KR100420774B1 - 다중촉매성프로테아제억제제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 하기 화학식의 다중 촉매성 프로테아제 효소의 억제제를 개시한다. 구성 성분 및 바람직한 구성 성분을 개시한다. 개시된 화합물을 제조하는 사용하는 방법론 또한 설명한다.

Description

다중 촉매성 프로테아제 억제제{Multicatalytic Protease Inhibitors}
<관련 출원에 대한 참조>
본 출원은 1994년 11월 14일 출원된 미국출원 제 337,795호의 부분 계속 출원인 1995년 6월 5일 출원된 미국출원 제 464,398호의 부분 계속 출원이다.
진핵세포는 지속적으로 분해하여 세포 단백질을 대체시킨다. 이로인해 세포는 구조가 비정상적인 단백질 및 펩티드를 선택적으로 그리고 신속하게 제거하고, 조절 펩티드의 농도를 조절함으로써 대사 경로를 제어하며 아사 상태와 같이 필요할 경우 에너지용 아미노산을 제공한다 [Goldberg, A.L. ＆ St. John, A.C. Annu. Rev. Biochem. 45: 747-803 (1976)]. 포유류의 세포 메카니즘은 다중 경로로 단백질을 분해시킨다. 이들 경로중 몇몇은 아데노신 트리포스페이트 ("ATP")의 형태로 에너지 투입을 요구하는 것으로 나타난다 [Goldberg, A.L. ＆ St. John, supra].
다중 촉매성 프로테아제 (MCP, 또한 전형적으로 "다중 촉매성 프로테이나제", "프로테아좀", "다중 촉매성 프로테이나제 복합체", "다중 촉매성엔도펩티다제 복합체", "20S 프로테아좀" 및 "인젠신"으로 칭해짐)는 2 이상의 세포 경로에서 단백질을 펩티드와 아미노산으로 분해시키기 위한 역할을 하는 큰 분자량 (700 kD)의 성숙핵 비-리소좀 프로테이나제 복합체이다 [Orlowski, M. Biochemistry 29 (45) 10289-10297 (1990)]. 복합체는 (1) 펩티드 결합이 염기성 아미노산의 카르복실 측에서 분해되는 트립신형 활성, (2) 펩티드 결합이 소수성 아미노산의 카르복실 측에서 분해되는 키모트립신형 활성, (3) 펩티드 결합이 글루타민산의 카르복실 측에서 분해되는 활성과 같은 3종 이상의 상이한 가수분해 활성 형태를 갖는다 [Rivett, A.J. J. Biol. Chem. 264:21 12215-12219 (1989) 및 Orlowski, supra].
MCP를 포함하는 단백질 분해의 한 경로는 또한 폴리펩티드 "유비퀴틴"을 포함한다 [Hershko, A. ＆ Crechanovh, A. Annu Rev. Biochem. 51: 335-364 (1982)]. MCP, ATP 및 유비퀴틴을 요구하는 이같은 경로는 섬유아세포의 성장 및 레티큘로이트의 성숙시 매우 비정상적인 단백질, 특정 단수명 정상 단백질 및 단백질의 벌크 분해의 원인이 되는 것으로 나타난다 [Driscoll, J. and Goldberg, A.L. Proc. Nat, Acad. Sci. U.S.A. 86:787-791 (1989)]. 이같은 경로에 의해 분해되는 단백질은 APT-종속 방식으로 그의 리진 아미노기를 통해 유비퀴틴에 공유결합된다. 이어서, 유비퀴틴-공액된 단백질은 그의 단백질 분해 핵으로 MCP를 포함하는 26S 프로테아좀에 의해 ATP-종속 프로테아제 복합체에 의해 작은 펩티드로 분해된다 [Goldberg, A.L. ＆ Rock. K.L. Nature 357:375-379 (1992)].
또한, 유비퀴틴을 요구하지 않지만 MCP 및 ATP를 요구하는 단백질 분해의제2 경로가 개시되어 있다 [Driscoll, J. ＆ Geldberg, A.L., supra.]. 이같은 방법에서, MCP는 ATP-종속 방식으로 단백질을 가수분해시킨다 [Goldberg, A.L. ＆ Rock. K.L. Supra]. 이같은 방법은 골격근에서 관찰되었다 [Driscoll ＆ Goldberg, supra]. 하지만, 근에서 MCP는 다른 프로테아제, 멀티페인 (multipain)과 상승적으로 작용하여 근단백질의 분해가 촉진되는 것으로 제안되었다 [Goldberg ＆ Rock, supra].
MCP는 활성 위치 친핵체가 N-말단 트레오닌 잔기의 히드록실기인 단백질분해 메카니즘에 의해 작용하는 것으로 보고되었다. 즉, MCP는 트레오닌 프로테아제의 제1의 공지된 예이다 [Seemuller et al., Science (1995) 268 579-582; Goldberg, A.L, Science (1995) 268 522-523].
세포 단백질 합성 및 분해 경로의 상대적 활성도는 단백질의 축적 또는 손실여부를 결정한다. 단백질 질량의 비정상적인 손실은 근이영양증, 심장악액질, 기종, 나병, 영양실조, 골연화증, 소아 급성 백혈병 및 암악액질과 같은 몇몇 질환 상태와 연관된다. 근육 질량의 손실은 또한 노화, 장시간 입원 또는 장기간의 침대 생활, 및 만성적인 요통증에서 관찰된다.
신경지배 제거 또는 무위시, 골격근은 급속히 위축되고 이로인해 크기, 단백질 함량 및 수축력이 매우 감소한다. 이같은 위축은 인체의 많은 신경근 질병의 주요 인자이다. 단백질 분해의 상승은 신경지배 제거 위축에서 근 소모의 주원인으로서 관련되어있다 [Furono, K. et al. J. Biochem. 265/15:8550-8557 (1990)]. 특정 방법 또는 근의 단백질 분해에 관련된 방법은 확인되지 않은 한편, 근 단백질의 가속화된 분해에서 MCP가 관련되었다는 증거가 있다. 예컨대, 문헌 [Furono, supra] and 1992년 11월 26일자로 공개된 PCT 공개 출원 제 WO 92/20840호를 참조한다.
MCP 활성은 몇몇 질병 상태에 관련되어있다. 예컨대, 인체 백혈 세포주에서 MCP의 비정상적인 높은 발현이 보고되었다 [Kumatori, A. 등, PNAS 87:7071 (1990)]. 또한, 전신 낭창 홍반 ("SLE")을 갖는 환자에 있어서 MCP에 대한 자가항체가 보고되었다 [Arribas, J. 등, J. Exp. Med. 173:423-427 (1990)].
MCP 복합체를 억제시킬 수 있는 작용제가 필요하다. 이같은 작용제는 예컨대, MCP 활성 영역에서 조사를 수행하는 것 뿐만 아니라 의학 분야의 것을 위한 가치있는 수단을 제공하여 예컨대 비정상적이거나 이상한 MCP 활성의 유해한 효과를 조절할 것이다. 본 발명은 이같은 중요한 목적에 관한 것이다.
<발명의 요약>
본 발명은 신규한 다중 촉매성 프로테아제 ("MCP") 억제제에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 근육 소모질병의 치료를 포함하는, 특정 질병과 연관된 MCP의 억제를 위한 방법을 포함한다.
한 측면에서, 하기 화학식의 화합물이 제공된다.
Figure pct00001
구성 성분, 뿐만 아니라 바람직한 구성 성분을 하기에 정의한다.
본 발명의 화합물은 다양한 용도에서 유용하다 예컨대, 화합물은 연구 용도에 사용되어 MCP 경로의 기전적 이해 및 주요 조직적합성 복합체 종 (MHC I) 경로에 의한 펩티드 항원의 발현을 위한 시험관내 및 생체내 모형을 더욱 정제시키고 발전시킬 수 있다.
임상 장치에서, 청구된 화합물을 포함하는 조성물은 MCP 활성을 억제시키고, 근육 질량의 손실을 감소시키고, 근 소모성 질병을 치료하고, 초과산화물 디스무타제 분해를 감소시키고, 초과산화물 디스무타제 활성의 감소를 특징으로 하는 질병의 치료에 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 화합물을 제조하기 위한 방법론을 개시한다.
화합물의 상기 특성 및 기타 특성이 설명이 계속됨에 따라 확장되는 형태로 제시될 것이다.
[도면의간단한설명]
도 1은 M12.B6 세포에 의한 일렉트로포레이트 (electroporate)된 OVA의 프로세싱에 대한 개시된 MCP 억제제 실시 양태의 효과를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 한 실시 양태에 의한 프로세싱의 억제에 대한 OVA 농도 효과를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 한 실시 양태에 의한 프로세싱 억제에 대한 OVA 농도 효과를 나타낸다.
도 4는 SOD-유전자 및 FALS 변이, 제한 위치 및 PCR 프라이머의 위치를 한정하는 물리적 맵이다.
도 5는 5μM의 실시 양태의 MCP 억제제의 태양으로 배양시킨 후 일시적으로감염된 293 세포에서의 SOD-1 농도의 수치화도를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 한 실시 양태에 대한 각종의 SOD-1 이소폼의 투약량에 따른 반응을 나타낸다.
도 7은 SOD-1 교체가 MCP 활성도의 함수임을 나타낸다.
본 발명은 다중 촉매성 프로테아제 (MCP)의 억제제, 이들 억제제를 포함하는 조성물 및 예컨대, 각종의 생리학적 상태에서 나타나기 쉬운 근육 질량 손실을 지연시키기 위한 MCP 억제제의 사용 방법에 관한 것이다.
본 발명은 MCP 억제제, 이들 억제제를 포함하는 조성물 및 이들 억제제를 이용하는 방법을 제공한다. 본 발명의 MCP 억제제는 예컨대, 하기 화학식으로 나타난다.
Figure pct00002
식 중,
R1은 -C≡N, -C(=O)OR9, 프탈이미도, -NH-SO2R9, 및 -NH-J로 이루어진 군으로부터 선택된 것이고,
R2은 H, 히드록실, 탄소수 1 내지 10의 알킬, 및 탄소수 3 내지 7의 시클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택된 것이며,
R3은 -(CH2)m-NH-C(=N-R5)-NH2, -R6-NO2, -R6-J 및 -R6-CN으로 이루어진 군으로부터 선택된 것이고,
R4은 -CH(CH2-R7)-Q이며,
Q는 -CH-R8, -C(=O)CH3, -C(=O)CH2Cl, -C(=O)CH2Br, -C(=O)CH2F, -C(=O)CHF2, -C(=O)CF3, -C(=O)C(=O)R7, -C(=O)C(=O)NH-R7, -C(=O)CO2-R7, -C(=O)CO2H, -B(OH)2,
Figure pct00003
(여기서, p 및 q는 각각 독립적으로 2 또는 3이고, W는 시클로알킬임)로 이루어진 군으로부터 선택된 것이며,
R5은 -NO2, -CN, 및 -J로 이루어진 군으로부터 선택된 것이고,
R6은 -(CH2)m-NH-C(=NH)-NH-이며,
R7은 페닐, 및 탄소수 1 내지 8의 알킬로 이루어진 군으로부터 선택된 것이고, 여기서 알킬기는 하나 이상의 할로겐 원자, 아릴 또는 헤테로아릴기로 임의 치환되고,
R8은 =O, =N-NHC(=O)-NH2, =N-OH, =N-OCH3, =N-O-CH2-C6H5, =NNH-C(=S)-NH2및 =N-NH-J로 이루어진 군으로부터 선택된 것이며,
R9은 수소 및 탄소수 1 내지 6의 알킬로 이루어진 군으로부터 선택된 것이고, 여기서 알킬기는 하나 이상의 할로겐 원자, 아릴 또는 헤테로아릴기로 임의 치환되고,
J는 보호기이며,
n은 3 내지 10의 정수이고,
m은 2 내지 5의 정수이다.
몇몇 바람직한 태양에서, R1가 -C≡N, -C(=O)OCH3, 프탈이미도 또는 -NH-SO2CF3이고, 다른 바람직한 태양에서, R2가 H 또는 시클로펜틸이다.
R3가 바람직하게는 -(CH2)3-NH-C(=N-R5)-NH2이다.
Q가 바람직하게는 -CH-R8, -B(OH)2,-C(=O)C(=O)NH-R7또는
Figure pct00004
R5가 바람직하게는 -NO2, -CN, -PMC, -MTR, -MTS, 또는 Tos이다.
R7은 바람직하게는 -CH(CH3)2, -(CH2)2-CH3, -CH2-CH3또는 -C6H5이다.
R8은 바람직하게는 =O, =N-OH, =N-O-CH2-C6H5, =NNH-C(=O)-NH2또는 =NNH-C(=S)-NH2이다.
몇몇 바람직한 태양에서, R1가 -C(=O)OCH3, 프탈이미도 또는 -NH-SO2CF3이고, R2가 시클로펜틸이며, R3가 -(CH2)3-NH-C(=N-NO2)-NH2이고, R7가 -CH(CH3)2이며, R8은 =O이다.
다른 바람직한 태양에서, R1가 -C≡N이고, R2가 시클로펜틸이며, R3가 -(CH2)3-NH-C(=N-NO2)-NH2또는 -(CH2)3-NH-C(=N-J)-NH2이고, R7가 -CH(CH3)2이며, R8은=O이다.
다른 바람직한 태양에서, R1가 -C≡N이고, R2가 시클로펜틸이며, R3가 -(CH2)3-NH-C(=N=NO2)-NH2또는 -(CH2)3-NH-C(=N-J)-NH2이고, R7가 -CH(CH3)2이며, Q가 -CH-R8이고, R8가 =N-NHC(=O)-NH2, =N-OH, =N-OCH3, 또는 =N-O-CH2-C6H5이다.
본 명세서에서 사용된, "알킬"이란 에틸, 이소프로필 및 시클로펜틸기와 같은 직쇄, 측쇄 및 시클릭 탄화수소를 포함하는 것을 의미한다. 치환된 알킬기는 하나 이상의 수소 원자가 할로겐, 다른 탄화수소기 (예컨대, 페닐기), 헤테로아릴기, 또는 하나 이상의 탄소 원자 사이에 산소 원자가 삽입된 기에 의해 치환된 알킬기이다. 바람직한 알킬기는 1 내지 약 8의 탄소 원자를 갖는다. 본 명세서에서, "할로겐"이란 그의 일반적인 의미를 갖고, 불소, 염소, 브롬 및 요오드를 포함하고, 불소가 바람직한 할로겐이다. 본 명세서에서 사용된 "Arg"란 아미노산 "아르기닌"에 대한 약어로서 그의 일반적인 의미를 갖는다.
몇몇 태양에서 본 발명의 화합물은 보호기를 포함한다. 본 명세서에서, "보호기"란 넓게 해석된다. 보호기는 히드록실기, 아미노기 및 카르복실기와 같은 작용기에 선택적으로 부착되고 그리고 이로부터 제거될 수 있는 화학적 작용기로 알려져있다. 이들 기는 화학적 화합물에 존재하여 화합물이 노출되는 화학 반응 조건에 대해 상기 작용성이 비활성이 되도록 한다. 임의의 다양한 보호기가 본 발명에서 사용될 수 있다. 이같은 하나의 보호기는 프탈이미도기이다. 본 발명에 따른 다른 바람직한 보호기는 하기 화학식을 갖는다.
Figure pct00005
본 발명을 행하기에 적합한 다른 대표적인 보호기는 문헌 [Greene, T.W 및 Wuts, P.G.M., "Protective Groups in Organic Synthesis" 2d. Ed., Wiley ＆ Sons, 1991]에 실려있고, 그의 개시 사항을 본 명세서에서 온전히 참고로 인용한다.
전술한 바와 같이, MCP 활성은 각종 장애 및 질환과 연관되어있다. 본 명세서에서 개시된 화합물이 MCP 활성의 억제에 유용하고, 이들 화합물의 유용성이 연구 및 치료 장치 모두에 적용될 수 있으므로, 본 발명의 화합물과 MCP를 접촉시켜 MCP 활성을 억제시키기 위한 방법론은 인간을 포함하는 포유류에 약제 또는 제약학적 작용제로서 상기 화합물을 제공하는 것을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 "접촉"이란 직간접적으로 잔기를 함께 위치시켜 접촉되도록 하여 잔기가 서로 물리적으로 접촉되게 하는 것을 의미한다. 즉, 접촉시키는 것은 용기내에 함께 잔기를 위치시키거나 환자에게 잔기를 투여하는 것과 같은 물리적 행위를 포함한다. 즉, 에컨대 본 발명의 화합물을 이같은 질환 또는 질병과연관된 MCP의 비정상 및 (또는) 이상한 활성과 관련된 질병 또는 질환을 나타내는 인간 환자에게 투여하는 것은 "접촉"이란 용어의 정의 범위에 해당한다.
바람직한 태양에서, 본 발명에 따른 제약학적 조성물은 질병, 예컨대 비정상적인 신체 조건, 비정상적 및 (또는) 이상한 MCP 활성과 연관된 질환 또는 이상생리학 조건으로 인해 고통을 겪는 환자에 투여된다. 본 발명의 조성물이 투여되는 질병은 바람직하게는 직간접적으로 근육 질량의 손실 (즉, 감소)를 초래하는 질병, 즉 근 손실 질병이다. 이같은 질환으로는 근이영양증, 심장악액질, 기종, 나병, 영양실조, 골연화증, 소아 급성 백혈병, AIDS악액질 및 암악액질이 있다.
본 발명의 문맥상, "투여"는 환자에게 제약학적 조성물을 도입시키는 것을 의미한다. 투여의 바람직한 방법으로는 정맥내, 피하 및 근육내 투여가 있다. 바람직하게는, 화합물은 생리학적 염수와 같은 제약학적으로 허용가능한 담체와 함께 화합물을 포함하는 제약학적 조성물로서 투여될 것이다. 다른 적합한 담체는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., Easton, PA, 1980]에 실려있다.
제약학적인 조성물에서 본 명세서에서 설명된 화합물의 농도는 투여될 약제의 투약량, 사용되는 화합물의 화학적 특성 (예컨대, 소수성), 및 투여 경로를 포함하는 다수의 요소에 따라 변할 것이다. 일반적으로, 본 발명의 화합물은 비경구 투여를 위한 화합물 약 0.1 내지 10 % w/v를 포함하는 생리학적 완충 수용액 중에 제공될 수 있다. 전형적인 투약 범위는 하루당 체중 1kg 당 약 1 ㎍ 내지 약 1g이고, 바람직한 투약 범위는 하루당 체중 1kg 당 약 0.01 mg 내지 100 mg이다. 투여될 약제의 바람직한 투약량은 질환 또는 질병 형태 및 진행 정도, 특정 환자의 전체적인 건강 상태, 선택된 화합물의 상대적인 생물학적 효율, 및 화합물 부형제의 제제와 같은 변수, 및 그의 투여 경로에 좌우되기 쉽다. 본 명세서에서 "환자"란 용어는 모든 형태의 척추 동물을 의미한다. 바람직하게는, 환자는 인간이다.
근이영양증은 신경변성의 증거없이 근섬유의 점진적인 약화 및 변성을 특징으로 하는 유전적 질환이다. 뒤시엔느 근이영양증 (DMD)에서 환자는 근육 질량이 평균 67% 감소되고, 근경직성이영양증에서, 단편적인 근단백질 합성은 상응하는 정도의 비근단백질 합성의 감소없이 평균 28% 정도 감소하는 것으로 나타났다 (동화 호르몬 또는 기질에 대한 손상된 말단기 반응에 기인하는 것 같다). 촉진된 단백질 분해는 DMD 환자의 근에서 나타났다.
심한 심부전 (CHF)은 "심장악액질", 즉 19%의 체중 감량을 동반한 심장근 및 골격근의 근단백질 소모를 특징으로 한다. 심장악액질은 근원섬유 단백질 분해 속도 감소에 기인한다.
기종은 폐포벽의 파괴적인 변화에 수반되는 말기의 비호흡기관초에 대해 원심성인 기공의 확대로 정의되는 만성적인 폐쇄성 폐 질환이다. 감소된 폐 작용의 임상적 징후로는 기침, 씨근거림, 순환성 호흡 감염, 부종, 및 작용성 손상 및 수명의 감소가 있다. 기종 환자에 있어서 트로신의 유출량은 47% 증가한다. 또한, 전체 류신 유출은 정상이고, 전체 류신 산화는 증가하고, 전체 단백질 합성은 감소한다. 결과적으로 근단백질 합성이 감소하고, 전체 단백질 교체 및 골격 근육 질량의 감소를 수반한다. 이같은 감소는 질환 진행 및 장기간 열화에 있어서 더욱 명백해진다.
진성당뇨병에서, 만성적인 부분 신경지배 제거 (신경병)에 기인하는 손의 작은 근이 일반적으로 소모된다. 이것은 장기간 질환 진행 및 열화에 있어서 가장 명확하고 악화된다.
나병은 엄지 및 집게 손가락의 중수골 사이에서 나타나는 근 소모와 연관된다. 심한 영양실조는 특히, 심한 근 소모를 특징으로 한다.
골연화증은 비타민 D 및 칼슘 부족에 기인하는 영양 질병이다. 소아인 경우 "구루병"으로 성인인 경우 "골연화증"이라고 칭한다. 이것은 골의 연화 (골유기기질의 과다 축적을 동반하는 손상된 석화 작용에 기인함), 통증, 무름, 근육 소모 및 약화, 식욕감퇴, 및 전체적인 중량 손실을 특징으로 한다. 이것은 영양실조, 반복적인 임신 및 수유 (비타민 D 및 칼슘 축적을 소모 또는 고갈시킴), 및 비타민 D 저항성에 기인할 수 있다.
유년기 급성 백혈병인 경우, 골격근 소모를 초래하는 단백질 에너지 영양실조가 나타난다. 연구는 몇몇 소아가 근육 질량의 평균 27% 감소를 수반하는 백혈병의 진단 전에도 근 소모를 보임을 나타내었다. 또한, 지방 조직이 동시에 33 내지 37% 증가하고, 이같은 증가는 비교 체중 및 각위에서 순변화를 초래하지 않는다.
암악액질은 충실성종양 및 혈액학적 악성을 갖는 환자에게 가변성으로 발생하는 복합 증후군이다. 임상적으로, 암악액질은 지방 조직 및 지방이 적은 근육 질량의 대규모 고갈에 따른 체중 감소로 증명되고 암에 기인하는 사망의 한 원인이다. 암악액질 환자는 더 짧은 생존 시간을 갖고 화학요법에 대해 감소된 반응을 갖는다. 근 소모를 유발시키는 질병 이외에, 다른 환경 및 조건이 근육 질량의 감소와 어느 정도 결합되는 것같다. 이같은 고통에는 만성적인 요통, 고령에 기인하는 근 소모, 병 또는 상해에 기인하는 장기간 입원, 알코올 중독 및 코스티코스테로이드치료가 포함된다.
연구에서 만성적인 하부 요통의 심한 경우 부척수 근이 소모되는 것으로 나타났다. 부척수 근의 소모가 감소되면 통증이 완화되고 기능이 향상된다.
또한, 노령의 일반적인 악화는 근 소모에 기인하는 것으로 간주된다. 신체가 노화됨에 따라, 증가되는 비율의 골격근은 섬유성 조직에 의해 대체된다. 결과적으로 근력은 현저히 감소하고, 무지방군은 근소하게 감소한다.
연구에서 상해 또는 만성적인 병을 앓고 있고 장기간 입원한 환자에게 있어서 근육 질량이 평균 31% 감소하는 장기간의 일측성 근 소모가 있는 것으로 나타났다. 또한, 연구에서 이것은 점진적인 물리요법과 연관될 수 있는 것으로 나타났다. 하지만, 많은 환자에게 있어서 약제 요법으로 회복되는 것이 더욱 효과적일 수 있다.
알코올 중독의 경우, 전경골근의 소모가 나타난다. 이같은 인접면 근 손상은 신경성 손상, 즉 손상된 당분해작용 및 가인산분해효소 활성에 기인한다. 알코올 남용 기간이 길어질수록 손상은 명확해지고 악화된다. 코르티코스테로이드로 처리된 환자는 근육 질량 손실을 경험한다.
MCP는 NFkappaB로 칭해지는 염증의 세포내 매개자를 활성화시키는 것으로 나타났다. 문헌 [Baeuerle, P.A. and Henkel, T. (1994) Annu. Rev. Immunol. 12, 141-179]을 참조한다. 즉, MCP의 억제제는 자가 면역 및 염증성 질환의 치료에서 잠재적으로 사용된다.
본 발명의 화합물을 사용하여 전술한 조건, 뿐만 아니라 다른 조건에서 기인하는 근육 질량 손실을 완화시킬 수 있다. 부가적으로, 본 발명의 MCP 억제제는 동물의 체중 감소를 막거나 성장을 촉진시키는 수의 및 동물 농업 응용에 유용하다.
MCP는 대부분의 조직적합성 복합체 종 I (MHC I) 경로를 통해 펩티드 항원의 제시에 포함되어 있다. 문헌 [Goldberg and Rock, supra] 및 이후에 "Rock 등"라고 칭해질 [Rock 등, Cell, 78: 761-771 (1994)]를 참조한다. 즉, MCP의 억제제는 항원의 이상한 및 (또는) 비정상적인 MCH-1 프로세싱과 연관된 질환 및 질병의 완화시 MCH I 경로의 억제가 필요한 연구에서 조사 시약으로서 이용된다. MHC-I 분자 상에 존재하는 대부분의 펩티드의 정확한 기원은 여전히 명확하지 않고 MCP가 MHC-I 제시에서 중요한 역할을 할 수 있음을 나타내는 증거가 최근 축적되었으므로 ([Rock 등 supra] 참조, MHC-I 제시를 위한 항원의 단백질 분해 프로세싱을 차단하는 개시된 MCP 억제제와 같은 시약은 이같은 경로의 중요성을 분석하는데 유용할 수 있다.
놀랍게도, 본 발명에 와서야 본 발명의 MCP 억제제가 Cu/Zn 초과산화물 디스무타제-1 ("SOD-1") 효소의 활성을 향상시키는데도 유용한 것을 알게되었다. 즉, 이들 화합물은 SOD-1 결핍 시스템을 조사하기 위한 조사 장치 및 SOD-1 효소 활성의 감소 (여기서, 이같은 감소는 질병의 병인에 포함됨)를 특징으로 하는 신경 퇴행성질병 또는 기타 질병의 치료에서 유용하다. 이같은 병으로는 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅톤병, 졸증, 외상, 및 허혈과 같은 산화성 스트레스와 관련된 질환이 있다.
SOD-1은 독성 초과산화물 음이온 O2 .-을 O2와 H2O2. 로 비돌연변이화시키는 것을 촉진시키는 동종이합성 금속효소이다. SOD-1는 자유 라디칼의 분해제이고 호기성 대사의 정상 부산물인 초과산물 라디칼의 해독화에서 제1 선 방어제로서 작용한다. SOD-1은 주로 진핵세포에서 발생하고 실질적으로 모든 세포 형태의 세포질에서 발견된다. SOD-1은 산소 독성에 대한 생리학적 반응에서 필수적인 효소이고 산화 스트레스와 관련된 병리학적 이상에서 치료제인 것으로 활발히 조사되었다. 문헌 [Bannister 등., CRC Crit. Rev. Biochem. 22: 111-180 (1987); Halliwell 등., Methods in Enzymol., 186:1-75 (1990); Greenwall, Free Rad. Biol. Med. 8: 201-209 (1990)]을 참조한다.
치료제로서의 SOD-1의 용도를 저해해온 특성은 외인적으로 공급될 때의 열악한 세포내 접근성 및 혈청에서의 매우 짧은 반감기이다. 즉, 세포내 SOD-1 활성을 증진시키는 화합물은 SOD-1 치료를 현저히 향상시킬 것이다.
ALS는 척수 및 뇌의 큰 운동신경단위의 변성에 기인하는 진행성 마비 질병이다. ALS 사례 중 약 5 내지 10%는 가족성 (FALS)이고 여기서 상염색체가 주도적인 특성으로 유전된다. 최근에 16종의 상이한 미스센스 돌연변이가 FALS를 갖는 가족의 부분집합에서 확인되었고, SOD-1을 코딩하는 유전자 내에서 발생한다. 문헌[Rosen, D. R., 등, Science 261: 1047-1051 (1993); Deng, H. -X., 등, Nature 362: 59-62 (1993)]을 참조한다. 이같은 돌연변이는 적혈세포 및 뇌조직에서의 SOD-1 활성을 감소시키고, 효소의 교체를 증가시키는 SOD-1 단백질을 불안정하게 하는 것으로 나타났다. 문헌 [Bowling, A.C., 등, J. Neurochem. 61:2322-2325 (1993); Borchelt, D.R., 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 91:8292-8296 (1994)]을 참조한다.
부가적으로, SOD-1 및 ALS 간의 연결을 포함시킨 것을 기준으로한 변형유전성 쥐 모델을 기재하였다 (Brown, R. H. 331/16 NEJM 1901 (1994)).
본 발명자들은 MCP 억제제가 SOD-1의 강력한 양성 효과기인 것을 알게되었다. 본 명세서에서 "화합물 14"로 언급되는 바람직한 MCP 억제제는 투약량-종속 방식으로 와일드형 및 돌연변이성 SOD-1 분해를 명확하게 감소시킨다. 화합물 번호는 화합물의 합성을 개시하는 실시예 번호를 기준으로 지정하였다. 예컨대, 화합물 14의 합성은 하기 실시예 14에 실었다. 본 명세서에서, SOD-1 분해의 감소는 SOD-1 단백질이 이화되는 속도를 지연시키는 것을 의미한다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 더 설명된다. 이들 실시예는 본 발명을 더 명료하게 하기 위한 것으로 첨부된 청구의범위를 제한하지 않는다.
<실시예 1>
인간의 조직으로부터의 다중 촉매성 프로테아제의 단리
사후에 얻어진 인간의 간 및 뇌 시료를 사용하여 이온교환 크로마토그래피, 황산 암모늄 침전, 겔 여과시켜 MCP를 단리시키고 부분적으로 정제시켰다 (예컨대,Driscoll and Goldberg, Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 787-791. (1989); Yamamoto 등, Biochim, Biophys. Acta 882, 297-304 (1986)). 어느 한쪽의 개시 물질에 있어서, 조직을 20% 글리세롤을 포함하는 10배 용량의 20 mM 트리스-HCl (pH 7.5)에서 균질화시켰다. 30분 동안 40,000 x g로 원심분리시킨 후, MCP의 키모트립신형 성분의 단백질 분해 활성을 상청액에서 검출할 수 있었다 (하기 참조). 상청액을 균질화 완충액 중에서 평형을 이룬 DEAE-Sepharose 고속 유동 칼럼 상에서 분획시켰다. 상청액 1 리터당 수지 250 ㎖을 사용하였다. 샘플을 부가한 후, 약 10배 용량의 칼럼을 균질화 완충액으로 세척하고 단백질을 0 내지 400 mM의 선형 NaCl 기울기로 용출시켰다 (수지 250 ㎖에 대해 2 ℓ). 분획물을 MCP 활성에 대해 분석하였고, 활성 분획물을 고이게하고 80% 포화 상태로 (NH4)2SO4을 사용하여 침전시켰다. 침전된 단백질을 원심분리시켜 수집하고, 균질화 완충액에서 재현탁시키고 우혈청 알부민 (68 kDa)을 사용하여 표준화된 세파크릴 (Sephacryl) S300HR 칼럼 (500 ㎖ 수지 부피) 상에 부가시켰다. MCP 활성의 단일 피크를 분자량 약 650 kDa의 것으로 용출시켰다. 이같은 제제는 측정가능한 다른 단백질 분해성 활성이 없고 4℃에서 >6 개월 저장시 그의 MCP 활성을 유지하였다. 이같은 제제는 대부분의 실험에서 사용되었다. 히드록실아파타이트-울트로겔 (Ultrogel) 칼럼 (Yamamoto 등, supra)상에서 제제를 더 분획시켜서 더욱 고도로 정제된 효소를 수득하였고, 이것은 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 변성시키는 것에 따라 20 내지 35 kDa의 Mr범위에서 예상되는 >10 의 서브 유닛으로 이루어졌다.
<실시예 2>
MCP의 키모트립신형 및 트립신형 활성에 대한 분석
상술한 MPC 단리 과정으로 단백질 분해 활성이 잠재되어 있고, 저농도(0.02 - 0.05%)의 SDS (Yamamoto 등, supra)를 부가하여 활성화될 수 있는 효소 복합체를 생성시켰다. 키모트립신형 활성을 하기 과정으로 분석하였다. 96 웰 마이크로타이터 (microtiter) 플레이트에서, 인간의 MCP를 0.04 % SDS를 포함하는 균질화 완충액 중에서 4 내지 10배로 희석시켰다. 펜실바니아주 킹 오브 프러시안 소재의 바켐 바이오사이언스 인크 (Bachem Bioscience Inc.)로부터 구입한 비색 기질 MeOSuc-EVKM-파라-니트로아닐리드 (메톡시숙시닐-Glu-Val-Lys-Met-pNa)를 디메틸술폭사이드 10 mM 중의 원액으로부터의 100 μM의 최종 농도 물질에 첨가하였다. 반응 부피는 웰당 200 ㎕였다. 37℃에서 다양한 기간 동안 배양시킨 후, 유리 pNa의 농도를 490 nm에서 흡수 판독되는 바이오테크 EL-340 마이크로플레이트 판독기 상에서 측정하였다. 프로테아제 활성을 기질 가수분해가 시간에 따라 선형으로 증가하고 흡수 변화가 유리 pNa의 농도에 비례하는 조건하에서 측정하였다. 별법으로, 형광유전성 기질, 메톡시숙시닐-Phe-Leu-Phe-아미도메틸쿠마린 (캘리포니아주 두블린 소재의 엔자임 시스템즈 프로덕츠 (Enzyme Systems Products) 제품)을 사용하여, 형광성의 변화를 390 nm의 여기 및 460 nm의 방출에서 측정하였다.
인간 MCP의 트립신형 활성을 하기와 같이 변형시켜 상기한 바와 같이 분석하였다. 1 mM 2-메르캅토에탄올이 첨가된 트리글리세롤 완충액 (pH 9.5)에서 반응을 행하였고 기질은 형광원성 기질인 벤질옥시카르보닐-Phe-Arg-AMC (100 μM)이였다.
37 ℃에서 다양한 기간 동안 배양시킨 후, 유리 AMC의 농도를 390 nm의 여기 필터 및 460 nm의 방출 필터를 갖는 플루오로스캔 (Fluoroscan) II 분광형광계상에서 측정하였다. 프로테아제 활성을 기질 가수분해가 시간에 따라 선형으로 증가하고 형광성 변화가 유리 AMC의 농도에 비례하는 조건하에서 측정하였다.
<실시예 3>
MCP 억제제에 대한 IC50값의 측정
IC50값은 전형적으로 효소 활성을 50% 억제시키기에 필요한 화합물 (이 경우, 개시된 MCP 억제제)의 농도로 정의된다. IC50값은 의도된 용도에 대한 화합물의 활성을 나타내는 유용한 지표이다. 바람직하게는, 본 발명의 억제제는 IC50값이 약 10 마이크로몰 미만이다.
기질을 부가하기전 15분 동안 37℃에서 다양한 농도의 추정적 억제제로 효소를 배양하여 MCP의 키모트립신형 또는 트립신형 활성의 억제를 측정하였다. 각 실험 조건을 3회 평가하고 여기에 기재한 억제제에 대해 반복 실험을 행하였다.
<실시예 4>
세포 근 분해의 억제에 대한 증명:
어린 쥐에 있어서 감량 위축의 억제
어린 쥐에서 가자미근의 감량 위축에 대한 몇몇 억제제의 효과를 측정하였다. 이 과정에 대한 일반적인 논의를 위해 문헌 [Tischler. M.E. (1990) Metabolism 39/7:756-763] (이후, "Tischler-1990"이라고 칭함)을 참조한다.
80 내지 90 g의 어린 암컷 스프라그-다우리 (Sprague-Dawley) 쥐를 문헌 [Jaspers, S.R. and Tischler, M.E., (1984) J. Appl. Physiol. 57: 1472-1479]에서와 같이 꼬리 캐스트하고 뒷발을 매달았다. 동물의 뒷발을 각 동물이 개별적으로 수용되는 우리의 바닥 위로 향하게 하고 매단시간 및 종료시간에 체중을 측정하였다. 매단 기간 동안 동물을 매일 점검하여 발가락이 우리의 바닥에 접하지 않고 캐스트로 인한 꼬리의 팽윤이 없도록 하였다.
A 실험 고안 - 파트 1
각 실험을 각 5마리로 이루어진 4군으로 무작위로 나누어진 현탁된 20 마리의 쥐로 시작하였다. A군을 2일 동안 매달았고 이것은 더 긴 시간동안 매단 다른 동물의 가자미근 크기를 추정하기 위한 바탕선 데이타를 제공하였다. 연구의 초기에 군의 평균 체중을 비교하여 이를 몸체 크기 차이에 대한 보정 인자로 사용하였다. B군은 한쪽 가자미근이 2일의 감량후 메르살릴 수용액으로 처리된 제 2 대조군으로, 각 동물군에 대해 감량중 근 위축을 지체시키는 능력을 보여준다. 메르살릴은 선행 연구되었고 여기서 이용되는 실험 계획안에서 기재된 바와 같이 실질적으로 생체내 모형 실험에서 위축을 막는 것을 보여 주었다. Tischler-1990을 참조한다. 감량이 시작된 후 2일 째, 메르살릴의 수용액 (200 nM; 4 ㎕/100 g의 초기 중량)을 전술한 바와 같이 하나의 가자미근에 주사하였다. 반대쪽 근에 0.9% 염수("비히클") 유사 부피를 주사하였다. 동일계에서 주사하는 중에 동물을 이노바-베트(Innovar-vet) (10㎕/100 g 체중)하에서 유지시켰다. 주사후, 동물을 24시간 동안 더 현탁시키고 가자미근을 제거하였다. 각 실험에 대해 C 군 및 D 군을 사용하여 개시된 화합물의 2 가지의 상이한 태양에 대해 각각 시험하였다. 디메틸술폭사이드(DMSO)에 포함된 1mM MCP 억제제를 한쪽 다리의 가자미근에 주사하고 반대쪽 가자미근에 DMSO만을 주사한 것을 제외하고는 B 군에서와 같이 동물을 처리하였다. 즉, 각 실험은 2개의 대조군 및 본 발명의 MCP 억제제에 대한 시험으로 이루어졌다. 다른 쌍의 억제제를 갖는 이같은 5가지 실험을 완료하여 각 MCP 억제제를 시험하기 위한 10개의 "n" 값을 얻었고 각 실험은 동물을 2개의 다른 방법으로 적하하여 시험되었다.
B. 가자미근의 프로세싱 - 파트 1
동물을 죽여, 가자미근을 절단하고 지방 및 결합조직을 잘라내고, 조심스럽게 체중을 측정하였다. 이어서, 근을 10% 트리클로로아세트산 (TCA) 중에서 균질화시키고 침전된 단백질을 원심분리시켜 펠렛화시켰다. 이어서, 펠렛을 10% TCA로 1회 에탈올:에테르 (1:1)로 1회 세척하였다. 최종 펠렛을 4 ㎖의 1N 수산화나트륨 중에 용해시켰다. 이어서, 표준으로 알부민을 사용하여 2중 화합 방법에 의해 단백질 함량을 분석하였다.
C. 데이타 분석- 파트 1
총 근 단백질 함량에 대한 MCP 억제제의 효과를 비처리된 반대쪽 근과 쌍으로 비교하여 주로 시험하였다. 함량비를 계산하고 이어서 변이량 분석("ANOVA")으로 통계적으로 분석하였다. 왼쪽 다리는 항상 처리된 다리이고, 단백질 함량비는 비처리 대조 동물과 비교될 수 있었다. 이와 같은 방식으로, 시험된 MCP 억제제의 비교 효율성 뿐만 아니라 2 개의 다리의 단백질 함량을 비교하여 현저한 차이가 나타날 수 있다. 또한 각각의 별개의 처리의 효과에 대해 한 쌍의 스튜던트 시험을 행하였다. 또한, 비처리 대조 데이타는 2일의 단백질 함량 추정치를 제공하였다. 이것으로 각각 B군, C군 및 D군에 대한 24시간 처리에 따른 단백질 변화를 추정할 수 있었다.
D. 실험 고안 - 파트 2
각 실험은 5 마리의 군이 단백질 합성에 대한 그의 효과를 위해 억제제 중 하나로 처리되도록하여 10 마리로 이루어졌다. 본 연구의 이같은 측면에 있어서 반대쪽의 DMSO-처리된 근이 억제제 처리된 군에 대한 쌍을 이룬 대조용으로 작용하므로 대조 동물은 필요하지 않다. 각 군은 파트 1의 C 군 및 D 군에 기재된 바와 같이 주사되었다. 동일계 처리한지 24 시간후 단백질 합성의 분획율을 양쪽 가자미 근에서 분석하였다. 각 근을3H-페닐알라닌 (50 mM; 1 μCi/㎕)을 포함하는 0.9% 염수 용액 (3.5 ㎕/100 g 최종 체중)으로 주사하였다. 15분 후, 근의 중간 2/3 지점을 절단하고 근을 하기와 같이 프로세싱하였다.
E. 가자미근의 프로세싱 - 파트 2
근을 0.5 mM 시클로헥시미드를 포함하는 0.84 % 염수에 10 분 동안 먼저 세척하여 단백질 합성을 종료하고 20 mM 시클로류신으로 세척하여 세포 중에 페닐알라닌을 트랩시켰다. 이어서, 근을 2.5 ㎖의 2% 냉과염소산 중에서 균질화시켰다. 침전된 단백질을 원심분리하여 펠렛화시켰다. 상청액의 부분표본을 취하여 액체 신틸레이션 평가하고 다른 부분표본을 프로세싱하여 페닐알라닌을 페닐에틸아민으로전환시켜 가용성 페닐알라닌 농도를 형광계로 측정하였다. 문헌 [Garlick, P.J. 등, Biochem. J., 192 719-723 (1980) 및 Munoz, K.M. 등, 1993 Meatbolism]을 참조한다. 상기 수치는 세포내 특정 활성을 제공한다. 6N HCl에서 가열하여 단백질을 가수분해시킨 후 근단백질 내의 페닐알라닌의 특정 활성을 측정하였다. 방출된 아미노산을 완충액 중에서 용해시켰다. 하나의 부분표본을 취하여 신틸레이션 평가하고 다른 부분표본을 취하여 상청액 분획물에 대해서와 같이 페닐알라닌 분석하였다. 단백질 합성의 분획율을 '단백질 특정 활성/세포내 특정 활성 x 시간'으로 계산하였다.
F. 데이타 분석- 파트 2
단백질 합성을 각각의 MCP 억제제에 대해 한쌍을 기준으로 분석하였다. 반대쪽 근의 스튜던트 쌍의 t 시험 비교로 단백질 합성에 대한 억제제의 효과가 나타났지는를 평가하였다. 단백질 분해를 단백질 합성의 분율 (파트 2) + 단백질 성장의 분율 (파트 1)로서 대략적으로 계산할 수 있었고, 단백질 손실로 단백질 성장에 대한 음의 값이 얻어졌다.
단백질 합성에 작용하지 않으면서 단백질 손실을 지체시키는 MCP 억제제의 능력은 정량적으로 단백질 분해의 지체를 나타낸다.
G. 결과
표 1은 대조 근에 대한 MCP 억제제의 효과 결핍을 나타낸다.
표 2는 감량 3일째 단백질 함량의 변화를 나타낸다.
표 3은 감량된 근단백질에 대한 MCP 억제제의 효과를 나타낸다.
표 4는 감량된 근 합성에 대한 MCP 억제제의 효과를 나타낸다.
표에서, 화합물 번호는 화합물의 합성 경로가 실린.실시예 번호를 참조한다.
[표 1]
Figure pct00006
[표 2]
Figure pct00007
[표 3]
Figure pct00008
[표 4]
Figure pct00009
<실시예 5>
MHC-1 프로세싱을 이용한 MCP 억제제의 증명
본 발명의 화합물을 I종 주요 조직적합성 경로 (MHC-I)에 의해 외인성 OVA 항원의 프로세싱을 억제시키는 능력에 대해 분석하였다. 항원에 노출되는 동안 항원 프로세싱 세포내에서 억제제를 포함시키는, 작용성 항원 프로세싱 시스템에 MCP 억제제를 적용시키고, 이어서 프로세싱 세포를 고정시켰다. 이어서, T 세포 하이브리도마를 억제제 부재상태에서 프로세싱 세포에 첨가하여 고정화전에 항원 프로세싱을 반영하는 펩티드-MHC-I 복합체의 발현을 결정하였다.
A. 세포 배양
세포를 37℃에서 5% CO2로 유지되는 습한 대기에서 10% 태아 송아지 혈청(Hyclone, Logan UT)과 함께 DMEM (Gibco, St. Louis, MO), 5 x 10-5M 2-메르캅토에탄올, 항생제 및 L-아르기닌 HCl (116 mg/L), L-아스파라긴 (36 mg/L), NaHCO3(2g/L), 소듐 피루베이트 (1mM)와 같은 추가물질로 이루어진 매질에서 성장시켰다. 문헌 [Harding, C.V., (1992) Eur. J. Immunol. 22:1865-1869]를 참조한다. M12.B6 세포 (generous gift of Osami Kanagawa, Washington University. ST. Louis, MO)를 항원 제시를 위해 사용하였다. 이 세포를 M12.C3 쥐과의 B 림프종 세포를 C57BL/6 쥐로부터의 LPS-자극된 비세포 (B 림프아세포의 원)으로 융화시켜서 만들었다. 즉, 이들은 H-2b항원을 발현시킨다. DOWBT 하이브리도마 세포는 I-Ab또는 I-Ad에 결합된 OVA (323-339) 펩티드에 대해 특정하다. 문헌 [Yewdell 등 Science 1988 239 : 637]을 참조한다. B3. 1T 하이브리도마 세포는 OVA(258-276)-Kb에 반응한다.
B. 일렉트로포레이션(electroporation) 및 항원 프로세싱 연구
MHC-1 경로로 프로세싱하고 제시하기 위해 외인성 항원 (난알부민; OVA)이 프로세싱 세포의 시토졸로 침투되어야 한다. OVA는 일렉트로포레이션에 의해 프로세싱 세포 (M12.B6 세포)의 시토졸로 도입되었다.
일렉트로포레이션을 0.4 cm 간격의 규벳 쳄버를 사용하여 기브코 (Gibco)BEL 일렉트로포레이터를 사용하여 행하였다. 정전용량은 800 ㎌였고 전압은 50 내지 300 V였다. 일렉트로포레이션을 1.5 x 107M12.B6 세포/㎖ (0.5 x 107- 4.0 x 107범위)와 함께 혈청이 없는 RPMI 또는 PMEM (기브코)에서 OVA의 존재하에서 4℃에서 행하였다. 세포를 즉시 얼음위로 위치시켰다. 이어서, 각종의 억제제를 부가하고 세포를 18℃ 또는 37℃로 옮겼다. 최종적으로, 세포를 1% 파라포름알데히드로 약 10 분 동안 살짝 고정시키고 더 프로세싱되는 것을 막으면서 37 ℃에서 광범위하게 세척하였다. 프로세싱 정도 (즉, 발현된 특정 펩티드-MHC 복합체의 농도)를 B3.1 또는 DOBW T 하이브리도마 세포에 의해 IL-2 분비를 자극시키는 M12.B6 세포의 능력으로 결정하였다. T 세포 (105)를 102쳄버에서 18 내지 24 시간 동안 37℃에서 0.2 ㎖ 중의 M12.B6 세포 (고정화되면 2 x 105, 생존가능하면 5 x 104)로 플레이트화시켰다. 두가지 T 하이브리도마는 모두 IL-2의 분비에 의한 항원 자극에 반응한다 (IL-2-종속 CTLL 세포 증식 및 [H3] 티미드 결합에 의해 상청액에서 분석됨, 문헌 [Allen 등, J. Imunol. 132:1077]참조).
상기 연구의 결과를 도 1 내지 도 3에 나타낸다. 도 1은 M12.B6 세포에 의해 일렉트로포레이트된 OVA의 프로세싱에 대한 화합물 14 및 16의 효과를 나타낸다. 도 2 및 도 3은 MHC-1 OVA 프로세싱에 대한 화합물 14 및 20의 효과를 나타낸다. 이들 화합물 모두는 효과적으로 OVA 프로세싱을 억제한다. 이들 데이타는 본 발명의 화합물의 MCP 억제 효과에 대한 부가적인 증거를 제공한다. 전통적인 MHC-I 경로는 프로테아좀에 의한 항원의 분해를 포함하는 것으로 받아들여진다(문헌 [Goldberg 등, supra] 참조). 즉, 화합물은 항원의 단백질 분해 프로세싱의 중요성을 더 이해하기 위해 이용될 수 있다.
<실시예 6>
A. Cu/Zn 초과산화물 디스무타제 (SOD-1) 분해의 감소
I. 파트 1 - 클로닝 및 돌연변이유발
쥐 SOD-1 cDNA 클론을 짐 마하피 (Jim Mahaffey) (North Carolina State University, Raleigh, NC)로부터 입수하였다. 이같은 클론은 1) 개시 코돈의 직접적인 상류의 코자크 번역 개시 일치 신호 (즉, 5'-GCCGCCACC-3') ATG, 2) 이같은 일치 신호의 Hind III 제한 위치 5', 및 3) cDNA의 3' 말단에서의 Xha I 제한 위치를 결합시키는 폴리메라제 사슬 반응 (PCR) 방법론에 의해 변성되었다. PCR 과정을 위해 사용되는 올리고뉴클레오티드 프라이머는 5' 프라이머 (EH87) = 5'-TCGATCGAAGCTTGCCGCCACCATGGCGATGAAAAGC-3' (SEQ ID NO:1), 3' 프라이머 (EH88) = 5'-AGCTAGCCTCGAGCAGATTACAGTTTAATG-3' (SEQ ID NO:2)이었다. 수득된 PCR 생성물을 제한 효소 Hind III + Xho I로 소화시키고 Hind III + Xho I 소화된 벡터 pBluescript II SK+ (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA)으로 클론시켜서 pSK-HX2를 얻었다.
아미노산 4에서의 FALS 점 돌연변이 (Ala4-> Val) (GCG -> GTG) 및 아미노산 113에서의 FALS 점 돌연변이 (Ile113-> Thr) (ATT -> ACT)를 문헌 [Ho 등, Gene77: 51-59) (1989)]에 기재된 증복 신장 PCR 돌연변이유발 과정을 사용하여 SOD-1 cDNA 클론 pSK-HX2로 도입시켰다. Ile113-> Thr 돌연변이체는 하기와 같이 구성되었다. 5'PCR 파편이 뉴클레오티드 서열 5'-TTAATCCTCACTCTAAGAAAC-3'(SEQ ID NO:3) (＃1이 ATG 개시 코돈의 A인 SOD1 cDNA의 뉴클레오티드 193 내지 213)로 이루어진 5' 프라이머 EH78 및 뉴클레오티드 서열 5'-TTGTACGGCCAGTGATGGAATGCT-3'(SEQ ID NO:4)(뉴클레오티드 351 내지 328)로 이루어진 3'프라이머 EH84를 사용하여 생성되었고, 3' PCR 파편이 뉴클레오티드 서열 5'-AGCATTCCATCACTGGCCGTACAA-3' (SEQ ID NO:5) (뉴클레오티드 328 내지 351)로 이루어진 5' 프라이머 EH83 및 뉴클레오티드 서열 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'(SEQ ID NO:6)(pBluescript II SK+의 뉴클레오티드 626 내지 645)로 이루어진 3' 프라이머 EH42를 사용하여 구성되었다. 5' 및 3' PCR 파편 50 나노그램 (ng)을 제2 반응 단계 PCR 반응에서 결합시키고 프라이머 EH78 및 EH42를 사용하여 증폭시켰다. 이같은 PCR 생성물을 Bal I 및 Xho I로 소화시키고 Bal I + Xho I 소화된 pSK-HX2로 클론시켜서 천연의 255 bp Bal I/Xho I 단편을 FALS 돌연변이 단편 (클론 pSK-113)으로 대체시켰다.
Ala4-> Val 돌연변이체는 하기와 같이 구성되었다. 5'PCR 단편이 뉴클레오티드서 열 5'-GCACACCACTTTCATCGCCATGGTGGCGGCAAGCTTCGATC-3'(SEQ ID NO:7) (뉴클레오티드 +21 내지 -20)로 이루어진 5' 프라이머 EH105 및 뉴클레오티드 서열 5'-ATTAACCCTCACTAAAGGGA-3'(SEQ ID NO:8)(pBluescript II SK+의 뉴클레오티드 792 내지 773)로 이루어진 3'프라이머 EH41를 사용하여 생성되었다. 3' PCR 파편이 뉴클레오티드 서열 5'-GATCGAAGCTTGCCGCCACCATGGCGATGAAAGTGGTGTGC-3'(SEQ ID NO:9) (뉴클레오티드 -20 내지 +21)로 이루어진 5' 프라이머 EH104 및 뉴클레오티드 서열 5'-CTTCAGTTAATCCTGTAA-3'(SEQ ID NO:10) (뉴클레오티드 123 내지 106)로 이루어진 3' 프라이머 EH103을 사용하여 생성되었다. 상기와 같이, 5' 및 3'PCR 단편 50 ng을 제2 반응 단계 PCR 반응에서 결합시키고 프라이머 EH41 및 EH103를 사용하여 증폭시켰다. 이같은 PCR 생성물을 Hind III 및 Rsr II로 소화시키고 Hind III + Rsr II 소화된 pSK-HX2로 클론시켜서 고유의 51 bp Hind III/Rsr II 단편을 FALS 돌연변이 단편 (클론 pSK-A4V)으로 대체시켰다. 상기의 모든 PCR 생성물은 시쿼나즈 (Sequenase) 법 (US Biochemical, Cleveland, OH)을 이용하여 서열화되어 돌연변이의 존재 및 PCR 오류의 부재를 확인하였다. 돌연변이의 위치, 프라이머 및 제한 위치를 한정하는 SOD-1 유전자의 예를 도 4에 나타낸다.
SOD-1 cDNA 발현 벡터는 와일드형 (pSK-HX2) 및 Hind III 및 Xho I와 함께 돌연변이 구성물 (pSK-113 및 pSK-A4V)로 구성되었다. 합성된 SOD-1 cDNA 서열을 포함하는 3개의 수득된 546 bp 단편을 각각 별개로 Hind III + Xho I 소화된 pcDNA I/Neo (Invitrogen Corp., San Diego, CA) 로 클론시켰서 각각 pCMV-HX5 (와일드형 SOD), pCMV-113 (Ile113-> Thr), 및 pCMV-A4V (Ala4-> Val)를 얻었다.
II. 파트 2
초기 실험을 행하여 FALS 돌연변이 SOD-1 단백질의 감소된 안정성이 MCP-중개의 단백질 분해성 분해에 의한 것인지를 결정하였다. 293으로 지정된 인간 신장세포주 (인간 293 세포 또는 293 세포)를 20852 마릴랜드주 록빌 파크론 드라이브 12301 (ATCC ＃CRL 1573)소재의 아메리칸 타입 컬처 콜렉션 (American Type Culture Collection (ATCC))으로부터 입수하고 4.6 g/L 글루코스, 10% 열비활성 말 형청을 갖는 둘베코 (Dulbecco)의 변성된 이글 (Eagle) 매질 (Gibco/Life Technologies Inc. Gaithersburg, MD)에서 성장시켰다. 인간 293 세포를 5% CO2대기중에서 37℃에서 유지시켰다. 293 세포를 인산 칼슘법을 사용하여 순간적으로 세포 감염시켰다 (Chen, C 등, Biotechniques 6:632 (1988)). pCMV-113 SOD-1 발현 벡터를 293 세포로 도입하고 24 시간후 세포를 화합물 34, 화합물 14 또는 화합물 24중 어느 하나로 배양시켰다 (각 경우 모두 24 시간 동안 5 μM 농도에서 배양시킴). 공지된 MCP 및 다른 프로테아제 억제 화합물을 디메틸 술폭사이드(DMSO)에서 용해시켰다. 다른 293 세포 배양물을 DMSO 동부피로 배양시키거나 음성적 대조물로서 매질에 잔류시켰다.
시험 화합물을 수용하기 약 48 시간 전에 5 x 105개의 293 세포를 36 mm 접시에 시드(seed)시켜 5% CO2대기 중에서 37 ℃로 유지시켰다. 세포를 MCP 억제제 (화합물 34, 14 또는 24) 또는 DMSO로 음성적 대조물로서 24 시간 동안 배양시켰다. 세포 용해물은 냉동/해동을 순환시켜 포스페이트-완충된 염수 (PBS) 약 75㎕ 중에서 세포를 용해시켜 제조되었다. 세포 용해물의 단백질 농도는 BCA법(Pierce, Rockford, IL)을 이용하여 측정되었고 각 시료 2 내지 2.5 ㎍은 4 내지 20% 폴리아크릴아미드겔 (Novex, San Diego, CA) 상에서 트리스/글리신/SDS (25 mM 트리스/192 mM 글리신/ 0.1% SDS) 완충 시스템을 사용하여 전기전달되었다. 단백질은 전기용출에 의해 니트로셀룰로우스 필터로 옮겨지고 필터는 30 분 동안 블로토 (blotto) 용액 (25 mM 트리스-완충된 염수 (1 x TBS> 중의 5% 분유) 중에서 배양시켜 차단되었다. 필터는 제1 항체 용액 (블로토 용액 중에서 1:10,000 희석)으로 옮겨지고 2 내지 18시간 동안 배양되었다. 본 연구에서 사용된 제1 항체는 E.Coli (Hazelton Research Products, Denver, PA) 중에서 제조된 정제된 쥐 SOD-1에 대해 성장한 폴리클론성 토끼 항혈청이다. 필터를 1 x TBS에서 각각 5분 동안 3회 세척하고 제2 항체 용액 (블로토 용액 중에서 1:2,000 희석)에서 2 시간 동안 배양시켰다. 제2 항체는 알칼리성 포스파타제 (Bio-Rad, Richmond, CA)에 접합된 염소 항-토끼 IgG였다. 필터를 5 분동안 각각 1 x TBS 중에서 3회 세척하고 시판되는 알칼리성 포스파타제 탐지 시약 (Bio-Rad, Richmond, CA) 중에서 5 내지 60 분 동안 배양시켜 알칼리성 포스파타제 활성에 대해 염색시켰다. SOD-1 단백질에 상응하는 염색된 밴드를 도쿠겔 (DocuGel) V 이미지 분석 시스템 및 RFLPscan 소프트웨어 (Scanalytics, Billerica, MA)를 사용하여 정량하였다. SOD-1의 농도를 음성 대조물에 대한 유도 단위로 표현하였다 (즉, 실험 단위를 대조 단위로 나눔). 세포 용해물의 면역표본을 분석하여 SOD-1 농도는 MCP 억제제의 존재하에서 배양된 3개의 시료 각각의 대조물의 SOD-1 농도와 비교하여 적당하게 증가함을 밝혔다 (도 5). 이들 결과는 본 발명의 화합물에 의한 MCP의 억제로 인해 Ile113-> Thr 돌연변이체에서 SOD-1 단백질의 축적을 증가시켜서 FALS 돌연변이를 포함하는 세포중의 SOD-1의 감소된 농도에 대한 원인이 되는 MCP를 포함하게 되는 것을 나타낸다.
III. 파트 3
MCP 활성이 SOD-1 교체에 대한 원인이 됨을 더 나타내기 위해, 와일드형 쥐 SOD-1 또는 FALS 돌연변이 단백질, 즉 Ala4대신 Val 및 Ile113대신 Thr을 안정하게 생산하는 세포주 상에서 연구하였다. 쥐 천연의 SOD-1 및 상술한 2개의 FALS 돌연변이 SOD-1 단백질을 안정하게 발현시키는 세포주는 상술한 바와 같이 SOD-1 cDNA 발현 구성물에 의한 293 세포의 칼슘 포스페이트 세포 감염 (Chen, C. 등, Biotechniques 6: 632 (1988) 및 후속적인 1mg/㎖ G418 (GeneticinTM, Gibco/Life Technologies, Inc., Gaitherburg, MD)존재하에서의 성장에 의해 네오마이신 항성에 대해 선정하여 유도되었다. 세포를 G418 선택물에 3 주 동안 유지시키고, 이때 약제 선택물이 제거되고 각 변형된 세포형의 G418-항성 군체는 더 성장시키기 위해 모아졌다. 화합물 14를 본 연구에 사용하였다.
표시된 SOD-1 이소폼을 발현시키는 세포주를 다양한 농도의 화합물 14로 24 시간 동안 배양하고, 이때 SOD-1 농도를 면역표본의 농도계로 조사하여 측정하였다. SOD-1 농도를 상기와 같이 음성 대조물로부터의 시료에 대한 유도 단위로서 표현하고 각 데이타 점은 3가지 실험의 평균치이다. 화합물 14의 투약량 반응 분석으로 이같은 MCP 억제제로 변형된 세포를 배양시키는 것은 약 20μM의 농도에서 화합물 14로 배양된 세포에서 나타나는 최대 축적을 갖는 SOD-1 단백질 단백질 농도의 현저한 축적을 유도한다는 것을 밝혔다 (도 6). 더욱이 SOD-1 축적 정도는 각종의SOD 단백질의 추정된 반감기와 연관되고, 와일드형 SOD-1은 가장 안정하고 Ala4Val은 가장 불안정하다 (Borchelet D.R. 등, Proc. Natl, Acad. Sci. 91:8292-8296 (1994)). 상기 데이타는 FALS 돌연변이가 미스폴딩에 의해 그리고 MCP에 의한 분해에 의해 돌연변이 표적 단백질로부터의 구조적 변형의 결과로서 SOD-1 단백질을 탈안정화시킨다는 가설과 일치한다. 또한, 이들 결과는 화합물 14가 SOD-1 분해에서 MCP의 역할을 더욱 지지하는 와일드형 SOD-1 단백질의 교체에 대해 통계적으로 현저한 영향을 미치는 것을 증명한다.
IV. 파트 4
SOD-1 교체에서의 MCP 활성의 특이성을 증명하기 위해 (그리고 칼슘 활성 프로테아제 칼페인 (calpain) 및 리소좀 프로테아제와 같은 다른 주요 단백질 분해 경로의 일어날 수 있는 관여를 배제시키기 위해), 2종의 변형된 세포주 (상술한 바와 같이, 하나는 와일드형 단백질이고 다른 하나는 Ala4-> Val 돌연변이를 수반하는 SOD-1 단백질을 생산함)를 각각이 유일한 단백질 분해 활성에 대해 특이적인 각종의 프로테아제 억제제로 배양시켰다. 화합물 14는 MCP를 억제시킨다. "칼펩틴" (Calpeptin) (Novabiochem USA. La Jolla, CA, cat no. 03-34-0051;CBZ-Leu-Nle-알데히드, Biochem. Biophys. Res. Comm. (1988) 153 : 1201), 세포 투과 "칼페인" 억제제 (칼페인은 시스테인 프로테아제) 및 DK-3 (Enzyme Systems Products, Dubline, CA CBZ-Phe-Ala-CHN2)는 리소좀 프로테아제 활성을 억제시킨다. 또한, 세포는 본 발명에 특히 바람직한 화합물, 즉 화합물 14에 비해 덜 강력한 MCP 억제제인 화합물 16으로 배양되었다. 표시된 SOD-1 이소폼을 발현시키는 세포주는 화합물 14 (20 μM), 칼펩틴 (10 μM), DK-3 (5 μM), 화합물 16 (20 μM)의 프로테아제 억제제로 또는 음성 대조용인 DMSO와 함께 24 시간동안 배양되었다. 억제제로 24 시간 동안 배양시킨 후, SOD-1 농도를 면역표본의 농도계 주사로 측정하였다. SOD-1 농도는 상기와 같이 비처리된 시료에 대한 유도 단위로서 표현되었다. 각 데이타 점은 세번의 실험 결과의 평균이다.
결과를 도 7에 나타낸다. Ala4-> Val 돌연변이 SOD-1의 교체는 MCP 활성도의 함수이고 바람직한 화합물 14에 의한 MCP의 특정 억제만이 SOD-1 단백질 축적에서 현저한 (3배) 증가를 유도함을 알 수 있다. 칼페인 또는 리소좀 프로테아제의 억제제를 이용하여 배양시키는 것은 SOD-1 교체에 상당한 영향을 미치지 못했다. 더욱이, 화합물 14 처리로 와일드형 SOD-1 축적이 다소 증가하였고, 이같은 사실은 투약량 반응 연구에서 이미 관찰되었다. 종합하면, 이같은 연구로 MCP 활성이 변형된 293 세포주에서 SOD-교체에 결정적이고, 화합물 14에 의한 MCP의 억제가 세포내에서 SOD-1 단백질의 증가를 유도시킨다는 것이 증명된다.
억제제의 합성
하기는 본 발명의 화합물을 제조하기 위한 전형적인 합성 경로를 제공한다. 다른 합성 경로, 뿐만 아니라 하기 합성 반응식의 변형은 개시된 본 발명을 한번 접한 본 분야의 숙련자에게 쉽게 이해될 것이다.
본 발명의 억제제는 문헌 [The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology,Volume I (1979), eds. Gross 등, Academic Press] 및 하기 실시예 8 내지 11에 기재된 바와 같은 용액-상 기술을 이용한 공지된 합성 방법에 의해 도입될 수 있는 아미드 결합을 포함한다.
억제제는 별개의 합성 및 실시예 14 내지 38에서 기재된 바와 같이 R1-(CH2)n-CH(R2)-COOH 및 H2N-CH(R3)-CONH-R4단편의 커플링 (커플링 방법 I)에 의해 제조될 수 있다.
별법으로, 억제제는 별개의 합성 및 실시예 39 내지 42에서 기재된 바와 같이 R1-(CH2)n-CH(R2)-CONH-CH(R3)-COOH 및 H2N-R4단편의 커플링 (커플링 방법 II)에 의해 제조될 수 있다.
치환체 Q가 알데히드기를 포함할 때 (즉, H2N-R4가 아미노산, 예컨대 H2N-CH(CH2R7)-CHO로부터 유도된 아미노알데히드일 때), 필요한 아세탈 보호된 아미노알데히드가 문헌 [Gacek 등. Tetrahedron, 30, 4233 (1974)] 또는 실시예 12에 기재된 방법에 의해 합성될 수 있다. 커플링이 완료된 후 (커플링 방법 I 또는 II에 의해), 아세탈 보호기를 실시예 11 (방법 E)에 기재된 바와 같이 제거시켜 자유 알데히드기를 유리시킬 수 있다.
Q가 메틸케톤 또는 디아조-, 브로모-, 또는 클로로메틸케톤일 때 (즉, H2N-R4가 알파-아미노-치환된 메틸 케톤 또는 아미노산으로부터 유도된 알파 디아자-, 브로모-, 또는 클로로메틸 케톤일 때), 커플링 방법 II가 특히 용이하다. 클로로메틸 케톤의 히드로클로라이드 염은 구입할 수 있고 (Bachem Bioscience Inc., King of Prussia, Pennsylvania) 또는 Boc-보호된 아미노산을 혼합된 탄소성 무수물로 전환시키고 디아조메탄과 반응시켜 디아조메틸 케톤을 수득하여 제조될 수 있다. 브로모- 및 클로로-메틸 케톤을 문헌 [Kettner 등. Arch. Biochem. Biophys. 162, 56(1974), Fittkau, J. Prakt. Chem. 315, 1037 (1973)] 또는 Zimmerman 등의 1995년 6월 15일자로 공개된 PCT 제 WO 95/15749에 기재된 바와 같이 브롬화 수소 또는 염화 수소와 디아조메틸 케톤을 반응시켜 제조한다.
상응하는 메틸 케톤이 Kettner 등의 미국특허 제 4,652,552에 기재된 클로로메틸 케톤의 가수분해에 의해 제조될 수 있다.
Q가 알파-디플루오로메틸 케톤일 경우, 상응하는 1-아미노-3,3-디플루오로-2-프로파놀이 제조될 수 있고 커플링 방법 II에 의해 커플링될 수 있으며, 수득된 디플루오로알코올은 Trainor 및 Stein의 미국특허 제 4,923,890에 기재된 방법에 의해 디플루오로케톤으로 산화되었다.
Q가 트리플루오로케논 (즉, H2N-R4가 아미노산 유도된 트리플루오로 케톤, 예컨대 H2N-CH(CH2-R7)-COCF3임) 일 때, 필요한 케톤은 문헌 [Imperiali and Abeles, Biochemistry 25, 3760 및 보조 페이지 (1986)]에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다.
Q가 아미노산으로부터 유도된 모노플루오로메틸 케톤 (즉, H2N-R4가 플루오로메틸 케톤기, 예컨대 H2N-CH(CH2-R7)-COCH2F을 포함함)일 때, 필요한 케톤은 Boc-보호된 아미노산 및 마그네슘 벤질 플루오로말로네이트를 사용하여 유럽특허 출원 제 EP 442, 754호에 실린 팔머 (Palmer) 방법에 의해 제조될 수 있다. Boc 보호기를 제거한 후, 아민을 커플링 방법 II를 이용하여 커플링시킬 수 있었다. 별법으로, 모노플루오로메틸 케톤은 실시예 42에 기재된 바와 같이 상응하는 알코올을 산화시켜 제조될 수 있다.
Q가 보로아미노산 유도체 (즉, Q가 -B(OH)2또는 그의 시클릭 에스테르)일때, 시클릭 에스테르는 본질적으로 Shenvi의 미국특허 제 4,537,773에 기재된 바와 같이 제조되고 커플링 방법 II에 의해 커플링시킨 후 Shenvi 및 Kettner의 미국특허 제 4,499,082호 및 동 5,187,157호 및 문헌 [J.Biol. Chem. 259, 15106 (1984)]에 기재된 바와 같이 자유 펩티드 보론산으로 임의로 전환될 수 있었다.
Q가 알파-디케톤 또는 알파-케토 에스테르 (즉, Q가 -C(=O)C(=O)R7또는 -C(=O)CO2R7일 때, 필요한 아미노디케논 또는 알파-케토 에스테르는 문헌[Angelastro 등, J. Med. Chem. 33, 13 (1990)] 및 여기에 실린 참고 문헌에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 알파-케토 에스테르는 가수분해되거나 아미드화되어 상응하는 알파-케토산 또는 아미드를 생성할 수 있다. 알파-케토 아미드는 문헌[Harbeson 등, J. Med. Chem. 37, 2918-2929 (1994)]의 방법을 변형시켜 시판되는 Boc-보호된 아미노산으로부터 제조될 수 있다. 후자의 매우 유용한 방법에서, Boc-보호된 아미노산은 연속적으로 N,O-디메틸히드록실아미드, 알데히드, 시아노히드린, 알파-히드록실카르복실레이트, 및 알파-히드록실아미드로 전환된다.
Figure pct00010
(식 중, R1은 Boc-NH-CH(CH2R7)-이다)
Boc 기는 산 조건에서 제거되고 중화후, 자유 아미노 잔기가 커플링 방법 II에서와 같이 커플링되어 알파히드록실카르복사미드가 수득되고 이것은 산화되어 알파-케토카르복사미드 억제제가 얻어진다.
Figure pct00011
<실시예 7>
방법 A : 혼합된 무수물 방법:
반응식:
Figure pct00012
식 중,
X는 플루오르에닐메틸옥시카르보닐 (Fmoc)- 또는 t-부틸옥시카르보닐(Boc)-기이고, Y는 아세탈 또는 아미드 알데히드용 다른 보호기이며,
AA1은 아미노산이고,
AA2은 아미노 알데히드이다.
N-메틸모르폴린 (NMM) (1 당량)을 테트라히드로푸란 (THF) 중에서의 보호된 아미노산의 교반액에 부가하였다. 혼합물을 이소부탈 클로로포르메이트 (IBCF)(1.1 당량)으로 처리하면서 -15 ℃로 냉각시키고, 10 분 동안 반응시켰다. 자유 염기 형태의 아미노 알데히드 성분을 부가하고 이어서 NMM (1.1 당량, 산염이면 2.2 당량)을 부가하였다. -15℃에서 30분 동안 이어서 실온에서 3 내지 4시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 (EtOAc) 150 내지 200 ㎖에 용해시켰다. 수득된 용액을 연속적으로 물, 5% 탄산수소나트륨 (NaHCO3), 2% 수성 시트르산으로 세척하고 최종적으로 물로 세척하였다. 유기층을 무수 황산 나트륨 (Na2SO4) 또는 황산 마그네슘 (MgSO4) 상에서 건조시키고, 용매를 감압하에서 제거하고 이 같이 수득된 생성물을 석유 에테르로 저작시켰다. 이와 같이 수득된 고형 펩티드를 여과시키고 건조시키고 특성화시켰다.
<실시예 8>
방법 B : Fmoc-기 탈보호 과정:
반응식 :
Figure pct00013
에틸 아세테이트 (EtOAc)에의 30% 디메틸포름아미드 (DMF) 혼합물 중의 Fmoc-보호 펩티드 (0.2 내지 4 밀리몰)을 50 내지 60배의 과량의 디에틸아민(DEA)로 2 시간 동안 실온에서 처리하였다. 용매를 감압하에서 30 ℃에서 증발시키고, 석유 에테르를 잔기에 부가하였다. 침전물이 형성될 때 이것을 여과시키고 건조시켰다. 다른 경우, 수득된 검을 석유 에테르로 반복적으로 저작하고 검을 진공하에서 보관하였다.
<실시예 9>
방법 C : 펩티드에의 캡핑기 또는 아미노산 부가:
반응식 :
Figure pct00014
캡핑기 (자유 카르복시산으로서) 또는 보호 아미노산 (1당량), 벤조트리아졸-1-일옥시-트리스-(디메틸아미노)-포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (BOP) (1.1 당량) 및 1-히드록실벤조트리아졸 (HOBt) (1당량)을 DMF 5㎖에 그리고 NMM (2.2 당량)에 용해시켰다. 5분 후, 펩티드의 탈보호된 염기성 성분 또는 카르복시기 보호된 아미노산을 부가하고, pH를 8로 조종하고 혼합물을 3 내지 4 시간 동안 교반시켰다. 이후, EtOAc 150 내지 300 ㎖ 희석시키고 물, 2% NaHCO3, 물, 2% 시트르산 및 물로 연속적으로 추출하였다. 유기상을 건조시키고 증발건조시켜 캡핑되거나 N-보호된 펩티드를 수득하였다.
<실시예 10>
방법 D : 카르보벤질옥시 (CBZ-)기 제거 방법:
에틸 아세테이트 (15 ㎖) 중의 CBZ-보호된 펩티드 또는 아미노산 유도체(1g) 용액을 탄소 상의 Pd/C 0.2 g (물 50 중량%를 포함한 탄소 상의 10% Pd)과 혼합하고 4 시간 동안 40 psi에서 수소화시켰다. 용액을 셀라이트R(규조토)를 통해 여과시키고 증발건조시켜 비보호된 펩티드 또는 아미노산 유도체를 수득하였다.
<실시예 11>
방법 E : 아세탈의 알데히드로의 전환:
THF 3 ㎖ 중의 펩티드 아세탈 (1당량) 용액을 수성 HCl (2M) 3 ㎖와 혼합하고 0.5 내지 2 시간 동안 교반시켰다. 용매를 증발시켜 제거하고 최종 잔기를 물로 희석시키고 동결건조시켜 펩티드 알데히드를 수득하였다.
<실시예 12>
방법 F : 류시날 디에틸아세탈의 제조
Figure pct00015
단계 1: NMM (10㎖)을 THF 250 ㎖ 중의 CBZ-Leu-OH (25 g, 93 밀리몰)의 용액에 첨가하였다. 용액을 -15 ℃로 냉각시키고 이소부틸 클로로포르메이트(IBCF) 13 ㎖로 처리하고 10분 동안 반응시켰다. 이어서, DMF 40 ㎖ 및 NMM 10 ㎖ 중의 N,O-디메틸히드록실아민 히드로클로라이드 (9.36 g, 96 밀리몰)의 현탁액을 첨가하였다. 4 시간 동안 교반시킨 후, 혼합물을 EtOAc 400 ㎖로 희석시키고 용액을 물, 5% NaHCO3용액, 물, 2% 시트르산 및 물로 연속적으로 세척하였다. 유기층을 MgSO4상에서 건조시키고 증발시켜서 무색 오일 19.0 g을 수득하였다.
단계 2: 에테르 200 ㎖ 중의 단계 1로부터의 오일 (19 g)의 용액을 -78 ℃로 냉각시키고 에테르 중의 리듐 알루미늄 히드라이드 (LiAlH4) 용액 (1.0 M) 120 ㎖을 45 분동안 적가하였다. 용액을 30 분 동안 교반시키고, 1M 황산수소칼륨 (KHSO4) 200 ㎖을 질소 대기에서 적가하였다. 유기층을 분리하고 KHSO4(1M) 용액으로 세척하고 MgSO4상에서 건조시키고 증발시켜 무색 액체 (CBZ-Leu-H)를 수득하였다.
단계 3: 트리에틸 오르토포르메이트 104 ㎖를 30 분동안 무수 에탄올 (EtOH) 100 ㎖ 중의 CBZ-Leu-H (12 g) 및 p-톨루엔술폰산 (0.9 g)의 용액에 부가하였다. 혼합물을 30 분 동안 교반시키고, 증발시키고 에테르 500 ㎖로 희석시켰다. 에테르층을 NaHCO3의 포화 용액 및 염화나트륨으로 연속적으로 세척하였다. 황갈색 반고체를 냉핵산으로부터 재결정화시켜 회백색의 침상 CBZ-류시날 디에틸아세탈을
Figure pct00016
단계 4: 단계 3의 생성물 (14.8 g)을 Pa/C 2.5 g으로 방법 D를 사용하여 수소화시켜 오일 상의 류시날 디에틸아세탈 4.09 g을 수득하였다.1H HMR (300
Figure pct00017
<실시예 13>
방법 G : P3 모방체의 합성 (명명을 위해, 문헌 [Schechter, I. 및 Burger, A. (1967) Biochem. Biophys. Res. Commun. 27:157-162] 참조).
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
단계 1: 벤질 시클로펜탄 아세테이트의 제조:
벤젠 (60 ㎖) 중의 시클로펜틸아세트산 (10.02 g, 78.2 밀리몰), 벤질 알코올 (8.46 g, 78.2 밀리몰) 및 p-톨루엔술폰산 모노히드레이트 (1.48 g, 7.82 밀리몰)의 혼합물을 딘-스타크 수 분리기를 사용하여 2 시간 동안 환류시켰다. 냉각시킨 후, 벤젠을 제거하고 혼합물을 에테르 (50 ㎖)로 희석시키고 포화 NaHCO3용액, 포화 염수 용액으로 연속적으로 세척하고 건조 증발시켜 오일상의 화합물 (15.40 g)을 수
Figure pct00021
단계 2: 벤질 2-시클로펜틸-10-요오도데카노에이트의 제조
THF (20 ㎖) 와 헥산 (8 ㎖)의 혼합물에 리듐 디이소프로필아미드 (20 밀리몰)의 냉각액 (-78 ℃) (상응하는 디이소프로필아민 및 n-BuLi로부터 동일계에서 수득됨)에 무수 THF (10 ㎖) 중의 단계 1에서 수득된 화합물 (3.96 g, 18 밀리몰)을 천천히 부가하였다. 혼합물을 30분 동안 교반하고 헥사메틸포스포르아미드 (3.50g, 20 밀리몰) 중의 1.8-디요오도옥탄 (7.19 g, 20 밀리몰)을 부가하였다. 혼합물을 -78 ℃에서 30 분 동안 교반시키고, 2 시간 동안 천천히 0 ℃가 되도록하고, 12 % 염화나트륨 수용액 50 ㎖을 조심스럽게 첨가하여 급냉시켰다. 혼합물을 에테르로 추출하고, 염수로 세척하고, 건조시키고 용매를 증발시켰다. 조생성물을 용출액으로서 헥산 중의 1 % EtOAc에 대한 헥산을 사용하여 실리카 상에서 플레시크로마토그래
Figure pct00022
단계 3: 벤질 10-시아노-2-시클로펜틸데카노에이트의 제조
무수 DMSO 15 ㎖ 중의 단계 2의 요오도에스테르 (3.99 g, 8.7 밀리몰) 및 소듐 시아나이드 (0.47 g, 9.6 밀리몰)의 혼합물을 70 내지 75 ℃로 30 분 동안 가열하였다. 냉각시킨 후, 반응 혼합물을 얼음 (약 40 g) 위에 쏟아 붓고 에테르로 추출하고 물 및 포화 염수로 연속적으로 세척하였다. 유기상을 농축시켜 오일 (2.89 g)
Figure pct00023
단계 4: 벤질 10-N-프탈이미도-2-시클로펜틸데카노에이트의 제조:
DMF 8㎖ 중의 단계 2의 화합물 (1.21 g, 2.6 밀리몰) 및 포타슘 프탈이미드 (0.536 g, 3 밀리몰)의 혼합물을 30 분 동안 70 내지 75 ℃로 가열하였다. 냉각시킨 후, 반응 혼합물을 얼음 (약 40℃) 위에 쏟아 붓고 에테르 60 ㎖로 추출시켰다. 결합된 유기층을 물 및 포화 염수로 세척하고 농축시켜 무색의 오일 (1.24 g)을 수득
Figure pct00024
단계 5: 10-시아노-2-시클로펜틸데카노산의 제조:
무수 MeOH (35 ㎖) 중의 단계 3의 시아노에스테르 (2.89 g, 8 밀리몰) 및 10% Pd-C (0.6 g, DeGussa, H2O 함량 50 %)의 혼합물을 2 시간 동안 (42 내지 26 psi) 수소화시켰다 반응 혼합물을 셀라이트R패드를 통해 여과시키고 무색의 오일
Figure pct00025
단계 6: 2-시클로펜틸-10-N-프탈이미도 데카논산의 제조:
단계 5후, 단계 4의 생성물 (0.41 g)을 표제 화합물 (0.31 g)로 전환시켰다.
Figure pct00026
단계 7: 10-트리플루오로메탄술폰아미도-2-시클로펜틸-데칸산 벤질 에스테르의 제조
Figure pct00027
메탄올 (8㎖) 중의 단계 4로부터의 에스테르 (0.874 g, 1.7 밀리몰) 및 히드라진 모노히드레이트 (0.425g, 0.41 ㎖, 8.5 밀리몰)의 혼합물을 30분동안 환류하에서 가열하여 농축시키고, 잔기를 에테르로 저작하여 여과된 백색 침전물을 얻었다. 여과액을 농축시켜 오일 (0.540 g)을 얻었다. 오일을 -10 ℃로 냉각된 CH2Cl2(8 ㎖)에 용해시키고 여기에 트리에틸아민 (0.324 ㎖) 이어서 트리플루오로메탄 술포닐클로라이드 (0.25 ㎖)를 첨가하였다. 1 시간 동안 천천히 실온으로 되게 하였다. 이어서 반응 혼합물을 물, 2% HCl, 물 및 포화 염수로 세척하였다. 유기층을 오일로 농축시키고 용출액으로서 헥산 중의 10% EtOAc를 사용하여 실리카겔 상에서 플레시 크로마토그래피시켜 정제하여 오일상의 10-프리플루오로메탄술폰아미도-2-시클로펜틸-데칸산 벤질 에스테르 (0.25 g)을 수득하였다.1H NMR (300 MHz, CDCl3)
Figure pct00028
단계 8: 2-시클로펜틸-10-(트리플루오로메탄술폰아미도)-데칸산의 제조
단계 5와 동일한 과정을 따라, 단계 7의 화합물 (0.25 g)을 오일상의 표제 화
Figure pct00029
Figure pct00030
단계 9: t-부틸 8-요오도카프릴산의 제조
표제 화합물을 t-부틸 아세테이트 (1.16 g) 및 1,6-디요오도헥산 (4.06 g)으로부터 단계 2의 화합물에 대해 기재된 방법에 따라 오일상으로 합성하였다.1H
Figure pct00031
단계 10: 2-시클로펜틸데칸-1,10-디산-1-벤질-10-t-부틸 에스테르의 제조
단계 2의 과정을 사용하여, 단계 2로부터의 에스테르 (6.92g) 및 단계 9의 요오도에스테르 (11.37g)을 반응시켜 오일상의 표제 화합물 (7.44 g)을 수득하였다.
Figure pct00032
단계 11: 2-시클로펜틸데칸-1,10-디산-1-벤질-10-메틸 에스테르의 제조
CH2Cl2(30㎖) 및 90% TFH 10㎖ 중의 단계 10의 디에스테르 (2.86g, 7 밀리몰)의 용액을 30 분 동안 교반시켰다. 증발시킨 후 수득된 생성물을 CH2Cl2(10㎖) 및 MeOH (6㎖)의 혼합물에 용해시켰다. 용액을 -20 ℃에서 교반시키고 여기에 2시간 동안 티오닐 클로라이드 (6㎖)을 천천히 부가하였다. 용매를 증발시키고 잔기를 디에틸 에테르 (20㎖)에 용해시켰다. 유기층을 포화 NaHCO3용액, 물, 염수로 연속 세척하고, 건조시키고, 증발시키고 실리카겔 (용출액 : 2% EtOAc-헥산) 상에서 플래시 크로마토그래피하여 오일상의 생성물 (2.05 g)을 수득하였다.1H NMR
Figure pct00033
단계 12: 2-시클로펜틸데칸-1,10-디산-10-메틸 에스테르의 제조
단계 5의 과정을 사용하여, 단계 11로부터의 화합물 (4.96g)을 오일상의 표제
Figure pct00034
단계 13: 6-시클로헥산-1-술핀산 나트륨 염의 제조
Figure pct00035
물 응축기, 기계적 교반기 및 적하 깔대기를 구비한 3가지 플라스크에서, 1-브로모-6-시아노헥산 (8.04 g, 42.3 밀리몰)의 용액을 95 % EtOH 75 ㎖에 위치시켰다. 혼합물을 가열 환류시키고 여기에 H2O 50 ㎖ 중의 소듐 술파이트 (8.00 g, 63.5 밀리몰) 용액을 30분 동안 천천히 부가하였다. 혼합물을 2 시간 동안 가열하고 감압하에서 농축시켰다. 잔기를 95% EtOH (200 ㎖) 중에 용해시키고 가열하여 비등시키고 여과시켰다. 여과액을 농축시키고 빙조에서 냉각시켰다. 침전물을 여과시켜 수집하고 건조하여 3.00 g의 백색 고체를 얻었다. 모액을 더 농축시켜 생성물
Figure pct00036
단계 14: 6-시클로헥산-1-술포닐 클로라이드의 제조:
단계 13으로부터의 생성물 (0.340g, 1.6 밀리몰), 티오일 클로라이드 (0.95 g, 8 밀리몰) 및 DMF 한방울의 혼합물을 75 내지 80 ℃에서 30 분 동안 가열하였다. 냉각시킨 후, 용매를 제거하고 잔기를 냉수 5 ㎖로 처리하였다. 유기층을 에테르 30㎖로 추출하고 결합된 유기층을 3% NaHCO3용액 및 물로 세척하고, MgSO4에서 건조시키고 여과시켰다. 여과액을 활성 탄소 (Darco)로 처리하고, 여과시키고 농축시켜 추가의 정제없이 사용되는 무색의 오일 (0.240g)을 수득하였다.
실시예 4 내지 38에는 표 5에 실린 MCP 억제제의 합성을 기재한다. 상응하는 정제 조건을 표 6에 기록한다.
[표 5]
Figure pct00037
[표 5]
Figure pct00038
[표 5]
Figure pct00039
[단계 6]
Figure pct00040
[단계 6(계속)]
Figure pct00041
[단계 6(계속)]
Figure pct00042
<실시예 14>
10-시아노-2-시클로펜틸데카노일-Ng-니트로-L-아르기닐-L-류시날
Figure pct00043
단계 1: 플루오르에틸메틸옥시카르보닐-Ng-니트로-L-아르기닐-L-류시날 디에틸아세탈.
Fmoc-Arg(NO2)-OH (4.41 g, 10 밀리몰)을 IBCF 1.29 ㎖, NMM 2.2 ㎖ 및 THF 10 ㎖ (실시예 7 방법 A의 DMF 대신)을 사용하여 방법 A (실시예 7)에 따라 류-아세탈 (1.89 g, 10 밀리몰)과 커플링시켰다. 조펩티드를 비결정질 고체로 수득
Figure pct00044
단계 2: Ng-니트로-L-아르기닐-L-류시날 디에틸아세탈.
Fmoc기를 탈보호 방법 B (실시예 8)을 사용하여 단계 1의 생성물 3.5 g으로부터 제거하였다. 자유 염기 (2.5 g)을 반고체로 수득하였다.1H NMR (300 MHz,
Figure pct00045
단계 3: 10-시아노-2-시클로펜틸-데카노일-Ng-니트로-L-아르기닐-L-류시날디에틸아세탈
방법 C (실시예 9)에 따라, DMF 16㎖ 중의 방법 G의 10-시아노-2-시클로펜틸-데칸산 (2g, 7.5 밀리몰)을 BOP (3.34 g, 7.5 밀리몰) 및 HOBt (1.01g, 7.5 밀리몰)을 사용하여 단계 2의 생성물 (2.15 g, 5.5 밀리몰)로 처리하여 조펩티드 (3.85 g)
Figure pct00046
단계 4: 30% THF를 포함하는 아세토니트릴 (ACN) 10 ㎖ 중의 단계 3의 생성물 (0.2 g)의 용액을 1시간 동안 교반하고 용매를 증발시키고 화합물 14를 디에틸 에테르를 사용하여 침전시켰다. HPLC 정제 조건을 표 6에 기재한다.1H NMR
Figure pct00047
실시예 15:
10-시아노-2-시클로펜틸-데카노일-Ng-(2,2,5,7,8-펜타메릴크로만-6-술포닐)-L-아르기닐-류시날
Figure pct00048
단계 1: 10-시아노-2-시클로펜틸-데카노일-Ng-(2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-술포닐)-L-아르기닐-L-류시날 디에틸아세탈.
방법 C (실시예 9)에 따라, 10-시아노-2-시클로펜틸 데칸산 (2 밀리몰, 실시예 13의 방법 G의 단계 5)를 Ng-(2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-술포닐)-L-아르기닐-L-류시날 디에틸아세탈 (1.8 밀리몰, 화합물 14의 단계 2)과 커플링시켜 고체상의 화합물을 수득하였다.
단계 2: 10-시아노-2-시클로펜틸-데카노일-Ng-(2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-술포닐)-L-아르기닐-L-류시날.
방법 E (실시예 11)를 따라, 단계 1로부터의 생성물 (0.3 g)을 화합물 15 (0.2 g)로 전환시키고 HPLC에 의해 정제하였다.1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ
Figure pct00049
실시예 16:
10-시아노-2-시클로펜틸-데카노일-Ng-니트로-L-아르기닐-L-류시날 세미카르바존
Figure pct00050
세미카르바지드 히드로클로라이드 (0.20 밀리몰), 소듐 아세테이트 (0.3 밀리몰) 및 물 (0.5 ㎖)을 에탄올 4.5 ㎖중의 화합물 14 (0.050g, 0.089 밀리몰)의 용액에 첨가하고 실온에서 철야 교반하였다. 용매를 제거하고 수득된 화합물 16을 표 6에 기재된 바와 같이 HPLC로 정제하였다.1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ9.91(s,
Figure pct00051
<실시예 17>
10-시아노-2-시클로펜틸-데카노일-Ng-니트로-L-아르기닐-L-류시날 옥심
Figure pct00052
히드록실아민 히드로클로라이드 (0.037 g, 0.534 밀리몰)을 피리딘 (0.175g,2.2 밀리몰) 중의 실시예 14 단계 4의 생성물 (0.05 g, 0.089 밀리몰) 용액에 실온에서 그리고 30 분 동안 80 ℃에서 첨가하였다. 생성물을 표 6에 기재된 바와 같이 HPLC로 단리시켰다.
<실시예 18>
10-시아노-2-시클로펜틸-데카노일-Ng-니트로-L-아르기닐-L-류시날-O-메틸옥심
Figure pct00053
실시예 17의 과정에 따라, 화합물 18을 O-메틸히드록실아민 히드로클로라이드 (0.031 g, 0.38 밀리몰)을 사용하여 제조하고 표 6에 기재된 바와 같이 HPLC에
의해 2개의 피크의 혼합물로서 단리시켰다.
<실시예 19>
10-시아노-2-시클로펜틸-데카노일-Ng-니트로-L-아르기닐-L-류시날-O-벤질 옥심
Figure pct00054
실시예 17의 제조에서의 과정을 따라, 화합물 19을 화합물 14 (0.05g, 0.089밀리몰), O-벤질 히드록실아민 히드로클로라이드 (0.043 g, 2.267 밀리몰) 및 피리딘 (0.092 ㎖, 1.14 밀리몰)을 사용하여 제조하였다. 화합물을 HPLC 정제에서 2개의 피크로 분리시켰다.
<실시예 20>
9-메톡시카르보닐-2-시클로펜틸-노나오일-Ng-(2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-술포닐)-L-아르기닐-L-류시날
Figure pct00055
단계 1: Fmoc-Ng-(2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-술포닐)-L-아르기닐-L-류시날디에틸아세탈
방법 C (실시예 9)에 따라, Fmoc-Ng-(2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-술포
닐)-L-아르기닌 (3.31 g, 5 밀리몰)을 DMF 12 ㎖ 중의 BOP (2.21 g, 5 밀리몰), HOBt (0.67 g, 5 밀리몰) 및 NMM (0.7 ㎖)을 사용하여 L-류시날 디에틸아세탈 (0.85 g, 실시예 12의 방법 F)와 커플링시켜 디펩티드 아세탈 (3.24 g)을 수득하였다.
Figure pct00056
단계 2: Ng-(2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-술포닐)-L-아르기닐-L-류시날
방법 B (실시예 8)에 따라, Fmoc 기를 단계 1의 생성물 (1.6 g)으로부터 제
Figure pct00057
단계 3: 9-메톡시카르보닐-2-시클로펜틸-노나노일-Ng-(2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-술포닐)-L-아르기닐-L-류시날 디에틸아세탈.
방법 C (실시예 9)에 따라, 9-메틸옥시카로닐-2-시클로펜틸-노난산 (0.56 g)을 DMF 5 ㎖ 중의 BOP (0.66 g, 1.5 밀리몰), HOBt (0.202 g, 1.5 밀리몰) 및 NMM (2.2 ㎖, 2밀리몰)을 사용하여 Ng-(2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-술포닐)-L-아르기닐-L-류시날 디에틸아세탈 (0.7g, 1.1밀리몰)과 커플링시켜 고체상의 생성물 (1.8
Figure pct00058
Figure pct00059
단계 4: 9-메톡시카르보닐-2-시클로펜틸-노나노일-Ng-(2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-술포닐)-L-아르기닐-L-류시날
방법 E (실시예 11)에 따라, 단계 1의 생성물 (0.2 g)을 화합물 20으로 전환시키고 HPLC에 의해 직접 정제하였다.1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 9.37
Figure pct00060
<실시예 21>
9-메톡시카르보닐-2-시클로펜틸-노나노일-Ng-(4-메톡시-2,3,6-트리메틸-벤젠-1-술포닐)-L-아르기닐-L-류시날
Figure pct00061
단계 1: 9-메톡시카르보닐-2-시클로펜틸-노나노일-Ng-(4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠-1-술포닐)-L-아르기닐-L-류시날 디에틸아세탈.
방법 C (실시예 9)에 따라, 9-메톡시카르보닐-2-시클로펜틸-노난산 (1.2 밀리몰, 방법 G의 단계 12)을 Ng-(4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠-I-술포닐)-L-아르기닐-L-류시날 디에틸아세탈 (1.0 밀리몰)과 커플링시켜 고체상의 펩티드를 수득하였다.
단계 2: 방법 E (실시예 11)에 따라, 단계 1로부터의 아세탈을 화합물 21로
Figure pct00062
<실시예 22>
9-메톡시카르보닐-2-시클로펜틸-노나노일-Ng-(2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-술포닐)-L-아르기닐-L-노르류시날
Figure pct00063
단계 1: 9-메톡시카르보닐-2-시클로펜틸-노나노일-Ng-(2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-술포닐)-L-아르기닐-L-류시날 디에틸아세탈
방법 C (실시예 9)에 따라, 9-메톡시카르보닐-2-시클로펜틸-노난산 (1 밀리몰)을 DMF 5 ㎖ 중의 BOP (1 밀리몰), HOBt (1 밀리몰) 및 NMM (2.5 밀리몰)을 사용하여 Ng-(2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-술포닐)-L-아르기닐-L-노르류시날 디에틸아세탈 (0.69 밀리몰, 실시예 30의 방법 B로부터 수득됨)와 커플링시켰다. 반응 생성물을 4.5시간 동안 교반시키고 펩티드를 단리시켰다 (0.37 g, 0.42 밀리몰).
단계 2: 9-메톡시카르보닐-2-시클로펜틸-노나노일-Ng-(2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-술포닐)-L-아르기닐-L-노르류시날.
방법 E (실시예 11)에 따라, 단계 1의 생성물 (0.37 g, 0.42 밀리몰)을 화합물 22 (0.33 g)로 전환시키고 HPLC로 정제시켰다.1H NMR(300 MHz, DMSO-d6) δ:
Figure pct00064
<실시예 23>
9-메톡시카르보닐-2-시클로펜틸-노나오일-Ng-니트로-L-아르기닐-L-류시날
Figure pct00065
단계 1: 9-메톡시카르보닐-2-시클로펜틸-노나노일-Ng-니트로-L-아르기닐-L-류시날 디에틸아세탈
방법 C (실시예 9)에 따라, 9-메톡시카르보닐-2-시클로펜틸-노난산 (0.06 g, 0.33 밀리몰)을 DMF 7 ㎖ 중의 BOP (0.146 g, 0.33 밀리몰), HOBt (0.0449 g, 0.33 밀리몰) 및 NMM (0.105 g, 0.95 밀리몰)을 사용하여 실시예 14의 단계 2의 생성물 (0.109 g, 0.28 밀리몰)과 커플링시켜 단계 1의 표제 화합물 (0.124g)을 수득하였다.
Figure pct00066
단계 2: 방법 E (실시예 11)에 따라, 단계 1의 펩티드 (0.124 g)을 화합물 23
Figure pct00067
<실시예 24>
2-시클로펜틸-10-N-프탈아미도-데카노일-Ng-니트로-L-아르기닐-L-류시날
Figure pct00068
단계 1: 2-시클로펜틸-10-N-프탈이미도-데카노일-Ng-니트로-L-아르기닐-L-류시날 디에틸아세탈
방법 C (실시예 9)에 따라, 방법 G (실시예 13)의 단계 6으로부터의 생성물(0.25 g, 0.65 밀리몰)을 DMF 5 ㎖ 중의 BOP (0.288 g, 0.65 밀리몰), HOBt (0.088 g, 0.65 밀리몰) 및 NMM (0.130 ㎖, 0.130 밀리몰)을 사용하여 실시예 14 단계 2의 생성물 (0.195 g, 0.5 밀리몰)에 커플링시켜 고체상의 표제 화합물 (0.557 g)을 수득
Figure pct00069
단계 2: 2-시클로펜틸-10-N-프탈이미도-데카노일-Ng-니트로-아르기닐-L-류시날.
방법 E (실시예 11)을 사용하여, 단계 1의 생성물 (0.45 g)을 화합물 24(0.32
Figure pct00070
<실시예 25>
10-(트리플루오로메탄술포닐)아미노-2-시클로펜틸-데카노일-Ng-니트로-L-아르기닐-L-류시날
Figure pct00071
단계 1: (트리플루오로메탄술포닐)10-아미노-2-시클로펜틸-데카노일-Ng-니트로-L-아르기닐-L-류시날 디에틸아세탈.
방법 C (실시예 9)에 따라, 10-(트리플루오로메탄술포닐)-아미노-2-시클로펜틸-데칸산 (0.199 g, 0.51 밀리몰)을 DMF 5 ㎖ 중의 BOP (0.22 g, 0.51 밀리몰), HOBt (0.069 g, 0.51 밀리몰) 및 NMM (0.052 ㎖, 0.47 밀리몰)을 사용하여 실시예 14 단계 2의 생성물 (0.175 g, 0.45 밀리몰)에 커플링시켰다. 아세탈을 고체 (0.42g)
Figure pct00072
단계 2: 10-(트리플루오로메탄술포닐)아미노-2-시클로펜틸-데카노일-Ng-니트로-L-아르기닐-L-류시날.
방법 E (실시예 11)에 따라, 단계 1의 생성물 (0.35 g)을 화합물 25 (0.17 g)
Figure pct00073
<실시예 26>
모노메틸아젤라일-Ng-니트로-L-아르기닐-L-류시날
Figure pct00074
단계 1: 모노메틸아젤라일-Ng-니트로-L-아르기닐-L-류시날 디에틸아세탈:
방법 C (실시예 9)에 따라, 표제 화합물을 DMF 12 ㎖ 중의 아젤라산 모노메틸 에스테르 (0.708 g, 3.5 밀리몰), BOP (1.55 g, 3.5 밀리몰), HOBt (0.47 g,3.5 밀리몰), NMM (0.38 ㎖, 3.5 밀리몰), Ng-니트로-L-아르기닐-L-류시날 디에틸아세탈(실시예 B, 방법 B에 따라 실시예 14의 단계 2로부터 수득됨) (1.306 g, 3.5 밀리몰)을 사용하여 제조하였다. 펩티드를 비결정형 고체로 수득하였다 (2.17g),1H
Figure pct00075
단계 2: 모노메틸아젤라일-Ng-니트로-L-아르기닐-L-류시날:
방법 E (실시예 11)을 사용하여, 단계 1의 펩티드 아세탈 (250 mg)을 화합물
Figure pct00076
<실시예 27>
모노메틸아젤라일-Ng-니트로-L-아르기닐-L-페닐알라니날
Figure pct00077
단계 1: 페닐알리니날 디에틸아세탈.
CBZ-Phe-OH (6.0 g, 2 밀리몰)을 류시날 디에틸아세탈에서 사용된 동일한 과정 (방법 F, 실시예 12)을 따라 페닐알라니날-디에틸 아세탈로 전환시켰다.
단계 2: Fmoc-Arg(NO2)-OH
THF 60 ㎖ 중의 플루오르에닐 메틸옥시카르보닐-N-히드록실숙신이미딜 에스테르 (32 밀리몰)의 용액을 H2O 70 ㎖ 중의 Ng-니트로-L-아르기닌 (35 밀리몰) 및 NaHCO3(70 밀리몰)의 교반 용액에 첨가하였다. 밀키성 용액을 1시간 후에 제거하고 용액을 고체 시트르산을 이용하여 pH 2-3으로 산성화시키고 EtOAc 300 ㎖로 추출하였다. 유기층을 물로 1회 세척하고 건조시키고 증발시켜 백색 고체상의 화합물 (26.8 밀리몰)을 수득하였다.
단계 3: Fmoc-Arg(NO2)-수지
DMF 40 ㎖ 중의 9-플루오르에틸메틸옥시카르보닐-Ng-니트로-L-아르기닌 (단계 2, 26.8 밀리몰), BOP (30 밀리몰), HOBt (30 밀리몰) 및 NMM (55 밀리몰)의 용액을 PAC 수지 (폴리스티렌-1% 디비닐벤젠에 부착된 α-메틸페나크릴 결합제, 치환 0.97 밀리몰/g, 펜실바니아주 킹 어브 프러시아 소재의 Bachem Bioscience 제품)10 g과 혼합시키고 4시간 동안 교반시켰다. 수지를 여과시키고, DMF, DCM 및 MeOH로 세척하고 건조하여 최종 생성물 Fmoc-Arg(NO2)-수지 (11.1g)을 수득하였다. 수지, Fmoc-Arg(NO2)-수지 (11.1g)을 피페리딘 (30%), pMF (35%) 및 톨루엔 (35%)을 포함하는 용액 100 ㎖로 처리하고 2.5 시간 동안 교반시켰다. Fmoc 제거된 수지를 여과시키고 DCM/DMF(50:50) 및 MeOH로 연속적으로 세척하여 생성물 (9.2 g)을 수득하였다.
단계 4: MeOAz: Arg (NO2)-수지
모노메틸 아젤레이트 (20 밀리몰)을 Arg(NO2)-수지 (9.2 g), BOP (20 밀리몰), HOBt (20 밀리몰) 및 NMM (pH 8로 조절하기 위함)의 교반된 슬러리에 부가하였다. 철야 교반후, 모노메틸아젤레이트 (10 밀리몰), BOP (10 밀리몰), HOBt (10 밀리몰), 및 NMM (20 밀리몰)의 혼합물을 부가하고 24 시간 동안 교반시켰다. 수지를 DMF, DCM 및 메탄올로 세척하여 수지 10.56 g을 수득하였다.
단계 5: 모노메틸아젤라일-Ng-니트로-L-아르기닌
단계 4의 생성물 (10.56 g)을 5 시간 동안 67% DCM (30%) TFA 및 (3%) 아니졸 100 ㎖ 용액에서 5 시간 동안 교반시켰다. 슬러리를 여과시키고 용매를 증발시키고 에테르로 저작시켜 펩티드를 수득하였다 (1.11g, 2.75 밀리몰).
단계 6: 모노메틸아젤라일-Ng-니트로-L-아르기닐-L-페닐알라니날 디에틸아세탈.
방법 C (실시예 9)에 따라, 메톡시아젤라오일-Ng-니트로-L-아르기닌 (1 밀리몰)을 BOP (1.3밀리몰), HOBt (1.3 밀리몰), 및 NMM (pH8로 조정하기 위함)을 사용하여 L-페닐알라니날 디에틸아세탈 (1.3 밀리몰)과 커플링시켜 표제 펩티드를 수득하였다 (0.82 밀리몰).
단계 7: 모노메틸아젤라일-Ng-니트로-L-아르기닐-L-페닐알라니날.
방법 E (실시예 11)에 따라, 단계 6의 생성물 (0.82 밀리몰)을 표제 화합물
Figure pct00078
<실시예 28>
모노메틸아젤라일-Ng-(2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-술포닐)-L-아르기닐-L-류시날
Figure pct00079
단계 1: 모노메틸아젤라일-Ng-(2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-술포닐)-L-아르기닐-L-류시날 디에틸아세탈.
방법 C (실시예 9)에 따라, 모노메틸아젤레이트 (1.42 g, 7.0 밀리몰)을 BOP, HOBt 및 NMM를 각각 7.0 밀리몰 사용하여, Ng-(2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-술포닐)-L-아르기닐-L-류시날 디에틸아세탈 (실시예 20, 단계 2로부터 수득됨) (3.06g, 5.0 밀리몰)과 커플링시켜 고체상의 화합물 (3.43 g)을 수득하였다.1H NMR (300
Figure pct00080
단계 2: 모노메틸아젤라일-Ng-(2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-술포닐)-L-아르기닐-L-류시날.
방법 E (실시예 11)를 사용하여, 단계 1의 생성물 (0.30 g)을 화합물 28 (0.22
Figure pct00081
<실시예 29>
모노메틸아젤라일-Ng-(2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-술포닐)-D-아르기닐-L-류시날
Figure pct00082
단계 1:9-플루오로메톡시카르보닐-Ng-(2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-술포닐)-D-아르기닐-L-류시날 디에틸아세탈.
방법 C (실시예 9)에 따라, 9-플루오로에닐메틸옥시카르보닐-Ng-(2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-술포닐)-D-아르기닌 (3밀리몰)을 DMF 5 ㎖ 중의 BOP (3 밀리몰), HOBt (3 밀리몰) 및 NMM (5 밀리몰)을 사용하여 류시날 디에틸아세탈 (2.5 밀리몰)과 커플링시켜서 고체상의 펩티드를 수득하였다 (1.72g, 2밀리몰).
단계 2: MeOAz-D-Arg(PMC)-류시날 디에틸아세탈.
방법 C (실시예 9)에 따라, 모노메틸아젤레이트 (1.0 밀리몰)을 DMF 5 ㎖ 중의 BOP (1 밀리몰), HOBt (1 밀리몰) 및 NMM (3 밀리몰)을 사용하여 방법 B (실시예 8)에 따라 단계 1의 표제 생성물로부터 수득되는 Ng-(2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-술포닐)-D-아르기닐-L-류시날 디에틸아세탈 (0.54 g, 0.88 밀리몰)과 커플링시켜서 생성물 (0.735g)을 수득하였다.
단계 3: 모노메틸아젤라일-Ng-(2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-술포닐)-D-아르기닐-L-류시날.
방법 E (실시예 11)을 사용하여, 단계 2의 생성물 (0.1 g)을 화합물 29로 전
Figure pct00083
<실시예 30>
모노메틸아젤라일-Ng-(2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-술포닐)-L-아르기닐-L-노르류시날
Figure pct00084
단계 1: Fmoc-Ng-(2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-술포닐)-L-아르기닐-L-노르류시날.
방법 C (실시예 9)에 따라, Fmoc-Arg(PMC)-OH (2밀리몰)을 DMF 6 ㎖ 중의 BOP (2 밀리몰), HOBt (2 밀리몰) 및 NMM (6 밀리몰)을 사용하여 노르류시날 디에틸아세탈 (2 밀리몰, 류아세탈의 제조시의 과정에 따라 CBZ-Nle-OH로부터 수득됨)과 커플링시켜서 펩티드를 수득하였다 (1.37g, 1.64밀리몰).
단계 2: MeOAz-Arg(PMC)-L-노르류시날 디에틸 아세탈.
방법 C (실시예 9)에 따라, 모노메틸 아젤레이트 (2 밀리몰)을 BOP (2 밀리몰), HOBt (2 밀리몰) 및 NMM (6 밀리몰)을 사용하고 철야교반시켜 Arg(PMC)-노르류시날 디에틸 아세탈 (1.39 밀리몰, 방법 B (실시예 8)에 따라 단계 1로부터 수득됨)와 결합시켰다. 다음날, 모노메틸아젤레이트, BOP, HOBt 및 NMM을 각각 1 밀리몰 첨가하고 4 시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 실시예 9의 방법 C와 같이 처리하여 펩티드 (0.37 g, 0.84 밀리몰)를 수득하였다.
단계 3: 방법 E (실시예 11)을 사용하여, 단계 2의 생성물 (0.94 g, 0.84 밀리몰)을 화합물 30 (0.58 g)으로 전환시켰다.1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: 9.54 (s,
Figure pct00085
Figure pct00086
<실시예 31>
모노메틸아젤라일-Ng-(p-톨루엔술포닐)-L-아르기닐-L-류시날
Figure pct00087
단계 1: Fmoc-Ng-(p-톨루엔술포닐)-L-아르기닐-L-류시날 디에틸아세탈.
방법 C (실시예 9)에 따라, Fmoc-N9-(p-톨루엔술포닐)-L-아르기닌 (5밀리몰)을 DMF 15 ㎖ 중의 HBUT (5.5 밀리몰), HOBt (5.5 밀리몰) 및 NMM (11 밀리몰)을 사용하여 류시날 디에틸아세탈 (5.5 밀리몰)과 커플링시켰다. 펩티드를 고체상으로 단리시켰다 (2.86g, 3.96밀리몰).
단계 2: 모노메틸아젤라일-Ng-(p-톨루엔술포닐)-L-아르기닐-L-류시날 디에틸아세탈.
방법 C (실시예 9)에 따라, 모노메틸 아젤레이트 (6 밀리몰)을 DMF 15 ㎖중의 1-벤조트리아졸-1-일-1,1,3,3-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스페이트 (HBTU) (6 밀리몰), HOBt (6 밀리몰) 및 NMM (12 밀리몰)을 사용하고 철야교반하여 Ng-(p-톨루엔술포닐)-L-아르기닐-L-류시날 디에틸아세탈 (2.7 g, 4.7 밀리몰, 방법 B (실시예 8)에 따라 단계 1로부터 수득됨)와 커플링시켰다. 반응 수득물을 모노메틸 아젤레이트 (3 밀리몰) 및 디페닐포스포릴 아지드 (3 밀리몰)를 첨가하여 상승시키고 4시간 동안 교반하여 고체상의 펩티드 (1.92 g)을 수득하였다.
단계 3: 모노메틸아젤라일-Ng-(p-톨루엔술포닐)-L-아르기닐-L-류시날
방법 E (실시예 11)에 따라, 단계 2의 생성물 (1.92 g, 2.8 밀리몰)을 화합물
Figure pct00088
<실시예 32>
모노메틸아젤라일-Ng-(4-메톡시-2,3,6-트리메틸-1-술포닐)-L-아르기닐-L-류시날 세미카르바존
Figure pct00089
문헌 [Basak, A 등, Int. J. Peptide Protein Res. 36 7-17 (1990)]을 참조한다. 90% EtOH 3 ㎖ 중의 MeOAz-Arg(MTR)-Leu-H (실시예 34) (67mg, 0.10 밀리몰), 세미카르바지드 히드로클로라이드 (11mg, 0.1 밀리몰) 및 소듐 아세테이트 (9mg, 0.11 밀리몰)의 혼합물을 70 ℃로 18 시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 농축시켜 표 6과 같이 HPLC에 의해 후속적으로 정제될 담황색의 고체 (화합물32)를 수
Figure pct00090
<실시예 33>
모노메틸아젤라일-Ng-(4-메톡시,2,3,6-트리메틸-1-술포닐)-L-아르기닐-L-류시날 티오세미카르바존
Figure pct00091
실시예 32와 동일한 단계를 따라, 화합물 33을 90 % EtOH 2 ㎖ 중의 실시예 34의 화합물 (51 mg, 0.07 밀리몰) 및 티오세미카르바지드 (7mg, 0.07 밀리몰)로부터 제조하였다.
<실시예 34>
모노메틸아젤라일-Ng-(4-메톡시,2,3,6-트리메틸벤젠-1-술포닐)-L-아르기닐-L-류시날
Figure pct00092
단계 1: 방법 C(실시예 9)에 따라, 9-플루오레닐-메틸옥시카르보닐-N9-(4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠-1-술포닐)-L-아르기닌-L-류시날 디에틸 아세탈올 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐-Ng-(4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠-1-술포닐)-L-아르기닌 및 L-류시날 디에틸 아세탈로부터 제조하였다.
단계 2: 모노메틸아젤라일-Ng-(4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠술포닐)-L-아르기닐-L-류시날.
방법 C (실시예 9)에 따라, 모노메틸 아젤레이트 (6 밀리몰)을 Ng-(4-메톡시-2,5,6-트리메틸벤젠-1-술포닐)-L-아르기닐-L-류시날 디에틸아세탈 (5 밀리몰, 방법 B (실시예 8)에 따라 단계 1로부터 수득됨)와 커플링시키고 펩티드를 비결정질 고체(3.3 g)로서 단리시켰다.
단계 3: 메톡시아젤라일-Ng-(4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠-1-술포닐)-L-아르기닐-L-류시날
방법 E (실시예 11)을 사용하여, 단계 2의 생성물 (0.5 g)을 화합물 34(0.36
Figure pct00093
<실시예 35>
메톡시아젤라일-Ng-(2,4,6-트리메틸벤젠-1-술포닐)-L-아르기닐-L-류시날
Figure pct00094
단계 1: Fmoc-N9-(2,4,6-트리메틸벤젠-1-술포닐)-L-아르기닌-L-류시날 디에틸 아세탈
디옥산 (10㎖) 중의 4M HCl 용액을 디옥산 10 ㎖ 중의 Boc-Arg(MTS)-OH (6 밀리몰)의 용액에 부가하였다. 30분 후, 용매를 제거하고 에테르를 부가하고, 침전물을 수집하고 건조시켰다 (3.21 g, 9 밀리몰). Arg-MTS-OH 히드로클로라이드를 실시예 31의 토실 유도체의 제조에 설명된 방법에 따라 Fmoc-Arg(MTS)-OH로 전환시켜 백색 고체의 표제 화합물 (2.09 g)을 수득하였다.
단계 2: Fmoc-Arg(MTS)-Leu-아세탈
방법 C (실시예 9)에 따라, Fmoc-Arg(MTS)-OH (3.361 밀리몰)을 DMF 15 ㎖ 중의 HBTU (4밀리몰), HOBt (4밀리몰) 및 NMM (10 밀리몰)을 사용하여 류시날 디에틸아세탈 (4밀리몰)과 커플링시켜 표제 펩티드 (1.05 g)을 수득하였다.
단계 3: MeOAz-Arg(MTS)-Leu-아세탈
방법 C에 따라, 모노메틸 아젤레이트 (1.2 밀리몰)을 DMF 3 ㎖ 중의 BOP (1.2 밀리몰), HOBt (1.2 밀리몰) 및 NMM (3.6 밀리몰)을 사용하여 Arg (MTS)-Leu-아세탈 (0.085 밀리몰, 실시예 8의 방법을 따라 단계 2로부터 수득됨)과 커플링시키고 철야 교반시켜 반-고체상의 표제 펩티드 (0.59 g)을 수득하였다.
단계 4: 메톡시아젤로일-Ng-(2,4,6-트리메틸벤젠-1-술포닐)-L-아르기닐-L-류시날
방법 E (실시예 11)에 따라, 단계 3의 생성물 (0.59 g)을 화합물 35 (0.54g)으
Figure pct00095
<실시예 36>
6-시아노-헥산-1-술포닐-Ng-(2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-술포닐)-L-아르기닐-L-류시날
Figure pct00096
단계 1: 6-시아노-헥산-1-술포닐-Ng-(2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-술포닐)-L-아르기닐-L-류시날 디에틸아세탈.
방법 G (실시예 13)의 단계 14로부터의 6-시아노-헥산-1-술포닐 클로라이드 (0.19 g, 0.89 밀리몰)을 DMF ㎖ 중의 실시예 20의 단계 2의 생성물 (0.55 g, 0.899 밀리몰)의 용액에 부가하고, 용액의 pH를 NMM을 사용하여 8로 조정하였다. 4시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 방법 A (실시예 7)에 기재된 바와 같이 처리하여 표제 화합물 (0.466 g)을 수득하였다.
단계 2: 6-시아노-헥산-1-술포닐-Ng-(2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-술포닐)-L-아르기닐-L-류시날
방법 E (실시예 11)에 따라, 단계 1의 생성물 (0.297 g)을 화합물 36 (0.22 g)으로 전환시키고 표 6에 기재된 바와 같이 HPLC로 정제시켰다.1H NMR (300
Figure pct00097
<실시예 37>
2-나프토일-Ng-니트로-L-아르기닐-L-류시날
Figure pct00098
단계 1: 2-나프토일-Ng-니트로-L-아르기닐-L-류시날 디에틸아세탈.
2-나프토일클로라이드 (0.104 g, 0.55 밀리몰)을 DMF 2㎖ 및 NMM (0.18 ㎖) 중의 실시예 14의 단계 2의 생성물의 용액에 부가하고, 표제 생성물을 처리하여 고체상의 표제 화합물 (0.22 g)을 수득하였다.1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: 8.92
Figure pct00099
단계 2: 2-나프토일-Ng-니트로-L-아르기닐-L-류시날.
방법 E (실시예 11)에 따라, 단계 1의 생성물 (0.1 g)을 화합물 37 (60 mg)으
Figure pct00100
<실시예 38>
CBZ-7-아미노헵타노일-Ng-니트로-L-아르기닐-L-류시날
Figure pct00101
단계 1: CBZ-7-아미노헵타노일-Ng-니트로-L-아르기닐-L-류시날 디에틸아세탈.
방법 C (실시예 9)에 따라, CBZ-7-아미노헵탄산 (0.7 g, 2.5 밀리몰)을 BOP (1.1 g, 2.5 밀리몰), HOBt (0.34 g, 2.5 밀리몰) 및 NMM (0.253 ㎖, 2.5 밀리몰)을 사용하여 실시예 14의 단계 2의 생성물 (0.78 g, 2.0 밀리몰)과 커플링시켜 반 고체상의 펩티드를 수득하였고, 이것을 다음 단계에서 직접 사용하였다.
단계 2: CBZ-7-아미노헵타노일-Ng-니트로-L-아르기닐-L-류시날.
방법 E (실시예 11)에 따라, 5 시간 동안 반응물을 교반 시킨 후 단계 1의 아세탈이 화합물 38 (0.8 g)으로 전환되었다.1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ:
Figure pct00102
실시예 39 내지 42는 표 7에 기록된 MCP 억제제의 합성을 개시한다.
[표 7]
Figure pct00103
<실시예 39>
10-시아노-2-시클로펜틸-데카노일-Ng-니트로-L-아르기닐-L-류신 클로로메틸케톤
Figure pct00104
본 실시예 및 하기 3개의 실시예에서, 본 발명의 억제제를 커플링 방법 II에 의해 제조하였다. 각 경우, 여기에 기재된 바와 같이 제조된 10-시아노-2-시클로펜틸-데카노일-Ng-니트로-L-아르기닌을 효소-활성 아미노산 유도체와 커플링시켜 억제제를 제조한다. 이들 억제제는 몇 경우 HPLC에 의해 분리될 수 있는 2 이상의 부분 입체 이성질체의 혼합물로서 수득되었다.
A) 10-시아노-2-시크로펜틸-데카노일-Ng-니트로-L-아르기닌 메틸 에스테르
방법 C (실시예 9)의 과정에 따라, DMF 26 ㎖ 중의 실시예 13 단계 5의 10-시아노-2-시클로펜틸-데칸산 (2.4 g, 11 밀리몰)을 Ng-니트로-L-아르기닌 메틸 에스테르 디클로라이드 (2.86 g, 11 밀리몰), BOP (6.6 g, 15 밀리몰), HOBt (1.62 g, 12 밀리몰) 및 NMM (3.6 ㎖, 33 밀리몰)과 교반시켜서 거품 고체상의 메틸 에스테
Figure pct00105
B) 10-시아노-2-시크로펜틸-데카노일-Ng-니트로-L-아르기닌
메탈올 30 ㎖ 중의 상기 파트 "A"의 메틸 에스테르 5.5 g의 용액을 수성 수산화나트륨 1.00 N 24 ㎖으로 처리하였다. 2 시간 후, 2% 수성 소듐 비카르보네이트 용액 100 ㎖를 부가하고, 수득된 용액을 에테르 100 ㎖로 추출시켰다. 수성층을 분리시키고 3% 수성 시트르산으로 산성화시키고 에틸 아세테이트 250 ㎖로 추출시켰다. 수득된 유기층을 분리시키고, 무수 MgSO4상에서 건조시키고 증발시켜 무색의 검을 수득하고, 이것을 석유 에테르로 저작시켜 4.4 g의 백색 미분말로 고화시
Figure pct00106
C) 10-시아노-2-시크로펜틸-데카노일-Ng-니트로-L-아르기닌-L-류신 클로로메틸 케톤.
상기 파트 "B"의 생성물 467 mg (1.0 밀리몰) 및 DMF 4.0 ㎖ 중의 류신 클로로메틸 케논 히드로클로라이드 270 mg (펜실바니아주 킹 오브 프러시아 소재의 Bachem Biosciences) BOP 440 mg (1.0 밀리몰) 및 HOBt 135 mg (1밀리몰)의 혼합물을 NMM 0.33 ㎖ (3밀리몰)로 처리하였다. 4 시간 후, 혼합물을 에틸 아세테이트 75 ㎖로 희석시키고, 2% 수성 NaHCO3, 물, 3% 수성 시트르산 및 최종적으로 물로 세척하였다. 유기층을 분리시키고 건조시키고 (MgSO4) 최종적으로 증발시켜 담황색의 점성 오일을 얻었다. 이 화합물을 용출시키기 위해 에틸 아세테이트를 사용하여 실리카 겔 60-H의 9 x 1/2 인치 컬럼을 통해 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 수득된 용액을 증발시켜 무색의 검을 수득하고 이것은 1:1 에틸 아세테이트/에테르에 정치시킬 때 고화되어 무색 고체상의 클로로메틸 케톤 198 mg을 수득하였다. HPLC는 제조적 RP-HPLC에 의해 분리된 2개의 부분입체 이성질체의 존재를 나타내었다. 수-아세토니트릴 용매 기울기 (40분 동안의 아세토 니트릴 30-80 %)에서 22.58 분 (부분 입체 이성질체 a) 및 23.7 분 (부분 입체 이성질체 b)에서의 피크를 단리시켰다.
Figure pct00107
<실시예 40>
10-시아노-2-시크로펜틸-데카노일-Ng-니트로-L-아르기닌-보로류신 피나콜 에스테르
Figure pct00108
Figure pct00109
DMF 5.0 ㎖ 중의 10-시아노-2-시클로펜틸-데카노일-Ng-니트로-L-아르기닌(상기 실시예 39 파트 "B") 467 mg (1.0 밀리몰) 및 쉔비의 미국특허 제 4,537,773의 방법에 의해 제조된 보로류신 피나콜 에스테르 히드로클로라이드 264 mg (1.0 밀리몰), BOP 440 mg (1.0 밀리몰) 및 HOBt 135 mg (1.0 밀리몰)의 용액을 NMM 0.33 ㎖ (3 밀리몰)로 처리하였다. 2 시간 후, 혼합물을 에틸 아세테이트 75 ㎖로 희석시키고, 2% 수성 NaHCO3, 및 물로 세척하고, 유기층을 분리시키고 건조시키고 (MgSO4) 증발시켜 담갈색의 분말 410 mg을 얻었다. 이 고체를 클로로포름으로 세척하여HPLC에서 단일 피크를 나타내는 회백색 고체상의 생성물 290 mg을 수득하
Figure pct00110
<실시예 41>
10-시아노-2-시크로펜틸-데카노일-Ng-니트로-L-아르기닌-L-류신 알파-케토에틸아미드
Figure pct00111
A) 10-시아노-2-시크로펜틸-데카노일-Ng-니트로-L-아르기닌-(1-에틸아미노카르보닐 1-히드록실-4-메틸)-2-펜틸아미드
DMF 5.0 ㎖ 중의 10-시아노-2-시클로펜틸-데카노일-Ng-니트로-L-아르기닌 467 mg (1.0 밀리몰) 및 3-아미노-2-히드록실-5-메틸-헥산산 N-에틸아미드 히드로클로라이드 (Harbeson 등의 [J. Med. Chem. 37, 2918-29 (1994)]에 실린 방법에 의해 제조됨)의 용액을 BOP 440 mg (1 밀리몰), HOBt 135 mg (1 밀리몰) 및 NMM 0.33 ㎖ (3 밀리몰)로 처리하였다. 2 시간 동안 교반시킨 후, 용액을 에틸 아세테이트 75 ㎖로 희석시키고, 2% 수성 NaHCO3, 물, 3% 수성 시트르산, 물로 세척하고, 건조시키고 (MgSO4) 증발시켜 회백색 고체상의 히드록실 화합물 540 mg을 얻었다.
Figure pct00112
B) 10-시아노-2-시크로펜틸-데카노일-Ng-니트로-L-아르기닌-L-류신 알파-케토에틸아미드
건식 디클로로메탄 6.0 ㎖ 중의 상기 파트 "A"의 히드록실 화합물 250 mg의 용액을 0℃로 냉각시키고 Dess-Martin 시약 225 mg (약 0.5 밀리몰)과 교반시켰다 (D.B.Dess 및 J.C.Martin. J. Org. Chem. 48, 4156-4158 (1983)).
반응물을 실온으로 승온시키고 2 시간 동안 교반시켰다. 흐린 현탁액을 50 ㎖ 에틸 아세테이트로 희석시키고 미세하게 소결된 유리 필터 상에서 여과시켰다. 여과물을 10% 수성 Na2S2O3및 포화 NaCl로 세척하였다. 이것을 건조시키고 (MgSO4) 증발시켜 백색 고체의 케토아미드 생성물 180 mg을 수득하였다. 이것을 수-아세토니트릴 기울기 시스템 (40 분 동안 40-70% 아세토니트릴)을 사용하여 제조용 RP-HPLC에 의해 정제하였다. 18.07 분 (부분 입체 이성질체 a) 및 19.54 분 (부분 입체 이성질체 b)에서의 피크를 수집하였다.
Figure pct00113
<실시예 42>
10-시아노-2-시클로펜틸-데카노일-Ng-니트로-L-아르기닌-L-페닐알라닌 플루오로메틸케톤
Figure pct00114
A) 1-니트로-2-페닐에탄의 합성
실온에서 클로로포름 (40㎖) 중의 트랜스-β-니트로 (5.25 g, 0.035 밀리몰) 및 실리카 겔 (10 g, 230-400 메쉬) 및 이소프로파놀 (75 ㎖)의 교반 혼합물에 45분동안 소듐 보로히드라이드 (5.50 g, 0.145 밀리몰)을 천천히 부가하였다. 반응 혼합물을 15 분 동안 더 교반시키고 이어서 조심스럽게 10% 염산 (20 ㎖)로 급냉시켰다. 분리된 고체를 여과시키고 클로로포름 (50 ㎖)으로 세척하였다. 결합된 여과액 및 세척액을 물 (1 x 20 ㎖), 염수 (1 x 20 ㎖)로 세척하고 무수 소듐 술페이트 상에서 건조시켰다. 감압하에서 용매를 증발시켜 조 물질을 얻고 플래시 크로마토그래피에 의해 정제시켜 무색 오일 상의 1-니트로-2-페닐에탄 (향기로운 향) 2.86 g을 수득하였다. Rf(헥산 중의 10% 에틸 아세테이트): 0.40;1H-NMR (300MHz, CDCl3) 7.40-7.20 (m, 5H), 4.60(t, 2H), 3.30 (t, 2H).
B) 1-플루오로-2-히드록실-3-니트로-4-페닐부탄의 합성
메틸렌 클로라이드 (11.60 ㎖, 0.0232 밀리몰) 중의 옥살릴 클로라이드 (2M)의 냉각 (-78℃) 용액에 디메틸 술폭사이드 (3.65 g, 3.32 ㎖, 0.0467 몰)를 천천히 부가하였다. 반응 혼합물을 15 분 동안 교반시켰다. 이어서, 메틸렌 클로라이드 (10 ㎖) 중의 2-플루오로에탄올 (1.16 g, 0.0181 몰)의 용액을 반응 플라스크에 천천히 도입시켰다. 15 분 동안 더 교반시킨 후, 반응 혼합물을 무수 메틸렌 클로라이드 (180 ㎖)으로 희석시키고 여기에 트리에틸아민 (9.20 g, 12.63 ㎖, 0.090 몰)을 부가하였다. 2 시간 동안 더 계속 교반시켰고,이 때에 온도가 실온으로 상승되었다. 이때에, 무수 메틸렌 클로라이드 (10 ㎖) 중의 1-니트로-2-페닐에탄 (2.74 g, 0.0181 몰)의 용액을 반응 혼합물에 부가하고 철야 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 물(1 x 30 ㎖), 4% 염산 (3 x 20 ㎖), 물 (1 x 20 ㎖), 포화 소듐 비카르보네이트 용액 (2 x 20 ㎖) 및 염수 (1 x 20 ㎖)로 세척시켰다. 무수 황산 나트륨 상에서 건조시키고 용매를 건조시켜 조물질을 얻고 이를 플래시 크로마토그래피 (실리카 겔, 25% 에틸 아세테이트 헥산)에 의해 정제하여 에리트로 및 테레오 이성질체의 생성물을 얻었다. 결합된 수율은 3.01 g이었다. 본 과정에 대한 일반적인 설명을 문헌 [Imperiali. B. 등, Tetrahedron Lett. 27 (2), 135 (1986)] 및 [Revesz. L. 등. Tetrahedron Lett. 35 (52), 9693 (1994)]에서 발견할 수 있다.
이성질체 a는 융점 71 - 73 ℃의 백색 고체였다; Rf(헥산 중의 30% 에틸 아
Figure pct00115
이성질체 b는 무색의 오일이었다; Rf(헥산 중의 30% 에틸 아세테이트) :
Figure pct00116
C) 3-아미노-1-플루오로-2-히드록실-4-페닐부탄의 합성
상기 이성질체 a (0.48 g, 2.25 밀리몰), 무수 에탄올 (20 ㎖) 및 라니-니켈 (Raney-Nikel) (촉매성)의 혼합물을 5 시간 동안 파르 (Parr) 장비에서 수소화 (60 psi)시켰다. 셀라이트 (Celite) 패드를 통해 여과시키고 용매를 증발시켜 아민 이성질체 a 410 mg을 수득하였다. 상기 이성질체 b (800 mg, 3.75 밀리몰)를 유사하게 처리하여 아민 이성질체 b 510 mg을 수득하였다.
아민 이성질체a는 융점 64-67 ℃의 백색 고체였다:1H-NMR (300MHz,
Figure pct00117
아민 이성질체b는 융점 67-70 ℃의 백색 고체였다.1H-NMR (300MHz,
Figure pct00118
D) 10-시아노-2-시클로펜틸-데카노일-Ng-니트로-L-아르기닐-(4-플루오로-3-히드록실-1-페닐)-2-부틸아미드
DMF 5.0 ㎖ 중의 10-시아노-2-시클로펜틸-데카노일-Ng-니트로-L-아르기닌 467 mg (1.0 밀리몰) 및 3-아미노-1-플루오로-2-히드록실-4-페닐-부탄 183 mg (1.0 밀리몰)의 용액을 BOP 440 mg (1.0 밀리몰), HOBt 135 mg (1.0 밀리몰) 및 NMM 0.33 ㎖ (3 밀리몰)로 처리하였다. 2 시간 동안 교반시킨 후, 용액을 에틸 아세테이트 75 ㎖로 희석시키고 2 % 수성 NaHCO3, 물, 3% 수성 시트르산, 물로 세척하고 건조시켜 (MgSO4) 증발시킨 후 회백색 고체의 히드록실 화합물 480 mg을 수
Figure pct00119
E) 10-시아노-2-시클로펜틸-1-데카노일-Ng-니트로-L-아르기닐-페닐알라닌 플루오로메틸케톤
무수 디클로로메탄 6.0 ㎖ 중의 상기 파트 "C"의 히드록실 화합물 250 mg의 용액을 0 ℃로 냉각시키고 데스-마틴 (Dess-Martin) 시약 225 mg (약 0.5 밀리몰)로 교반시켰다. 반응물을 실온으로 냉각시키고 2 시간 동안 교반시켰다. 흐린 현탁액을 50 ㎖ 에틸 아세테이트로 희석시키고 미세 소결 유리 필터를 통해 여과시켰다. 여과물을 10% 수성 Na2S2O3및 포화 NaCl로 세척하였다. 이것을 건조시키고 (MgSO4) 증발시켜 순수한 백색 고체 180 mg을 수득하였다. HPLC 정제후, 순수한 플로오로메틸 케톤 생성물 42 mg을 수득하였다.1H-NMR (300MHz, CDCl3) δ
Figure pct00120
본 명세서에서 참조된 각각의 간행 서류를 온전히 참고로 인용한다.
본 분야의 숙련자는 다수의 변화 및 변형이 본 발명의 바람직한 태양에 가해질 수 있고 본 발명의 정신에 벗어나지 않는한 이같이 변화 및 변형될 수 있음을 이해할 것이다. 즉, 첨부된 청구범위는 본 발명의 진정한 정신 및 영역에 포함되는한 모든 등가의 변형을 포함하는 것을 의미한다.
Figure pct00121
Figure pct00122
Figure pct00123
Figure pct00124
Figure pct00125
Figure pct00126

Claims (21)

  1. 하기 화학식의 화합물.
    Figure pct00127
    식 중,
    R1은 -C≡N, -C(=O)OR9, 프탈이미도, -NH-SO2R9, 및 -NH-J로 이루어진 군으로부터 선택된 것이고,
    R2은 H, 히드록실, 탄소수 1 내지 10의 알킬, 및 탄소수 3 내지 7의 시클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택된 것이며,
    R3은 -(CH2)m-NH-C(=N-R5)-NH2, -R6-NO2, -R6-J 및 -R6-CN으로 이루어진 군으로부터 선택된 것이고,
    R4은 -CH(CH2-R7)-Q이며,
    Q는 -CH-R8, -C(≡O)CH3, -C(=0)CH2Cl, -C(=O)CH2Br, -C(=O)CH2F, -C(=O)CHF2, -C(=O)CF3, -C(=O)C(=O)R7, -C(=O)C(=O)NH-R7, -C(=O)CO2-R7, -C(=O)CO2H,-B(OH)2,
    Figure pct00128
    (여기서, p 및 q는 각각 독립적으로 2 또는 3이고, W는 시클로알킬임)으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    R5은 -NO2, -CN, 및 -J로 이루어진 군으로부터 선택된 것이고,
    R6은 -(CH2)m-NH-C(=NH)-NH-이며,
    R7은 페닐, 및 탄소수 1 내지 8의 알킬로 이루어진 군으로부터 선택된 것이고, 여기서 알킬기는 하나 이상의 할로겐 원자, 아릴 또는 헤테로아릴기로 임의 치환되고,
    R8은 =O, =N-NHC(=O)-NH2, =N-OH, =N-OCH3, =N-O-CH2-C6H5, =NNH-C(=S)-NH2및 =N-NH-J로 이루어진 군으로부터 선택된 것이며,
    R9은 수소 및 탄소수 1 내지 6의 알킬로 이루어진 군으로부터 선택된 것이고, 여기서 알킬기는 하나 이상의 할로겐 원자, 아릴 또는 헤테로아릴기로 임의 치환되고,
    J는 보호기이며,
    n은 3 내지 10의 정수이고,
    m은 2 내지 5의 정수이다.
  2. 제1항에 있어서, R1가 -C≡N, -C(=O)OCH3, 프탈이미도 또는 -NH-SO2CF3으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 화합물.
  3. 제1항에 있어서, R2가 H 및 시클로펜틸로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 화합물.
  4. 제1항에 있어서, R3가 -(CH2)3-NH-C(=N-R5)-NH2인 화합물.
  5. 제4항에 있어서, R5가 -NO2, -CN, -PMC, -MTR, -MTS, 또는 Tos로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 화합물.
  6. 제1항에 있어서, R7가 -CH(CH3)2, -(CH2)2-CH3, 및 -C6H5로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 화합물.
  7. 제1항에 있어서, Q가 -CH-R8인 화합물.
  8. 제1항에 있어서, Q가 -C(=O)CH3, -C(=O)CH2Cl, -C(=O)CH2Br, -C(=O)CH2F, -C(=O)CHF2, -C(=O)CF3, -C(=O)C(=O)R7, -C(=O)C(=O)NH-R7, -C(=O)CO2-R7,-C(=O)CO2H,-B(OH)2,
    Figure pct00129
    로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 화합물.
  9. 제1항에 있어서, Q가 -CH-R8, -B(OH)2, -C(=O)C(=O)NH-R7,
    Figure pct00130
    로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 화합물.
  10. 제7항에 있어서, R8가 =O, =N-NHC(=O)-NH2, =N-OH, =N-OCH3, =N-O-CH2-C6H5, 및 =NNH-C(=S)-NH2로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 화합물.
  11. 제1항에 있어서, R1가 -C(=O)OCH3, 프탈이미도 또는 -NH-SO2CF3로 이루어진 군으로부터 선택된 것이고, R2가 시클로펜틸이며, R3가 -(CH2)3-NH-C(=N-NO2)-NH2이고, Q가 -CH-R8이며, R7가 -CH(CH3)2이고, R8가 =O인 화합물.
  12. 제1항에 있어서, R1가 -C≡N이고, R2가 시클로펜틸이며, R3가 -(CH2)3-NH-C(=N-NO2)-NH2및 -(CH2)3-NH-C(=N-J)-NH2로 이루어진 군으로부터 선택된 것이고, Q가 -CH-R8이며, R7이 -CH(CH3)2이며, R8가 =O인 화합물.
  13. 제1항에 있어서, R1가 -C≡N이고, R2가 시클로펜틸이며, R3가 -(CH2)3-NH-C(=N-NO2)-NH2및 -(CH2)3-NH-C(=N-J)-NH2로 이루어진 군으로부터 선택된 것이고, Q가 -B(OH)2, -C(=O)C(=O)NH-R7,
    Figure pct00131
    로 이루어진 군으로부터 선택된 것이며, R7가 -CH(CH3)2및 -CH2-CH3로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 화합물.
  14. 제1항에 있어서, R1가 -C≡N이고, R2가 시클로펜틸이며, R3가 -(CH2)3-NH-C(=N-NO2)-NH2및 -(CH2)3-NH-C(=N-J)-NH2로 이루어진 군으로부터 선택된 것이고, Q가 -CH-R8이며, R7가 -CH(CH3)2이고, R8가 =N-NHC(=O)-NH2, =N-OH, =N-OCH3, 및 =N-O-CH2-C6H5로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 화합물.
  15. 제1항의 화합물 및 제약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 다중 촉매성 프로테아제를 억제시키는 조성물.
  16. 제1항의 화합물 및 제약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 근육 질량의 손실을 감소시키는 조성물.
  17. 제1항의 화합물 및 제약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 근육 소모질병을 치료하는 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 질병이 근이영양증, 심장악액질, 기종, 당뇨병, 나병, 영양실조, 골연화증 또는 암악액질인 조성물.
  19. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 기재된 화합물인 다중 촉매성 프로테아제의 억제제 및 제약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 Cu/Zn 초과산화물 디스무타제-1 효소 분해를 감소시키는 조성물.
  20. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 기재된 화합물인 다중 촉매성 프로테아제의 억제제 및 제약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, Cu/Zn 초과산화물 디스무타제-1 효소 활성 감소가 특징인 질병의 치료를 위한 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 질병이 근위축성 측색경화증, 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅톤병, 졸증, 외상, 또는 허혈인 조성물.
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Families Citing this family (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6083903A (en) * 1994-10-28 2000-07-04 Leukosite, Inc. Boronic ester and acid compounds, synthesis and uses
US5614649A (en) * 1994-11-14 1997-03-25 Cephalon, Inc. Multicatalytic protease inhibitors
US6214800B1 (en) 1995-10-25 2001-04-10 Senju Pharmaceutical Co., Ltd. Angiogenesis inhibitor
ATE230389T1 (de) 1995-10-25 2003-01-15 Senju Pharma Co Angiogenese inhibitoren
US6043224A (en) * 1996-09-05 2000-03-28 The Massachusetts Institute Of Technology Compositions and methods for treatment of neurological disorders and neurodegenerative diseases
US6184248B1 (en) * 1996-09-05 2001-02-06 Robert K. K. Lee Compositions and methods for treatment of neurological disorders and neurodegenerative diseases
US5939581A (en) * 1997-08-20 1999-08-17 First Chemical Corporation Processes for preparing hydrocinnamic acid
US6083944A (en) * 1997-10-07 2000-07-04 Cephalon, Inc. Quinoline-containing α-ketoamide cysteine and serine protease inhibitors
US6096778A (en) 1997-10-07 2000-08-01 Cephalon, Inc. α-ketoamide multicatalytic protease inhibitors
US6150378A (en) 1997-10-07 2000-11-21 Cephalon, Inc. Peptidyl-containing α-ketoamide cysteine and serine protease inhibitors
GB9723407D0 (en) * 1997-11-05 1998-01-07 Ciba Geigy Ag Organic compounds
EP1037626A1 (en) * 1997-12-16 2000-09-27 Cephalon, Inc. Multicatalytic protease inhibitors for use as anti-tumor agents
EP2823812A1 (en) * 1998-02-02 2015-01-14 Trustees Of Tufts College Dipeptidylpeptidase IV inhibitors for use in the treatment of Type II diabetes
US6096711A (en) * 1998-02-25 2000-08-01 Sherman; Michael Hsp72 induction and applications
AU762373B2 (en) 1998-10-20 2003-06-26 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Method for monitoring proteasome inhibitor drug action
US20030054977A1 (en) * 1999-10-12 2003-03-20 Cell Therapeutics, Inc. Manufacture of polyglutamate-therapeutic agent conjugates
US6358928B1 (en) 1999-11-22 2002-03-19 Enzyme Systems Products Peptidyl sulfonyl imidazolides as selective inhibitors of serine proteases
GB0003111D0 (en) * 2000-02-10 2000-03-29 Novartis Ag Organic compounds
CA2435124A1 (en) * 2001-01-25 2002-08-01 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Formulation of boronic acid compounds
PT1399468E (pt) 2001-05-30 2006-05-31 Novartis Ag Derivados do acido 2-{[n-(2-amino-3-(heteroaril ou aril)propionil)-aminoacil]-amino}-alquilboronico
JP2005511636A (ja) 2001-11-26 2005-04-28 トラスティーズ オブ タフツ カレッジ 自己免疫疾患の治療方法及びそれに関する試薬
CA2468192A1 (en) 2001-11-26 2003-06-05 Trustees Of Tufts College Peptidomimetic inhibitors of post-proline cleaving enzymes
US7223745B2 (en) * 2003-08-14 2007-05-29 Cephalon, Inc. Proteasome inhibitors and methods of using the same
US7576206B2 (en) * 2003-08-14 2009-08-18 Cephalon, Inc. Proteasome inhibitors and methods of using the same
US7468383B2 (en) * 2005-02-11 2008-12-23 Cephalon, Inc. Proteasome inhibitors and methods of using the same
FR2914920B1 (fr) 2007-04-11 2011-09-09 Clariant Specialty Fine Chem F Procede de deacetalisation d'alpha-aminoacetals.
CN101674853B (zh) * 2007-05-04 2013-03-27 玛瑞纳生物技术有限公司 氨基酸脂质及其用途
FR2916441B1 (fr) 2007-05-22 2009-08-28 Clariant Specialty Fine Chem Procede de racemisation d'alpha-aminoacetals optiquement actifs.
US7442830B1 (en) 2007-08-06 2008-10-28 Millenium Pharmaceuticals, Inc. Proteasome inhibitors
FR2927900B1 (fr) 2008-02-27 2010-09-17 Clariant Specialty Fine Chem Procede de preparation d'alpha-aminoacetals optiquement actifs.
GEP20135847B (en) 2008-06-17 2013-06-10 Millennium Pharm Inc Boronate ester compounds and pharmaceutical compositions containing them
US20110143375A1 (en) * 2008-08-11 2011-06-16 Banyan Blomakers, Inc. Biomarker detection process and assay of neurological condition
AR075090A1 (es) 2008-09-29 2011-03-09 Millennium Pharm Inc Derivados de acido 1-amino-2-ciclobutiletilboronico inhibidores de proteosoma,utiles como agentes anticancerigenos, y composiciones farmaceuticas que los comprenden.
WO2011041584A2 (en) 2009-09-30 2011-04-07 President And Fellows Of Harvard College Methods for modulation of autophagy through the modulation of autophagy-enhancing gene products
WO2011087822A1 (en) 2009-12-22 2011-07-21 Cephalon, Inc. Proteasome inhibitors and processes for their preparation, purification and use
US8354548B2 (en) * 2010-02-19 2013-01-15 Bristol-Myers Squibb Company Glycine chroman-6-sulfonamides for use as inhibitors of diacylglycerol lipase
EA029521B1 (ru) 2010-03-31 2018-04-30 Милленниум Фармасьютикалз, Инк. Производные 1-амино-2-циклопропилэтилбороновой кислоты
SG10202003693RA (en) 2014-05-20 2020-05-28 Millennium Pharm Inc Boron-containing proteasome inhibitors for use after primary cancer therapy
WO2015195950A1 (en) * 2014-06-20 2015-12-23 Principia Biophamram Inc. Lmp7 inhibitors
CN110366558A (zh) 2016-10-28 2019-10-22 班扬生物标记公司 针对泛素c末端水解酶l1(uch-l1)和胶质纤维酸性蛋白(gfap)的抗体及相关方法

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5754157A (en) * 1980-09-19 1982-03-31 Nippon Kayaku Co Ltd L-argininal derivative and its preparation
US4518528A (en) * 1983-05-19 1985-05-21 Rasnick David W α Amino fluoro ketones
US4499082A (en) * 1983-12-05 1985-02-12 E. I. Du Pont De Nemours And Company α-Aminoboronic acid peptides
US4537773A (en) * 1983-12-05 1985-08-27 E. I. Du Pont De Nemours And Company α-Aminoboronic acid derivatives
US4636492A (en) * 1984-08-29 1987-01-13 E. I. Du Pont De Nemours And Company Inhibition of viral protease activity by peptide halomethyl ketones
US4652552A (en) * 1984-09-10 1987-03-24 E. I. Du Pont De Nemours And Company Tetrapeptide methyl ketone inhibitors of viral proteases
NZ222755A (en) * 1986-12-23 1989-11-28 Warner Lambert Co Renin inhibiting acyl peptide derivatives containing two to four amino acid residues, and pharmaceutical compositions
US5024994A (en) * 1986-12-23 1991-06-18 Warner-Lambert Company Renin inhibitors IV
US5169932A (en) * 1989-10-30 1992-12-08 The Salk Institute For Biological Studies Gnrh analogs
US5296468A (en) * 1989-10-30 1994-03-22 The Salk Institute For Biological Studies GnRH analogs
EP0732399A3 (en) * 1990-03-05 1997-03-12 Cephalon Inc Chymotrypsin-like proteases and their inhibitors
JPH04202170A (ja) * 1990-11-29 1992-07-22 Taisho Pharmaceut Co Ltd トリペプチド誘導体
US5340736A (en) * 1991-05-13 1994-08-23 The President & Fellows Of Harvard College ATP-dependent protease and use of inhibitors for same in the treatment of cachexia and muscle wasting
US5614649A (en) * 1994-11-14 1997-03-25 Cephalon, Inc. Multicatalytic protease inhibitors
US5550262A (en) * 1994-11-14 1996-08-27 Cephalon, Inc. Multicatalytic protease inhibitors

Also Published As

Publication number Publication date
AU710437B2 (en) 1999-09-23
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AU4110496A (en) 1996-06-06
EP0789578B1 (en) 2003-06-04

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