NO324066B1 - Multikatalytiske proteaseinhibitorer, farmasoytiske sammensetninger omfattende disse og deres anvendelse - Google Patents

Multikatalytiske proteaseinhibitorer, farmasoytiske sammensetninger omfattende disse og deres anvendelse Download PDF

Info

Publication number
NO324066B1
NO324066B1 NO19972104A NO972104A NO324066B1 NO 324066 B1 NO324066 B1 NO 324066B1 NO 19972104 A NO19972104 A NO 19972104A NO 972104 A NO972104 A NO 972104A NO 324066 B1 NO324066 B1 NO 324066B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
mmol
group
compound
mcp
arginyl
Prior art date
Application number
NO19972104A
Other languages
English (en)
Other versions
NO972104L (no
NO972104D0 (no
Inventor
James C Kauer
Robert Siman
Mohamed Iqbal
James Diebold
Sankar Chatterjee
Original Assignee
Cephalon Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US08/337,795 external-priority patent/US5550262A/en
Application filed by Cephalon Inc filed Critical Cephalon Inc
Publication of NO972104D0 publication Critical patent/NO972104D0/no
Publication of NO972104L publication Critical patent/NO972104L/no
Publication of NO324066B1 publication Critical patent/NO324066B1/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D209/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D209/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom condensed with one carbocyclic ring
    • C07D209/44—Iso-indoles; Hydrogenated iso-indoles
    • C07D209/48—Iso-indoles; Hydrogenated iso-indoles with oxygen atoms in positions 1 and 3, e.g. phthalimide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
    • A61K31/18—Sulfonamides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
    • A61K31/216—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acids having aromatic rings, e.g. benactizyne, clofibrate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
    • A61K31/22—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/275—Nitriles; Isonitriles
    • A61K31/277—Nitriles; Isonitriles having a ring, e.g. verapamil
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
    • A61K31/352—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings, e.g. methantheline 
    • A61K31/353—3,4-Dihydrobenzopyrans, e.g. chroman, catechin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/403—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil condensed with carbocyclic rings, e.g. carbazole
    • A61K31/4035—Isoindoles, e.g. phthalimide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C279/00—Derivatives of guanidine, i.e. compounds containing the group, the singly-bound nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C279/30—Derivatives of guanidine, i.e. compounds containing the group, the singly-bound nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups having nitrogen atoms of guanidine groups bound to nitro or nitroso groups
    • C07C279/32—N-nitroguanidines
    • C07C279/36—Substituted N-nitroguanidines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C311/00—Amides of sulfonic acids, i.e. compounds having singly-bound oxygen atoms of sulfo groups replaced by nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C311/01—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C311/02—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to acyclic carbon atoms of an acyclic saturated carbon skeleton
    • C07C311/09—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to acyclic carbon atoms of an acyclic saturated carbon skeleton the carbon skeleton being further substituted by at least two halogen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C311/00—Amides of sulfonic acids, i.e. compounds having singly-bound oxygen atoms of sulfo groups replaced by nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C311/30—Sulfonamides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by singly-bound nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C311/45—Sulfonamides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by singly-bound nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups at least one of the singly-bound nitrogen atoms being part of any of the groups, X being a hetero atom, Y being any atom, e.g. N-acylaminosulfonamides
    • C07C311/47—Y being a hetero atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C311/00—Amides of sulfonic acids, i.e. compounds having singly-bound oxygen atoms of sulfo groups replaced by nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C311/50—Compounds containing any of the groups, X being a hetero atom, Y being any atom
    • C07C311/52—Y being a hetero atom
    • C07C311/64—X and Y being nitrogen atoms, e.g. N-sulfonylguanidine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C337/00—Derivatives of thiocarbonic acids containing functional groups covered by groups C07C333/00 or C07C335/00 in which at least one nitrogen atom of these functional groups is further bound to another nitrogen atom not being part of a nitro or nitroso group
    • C07C337/06—Compounds containing any of the groups, e.g. thiosemicarbazides
    • C07C337/08—Compounds containing any of the groups, e.g. thiosemicarbazides the other nitrogen atom being further doubly-bound to a carbon atom, e.g. thiosemicarbazones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D311/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings
    • C07D311/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D311/04—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring
    • C07D311/58—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring other than with oxygen or sulphur atoms in position 2 or 4
    • C07D311/70—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring other than with oxygen or sulphur atoms in position 2 or 4 with two hydrocarbon radicals attached in position 2 and elements other than carbon and hydrogen in position 6
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F5/00—Compounds containing elements of Groups 3 or 13 of the Periodic Table
    • C07F5/02—Boron compounds
    • C07F5/025—Boronic and borinic acid compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/02—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link
    • C07K5/0207—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link containing the structure -NH-(X)4-C(=0), e.g. 'isosters', replacing two amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06086—Dipeptides with the first amino acid being basic
    • C07K5/06095—Arg-amino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C2601/00—Systems containing only non-condensed rings
    • C07C2601/06—Systems containing only non-condensed rings with a five-membered ring
    • C07C2601/08—Systems containing only non-condensed rings with a five-membered ring the ring being saturated

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Macromonomer-Based Addition Polymer (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Pyrane Compounds (AREA)

Description

OPPFINNELSENS FELT
Foreliggende oppfinnelse angår inhibitorer av multikatalytiske proteaser (MCP), sammensetninger som omfatter slike inhibitorer og anvendelsen av MCP-inhibitorer for fremstilling av et preparat for eksempelvis å retardere tap av muskelmasse som opptrer ved forskjellige fysiologiske tilstander.
BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN
Eukaryote celler nedbryter og erstatter konstant cellulærproteiner. Dette gir cellen mulighet for selektivt og hurtig å fjerne proteiner og peptider som har abnormale konformasjoner, for å utøve kontroll over metabolske veier for å justere nivået av regulatoriske peptider og for å tilveiebringe aminosyrer til energi om nødvendig, slik som under sult. Se Goldberg, A.L. & St. John, A.C. Annu. Rev. Biochem. 45: 747 - 803 (1976). Den cellulære mekanismen for pattedyr tillater multiple veier for proteinnedbrytelse. Noen av disse veiene synes å kreve energitilførsel i form av adenosintrifosfat ("ATP"). Se Goldberg, A.L. & St. John, supra.
Multikatalytiske proteaser (MCP, også referert til som "multikatalytiske proteinaser", "proteasome", "multikatalytisk proteinasekompleks", multikatalytisk endopeptidase-kompleks", "20S-proteasome" og "ingesin") er et høymolekylært (700 kD) eukaryotisk ikke-lysosomalt proteinasekompleks som spiller en rolle i minst to cellulære veier for nedbryting av protein til peptid og aminosyrer. Se Orlowski, M. Biochemistry 29 (45) 10289-10297 (1990). Komplekset har minst tre forskjellige typer hydrolytiske aktiviteter: (1) en trypsinlignende aktivitet hvor peptidbindinger blir spaltet ved karboksylsiden av basisk aminosyrer; (2) en chymotrypsinlignende aktivitet hvor peptidbindingene blir spaltet ved karboksylsiden av hydrofobe aminosyrer; og (3) en aktivitet hvor peptidbindingene blir spaltet ved karboksylsiden av glutaminsyre. Se Rivett, A.J. J. Biol. Chem. 264: 21 12215 - 12219 (1989) og Orlowski, supra.
En vei for proteinhydrolyse som omfatter MCP omfatter også polypeptid "ubiquitin". Hershko, A. & Crechanovh, A. Annu. Rev. Biochem. 51: 335-364 (1982). Denne veien, som krever MCP, ATP og ubiquitin, synes å være ansvarlig for degradering av sterkt unormale proteiner, visse kort-levede normale proteiner og det meste av proteinet i voksne fibroblaster og modnende retikuloyter. Se Driscoll, J. og Goldberg, A.L. Proe. Nat. Acad. Sei. U.S.A. 86: 787-791 (1989). Proteiner som skal degraderes på denne måten blir kovalent bundet til ubiquitin via deres lycinaminogrupper på en ATP-avhengig måte. De ubiquitin-konjugerte proteiner ble så degradert til små peptider ved et ATP-avhengig proteasekompleks ved 26S-proteasom som inneholder MCP som dets protolytiske kjerne. Goldberg, A.L. & Rock, K.L. Nature 357: 375-379 (1992).
En andre vei for proteindegradering som krever MCP og ATP, men som ikke krever ubiquitin har også blitt beskrevet. Se Driscoll, J. & Goldberg, A.L., supra. I denne prosessen, hydrolyserer MCP-proteiner på en ATP-avhengig måte. Se Goldberg, A.L. & Rock, K.L., supra. Denne prosessen er blitt observert i skjelettmuskler. Se Driscoll & Goldberg, supra. Imidlertid, har det blitt foreslått at i muskler, virker MCP synergistisk med den annen protease, multipain, som resulterer i en aksellerert nedbryting av muskelprotein. Se Goldberg & Rock, supra.
Det har blitt rapportert at MCP virker ved en proteolytisk mekanisme hvor den aktive setenukleofile er hydroksylgruppen til den N-terminale treoninresten. MCP er således det første kjente eksemplet på en treonin protease. Se Seemuller et al., Science (1995) 268 579 - 582; Goldberg, A.L., Science (1995) 268 522 - 523.
De relative aktivitetene til cellulære proteiners syntetiske og degradative veier bestemmer om protein blir akkumulert eller tapt. De normale tap av proteinmasse er assosiert med forskjellige sykdomstilstander og slik som muskulær dystrofi, hjertekakesi, emfysem, lepra, feilernæring, osteomalaki, akutt barneleukemi og cancer kakesi. Tap av muskelmasse er også observert ved eldring, langtids sykehusopphold eller langtids opphold i seng og ved kronisk smerte i den nedre ryggen.
Ved forsvinningene av eller ved inaktivitet av nerver, gjennomgår skjelettmuskler hurtig atrofi som fører til en uttalt reduksjon i størrelse, proteininnhold og kontraktil styrke. Denne atropien er en viktig komponent i mange neuromuskulære sykdommer hos mennesker. Økning av proteinnedbryting har blitt implisert som den primære årsak for muskelnedbryting ved atrofi med forsvinning av nerver. Furono, K. et al. J. Biochem. 265/15:8550-8557 (1990). Mens den spesifikke prosessen eller prosessen involvert i proteinhydrolyse i muskel ikke har blitt identifisert, er det tilgengelige material som tyder på involvering av MCP i den aksellererte nedbrytingen av muskelproteiner. Se f.eks. Furono, supra, og PCT søknad WO 92/20804 (publiseirngsdato: 26. november 1992).
MCP aktivitet har blitt implisert i flere sykdomstilstander. F.eks., har abnormal høy ekspressjon av MCP i humane leukemi cellelinjer blitt rapportert. Kumatori, A. et al. PNAS 87: 7071 (1990). Autoantistoffer mot MCP i pasienter med systemisk lupus 3
erythematosus ("SLE") har også blitt rapportert. Arribas, J. et al. J. Exp. Med. 173: 423-427 (1990).
Midler som er i stand til å hemme MCP-komplekset er nødvendige; slike midler vil gi et 5 verdifullt verktøy for både de som utfører forskning innen området som f.eks. MCP-terapi, såvel som de i det medisinske feltet for eksempelvis å kontrollere de nedbrytende feltene av en abnormal eller avvikende MCP aktivitet. Foreliggende oppfinnelse er rettet mot disse viktige felt.
io OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN
Foreliggende oppfinnelse er rettet mot nye multikatalytiske protease("MCP")-inhibitorer. Foreliggende oppfinnelse omfatter også anendelse av inhibitorene for fremstilling av et preparat for hemming av MCP assosiert med visse forstyrrelser,
inkludert behandling av muskulære nedbrytingsforstyrrelser.
15
Ifølge et aspekt ble det fremskaffet forbindelser med formelen:
Substituentene er definert nedenfor, såvel som de foretrukne substituentgruppene.
20 Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse er nyttig i forskjellige anvendelser. For eksempel, kan forbindelsene bli benyttet i forskningsanvendelser for ytterligere å definere og utvikle in vitro- og in vivo-modeller for mekanistatiske forståelser av MCP veien og for presentasjon av peptidantigener via den store histokompatibilitetskompleks
klasse I (MHC I) veien.
25
I en klinisk sammenheng, kan sammensetninger omfattende foreliggende oppfinnelse bli benyttet for inhibering av MCP-aktivitet, redusere tap av muskelmasse, behandle muskel nedbrytende forstyrrelser, redusere superoksyd dismutasedegradering og
behandling av forstyrrelser kjennetegnet ved reduksjon av superoksyd
30 dismutaseaktivitet.
Det presenterer også metoder for fremstilling av forbindelser ifølge oppfinnelsen.
Disse og andre trekk ved forbindelsene vil bli beskrevet videre i beskrivelsen som følger.
KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE
Figur 1 viser effekten av utførelsesformer av de beskrevne MCP-inhibitorene på prosessering av elektroporerte OVA ved M12.B6 celler. Figur 2 viser effekten av OVA-konsentrasjon på inhibering av prosessering ved en utførelsesform av oppfinnelsen. Figur 3 viser effekten av OVA-konsentrasjon på inhibering av prosessering ved en utførelsesform av oppfinnelsen. Figur 4 viser et fysikalsk kart som definerer SOD-1 genet og lokalisering av FALS-mutasjoner, restriksjonsseter og PCR-primer. Figur 5 viser kvantifisering av SOD-1 nivåer i transiente transfekterte 293 celler etter inkubering med 5 uM av utførelsesformer av MCP-inhibitorene. Figur 6 viser doserespons av forskjellige SOD-1 isoformer ved en utførelsesform av oppfinnelsen.
Figur 7 viser at SOD-1 omsetningen er en funksjon av MCP-aktivitet.
DETALJERT BESKRIVELSE AV DE FORETRUKNE UTFØRELSESFORMER
Foreliggende oppfinnelse fremskaffer MCP-inhibitorer, sammensetninger som omfatter disse inhibitorene og anvendelse av disse inhibitorene. MCP-inhibitorene ifølge oppfinnelsen er representert ved formelen:
hvor
Ri er valgt fra gruppen bestående av -C=N, -C(=0)OR9, ftalimid, -NH-SO2R9 og -NH-CBZ;
R2 er valgt fra gruppen omfattende H, og cykloalkyl som har fra tre til syv karbonatomer;
R3 er valgt fra gruppen omfattende -(CH2)m-NH-C(=N-R5)-NH2, og -R6-N02,
R4 er -CH(CH2-R7)-Q;
Q er valgt fra gruppen omfattende -CH-Rg, -C(=0)CH3, -C(=0)CH2C1, -C(=0)CH2Br,
-C(=0)CH2F, -C(=0)CHF2, -C(=0)CF3) -C(=0)C(=0)NH-R7, -B(OH)2,
p er 2 eller 3;
R5 er valgt fra gruppen omfattende -N02, og -J;
R6 er -(CH2)m-NH-C(=NH)-NH-;
R7 er valgt fra gruppen omfattende fenyl og alkyl som har fra en til åtte karbonatomer hvor nevnte alkylgruppe eventuelt er substituert med en eller flere halogenatomer, eller en fenylgruppe;
R8 er valgt fra gruppen omfattende =0, =N-NHC(=0)-NH2, =N-OH, =N-OCH3, =N-0-CH2-C6H5, =NNH-C(=S)-NH2;
R9 er valgt fra gruppen omfattende hydrogen og alkyl som har fra en til seks karbonatomer, hvor nevnte alkylgruppe eventuelt er substituert med eller flere halogenatomer, eller en fenylgruppe;
J er en beskyttende gruppe valgt blant -PMC, -MTR, -MTS, -TOS og -CBZ;
n er et helt tall fra 3 til 10; og
mer et helt tall fra 2 til 5.
I noen foretrukne utførelsesformer er R] -C=N, -C(=0)OCH3, ftalimid eller
-NH-S02CF3, og i andre foretrukne utførelsesformer er R2 H eller cyklopentyl.
R3 er fortrinnsvis -(CH2)3-NH-C(=N-R5)-NH2.
Q er fortrinnsvis -CH-R8, -B(OH)2, -B(OH)2, -C(=0)C(=0)NH-R7, eller har strukturen
R5 er fortrinnsvis -N02, -PMC, -MTR, -MTS eller Tos.
R7 er fortrinnsvis -CH(CH3)2, -(CH2)2-CH3, -CH2-CH3 eller -C6H5.
R8 er fortrinnsvis =0, =N-OH, =N-0-CH2-C6H5, =NNH-C(=0)-NH2 eller =NNH-C(=S)-NH2.
I noen foretrukne utførelsesformer er R] -C6N; R2 er cyklopentyl; R3 er -(CH2)3-NH-C(=N-N02)-NH2 eller -(CH2)3-NH-C(=N-J)-NH2; R7 er -CH(CH3)2; og R8 er =0.
I ytterligere foretrukne utførelsesformer er R] C8N; R2 er cyklopentyl; R3 er -(CH2)3-NH-C(=N-N02)-NH2 eller -(CH2)3-NH-C(=N-J)-NH2; R7 er -CH(CH3)2; Q er -CH-R8 og Rs er =N-NHC(=0)-NH2, =N-OH, =N-OCH3 eller =N-0-CH2-C6H5.
Videre angår foreliggende oppfinnelse en farmasøytisk sammensetning kjennetegnet ved at den omfatter en fobindelse ifølge oppfinnelsen og en farmasøytisk akseptabel bærer.
Foreliggende oppfinnelse angår også anvendelse av en forbindelse ifølge oppfinnelsen for fremstilling av et preparat for behandling av en muskelnedbrytende forstyrrelse valgt blant dystrofi, hjertekakesi, emfysem, diabetes, lepra, feilernæring, osteomalaki og cancerkakesi.
Som benyttet her er uttrykket "alkyl" ment å omfatte rettkjedede, forgrenede og cykliske hydrokarboner slik som etyl, isopropyl og cyklopentyl. Substituerte alkylgrupper er alkylgrupper hvor en eller flere hydrogenatomer er blitt erstattet med halogen, eller en fenylgruppe. Foretrukne alkylgrupper har 1 til 8 karbonatomer. Som benyttet heri, har uttrykket "halogen" sin vanlige mening og omfatter fluor, klor, brom og jod, og fluor er et foretrukket halogen. Uttrykket "Arg" som benyttet i foreliggende oppfinnelse har sin normale betydning som forkortelsen for aminosyren "arginin".
I noen utførelsesformer inneholder forbindelsen ifølge oppfinnelsen beskyttende grupper. Som benyttet heri, skal uttrykket "beskyttende gruppe" bli forstått med en bred tolking. Beskyttende grupper er kjent per se som kjemiske funksjonelle grupper som kan bli selektivt satt på og fjernet fra funksjonalitet, slik som hydroksylgrupper, aminogrupper og karboksylgrupper. Disse gruppene er tilstede i en kjemisk forbindelse for å gjøre slike funksjonaliteter inerte for kjemisk reaksjonsbetingelser som forbindelsen er utsatt for. En hvilken som helst variasjon av beskyttende grupper kan bli benyttet for foreliggende oppfinnelse, med mindre anet er presisert. En slik beskyttende gruppe er ftalimidogruppen. Andre foretrukne beskyttende grupper ifølge oppfinnelsen, har de følgende formler:
Videre representative beskyttende grupper som passer for utførelse av oppfinnelsen, kan bli funnet i Greene, T.W. og Wuts, P.G.M., "Protective Groups in Organic Synthesis" 2d. ed., Wiley & Sons, 1991, hvis beskrivelse herved er innlemmet som referanse i sin helhet.
Som tidligere indikert, har MCP-aktiviteten vært forbundet med forskjellige forstyrrelser og sykdommer. Da forbindelsene som beskrevet heri er nyttige for hemming av aktiviteten av MCP og da nytten av slike forbindelser kan bli benyttet både for forskning og i terapeutiske sammenheng, inklusiv metoder for hemming av aktiviteten av MCP ved å bringe i kontakt MCP med en forbindelse ifølge oppfinnelsen, og gi forbindelsen til et pattedyr, inkludert et menneske, som et medikament eller et farmasøytisk middel.
Benyttet heri, betyr uttrykket "bringe i kontakt" direkte eller indirekte å forårsake plassering sammen av grupper som skal bli bragt i kontakt, slik at gruppene kommer i fysisk kontakt med hverandre. Å bringe i kontakt omfatter således fysiske handlinger slik som å plassere gruppene sammen i en beholder, eller administrere gruppene til en pasient. Således, faller eksempelvis administrering av en forbindelse ifølge oppfinnelsen til en pasient som lider av en sykdom eller tilstand forbundet med abnormal og/eller avvikende aktivitet av MCP som er forbundet med slik sykdom eller forstyrrelser, innen rammen av oppfinnelsene av uttrykket "bringe i kontakt".
I foretrukne utførelsesformer blir farmasøytiske sammensetninger ifølge foreliggende oppfinnelse administrert til pasienter som lider av en forstyrrelse, dvs. en abnormal fysikalsk tilstand, en sykdom eller patofysiologisk tilstand forbundet med abnormal og/eller avvikende aktivitet av MCP. Forstyrrelsene for hvilke sammensetningene ifølge oppfinnelsen blir administrert, er fortrinnsvis de som direkte eller indirekte produserer en nedbryting (dvs. tap) av muskelmasse, dvs. en muskelnedbrytende forstyrrelse. Disse omfatter muskulære dystrofier, hjertekakesi, emfysem, lepra, feilernæring, osteomalaki, akutt barneleukemi, AIDS kakesi og cancerkakesi.
Innen rammen av dette dokument, betyr "administrering" introduksjon av farmasøytiske sammensetninger til en pasient. Foretrukne metoder for administrasjon omfatter intra-venøs, subkutan og intramuskulær administrasjon. Fortrinnsvis, vil forbindelsen blir administrert som en farmasøytisk sammensetning omfattende forbindelsen i kom-binasjon med en farmasøytisk akseptabel bærer, slik som fysiologisk saltvann, andre passende bærere kan bli funnet i Remingtons Pharmaceutical Sciences (Mack Pub.Co., Easton, PA, 1980).
Konsentrasjonen av forbindelsene beskrevet heri i en farmasøytisk sammensetning vil variere avhengig av et antall faktorer, inkludert dosering av medikamentet som skal administreres, de kjemiske karakteristikkene, (f.eks. hydrofobisitet) til de benyttede forbindelsene, og administrasjon. I generelle termer, kan forbindelsene ifølge oppfinnelsen bli anbragt i en vandig fysiologisk bufferoppløsning inneholdende omkring 0,1 til 10 % w/v forbindelse for parenteral administrasjon. Typiske doseområder er omkring 1 ug/kg til 1 g/kg kroppsvekt pr. dag, et foretrukket doseringsområde er fra omkring 0,01 mg/kg til 100 mg/kg kroppsvekt pr. dag. Den foretrukne doseringen av det medikament som ble administrert, blir sannsynligvis avhengig av slike variable som typen og graden av progresjon av sykdommen eller forstyrrelsen, den totale helsestatus til pasienten, den relative biologiske effektiviteten til den valgte forbindelsen og formuleringen av hjelpestoffene og dets administrasjonsvei. Som benyttet heri, angir uttrykket "pasient" en hvilken som helst type virveldyr. Spesielt er pasienten et menneske.
De muskulære dystrofiene er genetiske sykdommer som er kjennetegnet ved progressiv svakhet og degenerering av muskelfibre uten tegn på neural degenerering. I Duchennes muskulære dystrofi (DMD) viser pasienten en gjennomsnitt på 67 % reduksjon i muskelmasse og i biotonisk dystrofi, har fraksjonell muskelproteinsyntese vist seg å bli redusert til gjennomsnittlig 28 %, uten noen korresponderende reduksjon i ikke-muskulær proteinsyntese (muligens på grunn av redusert slutt-organ respons for anaboliske hormoner eller substrater). Aksellerert proteindegradering har blitt demonstrert i muskler til DMD pasienter.
Alvorlig kognestiv hjertesvikt (CHF) er kjennetegnet ved "hjertekakesi", dvs. en muskelprotein-forsvinning i både hjerte- og skjelettmuskler, med en gjennomsnitt på rundt 19 % kroppsvekt reduksjon. Hjertekakesi er forårsaket av en øket rate av myofibrillær proteinnedbryting.
Emfysem er en kronisk obstruktiv lungesykdom, definert ved en forstyrrelse av luft-rommet distalt for de terminale ikke-respiratoriske bronkiolene, fulgt av en destruktiv forandring av alveole veggene. Kliniske manifesteringer av redusert pulmonar funksjonalitet inkludert hosting, vesing, gjenopptredende respiratoriske infeksjoner, ødem og funksjonelle svikter og forkortet livsløp. Utslipp av tyrosin er øket med 47 % hos emfysematøse pasienter. Hele kroppens leucinstrømning forblir normal, hele kroppens leucinoksydering er øket, hele kroppens proteinsyntese er redusert. Resultatet er en reduksjon i muskelproteinsyntesen, fulgt av en reduksjon i hele kroppens proteinomsetning og skjelettmuskelmasse. Denne reduksjon blir stadig tydligere med sykdomsprogressjon og langtidssykdom.
Ved diabetes mellitus er det en generell reduksjon i mindre muskler i hånden, som forårsakes av kronisk artiel nervereduksjon (neuropati). Dette er mest tydelig og blir verre ved langtids sykdomsprogressjon og alvorlighet.
Lepra er forbundet med en muskulær reduksjon som opptrer mellom metakarpalene på tommelen og pekefingeren. Alvorlig feilernæring er kjennetegnet blant annet ved alvorlig muskelreduksjon.
Osteomalaki er en ernæringsforstyrrelse forårsaket av en svikt på vitamin D og kalsium. Den er referert til som "Engelsk syke" hos barn og "osteomalaki" hos voksne. Den er kjennetegnet ved en mykning av benene (på grunn av utilstrekkelig mineralisering, med overskuddsakkumulering av osteoid), smerte, ømhet, muskelreduksjon og svakhet, anoreksi og totalt vekttap. Det kan være et resultat av feilernæring, gjentatte svanger-skap og melkeproduksjon (uttømming eller reduksjon av vitamin D og kalsiumlager) og vitamin D resistens.
Ved akutt barneleukemi er det proteinenergy feilernæring som resulterer i reduksjon av skjelettmuskler. Studier har vist at noen barn har muskeltap selv før diagnose på leukemi, med en gjennomsnitt på 27 % reduksjon av muskelmasse. Det er også en samtidig 33 % - 37 % økning i adipost vev, noe som resulterer i ingen netto forandring i relativ kroppsvekt og lemmers omkrets.
Cancerkakesi er et kompleks symptom som opptrer ved variable tilstander hos pasienter med faste tumorer og hematologiske maligne lidelser. Klinisk, er cancerkakesi manifistert som vekttap med massive uttømminger av både adipost vev og magert muskelmasse og er en årsak til død som resultat fra cancer. Cancerkakesi pasienter har avkortet overlevelsestid og redusert respons for kjemiterapi. I tillegg til forstyrrelse som gir muskelreduksjon, synes andre forhold og tilstander å være forbundet i en viss grad med en reduksjon i muskelmasse. Slike sammenhenger omfatter tap av muskler på grunn av kronisk smerte i den nedre ryggen, høy alder, langtids hospitalisering på grunn av sykdom eller skade, alkoholisme og corticosteroidterapi.
Studier har vist at i alvorlige tilfeller av kroniske smerter i den nedre rygg, er det en paraspinal muskelreduksjon. Reduksjon av paraspinal muskelreduksjon letter smerte og forbedrer funksjonen.
Det er også antatt at den generelle svakhet ved høy alder skyldes muskelreduksjon. Ettersom kroppen eldes, blir en økende andel av skjelettmuskel erstattet av fibrøsvevet. Resultatet er en signifikant reduksjon i muskelkraft, men kun en marginal reduksjon i fettfri masse.
Studier har vist at de pasienter som lider av skader eller kronisk sykdom og som er hospitalisert i lengere tid, er det en lang tids unilateral muskelreduksjon, med en gjennomsnitt på 31 % reduksjon i muskelmasse. Studier har også vist at dette kan bli korrigert med intensiv fysioterapi. Imidlertid, kan det være mer effektivt for mange pasienter og gi forbedring med medikamentterapi.
Hos alkoholikere er det reduksjon av den anteriore tibiale muskel. Denne proksimale muskelskade er forårsaket av neurogen skade, nemlig reduserte glykolytisk og fosforylaseenzymaktivitet. Skaden blir tydelig og verre desto lengere varigheten av alkoholmisbruket er. Pasienter behandlet med kortikosteroider erfarer tap av muskelmasse.
MCP har blitt vist å aktivere den intracellulære mediatoren for inflammasjon referert til som NFkappaB. Se Baeuerle, P.A. og Henkel, T. (1994) Annu. Rev. Immunol. 12,141-179. Inhibitorer av en MCP har derfor potensielt anvendelse i behandling av auto-immune og inflammatoriske sykdommer.
Forbindelser ifølge oppfinnelsen kan bli benyttet for å lette muskelmassetapet som et resultat av de nevnte betingelser, såvel som andre. I tillegg, er MCP-inhibitorer ifølge oppfinnelsen nyttige i veterinær- og dyrehusholdsanvendelser for å imøtegå vekttap hos dyr, eller å fremme vekst.
MCP har blitt implisert i presentasjonen av peptid antigener via hoved-histokompatibilitetskompleks klasse I (MHC I) veien. Se Goldberg og Rock, supra; se også Rock et al., Cell. 78: 761-771 (1994) heretter "Rock et al." Inhibitorer av MCP kan derfor anvendes som forskningsmidler i studier hvor inhibering av MCHI veien er ønskelig, så vel som i lettelse av sykdommer og forstyrrelser som er forbundet med avvikende og/eller abnormal MHC-I prosessering av antigener. Da den nøyaktige opprinnelsen av de fleste av peptidene presentert i MHC-I-molekylet enda ikke er klart og det nylig er samlet bevis for at MCP spiller en rolle i MHC-I presentasjonen (se Rock et al. supra), vil reagenser slik som de beskrevne MCP-inhibitorene som blokkerer den proteolyttiske prosesseringen av antigener for MHC-I presentasjonen, være nyttige i oppklaringen av viktigheten av denne veien.
Overraskende er det nå blitt funnet at MCP-inhibitorer ifølge oppfinnelsen også er nyttige i å øke aktiviteten av Cu/Zn superoksyd dismutase-1 ("SOD-l")-enzymet. Følgelig, er disse forbindelsene nyttige i både forskningsanvendelse for undersøkelse av SOD-1 manglende systemer i behandling av neurodegenerative eller andre forstyrrelser kjennetegnet som en reduksjon i SOD-1 enzymaktivitet (dvs. hvor slike reduksjoner har blitt implisert i patogeneseforstyrrelsen). Slike tilstander omfatter sykdommer som omfatter oksydativt stress slik som Parkinsons sykdom, Alzheimers sykdom, Huntingtons sykdom, slag, trauma og iskemi.
SOD-1 er et homodimerert metalloenzym som katalyserer dismuteringen av de giftige superoksydanionet 02" til 02 og H202. SOD-1 er en oppfanger av frie radikaler og virker derfor som et første linje forsvar i detoksiifseringen av superoksydradikaler, som er normale biprodukter ved aerob metabolisme. SOD-1 opptrer primært i eukaryoter og er funnet i cytoplasma til nesten alle celletyper. SOD-1 er et essensielt enzym i den fysiologiske responsen overfor oksygentoksisitet og har blitt aktivt undersøkt som et terapeutisk middel i patologiske tilstander relatert til oksydativt stress. Se Bannister et al., CRC Crit. Rev. Biochem. 22: 111-180 (1987); Halliwell et al., Methods in Enzymol., 186: 1-75 (1990); Greenwald, Free Rad. Biol. Med. 8: 201-209 (1990). Egenskaper som har forhindret anvendelsen av SOD-1 som et terapeutisk middel, er dets dårlige intracellulære tilgang når tilført eksogent, og dets ekstremt korte halveringstid i serum. Forbindelser som øker aktiviteten til intracellulært SOD-1 vil derfor gi en signifikant forbedring i SOD-1 terapi.
ALS er en progressiv paralytisk forstyrrelse forårsaket av degenerering av store motoriske neuroner i ryggmargen og hjernen. Omkring 5 -10 % av ALS tilfeller er familiære (FALS) og blir arvet som et autosomalt dominant trekk. Nylig, har seksten forskjellig missens muteringer blitt identifisert i et subset av familier med FALS og opptrer innen genet som koder for SOD-1. Se Rosen, D.R., et al., Science 261: 1047-1051 (1993); Deng, H.-X., et al., Nature 362: 59-62 (1993). Disse mutasjoner fører til en reduksjon i SOD-1 aktivitet i røde blodceller og hjernevev og har blitt vist til å stabilisere SOD-1 protein og resultere i økende omsetning av enzymet. Se Bowling, A.C., et al., J. Neurochem. 61: 2322-2325 (1993); Borchelt, D.R., et al., Proe. Nati. Acad. Sei. 91: 8292-8296 (1994). I tillegg, har en transgenisk musemodell av ALS, basert på impliseringen av forbindelsen mellom SOD-1 og ALS, blitt beskrevet. Brown, R.H. 331/16 NEJM 1901 (1994).
Det er nå oppdaget at foreliggende MCP-inhibitorer er potente positive effektorer for SOD-1. En foretrukket MCP-inhibitor, referert til heri som "Forbindelse 14", reduserer spesifikt vill-typer og mutant SOD-1 degradering på en doseavhengig måte (forbindelse nummer angivelser er basert på eksempel nummer som beskriver syntesen av forbindelsen, f.eks. er syntesen av Forbindelse 14 angitt i Eksempel 14 nedenfor). Som benyttet heri, betyr reduksjon av SOD-1 degradering forsinkelse av hastigheten ved hvilken SOD-1 protein blir katabolisert.
Oppfinnelsen blir videre illustrert ved hjelp av de følgende eksempler. Disse eksemplene er ment videre å forklare oppfinnelsen.
Eksempel 1
Isolering av multikatalytisk protease fra humane vev.
Prøver av human lever og hjerne oppnådd post-mortem, ble benyttet for isolering og delvis rensing av MCP ved ionebyttekromatografi, ammoniumsulfat-utfelling og gelfiltrering (f.eks. Driscoll og Goldberg, Proe. Nati. Acad. Sei. 86, 787-791 (1989); Yamamoto et al., Biochim, Biophys, Acta 882,297-304 (1986). For begge start-materialer ble vev homogenisert i 10 volumer 20 mM Tris-HCl (pH 7.5) inneholdende 20 % glycerol. Etter sentrifugering ved 40.000 x g i 30 minutter kunne den proteolytiske aktiviteten av den chymotrypsin-lignende komponenten av MCP, bli bestemt i supernatanten (se nedenfor). Supematanten ble fraksjonert på en DEAE-Sefarose Fast Flow-kolonne ekvilibrert i homogeniseirngsbuffer. For hver liter supernatant, ble 250 ml resin benyttet. Etter påsetting av prøven ble kolonnen vasket med ~10 volumer homogeniseringsbuffer og proteiner ble eluert med en lineær NaCl gradient på fra 0 til 400 mM (21 for 250 ml resin). Fraksjoner ble analysert for MCP-aktivitet og aktive fraksjoner ble oppsamlet og utsatt for felling med (NIL^SC^ ved 80 % metning. Utfelte proteiner ble oppsamlet ved sentrifugering, resuspendert i homogeniseringsbuffer og lastet på en Sefakryl S300HR kolonne (500 ml resinvolum) som hadde blitt standardisert for anvendelse av bovint serumalbumin (68 kDa). En enkel topp av MCP-aktivitet ble eluert med en molekylvekt på -650 kDa. Dette preparatet var fritt for andre målbare protolytiske aktiviteter og beholdt sin MCP-aktivitet etter lagring ved 4 °C i mer enn 6 måneder. Dette preparatet ble benyttet for de fleste eksperimentene. Videre fraksjonering av prepareringen på en hydroksyapatit-Ultrogel kolonne (Yamamoto et al., supra) ga et høyere renset enzym som ifølge denaturerende SDS-polyakrylamid gel elektroforese besto av de forventede >10 subenhetene i området Mr fra 20 til 35 kDa.
Eksempel 2
Analyse for chymotrypsin-lignende og trypsin-lignende aktiviteter til MCP Prosedyren for MCP isolering beskrevet ovenfor genererte et enzymkompleks hvis proteolytiske aktivitet var latent, men kunne bli aktivert med tilsetting av lave konsentrasjoner (0.02 - 0.05 %) SDS (Yamamoto et al., supra). Chymotrypsin-lignende aktivitet ble analysert ifølge den følgende prosedyre: i en 96 brønners mikrotiter plate ble humant MCP fortynnet 4-10 ganger i homogeniseirngsbuffer inneholdende 0.04 % SDS. Et kolorimetrisk substrat MeOSuc-EVKM-para-nitroanilid (metoksysuccinyl-Glu-Val-Lys-Met-pNa), anskaffet fra Bachem Bioscience Inc., King of Prussia, Pennsylvania ble tilsatt til en endelig konsentrasjon på lOOuM fra en stamoppløsmng av 10 mM i dimetylsulfoksyd. Reaksjonsvolumet var 200ul pr. brønn. Etter inkubering i flere perioder ved 37 °C ble konsentrasjonen av fri pNa bestemt på en Biotech EL-340 mikroplate leser, ved lesing av absorbsjon ved 490 nm. Proteaseaktiviteten ble bestemt under betingelser hvor substrat hydrolyse øket lineært med tid og forandringen i absorbans var proporsjonal med konsentrasjonen av fri pNa. Alternativt, ble fluorgen-substrat benyttet, metoksysuccinyl-Phe-Leu-Phe-amidometyhlcoumarin (Enzyme Systems Products, Dublin, CA) og en forandring i fluoressens målt ved en eksitering ved 390 nm og en emisjon ved 460 nm.
Trypsinlignende aktivitet av humant MCP ble analysert som beskrevet ovenfor med de følgende modifikasjoner. Reaksjoner ble utført i tris-glycerol buffer (pH 9.5), tilsatt 1 mM 2-merkaptoetanol, og substratet var et fluorgent substrat, benzyloksykarbonyl-Phe-Arg-AMC (100 uM).
Etter inkubering i forskjellige tidsperioder ved 37 °C ble konsentrasjonen av fri AMC .. bestemt på et Fluoroskan II spektrofluorimeter med et eksitasjonsfilter på 390 nm og et emisjonsfilter på 460 nm. Proteaseaktivitet ble bestemt under betingelser i hvilket substrathydrolyse øket lineært med tid og forandringen i fluoressens var proporsjonell med konsentrasjonen av fri AMC.
Eksempel 3
Bestemmelse av IC50 verdier for MCP-inhibitorer.
IC50 verdier er typisk definert som konsentrasjon av en forbindelse (i dette tilfelle, den beskrevne MCP-inhibitor) som er nødvendig for å gi 50 % inhibering av enzymets aktivitet. IC50 verdier er nyttige indikatorer for aktiviteten av en forbindelse for dets beregnede anvendelse. Fortrinnsvis, har inhibitorene ifølge oppfinnelsen IC50 verdier på mindre enn omkring 10 mikromolar.
Inhibering av chymotrypsinlignende eller trypsinlignende aktivitet av MCP ble bestemt ved inkubering av enzymet med forskjellige konsentrasjoner av aktuelle inhibitorer i 15 minutter ved 37 °C før tilsetting av substrat. Hver eksperimentelle tilstand ble evaluert i triplikat, og replikate eksperimenter ble utført for inhibitorer beskrevet heri.
Eksempel 4
Demonstrasjon av inhibering av cellulær muskelnedbryting:
Inhibering av avlastningsatrofi hos juvenilrotter.
Effekten av forskjellige inhibitorer på avlastningsatrofi av soleus muskelen i juvenilrotter ble bestemt. Se Tischler, M.E. (1990) Metabolism 39/7: 756-763 (heretter "Tischler-1990") for en generell diskusjon av prosedyren.
Juvenile hunkjønn Sprague-Dawley rotter (80-90 g) ble haleforbundet, baklemmen suspendert som i Jaspers, S.R. og Tischler, M.E., (1984) J. Appl. Physiol. 57: 1472-1479. Dyrenes baklemmer ble hevet over gulvet i buret og hvert dyr var huset individuelt. Dyrene hadde fri tilgang til mat og vann og ble veid ved tid for opphenging og ved terminering. Under opphengingsperioden ble dyrene sjekket daglig for å sikre at deres tær ikke rørte gulvet i buret og at det ikke var noen oppsvelling av halen på grunn av oppbindingen.
A. Eksperimentell utforming - del 1.
Hvert eksperiment startet med opphengning av 20 rotter som ble tilfeldig oppdelt i 4 grupper på 5 dyr hver. Gruppe A ble opphengt i kun 2 dager og ga basislinjedata for å sammenligne soleus muskelstørrelse for andre dyr opphengt i lengere tid. Gjennomsnittlig kroppsvekt for hver gruppe som angitt i studien, ble sammenlignet og benyttet som en korreksjonsfaktor for kroppsstørrelsesforskj eller. Gruppe B var en andre kontrollgruppe som hadde fått soleus i en lem behandlet med en vandig oppløsning mersalyl etter to dager avlastning for å demonstrere evnen til å senke muskelatrofi under avlastning, for hver gruppe dyr. Mersalyl hadde blitt tidligere studert og vist å forhindre atrofi i en in vivo modell hovedsakelig som beskrevet i protokollen benyttet heri. Se Tischler - 1990. To dager etter avlastningen startet ble en vandig oppløsning av mersalyl (200 nM; 4 p.1/100 g initiell kroppsvekt) injisert inn i en soleus, som beskrevet tidligere. Den kontralaterale muskel ble injisert med tilsvarende volum 0.9 % saltvann ("Bæreren"). Dyrene ble holdt under Innovar-vet (10 (al/100 g kroppsvekt) beroligende middel under in situ injeksjonsprosedyren. Etter injeksjonene ble dyrene opphengt i ytterligere 24 timer og soleus fjernet. Gruppe C og D for hvert eksperiment ble benyttet for test av hver av de to forskjellige utførelsesformene av de beskrevne forbindelser. Dyrene ble behandlet som i gruppe B, bortsett fra at 1 mM MCP-inhibitor, inneholdt dimetylsulfoksyd (DMSO), ble injisert inn i soleus i en fot og kun DMSO inn i den kontralaterale soleus. Hvert eksperiment besto således av to kontrollgrupper og utprøvingen av MCP-inhibitorer ifølge oppfinnelsen. Fullførelsen av fem slike eksperimenter med forskjellige par inhibitorer sørget for en "n" verdi på 10 for testing av hver MCP-inhibitor og med hver testet i to forskjellige forsendelser av dyr.
B. Prosessering av soleusmuskel - Del 1.
Etter at dyrene var avlivet, ble soleus skåret ut, frigjort fra fett og bindevev og forsiktig veid. Muskelen ble så homogenisert i 10 % trikloreddiksyre (TC A) og utfelt protein pelletert ved sentrifugering. Pelleten ble så vasket en gang med 10 % TC A og en gang med etanol.eter (1:1). Den endelige pelleten ble oppløst i 4 ml 1 N natriumhydroksyd. Prøven ble så analysert for proteininnhold ved biuret-prosedyren ved anvendelse av albumin som standard.
C. Dataanalyse - Del 1.
Effekten av MCP-inhibitorer på total muskelproteininnhold ble undersøkt primært ved parvis sammenligning med den ubehandlede kontralaterale muskel. Forholdet av innholdene ble beregnet og så analysert statistisk med variansanalyse ("ANOVA"). Venstre ben var alltid det behandlede benet slik at proteininnholdforhold kunne bli sammenlignet både med de ikke-behandlede kontrolldyr. På denne måten kan en signifikant forskjell bli vist ved sammenligning av proteininnholdet i de to benene, såvel som den relative effektiviteten til de testede MCP-inhibitorene. En paret student-test ble utført for effekten av hver separate behandling. Data for ikke-behandlet kontroll ga også et estimat av proteininnhold på dag 2. Dette tillater tilnærming av proteinforandring over 24 timers behandling for hver av gruppene B, C og D.
D. Eksperimentell utførelse - Del 2.
Hvert eksperiment besto av 10 dyr hvor grupper av 5 dyr ble testet med en inhibitor på dens effekt på proteinsyntese. Kontrolldyr var ikke nødvendig for dette aspektet av studien ettersom den kontralaterale DMSO behandlede muskelen tjente som en parvis kontroll for den inhibitorbehandlede muskelen. Hver gruppe ble injisert som beskrevet for gruppe C og D i del 1. 24 timer etter in situ behandling ble det fraksjonelle forholdet av proteinsyntese analysert i begge soleus muskler. Hver muskel ble injisert med 0.9 % saltvannsoppløsning (3.5 (j.1/100 g endelig kroppsvekt) inneholdende <3>H-fenylalanin (50 mM; 1 uCi/ul). 15 minutter senere ble midterste 2/3 av muskelen skåret ut og muskelen ble behandlet som beskrevet nedenfor.
E. Prosessering av soleus muskelen - Del 2.
Muskelen ble først vasket i 10 minutter i 0.84 % saltvann inneholdende 0.5 mM cyklo-heksimid, for å terminere proteinsyntesen, og 20 mM cykloleucin for å fange fenylalanin i cellen. Muskelen ble så homogenisert i 2.5 ml iskaldt 2 % perklorsyre. Det utfelte protein ble pelletert ved sentrifugering. En aliquot av supernatanten ble tatt for væskescintillasjonstelling og en annen aliquot ble prosessert for omdanning av fenylalanin til fenetylamin for å bestemme den oppløselige fenylalaninkonsentrasjonen fluorometrisk. Se Garlick, P.J. et al., Biochem. J., 192 719-723 (1980) og Munoz, K.M. et al., 1993 Meatbolism, under trykking. Disse verdiene gir den intracellulære spesifikke aktiviteten. Den spesifikke aktiviteten til fenylalanin i muskelprotein ble bestemt etter hydrolysering av proteinen ved oppvarming i 6 N HC1. Aminosyrene frigitt ble oppløst i buffer. En aliquot ble tatt for scintillasjonstelling og en annen for analyse av fenylalanin som for supernatantfraksjonen. Det fraksjonelle forholdet av proteinsyntese ble beregnet som: protein spesifikk aktivitet/intracellulær spesifikk aktivitet x. tid.
F. Data analyse - Del 2.
Analyser av proteinsyntese var på en paret basis for hver MCP-inhibitor. Studentpar t test sammenligninger av kontralaterale muskler bestemte om det var noen effekt på inhibitoren på proteinsyntesen. Protein-nedbryting kan bli beregnet tilnærmet som fra det fraksjonelle forholdet av proteinsyntese (fra del 2) pluss det fraksjonelle forholdet av proteintilvekst.
Kvantitativt, indikerer evnen av MCP-inhibitorer å redusere proteintapet uten å påvirke proteinsyntesen, en reduksjon av proteindegraderingen.
G. Resultater.
Tabell 1 viser den manglende effekt av MCP-inhibitorer på kontrollmuskel.
Tabell 2 viser forandringer i proteininnhold i løpet av den tredje vektløse dag.
Tabell 3 viser effekten på MCP-inhibitorer på ubelastet muskelprotein.
Tabell 4 viser effekten på MCP-inhibitorer på ubelastet muskelsyntese.
I tabellene, refererer forbindelsenummer til eksempelnummer hvor synteseveien for forbindelsene er angitt.
Eksempel 5
Demonstrasjon av MCP inhibering ved anvendelse av MHC-1 prosessering. Forbindelser ifølge oppfinnelsen ble analysert for evnen til å hemme prosessering av eksogent OVA-antigen med en klasse I hovedhistokompatibilitetsveien (MHC-I). MCP-inhibitorene ble benyttet for funksjonelt antigen prosesseringssystem som muliggjør inkludering av inhibitoren i den antigen prosesserende cellen under eksponering for antigenet, fulgt av fiksering av den prosesserende cellen. T celle hybridomas ble så tilsatt til de prosesserende cellene i fravær av inhibitor for å bestemme ekspressjon av peptid-MHC-I komplekser som reflekterer antigen prosessering før fiksering.
A. Cellekultur.
Celler ble dyrket ved 37 °C i en fuktig atmosfære holdt ved 5 % CO2 i et standard
medium: DMEM (Gibco, St. Louis, MO) med 10 % fetalt kalveserum (Hyclone, Logan UT), 5 x 10"<5>M 2-merkaptoetanol, antibiotika og de følgende tilsetninger: L-arginin HC1 (116 mg/L), L-asparagin (36 mg/L), NaHC03 (2 g/L), natrium pyruvat (1 mM). Se også Harding, C.V., (1992) Eur. J. Immunol. 22: 1865-1869. M12.B6 celler (generøs gave fra Osami Kanagawa, Washington University, St. Louis, MO) ble benyttet for antigen
representering; de ble dannet ved rasering av M12.C3 murin B lymfoma celler med LPS-stimulerte spenocytter (kilde for B lymfoblasta) fra en C57BL/6 mus. Følgelig uttrykker de H-2b antigenene. DOWB T hybridoma celler er spesifikke for OVA (323-339) peptid bundet til enten I-Ab eller I-Ad. Se Yewdell et al., Science 1988 239:637. B3.1 T hybridoma celler responderer for OVA (258-276)-Kb.
B. Elektroporering av antigen prosesseringstudier
For å bli prosessert og presentert ved MHC-1 veien, må eksogent antigen (ovalbumin; OVA) bli penetrert inn i cytosol i de prosesserende cellene. OVA ble introdusert i cytosol til prosesserende celler (M12.B6 celler) ved hjelp av elektroporering.
Elektroporering ble utført med en Gibco Bel elektroporator ved bruk av cuvette kammeret med 0.4 cm gap. Kapasitans var 800 uF og spenningen var 50 - 300 V. Elektroporering ble utført i serumfritt RPMI eller PMEM (Gibco) med 1.5 x 10<7 >M12.B6 celler/ml (0.5 x IO<7> - 4.0 x IO<7> området) i nærvær av OVA ved 4 °C. Cellene ble umiddelbart plassert på is. Forskjellige inhibitorer ble så tilsatt og cellene ble overført til 18 °C eller 37 °C. Endelig ble cellene forsiktig fiksert i omkring 10 minutter med 1 % paraformaldehyd og vasket grundig ved 37 °C for å hindre ytterligere prosessering. Graden av prosessering (dvs. nivået av spesifikk peptid-MHC komplekset uttrykt) ble bestemt ved evnen av M12.B6 celene til å stimulere i IL-2 sekresjonen ved B3.1 or DOBW T hybridoma celler. T celler (IO<5>) ble utsådd med M12.B6 celler (2 x IO<5> dersom fiksert, 5 x IO4hvis fri) i 0.2 ml i 18 - 24 timer ved 37 °C i et IO<2> kammer. Begge T hybridomas responderte for antigenstimulering ved sekresjon av IL-2 (analysert i supernatantene ved IL-2-avhengig CTLL celleproliferasjon og [H<3>] tymidin-inkorporering. Se Allen et al., J. Imunol. 132:1077).
Resultater av disse studiene er vist i fig. 1-3. Fig. 1 viser effekten av forbindelsene 14 og 16 på prosessering av elektroporert OVA ved M12.B6 celler. Figurene 2 og 3 viser effekten av forbindelsene 14 og 20 på en MHC-1 OVA prosessering. Begge forbindelsene hemmer effektivt OVA prosessering. Disse data gir ytterligere støtte for MCP inhibitorisk effekt av forbindelsen ifølge oppfinnelsen. Det er akseptert at den klassiske MHC-I veien omfatter antigen degradering av proteasomer. Se Goldberg et al., supra. Forbindelsene kan således bli benyttet for videre å forstå viktigheten av den protolyttiske prosesseringen av antigener.
Eksempel 6
A. Reduksjon av Cu/Zn superoksyd dismutase (SOD-1) degradering
I. Del 1 - Kloning og mutagenese.
En mus SOD-1 cDNA klone ble anskaffet fra Jim Mahaffey (North Carolina State University, Raleigh, NC). Denne klonen ble modifisert ved polymerase kjedereaksjon (PCR) metoder for å innlemme 1) et Kozak translasjonsinitieirngskonsensussignal (dvs. 5'-GCCGCCACC-3') direkte oppstrøms fra ATG startkodonet, 2) et Hind in restriksjonssete 5' for dette konsensussignalet og 3) et Xho I restriksjonssete ved 3' terminalen av cDNA. Oligonukleotidprimerne benyttet for PCR prosedyrene var: 5' primer (EH87) = 5 '-TCGATCGAAGCTTGCCGCCACCATGGCGATGAAAGC-L3'
(SEQ ID NO:l), 3' primer (EH88) = 5'-AGCTAGCCTCCAGCAGATTACAGTTTAATG-3' (SEQ ID NO:2). Det
resulterende PCR produkt ble kurtet med restriksjonsenzymer Hind III og Xho I og klonet i Hind Ul + Xho I kuttet vektor pBluescript II SK+ (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) for å gi pSK-HX2.
FALS punktmutasjonene ved aminosyre 4 (Ala<4->»Val) (GCG->GTG) og aminosyre 113 (Ile113->Thr) (ATT->ACT) ble introdusert i SOD-1 cDNA klone pSK-HX2 anvendelse av overlapps ekstensjons PCR mutageneseprosedyren beskrevet av Ho et al., Gene 77: 51-59 (1989). Ile<113->»Thr mutant ble konstruert som følger: 5' PCR fragmentet ble generert ved anvendelse av 5' primeren EH78; bestående av nukleotidsekvensen 5'-TTAATCCTCACTCTAAGAAAC-3' (SEQ IDNO:3)
(nukleotider 193 til 213 av SODI cDNA hvor #1 er A i ATG start kodon) og 3' primeren EH84; bestående av nukleotidsekvensen 5'-TTGTACGGCCAGTGATGGAATGCT-3' (SEQ ID NO:4) (nukleotider 351 to 328), 3' PCR fragmentet var konstruert ved anvendelse av 5' primeren EH83; bestående av nukleotidsekvensen 5 '-AGCATTCCATCACTGGCCGTACAA-3' (SEQ ED NO: 5)
(nukloetider 328 til 351) og 3' primeren EH42; bestående av nukleotidsekvensen 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3' (SEQ ID NO: 6) (nukleotider 626 til 645 av pBluescript IISK+). Femti nanogram av både 5' og 3' PCR fragmentene ble kombinert i det andre trinnet PCR reaksjonen og forsterket ved anvendelse av primere EH78 og EH42. Dette PCR produktet ble kuttet ved Bal I og Xho I og klonet inn i Bal I + Xho I kuttet pSK-HX2 for således å erstatte det native 255 bp Bal I/Xho I fragmentet med et FALS mutant fragment (klone pSK-113).
Ala<4->»Val mutanten ble konstruert som følger: 5' PCR fragmentet ble generert ved anvendelse av 5' primer EH105; bestående av nukleotidsekvensen 5'-GCACACCACTTTCATCGCCATGGTGGCGGCAAGCTTCGATC-3' (SEQ ID NO: 7) (nukleotider +21 til -21) og 3' primeren E41; bestående av nukleotidsekvensen 5'-ATTAACCCTCACTAAAGGGA-3' (SEQ ID NO: 8) (nukleotider 792 til 773 av pBluescript IISK+). 3' PCR fragmentet ble generert ved anvendelse av 5' primeren EH104, bestående av nukleotidsekvensen 5'-GATCGAAGCTTGCCGCCACCATGGCGATGAAAGTGGTGTGC-3' (SEQ ID NO: 9) (nukleotider -20 til +21) og 3' primeren EH103; bestående av nukleotidsekvensen 5'-CTTCAGTTAATCCTGTAA-3' (SEQ ID NO: 10) (nukleotider 123 til 106). Som ovenfor, ble 50 ng av både 5' og 3' PCR fragmentene kombinert i den andre trinns PCR reaksjonen som ble forsterket ved anvendelse av primere EH41 og EH103. Dette PCR produktet ble kuttet med Hind Ul og Rsr II og klonet inn i Hind III + Rsr II kuttet pSK-HX2 for således å erstatte det native 51 bp Hind III/Rsr II fragmentet med FALS mutantfragmentet (klone pSK-A4V). Alle PCR produktene beskrevet ovenfor ble sekvensert ved anvendelse av sekvenasemetoden (US Biochemical, Cleveland, OH) for å bekrefte nærværet av mutasjoner og fraværet av PCR feil. En illustrasjon av SOD-1 genet som definerer lokaliseringen av mutasjonene, primere og restriksjonsseter, er vist i fig. 4.
SOD-1 cDNA ekspressjonsvektorene ble konstruert ved kutting av vill-type (pSK-HX2) og mutantkonstrukte (pSK-113 og pSK-A4V) med Hind Ul og Xho I. Hver av de tre
resulterende 546 bp fragmentene som inneholder SOD-1 cDNA sekvensene, ble separat klonet inn i Hind HI + Xho I kuttet pcDNA I/Neo (Invitrogen Corp., San Diego, CA) for å gi henholdsvis pCMV-HX5 (vill-type SOD), pCMV-113 (Ile<113->»Thr) og pCMV-A4V (Ala<4->»Val).
II. Del 2.
Initielle eksperimenter ble utført for. å bestemme om den reduserte stabiliteten til FALS mutant SOD-1 proteinene var på grunn av MCP-mediert proteolytisk degradering. Den humane nyrecellelinjen betegnet 293 (human 293 celler eller 293 celler) ble anskaffet fra the American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852 ATCC#CRL 1573) og dyrket i Dulbecco's modifiserte Eagles medium med 4.6 g/l glukose, 10 % varmeinaktivert serum (Gibco/Life Technologies Inc. Gaithersburg, MD). De humane 293 cellene ble opprettholdt ved 37 °C i en atmosfære ved 5 % C02. 293 cellene ble transient transfektert ved anvendelse av kalisiumfosfat-metoden (Chen, C. et al., Biotechniques 6: 632 (1988). pCMV-113 SOD-1 ekspressjons vektoren ble innført i 293 cellene og 24 timer senere ble cellene inkubert med enten forbindelse 34, forbindelse 14 eller forbindelse 24, alle med en konsentrasjon på 5 |jM, for en varighet på 24 timer. Den kjente MCP og andre proteaseinhibitoriske forbindelser ble oppløst i dimetylsulfoksyd (DMSO). Andre 293 cellekulturer ble inkubert med et like stort volum DMSO og plassert medium kun som negativ kontroll.
Omkring 48 timer før mottagelse av testeforbindelser, ble 5 x 10<5> 293 celler utsådd i 36 mm skåler og holdt ved 37 °C i en atmosfære av 5 % C02. Celler ble inkubert med MCP inhibitorer (forbindelse 34,14 eller 24) eller med DMSO som negativ kontroll i en varighet på 24 timer. Cellelysata ble så preparert ved lysering av cellene i omkring 75 [ i 1 fosfatbufret saltvann (PBS) ved fryse/tinesyklisering. Proteinkonsentrasjoner av cellelysatene ble bestemt ved anvendelse av BCA metoden (Pierce, Rockford, IL) og 2 til 2,5 [ ig av hver prøve ble elektroforisert på en 4 - 20 % polyakrylamid gel (Novex, San Diego, CA) ved bruk av et tris/glycin/SDS (25 mM Tris/192 mM glycin/0.1 % SDS) buffersystem. Proteiner ble overført til nitrocellulosefiltere ved elektroeluering og filteret ble blokkert ved inkubering i blottooppløsning (5 % tørrmelk i 25 mM tris-bufret saltvann (lx TBS)) i 30 minutter. Filtere ble overført til primær antistoffoppløsning (1:10.000 fortynning i blottooppløsning) og inklubert i 2 - 18 timer. Primærantistoffet benyttet i denne studien var polyklonalt kanin antiserum mot renset mus SOD-1 produsert i E. coli (Hazelton Research Products, Denver, PA). Filterne ble vasket tre ganger i 5 minutter hver i 1 x TBS og inkubert i en sekundær antistoffoppløsning (1:2.000 oppløsning i blottooppløsning) i 2 timer. Det sekundære antistoff var geit anti-kanin IgG konjugert til alkalisk fosfatase (Bio-Rad, Richmond, CA). Filtere ble vasket tre ganger, hver gang 5 minutter 1 x TBS og farget for alkalisk fosfataseaktivitet ved inkubering i 5 - 60 minutter i kommersielt tilgjengelig alkalinfosfatasedetekterings-reagens (Bio-Rad, Richmond, CA). Fargede bånd tilsvarende SOD-1 protein ble kvantifisert ved anvendelse av DucoGel V bildeanalysesystem og RFLPscan software (Scanalytics, Billerica, MA). Nivåer av SOD-1 er uttrykt som enheter for induksjon i forhold til negativ kontroll (dvs. eksperimentelle enheter delt på kontrollenheter). Immunoblotanalyse av cellelysater avslørte at SOD-1 nivåer ble moderat forhøyet sammenlignet med de til kontroller i hver av de tre prøvene inkubert i nærvær av MCP inhibitorer (Fig. 5). Disse resultatene viser at hemming av MCP ved forbindelsene ifølge oppfinnelsen fører til øket akkumulering av SOD-1 protein i Ile<113->>Thr mutanten og derved implikerer MCP som ansvarlig for de reduserte nivåene av SOD-1 i cellene inneholdende FALS mutasjonen.
III. Del 3.
For ytterligere å vise at MCP aktiviteten er ansvarlig for SOD-1 omsetningen, ble studier utført på en cellelinje som stabilt produserte vill-type mus SOD-1 eller FALS mutant proteiner, dvs. Val i stedet for Ala<4> og Thr i stedet for Ile113. Cellelinjer som stabilt uttrykte mus nativt SOD-1 og de to FALS mutant SOD-1 proteinene nevnt ovenfor, ble avledet med kalsiumfosfattransfeksjon (Chen, C. et al., Biotechniques 6:632 (1988)) av 293 celler med SOD-1 cDNA ekspressjonskonstrukter (beskrevet ovenfor) fulgt av seleksjon for neomycin resistans ved vekst i nærvær av 1 mg/ml G418 (Geneticin™, Gibco/Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD). Celler ble opprettholdt i G418 seleksjon tre uker ved hvilken medikamentseleksjonen ble fjernet og G418 resistent kolonier i hver transformerte celletype ble oppsamlet for ytterligere vekst. Forbindelse 14 ble benyttet i disse studiene.
Cellelinjer som uttrykte de angitte SOD-1 isoformene, inkubert med forskjellig konsentrasjoner av forbindelse 14 i 24 timer, ved hvilken SOD-1 nivåene ble målt ved densitometrisk scanning av immunoblot. Nivåer av SOD-1 er uttrykt som enheter av induksjon i forhold til prøver fra negative kontroller (som ovenfor) og hvert datapunkt er gjennomsnitt av tre eksperimenter. Doseresponsanalyser av forbindelse 14 indikerer at indusering av de transformerte cellene med denne MCP inhibitoren fører til signifikant akkumulering av SOD-1 proteinnivå, hvor maksimal akkumulering opptrer i de cellene inkubert med forbindelse 14 ved en konsentrasjon på omkring 20uM (fig. 6). Videre, korrelerer størrelsesorden av SOD-1 akkumulering med estimert halveringstid til forskjellige SOD proteiner; villtype SOD-1 er mest stabile og Ala<4->>Val er den minst stabile (Borchelt D.R. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. 91: 8292-8296 (1994)). Disse data er i samsvar med hypotesen av FALS mutasjonene destabilisert SOD-1 med proteinene, muligens på grunn av gal folding, og som et resultat av strukturelle endringer som resultat av mutasjonsmålene på disse proteinene for degradering av MCP. Disse resultatene demonstrerer at forbindelse 14 har statistisk signifikant effekt på omsetningen av vill-type SOD-1 protein og støtter videre rollen til MCP i SOD-1 gradering.
IV. Del4.
For å demonstrere spesifisiteten til MCP-aktivitet i SOD-1 omsetning (og kutte ut mulig involvering av andre viktige proteolyttiske veier, slik som den kalsiumaktiverte proteasen kalpain og de lysosomale proteasene), ble det utført eksperimenter hvor to transformerte cellelinjer (beskrevet ovenfor, en produserende villtype protein og den andre SOD-1 proteinet, med Ala4-*Val mutasjonen), ble inkubert med forskjellige proteaseinhibitorer, hver av hvilke er spesifikke for en unik protolyttisk aktivitet: Forbindelse 14 hemmer MCP; "Calpeptin" (Novabiochem USA, La Jolla, CA, eat no. 03-034-0051; CBZ-Leu-Nle-aldehyd, Biochem. Biophys. Res. Comm. (1988) 153: 1201), en celle penetrerende "kalpain" inhibitor (kalpain er cysteinprotease); og DK-3 (Enzyme Systems Products, Dublin, CA CBZ-Phe-Ala-CHN2) hemmer lysosomal proteaseaktivitet. I tillegg, ble celler inkubert med forbindelse 16 som er en mindre kraftig MCP inhibitor sammenlignet med den spesielt foretrukne forbindelsen ifølge oppfinnelsen, dvs. forbindelse 14. Cellelinjen som uttrykker de indikerte SOD-1 isoformer, ble inkubert i 24 timer med de følgende proteaseinhibitorene: Forbindelse 14, 20 pM; kalpeptin, 10 uM; DK-3, 5 pM; Forbindelse 16,20 p.M; eller med DMSO som negativ kontroll. Etter 24 timers inkubering med inhibitorene, ble SOD-1 nivåene målt ved densitometrisk scanning av immunoblot. Nivåer av SOD-1 er uttrykt som enheter av induksjon i forhold til ikke behandlede prøver, som ovenfor. Hvert eksperimentelle punkt er gjennomsnittsresultat av tre eksperimenter.
Resultater er uttrykt i figur 7. Det kan bli sett at ved omsetningen av Ala<4->>Val mutant SOD-1 er en funksjon av MCP aktiviteten kun den spesifikke hemmingen av MCP ved den foretrukne forbindelsen 14 fører til en signifikant (tre-ganger) økning i akkumuleringen av SOD-1 protein. Inkubering med inhibitorer av kalpain eller lysosomal proteaser hadde ingen merkbar effekt på SOD-1 omsetningen. Videre, resulterte behandling med forbindelse 14 i en svak økning av villtype SOD-1 akkumulering, et funn også observert tidligere i doseresponsstudiene. Sett sammen, demonstrerer disse studiene at MCP aktiviteten helt er kritisk for SOD-1 omsetning i de transformerte 293 cellelinjene og at inhibering av MCP ved forbindelse 14 fører til en økning av SOD-1 protein i cellen.
Syntese av inhibitorer
Nedenfor fremskaffes eksempelvise syntetiske veier for fremstilling av forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse. Andre synteseprotokoller, såvel som modifikasjoner av de følgende synteseskjemaene, vil være opplagte for fagmannen som er utstyrt med foreliggende beskrivelse.
Inhibitorene ifølge oppfinnelsen omfatter amidbindinger som kan bli innført ved velkjente syntetiske prosedyrer ved anvendelse av oppløsningsfaseteknikken beskrevet i The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Volume I (1979), eds. Gross, et al, Academic Press og beskrevet i detalj i Eksemplene 8-11 nedenfor.
Inhibitorene kan bli fremstilt med de separate syntesene og kobling av fragmentene:
(Koblingsprosedyre I) som beskrevet i Eksemplene 14-38.
Alternativt, kan de bli fremstilt med separate synteser og kobling av fragmentene;
(Koblingsprosedyre II) som beskrevet i Eksemplene 39-42 nedenfor.
Når substituenten Q inneholder en aldehydgruppe (dvs. når H2N-R4 er et aminoaldehyd avledet fra en aminosyre, f.eks. H2N-CH(CH2R7)-CHO), kan ønskede acetalbeskyttede aminoaldehydet bli syntetisert som beskrevet av Gacek, et al. Tetrahedron, 30,4233
(1974) eller som beskrevet i Eksempel 12. Etter at koblingen er fullført (via Koblingsprosedyre I eller II), kan de acetalbeskyttede gruppene bli fjernet som beskrevet i Eksempel 11 (Metode E) for å frigi den fri aldehydgruppen. Når Q er et metylketon eller et diazo-, bromo- eller klormetylketon (dvs. når H2N-R4 er et alfaaminosubstituert metylketon eller et alfadiazo-, brom- eller klormetylketon avledet fra en aminosyre), er Koblingsprosedyre II spesielt anvendelig. Hydrokloirdsaltet av klormetylketonet kan bli anskaffet (Bachem Bioscience Inc., King of Prussia, Pennsylvania) eller kan bli fremstilt ved omdannelsen av den Boc-beskyttede aminosyren til et blandet karbonisk anhydrid fulgt av reaksjon med diazometan for å gi diazometyl keton. Brom- og klormetylketoner ble fremstilt ved reaksjon av diazometyl-ketonet med hydrogenbromid eller -klorid som beskrevet av Kettner, et al. Arch. Biochem. Biophys. 162, 56(1974), Fittkau, J. Prakt.Chem. 315,1037 (1973) eller Zimmerman, et al. PCT WO 95/15749 publisert 15. juni 1995.
De tilsvarende metylketonene kan bli fremstilt ved hydrogenolyse av klormetylketonet som beskrevet av Kettner, et al. U.S. Patent 4.652.552.
Når Q er et alfadifluormetylketon, kan det tilsvarende l-amino-3,3-difluor-2-propanol bli fremstilt og koblet ved Koblingsprosedyre II og den resulterende difluoralkohol oksydert til difluorketonet ved prosedyren beskrevet av Trainor and Stein, U.S. Patent 4.923.890.
Når Q er et trifluormetylketon (dvs. hvor H2N-R4 er et aminosyreavledet trifluormetylketon, f.eks. H2N-CH(CH2-R7)-COCF3), kan det nødvendige ketonet bli fremstilt som beskrevet av Imperiali og Abeles, Biochemistry 25,3760 og supplementerende sider
(1986).
Når Q er et monofluormetylketon (dvs. hvor H2N-R4 inneholder en fluormetylketon-gruppe, f.eks. H2N-CH(CH2-R7)-COCH2F) avledet fra en aminosyre, kan det nødvendige keton bli fremstilt ved prosedyre ifølge Palmer i EP PS 442.754 ved anvendelse av den Boc-beskyttede aminosyren og magnesium benzyl fluormalonat. Etter fjerning av de Boe beskyttede gruppene, kan aminet bli koblet ved anvendelse av Koblingsprosedyre II. Alternativt, kan monofluormetylketonet bli fremstilt ved oksydering av en tilsvarende alkohol som beskrevet i Eksempel 42.
Når Q er et boraminosyrederivat (dvs. Q = -B(OH)2 eller dets cykliske ester), blir den cykliske esteren fremstilt hovedsakelig som beskrevet av Shenvi, U.S. Patent 4.537.773 og etter kobling ved Koblingsprosedyre II, kan eventuelt bli omdannet til den fri peptidborsyren som beskrevet av Shenvi og Kettner i U.S. Patent 4.499.082 og 5.187.157 og i J. Biol. Chem. 259,15106 (1984).
Når Q er et alfa-diketon eller alfaketoester (dvs. Q = -C(=0)C(=0)R7 eller
-C(=0)C02R7) kan de nødvendige aminodiketonene eller alfaketoestere, bli fremstilt som beskrevet av Angelastro, et al, J. Med. Chem. 33,13 (1990) og referansene deri. Alfaketoesterne kan bli hydrolysert eller amidert for å produsere tilsvarende alfaketosyrene eller amidene. Alfaketoamidene kan også bli fremstilt for kommersielt tilgjengelig Boc-beskyttede aminosyrene ved modifikasjoner av prosedyren til Harbeson, et al. J. Med. Chem. 37,2918-2929 (1994). I denne siste meget nyttige prosedyren, blir den Boc-beskyttede aminosyren sekvensielt omdannet til et N, O-dimetylhydroksylamid, et aldehyd, et cyanohydrin, et alfahydroksykarboksylat og et alfahydroksykarboksamid:
hvor R<1> =Boc-NH-CH(CH2R7)-.
Boe gruppen blir fjernet under sure betingelser og etter nøytralisering blir den fri aminnosyreresten koblet som i en Koblingsprosedyre II for å gi et alfahydroksykarboksamid som så ble oksydert for å gi alfaketokarboksamid-inhibitoren:
Eksempel 7
Metode A: Blandet anhydridmetode:
Skjema:
X = fluorenylmetyloksykarbonyl (Fmoc) - eller t-butyloksykarbonyl (Boc)-gruppe; Y = acetal eller annen beskyttende gruppe for aminoaldehydet
AAi = aminosyre
AA2 = aminoaldehyd
N-metylmorfolin (NMM) (1 ekvivalent) ble tilsatt til en omrørt oppløsning av den beskyttede aminosyren i tetrahydrofuran (THF). Blandingen ble avkjølt til -15 °C, behandlet med isobutyl kloroformat (D3CF) (1.1 ekvivalent), og reagert i 10 minutter. Deretter ble aminoaldehydkomponenten i form av den frie basen, tilsatt fulgt av NMM (1.1 ekvivalent, 2.2 ekvivalenter dersom syresalt) Omrøring ble fortsatt i 13 minutter med -15 °C og ved romtemperatur i 3 - 4 timer. Reaksjonsblandingen ble oppløst i 150 - 200 ml etylacetat (EtOAc). Den resulterende oppløsning ble suksessivt vasket med vann, 5 % natriumhydrogenkarbonat (NaHC03), 2 % vandig sitronsyre og til sist vann. Det organiske laget ble tørket over vannfri natriumsulfat (Na2S04) eller magnesiumsulfat (MgS04), oppløsningsmiddel ble fjernet under redusert trykk og det således oppnådde produktet ble triturert med petroleumseter. Det således oppnådde faste peptidet ble filtrert fra, tørket og karakterisert.
Eksempel 8
Metode B: Fmoc-gruppe av beskyttelsesprosedyre:
Skjema:
Det Fmoc beskyttede peptidet (0.2 til 4 mmol) i en blanding av 30 % dimetylformamid (DMF) i etylacetat (EtOAc) ble behandlet med et 50 - 60 ganger overskudd av dietylamin (DEA) i 2 timer ved romtemperatur. Oppløsningsmiddel ble avdampet under redusert trykk ved 30 °C og petroleumseter ble tilsatt til resten. Når et presipitat ble dannet, ble det filtrert og tørket. I andre tilfeller ble den resulterende gummi gjentatt triturert med petroleumseter og gummi ble lagret under vakuum.
Eksempel 9
Metode C: Kappegruppe eller aminosyretilsetning til peptidet:
Skjema:
Kappegruppen (som en fri karboksylsyre eller beskyttet aminosyre (1 ekvivalent), benzotriazol-l-yloksy-tris-(dimetylamino)-fosfoniumheksafluorfosfat (BOP) (1.1 ekvivalent) og 1-hydroksybenzotriazol (HOBt) (1 ekvivalent) ble oppløst i 5 ml DMF fulgt av NMM (2.2 ekvivalent). Etter 5 minutter ble den beskyttede basiskomponent av peptidet eller den karboksylgruppe-beskyttede aminosyren, tilsatt, pH ble justert til 8 og blandingen ble omrørt i 3 til 4 timer. Den ble så fortynnet med 150 - 300 ml EtOAc og ekstraktert i rekkefølge med vann, 2 % NaHC03, vann, 2 % saltsyre og vann. Den organiske fasen ble tørket og avdampet til tørrhet for å gi et kappet eller et N-beskyttet peptid.
Eksempel 10
Metode D: Karbobenzyloksy (CBZ-) gruppe fjerningsprosedyre:
En oppløsning av det CBZ-beskyttede peptidet eller aminosyrederivåtet (1 g) i etylacetat (15 ml) ble blandet med 0.2 g Pd/C på karbon (10 % Pd på karbon inneholdende 50 vektprosent vann) og hydrogenert i 4 timer ved 276 kPa. Oppløsningen ble filtrert gjennom "Celite" (diatomerjord) og avdampet til tørrhet for å gi det ubeskyttede peptid eller aminosyrederivat.
Eksempel 11
Metode E: Omdanning av acetal til aldehyd:
En oppløsning av peptidacetalet (1 ekvivalent) i 3 ml THF ble blandet med 3 ml vandig HCL (2 M) og omrørt i 0.5 - 2 timer. Oppløsningsmiddel ble fjernet ved avdamping og den endelige resten ble fortynnet med vann og lyofilisert for å gi peptidaldehydet.
Eksempel 12
Metode F: Fremstilling av leucinal dietylacetal:
Trinn 1: NMM (10 ml) ble tilsatt til en oppløsning av CBZ-Leu-OH (25 g, 93 mmol) i 250 ml THF. Oppløsningen ble avkjølt til -15 °C, behandlet med 13 ml isobutyl klorformat (IBCF) og reagerte i 10 min. Deretter ble en oppløsning av N,0-dimetylhydroksylaminhydroklorid (9.36 g, 96 mmol) 40 ml DMF og 10 ml NMM tilsatt. Etter 4 timer omrøring ble blandingen fortynnet med 400 ml EtOAc og oppløsningen ble deretter vasket med vann, 5 % NaHC03 oppløsning, vann, 2 % sitronsyre og vann. Det organiske laget ble tørket over MgS04 og avdampet for å gi 19.0 g av en fargeløs olje.
Trinn 2: En oppløsning av oljen (19 g) fra trinn 1, i 200 ml eter ble avkjølt til -78 °C og 120 ml av en oppløsning av litiumalumniumhydrid (LiAfflL,) (1.0 M) i eter ble tilsatt
dråpevis over en periode på 45 minutter. Oppløsningen ble omrørt i 30 minutter og 200 ml IM kaliumhydrogensulfat (KHSO4) ble tilsatt dråpevis under en nitrogenatmosfære. Det organiske laget ble separert, vasket med KHSO4 (IM) oppløsning, tørket (MgS04) og avdampet for å gi en fargeløs væske (CBZ-Leu-H).
Trinn 3: 104 ml trietylortoformat ble tilsatt over en periode på 30 minutter til en oppløsning av CBZ-Leu-H (12 g) og p-toluensulfonsyre (0.9 g) i 100 ml vannfri etanol (EtOH). Blandingen ble omrørt i 30 minutter og så avdampet og fortynnet med 500 ml eter. Eterlaget ble vasket i rekkefølge med mettet oppløsning av NaHC03 og natriumklorid. Det gulbrune halvfaste stoffet ble rekrystallisert fra kald heksan for å gi nær hvite nåler av CBZ-Leucinal dietylacetal. <*>H NMR (300 MHz, CDC13) 8: 7.28 (m, 5H), 5.03 (s, 2H), 4.77 (d, 1H), 4.27 (d, 1H), 3.8 (m, 1H), 3.63 (m, 2H), 3.43 (m, 2H), 1.6 (dd, 2H), 1.30 (m, 2H), 1.12 (m, 6H), 0.83 (d, 6H).
Trinn 4: Produktet (14.8 g) fra trinn 3 ble hydrogenert ved anvendelse av metode D, med 2.5 g Pd/C for å gi 4.09 g av leucinal dietylacetalet som en olje. <*>H NMR (300 MHz, DDC13) 8: 4.16 (d, 1H), 3.70 (m, 3H), 3.75 (m, 2H), 2.87 (m, 1H), 1.78 (m, 1H), 1.33 (m, 2H), 1.23 (m, 6H), 0.935 (dd, 6H).
Eksempel 13
Metode G: Syntese av P3 mimetika (For nomenklatur, se Schechterø, )I. og Burger, A. (1967) Biochem. Biophys. Res. Commun. 27:157 - 162).
Trinn 1: Fremstilling av benzylcyklopentanacetat:
En blanding av cyklopentyleddiksyre (10.02 g, 78.2 mmol), benzylalkohol (8.45 g, 78.2 mmol) og p-toluensulfonsyre monohydrat (1.48 g, 7.82 mmol) i benzen (60 ml) ble oppvarmet ved bruk av en Dean-Stark separator i 2 timer. Etter avkjøling ble benzen fjernet og blandingen ble fortynnet med eter (50 ml) og vasket i rekkefølge med mettet NaHCC>3 oppløsning over mettet saltvann, tørket og avdampet i forbindelsen (15.40 g) som en olje; <*>H NMR (300 MHz, CDC13) 8: 7.35 (m, 5H), 5.10 (s, 2H), 2.40 (d, j=8 Hz, 2H), 2.26 (m, 1H), 1.81 (m, 2H), 1.6 (m, 4H), 1.18 (m, 2H).
Trinn 2: Fremstilling av benzyl 2-cyklopentyl-lO-jododekanoat:
Til en avkjølt (-78 °C) oppløsning av litiumdiisopropylamid (20 mmol) i en blanding av THF (20 ml) og heksan (8 ml) (fremstilt in situ fra det tilsvarende diisopropylamin og n-BuLi) ble det sakte tilsatt forbindelsen oppnådd i trinn 1 (3.96 g, 18 mmol) i anhyd. THF (10 ml). Blandingen ble omrørt i 30 minutter og 1.8-dijodoktan (7.19 g, 20 mmol) i heksametylfosforamid (3.50 g, 20 mmol) ble tilstått. Blandingen ble omrørt ved - 78 °C i 30 minutter, sakte bragt opp til 0 °C over en periode på 2 timer og stanset ved forsiktig tilsetting av 50 ml 12 % vandig natriumkloridoppløsning. Blandingen ble ekstrahert med eter, vasket med saltvann, tørket og oppløsningsmiddel ble avdampet. Råproduktet ble renset til en olje (3.23 g) ved flash-kromatografi over silika ved anvendelse av heksan til 1 % EtOAc i heksan som et elueringsmiddel; <*>H NMR (30 MHz, CDC13) 8: 7.35 (m, 5H), 5.15 (s, 2H), 3.20 (t, 8Hz, 2H), 2.20 (m, 1H), 2.0 (m, 1H), 1.2-1.8 (m, 22H).
Trinn 3: Fremstilling av benzyl 10 cyano-2-cyklopentyldekanoat:
En blanding av jodesteren fra trinn 2 (3.99 g, 8.7 mmol) og natriumcyanid (0.47 g, 9.6 mmol) i 15 ml anhyd. DMSO ble oppvarmet til 70 - 75 °C i 30 minutter. Etter avkjøling ble reaksjonsblandingen heilt over is (~40 g), ekstrahert inn i eter, vasket i rekkefølge med vann og mettet saltvann. Det organiske laget ble konsentrert for å gi en olje (2.89 g). <]>H NMR (300 MHz, CDC13). 8: 7.35 (m, 5H), 5.15 (s, 2H), 2.30 (t, 8Hz, 2H), 2.20 (m, 1H), 2.00 (m, 1H), 1.3-1.8 (m, 22H).
Trinn 4: Fremstilling av benzyl 10-N-ftalimido-2-cyklopentyldekanoat:
En blanding av forbindelsen fra trinn 2 (1.21 g, 2.6 mmol) og kaliumftalimid (0.536 g, 3 mmol) i 8 ml DMF ble oppvarmet til 70 - 75 °C i 30 minutter. Etter avkjøling ble reaksjonsblandingen fylt på is (~40 g) og ekstrahert inn i 60 ml eter. Den kombinerte organiske ekstrakten ble vasket med vann og mettet saltvann og konsentrert til en fargeløs olje (1.24 g). 'H NMR (300 MHz, CDC13) 8: 7.85 (m, 2H), 7.70 (m, 2H), 7.35 (m, 5H), 5.10 (s, 2H), 3.65 (t, 8 Hz, 2H), 2.20 (m, 1H), 2.00 (m, 1H), 1.22-1.18 (m, 22H).
Trinn 5: Fremstilling av 10-cyano-2-cyklopentyldekansyre:
En blanding av cyanoesteren fra trinn 3 (2.89 g, 8 mmol) og 10 % Pd-C (0.6, DeGussa, H20 innhold 50 %) i anhyd MeOH (35 ml) ble hydrogenert i 2 timer (290 - 179 kPa). Reaksjonsblandingen ble filtrert gjennom en Celite® pute og konsentrert til en fargeløs olje (2.02 g). 'H NMR (300 MHz, CDC13) 8: 2.35 (t, 8 Hz, 2H), 2.20 (m, 1H), 2.00 (m, 1H), 1.3-1.9 (m, 22H).
Trinn 6: Fremstilling av 2-cyklopentyl-lO-N-tfalimido-dekansyre.
Ved å følge prosedyren i trinn 5, ble produktet (0.41 g) fra trinn 4 omdannet til forbindelsen i tittelen (0.31 g). <!>H NMR (300 MHz, CDC13) 8: 7.85 (m, 2H), 7.70 (m, 2H), 3.70 (t, 8Hz, 2H), 2.15 (m, 1H), 1.95 (m, 1H), 1.10 -1.85 (m, 22H).
Trinn 7: Fremstilling av lO-trifluormetansulfonamido-2-cyklopentyl-dekansyre benzylester.
En blanding av esteren fra trinn 4 (0.874 g, 1.7 mmol) og hydrazin monohydrat (0.425 g, 0.41 ml, 8.5 mmol) i metanol (8 ml) ble oppvarmet med tilbakeløpskjøling i 30 minutter, konsentrert og resten ble triturert med eter for å gi en hvit utfelling som ble filtrert fra. Filtratet ble konsentrert til en olje (0.540 g). Oljen ble oppløst i CH2C12 (8 ml), avkjølt til -10 °C og til denne ble det tilsatt trietylamin (0.324 ml) fulgt av trifluormetan sulfonylklorid (0.25 ml). Temperaturen ble sakte bragt til romtemperatur over en periode på 1 time. Reaksjonsblandingen ble så vasket med vann, 2 % HC1, vann og mettet saltvann. Det organiske laget ble konsentrert til en olje og ble renset ved flash-kromatografi over silikagel ved bruk av 10 % EtOAc i heksan som elueringsmiddel for å gi lO-trifluormetansulfonamido-2-cyklopentyl-dekansyre benzylester som en olje (0.25 g). 'h NMR (300 MHz, CDC13) 8: 7.35 (m, 5H), 5.15 (s, bred, 1H), 5.10 (s, 2H), 3.25 (m, 1H), 2.20 (m, 1H), 2.00 (m, 1H), 1.10 -1.7 (m, 22H).
Trinn 8: Fremstilling av 2-cyklopentyl-10-(trifluormetansulfonamido)-dekansyre: Ifølge den samme prosedyren som beskrevet i trinn 5, ble forbindelsen (0.25 g) oppnådd i trinn 7 omdannet til forbindelsen i tittelen (0.20 g) som en olje. <*>H NMR (300 MHz, CDCI3) 8: 6.60 - 5.60 (b, 1H), 3.30 (d, 8Hz, 2H), 2.15 (m, 1H), 1.90 (m, 1H), 1.1 -1.8 (m, 22H).
Trinn 9: Fremstilling av t-butyl 8-jodkaprylsyre:
Forbindelsen i tittelen ble syntetisert ved å følge prosedyren som beskrevet for forbindelsen i trinn 2 fra t-butylacetat (1.16 g) og 1.6-dijodheksan (4.06 g) som en olje (2.13 g). <!>H NMR (300 MHz, CDC13) 8: 3.20 (t, 8Hz, 2H), 2.20 (t, 8Hz, 2H), 1.75 - 1.85 (m, 2H), 1.55 - 1.65 (m, 2H), 1.45 (s, 9H), 1.25 - 1.43 (m, 6H).
Trinn 10: Fremstilling av 2-cyklopentyldekan-1,10-dioinsyre-1 -benzyl-10-t-butylester: Ved anvendelsen av prosedyren som beskrevet i trinn 2, ble esteren (6.92 g) fra trinn 1 og jodesteren (11.37 g) fra trinn 9 reagert for å gi forbindelsen i tittelen (7.44 g) olje.
<!>H NMR (300 MHz, CDC13) 8: 7.35 (m, 5H), 5.10 (s, 2H), 2.20 (m, 3H), 2.00 (m, 1H), 1.45 (s,9H), 1.0-1.9 (m, 20H).
Trinn 11: Fremstilling av 2-cylopentyldekan-1,10-dioinsyre-1 -benzyl-10-metylester.
En oppløsning av diesteren fra trinn 10 (2.86 g, 7 mmol) i CH2C12 (30 ml) og 10 ml 90 % TF A ble omrørt i 30 minutter. Det oppnådde produktet etter avdampingen ble oppløst i en blanding av CH2C12 (10 ml) og MeOH (6 ml). Oppløsningen ble omrørt ved -20 °C og til den ble det sakte tilsatt tionylklorid (6 ml) i løpet av 2 timer. Oppløsningsmiddel ble avdampet og resten ble oppløst i dietyleter (20 ml). Det organiske laget ble vasket i rekkefølge med mettet NaHC03 oppløsning, vann og saltvann, tørket, avdampet og flash-kromatografert på silikagel (elueringsmiddel: 2 % EtOAc-heksan) for å gi produktet som en olje (2.05 g). 'h NMR (300 MHz, CDC13) 8: 7.35 (m, 5H), 5.10 (s, 2H), 3.65 (s, 3H), 2.30 (t, 8Hz, 2H), 2.20 (m, 1H), 2.00 (m, 1H), 1.10-1.90 (m, 10H).
Trinn 12: Fremstilling av 2-cyklopentyldekan-1,10-dioinsyre-10-metylester:
Ved anvendelsen av prosedyren som beskrevet i trinn 5, ble forbindelsen (4.96 g) fra trinn 11 omdannet til forbindelsen i tittelen (3.66 g) som en olje. 'H NMR (300 MHz, CDCI3) 8: 3.65 (s, 3H), 2.30 (t, 8Hz, 2H), 2.15 (m, 1H), 2.00 (m,lH), 1.10-1.19 (m, 20H).
Trinn 13: Fremstilling av 6-cyanoheksan-1 -sulfinsyre natriumsalt:
I en trehalset flaske utstyrt med en vannkondensator, en mekanisk rører og en dråpetrakt ble en oppløsning av l-brom-6-cyanoheksan (8.04 g, 42.3 mmol) plassert i 75 ml 95 % EtOH. Blandingen ble oppvarmet med tilbakeløpskjøling og ble sakte tilsatt til en oppløsning av natriumsulfitt (8.00 g, 63.5 mmol) i 50 ml H20 og fjernes i løpet av 30 minutter. Blandingen ble oppvarmet i 2 timer og så konsentrert under redusert trykk. Resten ble oppløst i 95 % EtOH (200 ml), oppvarmet til koking og filtrert. Filtratet ble konsentrert og avkjølt i et isbad. Utfellingen ble oppvarmet ved filtrering og tørket for å gi 3.00 g av et hvitt faststoff. Morvæsken ble redusert ved ytterligere konsentrering i en ytterligere porsjon på 2.2 g av produktet. <!>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 8: 2.50 (t, j=8Hz, 2H), 2.40 (t, 8Hz, 2H), 1.55 (m, 4H), 1.3 (m, 4H).
Trinn 14: Fremstilling av 6-cyanoheksan-l-sulfonylklorid:
En blanding av produktet fra trinn 13 (0.340 g, 1.6 mmol), tionylklorid (0.95 g, 8 mmol) og en dråpe DMF ble oppvarmet til 75 - 80 °C i 30 minutter. Etter avkjøling ble oppløsningsmiddel fjernet og resten ble behandlet med isvann (5 ml). Det organiske laget ble konsentrert i 30 ml eter og det sammenslåtte organiske laget ble vasket med 3 % NaHC03 oppløsning og vann, tørket (MgS04) og filtrert. Filtratet ble behandlet med aktivt karbon (Darco), filtrert og konsentrert for å gi en fargeløs olje (0.240 g) som ble benyttet uten ytterligere rensing.
Eksempler 14-38 beskriver syntesen av MCP inhibitorer opplistet i Tabell 5. De tilsvarende rensingsbetingelsene er opplistet i Tabell 6.
Eksempel 14 10-cyano-2-cyklopentyldekanoyl-N8-nitro-L-arginyl-L-leucinal
Trinn 1: Fluormetyloksykarbonyl-N<8->nitro-L-arginyl-L-leucinal dietylacetal.
Fmoc-Arg(N02)-OH (4.41 g, 10 mmol) ble koblet med Leu-acetal (1.89 g, 10 mmol) ifølge fremgangsmåte A (Eksempel 7) ved bruk av 1.29 ml D3CF, 2.2 ml NMM og 10 ml THF (i stedet for DMF som i metode A i Eksempel 7). Råpeptidet ble oppnådd som et amorft faststoff. <*>H NMR (300 MHz, CDC13) 8: 7.75 (d, 2H), 7.55 (d, 2H), 7.4 (m, 2H), 7.29 (m, 2H), 6.21 (d, 1H), 5.91 (d, 1H), 4.30 (m, 5H), 3.66 (m, 3H), 3.63 (d, 2H), 3.32 (m, 2H), 1.72 (m, 4H), 1.29 (m, 2H), 1.17 (b, 6H), 0.89 (m, 6H).
Trinn 2: N<8->nitro-L-arginyl-L-leucinal dietylacetal.
Fmoc-gruppen ble fjernet fra 3.5 g av produktet fra trinn 1 ved anvendelse av beskyttelsesmetode B (Eksempel 8). Den fri base (2.5 g) ble oppnådd som et halvfast stoff. 'H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 8: 8.6 (b, 1H), 7.61 (d, 1H), 4.27 (d, 1H), 3.90 (m, 1H), 3.59 (m, 1H), 3.45 (m, 4H), 3.14 (m, 2H), 1.54 (m, 4H), 1.33 (m, 3H), 1.10 (tt, 6H), 0.83 (dd, 6H).
Trinn 3: 10-cyano-2-cyklopentyl-dekanoyl-N<8->nitro-L-arginyl-L-leucinal dietylacetal.
Ifølge metode C (Eksempel 9) ble 10-cyano-2-cyklopentyl-dekansyre fra metode G i 16 ml DMF behandlet med produkt fra trinn 2 (2.15 g, 5.5 mmol) ved bruk av BOP (3.34 g, 7.5 mmol) og HOBt (1.01 g, 7.5 mmol) for å gi det rå peptidet (3.85 g) som et blekt gult faststoff. <*>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 8: 8.31 (bd, 1H), 8.0 (bd, 1H), 7.83 (d, 1H), 4.34 (m, 1H), 4.24 (d, 1H), 3.91 (m, 1H), 3.56 (m, 4H), 3.43 (m, 2H), 3.16 (m, 2H), 2.47 (t, 3H), 2.03 (m, 1H), 1.76 (m, 2H), 1.15-2.0 (m, 25H), 1.07 (m, 6H), 0.81 (d, 6H).
Trinn 4: En oppløsning av produktet fra trinn 3 (0.2 g) i 10 ml acetonitril (ACN) inneholdende 30 % TF A, omrørt i 1 time og oppløsningsmiddel ble avdampet og Forbindelse 14 ble utfelt ved anvendelse av dietyleter. HPLC rensingsbetingelser er angitt i Tabell 6. lK NMR (300 MHz, DMSO-de) 6: 9.38 (s, 1H), 8.56 (b, 1H), 8.3 (d, 1H), 7.99 (dd, 1H), 4.38 (m, 1H), 4.17 (m, 1H), 3.37 (m, 4H), 3.17 (m, 2H), 2.26 (t, 3H), 1.0 - 2.0 (m, 27H), 0.86 (dd, 6H).
Eksempel 15
10-cyano-2-cyklopentyl-dekanoyl-N<8->(2,2,5,7,8-pentametylkroman-6-sulfonyl)-L-arginyl-L-leucinal
Trinn 1:10-cyano-2-cyklopentyl-dekanoyl-Ng<->(2,2,5,7,8-pentametylkroman-6-sulfonyl)-L-arginyl-L-leucinal dietylacetal.
Ved å følge metode C (Eksempel 9), ble lO-cyano-2-cyklopentyl-dekansyre (2 mmol, fra tinn 5 i metode G i Eksempel 13) koblet med N<8->(2,2,5,7,8-pentametylkroman-6-sulfonyl)-L-arginyl-L-laucinal dietylacetal (1.8 mmol, fra trinn 2 i forbindelse 14) for å gi forbindelsen som et faststoff.
Trinn 2: 10-cyano-2-cyklopentyl-dekanoyl-N<8->(2,2,5,7,8-pentametylkroman-6-sulfonyl)-L-arginyl-L-leucinal.
Ved å følge metode E (Eksempel 11) ble produktet fra tinn 1 (0.3 g) omdannet til Forbindelse 15 (0.2 g) og renset ved HPLC. <!>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 8: 9.38 (s, 1H), 8.23 (d, 1H), 7.8 (s, 1H), 7.72 (d, 1H), 7.49 (t, 1H), 7.48 (s, 1H), 4.34 (m, 1H), 4.14 (m, 1H), 3.05 (m, 2H), 2.60 (t, 2H), 2.50 (s, 3H), 2.46 (s, 3H), 2.25 (m, 4H), 2.00 (s, 3H), 1.74 (t, 2H), 1.6-1.0 (m, 25H), 1.13 (s, 6H), 0.82 (dd, 6H).
Eksempel 16
10-cyano-2-cyklopentyl-dekanoyl-N8-nitro-L-arginyl-L-leucinal semikarbazon
Semkarbazid hydroklorid (0.20 mmol), natriumacetat (0.3 mmol) og vann (0.5 ml) ble tilsatt til en oppløsning av Forbindelse 14 (0.050 g, 0.089 mmol) i 4.5 ml etanol og omrørt over natten ved romtemperatur. Oppløsningsmiddel ble fjernet og den resulterende Forbindelse 16 ble renset for HPLC som angitt i Tabell 6: *H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 8: 9.91 (s, 1H), 8.51 (s, 2H), 8.04 (d, 1H), 7.95 (d, 1H), 7.40 (s, 1H), 7.09 (d, 1H), 6.29 (s, 2H), 4.44 (m, 1H), 4.33 (m, 1H), 3.16 (s, 2H), 2.08 - 1.00 (m, 33H), 0.87 (dd, 6H).
Eksempel 17
10-cyano-2-cyklopentyl-dekanoyl-N<8->nitro-L-arginyl-L-leucinal oksim
Hydroksyamin hydroklorid (0.037 g, 0.534 mmol) ble tilsatt til en oppløsning av produktet for trinn 4 i Eksempel 14 (0.05 g, 0.089 mmol) i pyridin (0.175 g, 2.2 mmol) ved romtemperatur og så ved 80 °C i 30 minutter. Produktet ble isolert ved HPLC som angitt i Tabell 6.
Eksempel 18
10-cyano-2-cyklopentyl-dekanoyl-N8-nitro-L-arginyl-L-leucinaI-O-metyloksim
Ved å følge prosedyren i Eksempel 17, ble Forbindelse 18 fremstilt ved anvendelse av O-metylhydroksyamin hydroklorid (0.031 g, 0.38 mmol) og isolert som en blanding av to topper ved HPLC som angitt i Tabell 6.
Eksempel 19
10-cyano-2-cyklopentyl-dekanoyl-Ng-nitro-L-arginyl-L-leucinal-O-benzyloksim
Ved å følge prosedyren som i fremstilling av Eksempel 17, ble Forbindelse 19 fremstilt ved anvendelse av forbindelse 14 (0.05 g, 0.089 mmol), O-benzyl hydroksylamin hydroklorid (0.043 g, 0.267i mmol) og pyridin (0.092 ml, 1.14 mmol). Forbindelsen ble separert som to topper i HPLC rensing.
Eksempel 20
9-metoksyikarbonyl-2-cykIopentyl-nonanoyl-NB<->(2,2,5,7,8-pentametylkroman-6-sulfonyl)-L-arginyl-L-leucinal
Trinn 1: Fmoc-NB<->(2,2,5,7,8-pentametylkroman-6-sulfonyl)-L-argininyl-L-leucinal dietylacetal.
Ved å følge metode C (Eksempel 9), ble Fmoc-N<8->(2,2,5,7,8-pentametylkroman-6-sulfonyl)-L-arginin (3.31 g, 5 mmol) koblet med L-leucinal dietylacetal (0.85 g, fra metode F, Eksempel 12) ved anvendelse av BOP (2.21 g, 5 mmol), HOBt (0.67 g, 5 mmol) og NMM (0.7 ml) i 12 ml DMF og fjernes for å gi dipeptidacetalet (3.24 g). 'H NMR (300 MHz, CDC13) 6: 7.89 (s, 1H), 7.78 (d, 2H), 7.6 (d, 2H), 7.4 (t, 2H), 7.31 (t, 3H), 6.4 (d, 2H), 5.92 (d, 1H), 4.58 (m, 1H), 4.43 (m, 1H), 4.35 (m, 3H), 3.69 (m, 2H), 3.53 (m, 2H), 3.30 (m, 2H), 2.6 (t, 2H), 2.58 (s, 6H), 2.12 (s, 3H), 1.80 (tt, 2H), 1.64 (m, 3H), 1.32 (m, 10H), 1.18 (q, 6H), 0.89 (t, 6H).
Trinn 2: N<8->(2,2,5,7,8-pentametylkroman-6-sulfonyl)-L-arginyl-L-leucinal.
Ved å følge metode B (Eksempel 8), ble Fmoc gruppen fjernet fra produktet (1.6 g) fra trinn 1, for å gi halvfaste stoff (1.3 g). !H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 8: 7.6 (d, 1H), 6.76 (b, 1H), 6.46 (b, 1H), 4.27 (d, 1H), 3.9 (m, 1H), 3.58 (m, 1H), 3.44 (m, 4H), 3.11 (t, 1H), 3.01 (m, 2H), 2.58 (t, 2H), 2.47 (s, 6H), 2.03 (s, 3H), 1.77 (t, 2H), 1.5 (m, 5H), 1.26 (s, 6H), 1.09 (m, 6H), 0.83 (dd, 6H).
Trinn 3: 9-metoksykarbonyl-2-cylopentyl-nonanoyl-N<8->(2,2,5,7,8-pentametylkroman-6-sulfonyl)-L-arginyl-L-leucinal dietylacetal.
Ved å følge metode C (Eksempel 9) ble 9-metyloksykarbonyl-2-cyklopentyl-nanonsyre (0.56 g) koblet med NB<->(2,2,5,7,8-pentametylkroman-6-sulfonyl)-L-arginyl-L-leucinal
dietylacetal (0.7 g, 1.1 mmol) ved bruk av BOP (0.66 g, 1.5 mmol), HOBt (0.202 g, 1.5 mmol) og NMM (2.2 ml, 2 mmol) i 5 ml DMF og fjernes for å gi produktet (1.8 g) som faststoff. 'H NMR (300 MHz, MSO-d6) 8: 7.5 - 8.0 (m, 2H), 6.66 (m, 1H), 6.4 (m, 1H), 4.32 (m, 1H), 4.24 (d, 1H), 3.93 (m, 1H), 3.57 (m, 6H), 3.44 (m, 4H), 3.04 (m, 2H), 2.59 (t, 2H), 2.48 (s, 6H), 2.28 (m, 3H), 2.03 (s, 3H), 1.77 (t, 2H), 1.48 (m, 22H), 1.26 (s, 6H), 1.1 (tt, 9H), 0.81 (dd, 6H).
Trinn 4: 9-metoksykarbonyl-2-cyklopentyl-nanonsyre-Ng-(2,2,5,7,8-pentametyl-kroman-6-sulfonyl)-L-arginyl-L-leucinal.
Ved å følge metode E (Eksempel 11), ble produktet (0.2 g) fra trinn 1 omdannet til Forbindelse 20 og renset direkte ved HPLC. <l>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 8: 9.37 (s, 1H), 8.2 - 7.4 (m, 2H), 6.69 (drm, 1H), 6.4 (brm, 1H), 4.3 (m, 2H), 3.58 (s, 3H), 3.03 (m, 2H), 2.60 (t, 2H), 2.48 (s, 6H), 2.26 (m, 4H), 2.03 (s, 3H), 1.77 (t, 2H), 1.47 (brm, 28H), 1.24 (s, 3H), 0.80 (dd, 6H).
Eksempel 21
9-metoksykarbonyl-2-cyklopentyl-nanonsyre-Ng<->(4-metoksy-2,3,6-trimetyl-benzen-l-sulfonyl)-L-arginyl-L-laucinaI
Trinn 1: 9-metoksykarbonyl-2-cyklopentyl-nanonsyre-N<8->(4-metoksy-2,3,6-trimetylbenzen-1 -sulfonyl)-L-arginyl-L-leucinal dietylacetal.
Ved å følge metode C (Eksempel 9), ble 9-metoksykarbonyl-2-cyklopentyl-nanonsyre (1.2 mmol, fra trinn 12 i metode G) koblet med N<8->(4-metoksy-2,3,6-trimetylbenzen-l-sulfonyl)-L-arginyl-L-leucinal dietylacetal (1.0 mmol) for å gi peptidet som et faststoff. Trinn 2: Ved å følge metode E (Eksempel 11), ble acetalet fra trinn 1 omdannet til Forbindelse 21 og renset for HPLC. <*>H (300 MHz, CDCl3/DMSO-d6) 6: 9.42 (s, 1H), 8.25 (d, 1H), 7.92 (d, 1H), 7.84 (s, 1H), 6.4 (m, 2H), 4.40 (m, 1H), 4.20 (m, 1H), 3.80 (s, 3H), 3.57 (s, 3H), 3.26 (m, 2H), 2.64 (s, 3H), 2.55 (s, 3H), 2.36 (m, 2H), 2.07 (s, 3H), 1.8-1.0 (m, 30H), 0.87 (dd, 6H).
Eksempel 22
9-metoksykarbonyl-2-cyklopentyl-nonanoyl-N<8->(2,2,5,7,8-pentametylkroman-6-sulfonyl)-L-arginyl-L-norleucinal
Trinn 1: 9-metoksykarbonyl-2-cyklopentyl-nonanoyl-N<8->(2,2,5,7,8-pentametylkroman-6-sulfonyl)-L-arginyl-L-norleucinal dietylacetal.
Ved bruk av metode C (Eksempel 9) ble 9-metoksykarbonyl-2-cyklopentyl-nonansyre (1 mmol) koblet med N<8->(2,2,5,7,8-pentametylkroman-6-sulfonyl)-L-arginyl-L-norleucinal dietylacetal (0.69 mmol, oppnådd fra trinn 1 i Eksempel 30 ved å følge metode B), ved anvendelse av BOP (1 mmol), HOBt (1 mmol) og NMM (2.5 mmol) i 5 ml DMF. Reaksjonsblandingen ble omrørt i 4.5 timer og peptidet ble isolert (0.37 g, 0.42 mmol).
Trinn 2: 9-metoksykarbonyl-2-cyklopentyl-nonanoyl-N<8->(2,2,5,7,8-pentametylkroman-6-sulfonyl)-L-arginyl-L-norleucinal.
Ifølge metode E (Eksempel 11), ble produktet (0.37 g, 0.42 mmol) fra trinn 1 omdannet til Forbindelse 22 (0.33 g) og renset på HPLC. !H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 8: 9.29 (s, 1H), 7.79 (d, 1H), 7.89 (d, 1H), 7.31 (t, 1H), 7.26 (s, 2H), 4.17 (m, 1H), 3.94 (m, 1H), 3.49 (s, 3H), 2.94 (m, 2H), 2.74 (t, 2H), 2.51 (t, 2H), 2.37 (s, 6H), 2.20 (m, 4H), 1.94 (s, 3H), 1.14 (s, 6H), 1.0-1.8 (m, 3H), 0.74 (t, 3H).
Eksempel 23
9-metoksykarbonyl-2-cyklopentyl-nonanoyl-Ne<->nitro-L-arginyl-L-leucinal
i
Trinn 1: 9-metoksykarbonyl-2-cyklopentyl-nonanoyl-N<8->nitro-L-arginyl-L-leucinal dietylacetal.
Ved å følge metode C (Eksempel 9), ble 9-metoksykarbonyl-2-cyklopentyl-nanonsyre koblet med produktet fra trinn 2 i Eksempel 14 (0.109 g, 0.28 mmol) ved bruk av BOP
(0.146 g, 0.33 mmol), HOBt (0.0449 g, 0.33 mmol) og NMM (0.105, 0.95 mmol) i 7 ml DMF for å gi forbindelsen i tittelen fra trinn 1 (0.124 g). <*>H NMR (300 MHz, CDC13 6: 8.31 (m, 2H), 6.69 (br d, 1H), 6.15 (br d, 1H), 4.5 (m, 1H), 4.33 (m, 1H), 4.18 (m, 1H), 3.67 (s, 3H), 3.53 (m, 4H), 3.32 (m, 2H), 2.68 (m, 2H), 2.29 (t, 3H), 2.0 -1.0 (b m, 34H), 0.90 (dd, 6H).
Trinn 2: Ved å følge metode E (Eksempel 11) ble peptidet (fra trinn 1, 0.124 g) omdannet £1 Forbindelse 23 (0.106 g). <!>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 8: 9.39 (s, 1H), 8.54 (m, 1H), 8.31 (d, 1H), 7.99 (br d, 2H), 4.36 (m, 1H), 4.15 (m, 1H), 3.33 (s, 3H), 3.16 (m, 2H), 2.27 (t, 2H), 2.03 (m, 2H), 1.0 -1.7 (m, 28H), 0.83 (dd, 6H).
Eksempel 24
2-cyklopentyl-10-N-ftalimido-decanoyl-Ne<->nitro-L-arginyl-L-leucinal
Trinn 1: 2-cyklopentyl-10-N-ftalimido-decanoyl-N8-nitro-L-arginyl-L-leucinal dietylacetal.
Ved å følge metode C (Eksempel 9), ble produktet (0.25 g, 0.65 mmol) fra trinn 6 i metode G (Eksempel 13) koblet til produktet fra trinn 2 i Eksempel 14 (0.195 g, 0.5 mmol) ved bruk av BOP (0.288 g, 0.65 mmol), HOBt (0.088 g, 0.65 mmol) og NMM (0.130 ml, 0.130 mmol) i 5 ml DMF for å gi forbindelsen i tittelen (0.557 g) som et faststoff. <*>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 8: 8.57 (br m, 1H), 7.91 (d, 1H), 7.85 (br d, 4H), 7.55 (d, 1H), 4.32 (m, 1H), 4.23 (dd, 1H), 3.90 (m, 1H), 3.55 (t, 3H), 3.43 (m, 4H), 3.14 (m, 2H), 2.0 (br m, 1H), 1.74 (br m, 2H), 2.0 -1.15 (2 br m, 28H), 1.09 (tt, 6H), 0.79 (dd, 6H).
Trinn 2: 2-cyklopentyl-10-N-ftalimido-dekanoyl-NB<->nitro-arginyl-L-leucinal.
Ved bruk av metode E (Eksempel 11), ble produktet fra trinn 1 (0.45 g) omdannet til forbindelse 24 (0.32 g). <J>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 8: 9.38 (s, 1H), 8.31 (d, 1H), 8.00 (d, 1H), 7.85 (m, 4H), 4.38 (m, 1H), 4.15 (1, 1H), 3.57 (tt, 3H), 3.15 (m, 2H), 2.00 (m, 1H), 1.9 -1.0 (br m, 30H), 0.86 (dd, 6H).
Eksempel 25
10-(trifluormetansulfonyl)amino-2-cyklopentyl-dekanoyl-N<8->nitro-L-arginyl-L-leucinal
Trinn 1: (Trifluormetansulfonyl)10-amino-2-cyklopentyl-dekanoyl-NB<->nitro-L-arginyl-L-leucinal dietylacetal.
Ved bruk av metode C (Eksempel 9), ble 10-(trifluormetansulfonyl)-amino-2-cyklopentyl-dekansyre (0.199 g, 0.51 mmol) koblet til produktet fra trinn 2 i Eksempel 14 (0.175 g, 0.45 mmol) ved bruk av BOP (0.22 g, 0.51 mmol), HOBt (0.069 g, 0.51 mmol) og NMM (0.052 ml, 0.47 mmol) i 5 ml DMF. Acetalet ble oppnådd som et faststoff (0.42 g). 'H NMR (300 MHz, CDC13) 8: 6.06 (br m, 1H), 5.81 (m, 1H), 4.53 (m, 1H), 4.32 (d, 1H), 4.13 (m, 1H), 3.73 (q, 4H), 3.53 (m, 2H), 3.30 (q, 3H), 2.0 -1.0 (2brm, 36H), 0.9 (dd, 6H).
Trinn 2: 10-(trifluormetansulfonyl)ammo-2-cyklopentyl-dekano L-leucinal.
Ved å følge metode E (Eksempel 11) ble produktet fra trinn 1 (0.35 g) omdannet til Forbindelse 25 (0.17 g). <!>H NMR (300 MHz, DMSO-de) 8: 9.27 (s, 1H), 8.46 (br m, 1H), 4.30 (m, 1H), 3.87 (m, 1H), 3.09 (m, 5H), 2.8 -1.0 (2 brm, 30H), 0.78 (dd, 6H).
Eksempel 26
Monometylazelayl-Ng<->nitro-L-arginyl-L-leucinal
Trinn 1: Monometlazelayl-N<8->nitro-L-arginyl-L-leucinal dietylacetal:
Ved å følge metode C (Eksempel 9), ble forbindelsen i tittelen fremstilt ved bruk av azelainsyre monometylester (0.708 g, 3.5 mmol), BOP (1.55 g, 3.5 mmol), HOBt (0.47 g, 3.5 mmol), NMM (0.38 ml, 3.5 mmol), NB-nitro-L-arginyl-L-leucinal dietylacetal (oppnådd fra trinn 2 i Eksempel 14 ved å følge metode B, Eksempel B) (1.306 g, 3.5 mmol) i 12 ml DMF. Peptidet ble oppnådd som et amorft faststoff (2.17 g). <*>H NMR (300 MHz, CDCI3) 8: 6.58 (d, 1H), 6.04 (d, 1H), 4.47 (m, 1H), 4.30 (d, 1H), 4.17 (m, 1H), 3.67 (s, 3H), 3.53 (m, 2H), 3.2 - 3.4(t, d, 2H), 2.3 (m, 3H), 2.2 (t, 1H), 1.83 (m, 1H), 1.2-1.8 (m, 24H), 1.2 (m, 3H), 0.9 (d, 3H).
Trinn 2: Monometylazelayl-Ng<->nitro-L-arginyl-L-leucinal:
Ved anvendelse av metode E (Eksempel 11) ble peptidacetalet (fra trinn 1) (250 mg), omdannet til Forbindelse 26 (0.22 g). <]>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 8: 9.38 (s, 1H), 7.73 (d, 1H), 4.30 (m, 1H), 4.09 (m, 1H), 3.57 (s, 3H), 3.15 (m, 2H), 3.01 (q, 1H), 2.75 (m, lH), 2.24 (m, 7H), 1.50 (m, 12H), 1.24 (b, 14H), 0.86 (m, 6H).
Eksempel 27
Mon<p>metylazelayl-Ng<->nitro-L-arginyl-L-fenylalaninal
Trinn 1: Fenylalaninaldietylacetal.
CBZ-Phe-OH (6.0 g, 2 mmol) ble omdannet til fenylalaninaldietylacetal ved å følge prosedyren benyttet i Leucinal dietylacetal (metode F, Eksempel 12).
Trinn 2: Fmoc-Arg(N02)-OH.
En oppløsning av fluorenylmetyloksykarbonyl-N-hydroksysuccinimidylester (32 mmol) i 60 ml THF ble tilsatt til en omrørt oppløsning av NB<->nitro-L-arginin (35 mmol) og NaHCC«3 (70 mmol) i 70 ml H20. Den melkeaktige oppløsningen var klar etter 1 time og oppløsningen ble surgjort med fast sitronsyre til pH 2 - 3 og ekstrahert med 300 ml EtOAc. Det organiske laget ble vasket en gang med vann, tørket og avdampet for å gi forbindelsen som et hvitt faststoff (26.8 mmol).
Trinn 3: Fmoc-Arg(N02)-resin.
En oppløsning av 9-fluorenylmetyloksykarbonyl-N<8->nitro-L-arginin (fra trinn 2,26.8 mmol), BOP (30 mmol), HOBt (30 mmol) og NMM (55 mmol) i 40 ml DMF ble blandet med 10 g PAC resin (cc-metylfenylacyl linker bundet til polystyren-1 % divinylbenzen, substitusjon 0.97 mmol/g, levert av Bachem Bioscience, Inc. King of Prussia, PA) og omrørt i 4 timer. Resinen ble filtrert fra, vasket med DMF, DCM og MeOH og tørket for å gi det endelige produkt Fmoc-Arg(N02)-resin (11.1 g). Resinen, FmocrArg(N02)-resin (11.1 g) ble behandlet med 100 ml av en oppløsning inneholdende piperidin (30 %), DMF (35 %) og toluen (35 %) og omrørt i 2.5 timer. Fmoc fjernet resin ble filtrert og deretter vasket med DCM/DMF (50:50) og MeOH for å gi produktet (9.2 g).
Trinn 4: MeOAz:Arg(N02)-resin.
Monometylazelat (20 mmol) ble tilsatt til en omrørt oppslemming av Arg(N02)-resin (9.2 g), BOP (20 mmol), HOBt (20 mmol) og NMM (for å justere pH til 8). Etter omrøring over natten ble en blanding av monometylazelat (10 mmol), BOP (10 mmol), HOBt (10 mmol) og NMM (20 mmol) tilsatt og omrørt i 24 timer. Resinen ble vasket med DMF, DCM og metanol for å gi 10.56 g resin.
Trinn 5: Monometlazelayl-Ns<->nitro-L-arginin:
Produktet fra trinn 4 (10.56 g) ble omrørt i 5 timer i en oppløsning av 100 ml 67 % DCM (30 %) TFA og (3 %) anisol. Oppslemmingen ble filtrert og oppløsningsmiddelet ble avdampet og triturert med eter for å gi peptidet (1.11 g, 2.75 mmol).
Trinn 6: Monometylazelayl-Ng<->nitro-L-arginyl-L-fenylalaninaldietylacetal.
Ved å følge metode C (Eksempel 9), ble metoksyazelaoyl-Ng<->nitro-L-arginin (1 mmol) koblet med L-fenylalaninaldietylacetal (1.3 mmol) ved bruk av BOP (1.3 mmol), HBOt (1.3 mmol) og NMM (for å justere pH til 8) for å gi peptidproduktet i tittelen (0.82 mmol).
Trinn 7: Monometylazelayl-Ng<->nitro-L-arginyl-L-fenylalaninal.
Ved anvendelse av metode E (Eksempel 11), ble produktet (0.82 mmol) fra trinn 6 omdannet til forbindelsen i tittelen (0.81 mmol). <!>H NMR (300 MHz, CDC13) 8: 9.59 (s, 1H), 8.36 (s, 1H), 7.49 (s, 1H), 7.31 - 7.09 (m, 7H), 6.71 (d, 1H), 4.69 (m, 1H), 4.60 (m, 1H), 3.66 (s, 3H), 3.41 (m, 2H), 3.27 (m, 2H), 2.31 (t, 2H), 2.2 (t, 2H), 1.80 -1.2 (m, 14H.).
Eksempel 28
Monometylazelayl-Ng<->(2,2,5,7,8-pentametylkroman-6-sulfonyl)-L-arginyl-L-leucinal
Trinn 1: Monometylazelayl-NB<->(2,2,5,7,8-pentametylkroman-6-sulfonyl)-L-arginyl-L-leucinaldietylacetal.
Ved å følge metode C (Eksempel 9), ble monometylazelat (1.42 g, 7.0 mmol) koblet medN8-(2,2,5,7,8-pentametylkroman-6-sulfonyl)-L-arginyl-L-laucinal dietylacetal (3.06 g, 5.0 mmol, oppnådd fra trinn 2 i Eksempel 20), ved anvendelse av 7.0 mmol hver av BOP, HOBt og NMM for å oppnå forbindelsen (3.43 g) som faststoff, •h NMR (300 MHz, CDC13) 8: 6.58 (d, 1H), 6.04 (d, 1H), 5.4 (br, 1H), 5.06 (br, 1H), 4.47 (m, 1H), 4.30 (d, 1H), 4.17 (m, 1H), 3.67 (s, 3H), 3.53 (m, 4H), 3.23 (d, 1H), 3.19 (t, 2H), 2.30 (m, 2H), 2.2 (tt, 2H), 2.0 -1.25 (2 br m, 17H), 1.20 (tt, 6H), 0.90 (dd, 6H).
Trinn 2: Monometylazelayl-N<6->(2,2,5,7,8-pentametylkroman-6-sulfonyl)-L-arginyl-L-leucinal.
Ved anvendelse av metode E (Eksempel 11), ble produktet (0.30 g) fra trinn 1 omdannet til Forbindelse 28 (0.22 g). <!>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 8: 9.38 (s, 1H), 8.5 (br, 1H), 4.30 (m, 1H), 4.09 (m, 1H), 3.57 (s, 3H), 3.15 (m, 2H), 3.00 (t, 2H), 2.75 (m, 2H), 2.12 (t, 2H), 1.8 -1.20 (2 br m, 17H), 0.86 (dd, 6H).
Eksempel 29
Monometylazelayl-Ng<->(2,2,5,7,8-pentametylkroman-6-sulfonyl)-D-arginyl-L-leucinal
Trinn 1: 9-fluorenylmetoksykarbonyl-N<8->(2,2,5,7,8-pentametylkroman-6-sulfonyl)-D-arginyl-L-leucinal dietylacetal.
Ved å følge metode C (Eksempel 9), ble 9-fluorenylmetyloksykarbonyl-N<6->(2,2,5,7,8-pentametylkroman-6-sulfonyl)-D-arginin (3 mmol) koblet med leucinal dietylacetal (2.5 mmol) ved bruk av BOP (3 mmol), HOBt (3 mmol) og NMM (5 mmol) i 5 ml DMF for å gi peptidet (1.72 g, 2 mmol) som et faststoff.
Trinn 2: MeOAz-D-Arg(PMC)-Leucinal dietylacetal.
Ved anvendelse av metode C (Eksempel 9), ble monometylazelat (1.0 mmol) koblet med Ng<->(2,2,5,7,8-pentametylkroman-6-sulfonyl)-D-arginyl-L-leucinal dietylacetal (0.54 g, 0.88 mmol) oppnådd fra produktet i tittelen i trinn 1 ved metode B (Eksempel 8) ved bruk av BOP (1 mmol), HB Ot (1 mmol) og NMM (3 mmol) i 5 ml DMF for å gi produktet (0.735 g).
Trinn 3: Monometylazelayl-Ng<->(2,2,5,7,8-pentametylkroman-6-sulfonyl)-D-arginyl-L-leucinal.
Ved bruk av metode E (Eksempel 11) ble produktet (0.1 g) fra trinn 2 omdannet til Forbindelse 29 og renset ved HPLC. <*>H NMR (300 MHz, CDC13) 8: 9.49 (s, 1H), 7.74 (t, 1H), 7.43 (d, 1H), 6.43 (d, 1H), 6.34 (s, 2H), 4.60 (m, 1H), 4.51 (s, 3H), 4.54 (s, 3H), 4.37 (m, 1H), 3.66 (s, 3H), 3.31 (m, 2H), 2.63 (t, 2H), 2.26 (m, 4H), 2.09 (s, 3H), 1.80 (t, 2H), 1.57 (m, 7H), 1.26 (m, 16H), 0.90 (dd, 6H).
Eksempel 30
Monometylazelayl-N<8->(2,2,5,7,8-pentametylkroman-t-sulfonyl)-L-arginyl-L-norleucinal
Trinn 1: Fmoc-N<8->(2,2,5,7,8-pentametylkroman-6-sulfonyl)-L-arginyl-L-norleucinal.
Fmoc-Arg(PMC)-OH (2 mmol) ble koblet med norleucinal dietylacetal (2 mmol, oppnådd fra CBZ-Nle-OH ved å følge prosedyren i fremstillingen av Leu-acetal) ved anvendelse av BOP (2 mmol), HOBt (2 mmol) og NMM (6 mmol) i 6 ml DMF, ifølge metode C (Eksempel 9) for å gi peptidet (1.37 g, 1.64 mmol).
Trinn 2: MeOAz-Arg(PMC)-L-norleucinal dietylacetal.
Ved å følge metode C (Eksempel 9) ble monometylazelat (2 mmol) koblet med Arg(PMC)-norleucinaldietylacetal (1.39 mmol, oppnådd fra trinn 1 ved å følge metode B, Eksempel 8) ved anvendelse av BOP (2 mmol), HOBt (2 mmol) og NMM (6 mmol) og omrørt over natten. Den neste dag ble 1 mmol av hver av monometylazelat, BOP, HOBt og NMM tilsatt og omrørt i 4 timer. Reaksjonsblandingen ble opparbeidet som i metode C (Eksempel 9), for å gi peptid (0.37 g, 0.84 mmol).
Trinn 3: Ved å følge metode E (Eksempel 11) ble produktet fra Eksempel 2 (0.94 g, 0.84 mmol) omdannet til Forbindelse 30 (0.58 g). 'H NMR (300 MHz, CDC13) 5: 9.54 (s, 1H), 7.49 (t, 1H), 6.74 (d, 1H), 6:26 (s, 2H), 6.23 (d, 1H), 4.58 (m, 1H), 4.31 (m, 1H), 3.66 (s, 3H), 3.34 (m, 2H), 2.63 (t, 2H), 2.58 (s, 3H), 2.56 (s, 3H), 2.29 (t, 2H), 2.23 (t, 2H), 1.9-1.5 (m, 22H), 1.30 (s, 6H), 0.86 (t, 3H).
Eksempel 31
Monometylazelayl-NB<->(p-toluensulfonyl)-L-arginyl-L-leucinal
Trinn 1: Fmoc-N<8->(p-toluensulfonyl)-L-arginyl-L-leucinaldietylacetal.
Ved anvendelse av metode C (Eksempel 9), ble Fmoc-N<8->(p-toluensulfonyl)-L-arginin (5 mmol) koblet med laucinaldietylacetal (5.5 mmol) ved bruk av HBTU (5.5 mmol), HOBt (5.5 mmol) og NMM (11 mmol) i 15 ml DMF. Peptidet ble isolert som et faststoff (2.86 g, 3.96 mmol).
Trinn 2: Monometylazelayl-^-^-toluensulfon<y>^-L-ar<g>in<y>l-L-leucinaldietylacetal.
Ved å følge metode C (Eksempel 9), ble monoetylazelat (6 mmol) koblet med N<8->(p-toluensulfonyl)-L-arginyl-L-leucinaldietylacetal (2.7 g, 4.7 mmol, oppnådd fra trinn 1 ved anvendelse av metode B, Eksempel 8), ved anvendelse av 1-benzotriazol-l-yl-1,1,3,3,-tetrametyluronium heksafluorfosfat (HBTU) (6 mmol), HOBt (6 mmol) og NMM (12 mmol) i 15 ml DMF og omrørt over natten. Reaksjonsutbyttet ble forsterket ved tilsetting av monometylazelat (3 mmol) og difenylfosforylazid (3 mmol) og omrørt i 4 timer for å gi peptidet som et faststoff (1.92 g).
Trinn 3: Monometylazelayl-N<8->(p-toluensulfonyl)-L-arginyl-L-leucinal.
Ifølge metode E (Eksempel 11), ble produktet fra trinn 2 (1.92 g, 2.8 mmol) omdannet til Forbindelse 31 (1.64 g). 'H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 8: 9.37 (s, 1H), 8.97 (d, 1H), 8.37 (d, 1H), 7.66 (d, 2H), 7.37 (m, 1H), 7.29 (d, 2H), 7.03 (s, 1H), 6.63 (s, 1H), 4.09 (m, 1H), 3.57 (s, 3H), 3.44 (m, 1H), 3.04 (m, 2H), 2.26 (s, 3H), 2.33 (t, 2H), 2.13 (t, 2H), 2.80 - 1.09 (m, 7H), 0.86 (dd, 6H).
Eksempel 32
Monometylazelayl-Ne<->(4-metoksy,2,3,6-trimetyl-l-sulfonyl)-L-arginyl-L-leucinal semikarbazon
Se Basak, A. et al., Int. J. Peptide Protein Res. 36, 7 - 17 (1990). En blanding av MeOAz-Arg(MTR)-Leu-H (Eksempel 34) (67 mg, 0.10 mmol), semikarbazid
hydroklorid (11 mg, 0.1 mmol) og natriumacetat (9 mg, 0.11 mmol) i 3 ml 90 % EtOH ble oppvarmet til 70 °C i 18 timer. Reaksjonsblandingen ble konsentrert for å gi et lyst gult faststoff (Eksempel 32) som deretter ble renset for HPLC som i Tabell 6. <!>H NMR (300 MHz, CDC13) 5: 97.91 (t, 1H), 7.09 (d, 1H), 6.68 (s, 1H), 6.22 (s, 1H), 4.37 - 4.46 (m, 1H), 4.2 - 4.3 (m, 1H), 4.04 (d, 1H), 3.7 (s, 3H), 3.58 (s, 3H), 2.6 (s, 3H), 2.27 (dd, 2H), 2.05, 2.12 (s, 3H), 1.2 -1.64 (m, 12H), 0.85 (t, 6H)
Eksempel 33
MonometylazeIayl-N<8->(4-metoksy,2,3,6-trimetyl-l-suIfonyl)-L-arginyl-L-leucinal tiosemikarbazon)
Ved å følge de samme trinn som i Eksempel 32, ble Forbindelse 33 fremstilt fra Forbindelsen i Eksempel 34 (51 mg, 0.07 mmol) og tiosemikarbazid (7 mg, 0.07 mmol) i 2 ml 90 % EtOH.
Eksempel 34
Monometylazelayl-Ng<->(4-metoksy,2,3,6-trimetylbenzen-l-sulfonyl)-L-arginyl-L-leucinal
Trinn 1: Ved å følge metode C (Eksempel 9), ble 9-fluorenyl-metyloksykarbonyl-N<B>(4-metoksy-2,3,6-trimetyl-benzen-l-sulfonyl)-L-arginyl-L-leucinal dietylacetal fremstilt fra9-fluorenylmetyloksykarbonyl-NB-(4-me arginin og L-leucinal dietylacetal.
Trinn 2: Monometylazelayl-NB<->(4-metoksy-2,3,6-trimetylbenzensulfonyl)-L-arginyl-L-leucinal.
Ved å følge metode C (Eksempel 9), ble monometylazelat (6 mmol) koblet med N<8->(4-metoksy-2,5,6-tirmetyhlbenzen-l-sulfonyl)-L-arginyl-L-leucinal dietylacetal (5 mmol, oppnådd fra trinn 1 ved anvendelse av metode B, Eksempel 8), og peptidet ble isolert som et amorft faststoff (3.3 g).
Trinn 3: Metoksyazelayl-Ng-(4-metoksy-2,3,6-tirmetylbenzen-l-sulfonyl)-L-arginyl-L-leucinal.
Produktet fra trinn 2 (0.5 g) ble omdannet til Forbindelse 34 (0.36 g) ifølge metode E, Eksempel 11. 'H NMR (300 MHz, CDC12) 8: 9.54 (s, 1H), 7.51 (s, 1H), 6.74 (d, 1H), 6.57 (s, H), 6.40 (s, 2H), 6.31 (s, 1H), 4.66 (m, 1H), 4.41 (m, 1H), 3.87 (s, 3H), 3.70 (s, 3H), 3.33 (m, 2H), 2.73 (s, 3H), 2.66 (s, 3H), 2.33 (t, 2H), 2.26 (t, 2H), 2.17 (s, 3H), 2.00 - 1.26 (m, 17H), 0.96 (dd, 6H).
Eksempel 35
Metoksyazelayl-NB<->(2,4,6-trimetylbenzen-l-sulfonyl)-L-arginyl-L-leucinal
Trinn 1: Fmoc-N<8->(2,4,6-trimetylbenzen-l-sulfonyl)-L-arginyl-L-leucinal dietylacetal.
En oppløsning av 4 M HC1 i dioksan (10 ml) ble tilsatt til en oppløsning av Boc-Arg(MTS)-OH (6 mmol) i 10 ml dioksan. Etter 30 minutter ble oppløsningsmiddelet fjernet og eter ble tilsatt, utfellingen ble oppsamlet og tørket (3.21 g, 9 mmol). Arg-MTS-OH hydrokloridet ble omdannet til Fmoc-Arg(MTS)-OH ved å følge prosedyren som beskrevet for fremstilling av tosylderivatet (Eksempel 31) for å gi forbindelsen i tittelen som et hvitt faststoff (2.09 g).
Trinn 2: Fmoc-Arg(MTS)-Leu-acetal.
Ved å følge metode C (Eksempel 9), ble Fmoc-Arg(MTS)-OH (3.361 mmol) koblet med leucinal dietylacetal (4 mmol) ved bruk av HBTU (4 mmol), HOBt (4 mmol) og NMM (10 mmol) i 15 ml DMF for å gi peptidet i tittelen (1.05 g).
Trinn 3: MeOAz-Arg(MTS)-Leu-acetal.
Ved anvendelse av metode C, ble monometylazelat (1.2 mmol) koblet med Arg (MTS)-Leu-acetal (0.85 mmol, oppnådd fra trinn 2, ved bruk av metode B, Eksempel 8), ved anvendelse av BOP (1.2 mmol), HOBt (1.2 mmol) og NMM (3.6 mmol) i 3 ml DMF og omrørt over natten for å gi peptidet i tittelen som et halvfast stoff (0.59 g).
Trinn 4: Metoksyazelaoyl-N8-(2,4,6-tirmetylbenzen-1 -sulfonyl)-L-arginyl-L-leucinal.
Ifølge metode E (Eksempel 11) ble produktet (0.59 g) fra trinn 3, omdannet til Forbindelse 35 (0.54 g) og renset for HPLC. 'H NMR (300 MHz, CDC13) 8: 9.49 (s, 1H), 7.53 (s, 1H), 6.90 (s, 2H), 6.81 (d, 1H), 6.40 (bs, 3H), 4.61 (m, 1H), 4.38 (m, 1H), 3.67 (s, 3H), 2.67 (s, 6H), 2.29 (t, 2H), 2.20 (t, 2H), 2.0 - 1.20 (m, 19H), 0.91 (dd, 6H).
Eksempel 36
Dette er et referanseeksempel, og denne forbindelse er ikke omfattet av foreliggende oppfinnelse.
6-cyano-heksan-l-sulfonyl-Ne<->(2,2,5,7,8-pentametylkroman-6-sulfonyl)-L-arginyl-L-leucinal
Trinn 1: 6-cyano-heksan-l-sulfonyl-NB<->(2,2,5,7,8-pentametylkroman-6-sulfonyl)-L-arginyl-L-leucinal dietylacetal.
6-cyano-heksan-l-sulfonylklorid (0.19 g, 0.89 mmol) fra trinn 14 i metode G (Eksempel 13) ble tilsatt til en oppløsning av produktet (0.55 g, 0.899 mmol) fra trinn 2 i Eksempel 20, i 1 ml DMF og pH i oppløsningen ble justert til 8 ved bruk av NMM. Etter 4 timers omrøring ble reaksjonsblandingen opparbeidet som beskrevet i metode A (Eksempel 7) for å oppnå forbindelsen i tittelen (0.466 g).
Trinn 2: 6-cyano-heksan-l-sulfonyl-Ng-(2,2,5,7,8-pentametylkroman-6-sulfonyl)-L-arginyl-L-leucinal.
Ved anvendelse av metode E (Eksempel 11) ble produktet (0.297 g) fra trinn 1 omdannet til Forbindelse 36 (0.22 g) og renset ved HPLC som beskrevet i Tabell 6. <*>H NMR (300 MHz, DMSO-dg) 8: 9.37 (s, 1H), 6.83 (b, 1H), 6.43 (b, 1H), 3.88 (m, 1H), 3.77 (m, 1H), 3.01 (m, 2H), 2.80 (m, 2H), 2.55 (t, 2H), 2.46 (s, 6H), 2.0 (s, 3H), 1.75 (m, 5H), 1.6-1.3 (m, 15H), 1.23 (s, 6H), 0.84 (dd, 6H).
Eksempel 37
Dette er et referanseeksempel, og denne forbindelse er ikke omfattet av foreliggende oppfinnelse.
2-naftoyl-N<8->nitro-L-arginyl-L-leucinal
Trinn 1: 2-naftoyl-N^-nitro-L-arginyl-L-leucinal dietylacetal.
2-naftoylklorid (0.104g, 0.55 mmol) ble tilsatt til en oppløsning av produktet fra trinn 2 i Eksempel 14 i 2 ml DMF og NMM (0.18 ml) og forbindelsen i tittelen ble opparbeidet for å oppnå forbindelsen som et faststoff (0.22 g). <*>H NMR (300 MHz, CDC13) 8: 8.92 (b, 1H), 8.0 - 7.91 (mm, 10H), 6.93 (d, 1H), 5.07 (m, 1H), 4.37 (d, 1H), 4.17 (m, 1H),
3.69 (m, 3H), 3.53 (m, 3H), 3.38 (m, 2H), 1.77,1.58,1.4 (mm, 5H), 0.83 (dd, 6H).
Trinn 2: 2-naftoyl-NB<->nitro-L-arginyl-L-leucinal.
Ved bruk av metode E (Eksempel 11), ble produktet (0.1 g) fra trinn 1 omdannet til Forbindelsen 37 (60 mg). <*>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 8: 9.43 (s, 1H), 8.72 (d, 1H), 8.53 (m, 2H), 8.0 (m, 6H), 7.6 (m, 2H), 6.20 (m, 1H), 4.57 (m, 1H), 4.14 (m, 1H), 3.92 (m, 1H), 3.2 (m, 2H), 3.0 (d, 1H), 1.77 (m, 5H), 0.86 (m, 6H).
Eksempel 38
CBZ-7-aminoheptanoyl-Ng<->nitro-L-arginyl-L-leucinal
Trinn 1: CBZ-7-aminoheptanoyl-N<8->nitro-L-arginyl-L-leucinal dietylacetal.
Ved å følge metode C (Eksempel 9), ble CBZ-7-aminoheptansyre (0.7g, 2.5 mmol) koblet med produktet fra trinn 2 i Eksempel 14 (0.78 g, 2.0 mmol) ved bruk av BOP (1.1 g, 2.5 mmol), HOBt (0.34 g, 2.5 mmol) og NMM (0.253 ml, 2.5 mmol) for å gi peptidet som et halv-faststoff som ble benyttet direkte i det neste trinn.
Trinn 2: CBZ-7-aminoheptanoyl-Ng<->nitro-L-arginyl-L-leucinal.
Ved å følge metode E (Eksempel 11), ble acetalet fra trinn 1 omdannet til Forbindelse 38 (0.8 g) etter omrøring av reaksjonen i 5 timer. 'H (300 MHz, DMSO-de) 5: 9.30 (s, 1H), 8.47 (s, 1H), 8.46 (s, 1H), 8.29 (d, 1H), 8.11 (t, 1H), 7.80 (s, 1H), 7.64 (d, 1H), 7.31 (s, 1H), 7.23 (s, 5H), 4.91 (s, 2H), 4.23 (m, 1H), 4.00 (m, 1H), 3.51 (q, 2H), 3.27 (m, 2H), 2.89 (q, 2H), 2.11 (t, 2H), 2.03 (t, 2H), 1.7 -1.00 (m, 10H), 0.77 (dd, 6H).
Eksemplene 39 - 42 beskriver syntesen av MCP inhibitorene opplistet i Tabell 7.
Eksempel 39
10-cyano-2-cyklopentyl-dekanoyl-Ne<->nitro-L-arginyl-L-leucin klormetylketon.
I dette og de følgende tre eksemplene, ble inhibitorene ifølge oppfinnelsen fremstilt ved Koblingsprosedyre II. I ethvert tilfelle ble 10-cyano-2-cyklopentyl-dekanoyl-N<8->nitro-L-arginin fremstilt som heri beskrevet, koblet til et enzymreaktivt aminosyrederivat for å gi inhibitoren. Disse inhibitorene ble oppnådd som en blanding av to eller flere diastereoisomerer som i noen tilfeller kan være separerbare ved HPLC.
A) 10-cyano-2-cyklopentyl-decanoyl-Ne<->nitro-L-arginin metylester.
Ved å følge prosedyren i metode C (Eksempel 9) ble lO-cyano-2-cyklopentyl-dekansyre (2.4 g; 11 mmol) fra eksempel 13, trinn 5, i 26 ml DMF, omrørt med N<8->nitro-Larginin metylester dihydroklorid (2.86 g, 11 mmol), BOP (6.6 g, 15 mmol), HOBt (1.62 g, 12 mmol) og 3.6 ml NMM (33 mmol) for å gi 4.8 g av metylesteren som et skumaktig faststoff. <1>H-NMR(300 MHz, CDC13) 8: 8.75 (bs, 1H), 7.81 (bs, 2H), 6.42 (d, 1H), 4.67 (t, 1H), 3.82 (s, 3H), 3.75 (m, 1H), 3.32 (m, 1H), 2.15 (t, 2H), 2.05 -1.12 (m, 28H).
B) 10-cy ano-2-cyklopentyl-dekanoyl-N8-nitro-L-arginin.
En oppløsning av 5.5 g av metylesteren fra del "A" ovenfor i 30 ml metanol ble behandlet med 24 ml 1.00 N vandig natriumhydroksyd. Etter 2 timer ble 100 ml 2 % vandig natriumbikarbonatoppløsning tilsatt og den resulterende oppløsning ble ekstrahert med 100 ml eter. Det vandige laget ble separert og surgjort med 3 % vandig sitronsyre og ekstrahert med 250 ml etylacetat. Det resulterende organiske laget ble separert, tørket over vannfri MgSC^og avdampet for å gi en fargeløs gummi som ble triturert med petroleumseter for å gi et fint hvitt pulver med vekt 4.4 g. !H-NMR (300 MHz, CDC13) 8: 10.6 (bs, 1H), 8.75 (bs, 1H), 7.82 (bs, 2H), 6.41 (d, 1H), 6.47 (t, 1H), 3.71 (m, 1H), 3.32 (m, 1H), 2.15 (t, 2H), 2.04 -1.12 (m, 30H).
C) 10-cyano-2-cyklopentyl-dekanoyl-Ng<->nitro-L-arginyl-L-leucin klorometylketon. En blanding av 467 mg (1.0 mmol) av produktet fra "B" ovenfor og 270 mg (1.0 mmol) leucin klorometyl keton hydroklorid (Bachem Biosciences, Inc., King of Prussia, Pennsylvania), 440 mg (1.0 mmol) BOP og 135 mg (1 mmol) HOBt i 4.0 ml DMF ble
behandlet med 0.33 ml (3 mmol) NMM. Etter 4 timer ble blandingen fortynnet med 75 ml etylacetat, vasket med 2 % vandig NaHC03, vann, 3 % vandig sitronsyre og endelig med vann. Det organiske laget ble separert og tørket (MgSO^ og endelig avdampet for å gi en blekt gul, viskøs olje. Denne forbindelsen ble renset ved flash-kromatografi
gjennom en 22.9 x 1.3 cm kolonne med silikagel 60-H ved anvendelse av etylacetat for eluering. Den resulterende oppløsningen ble avdampet for å gi en fargeløs gummi som stivnet ved henstand i 1:1 etylacetat/eter for å gi 198 mg av fargeløst fast klormetylketon. HPLC indikerte nærvær av to diastereoisomerer som ble separert ved preparativ RP-HPLC. I en vann-acetonitril oppløsningsmiddelgradient (30 - 80 % acetonitril i løpet av 40 minutter), ble toppene ved 22.58 minutter (diastereoisomer a) og 23.7 min.
(diastereoisomer b) isolert.
Diastereoisomer a: <!>H-NMR(300 MHz, CDC13) 8: 8.53 (bs, 1H), 7.61 (bs, 2H), 7.31 (bs, 1H), 6.69 (d, 1H), 4.73 (m, 1H), 4.65 (m, 1H), 4.28 (q, 2H), 3.53 (m, 1H), 3.31 (t, 1H), 2.32 (t, 2H), 1.90 -1.11 (m, 31H), 0.93 (q, 6H).
Diastereoisomer b: 'H-NMR (300 MHz, CDC13) 8: 8.53 (bs, 1H), 7.61 (bs, 2H), 7.31 (bs, 1H), 6.79 (d, 1H), 4.73 (m, 1H), 4.65 (m, 1H), 4.28 (q, 2H), 3.53 (m, 1H), 3.31 (t, 1H), 2.32 (t, 2H), 1.90 -1.11 (m, 31H), 0.93 (q, 6H).
Eksempel 40
10-cyano-2-cyklopentyl-dekanoyl-Ng-nitro-L-arginyl-borleucin pinakolester
En oppløsning av 467 mg (1.0 ml 10-cyano-2-cyklopentyl-dekanoyl-Ng-nitro-L-arginin (Eksempel 39, del "B" ovenfor) og 264 mg (1.0 mmol) borleucin pinakolester hydroklorid fremstilt ved fremgangsmåten ifølge Shenvi, U.S. Patent 4.537.773,440 mg (1.0 mmol) BOP og 135 mg (1.0 mmol) HOBt i 5.0 ml DMF, ble behandlet med 0.33 ml (3 mmol) NMM. Etter 2 timer ble blandingen fortynnet med 75 ml etylacetat og vasket med 2 % vandig NaHC03 og vann og det organiske laget ble separert, tørket (MgS04) og avdampet for å gi 410 mg av et blekt brunt pulver. Dette faststoffet ble vasket med kloroform for å gi 290 mg av produktet som et nær hvitt faststoff som viste en enkelt topp ved HPLC. 'H-NMR (300 MHz, CDC13) 8: 8.53 (bs, 1H), 7.65 (bs, 2H), 6.71 (t, 1H), 4.61 (m, 1H), 3.52 (m, 1H), 3.31 (m, 2H), 3.05 (m, 1H), 2.82 (m, 1H), 2.38 (t, 2H), 2.06 - 1.42 (m, 28H), 1.22 (s, 12H), 1.15 (m, 2H), 0.92 (m, 6H).
Eksempel 41
10-cyano-2-cyklopentyl-dekanoyI-NB<->nitro-L-arginyl-L-leucin alfa-ketoetylamid
A) 10-cyano-2-cyklopenryl-dekanoyl-Ng-nitro-L-arginyl-(l-etylaminokarbonyl 1-hydroksy-4-metyl)-2-pentylamid
En oppløsning av 467 mg (1.0 mmol) 10-cyano-2-cyklopentyl-dekanoyl-N<8->nitro-L-arginin og 225 mg 3-amino-2-hydroksy-5-metyl-heksansyre N-etylamid hydroklorid (fremstilt ved fremgangsmåten ifølge Harbeson et al., J. Med. Chem. 37,2918 - 29
(1994)) i 5.0 ml DMF, ble behandlet med 440 mg (1 mmol) BOP, 135 mg (1 mmol)
HOBt og 0.33 ml (3 mmol) NMM. Etter omrøring i 2 timer ble oppløsningen fortynnet med 75 ml etylacetat og vasket med 2 % vandig NaHC03, vann, 3 % vandig sitronsyre, vann og tørket (MgS04) for å gi, etter avdamping, 540 mg av hydroksyforbindelsen som et nær hvitt faststoff. <!>H-NMR (300 MHz, CDC13) 5: 8.53 (bs, 1H), 7.73 (bs, 2H), 7.04 (bm, 1H), 6.83 (t, 1H), 4.52 (m, 1H), 4.19 (m, 1H), 4.11 (q, 2H), 3.46 (q, 2H), 3.26 (m, 2H),2.35 (t, 2H), 1.91 (m, 2H), 1.83 (m, 2H), 1.8 -1.2 (m, 28H), 1.13 (t, 3H), 0.88 (m, 6H). B) 10-cyano-2-cyklopentyl-dekanoyl-N<8->nitro-L-arginyl-L-leucin alfa-ketoetylamin.
En oppløsning av 250 mg av hydroksyforbindelsen fra del "A" ovenfor, i 6.0 ml tørr diklormetan, ble avkjølt til 0 °C og omrørt med 225 mg (ca.0.5 mmol) Dess-Martin reagent (D.B. Dess og J.C. Martin, J. Org. Chem. 48,4156 - 4158 (1983)).
Reaksjonsblandingen ble oppvarmet til romtemperatur og omrørt i 2 timer. Den uklare suspensjonen ble fortynnet med 50 ml etylacetat og filtrert gjennom finsintret glassfilter. Filtratet ble vasket med 10 % vandig Na2S203 og så med mettet NaCl. Den ble tørket (MgS04) og avdampet for å gi 180 mg hvitt fast ketoamidprodukt. Den ble renset ved preparativ RP-HPLC ved bruk av en vann-acetonitril gradient (40 - 70 % acetonitril i 40 min.). Toppene ved 18.07 min. (diastereoisomer a) og 19.54 min.
(diastereoisomer b) ble oppsamlet.
Diastereoisomer a: 'H-NMR(300 MHz, CDC13) 8: 8.45 (bs, 1H), 7.58 (bs, 2H), 7.04 (bm, 2H), 6.57 (t, 1H), 5.33 (t, 1H), 4.60 (m, 1H), 3.51 (m, 1H), 3.33 (m, 3H), 2.35 (t, 2H), 1.91 - 1.11 (m, 34H), 0.94 (m, 6H).
Diastereoisomer b: 'H-NMR (300 MHz, CDC13) 8: 8.45 (bs, 1H), 7.48 (bs, 2H), 7.25 (m, 1H), 7.04 (t, 1H), 6.85 (m, 1H), 6.62 (d, 1H), 5.32 (t, 1H), 4.81 (m, 1H), 4.58 (m, 1H), 3.51 (m, 1H), 3.35 (m, 3H), 2.35 (t, 2H), 1.95 -1.11 (m, 32H), 0.98 (m, 6H).
Eksempel 42
10-cyano-2-cyklopentyl-dekanoyl-Ne-nitro-L-arginyl-fenylalanin fluormetylketon
A) Syntese av l-nitro-2-fenyletan.
Til en omrørt blanding av trans-P-nitrostyren (5.25 g, 0.035 mol) og silikagel (10 g, 230-400 mesh) i kloroform (400 ml) og isopropanol (75 ml) ved romtemperatur, ble det sakte tilsatt natriumborhydrid (5.50 g, 0.145 mol) i løpet av 45 minutter. Reaksjonsblandingen ble omrørt i ytterligere 15 minutter og så forsiktig stanset med 10 % saltsyre (20 ml). Separat faststoff ble filtrert og vasket med kloroform (50 ml). Kombinerte filtrater og vaskingen ble vasket med vann (1 x 20 ml), saltvann (1 x 20 ml) og tørket over vandig natriumsulfat. Avdamping av oppløsningsmiddel over redusert trykk ga et råmateriale som ble renset ved flash-kromatografi (silikagel, 8 % etylacetat-heksan) for å gi 2.86 g l-nitro-2-fenyletan som en fargeløs olje (krydderaktig lukt); Rf (10 % etylacetat i heksan): 0.40; <1>H-NMR(300 MHz, CDC13) 7.40 - 7.20 (m, 5H), 4.60 (t, 2H), 3.30 (t, 2H).
B) Syntese av l-fluor-2-hydroksy-3-nitro-4-fenylbutan.
Til en avkjølt (-78 °C) oppløsning oksalylklorid (2M) i metylenklorid (11.60 ml, 0.0232 mol) ble sakte tilsatt dimetylsulfoksid (3.65 g, 3.32 ml, 0.0467 mol). Reaksjonsblandingen ble omrørt i 15 minutter. En oppløsning av 2-fluoretanol (1.16 g, 0.0181 mol) i metylenklorid (10 ml) ble så sakte innført i reaksjonsflasken. Etter omrøring i ytterligere 15 minutter ble reaksjonsblandingen fortynnet med vannfri metylenklorid (180 ml) og trietylamin (9.20 g, 12.63 ml, 0.090 mol) ble tilsatt til denne. Omrøringen ble fortsatt i ytterligere 2 timer ved hvilken tid temperaturen hadde steget til romtemperatur. Ved denne tiden ble en oppløsning av l-nitro-2-fenyletan (2.74 g, 0.0181 mol) i vannfri metylenklorid (10 ml) tilsatt til reaksjonsblandingen og omrøring ble fortsatt over natten. Blandingen ble så vasket med vann (1 x 30 ml), 4 % saltsyre (3 x 20 ml), vann (1 x 20 ml), mettet natriumbikarbonat oppløsning (2 x 20 ml) og saltvann (1 x 20 ml). Tørking over vannfri natriumsulfat og oppløsningsmiddel-avdamping av råmateriale som var renset ved flash-kromatografi (silikagel, 25 % etylacetatheksan) ga produktet som erytro og treoisomerer. Kombinert utbytte var 3.01 g. En generell beskrivelse av prosedyren kan bli funnet i Imperiali, B., et al., Tetrahedron Lett. 27(2), 135 (1986) og i Revesz, L., et al., Tetrahedron Lett. (35(52), 9693 (1994).
Isomer a var et hvitt faststoff, smp. 71 - 73 °C, Rf (30 % etyl acetat i heksan): 0.46, <*>H-NMR(300 MHz, CDC13) 8: 7.40 - 7.10 (m, 5H), 4.90 (m, 1H), 4.60 (m, 1H), 4.50 - 4.30 (m, 2H), 3.45 - 3.25 (m, 2H), 2.70 (d, 1H).
Isomer b var en fargeløs olje: Rf (30 % etylacetat i heksan): 0.42; 'H-NMR (300 MHz, CDC13) 8: 7.40 - 7.15 (m, 5H), 4.90 (m, 1H), 4.65 (m, 1H), 4.50 (m, 1H), 4.20 (m, 5H), 4.90 (m, 1H), 4.65 (m, 1H), 4.50 (m, 1H), 4.20 (m, 1H), 3.40 - 3.30 (m, 2H), 2.90 (d, 1H).
C) Syntese av 3-amino-l-fluor-2-hydroksy-4-fenlbutan.
En blanding av isomer a ovenfor (0.48 g, 2.25 mmol), absolutt etanol (20 ml) og Raney-Nickel (katalytisk) ble hydrogenert (476 kPa) i et Parr apparat i 5 timer. Filtreringen gjennom Celite pute og oppløsningsmiddelavdamping ga 410 mg av aminoisomer a. Tilsvarende behandling av isomer b ovenfor (800 mg, 3.75 mmol) ga 510 mg av aminisomer b.
Aminisomer a var et hvitt faststoff, smp. 64 - 67 °C; 'H-NMR (300 MHz, CDC13) 8: 7.40 - 7.10 (m, 5H), 4.70 (d, 1H), 3.90 - 3.70 (m, 1H), 3.30 - 3.10 (m, 1H), 2.95 (dd, 1H), 2.60 - 2.45 (q, 1H), 2.20 - 1.70 (bred, 3H).
Aminisomer b var et hvitt faststoff, smp. 67 - 70 °C; 'H-NMR (300 MHz, CDC13) 8: 7.40 - 7.10 (m, 5H), 4.70 (d, 1H), 4.55 (d, 1H), 3.70 - 3.50 (m, 1H), 3.20 - 3.00 (m, 1H), 2.95 (dd, 1H), 2.60 - 2.45 (q, 1H), 2.20 - 1.65 (bred, 3H).
D) 10-cyano-2-cyklopentyl-dekanoyl-NB<->nitro-L-arginyl-(4-fluor-3-hydroksy-l-fenyl)-2-butylamid
En oppløsning av 467 mg (1.0 mmol) 10-cyano-2-cyklopentyl-dekanoyl-N<8->nitro-L-arginin og 183 mg (1.0 mmol) 3-amino-l-fluor-2-hydroksy-4-fenyl-butan i 5.0 ml DMF ble behandlet med 440 mg (1.0 mmol) BOP, 135 mg (1.0 mmol) HOBt og 0.33 ml (3 mmol) NMM. Etter omrøring i 2 timer ble oppløsningen fortynnet med 75 ml etylacetat og vasket med 2 % vandig NaHC03, vann, 3 % vandig sitronsyre, vann og tørket (MgSCv) for etter avdamping å gi 480 mg av hydroksyforbindelsen som et nær hvitt faststoff. 'H-NMR (300 MHz, CDC13+ dVDMSO) 6: 8.15 (bs, 1H), 7.82 (bs, 2H), 7.21 (m, 6H), 5.05 (t, 1H), 4.51 (m, 1H), 4.22 (m, 1H), 3.82 (m, 1H), 3.75 (m, 2H), 2.95 (q, 2H), 2.35 (t, 2H), 2.04 - 1.13 (m, 31H).
E) 10-cyano-2-cykIopentyl-l-dekanoyl-N8-nitro-L-arginyl-fenylalanin fluormetylketon
En oppløsning av 250 mg av hydroksyforbindelsen fra del "C" ovenfor i 6.0 ml vannfri diklormetan ble avkjølt til 0 °C og omrørt med 225 mg (ca. 0.5 mmol) Dess-Martin reagens. Reaksjonen ble oppvarmet til romtemperatur og omrørt i 2 timer. Den uklare suspensjonen ble fortynnet med 50 ml etylacetat og filtrert gjennom et finsintret glassfilter. Filtratet ble vasket med 10 % vandig Na2S203 og med mettet NaCl. Den ble tørket (MgS04) og avdampet for å gi 180 mg hvitt faststoff. Etter HPLC rensing ble 42 mg ren fluormetylketonprodukt oppnådd. 'H-NMR (300 MHz, CDC13) 6: 8.56 (bs, 1H), 7.62 (bs, 2H), 7.42 (t, 1H), 7.21 (m, 5H), 6.63 (m, 1H), 5.05 - 4.53 (m, 4H), 3.46 (m, 1H), 3.18 (m, 2H), 2.98 (q, 2H), 2.33 (t, 2H), 2.04 -1.13 (m, 27H).

Claims (15)

1. Forbindelse, karakterisert ved formelen: hvor Ri er valgt fra gruppen bestående av -C=N, -C(=0)OR9, ftalimid, -NH-SO2R9 og -NH-CBZ; R2 er valgt fra gruppen omfattende H, og cykloalkyl som har fra tre til syv karbonatomer; R3 er valgt fra gruppen omfattende -(CH2)m-NH-C(=N-R5)-NH2, og -R6-NO2, R4 er -CH(CH2-R7)-Q; Q er valgt fra gruppen omfattende -CH-R8, -C(=0)CH3, -C(=0)CH2C1, -C(=0)CH2Br, -C(=0)CH2F, -C(=0)CHF2, -C(=0)CF3, -C(=0)C(=0)NH-R7, -B(OH)2, p er 2 eller 3; R5 er valgt fra gruppen omfattende -NO2, og -J; Re er -(CH2)m-NH-C(=NH)-NH-; R7 er valgt fra gruppen omfattende fenyl og alkyl som har fra en til åtte karbonatomer hvor nevnte alkylgruppe eventuelt er substituert med en eller flere halogenatomer, eller en fenylgruppe; Rg er valgt fra gruppen omfattende =0, =N-NHC(=0)-NH2, =N-OH, =N-OCH3, =N-0-CH2-C6H5, =NNH-C(=S)-NH2; R9 er valgt fra gruppen omfattende hydrogen og alkyl som har fra en til seks karbonatomer, hvor nevnte alkylgruppe eventuelt er substituert med eller flere halogenatomer, eller en fenylgruppe; J er en beskyttende gruppe valgt blant -PMC, -MTR, -MTS, -TOS og -CBZ; n er et helt tall fra 3 til 10; og m er et helt tall fra 2 til 5.
2. Forbindelsen ifølge krav 1, karakterisert ved at Ri er valgt fra en gruppe bestående av -C=N, -C(=0)OCH3, ftalimid og -NH-S02CF3.
3. Forbindelsen ifølge krav 1, karakterisert ved at R2 er valgt fra gruppen bestående av H og cyklopentyl.
4. Forbindelsen ifølge krav 1, karakterisert ved at R3 er -(CH2)3-NH-C(=N-R5)-NH2.
5. Forbindelsen ifølge krav 1, karakterisert ved at R7 er valgt fra gruppen omfattende -CH(CH3)2, - (CH2)2-CH3 og -CeHs.
6. Forbindelsen ifølge krav 1, karakterisert ved at Q er -CH-R8.
7. Forbindelsen ifølge krav 1, karakterisert ved at Q er valgt fra gruppen omfattende -C(=0)CH3, -C(=0)CH2C1, -C(=0)CH2Br, -C(=0)CH2F, -C(=0)CHF2, -C(=0)CF3, -C(=0)C(=0)NH-R7, -B(OH)2,
8. Forbindelsen ifølge krav 1, karakterisert ved atQ er valgt fra gruppen omfattende -CH-Rg, -B(OH)2, -C(=0)C(=0)NH-R7,
9. Forbindelsen ifølge krav 6, karakterisert ved at Rg er valgt fra gruppen omfattende =0, =N-NHC(=0)-NH2, =N-OH, =N-OCH3, =N-0-CH2-C6H5 og =NNH-C(=S)-NH2.
10. Forbindelsen ifølge krav 1, karakterisert ved at Ri er valgt blant gruppen omfattende -C(=0)OCH3, ftalimid og -NHS02CF3; R2 er cyklopentyl; R3 er -(CH2)3-NH-C(=N-N02)-NH2; Q er -CH-R8; R7 er -CH(CH3)2; og Rg er =0.
11. Forbindelsen ifølge krav 1, karakterisert ved at Ri er -C=N; R2 er cyklopentyl; R3 er valgt fra gruppen bestående av -(CH2)3 -NH-C(=N-J) -NH2; Q er -CH-Rg; R7 er -CH(CH3)2; og Rg er =0.
12. Forbindelsen ifølge krav 1, karakterisert ved at Ri er -C^N; R2 er cyklopentyl; R3 er valgt fra gruppen bestående av -(CH2)3.NH-C (=N-N02)-NH2 og -(CH2)3.NH-C(=N-J)-NH2; Q er valgt fra gruppen bestående av -B(OH)2, -C(=0)C(=0)NH-R7, og R7 er valgt fra gruppen bestående av -CH(CH3)2 og -CH2-CH3.1
13. Forbindelsen ifølge krav 1, karakterisert ved at Ri er -C=N; R2 er cyklopentyl; R3 er valgt fra gruppen bestående av -(CH2)3-NH-C (=N-N02)-NH2 og -(CH2)3-NH-C(=N-J)-NH2; Q er -CH-R8; R7 er -CH(CH3)2; og Rg er valgt fra gruppen omfattende =N-NHC(=0)-NH2, =N-OH, N-OCH3 og =N-0-CH2-C6H5.
14. Farmasøytisk sammensetning, karakterisert ved at den omfatter en forbindelse ifølge krav 1 og en farmasøytisk akseptabel bærer.
15. Anvendelse av en forbindelse ifølge krav 1 for fremstilling av et preparat for behandling av en muskelnedbrytende forstyrrelse valgt blant dystrofi, hjertekakesi, emfysem, diabetes, lepra, feilernæring, osteomalaki og cancerkakesi.
NO19972104A 1994-11-14 1997-05-07 Multikatalytiske proteaseinhibitorer, farmasoytiske sammensetninger omfattende disse og deres anvendelse NO324066B1 (no)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/337,795 US5550262A (en) 1994-11-14 1994-11-14 Multicatalytic protease inhibitors
US46439895A 1995-06-05 1995-06-05
US08/552,794 US5614649A (en) 1994-11-14 1995-11-03 Multicatalytic protease inhibitors
PCT/US1995/014921 WO1996014857A1 (en) 1994-11-14 1995-11-14 Multicatalytic protease inhibitors

Publications (3)

Publication Number Publication Date
NO972104D0 NO972104D0 (no) 1997-05-07
NO972104L NO972104L (no) 1997-06-13
NO324066B1 true NO324066B1 (no) 2007-08-06

Family

ID=27407222

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO19972104A NO324066B1 (no) 1994-11-14 1997-05-07 Multikatalytiske proteaseinhibitorer, farmasoytiske sammensetninger omfattende disse og deres anvendelse

Country Status (18)

Country Link
US (3) US5614649A (no)
EP (1) EP0789578B1 (no)
JP (2) JP3056258B2 (no)
KR (1) KR100420774B1 (no)
CN (1) CN1166403C (no)
AT (1) ATE241998T1 (no)
BR (1) BR9509665A (no)
CA (1) CA2202760A1 (no)
DE (1) DE69530993T2 (no)
DK (1) DK0789578T3 (no)
ES (1) ES2200010T3 (no)
FI (1) FI118325B (no)
HK (1) HK1004638A1 (no)
MX (1) MX9703564A (no)
NO (1) NO324066B1 (no)
NZ (1) NZ296479A (no)
PT (1) PT789578E (no)
WO (1) WO1996014857A1 (no)

Families Citing this family (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6083903A (en) 1994-10-28 2000-07-04 Leukosite, Inc. Boronic ester and acid compounds, synthesis and uses
US5614649A (en) * 1994-11-14 1997-03-25 Cephalon, Inc. Multicatalytic protease inhibitors
DE69625575T2 (de) 1995-10-25 2003-09-25 Senju Pharma Co Angiogense-Inhibitor
US6214800B1 (en) 1995-10-25 2001-04-10 Senju Pharmaceutical Co., Ltd. Angiogenesis inhibitor
EP1006798A4 (en) 1996-09-05 2003-03-05 Massachusetts Inst Technology COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING NEUROLOGICAL DISORDERS AND NEURODEGENERATIVE DISEASES
US6184248B1 (en) 1996-09-05 2001-02-06 Robert K. K. Lee Compositions and methods for treatment of neurological disorders and neurodegenerative diseases
US5939581A (en) * 1997-08-20 1999-08-17 First Chemical Corporation Processes for preparing hydrocinnamic acid
US6150378A (en) 1997-10-07 2000-11-21 Cephalon, Inc. Peptidyl-containing α-ketoamide cysteine and serine protease inhibitors
US6083944A (en) * 1997-10-07 2000-07-04 Cephalon, Inc. Quinoline-containing α-ketoamide cysteine and serine protease inhibitors
US6096778A (en) * 1997-10-07 2000-08-01 Cephalon, Inc. α-ketoamide multicatalytic protease inhibitors
GB9723407D0 (en) * 1997-11-05 1998-01-07 Ciba Geigy Ag Organic compounds
EP1037626A1 (en) * 1997-12-16 2000-09-27 Cephalon, Inc. Multicatalytic protease inhibitors for use as anti-tumor agents
CA2819705C (en) 1998-02-02 2014-07-08 Trustees Of Tufts College Method of regulating glucose metabolism, and reagents related thereto
US6096711A (en) * 1998-02-25 2000-08-01 Sherman; Michael Hsp72 induction and applications
KR20010080267A (ko) 1998-10-20 2001-08-22 밀레니엄 파머슈티컬스 인코퍼레이티드 프로테아솜 억제제 약물 작용을 모니터링하는 방법
US20030054977A1 (en) * 1999-10-12 2003-03-20 Cell Therapeutics, Inc. Manufacture of polyglutamate-therapeutic agent conjugates
US6358928B1 (en) 1999-11-22 2002-03-19 Enzyme Systems Products Peptidyl sulfonyl imidazolides as selective inhibitors of serine proteases
GB0003111D0 (en) * 2000-02-10 2000-03-29 Novartis Ag Organic compounds
EP3078667B1 (en) * 2001-01-25 2018-11-21 The United States of America, represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Formulation of boronic acid compounds
BR0210112A (pt) * 2001-05-30 2004-06-08 Novartis Ag Derivados do ácido 2-{[n-(2-amino-3-(heteroarila ou arila)propionil)-aminoacil]-amino}-alquilborÈnico
CA2468192A1 (en) 2001-11-26 2003-06-05 Trustees Of Tufts College Peptidomimetic inhibitors of post-proline cleaving enzymes
EP1487471A4 (en) 2001-11-26 2010-03-10 Tufts College METHOD FOR TREATING AUTOIMMUNE DISEASES AND ASSOCIATED REAGENTS
US7576206B2 (en) 2003-08-14 2009-08-18 Cephalon, Inc. Proteasome inhibitors and methods of using the same
US7223745B2 (en) * 2003-08-14 2007-05-29 Cephalon, Inc. Proteasome inhibitors and methods of using the same
US7468383B2 (en) * 2005-02-11 2008-12-23 Cephalon, Inc. Proteasome inhibitors and methods of using the same
FR2914920B1 (fr) 2007-04-11 2011-09-09 Clariant Specialty Fine Chem F Procede de deacetalisation d'alpha-aminoacetals.
HUE040417T2 (hu) * 2007-05-04 2019-03-28 Marina Biotech Inc Aminosavlipidek és alkalmazásuk
FR2916441B1 (fr) 2007-05-22 2009-08-28 Clariant Specialty Fine Chem Procede de racemisation d'alpha-aminoacetals optiquement actifs.
US7442830B1 (en) 2007-08-06 2008-10-28 Millenium Pharmaceuticals, Inc. Proteasome inhibitors
FR2927900B1 (fr) 2008-02-27 2010-09-17 Clariant Specialty Fine Chem Procede de preparation d'alpha-aminoacetals optiquement actifs.
MX2010013642A (es) 2008-06-17 2010-12-21 Millennium Pharm Inc Compuestos de ester boronato y composiciones farmaceuticas de los mismos.
CA2733990C (en) * 2008-08-11 2018-12-11 Banyan Biomarkers, Inc. Biomarker detection process and assay of neurological condition
AR075090A1 (es) 2008-09-29 2011-03-09 Millennium Pharm Inc Derivados de acido 1-amino-2-ciclobutiletilboronico inhibidores de proteosoma,utiles como agentes anticancerigenos, y composiciones farmaceuticas que los comprenden.
JP2013506686A (ja) 2009-09-30 2013-02-28 プレジデント アンド フェロウズ オブ ハーバード カレッジ オートファジー阻害遺伝子産物の変調によりオートファジーを変調する方法
CN102725300B (zh) 2009-12-22 2015-03-11 赛福伦公司 蛋白酶体抑制剂及其制备、纯化、和应用的方法
US8354548B2 (en) * 2010-02-19 2013-01-15 Bristol-Myers Squibb Company Glycine chroman-6-sulfonamides for use as inhibitors of diacylglycerol lipase
AR080863A1 (es) 2010-03-31 2012-05-16 Millennium Pharm Inc Derivados del acido1-amino-2-ciclopropiletilboronico, composiciones farmaceuticas que los contienen y uso de los mismos en el tratamiento del cancer.
KR102509950B1 (ko) 2014-05-20 2023-03-14 밀레니엄 파머슈티컬스 인코퍼레이티드 일차 암 치료법 후 사용하기 위한 붕소-함유 프로테아좀 저해제
WO2015195950A1 (en) * 2014-06-20 2015-12-23 Principia Biophamram Inc. Lmp7 inhibitors

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5754157A (en) * 1980-09-19 1982-03-31 Nippon Kayaku Co Ltd L-argininal derivative and its preparation
US4518528A (en) * 1983-05-19 1985-05-21 Rasnick David W α Amino fluoro ketones
US4537773A (en) * 1983-12-05 1985-08-27 E. I. Du Pont De Nemours And Company α-Aminoboronic acid derivatives
US4499082A (en) * 1983-12-05 1985-02-12 E. I. Du Pont De Nemours And Company α-Aminoboronic acid peptides
US4636492A (en) * 1984-08-29 1987-01-13 E. I. Du Pont De Nemours And Company Inhibition of viral protease activity by peptide halomethyl ketones
US4652552A (en) * 1984-09-10 1987-03-24 E. I. Du Pont De Nemours And Company Tetrapeptide methyl ketone inhibitors of viral proteases
NZ222755A (en) * 1986-12-23 1989-11-28 Warner Lambert Co Renin inhibiting acyl peptide derivatives containing two to four amino acid residues, and pharmaceutical compositions
US5024994A (en) * 1986-12-23 1991-06-18 Warner-Lambert Company Renin inhibitors IV
US5169932A (en) * 1989-10-30 1992-12-08 The Salk Institute For Biological Studies Gnrh analogs
US5296468A (en) * 1989-10-30 1994-03-22 The Salk Institute For Biological Studies GnRH analogs
WO1991013904A1 (en) * 1990-03-05 1991-09-19 Cephalon, Inc. Chymotrypsin-like proteases and their inhibitors
JPH04202170A (ja) * 1990-11-29 1992-07-22 Taisho Pharmaceut Co Ltd トリペプチド誘導体
US5340736A (en) * 1991-05-13 1994-08-23 The President & Fellows Of Harvard College ATP-dependent protease and use of inhibitors for same in the treatment of cachexia and muscle wasting
US5614649A (en) * 1994-11-14 1997-03-25 Cephalon, Inc. Multicatalytic protease inhibitors
US5550262A (en) * 1994-11-14 1996-08-27 Cephalon, Inc. Multicatalytic protease inhibitors

Also Published As

Publication number Publication date
FI972029A (fi) 1997-05-13
FI118325B (fi) 2007-10-15
AU710437B2 (en) 1999-09-23
JP2000290197A (ja) 2000-10-17
HK1004638A1 (en) 1998-11-13
EP0789578A1 (en) 1997-08-20
NZ296479A (en) 1999-06-29
US5990083A (en) 1999-11-23
BR9509665A (pt) 1997-10-28
MX9703564A (es) 1997-08-30
PT789578E (pt) 2003-10-31
ES2200010T3 (es) 2004-03-01
DE69530993T2 (de) 2004-05-19
FI972029A0 (fi) 1997-05-13
DK0789578T3 (da) 2003-09-22
US5614649A (en) 1997-03-25
EP0789578B1 (en) 2003-06-04
EP0789578A4 (en) 2000-09-20
CA2202760A1 (en) 1996-05-23
JPH10507465A (ja) 1998-07-21
AU4110496A (en) 1996-06-06
NO972104L (no) 1997-06-13
NO972104D0 (no) 1997-05-07
CN1166403C (zh) 2004-09-15
JP3056258B2 (ja) 2000-06-26
KR100420774B1 (ko) 2004-07-05
DE69530993D1 (de) 2003-07-10
CN1164192A (zh) 1997-11-05
WO1996014857A1 (en) 1996-05-23
ATE241998T1 (de) 2003-06-15
US5830870A (en) 1998-11-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NO324066B1 (no) Multikatalytiske proteaseinhibitorer, farmasoytiske sammensetninger omfattende disse og deres anvendelse
JP5176964B2 (ja) ジペプチジルペプチダーゼｉｖ阻害剤
US5550262A (en) Multicatalytic protease inhibitors
EP2156846A1 (en) Prophylactic or therapeutic agent for diarrhea
EA011860B1 (ru) Селективные агонисты рецептора y2 для терапевтического воздействия
KR20080006557A (ko) Ａｇｅ 억제제
EP3193939A1 (en) Small lipopeptidomimetic inhibitors of ghrelin o-acyl transferase
WO2012140500A1 (en) Selective cysteine protease inhibitors and uses thereof
US11345705B2 (en) Substituted pyrazolo[1,5-a]pyrimidines as apelin receptor agonists
US11667675B2 (en) MASP inhibitory compounds and uses thereof
Lin et al. Role of the ACE2‑Ang‑(1‑7)‑Mas axis in blood pressure regulation and its potential as an antihypertensive in functional foods
CA2840317C (en) Enkephalin analogues
AU710437C (en) Multicatalytic protease inhibitors
CA2581564C (en) Compounds that modulate trh actions
US20220298208A1 (en) Compounds and compositions for modulating listeria virulence
JPH09508365A (ja) マラリア原虫アスパラギン酸プロテアーゼ阻害剤
NO305085B1 (no) HIV-proteaseinhibitorer, farmas°ytiske preparater som omfatter slike, samt fremgangsmÕte for in vitro inhibering av HIV-virusreplikasjon

Legal Events

Date Code Title Description
MM1K Lapsed by not paying the annual fees