes for å bestemme detaljstrukturéne av de komplekser som dannes mellom konstruerte zink-finger-proteiner og deres målgener, som del av en struktur-basert måte for å raffinere genselektivitet og forbedre bindingsaffinitet.
EKSEMPEL 2
ISOLERING AV NYE NUKLEOTID-
BINDENDE ZINK-FINGER-PROTEINER
For hurtig å sortere store biblioteker av zink-finger-varianter ble det benyttet et fagoverflate-presentasjonssystem opprinnelig utviklet for antistoff-bibliotek (Barbas, et al., METHODS, 2:119, 1991). Til dette formål er pComb3 blitt modifisert for zink-finger-seleksjon. Promoter- og kloningssekvenser for antistoffets lette kjede er blitt fjernet for å frembringe en ny vektor pComb.5. Tre-finger zif268-proteinet er<i >modifisert ved PCR og skutt inn i pComb3.5. Zink-fingrene presenteres funksjonelt på fagen, hvilket er fastslått ved fastfase-bestemmelser som viser at fagen binder DNA på en sekvensavhengig måte. Stedsrettet mutagenese er foretatt for å skyte inn et Nsil-sete mellom fingrne 1 og 2 for å forenkle bibliotek-konstruksjon. Dessuten er zif268 funksjonell når den er fusjonert til en dekapeptid-markering som gjør det mulig lett å følge dets binding. Et første bibliotek er blitt konstruert ved å benytte overlapps-PCR (Barbas, et al. Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 89:4457,1992) for å frembringe finger-3-varianter, hvor 6 rester på den aminoterminale side av den ct-helix som er involvert i gjenkjenningen, ble variert ved hjelp av en NNK-dopiJg-strategi for å frembringe degenererthet. Denne tredje finger bandt opprinnelig det 3 bp GCG subsetet. Seleksjon for binding til et AAA-subsete avdekket et konisensus-mønster som fremkom i de selekterte sekvenser. i
Det zif268-holdige plasmid, pZif89 (Pavletich, et al., Science, 252:809,1991)
i
ble benyttet som zif268-DNA-kilde for modifisering av zink-fingrene. I korte treikk ble pZif89 klonet inn i plasmidet pComb3.5 etter PCR-amplifisering ved å benytte
i følgende primere:
i •
PCR-reaksjonen ble foretatt i 100 uL inneholdende 1 ug av hver av oligonukleotid-primerne ZF og ZR, dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 1,5 mM MgCI2 Taq-polymerase (5 enheter) 10 ng templat pZif89 og 10 uL 10 x PCR-buffer (Perkin Eimer Corp.). Det ble foretatt 30 PCR-amplifikasjonsrunder i en Perkin-Elmer Cetus 9600 Gene Amp PCR-system Thermocycler. Amplifiseringscyklusen besto av denaturering ved 94°C i ett minutt, hybridisering ved 54°C i ett minutt, etterfulgt av polymerisering ved 72°C i to minutter. De resulterende PCR-amplifikasjonsproduktene ble renset på gel som beskrevet nedenfor og kuttet med Xhol/Spel og ligert inn i pComb3.5. pComb3.5 er en variant av pComb3. (Barbas, et ål., Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 88:7978,1991) som har fått fjernet regionen for dens lette kjede, inklusivt lacZ-promoteren. I korthet ble pComb3 kuttet med Nhel, Klenow-behandlet, kuttet med Xbal og på nytt ligert for å danne pComb3.5. Andre lignende vektorer som kunne vært brukt i stedet for pComb3.5, som f.eks. Surf Zap™ (Stratagene, La Jolla, CA) vil være kjent for fagmannen.
Phagemideh pComb3.5 inneholdende zif268, ble deretter benyttet i PGR-amplifikasjoner som her beskrevet for å innføre nukleotid-substitusjoner i zink fingrene til zif268, for å fremstille nye zink-fingre som binder seg til spesifikke; gjenkjenningssekvenser og som forsterker eller undertrykker transkripsjon etter binding til en gitt promotersekvens.
Fremgangsmåten for fremstilling av nye zink-fingre med særlig sekvens-gjenkjennings-spesifisitet og evne til regulering av genekspresjon, innbefattet følgende trinn: 1. en første zink-finger (f.eks. zink-finger 3 av zif268) ble først randomisert ved bruk av overlapps-PCR; 2. amplifiseringsproduktene fra den overlapps-PCR, inneholdende randomiserte zink-fingre, ble ligert inn igjen i pComb3.5 for å danne et randomisert bibliotek; 3. etter ekspresjon av bakteriofagens kappeprotein lll-forankrede zink-finger fra biblioteket, ble den overflateprotein-uttrykkende fag "pannet" mot spesifikke zink-finger-gjenkjenningssekvenser, hvilket resulterte i seleksjon av flere spesifikke randomiserte zink-fingre; og 4. etter seleksjon av sekvensspesifikke zink-fingré, ble de tilsvarende phagemider sekvensert og sekvensen av aminosyrerestene avledet fra disse.
EKSEMPEL 3
FREMSTILLING AV RANDOMISERTE ZINK-FINGRE
For å randomisere zink-fingrene av zif268 i pComb3.5, beskrevet ovenfor, ble det foretatt to separate PCR-amplifikasjoner for hver finger, slik som her beskrevet, etterfulgt av en tredje overlapps-PCR-amplifikasjon som resulterte i hybridisering av de to foregående amplifikasjonsproduktene, etterfulgt av en tredje amplifikasjon. Nukleotidsekvensen av zink-fingeren av zif268 av templat pComb3.5 er vist i Figur 7 og er angitt i SEKV. ID. Nr.:4. De nukleotidposisjoner som ble randomisert i zink-finger 3 begynte i nukleotidposisjon 217 og sluttet i posisjon 237, under utelatelse av serin. Templat zif268-sekvensen i nevnte sete, kodet for totalt åtte aminosyrerester i finger 3. Denne aminosyresekvens for finger 3 i pComb3.5 som skulle modifiseres, er Arg-Ser- Asp- Glu- Ara- Lvs- Arg-His (SEKV. ID. Nr.:5). De understrekede aminosyrene representerer de restene som ble randomisert.
Et oligonukleotid-forråd som inkluderte degenererte oligonukleotid-primere, betegnet BZF3 og ZF36K og ikke-degenererte primere R3B og FTX3, med den nedenfor beskrevne nukleotidformel (syntetisert av Operon Technologies, Alameda, CA) ble benyttet for randomisering av zink-finger 3 av zif268 i pComb3.5. De seks triplettkodonene for innføring av randomiserte nukleotider innbefattet den repeterende sekvens NNM (komplement av NNK), hvor M kan være enten G eller C og N kan være A, C, G eller T.
Den første PCR-amplifikasjon resulterte i amplifikasjon av 5'-regionen av zink-finger-3-fragmentet i pComb3.5-phagemidvektor-klonen. For å amplifisere denne region, ble følgende primerpar benyttet. 5'-oligonukleotid-primeren FTX3, som har nukleotidsekvensen 5'-GCA ATT AAC CCT CAC TAA AGG G-3' (SEKV. ID. Nr.:6), hybridiserte til en ikke-kodende kjede av finger 3, som tilsvarer region 5' (som inkluderer vektorsekvensen) av og inklusivt de første to nukleotidene av zif268. 3'-oligonukleotid-primeren BZF3, som har nukleotidsekvensen 5'-GGC AAA CTT CCT CCC ACA AAT-3' (SEKV. ID. Nr.:7) hybridiserte til den kodende kjede av finger 3 med start ved nukleotid 216 og avslutning ved nukleotid 196.
PCR-reaksjonen ble foretatt i en 100 mikroliter reaksjonsblanding inneholdende ett mikrogram (jxg) av hver av oligonukleotid-primerne FTX3 og BZF3, 200 millimolar (mM) dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 1,5 mM MgCI2 Taq-polymerase (5 enheter) (Perkin-Elmer Corp., Norwalk, CT), 10 nanogram (ng) av templat pComb3.5 zif268 og 10 uL av 10 x PCR-buffer som er kommersielt tilgjengelig (Perkin-Elmer Corp.). 30 PCR-amplifikasjonsrunder i en Perkin-Elmer Cetus 9600 GeneAmp. PCR System Thermocycler ble deretter foretatt. Amplifikasjonscyklusen besto av denaturering ved 94°C i 30 sekunder, hybridisering ved 50°C i 30 sekunder med påfølgende polymerisering ved 72°C i 1 minutt. For å oppnå tilstrekkelige mengder amplifikasjonsprodukt, ble det foretatt 30 like PCR-reaksjoner.
De resulterende PCR-amplifikasjonsproduktene ble deretter renset på en 1,5% agarosegel ved å benytte vanlige elektroelueringsteknikker, som beskrevet i "Molecuiar Cloning: A Laboratory Manual", Sambrook, et al., red. Cold Spring Harbor, NY (1989). Etter gelelektroforese av det oppkuttede, PCR-amplifiserte zink-finger-domenet, ble det gelområdet som inneholdt DNA-fragmentene av forutbestemt størrelse, kuttet ut, elektroeluert gjennom en dialysemembran, utfelt med etahol og resuspendert i buffer inneholdende 10 mM Tris-HCI, pH 7,5 og 1 mM EDTA, til en sluttkonsentrasjon på 50 ng/mL.
De rensede, resulterende PCR-amplifikasjonsproduktene fra den første reaksjonen ble deretter benyttet i en overlappsekstensjons-PCR-polymerisasjon med produktene av den andre PCR-reaksjon, begge slik som beskrevet nedenfor, for å rekombinere de to produktene til et rekonstruert zif268 inneholdende randomiserte zink-fingre.
Den andre PCR-reaksjonen resulterte i amplifikasjon av 3'-enden av zif268 finger 3 under overlapping av produktene ovenfor og forbi 3' for finger 3. For å amplifisere denne regionen for randomisering av den kodede sekvensen på 8 aminosyrer av finger 3, ble følgende primerpar benyttet. Forrådet av den 5'-kpdende oligonukleotidprimer ble betegnet ZF36K og hadde nukleotidsekvensen: 5'-ATT TGT GGG AGG AAG TTT GCC NNK AGT NNK NNK NNK NNK NNK CAT ACC AAA ATC CAT TTA-3' (SEKV: ID: Nr.:8) (nukleotidene 196-255). Den 3' ikke-kodende primer, R3B, hybridiserte til den kodende kjede i 3'-enden av gen III (gl 11) som har sekvensen 5'-TTG ATA TTC ACA AAC GAA TGG-3' (SEKV. ID. Nr.:9). Området mellom de to angitte ender av primer-forrådet representeres av en 15-mer, NNK-degenererthet. Den andre PCR-reaksjonen ble foretatt på en ny alikvot av pComb3.5-templat i en 100 uL reaksjonsblanding slik som ovenfor beskrevet og som inneholdt 1 ug av hver av de beskrevne oligonukleotid-primere. De resulterende PCR-produktene kodet for en uensartet populasjon av randomiserte zif268 finger-3 - regioner med en lengde på 8 aminosyrerester. Produktene ble deretter renset på gel som ovenfor beskrevet.
Ved hybridiseringsreaksjonen for de to PCR-amplifiseringene ble 1 u.g av hver av de gelrensede produktene fra den første og den andre PCR-reaksjon, blandet og fusjonert uten primere i 35 runder av PCR som ovenfor beskrevet. Det resulterende fusjonsprodukt ble deretter amplifisert med 1 u.g av hver av FTX3- og R3B- oligonukleotid-primer som et primerpar i en avsluttende PCR-reaksjon for å danne et fullstendig zif268-fragment ved overlappsekstensjon. Overlapps-PCR-amplifisering ble foretatt som beskrevet ovenfor for andre PCR-amplifikasjoner.
For å oppnå tilstrekkelige mengder amplifikasjonsprodukt ble det foretatt 30 identiske overlapps-PCR-reaksjoner. De resulterende fragmenter strakte seg fra 5' til 3<*> og hadde randomisert finger 3 som koder for 6 aminosyrerester. De randomiserte zif268 amplifikasjonsproduktene med en lengde på ca. 450 basepar (bp) i hver av de 30 reaksjonene, ble først slått sammen og deretter gel-renset som beskrevet ovenfor og kuttet med Xhol og Spel før deres innplassering i pComb3.5 overflate-presentasjons fagemid-ekspresjonsvektoren for å etablere et bibliotek for senere screening mot zink-finger gjenkjennings-oligonukleotidsekvenser for seleksjon av en bestemt zink-finger. Ligeringsprosedyren ved etablering av ekspresjonsvektor-biblioteker og den påfølgende ekspresjon av de zif268-randomiserte pComb3.5-klonene, ble foretatt som beskrevet nedenfor i Eksempel 4.
Nukleotidsubstitusjoner kan foretas også på ytterligere zink-fingre. I zif268 kan for eksempel også fingrene 1 og 2 modifiseres slik at ytterligere bindingsseter kan identifiseres. For modifikasjon av zink-finger 2 benyttes primerne FTX3 (som ; beskrevet ovenfor) og ZFNsi-B, 5'-CAT GCA TAT TCG ACA CTG GAA-3' (SEKV. ID. Nr.:10) (nukleotidene 100-120) for den første PCR-reaksjon og R3B (beskrevet ovenfor) og ZF2r6F (5'-CAG TGT CGA ATA TGC ATG CGT AAC TTC (NNK)6 ACC ACC CAC ATC CGC ACC CAC-3") (SEKV. ID. Nr.11) (nukleotidene 103 til 168) for den andre reaksjonen. For modifikasjon av finger 1 benyttes RTX3 (ovenfor) og
ZFI6rb (5'-CTG GCC TGT GTG GAT GCG GAT ATG (MNN)5 CGA MNN AGA AAA
GCG GCG ATC GCA GGA-3') (SEKV. ID. Nr.:12) (nukleotidene 28 til 93) for den første reaksjonen og ZFIF (5'-CAT ATC CGC ATC CAC ACA GGC CAG-3') (SEKV. ID. Nr.:13) (nukleotid 70 til 93) og R3B (ovenfor) i den andre reaksjonen. Overlapps-reaksjonen gjør bruk av FTX3 og R3B som ovenfor beskrevet for finger 3. Fortrinnsvis modifiseres hver finger individuelt og etter hverandre på ett protein-molekyl i stedet for alle tre i en reaksjon. Nukleotidmodifikasjonen av finger 1 av zif268 vil således inkludere de understrekede aminosyrene R-S DELTRH, (SEKV. ID. Nr.:14) som kodes av nukleotidene 49 til 72. Nukleotidmodifikasjonene av finger 2 av zif268 vil inkludere S R S D H L (SEKV. ID: Nr.: 15) som kodes av nukleotidene 130 til 147 (se Figur 7).
EKSEMPEL 4
FREMSTILLING AV FAGEMID-PRESENTERTE
SEKVENSER SOM HAR RANDOMISERTE ZINK-FINGRE
Fagemiden pComb3.5 inneholdende zif268-sekvenser er en fagemid-ekspresjonsvektor som sørger for ekspresjonen av fag-presenterte forankrede proteiner som beskrevet ovenfor. Den opprinnelige pComb3-ekspresjonsvektoren ble konstruert for å muliggjøre forankring av uttrykte antistoff-proteiner på kappeprotein 3 på bakteriofagen for kloningen av kombinatoriske Fab-biblioteker. Det ble anbragt Xhol- og Spel-seter for kloning av fullstendige PCR-amplifiserte tunge kjedesekvenser (Fd) som besto av regionen som startet med rammeverk 1 og strakte seg gjennom rammeverk 4. Gen III av den filamentære fag koder for dette 406 resteres mindre fag's kappeprotein, cplll (cplll), som uttrykkes før utstøting i løpet av sammensetningsprosessen for fagen på en bakteriemembran og akkumulers på den indre membran vendt mot periplasmaet til E. coli.
I dette system koder det første cistron for et periplasmatisk sekresjonssignal (pelB leder) operativt bundet til fusjonsproteinet zif268-cplll. Nærværet av pelB-lederen letter sekresjonen av fusjonsproteinet som inneholder randomiserte zink-fingre, fra bakterie-cytoplasmaet inn i det periplasmatiske rom.
Ved hjelp av denne prosess ble zif268-cplll avgitt til det periplasmatiske rom av pelB-ledersekvensen son senere ble avspaltet. Den randomiserte zink-finger ble forankret til membranen gjennom cplll-membran-forankringsdomenet. Fagemidvektoren, betegnet pComb3.5, gjorde overflate-presentasjon av zink-finger-proteinet mulig. Nærværet av Xhol/Spel-seter muliggjorde innføring av Xhol/Spel-kutt av de randomiserte zif268 PCR-produktene i pComb3.5-vektoren. Ligeringen av den zif268-mutageniserte nukleotidsekvens fremstillet i Eksempel 3, resulterte derved i ligering, i riktig leseramme, av et komplett zif268-fragment bestående av PCR-amplifisert finger 3. Kloningssetene i pComb3.5-ekspresjonsvektoren var forenelige med PCR-primere fra mus og menneske som tidligere beskrevet av Huse, et al., Science, 246:1275-1281 (1989) og Persson, et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 88:2432-2436 (1991). Nukleotidsekvensen av pelB, en ledersekvens for å dirigere det uttrykte protein til det periplasmatiske rom, var som angitt av Huse, ét al. supra.
Vektoren inneholdt også et ribosom-bindingssete som beskrevet av Shine, et al., Nature, 254:34 (1975). Den sekvens av fagemidvektoren, pBluescript, som innbefatter ColE1- og F1-ori og et p-laktamasegen, er tidligere beskrevet av Short, et al., Nuc. Acids Res., 16:7583-7600, (1988) og har GenBank tilgangsnummeret 52330 for den fullstendige sekvens. Ytterligere restriksjonsseter, Sali, Accl, Hincll, Clal, Hindlll, EcoRV, Pstl og Smal, lokalisert mellom Xhol og Spel-setene forden tomme vektor, ble avledet fra et 51 basepars stuffer-fragment av pBluescript, som beskrevet av Short, et al., supra. En nukleotidsekvens som koder for en fleksibel "tether"-sekvens på 5 aminosyrer og som mangler en ordnet sekundær struktur, ble sammenstillet mellom Fab- og cp3-nukleotid-domenet slik at innvirkning på det uttrykte fusjonsprotein ble minimalisert.
Den resulterende kombinatoriske vektor, pComb3.5, besto av et DNA-molekyl med en kassett til å uttrykke et fusjonsprotein, zif256/cp3. Vektoren inneholdt også nukleotidsekvenser for de etterfølgende operativt koblede elementene oppgitt i 5'- til 3'-retning: Kassetten bestående av LacZ-promoter/operator-sekvenser; et Notl-restriksjonssete; et ribosom-bindingssete; en pelB-leder; en spacer-region; en kloningsregion avgrenset av 5' Xhol- og 3* Spel-restriksjonsseter; "tether"-sekvensen og sekvensen som koder for bakteriofag cp3 etterfulgt av et stoppkodon. Et Nhel-restriksjonssete lokalisert mellom de opprinnelige to kassettene (for tunge og lette kjeder); en andre lacZ-promoter/operator-sekvens etterfulgt av et ekspresjonskontroll-ribosom-bindingssete; en pelB-leder; en spacer-region; en kloningsregion avgrenset av 5' Sacl- og et 3' Xbal-restriksjonssete etterfulgt av ekspresjonskontroll-stoppsekvenser og et andre Notl-restriksjonssete, ble deletert fra pComb3 for å danne pComb3.5. Fagmannen vil kjenne til lignende vektorer som ville kunne benyttes for fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen så som SurfZap™-vektoren (Stratagene, La Jolla, CA).
I ovennevnte ekspresjonsvektor er zif268/cp3 fusjonsproteinet satt under kontroll av en lac-promoter/operator-sekvens og styres av pelB-ledersekvenser mot det periplasmatiske rom for funksjonell sammensetning på membranen. Inklusjon av den fag F1 -intergene region i vektoren tillot pakking av enkeltkjedet fagemid ved hjelp av hjelperfag. Bruken av hjelperfag-superinfeksjon muliggjorde ekspresjonen av to former av cp3. Som følge av dette ble normal fag-morfogenese forstyrret gjennom konkurranse mellom Fd/cp3-fusjonen og hjelperfagens native cp3 for inkorporering i virionet. Det resulterende pakkede fagemid var bærer av nativt cp3, noe som er nødvendig for infeksjon, og det kodede fusjonsprotein som presenteres for seleksjon. Fusjon med det C-terminale domene var nødvendig for denne fagemid-metoden siden fusjon med det ineffektive N-terminale domene ville gjøre vertscellen resistent mot infeksjon.
pComb3 og -3.5-ekspresjonsvektoren beskrevet ovenfor, utgjør basis-konstruksjonen av fagemid-ekspresjonsvektoren som i henhold til foreliggende oppfinnelse benyttes til fremstilling av randomiserte zink-finger-proteiner.
EKSEMPEL 5
KONSTRUKSJON AV FAGEMID-BIBLIOTEK
For å oppnå et uttrykt protein som representerer randomiserte zink-fingre, ble det konstruert fagemid-biblioteker. Bibliotekene gjorde det mulig å oppnå overflate-ekspresjon av rekombinante molekyler hvor zink-fingre var randomisert som beskrevet i Eksempel 3.
For fremstilling av fagemid-bibliotek for ekspresjon av PCR-produktene fremstillet i Eksempel 3, ble PCR-produktene først kuttet med Xhol og Spel og ligert hver for seg med en tilsvarende kuttet opprinnelig (dvs. jkke-randomisert) pComb3.5-fagemid-ekspresjonsvektor. Xhol- og Spel-setene forekom i pComb3.5-vektoren som beskrevet ovenfor. Ligeringen resulterte i operativ tilkobling av zif268 til vektoren, lokalisert 5' til cp3-genet. Siden amplifikasjonsproduktene ble skutt inn i den template pComb3.5-ekspresjonsvektor som opprinnelig hadde sekvensene for den tunge kjedes variable domene, ble bare kloningssetet for den tunge kjedes domene erstattet, mens resten av pComb3.5-ekspresjonsvektoren forble uendret. Etter ekspresjon fra de rekombinante kloner, inneholdt de uttrykte proteiner en randomisert zink-finger.
Fagemid-bibliotek for ekspresjon av hver av de randomiserte zink-fingre ifølge oppfinnelsen, ble fremstillet i henhold til det følgende. For å danne sirkulariserte vektorer som inneholdt PCR-produktinnskuddet, ble 640 ng av de kuttede PCR-produktene blandet med 2 ug av den lineariserte pComb3.5-phagemidvektor, hvoretter ligeringen fikk skje i løpet av natten ved romtemperatur ved å benytte 10 enheter BRL-ligase (Gaithersburg, MD) i BRL-ligasebuffer i et reaksjonsvolum på 150 uL. Det ble foretatt fem separate ligeringsreaksjoner for å øke størrelsen av det fag-bibliotek som hadde randomiserte zink-fingre. Etter ligeringsreaksjonene ble det sirkulariserte DNA utfelt ved -20°C i løpet av 2 timer ved tilsetning av 2 uL av 20 mg/mL glykogen, 15 uL av 3M natriumacetat ved pH 5,2 og 300 mL etanol. DNA ble deretter underkastet mikrosentrifugering ved 4°C i 15 minutter. Den oppnådde DNA-pellet ble vasket med kald 70% etanol og tørket under vakuum. Pelleten ble resuspendert i 10 u.L vann og transformert ved elektroporering inn i 300 uL E. coli XL1 -Blue-celler for å danne et fag-bibliotek.
For å isolere fag som uttrykte mutagenisert finger 3, ble fag etter transformasjon indusert som beskrevet nedenfor, for påfølgende panning på et hårnåls-oligonukleotid med følgende sekvens (SEKV. ID. Nr.:16)
Den uthevede sekvens angir det nye bindingssetet (tidligere GCG) for zink-finger 3, den understrekede sekvens representerer finger-2-setet og den dobbeltunderstrekede representerer f inger-1-bindingssetet.
Transformerte E. coli ble dyrket i 3 mL SOC-medium (SOC ble fremstillet ved blanding av 20 gram (g) bacto-trypton, 5 g gjærekstrakt og 0,5 g NaCI i 1 Liter vann, justert til pH 7,5 og tilsatt 20 mL glukose umiddelbart før bruk for å indusere ekspresjon av zif268-cplll), ble blandet og kulturen ristet ved 220 rpm. i 1 time ved 37°C. Etter denne inkubering ble det tilsatt 10 mL SB (SB ble fremstillet ved å blande 30 g trypton, 20 g gjærekstrakt og 10 g Mops-buffer per liter og pH justert til 7) inneholdende 20 ug/mL carbenicillin og 10 ug/mL tetracyklin, hvorpå blandingen ble ristet ved 300 rpm. i ytterligere 1 time. Den resulterende blanding ble tilsatt til 100 mL SB inneholdende 50 ug/mL carbenicillin og 10 ug/mL tetracyklin og ristet i 1 time, hvoretter hjelperfagen VCSM13 (10<12>pfu) ble tilsatt og blandingen ristet i ytterligere 2 timer ved 37°C. Deretter ble 70 ug/mL kanamycin tilsatt og blandingen holdt ved 30°C over natten. Den lavere temperatur resulterte i en bedre ekspresjon av zif268 på fag-overflaten. Supernatahten ble klarnet ved sentrifugering (4000 rpm. i 15 minutter i en JA10-rotor ved 4°C). Fag ble utfelt ved å tilsette 4% (vekt/vol.) polyetylenglykol 8000 og 3% (vekt/vol.) NaCI og blandingen holdt på is i 30 minutter, hvorpå den ble sentrifugert (9000 rpm. i 20 minutter i en JA10-rotor ved 4°C). Fag-pellets ble resuspendert i 2 mL buffer (5 mM DTT, 10 mM Tris-HCI, pH 7,56, 90 mM Kcl, 90 mM ZnCI2,1 mM MgCI2 og mikrosentrifugert i tre minutter for å fjerne brokker, overført til nye sentrifugeglass og oppbevart ved -20°C for senere screening som beskrevet nedenfor. DTT ble tilsatt for at polypeptidet skulle folde seg tilbake på fag-overflaten.
For å bestemme titeret av kolonidannende enheter (cfu) ble fag (pakket fagemid) fortynnet i SB, hvorpå 1 uL ble benyttet til å infisere 50 uL friske (Aod6oo=1) E. coli XL1-Blue-celler dyrket i SB inneholdende 10 ug/mL tetracyklin. Fag og celler ble holdt ved romtemperatur i 15 minutter og deretter utplatet direkte på LB/carbenicillin-plater. Det randomiserte zink-finger-3-bibliotek besto av totalt 5 x 107
PFU.
Multiple panninger av fag-biblioteket
Fag-biblioteket ble "pannet" mot hårnåls-oligonukleotidet som inneholdt et endret bindingssete, slik som ovenfor beskrevet, på belagte mikrotiterplater for å selektere for nye zink-fingre.
Den anvendte panning-prosedyren som besto av flere runder gjenkjenning og replikasjon, var en modifikasjon av den metode som opprinnelig er beskrevet av Parmley & Smith (Parmley, et al., Gene, 73:305-318,1988; Barbas, et al. 1991, supra). Fem panning-runder ble foretatt for å anrike sekvensspesifikke bindende kloner. For dette formål ble fire brønner i en mikrotiterplate (Costar 3690) belagt med 1 jig av oligonukleotidet ved tørking over natten ved 37°C, eller oligonukleotidet ble kovalent bundet til BSA med EDC/NHS-aktivering for å dekke platen (360 (ig acetylen" BSA (Boehringer Mannheim), 577 ug oligo, 40 mM NHS og 100 mM EDC ble kombinert i et totalvolum på 1,8 mL og inkubert over natten ved romtemperatur. Platene ble belagt ved å benytte 50 uL per plate og inkubert ved 4°C over natten. Brønnene ble vasket to ganger med vann og blokkert ved å fylle brønnen fullstendig med 3% (vekt/vol.) BSA i PBS og holde platen ved 37°C i 1 time. Etter at blokkeringsløsningen var ristet ut, ble 50 uL av den ovenfor fremstillede fag-suspensjon (typisk 10<12> pfu) tilsatt til hver brønn og platen holdt ved 37°C i 2 timer. Fag ble fjernet og platen vasket en gang med vann. Hver brønn ble deretter vasket 10 ganger med TBS/Tween (50 mM Tris-HCI, pH 7,5,150 mM NaCI, 0,5% Tween 20) i et tidsrom på 1 time ved romtemperatur, idet vaskingen besto av pipettering opp og ned for å vaske brønnen, hvorunder brønnen hver gang fikk stå fullstendig fylt med TBS/Tween mellom vaskingene. Platen ble vasket en gang til med destillert vann, hvoretter adhererende fag ble eluert ved tilsetning av 50 uL elueringsbuffer (0,1 M HCI, justert til pH 2,2 med fast glycin, inneholdende 1 mg/mL BSA) til hver brønn, etterfulgt av opphold ved romtemperatur i 10 minutter. Elueringsbufferen ble pipettert opp og ned flere ganger, tatt ut og nøytralisert med 3 uL 2 M Trisbase per 50 uL anvendt elueringsbuffer.
Eluerte fag ble benyttet til å infisere 2 mL friske (OD6oo=1) E.coli XL1-Blue-celler i 15 minutter ved romtemperatur, hvoretter 10 mL SB inneholdende 20 u,g/mL carbenicillin og 10 (ig/mL tetracyklin ble tilsatt. Alikvoter på 20,10 og 1/10 uL ble uttatt fra kulturen for utplating for å bestemme antallet av fag (pakkede phagemider) som ble eluert fra platen. Kulturen ble ristet i 1 time ved 37°C, hvorpå den ble tilsatt til 100 mL SB inneholdende 50 ug/mL carbenicillin og 10 u.g/mL tetracyklin og ristet i 1 time. Hjelperfag VCSM13 (10<12>pfu) ble deretter tilsatt og kulturen ristet i ytterligere 2 timer. Deretter ble 70 ug/mL kanamycin tilsatt og kulturen inkubert ved 37°C over natten. Fag-fremstilling og videre panning ble foretatt som beskrevet ovenfor.
Etter hver panning-runde ble det prosentuelle utbytte av fag bestemt, hvor
% utbytte=(antall eluerte fag/antall påførte fag) X 100. Det initiale inngangsforhold for fag ble ved titrering på selektive plater, bestemt til ca. 10<11> cfu for hver panning-runde. Det endelige utgangsforhold for fag ble bestemt ved å infisere 2 mL av XL1-BLue-celler i logaritmisk fase, slik som ovenfor beskrevet, og utplate alikvoter på selektive plater. Fra denne prosedyre ble kloner selektert fra Fab-biblioteket med henblikk på deres evne til å binde seg til det nye bindende sekvens-oligo. De. selekterte klonene hadde randomiserte zink-finger-3-domener.
Resultatene av sekvensiell panning av det randomiserte zink-finger-3-bibliotek røpet fem bindende sekvenser som gjenkjente det nye finger-3-setet. Det native setet GCG, ble endret til AAA og de følgende sekvenser vist i Tabell 1 ble påvist å binde AAA..
EKSEMPEL 6
KOTRANSFORMASJONSANALYSE FOR IDENTIFIKASJON AV ZINK-FINGER-AKTIVERING AV PROMOTER
For å vurdere de funksjonelle egenskaper av de frembrakte nye zink-fingre er det utviklet et E.coli-basert in vivo system. Dette system gjør bruk av to plasmider med de kompatible replikoner colE1 og p15. Cytoplasmatisk ekspresjon av zink-fingeren bevirkes av arabinasepromoteren i colE1-plasmidet. Det p15 replikon-holdige plasmid inneholder et zink-finger-bindingssete i stedet for repressor-bindingssetet i et plasmid som uttrykker a-f ragméntet av p-galaktosidase. Bindingen av zink-fingeren til dette sete på det andre plasmid avbryter produksjonen av p-galaktosidase og nye zink-fingre kan således bestemmes ved denne in vivo funksjonsbestemmelse ved å benytte en hensiktsmessig blå/hvit-seleksjon. I nærvær av arabinose og laktose uttrykkes for eksempel zink-finger-genet, hvorpå proteinproduktet binder seg til zink-finger-bindingssetet og undertrykker laktosepr<p>moterén. Det dannes derfor intet p-galaktosidase og det vil forekomme hvite plakk. Dette system som med hensyn til restriksjonsseter, er forenelig med pComb3.5, vil lette den hurtige karakterisering av nye fingre. Denne metode vil dessuten kunne utvides til å gjøre genetisk seleksjon av nye transkripsjons-regulatorer mulig.
En annen metode for mutagenisering av en villtype av nukleotid-bindende zink-finger-protein, inkluderer segmental "omstokking" ved å benytte en PCR-teknikk som muliggjør omstokking av gensegmenter mellom gensamlinger. Fortrinnsvis inneholder genene begrensede homologi-regioner og minst 15 basepar av sammenhengende sekvensidentitet. Samlinger av zink-finger-gener i vektoren pComb3.5 benyttes som templater for PCR-teknikken. Det foretas fire PCR-runder under denaturering, for eksempel i 1 minutt ved 94°C og hybridisering i 15 sekunder ved 50C. I egne forsøk foretas PCR ved 94°C, 1 min., 50°C, 30 sek.; 94°C, 1 min., 50°C, 1 min.; 94°C, 1 min., 50°C, 15 sek., 72°C, 1 sek. I alle forsøk benyttes det samme templat (en 10 ng blanding). Forsøket foretas slik at det under hver betingelse foretas to sett av reaksjoner.Hvert sett har kun en primer for en topp- eller bunn-kjede, som fører til utvikling av enkeltkjedede DNA-sekvenser av ulike lengder. For eksempel kan FTX3-, ZFIF- og FZF3-primere benyttes i et eget sett for å gi enkeltkjedede produkter. Produktene fra disse reaksjonene slås deretter sammen og tilsettes ytterligere 5'- og 3'-terminale primere (f.eks. FTX3 og R3B), og blandingen underkastes ytterligere 35 PCR-runder ved 94°C, 1 min., 50°C, 15 sek., 72°C, 1 min. 30 sek. Den resulterende blanding kan deretter klones ved Xhol/Spel-kutting. De nye, omstokkede zink-fingrene kan selekteres som beskrevet ovenfor ved panning av et utvalg av zink-fingre på en hvilken som helst genetisk pakke for seleksjon av de optimale zink-fingersamlinger. Denne teknikk kan benyttes for en hvilken som helst samling av gener som inneholder minst 15 bp sammenhengende sekvens-identitet. Primere kan også i en viss utstrekning dopes som beskrevet ovenfor under bruk av NNK-eksemplet, for å innføre mutasjoner i primer-bindingsregioner. Reaksjonstidene kan varieres avhengig av templatlengde og antallet av anvendte primere.
EKSEMPEL 7
MODIFISERING AV SPESIFISITETEN AV Zif268
Reagenser, stammer og vektorer
Restriksjons-endonukleaser ble anskaffet fra New England Biolabs eller Boehringer, Mannheim. T4 DNA-ligase var produktet til GIBCO BRL. Taq-polymerase og Vent-polymerase ble kjøpt fra Promega. Heparin-Sepharose CL-6B medium var fra Pharmacia. Oligonukleotider var fra Ope ro n Technologies (Alameda, CA) eller laboratoriemessig fremstillet på en Gene Assembler Plus (Pharmacia LKB), mens pZif89 var en gave fra Drs. Pavletich og Pabo (Pavletich, Science, 252,809-817,1991). Escherichia coli BL21(DE3)pLysS og plasmid pET3a var fra Novagen, Escherichia coli XL1-Blue, fag VCSM13, fagemid-vektoren pComb3, og pAraH er som beskrevet (Barbas III, et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 88:7978-7982,1991; Barbas III, et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 2:119-124, 1991).
Plasmidkonstruksjon
Gener som koder for villtype-zink-finger-proteiner ble satt under kontroll av Salmonella typhimurium araB-promoteren ved innskudd av et DNA-fragment amplifisert ved PCR og inneholdende villtype-Zif268-genet av pzif89 (Pavletich, supra) under addisjon av multiple restriksjonsseter (Xhol/Sacl/ og Xbal/Spel). Den resulterende plasmidvektor ble deretter benyttet for subkloning av de selekterte zink-finger-gener for immunoscreening. I denne vektoren uttrykkes zink-finger-prdteinet som en fusjon med en hemagglutinin-dekapeptid-merking i dets C-terminal som kan påvises med et anti-dekapeptid-monoklonalt antistoff (Figur 8A) (Field, et al.., Mol. & Cell. Biol. 8:2159-2165,1988). Zif268-proteinet er rettet inn på linje for å vise hver zink-fingers konserverte trekk, a-spiralene og antiparallelle (3-plater er antydet. Seks aminosyrerester understreket i hver fingersekvens, ble randomisert i bibliotek-konstruksjoner. Den C-terminale ende av Zif268-proteinet ble fusjonert med et fragment inneholdende en dekapeptid-merking. Fusjonsposisjonen er antydet med en pil.
Fagemiden pComb3 ble modifisert ved kutting med Nhel og Xbal for å fjerne fragmentet av antistoffets lette kjede, utfylt med Klenow-fragment og ryggraden selvligert, hvilket førte til plasmid pComb3.5. PCR-fragmentet av Zif268 ble skutt inn i pComb3.5 som ovenfor. For å fjerne bakgrunnsproblemer ved bibliotek-konstruksjonen ble en 1,1-kb ikke-funksjonell stuffer innsatt i stedet for villtype-Zif268-genet ved bruk av Sacl og Xbal. Det resulterende plasmid ble kuttet med Sacl og Xbal for å fjerne stufferen, og pComb3.5-ryggraden ble gel-renset og utgjorde vektor for bibliotek-konstruksjon.
Zink-finger-biblioteker
Det ble konstruert tre zink-finger-bibliotek ved PCR-overlappspolymerisasjon ved å benytte betingelser beskrevet tidligere i Eksempel 3. I korthet ble det for finger-1-biblioteket benyttet primerparene A (5'-GTC CAT AAG ATT AGC GGA TCC-3') (SEKV. ID. Nr.:29) og Zf16rb (SEKV. ID. Nr.:12) (hvor N er A, T, G eller C, og M er A eller C), og B (5'-GTG AGC GAG GAA GCG GAA GAG-3') (SEKV. ID. Nr.:30) og Zf1f (SEKV. ID. Nr.:13) for å amplifisere Zif268-genfragmenter under bruk av plasmid pAra-Zif268 som templat. To PCR-fragmenter ble blandet i likt molforhold og blandingen benyttet som templat for overlappspolymerisasjon. De rekombinante fragmentene ble deretter PCR-amplifisert ved å benytte primerne A og B og det resulterende produkt kuttet med Sacl og Xbal og gel-renset. Under hver ligeringsreaksjon ble 280 ng oppsluttet fragment ligert med 1,8 jxg av pComb3.5-vektor ved romtemperatur over natten. Det ble foretatt 12 reaksjoner, hvoretter det oppnådde DNA ble utfelt med etanol og elektroporert inn i E. coli XL1 -Blue. Bibliotekene for finger 2 og 3 ble konstruert på lignende måte bortsett fra at PCR-primerne Zf16rb og Zf1 F benyttet ved konstruksjonen av f inger-1-biblioteket, ble erstattet med Zfnsi-B (SEKV. ID. Nr.:10) og ZF2r6F (SEKV. ID. Nr.:11) (hvor K er G eller T) for finger-2-biblioteket og med BZF3 (SEKV. ID. Nr.:7) og ZF36K (SEKV. ID. Nr.:8) for finger-3-biblioteket. I bibliotekene ble seks aminosyrerester tilsvarende oc-helix-posisjonene -1, 2, 3, 4, 5, 6 av finger 1 og 3, posisjonene -2, -1,1,2,3,4 av finger 2 randomisert (Figur 8A).
In vitro seleksjon av zink-fingre
En 34-nukleotiders hårnål-DNA som inneholdt enten konsensus- eller endret Zif268-bindingssete, ble benyttet for zink-finger-seleksjon (Figur 8). Konsensus-bindingssetet er betegnet Z268N (5'-CCT GCG TGG GCG CCC TTTT GGG CGC CCA CGC AGG-3') (SEKV. ID. Nr.:31). Det endrede setet for finger 1 er TGT (5'-CCT GCG TGG JGI CCC TTTT GGG ACA CAA CGC AGG-3'), for finger 2 er det TTG (5'-CCT GCG JTG GCG CCC TTTT GGG CGC CAA CGC AGG-3') og for finger 3 er det CTG (5'-CCT CTG TGG GCG CCC TTTT GGG CGC CCA CAG AGG-3'). Oligonukleotidet ble syntetisert med en primær n-heksylaminogruppe i dets 5'-ende. Et DNA-BSA-konjugat ble fremstillet ved å blande 30 \ iM DNA med 30 u.M acetylert BSA i en løsning inneholdende 100 mM 1-(3-dimetylaminopropyl)-3-etylkarbodiimid-hydroklorid (EDCI) og 40 mM N-hydroksysuccinimid (NHS) ved romtemperatur i 5 timer over natten. Zif268-fag, 10<12> kolonidannende enheter, i 50 |xL zink-buffer (10 mM Tris-CI, pH 7,5, 90 mM KCI, 1 mM MgCI2, 90 u.M ZnCI2,
1 mM MgCI2 og 5 mM DTT) inneholdende 1% BSA ,ble tilsatt til en mikrotiterbrønn som på forhånd var dekket med 4,9 u.g DNA-BSA-konjugat i 25 uL PBS-buffer (10 mM kaliumfosfat, 160 mM NaCI, pH 7,4) per brønn. Etter inkubering i 2 timer
ved 37°C ble fagen fjernet og platen vasket en gang med TBS-buffer (50 mM Tris-CI og 150 mM NaCI, pH 7,5) inneholdende 0,5% Tweért i den første selekteringsrunde. Platen ble vasket fem ganger i 2. runde og 10 ganger i senere runder. Bundet fag ble ekstrahert med elueringsbuffer (0,1 M HCI, pH 2,2 (justert med glycin) og 1% BSA) og benyttet i infiserte E. coli XL1-Blue-celler for å danne fag for senere seleksjon.
Immunoscreening
Mutante zink-finger-gener selektert etter fem eller seks panning-runder ble subklonet inn i pAraHA-vektoren under bruk av Xhol- og Spel-restriksjonsseter. I alminnelighet var 20 kloner gjenstand for screening hver gang. Cellen ble dyrket ved 37°C til sen-log-fase (OD6oo 0,8-1) i 6 mL SB-medium (Barbas III, et al., supra) inneholdende 30 ug/mL kloramfenikol. Ekspresjonen av zink-finger-proteiner ble indusert ved tilsetning av 1% arabinose. Celler ble høstet 3 til 12 timer etter induksjon. Cellepellets ble resuspendert i 600 uL zink-buffer inneholdende 0,5 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF). Celler ble lysert gjennom 6-frys/tine-cyklusér og supematanten klarnet ved sentrifugering ved 12.000 g i 5 minutter. En 50 jxL alikvot av cellesupematant ble avsatt i en mikrotiterbrønn på forhånd dekket med 1,1 ug DNA-BSA-konjugat. Etter 1 time ved 37°C ble platen vasket ti ganger med destillert vann og et alkalisk fosfatase-konjugert anti-dekapeptid-antistoff tilsatt til platen. Etter 30 minutter ved 37°C ble platen vasket ti ganger og tilsatt p-nitrofenylfosfat. Platen ble deretter avlest med en automatisert mikroplate-leser ved 405 nm.
Overekspresjon og rensing av zink-finger-proteiner
Zink-finger-proteiner ble overprodusert ved å benytte pET-ekspresjonssystemer (Studier, et al., Methods Enzymol., 185:60-89,1990). Zif268-genet ble etter PCR innført i Ndel og BamHI kuttet vektor pET3a. Deretter ble Zif268-genet erstattet med et 680-bp ikke-funksjonelt stuffer-fragment. Det resulterende pET-plasmid som inneholdt stuffer-fragmentet, ble benyttet for kloning av andre zink-finger-gener ved å erstatte stufferen med zink-fihger-gener under bruk av Spel- og Xhol-seter. pET-plasmidene som koder for zink-finger-gener ble innført i
BL21 (DE3)pLysS ved kjemisk transformasjon. Celler ble dyrket til mid-log-fase (OD6oo 0,4-0,6) i SB-medium inneholdende 50 u,g/mL carbenicillin og 30 ug/rriL kloramfenikol. Proteinekspresjon ble indusert ved tilsetning av 0,7 mM IPTG til mediet. I alminnelighet ble 500 mL kulturer høstet 3 timer etter induksjon. Cellepelleter ble resuspendert i zink-bufferen som inneholdt 1 mM PMSF og cellene lysert ved ultralydbehandling i 5 minutter ved 0°C. Etter tilsetning av 6 mM MgCI2, ble cellelysatet inkubert med 10 ug/mL DNase I i 20 minutter på is. Inklusjons-legemer som inneholdt zink-finger-proteiner ble oppsamlet ved sentrifugering ved 25.000 g i 30 minutter og ble deretter resuspendert og solubilisert i 10 mL zink-buffer inneholdende 6 M urea og 0,5 mM PMSF under forsiktig blanding i 3 til 12 timer ved 4°C. Ekstraktet ble klarnet ved sentrifugering ved 30.000 g i 30 minutter og filtrert gjennom et 0,2-u.m lavprotein-bindende filter. Det totale proteinekstrakt ble avsatt på en Heparin-Sepharose FPLC-kolonne (1,6 x 4,5 cm) ekvilibrert med zink-buff,ér. Proteiner ble eluert med en 0-0,7 M NaCI-gradient. Fraksjoner som inneholdt1 zink-finger-protein ble identifisert ved hjelp av SDS-PAGE og slått sammen. Proteinkonsentrasjoner ble bestemt ved hjelp av Bradford-metoden under bruk av BSA (fraksjon V) som standard (Bradford, Anal. Biochem., 72:248-254,1976). Utbyttet av renset protein var fra 7 til 19 mg/Liter cellekultur. Proteinet var ifølge SDS-PAGE mer enn 90% homogent.
Kinetisk analyse
De kinetiske konstantene for interaksjonene mellom Zif268-peptider og deres DNA-mål, ble bestemt ved analyse basert på overflate-plasmonresonans ved å benytte BIAcore-instrumentet (Pharmacia) (Malmquist, Curr. Opinion in Immune, 5:282-286,1993). Overflaten av en sensor chip ble aktivert med en blanding av EDCI og NHS i 15 minutter. Deretter ble 40 uL affinitetsrenset streptavidin (Pierce), 200 jig/mL i 10 mM natriumacetat (pH 4,5) injisert med en hastighet på 5 uL/min. I alminnelighet ble 5000-6000 resonansenheter av streptavidin immobilisert pa chipen. Overskytende estergrupper ble dekomponert med 30 uL 1 M etanolamin. Oligonukleotider ble immobilisert på chipen ved injeksjon av 40 uL biotinylerte
oligonukleotider (50 jig/mL) i 0,3 M natriumklorid. Vanligvis ble 1500-3000
i resonansenheter oligomerer immobilisert. Assosiasjonshastigheten (kon) ble bestemt ved å studere bindingshastigheten av proteinet til overflaten i 5 ulike proteinkonsentrasjoner varierende fra 10 til 200 ug/mL i zink-bufferen. Dissosiasjonshastigheten (koff) ble bestemt ved å øke strømningshastigheten til 20 uL/min. etter assosiasjonsfasen. koff-verdien er gjennomsnittet av tre målinger, kon- og koff-verdiene ble beregnet ved å benytte Biacore® kinetics evaluation programvare. Likevektsdissosiasjonskonstantene ble utledet fra hastighetskonstantene.
EKSEMPEL 9
FAGEMID-PRESENTASJON AV MODIFISERTE ZINK-FINGRE
Bibliotek-utvikling og seleksjon
Fag-presentasjon av Zif268-proteinet ble oppnådd ved modifikasjon av fagemid-presentasjonssystemet pComb3 som beskrevet i Eksempel 2-6. Zif268-sekvensen fra pzif89 ble spesialtilpasset ved PCR for insersjon mellom Xhol- og Spel-setene i pComb3.5. Som beskrevet ovenfor i Eksempel 4,resulterer insérsjon i disse setene i fusjon av Zif268 med det karboksylterminale segment av genet for den filamentære fags kappeprotein III, pill. Et enkelt panning-forsøk som besto i; inkubering av fagen som presenterte zink-finger-proteinet, med DNA-målsekyensen immobilisert i en mikrotiterbrønn, omhyggelig etterfulgt av vasking, eluering og titrering av eluert fag, ble benyttet for å undersøke de funksjonelle egenskaper av proteinet presentert på fag-overflaten.
I kontrollforsøk ble fag som presenterte Zif268 undersøkt i et panning-forsøk for å binde en målsekvens som var bærer av dens konsensus-bindingssete eller bindingssetet for de første tre fingrene av TFIIIA. Disse forsøkene viste at Zif268-presenterende fag bandt den passende DNA-målsekvens 9 ganger sterkere enn TFIIIA-sekvensen eller BSA og viste at sekvensspesifikk binding av finger-komplekset bibeholdes under fag-presentasjon. En fire gangers reduksjon i fag-binding ble registrert når Zn<+2> og DTT ikke inngikk i bindingsbufferen. To rapporter bekrefter at Zif268 kan presenteres på fag-overflaten (Rebar, et al., Science, 263:671-673,1994; Jamieson, et al., Biochem., 33:5689-5695,1994).
I et lignende forsøk ble de første tre fingrene av TFIIIA presentert på fag-overflaten og også vist å bibeholde spesifikk bindingsaktivitet. Immobilisering av DNA
i
ble gjort lettere ved å konstruere en stabil hårnålssekvens som presenterte dupleks-DNA-målet av fingrene innenfor et enkelt oligonukleotid som var amino-merket (Figur 8B) (Antao, et al., Nucleic Acids Research, 19:5901-5905,1991). Dette håmåls-DNA inneholdende 9-bp-konsensus-bindingssetet (5'-GCGTGGGCG-3\ som omraimmet) av villtype-Zif268, ble benyttet for affinitetsseleksjon av fag-presenterte zink-finger-proteiner. I tillegg ble de 3-bp-subsetene (innrutet) av konsensus HIV-1 DNA-sekvensen benyttet i stedet for villtype-Zif268 3-bp-subseter for affinitetsseleksjon.
Amino-linkeren muliggjorde kovalent kobling av hårnålssekvensen til acetylert
BSA som deretter ble immobilisert for seleksjonsforsøk ved adsorpsjon til polystyren
i mikrotiterbrønner. Biotinylerte hårnålssekvenser virket like godt for seleksjon etter immobilisering til streptavidin-dekket plate.
Biblioteker av hver av de 3 fingrene av Zif268 ble konstruert uavhengig av hverandre ved å benytte den tidligere beskrevne overlapps- PCR mutagenese-strategi (Barbas III, et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 89:4457-4461,1992 og Eksempel 2-6). Randomisering ble begrenset til seks posisjoner på grunn av de
bånd som hefter ved størrelsen av bibliotek som rutinemessig kan konstrueres (Barbas III, et al., Curr. Opinion in Biotech., 4:526-530,1993). Zink-finger-proteinets gjenkjenning av DNA medfører en antiparallell anordning av proteinet i DNA's hovedgrop, dvs. den aminoterminale region er involvert i 3'-kontakter med målsekvensen, mens den karboksyterminale region er involvert i 5'-kontakter (Figur 8B). Innenfor et gitt finger/DNA-subsete-kompleks forblir kontaktene antiparallelle, hvor i finger 1 av Zif268, guanidiniumgrupper i Arg i helix-posisjonene -1 og 6 danner hydrogenbindinger med henholdsvis 3'- og 5'-guaninene av GCG-målsekvensen. Kontakt med den sentrale base i en triplett-subsete-sekvens med sidekjeden av helix-posisjon 3-resten sees i finger 2 av Zif268, fingrene 4 og 5 av GLI og fingrene 1 og 2 av TTK. Innenfor de tre rapporterte krystallstrukturene av zink-finger/DNA-
komplekser har direkte basekontakt vært observert mellom sidekjedene i restene -1 til 6, med unntak av 4 (Pavletich, supra, Pavletich, Science, 261:1701-1707,1993; Fairall, et al., Nature, 366:483-487, 1993).
På basis av disse observasjoner ble rester tilsvarende helix-posisjonene -1,2, 3,4, 5 og 6 randomisert i finger 1- og 3-bibliotekene. Ser i posisjon 1 ble konservert i disse forsøkene siden den er vel konservert i denne posisjon i zink-finger-sekvenser i sin alminnelighet og fullstendig konservert i Zif268 (Jacobs, EMBO, J., 11:4507-4517,1992). I finger 2-biblioteket ble helix-posisjonene -2, -1,1, 2, 3 og 4 randomisert for å utprøve en annen mutagenese-strategi, hvor -2-posisjonen undersøkes siden både Zif268 og GLI-strukturer viser at denne posisjonen er involvert i fosfatkontakter og siden det vil ha en effekt som har sammenheng med resten av domenet. Restene 5 og 6 ble holdt fast siden målsekvensen TTG beholdt 5'-thymidinet av villtype TGG-setet. Innføring av ligert DNA ved elektroporering resulterte i konstruksjonen av bibliotek som besto av 2 x 10<9>, 6 x TO<8> og 7 x 10<8 >uavhengige transformanter for henholdsvis fingerbibliotekene 1, 2 og 3. Hvert bibliotek resulterte i presentasjon av den mutageniserte finger i sammenheng med de to øvrige fingre av villtype-sekvenser.
EKSEMPEL 10
SEKVENSANALYSE AV SELEKTERTE FINGRE
For å undersøke muligheten for å modifisere zink-fingre til å binde definerte mål og å undersøke deres muligheter innen genterapien, ble en konservert sekvens innen HIV-1 -genomet valgt som en målsekvens. 5'-ledersekvensen av HIV-1 HXB2-klon i posisjonene 106 til 121 i forhold til startsetet for transkripsjonsinitiering, utgjør en av flere konserverte regioner innen HIV-1-genomer (Yu, et al., Proe. Nati. Acad. Sei.. USA, 90:6340-6344,1993); Myers, et al., 1992). For disse forsøkene var målet det 9 basepar lange området 113 til 121, vist i Figur 8B.
Etter seleksjon for binding av de native konsensus- eller HIV-1-målsekvenser, ble funksjonelle zink-fingre hurtig identifisert gjennom en immunoscreening. Ekspresjon av de selekterte proteiner i et pAraHA-derivat resulterte i fusjon av de mutante Zif268-proteinene med en peptidmerkingssekvens som ble gjenkjent av et monoklonalt antistoff (Figur 8A). Binding ble bestemt ved et ELISA-oppsett under bruk av rå cellelysater. En kvalitativ vurdering av spesifisiteten kan også oppnås gjennom denne metodikk som er følsom for minst fire gangers forskjeller i affinitet. Flere posistive kloner fra hver seleksjon ble sekvensert og er vist i Figur 9. De seks randomiserte restene av finger 1 og, 3 er i posisjonene -1, 2, 3,4, 5 og 6 i a-helix-regionen og i -2, -1,1, 2,3 og 4 i finger 2 (Figur 9). De tre nukleotidene angir det bindingssete som ble benyttet for affinitetsseleksjon av hver finger. Proteiner som er studert i detalj er angitt med en klonbetegnelse.
Finger 1-seleksjon med konsensus-bindingssetet GCG oppviste en sterk seleksjon for Lys i posisjon -1 og Arg i posisjon 6. Samspill mellom posisjonene -1 og 2 sees i tre kloner som i disse posisjonene inneholder henholdsvis Lys og Cys. Klon C7 ble fortrinnsvis anriket ved seleksjonen på grunnlag av dens forekomst i tre av de tolv sekvenserte kloner. Seleksjon mot HIV-1-målsekvensen i denne region, TGT, oppviste et mangfold av sekvenser med en seleksjon for rester med hydrogen-bindende sidekjeder i posisjon -1 og en moderat seleksjon for Gin i posisjon 3. Finger-2-seleksjon mot konsensus TGG-subsetet viste en seleksjon for en aromatisk rest ved -1, mens seleksjon mot HIV-1 målet TTG oppviste en seleksjon for en basisk rest i denne posisjonen. Preferansen for Ser i posisjon 3 kan være relevant ved gjenkjenningen av thymidin. Kontakt av thymin med Ser har vært iakttatt i GLI-og TTK-strukturer (Pavletich, supra; Fairall, et al., supra). Andre moderate seleksjoner mot konsensus-rester kan sees i tabellen. Seleksjoner ble foretatt ved å benytte en supE-stamme av E. coli som resulterte i lesing av amber-kodonet TAG som Gin under translasjonen. Av de 51 sekvenser som er angitt i Figur 9, var 14 kloner i besittelse av et enkelt amber-kodon. Ingen kloner hadde mer enn ett amber-kodon. Seleksjon for suppresjon av amber-stoppkodonet i supE-stammer har vært registrert i andre DNA-bindinde protein-bibliotek og forbedrer sannsynligvis kvaliteten av biblioteket siden denne rest ofte benyttes som en kontaktrest i DNA-bindende proteiner (Huang, et al., Proe. Nati. Acad, Sei., USA, 91:3969-3973,1994). Seleksjon for fingre som inneholder frie cysteiner registreres også og reflekterer sannsynligvis forsøksprotokollen. Fag ble inkubert i en buffer som inneholdt Zn<+2> og DTT for å maksimalisere antallet av fag med riktig foldede fingre. Seleksjon mot frie cysteiner, antagelig som følge av aggregasjon eller ukorrekt folding, har tidligere vært registrert i fag-presentasjons-biblioteker av andre proteiner (Lowman, et al., J. Mol. Biol., 234:564-578, 1993).
For videre karakterisering ble høy grad av ekspresjon av zink-finger-proteiner oppnådd ved å benytte T7-promoteren (Figur 10) (Studier, et al., supra). I Figur 10 ble proteiner separert ved 15% SDS-PAGE og farvet med Coomassie-brilliantblått. Bane 1: molekylvektstandarder (kDa). Bane 2: celleekstrakt før IPTG-induksjon. Bane 3: celleekstrakt etter IPTG-induksjon. Bane 4: cytoplasmafraksjon etter fjerning av inklusjonslegemer ved sentrifugering. Bane 5: inklusjonslegemer inneholdende zink-finger-peptid. Bane 6: mutant Zif268-peptid renset ved Heparin-Sepharose FPLC. Klonene C10, F8 og G3 hadde alle et amber-kodon som ble omdannet til CAG for å kode for Gin før ekspresjon i dette system.
EKSEMPEL 11
KARAKTERISERING AV AFFINITET OG SPESIFISITET
For å få innblikk i mekanismen for endret spesifisitet eller affinitet ble de kinetiske sider ved bindingen bestemt ved anvendelse av sanntids-endringer i SPR (surface plasmon resonance) (Malmquist, supra). De kinetiske konstanter og beregnede likevektsdissosiasjonskonstanter for 11 proteiner er vist i Figur 11. Hvert av de undersøkte zink-finger-proteiner er angitt med en klonbetegnelse (angående sekvensen for denne , se Figur 9). DNA-målsetet benyttet for seleksjon av hver finger, er angitt med fete typer. Konsensus-bindingssetet for villtype-proteinet er også vist med fete typer. Ikke-håmåls-dupleksen DNA (understreket) ble fremstillet ved hybridisering av to enkeltkjedede DNA. Assosiasjonshastigheten, kon! dissosiasjonshastigheten koff og likevektsdisssosiasjonskonstanten Kd er angitt for hvert protein.
De beregnede likevektsdissosiasjonskonstantene for Zif268-binding til dens konsensus-sekvens i form av den utviklede hårnål eller en lineær dupleks som mangler tetrathymidinsløyfen, er faktisk identiske hvilket tyder på at konformasjonen av den dupleks-sekvens som gjenkjennes av proteinet ikke har fått forstyrret konformasjonen innen hårnålen. Verdien på 6,5 nM for Zif268-binding til dens konsensus er i det området på 0,5 til 6 nM som er rapportert ved bruk av elektroforetiske mobilitetsforskyvnings-målinger for dette proteins binding til dets konsensus-sekvens innenfor oligonukleotider av forskjellig lengde og sekvens (Pavletich, supra; Rebar, supra; Jamieson, et al., supra).
Som et mål på spesifisitet ble affiniteten av hvert protein bestemt for binding til den native konsensus-sekvens og en mutantsekvens hvor et finger-subsete var blitt endret. Figur 11 viser bestemmelsen av dissosiasjonshastigheten (koff) av villtype
Zif268-protein (WT) og dets variant C7 ved sanntids-endringer i overflate-plasmonresonans. Instrumentresponsen, r, er proposjonal med [proteinDNA]-komplekset. Siden dr/dt=koffr når [protein]=0, er koff=ln (rti/Rtn)/(tn-ti), hvor r^ er responsen til tiden tn- Resultatene av et enkelt forsøk for hvert protein er vist. Tre forsøk ble foretatt for å frembringe de verdiene som er vist i Figur 11. Klon C7 har en 13 gangers forbedret bindingsaffinitet for villtype-sekvensen GCG. Hovedbidraget til denne affinitetsforbedring er en fem gangers forsinkelse av diassosiasjons-hastigheten til komplekset (Figur 12). Spesifisiteten av C7-proteinet er også 9 ganger forbedret med henyn til HVI-1 -målsekvensen. Dette resultat tyder på at det i komplekset gjøres ytterligere eller forbedrede kontakter. Studier av protein C9 oppviser en annen mekanisme for forbedret spesifisitet. I dette tilfelle er totalaffiniteten av C9 for GCG-setet ekvivalent med Zif268, men spesifisiteten er forbedret tre ganger i forhold til Zif268 for binding til TGT-målsetet ved en økning i off-hastigheten av dette kompleks. Karakterisering av proteinene F8 og F15 viser at det 3 basepar lange gjenkjennings subsetet til finger 1 kan endres fullstendig til TGT og at nye fingre kan selekteres til å binde dette sete.
Karakterisering av proteiner modifisert i finger 2-domenet og selektert for å binde TTG-subsetet, viser at spesifisiteten av denne finger er åpen for modifikasjon. Proteinene G4 og G6 binder et oligonukleotid som har det nye subsete med affiniteter som er likeverdige med Zif268-binding av dens konsensus-mål. Spesifisiteten av disse proteinene for det mål som de ble selektert for å binde seg til, fremgår av en ca. 4 ganger bedre affinitet for dette oligonukleotid i forhold til det native bindingssete som adskiller seg gjennom et enkelt basepar. Dette distinksjonsnivå tilsvarer det som er rapportert for en f inger-1-mutant (Jamieson, et al., supra). Det finger-3-modifiserte protein A14, ble selektert for å binde det native finger-3-subsete og binder dette sete med en affinitet som kun er to ganger lavere enn Zif268. Det skal bemerkes at protein A14 i sin sekvens, adskiller seg radikalt fra
det native protein i gjenkjennings-subsetet. Sekvens-spesifisitet i 10 av de 11 karakteriserte proteinene ble oppnådd gjennom forskjeller i stabiliteten av komplekset. Kun et enkelt protein, G6, oppnådde spesifisitet gjennom en dramatisk endring i on-hastighet. Undersøkelse av on-hastighetsvariasjon med proteinets ladningsvariasjon, viste ingen korrelasjon.
EKSEMPEL 12
KONSTRUKSJON AV DIMER ZINK-FINGER
Zink-finger-proteiner ifølge oppfinnelsen kan manipuleres til å gjenkjenne og
binde seg til utvidede målsekvenser. For eksempel kan zink-finger-proteiner som
i inneholder f ra ca. 2 til 12 zink-fingre, Zif(2) til Zif (12) kondenseres til leucin-gljdelås-domenet i Jun/Fos-proteinene, prototypiske medlemmer av bZIP-proteinfamilien (0'Shea, et al., Science, 254:539,1991). Som et alternativ kan zink-finger-proteiner fusjoneres til andre proteiner som kan danne heterodimerer og inneholde i dimeriseringsdomener. Slike proteiner vil være kjent for fagmannen.
Jun/Fos-leucin-glidelåsene danner fortrinnsvis heterodimerer og muliggjør gjenkjenningen av 12 til 72 basepar. I det følgende refererer Jun/Fos seg til disse proteiners leucin-glidelås-domene. Zink-finger-proteiner fusjoneres til Jun og uavhengig til Fos, ved hjelp av metoder som vanligvis benyttes for å sammenkoble proteiner. Etter rensing blandes Zif-Jun/Zif-Fos-konstruksjonene (henholdsvis Figur 13 og 14) for spontant å danne en Zif-Jun/Zif-Fos-heterodimer. Alternativt resulterer koekspresjon av genene som koder for disse proteiner, i dannelse av Zif-Jun/Zif-Fos-j heterodimerer in vivo. Fusjon med et N-terminalt nukleært lokaliseringssignal muliggjør målretting av ekspresjonen til kjernen (Calderon, et al., Cell, 41:499,1982). Aktiveringsdomener kan også inkorporeres i én av eller alle leucin-glidelås-fusjonskonstruksjoner for å frembringe transkripsjonsaktivatorer (Sadowski, ét al., Gene, 118:137,1992). Disse dimere konstruksjonene muliggjør da spesifikk, aktivering eller undertrykkelse av transkripsjon. Disse heterodimere Zif-konstruksjonene er fordelaktige siden de muliggjør gjenkjenning av palindrom-sekvenser (dersom fingrene både på Jun og Fos gjenkjenner den samme DNA/RNA-sekvens) eller utvidede asymmetriske sekvenser (dersom fingrene på Jun og Fos gjenkjenner forskjellige DNA/RNA-sekvenser). For eksempel gjenkjennes palindromsekvensen
av Zif268-Fos/Zif268-Jun-dimeren (x er et hvilket som helst tall). Avstanden rjnellom subsetene bestemmes av setet for fusjon av Zif med Jun- eller Fos-glidelås-domenet og lengden av linkeren mellom Zif og glidelås-domenene. Subsete-avstandeh
bestemmes etter en metode for bindingssete-seleksjon som er kjent for fagmannen (Tiesen, et al., Nucleic Acids Research, 18:3203,1990). Et eksempel på gjenkjenningen av en utvidet asymmetrisk sekvens er vist med Zif(C7)6-Jun/Zif-268-Fos-dimeren. Dette protein består av 6 fingre av C7-type (Eksempel 11) bundet til Jun, og 3 fingre av Zif268 bundet til Fos og gjenkjenner den utvidede sekvens:
EKSEMPEL 13
KONSTRUKSJON AV MULTI-FINGER-PROTEINER VED Å
GJØRE BRUK AV REPETISJONER AV DEN FØRSTE FINGER AV ZIF268
Etter mutagenese og seleksjon av varianter av Zif268-proteinet hvor finger-1 - spesifisiteten eller affiniteten var modifisert (se Eksempel 7) kan det i henhold til kjente metoder konstrueres proteiner som har flere kopier av fingeren, ved å benytte TGEKP-linker-sekvensen. For eksempel kan C7-fingeren konstrueres i henhold til skjemaet:
hvor sekvensen til den siste linker er gjenstand for forandring siden den befinner seg ved terminalen og ikke er involvert i sammenkoblingen av to fingre. Et eksempel på en 3-finger C7-konstruksjon er vist i Figur 15. Dette protein binder den konstruerte målsekvens GCG-GCG-GCG (SEKV. ID. Nr.:32) i oligonukleotid-hårnålen CCT-CGC-CGC-CGC-GGG-TTT-TCC-CGC-GCC-CCC-GAG-G med en affinitet på 9 nM sammenlignet med en affinitet på 300 nM for et oligonukleotid som koder for GCG-TGG-GCG-sekvensen (bestemt gjennom overflate-plasmon-resonansstudier). Proteiner inneholdende 2 til 12 kopier av C7-fingeren er blitt konstruert og ved ELISA vist å ha spesifisitet for deres forutsagte mål (se for eksempel Eksempel 7). De anvendte fingre behøver ikke være identiske og kan blandes og tilpasses for å produsere proteiner som gjenkjenner en ønsket målsekvens. Disse kan også utnyttes sammen med leucin-glidelåser (f.eks. Fos/Jun) for å produsere proteiner med utvidet sekvens-gjenkjenning.
I tillegg til å produsere f inger-1-polymerer, kan hele 3-finger-Zif268 inklusivt modifiserte versjoner i disse, fusjoneres ved å benytte konsensus-linkeren TGEKP for å frembringe proteiner med utvidede gjenkjenningsseter. For eksempel viser
Figur 16 sekvensen av proteinet Zif268-Zif268, hvor det naturlige protein er fusjonert til seg selv ved å benytte TGEKP-linkeren. Som vist gjennom ELISA binder dette protein nå sekvensen GCG-TGG-GCG-GCG-TGG-GCG. Modifikasjoner i de tre fingrene til Zif268 kan således fusjoneres sammen for å danne et protein som gjenkjenner utvidede sekvenser. Om ønskes, kan disse nye zink-proteinene også benyttes i kombinasjon med leucin-glidelåser, som beskrevet i Eksempel 12.
Selv om oppfinnelsen har blitt beskrevet med referanse til de foreliggende foretrukne utførelsesformer, må det forstås at ulike modifikasjoner kan gjøres uten å fravike fra oppfinnelsens ide. Følgelig er oppfinnelsen begrenset kun av de følgende kravene.

Claims (8)

1. Fremgangsmåte for å oppnå en isolert zinkfinger-nukleotidbindende polypeptidvariant som binder seg til en cellulær nukleotidsekvens og som omfatter: a) identifisering av aminosyrer i zinkfingre av et zinkfinger-nukleotidbindende polypeptid som binder seg til en første cellulær nukleotidsekvens, hvor polypeptidet omfatter minst to zinkfinger-moduler av et kjent zinkfinger-nukleotidbindende polypeptid hvori aminosyresekvensen til hver modul som binder den første nukleotidsekvensen omfatter to cysteinresiduer og to histidinresiduer hvor begge cysteinene er amino-proksimale til begge histidinene; b) etablering av et ekspresjonsbibliotek som koder for polypeptidvarianten, inneholdende randomisert substitusjon av i det minste én av aminosyrene identifisert ovenfor i trinn a); ovenfor i minst en av dets zinkfingre; c) ekspresjon av biblioteket i en passende vertscelle; og d) isolering av en klon som produserer en polypeptidvariant som binder seg til en andre cellulær nukleotidsekvens for derigjennom å oppnå en zinkfinger-nukleotidbindende polypeptidvariant som binder seg til en cellulær nukleotidsekvens.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvor biblioteket uttrykkes i et fag-overflate-ekspresjonssystem.
3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvor fag-ekspresjonssystemet innbefatter et reduserende reagens som muliggjør folding av ekspresjonsproduktene på fag-overflaten.
4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, hvor det reduserende reagens er ditiotreitol.
5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvor biblioteket randomiseres ved PCR under bruk av primere som inneholder degenererte triplettkodoner i sekvensposisjoner som tilsvarer de bestemte aminosyrene.
6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvor den andre cellulære nukleotidsekvens er DNA.
7. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvor den andre cellulære nukleotidsekvens er RNA.
8. Zinkfinger- nukleotidbindende polypeptidvariant fremstilt etter fremgangsmåten i krav 1.
NO19962991A 1994-01-18 1996-07-17 Fremgangsmate for a oppna en isolert zinkfinger-nukleotidbindende polypeptidvariant samt zinkfinger-nukleotid-bindende polypeptidvariant fremstilt etter fremgangsmaten. NO325015B1 (no)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US18311994A 1994-01-18 1994-01-18
US31260494A 1994-09-28 1994-09-28
PCT/US1995/000829 WO1995019431A1 (en) 1994-01-18 1995-01-18 Zinc finger protein derivatives and methods therefor

Publications (3)

Publication Number Publication Date
NO962991D0 NO962991D0 (no) 1996-07-17
NO962991L NO962991L (no) 1996-09-18
NO325015B1 true NO325015B1 (no) 2008-01-14

Family

ID=26878774

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO19962991A NO325015B1 (no) 1994-01-18 1996-07-17 Fremgangsmate for a oppna en isolert zinkfinger-nukleotidbindende polypeptidvariant samt zinkfinger-nukleotid-bindende polypeptidvariant fremstilt etter fremgangsmaten.

Country Status (9)

Country Link
EP (1) EP0770129B1 (no)
JP (1) JP4012243B2 (no)
AT (1) ATE310812T1 (no)
AU (1) AU704601B2 (no)
CA (2) CA2181548C (no)
DE (1) DE69534629D1 (no)
FI (2) FI121014B (no)
NO (1) NO325015B1 (no)
WO (1) WO1995019431A1 (no)

Families Citing this family (278)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
DE69233769D1 (de) 1991-03-01 2009-09-24 Dyax Corp Chimäres Protein mit Mikroprotein mit zwei oder mehr Disulfidbindungen und Ausgestaltungen davon
US6140466A (en) * 1994-01-18 2000-10-31 The Scripps Research Institute Zinc finger protein derivatives and methods therefor
DE69535829D1 (de) 1994-08-20 2008-10-16 Gendaq Ltd Verbesserung in bezug auf bindungsproteine bei der erkennung von dna
US7262055B2 (en) 1998-08-25 2007-08-28 Gendaq Limited Regulated gene expression in plants
GB9824544D0 (en) * 1998-11-09 1999-01-06 Medical Res Council Screening system
US7285416B2 (en) 2000-01-24 2007-10-23 Gendaq Limited Regulated gene expression in plants
US5789538A (en) * 1995-02-03 1998-08-04 Massachusetts Institute Of Technology Zinc finger proteins with high affinity new DNA binding specificities
US6156535A (en) 1995-08-04 2000-12-05 University Of Ottawa Mammalian IAP gene family, primers, probes, and detection methods
US5919912A (en) * 1995-08-04 1999-07-06 University Of Ottawa Mammalian IAP antibodies and diagnostic kits
GB9601108D0 (en) 1996-01-19 1996-03-20 Univ Ottawa Neuronal apoptosis inhibitor protein (NAIP)
US6133437A (en) 1997-02-13 2000-10-17 Apoptogen, Inc. Modulation of IAPs for the treatment of proliferative diseases
ATE398459T1 (de) * 1996-04-26 2008-07-15 Univ Ottawa Verwendung von naip oder iap für die behandlung und vorbeugung von neuronalen erkrankungen
US5925566A (en) * 1996-06-06 1999-07-20 University Of Massachusetts Non-activated receptor complex proteins and uses thereof
GB9710809D0 (en) 1997-05-23 1997-07-23 Medical Res Council Nucleic acid binding proteins
AU2002300619B2 (en) * 1997-05-27 2007-04-26 The Scripps Research Institute Zinc finger protein derivatives and methods therefor
AU2007201586B2 (en) * 1997-05-27 2010-12-23 The Scripps Research Institute Zinc finger protein derivatives and methods therefor
WO1999021991A1 (en) * 1997-10-29 1999-05-06 Shanghai Second Medical University Bmzf12: a zinc finger gene cloned from bone marrow
US6410248B1 (en) 1998-01-30 2002-06-25 Massachusetts Institute Of Technology General strategy for selecting high-affinity zinc finger proteins for diverse DNA target sites
EP1060261B1 (en) 1998-03-02 2010-05-05 Massachusetts Institute of Technology Poly zinc finger proteins with improved linkers
CA2323064C (en) 1998-03-17 2011-05-31 Gendaq Limited Nucleic acid binding proteins
US6140081A (en) * 1998-10-16 2000-10-31 The Scripps Research Institute Zinc finger binding domains for GNN
US6599692B1 (en) 1999-09-14 2003-07-29 Sangamo Bioscience, Inc. Functional genomics using zinc finger proteins
US7013219B2 (en) 1999-01-12 2006-03-14 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US6534261B1 (en) 1999-01-12 2003-03-18 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US6453242B1 (en) 1999-01-12 2002-09-17 Sangamo Biosciences, Inc. Selection of sites for targeting by zinc finger proteins and methods of designing zinc finger proteins to bind to preselected sites
US7070934B2 (en) 1999-01-12 2006-07-04 Sangamo Biosciences, Inc. Ligand-controlled regulation of endogenous gene expression
US6794136B1 (en) 2000-11-20 2004-09-21 Sangamo Biosciences, Inc. Iterative optimization in the design of binding proteins
US20030104526A1 (en) 1999-03-24 2003-06-05 Qiang Liu Position dependent recognition of GNN nucleotide triplets by zinc fingers
US7030215B2 (en) 1999-03-24 2006-04-18 Sangamo Biosciences, Inc. Position dependent recognition of GNN nucleotide triplets by zinc fingers
US7329728B1 (en) 1999-10-25 2008-02-12 The Scripps Research Institute Ligand activated transcriptional regulator proteins
WO2001040798A2 (en) 1999-12-06 2001-06-07 Sangamo Biosciences, Inc. Methods of using randomized libraries of zinc finger proteins for the identification of gene function
US7151201B2 (en) 2000-01-21 2006-12-19 The Scripps Research Institute Methods and compositions to modulate expression in plants
EP1250424B1 (en) * 2000-01-24 2007-02-28 Gendaq, Ltd. Nucleic acid binding polypeptides characterized by flexible linkers connected nucleic acid binding modules
WO2001053478A2 (en) * 2000-01-24 2001-07-26 Gendaq Limited Methods for regulating transcription in plants by introduction of engireed zinc finger polypeptides
AU5077401A (en) 2000-02-08 2001-08-20 Sangamo Biosciences Inc Cells for drug discovery
US6511808B2 (en) 2000-04-28 2003-01-28 Sangamo Biosciences, Inc. Methods for designing exogenous regulatory molecules
CA2407745C (en) 2000-04-28 2011-11-22 Sangamo Biosciences, Inc. Databases of regulatory sequences; methods of making and using same
US7923542B2 (en) 2000-04-28 2011-04-12 Sangamo Biosciences, Inc. Libraries of regulatory sequences, methods of making and using same
WO2001084148A2 (en) 2000-04-28 2001-11-08 Sangamo Biosciences, Inc. Pharmacogenomics and identification of drug targets by reconstruction of signal transduction pathways based on sequences of accessible regions
WO2001085780A2 (en) * 2000-05-08 2001-11-15 Gendaq Limited Nucleic acid binding polypeptides
US7011972B2 (en) 2000-07-18 2006-03-14 The Scripps Research Institute Fusion polypeptide comprising two ligand binding domains
AU2001278496A1 (en) * 2000-07-21 2002-02-05 Syngenta Participations Ag Zinc finger domain recognition code and uses thereof
US20030082561A1 (en) * 2000-07-21 2003-05-01 Takashi Sera Zinc finger domain recognition code and uses thereof
US6673917B1 (en) 2000-09-28 2004-01-06 University Of Ottawa Antisense IAP nucleic acids and uses thereof
AU2884102A (en) 2000-12-07 2002-06-18 Sangamo Biosciences Inc Regulation of angiogenesis with zinc finger proteins
US7067317B2 (en) 2000-12-07 2006-06-27 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of angiogenesis with zinc finger proteins
AU2002243645A1 (en) 2001-01-22 2002-07-30 Sangamo Biosciences, Inc. Zinc finger proteins for dna binding and gene regulation in plants
US7067617B2 (en) 2001-02-21 2006-06-27 The Scripps Research Institute Zinc finger binding domains for nucleotide sequence ANN
EP1364027B1 (en) * 2001-02-21 2009-09-02 Novartis AG Zinc finger binding domains for nucleotide sequence ann
WO2003027247A2 (en) 2001-09-24 2003-04-03 Sangamo Biosciences, Inc. Modulation of stem cells using zinc finger proteins
US7262054B2 (en) 2002-01-22 2007-08-28 Sangamo Biosciences, Inc. Zinc finger proteins for DNA binding and gene regulation in plants
DE60327618D1 (de) 2002-03-27 2009-06-25 Aegera Therapeutics Inc Gegen iap gerichtete antisense-nukleobasen und deren verwendungen
AU2003246349B2 (en) 2002-08-07 2011-02-03 Basf Plant Science Gmbh Nucleic acid sequences encoding proteins associated with abiotic stress response
US7361635B2 (en) 2002-08-29 2008-04-22 Sangamo Biosciences, Inc. Simultaneous modulation of multiple genes
CN101018864A (zh) 2002-12-26 2007-08-15 先正达合作有限公司 细胞增殖相关多肽及其应用
EP2194135A3 (en) 2003-04-15 2010-10-06 BASF Plant Science GmbH Nucleic acid sequences from yeast encoding proteins associated with abiotic stress response and transformed plant cells and plants with increased tolerance to environmental stress
US7888121B2 (en) 2003-08-08 2011-02-15 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
JP4555292B2 (ja) 2003-08-08 2010-09-29 サンガモ バイオサイエンシズ インコーポレイテッド 標的化された切断及び組換えの方法及び組成物
US20120196370A1 (en) 2010-12-03 2012-08-02 Fyodor Urnov Methods and compositions for targeted genomic deletion
WO2005028630A2 (en) 2003-09-19 2005-03-31 Sangamo Biosciences, Inc. Engineered zinc finger proteins for regulation of gene expression
US8012944B2 (en) 2003-10-30 2011-09-06 Pharmascience Inc. Method for treating cancer using IAP antisense oligomer and chemotherapeutic agent
WO2005100393A1 (en) 2004-04-08 2005-10-27 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for modulating cardiac contractility
US20060063231A1 (en) 2004-09-16 2006-03-23 Sangamo Biosciences, Inc. Compositions and methods for protein production
CA2579800A1 (en) 2004-09-24 2006-03-30 Basf Plant Science Gmbh Nucleic acid sequences encoding proteins associated with abiotic stress response and plant cells and plants with increased tolerance to environmental stress
EP1645633B1 (en) 2004-10-05 2011-09-21 SunGene GmbH Constitutive expression cassettes for regulation of plant expression
EP1655364A3 (en) 2004-11-05 2006-08-02 BASF Plant Science GmbH Expression cassettes for seed-preferential expression in plants
EP1662000B1 (en) 2004-11-25 2011-03-30 SunGene GmbH Expression cassettes for guard cell-preferential expression in plants
EP1666599A3 (en) 2004-12-04 2006-07-12 SunGene GmbH Expression cassettes for mesophyll- and/or epidermis-preferential expression in plants
EP2163634A1 (en) 2004-12-08 2010-03-17 SunGene GmbH Expression cassettes for vascular tissue-preferential expression in plants
EP1669456A3 (en) 2004-12-11 2006-07-12 SunGene GmbH Expression cassettes for meristem-preferential expression in plants
US7554018B2 (en) 2005-01-14 2009-06-30 University Of Guelph Nitrogen-regulated sugar sensing gene and protein and modulation thereof
EP2147977A1 (en) 2005-02-09 2010-01-27 BASF Plant Science GmbH Expression cassettes for regulation of expression in monocotyledonous plants
US20090031440A1 (en) 2005-02-26 2009-01-29 Basf Plant Science Gmbh Expression Cassettes for Seed-Preferential Expression in Plants
EP1869075B1 (en) 2005-02-28 2012-04-11 Sangamo BioSciences, Inc. Anti-angiogenic methods and compositions
BRPI0614070A2 (pt) 2005-05-10 2018-07-31 Basf Plant Science Gmbh cassetes de expressão, sequência de nucleotídeos isolada, seqüência sintética reguladora de transcrição, métodos para proporcionar uma seqüência sintética de nucleotídeos reguladora de transcrição, e um cassete de expressão, vetor, organismo não-humano ou célula hospedeira transgênico(a), e, célula de planta ou planta transgênica
EP1913149A4 (en) 2005-07-26 2009-08-05 Sangamo Biosciences Inc TARGETED INTEGRATION AND EXPRESSION OF EXOGENOUS NUCLEIC ACID SEQUENCES
WO2007020198A2 (en) 2005-08-12 2007-02-22 Basf Plant Science Gmbh Nucleic acid sequences encoding proteins associated with abiotic stress response and plant cells and plants with increased tolerance to environmental stress
US8222028B2 (en) 2005-09-08 2012-07-17 Chromatin, Inc. Plants modified with mini-chromosomes
WO2007062422A2 (en) 2005-11-28 2007-05-31 The Scripps Research Institute Zinc finger binding domains for tnn
US20090172834A1 (en) 2006-03-24 2009-07-02 Basf Plant Science Gmbh Proteins Associated With Abiotic Stress Response And Homologs
ES2465996T3 (es) 2006-05-25 2014-06-09 Sangamo Biosciences, Inc. Métodos y composiciones para la inactivación genética
EP2213731B1 (en) 2006-05-25 2013-12-04 Sangamo BioSciences, Inc. Variant foki cleavage half-domains
UA106193C2 (ru) 2006-08-11 2014-08-11 ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЕлЕлСи Гомологичная рекомбинация, опосредованная нуклеазами с цинковыми пальцами
EP2121936A2 (en) 2006-10-13 2009-11-25 BASF Plant Science GmbH Plants with increased yield
US9217026B2 (en) 2006-11-13 2015-12-22 Sangamo Biosciences, Inc. Method of inactivating a glucocorticoid receptor gene in an isolated cell
BRPI0720048A8 (pt) 2006-12-14 2023-02-07 Dow Agrosciences Llc Proteínas de dedo de zinco não-canônicas otimizadas
CN101631868B (zh) 2007-02-16 2016-02-10 巴斯福植物科学有限公司 用于在单子叶植物中调节胚特异性表达的核酸序列
CA2584934A1 (en) 2007-04-17 2008-10-17 University Of Guelph Nitrogen-regulated sugar sensing gene and protein and modulation thereof
EP2137310B1 (en) 2007-04-26 2010-11-24 Sangamo BioSciences, Inc. Targeted integration into the ppp1r12c locus
AR067318A1 (es) 2007-05-22 2009-10-07 Basf Plant Science Gmbh Plantas con mayor tolerancia y/o resistencia aumentada al estres ambiental y mayor produccion de biomasa
EP2390335A3 (en) 2007-05-23 2012-03-21 Syngenta Participations AG Polynucleotide markers
EP2527435B2 (en) 2007-07-12 2021-10-13 Sangamo BioSciences, Inc. Methods and compositions for inactivating alpha 1,6 fucosyltransferase (FUT 8) gene expression
DE112008002435T5 (de) 2007-09-18 2010-07-22 Basf Plant Science Gmbh Pflanzen mit erhöhtem Ertrag
CN101939435A (zh) 2007-09-21 2011-01-05 巴斯夫植物科学有限公司 具有增加的产量的植物
US11235026B2 (en) 2007-09-27 2022-02-01 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for modulating PD1
WO2009042163A2 (en) 2007-09-27 2009-04-02 Sangamo Biosciences, Inc. Rapid in vivo identification of biologically active nucleases
US8563314B2 (en) 2007-09-27 2013-10-22 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for modulating PD1
BRPI0817560B1 (pt) 2007-09-27 2022-09-20 Dow Agrosciences Llc Proteínas de dedo de zinco (zfp) engenheiradas que têm como alvo genes de 5-enolpiruvil shiquimato-3-fosfato sintase, nuclease de dedo de zinco (zfn), vetor, bem como métodos para introdução de um transgene no genoma de uma célula de planta, para expressar o produto de um transgene em uma célula de planta, para deleção de uma sequência de gene de epsps a partir de um locus de gene epsps no genoma de uma célula de planta, e para modular expressão de um gene de epsps
JP2011500082A (ja) 2007-10-25 2011-01-06 サンガモ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド 標的組込みのための方法および組成物
ES2647767T3 (es) 2007-12-03 2017-12-26 Syngenta Participations Ag Generación por ingeniería genética de proteínas enzimáticamente susceptibles
DE112008003318T5 (de) 2007-12-19 2011-04-21 Basf Plant Science Gmbh Pflanzen mit erhöhtem Ertrag und erhöhter Toleranz gegenüber Umweltstress (IY-B)
EP2247735A2 (en) 2008-02-27 2010-11-10 BASF Plant Science GmbH Plants with increased yield
EP2281050B1 (en) 2008-04-14 2014-04-02 Sangamo BioSciences, Inc. Linear donor constructs for targeted integration
WO2009154686A1 (en) 2008-05-28 2009-12-23 Sangamo Biosciences, Inc. Compositions for linking dna-binding domains and cleavage domains
KR101802393B1 (ko) 2008-06-10 2017-11-28 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드 Ｂａｘ- 및 ｂａｋ-결함 세포주들의 제조 방법 및 조성물
CA2734347A1 (en) 2008-08-19 2010-02-25 Basf Plant Science Gmbh Plants with increased yield by increasing or generating one or more activities in a plant or a part thereof
CN102159722B (zh) 2008-08-22 2014-09-03 桑格摩生物科学股份有限公司 用于靶向单链切割和靶向整合的方法和组合物
BRPI0919153A2 (pt) 2008-09-23 2019-05-07 Basf Plant Science Gmbh método para produzir uma planta com rendimento aumentado, molécula de ácido nucleico, construto de ácido nucleico, vetor, processo para produzir um polipeptídeo, poliptídeo, anticorpo, núcleo de célula de planta, célula de planta, tecido de planta, material de propagação, pólen, progênie, material coletado, ou uma planta, ou uma parte da planta, planta transgênica, processo para identificar um composto, método para a produção de uma composição agrícola, composição, uso de ácido nucleico, e, método para a identificação de uma planta com um rendimento aumentado, e para aumentar o rendimento de uma população de plantas
EP2350289A1 (en) 2008-10-23 2011-08-03 BASF Plant Science GmbH Plants with increased yield (nue)
AU2009306369A1 (en) 2008-10-23 2010-04-29 Basf Plant Science Gmbh A method for producing a transgenic cell with increased gamma-aminobutyric acid (GABA) content
EP2344660B1 (en) 2008-10-29 2018-01-17 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for inactivating glutamine synthetase gene expression
WO2010065123A1 (en) 2008-12-04 2010-06-10 Sangamo Biosciences, Inc. Genome editing in rats using zinc-finger nucleases
EP2370575B1 (en) 2008-12-17 2017-11-01 Dow AgroSciences LLC Targeted integration into the zp15 locus
CA2934285C (en) 2009-02-04 2018-11-27 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for treating neuropathies
CA2755192C (en) 2009-03-20 2018-09-11 Sangamo Biosciences, Inc. Modification of cxcr4 using engineered zinc finger proteins
WO2010117464A1 (en) 2009-04-09 2010-10-14 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted integration into stem cells
US8772008B2 (en) 2009-05-18 2014-07-08 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for increasing nuclease activity
WO2011002503A1 (en) 2009-06-30 2011-01-06 Sangamo Biosciences, Inc. Rapid screening of biologically active nucleases and isolation of nuclease-modified cells
EP2456873A1 (en) 2009-07-23 2012-05-30 BASF Plant Science Company GmbH Plants with increased yield
US9234016B2 (en) 2009-07-28 2016-01-12 Sangamo Biosciences, Inc. Engineered zinc finger proteins for treating trinucleotide repeat disorders
NZ619886A (en) 2009-08-11 2015-03-27 Sangamo Biosciences Inc Organisms homozygous for targeted modification
US8592645B2 (en) 2009-10-22 2013-11-26 Dow Agrosciences Llc Engineered zinc finger proteins targeting plant genes involved in fatty acid biosynthesis
US8956828B2 (en) 2009-11-10 2015-02-17 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted disruption of T cell receptor genes using engineered zinc finger protein nucleases
WO2011061656A1 (en) 2009-11-17 2011-05-26 Basf Plant Science Company Gmbh Plants with increased yield
CA2787494C (en) 2010-01-22 2019-09-17 Dow Agrosciences Llc Targeted genomic alteration
PT2534173T (pt) 2010-02-08 2019-10-31 Sangamo Therapeutics Inc Semidomínios de clivagem manipulados
WO2011100058A1 (en) 2010-02-09 2011-08-18 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted genomic modification with partially single-stranded donor molecules
CA2796600C (en) 2010-04-26 2019-08-13 Sangamo Biosciences, Inc. Genome editing of a rosa locus using zinc-finger nucleases
LT2566972T (lt) 2010-05-03 2020-03-10 Sangamo Therapeutics, Inc. Kompozicijos, skirtos cinko pirštu modulių susiejimui
JP6208580B2 (ja) 2010-05-17 2017-10-04 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド 新規のｄｎａ結合タンパク質及びその使用
KR20170120211A (ko) 2010-06-16 2017-10-30 닛토덴코 가부시키가이샤 방수 통기 필터 및 그의 용도
EP2596011B1 (en) 2010-07-21 2018-10-03 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for modification of a hla locus
EP2622090B1 (en) 2010-09-27 2019-06-19 Sangamo Therapeutics, Inc. Compositions for inhibiting viral entry into cells
KR101930711B1 (ko) 2010-10-12 2018-12-19 더 칠드런스 호스피탈 오브 필라델피아 혈우병 ｂ의 치료를 위한 방법 및 조성물
WO2012094132A1 (en) 2011-01-05 2012-07-12 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for gene correction
CN103429740B (zh) 2011-03-18 2016-06-15 巴斯夫植物科学有限公司 用于调节在植物中的表达的启动子
AU2012286901B2 (en) 2011-07-25 2016-10-27 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for alteration of a cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene
SG11201400707TA (en) 2011-09-21 2014-04-28 Sangamo Biosciences Inc Methods and compositions for regulation of transgene expression
WO2013059507A1 (en) 2011-10-20 2013-04-25 University Of Iowa Research Foundation N-demethyase genes and uses thereof
WO2013063315A2 (en) 2011-10-27 2013-05-02 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for modification of the hprt locus
AU2012340213B2 (en) 2011-11-16 2017-12-07 Sangamo Therapeutics, Inc. Modified DNA-binding proteins and uses thereof
WO2013130824A1 (en) 2012-02-29 2013-09-06 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for treating huntington's disease
BR112014027227B1 (pt) 2012-05-02 2022-04-19 Sangamo Biosciences, Inc. Métodos para produzir uma planta que apresenta expressão reduzida do gene endógeno de malato desidrogenase (mdh), e para aumentar o rendimento da cultura
AU2013259647B2 (en) 2012-05-07 2018-11-08 Corteva Agriscience Llc Methods and compositions for nuclease-mediated targeted integration of transgenes
US20150184166A1 (en) 2012-06-15 2015-07-02 Uinversity of Iowa Research Foundation Caffeine responsive promoters and regulatory genes
ES2697912T3 (es) 2012-07-11 2019-01-29 Sangamo Therapeutics Inc Métodos y composiciones para el tratamiento de enfermedades monogénicas
WO2014011901A2 (en) 2012-07-11 2014-01-16 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for delivery of biologics
US10648001B2 (en) 2012-07-11 2020-05-12 Sangamo Therapeutics, Inc. Method of treating mucopolysaccharidosis type I or II
KR20220164090A (ko) 2012-08-29 2022-12-12 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드 유전적 병태를 치료하기 위한 방법 및 조성물
UA118090C2 (uk) 2012-09-07 2018-11-26 ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі Спосіб інтегрування послідовності нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес, у ген fad2 у клітині сої та специфічний для локусу fad2 білок, що зв'язується, здатний індукувати спрямований розрив
RU2665811C2 (ru) 2012-09-07 2018-09-04 ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи Локусы fad3 для выполнения операций и соответствующие связывающиеся со специфическими сайтами-мишенями белки, способные к вызову направленных разрывов
UA119135C2 (uk) 2012-09-07 2019-05-10 ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі Спосіб отримання трансгенної рослини
US9597357B2 (en) 2012-10-10 2017-03-21 Sangamo Biosciences, Inc. T cell modifying compounds and uses thereof
US9255250B2 (en) 2012-12-05 2016-02-09 Sangamo Bioscience, Inc. Isolated mouse or human cell having an exogenous transgene in an endogenous albumin gene
US20140173783A1 (en) 2012-12-13 2014-06-19 Dow Agrosciences Llc Precision gene targeting to a particular locus in maize
WO2014130955A1 (en) 2013-02-25 2014-08-28 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for enhancing nuclease-mediated gene disruption
CN105208866B (zh) 2013-03-21 2018-11-23 桑格摩生物治疗股份有限公司 使用工程化锌指蛋白核酸酶靶向断裂t细胞受体基因
AU2014248208C1 (en) 2013-04-05 2023-04-27 Corteva Agriscience Llc Methods and compositions for integration of an exogenous sequence within the genome of plants
EP2997146A4 (en) 2013-05-15 2017-04-26 Sangamo BioSciences, Inc. Methods and compositions for treatment of a genetic condition
EP3039136B8 (en) 2013-08-28 2020-12-16 Sangamo Therapeutics, Inc. Compositions for linking dna-binding domains and cleavage domains
US9957526B2 (en) 2013-10-17 2018-05-01 Sangamo Therapeutics, Inc. Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering
US10117899B2 (en) 2013-10-17 2018-11-06 Sangamo Therapeutics, Inc. Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering in hematopoietic stem cells
AP2016009227A0 (en) 2013-11-04 2016-05-31 Dow Agrosciences Llc Optimal maize loci
US9909131B2 (en) 2013-11-04 2018-03-06 Dow Agrosciences Llc Optimal soybean loci
CN107223156A (zh) 2013-11-04 2017-09-29 美国陶氏益农公司 最优玉米座位
CA2926822C (en) 2013-11-04 2022-12-13 Dow Agrosciences Llc Optimal soybean loci
WO2015070212A1 (en) 2013-11-11 2015-05-14 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for treating huntington's disease
HRP20211706T1 (hr) 2013-11-13 2022-02-04 The Children's Medical Center Corporation Nukleazom posredovana regulacija ekspresije gena
US9771403B2 (en) 2013-12-09 2017-09-26 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for treating hemophilia
JP6606088B2 (ja) 2014-02-24 2019-11-13 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド ヌクレアーゼ媒介性標的化組み込みのための方法および組成物
CN106459894B (zh) 2014-03-18 2020-02-18 桑格摩生物科学股份有限公司 用于调控锌指蛋白表达的方法和组合物
WO2015164748A1 (en) 2014-04-24 2015-10-29 Sangamo Biosciences, Inc. Engineered transcription activator like effector (tale) proteins
RU2691102C2 (ru) 2014-05-08 2019-06-11 Сангамо Байосайенсиз, Инк. Способы и композиции для лечения болезни хантингтона
WO2015175642A2 (en) 2014-05-13 2015-11-19 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for prevention or treatment of a disease
EP3152319A4 (en) 2014-06-05 2017-12-27 Sangamo BioSciences, Inc. Methods and compositions for nuclease design
US20170159065A1 (en) 2014-07-08 2017-06-08 Vib Vzw Means and methods to increase plant yield
FI3169778T3 (fi) 2014-07-14 2023-12-13 Univ Washington State Ituradan soluja ablatoiva nanos-geeninpoisto
WO2016011381A1 (en) 2014-07-18 2016-01-21 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Reducing cxcr4 expression and/or function to enhance engraftment of hematopoietic stem cells
WO2016014837A1 (en) 2014-07-25 2016-01-28 Sangamo Biosciences, Inc. Gene editing for hiv gene therapy
US9816074B2 (en) 2014-07-25 2017-11-14 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for modulating nuclease-mediated genome engineering in hematopoietic stem cells
WO2016019144A2 (en) 2014-07-30 2016-02-04 Sangamo Biosciences, Inc. Gene correction of scid-related genes in hematopoietic stem and progenitor cells
RS62334B1 (sr) 2014-09-16 2021-10-29 Sangamo Therapeutics Inc Postupci i sastavi za inženjering genoma posredovan nukleazom i korekciju kod matičnih ćelija hematopoeze
US10889834B2 (en) 2014-12-15 2021-01-12 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for enhancing targeted transgene integration
EP3247366A4 (en) 2015-01-21 2018-10-31 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for identification of highly specific nucleases
US11248234B2 (en) 2015-02-11 2022-02-15 Basf Se Herbicide-resistant hydroxyphenylpyruvate dioxygenases
EP4335918A3 (en) 2015-04-03 2024-04-17 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Composition and methods of genome editing of b-cells
US10179918B2 (en) 2015-05-07 2019-01-15 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for increasing transgene activity
CA2984013A1 (en) 2015-05-12 2016-11-17 Sangamo Therapeutics, Inc. Nuclease-mediated regulation of gene expression
US9957501B2 (en) 2015-06-18 2018-05-01 Sangamo Therapeutics, Inc. Nuclease-mediated regulation of gene expression
WO2017011519A1 (en) 2015-07-13 2017-01-19 Sangamo Biosciences, Inc. Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering
EP3331355B1 (en) 2015-08-06 2024-04-03 The Curators of the University of Missouri Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (prrsv)-resistant porcine and cells having modified cd163 genes
KR20180054672A (ko) 2015-09-23 2018-05-24 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드 Htt 리프레서 및 이의 용도
AU2016361350B2 (en) 2015-11-23 2023-04-06 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for engineering immunity
AU2016369490C1 (en) 2015-12-18 2021-12-23 Sangamo Therapeutics, Inc. Targeted disruption of the T cell receptor
JP2018537112A (ja) 2015-12-18 2018-12-20 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド Ｍｈｃ細胞受容体の標的化破壊
US20170202931A1 (en) 2016-01-15 2017-07-20 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for the treatment of neurologic disease
JP7012650B2 (ja) 2016-02-02 2022-01-28 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド Ｄｎａ結合ドメインと切断ドメインとを連結するための組成物
AU2017238512B2 (en) 2016-03-23 2022-12-08 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods for enhancing the efficiency of gene editing
CN109863143B (zh) 2016-07-13 2021-10-15 威泰克斯制药公司 提高基因组编辑效率的方法、组合物和试剂盒
US11344511B2 (en) 2016-07-27 2022-05-31 Case Western Reserve University Compounds and methods of promoting myelination
JP7066126B2 (ja) 2016-08-09 2022-05-13 ブイアイビー ブイゼットダブリュ セルロースシンターゼ阻害剤および突然変異体植物
BR112019003327A2 (pt) 2016-08-24 2019-07-02 Sangamo Therapeutics Inc nucleases manipuladas de alvo específico
EP3995574A1 (en) 2016-08-24 2022-05-11 Sangamo Therapeutics, Inc. Regulation of gene expression using engineered nucleases
CA3035534A1 (en) 2016-09-07 2018-03-15 Sangamo Therapeutics, Inc. Modulation of liver genes
KR20190062505A (ko) 2016-10-03 2019-06-05 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 Hpv-특이적 결합 분자
ES2811500T3 (es) 2016-10-04 2021-03-12 Prec Biosciences Inc Dominios coestimuladores para su uso en células genéticamente modificadas
CA3039673A1 (en) 2016-10-20 2018-04-26 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for the treatment of fabry disease
AU2017347928A1 (en) 2016-10-31 2019-05-09 Sangamo Therapeutics, Inc. Gene correction of scid-related genes in hematopoietic stem and progenitor cells
MX2019006426A (es) 2016-12-01 2019-08-14 Sangamo Therapeutics Inc Reguladores de tau, y composiciones y metodos para su administracion.
EP3551754B1 (en) 2016-12-08 2023-08-30 Case Western Reserve University Methods and compositions for enhancing functional myelin production
BR112019021993A2 (pt) 2017-04-20 2020-05-12 Oregon Health & Science University Correção de gene humano
CN110869497A (zh) 2017-05-03 2020-03-06 桑格摩生物治疗股份有限公司 修饰囊性纤维化跨膜传导调节蛋白（cftr）基因的方法和组合物
CA3062698A1 (en) 2017-05-08 2018-11-15 Precision Biosciences, Inc. Nucleic acid molecules encoding an engineered antigen receptor and an inhibitory nucleic acid molecule and methods of use thereof
US11512287B2 (en) 2017-06-16 2022-11-29 Sangamo Therapeutics, Inc. Targeted disruption of T cell and/or HLA receptors
EP3645038A1 (en) 2017-06-30 2020-05-06 Precision Biosciences, Inc. Genetically-modified t cells comprising a modified intron in the t cell receptor alpha gene
KR20200104284A (ko) 2017-10-03 2020-09-03 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 Hpv-특이적 결합 분자
US20200239544A1 (en) 2017-10-03 2020-07-30 Precision Biosciences, Inc. Modified epidermal growth factor receptor peptides for use in genetically-modified cells
WO2019089913A1 (en) 2017-11-01 2019-05-09 Precision Biosciences, Inc. Engineered nucleases that target human and canine factor viii genes as a treatment for hemophilia a
US11661611B2 (en) 2017-11-09 2023-05-30 Sangamo Therapeutics, Inc. Genetic modification of cytokine inducible SH2-containing protein (CISH) gene
WO2019143678A1 (en) 2018-01-17 2019-07-25 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Dna-pk inhibitors
US20200361877A1 (en) 2018-01-17 2020-11-19 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Quinoxalinone compounds, compositions, methods, and kits for increasing genome editing efficiency
CA3088788A1 (en) 2018-01-17 2019-07-25 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Dna-pk inhibitors
CA3089587A1 (en) 2018-02-08 2019-08-15 Sangamo Therapeutics, Inc. Engineered target specific nucleases
JP2021520211A (ja) 2018-04-05 2021-08-19 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド 組換え受容体を発現するｔ細胞、関連ポリヌクレオチド、および方法
MX2020010459A (es) 2018-04-05 2021-01-20 Juno Therapeutics Inc Metodos para producir celulas que expresan un receptor recombinante y composiciones relacionadas.
CA3095027A1 (en) 2018-04-05 2019-10-10 Juno Therapeutics, Inc. T cell receptors and engineered cells expressing same
US11421007B2 (en) 2018-04-18 2022-08-23 Sangamo Therapeutics, Inc. Zinc finger protein compositions for modulation of huntingtin (Htt)
US11690921B2 (en) 2018-05-18 2023-07-04 Sangamo Therapeutics, Inc. Delivery of target specific nucleases
WO2020041249A1 (en) 2018-08-23 2020-02-27 Sangamo Therapeutics, Inc. Engineered target specific base editors
EP3853244A4 (en) 2018-09-18 2022-09-14 Sangamo Therapeutics, Inc. PROGRAMMED CELL DEATH 1 (PD1) SPECIFIC NUCLEASES
WO2020132659A1 (en) 2018-12-21 2020-06-25 Precision Biosciences, Inc. Genetic modification of the hydroxyacid oxidase 1 gene for treatment of primary hyperoxaluria
SG11202106987WA (en) 2019-01-11 2021-07-29 Acuitas Therapeutics Inc Lipids for lipid nanoparticle delivery of active agents
US11857641B2 (en) 2019-02-06 2024-01-02 Sangamo Therapeutics, Inc. Method for the treatment of mucopolysaccharidosis type I
MA55531A (fr) 2019-04-02 2022-02-09 Sangamo Therapeutics Inc Procédés pour le traitement de béta-thalassémie
EP3947682B1 (en) 2019-04-03 2023-10-11 Precision Biosciences, Inc. Genetically-modified immune cells comprising a microrna-adapted shrna (shrnamir)
CA3136265A1 (en) 2019-04-05 2020-10-08 Precision Biosciences, Inc. Methods of preparing populations of genetically-modified immune cells
KR20220003561A (ko) 2019-04-23 2022-01-10 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드 염색체 9 오픈 리딩 프레임 72 유전자 발현의 조정제 및 그의 용도
BR112021021075A2 (pt) 2019-05-01 2021-12-14 Editas Medicine Inc Células que expressam um receptor recombinante de um locus de tgfbr2 modificado, polinucleotídeos relacionados e métodos
WO2020223571A1 (en) 2019-05-01 2020-11-05 Juno Therapeutics, Inc. Cells expressing a chimeric receptor from a modified cd247 locus, related polynucleotides and methods
WO2021016608A1 (en) 2019-07-25 2021-01-28 Precision Biosciences, Inc. Compositions and methods for sequential stacking of nucleic acid sequences into a genomic locus
JP2022544825A (ja) 2019-08-20 2022-10-21 プレシジョン バイオサイエンシズ，インク． 細胞免疫療法のためのリンパ球枯渇投与レジメン
WO2021035170A1 (en) 2019-08-21 2021-02-25 Precision Biosciences, Inc. Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins
CN114728037A (zh) 2019-10-02 2022-07-08 桑格摩生物治疗股份有限公司 用于朊病毒病治疗的锌指蛋白转录因子
CN114466867A (zh) 2019-10-02 2022-05-10 桑格摩生物治疗股份有限公司 用于抑制α-突触核蛋白表达的锌指蛋白转录因子
US20220411479A1 (en) 2019-10-30 2022-12-29 Precision Biosciences, Inc. Cd20 chimeric antigen receptors and methods of use for immunotherapy
TW202132565A (zh) 2019-11-01 2021-09-01 美商聖加莫治療股份有限公司 Ｇｉｎ重組酶變異體
EP4069285A1 (en) 2019-12-06 2022-10-12 Precision BioSciences, Inc. Methods for cancer immunotherapy, using lymphodepletion regimens and cd19, cd20 or bcma allogeneic car t cells
MX2022008953A (es) 2020-01-22 2022-08-15 Sangamo Therapeutics Inc Factores de transcripcion de proteina de dedos de zinc para reprimir la expresion de tau.
WO2021158915A1 (en) 2020-02-06 2021-08-12 Precision Biosciences, Inc. Recombinant adeno-associated virus compositions and methods for producing and using the same
WO2021202513A1 (en) 2020-03-31 2021-10-07 Elo Life Systems Modulation of endogenous mogroside pathway genes in watermelon and other cucurbits
CN115715203A (zh) 2020-05-06 2023-02-24 塞勒克提斯公司 对细胞进行基因修饰以递送治疗性蛋白质的方法
AU2021268253A1 (en) 2020-05-06 2022-12-08 Cellectis S.A. Methods for targeted insertion of exogenous sequences in cellular genomes
WO2021231259A1 (en) 2020-05-11 2021-11-18 Precision Biosciences, Inc. Self-limiting viral vectors encoding nucleases
WO2021231661A2 (en) 2020-05-13 2021-11-18 Juno Therapeutics, Inc. Process for producing donor-batched cells expressing a recombinant receptor
CN116234558A (zh) 2020-06-26 2023-06-06 朱诺治疗学有限公司 条件性地表达重组受体的工程化t细胞、相关多核苷酸和方法
US11976019B2 (en) 2020-07-16 2024-05-07 Acuitas Therapeutics, Inc. Cationic lipids for use in lipid nanoparticles
WO2022035793A1 (en) 2020-08-10 2022-02-17 Precision Biosciences, Inc. Antibodies and fragments specific for b-cell maturation antigen and uses thereof
WO2022046760A2 (en) 2020-08-25 2022-03-03 Kite Pharma, Inc. T cells with improved functionality
WO2022067122A1 (en) 2020-09-25 2022-03-31 Sangamo Therapeutics, Inc. Zinc finger fusion proteins for nucleobase editing
JP2023545972A (ja) 2020-10-02 2023-11-01 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド アルファ－シヌクレイン発現を抑制するための新規ジンクフィンガータンパク質転写因子
WO2022076547A1 (en) 2020-10-07 2022-04-14 Precision Biosciences, Inc. Lipid nanoparticle compositions
CR20230175A (es) 2020-10-23 2023-07-26 Elo Life Systems Inc Métodos para producir plantas de vainilla con mejor sabor y producción agronómica
EP4240756A1 (en) 2020-11-04 2023-09-13 Juno Therapeutics, Inc. Cells expressing a chimeric receptor from a modified invariant cd3 immunoglobulin superfamily chain locus and related polynucleotides and methods
CA3200855A1 (en) 2020-11-16 2022-05-19 Pig Improvement Company Uk Limited Influenza a-resistant animals having edited anp32 genes
WO2022165111A1 (en) 2021-01-28 2022-08-04 Precision Biosciences, Inc. Modulation of tgf beta signaling in genetically-modified eukaryotic cells
US20240141311A1 (en) 2021-04-22 2024-05-02 North Carolina State University Compositions and methods for generating male sterile plants
WO2023064872A1 (en) 2021-10-14 2023-04-20 Precision Biosciences, Inc. Combinations of anti-bcma car t cells and gamma secretase inhibitors
AU2022371430A1 (en) 2021-10-19 2024-05-30 Precision Biosciences, Inc. Gene editing methods for treating alpha-1 antitrypsin (aat) deficiency
WO2023081900A1 (en) 2021-11-08 2023-05-11 Juno Therapeutics, Inc. Engineered t cells expressing a recombinant t cell receptor (tcr) and related systems and methods
WO2023091910A1 (en) 2021-11-16 2023-05-25 Precision Biosciences, Inc. Methods for cancer immunotherapy
WO2023105244A1 (en) 2021-12-10 2023-06-15 Pig Improvement Company Uk Limited Editing tmprss2/4 for disease resistance in livestock
WO2023122722A1 (en) 2021-12-22 2023-06-29 Sangamo Therapeutics, Inc. Novel zinc finger fusion proteins for nucleobase editing
WO2023131616A1 (en) 2022-01-05 2023-07-13 Vib Vzw Means and methods to increase abiotic stress tolerance in plants
WO2023131637A1 (en) 2022-01-06 2023-07-13 Vib Vzw Improved silage grasses
WO2023144199A1 (en) 2022-01-26 2023-08-03 Vib Vzw Plants having reduced levels of bitter taste metabolites
WO2024013514A2 (en) 2022-07-15 2024-01-18 Pig Improvement Company Uk Limited Gene edited livestock animals having coronavirus resistance
WO2024100604A1 (en) 2022-11-09 2024-05-16 Juno Therapeutics Gmbh Methods for manufacturing engineered immune cells

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5198346A (en) * 1989-01-06 1993-03-30 Protein Engineering Corp. Generation and selection of novel DNA-binding proteins and polypeptides
US4990607A (en) * 1989-03-14 1991-02-05 The Rockefeller University Alteration of gene expression in plants
US5243041A (en) * 1991-08-22 1993-09-07 Fernandez Pol Jose A DNA vector with isolated CDNA gene encoding metallopanstimulin
US5302519A (en) * 1991-09-09 1994-04-12 Fred Hutchinson Cancer Research Center Method of producing a Mad polypeptide

Also Published As

Publication number Publication date
AU1686595A (en) 1995-08-01
JPH09508019A (ja) 1997-08-19
FI962879A0 (fi) 1996-07-17
CA2181548C (en) 2009-11-03
EP0770129A1 (en) 1997-05-02
EP0770129B1 (en) 2005-11-23
FI121014B (fi) 2010-06-15
NO962991L (no) 1996-09-18
NO962991D0 (no) 1996-07-17
EP0770129A4 (en) 1999-02-03
FI122725B (fi) 2012-06-15
ATE310812T1 (de) 2005-12-15
DE69534629D1 (de) 2005-12-29
FI962879A (fi) 1996-09-17
CA2681922C (en) 2012-05-15
FI20105336A (fi) 2010-03-31
CA2181548A1 (en) 1995-07-20
JP4012243B2 (ja) 2007-11-21
AU704601B2 (en) 1999-04-29
CA2681922A1 (en) 1995-07-20
WO1995019431A1 (en) 1995-07-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NO325015B1 (no) Fremgangsmate for a oppna en isolert zinkfinger-nukleotidbindende polypeptidvariant samt zinkfinger-nukleotid-bindende polypeptidvariant fremstilt etter fremgangsmaten.
US6242568B1 (en) Zinc finger protein derivatives and methods therefor
US6790941B2 (en) Zinc finger protein derivatives and methods therefor
EP0781331B1 (en) Improvements in or relating to binding proteins for recognition of dna
Ruben et al. Functional characterization of the NF-κB p65 transcriptional activator and an alternatively spliced derivative
Qian et al. PKD1 interacts with PKD2 through a probable coiled-coil domain
CA2290717C (en) Nucleic acid binding proteins
JP2008516210A (ja) 治療、診断およびクロマトグラフィーに使用するためのタンパク質複合体
WO1998053059A1 (en) Nucleic acid binding proteins
WO2004108883A2 (en) Transducible dna-binding proteins
JP2004515245A (ja) Ｃ型レクチン様ドメインの骨格構造を有する蛋白質のコンビナトリアルライブラリ
US20050084885A1 (en) Zinc finger protein derivatives and methods therefor
AU2002300619B2 (en) Zinc finger protein derivatives and methods therefor
AU2007201586B2 (en) Zinc finger protein derivatives and methods therefor
JP4927546B2 (ja) ヘプタペプチドパターン及び細胞透過ドメインを含む相互作用ポリペプチド
AU726759B2 (en) Improvements in or relating to binding proteins for recognition of DNA

Legal Events

Date Code Title Description
MK1K Patent expired