ES2200010T3 - Inhibidores de la proteasa multicatalitica. - Google Patents

Inhibidores de la proteasa multicatalitica.

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ES2200010T3
ES2200010T3 ES95939165T ES95939165T ES2200010T3 ES 2200010 T3 ES2200010 T3 ES 2200010T3 ES 95939165 T ES95939165 T ES 95939165T ES 95939165 T ES95939165 T ES 95939165T ES 2200010 T3 ES2200010 T3 ES 2200010T3
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mmol
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cyclopentyl
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James Diebold
Robert Siman
Sankar Chatterjee
James C. Kauer
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Cephalon LLC
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Abstract

SE MUESTRAN AQUI INHIBIDORES DE LA ENZIMA DE PROTEASA MULTICATALITICA REPRESENTADOS POR LA FORMULA GENERAL (I). SE MUESTRAN TAMBIEN LOS ELEMENTOS CONSTITUTIVOS GENERALES Y PREFERIDOS. TAMBIEN SE EXPONEN METODOLOGIAS PARA HACER Y USAR LOS COMPUESTOS MOSTRADOS.

Description

Inhibidores de la proteasa multicatalítica.
Campo de la invención
Esta invención se refiere a inhibidores de la proteasa multicatalítica (MCP), y a composiciones que incluyen tales inhibidores para el uso de los inhibidores de la MCP para, por ejemplo, retrasar la pérdida de masa muscular que conllevan varios estados fisiológicos.
Antecedentes de la invención
Las células eucariotas degradan y sustituyen constantemente las proteínas celulares. Esto permite a la célula eliminar rápida y selectivamente las proteínas y péptidos que tengan conformaciones anormales, para ejercer un control sobre las vías metabólicas mediante el ajuste de los niveles de péptidos reguladores, y proporcionar aminoácidos para energía cuando es necesario, como en el ayuno. Véase Goldberg, A.L. & St. John, A.C. Annu. Rev. Biochem. 45:747-803 (1976). Los mecanismos celulares de los mamíferos aseguran múltiples vías para la degradación de las proteínas. Resulta que algunas de estas vías requieren una aportación de energía en forma de adenosina trifosfato ("ATP"). Véase Goldberg, A.L. & St. John, supra.
La proteasa multicatalítica (MCP, a la que también se denomina típicamente "proteinasa multicatalítica", "proteasoma", "complejo de la proteinasa multicatalítica", "complejo multicatalítico de endopeptidasas", "proteasoma 20S" e "ingensina") es un complejo de proteinasa no lisosómico eucariota de alto peso molecular (700 kD) que desempeña un papel en por lo menos dos vías celulares para la degradación de proteínas en péptidos y aminoácidos. Véase Orlowski, M. Biochemistry 29(45) 10289-10297 (1990). El complejo tiene por lo menos tres tipos distintos de actividades hidrolíticas: (1) una actividad parecida a la tripsina en la que se rompen enlaces peptídicos del lado carboxílico de los aminoácidos básicos; (2) una actividad parecida a la quimotripsina en la que se rompen enlaces peptídicos del lado carboxílico de los aminoácidos hidrófobos; y (3) una actividad en la que se rompen los enlaces peptídicos del lado carboxílico del ácido glutámico. Véase Rivett, A.J. J. Biol. Chem. 264: 21 12215-12219 (1989) y Orlowski, supra.
Una vía de hidrólisis de las proteínas que implica a la MCP, implica también al polipéptido "ubiquitina". Hershko, A. & Crechanovh, A. Annu. Rev. Biochem. 51:335-364 (1982). Esta vía, que requiere a la MCP, ATP y ubiquitina, parece responsable de la degradación de proteínas muy anormales, ciertas proteínas normales de corta duración de vida y la masa de proteínas en los fibroblastos en crecimiento y los reticulocitos en maduración. Véase Driscoll, J. y Goldberg, A.L. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 86:787-791 (1989). Las proteínas que haya que degradar por esta vía se unen covalentemente a la ubiquitina a través de sus grupos amino de lisina de una manera que depende del ATP. A continuación, las proteínas conjugadas con la ubiquitina están degradadas en pequeños péptidos por un complejo de proteasa que depende de ATP por el proteasoma 26S, que contiene la MCP como núcleo proteolítico. Goldberg, A.L. & Rock, K.L. Nature 357:375-379 (1992).
También se ha descrito una segunda vía de degradación de las proteínas que requiere a la MCP y al ATP, pero que no requiere a la ubiquitina. Véase Driscoll, J. & Goldberg, A.L., supra. En este procedimiento, la MCP hidroliza a las proteínas de una manera que depende del ATP. Véase Goldberg, A.L. & Rock, K.L., supra. Este procedimiento se ha observado también en el músculo esquelético. Véase Driscoll & Goldberg, supra. Sin embargo, se ha sugerido que en el músculo, la MCP funciona de manera sinérgica con otra proteasa, la multipaína, dando lugar así a una degradación acelerada de las proteínas musculares. Véase Goldberg & Rock, supra.
Se ha informado de que la MCP funciona a través de un mecanismo proteolítico en el que el nucleófilo del sitio activo es el grupo hidroxilo del residuo N-terminal de treonina. Por lo tanto, la MCP es el primer ejemplo conocido de una treonina proteasa. Véanse Seemuller y col., Science (1995) 268 579-582; Goldberg, A.L, Science (1995) 268 522-523.
Las actividades relativas de las vías de síntesis y degradación proteicas celulares determinan si se acumulan o pierden proteínas. La pérdida anormal de masa proteica está asociada con diversos estados de enfermedad tales como la distrofia muscular, la caquexia cardíaca, el enfisema, la lepra, la malnutrición, la osteomalacia, la leucemia aguda infantil, y la caquexia cancerosa. También se observa pérdida de masa muscular en el envejecimiento, la hospitalización de larga duración, o el confinamiento a la cama de larga duración, y en el dolor crónico de la parte inferior de la espalda.
Con la denervación o la falta de uso, los músculos esqueléticos experimentan una rápida atrofia que lleva a una importante disminución de tamaño, de contenido en proteínas y fuerza contráctil. Esta atrofia es un componente importante de muchas enfermedades neuromusculares en los seres humanos. Se ha implicado al aumento de la degradación de proteínas como la causa principal de la enfermedad de desgaste muscular en la atrofia por denervación. Furono, K. y col. J. Biochem. 265/15:8550-8557 (1990). Mientras que el procedimiento o los procedimientos específicos implicados en la hidrólisis de las proteínas en los músculos no han sido identificados, existen indicios que relacionan la implicación de la MCP en la degradación acelerada de las proteínas musculares. Véanse, por ejemplo, Furono, supra, y la solicitud PCT publicada WO 92/20804 (fecha de publicación: 26 de noviembre de 1992).
Se ha implicado la actividad de la MCP en varios estados de enfermedad. Por ejemplo, se ha informado acerca de una expresión anormalmente alta de MCP en líneas celulares de leucemia humanas. Kumatori, A. y col. PNAS 87:7071 (1990). También se ha informado acerca de autoanticuerpos frente a la MCP en pacientes con lupus eritematoso sistémico ("SLE"). Arribas, J. y col. J. Exp. Med. 173:423-427 (1990).
Se necesitan agentes que sean capaces de inhibir el complejo de la MCP; tales agentes proporcionarían una valiosa herramienta tanto para aquellos que llevan a cabo investigaciones en el área de, por ejemplo, la actividad de la MCP, como para aquellos en los campos médicos para, por ejemplo, controlar los efectos perjudiciales de una actividad anormal o aberrante de la MCP. La presente invención está encaminada hacia estos fines importantes.
Resumen de la invención
La presente invención está encaminada hacia inhibidores de la proteasa multicatalítica ("MCP"). La presente invención puede también emplearse en procedimientos para la inhibición de la MCP asociada con ciertos trastornos, incluido el tratamiento de trastornos de desgaste muscular.
En un aspecto, se proporcionan compuestos que tienen la fórmula:
R_{1}---(CH_{2})_{n}---
\delm{C}{\delm{\para}{R _{2} }}
H---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}
---NH---
\delm{C}{\delm{\para}{R _{3} }}
H---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}
---NH---R_{4}
Los miembros constitutivos se definen infra, así como los miembros constitutivos preferidos.
Los compuestos de la invención son útiles en una diversidad de aplicaciones. Por ejemplo, los compuestos se pueden emplear en aplicaciones de investigación para perfeccionar y desarrollar más allá, modelos in vitro e in vivo para la comprensión de los mecanismos de la vía de la MCP y para la presentación de antígenos peptídicos a través de la vía del complejo principal de histocompatibilidad de clase I (MHC I).
En un marco clínico, se pueden usar las composiciones que comprenden los compuestos que se reivindican para inhibir la actividad de la MCP, disminuir la pérdida de la masa muscular, tratar los trastornos del desgaste muscular, reducir la degradación de la superóxido dismutasa y tratar los trastornos que se caracterizan por una reducción de la actividad de la superóxido dismutasa.
También se presentan metodologías para fabricar compuestos de la invención.
Éstas y otras características de los compuestos se expondrán de manera detallada según sigue la descripción.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 presenta el efecto de realizaciones de los inhibidores de la MCP que se describen sobre el procesamiento, por células M12.B6, de OVA introducida por electroporación.
La figura 2 presenta el efecto de la concentración de OVA sobre la inhibición del procesamiento por una realización de la invención.
La figura 3 presenta el efecto de la concentración de OVA sobre la inhibición del procesamiento por una realización de la invención.
La figura 4 presenta un mapa físico que define el gen de la SOD-1 y la localización de las mutaciones ELAF, los sitios de restricción y los cebadores de PCR.
La figura 5 presenta la cuantificación de los niveles de SOD-1 en células 293 a las que se realizó una transfección transitoria, tras la incubación con 5 \muM de realizaciones de los inhibidores de la MCP.
La figura 6 presenta la respuesta a la dosis de diversas isoformas de la SOD-1 a una realización de la invención.
La figura 7 muestra que el recambio de la SOD-1 es una función de la actividad de la MCP.
Descripción detallada de las realizaciones preferidas
Esta invención proporciona inhibidores de la MCP y composiciones que incluyen estos inhibidores. Los inhibidores de la MCP de la invención están representados, por ejemplo por la fórmula:
R_{1}---(CH_{2})_{n}---
\delm{C}{\delm{\para}{R _{2} }}
H---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}
---NH---
\delm{C}{\delm{\para}{R _{3} }}
H---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}
---NH---R_{4}
en la que:
R_{1} se selecciona del grupo formado por -C\equivN, -C(=O)OR_{9}, ftalimido, -NH-SO_{2}R_{9}, y -NH-J;
R_{2} se selecciona del grupo formado por H, hidroxilo, alquilo que tiene uno a diez carbonos, y cicloalquilo que tiene tres a siete carbonos;
R_{3} se selecciona del grupo formado por -(CH_{2})_{m}-NH-C(=N-R_{5})-NH_{2}, -R_{6}-NO_{2}, -R_{6}-J, y -R_{6}-CN;
R_{4} es -CH(CH_{2}-R_{7})-Q;
Q se selecciona del grupo formado por -CH-R_{8}, -C(=O)CH_{3}, -C(=O)CH_{2}Cl, -C(=O)CH_{2}Br, -C(=O)CH_{2}F, -C(=O)CHF_{2}, -C(=O)CF_{3}, -C(=O)C(=O)R_{7}, -C(=O)C(=O)NH-R_{7}, -C(=O)CO_{2}-R_{7}, -C(=O)CO_{2}H, -B(OH) _{2},
3
en las que p y q, independientemente, son 2 ó 3;
W es cicloalquilo;
R_{5} se selecciona del grupo formado por -NO_{2}, -CN, y -J;
R_{6} es -(CH_{2})_{m}-NH-C(=NH)-NH-;
R_{7} se selecciona del grupo formado por fenilo, y alquilo que tiene uno a ocho carbonos, encontrándose dicho grupo alquilo opcionalmente sustituido con uno o más átomos de halógeno, grupos arilo o heteroarilo;
R_{8} se selecciona del grupo formado por =O, =N-NHC(=O)-NH_{2}, =N-OH, =N-OCH_{3}, =N-O-CH_{2}-C_{6}H_{5}, =NNH-C(=S)-NH_{2} y =N-NH-J;
R_{9} se selecciona del grupo formado por hidrógeno y alquilo que tiene de uno a seis carbonos, encontrándose dicho grupo alquilo opcionalmente sustituido con uno o más átomos de halógeno, grupos arilo o heteroarilo;
J es un grupo protector;
n es un número entero de 3 a 10; y
m es un número entero de 2 a 5.
En algunas realizaciones preferidas, R_{1} es -C\equivN, -C(=O)OCH_{3}, ftalimido o -NH-SO_{2}CF_{3}, y en otras realizaciones preferidas, R_{2} es H o ciclopentilo.
R_{3} es preferiblemente -(CH_{2})_{3}-NH-C(=N-R_{5})-NH_{2}.
Q es preferiblemente -CH-R_{8}, -B(OH) _{2}, -C(=O)C(=O)NH-R_{7} o tiene la estructura:
4
R_{5} es preferiblemente -NO_{2}, -CN, -PMC, -MTR, -MTS, o Tos.
R_{7} es preferiblemente -CH(CH_{3})_{2}, -(CH_{2})_{2}-CH_{3}, -CH_{2}-CH_{3}, o -C_{6}H_{5}.
R_{8} es preferiblemente =O, =N-OH, =N-O-CH_{2}-C_{6}H_{5}, =NNH-C(=O)-NH_{2} o =NNH-C(=S)-NH_{2}.
En algunas realizaciones preferidas R_{1} es -C(=O)OCH_{3}, ftalimido o -NH-SO_{2}CF_{3}; R_{2} es ciclopentilo; R_{3} es -(CH_{2})_{3}-NH-C(=N-NO_{2})-NH_{2}; R_{7} es -CH(CH_{3})_{2}; y R_{8} es =O.
En otras realizaciones preferidas R_{1} es -C\equivN; R_{2} es ciclopentilo; R_{3} es -(CH_{2})_{3}-NH-C(=N-NO_{2})-NH_{2} o -(CH_{2})_{3}-NH-C(=N-J)-NH_{2}; R_{7} es -CH(CH_{3})_{2}; y R_{8} es =O.
En realizaciones preferidas adicionales R_{1} es C\equivN; R_{2} es ciclopentilo; R_{3} es -(CH_{2})_{3}-NH-C(=N-NO_{2})-NH_{2} o
-(CH_{2})_{3}-NH-C(=N-J)-NH_{2}; R_{7} es -CH(CH_{3})_{2}; Q es -CH-R_{8}; y R_{8} es =N-NHC(=O)-NH_{2}, =N-OH, =N-O-CH_{3}, o =N-O-CH_{2}-C_{6}H_{5}.
Tal y como se usa en la presente memoria, se supone que el término "alquilo" incluye los hidrocarburos de cadena lineal, ramificada y cíclica tales como los grupos etilo, isopropilo y ciclopentilo. Los grupos alquilo sustituidos son grupos alquilo para los cuales uno o más átomos de hidrógeno han sido sustituidos por halógeno, otros grupos hidrocarburos (por ejemplo, un grupo fenilo), un grupo heteroarilo, o un grupo en el que uno o más átomos de carbono están interrumpidos por átomos de oxígeno. Los grupos alquilo preferidos tienen 1 a aproximadamente 8 átomos de carbono. Tal y como se usa en la presente memoria, el término "halógeno" tiene su significado habitual e incluye flúor, cloro, bromo e yodo, siendo el flúor el halógeno preferido. El término "Arg" tal y como se usa en la presente memoria tiene su significado normal como abreviatura para el aminoácido "arginina".
En algunas realizaciones, los compuestos de la invención contienen grupos protectores. Tal y como se usa en la presente memoria, hay que darle una amplia interpretación a la expresión "grupos protectores". Los grupos protectores son conocidos per se como grupos funcionales químicos que se pueden añadir a y quitar de grupos funcionales selectivamente, tales como los grupos hidroxilo, los grupos amino y los grupos carboxilo. Estos grupos se encuentran presentes en un compuesto químico para volver tal grupo funcional inerte frente a las condiciones de reacción química a las que se expone el compuesto. Se puede emplear cualquiera de una diversidad de grupos protectores con la presente invención. Un grupo protector semejante es el grupo ftalimido. Otros grupos protectores preferidos según la invención tienen las siguientes fórmulas:
5
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Se pueden encontrar otros grupos protectores representativos adecuados para la práctica en la invención en Greene, T.W. y Wuts, P.G.M., "Protective Groups in Organic Synthesis" 2ª Ed., Wiley & Sons, 1991.
Como se indicó anteriormente, se ha relacionado la actividad de la MCP con una diversidad de trastornos y enfermedades. Puesto que compuestos como aquellos que se describen en la presente invención son útiles para inhibir la actividad de la MCP, y puesto que se puede aplicar la utilidad de tales compuestos tanto a marcos de investigación como terapéuticos, las metodologías para inhibir la actividad de la MCP mediante la puesta en contacto de la MCP con un compuesto de la invención incluye administrar el compuesto a un mamífero, incluido un ser humano, como medicamento o agente farmacéutico.
Tal y como se usa en la presente memoria, el término "puesta en contacto" significa provocar la colocación juntos directa o indirectamente de los restos que se quiere poner en contacto, de modo que los restos entren en contacto físico el uno con el otro. La puesta en contacto incluye por lo tanto actos físicos tales como colocar los restos juntos en un recipiente, o administrar los restos a un paciente. Así, por ejemplo, la administración de un compuesto de la invención a un paciente humano que de muestras de una enfermedad o un trastorno asociado con actividades anormales y/o aberrantes de la MCP que están asociadas con tal enfermedad o trastorno, cae dentro del alcance de la definición de "puesta en contacto".
Según un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona una composición para inhibir la proteasa multicatalítica que comprende un compuesto de la presente invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En las realizaciones preferidas, se administran composiciones farmacéuticas según la presente invención a pacientes que padecen un trastorno, es decir, un estado físico anormal, una enfermedad o un estado fisiopatológico asociado con actividades anormales y/o aberrantes de la MCP. Los trastornos para los cuales se administran las composiciones de la invención son preferiblemente aquellos que producen directa o indirectamente un desgaste (es decir, una pérdida) de masa muscular, es decir, un trastorno de desgaste muscular. Éstos incluyen las distrofias musculares, la caquexia cardíaca, los enfisemas, la lepra, la malnutrición, la osteomalacia, la leucemia infantil aguda, la caquexia por SIDA y la caquexia cancerosa.
En el contexto de la invención, "administración" significa introducción de la composición farmacéutica dentro de un paciente. Los procedimientos de administración preferidos incluyen la administración por vía intravenosa, subcutánea e intramuscular. Preferiblemente, el compuesto se administrará como una composición farmacéutica que comprende el compuesto en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como una solución salina fisiológica. Se pueden encontrar otros vehículos adecuados en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., Easton, PA, 1980).
Las concentraciones de los compuestos que se describen en la presente invención en una composición farmacéutica variarán según varios factores, incluidas la posología del fármaco que se pretende administrar, las características químicas (por ejemplo, la hidrofobicidad) de los compuestos que se emplean, y la vía de administración. En términos generales, los compuestos de esta invención se pueden proporcionar en una solución tampón fisiológica acuosa que contiene aproximadamente 0,1 a 10% p/v de compuesto para la administración por vía parenteral. Los intervalos de dosis típicas son desde aproximadamente 1 \mu/kg a aproximadamente 1 g/kg de peso corporal por día; un intervalo de dosis preferida es desde aproximadamente 0,01 mg/kg a 100 mg/kg de peso corporal por día. Es probable que la posología preferida del fármaco que se pretende administrar dependa de variables tales como el tipo y el grado de progresión de la enfermedad o del trastorno, el estado de salud global del paciente concreto, la eficacia biológica relativa del compuesto que se escogió, y la formulación del excipiente del compuesto, y su vía de administración. Tal y como se usa en la presente memoria, el término "paciente" indica cualquier tipo de vertebrado. Preferiblemente, el paciente es un ser humano.
Las distrofias musculares son enfermedades genéticas que se caracterizan por una debilidad y degeneración progresivas de las fibras musculares sin indicios de degeneración nerviosa. En la distrofia muscular de Duchenne (DMD), los pacientes exhiben una media de reducción de la masa muscular del 67%, y en la distrofia miotónica, se ha mostrado que la síntesis de la fracción de proteínas musculares se encuentra reducida en una media del 28%, sin disminución correspondiente alguna en la síntesis de proteínas no musculares (posiblemente debido a un deterioro de la respuesta del órgano final a las hormonas o sustratos anabólicos). Se ha demostrado degradación acelerada de proteínas en los músculos de pacientes con DMD.
La insuficiencia cardíaca congestiva (CHF) grave se caracteriza por una "caquexia cardíaca", es decir, un desgaste de proteínas musculares tanto de los músculos cardíaco y esqueléticos, con una reducción media del peso corporal del 19%. La caquexia cardíaca está provocada por un aumento de la tasa de degradación de las proteínas de las miofibrillas.
El enfisema es una enfermedad obstructiva crónica del pulmón, que se caracteriza por un aumento del tamaño de los espacios de aire distales con respecto a los bronquiolos terminales no respiratorios, que se acompaña de cambios destructores de las paredes alveolares. Las manifestaciones clínicas del funcionamiento reducido del pulmón incluyen tos, respiración ruidosa, infecciones respiratorias recurrentes, edema, y deterioro funcional y duración de vida reducida. La liberación de tirosina está aumentada en 47% en los pacientes enfisematosos. Asimismo, el flujo de leucina en el cuerpo entero se mantiene normal, la oxidación de leucina en el cuerpo entero aumenta, y la síntesis de proteínas en el cuerpo entero disminuye. La consecuencia es una disminución de la síntesis de proteínas musculares, acompañada de una disminución de recambio proteico en el cuerpo entero y de la masa muscular esquelética. Esta disminución se hace cada vez más patente con la progresión de la enfermedad y el deterioro a largo plazo.
En la diabetes mellitus, se produce un desgaste generalizado de los pequeños músculos de las manos que se debe a una denervación parcial crónica (neuropatía). Esto es muy claro y empeora con la progresión a largo plazo de la enfermedad y su gravedad.
La lepra está asociada con un desgaste muscular que se produce entre los metacarpianos del pulgar y del dedo índice. La malnutrición grave se caracteriza por, entre otros, un desgaste muscular grave.
La osteomalacia es un trastorno nutricional provocado por una deficiencia en vitamina D y calcio. Se la denomina "raquitismo" en los niños, y "osteomalacia" en los adultos. Se caracteriza por un ablandamiento de los huesos (debido a un deterioro de la mineralización con un exceso de acumulación de osteoide), dolor, blandura, desgaste y debilidad muscular, anorexia, y pérdida global de peso. Puede ser la consecuencia de una malnutrición, embarazos y lactaciones repetidos (que agotan o merman las reservas de vitamina D y calcio), y resistencia a la vitamina D.
En la leucemia aguda infantil, se produce una malnutrición de energía proteica que da lugar a un desgaste de los músculos esqueléticos. Unos estudios han mostrado que algunos niños exhiben el desgaste muscular incluso antes del diagnóstico de la leucemia, con una disminución media de la masa muscular del 27%. También se produce un aumento simultáneo del tejido adiposo en un 33%-37%, que tiene por consecuencia que no hay cambio neto del peso corporal relativo y de la circunferencia de las extremidades.
La caquexia cancerosa es un síndrome complejo que se produce con una incidencia variable en pacientes con tumores sólidos y enfermedades hematológicas malignas. Clínicamente, la caquexia cancerosa se manifiesta como una pérdida de peso con una merma masiva tanto del tejido adiposo como de la masa muscular magra, y es una causa de muerte como consecuencia del cáncer. Los pacientes con caquexia cancerosa tienen duraciones de supervivencia más cortos, y una respuesta disminuida a la quimioterapia. Además de los trastornos que producen desgaste muscular, parece que existen otras circunstancias y estados que están relacionadas de algún modo con una disminución de la masa muscular. Tales achaques incluyen el desgaste muscular debido a los dolores de espalda crónicos, la edad avanzada, la hospitalización de larga duración debida a enfermedades o lesiones, el alcoholismo y la terapia con corticosteroides.
Unos estudios han mostrado que en los casos graves de dolores de la parte inferior de la espalda, se produce desgaste muscular en la región paraespinal. La disminución del desgaste muscular en la región paraespinal alivia el dolor y mejora el funcionamiento.
También se cree que la debilidad general en la edad avanzada se debe al desgaste muscular. Según envejece el cuerpo, una proporción cada vez mayor de músculo esquelético se sustituye por tejido fibroso. La consecuencia es una disminución importante de la potencia muscular, pero solo una disminución marginal de la masa exenta de grasa.
Unos estudios han mostrado que en pacientes que padecen lesiones o enfermedades crónicas, y que se hospitalizan por largos periodos de tiempo, se produce desgaste muscular unilateral de larga duración, con una disminución media de la masa muscular en un 31%. Asimismo, unos estudios han mostrado que esto se puede corregir con fisioterapia intensiva. Sin embargo, puede ser mucho más eficaz para muchos pacientes efectuar la mejoría con terapia farmacológica.
En los alcohólicos, se produce un desgaste del músculo tibial anterior. Este desgaste muscular proximal está provocado por un daño neurogénico, a saber, un deterioro de la actividad de las enzimas glicolíticas y de la fosforilasa. El daño se hace patente y empeora cuanto más larga sea la duración del abuso de alcohol. Los pacientes que se tratan con corticosteroides experimentan una pérdida de masa muscular.
Se ha mostrado que la MCP activa el mediador intracelular de la inflamación denominado NF_{kappa}B. Véase Baeuerle, P.A. y Henkel, T. (1994) Annu. Rev. Immunol. 12, 141-179. Por lo tanto, los inhibidores de la MCP tienen uso en potencia en el tratamiento de enfermedades autoinmunes e inflamatorias.
Los compuestos de la invención pueden usarse para mitigar la pérdida de masa muscular que se produce como consecuencia de los estados anteriores, así como de otros. Además, los inhibidores de la MCP de la invención son útiles en aplicaciones veterinarias y de la cría de animales para hacer frente a la pérdida de peso en los animales, o para fomentar el crecimiento.
La MCP ha sido implicada en la presentación de antígenos peptídicos a través de la vía del complejo principal de histocompatibilidad de clase I (MHC I). Véase Goldberg y Rock, supra; véase también Rock y col., Cell, 78: 761-771 (1994) en lo sucesivo "Rock y col.". Por lo tanto, los inhibidores de la MCP tienen utilidad como reactivos para investigación en estudios en los que se desea una inhibición de la vía del MHC I así como en el alivio de enfermedades y trastornos que están asociados con un procesamiento anormal y/o aberrante de antígenos por el MHC I. Debido a que el origen exacto de la mayoría de los péptidos que se presentan en moléculas del MHC I queda por esclarecer y debido a que se han acumulado recientemente indicios de que la MCP pueda tener un papel en la presentación por el MHC I (véase Rock y col. supra), los reactivos tales como los inhibidores de la MCP descritos que bloquean el procesamiento proteolítico de antígenos para la presentación por el MHC I serían útiles para resolver la importancia de esta vía.
Sorprendentemente, se encontró también que los inhibidores de la MCP de la invención son también útiles para aumentar la actividad de la enzima Cu/Zn superóxido dismutasa-1 ("SOD-1"). Por consiguiente, estos compuestos son útiles tanto en marcos investigadores para la investigación de sistemas deficitarios en SOD-1 como en el tratamiento de trastornos neurodegenerativos u otros trastornos que se caracterizan por una reducción de la actividad de la enzima SOD-1 (es decir, en los que tal reducción ha sido implicada en la patogénesis del trastorno). Tales estados incluyen enfermedades que implican estrés oxidativo tales como la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Huntington, la apoplejía, el trauma, y la isquemia.
Según un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona una composición para la reducción de la degradación de la enzima Cu/Zn superóxido dismutasa-1 que comprende un inhibidor de la proteasa multicatalítica en la que el inhibidor es un compuesto de la presente invención, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Según un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona una composición para el tratamiento de un trastorno caracterizado por una reducción de la actividad de la enzima Cu/Zn superóxido dismutasa-1 que comprende un inhibidor de la proteasa multicatalítica en la que el inhibidor es un compuesto de la presente invención, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Según un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona el uso de un compuesto que comprende un inhibidor de la proteasa multicatalítica en el que el inhibidor es un compuesto de la presente invención en la fabricación de un medicamento para reducir la degradación de la enzima Cu/Zn superóxido dismutasa-1 en un mamífero en el que dicha degradación está asociada con una enfermedad oun trastorno provocado por dicha degradación.
Según un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona el uso de un compuesto que comprende un inhibidor de la proteasa multicatalítica en el que el inhibidor es un compuesto de la presente invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de trastornos que se caracterizan por una reducción de la actividad de la enzima Cu/Zn superóxido dismutasa-1.
La SOD-1 es una metaloenzima homodimérica que cataliza la dismutación del anión superóxido tóxico O_{2}- en O_{2} y H_{2}O_{2}. La SOD-1 es una enzima limpiadora de radicales libres y por lo tanto hace las veces de primera línea de defensa en la destoxificación de los radicales superóxido, que son subproductos normales del metabolismo aerobio. La SOD-1 existe principalmente en los eucariotas y se encuentra en el citoplasma de prácticamente todos los tipos celulares. La SOD-1 es una enzima esencial en la respuesta fisiológica a la toxicidad del oxígeno y se ha investigado activamente como agente terapéutico para los estados patológicos relacionados con el estrés oxidativo. Véanse Bannister y col., CRC Crit. Rev. Biochem. 22: 111-180 (1987); Halliwell y col., Methods in Enzymol., 186: 1-75 (1990); Greenwald, Free Rad. Biol. Med. 8: 201-209 (1990).
Las características que han impedido el uso de la SOD-1 como agente terapéutico son su difícil acceso intracelular cuando se administra de forma exógena, y su media vida extremadamente corta en el suero. Por lo tanto, los compuestos que aumentan la actividad de la SOD-1 intracelular proporcionarían un progreso importante en la terapia con SOD-1.
La ELA es un trastorno paralítico progresivo provocado por la degeneración de grandes neuronas motoras de la médula espinal y del cerebro. Aproximadamente el 5-10% de los casos de ELA son familiares (ELAF) y se heredan como un carácter dominante autosómico. Recientemente, se han identificado dieciséis mutaciones sin sentido distintas en un subconjunto de familias con ELAF y se producen dentro del gen que codifica la SOD-1. Véanse Rosen, D.R., y col., Science 261: 1047-1051 (1993); Deng, H.-X., y col., Nature 362: 59-62 (1993). Estas mutaciones llevan a una disminución de la actividad de la SOD-1 en los glóbulos rojos y en el tejido cerebral, y se ha mostrado que desestabilizan la proteína SOD-1 lo cual tiene como consecuencia un aumento del recambio de la enzima. Véanse Bowling, A.C., y col., J. Neurochem. 61: 2322-2325 (1993); Borchelt, D.R., y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 8292-8296 (1994). Además, se ha descrito un modelo de ELA en ratón transgénico, basado en la implicación de la relación entre la SOD-1 y la ELA. Brown, R.H. 331/16 NEJM 1901 (1994).
Los autores han descubierto que sus inhibidores de la MCP son potentes efectores positivos de la SOD-1. Un inhibidor preferido de la MCP, denominado "compuesto 14" en la presente invención, reduce específicamente la degradación de la SOD-1 de tipo silvestre y mutante de una manera que depende de la dosis (las designaciones de los números de compuesto se basan sobre el número del ejemplo que describe la síntesis del compuesto, por ejemplo, la síntesis del compuesto 14 se expone en el ejemplo 14, infra). Tal y como se usa en la presente, la reducción de la degradación de la SOD-1 significa retrasar la tasa a la que la proteína SOD-1 se cataboliza.
La invención se ilustra adicionalmente mediante los ejemplos siguientes. Estos ejemplos tienen el propósito de aclarar adicionalmente la invención, y no tienen el propósito de restringir el alcance de las reivindicaciones que se adjuntan.
Ejemplo 1 Aislamiento de la proteasa multicatalítica de tejidos humanos
Se usaron muestras de hígado y cerebro humano que se obtuvieron post-mortem para el aislamiento y la purificación parcial de la MCP por cromatografía de intercambio iónico, precipitación con sulfato de amonio y cromatografía de permeación sobre gel (por ejemplo, Driscoll y Goldberg, Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 787-791 (1989); Yamamoto y col., Biochim. Biophys. Acta 882, 297-304 (1986). Para cada material de partida, se homogeneizó el tejido en 10 volúmenes de Tris-HCl 20 mM (pH 7,5) que contenía glicerol al 20%. Después de una centrifugación a 40.000 x g durante 30 minutos, se pudo detectar actividad proteolítica del componente semejante a la quimotripsina de la MCP en el líquido sobrenadante (véase abajo). El líquido sobrenadante se fraccionó en una columna de DEAE-Sepharose de flujo rápido equilibrada en tampón de homogeneización. Para cada litro de líquido sobrenadante se usaron 250 ml de resina. Tras la carga de la muestra, se lavó la columna con \sim10 volúmenes de tampón de homogeneización, y se produjo la elución de las proteínas con un gradiente lineal de NaCl desde 0 a 400 mM (2 l para 250 ml de resina). Se comprobaron las fracciones por su actividad MCP, y las fracciones activas se mezclaron y se sometieron a precipitación con (NH_{4})_{2}SO_{4} a 80% de saturación. Se recogieron las proteínas precipitadas por centrifugación, se volvieron a poner en suspensión en tampón de homogeneización, y se cargaron en una columna de Sephacryl S300HR (volumen de resina 500 ml) que se había calibrado mediante el uso de sueroalbúmina bovina (68 kDa). Se produjo la elución de un único pico de actividad MCP con un peso molecular de \sim650 kDa. Esta preparación estaba exenta de otras actividades proteolíticas perceptibles y conservó su actividad MCP al almacenarla a 4ºC durante >6 meses. Esta preparación se usó para la mayoría de los experimentos. Un fraccionamiento posterior de la preparación en una columna de hidroxiapatita-Ultrogel (Yamamoto y col., supra) produjo una enzima más altamente purificada, que según electroforesis desnaturalizante en gel de poliacrilamida con SDS constaba de las >10 subunidades que se esperaban cuya M_{r} se extendía desde 20 a 35 kDa.
Ejemplo 2 Ensayo para las actividades semejante a la quimotripsina y semejante a la tripsina de la MCP
El procedimiento para el aislamiento de la MCP que se describió arriba generó un complejo enzimático cuyas actividades proteolíticas eran latentes, pero que se podían activar mediante la adición de bajas concentraciones (0,02 - 0,05%) de SDS (Yamamoto y col., supra). La actividad semejante a la quimotripsina se ensayó según el procedimiento siguiente: en placas de microvaloración de 96 pocillos, se diluyó de 4 a 10 veces la MCP humana en tampón de homogeneización que contenía SDS al 0,04%. Se añadió un sustrato colorimétrico MeOSuc-EVKM-para-nitroanilida (metoxisuccinil-Glu-Val-Lys-Met-pNa), que se compró a Bachem Bioscience Inc., King of Prussia, Pensilvania a una concentración final de 100 \mu;M a partir de una solución madre de 10 mM en dimetilsulfóxido. Los volúmenes de reacción fueron de 200 \mul por pocillo. Tras una incubación durante distintos periodos de tiempo a 37ºC, se determinó la concentración de la pNa libre en un lector de placas Biotech EL-340, por lectura de la absorción a 490 nm. Se determinó la actividad proteásica en condiciones en las que la hidrólisis del sustrato aumentaba linealmente con el tiempo y la variación de absorción era proporcional a la concentración de pNa libre. Si no, se usaba un sustrato generador de fluorescencia, la metoxisuccinil-Phe-Leu-Phe-amidometilcoumarina (Enzyme Systems Products, Dublin, CA), y se seguía la variación de fluorescencia a una excitación de 390 nm, y una emisión a 460 nm.
Se ensayó la actividad semejante a la tripsina de la MCP humana como se describió arriba con las modificaciones siguientes: las reacciones se llevaron a cabo en tampón Tris-glicerol (pH 9,5) al que se añadió 2-mercaptoetanol 1 mM, y el sustrato fue un sustrato generador de fluorescencia, el benciloxicarbonil-Phe-Arg-AMC (100 \muM).
Tras una incubación durante distintos periodos de tiempo a 37ºC, se determinó la concentración de AMC libre con un espectrofluorímetro Fluoroskan II con un filtro de excitación de 390 nm y un filtro de emisión de 460 nm. Se determinó la actividad proteásica en condiciones en las que la hidrólisis del sustrato aumentaba linealmente con el tiempo y la variación de fluorescencia era proporcional a la concentración de AMC libre.
Ejemplo 3 Determinación de los valores de CI_{50} para los inhibidores de la MCP
Por regla general, los valores de CI_{50} se definen como la concentración de un compuesto (en este caso, el inhibidor de la MCP que se describe) necesaria para producir una inhibición del 50% de la actividad de la enzima. Los valores de CI_{50} son indicadores útiles de la actividad de un compuesto para el uso al que se destina. Preferiblemente, los inhibidores de la invención tienen valores de CI_{50} inferiores a aproximadamente 10 micromolar.
La inhibición de la actividad semejante a la quimotripsina o semejante a la tripsina de la MCP se determinó mediante la incubación de la enzima con distintas concentraciones de supuestos inhibidores durante 15 minutos a 37ºC antes de la adición del sustrato. Se evaluó cada condición experimental por triplicado, y se realizaron experimentos replicados para los inhibidores que se describen en la presente invención.
Ejemplo 4
Demostración de la inhibición de la degradación muscular celular: inhibición de la atrofia por aligeramiento en ratas juveniles
Se determinó el efecto de varios inhibidores sobre la atrofia por aligeramiento del músculo sóleo en ratas juveniles. Véase Tischler, M.E. (1990) Metabolism 39/7: 756-763 (en lo sucesivo "Tischler-1990") para un análisis general del procedimiento. Se sujetaron ratas hembras Sprague-Dawley juveniles por el rabo (80-90 g), se suspendieron por un miembro posterior como en Jaspers, S.R. y Tischler, M.E., (1984) J. Appl. Physiol. 57: 1472-1479. Los miembros posteriores de los animales se elevaron por encima del suelo de la jaula, siendo cada animal alojado individualmente. Los animales pudieron acceder libremente a los alimentos y al agua, y se pesaron en el momento de la suspensión y en el momento de la terminación. Durante el periodo de suspensión, se comprobaron los animales diariamente para asegurar que los dedos de sus patas posteriores no tocaran el suelo de la jaula y que no se hubiese hinchado el rabo a consecuencia de la sujeción.
A. Diseño experimental - 1ª parte
Cada experimento empezó con la suspensión de 20 ratas que se dividieron aleatoriamente en 4 grupos de 5 animales cada uno. El grupo A se suspendió sólo durante 2 días y proporciono datos de referencia para aproximar el tamaño del músculo sóleo en otros animales suspendidos durante tiempos más largos. Se compararon los pesos corporales medios para los grupos al principio del estudio, y se usaron como factor de corrección para diferencias en los tamaños corporales. El grupo B fue un segundo grupo control al que se trató el sóleo de un miembro con una solución acuosa de mersalilo al cabo de dos días de aligeramiento, para demostrar la capacidad de frenar la atrofia muscular durante el aligeramiento, para cada grupo de animales. Se ha estudiado con anterioridad al mersalilo y se ha demostrado que previene la atrofia en un modelo in vivo básicamente como el que se describe en el protocolo que se utiliza en la presente invención. Véase Tischler - 1990. 2 días después de que empezara el aligeramiento, se inyectó una solución acuosa de mersalilo (200 nM; 4 \mul/100 g de peso corporal inicial) en el sóleo, como se ha descrito con anterioridad. Se inyectó un volumen similar de solución salina al 0,9% ("vehículo") en el músculo contralateral.
Se mantuvo a los animales bajo sedación con Innovar-vet (10 \mul/100 g de peso corporal) durante el procedimiento de inyección in situ. Después de las inyecciones, se suspendieron a los animales durante 24 horas adicionales y se extrajo el sóleo. Para cada experimento se usaron el grupo C y el grupo D para comprobar cada una de dos realizaciones distintas de los compuestos que se describen. Los animales se trataron como en el grupo B, salvo que se inyectó inhibidor de la MCP 1 mM, contenido en dimetilsulfóxido (DMSO), dentro del sóleo de una pierna y sólo DMSO dentro del sóleo contralateral. Por lo tanto, cada experimento consistió en dos grupos control y la comprobación de los inhibidores de la MCP de la invención. La realización de cinco experimentos semejantes con pares distintos de inhibidores aseguró un valor "n" de 10 para las pruebas de cada inhibidor de la MCP siendo cada uno de ellos probado en dos remesas distintas de animales.
B. Procesamiento del músculo sóleo - 1ª parte
Después de que se hubiese sacrificado el animal, se extirpó el sóleo, se le quitó la grasa y el tejido conectivo, y se pesó con cuidado. A continuación, se homogeneizó el músculo en ácido tricloroacético (TCA) al 10% y se sedimentaron las proteínas que habían precipitado por centrifugación. Luego se lavó el sedimento una vez con TCA al 10% y una vez con etanol:éter (1:1). Se solubilizó el sedimento final en 4 ml de hidróxido sódico 1 N. A continuación, se analizó la muestra para su contenido en proteínas por el procedimiento del biuret, usando albúmina como patrón.
C. Análisis de los datos - 1ª parte
Se examinaron principalmente los efectos de los inhibidores de la MCP sobre el contenido en proteínas totales del músculo por comparación por parejas con el músculo contralateral sin tratar. Se calculó la razón de contenidos y luego se analizó estadísticamente por análisis de la varianza ("ANOVA"). La pata izquierda fue siempre la pata tratada para que se pudieran comparar las razones de los contenidos en proteínas con los animales control no tratados también. De este modo, se puede mostrar una diferencia significativa por comparación del contenido en proteínas de las dos patas, así como la eficacia relativa de los inhibidores de la MCP que se probaron. Se realizó también una prueba de Student por parejas para el efecto de cada tratamiento separado. Los datos de los controles no tratados proporcionaron también una estimación del contenido en proteínas en el día 2. Esto permitió una aproximación de las variaciones en proteínas a lo largo de las 24 horas de tratamiento para cada uno de los grupos B, C y D.
D. Diseño experimental - 2ª parte
Cada experimento consistió en 10 animales, probándose grupos de 5 animales con uno de los inhibidores para sus efectos sobre la síntesis proteica. No hicieron falta animales control para este aspecto del estudio ya que el músculo contralateral que se trató con DMSO hizo las veces de control apareado para el músculo que se trató con el inhibidor. A cada grupo se le inyectó según se describió para los grupos C y D en la 1ª parte. Veinticuatro horas después del tratamiento in situ, se analizó la tasa fraccional de síntesis proteica en ambos músculos sóleo. A cada músculo se le inyectó una solución salina al 0,9% (3,5 \mul/100 g de peso corporal final) que contenía ^{3}H-fenilalanina (50 mM; 1 \muCi/\mul). Quince minutos después, se extirpó los dos tercios medianos del músculo y se procesó al músculo como se describe abajo.
E. Procesamiento del músculo sóleo - 2ª parte
Se lavó primero el músculo durante 10 minutos en solución salina al 0,84% que contenía cicloheximida 0,5 mM para detener la síntesis proteica, y cicloleucina 20 mM para atrapar la fenilalanina en la célula. A continuación, se homogeneizó el músculo en 2,5 ml de ácido perclórico helado al 2%. Se sedimentaron las proteínas que habían precipitado por centrifugación. Se cogió una alícuota del líquido sobrenadante para recuento por centelleo líquido y se procesó otra alícuota para la conversión de la fenilalanina en fenetilamina para determinar la concentración de fenilalanina soluble por fluorometría. Véanse Garlick, P.J. y col., Biochem. J., 192 719-723 (1980) y Munoz, K.M. y col., 1993 Metabolism, en prensa. Estos valores proporcionan la actividad específica intracelular. Se determinó la actividad específica de la fenilalanina en las proteínas del músculo tras hidrolizar la proteína por calentamiento en HCl 6 N. Se solubilizaron los aminoácidos que se liberaron en tampón. Se cogió una alícuota para recuento por centelleo y otra para el análisis de la fenilalanina como para la fracción sobrenadante. Se calculó la tasa fraccional de síntesis proteica como: actividad específica de proteína/actividad específica intracelular x tiempo.
F. Análisis de los datos - 2ª parte
Los análisis de la síntesis proteica se hicieron por parejas para cada inhibidor de la MCP. Las comparaciones por la prueba t de Student por parejas de los músculos contralaterales determinaron si había algún efecto del inhibidor sobre la síntesis proteica. La degradación proteica se puede calcular aproximadamente como la tasa fraccional de síntesis proteica (a partir de la 2ª parte) más la tasa fraccional de aumento proteico (a partir de la 1ª parte), en la que la pérdida de proteínas produce un valor negativo para el aumento proteico.
Cualitativamente, la capacidad de los inhibidores de la MCP para frenar la pérdida en proteínas sin afectar a la síntesis proteica indica una deceleración de la degradación de proteínas.
G. Resultados
La tabla 1 muestra la ausencia de efecto de los inhibidores de la MCP sobre el músculo control.
La tabla 2 muestra la variación del contenido en proteínas durante el tercer día de aligeramiento.
La tabla 3 muestra el efecto de los inhibidores de la MCP sobre las proteínas musculares con aligeramiento.
La tabla 4 muestra el efecto de los inhibidores de la MCP sobre la síntesis muscular con aligeramiento.
En las tablas, el número del compuesto hace referencia al número del ejemplo en el que se expone la vía de síntesis para el compuesto.
TABLA 1 Ausencia de efecto de los inhibidores de la MCP sobre el músculo control
Tratamiento Proteína (mg/músculo)
Vehículo Tratamiento
DMSO 5,9 6,7
Compuesto 34 6,1 6,3
Compuesto 14 6,0 6,1
Compuesto 20 5,7 5,9
TABLA 2 Variación del contenido en proteínas durante el día 3 de aligeramiento
Tratamiento Proteína (mg/músculo) Efecto (%) P
Principio Fin
Sol. salina 6,5 5,7 -12 <0,001
DMSO 6,5 5,9 -10 <0,001
Mersalilo 6,4 6,6 +3 <0,05
Compuesto 34 6,3 6,6 +5 <0,05
Compuesto 14 6,8 6,4 0 >0,1
Compuesto 20 6,5 6,2 -4 <0,07*
Compuesto 16 6,3 6,0 -5 <0,07*
*valores marginalmente significativos
TABLA 3 Efecto de los inhibidores de la MCP sobre la proteína muscular con aligeramiento
Tratamiento Proteína (mg/músculo) Efecto (%) P
Vehículo Tratamiento (%)
Mersalilo 5,7 6,6 14 <0,001
Compuesto 34 5,9 6,6 12 <0,001
Compuesto 14 6,0 6,4 7 <0,06*
Compuesto 20 5,9 6,2 5 <0,05
Compuesto 16 5,9 6,0 0 >0,1
*valores marginalmente significativos
TABLA 4 Ausencia de efecto de los inhibidores de la MCP sobre la síntesis muscular con aligeramiento
Tratamiento Proteína (mg/músculo)
Vehículo Inhibidor de la MCP
Compuesto 34 14,5 13,3
Compuesto 14 13,1 13,8
Compuesto 20 14,1 14,6
Ejemplo 5 Demostración de la inhibición de la MCP mediante el uso del procesamiento por el MHC-1
Se ensayaron los compuestos de la invención para su capacidad para inhibir el procesamiento del antígeno OVA exógeno por la vía del complejo principal de histocompatibilidad de clase I (MHC-I). Se aplicaron los inhibidores de la MCP a un sistema de procesamiento de antígenos funcional que permite la inclusión del inhibidor dentro de la célula que procesa el antígeno durante la exposición al antígeno, seguido de la fijación de la célula de procesamiento. A continuación se añaden hibridomas de células T a las células de procesamiento en ausencia de un inhibidor para determinar la expresión de los complejos péptido-MHC-I, que refleja el procesamiento del antígeno antes de la fijación.
A. Cultivo de células
Se pusieron las células en cultivo a 37ºC en una atmósfera humidificada que se mantuvo a 5% de CO_{2} en un medio corriente: DMEM (Gibco, St. Louis, MO) con suero de ternera fetal al 10% (Hyclone, Logan, UT), 2-mercaptoetanol 5 X 10^{-5} M, antibióticos y los complementos siguientes: L-arginina HCl (116 mg/l), L-asparragina (36 mg/l), NaHCO_{3} (2 g/l), piruvato sódico (1 mM). Véase también Harding, C.V., (1992) Eur. J. Immunol. 22: 1865-1869. Se usaron células M12.B6 (cortesía de Osami Kanagawa, Washington University, St. Louis, MO) para la presentación de los antígenos; fueron creadas por fusión de células M12.C3 de linfoma B de ratón con esplenocitos (fuente de linfoblastos B) estimulados con LPS a partir de un ratón C57BL/6. Por consiguiente expresan los antígenos H-2^{b}. Las células de hibridoma T DOWB son específicas para el péptido (323-339) de la OVA unido o bien a I-A^{b} o bien a I-A^{d}. Véase Yewdell y col., Science 1988 239: 637. Las células de hibridoma T B3.1 responden a OVA (258-276)-K^{b}.
B. Electroporación y estudios del procesamiento del antígeno
Para poder ser procesado y presentado por la vía del MHC-1, el antígeno exógeno (ovoalbúmina; OVA) debe penetrar en el citosol de las células de procesamiento. La OVA se introdujo en el citosol de las células de procesamiento (células M12.B6) mediante electroporación.
La electroporación se llevó a cabo con un electroporador Gibco BEL mediante el uso de cámaras de cubeta de 0,4 cm de ancho. La capacitancia fue de 800\mu\F y el voltaje fue de 50-300 V. La electroporación se llevó a cabo en RPMI o PMEM (Gibco) exento de suero con 1,5 X 10^{7} células MB12.B6/ml (intervalo 0,5 X 10^{7} - 4,0 X 10^{7}) en presencia de OVA a 4ºC. Las células se colocaron inmediatamente sobre hielo. A continuación se añadieron varios inhibidores y se transfirieron las células a 18ºC o 37ºC. Finalmente las células fueron ligeramente fijadas durante aproximadamente 10 minutos con paraformaldehído al 1% y lavadas a fondo a 37ºC, lo cual impide procesamiento adicional. El grado de procesamiento (es decir, el nivel de complejos péptido-MHC específicos que se expresaron) se determinó por la capacidad de las células M12.B6 para estimular la secreción de IL-2 por células de hibridoma T B3.1 o DOBW. Las células T (10^{5}) se sembraron en placa con las células M12.B6 (2 X 10^{5} si fijadas, 5 X 10^{4} si viables) en 0,2 ml durante 18-24 horas a 37ºC en una cámara de 10^{2}. Los dos hibridomas T responden a la estimulación antigénica mediante la secreción de IL-2 (ensayada en los líquidos sobrenadantes mediante la proliferación de células CTLL dependiente de IL-2 e incorporación de [H^{3}] timidina. Véase Allen y col., J. Imunol. 132: 1077).
Los resultados de estos estudios se presentan en las figuras 1-3. La figura 1 presenta los efectos de los compuestos 14 y 16 sobre el procesamiento por las células M12.B6 de la OVA introducida por electroporación. Las figuras 2 y 3 presentan el efecto de los compuestos 14 y 20 sobre el procesamiento de la OVA por el MHC-1. Los dos compuestos inhiben eficazmente el procesamiento de la OVA. Estos datos proporcionan argumentos adicionales para los efectos inhibidores de la MCP por los compuestos de la invención. Se admite que la vía clásica del MHC-1 implica la degradación del antígeno por los proteasomas. Véase Goldberg y col., supra. Por lo tanto, los compuestos se pueden utilizar para una mayor comprensión de la importancia del procesamiento proteolítico de los antígenos.
Ejemplo 6 A. Reducción de la degradación de la Cu/Zn superóxido dismutasa (SOD-1) I. 1ª parte - clonación y mutagénesis
Se obtuvo un clon de ADNc de SOD-1 de ratón de Jim Mahaffey (North Carolina State University, Raleigh, NC). Se modificó este clon por metodologías de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para incorporar 1) una señal de consenso de iniciación de la traducción Kozak (es decir, 5'-GCCGCCACC-3') directamente cadena arriba del codón de iniciación ATG, 2) un sitio de restricción para Hind III del lado 5' de esta señal de consenso y 3) un sitio de restricción para Xho I en el extremo 3' del ADNc. Los cebadores oligonucleotídicos que se usaron para los procedimientos de PCR fueron: cebador 5' (EH87) = 5'-TCGATCGAAGCTTGCCGCCACCATGGCGATGAAAGC-3' (SEC ID N º : 1), cebador 3' (EH88) = 5'-AGCTAGCCTCGAGCAGATTACAGTTTAATG-3' (SEC ID Nº: 2). El producto de PCR obtenido se digirió con las enzimas de restricción Hind III y Xho I y se clonó dentro del vector pBluescript II SK+ (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) digerido con Hind III + Xho I para obtener pSK-HX2.
Las mutaciones puntuales ELAF en el aminoácido 4 (Ala^{4}\rightarrowVal) (GCG\rightarrowGTG) y en el aminoácido 113 (Ile^{113}\rightarrow Thr) (ATT\rightarrowACT) se introdujeron en el clon pSK-HX2 de ADNc de SOD-1 mediante el uso del procedimiento de mutagénesis por PCR por extensión del solapamiento descrita por Ho y col., Gene 77: 51-59 (1989). El mutante Ile^{113}\rightarrowThr se construyó de la manera siguiente: se generó el fragmento de PCR 5' mediante el uso del cebador 5' EH78; que consiste en la secuencia de nucleótidos 5'-TTAATCCTCACTCTAAGAAAC-3' (SEC ID Nº: 3) (nucleótidos 193 a 213 del ADNc de SOD1 en el que el #1 es la A del codón de iniciación ATG) y el cebador 3' EH84; que consiste en la secuencia de nucleótidos 5'-TTGTACGGCCAGTGATGGAATGCT-3' (SEC ID Nº: 4) (nucleótidos 351 a 328), el fragmento de PCR 3' se construyó mediante el uso del cebador 5' EH83; que consiste en la secuencia de nucleótidos 5'-AGCATTCCATCACTGGCCGTACAA-3' (SEC ID Nº: 5) (nucleótidos 328 a 351 y el cebador 3' EH42; que consiste en la secuencia de nucleótidos 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3' (SEC ID Nº: 6) (nucleótidos 626 a 645 de pBluescript II SK+). Se combinaron cincuenta nanogramos de los dos fragmentos de PCR 5' y 3' en la reacción de PCR de la segunda etapa y se amplificaron mediante el uso de los cebadores EH78 y EH42. Este producto de PCR se digirió con Bal I y Xho I y se clonó en pSK-HX2 digerido con Bal I + Xho I sustituyendo así el fragmento Bal I/Xho I nativo de 255 pb por el fragmento mutante ELAF (clon pSK-113).
El mutante Ala^{4}\rightarrowVal se construyó de la manera siguiente: se generó el fragmento de PCR 5' mediante el uso del cebador 5' EH105; que consiste en la secuencia de nucleótidos 5'-GCACACCACTTTCATCGCCATGGTGGCGGCAAGCTTCGATC-3' (SEC ID Nº: 7) (nucleótidos +21 a -20) y el cebador 3' EH41; que consiste en la secuencia de nucleótidos 5'-ATTAACCCTCACTAAAGGGA-3' (SEC ID Nº: 8) (nucleótidos 792 a 773 de pBluescript II SK+). El fragmento de PCR 3' se generó mediante el uso del cebador 5' EH104, que consiste en la secuencia de nucleótidos 5'-GATCGAAGCTTGCCGCCACCATGGCGATGAAAGTGGTGTGC-3' (SEC ID Nº: 9) (nucleótidos -20 a +21) y el cebador 3' EH103; que consiste en la secuencia de nucleótidos 5'-CTTCAGTTAATCCTGTAA-3' (SEC ID Nº: 10) (nucleótidos 123 a 106). Como arriba, se combinaron 50 ng de los dos fragmentos de PCR 5' y 3' en la reacción de PCR de la segunda etapa y se amplificaron mediante el uso de los cebadores EH41 y EH103. Este producto de PCR se digirió con Hind III y Rsr II y se clonó en pSK-HX2 digerido con Hind III + Rsr II sustituyendo así el fragmento Hind III/Rsr II nativo de 51 pb por el fragmento mutante ELAF (clon pSK-A4V). Se estableció la secuencia de todos los productos de PCR descritos arriba mediante el uso del procedimiento Sequenase (US Biochemical, Cleveland, OH) para confirmar la presencia de las mutaciones y la ausencia de cualquier error de PCR. Se presenta una ilustración del gen SOD-1 que define las posiciones de las mutaciones, los cebadores y los sitios de restricción en la figura 4.
Se construyeron los vectores de expresión de ADNc de SOD-1 por digestión de las construcciones de tipo silvestre (pSK-HX2) y mutantes (pSK-113 y pSK-A4V) con Hind III y Xho I. Cada uno de los tres fragmentos de 546pb obtenidos que contenían las secuencias de ADNc de SOD-1 se clonaron por separado en el pcDNA I/Neo (Invitrogen Corp., San Diego, CA) digerido con Hind III y Xho I para obtener, respectivamente, pCMV-HX5 (SOD de tipo silvestre), pCMV-113 (Ile^{113}\rightarrowThr), y pCMV-A4V (Ala^{4}\rightarrowVal).
II. 2ª parte
Se llevaron a cabo experimentos iniciales para determinar si la estabilidad reducida de las proteínas mutantes ELAF de SOD-1 se debía a una degradación proteolítica mediada por la MCP. Se obtuvo la línea de células de riñón humano denominada 293 (células 293 humanas o células 293) de la American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852 (ATCC #CRL 1573) y se hizo crecer en medio de Eagle modificado por Dulbecco con 4,6 g/l de glucosa, suero de caballo inactivado al calor al 10% (Gibco/Life Technologies Inc. Gaithersburg, MD). Se mantuvieron las células 293 humanas a 37ºC en una atmósfera de CO^{2} al 5%. Las células 293 fueron sometidas a transfección transitoria mediante el uso del procedimiento del fosfato de calcio (Chen, C. y col., Biotechniques 6: 632 (1988)). Se introdujo el vector de expresión de SOD-1 pCMV-113 en las células 293 y 24 horas más tarde, se incubaron las células o bien con el compuesto 34, el compuesto 14, o el compuesto 24, todos a la concentración de 5 \muM, por un periodo de 24 horas. Los compuestos inhibidores conocidos de la MCP y de otras proteasas se solubilizaron en dimetilsulfóxido (DMSO). Otros cultivos de células 293 se incubaron con un volumen igual de DMSO o se dejaron en medio sólo, como controles negativos.
Aproximadamente 48 horas antes de recibir los compuestos de prueba, se sembraron 5 x 10^{5} células 293 en placas de 36 mm y se mantuvieron a 37ºC en una atmósfera de CO_{2} al 5%. Se incubaron las células con inhibidores de la MCP (compuesto 34, 14 ó 24) o con DMSO como control negativo por un periodo de 24 horas. Se prepararon productos de lisis celular al someter las células a lisis en aproximadamente 75 \mul de solución salina con tampón fosfato (PBS) por ciclos de congelación/descongelación. Se determinaron las concentraciones en proteínas de los productos de lisis celular mediante el uso del procedimiento del BCA (Pierce, Rockford, IL) y se llevó a cabo una electroforesis de 2 a 2,5 \mug de cada muestra en un gel de poliacrilamida al 4-20% (Novex, San Diego, CA) mediante el uso de un sistema tampón de Tris/glicina/SDS (Tris 25 mM/glicina 192 mM/SDS al 0,1%). Se transfirieron las proteínas a filtros de nitrocelulosa por electroelución y se bloquearon los filtros por incubación en solución blotto (leche en polvo al 5% en solución salina con tampón Tris 25 mM (1 x TBS)) durante 30 minutos. Los filtros se transfirieron a una solución con anticuerpo primario (dilución 1:10.000 en solución blotto) y se incubaron durante 2-18 horas. El anticuerpo primario que se usó en estos estudios fue un antisuero de conejo policlonal criado frente a la SOD-1 purificada de ratón producida en E. coli (Hazelton Research Products, Denver, PA). Los filtros se lavaron tres veces durante 5 minutos cada una en TBS 1 x y se incubaron en una solución con anticuerpo secundario (dilución 1:2.000 en solución blotto) durante dos horas. El anticuerpo secundario fue una IgG de cabra anti-conejo conjugada con la fosfatasa alcalina (Bio-Rad, Richmond, CA). Los filtros se lavaron tres veces durante 5 minutos cada una en TBS 1 x y se tiñeron para actividad de la fosfatasa alcalina mediante incubación durante 5-60 minutos en un reactivo de detección de la fosfatasa alcalina disponible en el mercado (Bio-Rad, Richmond, CA). Se cuantificaron las bandas teñidas que corresponden a la proteína SOD-1 mediante el uso de un sistema de análisis de imagen DocuGel V y el software RFLPscan (Scanalytics Billerica, MA). Los niveles de SOD-1 se expresan como unidades de inducción con respecto al control negativo (es decir, unidades de experimental divido por unidades de control). El análisis por inmunotransferencia de los productos de lisis celular reveló que los niveles de SOD-1 se habían incrementado con moderación en comparación con aquellos de los controles en cada una de las tres muestras que se incubaron en presencia de inhibidores de la MCP (figura 5). Estos resultados muestran que la inhibición de la MCP por los compuestos de la invención lleva a una mayor acumulación de la proteína SOD-1 en el mutante Ile^{131}\rightarrowThr y de ese modo implica a la MCP como la responsable de los niveles reducidos de SOD-1 en las células que contienen la mutación ELAF.
III. 3ª parte
Para seguir demostrando que la actividad de la MCP es responsable del recambio de la SOD-1, se llevaron a cabo estudios en líneas celulares que producen de manera estable la SOD-1 de ratón de tipo silvestre o las proteínas mutantes ELAF, es decir, Val en lugar de Ala^{4} y Thr en lugar de Ile^{131}. Las líneas celulares que expresan de manera estable la SOD-1 nativa de ratón y las dos proteínas mutantes ELAF de SOD-1 mencionadas arriba se obtuvieron por transfección con fosfato de calcio (Chen, C. y col., Biotechniques 6:632 (1988)) de células 293 con construcciones de expresión de ADNc de SOD-1 (descritas arriba) seguida de la selección para la resistencia a la neomicina por crecimiento en presencia de 1 mg/ml de G418 (Geneticin^{TM}, Gibco/Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD). Se mantuvieron a las células bajo selección con G418 durante tres semanas, momento en el cual se suprimió la selección por el fármaco y se mezclaron las colonias resistentes a G418 de cada tipo de células transformadas para cultivo ulterior. Se utilizó el compuesto 14 en estos estudios.
Se incubaron líneas celulares que expresan las isoformas indicadas de SOD-1 con distintas concentraciones del compuesto 14 durante 24 horas, momento en el cual se midieron los niveles de SOD-1 por barrido densitométrico de las inmunotransferencias. Los niveles de SOD-1 se expresan como unidades de inducción con respecto a las muestras de los controles negativos (como arriba) y cada punto de los datos es la media de tres experimentos. El análisis de la respuesta a la dosis del compuesto 14 indicó que la incubación de las células transformadas con este inhibidor de la MCP lleva a acumulaciones importantes de niveles de proteína SOD-1 produciéndose las acumulaciones máximas en aquellas células que se incubaron con el compuesto 14 a una concentración de aproximadamente 20 \muM (figura 6). Además, la magnitud de la acumulación de SOD-1 está en correlación con las medias vidas estimadas de las distintas proteínas SOD; la SOD-1 de tipo silvestre siendo la más estable y Ala^{4}\rightarrowVal la menos estable (Borchelt D.R. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 8292-8296 (1994)). Estos datos concuerdan con la hipótesis de que las mutaciones ELAF desestabilizan las proteínas SOD-1, posiblemente debido a un plegamiento erróneo, y como consecuencia de las alteraciones estructurales que se producen como consecuencia de las mutaciones, marcan estas proteínas para la degradación por la MCP. Estos resultados demuestran también que el compuesto 14 tiene un efecto estadísticamente significativo sobre el recambio de la proteína SOD-1 de tipo silvestre lo cual confirma adicionalmente el papel de la MCP en la degradación de la SOD-1.
IV. 4ª parte
Para demostrar la especificidad de la actividad de la MCP en el recambio de la SOD-1 (y excluir la posible implicación de otras vías proteolíticas importantes tales como la proteasa activada por el calcio calpaína y las proteasas lisosómicas), se llevaron a cabo experimentos en los que dos líneas de células transformadas (descritas arriba, una que produce la proteína de tipo silvestre y la otra la proteína SOD-1, con la mutación Ala^{4}\rightarrowVal), se incubaron con distintos inhibidores de proteasa cada uno de los cuales es específico para una sola actividad proteolítica: el compuesto 14 inhibe a la MCP; la "Calpeptin" (Novabiochem USA, La Jolla, CA, nº de catálogo 03-34-0051; CBZ-Leu-Nle-aldehído, Biochem. Biophys. Res. Comm. (1988) 153: 1201), un inhibidor de la "calpaína" que penetra en las células (la calpaína es una cisteína-proteasa); y DK-3 (Enzyme Systems Products, Dublin, CA. CBZ-Phe-Ala-CHN_{2}) que inhibe la actividad de la proteasa lisosómica. Además, se incubaron células con el compuesto 16 que es un inhibidor de la MCP de menor potencia en comparación con un compuesto particularmente preferido de la invención, es decir, el compuesto 14. Se incubaron las líneas celulares que expresan las isoformas indicadas de SOD-1 durante 24 horas con los inhibidores de proteasa siguientes: compuesto 14, 20 \muM; calpeptina, 10 \muM; DK-3, 5 \muM; compuesto 16, 20 \muM; o con DMSO como control negativo. Después de las 24 horas de incubación con los inhibidores, se midieron los niveles de SOD-1 por barrido densitométrico de las inmunotransferencias. Los niveles de SOD-1 se expresan como unidades de inducción con respecto a las muestras no tratadas, como arriba. Cada punto de los datos es la media de los resultados de tres experimentos.
Los resultados se presentan en la figura 7. Se puede observar que el recambio de la SOD-1 mutante Ala^{4}\rightarrowVal es función de la actividad de la MCP y únicamente la inhibición específica de la MCP por el compuesto 14 preferido lleva a un aumento importante (de tres veces) de la acumulación de la proteína SOD-1. La incubación con los inhibidores de la calpaína o de las proteasas lisosómicas no tuvo efecto apreciable sobre el recambio de la SOD-1. Además, el tratamiento con el compuesto 14 dio lugar a un ligero aumento de la acumulación de SOD-1 de tipo silvestre, un hallazgo que también se observó anteriormente en los estudios de respuesta a la dosis. En su conjunto, estos estudios demuestran que la actividad de la MCP es crítica para el recambio de la SOD-1 en las líneas de células 293 transformadas, y que la inhibición de la MCP por el compuesto 14 conduce a un aumento de la proteína SOD-1 dentro de la célula.
Síntesis de inhibidores
Lo que viene a continuación proporciona vías de síntesis ilustrativas para la preparación de compuestos de la presente invención. Otros protocolos de síntesis, así como modificaciones de los esquemas de síntesis siguientes resultarán perfectamente claros para aquellos expertos en la materia una vez armados con la presente descripción.
Los inhibidores de la invención incorporan enlaces amida que se pueden introducir por procedimientos sintéticos bien conocidos mediante el uso de las técnicas en fase líquida que se describen en The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Volumen I (1979), eds. Gross, y col., Academic Press, y que se describen con detalle en los ejemplos 8-11 más adelante.
Se pueden preparar los inhibidores mediante la síntesis y la unión por separado de los fragmentos:
R_{1}-(CH_{2})_{n}-CH(R_{2})-COOH y H_{2}N-CH(R_{3})-CONH-R_{4}
(procedimiento de unión I) como se describe en los ejemplos 14-38.
Si no, se pueden preparar mediante la síntesis y la unión por separado de los fragmentos:
R_{1}-(CH_{2})_{n}-CH(R_{2})-CONH-CH(R_{3})-COOH y H_{2}N-R_{4}
(procedimiento de unión II) como se describe en los ejemplos 39-42 más adelante.
Cuando el sustituyente Q contiene un grupo aldehído (es decir, cuando H_{2}N-R_{4} es un aminoaldehído que procede de un aminoácido, por ejemplo H_{2}N-CH(CH_{2}R_{7})-CHO) el aminoaldehído protegido por acetal necesario se puede sintetizar como lo describen Gacek, y col., Tetrahedron, 30, 4233 (1974) o por los procedimientos que se describen en el ejemplo 12. Después de que se haya llevado a cabo la unión (a través de los procedimientos de unión I o II), se pueden retirar los grupos acetal de protección como se describe en el ejemplo 11 (procedimiento E) para liberar el grupo aldehído libre.
Cuando Q es una metilcetona o una diazo-, bromo- o clorometilcetona (es decir, cuando H_{2}N-R_{4} es una metilcetona alfa-amino-sustituida o una alfa diazo-, bromo- o clorometilcetona que procede de un aminoácido), el procedimiento de unión II resulta particularmente práctico. La sal de clorhidrato de la clorometilcetona se puede comprar (Bachem Bioscience Inc., King of Prussia, Pensilvania) o puede prepararse por conversión del aminoácido protegido por Boc en un anhídrido carbónico mixto seguida de reacción con diazometano para proporcionar la diazometilcetona. Las bromo- y clorometilcetonas se preparan por reacción de la diazometilcetona con bromuro o cloruro de hidrógeno como lo describen Kettner, y col. Arch. Biochem. Biophys. 162, 56 (1974), Fittkau, J. Prakt. Chem. 315, 1037 (1973) o Zimmerman, y col., PCT WO 95/15749 publicada el 15 de junio de 1995.
Las metilcetonas correspondientes pueden prepararse por hidrogenolisis de las clorometilcetonas como lo describen Kettner, y col., patente de EE.UU. 4.652.552.
Cuando Q es una alfa-difluorometilcetona, el 1-amino-3,3-difluoro-2-propanol correspondiente puede prepararse y unirse mediante el procedimiento de unión II, y el difluoroalcohol obtenido oxidarse para dar la difluorocetona mediante el procedimiento descrito por Trainor y Stein, patente de EE.UU. 4.923.890.
Cuando Q es una trifluorometilcetona (es decir, cuando H_{2}N-R_{4} es una trifluorometilcetona que procede de un aminoácido, por ejemplo H_{2}N-CH(CH_{2}R_{7})-COCF_{3}), la cetona necesaria puede prepararse como lo describen Imperiali y Abeles, Biochemistry 25, 3760 y paginas siguientes (1986).
Cuando Q es una monofluorometilcetona (es decir, cuando H_{2}N-R_{4} contiene un grupo fluorometilcetona, por ejemplo H_{2}N-CH(CH_{2}R_{7})-COCH_{2}F) que procede de un aminoácido, la cetona necesaria puede prepararse por el procedimiento de Palmer en la solicitud de patente europea EP 442.754 mediante el uso del aminoácido protegido por Boc y el bencilfluoromalonato de magnesio. Después de la eliminación de los grupos Boc de protección, la amina se puede unir mediante el uso del procedimiento de unión II. Si no, la monofluorometilcetona puede prepararse por oxidación del alcohol correspondiente como se describe en el ejemplo 42.
Cuando Q es un derivado de un boroaminoácido (es decir, Q = B(OH)_{2} o su éster cíclico), el éster cíclico se prepara fundamentalmente como lo describe Shenvi, patente de Estados Unidos 4.537.773, y después de la unión mediante el procedimiento de unión II, puede convertirse opcionalmente en el ácido borónico del péptido libre como lo describen Shenvi y Kettner en las patentes de Estados Unidos Nº 4.499.082 y 5.187.157, y en J. Biol. Chem. 259, 15106 (1984).
Cuando Q es una alfa-dicetona o un alfa-cetoéster (es decir, Q = -C(=O)C(=O)R_{7} o -C(=O)CO_{2}R_{7}) las amino dicetonas o alfa-cetoésteres necesarios pueden prepararse como lo describen Angelastro, y col., J. Med. Chem. 33, 13 (1990) y las referencias en ésta. Los alfa-cetoésteres pueden hidrolizarse o amidarse para producir los correspondientes alfa-cetoácidos o amidas. Las alfa-cetoamidas pueden prepararse también a partir de aminoácidos protegidos por Boc comercialmente disponibles mediante una modificación del procedimiento de Harbeson, y col., J. Med. Chem. 37, 2918-2929 (1994). En este último procedimiento muy útil, el aminoácido protegido por Boc se convierte secuencialmente en una N, O-dimetilhidroxilamida, un aldehído, una cianhidrina, un alfa-hidroxicarboxilato, y una alfa-hidroxicarboxamida:
R^{1}-COOH \rightarrow R^{1}-CON(CH_{3})-OCH_{3}\rightarrow R^{1}-CHO \rightarrow R^{1}-CH(OH)-CN \rightarrow R^{1}-CH(OH)-COOH\rightarrow R^{1}-CH(OH)-CONH-R
en la que R^{1} =Boc-NH-CH(CH_{2}R_{7})-.
El grupo Boc se elimina en condiciones ácidas y después de la neutralización, el residuo amino libre se une según el procedimiento de unión II para producir la alfa-hidroxicarboxamida que luego se oxida para proporcionar el inhibidor alfa-cetocarboxamida:
Boc-NH-CH(CH_{2}R_{7})-CH(OH)-CONH-R_{7} - -> H_{2}N-CH(CH_{2}R_{7})-CH(OH)-CONH-R_{7} --(Procedimiento\ de\ unión\ II) - -> R_{1}-(CH_{2})_{n}-CHR_{2}-CONH-CH(R_{3})-CONH-CH(CH_{2}R_{7})-CH(OH)-CONHR_{7} - -> R_{1}-(CH_{2})n-CH(R_{2})-CONH-CH(R_{3})-CONH-CH(CH_{2}R_{7})-COCONH-R_{7}
\newpage
Ejemplo 7 Procedimiento A Procedimiento de anhídrido mixto Esquema 
\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 \+ IBCF\+\cr  X-AA _{1} -COOH +
H _{2} N-AA _{2} -Y \+ - - - - - - -
- - -> \+
X-AA _{1} -AA _{2} -Y\cr
 \+
NMM\+\cr}
X = grupo fluorenilmetiloxycarbonilo (Fmoc) - o t-butiloxycarbonilo (Boc); Y = Acetal u otro grupo protector para el aminoaldehído
AA_{1} = aminoácido
AA_{2} = aminoaldehído
Se añadió N-metilmorfolina (NMM) (1 eq.) a una solución en agitación del aminoácido protegido en tetrahidrofurano (THF). Se enfrió la mezcla hasta -15ºC, se trató con cloroformiato de isobutilo (IBCF) (1,1 eq.), y se dejó reaccionar durante 10 min. Posteriormente, se añadió el componente aminoaldehído en forma de la base libre seguido de NMM (1,1 eq., 2,2 eq. si sal ácida). Se siguió agitando durante 30 min a -15ºC, y luego a temperatura ambiente durante 3-4 h. La mezcla de reacción se disolvió en 150-200 ml de acetato de etilo (EtOAc). La solución obtenida se lavó sucesivamente con agua, bicarbonato sódico al 5% (NaHCO_{3}), ácido cítrico acuoso al 2%, y finalmente, agua. La fase orgánica se secó sobre sulfato sódico (Na_{2}SO_{4}) o sulfato magnésico (MgSO_{4}) anhidro, se eliminó el disolvente a presión reducida, y se trituró el producto así obtenido con éter de petróleo. El péptido sólido así obtenido se filtró, se secó y se caracterizó.
Ejemplo 8 Procedimiento B Procedimiento de desprotección del grupo Fmoc Esquema
Fmoc-HN-AA_{1}-AA_{2}-Y - - -> H_{2}N-AA_{1}-AA_{2}-Y
Se trató el péptido protegido por Fmoc (0,2 a 4 mmol) en una mezcla de dimetilformamida (DMF) al 30% en acetato de etilo (EtOAc) con un exceso de 50-60 veces de dietilamina (DEA) durante 2 h a temperatura ambiente. Se evaporó el disolvente a presión reducida a 30ºC, y se añadió éter de petróleo al residuo. Cuando se hubo formado un precipitado, éste se filtró y se secó. En otros casos, la goma obtenida se trituró repetidas veces con éter de petróleo, y la goma se conservó al vacío.
Ejemplo 9 Procedimiento C Adición de un grupo tapón o de un aminoácido al péptido: Esquema
R-COOH + H_{2}N-(AA)_{n}-COOR' - - - - - - -> R-CO-HN-(AA)_{n}-COOR'
Se disolvió el grupo tapón (como ácido carboxílico libre) o el aminoácido protegido (1 eq.), hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxi- tris(dimetilamino)-fosfonio (BOP) (1.1 eq.) y 1-hidroxibenzotriazol (HOBt) (1 eq.) en 5 ml de DMF seguido de NMM (2,2 eq.). Al cabo de 5 min, se añadió el componente básico desprotegido del péptido o el aminoácido protegido por un grupo carboxilo, se ajustó el pH a 8 y se agitó la mezcla durante 3-4 h. A continuación se diluyó con 150-300 ml de EtOAc y se sometió a extracción consecutivamente con agua, NaHCO_{3} al 2%, agua, ácido cítrico al 2% y agua. Se secó la fase orgánica y se evaporó hasta sequedad para producir un péptido taponado o N-protegido.
Ejemplo 10 Procedimiento D Procedimiento de eliminación del grupo carbobenciloxi (CBZ-)
Se mezcló una solución del péptido o derivado de aminoácido protegido por CBZ- (1 g) en acetato de etilo (15 ml) con 0,2 g de Pd/C en carbono (10% de Pd en carbono que contenía 50% en peso de agua) y se hidrogenó durante 4 h a 40 psi (276 kPa). Se filtró la solución a través de Celite® (tierra de diatomeas) y se evaporó hasta sequedad para producir el péptido o el derivado de aminoácido no protegido.
Ejemplo 11 Procedimiento E Conversión del acetal en aldehído
Se mezcló una solución del acetal de péptido (1 eq.) en 3 ml de THF con 3 ml de HCl acuoso (2 M) y se agitó durante 0,5 - 2 h. Se eliminó el disolvente por evaporación y el residuo final se diluyó con agua y se liofilizó para proporcionar el aldehído de péptido.
Ejemplo 12 Procedimiento F Preparación del dietilacetal de leucinal
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8
9
Etapa 1
Se añadió NMM (10 ml) a una solución de CBZ-Leu-OH (25 g, 93 mmol) en 250 ml de THF. Se enfrió la solución hasta -15ºC, se trató con 13 ml de cloroformiato de isobutilo (IBCF), y se dejó reaccionar durante 10 min. Posteriormente, se añadió una suspensión de clorhidrato de N,O-dimetilhidroxilamina (9,36 g, 96 mmol) en 40 ml de DMF y 10 ml de NMM. Al cabo de 4 h de agitación, se diluyó la mezcla con 400 ml de EtOAc y se lavó la solución consecutivamente con agua, una solución de NaHCO_{3} al 5%, agua, ácido cítrico al2%, y agua. Se secó la fase orgánica sobre MgSO_{4} y se evaporó para producir 19,0 g de un aceite incoloro.
Etapa 2
Se enfrió una solución del aceite (19 g) de la etapa 1, en 200 ml de éter, hasta -78ºC, y se añadieron gota a gota 120 ml de una solución de hidruro de litio-aluminio (LiALH_{4}) (1,0 M) en éter a lo largo de un periodo de 45 min. Se agitó la solución durante 30 min, y se añadieron gota a gota 200 ml de bisulfato potásico (KHSO_{4}) 1 M bajo atmósfera de nitrógeno. Se separó la fase orgánica, se lavó con solución de KHSO_{4} (1 M), se secó (MgSO_{4}) y se evaporó hasta un líquido incoloro (CBZ-Leu-H).
\newpage
Etapa 3
Se añadieron 104 ml de ortoformiato de trietilo a lo largo de un período de 30 min a una solución de CBZ-Leu-H (12 g) y ácido p-toluenosulfónico (0,9 g) en 100 ml de etanol (EtOH) anhidro. Se agitó la mezcla durante 30 min, y luego se evaporó y se diluyó con 500 ml de éter. La fase de éter se lavó consecutivamente con soluciones saturadas de NaHCO_{3} y cloruro sódico. El semisólido marrón amarillento se recristalizó a partir de hexano frío para producir agujas de dietilacetal de CBZ-leucinal de color blanco sucio. RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta: 7,28 (m, 5H), 5,03 (s, 2H), 4,77 (d, 1H), 4,27 (d, 1H), 3,8 (m, 1H), 3,63 (m, 2H), 3,43 (m, 2H), 1,6 (dd, 2H), 1,30 (m, 2H), 1,12 (m, 6H), 0,83 (d, 6H).
Etapa 4
Se hidrogenó el producto (14,8 g) de la etapa 3 mediante el uso del procedimiento D, con 2,5 g de Pd/C para producir 4,09 g de dietilacetal de leucinal en forma de aceite. RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta: 4,16 (d, 1H), 3,70 (m, 3H), 3,75 (m, 2H), 2,87 (m, 1H), 1,78 (m, 1H), 1,33 (m, 2H), 1,23 (m, 6H), 0,935 (dd, 6H)
Ejemplo 13 Procedimiento G Síntesis de mímicas P3 (para la nomenclatura, véase Schechter, I. y Burger, A. (1967) Biochem. Biophys. Res. Commun. 27: 157-162).
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Etapa 1 Preparación de bencilciclopentanoacetato
Una mezcla de ácido ciclopentilacético (10,02 g, 78,2 mmol), alcohol bencílico (8,45 g, 78,2 mmol) y monohidrato de ácido p-toluenosulfónico (1,48 g, 7,82 mmol) en benceno (60 ml) se llevó a reflujo mediante el uso de un separador de agua Dean-Stark durante 2h. Después de que se enfriara, se eliminó el benceno, y se diluyó la mezcla con éter (50 ml) y se lavó sucesivamente con una solución saturada de NaHCO_{3}, una solución saturada de salmuera, se secó y se evaporó para proporcionar el compuesto (15,40 g) como un aceite: RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta: 7,35 (m, 5H), 5,10 (s, 2H), 2,40(d, j = 8 Hz, 2H), 2,26 (m, 1H), 1,81 (m, 2H), 1,6 (m, 4H), 1,18 (m, 2H).
Etapa 2 Preparación de bencil-2-ciclopentil-10-yododecanoato
A una solución enfriada (-78ºC) de diisopropilamida de litio (20 mmol) en una mezcla de THF (20 ml) y hexano (8 ml) (obtenida in situ de los correspondientes diisopropilamina y n-BuLi) se añadió lentamente el compuesto que se obtuvo en la etapa 1 (3,96 g, 18 mmol) en THF anhidro (10 ml). Se agitó la mezcla durante 30 minutos y se añadió 1,8-diyodooctano (7,19 g, 20 mmol) en hexametilfosforamida (3,50 g, 20 mmol). Se agitó la mezcla a -78ºC durante 30 minutos, se llevó lentamente a 0ºC a lo largo de un periodo de 2 h y se detuvo por la adición cuidadosa de 50 ml de solución acuosa de cloruro sódico al 12%. La mezcla se sometió a extracción con éter, se lavó con salmuera, se secó y se evaporó el disolvente. El producto bruto se purificó hasta conseguir un aceite (3,23 g) por cromatografía ultrarrápida sobre sílice mediante el uso de hexano hasta EtOAc al 1% en hexano como eluyente; RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta: 7,35 (m, 5H), 5,15 (s, 2H), 3,20 (t, 8 Hz, 2H), 2,20 (m, 1H), 2,0 (m, 1H), 1,2-1,8 (m, 22H)
Etapa 3 Preparación de bencil-10-ciano-2-ciclopentildecanoato
Se calentó una mezcla del yodoéster de la etapa 2, (3,99 g, 8,7 mmol) y de cianuro sódico (0,47 g, 9,6 mmol) en 15 ml de DMSO anhidro a 70-75ºC durante 30 min. Tras enfriarse, se vertió la mezcla de reacción sobre hielo (40 g), se sometió a extracción en éter, y se lavó sucesivamente con agua y salmuera saturada. La fase orgánica se concentró para producir un aceite (2,89 g). RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta: 7,35 (m, 5H), 5,15 (s, 2H), 2,30 (t, 8 Hz, 2H), 2,20 (m, 1H), 2,00 (m, 1H), 1,3-1,8 (m, 22H).
Etapa 4 Preparación de bencil-10-N-ftalimido-2-ciclopentildecanoato
Se calentó una mezcla del compuesto de la etapa 2 (1,21 g, 2,6 mmol) y ftalimido potásico (0,536 g, 3 mmol) en 8 ml de DMF a 70-75ºC durante 30 min. Tras enfriarse, se vertió la mezcla de reacción sobre hielo (\sim40 g) y se sometió a extracción en 60 ml de éter. Se lavó la fase orgánica combinada con agua y salmuera saturada y se concentró para producir un aceite incoloro (1,24 g). RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta: 7,85 (m, 2H), 7,70 (m, 2H), 7,35 (m, 5H), 5,10 (s, 2H), 3,65 (t, 8 Hz, 2H), 2,20 (m, 1H), 2,00 (m, 1H), 1,22-1,18 (m, 22H).
Etapa 5 Preparación de ácido 10-ciano-2-ciclopentildecanoico
Se hidrogenó una mezcla del cianoéster de la etapa 3 (2,89 g, 8 mmol) y Pd-C (0,6 g, DeGussa, contenido en agua de 50%) al 10% en MeOH anhidro (35 ml) durante 2 h (42-26 psi; 290-179 kPa). La mezcla de reacción se filtró a través de una almohadilla de Celite® y se concentró para producir un aceite incoloro (2,02 g). RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta: 2,35 (t, 8 Hz, 2H), 2,20 (m, 1H), 2,00 (m, 1H), 1,3-1,9 (m, 22H).
Etapa 6 Preparación de ácido 2-ciclopentil-10-N-ftalimido-decanoico
Siguiendo el procedimiento de la etapa 5, el producto (0,41 g) de la etapa 4 se convirtió en el compuesto del título (0,31 g). RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta: 7,85 (m, 2H), 7,70 (m, 2H), 3,70 (t, 8 Hz, 2H), 2,15 (m, 1H), 1,95 (m, 1H), 1,10-1,85 (m, 22H).
Etapa 7 Preparación del benciléster del ácido 10-trifluorometanosulfonamido-2-ciclopentil-decanoico
13
14
Se calentó una mezcla del éster de la etapa 4 (0,874 g, 1,7 mmol) y monohidrato de hidrazina (0,425 g, 0,41 ml, 8,5 mmol) en metanol (8 ml) con reflujo durante 30 min, se concentró, y se trituró el residuo con éter para proporcionar un precipitado blanco que se filtró. El producto de la filtración se concentró para proporcionar un aceite (0,540 g). El aceite se disolvió en CH_{2}Cl_{2} (8 ml), se enfrió hasta -10ºC y se le añadió trietilamina (0,324 ml) seguido de sulfonilcloruro de trifluorometano (0,25 ml). La temperatura se llevó lentamente hasta temperatura ambiente a lo largo de un periodo de 1 h. A continuación se lavó la mezcla de reacción con agua, HCl al 2%, agua y salmuera saturada. La fase orgánica se concentró hasta producir un aceite y se purificó por cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice mediante el uso de EtOAc al 10% en hexano como eluyente para producir benciléster del ácido 10-trifluorometanosulfonamido-2-ciclopentil-decanoico en forma de aceite (0,25 g). RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta: 7,35 (m, 5H), 5,15 (s, ancho, 1H), 5,10 (s, 2H), 3,25 (m, 1H), 2,20 (m, 1H), 2,00 (m, 1H), 1,10-1,7 (m, 22H).
Etapa 8 Preparación del ácido 2-ciclopentil-10-(trifluorometanosulfonamido)-decanoico
Siguiendo el mismo procedimiento que aquél descrito en la etapa 5, se convirtió el compuesto (0,25 g) obtenido de la etapa 7 en el compuesto del título (0,20 g) en forma de aceite. RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta: 6,60-5,60 (b, 1H), 3,30 (d, 8 Hz, 2H), 2,15 (m, 1H), 1,90 (m, 1H), 1,1-1,8 (m, 22H).
15
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17
Etapa 9 Preparación de ácido t-butilo-8-yodocaprílico
Se sintetizó el compuesto del título siguiendo el procedimiento como se describió para el compuesto en la etapa 2 a partir de acetato de t-butilo (1,16 g) y 1,6-diyodohexano (4,06 g) en forma de aceite (2,13 g). RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta: 3,20 (t, 8 Hz, 2H), 2,20 (t, 8 Hz, 2H), 1,75-1,85 (m, 2H), 1,55-1,65 (m, 2H), 1,45 (s, 9H), 1,25-1,43 (m, 6H).
Etapa 10 Preparación del 1-bencil-10-t-butil-diéster del ácido 2-ciclopentildecan-1,10-dioico
Mediante el uso del procedimiento tal como se describió en la etapa 2, se hicieron reaccionar el éster (6,92 g) de la etapa 1 y el yodoéster (11,37 g) de la etapa 9 para proporcionar el aceite del compuesto del título (7,44 g). RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta: 7,35 (m, 5H), 5,10 (s, 2H), 2,20 (m, 3H), 2,00 (m, 1H), 1,45 (s, 9H), 1,0-1,9 (m, 20H).
Etapa 11 Preparación del 1-bencil-10-metil-diéster del ácido 2-ciclopentildecan-1,10-dioico
Se agitó una solución del diéster de la etapa 10 (2,86 g, 7 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (30 ml) y 10 ml de TFA al 90% durante 30 min. Se disolvió el producto obtenido tras evaporación en una mezcla de CH_{2}Cl_{2} (10 ml) y MeOH (6 ml). Se agitó la solución a -20ºC y se le añadió lentamente cloruro de tionilo (6 ml) a lo largo de un periodo de 2 h. Se evaporó el disolvente y se disolvió el residuo en éter dietílico (20 ml). La fase orgánica se lavó sucesivamente con una solución saturada de NaHCO_{3}, agua y salmuera, se evaporó y se purificó por cromatografía ultrarrápida en gel de sílice (eluyente: EtOAc-hexano al 2%) para proporcionar el producto como un aceite (2,05 g). RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta: 7,35 (m, 5H), 5,10 (s, 2H), 3,65 (s, 3H), 2,30 (t, 8 Hz, 2H), 2,20 (m, 1H), 2,00 (m, 1H), 1,10-1,90 (m, 10H).
Etapa 12 Preparación del 10-metiléster del ácido 2-ciclopentildecan-1,10-dioico
Mediante el uso del procedimiento tal como se describió en la etapa 5, se convirtió el compuesto (4,96 g) de la etapa 11 en el compuesto del título (3,66 g) en forma de aceite. RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta: 3,65 (s, 3H), 2,30 (t, 8 Hz, 2H), 2,15 (m, 1H), 2,00 (m, 1H), 1,10-1,19 (m, 20H).
Etapa 13 Preparación de la sal sódica del ácido 6-cianohexano-1-sulfínico
18
Se colocó una solución de 1-bromo-6-cianohexano (8,04 g, 42,3 mmol) en un matraz de tres cuellos, provisto de un condensador de agua, un agitador mecánico y un embudo de goteo, en 75 ml de etanol al 95%. Se calentó la mezcla hasta que refluyera y se le añadió lentamente una solución de sulfito sódico (8,00 g, 63,5 mmol) en 50 ml de H_{2}O a lo largo de un periodo de 30 min. Se calentó la mezcla durante 2 h y luego se concentró a presión reducida. Se disolvió el residuo en EtOH al 95% (200 ml), se calentó hasta que hirviera y se filtró. Se concentró el producto filtrado y se enfrió en un baño de hielo. El precipitado se recogió por filtración y se secó para proporcionar 3,00 g de un sólido blanco. Por concentración adicional, la lejía madre produjo otro lote de 2,2 g del producto. RMN ^{1}H (300 MHz, DMSO-d_{6}) \delta: 2,50 (t, j = 8 Hz, 2H), 2,40 (t, 8 Hz, 2H), 1,55 (m, 4H), 1,3 (m, 4H).
Etapa 14 Preparación de cloruro de 6-cianohexano-1-sulfonilo
Una mezcla del producto de la etapa 13 (0,340 g, 1,6 mmol), cloruro de tionilo (0,95 g, 8 mmol) y una gota de DMF se calentó a 75-80ºC durante 30 min. Después de que se enfriara, se eliminó el disolvente y se trató el residuo con agua helada (5 ml). Se sometió la fase orgánica a extracción en 30 ml de éter y la fase orgánica combinada se lavó con una solución de NaHCO_{3} al 3% y agua, se secó (MgSO_{4}) y se filtró. El producto filtrado se trató con carbón activado (Darco), se filtró y se concentró para proporcionar un aceite incoloro (0,240 g) que se usó sin purificación adicional.
Los ejemplos 14-38 describen las síntesis de los inhibidores de la MCP que aparecen listados en la tabla 5. Las condiciones de purificación correspondientes aparecen listadas en la tabla 6.
TABLA 5 Inhibidores de la proteasa multicatalítica
19
Ej. Nº R n W X Y Z CI_{50}nM
14 NC- 8
20
NO_{2} (CH_{3})_{2}CH- o 7/6 15 NC- 8 '' PMC (CH_{3})_{2}CH- o 20 16 NC- 8 '' NO_{2} (CH_{3})_{2}CH- N- 100 NHCONH_{2}
TABLA 5 (continuación)
Ej. Nº R n W X Y Z CI_{50}nM
17 NC- 8 '' NO_{2} (CH_{3})_{2}CH- N-OH ...
18 NC- 8 '' NO_{2} (CH_{3})_{2}CH- N-OCH_{3} 700
19 NC- 8 '' NO_{2} (CH_{3})_{2}CH- N-O- ...
CH_{2}C_{6}H_{5}
20 MeOOC- 7 '' PMC (CH_{3})_{2}CH- o 10
21 MeOOC- 7 '' MTR (CH_{3})_{2}CH- o 30
22 MeOOC- 7 '' PMC CH_{3}CH_{2}CH_{2}- o 110
23 MeOOC- 7 '' NO_{2} (CH_{3})_{2}CH- o 5
24 C_{6}H_{4}(CO)_{2}N- 8 '' NO_{2} (CH_{3})_{2}CH- o 2
25 CF_{3}-SO_{2}NH- 8 '' NO_{2} (CH_{3})_{2}CH- o 8/5
26 MeOOC- 6 H NO_{2} (CH_{3})_{2}CH- o 40
27 MeOOC- 6 H NO_{2} C_{6}H_{5} o 130
28 MeOOC- 6 H PMC (CH_{3})_{2}CH- o 20
29 MeOOC- 6 H PMC CH_{3}CH_{2}- o >300
30 MeOOC- 6 H PMC CH_{3}CH_{2}CH_{2}- o >100
31 MeOOC- 6 H TOS (CH_{3})_{2}CH- o 75
32 MeOOC- 6 H MTR (CH_{3})_{2}CH- N- 220
NHCONH_{2}
33 MeOOC- 6 H MTR (CH_{3})_{2}CH- N- 700
NHCONH_{2}
34 MeOOC- 6 H MTR (CH_{3})_{2}CH o 80
35 MeOOC- 6 H MTS (CH_{3})_{2}CH o 40
21
22 
\newpage
TABLA 5 (continuación)
R-(CH_{2})_{m}-(
\delm{C}{\delm{\para}{W}}
H)_{n}-Y–
\uelm{N}{\uelm{\para}{H}}
–
\delm{C}{\delm{\para}{X}}
H– 
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}
–
\uelm{N}{\uelm{\para}{H}}
-
\delm{C}{\delm{\para}{CH _{2} -CH(CH _{3} ) _{2} }}
H-CHO
Ej. Nº R m n W X Y CI_{50}nM
36 NC- 5 1 H PMC-NH-C(=NH)-NH-(CH_{2})_{3}- -SO_{2}- >100
37 \beta- 0 0 - O_{2}N-NH-C(=NH)-NH-(CH_{2})_{3}-
24
250 Naftilo 38 H 5 1 H O_{2}N-NH-C(=NH)-NH-(CH_{2})_{3}-
25
... CBZ-N-
TABLA 6
Ej. Compuesto Gradiente de Tpo. de Peso (M +
Nº HPLC (Tiempo de ret. molec. H)^{+}
ret. del pico analít.
recogido) en min.
14 10-ciano-2-ciclopentil-decanoil-N^{g}-nitro-L- 45-75% B (10,63) 22,5 563,75 564
arginil-L-leucinal
15 10-ciano-2-ciclopentil-decanoil-N^{g}-(2,2,5,7,8- 43-100% B (22,0) 31,7 785,2 786
pentametilcroman-6-sulfonil)-L-arginil-L-leucinal
16 semicarbazona de 10-ciano-2-ciclopentil-decanoil- 30-35% B 60 min 22,2 621 621
N^{g}-nitro-L-arginil-L-leucinal (A=30,0, B=32,0) 22,7
17 oximo de 10-ciano-2-ciclopentil-decanoil-N^{g}- 45-65% B (12,3) 24,8 578,7 579
nitro-L-arginil-L-leucinal
18 10-ciano-2-ciclopentil-decanoil-N^{g}-nitro-L- 55-75% B 27,7 592,7 593
arginil-L-leucinal-O-metiloximo (A=8,9, B=10,12)
19 10-ciano-2-ciclopentil-decanoil-N^{g}-nitro-L-arginil-L- 65-75% B 31,3 668,7 669
leucinal-O-benciloximo (A=8,3, B=9,5)
20 9-metoxicarbonil-2-ciclopentil-nonanoil-N^{g}- 60-100% B (14,1) 32,0 804,11 805
(2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonil)-L-
arginil-L-leucinal
21 9-metoxicarbonil-2-ciclopentil-nonanoil-N^{g}-(4- 40-60% B (29,9) 28,9 749 750
metoxi-2,3,6-trimetilbenceno-1- sulfonil)-L-
arginil-L-leucinal
22 9-metoxicarbonil-2-ciclopentil-nonanoil-N^{g}- 60-70% B (18,8) 32,2 804 804
(2,2,5,7,8-pentametilcroman-6- sulfonil)-L-
arginil-L-norleucinal
TABLA 6 (continuación)
Ej. Compuesto Gradiente de Tpo. de Peso (M +
Nº HPLC (Tiempo de ret. molec. H)^{+}
ret. del pico analít.
recogido) en min.
23 9-metoxicarbonil-2-ciclopentil-nonanoil-N^{g}-nitro- 40-70% B (13,98) 23,6 582,34 583
L-arginil-L-leucinal
24 2-ciclopentil-10-N-ftalimido-decanoil-N^{g}-nitro-L- 50-80% B (12,66) 27,89 683,86 684
arginil-L-leucinal
25 10-(trifluorometanosulfonil)amino-2-ciclopentil- 50-70% B 27,20 686,02 686
decanoil-N^{g}-nitro-L-arginil-L-leucinal (A=12,1, B=12,9) 27,46
26 Monometilazelail-N^{g}-nitro-L-arginil-L-leucinal 30-100% B (8,14) 17,06 501 501
27 Monometilazelail-N^{g}-nitro-L-arginil-L-fenilalaninal 10-100% B (16,9) 17,3 534 535
28 Monometilazelail-N^{g}-(2,2,5,7,8-pentametilcroman- 10-100% B (11,7) 26,5 722 723
6-sulfonil)-L-arginil-L-leucinal
29 Monometilazelail-N^{g}-(2,2,5,7,8-pentametilcroman- 40-70% B (16,2) 26,3 722 723
6-sulfonil)-D-arginil-L-leucinal
30 Monometilazelail-N^{g}-(2,2,5,7,8-pentametilcroman- 50-60% B (14,0) 26,2 722 723
6-sulfonil)-L-arginil-L-norleucinal
31 Monometilazelail-N^{g}-(p-toluenosulfonil)-L- 40-50% B (19,6) 21,3 610 610
arginil-L-leucinal
32 Semicarbazona de monometilazelail-N^{g}-(4-metoxi- - 13,2 724 725
2,3,6-trimetil-1-sulfonil)-L-arginil-L-leucinal
33 Tiosemicarbazona de monometilazelail-N^{g}-(4-metoxi - 23,4 741 741
-2,3,6-trimetil-1-sulfonil)-L-arginil-L-leucinal
34 Monometilazelail-N^{g}-(4-metoxi-2,3,6- 40-44% B (60 min) 23,3 668 669
trimetilbenceno-1-sulfonil)-L-arginil-L-leucinal (16,9)
35 Metoxiazelaoil-N^{g}-(2,4,6-trimetilbenceno-1- 40-60% B (14,1) 32,0 638 638
sulfonil)-L-arginil-L-leucinal
36 6-ciano-hexano-1-sulfonil-N^{g}-(2,2,5,7,8- 45-75% B (13,74) 24,94 710,9 711
pentametilcroman-6-sulfonil)-L-arginil-L-leucinal
37 2-naftoil-N^{g}-nitro-L-arginil-L-leucinal 35-55% B (9,16) 18,10 470,51 471
38 CBZ-7-aminoheptanoil-N^{g}-nitro-L-arginil-L- 30-60% B 19,1 577 578
leucinal (A=13,3, B=13,9)
Condiciones de HPLC
Disolvente A: agua que contiene TFA al 0,1%
Disolvente B: acetonitrilo que contiene TFA al 0,1%
Detección: 215 nm
Los gradientes de HPLC se llevan a cabo en 40 min. a menos que se indique lo contrario.
Tipo de columna:
\hskip1cm Zorbax R_{2}-C_{8}
\hskip1cm Dimensiones 4,6 mm x 250 mm
\hskip1cm Tamaño de poro 80 \ring{A}ngstrom
\hskip1cm Tamaño de partícula 5 micrómetros
Ejemplo 14 10-ciano-2-ciclopentil-decanoil-N^{g}-nitro-L-arginil-L-leucinal
26
Etapa 1 Dietilacetal de fluorenilmetiloxicarbonil- N^{g}-nitro-L-arginil-L-leucinal
Se unió Fmoc-Arg(NO_{2})-OH (4,41 g, 10 mmol) con Leu-acetal (1,89 g, 10 mmol) según el procedimiento A (ejemplo 7), mediante el uso de 1,29 ml de IBCF, 2,2 ml de NMM y 10 ml de THF (en lugar de DMF como en el procedimiento A del ejemplo 7). Se obtuvo el péptido crudo en forma de un sólido amorfo. RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta; 7,75 (d, 2H), 7,55 (d, 2H), 7,4 (m, 2H), 7,29 (m, 2H), 6,21 (d, 1H), 5,91 (d, 1H), 4,30 (m, 5H), 3,66 (m, 3H), 3,63 (d, 2H), 3,32 (m, 2H), 1,72 (m, 4H), 1,29 (m, 2H), 1,17 (b, 6H), 0,89 (m, 6H).
Etapa 2 Dietilacetal de N^{g}-nitro-L-arginil-L-leucinal
Se eliminó el grupo Fmoc de 3,5 g del producto de la etapa 1 mediante el uso del procedimiento de desprotección B (ejemplo 8). Se obtuvo la base libre (2,5 g) en forma de un semisólido. RMN ^{1}H (300 MHz, DMSO-d_{6}) \delta; 8,6 (b, 1H), 7,61 (d, 1H), 4,27 (d, 1H), 3,90 (m, 1H), 3,59 (m, 1H), 3,45 (m, 4H), 3,14 (m, 2H), 1,54 (m, 4H), 1,33 (m, 3H), 1,10 (tt, 6H), 0,83 (dd, 6H).
Etapa 3 Dietilacetal de 10-ciano-2-ciclopentil-decanoil-N^{g}-nitro-L-arginil-L-leucinal
Según el procedimiento C (ejemplo 9) se trató ácido 10-ciano-2-ciclopentil-decanoico (2 g, 7,5 mmol) del procedimiento G en 16 ml de DMF con el producto de la etapa 2 (2,15 g, 5,5 mmol) mediante el uso de BOP (3,34 g, 7,5 mmol) y HOBt (1,01 g, 7,5 mmol) para producir el péptido crudo (3,85 g) en forma de un sólido de color amarillo pálido. RMN ^{1}H (300 MHz, DMSO-d_{6}) \delta; 8,31 (bd, 1H), 8,0 (bd, 1H), 7,83 (d, 1H), 4,34 (m, 1H), 4,24 (d, 1H), 3,91 (m, 1H), 3,56 (m, 4H), 3,43 (m, 2H), 3,16 (m, 2H), 2,47 (t, 3H), 2,03 (m, 1H), 1,76 (m, 2H), 1,15-2,0 (m, 25H), 1,07 (m, 6H), 0,81 (d, 6H).
Etapa 4
Se agitó una solución del producto de la etapa 3 (0,2 g) en 10 ml de acetonitrilo (ACN) que contenía TFA al 30% durante 1 h, y se evaporó el disolvente y se precipitó el compuesto 14 mediante el uso de éter dietílico. Las condiciones de la purificación por HPLC se proporcionan en la tabla 6. RMN ^{1}H (300 MHz, DMSO-d_{6}) \delta; 9,38 (s, 1H), 8,56 (b, 1H), 8,3 (d, 1H), 7,99 (dd, 1H), 4,38 (m, 1H), 4,17 (m, 1H), 3,37 (m, 4H), 3,17 (m, 2H), 2,26 (t, 3H), 1,0-2,0 (m, 27H), 0,86 (dd, 6H).
Ejemplo 15 10-ciano-2-ciclopentil-decanoil-N^{g}-(2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonil)-L-arginil-L-leucinal
27
Etapa 1 Dietilacetal de 10-ciano-2-ciclopentil-decanoil-N^{g}-(2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonil)-L-arginil-L-leucinal
Siguiendo el procedimiento C (ejemplo 9), se unió ácido 10-ciano-2-ciclopentil-decanoico (2 mmol, de la etapa 5 en el procedimiento G del ejemplo 13) con dietilacetal de N^{g}-(2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonil)-L-arginil-L-leucinal (1,8 mmol, de la etapa 2 en el compuesto 14) para obtener el compuesto en forma de un sólido.
Etapa 2 10-ciano-2-ciclopentil-decanoil-N^{g}-(2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonil)-L-arginil-L-leucinal
Siguiendo el procedimiento E (ejemplo 11), se convirtió el producto de la etapa 1 (0,3 g) en el compuesto 15 (0,2 g) y se purificó por HPLC. RMN ^{1}H (300 MHz, DMSO-d_{6}) \delta; 9,38 (s, 1H), 8,23 (d, 1H), 7,8 (s, 1H), 7,72 (d, 1H), 7,49 (t, 1H), 7,48 (s, 1H), 4,34 (m, 1H), 4,14 (m, 1H), 3,05 (m, 2H), 2,60 (t, 2H), 2,50 (s, 3H), 2,46 (s, 3H), 2,25 (m, 4H), 2,00 (s, 3H), 1,74 (t, 2H), 1,6-1,0 (m, 25H), 1,13 (s, 6H), 0,82 (dd, 6H).
Ejemplo 16 Semicarbazona de 10-ciano-2-ciclopentil-decanoil-N^{g}-nitro-L-arginil-L-leucinal
28
Se añadieron clorhidrato de semicarbazida (0,20 mmol), acetato de sodio (0,3 mmol) y agua (0,5 ml) a una solución del compuesto 14 (0,050 g, 0,089 mmol) en 4,5 ml de etanol y se agitó por la noche a temperatura ambiente. Se eliminó el disolvente y se purificó el compuesto 16 obtenido por HPLC como se indica en la tabla 6. RMN ^{1}H (300 MHz, DMSO-d_{6}) \delta; 9,91 (s, 1H), 8,51 (s, 2H) 8,04 (d, 1H), 7,95 (d, 1H), 7,40 (s, 1H), 7,09 (d, 1H), 6,29 (s, 2H), 4,44 (m, 1H), 4,33 (m, 1H), 3,16 (s, 2H), 2,08-1,00 (m, 33H), 0,87 (dd, 6H).
Ejemplo 17 Oximo de 10-ciano-2-ciclopentil-decanoil-N^{g}-nitro-L-arginil-L-leucinal
29 
\newpage
Se añadió clorhidrato de hidroxilamina (0,037 g, 0,534 mmol) a una solución del producto de la etapa 4 en el ejemplo 14 (0,05 g, 0,089 mmol) en piridina (0,175 g, 2,2 mmol) a temperatura ambiente y luego a 80ºC durante 30 minutos. Se aisló el producto por HPLC como se indica en la tabla 6.
Ejemplo 18 10-ciano-2-ciclopentil-decanoil-N^{g}-nitro-L-arginil-L-leucinal-O-metiloximo
30
Siguiendo el procedimiento del ejemplo 17, se preparó el compuesto 18 mediante el uso de clorhidrato de O-metilhidroxilamina (0,031 g, 0,38 mmol) y se aisló como una mezcla de dos picos por HPLC como se indica en la tabla 6.
Ejemplo 19 10-ciano-2-ciclopentil-decanoil-N^{g}-nitro-L-arginil-L-leucinal-O-benciloximo
31
Siguiendo el procedimiento tal como en la preparación del ejemplo 17, se preparó el compuesto 19 mediante el uso de compuesto 14 (0,05 g, 0,89 mmol), clorhidrato de O-bencilhidroxilamina (0,043 g, 0,267 mmol) y piridina (0,092 ml, 1,14 mmol). El compuesto se separó según dos picos en las purificaciones por HPLC.
Ejemplo 20 9-metoxicarbonil-2-ciclopentil-nonanoil-N^{g}-(2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonil)-L-arginil-L-leucinal
32
Etapa 1 Dietilacetal de Fmoc-N^{g}-(2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonil)-L-arginil-L-leucinal
Siguiendo el procedimiento C (ejemplo 9), se unió Fmoc-N^{g}-(2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonil)-L-arginina (3,31 g, 5 mmol) con dietilacetal de L-leucinal (0,85 g, a partir del procedimiento F, ejemplo 12) mediante el uso de BOP (2,21 g, 5 mmol), HOBt (0,67 g, 5 mmol) y NMM (0,7 ml) en 12 ml de DMF para producir el acetal dipeptídico (3,24 g). RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta; 7,89 (s, 1H), 7,78 (d, 2H), 7,6 (d, 2H), 7,4 (t, 2H), 7,31 (t, 3H), 6,4 (d, 2H), 5,92 (d, 1H), 4,58 (m, 1H), 4,43 (m, 1H), 4,35 (m, 3H), 3,69 (m, 2H), 3,53 (m, 2H), 3,30 (m, 2H), 2,6 (t, 2H), 2,58 (s, 6H), 2,12 (s, 3H), 1,80 (tt, 2H), 1,64 (m, 3H), 1,32 (m, 10H), 1,18 (q, 6H), 0,89 (t, 6H).
Etapa 2 N^{g}-(2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonil)-L-arginil-L-leucinal
Siguiendo el procedimiento B (ejemplo 8), se eliminó el grupo Fmoc del producto (1,6 g) de la etapa 1, para producir un semisólido (1,3 g). RMN ^{1}H (300 MHz, DMSO-d_{6}) \delta; 7,6 (d, 1H), 6,76 (b, 1H), 6,46 (b, 1H), 4,27 (d, 1H), 3,9 (m, 1H), 3,58 (m, 1H), 3,44 (m, 4H), 3,11 (t, 1H), 3,01 (m, 2H), 2,58 (t, 2H), 2,47 (s, 6H), 2,03 (s, 3H), 1,77 (t, 2H), 1,5 (m, 5H), 1,26 (s, 6H), 1,09 (m, 6H), 0,83 (dd, 6H).
Etapa 3 Diacetal de 9-metoxicarbonil-2-ciclopentil-nonanoil-N^{g}-(2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonil)-L-arginil-L-leucinal
Siguiendo el procedimiento C (ejemplo 9), se unió ácido 9-metoxicarbonil-2-ciclopentil-nonanoico (0,56 g) con dietilacetal de N^{g}-(2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonil)-L-arginil-L-leucinal (0,7 g, 1,1 mmol) mediante el uso de BOP (0,66 g, 1,5 mmol), HOBt (0,202 g, 1,5 mmol) y NMM (2,2 ml, 2 mmol) en 5 ml de DMF para obtener el producto (1,8 g) en forma de sólido. RMN ^{1}H (300 MHz, DMSO-d_{6}) \delta: 7,5-8,0 (m, 2H), 6,66 (m, 1H), 6,4 (m, 1H), 4,32 (m, 1H), 4,24 (d, 1H), 3,93 (m, 1H), 3,57 (m, 6H), 3,44 (m, 4H), 3,04 (m, 2H), 2,59 (t, 2H), 2,48 (s, 6H), 2,28 (m, 3H), 2,03 (s, 3H), 1,77 (t, 2H), 1,48 (m, 22H), 1,26 (s, 6H), 1,1 (tt, 9H), 0,81 (dd, 6H).
Etapa 4 9-metoxicarbonil-2-ciclopentil-nonanoil-N^{g}-(2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonil)-L-arginil-L-leucinal
Según el procedimiento E (ejemplo 11), se convirtió el producto (0,2 g) de la etapa 1 en el compuesto 20 y se purificó directamente por HPLC. RMN ^{1}H (300 MHz, DMSO-d_{6}) \delta; 9,37 (s, 1H), 8,2-7,4 (m, 2H), 6,69 (drm, 1H), 6,4 (brm, 1H), 4,3 (m, 2H), 3,58 (s, 3H), 3,03 (m, 2H), 2,60 (t, 2H), 2,48 (s, 6H), 2,26 (m, 4H), 2,03 (s, 3H), 1,77 (t, 2H), 1,47 (brm, 28H), 1,24 (s, 3H), 0,80 (dd, 6H).
Ejemplo 21 9-metoxicarbonil-2-ciclopentil-nonanoil-N^{g}-(4-metoxi-2,3,6-trimetilbenceno-1-sulfonil)-L-arginil-L-leucinal
33
Etapa 1 Dietilacetal de 9-metoxicarbonil-2-ciclopentil-nonanoil-N^{g}-(4-metoxi-2,3,6-trimetilbenceno-1-sulfonil)-L-arginil-L-leucinal
Siguiendo el procedimiento C (ejemplo 9), se unió ácido 9-metoxicarbonil-2-ciclopentil-nonanoico (1,2 mmol, de la etapa 12 en el procedimiento G) con dietilacetal de N^{g}-(4-metoxi-2,3,6-trimetilbenceno-1-sulfonil)-L-arginil-L-leucinal (1,0 mmol) para producir el péptido en forma sólida.
Etapa 2
Siguiendo el procedimiento E (ejemplo 11), el acetal de la etapa 1 se convirtió en el compuesto 21 y se purificó por HPLC. ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}/DMSO-d_{6}) \delta; 9,42 (s, 1H), 8,25 (d, 1H), 7,92 (d, 1H), 7,84 (s, 1H), 6,4 (m, 2H), 4,40 (m, 1H), 4,20 (m, 1H), 3,80 (s, 3H), 3,57 (s, 3H), 3,26 (m, 2H), 2,64 (s, 3H), 2,55 (s, 3H), 2,36 (m, 2H), 2,07 (s, 3H), 1,8-1,0 (m, 30H), 0,87 (dd, 6H).
Ejemplo 22
34
9-metoxicarbonil-2-ciclopentil-nonanoil-N^{g}-(2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonil)-L-arginil-L-norleucinal Etapa 1 Dietilacetal de 9-metoxicarbonil-2-ciclopentil-nonanoil-N^{g}-(2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonil)-L-arginil-L-norleucinal
Siguiendo el procedimiento C (ejemplo 9), se unió ácido 9-metoxicarbonil-2-ciclopentil-nonanoico (1 mmol) con dietilacetal de N^{g}-(2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonil)-L-arginil-L-norleucinal (0,69 mmol, obtenido de la etapa 1 en el ejemplo 30 siguiendo el procedimiento B) mediante el uso de BOP (1 mmol), HOBt (1 mmol) y NMM (2,5 mmol) en 5 ml de DMF. Se agitó la mezcla de reacción durante 4,5 horas y se aisló el péptido (0,37 g, 0,42 mmol).
Etapa 2 9-metoxicarbonil-2-ciclopentil-nonanoil-N^{g}-(2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonil)-L-arginil-L-norleucinal
Según el procedimiento E (ejemplo 11), el producto (0,37 g, 0,42 mmol) de la etapa 1 se convirtió en el compuesto 22 (0,33 g) y se purificó por HPLC. RMN ^{1}H (300 MHz, DMSO-d_{6}) \delta: 9,29 (s, 1H), 7,79 (d, 1H), 7,89 (d, 1H), 7,31 1H), 7,26 (s, 2H), 4,17 (m, 1H), 3,94 (m, 1H), 3,49 (s, 3H), 2,94 (m, 2H), 2,74 (t, 2H), 2,51 (t, 2H), 2,37 (s, 6H), 2,20 (m, 4H), 1,94 (s, 3H), 1,14 (s, 6H), 1,0-1,8 (m, 3 H), 0,74 (t, 3H).
Ejemplo 23 9-metoxicarbonil-2-ciclopentil-nonanoil-N^{g}-nitro-L-arginil-L-leucinal
35
Etapa 1 Dietilacetal de 9-metoxicarbonil-2-ciclopentil-nonanoil-N^{g}-nitro-L-arginil-L-leucinal
Siguiendo el procedimiento C (ejemplo 9), se unió ácido 9-metoxicarbonil-2-ciclopentil-nonanoico (0,66 g, 0,33 mmol) con el producto de la etapa 2 en el ejemplo 14 (0,109 g, 0,28 mmol) mediante el uso de BOP (0,146 g, 0,33 mmol), HOBt (0,0449 g, 0,33 mmol) y NMM (0,105, 0,95 mmol) en 7 ml de DMF para producir el compuesto del titulo de la etapa 1 (0,124 g). RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta: 8,31 (m, 2H), 6,69 (br d, 1H ), 6,15 (br d, 1H), 4,5 (m, 1H), 4,33 (m, 1H), 4,18 (m, 1H), 3,67 (s, 3H), 3,53 (m, 4H), 3,32 (m, 2H), 2,68 (m, 2H), 2,29 (t, 3H), 2,0-1,0 (b m, 34H), 0,90 (dd, 6H).
Etapa 2
Siguiendo el procedimiento E (ejemplo 11), se convirtió el péptido (de la etapa 1, 0,124 g) en el compuesto 23 (0,106 g). RMN ^{1}H (300 MHz, DMSO-d_{6}) \delta: 9,39 (s, 1H), 8,54 (m, 1H), 8,31 (d, 1H), 7,99 (br d, 2H), 4,36 (m, 1H), 4,15 (m, 1H), 3,33 (s, 3H), 3,16 (m, 2H), 2,27 (t, 2H), 2,03 (m, 2H), 1,0-1,7 (m, 28H), 0,83 (dd, 6H).
Ejemplo 24 2-ciclopentil-10-N-ftalimido-decanoil-N^{g}-nitro-L-arginil-L-leucinal
36
Etapa 1 Dietilacetal de 2-ciclopentil-10-N-ftalimido-decanoil-N^{g}-nitro-L-arginil-L-leucinal
Siguiendo el procedimiento C (ejemplo 9), se unió el producto (0,25 g, 0,65 mmol) de la etapa 6 en el procedimiento G (ejemplo 13) al producto de la etapa 2 en el ejemplo 14 (0,195 g, 0,5 mmol) mediante el uso de BOP (0,288 g, 0,65 mmol), HOBt (0,088 g, 0,65 mmol) y NMM (0,130 ml, 0,130 mmol) en 5 ml de DMF para obtener el compuesto del título (0,557 g) en forma de un sólido. RMN ^{1}H (300 MHz, DMSO-d_{6}) \delta;: 8,57 (br m, 1H), 7,91 (d, 1H), 7,85 (br d, 4H), 7,55 (d, 1H), 4,32 (m, 1H), 4,23 (dd, 1H), 3,90 (m, 1H), 3,55 (t, 3H), 3,43 (m, 4H), 3,14 (m, 2H), 2,0 (br m, 1H), 1,74 (br m, 2H), 2,0-1,15 (2 br m, 28H), 1,09 (tt, 6H), 0,79 (dd, 6H).
Etapa 2 2-ciclopentil-10-N-ftalimido-decanoil-N^{g}-nitro-arginil-L-leucinal
Mediante el uso del procedimiento E (ejemplo 11), se convirtió el producto de la etapa 1 (0,45 g) en el compuesto 24 (0,32 g). RMN ^{1}H (300 MHz, DMSO-d_{6}) \delta: 9,38 (s, 1H), 8,31 (d, 1H), 8,00 (d, 1H), 7,85 (m, 4H), 4,38 (m, 1H), 4,15 (1, 1H), 3,57 (tt, 3H), 3,15 (m, 2H), 2,00 (m, 1H), 1,9-1,0 (br m, 30H), 0,86 (dd, 6H).
Ejemplo 25 10-(trifluorometanosulfonil)amino-2-ciclopentil-decanoil-N^{g}-nitro-L-arginil-L-leucinal
37
Etapa 1 Dietilacetal de 10-(trifluorometanosulfonil)amino-2-ciclopentil- decanoil-N^{g}-nitro-L-arginil-L-leucinal
Mediante el procedimiento C (ejemplo 9), se unió ácido 10-(trifluorometanosulfonil)-amino-2-ciclopentil-decanoico (0,199 g, 0,51 mmol) al producto de la etapa 2 en el ejemplo 14 (0,175 g, 0,45 mmol) mediante el uso de BOP (0,22 g, 0,51 mmol), HOBt (0,069 g, 0,51 mmol) y NMM (0,052 ml, 0,47 mmol) en 5 ml de DMF. Se obtuvo el acetal en forma de un sólido (0,42 g). RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta: 6,06 (br m, 1H), 5,81 (m, 1H), 4,53 (m, 1H), 4,32 (d, 1H), 4,13 (m, 1H), 3,73 (q, 4H), 3,53 (m, 2H), 3,30 (q, 3H), 2,0-1,0 (2 br m, 36H), 0,9 (dd, 6H).
Etapa 2 10-(trifluorometanosulfonil)amino-2-ciclopentil-decanoil-N^{g}-nitro-L-arginil-L-leucinal
Siguiendo el procedimiento E (ejemplo 11), se convirtió el producto de la etapa 1 (0,35 g) en el compuesto 25 (0,17 g). RMN ^{1}H (300 MHz, DMSO-d_{6}) \delta: 9,27 (s, 1H), 8,46 (br m, 1H), 4,30 (m, 1H), 3,87 (m, 1H), 3,09 (m, 5H), 2,8-1,0 (2 br m, 30H), 0,78 (dd, 6H).
Ejemplo 26 Monometilazelail-N^{g}-nitro-L-arginil-L-leucinal
38
Etapa 1 Dietilacetal de monometilazelail-N^{g}-nitro-L-arginil-L-leucinal
Siguiendo el procedimiento C (ejemplo 9), se preparó el compuesto del título mediante el uso de monometiléster del ácido azelaico (0,708 g, 3,5 mmol), BOP, (1,55 g, 3,5 mmol), HOBt (0,47 g, 3,5 mmol), NMM (0,38 ml, 3,5 mmol), dietilacetal de N^{g}-nitro-L-arginil-L-leucinal (obtenido de la etapa 2 en el ejemplo 14 siguiendo el procedimiento B ejemplo 8) (1,306 g, 3,5 mmol) en 12 ml de DMF. Se obtuvo el péptido en forma de un sólido amorfo (2,17 g). RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta: 6,58 (d, 1H), 6,04 (d, 1H), 4,47 (m, 1H), 4,30 (d, 1H), 4,17 (m, 1H), 3,67 (s, 3H), 3,53 (m, 2H), 3,2-3,4 (t, d, 2H), 2,3 (m, 3H), 2,2 (t, 1H), 1,83 (m, 1H), 1,2-1,8 (m, 24H), 1,2 (m,3H), 0,9 (d, 3H).
Etapa 2 Monometilazelail-N^{g}-nitro-L-arginil-L-leucinal
Mediante el uso del procedimiento E (ejemplo 11), se convirtió el acetal de péptido (de la etapa 1) (250 mg) en el compuesto 26 (0,22 g). RMN ^{1}H (300 MHz, DMSO-d_{6}) \delta: 9,38 (s, 1H), 7,73 (d, 1H), 4,30 (m, 1H), 4,09 (m, 1H), 3,57 (s, 3H), 3,15 (m, 2H), 3,01 (q, 1H), 2,75 (m, 1H), 2,24 (m, 7H), 1,50 (m, 12H), 1,24 (b, 14H), 0,86 (m, 6H).
Ejemplo 27 Monometilazelail-N^{g}-nitro-L-arginil-L-fenilalaninal
39
Etapa 1 Dietilacetal de fenilalaninal
Se convirtió CBZ-Phe-OH (6,0 g, 2 mmol) en dietilacetal de fenilalaninal siguiendo el mismo procedimiento que se usó en el dietilacetal de leucinal (procedimiento F, ejemplo 12).
Etapa 2 Fmoc-Arg(NO_{2})-OH
Se añadió una solución de fluorenilmetiloxicarbonil-N-hidroxisuccinimidiléster (32 mmol) en 60 ml de THF a una solución en agitación de N^{g}-nitro-L-arginina (35 mmol) y NaHCO_{3} (70 mmol) en 70 ml de H_{2}O. La solución lechosa se aclaró al cabo de 1 h y se acidificó la solución con ácido cítrico sólido hasta pH 2-3 y se sometió a extracción con 300 ml de EtOAc. Se lavó la fase orgánica una vez con agua, se secó y se evaporó para producir el compuesto en forma de un sólido blanco (26,8 mmol).
Etapa 3 Fmoc-Arg(NO_{2})-resina
Se mezcló una solución de 9- fluorenilmetiloxicarbonil- N^{g}-nitro-L-arginina (de la etapa 2, 26,8 mmol), BOP (30 mmol), HOBt (30 mmol) y NMM (55 mmol) en 40 ml de DMF con 10 g de una resina PAC (conector á-metilfenacilo unido a poliestireno-1% divinilbenceno, sustitución 0,97 mmol/g, proporcionado por Bachem Bioscience, Inc, King of Prussia, PA) y se agitó durante 4 h. Se filtró la resina, se lavó con DMF, DCM, y MeOH y se secó para producir el producto final Fmoc-Arg(NO_{2})-resina (11,1 g). Se trató la resina, Fmoc-Arg(NO_{2})-resina (11,1 g), con 100 ml de una solución que contenía piperidina (30%), DMF (35%) y tolueno (35%) y se agitó durante 2,5 horas. La resina con el Fmoc eliminado se filtró y se lavó consecutivamente con DCM/DMF (50:50) y MeOH para producir el producto
(9,2 g).
Etapa 4 MeOAz:Arg(NO_{2})-resina
Se añadió monometilazelato (20 mmol) a una suspensión en agitación de la Arg(NO_{2})-resina (9,2 g), BOP (20 mmol), HOBt (20 mmol) y NMM (para ajustar el pH a 8). Después de agitarse durante la noche, se añadió una mezcla de monometilazelato (10 mmol), BOP (10 mmol), HOBt (10 mmol), y NMM (20 mmol) y se agitó durante 24 horas. Se lavó la resina con DMF, DCM y metanol para producir 10,56 g de la resina.
Etapa 5 Monometilazelail-N^{g}-nitro-L-arginina
Se agitó el producto de la etapa 4 (10,56 g) durante 5 h en una solución de 100 ml de DCM (67%), TFA (30%) y anisol (3%). Se filtró la suspensión y se evaporó el disolvente y se trituró con éter para producir el péptido (1,11 g, 2,75 mmol).
Etapa 6 Dietilacetal de monometilazelail-N^{g}-nitro-L-arginil-L-fenilalaninal
Siguiendo el procedimiento C (ejemplo 9), se unió metoxiazelaoil-N^{g}-nitro-L-arginina (1 mmol) con dietilacetal de L-fenilalaninal (1,3 mmol) mediante el uso de BOP (1,3 mmol), HBOt (1,3 mmol) y NMM (para ajustar el pH a 8) para producir el péptido del título (0,82 mmol).
Etapa 7 Monometilazelail-N^{g}-nitro-L-arginil-L-fenilalaninal
Mediante el uso del procedimiento E (ejemplo 11), se convirtió el producto (0,82 mmol) de la etapa 6 en el compuesto del título (0,81 mmol). RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta: 9,59 (s, 1H), 8,36 (s, 1H), 7,49 (s, 1H), 7,31-7,09 (m, 7H), 6,71 (d, 1H), 4,69 (m, 1H), 4,60 (m, 1H), 3,66 (s, 3H), 3,41 (m, 2H), 3,27 (m, 2H), 2,31 (t, 2H), 2,2 (t, 2H), 1,80-1,2 (m, 14H).
Ejemplo 28 Monometilazelail-N^{g}-(2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonil)-L-arginil-L-leucinal
40
Etapa 1 Dietilacetal de monometilazelail-N^{g}-(2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonil)-L-arginil-L-leucinal
Siguiendo el procedimiento C (ejemplo 9), se unió monometilazelato (1,42 g, 7,0 mmol) con dietilacetal de
N^{g}-(2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonil)-L-arginil-L-leucinal (3,06 g, 5,0 mmol, obtenido de la etapa 2 en el ejemplo 20), mediante el uso de 7,0 ml de cada uno de BOP, HOBt y NMM para obtener el compuesto (3,43 g) en forma sólida. RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta: 6,58 (d, 1H), 6,04 (d, 1H), 5,4 (br, 1H), 5,06 (br, 1H), 4,47 (m, 1H), 4,30 (d, 1H), 4,17 (m, 1H), 3,67 (s, 3H), 3,53 (m, 4H), 3,23 (d, 1H), 3,19 (t, 2H), 2,30 (m, 2H), 2,2 (tt, 2H), 2,0-1,25 (2 br m, 17H), 1,20 (tt, 6H), 0,90 (dd, 6H).
Etapa 2 Monometilazelail-N^{g}-(2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonil)-L-arginil-L-leucinal
Mediante el uso del procedimiento E (ejemplo 11), se convirtió el producto (0,30 g) de la etapa 1 en el compuesto 28 (0,22 g). RMN ^{1}H (300 MHz, DMSO-d_{6}) \delta: 9,38 (s, 1H), 8,5 (br, 1H), 4,30 (m, 1H), 4,09 (m, 1H), 3,57 (s, 3H), 3,15 (m, 2H), 3,00 (t, 2H), 2,75 (m, 2H), 2,12 (t, 2H), 1,8-1,20 (2 br m, 17H), 0,86 (dd, 6H).
Ejemplo 29 Monometilazelail-N^{g}-(2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonil)-D-arginil-L-leucinal
41
Etapa 1 Dietilacetal de 9-fluorenilmetoxicarbonil-N^{g}-(2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonil)-D-arginil-L-leucinal
Siguiendo el procedimiento C (ejemplo 9) se unió 9- fluorenilmetoxicarbonil-N^{g}-(2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonil)-D-arginina (3 mmol) con dietilacetal de leucinal (2,5 mmol) mediante el uso de BOP (3 mmol), HOBt (3 mmol) y NMM (5 mmol) en 5 ml de DMF para producir el péptido (1,72 g, 2 mmol) en forma de un sólido.
Etapa 2 Dietilacetal de MeOAz-D-Arg(PMC)-leucinal
Mediante el uso del procedimiento C (ejemplo 9), se unió monometilazelato (1,0 mmol) con dietilacetal de
N^{g}-(2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonil)-D-arginil-L-leucinal (0,54 g, 0,88 mmol) obtenido del producto del título de la etapa 1 siguiendo el procedimiento B (ejemplo 8), mediante el uso de BOP (1 mmol), HBOt (1 mmol) y NMM (3 mmol) en 5 ml de DMF para producir el producto (0,735 g).
Etapa 3 Monometilazelail-N^{g}-(2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonil)-D-arginil-L-leucinal
Mediante el uso del procedimiento E (ejemplo 11), se convirtió el producto (0,1 g) de la etapa 2 en el compuesto 29 y se purificó por HPLC. RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta: 9,49 (s, 1H), 7,74 (t, 1H), 7,43 (d, 1H), 6,43 (d, 1H), 6,34 (s, 2H), 4,60 (m, 1H), 4,51 (s, 3H), 4,54 (s, 3H), 4,37 (m, 1H), 3,66 (s, 3H), 3,31 (m, 2H), 2,63 (t, 2H), 2,26 (m, 4H), 2,09 (s, 3H), 1,80 (t, 2H), 1,57 (m, 7H), 1,26 (m, 16H), 0,90 (dd, 6H).
Ejemplo 30 Monometilazelail-N^{g}-(2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonil)-L-arginil-L-norleucinal
42
Etapa 1 Fmoc-N^{g}-(2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonil)-L-arginil-L-norleucinal
Se unió Fmoc-Arg(PMC)-OH (2 mmol) con dietilacetal de norleucinal (2 mmol, obtenido de CBZ-Nle-OH siguiendo los procedimientos en la preparación de Leu-acetal) mediante el uso de BOP (2 mmol), HOBt (2 mmol) y NMM (6 mmol) en 6 ml de DMF según el procedimiento C (ejemplo 9), para producir el péptido (1,37 g, 1,64 mmol).
Etapa 2 Dietilacetal de MeOAz-Arg(PMC)-L-norleucinal
Siguiendo el procedimiento C (ejemplo 9), se unió monometilazelato (2 mmol) con dietilacetal de Arg(PMC)-norleucinal (1,39 mmol, obtenido de la etapa 1 siguiendo el procedimiento B, ejemplo 8) mediante el uso de BOP
(2 mmol), HOBt (2 mmol) y NMM (6 mmol) y se agitó durante la noche. Al día siguiente, se añadió 1 mmol de cada uno de monometilazelato, BOP, HOBt y NMM y se agitó durante 4 horas. La mezcla de reacción se consiguió como en el procedimiento C, (ejemplo 9), para producir el péptido (0,37 g, 0,84 mmol).
Etapa 3
Siguiendo el procedimiento E (ejemplo 11), se convirtió el producto de la etapa 2 (0,94 g, 0,84 mmol) en el compuesto 30 (0,58 g). RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta: 9,54 (s, 1H), 7,49 (t, 1H), 6,74 (d, 1H), 6,26 (s, 2H), 6,23 (d, 1H), 4,58 (m, 1H), 4,31 (m, 1H), 3,66 (s, 3H), 3,34 (m, 2H), 2,63 (t, 2H), 2,58 (s, 3H), 2,56 (s, 3H), 2,29 (t, 2H), 2,23 (t, 2H), 1,9-1,5 (m, 22H), 1,30 (s, 6H), 0,86 (t, 3H).
Ejemplo 31 Monometilazelail-N^{g}-(p-toluenosulfonil)-L-arginil-L-leucinal
43
Etapa 1 Dietilacetal de Fmoc-N^{g}-(p-toluenosulfonil)-L-arginil-L-leucinal
Mediante el uso del procedimiento C (ejemplo 9), se unió Fmoc-N^{g}-(p-toluenosulfonil)-L-arginina (5 mmol) con dietilacetal de leucinal (5,5 mmol)mediante el uso de HBTU (5,5 mmol), HOBt (5,5 mmol) y NMM (11 mmol) en 15 ml de DMF. Se aisló el péptido en forma de un sólido (2,86 g, 3,96 mmol).
Etapa 2 Dietilacetal de monometilazelail-N^{g}-(p-toluenosulfonil)-L-arginil-L-leucinal
Siguiendo el procedimiento C (ejemplo 9), se unió monometilazelato (6 mmol) con dietilacetal de N^{g}-(p-toluenosulfonil)-L-arginil-L-leucinal (2,7 g, 4,7 mmol obtenido de la etapa 1 mediante el uso del procedimiento B, ejemplo 8) mediante el uso de hexafluorofosfato de 1-benzotriazol-1-il-1,1,3,3-tetrametiluronio (HBTU) (6 mmol), HOBt (6 mmol) y NMM (12 mmol) en 15 ml de DMF y agitación durante la noche. Se incrementó la producción de la reacción mediante la adición de monometilazelato (3 mmol) y difenilfosforilazida (3 mmol) y se agitó durante 4 horas para producir el péptido en forma de sólido (1,92 g).
Etapa 3 Monometilazelail-N^{g}-(p-toluenosulfonil)-L-arginil-L-leucinal
Siguiendo el procedimiento E (ejemplo 11), se convirtió el producto de la etapa 2 (1,92 g, 2,8 mmol) en el compuesto 31 (1,64 g). RMN ^{1}H (300 MHz, DMSO- d_{6}) \delta: 9,37 (s, 1H), 8,97 (d, 1H), 8,37 (d, 1H), 7,66 (d, 2H), 7,37 (m, 1H), 7,29 (d, 2H), 7,03 (s, 1,H), 6,63 (s, 1H), 4,09 (m, 1H), 3,57 (s, 3H), 3,44 (m, 1H), 3,04 (m, 2H), 2,26 (s, 3H), 2,33 (t, 2H), 2,13 (t, 2H), 2,80-1,09 (m, 7H), 0,86 (dd, 6H).
Ejemplo 32 Semicarbazona de monometilazelail-N^{g}-(4-metoxi-2,3,6-trimetil-1-sulfonil)-L-arginil-L-leucinal
44
Véase Basak, A. y col., Int. J. Peptide Protein Res. 36, 7-17 (1990). Se calentó una mezcla de MeOAz-Arg(MTR)-Leu-H (ejemplo 34) (67 mg, 0,10 mmol), clorhidrato de semicarbazida (11 mg, 0,1 mmol) y acetato de sodio (9 mg, 0,11 mmol) en 3 ml de EtOH al 90% hasta 70ºC durante 18 h. Se concentró la mezcla de reacción para obtener un sólido amarillo claro (compuesto 32) que se purificó posteriormente por HPLC como en la tabla 6. RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta: 7,91 (t, 1H), 7,09 (d, 1H), 6,68 (s, 1H), 6,22 (s, 1H), 4,37-4,46 (m, 1H), 4,2-4,3 (m, 1H), 4,04 (d, 1H), 3,7 (s, 3H), 3,58 (s, 3H), 2,6 (s, 3H), 2,27 (dd, 2H), 2,05, 2,12 (s, 3H), 1,2-1,64 (m, 12H), 0,85 (t, 6H).
Ejemplo 33 Tiosemicarbazona de monometilazelail-N^{g}-(4-metoxi-2,3,6-trimetil-1-sulfonil)-L-arginil-L-leucinal
45
Siguiendo las mismas etapas que en el ejemplo 32, se preparó el compuesto 33 a partir del compuesto del
ejemplo 34 (51 mg, 0,07 mmol) y tiosemicarbazida (7 mg, 0,07 mmol) en 2 ml de EtOH al 90%.
Ejemplo 34 Monometilazelail-N^{g}-(4-metoxi-2,3,6-trimetilbenceno-1-sulfonil)-L-arginil-L-leucinal
46
Etapa 1
Siguiendo el procedimiento C (ejemplo 9), se preparó dietilacetal de 9-fluorenilmetiloxicarbonil-N^{g}-(4-metoxi-2,3,6-trimetilbenceno-1-sulfonil)-L-arginil-L-leucinal a partir de 9-fluorenilmetiloxicarbonil-N^{g}-(4-metoxi-2,3,6-trimetilbenceno-1-sulfonil)-L-arginina y dietilacetal de L-leucinal.
Etapa 2 Monometilazelail-N^{g}-(4-metoxi-2,3,6-trimetilbencenosulfonil)-L-arginil-L-leucinal
Siguiendo el procedimiento C (ejemplo 9), se unió monometilazelato (6 mmol) con dietilacetal de N^{g}-(4-metoxi-2,3,6-trimetilbenceno-1-sulfonil)-L-arginil-L-leucinal (5 mmol obtenido de la etapa 1 mediante el uso del procedimiento B, ejemplo 8), y se aisló el péptido en forma de un sólido amorfo (3,3 g).
Etapa 3 Metoxiazelail-N^{g}-(4-metoxi-2,3,6-trimetilbenceno-1-sulfonil)-L-arginil-L-leucinal
El producto de la etapa 2 (0,5 g) se convirtió en el compuesto 34 (0,36 g) según el procedimiento E, ejemplo 11. RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{2}) \delta: 9,54 (s, 1H), 7,51 (s, 1H), 6,74 (d, 1H), 6,57 (s, H), 6,40 (s, 2H), 6,31 (s, 1H), 4,66 (m, 1H), 4,41 (m, 1H), 3,87 (s, 3H), 3,70 (s, 3H), 3,33 (m, 2H), 2,73 (s, 3H), 2,66 (s, 3H), 2,33 (t, 2H), 2,26 (t, 2H), 2,17 (s, 3H), 2,00-1,26 (m, 17H), 0,96 (dd, 6H).
Ejemplo 35 Metoxiazelail-N^{g}-(2,4,6-trimetilbenceno-1-sulfonil)-L-arginil-L-leucinal
47
Etapa 1 Dietilacetal de Fmoc-N^{g}-(2,4,6-trimetilbenceno-1-sulfonil)-L-arginil-L-leucinal
Se añadió una solución de HCl 4M en dioxano (10 ml) a una solución de Boc-Arg(MTS)-OH (6 mmol) en 10 ml de dioxano. Al cabo de 30 minutos, se eliminó el disolvente y se añadió éter, se recogió el precipitado y se secó (3,21 g, 9 mmol). Se convirtió el clorhidrato de Arg-MTS-OH en Fmoc-Arg(MTS)OH siguiendo el procedimiento tal como se describió para la preparación del derivado tosil (ejemplo 31) para producir el compuesto del título en forma de un sólido blanco (2,09 g).
Etapa 2 Fmoc-Arg(MTS)-Leu-acetal
Siguiendo el procedimiento C (ejemplo 9), se unió el Fmoc-Arg(MTS)-OH (3,361 mmol) con el dietilacetal de leucinal (4 mmol) mediante el uso de HBTU (4 mmol), HOBt (4 mmol) y NMM (10 mmol) en 15 ml de DMF para producir el péptido del título (1.05 g).
Etapa 3 MeOAz-Arg(MTS)-Leu-acetal
Mediante el uso del procedimiento C, se unió monometilazelato (1,2 mmol) con Arg(MTS)-Leu-acetal (0,85 mmol, obtenido de la etapa 2 siguiendo el procedimiento B, ejemplo 8) mediante el uso de BOP (1,2 mmol), HOBt (1,2 mmol) y NMM (3,6 mmol) en 3 ml de DMF y se agitó durante la noche para proporcionar el péptido del título en forma de un semisólido (0,59 g).
Etapa 4 Metoxiazelaoil-N^{g}-(2,4,6-trimetilbenceno-1-sulfonil)-L-arginil-L-leucinal
Según el procedimiento E (ejemplo 11), se convirtió el producto (0,59 g) de la etapa 3 en el compuesto 35 (0,54 g) y se purificó por HPLC. RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta: 9,49 (s, 1H), 7,53 (s, 1H), 6,90 (s, 2H), 6,81 (d, 1H), 6,40 (bs, 3H), 4,61 (m, 1H), 4,38 (m, 1H), 3,67 (s, 3H), 2,67 (s, 6H), 2,29 (t, 2H), 2,20 (t, 2H), 2,0-1,20 (m, 19H), 0,91 (dd, 6H).
\newpage
Ejemplo comparativo 36
6-ciano-hexano-1-sulfonil-N^{g}g-(2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonil)-L-arginil-L-leucinal
48
Etapa 1 Dietilacetal de 6-ciano-hexano-1-sulfonil-N^{g}-(2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonil)-L-arginil-L-leucinal
Se añadió cloruro de 6-ciano-hexano-1-sulfonilo (0,19 g, 0,89 mmol) a la etapa 14 en el procedimiento G (ejemplo 13) a una solución del producto (0,55 g, 0,899 mmol) de la etapa 2 en el ejemplo 20, en 1 ml de DMF y se ajustó el pH de la solución a 8 mediante el uso de NMM. Al cabo de 4 horas de agitación, se consiguió la mezcla de reacción tal como se describió en el procedimiento A (ejemplo 7), para obtener el compuesto del título (0,466 g).
Etapa 2 6-ciano-hexano-1-sulfonil-N^{g}-(2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonil)-L-arginil-L-leucinal
Mediante el uso del procedimiento E (ejemplo 11), se convirtió el producto (0,297 g) de la etapa 1 en el compuesto 36 (0,22 g) y se purificó por HPLC como se describe en la tabla 6. RMN ^{1}H (300 MHz, DMSO-d_{6}) \delta: 9,37 (s, 1H), 6,83 (b, 1H), 6,43 (b, 1H), 3,88 (m, 1H), 3,77 (m, 1H), 3,01 (m, 2H), 2,80 (m, 2H), 2,55 (t, 2H), 2,46 (s, 6H), 2,0 (s, 3H), 1,75 (m, 5H), 1,6-1,3 (m, 15H), 1,23 (s, 6H), 0,84 (dd, 6H).
Ejemplo comparativo 37
2-naftoil-N^{g}-nitro-L-arginil-L-leucinal
49
Etapa 1 Dietilacetal de 2-naftoil-N^{g}-nitro-L-arginil-L-leucinal
Se añadió 2-naftoilcloruro (0,104 g, 0,55 mmol) a una solución del producto de la etapa 2 en el ejemplo 14 en 2 ml de DMF y NMM (0,18 ml) y se preparó el producto del título para obtener el compuesto del titulo en forma de sólido (0,22 g). RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta: 8,92 (b, 1H), 8,0-7,91 (mm, 10H), 6,93 (d, 1H), 5,07 (m, 1H), 4,37 (d, 1H), 4,17 (m, 1H), 3,69 (m, 3H), 3,53 (m, 3H), 3,38 (m, 2H), 1,77, 1,58, 1,4 (mm, 5H), 0,83 (dd, 6H).
Etapa 2 2-naftoil-N^{g}-nitro-L-arginil-L-leucinal
Mediante el uso del procedimiento E (ejemplo 11), se convirtió el producto (0,1 g) de la etapa 1 en el compuesto 37 (60 mg). RMN ^{1}H (300 MHz, DMSO-d_{6}) \delta: 9,43 (s, 1H), 8,72 (d, 1H), 8,53 (m, 2H), 8,0 (m, 6H), 7,6 (m, 2H), 6,20 (m, 1H), 4,57 (m, 1H), 4,14 (m, 1H), 3,92 (m, 1H), 3,2 (m, 2H), 3,0 (d, 1H), 1,77 (m, 5H), 0,86 (m, 6H).
Ejemplo 38 CBZ-7-aminoheptanoil-N^{g}-nitro-L-arginil-L-leucinal
50
Etapa 1 Dietilacetal de CBZ-7-aminoheptanoil-N^{g}-nitro-L-arginil-L-leucinal
Siguiendo el procedimiento C (ejemplo 9), se unió ácido CBZ-7-aminoheptanoico (0,7 g, 2,5 mmol) con el producto de la etapa 2 en el ejemplo 14 (0,78 g, 2,0 mmol) mediante el uso de BOP (1,1 g, 2,5 mmol), HOBt (0,34 g, 2,5 mmol) y NMM (0,253 ml, 2,5 mmol) para producir el péptido en forma de semisólido, que se usó directamente en la etapa siguiente.
Etapa 2 CBZ-7-aminoheptanoil-N^{g}-nitro-L-arginil-L-leucinal
Siguiendo el procedimiento E (ejemplo 11), se convirtió el acetal de la etapa 1 en el compuesto 38 (0,8 g) tras agitar la reacción durante 5 h. RMN ^{1}H (300 MHz, DMSO-d_{6}) \delta: 9,30 (s, 1H), 8,47 (s, 1H), 8,46 (s, 1H), 8,29 (d, 1H), 8,11 (t, 1H), 7,80 (s, 1H), 7,64 (d, 1H), 7,31 (s, 1H), 7,23 (s, 5H), 4,91 (s, 2H), 4,23 (m, 1H), 4,00 (m, 1H), 3,51 (q, 2H), 3,27 (m, 2H), 2,89 (q, 2H), 2,11 (t, 2H), 2,03 (t, 2H), 1,7-1,00 (m, 10H), 0,77 (dd, 6H).
Los ejemplos 39-42 describen las síntesis de los inhibidores de la MCP que se enumeran en la tabla 7.
TABLA 7
Ejemplo Nº % de inhibición (1 \muM) CI_{50} nM
39 (isómero a) 31 >1000
39 (isómero b) 21 >1000
40 100 8
41 (isómero a) 99 22
41 (isómero b) 98 13
42 15 >1000
Ejemplo 39 Clorometilcetona de 10-ciano-2-ciclopentil-decanoil-N^{g}-nitro-L-arginil-L-leucina
51 
\newpage
En este y en los tres ejemplos que siguen, se preparan los inhibidores de la invención por el procedimiento de unión II. En cada caso, se une 10-ciano-2-ciclopentil-decanoil-N^{g}-nitro-L-arginina preparada como se describe en la presente invención a un derivado de aminoácido con reactividad para la enzima para producir el inhibidor. Estos inhibidores se obtienen en forma de mezcla de dos o más diastereoisómeros que se pueden separar por HPLC en algunos casos.
A) Metiléster de 10-ciano-2-ciclopentil-decanoil-N^{g}-nitro-L-arginina
Siguiendo el procedimiento del procedimiento C (ejemplo 9), se agitó ácido 10-ciano-2-ciclopentil-decanoico
(2,4 g; 11 mmol) del ejemplo 13 etapa 5, en 26 ml de DMF con diclorhidrato de metiléster de N^{g}-nitro-L-arginina (2,86 g, 11 mmol), BOP (6,6 g, 15 mmol), HOBt (1,62 g, 12 mmol) y 3,6 ml de NMM (33 mmol) para producir 4,8 g del metiléster en forma de un sólido espumoso. RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta: 8,75 (bs, 1H), 7,81 (bs, 2H), 6,42 (d, 1H), 4,67 (t, 1H), 3,82 (s, 3H), 3,75 (m, 1H), 3,32 (m, 1H), 2,15 (t, 2H), 2,05-1,12 (m, 28H).
B) 10-ciano-2-ciclopentil-decanoil-N^{g}-nitro-L-arginina
Una solución de 5,5 g del metiléster de la parte "A" arriba en 30 ml de metanol se trató con 24 ml de hidróxido sódico acuoso 1,00 N. Al cabo de 2 horas, se añadieron 100 ml de una solución acuosa de bicarbonato sódico al 2%, y se sometió la solución obtenida a extracción con 100 ml de éter. Se separó la fase acuosa y se acidificó con ácido cítrico acuoso al 3% y se sometió a extracción con 250 ml de acetato de etilo. Se separó la fase orgánica obtenida, se secó sobre MgSO_{4} anhidro y se evaporó para producir una goma incolora que se solidificó al triturarla con éter de petróleo en un polvo blanco fino que pesó 4,4 g. RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta: 10,6 (bs, 1H), 8,75 (bs, 1H), 7,82 (bs, 2H), 6,41 (d, 1H), 4,67 (t, 1H), 3,71 (m, 1H), 3,32 (m, 1H), 2,15 (t, 2H), 2,04-1,12 (m, 30H).
C) 10-ciano-2-ciclopentil-decanoil-N^{g}-nitro-L-arginil-L-leucina clorometilcetona
Una mezcla de 467 mg (1,0 mmol) del producto de la parte "B" arriba y 270 mg (1,0 mmol) de clorhidrato de leucina clorometilcetona (Bachem Biosciences, Inc., King of Prussia, Pensilvania), 440 mg (1,0 mmol) de BOP y 135 mg (1 mmol) de HOBt en 4,0 ml de DMF se trató con 0,33 ml (3 mmol) de NMM. Al cabo de 4 horas, se diluyó la mezcla con 75 ml de acetato de etilo, se lavó con NaHCO_{3} acuoso al 2%, agua, ácido cítrico acuoso al 3% y finalmente con agua. La fase orgánica se separó y se secó (MgSO_{4}) y finalmente se evaporó para proporcionar un aceite viscoso de color amarillo pálido. Se purificó este compuesto por cromatografía ultrarrápida a través de una columna de 9 x ½ pulgada (22,86 x 1,27 cm) de gel de sílice 60-H mediante el uso de acetato de etilo para la elución. La solución obtenida se evaporó para proporcionar una goma incolora que se solidificó al permanecer en 1:1 acetato de etilo/eter para proporcionar 198 mg de clorometilcetona sólida incolora. La HPLC indicó la presencia de dos diastereoisómeros que se separaron por RP-HPLC preparativa. Se aislaron los picos en un gradiente de disolvente agua-acetonitrilo (30 - 80 % de acetonitrilo en 40 min) a 22,58 min (diastereoisómero a) y 23,7 min (diastereoisómero b).
Diastereoisómero a: RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta: 8,53 (bs, 1H), 7,61 (bs, 2H), 7,31 (bs, 1H), 6,69 (d, 1H), 4,73 (m, 1H), 4,65 (m, 1H), 4,28 (q, 2H), 3,53 (m, 1H), 3,31 (t, 1H), 2,32 (t, 2H), 1,90-1,11 (m, 31H), 0,93 (q, 6H).
Diastereoisómero b: RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta: 8,53 (bs, 1H), 7,61 (bs, 2H), 7,31 (bs, 1H), 6,69 (d, 1H), 4,73 (m, 1H), 4,65 (m, 1H), 4,28 (q, 2H), 3,53 (m, 1H), 3,31 (t, 1H), 2,32 (t, 2H), 1,90-1,11 (m, 31H), 0,93 (q, 6H).
Ejemplo 40 10-ciano-2-ciclopentil-decanoil-N^{g}-nitro-L-arginil-boroleucina pinacol ester
52
Se preparó una solución de 467 mg (1,0 ml) de 10-ciano-2-ciclopentil-decanoil-N^{g}-nitro-L-arginina (ejemplo 39, parte "B" arriba) y 264 mg (1,0 mmol) de clorhidrato de boroleucina pinacol ester mediante el procedimiento de Shenvi, patente de EEUU 4.537.773, 440 mg (1,0 mmol de BOP y 135 mg (1,0 mmol) de HOBt en 5,0 ml de DMF se trató con 0,33 ml (3 mmol) de NMM. Al cabo de 2 horas, se diluyó la mezcla con 75 ml de acetato de etilo y se lavó con NaHCO_{3} acuoso al 2% y agua y se separó la fase orgánica, se secó (MgSO_{4}) y se evaporó para proporcionar 410 mg de un polvo marrón pálido. Este sólido se lavó con cloroformo para proporcionar 290 mg de producto en forma de un sólido de color blanco sucio que exhibió un único pico en la HPLC. RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta: 8,53 (bs, 1H), 7,65 (bs, 2H), 6,71 (t, 1H), 4,61 (m, 1H), 3,52 (m, 1H), 3,31 (m, 2H), 3,05 (m, 1H), 2,82 (m, 1H), 2,38 (t, 2H), 2,06-1,42 (m, 28H), 1,22 (s, 12H), 1,15 (m, 2H), 0,92 (m, 6H).
Ejemplo 41 10-ciano-2-ciclopentil-decanoil-N^{g}-nitro-L-arginil-L-leucina alfa-cetoetilamida
53
A) 10-ciano-2-ciclopentil-decanoil-N^{g}-nitro-L-arginil-(1-etilaminocarbonil 1-hidroxi-4-metil)-2-pentilamida
Una solución de 467 mg (1,0 mmol) de 10-ciano-2-ciclopentil-decanoil-N^{g}-nitro-L-arginina y 225 mg de clorhidrato de ácido 3-amino-2-hidroxi-5-metil- hexanoico N-etilamida (preparado por el método de Harbeson y col., J. Med. Chem. 37, 2918-29 (1994)) en 5,0 ml de DMF se trató con 440 mg (1 mmol) de BOP, 135 mg (1 mmol) de HOBt y 0,33 ml (3 mmol) de NMM. Después de 2 horas de agitación, se diluyó la solución con 75 ml de acetato de etilo y se lavó con NaHCO_{3} acuoso al 2%, agua, ácido cítrico acuoso al 3%, agua y se secó (MgSO_{4}) para producir, tras evaporación, 540 mg de compuesto hidroxi en forma de un sólido blanco sucio. RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta: 8,53 (bs, 1H), 7,73 (bs, 2H), 7,04 (bm, 1H), 6,83 (t, 1H), 4,52 (m, 1H), 4,19 (m, 1H), 4,11 (q, 2H), 3,46 (q, 2H), 3,26 (m, 2H), 2,35 (t, 2H), 1,91 (m, 2H), 1,83 (m, 2H), 1,8-1,2 (m, 28H), 1,13 (t, 3H), 0,88 (m, 6H).
B) 10-ciano-2-ciclopentil-decanoil-N^{g}-nitro-L-arginil-L-leucina alfa-cetoetilamida
Una solución de 250 mg del compuesto hidroxi de la parte "A" arriba en 6,0 ml de diclorometano seco se enfrió hasta 0ºC y se agitó con 225 mg (h. 0,5 mmol) de reactivo de Dess-Martin (D.B. Dess y J.C. Martin, J. Org. Chem. 48, 4156-4158 (1983)).
Se dejó que la reacción se calentara hasta temperatura ambiente y se agitó durante 2 horas. La suspensión turbia se diluyó con 50 ml de acetato de etilo y se filtró a través de un filtro de vidrio sinterizado fino. Se lavó el producto filtrado con Na_{2}S_{2}O_{3} acuoso al 10% y luego con NaCl saturado. Se secó (MgSO_{4}) y se evaporó para proporcionar 180 mg de un producto cetoamida sólido blanco. Se purificó por RP-HPLC preparativa mediante el uso de un sistema de gradiente agua-acetonitrilo (40-70% de acetonitrilo en 40 min). Se recogieron los picos a 18,07 min (diastereoisómero a) y 19,54 min (diastereoisómero b).
Diastereoisómero a: RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta: 8,45 (bs, 1H), 7,58 (bs, 2H), 7,04 (bm, 2H), 6,57 (t, 1H), 5,33 (t, 1H), 4,60 (m, 1H), 3,51 (m, 1H), 3,33 (m, 3H), 2,35 (t, 2H), 1,91-1,11 (m, 34H), 0,94 (m, 6H).
Diastereoisómero b: RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta: 8,45 (bs, 1H), 7,48 (bs, 2H), 7,25 (m, 1H), 7,04 (t, 1H), 6,85 (m, 1H), 6,62 (d, 1H), 5,32 (t, 1H), 4,81 (m, 1H), 4,58 (m, 1H), 3,51 (m, 1H), 3,35 (m, 3H), 2,35 (t, 2H), 1,95-1,11 (m, 32H), 0,98 (m, 6H).
Ejemplo 42 10-ciano-2-ciclopentil-decanoil-N^{g}-nitro-L-arginil-fenilalanina fluorometilcetona
54
A) Síntesis de 1-nitro-2-feniletano
A una mezcla en agitación de trans-\beta-nitrostireno (5,25 g, 0,035 mol) y de gel de sílice (10 g, 230-400 de malla) en cloroformo (400 ml) e isopropanol (75 ml) a temperatura ambiente, se añadió lentamente borohidruro de sodio
(5,50 g, 0,145 mol) durante un periodo de 45 min. Se agitó la mezcla de reacción durante 15 min adicionales y luego se detuvo con cuidado con ácido clorhídrico al 10% (20 ml). El sólido separado se filtró y se lavó con cloroformo
(50 ml). El producto de filtrado combinado y el lavado se lavaron con agua (1 x 20 ml), salmuera (1 x 20 ml) y se secó sobre sulfato sódico anhidro. La evaporación del disolvente a presión reducida proporcionó un material bruto que se purificó por cromatografía ultrarrápida (gel de sílice, 8% acetato de etilo-hexano) para proporcionar 2,86 g de 1-nitro-2-feniletano en forma de un aceite incoloro (olor picante); R_{f} (acetato de etilo al 10% en hexano): 0,40; RMN ^{1}H
(300 MHz, CDCl_{3} 7,40-7,20 (m, 5H), 4,60 (t, 2H), 3,30 (t, 2H).
B) Síntesis de 1-fluoro-2-hidroxi-3-nitro-4-fenilbutano
A una solución refrigerada (-78ºC) de cloruro de oxalilo (2M) en cloruro de metileno (11,60 ml, 0,0232 mol) se añadió lentamente dimetilsulfóxido (3,65 g, 3,32 ml, 0,467 mol). Se agitó la mezcla de reacción durante 15 min. A continuación se añadió lentamente una solución de 2-fluoroetanol (1,16 g, 0,0181 mol) en cloruro de metileno (10 ml) al matraz de reacción. Después de agitar durante otros 15 minutos, se diluyó la mezcla de reacción con cloruro de metileno anhidro (180 ml), y se le añadió trietilamina (9,20 g, 12,63 ml, 0,090 mol). Se continuó agitando durante 2 horas adicionales, y para entonces la temperatura había subido hasta la temperatura ambiente. En este momento, se añadió una solución de 1-nitro-2-feniletano (2,74 g, 0,0181 mol) en cloruro de metileno anhidro (10 ml) a la mezcla de reacción y se continuó agitando durante la noche. A continuación, se lavó la mezcla con agua (1 x 30 ml), ácido clorhídrico al 4% (3 x 20 ml), agua (1 x 20 ml), solución saturada de bicarbonato sódico (2 x 20 ml) y salmuera (1 x 20 ml). El secado sobre sulfato sódico anhidro y la evaporación del disolvente proporcionaron un material bruto que se purificó por cromatografía ultrarrápida (gel de sílice, 25% acetato de etilo-hexano) para proporcionar el producto en forma de los isómeros eritro y treo. La producción combinada fue de 3,01 g. Se puede encontrar una descripción general de este procedimiento en Imperiali, B., y col., Tetrahedron Lett. 27(2), 135 (1986) y en Revesz, L. y col., Tetrahedron Lett. 35(52), 9693 (1994).
El isómero a era un sólido blanco, Tf 71-73ºC; R_{f} (acetato de etilo al 30% en hexano): 0,46; RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,40-7,10 (m, 5H), 4,90 (m, 1H), 4,60 (m, 1H), 4,50-4,30 (m, 2H), 3,45-3,25 (m, 2H), 2,70 (d, 1H).
El isómero b era un aceite incoloro; R_{f} (acetato de etilo al 30% en hexano): 0,42; RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,40-7,15 (m, 5H), 4,90 (m, 1H), 4,65 (m, 1H), 4,50 (m, 1H), 4,20 (m, 1H), 3,40-3,30 (m, 2H), 2,90 (d, 1H).
C) Síntesis de 3-amino-1-fluoro-2-hidroxi-4-fenil-butano
Una mezcla del isómero a anterior (0,48 g, 2,25 mmol), etanol absoluto (20 ml) y níquel de Raney (catalítico) se hidrogenó (60 psi; 414 kPa) en un equipo Parr durante 5 horas. La filtración a través de una almohadilla Celite y la evaporación del disolvente proporcionaron 410 mg de isómero a de la amina. Un tratamiento similar del isómero b anterior (800 mg, 3,75 mmol) proporcionó 510 mg de isómero b de la amina.
El isómero a de la amina era un sólido blanco, Tf 64-67ºC; RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,40-7,10 (m, 5H), 4,70 (d, 1H), 4,50 (d, 1H), 3,90-3,70 (m, 1H), 3,30-3,10 (m, 1H), 2,95 (dd, 1H), 2,60-2,45 (q, 1H), 2,20-1,70 (ancho, 3H).
El isómero b de la amina era un sólido blanco, Tf 67-70 ºC; RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,40-7,10 (m, 5H), 4,70 (d, 1H), 4,55 (d, 1H), 3,70-3,50 (m, 1H), 3,20-3,00 (m, 1H), 2,95 (dd, 1H), 2,60-2,45 (q, 1H), 2,20-1,65 (ancho, 3H).
D) 10-ciano-2-ciclopentil-decanoil-N^{g}-nitro-L-arginil-(4-fluoro-3-hidroxi-1-fenil)-2-butilamida
Se trató una solución de 467 mg (1,0 mmol) de 10-ciano-2-ciclopentil-decanoil-N^{g}-nitro-L-arginina y 183 mg
(1,0 mmol) de 3-amino-1-fluoro-2-hidroxi-4-fenil-butano en 5,0 ml de DMF con 440 mg (1,0 mmol) de BOP, 135 mg
(1,0 mmol) de HOBt y 0,33 ml (3 mmol) de NMM. Después de 2 horas de agitación, se diluyó la solución con 75 ml de acetato de etilo y se lavó con NaHCO_{3} acuoso al 2%, agua, ácido cítrico acuoso al 3%, agua y se secó (MgSO_{4}) para producir, tras evaporación, 480 mg del compuesto hidroxi en forma de un sólido blanco sucio. RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3} + d_{6}-DMSO) \delta 8,15 (bs, 1H), 7,82 (bs, 2H), 7,21 (m, 6H), 5,05 (t, 1H), 4,51 (m, 1H), 4,22 (m, 1H),
3,82 (m, 1H), 3,75 (m, 2H), 2,95 (q, 2H), 2,35 (t, 2H), 2,04-1,13 (m, 31H).
E) 10-ciano-2-ciclopentil-decanoil-N^{g}-nitro-L-arginil-fenilalanina fluorometilcetona
Una solución de 250 mg del compuesto hidroxi de la parte "C" arriba en 6,0 ml de diclorometano seco se enfrió hasta 0ºC y se agitó con 225 mg (h. 0,5 mmol) de reactivo de Dess-Martin. Se dejó que la reacción se calentara hasta temperatura ambiente y se agitó durante 2 horas. La suspensión turbia se diluyó con 50 ml de acetato de etilo y se filtró a través de un filtro de vidrio sinterizado fino. Se lavó el producto filtrado con Na_{2}S_{2}O_{3} acuoso al 10% y luego con NaCl saturado. Se secó (MgSO_{4}) y se evaporó para proporcionar 180 mg de un sólido blanco. Tras purificación por HPLC, se obtuvieron 42 mg de producto fluorometilcetona puro. RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta 8,56 (bs, 1H), 7,62 (bs, 2H), 7,42 (t, 1H), 7,21 (m, 5H), 6,63 (m, 1H), 5,05-4,53 (m, 4H), 3,46 (m, 1H), 3,18 (m, 2H), 2,98 (q, 2H), 2,33 (t, 2H), 2,04-1,13 (m, 27H).
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
SOLICITANTES: Mohamed Iqbal
\hskip2cm
Sankar Chatterjee 
\hskip2cm
James L. Diebold 
\hskip2cm
James C. Kauer 
\hskip2cm
Robert Siman 
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Inhibidores de la proteasa multicatalítica
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 10
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
DESTINATARIO: Woodcock Washburn Kurtz Mackiewicz y Norris
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CALLE: One Liberty Place - 46th Floor
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Filadelfia
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
ESTADO: PA
\vskip0.333000\baselineskip
(E)
PAÍS: EE.UU.
\vskip0.333000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 19103
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Disquete de 3,5', 720 Kb
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: PC compatible IBM
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: WordPerfect 5.1
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: N/D
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: con la presente
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN: N/D
\vskip0.666000\baselineskip
(viii)
INFORMACIÓN DEL ABOGADO/ AGENTE:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Michael P. Straher
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 38.325
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE REFERENCIA/ EXPEDIENTE: CEPH-0148
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: 215-568-3100
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TELEFAX: 215-568-3439
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:1:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:1:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
TCGATCGAAG CTTGCCGCCA CCATGGCGAT GAAAGC 
\hfill
36 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:2:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:2:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
AGCTAGCCTC GAGCAGATTA CAGTTTAATG 
\hfill
30 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:3:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:3:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
TTAATCCTCA CTCTAAGAAA C 
\hfill
21 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:4:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:4:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
TTGTACGGCC AGTGATGGAA TGCT 
\hfill
24 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:5:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:5:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
AGCATTCCAT CACTGGCCGT ACAA 
\hfill
24 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:6:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:6:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
TAATACGACT CACTATAGGG 
\hfill
20 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:7:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 41 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:7:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
GCACACCACT TTCATCGCCA TGGTGGCGGC AAGCTTCGAT C 
\hfill
41 
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:8:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:8:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
ATTAACCCTC ACTAAAGGGA 
\hfill
20 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:9:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 41 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:9:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
GATCGAAGCT TGCCGCCACC ATGGCGATGA AAGTGGTGTG C 
\hfill
41 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:10:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:10:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CTTCAGTTAA TCCTGTAA 
\hfill
18

Claims (28)

1. Un compuesto de fórmula:
R_{1}---(CH_{2})_{n}---
\delm{C}{\delm{\para}{R _{2} }}
H---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}
---NH---
\delm{C}{\delm{\para}{R _{3} }}
H---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}
---NH---R_{4}
en la que:
R_{1} se selecciona del grupo formado por –C\equivN, -C(=O)OR_{9}, ftalimido, -NH-SO_{2}R_{9}, y -NH-J;
R_{2} se selecciona del grupo formado por H, hidroxilo, alquilo que tiene uno a diez carbonos, y cicloalquilo que tiene tres a siete carbonos;
R_{3} se selecciona del grupo formado por -(CH_{2})_{m}-NH-C(=N-R_{5})-NH_{2}, -R_{6}-NO_{2}, -R_{6}-J, y –R_{6}-CN;
R_{4} es -CH(CH_{2}-R_{7})-Q;
Q se selecciona del grupo formado por -CH-R_{8}, -C(=O)CH_{3}, -C(=O)CH_{2}Cl, -C(=O)CH_{2}Br, -C(=O)CH_{2}F, -C(=O)CHF_{2}, -C(=O)CF_{3}, -C(=O)C(=O)R_{7}, -C(=O)C(=O)NH-R_{7}, -C(=O)CO_{2}-R_{7}, -C(=O)CO_{2}H, -B(OH)_{2},
56
en las que p y q, independientemente, son 2 ó 3;
W es cicloalquilo;
R_{5} se selecciona del grupo formado por –NO_{2}, -CN, y -J;
R_{6} es -(CH_{2})_{m}-NH-C(=NH)-NH-;
R_{7} se selecciona del grupo formado por fenilo, y alquilo que tiene uno a ocho carbonos, encontrándose dicho grupo alquilo opcionalmente sustituido con uno o más átomos de halógeno, grupos arilo o heteroarilo;
R_{8} se selecciona del grupo formado por =O, =N-NHC(=O)-NH_{2}, =N-OH, =N-OCH_{3}, =N-O-CH_{2}-C_{6}H_{5}, =NNH-C(=S)-NH_{2} y =N-NH-J;
R_{9} se selecciona del grupo formado por hidrógeno, y alquilo que tiene de uno a seis carbonos, encontrándose dicho grupo alquilo opcionalmente sustituido con uno o más átomos de halógeno, grupos arilo o heteroarilo;
J es un grupo protector;
n es un número entero de 3 a 10; y
m es un número entero de 2 a 5.
2. El compuesto de la reivindicación 1 en el que R_{1} se selecciona del grupo formado por –C\equivN, -C(=O)CH_{3}, ftalimido y -NH-SO_{2}CF_{3}.
3. El compuesto de la reivindicación 1 o la reivindicación 2 en el que R_{2} se selecciona del grupo formado por H y ciclopentilo.
4. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que R_{3} es -(CH_{2})_{3}-NH-C(=N-R_{5})-NH_{2}.
5. El compuesto de la reivindicación 4 en el que R_{5} se selecciona del grupo formado por –NO_{2}, -CN, -PMC, -MTR, -MTS y Tos.
6. El compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en el que R_{7} se selecciona del grupo formado por -CH(CH_{3})_{2}, -(CH_{2})_{2}-CH_{3} y –C_{6}H_{5}. 7. El compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en el que Q es -CH-R_{8}.
8. El compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en el que Q se selecciona del grupo formado por -C(=O)CH_{3}, -C(=O)CH_{2}Cl, -C(=O)CH_{2}Br, -C(=O)CH_{2}F, -C(=O)CHF_{2}, -C(=O)CF_{3}, -C(=O)C(=O)R_{7}, -C(=O)C(=O)NH-R_{7}, -C(=O)CO_{2}-R_{7}, -C(=O)CO_{2}H, -B(OH)_{2},
57
9. El compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en el que Q se selecciona del grupo formado por -CH-R_{8}, -B(OH)_{2}, -C(=O)C(=O)NH-R_{7},
58
10. El compuesto de la reivindicación 7 en el que R_{8} se selecciona del grupo formado por =O, =N-NHC(=O)-NH_{2}, =N-OH, =N-OCH_{3}, =N-O-CH_{2}-C_{6}H_{5}, y =NNH-C(=S)-NH_{2}.
11. El compuesto de la reivindicación 1 en el que R_{1} se selecciona del grupo formado por -C(=O)OCH_{3}, ftalimido y –NHSO_{2}CF_{3}; R_{2} es ciclopentilo; R_{3} es -(CH_{2})_{3}-NH-C(=N-NO_{2})-NH_{2}; Q es -CH-R_{8}; R_{7} es -CH(CH_{3})_{2}; y R_{8} es =O.
12. El compuesto de la reivindicación 1 en el que R_{1} es –C\equiv\N; R_{2} es ciclopentilo; R_{3} se selecciona del grupo formado por -(CH_{2})_{3}-NH-C(=N-NO_{2})-NH_{2} y -(CH_{2})_{3}-NH-C(=N-J)-NH_{2}; Q es -CH-R_{8}; R_{7} es -CH(CH_{3})_{2}; y R_{8} es =O.
13. El compuesto de la reivindicación 1 en el que R_{1} es –C\equivN; R_{2} es ciclopentilo; R_{3} se selecciona del grupo formado por -(CH_{2})_{3}-NH-C(=N-NO_{2})-NH_{2} y -(CH_{2})_{3}-NH-C(=N-J)-NH_{2}; Q se selecciona del grupo formado por -B(OH)_{2}, -C(=O)C(=O)NH-R_{7},
59
y R_{7} se selecciona del grupo formado por -CH(CH_{3})_{2} y –CH_{2}-CH_{3}.
14. El compuesto de la reivindicación 1 en el que R_{1} es –C\equivN; R_{2} es ciclopentilo; R_{3} se selecciona del grupo formado por -(CH_{2})_{3}-NH-C(=N-NO_{2})-NH_{2} y -(CH_{2})_{3}-NH-C(=N-J)-NH_{2}; Q es -CH-R_{8}; R_{7} es -CH(CH_{3})_{2}; y R_{8} se selecciona del grupo formado por =N-NHC(=O)-NH_{2}, =N-OH, =N-OCH_{3}, y =N-O-CH_{2}-C_{6}H_{5}.
15. Una composición para inhibir la proteasa multicatalítica que comprende un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
16. Una composición para disminuir la pérdida de masa muscular que comprende un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
17. Una composición para el tratamiento de trastornos de desgaste muscular que comprende un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
18. Una composición de la reivindicación 17 en la que el trastorno es una distrofia muscular, una caquexia cardíaca, un enfisema, diabetes, lepra, malnutrición, osteomalacia o caquexia cancerosa.
19. Una composición para la reducción de la degradación de la enzima Cu/Zn superóxido dismutasa-1 que comprende un inhibidor de la proteasa multicatalítica en la que el inhibidor es un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
20. Una composición para el tratamiento de un trastorno caracterizado por una reducción de la actividad de la enzima Cu/Zn superóxido dismutasa-1 que comprende un inhibidor de la proteasa multicatalítica en la que el inhibidor es un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
21. La composición de la reivindicación 20 en la que el trastorno es la esclerosis lateral amiotrófica, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Huntington, la apoplejía, el trauma, o la isquemia.
22. Un procedimiento para preparar una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 21 que comprende la etapa de mezclar un compuesto según una cualquier de las reivindicaciones 1 a 14 con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
23. Uso de un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 en la fabricación de un agente farmacéutico para inhibir la proteasa multicatalítica.
24. Uso de un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 en la fabricación de un medicamento para disminuir la pérdida de masa muscular.
25. Uso de un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de trastornos de desgaste muscular.
26. El uso de la reivindicación 25 en el que dicho trastorno es distrofia muscular, caquexia cardíaca, enfisema, diabetes, lepra, malnutrición, osteomalacia o caquexia cancerosa.
27. Uso de un compuesto que comprende un inhibidor de la proteasa multicatalítica en el que el inhibidor es un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 en la fabricación de un medicamento para reducir la degradación de la enzima Cu/Zn superóxido dismutasa-1 en un mamífero en el que dicha degradación está asociada con una enfermedad o un trastorno provocado por dicha degradación.
28. Uso de un compuesto que comprende un inhibidor de la proteasa multicatalítica en el que el inhibidor es un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de trastornos que se caracterizan por una reducción de la actividad de la enzima Cu/Zn superóxido dismutasa-1.
29. El uso de la reivindicación 28 en el que el trastorno es la esclerosis lateral amiotrófica, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Huntington, la apoplejía, el trauma, o la isquemia.
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Families Citing this family (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6083903A (en) * 1994-10-28 2000-07-04 Leukosite, Inc. Boronic ester and acid compounds, synthesis and uses
US5614649A (en) * 1994-11-14 1997-03-25 Cephalon, Inc. Multicatalytic protease inhibitors
DE69628050T2 (de) 1995-10-25 2004-04-01 Senju Pharmaceutical Co., Ltd. Angiogenese Hemmer
US6214800B1 (en) 1995-10-25 2001-04-10 Senju Pharmaceutical Co., Ltd. Angiogenesis inhibitor
US6184248B1 (en) * 1996-09-05 2001-02-06 Robert K. K. Lee Compositions and methods for treatment of neurological disorders and neurodegenerative diseases
EP1006798A4 (en) * 1996-09-05 2003-03-05 Massachusetts Inst Technology COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING NEUROLOGICAL DISORDERS AND NEURODEGENERATIVE DISEASES
US5939581A (en) * 1997-08-20 1999-08-17 First Chemical Corporation Processes for preparing hydrocinnamic acid
US6096778A (en) * 1997-10-07 2000-08-01 Cephalon, Inc. α-ketoamide multicatalytic protease inhibitors
US6150378A (en) 1997-10-07 2000-11-21 Cephalon, Inc. Peptidyl-containing α-ketoamide cysteine and serine protease inhibitors
US6083944A (en) * 1997-10-07 2000-07-04 Cephalon, Inc. Quinoline-containing α-ketoamide cysteine and serine protease inhibitors
GB9723407D0 (en) * 1997-11-05 1998-01-07 Ciba Geigy Ag Organic compounds
EP1037626A1 (en) * 1997-12-16 2000-09-27 Cephalon, Inc. Multicatalytic protease inhibitors for use as anti-tumor agents
ES2288807T1 (es) 1998-02-02 2008-02-01 Trustees Of Tufts College Uso de inhibidores de dipeptidasa para regular el metabolismo de la glucosa.
US6096711A (en) * 1998-02-25 2000-08-01 Sherman; Michael Hsp72 induction and applications
WO2000023614A1 (en) 1998-10-20 2000-04-27 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Method for monitoring proteasome inhibitor drug action
US20030054977A1 (en) * 1999-10-12 2003-03-20 Cell Therapeutics, Inc. Manufacture of polyglutamate-therapeutic agent conjugates
US6358928B1 (en) 1999-11-22 2002-03-19 Enzyme Systems Products Peptidyl sulfonyl imidazolides as selective inhibitors of serine proteases
GB0003111D0 (en) * 2000-02-10 2000-03-29 Novartis Ag Organic compounds
DK3078667T3 (en) * 2001-01-25 2019-01-07 The United States Of America Represented By The Sec Dep Of Health And Human Services Formulation of boric acid compounds
US6933290B2 (en) 2001-05-30 2005-08-23 Novartis Ag 2-{N-(2-amino-3-(heteroaryl or aryl)propionyl)-aminoacyl}-amino}-alkylboronic acid derivatives
US7727964B2 (en) 2001-11-26 2010-06-01 Trustees Of Tufts College Peptidomimetic inhibitors of post-proline cleaving enzymes
AU2002360453C1 (en) 2001-11-26 2009-06-18 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Methods for treating autoimmune disorders, and reagents related thereto
US7223745B2 (en) * 2003-08-14 2007-05-29 Cephalon, Inc. Proteasome inhibitors and methods of using the same
US7576206B2 (en) * 2003-08-14 2009-08-18 Cephalon, Inc. Proteasome inhibitors and methods of using the same
US7468383B2 (en) * 2005-02-11 2008-12-23 Cephalon, Inc. Proteasome inhibitors and methods of using the same
FR2914920B1 (fr) 2007-04-11 2011-09-09 Clariant Specialty Fine Chem F Procede de deacetalisation d'alpha-aminoacetals.
CN101674853B (zh) * 2007-05-04 2013-03-27 玛瑞纳生物技术有限公司 氨基酸脂质及其用途
FR2916441B1 (fr) 2007-05-22 2009-08-28 Clariant Specialty Fine Chem Procede de racemisation d'alpha-aminoacetals optiquement actifs.
US7442830B1 (en) 2007-08-06 2008-10-28 Millenium Pharmaceuticals, Inc. Proteasome inhibitors
FR2927900B1 (fr) 2008-02-27 2010-09-17 Clariant Specialty Fine Chem Procede de preparation d'alpha-aminoacetals optiquement actifs.
US20090325903A1 (en) 2008-06-17 2009-12-31 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Boronate ester compounds and pharmaceutical compositions thereof
CA2733990C (en) * 2008-08-11 2018-12-11 Banyan Biomarkers, Inc. Biomarker detection process and assay of neurological condition
AR075090A1 (es) 2008-09-29 2011-03-09 Millennium Pharm Inc Derivados de acido 1-amino-2-ciclobutiletilboronico inhibidores de proteosoma,utiles como agentes anticancerigenos, y composiciones farmaceuticas que los comprenden.
EP2483407A2 (en) 2009-09-30 2012-08-08 President and Fellows of Harvard College Methods for modulation of autophagy through the modulation of autophagy-enhancing gene products
WO2011087822A1 (en) 2009-12-22 2011-07-21 Cephalon, Inc. Proteasome inhibitors and processes for their preparation, purification and use
US8354548B2 (en) * 2010-02-19 2013-01-15 Bristol-Myers Squibb Company Glycine chroman-6-sulfonamides for use as inhibitors of diacylglycerol lipase
MX2012011298A (es) 2010-03-31 2012-11-06 Millennium Pharm Inc Derivados del acido 1-amino-2-ciclopropiletilboronico.
SG11201609259VA (en) 2014-05-20 2016-12-29 Millennium Pharm Inc Boron-containing proteasome inhibitors for use after primary cancer therapy
US10654843B2 (en) 2014-06-20 2020-05-19 Principia Biopharma Inc. LMP7 inhibitors

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5754157A (en) * 1980-09-19 1982-03-31 Nippon Kayaku Co Ltd L-argininal derivative and its preparation
US4518528A (en) * 1983-05-19 1985-05-21 Rasnick David W α Amino fluoro ketones
US4537773A (en) * 1983-12-05 1985-08-27 E. I. Du Pont De Nemours And Company α-Aminoboronic acid derivatives
US4499082A (en) * 1983-12-05 1985-02-12 E. I. Du Pont De Nemours And Company α-Aminoboronic acid peptides
US4636492A (en) * 1984-08-29 1987-01-13 E. I. Du Pont De Nemours And Company Inhibition of viral protease activity by peptide halomethyl ketones
US4652552A (en) * 1984-09-10 1987-03-24 E. I. Du Pont De Nemours And Company Tetrapeptide methyl ketone inhibitors of viral proteases
NZ222755A (en) * 1986-12-23 1989-11-28 Warner Lambert Co Renin inhibiting acyl peptide derivatives containing two to four amino acid residues, and pharmaceutical compositions
US5024994A (en) * 1986-12-23 1991-06-18 Warner-Lambert Company Renin inhibitors IV
US5169932A (en) * 1989-10-30 1992-12-08 The Salk Institute For Biological Studies Gnrh analogs
US5296468A (en) * 1989-10-30 1994-03-22 The Salk Institute For Biological Studies GnRH analogs
CA2077665A1 (en) * 1990-03-05 1991-09-06 Robert Siman Chymotrypsin-like proteases and their inhibitors
JPH04202170A (ja) * 1990-11-29 1992-07-22 Taisho Pharmaceut Co Ltd トリペプチド誘導体
US5340736A (en) * 1991-05-13 1994-08-23 The President & Fellows Of Harvard College ATP-dependent protease and use of inhibitors for same in the treatment of cachexia and muscle wasting
US5614649A (en) * 1994-11-14 1997-03-25 Cephalon, Inc. Multicatalytic protease inhibitors
US5550262A (en) * 1994-11-14 1996-08-27 Cephalon, Inc. Multicatalytic protease inhibitors

Also Published As

Publication number Publication date
MX9703564A (es) 1997-08-30
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