FI118325B - Multikatalyyttisen proteaasin inhibiittoreita - Google Patents

Multikatalyyttisen proteaasin inhibiittoreita Download PDF

Info

Publication number
FI118325B
FI118325B FI972029A FI972029A FI118325B FI 118325 B FI118325 B FI 118325B FI 972029 A FI972029 A FI 972029A FI 972029 A FI972029 A FI 972029A FI 118325 B FI118325 B FI 118325B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
group
mmol
compound
alkyl
carbons
Prior art date
Application number
FI972029A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI972029A (fi
FI972029A0 (fi
Inventor
Sankar Chatterjee
James Diebold
Mohamed Iqbal
James C Kauer
Robert Siman
Original Assignee
Cephalon Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US08/337,795 external-priority patent/US5550262A/en
Application filed by Cephalon Inc filed Critical Cephalon Inc
Publication of FI972029A publication Critical patent/FI972029A/fi
Publication of FI972029A0 publication Critical patent/FI972029A0/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI118325B publication Critical patent/FI118325B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D209/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D209/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom condensed with one carbocyclic ring
    • C07D209/44—Iso-indoles; Hydrogenated iso-indoles
    • C07D209/48—Iso-indoles; Hydrogenated iso-indoles with oxygen atoms in positions 1 and 3, e.g. phthalimide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
    • A61K31/18—Sulfonamides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
    • A61K31/216—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acids having aromatic rings, e.g. benactizyne, clofibrate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
    • A61K31/22—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/275—Nitriles; Isonitriles
    • A61K31/277—Nitriles; Isonitriles having a ring, e.g. verapamil
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
    • A61K31/352—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings, e.g. methantheline 
    • A61K31/353—3,4-Dihydrobenzopyrans, e.g. chroman, catechin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/403—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil condensed with carbocyclic rings, e.g. carbazole
    • A61K31/4035—Isoindoles, e.g. phthalimide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C279/00—Derivatives of guanidine, i.e. compounds containing the group, the singly-bound nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C279/30—Derivatives of guanidine, i.e. compounds containing the group, the singly-bound nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups having nitrogen atoms of guanidine groups bound to nitro or nitroso groups
    • C07C279/32—N-nitroguanidines
    • C07C279/36—Substituted N-nitroguanidines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C311/00—Amides of sulfonic acids, i.e. compounds having singly-bound oxygen atoms of sulfo groups replaced by nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C311/01—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C311/02—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to acyclic carbon atoms of an acyclic saturated carbon skeleton
    • C07C311/09—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to acyclic carbon atoms of an acyclic saturated carbon skeleton the carbon skeleton being further substituted by at least two halogen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C311/00—Amides of sulfonic acids, i.e. compounds having singly-bound oxygen atoms of sulfo groups replaced by nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C311/30—Sulfonamides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by singly-bound nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C311/45—Sulfonamides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by singly-bound nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups at least one of the singly-bound nitrogen atoms being part of any of the groups, X being a hetero atom, Y being any atom, e.g. N-acylaminosulfonamides
    • C07C311/47—Y being a hetero atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C311/00—Amides of sulfonic acids, i.e. compounds having singly-bound oxygen atoms of sulfo groups replaced by nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C311/50—Compounds containing any of the groups, X being a hetero atom, Y being any atom
    • C07C311/52—Y being a hetero atom
    • C07C311/64—X and Y being nitrogen atoms, e.g. N-sulfonylguanidine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C337/00—Derivatives of thiocarbonic acids containing functional groups covered by groups C07C333/00 or C07C335/00 in which at least one nitrogen atom of these functional groups is further bound to another nitrogen atom not being part of a nitro or nitroso group
    • C07C337/06—Compounds containing any of the groups, e.g. thiosemicarbazides
    • C07C337/08—Compounds containing any of the groups, e.g. thiosemicarbazides the other nitrogen atom being further doubly-bound to a carbon atom, e.g. thiosemicarbazones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D311/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings
    • C07D311/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D311/04—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring
    • C07D311/58—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring other than with oxygen or sulphur atoms in position 2 or 4
    • C07D311/70—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring other than with oxygen or sulphur atoms in position 2 or 4 with two hydrocarbon radicals attached in position 2 and elements other than carbon and hydrogen in position 6
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F5/00—Compounds containing elements of Groups 3 or 13 of the Periodic Table
    • C07F5/02—Boron compounds
    • C07F5/025—Boronic and borinic acid compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/02—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link
    • C07K5/0207—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link containing the structure -NH-(X)4-C(=0), e.g. 'isosters', replacing two amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06086—Dipeptides with the first amino acid being basic
    • C07K5/06095—Arg-amino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C2601/00—Systems containing only non-condensed rings
    • C07C2601/06—Systems containing only non-condensed rings with a five-membered ring
    • C07C2601/08—Systems containing only non-condensed rings with a five-membered ring the ring being saturated

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Macromonomer-Based Addition Polymer (AREA)
  • Pyrane Compounds (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

118325
Multikatalyyttisen proteaasin inhibiittoreita
Ristiviite liittyviin hakemuksiin Tämä patenttihakemus on osittaista jatkoa US-pa-5 tenttihakemukseen sarjanumero 464 398, joka jätettiin 5. kesäkuuta 1995, joka on osittaista jatkoa US-patenttihakemukseen sarjanumero 337 795, joka jätettiin 14. marraskuuta 1994.
Keksinnön aihepiiri 10 Tämä keksintö koskee multikatalyyttisen proteaasin (MCP) inhibiittoreita, koostumuksia, jotka sisältävät tällaisia inhibiittoreita, ja menetelmiä MCP-inhibiittorien käyttämiseksi esimerkiksi lihasmassan menetyksen hidastamiseksi erilaisissa fysiologisissa tiloissa.
15 Keksinnön tausta
Eukaryoottiset solut hajoavat jatkuvasti ja korvaavat soluproteiinia. Tämä tekee solulle mahdolliseksi selektiivisesti ja nopeasti poistaa proteiineja ja peptidejä, joiden konformaatiot ovat epänormaalit, harjoittaa 20 aineenvaihdunnallisten reittien kontrollia säätämällä sää-telypeptidien tasoja, ja antaa käyttöön aminohappoja ener-giaksi milloin tarpeen, kuten nälkiintymisessä. Katso Goldberg, A. L. ja St. John, A. C., Annu. Rev. Biochem.
* · .···, 45. (1976) 747 - 803. Nisäkkäiden solumekanismit mahdollis- .·, · 25 tavat useita reittejä proteiinien hajoamiselle. Jotkut * · · .1' ' näistä reiteistä vaikuttavat vaativan energian käyttöä φ · · adenosiinitrifosfaatin ("ATP") muodossa. Katso Goldberg, * · · **’ * A. L. ja St. John, supra.
Multikatalyyttinen proteaasi (MCP, jota kutsutaan : "" 30 tyypillisesti myös "multikatalyyttiseksi proteinaasiksi", • · · *...· "proteasomiksi" , "multikatalyyttiseksi proteinaasikomplek- siksi", "multikatalyyttiseksi endopeptidaasikompleksiksi", .*··. "2OS-proteasomiksi" ja "ingensiiniksi") on korkean moleky- • · "* ylipainon (700 kDa) omaava eukaryoottinen ei-lysosomaali- ..li* 35 nen proteinaasikompleksi, joka esittää osaa ainakin kah- • · · · • · • · 118325 2 dessa solureitissä proteiinien hajottamiseksi peptideiksi ja aminohapoiksi. Katso Orlowski, M., Biochemistry 29:45 (1990) 10289 - 10297. Kompleksilla on ainakin kolmen eri tyyppistä hydrolyyttistä aktiivisuutta: (1) trypsiinin 5 kaltaista aktiivisuutta, jossa peptidisidokset tulevat pilkotuiksi emäksisten aminohappojen karboksyylipuolelta; (2) kymotrypsiinin kaltaista aktiivisuutta, jossa peptidi-sidokset tulevat pilkotuiksi hydrofobisten aminohappojen karboksyylipuolelta; ja (3) aktiivisuutta, jossa peptidi-10 sidokset tulevat pilkotuiksi glutamiinihapon karboksyylipuolelta. Katso Rivett, A. J. , J. Biol. Chem. 264:21 (1989) 12215 - 12219; ja Orlowski, suora.
Yhteen proteiinihydrolyysireittiin, johon liittyy MCP, liittyy myös polypeptidi "ubikitiini". Hershko, A. ja 15 Crechanovh, A., Annu. Rev. iochem. 51 (1982) 335 - 364.
Tämä reitti, joka vaatii MCP:tä, ATP:tä ja ubikitiinia, vaikuttaa olevan vastuussa hyvin epänormaalien proteiinien, tiettyjen lyhytikäisten normaalien proteiinien ja valtaosan proteiineista kasvavissa fibroblasteissa ja kyp-20 syvissä retikulosyyteissä hajoamisesta. Katso Driscoll, J. ja Goldberg, A. L. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86 (1989) :**· 787 - 791. Tämän reitin mukaan hajotettavat proteiinit sitoutuvat kovalenttieti ubikitiiniin lysiiniaminoryh- • · ,···, miensä välityksellä ATP-riippuvaiseen tapaan. Ubikitii- • · 25 niin konjugoidut proteiinit hajottaa sitten pieniksi pep- · ' tideiksi ATP-riippuvainen proteaasikompleksi 26S proteaso- millä, joka sisältää MCP:n proteolyyttisessä ytimessään. *·* ' Goldberg, A. L. ja Rock, K. L., Nature 357 (1992) 375 - 379.
• · : *·· 30 Toista proteiinihajotusreittiä, joka vaatii MCP:tä t · ί.,.ϊ ja ATP:tä mutta ei vaadi ubikitiinia, on myös kuvattu.
Katso Driscoll, J. ja Goldberg, A. L·., supra. Tässä pro- • ·· [··.. sessissa MCP hydrolysoi proteiineja ATP-riippuvaisella ta- • · valla. Katso Goldberg, A. L. ja Rock, K.L., supra. Tämä 35 prosessi on havaittu luustoon kiinnittyneessä lihaksessa.
· • · • · · • · 118325 3
Katso Driscoll ja Goldberg, supra. Kuitenkin on esitetty, että lihaksessa MCP toimii synergistisesti toisen pro-teaasin, multipaiinin, kanssa, mikä johtaa siten lihaspro-teiinin nopeutuneeseen hajoamiseen. Katso Goldberg ja 5 Rock, supra.
On raportoitu, että MCP toimii proteolyyttisellä mekanismilla, jossa aktiivisen kohdan nukleofiili on N-pään treoniinitähteen hydroksyyliryhmä. Täten MCP on ensimmäinen tunnettu esimerkki treoniiniproteaasista. Katso 10 Seemuller et ai.. Science 268 (1995) 579 - 582; Goldberg, A. L., Science 268 (1995) 522 - 523.
Soluproteiinin synteetisten ja degradatiivisten reittien suhteelliset aktiivisuudet määrittävät, kerään-tyykö proteiinia vai hajoaako sitä. Proteiinimassan epä-15 normaali menetys liittyy useihin sairaustiloihin kuten lihasten surkastuminen, sydämen vajaatoiminta, keuhkolaajentuma, lepra, aliravitsemus, luun pehmeneminen, lapsen akuutti leukemia ja syöpäliitteinen näivettyminen. Lihasmassan menetystä havaitaan myös ikääntymisessä, pitkäai- 20 kaisessa sairaalassa olossa tai pitkäaikaisessa vuodepoti laana olossa sekä kroonisessa alaselän kivussa.
;T: Hermon poistamisen tai käytämättömyyden seurauksena ·*·,· luustoon kiinnittyneet lihakset surkastuvat nopeasti, mikä • · .**·. johtaa huomattavaan laskuun koossa, proteiinipitoisuudessa »»* .·. : 25 ja supistusvoimassa. Tämä surkastuminen on tärkeä tekijä * ·· ' ihmisen monissa hermoihin ja lihaksiin liittyvissä sai- • · · rauksissa. Proteiinien hajoamisen kiihtyminen on osoitettu • · · *** ' pääasialliseksi syyksi lihasten katoamiseen hermojen pois tumisesta johtuvassa surkastumisessa. Furono, K., et ai..
: ** 30 J. Biochem. 265:15 (1990) 8550 - 8557. Vaikka spesifistä ·*· prosessia tai spesifisiä prosesseja, jotka liittyvät pro- i*. teiinihydrolyysiin lihaksessa, ei ole identifioitu, on ,···. tarjolla todisteita, jotka liittävät MCP:n osallistumisen • · ’·* lihasproteiinien nopeutuneeseen hajoamiseen. Katso esimer- 35 kiksi Furono, supra. ja PCT-hakemusjulkaisu WO 92/20 804 • · :.*·· (julkaisupäivämäärä 26. marraskuuta 1992).
. 118325 4 MCP-aktiivisuuden on osoitettu osallistuvan useihin sairaustiloihin. Esimerkiksi on raportoitu MCP:n epänormaalin korkea ilmentyminen ihmisen leukemiasolulinjoissa. Kumatori, A., et ai. . PNAS 87 (1990) 7071. On samoin ra-5 portoitu autovasta-aineista MCP:ta vastaan potilaissa, joilla on systeeminen punahukka ("SLE"). Arribas, J., et ai.. J. Exp. Med. 173 (1990) 423 - 427.
Tarvitaan aineita, jotka kykenevät inhiboimaan MCP-kompleksia; tällaiset aineet antaisivat käyttöön arvokkaan 10 työkalun esimerkiksi sekä MCP-aktiivisuuden alan tutkimusta harjoittaville että lääketieteen alan ammattilaisille esimerkiksi epänormaalin tai poikkeavan MCP-aktiivisuuden tuhoisten vaikutusten kontrolloimiseksi. Esillä oleva keksintö koskee näitä tärkeitä kohteita.
15 Keksinnön yhteenveto
Esillä oleva keksintö koskee uusia multikatalyyt-tisen proteaasin ("MCP") inhibiittoreita. Esillä oleva keksintö käsittää myös menetelmiä MCP:n inhiboimiseksi tietyissä sairaustiloissa, mukaan lukien lihasten surkas-20 tumishäiriöt.
Yhtenä näkökohtana annetaan käyttöön yhdisteitä, #...t joiden kaava on: • · · • ·
• * · A
'· “ O O
·· ||
I"·:’ 25 R — (CH-)— CH- C — NH- CH— C — NH- R
1 2, , (
:R, R
• · · * · ·
Mukaan kuuluvat jäsenet määritellään infra. kuten ·*·,, 30 myös edullisesti mukaan kuuluvat jäsenet.
.·**. Keksinnön mukaiset yhdisteet ovat käyttökelpoisia tn „· lukuisissa käyttöyhteyksissä. Esimerkiksi näitä yhdisteitä • · • " voidaan käyttää tutkimuskäytöissä in vitro- ja in vivo !·..* -mallien edelleen täsmentämiseksi ja kehittämiseksi MCP- ··· 35 reitin mekanistiseen ymmärtämiseen sekä peptidiantigeenien ·*·· * · t t « • i« • · 5 118525 esittämiseen pääasiallisen histokompabiliteettikompleksin luokan I (MHC I) reitin välityksellä.
Kliinisessä ympäristössä patentoitavaksi vaadittuja koostumuksia voidaan käyttää MCP-aktiivisuuden inhi-5 bointiin, lihasmassan menetyksen vähentämiseen, lihasten surkastumishäiriöiden hoitoon, superoksididismutaasin hajoamisen vähentämiseen sekä häiriöiden hoitoon, jolle on tunnusomaista superoksididismutaasiaktiivisuuden lasku.
Esitetään myös metodologioita keksinnön mukaisten 10 yhdisteiden valmistamiseksi.
Yhdisteiden näitä ja muita piirteitä esitetään laajennetussa muodossa julkistuksen edetessä.
Piirustusten kuvaus
Kuviossa 1 esitetään julkistettujen MCP-inhibiit-15 torien suoritusmuotojen vaikutus elektroporaation läpi käyneiden OVA-solujen prosessointiin M12.B6-soluilla.
Kuviossa 2 esitetään OVA-pitoisuuden vaikutus prosessoinnin keksinnön mukaisella suoritusmuodolla inhibi-tioon.
20 Kuviossa 3 esitetään OVA-pitoisuuden vaikutus pro sessoinnin keksinnön mukaisella suoritusmuodolla inhibi-·*·*· tioon.
.•.J Kuviossa 4 esitetään fysikaalinen kartta, jossa • · ,···. määritellään SOD-l-geeni ja FALS-mutaatioiden, restriktio- • · t"*. 25 kohtien ja PCR-alukkeiden sijainti.
• ·« ,1 * Kuviossa 5 esitetään SOD-l-tasojen kvantiointi • · *,,, ohimenevästi transfektoiduissa 2 93-soluissa inkuboinnin • · · '·* * jälkeen MCP-inhibiittorien suoritusmuodoilla pitoisuutena 5 μΜ.
: *·· 3 0 Kuviossa 6 esitetään erilaisten SOD-l-isoformien • · · ϊ,,.ϊ annos-vaste keksinnön mukaiselle suoritusmuodolle.
Kuviossa 7 esitetään SOD-l-vaihdon olevan MCP-ak- • ·» *·.. tiivisuuden funktio.
• φ • · ··· ··· ··· • · * · · • ·· • · 6 118321
Yksityiskohtainen kuvaus edullisista suoritusxnuo- doista Tämä keksintö antaa käyttöön MCP-inhibiittoreita, näitä inhibiittoreita sisältäviä koostumuksia ja menetel-5 miä näiden inhibiittorien käyttämiseksi. Keksinnön mukaisia MCP-inhibiittoreita esittää esimerkiksi kaava: O o
Il II
R — (CH-)— CH- C — NH- CH— C — NH- R
10 1 2 n | | 4
R, R
2 3 jossa R1 valitaan ryhmästä, jonka muodostavat -C=N, 15 -0(=0)01^, ftalimido, -NH-SO^ ja -NH-J; R2 valitaan ryhmästä, jonka muodostavat H, hydrok-syyli, alkyyli, jossa on 1 - 10 hiiltä, ja sykloalkyyli, jossa on 3 - 7 hiiltä;
Rj valitaan ryhmästä, jonka muodostavat -(CH2)ro-NH-20 C(=N-R5) -NH2, -R6-N02, -R6-J ja -R6-CN; R4 on -CH (CH2-R7) -Q; Q valitaan ryhmästä, jonka muodostavat -CH-R», • · · ö . -C(=0)CH3, -C(=0)CHzC1, -C (=0) CHgBr, -C(=0)CHzF, -C(=0)CHF2, -c(=o)cf3, -C(=0)C(=0)R7, -c(=o)c(=o)-nh-r7, -C(=0)C02-R7, *:·*! 25 -C (=0) C0-H, -B(OH),, • * * C C • ·· • · —B—0 —B—0 —B—0 —B X(CH2)p
V· M | I II
0—(C(CH3)2)2 , 0—(CHiJp , o—W ja °x ,m 30 (CHOq e ··· • · • ♦ ··· joissa p ja q ovat toisistaan riippumatta 2 tai 3; * ·♦ W on sykloalkyyli; e e
*·"* R5 valitaan ryhmästä, jonka muodostavat -N02, -CN
*:* 35 ja -J; e m • · e • ·· e · 118325 7 R6 on - (CH2)m-NH-C(=NH)-NH-; R7 valitaan ryhmästä, jonka muodostavat fenyyli ja alkyyli, jossa on 1 - 8 hiiltä, joka mainittu alkyyliryhmä on mahdollisesti substituoitu yhdellä tai useammalla halo-5 geeniatomilla, aryyli- tai heteroaryyliryhmällä; R8 valitaan ryhmästä, jonka muodostavat =0, »N-NHC (=0) -nh2, -n-oh, =n-och3, =n-o-ch2-c6h5, =NNH-C (=s) -nh2 ja =N-NH-J; R, valitaan ryhmästä, jonka muodostavat vety ja 10 alkyyli, jossa on 1 - 6 hiiltä, joka mainittu alkyyliryhmä on mahdollisesti substituoitu yhdellä tai useammalla halo-geeniatomilla, aryyli- tai heteroaryyliryhmällä; J on suojaryhmä; n on kokonaisluku 3 - 10; ja 15 m on kokonaisluku 2-5.
Joissakin edullisissa suoritusmuodoissa R, on -CsN, -C(=0)OCHj, ftalimido tai -NH-S02CF3 ja muissa edullisissa suoritusmuodoissa R2 on H tai syklopentyyli.
R3 on edullisesti - (CH^j-NH-C^N-Rj) -NH2.
20 Q on edullisesti -CH-R8, -B(OH)2, -C (=0) C (=0) NH-R7 tai sen rakenne on: ··· • · · • « · • —b—o —b—o
···* I I tai I I
25 0-(c(Ohhh O-(Ofe)p • · • · · • ·· • · : *·· Rj on edullisesti -N02, -CH, -PMC, -MTR, -MTS tai :T: Tos.
R7 on edullisesti -CH(CH3)2, -(CH2)2-CH3, -CH2-CH3 tai 30 -c6h5.
Rg on edullisesti =0, *N-0H, =N-0-CH2-C6H5, «NNH- C(«0)-NH? tai «NNH-C(=S)-NH,.
* ** Joissakin edullisissa suoritusmuodoissa R, on *···* -C(=0)0CH3, ftalimido tai -NH-S02CF3; R2 on syklopentyyli; ··· 35 Rj on - (CH2)3-NH-C(=N-N02)-NH2; R7 on -CH(CH3)2; ja Rg on =0.
• · • ♦ • ·· • · 118325 8
Toisissa edullisissa suoritusmuodoissa R1 on -CsN; R2 on syklopentyyli; R3 on - (CH2)3-NH-C (=N-N02) -NH2 tai - (CH2)3-NH-C(=N-J) -NH2; R? on -CH(CH3)2; ja R8 on =0.
Muissa edullisissa suoritusmuodoissa R,, on -CsN; R2 5 on syklopentyyli; R3 on - (CHZ) 3-NH-C (=N-N02)-NH2 tai - (CH2)3-NH-C(=N-J) -NHz; R7 on -CH(CH3)2; Q on -CH-R8; ja R8 on =N-NHC(=0)-NH2, =N-0H, «N-0CH3 tai =N-0-CH2-C6Hs.
Tässä käytettynä ilmaisun "alkyyli" piiriin tarkoitetaan kuuluviksi suoraketjuiset, haarautuneet ja syk-10 liset hiilivedyt kuten etyyli-, isopropyyli- ja syklopen-tyyliryhmät. Substituoituja alkyyliryhmiä ovat alkyyli-ryhmät, joissa yksi tai useampi vetyatomi on korvattu halogeenilla, muilla hiilivetyryhmillä (esimerkiksi fenyyli-ryhmällä), heteroaryyliryhmällä tai ryhmällä, jossa yhden 15 tai useamman hiiliatomin katkaisevat happiatomit. Edullisissa alkyyliryhmissä on 1 - noin 8 hiiliatomia. Tässä käytettynä ilmaisulla "halogeeni" on tavallinen merkityksenä ja sen piiriin sisältyvät fluori, kloori, bromi ja jodi, joista fluori on edullinen halogeeni. Ilmaisulla 20 "Arg" on esillä olevassa keksinnössä käytettynä tavallinen merkityksenä lyhenteenä aminohaposta "arginiini".
;*·*; Joissakin suoritusmuodoissa keksinnön mukaiset yh- t ϊ disteet sisältävät suojaryhmiä. Tässä käytettynä ilmaisua .···. "suojaryhmät" käytetään laajassa merkityksessä. Suojaryh- • · 25 mät tunnetaan sinänsä kemiallisina funktionaalisina ryh-• · · »
• M
.1 * minä, jotka voidaan selektiivisesti liittäää funktionsa- • · lisuuksiin ja poistaa niistä, kuten hydroksyyl i ryhmät, • · · *·' * aminoryhmät ja karboksyyliryhmät. Nämä ryhmät ovat läsnä kemiallisessa yhdisteessä tällaisen funktionaalisuuden te- • · : **· 30 kemiseksi inertiksi kemiallisiin reaktio-olosuhteisiin • · * nähden, joille yhdiste altistetaan. Mitä tahansa monilu- ;*! kuisesta määrästä suojaryhmiä voidaan käyttää esillä • · · \..t olevassa keksinnössä. Yksi tällainen suojaryhmä on f tai- • · *" imidoryhmä. Muita edullisia keksinnön mukaisia suojaryhmiä ..)·* 35 ovat seuraavien kaavojen mukaiset: • · • · · • M • · 9 118325 —^—OCHj —-SOj—·^ —
MIR MTS
5
10 PMC TOS CBZ
Lisää edustavia tämän keksinnön käytäntöön sopivia suojaryhmiä voidaan löytää julkaisusta Greene, T. W. ja Wuts, P.G.M., "Protective Groups in Organic Synthesis", 2. 15 painos, Wiley & Sons, 1991, jotka julkaisut sisällytetään tähän täten kokonaisuudessaan viitteiksi.
Kuten edellä mainittiin, MCP-aktiivisuus on yhdistetty lukuisiin häiriö- ja sairaustiloihin. Koska tässä julkistetut yhdisteet ovat käyttökelpoisia MCP-aktiivi-20 suuden inhiboinnissa ja koska tällaisten yhdisteiden käyttökelpoisuutta voidaan hyödyntää sekä tutkimus- että ,···, terapiaympäristössä, metodologiat MCP-aktiivisuuden inhi- • · · l . boimiseksi saattamalla MCP kosketuksiin keksinnön mukaisen lit • · · yhdisteen kanssa käsittävät yhdisteen antamisen nisäkkääl- • · ***** 25 le, mukaan lukien ihminen, lääkkeenä tai farmaseuttisena • · · *· *: aineena.
• · • * i " Tässä käytettynä ilmaisulla "kosketuksiin saat- *·· V * taminen" tarkoitetaan kosketuksiin saatettavien osuuksien suorasti tai epäsuorasti yhteensaattamista siten, että 30 osuudet tulevat fyysiseen kosketukseen keskenään. Koske- :***: tuksiin saattamista ovat siten fyysiset toimenpiteet kuten ·· ..* osuuksien sijoittaminen yhdessä astiaan tai osuuksien an- • ·· *... taminen potilaalle. Täten esimerkiksi "kosketuksiin saat- • · ’*;·* tamisen" määrittelyn piiriin kuuluu keksinnön mukaisen ..|j* 35 yhdisteen antaminen ihmispotilaalle, jolla on sairaus tai • · • · · • M • · 118325 10 häiriö, jossa MCP-aktiivisuudet ovat epänormaaleja ja/tai poikkeavia liittyen tällaisen sairauteen tai häiriöön.
Edullisissa suoritusmuodoissa keksinnön mukaisia farmaseuttisia koostumuksia annetaan potilaille, jotka 5 kärsivät häiriöistä, eli epänormaalista fyysisestä tilasta, sairaudesta tai patofysiologisesta tilasta, johon liittyvät epänormaalit ja/tai poikkeavat MCP-aktiivisuudet . Häiriöitä, joihin keksinnön mukaisia koostumuksia annetaan, ovat edullisesti ne, joissa suoraan tai epäsuoraa-10 ti tapahtuu lihasmassan häviämistä (eli menetystä), tosiin sanoen kyseessä on lihaksen häviämishäiriö. Näitä sairauksia ovat surkastumat, sydämen vajaatoiminta, keuhkolaajentuma, lepra, aliravitsemus, luun pehmeneminen, lapsen akuutti leukemia ja AIDS- tai syöpäliitteinen näivettymi-15 nen.
Keksinnön asianyhteydessä "antaminen" tarkoittaa farmaseuttisen koostumuksen viemistä potilaaseen. Edullisia antomenetelmiä ovat laskimonsisäinen, ihonalainen ja lihaksensisäinen anto. Edulisesti yhdiste annetaan 20 farmaseuttisessa koostumukseesaa, joka käsittää yhdisteen yhdistettynä farmaseuttisesti hyväksyttävään kantajaan, :T: kuten fysiologiseen suolaliokseen. Muita sopivia kantajia löytyy käsikirjasta "Remington's Pharmaceutical Sciences" • · .···. (Mack Pub. Co., Easton, PA 1980).
• t · : 25 Tässä kuvattujen yhdisteiden pitoisuudet farmaseut- *· ** ··, tisessa koostumuksessa vaihtelevat riippuen lukuisista • ·« tekijöistä, mukaan lukien annettavan lääkkeen annostus, • · · * * · • käytettujen yhdisteiden kemialliset ominaispiirteet (esim.
hydrofobisuus) ja antotite. Yleisesti ottaen tämän keksin- • · * 30 nön mukaiset yhdisteet voidaan antaa vesipohjaisessa fy- • · ·
Biologisessa puskuriliuoksessa, joka sisältää noin 0,1 -·*·,, 10 % w/v yhdistettä, ruoansulatuskanavan ulkopuolisesta.
t ,·**. Tyypillinen annosalue on noin 1 Mg/kg - noin 1 g/kg • · · • ruumiinpainoa päivässä; edullinen annosalue on noin ··· ···! 35 0,01 mg/kg - 100 mg/kg ruumiinpainoa päivässä. Annettavan t · * · · • M • * 118325 11 lääkkeen edullinen annostus riippuu todennäköisesti sellaisista muuttujista kuten sairauden tai häiriön tyyppi ja laajuus, kyseisen nimenomaisen potilaan yleinen terveydentila, valitun yhdisteen suhteellinen biologinen tehokkuus 5 ja yhdistetäyteaineen koostumus sekä yhdisteen antotie. Tässä käytettynä ilmaisulla "potilas" tarkoitetaan minkä tahansa tyyppistä selkärankaista. Edullisesti potilas on ihminen.
Lihassurkastumat ovat geneettisiä sairauksia, joil-10 le on tunnusomaista lihaskuitujen etenevä heikkous ja rappeutuminen ilman todisteita hermojen rappeutumisesta. Duchennen lihassurkastumisessa (DMD) potilaat osoittavat keskimäärin 67 %:n laskua lihasmassassa, ja lihasten jän-teyden surkastumisessa fraktionaalisen lihasproteiinisyn-15 teesin on osoitettu laskeneen keskimäärin 28 %:lla ilman mitään vastaavaa laskua ei-lihasproteiinisynteesissä (mikä mahdollisesti johtuu häiriintyneestä pääte-elinvasteesta anabolisiin hormoneihin tai substraatteihin). Kiihtynyt proteiinien hajoamminen on osoitettu DMD-potilaiden lihak-20 sissa.
Vakavalle sydämen vajaatoiminnalle (CHF) on tun- :*·*· nusomaista "sydämen näivettyminen", eli lihasten proteii- •\! nihukka sekä sydän- että luustoon kiinnittyneissä lihak- • · ,*··. sissa, mihin liittyy ruumiinpainon keskimäärin 19 %:n las- »M* ( ,·, · 25 ku. Sydämen näivettymisen aiheuttaa lihassyiden proteii- • Il .! * nihajoamisen kasvanut nopeus.
• Il
Keuhkolaajentuma on krooninen keuhkosairaus, jossa • t * *·* * sisään ja ulos virtaavan ilman vastus on lisääntynyt keuhkoputkien kapeutumisen takia, ja keuhkolaajentumaksi • · ! ** 30 määritellään distaalisesti päässä sijaitseviin ei-respi- ··· ratorisiin keuhkoputkiin sijaitsevien ilmatilojen laajen- tuminen, mihin liittyy tuhoisia muutoksia keuhkorakkuloi-* ·· * * .···. den seinämissä. Keuhkojen vähentyneen toiminnan kliinisiä • · *·* ilmentymiä ovat yskiminen, hengityksen vinkuminen, tois- ...Γ 35 tuvat hengitystie-infektiot, nesteen kertyminen keuhkoihin • · f « · • ·· • · 118325 12 sekä funktionaalinen heikentyminen ja lyhentynyt elämän odotettu pituus. Tyrosiinivuoto on kasvanut 47 % keuhko-laajentumapotilailla. Samoin koko ruumiin leusiinivuoto pysyy normaalina, koko ruumiin leusiinin hapetus kasvaa ja 5 koko ruumiin proteiinisynteesi laskee. Tuloksena on lasku lihasten proteiinisynteesissä, mihin liittyy lasku koko ruumiin proteiinivaihdossa ja luustoon liittyvien lihasten lihasmassassa. Tästä laskusta tulee lisääntyvästi ilmeinen taudin edetessä ja pitkäaikaisessa rapppeutumisessa.
10 Sokeritaudissa tapahtuu käsien pienten lihasten yleinen surkastuminen, joka johtuu kroonisesta osittaisesta hermojen poistumisesta (hermosairaus). Tämä on mitä ilmeisintä ja pahenee sairauden pitkäaikaisen etenemisen ja vakavuuden myötä.
15 Lepraan liittyy lihasten surkastuminen, joka esiin tyy peukalon ja etusormen välisiin kätranenluihin kiinnittyneissä lihaksissa. Vakavalle aliravitsemukselle on tunnusomaista mm. lihasten vakava surkastuminen.
Luun pehmeneminen on ravitsemuksellinen häiriötila, 20 jonka aiheuttaa D-vitamiinin ja kalsiumin puutos. Sitä kutsutaan "riisitaudiksi" lapsilla ja "luun pehmenemisek-;*·*: si" aikuisilla. Sille on tunnusomaista luiden pehmeneminen (joka johtuu heikentyneestä mineralisaatiosta, johon liit- • » .···. tyy luuta muistuttavan aineen liiallinen akkumulaatio) , • · 25 kipu, arkuus, lihasten surkastuminen ja heikkous, anorek- • ·* * siä ja painon yleinen lasku. Se voi olla seurausta alira- • *♦ vitsemuksesta, toistuvista raskauksista ja imetyksestä • i * '·* * (D-vitamiini- ja kaisiumivarantojen loppuun kuluttaminen tai tyhjeneminen) ja D-vitamiiniresistenssistä.
: *** 30 Lapsuuden akuutissa leukemiassa on proteiiniener- ··· gia-aliravitsemus, joka johtaa luustoon kiinnittyneiden lihasten surkastumiseen. Tutkimukset ovat osoittaneet, * · · ,···, että jotkut lapset osoittavat lihasten surkastumista jo * 9 *" ennen leukemian diagnosointia, jolloin lasku lihasmassassa 35 on keskimäärin 27 %. Samanaikaisesti tapahtuu 33 - 37 %:n • · • · · « ·· • · 118325 13 nousu rasvakudoksen määrässä, jolloin tämä ei -johda suhteellisen ruumiinpainon ja jäsenen halkaisijan nettomuutokseen.
Syöpään liittyvä kuihtuminen on kompleksinen oire-5 yhtymä, jota esiintyy vaihtelevasti potilailla, joilla on kiinteitä kasvaimia ja veren maligniteetteja. Kliinisesti syöpäliitteinen kuihtuminen ilmenee painon menetyksenä, johon liittyy massiivinen sekä rasvakudoksen että rasvattoman lihasmassan menetys, ja se on syövästä johtuvan kuolo leman yksi syy. Syöpäkuihtumispotilaiden eloonjääntiajat ovat lyhyemmät ja heidän vasteensa kemoterapiaan on laskenut. Lihasten surkastumista tuottavien häiriöiden lisäksi muut olosuhteet ja tilat vaikuttavat liittyvän jollakin tavoin lihasmassan laskuun. Tällaisia sairaustiloja ovat 15 kroonisesta selkäkivusta, ikääntymisestä, sairaudesta tai vammasta johtuvasta pitkäaikaisesta sairaalassa olosta, alkoholismista ja kortikosteroiditerapiasta johtuva lihasten surkastuminen.
Tutkimukset ovat osoittaneet, että kroonisen ala-20 selkäkivun vakavissa tapuksissa tapahtuu selkärangan viereisten lihasten surkastumista. Vähentynyt selkärangan vi-:*·*· ereisten lihasten surkastuminen lievittää kipua ja paran- : taa funktiota.
• «· • · .···. Uskotaan myös, että vanhuuden ajan yleinen heikkous *···* .·, · 25 johtuu lihasten surkastumisesta. Elimistön ikääntyessä • e· * kasvavan osuuden luustoon kiinnittyvästä lihaksesta korvaa sidekudos. Tuloksena on merkittävä lihasvoiman lasku, mut- * * *·* * ta vaan vähäinen lasku rasvattomassa massassa.
Tutkimukset ovat osoittaneet, että potilailla, #*· J ·· 30 jotka kärsivät vammoista tai kroonisista sairauksista ja ·#· jotka viettävät sairaalassa pitkän ajan, esiintyy pitkä-:% kestoista yksipuolista lihasten surkastumista, johon .«··. liittyy keskimäärin 31 %:n lasku lihasmassassa. Tutkimuk- • « *·* set ovat niinikään osoittaneet, että tämä voidaan korjata ··· ···* • · • Φ · • ·· • » 118325 14 intensiivisellä fysioterapialla. Kuitenkin lääketerapian lisääminen voi olla tehokkaampaa monille potilaille.
Alkoholisteilla esiintyy etummaisen sääriluuhun kiinnittyneen lihaksen surkastumista. Tämän Proksimaalisen 5 lihaksen vaurion aiheuttaa hermostoperäinen vaurio, nimittäin heikentynyt glykolyyttisen ja fosforylaasientsyymin aktiivisuus. Vaurio tulee ilmeiseksi ja pahenee mitä pitempi on alkoholin väärinkäytön kesto. Kortikosteroideilla hoidetuilla potilailla ilmenee lihasmassan menetystä.
10 MCP:n on osoitettu aktivoivan tulehduksen solun- sisäisen välittäjän, jota kutsutaan NFkappaB:ksi. Katso Baeuerle, P. A. ja Henkel, T., Annu. Rev. Immunol. 12 (1994) 141 - 179. MCP-inhibiittoreilla on tämän vuoksi mahdollisesti käyttöä autoimmuuni- ja tulehdussairauksien 15 hoidossa.
Keksinnön mukaisia yhdisteitä voidaan käyttää lihasmassan edeltävistä kuten myös muista tiloista johtuvan menetyksen lievittämiseksi. Lisäksi keksinnön mukaiset MCP-inhibiittorit ovat käyttökelpoisia eläinlääketieteel-20 lisissä ja eläintenhoitokäytöissä vastustamaan painon me netystä eläimissä tai edistämään kasvua, ί'ϊ'ί MCP: n on osoitettu liittyvän peptidiantigeenien •\! presentaatioon pääasiallisen histokompabiliteettikonqplek- • · .···. siluokan I (MHC I) reitillä. Katso Goldberg ja Rock, sup- ,·. · 25 ra; katso myös Rock et ai. . Cell 78 (1994) 761 - 771, jo- • ·· ' hon julkaisuun viitataan tästä eteenpäin maininnalla "Rock • ·· *... et ai.11. MCP-inhibiittoreilla on tämän vuoksi käyttöä tut- • · ·
'·* ' kimusreagensseina tutkimuksissa, joissa halutaan MCH I
-reitin inhibitiota, sekä sairauksien ja häiriötilojen **· ! ** 30 lievityksessä, joihin liittyy poikkeava ja/tai epänormaali ·«· antigeenien MHC-1-prosessointi. Koska useimpien MHC-I-mo- I*.tt lekyyleillä esitettyjen peptidien täsmällinen alkuperä ei .···. edelleenkään ole selvä ja koska viime aikoina on kertynyt * · *** todistusaineistoa siitä, että MCP saattaa esittää osaa 35 MHC-I-presentaatiossa (katso Rock et ai. . supra) , julkis- • · • · · • ♦· f « 118325 15 tettujen MCP-inhibiittorien kaltaiset reagenssit, jotka salpaavat antigeenien MHC-I-presentaatioon proteolyyttisen prosessoinnin, olisivat käyttökelpoisia tämän reitin merkityksen selvittämiseksi.
5 Yllättäen on myös todettu, että keksinnön mukaiset MCP-inhibiittorit ovat niinikään käyttökelpoisia Cu/Zn-superoksididismutaasi-1 ("SOD-l") -entsyymin aktiivisuuden tehostamiseksi. Täten nämä yhdisteet ovat käyttökelpoisia sekä tutkimusympäristöissä SOD-l-vajaiden systeemien tut-10 kimiseksi sekä hermoston rappeutumis- tai muiden häiriötilojen hoitamiseksi, joille on karakteristista lasku SOD-1-entsyymiaktiviisuudessa (eli joissa tällaisen laskun on osoitettu liittyvän häiriötilan syntyyn). Tällaisia tiloja ovat sairaudet, joihin liittyy oksidatiivinen stressi ku-15 ten Parkinsonin tauti, Alzheimerin tauti, Huntingtonin tauti, halvaus, trauma ja iskeemia.
SOD-l on homodimeerinen metalloentsyymi, joka katalysoi toksisen superoksidianionin 02"’ dismutaatiota 02:ksi ja H202:ksi. SOD-l on vapaiden radikaalien sieppaa-20 ja, minkä vuoksi se toimii etulinjan puolustuksena aerobisen aineenvaihdunnan normaalien sivutuotteiden superoksi-:'·*· diradikaalien detoksifikaatiossa. SOD-l :tä esiintyy ensi- ·*.#ϊ sijaisesti eukaryooteissa ja sitä tavataan käytännönises- • ♦ .···. ti katsoen kaikkien solutyyppien sytoplasmassa. SOD-l on . 25 oleellinen entsyymi fysiologisessa vasteessa hapen myrkyl- • ·· S, * lisyyteen, ja sitä on aktiivisesti tutkittu terapeuttisena • *·· aineena oksiaatiiviseen stressiin liittyvissä patologisis- • ♦ · *·* * sa tiloissa. Katso Bannister et ai. . CRC Crit. Rev.
Biochem. 22 (1987) 111 - 180; Halliwell et ai. . Meth.
*· : *" 30 Enzvmol. 186 (1990) 1 - 75; Greenwald, Free Rad. Biol.
ϊ"|ϊ Med. 8 (1990) 201 - 209.
*
Piirteitä, jotka ovat estäneet SOD-l :n käytön te- • ·· ,···. rapeuttisena aineena, ovat sen huono solunsisäinen saata- • · "* vuus eksogeenisesti annettuna ja sen äärimmäisen lyhyt 35 puoliintumisaika seerumissa. Tämän vuoksi yhdisteet, jotka • · * * i • ·· » · 118325 ie tehostavat solunsisäistä SOD-l-aktiivisuutta, tuottaisivat merkittävän parannuksen SOD-l-terapiaan.
ALS on progressiivinen halvauksellinen sairaustila, jonka aiheuttaa suurten liikeneuronien selkäytimessä ja 5 aivoissa rappeutuminen. Noin 5 - 10 % ALS-tapauksista on perheittäin esiintyviä (PALS) ja ne peritään autosomaali-sena dominoivana piirteenä. Vast'ikään 16 eri nonsense-mutaatiota on identifioitu FALSiia sairastavien perheiden alaryhmässä, ja ne esiintyvät SOD-l:tä koodattavassa geen-10 issä. Katso Rosen, D.R., et ai.. Science 261 (1993) 1047 -1051; Deng, H.-X., et ah, Nature 362 (1993) 59 - 62. Nämä mutaatiot johtavat SOD-l-aktiivisuuden laskuun punaisissa verisoluissa ja aivokudoksessa, ja niiden on osoitettu de-stabiloivan SOD-l-proteiinia, mikä johtaa kyseisen entsyy-15 min lisääntyneeseen vaihtoon. Katso Bowling, A.C., et ai., . J, Neurochem. 61 (1993) 2322 - 2325; Borchelt, D.
R. , et ai. . Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91 (1994) 8292 - 8296. Lisäksi on kuvattu ALS:in siirtogeenistä hiirimal-lia, joka perustuu SOD-l:n ja ALS:n väliseen osoitettuun 20 yhteyteen. Brown, R. H., NEJM 331:16 (1994) 1901.
Olemme havainneet, että MCP-inhibiittorimme ovat S0D-l:n tehokkaita positiivisia efektoreita. Edullinen MCP-inhibiittori, jota kutsutaan tässä "yhdisteeksi 14", • · .···, spesifisesti laskee villityypin ja mutantti-SOD-1 :n hajoa- *#·' .·,; 25 mistä annosriippuvaisella tavalla (yhdistenumeromerkinnät • ·· * perustuvat sen esimerkin numeroon, jossa yhdisteen syntee- • ·· si julkistetaan, esim. yhdisteen 14 synteesi esitetään • · t '·* * esimerkissä 14, infra.) Tässä käytettynä SOD-l-hajoamisen väheneminen tarkoittaa sen nopeuden hidastumista, jolla ϊ '*· 30 SOD-l-proteiini katabolisoituu.
·*·
Keksintöä havainnollistetaan edelleen seuraavilla ", esimerkeillä. Näiden esimerkkien tarkoitus on edelleen • ·· ,···, selvittää keksintöä, eikä niiden tarkoiteta rajoittavan t · *" oheisten patenttivaatimusten suojapiiriä.
• 99 ···· • · • · · • «e • * 118325 17
Esimerkki 1
Multikatalyyttieen proteaasln eristäminen ihmisku-doksista
Kuoleman jälkeen otettuja ihmisen maksa- ja aivo-5 näytteitä käytettiin MCP:n eristämiseksi ja osittaiseksi puhdistamiseksi ioninvaihtokromatografisesti, ammonium-sulfaattisaostuksella ja geelisuodatuksella [esim. Driscoll ja Goldberg, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86 (1989) 787 - 791; Yamamoto et ai. . Biochim. Biophvs. Acta 882 10 (1986) 297 - 304] . Kummankin lähtömateriaalin kohdalla kudosta homogenisoitiin 10 tilavuudessa 20 mM Tris-HCl:ää (pH 7,5), joka sisälsi 20 % glyserolia. 30 minuutin sent-rifugoinnin 40 000 x g:ssä jälkeen supernatantista voitiin todeta MCP:n kymotrypsiinin kaltaisen komponentin proteo-15 lyyttinen aktiivisuus (katso alla). Supernatantti frak tioitiin DEAE-Sepharose Fast Flow -kolonnissa, jota oli tasapainoitettu homogenisaatiopuskurissa. Kohden kutakin litraa supernatanttia käytettiin 250 ml hartsia. Näytteen panostuksen jälkeen kolonnia pestiin noin 10 tilavuudella 20 homogenisaatiopuskuria, ja proteiinit eluoitiin käyttäen lineaarista NaCl-gradienttia 0 - 400 mM (21 250 ml:lie ·*·*· hartsia) . Fraktioista määritettiin MCP-aktiivisuus, ja aktiiviset fraktiot yhdistettiin pooliksi ja ne saostet-,···. tiin (NH4)2S04:llä 80 %:n kyllästyksessä. Saostuneet pro- 4I*\ 25 teiinit otettiin talteen sentrifugoimalla, ne uudelleen- * ·· * suspendoitiin homogenisaatiopuskuriin ja panostettiin
Sephacryl S300HR -kolonniin (500 ml:n hartsitilavuus), • · « *·* * joka oli standardoitu nautaseerumiaalbumiinia (68 kDa) käyttäen. Eluoitiin yksittäinen MCP-aktiivisuuspiikki, ·· J *·· 30 joka vastasi molekyylipainoa noin 650 kDa. Tämä valmiste f*· ϊ,,,ϊ oli vapaa muista mitattavista proteolyyttisistä aktiivi- j*. suuksista, ja sen MCP-aktiivisuus säilyi varastoitaessa [··· 4 °C:ssa > 6 kuukauden ajan. Tätä valmistetta käytettiin Φ · *1* useimmissa kokeissa. Valmistetta edelleen fraktioimalla ..I" 35 hydroksiapatiiti-Ultrogel-kolonnissa (Yamamoto et ai. .
• * • i · • ·· • · 118325 18 supra) saatiin puhtaampaa entsyymiä, joka denaturoivan SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesin mukaan koostui odotetuista > 10 alayksiköstä, joiden Mr oli 20 - 35 kDa. Esimerkki 2 5 Määritys MCP:n kymotrypsiinin kaltaiselle ja tryp- siinin kaltaiselle aktiivisuudelle
Edellä kuvatussa menettelyssä MPC:n eristämiseksi muodostui entsyymikompleksi, jonka proteolyytiset aktiivisuudet olivat latentit, jolloin ne kuitenkin voitiin 10 aktivoida lisäämällä matalia pitoisuuksia (0,02 - 0,05 %) SDS:ää (Yamamoto et ai.. suora). Kymotrypsiinin kaltainen aktiivisuus määritettiin seuraavan menettelyn mukaan: 96-kuoppaisille mikrotiitterilevyille laimennettiin ihmisen MCP:tä 4 - 10-kertaisesti homogenisaatiopuskuriin, joka 15 sisälsi 0,04 % SDS:ää. Lisättiin kolorimetristä substraattia MeOSuc-EVKM-para-nitroanilidia (metoksisukkinyyli-Glu-Val-Lys-Met-pNa), joka hankittiin taholta Bachem Bioscience Inc., King of Prussia, Pennsylvania, loppupi-toisuuteen 100 μΜ varastoliuoksesta 10 mM dimetyylisulfok-20 sidissa. Reaktiotilavuudet olivat 200 μΐ/kuoppa. Vaihtele-van pituisten inkubointien 37 °C:ssa jälkeen vapaan pNa:n pitoisuus määritettiin Biotech EL-340 -mikrolevylukijalla, :\j jolloin absorptio luettiin 490 nm:ssä. Proteaasiaktiivi- • · .***. suus määritettiin olosuhteissa, joissa substraatin hydro- .*"· 25 lyysi kasvoi lineaarisesti ajan funktiona ja muutos ab- • ·· * sorptiossa oli suhteessa vapaan pNa:n pitoisuuteen. Vaih- • · · toehtoisesti käytettiin fluorogeenistä substraattia metok- S * * ·’ * sisukkinyyli-Phe-Leu-Phe-aminometyylikumariini (Enzyme
Systems Products, Dublin, CA) , ja muutosta fluoresenssissa • · : *" 30 tarkkailtiin eksitaatio-aallonpituudella 390 nm ja emis- ··· sio-aallonpituudella 460 nm.
Ϊ*. Ihmisen MCP:n trypsiinin kaltainen aktiivisuus mää- • * * ,···. ritettiin kuten edellä on kuvattu modifioiden seuraavasti.
• « *" Reaktiot suoritettiin Tris-glyserolipuskurissa (pH 9,5), 35 jota oli täydennetty pitoisuudella 1 mM 2-merkaptoetanoli, • · * I · • · · • · 118325 19 ja substraattina oli fluorogeeninen substraatti bentsyyli-oksikarbonyyli-Phe-Arg-AMC (100 μΜ).
Vaihtelevan mittaisen inkuboinnin 37 °C:ssa jälkeen määritettiin vapaan AMC:n pitoisuus Fluoroskan II -spek-5 trofluorimetrillä, jonka eksitaatiosuodatin oli 390 nm ja emissiosuodatin 460 nm. Proteaasiaktiivisuus määritettiin olosuhteissa, joissa substraatin hydrolyysi kasvoi lineaarisesti ajan myötä ja muutos fluoresenssissa oli suhteessa vapaan AMC:n pitoisuuteen.
10 Esimerkki 3 IC50-arvojen määrittäminen MCP-inhibiittoreille IC50-arvot määritellään tyypillisesti yhdisteen (tässä tapauksessa julkistetun MCP-inhibiittorin) siksi pitoisuudeksi, joka tarvitaan tuottamaan entsyymin aktii-15 visuuden 50 %:n inhibitio. IC50-arvot ovat käyttökelpoisia yhdisteen aktiivisuuden sen aiottuun käyttöön mittoja. Edullisesti keksinnön mukaisten inhibiittorien IC5Q-arvot ovat alle noin 10 μΜ.
MCP:n kymotrypsiinin kaltaisen tai trypsiinin kal- 20 täisen aktiivisuuden inhibitio määritettiin inkuboimalla entsyymiä eri pitoisuuksilla oletettuja inhibiittoreita 15 minuutin ajan 37 °C:ssa ennen substraatin lisäämistä. Ku- ·*·,· kin koeolosuhde arvioitiin kolminkertaisena, ja tässä ku- • * .**. vatuille inhibiittoreille suoritettiin toistokokeita.
• • · · ,·, : 25 Esimerkki 4 ** ;*a * Solulihashajoamisen inhibition osoitus: painottoman
• M
surkastumisen inhibointi nuorissa rotissa * · · • · · * Määritettin useiden inhibiittorien vaikutus nuorten rottien leveän jalkapohjan lihaksen painottomaan surkastu- ϊ ** 30 miseen. Katso Tischler, M. E., Metabolism 39:7 (1990) «· 756 - 763 (tästä eteenpäin "Tischler-1990") menettelyn e i*.aa yleisen esittelyn osalta.
.·*·. Nuorten naaraspuolisten Sprague-Dawley-rottien *·* (80 - 90 g) häntä kipsattiin ja ne ripustettiin takaraa- ··· *..i 35 joista kuten kuvataan julkaisussa Jaspers, S. R. ja • * • · · • ·· • · 118325 20
Tischler, M.E., J. Appi. Fhvsiol. 57 (1984) 1472 - 1479. Eläimen takaraajat nostettiin lattian yläpuolelle häkissä, johon kukin eläin majoitettiin yksinään. Eläimet voivat vapaasti nauttia ruokaa ja vettä, ja ne punnittiin ripus-5 tusajankohtana sekä päätosajankohtana. Ripustusvaiheen aikana eläimet tarkastettiin päivittäin sen varmistamiseksi, etteivät niiden varpaat kosketa häkin lattiaa ja että häntä ei ollut kipsin johdosta turvonnut, λ. Kokeellinen järjestely - osa 1 10 Kukin koe aloitettiin ripustamalla 20 rottaa, jotka oli satunnaisesti jaettu neljään kulloinkin 5 eläimen ryhmään. Ryhmä A ripustettiin vain 2 päiväksi ja sen eläimistä saatiin pohjalukematietoa, joka likimääräisesti muistutti leveän jalkapohjan lihaksen kokoa toisissa, pitem-15 pään ripustetuissa eläimissä. Keskimääräisiä ruumiinpainoja ryhmille tutkimuksen alussa verrattiin ja käytettiin korjaustekijänä ruumiin kokoeroille. Ryhmä B oli toinen kontrolliryhmä, jonka eläinten yhden raajan leveää jalkapohjan lihasta oli käsitelty mersalyylin vesiliuoksella 20 kahden päivän kuluttua painottomuuden tilassa, hitaan li-hassurkastumisen kyvyn osottamiseksi painottomuuden tilas-:T: sa kullekin eläinryhmälle. Mersalyyliä oli aiemmin tutkit- :*·,· tu, ja sen oli osoitettu estävän surkastumista in vivo • i ;***. -mallissa oleellisesti kuten kuvataan tässä käytetyssä «t» ,·, : 25 protokollassa. Katso Tischler - 1990. Kahden päivän kulutit * tua painottomuuden alkamisesta mersalyylin vesiliuosta • · · (200 nM; 4 μΙ/100 g ruumiin lähtöpainoa) ruiskutettiin • S · • yhteen leveään jalkapohjan lihakseen kuten aiemmin on kuvattu. Ruumiin vastakkaisella puolella olevaan lihakseen • · ϊ ** 30 ruiskutettiin sama tilavuus 0,9-%:ista suolaliuosta • · · ("kantaja") . Eläimiä pidettiin Innovar-vet- (10 μΙ/100 g ruumiin painoa) rauhoituksen alaisena in situ -ruiskutus- * .···. menettelyn aikana. Ruiskeiden annon jälkeen eläimet ripus- • · · tettiin vielä 24 tunniksi ja leveä jalkapohjan lihas poi- ·· •••ϊ 35 stettiin. Ryhmiä C ja D kussakin kokeessa käytettiin jul- • · • · · • ·· • « 118325 21 kistettujen yhdisteiden kummankin kahden eri suoritusmuodon testaamiseksi. Eläimiä käsiteltiin kuten ryhmässä B lukuun ottamatta, että pitoisuus 1 mM MCP-inhibiittoria dimmetyylisulfoksidissa (DMSO) ruiskutettiin yhden jalan 5 leveään jalkapohjan lihakseen ja pelkkää DMSO:ta vastakkaisen puolen leveään jalkapohjan lihakseen. Täten kukin koe koostui kahdesta verrokkiryhmästä ja keksinnön mukaisten MCP-inhibiittorien testaamisesta. Viiden tällaisen kokeen loppuun saattaminen käyttäen eri inhibiittoripareja 10 tuotti "n"-arvon 10 kunkin MCP-inhibiittorin testaamiseksi testaten kukin kahdesta eri eläinlähetyksestä.
B. Leveän jalkapohjan lihaksen prosessointi - osa 1 Kun eläin oli uhrattu, leveä jalkapohjan lihas leikattiin irti, siitä poistettiin rasva ja sidekudos ja se 15 punnittiin huolellisesti. Sitten lihas homogenisoitiin 10-%:isessa trikloorietikkahapossa (TCA) ja saostunut proteiini pelletoitiin sentrifugoimalla. Sitten pelletti pestiin kerran 10-%:isella TCA:11a ja kerran etanoli eetterillä (1:1). Lopullinen pelletti liuotettin 4 ml:aan 1 N 20 natriumhydroksidiliuosta. Sitten näytteestä analysoitiin proteiinipitoisuus biureettimenetelmällä käyttäen albumii-:T: nia standardina.
·*·'· C. Tulosten analyysi - osa 1 • · .*··. MCP-inhibiittorien vaikutusta lihaksen kokonaispro- ,·"· 25 teiinisisältöön tarkasteltiin pääasiassa parivertailulla • ·· •I * ei-käsiteltyyn vastakkaisen puolen lihakseen. Pitoisuus- • st suhde laskettiin, minkä jälkeen se analysoitiin tilastoi- * · · *·* lisesti varianssianalyysillä ("ANOVA"). Vasen jalka oli aina käsitelty jalka, jolloin proteiinipitoisuussuhteita · : **· 30 voitiin verrata myös ei-käsiteltyihin verrokki e laimi in.
Ml Tällä tavalla voidaan osoittaa merkittävä ero vertaamalla kyseisten kahden jalan proteiinipitoisuutta sekä testattu- • ** ,*··, jen MCP-inhibiittorien suhteellinen tehokkuus. Pari- • « "* Student-testi suoritettiin myös kunkin erillisen käsitte- * 35 lyn vaikutukselle. Ei-käsitelty verrokkitieto antoi samoin • · • · f • t· • « 118325 22 arvion proteiinipitoisuudesta päivänä 2. Tämä mahdollisti proteiinimuutosten likimääräistyksen 24 tunnin käsittely-jakson aikana kullekin ryhmälle B, C ja D.
D. Kokeellinen järjestely - osa 2 5 Kukin koe koostui 10 eläimestä, jolloin 5 eläimen ryhmillä testattiin yhden inhibiittorin vaikutusta proteiinisynteesiin. Verrokkieläimiä ei tarvittu tutkimuksen tässä vaiheessa, koska vastakkaisen puolen DMSOrlla käsitelty lihas toimi pariverrokkina inhibiittorilla käsitel-10 lylle lihakselle. Kukin ryhmä sai ruiskeet kuten kuvattiin ryhmille C ja D osassa 1. 24 tunnin kuluttua in situ -käsittelystä proteiinisynteesin fraktionsalinen nopeus analysoitiin kummastakin leveästä jalkapohjan lihaksesta. Kumpaankin lihakseen ruiskutettiin 0,9-%:ista suolaliuosta 15 (3,5 μΙ/lOO g lopullinen ruumiin paino), joka sisälsi 3H- fenyylialaniinia (50 mM; 1 μ€ί/μ1). 15 minuutin kuluttua keskimmäiset 2/3 lihaksesta leikattiin irti ja lihasta prosessoitiin kuten alla kuvataan.
E. Leveän jalkapohjan lihaksen prosessointi - osa 2 20 Lihasta pestiin ensin 10 minuutin ajan 0,84-%:isel- la suolaliuoksella, joka sisälsi pitoisuuden 0,5 mM syklo-ϊΤ: heksimidiä proteiinisynteesin päättämiseksi ja pitoisuuden ·'1.1 20 mM sykloleusiini fenyylialaniinin solussa sitomiseksi.
.·2. Lihasta homogenisoitiin sitten 2,5 ml:ssa jääkylmää M1 ,·, · 25 2-%:ista perkloorihappoa. Saostunut proteiini pelletoitiin sentrifugoimalla. Yksi näyte-erä supernatanttia otettiin • ·· nestetuikelaskentaan ja toista näyte-erää prosessoitiin '1 1 fenyylialaniinin muuttamiseksi fenetyyliamiiniksi liukoi sen fenyylialaniinin pitoisuuden määrittämiseksi fluoro- * '1 30 metrisesti. Katso Garlick, P. J., et ai.. Biochem. J. 192 *«· (1980) 719 - 723,- ja Munoz, K. M., et ai. . Metabolism 1993 |1.4t (painossa) . Nämä arvot antavat solunsisäisen spesifisen ,1··, aktiivisuuden. Fenyylialaniinin spesifinen aktiivisuus · ·' lihasproteiinissa määritettiin proteiinin hydrolysoinnin 2
• M
···! 35 kuumentamalla 6 N HCl:ssä jälkeen. Vapautuneet aminohapot • 1 • · · • ·· • · 118325 23 liuotettiin puskuriin. Yksi näyte-erä otettiin nestetui-kelaskentaan ja toinen fenyylialaniinin sekä supernatant-tifraktion analyysiin. Proteiinisynteesin fraktionaalinen nopeus laskettiin seuraavasti: proteiinin spesifinen ak-5 tiivisuus/solunsisäinen spesifinen aktiivisuus x aika.
F. Tulosten analyysi - osa 2
Proteiinisynteesin analyysit suoritettiin paripe-rusteella kullekin MCP-inhibiittorille. Studentin pari-t-testivertailuilla vastakkaisista lihaksista määritettiin, 10 oliko inhibiittorilla mitään vaikutusta proteiinisynteesiin. Proteiinin hajoaminen voidaan laskea likimääräisesti proteiinisynteesin fraktionaalisena nopeutena (osasta 2) ynnä proteiinin lisääntymisen fraktionaalinen nopeus (osasta 1) , jolloin proteiinihävikin tapauksessa saadaan 15 proteiinin lisääntymiselle negatiivinen arvo.
Kvalitatiivisesti MCP-inhibiittorien kyky hidastaa proteiinimenetystä vaikuttamatta proteiinisynteesiin osoittaa proteiinin hajoamisen hidastumista.
G. Tulokset 20 Taulukossa 1 esitetään MCP-inhibiittorien vaikutuk sen verrokkilihakseen puuttuminen.
:T: Taulukossa 2 esitetään muutos proteiinipitoisuude- ·*·,· ssa painottomuuden 3. päivänä.
• S
.···. Taulukossa 3 esitetään MCP-inhibiittorien vaikutus # ··· ,·, j 25 painottomaan lihasproteiiniin.
• 9t * Taulukossa 4 esitetään MCP-inhibiittorien vaikutus • ·· painottomaan lihassynteesiin.
• · · • Taulukoissa yhdistenumerolla viitataan sen esimerkin numeroon, jossa yhdisteen synteesireitti esitetään.
: '·· 30 • e# • e • · ·♦· e· • · ♦· t tee • · • t • ti e • 999 • ••e • · • · · • ·· • · 24 1 1 8325
Taulukko 1 MCP-inhibiittorien vaikutuksen verrokki lihakseen puuttuminen
Hoito Proteiini (mg/lihas) 5 Kantaja Hoito DMSO 5,9 6,7
Yhdiste 34 6,1 6,3
Yhdiste 14 6,0 6,1
Yhdiste 20 5,7 5,9 10
Taulukko 2
Muutos proteiinipitoisuudessa painottomuuden 3. päivänä
Hoito Proteiini (mg/lihas) Vaikutus P
Alku Loppu (%) 15 Suolaliuos 6,5 5,7 -12 < 0,001 DMSO 6,5 5,9 -10 < 0,001
Mersalyyli 6,4 6,6 +3 <0,05
Yhdiste 34 6,3 6,6 +5 <0,05
Yhdiste 14 6,8 6,4 0 >0,1 20 Yhdiste 20 6,5 6,2 -4 < 0,071
Yhdiste 16 6,3 6,0 -5 < 0,071 ♦marginaalisesti merkitseviä arvoja t ·"1 • · ·
Taulukko 3
St· ϊ„.: 25 MCP-inhibiittorien vaikutus painottomaan lihasproteiiniin
Hoito Proteiini (mg/lihas) Vaikutus P
* Kantaja Hoito (%) • ·· • es #es *·1 1 Mersalyyli 5,7 6,6 14 < 0,001 30 Yhdiste 34 5,9 6,6 12 <0,001 ! 1" Yhdiste 14 6,0 6,4 7 < 0,061 O Yhdiste 20 5,9 6,2 5 <0,05 !1. Yhdiste 16 5,9 6,0 0 >0,1 e t ,···, 1marginaalisesti merkitseviä arvoja • · »1· • s s·· • • ees · • s · • ·· • « 118325 25
Taulukko 4 MCP-Inhibiittorien vaikutuksen painottomaan lihassyntee-siin puuttuminen
Hoito Proteiini (mg/lihas) 5 Kantaja MCP-inhibiittori
Yhdiste 34 14,5 13,3
Yhdiste 14 13,1 13,8 yhdiste 20 14,1 14,6 10 Esimerkki 5 MCP-inhibition osoittaminen MHC-1-prosessointia käyttäen Määritettiin keksinnön mukaisten yhdisteiden kyky inhiboida eksogeenisen OVA-antigeenin prosessointia luokan 15 I pääasiallisella histokompabiliteettireitillä (MHC-I) . MCP-inhibiittorit panostettiin funktionaalinen antigeeni-prosessointisysteemiin, joka sallii inhibiittorin inkluu-sion antigeenin prosessoivaan soluun altistuksen antigeenille aikana, mitä seuraa prosessoivan solun kiinnitys. 20 T-soluhybridoomia lisätään sitten prosessoiviin soluihin inhibiittorin puuttuessa peptidi-MHC-I-kompleksien ilmen-e·.. tymisen määrittämiseksi, joka heijastaa antigeenin proses- • » i I , sointia ennen kiinnitystä.
• · · A. Soluviljelmä • · *··♦' 25 Soluja kasvatettiin 37 °C:ssa kostutetussa ilmake- • e • · · *. *: hässä, jossa CO?-pitoisuus oli 5 %, tavanomaisessa kasvu- ϊ *·· alustassa: DMEM (Gibco, St. Louis, MO), jossa oli 10 % ··· ί.ί S vasikansiskiöseerumia (Hyclone, Logan, UT) , pitoisuus 5 x 10'5 M 2-merkaptoetanolia, antibiootteja ja seuraavat j\. 30 täydennykset: L-arginiini-HCl (116 mg/1), L-asparagiini ·"*. (36 mg/1) , NaHC03 (2 g/litra) , natriumpyruvaatti (1 mM) .
*ee .,· katso myös Harding, C. V., Eur. J. Immunol. 22 (1992) • e 1865 - 1869. M12 .B6-soluja (antelias lahja Osami Ka- • · ’···* nagawalta, Washington University, St. Louis, MO) käytet- ·;· 35 tiin anitgeenipresentaatioon; ne muodostettiin fuusioimal- »··· * e * · · ·. ·: „ 118325 26 la M12.C3-hiiri-B-lymfoomasoluja LPS-stimuloituihin perna-soluihin (B-lymfoblastilähde) C57BL/6-hiirestä. Täten ne ilmentävät H-2b-antigeenejä. DOWB-T-hybrdoomasolut ovat spefisiiä OVA (323-339) -peptidille, joka on sidottu joko 5 I-Ab:hen tai I-Ad:hen. Katso Yewdell et ai.. Science 239 (1988) 637. B3.1-T-hybridoomasolut reagoivat OVA (258- 276) -K^hen.
B. Elektroporaatio- ja antigeeniprosessointitutki- muksia 10 Tullakseen prosessoiduksi ja esitetyksi MHC-I-rei- tillä eksogeenisen antigeenin (muna-albumiini; OVA) on tunkeuduttava prosessoivien solujen solulimaan. OVA vietiin prosessoivien solujen (M12.B6-soluja) solulimaan elektroporaation avulla.
15 Elektroporaatio suoritettiin Gibco BEL Electropora- tor -laitteella käyttäen 0,4 cm:n aukon kyvettikammioita. Kapasitanssi oli 800 μΡ ja jännite 50 - 300 V. Elektroporaatio suoritettiin seerumista vapaassa RPMIrssä tai PMEM:issä (Gibco), jolloin soluja oli 1,5 x 107 M12.B6-SO- 20 lua/ml (0,5 x 107 - 4,0 x 107) OVA:n läsnä ollessa 4 °C:ssa. Solut sijoitettiin välittömästi jäihin. Eri in- j*;’· hibiittoreita lisättiin sitten ja solut siirettiin 18 tai .\t; 37 °C:seen. Lopuksi soluja kiinnitettiin kevyesti noin 10 • » .···, minuutin ajan l-%:isessa paraformaldehydissä ja ne pestiin t·"· 25 perusteellisesti 37 °C:ssa jatkoprosessoinnnin estämisek- • ·· * si. Prosesoinnin laajuus (eli ilmentyneiden spesifisten peptidi-MHC-kompleksien taso) määritettiin M12.B6-solujen • ♦ · *·* * kyvystä stimuloida IL-2-eristystä B3.1- tai DOBW-T-hybri- doomasoluista. T-soluja (105) maljattiin M12.B6-solujen : *·· 30 kanssa (2 x 105 mikäli kiinitettyjä, 5 x 104 jos elinkel- *·· * poisia) 0,2 ml:aan 18 - 24 tunniksi 37 °C:ssa 10z kam- J*. miossa. Molemmat T-hybridoomat reagoivat antigeenistimu- • ** ,···. laatioon erittämällä IL-2:ta (määritettynä supernatanteis- • # "" ta IL-2-riippuvaisten CTLL-solujen lisääntymisestä ja »t·· • e • · e • « • · 118325 27 [3H]-tymidiinin inkorporaatiosta. Katso Allen et al., J. Immunol. 132 1077) .
Tulokset näistä tutkimuksista esitetään kuvioissa 1-3. Kuviossa 1 esitetään yhdisteiden 14 ja 16 vaikutuk-5 set elektroporaation läpikäyneen OVA:n prosessointiin M12.B6-soluilla. Kuvioissa 2 ja 3 esitetään yhdisteiden 14 ja 20 vaikutus MHC-l-OVA-prosessointiin. Molemmat yhdisteet inhiboivat tehokkaasti OVA:n prosessoinnin. Nämä tulokset suovat lisätukea keksinnön mukaisten yhdisteiden 10 MCP:tä inhiboivalle vaikutukselle. Tiedetään, että tavanomaiseen MHC-I-reitiin liittyy antigeenin hajoaminen pro-teasomeilla. Katso Goldberg et ai. . supra. Täten yhdisteitä voidaan käyttää antigeenien proteolyyttisen prosessoinnin merkityksen edelleen ymmärtämiseksi.
15 Esimerkki 6 A. Cu/Zn-superoksididismutaasin (SOD-1) hajoamisen vähentäminen I. Osa 1 - Kloonaus ja mutagenisointi
Hiiren SOD-l-cDNA-klooni saatiin Jim Mahaffeyltä 20 (North Carolina State University, Raleigh, NC) . Tätä kloonia modifioitiin polymeraasiketjureaktio (PCR) ϊΤί -metodologioilla seuraavien inkorporoimiseksi: 1) ·*·,· Kozakin translaation aloituksen konsensussignaali (eli 5 1 - • · .**·. GCCGCCACC-3 1) välittömästi ylävirtaan ATG-aloituskodonis- «•e ,·, · 25 ta, 2) Hindlll-restriktiokohta 5' tästä konsensussignaa- • ·· ' lista ja 3) Xhol-restriktiokohta cDNA:n 3'-päähän. PCR-me- • ·· nettelyihin käytetyt oligonukleotiditalukkeet olivat: 5'- ’·* * aluke (EH87) = 5 '-TCGATCGAAGCTTGCCGCCACCATGGCGATGAAAGC-3 ' (sekvenssi tunnusnumero 1), 3'-aluke (EH88) « ! 30 51-AGCTAGCCTCGAGCAGATTACAGTTTAATG-3' (sekvenssi tunnus- ··* numero 2) . Saatua PCR-tuotetta pilkottiin restriktioent- j\it syymeillä Hin-dIII ja XhoI ja kloonattiin Hindlllrlla ja ,···, XhoI:llä pilkottuun vektoriin pBluescript II SK+ (Strata- * · *·’ gene Cloning Systems, La Jolla, CA) , jolloin saatiin pSK- ...T 35 HX2.
• · 9 * · • «· • · 118325 28 FALS-pistemutaatiot aminohapossa 4 (Ala4 -» Vai) (GCG -+ GTG) ja aminohapossa 113 (Ile113 Thr) (ATT -* ACT) vietiin SOD-l-cDNA-klooniin pSK-HX2 käyttäen limittyvän laajentamisen PCR-mutagenisointimenettelyä, jota kuvaavat 5 Ho et ai. . Gene 77 (1989) 51 - 59. Ile113 -» Thr -mutantti rakennettiin seuraavasti: 5' PCR-fragmentti muodostettiin käyttäen 5'-aluketta EH78; joka koostui nukleotidisekvens-sistä 5'-TTAATCCTCACTCTAAGAAAC-3' (sekvenssi tunnusnumero 3) (nukleotidit 193 - 213 SOD-l-cDNA:ssa, jolloin nro 1 on 10 ATG-aloituskodonin A), ja 3'-aluketta EH84; joka koostui nukleotidisekvenssistä 5 ' -TTGTACGGCCAGTGATGGAATGCT-3 ' (sekvenssi tunnusnumero 4) (nukleotidit 351 - 328), 3'-PCR-fragmentti rakennettiin käyttäen 5'-aluketta EH83; joka koostui nukleotidisekvenssistä 15 5'-AGCATTCCATCACTGGCCGTACAA-3' (sekvenssi tunnusnumero 5) (nukleotidit 328 - 351), ja 3'-aluketta EH42; joka koostui nukleotidisekvenssistä 5'- TAATACGACTCACTATAGGG-3' (sekvenssi tunnusnumero 6) (nukleotidit 626 - 645 pBluescript II SK+:ssa). 50 ng sekä 5'- että 31-PCR-fragmenttia yhdis-20 tettiin PCR-reaktion toisessa vaiheessa ja monistettiin käyttäen alukkeita EH78 ja EH42. Tämä PCR-tuote pilkottiin ·'!*· Ballzllä ja XhoI:llä ja kloonattiin Ballrllä ja XhoI:llä .\tJ pilkottuun pSK-HX2:een, jolloin natiivi 255 ep:n Ball/ * *! ,···. Xhol- fragmentti tuli korvatuksi FALS-mutantti fragment il la • · t"\ 25 (klooni pSK-113) .
* ·* / ,1 ' Ala -+ Vai -mutantti rakennettiin seuraavasti: • 5'-PCR-fragment ti muodostettiin käyttäen 5'-aluketta • · · EH105; joka koostui nukleotidisekvenssistä 5'-GCACACCACTTTCATCGCCATGGTGGCGGCAAGCTTCOATC-3'(sekvenssi ·· ϊ *·· 30 tunnusnumero 7) (nukleotidit +21 - -20), ja 3'-aluketta • * · EH41; joka koostui nukleotidisekvenssistä ;·. 5 '-ATTAACCCTCACTAAAGGGA-3 ' (sekvenssi tunnusnumero 8) (nuk- • ·· ]··, leotidit 792 - 773 pBluescirpt II SK+:ssa). 3'-PCR- • · T fragmentti muodostettiin käyttäen 5'-aluketta EH104, joka 35 koostui nukleotidisekvenssistä • · • I » * ·· • · 118325 29 5 ' -GATCGAAGCTTGCCGCCACCATGGCGATGAAAGTGGTGTGC- 3 ' (sekvenssi tunnusnumero 9) (nukleotidit -20 - +21), ja 3'-aluketta EH103; joka koostui nukleotidisekvenssistä 5'-CTTCAGTTAATCCTGTAA-3' (sekvenssi tunnusnumero 10) (nuk-5 leotidit 123 - 106). Kuten edellä 50 ng sekä 5'- että 3'-PCR-fragmenttia yhdistettiin PCR-reaktion toisessa vaiheessa ja monistettiin käyttäen alukkeita EH41 ja EH103. Tämä PCR-tuote pilkottiin HindIII:lla ja RsrII:lla, ja kloonattiin HindIII:lla ja RsrII:lla pilkottuun pSK-10 HX2:een, jolloin natiivi 51 ep:n Hindlll/RsrII-fragmentti tuli korvatuksi FALS-mutanttifragmentilla (klooni pSK-A4V) . Kaikki edellä kuvatut PCR-tuotteet sekventointiin käyttäen Sequenase-menetelmää (UC Biochemical, Cleveland, OH) mutaatioiden läsnäolon ja mahdollisten PCR-virheiden 15 puuttumisen varmistamiseksi. Kuviossa 4 esitetään SOD-1-geeni määritellen mutaatioiden, alukkeiden ja restriktio-kohtien sijainnit.
SOD-l-cDNA-ilmentämisvektorit rakennettiin pilkkomalla villityypin (pSK-HX2) ja mutanttirakenteet (pSK-113 20 ja pSK-A4V) HindIII:lla ja Xholillä. Kukin saaduista kolmesta 546 ep:n fragmentista, jotka sisälsivät SOD-l-cDNA-·*·*: sekvenssit, kloonattiin erikseen HindIII:lla ja XhoI:llä
Aj pilkottuun pcDNA-I/Neo:oon (Invitrogen Corp., San Diego, • · .···, CA) , jolloin saatiin vastaavasti pCMV-HX5 (villityypin • · 25 SOD) , pCMV-113 (Ile113 -» Thr) ja pCMV-A4V (Ala4 Vai).
II. Osa 2 ♦ ·
Suoritettiin alustavia kokeita sen määrittämiseksi, • » * *·* * johtuiko FALS-mutantti-SOD-1-proteiinien alentunut stabii lisuus MCP-välitteisestä proteolyyttisestä hajoamisesta.
·· ϊ *·* 30 Ihmisen munuaissolulinja nimeltä 293 (ihmisen 293-solut M· tai 293-solut) saatiin talletuslaitoksesta the American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, • ··
Rockville, Maryland, 20852 (ATCC #CRL 1573), ja sitä kas- * · T vatettiin Dulbeccon modifioidussa Eagle-kasvualustassa, .,*·* 35 jossa oli 4,6 g/litra glukoosia, 10 % lämpöinaktivoitua • · • · · • ·· • · 118325 30 hevosseerumia (Gibco/Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD) . Ihraisen 293-soluja pidettiin 37 °C:ssa ilmakehässä, joka sisälsi 5 % C02:ta. 293-solut transfektoitiin tilapäisesti kalsiumfosfaattiraenetelmää käyttäen [Chen, C., et 5 ai. . Biotechnicrues 6, (1988) 632] . pCMV-113-S0D-l-ilmentä-misvektori vietiin 293-soluihin, ja 24 tunnin kuluttua soluja inkuboitiin 24 tunnin ajan joko yhdisteellä 34, yhdisteellä 14 tai yhdisteellä 24, joita kaikkia käytettiin pitoisuus 5 μΜ. Tunnetut MCP:tä ja muita proteaaseja inhi-10 boivat yhdisteet liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO). Muita 293-soluviljelmiä inkuboitiin samassa tilavuudessa DMSO:ta tai ne jätettiin vain kasvualustaan negatiivisiksi verrokeiksi.
Noin 48 tuntia ennen testiyhdisteiden vastaanotta-15 mistä 5 x 105 293-solua siirrostettiin 36 mm:n maljoihin, joita pidettiin 37 °C:ssa ilmakehässä, joka sisälsi 5 % C02:ta. Soluja inkuboitiin MCP-inhibiittoreilla (yhdiste 34, 14 tai 24) tai DMSO:11a negatiivisena verrokkina 24 tunnin ajan. Solulysaatit valmistettiin aikaansaamalla so-20 luissa lyysi noin 75 μ1:88Ά fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS) jäädytys/sulatuskierrätyksellä. Solulysaat-•|"i tien proteiinipitoisuudet määritettiin BCA-menetelmällä •*.t! (Pierce, Rockford, IL), ja 2 - 2,5 μg:lla kutakin näytettä • · ,···. suoritettiin elektroforeesi 4 - 20-%:isessa polyakryyli- • · ,·, · 25 amidigeelissä (Novex, San Diego, CA) käyttäen Tris/glysii- • ♦· Λ * ni/SDS- (25 mM Tris/192 mM glysiini/0,1 % SDS) puskurisys- • ·· teemiä. Proteiinit siirrettiin nitroselluloosasuodattimil- • * · le elektroeluutiolla ja suodattimia salvattiin inkuboimal-la Blotto-liuoksessa (5 % kuivamaitoa 25 mM Tris-puskuroi- ·· ! *·· 30 dussa suolaliuoksesa (lx TBS) 30 minuutin ajan. Suodatti-
• M
·„.* met siirettiin primaarisen vasta-aineen liuokseen (1:10 j*. 000 laimennos Blotto-liuoksessa) ja inkuboitiin 2-18 • ** f···, tunnin ajan. Näissä tutkimuksissa käytetty primaarinen t · *!* vasta-aine oli polyklonaalinen kaniini-antiseerumi, joka ...V 35 oli tuotettu vastaan puhdistettua hiiri-SOD-1:tä, joka oli • · • · ♦ • ·· « · 118325 31 tuotettu IL. colissa (Hazelton Research Products, Denver, PA) . Suodattimia pestiin kolmasti 5 minuutin ajan kulloinkin lx TBS:ssä ja inkuboitin sekundaarisen vasta-aineen liuoksessa (1:2 000 laimennos Blotto-liuoksessa) kahden 5 tunnin ajan. Sekundaarinen vasta-aine oli vuohen anti-kaniini -IgG konjugoituna alkaliseen fosfataasiin (Bio-Rad, Richmond, CA) . Suodattimia pestiin kolmeen kertaan 5 minuutin ajan kulloinkin lx TBS:ssä ja värjättiin alkalinen fosfataasaktiivisuuden suhteen inkuboimalla 5-60 minuu-10 tin ajan kaupallisesti saatavana olevassa alkalisen fos-fataasin toteamisreagenssissa (Bio-Rad, Richmond, CA). SOD-1-proteiinia vastaavat värjätyt nauhat kvantitoitiin käyttäen DocuGel V -kuva-analyysisysteemiä ja RFLPscan-oh-jelmaa (Scanalytics, Billerica, MA) . SOD-l-tasot ilmais-15 taan induktioyksikköinä suhteessa negatiiviseen kontrolliin (eli kokeelliset yksiköt jaettuna kontrolliyksiköil-lä) . Solulysaattien blot-immuunianalyysissä ilmeni, että SOD-l-tasot olivat kohtuullisesti kohonneet verrattuna verrokkitasoihin kussakin kolmessa näytteessä, joita inku-20 boitiin MCP-inhibiittorien läsnä ollessa (kuvio 5). Nämä tulokset osoittavat, että MCP:n inhibitio keksinnön mukai-silla yhdisteillä johtaa SOD-1-proteiinien kasvaneeseen • <1 «9 .·. : akkumulaatioon Ile -> Thr -mutanttiin, ja osoittaa siten • · * .···* MCP:n olevan vastuussa SOD-1 :n laskeneista tasoista FALS- • · 25 mutaation sisältävissä soluissa.
• * · I; III. Osa 3 • · • " Sen edelleen osoitamiseksi, että MCP-aktiivisuus on ··· • · · ’·* * vastuussa SOD-1-vaihdosta, suoritettiin tutkimuksia solu- linjoilla, jotka tuottivat stabiilisti villityypin hiiri- • *·· 30 SOD-1- tai FALS-mutanttiproteiineja, eli Vai AlaSn tilalla ja Thr Ile113:n tilalla. Solulinjoja, jotka ilmentävät ··* stabiilisti hiiren natiivin SOD-1 :n ja edellä mainitut • ·· "... kaksi FALS-mutantti-SOD-1-proteiinia, saatiin transfektoi- • m "* maila kalsiumfosfaattimenetelmällä [Chen, C., et ah, Bio- ..*·* 35 techniques 6 (1988) 632] 293-soluja SOD-1-cDNA-ilmentämis- • · * · · • ·· • · 118325 32 rakenteilla (kuvataan edellä) , minkä jälkeen valikoitiin neomysiiniresistenssin suhteen kasvattamalla 1 mg:n/ml G418:aa (Geneticin™, Gibco/Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) läsnä ollessa. Soluja pidettiin G418-va-5 likoinnissa 3 viikon ajan, minkä jälkeen lääkevälikointi poistettiin ja G418-resistentit pesäkkeet kustakin transformoidusta solutyypistä yhdistettiin pooliksi edelleen kasvatettaviksi. Näissä tutkimuksissa käytettiin yhdistettä 14.
10 Solulinjoja, jotka ilmentävät mainitut SOD-l-iso- formit, inkuboitiin eri pitoisuuksilla yhdistettä 14 24 tunnin ajan, jona ajankohtana SOD-1-tasot mitattiin blot-immuunisiirtojen densitometrisellä pyyhkäisyllä. SOD-1-tasot ilmaistaan induktioyksikköinä suhteessa näyttei-15 siin negatiivisista verrokeista (kuten edellä) ja kukin tulospiste on kolmen kokeen keskiarvo. Yhdisteen 14 annos-vasteanalyysi osoitti, että transformoitujen solujen inku-bointi tällä MCP-inhibiittorilla johti SOD-1-proteiinitasojen merkittäviin akkumulaatioihim maksimiakkumulaatioi-20 den esiintyessä niissä soluissa, joita inkuboitiin yhdisteellä 14 pitoisuutena noin 20 μΜ (kuvio 6). Lisäksi SOD-1-akkumulaation koko korreloi eri SOD-proteiinien arvioi- t ·\ϊ tuihin puoliintumisaikoihin; jolloin villityypin SOD-1 on • · / ,···. stabiilein ja Ala -» Vai on vähiten stabiili [Borchelt, D.
• · .·"· 25 R., et al_^, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91 (1994) 8292 - • · · ’ 8296] . Nämä tulokset sopivat siihen olettamukseen, että FALS-mutaatiot destabiloivat SOD-1-proteiinit, mahdolli- S * * ·* * sesti virheellisen laskostumisen johdosta, ja seurauksena mutaatioista johtuvat rakenteelliset muutokset kohdentavat • : 30 nämä proteiinit hajoamiseen MCP:llä. Nämä tulokset osoit- * · tavat myös, että yhdisteellä 14 on tilastollisesti merkit-tävä vaikutus villityyppi-SOD-l-proteiinin vaihtoon, mikä ]···. edelleen tukee MCP:n roolia SOD-l-hajoamisessa.
* ··· * ··· ·*·* * • · · • ·· • · 118325 33 IV. Osa 4 MCP-aktiivisuuden spesifisyyden osoittamiseksi SOD-1-vaihdossa (sekä muiden pääasiallisten proteolyyttisten reittien mahdollisen osallistumisen poissulkemiseksi, ku-5 ten kalsiumaktivoitu proteaasi kalpaiini ja lysosomaaliset proteaasit) suoritettiin kokeita, joissa kahta transformoitua solulinjaa (kuvataan edellä, yksi tuottaa villi-tyypin proteiinia ja toinen SOD-1-proteiinia, Ala* -» Vai -mutaatioin) inkuboitiin eri proteaasi-inhibiittoreilla, 10 joista kukin oli spesifinen yksittäiselle proteolyyt-tiselle aktiivisuudelle: yhdiste 14 inhiboi MCPitä; "Calpeptin"-valmiste [Novabiochem USA, La Jolla, CA, kata-loginro 03-34-0051; CBZ-Leu-Nle-aldehydi, Biochem. Biophvs. Res. Commun. 153 (1988) 1201] , soluun tunkeutuva 15 "kalpaiini"-inhibiittori (kalpaiini on kysteiiniproteaa-si) ; ja DK-3 (Enzyme Systems Products, Dublin, CA, CBZ-Phe-Ala-CHNg) inhiboi lysosomaalista proteaasiaktiivisuut-ta. Lisäksi soluja inkuboitiin yhdisteellä 16, joka on vähemmän tehokas MCP-inhibiittori verrattuna keksinnön 20 mukaiseen erityisen edulliseen yhdisteeseen, eli yhdisteeseen 14. Mainitut SOD-1-isoformit ilmentäviä solulinjoja inkuboitiin 24 tunnin ajan seuraavilla proteaasi-inhibiit- .·. : toreilla: yhdiste 14, 20 μΜ; Calpept in-valmiste, 10 μΜ; • · · t*..* DK-3, 5 μΜ) ; yhdiste 16, 20 μΜ; tai DMSOilla negatiivisena * · "*. 25 kontrollina. 24 tunnin inkuboinnin inhibiittoreilla jäi- • il " keen SOD-l-tasot mitattiin blot-immuunisiirtojen densito- « · 1 " metrisellä pyyhkäisyllä. SOD-l-tasot ilmaistaan induktio- *.* * yksikköinä suhteessa ei-käsiteltyihin näytteisiin, kuten edellä. Kukin tulospiste on 3 kokeen keskimääräinen tulos.
• *.· 30 Tulokset esitetään kuviossa 7. Voidaan havaita, ;***: että Ala4 -* Vai -mutantti-SOD-1 :n vaihto on MCP-aktiivisuu- • · · ./ den funktio ja vain MCP:n spesifinen inhibitio edullisella • · * *,,, yhdisteellä 14 johtaa merkittävään (kolminkertaiseen) nou- • · *·;** suun SOD-1-proteiinin akkumulaatiossa. Inkuboinnilla kal- 4>||* 35 paiinin tai lysosomaalisten proteaasien inhibiittoreilla • · • · · • · · • · 118325 34 ei ollut huomattavaa vaikutusta SOD-1-vaihtoon. Edelleen yhdisteellä 14 käsitteleminen johti lievään nousuun villi-tyypin SOD-1:n akkumulaatiossa, joka havainto tehtiin myös aiemmin annos-vastetutkimuksissa. Yhdessä tarkasteltuina 5 nämä tutkimukset osoittavat, että MCP-aktiivisuus on kriittinen SOD-1-vaihdolle transformoiduissa 293-solulin-joissa, ja että MCP:n inhibitio yhdisteellä 14 johtaa solun SOD-1-proteinitason nousuun.
Inhibiittorien synteesi 10 Seuraavassa esitetään esimerkkejä synteesiteistä esillä olevan keksinnön mukaisten yhdisteiden valmistamiseksi. Muutkin synteesiprotokollat sekä seuraavien syntee-sireittien muunnelmat ovat ilmeisisiä alan ammattilaisille heidän tutustuessaan esillä olevaan julkistukseen.
15 Keksinnön mukaiset inhibiittorit sisältävät amidi- sidoksia, jotka voidaan viedä mukaan tutuilla synteesime-nettelyillä käyttäen liuosfaasitekniikoita, joita kuvataan kirjassa "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology", osa I, toim. Gross et al.. Academic Press, 1979, ja kuvataan 20 yksityiskohtaisesti jäljempänä esimerkeissä 8-11.
Inhibiittorit voidaan valmistaa syntetisoimalla ;-1· erikseen ja liittämällä yhteen seuraavat fragmentit: • · • » » • ··
Rr (CH2)n-CH(R2)-COOH ja HgN-CH (¾) -C0NH-R4 Γ1. 25 • » · • · · .1 1 kytkemismenettelyn I mukaan kuten kuvataan esimerkeissä • · • ·» ·. 14 - 38.
··· • · ·
Vaihtoehtoisesti ne voidaan valmistaa syntetisoimalla erikseen ja liittämällä yhteen seuraavat fragmentit: j ’·· 30 S1”: Rr (CH2)n-CH(R2)-CONH-CH(Rj)-COOH ja H^-R1 ·· • · • ·· kytkemismenettelyn II mukaan kuten kuvataan esimerkeissä T1 39 - 42.
* ···· · • · · • · • · 118325 35
Kun substituentti Q sisältää aldehydiryhmän [eli kun HgN-R,^ on aminoaldehydi, joka on saatu aminohaposta, esim. HZN-CH (CH2R7)-CHO] , tarvittava asetaalisuojattu aminoaldehydi voidaan syntetisoida kuten kuvaavat Gacek et 5 ai.. Tetrahedron 30 (1974) 4233, tai esimerkissä 12 kuvatuilla menettelyillä. Kun kytkeminen on saatettu loppuun (kytkemismenettelyillä I tai II) , asetaalisuojaryhmät voidaan poistaa kuten kuvataan esimerkissä 11 (menetelmä E) vapaan aldehydiryhmän vapauttamiseksi.
10 Kun Q on metyyliketoni tai diatso-, bromi- tai kloorimetyyliketoni (eli kun H2N-R4 on alfa-aminosubsti-tuoitu metyyliketoni tai aminohaposta saatu alfa-diatso-, alfa-bromi- tai aifa-kloorimetyyliketoni), kytkemismenet-tely II on erityisen kätevä. Kloorimetyyliketönin hydro-15 kloridisuola voidaan ostaa (Bachem Bioscience Inc., King of Prussia, Pennsylvania) tai se voidaan valmistaa Boc-suojatun aminohapon konversiolla sekahiilihappoanhydridik-si, minkä jälkeen suoritetaan reaktio diatsometaanin kanssa diatsometyyliketonin saamiseksi. Bromi- ja kloorimetyy-20 liketonit valmistetaan diatsometyyliketonin reaktiolla bromi- tai kloorivedyn kanssa kuten kuvaavat Kettner et .'I*. ai. . Arch. Biochem. Biophvs- 162 (1974) 56; Fittkau, J^_
,·, : Prakt. Chem. 315 (1973) 1037; tai Zimmerman et ai. . PCT WO
• M
,*··] 95/15 749, joka on julkaistu 15. kesäkuuta 1995.
• · I". 25 Vastaavat metyyliketonit voidaan valmistaa kloori- metyyliketonien hydrogenolyysillä kuten kuvaavat Kettner • · • ^* et ai. . US-patentti julkaisu 4 652 552.
• * *·’ * Kun Q on alfa-difluorimetyyliketoni, vastaava l-amino-3,3-dif luori-2-propanoli voidaan valmistaa ja kyt-
• I
• '·· 30 keä kyt kerni smenettelyllä II, ja saatu difluorialkoholi ha- pettää difluoriketoniksi menettelyllä, jota kuvaavat ;·[ Trainor ja Stein, US-patenttijulkaisu 4 923 890.
• Il
Kun Q on trifluorimetyyliketoni [eli kun H2N-R4 on "* aminohappoperäinen trifluorimetyyliketoni, esim. H2N-CH- ,,)·* 35 (CH2-R7) -COCFj] , tarvittava ketoni voidaan valmistaa kuten * ·
I · I
• *·
• I
36 1 1 8325 kuvaavat Imperiali ja Abeles, Biochemistry 25 (1986) 3760 ja täydentävät sivut.
Kun Q on monofluorimetyyliketoni [eli kun sisältää fluorimetyyliketoniryhmän, esim. HjN-CH (CHg-I^)-5 COCH-jF] , joka on saatu aminohaposta, tarvittava ketoni voidaan valmistaa Palmerin menettelyllä, EP-patenttihakemus-julkaisu 442 754 käyttäen Boc-suojattua aminohappoa ja magnes iumbent syyli fluorimalonaatt ia. Boc-suoj aryhmien poistamisen jälkeen amiini voidaan kytkeä käyttäen kytke-10 mismenettelyä II. Vaihtoehtoisesti monofluorimetyyliketoni voidaan valmistaa hapettamalla vastaava alkoholi kuten kuvataan esimerkissä 42.
Kun Q on booriaminohappo j ohdannainen [eli Q = -B(0H)2 tai sen syklinen esteri], syklinen esteri valmis-15 tetaan oleellisesti kuten kuvaa Shenvi, US-patenttijulkai-su 4 537 773, ja kytkemisen jälkeen kytkemismenettelyllä II se voidaan mahdollisesti muuttaa vapaaksi peptidiboori-hapoksi kuten kuvaavat Shenvi ja Kettner US-patenttijulkaisuissa 4 499 082 ja 5 187 157 ja julkaisussa J. Biol. 20 Chem. 259 (1984) 15106.
Kun Q on alfa-diketoni tai alfa-ketoesteri [eli Q = :*·’· -C (=0) C (=0) Rj tai -C(=0)C02R7] , tarvittavat aminodiketönit : tai alfa-ketoesterit voidaan valmistaa kuten kuvaavat • «t • · .···. Angelastro et ai.. J. Med. Chem. 33 (1990) 13, ja siinä . 25 esitetyt viitteet. Alfa-ketoesterit voidaan hydrolysoida • ·· * tai amidoida vastaavien alfa-ketohappojen tai -amidien tuottamiseksi. Alfa-ketoamidit voidaan valmistaa myös • · · kaupallisesti saatavana olevista Boc-suojatuista aminohapoista Harbesonin et ai. menettelyn, J. Med. Chem. 37 ·« i ’·· 30 (1994) 2918 - 2929, muunnoksella. Tässä viimemainitussa ··· ϊ.,.ί hyvin käyttökelpoisessa menettelyssä Boc-suojattu amino- happo muutteaan sarjassa Ν,Ο-dimetyylihydroksyylamidiksi, » ·· aldehydiksi, syaanihydriiniksi, alfa-hydroksikarboksylaa- • · T tiksi ja alfa-hydroksikarboksamidiksi: • ··· -V r-
• 3 S
f · • ♦ · • · · • » 118325 37 R’-COOH -» R1-CON(CHj) -OCH3 R’-CHO -> R’-CHiOHj-CN ->
R1-CH (OH) -COOH -> R1-CH(OH)-CONH-R
jossa R1 = Boc-NH-CH (CH2R7) - .
5 Boc-ryhmä poistetaan happamissa olosuhteissa ja neutraloinnin jälkeen vapaa aminotahde kytketään kuten kytkemismenettelyssä II alfa-hydroksikarboksamidin saamiseksi, joka siten hapetetaan alfa-ketokarboksamidi-inhi-biittorin saamiseksi: 10
Boc-NH-CH (CH2R7)-CH (OH)-CONH-R7 -» H2N-CH(CH2R7) -CH(OH) -CONH-R7 - (kytkemismenettely II) -* R,- (CH2)n-CHR2-CONH-CH(R3) -CONH-CH (CH2R7) -CH(OH) -CONHR? R,- (CH2)n-CH(R2) -CONH-CH (R3) -CONH-CH (CHzR7) -COCONH-R7 15
Esimerkki 7
Menetelmä At Seka-anhydridimenetelmä
Kaavio:
20 IBCF
Χ-ΑΑ,-COOH + HjN-AAg-Y -* X-AA1-AA2-Y
NMM
f * « •
• I
• f · *· #* .··· X = f luorenyylimetyylioksikarbonyyli- (Fmoc) tai • · #I". 25 t-butyylioksikarbonyyli- (Boc) ryhmä; Y = asetaali tai muu • ·* „ * aminoaldehydin suojaryhmä; • · •ttt AA, = aminohappo; • · « "·' * AA2 = aminoaldehydi .
N-metyylimorfoliinia (NMM) (1 ekv.) lisättiin se- • '·· 30 koitettuun liuokseen, jossa oli suojattua aminohappoa tet- :.„ϊ rahydrofuraanissa (THF). Seos jäähdytettiin -15 °C:seen, ··) siihen lisättiin isobutyylikloroformaattia (IBCF) (1,1
• M
]... ekv.) ja annettiin reagoida 10 minuutin ajan. Sitten li- · sättiin aminoaldehydikomponentti vapaana emäksenä ja sit-35 ten NMM (1,1 ekv., 2,2 ekv. mikäli happosuola) . Sekoitta- * *. ·: 118325 38 mistä jatkettiin 30 minuutin ajan -15 °C:ssa ja sitten huoneenlämpötilassa 3-4 tunnin ajan. Reaktioseos liuotettiin 150 - 200 ml:aan etyyliasetaatta (EtOAc). Saatu liuos pestiin peräkkäin vedellä, 5-%:isella natriumvety-5 karbonaatti- (NaHC03) liuoksella, sitruunahapon 2-%:isella vesiliuoksella ja lopuksi vedellä. Orgaaninen faasi kuivattiin kidevedettömällä natriumsulfaatilla (Na2S04) tai magnesiumsulfaatilla (MgS04) , liuotin poistettiin alipaineessa ja näin saatua tuotetta trituroitiin petrolieette-10 rissa. Näin saatu kiinteä peptidi suodatettiin eroon, kuivattiin ja karakterisoitiin.
Esimerkki 8
Menetelmä B: Fmoc-suojaryhmänpoistomenettely
Kaavio: 15
Fmoc-HN-AA^AAj-Y Ι^Ν-ΑΑ,-ΑΑ^Υ
Fmoc-suojatun peptidin (0,2 - 4 rnrnol) seoksessa, jossa oli 30 % dimetyyliformamidia (DMF) etyyliasetaatissa 20 (EtOAc), annettiin reagoida 50 - 60-kertaisen ylimäärän dietyyliamiinia (DEA) kanssa 2 tunnin ajan huoneenläm- ·*·*· Potilassa. Liuotin haihdutettiin eroon alipaineessa ϊ 30 °C:ssa ja jäännökseen lisättiin petrolieetteriä. Kun • * ,···. sakka muodostui, se suodatettiin eroon ja kuivattiin.
• · 25 Muissa tapauksissa saatua kumia trituroitiin useaan ker- • ·· * taan petrolieetterissä ja kumi varastoitiin tyhjöön.
• e
Esimerkki 9 • · · *·* * Menetelmä C: Salpausryhmän tai aminohapon lisäämi nen peptidiin ·· ϊ *·· 30 Kaavio: • •a • · • ♦ ♦ ·· :·* R-COOH + H,N- (AA) -COOR' -» R-CO-HN-(AA) -COOR' • «· fin n 9 a·· • • f T Salpausryhmää (vapaana karboksyylihappona) tai suo- ..*·* 35 jattua aminohappoa (1 ekv.), bentsotriatsol-l-yylioksi- • · • · · • ·· a · 118325 39 tris(dimetyyliamino)fosfoniumheksafluorifosfaattia (BOP) (1,1 ekv.) ja 1-hydroksibentsotriatsolia (HOBt) (1 ekv.) liuotettiin 5 ml:aan DMF:ää ja lisättiin NMM:ää (2,2 ekv.). Viiden (5) minuutin kuluttua lisättiin peptidin 5 suojaryhmää vailla olevaa emäksistä komponenttia tai kar-boksyyliryhmässä suojattua aminohappoa, pH säädettiin 8:ksi ja seosta sekoitettiin 3-4 tunnin ajan. Sitten sitä laimennettiin 150 - 300 ml :11a EtOAcrtä ja uutettiin toisiaan seuraten vedellä, 2-%:isella NaHC03-liuoksella, 10 vedellä, 2-%:isella sitruunahapolla ja vedellä. Orgaaninen faasi kuivattiin ja haihdutettiin kuiviin salvatun tai N-suojatun peptidin saamiseksi.
Esimerkki 10
Menetelmä D: Karbobentsyylioksi (CBZ-) -ryhmänpois- 15 tomenettely
Liuokseen, jossa oli CBZ-suojattua peptidi- tai aminohappojohdannaista (1 g) etyyliasetaatissa (15 ml) , sekoitettiin 0,2 g Pd/C:tä (10 % Pd:tä hiilellä, joka sisältää 50 paino-% vettä) ja hydrattiin 4 tunnin ajan 2,8 20 kp:n/cmz paineessa. Liuos suodatettiin CelitelläR (piimää) ja haihdutettiin kuiviin ei-suojatun peptidi- tai amino-:'·1· happo johdannaisen saamiseksi.
: Esimerkki 11 • ·1 e » .···. Menetelmä E: Asetaalin konversio aldehydiksi • · 25 Liuos, jossa oli peptidiasetaalia (1 ekv.) 3 ml:ssa • e · .1 1 THF:ää, sekoitettiin 3 ml:aan HCl:n vesiliuosta (2 M) ja e · sekoitettiin 0,5 - 2 tunnin ajan. Liuotin poistettiin • e e *·1 1 haihduttamalla ja lopullinen jäännös laimennettiin veteen ja lyofilisoitiin peptidialdehydin saamiseksi.
• e e · • «· • M • · • e ··· • ee e e • ·· *·· • • · e·· • tee e • ••e · • · · • f· • · 40 1 1 8325
Esimerkki 12
Menetelmä pj Leusinaalidietyyliasetaalin valmistus
Λ o A
5 (QpAAr· inr^V: O 'O" O i Y^.he l Qp.AJya ϊϋϊ» 3 ^^oAJy^
X
Vaihe 4 1 λ ^ 15 Vaihe 1: NMM:ää (10 ml) lisättiin liuokseen, jossa oli CBZ-Leu-OH:ta (25 g, 93 mmol) 250 ml:ssa THF:ää. Liuos jäähdytettiin -15 °C:seen, siihen lisättiin 13 ml isobu-tyylikloroformaattia (IBCF) ja annettiin reagoida 10 minuutin ajan. Sitten lisättiin suspensio, jossa oli N,0-20 dimetyylihydroksyyliamiinihydrokloridia (9,36 g, 96 mmol) 40 ml:ssa DMF:ää ja 10 ml:ssa NMM:ää. 4 tunnin sekoituksen t... jälkeen seosta laimennettiin 400 ml:11a EtOAc:tä, minkä • · # I , jälkeen liuos pestiin vedellä, 5-%:isella NaHCO,-liuoksel- *;φ/ la, vedellä, 2-%:isella sitruunahapolla ja vedellä. Orgaa- t t *··*! 25 ninen faasi kuivattiin MgS04:llä ja haihdutettiin kuiviin, *»’i jolloin saatiin 19,0 g väritöntä öljyä.
·· i *·· Vaihe 2: Liuos, jossa oli öljy (19 g) vaiheesta 1 ··· ί,ϊ ! 200 ml:ssa eetteriä, jäähdytettiin -78 °C:seen ja 120 ml liuosta, jossa oli litiumaluminiumhydridiä (LiAlH4) (1,0 M) ·*·., 30 eetterissä, lisättiin tipoittain 45 minuutin aikana.
* .***. Liuosta sekoitettiin 30 minuutin ajan ja 200 ml 1 M ka- • tl liumvetysulfaatti (KHS04) -liuosta lisättiin tipoittain « · ! typpisuojakaasussa. Orgaaninen faasi erotettiin, se pes- tiin KHS04-liuoksella (1 M) , kuivattiin (MgS04) ja haih- ··· 35 dutettiin värittömäksi nesteeksi (CBZ-Leu-H) .
*··· • · * · #
• M
$ · 41 1 1 8325
Vaihe 3: 104 ml trietyyliortoformaattia lisättiin 30 minuutin aikana liuokseen, jossa oli CBZ-Leu-H:ta (12 grammaa) ja p-tolueenisulfonihappoa (0,9 g) 100 mlrssa vedetöntä etanolia (EtOH). Seosta sekoitettiin 30 minuutin 5 ajan, minkä jälkeen se haihdutettiin kuiviin ja jäännös laimennettiin 500 ml:aan eetteriä. Eetterifaasi pestiin peräkkäin kyllästetyillä NaHCOj- ja NaCl-liuoksi11a. Kellertävänruskea puolikiinteä aine uudelleenkiteytettiin kylmästä heksaanista, jolloin saatiin likaisenvalkoisina 10 neulasina CBZ-leusinaalidietyyliasetaalia. 1H-NMR (300 MHz, CDClj) δ: 7,28 (m, 5H); 5,03 (s, H); 4,77 (d, 1H); 4,27 (d, 1H) ; 3,8 (m, 1H) ; 3,63 (m, 2H) ; 3,43 (m, 2H) ; 1,6 (kak-sois-d, 2H); 1,30 (m, 2H)/ 1,12 (m, 6H); 0,83 (d, 6H).
Vaihe 4: Tuotetta (14,8 g) vaiheesta 3 hydrattiin 15 käyttäen menetelmää D ja 2,5 g Pd/C:tä, jolloin saatiin 4,09 g leusinaalidietyyliasetaalia öljynä. 1H-NMR (300 MHz, CDClj) öi 4,16 (d, 1H) ; 3,70 (m, 3H) ; 3,75 (m, 2H) ; 2,87 (m, 1H) ; 1,78 (m, 1H) ; 1,33 (m, 2H); 1,23 (m, 6H) ,- 0,935 (kaksois-d, 6H).
20 Esimerkki 13
Menetelmä G: P3-jäijittelijoiden synteesi [nimik- ,···' keistön osalta katso Schechter, I. ja Burger, A., BioGhem.
* · · .* . Biophvs. Res. Commun. 27 (1967) 157 - 162] f · « .........
• ·· • · • •s f · *···* OC oo o • * 1 1 Vai- 1 A Valhe 1 »ai.
i '·· CJ LJ L_J
··· • t · • · · t 30 Valhe 3 K? '"Y" b *=* ώ α r; ώ ·· • e • ·· Φ *···* (Vaiheet 3 ja 5, R = CN, vaiheet 4 ja 6 R * ·;♦ o ···· • § e · · • ·· 42 118325
Vaihe 1: Bentsyylisyklopentaaniaeetaatti
Seosta, jossa oli syklopentyylietikkahappoa (10,02 grammaa, 78,2 mmol), bentsyylialkoholia (8,45 g, 78,2 mmol) ja p-tolueenisulfonihappomonohydraatia (1,48 g, 7,82 5 mmol) bentseenissä (60 ml) , keitettiin käyttäen Dean-
Stark-vedenerottajaa 2 tunnin ajan. Jäähdyttämisen jälkeen bentseeni poistettiin ja seosta laimennettiin eetterillä (50 ml) ja se pestiin peräkkäin kyllästetyllä NaHC03-liuok-sella, kyllästetyllä suolaliuoksella, kuivattiin ja haih-10 dutettiin kuiviin, jolloin saatiin haluttua yhdistettä (15,40 g) öljynä. ’h-NMR (300 MHz, CDClj) Ö: 7,35 (m, 5H) ; 5,10 (s, 2H); 2,40 (d, J = 8 Hz, 2H); 2,26 (m, 1H); 1,81 (m, 2H); 1,6 (m, 4H); 1,18 (m, 2H).
Vaihe 2: Bentsyyli-2-syklopentyyli-10-jodidekanoaa-15 tin valmistus Jäähdytettyyn (-78 °C) liuokseen, jossa oli litium- di-isopropyyliamidia (20 mmol; saatiin in situ vastaavasta di-isopropyyliamiinista ja n-BuLi:stä) THF:n (20 ml) ja heksaanin (8 ml) seoksessa, lisättiin hitaasti vaiheessa 1 20 saatua yhdistettä (3,96 g, 18 mmol) vedettömässä THF:ssä (10 ml). Seosta sekoitettiin 30 minuutin ajan ja lisättiin .*$*. 1,8-dijodioktaania (7,19 g, 20 mmol) heksametyylifosfor- ,*. · amidissa (3,50 g, 20 mmol). Seosta sekoitettiin -78 °C:ssa • ·· tJ·/ 30 minuutin ajan, se lämmitettiin hitaasti 0 °C:seen 2 • · Γ*. 25 tunnissa ja keskeytettiin reaktio lisäämällä varovaisesti * 50 ml natriumkloridin 12-%:ista vesiliuosta. Seosta uutet- e t * “ tiin eetterilä, eetterifaasi pestiin suolaliuoksella, kui- • · * *·* * vattiin ja haihdutettiin liuotin eroon. Raakatuote puhdis tettiin öljyksi (3,23 g) paisuntakromatografisesti silika- ·· • *·· 30 geelissä käyttäen eluenttina heksaani π* 1 % EtOAc heksaa- nissa. 1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ: 7,35 (m, 5H) ; 5,15 (s, 2H) ; 3,20 (t, 8 Hz, 2H) ; 2,20 (m, 1H) ; 2,0 (m, 1H) ; 1,2 - \.Γ 1,8 (m, 22H).
• * • · tl» ·«· ···· • m • · • ·· • · 118325 43
Vaihe 3: Bentsyyll-10-syaani-2-syklopentyylideka-noaatin valmistus
Seosta, jossa oli jodiesteriä vaiheesta 2 (3,99 g, 8,7 mmol) ja natriumsyanidia (0,47 g, 9,6 mmol) 15 ml:ssa 5 vedetöntä DMS0:ta, kuumennettiin 70 - 75 °C:ssa 30 minuutin ajan. Jäähdyttämisen jälkeen reaktioseos kaadettiin jäihin (noin 40 g), uutettiin eetteriin ja pestiin peräkkäin vedellä ja kyllästetyllä suolaliuoksella. Orgaaninen faasi haihdutettiin öljyksi (2,89 g). 1H-NMR (300 MHz, 10 CDClj) δ: 7,35 (m, 5H) ; 5,15 (s, 2H) ; 2,30 (t, 8 Hz, 2H) ; 2,20 (m, 1H); 2,00 (m, 1H); 1,3 - 1,8 (m, 22H).
Vaihe 4: Bentsyyli-10-N-ftalimido-2-syklopentyyli-dekanoaatin valmistus
Seosta, jossa oli yhdistettä vaiheesta 2 (1,21 g, 15 2,6 mmol) ja kaliumftalimidiä (0,536 g, 3 mmol) 8 ml:ssa DMF:ää, kuumennettiin 70 - 75 °C:ssa 30 minuutin ajan.
Jäähdyttämisen jälkeen reaktioseos kaadettiin jäille (noin 40 g) ja uutettiin 60 ml:aan eetteriä. Yhdistetty orgaaninen faasi pestiin vedellä ja kyllästetyllä suolaliuoksella 20 ja haihdutettiin värittömäksi öljyksi. 1H-NMR (300 MHz, CDClj) ö: 7,85 (m, 2H) ; 7,70 (m, 2H) ; 7,35 (m, 5H) ; 5,10 (S, 2H) ; 3,65 (t, 8 Hz, 2H) ; 2,20 (m, 1H) ; 2,00 (m, 1H) ; • · · · 1,22 - 1,18 (m, 22H) .
e ··
Vaihe 5: 10-syaani-2-syklopentyylidekaanihapon val- *!**! 25 mistus e · · *· ** Seosta, jossa oli syaaniesteriä vaiheesta 3 (2,89 e t • ** 9, 8 mmol) ja katalysaattoria 10 % Pd:tä hiilellä (0,6 g, V · DeGussa, H20-pit. 50 %) vedettömässä MeOH: ssa (35 ml) , hyd- rattiin 2 tunnin ajan (2,9 - 1,8 kp/cmz) . Reaktioseos suo-j1·.· 30 datettiin CeliteR-tyynyn läpi ja haihdutettiin värittömäksi :***i öljyksi (2,02 g). ’h-NMR (300 MHz, CDC1,) δ: 2,35 (t, 8 Hz, f·· ^ ./ 2H); 2,20 (m, 1H); 2,00 (m, 1H); 1,3 - 1,9 (m, 22H).
• ♦· ··· • · e e ··· • et· t e··· t e e e e #1 • t 44 1 1 8325
Vaihe 6: 2-syklopentyyli-10-N-ftalimidodekaan±hapon valmistus
Noudattaen vaiheen 5 menettelyä vaiheen 4 tuote (0,41 g) muutettiin otsikkoyhdisteeksi (0,31 g) . ’H-NMR 5 (300 MHz, CDClj) δ: 7,85 (m, 2H) ; 7,70 (m, 2H) ; 3,70 (t, 8 Hz, 2H) ; 2,15 (m, 1H) ; 1,95 (m, 1H) ; 1,10 - 1,85 (m, 22H) .
Vaihe 7: 10-trifluorimetaanisulfonamido-2-syklo- pentyylidekaanihapon bentsyylieeterin valmistus 10 CFISOIra"<CBpAo^0j Valhe_8 σ,ίΟ,ΗΝ'^^ΟΗ • · ♦
• · I
V] Seosta, jossa oli esteriä vaiheesta 4 (0,874 g, 1,7 • * « mmol) ja hydratsiinimonohydraattia (0,425 g, 0,41 ml, 8,5 • · *···* 25 mmol) metanolissa (8 ml) , keitettiin palautus jäähdyttäen • · 30 minuutin ajan ja se haihdutettiin kuiviin, minkä jäi- • · ; *·· keen jäännöstä eetterissä trituroimalla saatiin valkoinen • · · !.! ί sakka, joka suodatettiin eroon. Suodos haihdutettiin öl jyksi (0,540 g). Öljy liuotettiin CHCl2:een (8 ml), joka ·*·,, 30 oli jääähdytetty -10 °C.seen, ja liuokseen lisättiin tri- .**·. etyyliamiinia (0,324 ml) ja siten trifluorimetaanisul- • · · ,.· fonyylikloridia (0,25 ml). Lämpötila kohotettiin hitaasti • · : " huoneenlämpötilaksi 1 tunnin aikana. Sitten reaktioseos '··.* pestiin vedellä, 2-%:isella Helillä, vedellä ja kylläste- ··· 35 tyllä suolaliuoksella. Orgaaninen faasi haihdutettiin öl- ···· « · • ♦ · • *· • · 45 1 1 8325 jyksi, jota puhdistettiin paisuntakromatografisesti silik-ageelissä käyttäen eluenttina 10 % EtOAc:tä heksaanissa, jolloin saatiin 10-trifluorimetaanisulfonamido-2-syklopen-tyylidekaanihapon bentsyyliesteriä öljynä (0,25 g). ’h-NMR 5 (300 MHz, CDClj) ö: 7,35 (m, 5H) ; 5,15 (s, leveä, 1H) ; 5,10 (s, 2H); 3,25 (m, 1H); 2,20 (m, 1H); 2,00 (m, 1H); 1,10 -1,7 (m, 22H).
Vaihe 8: 2-syklopentyyli-10-(trifluorimetaanisul- fonamido)dekaanihapon valmistus 10 Noudattaen samaa menettelyä kuin kuvattiin vaihees sa 5 vaiheessa 7 saatu yhdiste (0,25 g) muutettiin otsik-koyhdisteeksi (0,20 g) öljynä. 1H-NMR (300 MHz, CDClj) 6: 6,60 - 5,60 (b, 1H) ; 3,30 (d, 8 Hz, 2H) ; 2,15 (m, 1H) ; 1,90 (m, 1H); 1,1 - 1,8 (m, 22H).
15 O he 9 O Vai" li H he 10 H,C-C—O— tBu -► I-(CH^7—C-O—tBu ·---»► - -hr^nci ^ • · · • · · • · a · ·
* *· Q
g « si.
··· *·* : Vaihe 9: t-butyyli-8-jodikapryylihapon valmistus
Otsikkoyhdiste syntetisoitiin noudattaen vaiheen 2 • m j *.· 30 yhdisteelle kuvattua menettelyä, jolloin lähtöaineina käy- :*]*: tettiin t-butyyliasetaattia (1,16 g) ja 1,6-dijodiheksaa- nia (4,06 g) ja otsikkoyhdiste saatiin öljynä (2,13 g), ’h-NMR (300 MHz, CDC1,) , δ 3,20 (t, 8 Hz, 2H) / 2,20 (t, 8 Hz, 2H); 1,75 - 1,85 (m, 2H); 1,55 - 1,65 (m, 2H); 1,45 (s, 35 9H) ; 1,25 - 1,43 (m, 6H) .
♦ · ♦ · · • ·♦ • · 118325 46
Vaihe 10: 2-syklopentyylidekaani-l, 10-dionihappo-l-bentsyyli-10-t-butyyliesterin valmistus
Noudattaen vaiheessa 2 kuvattua menettelyä esteri (6,92 g) vaiheesta l ja jodiesteri (11,37 g) vaiheesta 9 5 saatettiin reagoimaan, jolloin saatiin otsikkoyhdistettä (7,44 g) Öljynä. 1H-NMR (300 MHz, CDClj) δ 7,35 (m, 5H) ; 5,10 (s, 2H) ; 2,20 (m, 3H) ; 2,00 (m, 1H) ; 1,45 (s, 9H) ; 1,0 - 1,9 (m, 2 OH) .
Vaihe 11: 2-syklopentyylidekaani-l,10-dionihappo-1-10 bentsyyli-10-metyyliesterin valmistus
Liuosta, jossa oli diesteriä vaiheesta 10 (2,86 g, 7 mmol) CH2Cl2:ssa (30 ml) ja 10 ml 90-%:ista TFA:ta, sekoitettiin 30 minuutin ajan. Kuiviin haihduttamalla saatu tuote liuotettiin seokseen, jossa oli CH2Cl2:ta (10 ml) ja 15 MeOH:ta (6 ml). Liuosta sekoitettiin -20 °C:ssa ja siihen lisättiin hitaasti tionyylikloridia (6 ml) 2 tunnin aikana. Liuotin haihdutettiin eroon ja jäännös liuotettiin dietyylieetteriin (20 ml) . Orgaaninen faasi pestiin peräkkäin kyllästetyllä NaHC03-liuoksella, vedellä ja suolaliu-20 oksella, kuivattiin, haihdutettiin kuiviin ja suoritettiin jäännöksellä paisuntakromatografia-ajo silikageelissä ·1·'; (eluentti: 2 % EtOAc-heksaani) , jolloin saatiin tuote öl- ;1.J jynä (2,05 g). 1H-NMR (300 MHz, CDC13) δ 7,35 (m, 5H) / 5,10 .·1·% (S, 2H) ; 3,65 (s, 3H) ; 2,30 (t, 8 Hz, 2H) ; 2,20 (m, 1H) ; f 25 2,00 (m, 1H) ; 1,10 - 1,90 (m, 10H) .
· · * Vaihe 12: 2-syklopentyylidekaani-l,10-dionihappo- • · 10-metyyliesterin valmistus • · t *·1 1 Käyttäen vaiheessa 5 kuvattua menettelyä yhdiste (4,96 g) vaiheesta 11 muutettiin otsikkoyhdisteeksi (3,66 • · • ’·· 30 g) öljynä. 1H-NMR (300 MHz, CDC13) δ 3,65 (s, 3H) ; 2,30 (t, 8 Hz, 2H) 2,15 (m, 1H) ; 2,00 (m, 1H) ; 1,10 - 1,19 (m, 20H).
• «f · · • • · ··♦ ··♦ • I • · ♦ • ·· • · 47 1 1 8325
Valhe 13: 6-eyaaxiiheksaani-l-sul£iinihapoxi natrium-suolan valmistus
Vaihe 13 Vaihe 14 5 NC-(CH2)6-Br -* NC- (CH2) 6-S02Na -* NC-(CH2)6- S02C1
Kolmikaulakolvissa, joka on varustettu palautus-jäähdyttäjällä, mekaanisella sekoittajalla ja tiputussup-10 pilolla, liuos, jossa oli l-bromi-6-syaaniheksaania (8,04 g, 42,3 mmol), sijoitettiin 75 ml:aan 95-%:ista EtOH:ta. Seos kuumennettiin palautusjäähdyttäen kiehuvaksi ja siihen lisättiin hitaasti liuos, jossa oli natriumsulfiittia (8,00 grammaa, 63,5 mmol) 50 ml:ssa Hz0:ta, 30 minuutin 15 aikana. Seosta kuumennettiin 2 tunnin ajan, minkä jälkeen se haihdutettiin alipaineessa kuiviin. Jäännös liuotettiin 95-%:iseen EtOHrhon (200 ml), kuumennettiin kiehuvaksi ja suodatettiin. Suodosta konsentroitiin ja jäähdytettiin jäähauteessa. Sakka otettiin suodattamalla talteen ja se 20 kuivaamalla saatiin 3,00 g valkoista kiinteää ainetta. Emänesteestä saatiin edelleen konsentroimalla toinen 2,2 ... g:n erä tuotetta. 1H-NMR (300 MHz, DMSO-d,) δ 2,50 (t, J = Y: 8 Hz, 2H) ; 2,40 (t, 8 Hz, 2H) ; 1,55 (m, 4H) ; 1,3 (m, 4H) .
t · · *·“ Vaihe 14: 6-syaaniheksaani-l-sul£onyylikloridin • * *···* 25 valmistus • s ·.*·: Seosta, jossa oli tuotetta vaiheesta 13 (0,340 g, ·· • *·· 1,6 mmol), tionyylikloridia (0,95 g, 8 mmol) ja pisara :#Γ: DMF:ää, kuumennettiin 75 - 80 °C:ssa 30 minuutin ajan.
Jäähdytyksen jälkeen liuotin poistetiin ja jäännökseen li-30 sättiin jäävettä (5 ml) . Orgaaninen faasi uutettiin 30 ml-.··♦, :aan eetteriä ja yhdistetty orgaaninen fasi pestiin 3-%:- "·* isella NaHC03-liuoksella ja vedellä, kuivattiin (MgSO^) ja * * ' ** suodatettiin. Suodokseen lisättiin aktiivihiiltä (Darco), s·· :...· se suodatettiin ja haihdutettiin värittömäksi öljyksi •j. 35 (0,240 g), jota käytettiin sitä enempää puhdistamatta.
• ••t • · ♦ * · • ·· • · 118325 48
Esimerkeissä 14-38 kuvataan taulukossa 5 lueteltujen MCP-inhibiittorien synteesejä. Vastaavat puhdistus-olosuhteet esitetään taulukossa 6.
5 Taulukko 5
Multikatalyyttisen prot©aasin inhibiittoreita
OH O II
R-(CH2)„—C H—t—ti—-CI I—(ϋ—ri—C H—CH=^) 10 <&> f &
^ /NH
®"n=<nh2
Esim. R n W X Y Z IC^M
nro 14 NC- 8 ^ N02 (CHj)2CH- o 7/6 15 __NC- 8__" PMC (CH3)2CH-__o 20 20 16 NC- 8 " N02 (CHj)2CH- N- 100 ______NHCONHi__
... 17 NC- 8 " NO: (CH3)2CH- N-OH
• « · —....... ‘ .......
] 18 NC- 8 " N02 (CH3)2CH- N-OCHa 700 • · · 1«·*· I “ " 1 “ 1 1" 11 " * 1 ' ' · — ** —.........
19 NC- 8 " NO: (CH3)2CH- N-O- 25______CHtC»H,__ */·! 20 MeOOC- 7__" PMC (CH3)2CH-__o 10 I’*·· 21 MeOOC- 7__" MTR (CH3)2CH-__o__30 0: 22 MeOOC- 7__" PMC CH3CH2CH2- o__110 23 MeOOC- 7__" NQ2 (CH3)2CH-__o__5_ I**·· 30 24 CtH,(CO)3N- 8__' NQ2 (CH3)2CH-__o__2_ 25 CF3-SQ2NH- 8__N02 (CH3)2CH-__o__8/5 !\„ 26 MeOOC- 6 H N02 (CH3),CH- o 40 I***; 27 MeOOC- 6__H N02 C,HS__o__130 ,c 28 MeOOC- 6 H PMC (CH3)2CH- o 20 ... 35 - I ---- -—--- ···· • t • · · • ·* • · 49 1 1 8325
Taulukko 5 (jatkuu) 29 MeOOC- 6__H PMC CH.CH,- o >300
30 MeOQC- 6__H PMC CH3CH;CHr o ~~> 10Q
5 31 MeOOC- 6__H TOS (CH3)2CH-__0 75 32 MeOOC- 6 H M TR (CH,),CH- N- 220 _______NHCONHa.____ 33 MeOOC- 6 H MTR (CH,),CH- N- 700 _______NHCSNHa__ 10 34 MeOOC- 6__H MTR (CH,),CH__o__80 35 MeOOC- 6 H MTS (CH,)jCH o 40 ..!S3V9=SS?! 15 S|°2 sn SO. OO 1¾ Är y O'
MTR PMC /n MTS I
sp2 20
O
tos T
• * < · · » • · • · · • ··
.1. HÖH
*...* 25 1 11 I
R-(CH2)m-(CH )„ - Y - N - CH - C - N-CH-CHO .. * lii : **· w x CHj-CH(CH3): *«· • · · • · · ·· 30 Jr1· =S3^=™ 1 ........."Ί............j.............·| - 1
: *·· Esim. R m n W X Y IC^nM
.*·*, nro 36 NC- _5__1__H PMC-NH-C(=NH)-NH-(CHI)3- -S02- »100 37 £ O O - OjN-NH-Ci=HH)-NH-(CH2)j- o 250 ! : naftyy- |) ··· , .
. li -c- t*t 35------------------ 38 H 5 1 H Oj.-N-NH-C(=NH)-NH-(CH2)3- o CBZ-N- l| * * -c- ,η 1 1 8325 50 + Λ Η ^ νο η σ\Γοσ\ + ΙΟ 00 ΟΊ Γ- VO “> S in VO m m vo 5 Ο οθ
LO
Γ"· (N Γ"· C"·* Γ" m m h co on oo • vo co m σ\ vo 2 jgi m r* vo ininvo g rt in r·· oi oo Γ' m __
. X + K H ^ V *. K O
4J -rl (N H ΓΊ ' rt1 «H
>, <8 - (N Γ0 <Nm CN M Γ0 £} iT · d ™ n
rt -P -H
3 s3 -rt Ö ro O Ö ~ ~ 2 3
JJ -H vo - *H ® ro H ~ H
u U A N (NJ S'* * * “» - α ΐ ra o m 2 oi ° * 3 <D-HJdH — rH H * ^
-H ft -H -- VO N — Il II
Ό β PQ PQ PQ PQ
Λ ti O PQ <#> PQ' PQ m PQ « Ό M S -H dP O Jfi ° dP dP ' dp ' #
Oi ρ P m o ra ' Ln in m ui M 2
O 1 :e) fl r~ h n 2 vo o ' r- ' R
ΐ ύ h Φ i i ifi i i oo i oo h .U ra id p lo n oi), ra in JJ, in Ji ' ti a· £ <D ra· ra· ro « ra< ra«iVD«« ° H H — M " “ “ ό 3 fr· Il I I "H i %. ¾ % 'ξ, % ' | H *3 S H H | *H H -H '
I i -H i I £ j Ή I I -H J
-H Ή H »H -rl -H j tQ -H *H s« 1 rH rl I d} rl rH -H q^iH H Ori £hio ra £h b!3 H o t* ··· >i >1 l ti PM ?I J< ij Ή P1 pi « >i
• O O-H-HOi O O -h H 0 l P £ PM
.· » ti -H ti ti Hl ti -H C -H fl S ti -H ti § ti
Ϊ · * « rH iti <0 ti <0 H (ti H 7 in (ti H D M -H
• I M ra ,* (ti ® ,¾ ra Ai « o> p Ai (ti ft H W
... Φ ra <U E m ® ra φ ra E <u <u ra otin • · Ό ti Opi Ό ti Ό ti i E Tti ti h n, Λ . .. -H -H ‘H H l-Q 'rl Ή -H Ή -Hl -H -H i t e r-iwrH,i^!rHra r—i ra i—i o rH ra ^ gq ra ··! p p ώ -h ·η >i ti ti w , i • ·· φ φ pi r—I i—I <U Si 4) Ρ*ι Ή <l) I hn.
** 0) p rH P in tn P rH P H P rH P rH C\| _ -H
J·, p «iti^putii ti i ti « ti i i ra h ... ra m ra o jj s φ ra <u ra <u ra <u ra -h _ in • -H a I ft ID ‘H ft ι Οι I ft ti ft I -H H fj Pn ... U O -H O ε tn 0 -H O -H O -H O -H ε b-, „ ti
Ϊ * * (ti i—l r—l rH (0 M rH rH rH rH ι-H ra rH f—l -H P>1 r-3 O
.** £ Ai >1 Ai P (ti Ai in Ai tn Ai ti Ai >i -H ti ~ <P
tn tn >ldl >(S-H >1 PM tM Φ tM iM ® O i i—l rad ra φ ra ratiti rad n h m ti Ai JQ q> ti I -H I ft I I -H o I -H II I -h o M B ra
(N 01 £N · ~ CNtnra N Ö1 <Niti M UlH (tili I M I oo -H I JH P I M I I I M rH Λί -H VO -H
... H Iti -H ^ H -H Iti Iti *H Iti -rl *H -H (ti -H rl I rl • ti1 ti r~ In ti i J3 ti i firHtiiinrain-Hcti ··· ra ra ra-ίη ra ra m rara ra S ra ra m ^iStins ϊ; rai ra ω ö ra i ra ra i ratnraipoorac ·.. >ιΟ >ιΌ >ιΟΐ >iO >iti >iOti ΡΠ«·Η . ra M ra ch ra mn -h raM n -h m m φ φ ra g ra ·· ipi-HipgipitniPÄEtiOti ·· Ο-ΗΟ033Ο-ΗΦΟ-ΗΟΜΟ-ΗΙ I O M A) :*· dll Η-ΊΙ riti» Hfi Hill HtiO OlfiJiH 1 2 .
• · A
• « 8
• · * -rt O
• wkrtiinvoc-'cooo
,J# MO H H H i—I i—I i—I (N
2 * • · · • ·· • · 51 1 1 8325 o ^ co vo h LT) n
Lf) O CO CO CO O CO ΟΊ
E'' CO LHVOVO |/> LO
*· Vf> (N
n co o G\ ^ <N CO V© H^Ol rf O CO CO 00 ΟΓΟΜ oo m φ vx> ιηΐΛΓ^ o> o \q νχ)
<J\ tN VO CO (N ^ o CO LO
' “ ' " ' ^ s. 1
CO CN CO Γ-· Γ- p" Γ"· Γ"1 VO
™ CO <N CN CN o, H H <N
— -- oovo 3» r·» 0^ CO (Tl VO (%] „ „
- - “ " H ·1 VO H
σ\ co n cn n oo h h CN H H H pcj 'v 1
^ 00 CQ CQ
m pq mm « H $ $ $
d¥> dP <#> dP <#> , o O O
O O O O o (\j o Q o vc t-~ ['οογ'ηηηη
I I I I I II I I I
O O o O o ^ o o o
*· VO, N< W l/l Cl Μ ,_, H
-H
§1H 1 1rl -H
Ί 5 H H 1
Hi1 W tti P S CC (ti 011 5 h ^ Q ε 3 2<ti (0 ' m i—| I d O ^ ^ d öQ 1 -H SV il ^ m l! 'H M -H S 1 CO 1 ... ^ S V VAtiSVaSra-Hj -c • Ϊ . S aj S S h 3 S 3 -¾ d § 1 1 1 r- "jj
··· >1 (!) >1 >)Ηβ) >1)1) Iin m J 1 H
* ΐ E 5 £Suti,-,'SrHVrH 1 1 en S
• · ö >h "H Ci S« Ö I _Q i -H jj O O «, Pi :·.: «up g.^gS^'S^'i-d n ° m 3 ·· ft L m ft ψ £ ft r ‘rt < N rt jj jj H 10 ... o i m 9 e ' o -h ε -h s 1 -rH h 3 n 1y • · Η\βΙ Ηιβι-ΗΗ^-ιΗ,-ιΠι» p CJ ™ — ·—l *.,.· ^ 4J ', £ S V S ° 53 I I P I 3
„ S m · SpHSS^S11"11 q>_ en -H en tn -H
.·, : m„~ m <β h n> d a> E? h h z K ΰ B i h • ·· 1 ro -H 1 Λ. S I >r| M-l .,_) 3 H H I -rl I (ti I VO (0 * · (H | H CN i S CN Π) Ι{τι(0^ιγΗμΗγΗ-γΗι—Ι1Η(<0
*· I -u S I 00 ti IGS^4-H>t(tiHitirH(tirH-rHH
J ,. H [q S ·Η «, -H -rl oj 1(0 d O cti S (ti S H S d H
• H U d rl fs til H l O | Cti d d Sd H S (ti M
... S O O S ' ^ Sjl-Hj (ti (ti -rl (ti -H (ti>t(ti(tip *·· S .U MH S ιλ cti SV I I ^ ^ Dl HM H S H g <1> ·,1· dajH d-i 0 o h o cu cu 3 <u 3 cu p <uoh O § 3 O n 0¾ Hu 0O(U M dl m CU M h i — λ i m λ;~ Λρ Shj h-h h uh aj mh 1j j P iHrtil G™ -H ΪΗ -h S.H VHHI (Oi (til (ti Hl
P (0 ^ H cd H (tip H-) p O ϊ1ι j -Hj Η .β H H -H
:·. M Ai i i H a; , S Ad T PV PS' HI hi h S h
... AD H O) -rl H H O) Ai -rl O) ti) O) H O -H >1 -H SH S rl S
» ptoisdiOMapMB aa ηρη Sh Sh S-uS
... -l-iA!l<U(ti^lOAi' OI HfflS+jSAJSHJeiö
*: " O-HOJd OHHH OH H Η hftS <uS OS d)gH
... 4-) H M H +JHH 4JH AdH AJOd Bd ΒΠ E ti ti) . «o aiSn-im oSd (US s S ^ h -h oh oh o-uh .. e S d d ε S m gS mS i ai di doi dm ddm .. o i o <υ a> i o i ιο ioo>iM o)h 0)h o <l> ;·· Aj οι (ί Λ H οι β ω CTid (Nd rl m (ti g(ti ε« ε Oi rl ... ·3 . 5
• . H
... 0
• PH CN VO A- CD
>J> E-l CN CN (N CN CN CN CN (N
• ···· · • · • 1· • · 52 1 1 8325 n n o to h o> oo (N Oi H CM Ά vo ro Γ"· f"* VO C"* O' VO vo CM Oi o H CO 00
Oi OJ H CM ^ VO ro
θ' t"* VO O- O* VO VO
ro Oi ro cm co O
vo vo H co co ro oi cm Oi cm H oi oi ro Ή ^ i-K *H ίΛ,
Oi O vo £ H
VO <7\ O
H H H VO ^ H
pq pq pq PQ ^0 pq
<& <& <#> “* dP
0 O O ^ o
O' VO LO VO
1 I I I I II
0 o o o o m ^
* I
"7 *rt
H H
1 *z! >i ^ 1 » -rl Ή I I If11 >i 1
CO 1 co 1 ö 'j -H β ·Η -H ί 4J
^ Λ fl) Π> O oj IQ h fl)H
• ei% r* ·Η φ J3 Λ · ® Λ 1 M O
·#* «. >ri ^ *7* p ä o J -y o J o ^ -r-ι S
• UI ^ H -*J 4J 1 s AJ 1 4J rj in« • « »H -¾1 O W (D - rP (U '—- 1 0)3 jj -rt : * ♦ Oj 5 OJ 3 p 3 g -H M g -rt -H | 01 i 01
» J »O «.O i 0) | H (d i H g I I t0 pH
.oj **< oj *p "rt & h S Pi ^ S 4) »id « « ^ H ^ H H ^ I w >1 *H ^ p>t K I 4<>
• * i 3 ι P <d | Kl i C ε i R 0 I -H .. P
ro W -H a ia ti q>i 0)00) o> 0 h q> R -rt oj1 .·. : aiHB'c!B-HBM-ioiTaiH4-) s oi h -p ~ • .1 I U) Iti I tfl -rl ( r-ι I H -rt I H -rt I 4) (0 , -rt
• · -rt I (0 Ή I tQ -rl -rt P H -H 3 r-1 -rt (0 (d σ> H
·· H-nRH-rtpHSHtnidHtnid h p R jäj S
: *.. S R h S R 4) Sr S i (d S i <d S R -n i S
ϊ S <d ra S ra h S-h S h R S h r S 4) m h r ... <d <d 3 ra rä rt <d tn <d i -ι-i ra ι η ra Λ p h o
• · · H g 4) H g 0 r-t M H *H M rl -H Dl H -rt 4) S <P
·.·· e) o h 4) o R a) td 4> h p id h p id h rt Sh w Ph i to M i toi m S 4) to >, <u ra S ι op p A! p p At P p P p S h p S h *j tdto g td-Hi td-rii (di (dpi (dpi ra p ' hi
p Ή H -H “H H -H -rt —- -rt 4) P -rt 4) p -rt 4) -rt (1) H
• · M H S H H S H H -rt H g I Hgl-rH H g r—H tOI-rl
! *.. -u S S S S S S S H >, -rt -rt S -rt -rt R S -rt S 4J -rl H
• e S p S S p S SS Sphh Sphho S Ph S ra R ra ... n p 4) R p 4) R p S p p S p p S ra p p r -h <i) ra ·. ^ <ug-rt <D g -ri o)R aiiS <uiSp « i --< maid ·»..* gram g(dtJi go g to R g ό R ra g to Οι At ra -n . »O 0 P H OPPH O M-l 0 - -rl O- -rl λ O - R O P Dl ,, Rflid R R (d Rh R oi 01 RmOIPh R m id pRp .· O 04)1 04)1 OP O - rt O - rt Id O ~ ' 4)0)4) ;·· Ä SQ.P gQilP g ID g PH Id g N 4 )t g PO lp g Λ H 1 2 fl • · 1j ··· p • e oi o h oh m ^Ln • Hm h oi ro οι (Τ)ρ-| ··· 2 * · • t · • «· • · 53 1 1 8325 H H 00 Γ* t1 2 Γ" ** m
Λ H
- m
O
h o i> r-
^ LO
σ\ o
- H H
^ * cn oo σ»
H H
^ σι r- — ^
ro H H
h ' 1
“ OI W
S m PQ ro 3
LO df> dp ' . J-J
r1 LO o ro *m
J Ln H> ^ "H
in i i Ji " S
^ in o d1 fi ·η m n v P 2 H £ *> <u
rH
n) H 0 -H JJ ' .
d' - o ti I (Ö j i eti -h ··· liotti. j biittica : : : w · 0 -h i h =ns -h
• S -H -H ,_| o 4-1 O
· Q 2 >1 m “^d43 2 -H (0 d S jj nti ·. ·; h te e) ff -h h ra -ri ... >, e h .5 £ - -h ra .3. S o > S r o ra 1 i
·· d iH |J U Dl rH
*·· 0 M I S S itti Iti <U
• · MH -H -H I I 1(0 Jti • 1J rH rH rH ,0 -H -H 4J O - ·· d S S | rl rl rH -ro ti . « M S S o >1 (ti itti -rl • · ijjdc S ns ra - ε
: 1 H <D -H £ 0 C -H -H
... I B tn -H d -H m rH O
·.. -rl (ti M rj (tira (ti
·.· · B U Iti I 4-) d (ti -H ε -H
* m ns ti 1 n Oi <u Jd μ u ε ti tinsiuja (UH 04->ns o a m ft 1 1 Λ I -ro -rl > ο ο
Ji ,¾ I -rl O J 4-> ti Ο 1Λ Ji .· *1 <D 00 -rl rH -rl ti I <U - o ε (N -rt : Λ Λ - rH S rH -rl -rl (1) -H 4-> d 4.) ·< ε
. -n -n r- S Sm ε h 4Jtn<u -ri X
... ti - S o « ioSj3(i)rain4J-H o m
·· ttiind 4->ti I S ti > (ti rH ti ft -g g CO
·...· ietti'0 MH -H E' ti ra (N 0) ft rj E O
* >1 CN MH (tira I -rl 0.....rl K 7 O Ji
* Otn-H ti d NO) HrtlPQ-flSxVO^O
:*. i 1 m d id) «o o o ie jj « ' o x ··· ji 10- ta N rl U ti titi-rliH-rl "M· Jd 10 • 3 d-H-HMJDidXraiti ··· H " 4J 4J Jti I K (0 4J O Jti :: 3 uoo(uuoj3(<ijiji ... « rti d ti 41 d Η ΪΗ4-Ι O d . EHIO t" 00 ft -rl -rl HS ft O O -rl d Ή . "(O ro ro s rl rl Iti Ji N £,drti • · · ·*«· • · • · · · · * · 3
Esimerkki 14 10 - syaani - 2 - syki open tyylidekanoyy li -N®-nitro-L-ar- ginyy1i-L-1eusinaali 54 1 1 8 3 2 5 c&n&r L A J102
NH NH
10 Vaihe Is Fluorenyylimetyylioksikarbonyyli-l^-nitro- L-arginyy1i-L-1eusinaalidietyyliasetaali
Fmoc-Arg(N02)-OH (4,41 g, 10 nunol) kytkettiin Leu-asetaaliin (1,89 g, 10 mmol) menetelmän A mukaan (esimerkki 7) käyttäen 1,29 ml IBCFrää, 2,2 ml NMM:ää ja 10 ml 15 THF:ää (DMF:n asemesta kuten esimerkin 7 menetelmässä A). Raakapeptidi saatiin amorfisena kiinteänä aineena. ’h-NMR (300 MHz, CDClj) 6 7,75 (d, 2H) ; 7,55 (d, 2H) ; 7,4 (m, 2H) ; 7,29 (m, 2H) ; 6,21 (d, 1H) ; 5,91 (d, 1H) ; 4,30 (m, 5H) ; 3,66 (m, 3H) ; 3,63 (d, 2H) ; 3,32 (m, 2H) ; 1,72 (m, 4H) ; 20 1,29 (m, 2H); 1,17 (b, 6H); 0,89 (m, 6H).
Vaihe 2: N^nitro-L-arginyyli-L-leusinaalidietyyli- ·.. asetaali • · · • · · ‘ . Fmoc-ryhmä poistettiin 3,5 g:sta vaiheen 1 tuotetta • · ·
käyttäen suojaryhmänpoistomenetelmää B (esimerkki 8) . Va-*;··] 25 paa emäs (2,5 g) saatiin puolikiinteänä aineena. H-NMR
(300 MHz, DMSO-d6) Ö 8,6 (b, 1H) ; 7,61 (d, 1H) ; 4,27 (d, • **· 1H) ; 3,90 (m, 1H) ; 3,59 (m, 1H) ; 3,45 (m, 4H) ; 3,14 (m, 2H) ; 1,54 (m, 4H) ; 1,33 (m, 3H) ; 1,10 (tt, 6H) ; 0,83 (kak-sois-d, 6H).
30 Vaihe 3 s 10- syaani - 2 - syklopentyy 1 ldekanoyy 1 i - N® - ni t - .1. ro-L-arginyyli-L-leusinaalidietyyliasetaali • · · ..· Menetelmä C mukaan (esimerkki 9) 10-syaani-2-syk- • · :t#" lopentyylidekaanihappoa (2 g, 7,5 mmol) menetelmästä G 16 • · *···* ml:ssa DMF:ää käsiteltiin vaiheen 2 tuotteella (2,15 g, 35 5,5 mmol) käyttäen BOP:tä (3,34 g, 7,5 mmol) ja HOBt:tä e··· • * • » · • ·· • ♦ 118325 55 (1,01 g, 7,5 mmol) raakapeptidin (3,85 g) saamiseksi vaaleankeltaisena kiinteänä aineena. ’h-NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 8,31 (leveä d, 1H) ; 8,0 (leveä d, 1H) ,- 7,83 (d, 1H) ; 4,34 (m, 1H) ; 4,24 (d, 1H) ; 3,91 (m, 1H) ; 3,56 (m, 4H) ; 5 3,43 (m, 2H) ; 3,16 (m, 2H) ; 2,47 (t, 3H) ; 2,03 (m, 1H) ; 1,76 (m, 2H); 1,15 - 2,0 (m, 25H); 1,07 (m, 6H); 0,81 (d, 6H) .
Vaihe 4: Liuosta, jossa oli vaiheen 3 tuotetta (0,2 grammaa) 10 ml:ssa asetonitriiliä (ACN), joka sisälsi 30 % 10 TFA:ta, sekoitettiin 1 tunnin ajan ja liuotin haihdutettiin eroon ja esimerkin 14 mukainen yhdiste saostettiin dietyylieetterillä. HPLC-puhdistusolosuhteet esitetään taulukossa 6. 1H-NMR (300 MHz, DMS0-d6) δ 9,38 (s, 1H) ; 8,56 (b, 1H); 8,3 (d, 1H); 7,99 (kaksois-d, 1H); 4,38 (m, 15 1H) ; 4,17 (m, 1H) ; 3,37 (m, 4H) ; 3,17 (m, 2H) ; 2,26 (t, 3H); 1,0 - 2,0 (m, 27H); 0,86 (kaksois-d, 6H).
Esimerkki 15 10 - syaani - 2 - syklopentyylidekanoyyli -N9- (2,2,5,7,8 -pen tame tyyl ikromaani - 6 - sul f onyy 1 i) - L - arginyy 1 i-L-leus inaa - 20 li
V! r\ jW*Y
V;: KJ ^ f f ί I
::**ί 25 "NH NH1' • ·· ^ ΊΓ Ό \ t* * • · • ·· • · · V· Vaihe 1: 10-syaani-2-syklopentyylidekanoyyli-N9)- (2,2,5,7,8-pentametyylikromaani-6-sulfoyyli)-L-arginyyli-30 L-leusinaalidietyyliasetaali ·1; Noudattaen menetelmää C (esimerkki 9) 10-syaani-2- • · · syklopentyylidekaanihappo (2 mmol, vaiheesta 5 esimerkin 13 menetelmässä G) kytkettiin N9-(2,2,5,7,8-pentametyyli- • · ’·;·* kromaani-6-sulfonyyli) -L-arginyyli-L-leusinaalidietyyli- ··· ···· • ♦ * * ♦ • ·· • · 118325 56 asetaaliin (1,8 mmol) vaiheesta 2 yhdisteessä 14) otsik-koyhdisteen saamiseksi kiinteänä aineena.
Vaihe 2$ lO-syaani-2-syklopentyylidekanoyyli-N9-(2,2,5,7,8 -pentainetyylikromaani - 6 - sul fonyy 1 i) - L - arginyy 1 i -5 L-leusinaali
Noudattaen menetelmää E (esimerkki 11) tuote vaiheesta 1 (0,3 g) muutettiin yhdisteeksi 15 (0,2 g) ja puhdistettiin HPLC: llä. ’h-NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 9,38 (s, 1H) ; 8,23 (d, 1H) ; 7,8 (s, 1H) ; 7,72 (d, 1H) ; 7,49 (t, 10 1H) ; 7,48 (s, 1H) ; 4,34 (m, 1H) ; 4,14 (m, 1H) ; 3,05 (m, 2H) ; 2,60 (t, 2H) ; 2,50 (s, 3H) ; 2,46 (s, 3H) ; 2,25 (m, 4H); 2,00 (s, 3H); 1,74 (t, 2H); 1,6 - 1,0 (m, 25H); 1,13 (s, 6H); 0,82 (kaksois-d, 6H).
Esimerkki 16 15 10 - syaani-2 - syklopentyylidekanoyyli-l^-nitro-L-ar- ginyyli-L-leusinaalisemikarbatsoni 20
Ncr r kh L A -MO, NH KH 1 *«· » · · • · · ; , Semikarbatsidihydrokloridia (0,20 mmol), natrium- • · · asetaattia (0,3 iranol) ja vettä (0,5 ml) lisättiin liuok- • e *···* 25 seen, jossa oli yhdistettä 14 (0,050 g, 0,089 mmol) 4,5 ·. *: ml:ssa etanolia ja sekoitettiin yön yli huoneenlämpötilas- ·· • *· sa. Liuotin poistettiin ja saatua yhdistettä 16 puhdistet- tiin HPLC:llä kuten esitetään taulukossa 6. ’h-NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 9,91 (s, 1Η) ; 8,51 (s, 2H) ; 8,04 (d, 1H) ; Γ·.. 30 7,95 (d, 1H) ; 7,40 (s, 1H) ; 7,09 (d, 1H) ; 6,29 (s, 2H) ; !·“. 4,44 (m, 1H) ; 4,33 (m, 1H) ; 3,16 (s, 2H) ; 2,08 - 1,00 (m, 33H); 0,87 (kaksois-d, 6H) .
• ·
• M
··· • · * · ··· 1 ··· • · • · * • ·· • · 57 1 1 8325
Esimerkki 17 10 - syaani-2 - syklopentyylidekanoyyli -N®-nitro-L-ar-ginyyli-L-leusinaallokai imi L JL .jioj
NS NS
10 Hydroksyyliamiinihydrokloridia (0,037 g, 0,534 mmol) lisättiin liuokseen, jossa oli tuotetta esimerkin 14 vaiheesta 4 (0,05 g, 0,089 mmol) pyridinissä (0,175 g, 2,2 mmol), huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen seosta pidettiin 80 °C:ssa 30 minuutin ajan. Tuote eristettiin HPLCillä 15 kuten esitetään taulukossa 6.
Esimerkki 18 10 - syaani-2 - syklopentyylidekanoyyli -rf'-ni tro-L- ar-ginyyl i - L -1 eus inaal i - O-metyyl ioksi imi θ^θγ»γΛ«^γ,'θ'' i 6,-
• M
* · ·· • · *;··’ 25 Noudattaen esimerkin 17 menettelyä valmistettiin *.*·! yhdiste 18 käyttäen O-metyylihydroksyyliamiinihydroklori- ·* : ’·· dia (0,031 g, 0,38 mmol) ja se eristettiin kahden HPLC- · · ί.ϊ ! piikin seoksena kuten esitetään taulukossa 6.
Esimerkki 19 30 10-syaani-2-syklopentyylidekanoyyli-Nfl-nitro-L-ar- .**·. ginyyli -L- leusinaali -O-bentsyylioksiimi «·· • 9 V n ^v"A*· 35 J ^ °Λ. E ^ • · L JL JfOl : nh kh 1 • 118325 58
Noudattaen esimerkin 17 valmistuksen menettelyä valmistettiin yhdiste 19 käyttäen yhdistettä 14 (0,05 g, 0,089 mmol), O-bentsyylihydroksyyliamiinihydrokloridia (0,043 g, 0,267 mmol) ja pyridiiniä (0,092 ml, 1,14 mmol).
5 Yhdiste erotettiin kahtena piikkinä HLPC-puhdistuksissa.
Esimerkki 20 9-metoksikarbonyyli-2 -sykiopentyylinonanoyyli-N9-(2,2,5,7,8 -pentametyylikromaani - 6 - sulfonyy 1 i) -L- arginyy 1 i -L-leusinaali NH "^ΙΛΜΓ-0 15 Vaihe 1: Fmoc-N9- (2,2,5,7,8-pentametyylikromaani-6- sulfonyyli)-L-arginyyli-L-leusinaalidietyyliasetaali
Noudattaen menetelmää C (esimerkki 9) Fmoc-N9-(2,- 2,5,7,8-pentametyylikromaani-6-sulfonyyli) -L-arginini (3,31 g, 5 mmol) kytkettiin L-leusinaalidietyyliasetaaliin 20 (0,85 g, esimerkin 12 menetelmä F) käyttäen BOP:tä (2,21 grammaa, 5 mmol), HOBtitä (0,67 g, 5 mmol) ja NMM:ää (0,7 t.·^ ml) 12 ml:ssa DMF:ää, jolloin saatiin dipeptidiasetaali *.*’.* (3,24 g). ’h-NMR (300 MHz, CDC1,) δ 7,89 (s, 1H) ; 7,78 (d, 2H) ; 7,6 (d, 2H) ; 7,4 (t, 2H) / 7,31 (t, 3H) ; 6,4 (d, 2H) ; V*: 25 5,92 (d, 1H) ; 4,58 (m, 1H) ; 4,43 (m, 1H) ; 4,35 (m, 3H) ; ·*.’·: 3,69 (rn, 2H) ; 3,53 (m, 2H) ; 3,30 (m, 2H) ; 2,6 (t, 2H) ; ·· Ϊ '** 2,58 (S, 6H) ; 2,12 (s, 3H) ; 1,80 (tt, 2H) ; 1,64 (m, 3H) ; •V*.· 1,32 (m, 10H) ; 1,18 (q, 6H) / 0,89 (t, 6H) .
Vaihe 2: N9- (2,2,5,7,8-pentametyylikramaani-6-sul- 30 fonyyli) -L-arginyy li-L-leusinaali ··**· Noudattaen menetelmää B (esimerkki 8) Fmoc-ryhmä ··· ..· poistettiin vaiheen 1 tuotteesta (1,6 g), jolloin saatiin • · :>f" puolikiinteää ainetta (1,3 g) . 1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) ö 7,6 (d, 1H) ; 6,76 (b, 1H) ; 6,46 (b, 1H) ; 4,27 (d, 1H) ; 3,9 ·:· 35 (m, 1H); 3,58 (m, 1H) ; 3,44 (m, 4H) ; 3,11 (t, 1H) ; 3,01 ···· • e • · · • ·· • · 118325 59 (m, 2H) ; 2,58 (t, 2H) ; 2,47 (s, 6H) ; 2,03 (s, 3H) ; 1,77 (t, 2H) ; 1,5 (m, 5H) ; 1,26 (s, 6H) ; 1,09 (m, 6H) ; 0,83 (kaksois-d, 6H).
Vaihe 3: 9-metoksikarbonyyli-2-syklopentyylinona- 5 noyyli-N3- (2,2,5/7/8-pentametyylikroinaaiii-6-sulfonyyli) -L-arginyyli-L-leusinaalidietyyliasetaali
Noudattaen menetelmää C (esimerkki 9) 9-metyyliok-sikarbonyyli-2-syklopentyylinonaanihappoa (0,56 g) kytkettiin N®-(2,2,5,7,8-pentametyylikromaani-6-sulfonyyli)-L-10 arginyyli-L-leusinaalidietyyliasetaaliin (0,7 g, 1,1 mraol) käyttäen B0P:tä (0,66 g, 1,5 mmol), HOBtrtä (0,202 g, 1,5 mmol) ja NMM:ää (2,2 ml, 2 mmol) 5 ml:ssa DMF:ää otsikko-yhdisteen saamiseksi kiinteänä aineena (1,8 g) . ^-NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 7,5 - 8,0 (m, 2H) ; 6,66 (m, 1H) ; 6,4 (m, 15 1H) ; 4,32 (m, 1H) ; 4,24 (d, 1H) ; 3,93 (m, 1H) ; 3,57 (m, 6H) ; 3,44 (m, 4H) ; 3,04 (m, 2H) ; 2,59 (t, 2H) ; 2,48 (s, 6H) ; 2,28 (m, 3H) ; 2,03 (s, 3H) ; 1,77 (t, 2H) ; 1,48 (m, 22H); 1,26 (s, 6H); 1,1 (tt, 9H); 0,81 (kaksois-d, 6H).
Vaihe 4: 9-xnetoksikarbonyyli-2-syklopentyylinona- 20 noyyli-N9- (2,2,5,7,8-pentametyylikromaani-6-sulfonyyli) -L- arginyy1i-L-1eusinaali ·'·1. Menetelmän E mukaan (esimerkki 11) tuote (0,2 g) : vaiheesta 1 muutettiin yhdisteeksi 20 ja puhdistettiin suoraan HPLC:llä. 1H-NMR (300 MHz, DMSO-dJ Ö 9,37 (s, 1H) ; t!|1. 25 8,2 - 7,4 (m, 2H) ; 6,69 (drm, 1H) ; 6,4 (brm, 1H) ; 4,3 (m, !.1 " 2H) ; 3,58 (s, 3H) ; 3,03 (m, 2H) ; 2,60 (t, 2H) ; 2,48 (s, • · 6H) ; 2,26 (m, 4H) ; 2,03 (s, 3H) ; 1,77 (t, 2H) ; 1,47 (brm, V 2 28H) ; 1,24 (s, 3H) ; 0,80 (kaksois-d, 6H) .
• · • 1 • ·· • · · • 1 • a a·· • a· • a a 1 a • aa • a a a • aa • a • aa • aaaa a a a a • aa 2 • a so 1 1 8325
Esimerkki 21 9 -metoksikarbonyyli - 2 - syklopen tyy 1 inonanoyy 1 i - N8- (4-metoksi-2,3,6-trimetyylibentseeni-1 -sulfonyyli) -L-arginyy- li-L-leuslnaali N8 10
Vaihe 1: 9 -metoksikarbonyyli -2- syklopentyylinona- noyyli-N®- (4-metoksi-2,3,6-trimetyylibentseeni-l-sulfonyy- li)-L-arginyyli-L-leusinaalidietyyliasetaali
Noudattaen menetelmää C (esimerkki 9) 9-metoksikar-15 bonyyli-2-syklopentyylinonaanihappoa (1,2 mmol, menetelmän G vaiheesta 12) kytkettiin N9-(4-metoksi-2,3,6-trimetyyli-bent seeni-1-sulfonyyli)-L-arginyy1i-L-leus inaalidietyyli-asetaaliin (1,0 mmol), jolloin saatiin peptidi kiinteänä aineena.
20 Vaihe 2: Noudattaen menetelmää E (esimerkki 11) asetaali vaiheesta 1 muutettiin yhdisteeksi 21 ja puhdis- ... tettiin HPLC:llä. 1H-NMR (300 MHz, CDCl./DMSO-cL) δ 9,42 (s, * · · . 1H) ; 8,25 (d, 1H) ; 7,92 (d, 1H) ; 7,84 (s, 1H) ; 6,4 (m, • * · 2H) ; 4,40 (m, 1H) ; 4,20 (m, 1H) ; 3,80 (s, 3H) ; 3,57 (s, *·/\ 25 3H) ; 3,26 (m, 2H) ; 2,64 (s, 3H) ; 2,55 (s, 3H) ; 2,36 (m, **.*"* 2H) ; 2,07 (s, 3H) ; 1,8 - 1,0 (m, 30H) ; 0,87 (kaksois-d, ·· Ϊ *** 6H) .
Esimerkki 22 9-me toksikarbonyy1i-2 -syklopentyy1Inonanoyy1i-N9-30 (2,2,5,7,8-pentametyylikromaani-6-sulfonyyli) -L-arginyyli-L-norleusinaali ··· i\ 9 “v0 Ϊ " I ± ^
Tl f I T
*. I f \ /“v * * 0 • ·· > \ 61 1 1 8325
Vaihe 1: 9-metoksikarbonyyli-2-syklopentyylinona-noyyli-H9- (2,2,5,7,8-pentametyylikromaani-6-sulfonyyli) -L-arginyyli-L-norleusinaalidietyyliasetaali Käyttäen menetelmää C (esimerkki 9) 9-metoksikar-5 bonyyli-2-syklopentyylinonaanihappo (1 mmol) kytkettiin N9-(2,2,5,7,8-pentametyylikromaani-6-sulfonyyli) -L-arginyyli-L-norleusinaalidietyyliasetaaliin (0,69 mmol, joka saatiin esimerkin 30 vaiheesta 1 noudattaen menetelmää B) käyttäen B0P:tä (1 mmol), HOBt:tä (1 mmol) ja NMM:ää (2,5 mmol) 5 10 ml:ssa DMF:ää. Reaktioseosta sekoitettiin 4,5 tunnin ajan ja eristettiin peptidi (0,37 g, 0,42 mmol).
Vaihe 2: 9-metoksikarbonyyli-2-syklopentyylinona- noyyli-N®- (2,2,5,7,8-pentametyylikromaani-6-sulfonyyli) -L-arginyy1i-L-norleusinaali 15 Menetelmän E mukaan (esimerkki 11) tuote (0,37 g, 0,42 mmol) vaiheesta 1 muutettiin yhdisteeksi 22 (0,33 g) ja puhdistettiin HPLCillä. 1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) 6 9,29 (s, 1H) ; 7,79 (d, 1H) ; 7,89 (d, 1H) ; 7,31 (t, 1H) ; 7,26 (S, 2H) ; 4,17 (m, 1H) ; 3,94 (m, 1H) ; 3,49 (s, 3H) ; 2,94 20 (m, 2H) ; 2,74 (t, 2H) ; 2,51 (t, 2H) ; 2,37 (s, 6H) ; 2,20 (m, 4H) ; 1,94 (s, 3H) ; 1,14 (s, 6H) ; 1,0 - 1,8 (m, 3H) ; ... 0,74 (t, 3H) .
I * · *' , Esimerkki 23 • · · 9 -metoksikarbonyyli - 2 - syki open tyylinonanoyy li -N9- • · *···* 25 nitro-L-arginyyli-L-leusinaali 30 • te f · • · "· Vaihe 1: 9 -metoksikarbonyyli-2 - syki open tyylinona- * # noyyli-lT-nitro-L-arginyyli-Ii-leusinaalidietyyliasetaali Käyttäen menetelmää C (esimerkki 9) 9-metoksikar- •S. 35 bonyyli-2-syklopentyylinonaanihappo (0,66 g, 0,33 mmol) «·*«
• t • · · f II
e · 62 1 1 8 3 2 5 kytkettiin tuotteeseen (0,109 g, 0,28 mmol) esimerkin 14 vaiheesta 2 käyttäen B0P:tä (0,146 g, 0,33 mmol) H0Bt:tä (0,0449 g, 0,33 mmol) ja NMM:ää (0,105 g, 0,95 mmol) 7 ml:ssa DMF:ää vaiheen 1 mukaisen otsikkoyhdisteen saarni-5 seksi (0,124 g). ’h-NMR (300 MHz, CDClj) δ 8,31 (m, 2H) ; 6,69 (leveä d, 1H); 6,15 (leveä d, 1H); 4,5 (m, 1H); 4,33 (m, 1H) ; 4,18 (m, 1H) ; 3,67 (s, 3H) ; 3,53 (m, 4H) ; 3,32 (rn, 2H); 2,68 (m, 2H); 2,29 (t, 3H); 2,0 - 1,0 (leveä m, 34H); 0,90 (kaksois-d, 6H).
10 Vaihe 2: Noudattaen menetelmää E (eismerkki 11) peptidi (vaiheesta 1, 0,124 g) muutettiin yhdisteeksi 23 (0,106 g). 1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) ö 9,39 (s, 1H) ; 8,54 (m, 1H); 8,31 (d, 1H); 7,99 (leveä d, 2H); 4,36 (m, 1H); 4,15 (m, 1H) ; 3,33 (s, 3H) ; 3,16 (m, 2H) ; 2,27 (t, 2H) ; 15 2,03 (m, 2H); 1,0 - 1,7 (m, 28H); 0,83 (kaksois-d, 6H).
Esimerkki 24 2 - syki open tyy 1 i-10-N-ftal imidodekanoyy 1 i - N9- ni t ro -L-arginyy1i-L-1eusinaali =t: ; . 'o »» "« I · » • ·· • · ·*** *.·.* 25 Vaihe 1: 2 - syklopen tyy 11-10-N-f tai imidodekanoyy 1 i - • · : N^-nitro-L-arginyy1i-L-leusinaalidietyyliasetaali #· • *·· Noudattaen menetelmää C (esimerkki 9) tuote (0,25 :J'i grammaa, 0,65 mmol) vaiheesta 6 menetelmässä G (esimerkki 13) kytkettiin tuotteeseen vaiheesta 2 esimerkissä 14 ·'·„ 30 (0,195 g, 0,5 mmol) käyttäen BOP:tä (0,288 grammaa, 0,65 .*·*, mmol), HOBtrtä (0,088 g, 0,65 mmol) ja NMM:ää (0,130 ml, ··· >t* 0,130 mmol) 5 ml:ssa DMF:ää otsikkoyhdisteen saamiseksi • " (0,557 g) kiinteänä aineena. ’h-NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ :...! 8,57 (leveä m, 1H) ; 7,91 (d, 1H) ; 7,85 (leveä d, 4H) ; 7,55 ·;· 35 (d, 1H) ; 4,32 (m, 1H) ; 4,23 (kaksois-d, 1H) ; 3,90 (m, 1H) ; ···* • * • « · • f · • · 118325 63 3,55 (t, 3H) ; 3,43 (m, 4H) ; 3,14 (m, 2H) ; 2,0 (leveä m, 1H) ; 1,74 (leveä m, 2H) ; 2,0 - 1,15 (2x leveä m, 28H) ; 1,09 (tt, 6H); 0,79 (kaksois-d, 6H).
Valhe 2: 2-syklopentyyli-10-N-ftalimidodekanoyyli-5 N*- ni tro - L -arginyy1i-L-leusinaali Käyttäen menetelmää E (esimerkki 11) tuote vaiheesta 1 (0,45 g) muutettiin yhdisteeksi 24 (0,32 g). 1H-NMR (300 MHz, DMS0-d6) δ 9,38 (s, 1H) ; 8,31 (d, 1H) ; 8,00 (d, 1H); 7,85 (m, 4H); 4,38 (m, 1H); 4,15 (1, 1H); 3,57 (tt, 10 3H); 3,15 (m, 2H); 2,00 (m, 1H); 1,9 - 1,0 (leveä m, 30H); 0,86 (kaksois-d, 6H).
Esimerkki 25 10- (trifluorimetaanlsulfonyyli) amino-2-syklopentyy-1 idekanoyyl i - N9-ni t ro - L - arginyy 1 i - L - leus inaal i w 0 ne
' KI KB
20
Vaihe 1: 10-(trifluorimetaanisulfonyyli)amino-2- syklopentyy 1 idekanoyyl i-N^nitro-L-arginyy 1 i - L - leus inaal i - • e e I . dietyyliasetaali Γ..* Käyttäen menetelmää C (esimerkki 9) 10-(trifluori- e e *“·[ 25 metaanisulfonyyli)amino-2-syklopentyylidekaanihappo(0,199 e e t *· " grammaa, 0,51 mmol) kytkettiin tuotteeseen vaiheesta 2 • e ϊ*" esimerkissä 14 (0,175 g, 0,45 mmol) käyttäen BOP:tä (0,22 ··« V : grammaa, 0,51 mmol), HOBtitä (0,069 g, 0,51 mmol) ja NMM-.ää (0,052 ml, 0,47 mmol) 5 ml:ssa DMFtää. Asetaali ϊ'·.. 30 saatiin kiinteänä aineena (0,42 g) . 1H-NMR (300 MHz, CDC13) :***: δ 6,06 (leveä m, 1H) ; 5,81 (m, 1H) ; 4,53 (m, 1H) ; 4,32 (d, ./* 1H) ; 4,13 (m, 1H) ; 3,73 (q, 4H) ; 3,53 (m, 2H) ; 3,3 0 (q, • · 3H) ; 2,0 - 1,0 (2x leveä m, 36H); 0,9 (kaksois-d, 6H).
e e • · ··« e·· ···# • · • * · • e· • · 118325 64
Vaihe 2: 10-(tri£luorimetaanieulfonyyli)amino-2- syklopen tyy 1 idekanoyyl i - N9 - ni t r o - L - arginyy 1 i - L -1 eus inaal i
Noudattaen menetelmää E (esimerkki 11) tuote vaiheesta 1 (0,35 g) muutettiin yhdisteeksi 25 (0,17 g). 1H-5 NMR (300 MHz, DMS0-d6) δ 9,27 (s, 1H) ; 8,46 (leveä m, 1H) ; 4,30 (m, 1H) ; 3,87 (m, 1H) ; 3,09 (m, 5H) ; 2,8 - 1,0 (2x leveä m, 30H); 0,78 (kaksois-d, 6H).
Esimerkki 26
Monametyyliatselayyli-I^-nitro-L-arginyyli-L-leusi - 10 naali ΤυΊ'/Α 15 '»Ah'»0·
Vaihe 1: Monometyyliatselayyli-N^-nitro-L-arginyy- li-L-leusinaalidietyyliasetaali
Noudatten menetelmää C (esimerkki 9) otsikkoyhdiste 20 valmistettiin käyttäen atselaiinihapon monometyyliesteriä (0,708 g, 3,5 mmol), BOPrtä (1,55 g, 3,5 mmol), HOBt:tä (0,47 g, 3,5 mmol), NMM:ää (0,38 ml, 3,5 mmol), Ng-nitro- • · ♦ . L-arginyyli-L-leusinaalidietyyliasetaalia (joka saatiin • · · vaiheesta 2 esimerkissä 14 noudattaen menetelmää B, esi- • · *;*\ 25 merkki B) (1,306 g, 3,5 mmol) 12 ml:ssa DMF:ää. Peptidi *· " saatiin amorfisena kiinteänä aineena (2,17a). Ή-NMR (300 ί *·* MHz, CDC13) δ 6,58 (d, 1H) ; 6,04 (d, 1H) ; 4,47 (m, 1H) ; V*: 4,30 (d, 1H) ; 4,17 (m, 1H) ; 3,67 (s, 3H) ; 3,53 (m, 2H) ; 3,2 - 3,4 (t, d, 2H); 2,3 (m, 3H); 2,2 (t, 1H); 1,83 (m, 30 1H); 1,2 - 1,8 (m, 24H) ; 1,2 (m, 3H) ; 0,9 (d, 3H) .
:**; Vaihe 2: Monometyyliatselayyli-N®-nitro-L-arginyy- • · · li-L-leusinaali • · Käyttäen menetelmää E (esimerkki 11) peptidiasetaa- • · *”·* li (vaiheesta 1) (250 mg) muutettiin yhdisteeksi 26 (0,22 t4*i· 35 grammaa). ’h-NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 9,38 (s, 1H) ; 7,73 • · • · · • ·· e · 65 1 1 8325 (d, 1H) ; 4,30 (ra, 1H) ; 4,09 (m, 1H) ; 3,57 (s, 3H) ; 3,15 (m, 2H) ; 3,01 (q, 1H) ; 2,75 (m, 1H) ; 2,24 (m, 7H) / 1,50 (m, 12H) ; 1,24 (b, 14H) ; 0,86 (tn, 6H) .
Esimerkki 27 5 Monoonetyyliatselayyli -N*-ni tro - L - arginyyl i - L - f enyy- lialaninaali
M
L A -NO»
NH NK
Vaihe 1; Fenyylialanlnaalidietyyliasetaali CBZ-Phe-OH (6,0 g, 2 mmol) muutettiin fenyyliala-15 ninaalidietyyliasetaaliksi noudattaen samaa menettelyä kuin mitä käytettiin leusinaalidietyyliasetaalin kohdalla (menetelmä F, esimerkki 12).
Vaihe 2: Fmoc-Arg(N02)-OH
Liuos, jossa oli fluorenyylimetyylioksikarbonyyli-20 N-hydroksisukkinimidyyliesteriä (32 mmol) 60 ml:ssa THF:ää, lisättiin sekoitettuun liuokseen, jossa oli N®-nit-ro-L-arginiinia (35 mmol) ja NaHC03:ea (70 mmol) 70 ml:ssa • t * ! . H?0:ta. Maitomainen liuos kirkastui 1 tunnissa, minkä jä- *,’· Ikeen liuos tehtiin happamaksi lisäämällä kiinteää sitru- • · *··*[ 25 unahappoa pH:hon 2 - 3 ja uutettiin 300 ml:11a EtOAc:tä.
• · · *· *: Orgaaninen faasi pestiin kerran vedellä, kuivattiin ja ·· : *·· haihdutettiin kuiviin, jolloin saatiin yhdistettä valkoi- • s· V* 5 sena kiinteänä aineena (26,8 mmol).
Vaihe 3: Ftaoc-Arg (N02)-hartsi 30 Liuos, jossa oli 9-fluorenyylimetyylioksikarbonyy- • ·"*. li-N9-nitro-L-arginiinia (vaiheesta 2, 26,8 mmol), BOP-.tä ..* (30 mmol), HOBt:tä (30 mmol) ja NMM:ää (55 mmol) 40 ml:ssa • · DMF:ää, sekoitettiin 10 g:aan PAC-hartsia (a-metyylifena- • · *·;·* syyliliittäjä kiinnitettynä polystyreeni - 1 % di vinyyli- •j* 35 bentseeniin, substituutio 0,97 mmol/g, toimittaja Bachem • ♦ • · · ♦ ·♦ • · G6 1 1 8325
Bioscience, Inc., King of Prussia, PA) ja sekoitettiin 4 tunnin ajan. Hartsi suodatettiin eroon, pestiin DMFrllä, DCM:llä ja MeOH:lla ja kuivattiin, jolloin saatiin lopputuotetta Fmoc-Arg (N02)-hartsia (11,1 g). Hartsiin, Fmoc-5 Arg (N02)-hartsiin (11,1 g), lisättiin 100 ml liuosta, joka sisälsi piperidiiniä (30 %) , DMF:ää (35 %) ja tolueenia (35 %) ja sekoitettiin 2,5 tunnin ajan. Hartsi, josta oli Fmoc poistettu, suodatettiin ja pestiin toisiaan seuraten DCM/DMF:llä (50:50) ja MeOH:lla halutun tuotteen saamisek-10 si (9,2 g).
Vaihe 4: MeOAz:Arg (N02)-hartsi
Monometyyliatselaattia (20 mmol) lisättiin sekoitettuun lietteeseen, jossa oli Arg (N02)-hartsia (9,2 g), BOP:tä (20 mmol), H0Bt:tä (20 mmol) ja NMM:ää (pH:n sää-15 tämiseksi 8:ksi). Yön yli jatkuneen sekoituksen jälkeen lisättiin seos, jossa oli monometyyliatselaattia (10 mmol), BOP:tä (10 mmol), H0Bt:tä (10 mmol) ja NMMrää (20 mmol), ja sekoitettiin 24 tunnin ajan. Hartsi pestiin DMFrllä, DCMillä ja metanolilla, jolloin saatiin 10,56 g 20 hartsia.
Vaihe 5: Monometyyllatselayyli-N^nitro-L-arginiini ·*;*: Tuotetta vaiheesta 4 (10,56 g) sekoitettiin 5 tun- * • *.f; nin ajan 100 mlrssa liuosta, joka koostui 67 %:sta DCMrää, • · .···. TFArsta (30 %) ja anisolista (3 %) . Liete suodatettiin ja • · 25 liuotin haihdutettiin ja jäännöstä trituroitiin eetterissä • · · peptidin saamiseksi (1,11 g, 2,75 mmol).
Vaihe 6s Monometyyllatselayyli-N^-nitro-L-arginyy- * · * li-L-fenyylialaninaalidietyyliasetaali
Noudattaen menetelmää C (esimerkki 9) metoksiatse- ·· ί *·· 30 laoyyli-N9-nitro-L-arginiinia (1 mmol) kytkettiin L-fenyy- ··· lialaninaalidietyyliasetaaliin (1,3 mmol) käyttäen BOP:tä :*! (1,3 mmol), HOBtrtä (1,3 mmol) ja NMMrää (pH:n säätämisek- • mm ]··.# si 8:ksi) otsikkopeptdin saamiseksi (0,82 mmol).
• a • a* • ··· ···· • · • » « • »t t · 67 1 1 8325
Vaihe 7: Monometyyliatselayyli-Nfl-nitro-L-arginyy-1i-L-fenyy1ialaninaali Käyttäen menetelmää E (esimerkki 11) tuote (0,82 mmol) vaiheesta 6 muutettiin otsikkoyhdisteeksi (0,81 5 mmol). ’H-NMR (300 MHz, CDC13) Ö 9,59 (s, 1H) ; 8,36 (s, 1H); 7,49 (s, 1H); 7,31 - 7,09 (m, 7H); 6,71 (d, 1H); 4,69 (m, 1H) ; 4,60 (m, 1H) ; 3,66 (s, 3H) ; 3,41 (m, 2H) ; 3,27 (m, 2H)? 2,31 (t, 2H); 2,2 (t, 2H); 1,80 - 1,2 (m, 14H). Esimerkki 28 10 Monametyyliatselayyli-N9-(2,2,5,7,8-pentametyylikro- maani-6-sulfonyyli)-L-arginyyli-L-leusinaali
v. rW-'A
Vaihe 1: Monometyyliatselayyli-N®- (2,2,5,7,8-penta-metyylikromaani-6-sulfonyy1i)-L-arginyyli-L-leusinaalidi-20 etyyliasetaali
Noudattaen menetelmää C (esimerkki 9) monometyyli- ... atselaatti (1,42 g, 7,0 mmol) kytkettiin N9-(2,2,5,7,8-pen- • 1 · • · · I . tametyylikromaani-6-sulfonyyli)-L-arginyyli-L-leusinaali- * · · '1,]· dietyyliasetaaliin (3,06 g, 5,0 mmol, joka saatiin vai- • · *··»! 25 heesta 2 esimerkissä 20), käyttäen 7,0 mmol kutakin BOP-.- *. 1: tä, HOBt:tä ja NMM:ää halutun yhdisteen saamiseksi (3,43 ··, .
: ·· grammaa) kiinteänä aineena. H-NMR (300 MHz, CDC13) Ö 6,58 :T: (d, 1H); 6,04 (d, 1H); 5,4 (leveä, 1H); 5,06 (leveä, 1H); 4,47 (m, 1H) ; 4,30 (d, 1H) ; 4,17 (m, 1H) ; 3,67 (s, 3H) ; ·1.„ 30 3,53 (m, 4H) ; 3,23 (d, 1H) ; 3,19 (t, 2H) ; 2,30 (m, 2H) ; .···. 2,2 (tt, 2H) ; 2,0 - 1,25 (2x leveä m, 17H) ; 1,20 (tt, 6H) ; e·· ..· 0,90 (kaksois-d, 6H) .
• e • ·· ··· • 1 • · • · · *· * ··1· ♦ • · e • ·« • · 68 " 8325
Vaihe 2: Monometyyliatselayyli-N9-(2,2,5,7,8-penta-me tyylikromaani-6-sulfonyy1i)-L-arginyy1i-L-leueinaali Käyttäen menetelmää E (esimerkki 11) tuote (0,30 g) vaiheesta 1 muutettiin yhdisteeksi 28 (0,22 g) . 1H-NMR (300 5 MHz, DMS0-d6) δ 9,38 (s, 1H) ; 8,5 (leveä, 1H) ; 4,30 (m, 1H) ; 4,09 (m, 1H) ; 3,57 (s, 3H) ; 3,15 (m, 2H) / 3,00 (t, 2H); 2,75 (m, 2H); 2,12 (t, 2H); 1,8 - 1,20 (2x leveä m, 17H); 0,86 (kaksois-d, 6H) .
Esimerkki 29 10 Monometyyliatselayyli-N9- (2,2,5,7,8-pen tame tyyl ikr o- maani-6-sulfonyyli)-D-arginyyli-L-leusinaali °Y~\ 15 " ’ C jc
Vaihe 1: S-fluorenyylimetoksikarbonyyli-N®- (2,2,5, - 7,8-pentametyylikromaani-6-sulfonyyli)-D-arginyyli-L-leu-20 sinaalidietyyliasetaali
Noudattaen menetelmää C (esimerkki 9) 9-fluorenyy-limetoksikarbonyyli-N9- (2,2,5,7,8-pentametyylikromaani-6- • · · sulfonyyli) -D-arginiini (3 mmol) kytkettiin leusinaalidi- • ·· λ,1 2 3 4 etyyliasetaaliin (2,5 mmol) käyttäen BOPrtä (3 mmol), • · *;·1! 25 HOBt:tä (3 mmol) ja NMM:ää (5 mmol) 5 mlrssa DMF:ää pep- • ta ]· 1· tidin saamiseksi kiinteänä aineena (1,72 g, 2 mmol).
1’ Vaihe 2: MeOAz-D-Arg(PMC)-leusinaalidietyyliasetaa- *·· 2 • 1 1 . .
3 ·.· · li Käyttäen menetelmää C (esimerkki 9) monometyyliat- ί30 selaatti (1,0 mmol) kytkettiin N9-(2,2,5,7,8-pentametyyli- kromaani-6-sulfonyyli) -D-arginyyli-L-leusinaalidietyyli- asetaaliin (0,54 g, 0,88 mmol), joka saatiin vaiheen 1 ot- *... sikkoyhdisteestä noudattaen menetelmää B (esimerkki 8) , • · ’;·1 käyttäen B0P:tä (1 mmol), HBOtitä (1 mmol) ja NMM:äa (3 ·»· 4 • · • · · • te • « 118325 69 mmol) 5 ml:ssa DMF:ää halutun tuotteen saamiseksi (0,735 grammaa).
Vaihe 3: Monometyyliatselayyli-N9-(2,2,5,7,8-penta-metyylikromaani-6-sulfonyyli)-D-arginyyli-L-leusinaali 5 Käyttäen menetelmää E (esimerkki 11) tuote (0,1 g) vaiheesta 2 muutettiin yhdisteeksi 29 ja puhdistettiin HPLC: llä. 1H-NMR (300 MHz, CDC13) δ 9,49 (s, 1H) ; 7,74 (t, 1H) ; 7,43 (d, 1H) ; 6,43 (d, 1H) ; 6,34 (s, 2H) ; 4,60 (m, 1H) ; 4,51 (s, 3H) ; 4,54 (s, 3H) ; 4,37 (m, 1H) ; 3,66 (s, 10 3H) ; 3,31 (m, 2H) ; 2,63 (t, 2H) ; 2,26 (m, 4H) ; 2,09 (s, 3H); 1,80 (t, 2H); 1,57 (m, 7H); 1,26 (m, 16H); 0,90 (kak-sois-d, 6H).
Esimerkki 30
Monometyyliatselayyli-N9- (2,2,5,7,8-pentaxnetyylikro-15 maani-6-sulfonyyli)-L-arginyyli-L-norleusinaali HS 0 20 ,··· Fmoc-Arg (PMC)-OH (2 mmol) kytkettiin norleusinaa- * · · ! . lidietyyliasetaaliin (2 mmol, saatiin CBZ-Nle-OH:sta nou-
• '«S
daatten menettelyjä Leu-asetaalin valmistuksessa) käyttäen • · *;··* 25 BOP:ta (2 mmol), HOBt:tä (2 mmol) ja NMM:ää (6 mmol) 6 • · · *· " ml:ssa DMF:ää menetelmän C mukaan (esimerkki 9) peptidin • e :'** (1,37 g, 1,64 mmol) saamiseksi.
V ! Vaihe 2: MeOAz-Arg (PMC) -L-norleusinaalidietyyli- asetaali j\. 30 Noudattaen menetelmää C (esimerkki 9) monometyyli- ·**’· atselaatti (2 rnrnol) kytkettiin Arg(PMC)-norleusinaalidi- ··· etyyliasetaaliin (1,39 mmol, saatiin vaiheesta 1 noudat- • · *>t" taen menetelmää B, esimerkki 8) käyttäen BOP:tä (2 mmol) , • · *“* HOBt:tä (2 mmol) ja NMM:ää (6 mmol) ja sekoitettiin yön •Γ 35 yli· Seuraavana päivänä 1 mmol kutakin monometyyliatse- *. *: 118325 70 laattia, BOP:tä, HOBt:tä ja NMM:ää lisättiin ja sekoitettiin 4 tunnin ajan. Reaktioseosta työstettiin kuten menetelmässä C, esimerkki 9, peptidin saamiseksi (0,37 g, 0,84 mmol).
5 Vaihe 3: Noudattaen menetelmää E (esimerkki 11) tuote vaiheesta 2 (0,94 g, 0,84 mmol) muutettiin yhdis teeksi 30 (0,58 g). 1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 9,54 (s, 1H) ; 7,49 (t, 1H) ; 6,74 (d, 1H) ; 6,26 (s, 2H) ; 6,23 (d, 1H) ; 4,58 (m, 1H) ; 4,31 (m, 1H) ; 3,66 (s, 3H) ; 3,34 (m, 2H) ; 10 2,63 (t, 2H) ; 2,58 (s, 3H) ; 2,56 (s, 3H) ; 2,29 (t, 2H) ; 2,23 (t, 2H); 1,9 - 1,5 (m, 22H); 1,30 (s, 6H); 0,86 (t, 3H) .
Esimerkki 31
Monometyyliatselayyli-N9-)p-tolueenisul£onyyli) -L-15 arginyyli-L-leusinaali iYi
° I S
20 “8
Vaihe 1: Fmoc-N9-(p-tolueenisulfonyyli)-L-arginyy- • 9 · (*a . li-L-leusinaalidletyyliasetaali • · · J.,‘ Käyttäen menetelmää C (esimerkki 9) Fmoc-N8- (p-tol- ···] 25 ueenisufonyyli) -L-arginiini (5 mmol) kytkettiin leusinaa- • · · ”· lidietyyliasetaaliin (5,5 mmol) käyttäen HBTUrta (5,5 ϊ " mmol), HOBt:tä (5,5 mmol) ja NMMrää (11 mmol) 15 ml:ssa »·· V* DMF:ää. Peptidi eristettiin kiinteänä aineena (2,86 g, 3,96 mmol).
• 30 Vaihe 2: Monometyyliatselayyli-N®- (p-tolueenisulfo- ;***: nyyli) -L-arginyyli-L-leusinaalidietyyliasetaali *·· ,/ Noudattaen menetelmää C (esimerkki 9) monometyyli- !„" atselaatti (6 mmol) kytkettiin N9-(p-tolueenisulfonyyli) - • · *"·* L-arginyyli-L-leusinaalidietyyliasetaaliin (2,7 g, 4,7 ta*j* 35 mmol, joka saatiin vaiheesta käyttäen menetelmää B, esi- • · * ♦ ♦ • M • · 71 1 1 8325 merkki 8) käyttäen 1-bentsotriatsol-l-yyli-l,1,3,3-tetram-etyyliuroniumheksafluorifosfaattia (HBTU) (6 mmol), HOBt:tä (6 mmol) ja NMM:ää (12 mmol) 15 ml:ssa DMF:ää ja sekoitettiin yön yli. Reaktion saantoa parannettiin lisää-5 mällä monometyyliatselaattia (3 mmol) ja difenyylifosfo-ryyliatsidia (3 mmol) ja sekoitettiin 4 tunnin ajan peptidin saamiseksi kiinteänä aineena (1,92 g).
Vaihe 3: Monometyyliatselayyli-N9- (p-tolueenisulfo-nyyli)-L-arginyyli-L-leusinaali 10 Menetelmän E mukaan (esimerkki 11) tuote vaiheesta 2 (1,92 g, 2,8 mmol) muutettiin yhdisteeksi 31 (1,64 g). 1H-NMR (300 MHz, DMSO-dfi) δ 9,37 (s, 1H) ; 8,97 (d, 1H) ; 8,37 (d, 1H) ; 7,66 (d, 2H) ; 7,37 (m, 1H) ; 7,29 (d, 2H) ; 7,03 (S, 1H) ; 6,63 (s, 1H) ; 4,09 (m, 1H) ; 3,57 (s, 3H) ; 15 3,44 (m, 1H) ? 3,04 (m, 2H) ; 2,26 (s, 3H) ; 2,33 (t, 2H) ; 2,13 (t, 2H); 2,80 - 1,09 (m, 7H); 0,86 (kaksois-d, 6H). Esimerkki 32
Monometyyliatselayyli-N8- (4-metoksi-2,3,6-trimetyy-1i-1-sulfonyy1i)-L-arginyy1i-L-leusinaalisemikarbatsoni 20 w '%Ύ; 25 1 • f V*: Katso Basak, A., et ai. . Int. J. Peptide Protein • *·· Res. 36 (1990) 7 - 17. Seosta, jossa oli MeOAz-Arg(MTR) -
Leu-H:ta (esimerkki 34) (67 mg, 0,10 mmol), semikarbatsi- dihydrokloridia (11 mg, 0,1 mmol) ja natriumasetaattia (9 30 mg, 0,11 mmol) 3 ml:ssa 90-%:ista EtOHita, kuumennettiin ,···, 70 °C:ssa 18 tunnin ajan. Reaktiosoes haihdutettiin kui- mt·* viin, jolloin saatiin vaaleankeltainen kiinteä aine (yh- • ** diste 32), jota sitten puhdistettiin HPLC:llä kuten tau- ··· lukossa 6. ’h-NMR (300 MHz, CDC13) δ 7,91 (t, 1H) ; 7,09 (d, 35 1H) ; 6,68 (s, 1H) ; 6,22 (s, 1H) ; 4,37 - 4,46 (m, 1H) ; *··· t · t · ♦ • ·· • · 118325 72 4,2 - 4,3 (m, 1H) ; 4,04 (d, 1H) ; 3,7 (s, 3H) ; 3,58 (s, 3H) ; 2,6 (s, 3H) ; 2,27 (kaksois-d, 2H) ; 2,05, 2,12 (s, 3H) ; 1,2 - 1,64 (m, 12H); 0,85 (t, 6H) .
Esimerkki 33 5 Monoxnetyyliatselayyli-N9- (4-metoksi-2,3,6-trimetyy- li-l-sulfonyyli) -L-arginyyli-L-leusinaalitiosemikarbats-oni) io !TLrr/-V·^ f V j , μη 1111 g \fcy-~0
Noudattaen samoja vaiheita kuin esimerkissä 32 yh-15 diste 33 valmistettiin esimerkin 34 mukaisesta yhdisteestä (51 mg, 0,07 mmol) ja tiosemikarbatsidista (7 mg, 0,07 mmol) 2 ml:ssa 90-%:ista EtOH:ta.
Esimerkki 34
Honometyyliatselayyli-N9- (4-matoksi-2,3,6-trimetyy-20 libentseeni-l-sulfonyyli)-L-arginyyli-L-leusinaali y ^ * ci! A-, s : n ;··. 25 s~\ ,· : Vaihe 1: Noudattaen menetelmää C (esimerkki 9) 9- f luorenyylimetyylioksikarbonyyli-N9 (4-metoksi-2,3,6-trime- a · · tyylibentseeni-l-sulfonyyli)-L-arginyyli-L-leusinaalidi-etyyliasetaali valmistettiin 9-fluorenyylimetyylioksikar- ·· • *·· 30 bonyyli-N9 (4-metoksi-2,3,6-trimetyylibentseeni-l-sulfonyy- :”*! li)-L-arginiinista ja L-leusinaalidietyyliasetaalista.
··] Vaihe 2: Monometyyliatselayyli-N9- (4-metoksi-2/3, 6-
• M
trimetyylibentseenisulfonyyli) -L-arginyyli-L-leusinaali • e "* Noudattaen menetelmää C (esimerkki 9) monometyyli- e 35 atselaatti (6 mmol) kytkettiin N9- (4-metoksi-2,5,6-trime- e e • · e • a# e e 118325 73 tyylibentseeni-l-sulfonyyli) -L-arginyyli-L-leusinaalidi-etyyliasetaaliin (5 mmol, joka saatiin vaiheesta 1 käyttäen menetelmää B, esimerkki 8) , ja peptidi eristettiin amorfisena kiinteänä aineena (3,3 g).
5 Vaihe 3: Metoksiatselayyli-N*- (4-metoksi-2,3,6-tri- metyylibentseen!-1-sulfonyy1i)-L-arginyy1i-L-leus inaali
Tuote vaiheesta 2 (0,5 g) muutettiin yhdisteeksi 34 (0,36 g) menetelmän E mukaan, esimerkki 11. 1H-NMR (300 MHz, CDC13) δ 9,54 (s, 1H) ; 7,51 (s, 1H) ; 6,74 (d, 1H) ; 10 6,57 (S, H); 6,40 (s, 2H) ; 6,31 (s, 1H) ; 4,66 (m, 1H) ; 4,41 (m, 1H) ; 3,87 (s, 3H) ; 3,70 (s, 3H) ; 3,33 (m, 2H) ; 2,73 (S, 3H) ; 2,66 (s, 3H) ; 2,33 (t, 2H) ; 2,26 (t, 2H) ; 2,17 (S, 3H); 2,00 - 1,26 (m, 17H); 0,96 (kaksois-d, 6H). Esimerkki 35 15 Metoksiatselayyll-N9- (2,4,6-trimetyylibentseeni-l- sulfonyy1i)-L-arginyy1-L-leusinaali
TutAt 20 r hi o \
HB »H
Φ · · \ . Vaihe 1: Fmoc-N9(2,4,6-trimetyylibentseeni-l-sulfo- • se nyyli) -L-arginyyli-L-leusinaalidietyyliasetaali • e 25 HCl:n 4 M liuosta dioksaanissa (10 ml) lisättiin • · · |· " liuokseen, jossa oli Boc-Arg(MTS)-OH:ta (6 mmol) 10 ml:ssa • e ϊ " dioksaania. 30 minuutin kuluttua liuotin poistettiin ja ·.· : eetteri lisättiin, sakka otettiin talteen ja kuivattiin (3,21 g, 9 mmol) . Arg-MTS-OH-hydrokloridi muutettiin Fmoc-; 30 Arg(MTS)-OH:ksi noudattaen menettelyä, jota kuvattiin toil*!: syylijohdannaisen valmistamiseksi (esimerkki 31), jolloin saatiin otsikkyhdistettä valkoisena kiinteänä aineena (2,09 g).
e · • e· e • • e· • see • * • · * • ·· • · 74 1 18 3 2 5
Vaihe 2: Fmoc-Arg(MTS)-Leu-asetaali
Noudattaen menetelmää C (esimerkki 9) Fmoc-Arg-(MTS)-OH (3,361 mmol) kytkettiin leusinaalidietyyliasetaa-liin (4 mmol) käyttäen HBTU:ta (4 mmol), HOBt:tä (4 mmol) 5 ja NMM:ää (10 mmol) 15 ml:ssa DMF:ää otsikkopeptidin saamiseksi (1,05 g).
Vaihe 3: MeOAz-Arg(MTS)-Leu-asetaali Käyttäen menetelmää C monometyyliatselaatti (1,2 mmol) kytkettiin Arg(MTS)-Leu-asetaaliin (0,85 mmol, saa- 10 tiin vaiheesta 2 noudatten menetelmää B, esimerkki 8) käyttäen BOP:tä (1,2 mmol), HOBt:tä (1,2 mmol) ja NMMrää (3,6 mmol) 3 ml:ssa DMF:ää ja sekoitettiin yön yli, jolloin saatiin otsikkopeptidiä puolikiinteänä aineena (0,59 grammaa).
15 Vaihe 4: Metoksiatselaoyyli-N9-(2,4,6-trimetyylibe- ntseeni-1-sulfonyy1i)-L-arginyy1i-L-leusinaali
Menetelmän E mukaan (esimerkki 11) tuote (0,59 g) vaiheesta 3 muutettiin yhdisteeksi 35 (0,54 g) ja puhdistetun HPLC: llä. 1H-NMR (300 MHz, CDClj) δ 9,49 (s, 1H) ; 20 7,53 (s, 1H); 6,90 (s, 2H); 6,81 (d, 1H); 6,40 (leveä s, 3H) ; 4,61 (m, 1H) ; 4,38 (m, 1H) ; 3,67 (s 3H) ; 2,67 (s, 6H); 2,29 (t, 2H); 2,20 (t, 2H); 2,0 - 1,20 (m, 19H); 0,91 *·' 1 (kaksois-d, 6H) .
• e :.2i Esimerkki 36 • · · 25 S-syaani-heksaani-l-sulfonyyll-N1- (2,2,5,7,8-penta- • · !,1·· metyylikromaani-6-sulfonyyli) -L-arginyyli-L-leusinaali • · • · • · · • · · Bv ^0 30 O lxj^ck * · ^ • · 1 • · 1 • · * · · · · · • · · · • · • · · • «t 2 • · 75 1 1 8325
Vaihe 1: 6 - syaaniheksaani-1 - sulfonyyli-N®- (2,2,5,- 7.8- pentametyylikromaani-6-sulfonyyli)-L-arginyyli-L-leu-sinaali 6-syaaniheksaani-l-sulfonyylikloridia (0,19 g, 0,89 5 iranol) vaiheesta 14 menetelmässä G (esimerkki 13) lisättiin tuotteen esimerkin 20 vaiheesta 2 (0,55 g, 0,899 mmol) liuokseen 1 ml:ssa DMF:ää ja liuoksen pH säädettiin 8:ksi NMM:ää lisäämällä. 4 tunnin sekoituksen jälkeen reaktio-seosta jatkotyöstettiin kuten kuvataan menetelmässä A 10 (esimerkki 7) otsikkoyhdisteen saamiseksi (0,466 g).
Vaihe 2: 6-syaaniheksaani-1-sulfonyyli-N9- (2,2,5, - 7.8- pentametyylikromaani-6-sulfonyyli)-L-arginyyli-L-leu-sinaali
Käyttäen menetelmää E (esimerkki 11) tuote (0,297 15 grammaa) vaiheesta 1 muutettiin yhdisteeksi 36 (0,22 g) ja puhdistettiin HPLCillä kuten kuvataan taulukossa 6. ’h-NMR
(300 MHZ, DMS0-d6) δ 9,37 (s, 1H) ; 6,83 (b, 1H) ; 6,43 (b, 1H) ; 3,88 (m, 1H) ; 3,77 (m, 1H) ; 3,01 (m, 2H) ; 2,80 (m, 2H) ; 2,55 (t, 2H) ; 2,46 (s, 6H) ; 2,0 (s, 3H) ; 1,75 (m, 20 5H) ; 1,6 - 1,3 (m, 15H) ; 1,23 (s, 6H) ; 0,84 (kaksois-d, 6H) .
... Esimerkki 37 • · · * , 2-naftoyyli-Nfl-nitro-L-arginyyli-L-leusinaali 3 „ , SSyi.A.-y
i ** 0 J H
... r NH
L X
MH MH
·*·.. 30 Vaihe 1: 2-naftoyyli-N®-nitro-I»-arginyyli-L-leusi- .1. naalidietyyliasetaali ··· ..· 2-naftoyylikloridia (0,104 g, 0,55 mmol) lisättiin • ** liuokseen, jossa oli tuotetta esimerkin 14 vaiheesta 2 2 • · *.*·* ml:ssa DMF:ää ja NMMrää (0,18 ml) ja otsikkotuotetta työs- 35 tettiin otsikkoyhdisteen saamiseksi kiinteänä aineena
• »«I
• · · · • »· • · 118325 76 (0,22 g). ’h-NMR (300 MHz, CDC13) δ 8,92 (b, 1H) ; 8,0 - 7,91 (mm, 10H); 6,93 (d, 1H); 5,07 (m, 1H); 4,37 (d, 1H); 4,17 (m, 1H) ; 3,69 (m, 3H) ; 3,53 (m, 3H) ; 3,38 (m, 2H)/ 1,77, 1,58, 1,4 (mm, 5H); 0,83 (kaksois-d, 6H).
5 Vaihe 2: 2-naftoyyli-l^-nitro-L-arginyyli-L-leusi- naali Käyttäen menetelmää E (esimerkki 11) tuote (0,1 g) vaiheesta 1 muutettiin yhdisteeksi 37 (60 mg) . ’h-NMR (300 MHz, DMS0-d6) δ 9,43 (s, 1H) ; 8,72 (d, 1H) ; 8,53 (m, 2H) ; 10 8,0 (m, 6H); 7,6 (m, 2H); 6,20 (m, 1H); 4,57 (m, 1H); 4,14 (m, 1H); 3,92 (m, 1H); 3,2 (m, 2H); 3,0 (d, 1H); 1,77 (m, 5H); 0,86 (m, 6H).
Esimerkki 38 CBZ - 7 - aminoheptanoyyli-l^-nitro-Ii-arginyyli-L-leu- 15 sinaali C j1 20 N3 ... Vaihe 1: CBZ-7-aminoheptanoyyli-N®-iiitro-L-arginyy- * · · ) , li-L-leusinaalidietyyliasetaali • · »
Noudattaen menetelmää C (esimerkki 9) CBZ-7-amino- • · ’|··1 25 heptaanihappo (0,7 g, 2,5 mmol) kytkettiin vaiheen 2 esi- :.2 3i merkistä 14 tuotteeseen (0,78 g, 2,0 mmol) käyttäen B0P:tä e1 • 1·· (1,1 g, 2,5 mmol), H0Bt:tä (0,34 g, 2,5 mmol) ja NMM:ää 4·· V : (0,253 ml, 2,5 mmol) halutun peptidin saamiseksi puoli- kiinteänä aineena, jota käytettiin suoraan seuraavassa 30 vaiheessa.
.·2. Vaihe 2: CBZ - 7 -aminoheptanoyyli -l^-ni tro-L-arginyy- li-L-leusinaali · 2 Noudattaen menetelmää E (esimerkki li) asetaali ··· • 9 2 *·»’ vaiheesta 1 muutettiin yhdisteeksi 38 (0,8 g) reaktion 5 3 35 tunnin sekoituksen jälkeen. ’h-NMR (300 MHz, DMSO-d-) δ • · • e · • «· • 9 118325 77 9,30 (S, 1H) ; 8,47 (s, 1H) ; 8,46 (s, 1H) ; 8,29 (d, 1H) ; 8,11 (t, 1H); 7,80 (s, 1H) ; 7,64 (d, 1H) / 7,31 (s, 1H) ; 7,23 (s, 5H) ; 4,91 (s, 2H) ; 4,23 (m, 1H) ; 4,00 (m, 1H) ; 3,51 (q, 2H) ; 3,27 (m, 2H); 2,89 (q, 2H); 2,11 (t, 2H) ; 5 2,03 (t, 2H) ,· 1,7 - 1,00 (m, 10H) / 0,77 (kaksois-d, 6H) .
Esimerkeissä 39-42 kuvataan taulukossa 7 lueteltujen MCP-inhibiittorien synteesejä.
Taulukko 7 10 Esimerkki Inhibitio-% numero (1 μΜ) 39 (isomeeri a) 31 >1 000 39 (isomeeri b) 21 >1 ooo 40 100 8 15 41 (isomeeri a) 99 22 41 (isomeeri b) 98 13 42 15 > 1 000
Esimerkki 39 20 10 - syaani - 2 - syklopentyylidekanoyyli-N®-nitrO“L-ar- ginyyli-L-leusiinikloorimetyyliketoni S - .·. : f nh2
NH
• · Tässä ja seuraavissa 3 esimerkissä keksinnön mukai- set inhibiittorit valmistetaan kytkemismenettelyllä II.
;·, 30 Kussakin tapauksessa tässä kuvatun mukaisesti valmistettu • ·· 10-syaani-2-syklopentyylidekanoyyli-N9-nitro-L-arginiini • · *;1 kytketään entsyymireaktiiviseen aminohappo johdannaiseen • e • 1·· inhibiittorin tuottamiseksi. Nämä inhibiittorit saadaan kahden tai useamman diastereoisomeerin seoksena, joka jos-35 sain tapauksissa voidaan erottaa HPLCtllä.
···· · • · · • e· • · 78 1 1 8325 A) 10 - syaani - 2 - sykiopentyylidekanoyyli tro - L-arginiinin metyyliesteri
Noudattaen menetelmän C menettelyä (esimerkki 9) 10-syaani-2-syklopentyylidekaanihappoa (2,4 g, 11 mmol) 5 esimerkin 13 vaiheesta 5 26 mlrssa DMF:ää sekoitettiin N9-nitro-L-arginiinimetyyliesteridihydrokloridin (2,86 g, 11 mmol), BOP:n (6,6 g, 15 mmol), HOBt:n (1,62 g, 12 mmol) ja 3,6 ml:n NMMrää (33 mmol) kanssa, jolloin saatiin 4,8 g metyyliesteriä vaahtoavana kiinteänä aineena. 1H-NMR (300 10 MHz, CDC13) δ 8,75 (leveä s, 1H); 7,81 (leveä s, 2H); 6,42 (d, 1H) ; 4,67 (t, 1H) ; 3,82 (s, 3H) ; 3,75 (m, 1H) ; 3,32 (m, 1H); 2,15 (t, 2H); 2,05 - 1,12 (m, 28H).
B) 10 - syaani-2 - syklopen tyy 1 idekanoyy 1 i -N9-ni t ro - L -arginiini 15 Liuokseen, jossa oli 5,5 g metyyliesteriä osasta "A" edellä 30 ml:ssa metanolia, lisättiin 24 ml natrium-hydroksidin 1,00 N vesiliuosta. 2 tunnin kulttua lisättiin 100 ml natriumbikarbonaatin 2-%ista vesiliuosta ja saatua liuosta uutettiin 100 ml :11a eetteriä. Vesifaasi erotet- 20 tiin ja tehtiin happamaksi lisäämällä sitruunahapon 3-%:ista vesiliuosta ja uutettiin 250 ml :11a etyyliase-·*·*· taattia. Saatu orgaaninen faasi erotettiin, se kuivattiin .*. : kidevedettömällä MgS04:llä ja haihdutettiin värittömäksi k- s · ,···, umiksi, joka petrolieetterissä trituroituna kiinteytyi hi- Φ · 25 enojakoiseksi valkoiseksi jauheeksi, joka painoi 4,4 g.
1H-NMR (300 MHz, CDC1,) 6 10,6 (leveä s, 1H) ; 8,75 (leveä tam" s, 1H) ; 7,82 (leveä s, 2H) ; 6,41 (d, 1H) ; 4,67 (t, 1H) ; V1 3,71 (m, 1H); 3,32 (m, 1H); 2,15 (t, 2H); 2,04 - 1,12 (m, 30H) .
·· • *·· 30 C) 10-syaani-2-syklopentyylidekanoyyli-N9-nitro-L- «·« ϊ 14 # l arginyy1i-L-leusiinikloorimetyy1iketöni ··) Seokseen, jossa oli 467 mg (1,0 mmol) tuotetta • ·· ]... osasta "B" edellä ja 270 mg (1,0 mmol) leusiinikloorime- • a *** tyyliketonihydrokloridia (Bachem Biosciences, Inc., King a 35 of Prussia, Pennsylvania), 440 mg (1,0 mmol) BOP:tä ja 135 • · • a • aa • a 118325 79 mg (1 mmol) HOBtitä 4,0 ml:ssa DMFiää, lisättiin 0,33 ml (3 mmol) NMM:ää. 4 tunnin kuluttua seosta laimennettiin lisäämällä 75 ml etyyliasetaattia, se pestiin NaHC03:n 2-%:isella vesiliuoksella, vedellä, sitruunahapon 5 3-%:isella vesiliuoksella ja lopuksi vedellä. Orgaaninen faasi erotettiin ja kuivattiin (MgS04) ja haihdutettiin lopuksi vaaleankeltaiseksi raskasliikkeiseksi öljyksi. Tätä yhdistettä puhdistettiin paisuntakromatografisesti 9 x M tuuman kolonnissa, jossa oli silikageeliä 60-H ja jossa 10 käytettiin etyyliasetaattia eluenttina. Saatu liuos kuiviin haihduttamalla saatiin värintönä kumia, joka kiinteytyi seisoessaan 1:1 etyyliasetaatti/eetterissä, jolloin saatiin 198 mg väritöntä kiinteää kloorimetyyliketonia. HPLC:ssä ilmeni kahden diastereoisomeerin läsnäolo, jotka 15 erotettiin preparatiivisella RP-HPLC:llä. Käyttäen vesi-asetonitriililiuotingradienttia (30 - 80 % asetonitriiliä 40 minuutissa) eristettiin piikit ajankohtina 22,58 min (diastereoisomeeri a) ja 23,7 min (diastereoisomeeri b).
Diastereoisomeeri a: ’h-NMR (300 MHz, CDC13) ö 8,53 20 (leveä s, 1H) ; 7,61 (leveä s, 2H) ; 7,31 (leveä s, 1H) ; 6,69 (d, 1H) ; 4,73 (m, 1H) ; 4,65 (m, 1H) ; 4,28 (q, 2H) ; :T: 3,53 (m, 1H); 3,31 (t, 1H); 2,32 (t, 2H); 1,90 - 1,11 (m, 31H) ; 0,93 (q, 6H) .
'* *· 1 .*··. Diastereoisomeeri b: Ή-NMR (300 MHz, CDC1,) δ 8,53 25 (leveä s, 1H) ; 7,61 (leveä s, 2H) ; 7,31 (leveä S, 1H) ; «, * 6,79 (d, 1H) ; 4,73 (m, 1H) ; 4,65 (m, 1H) ; 4,28 (q, 2H) ; 3,53 (m, 1H) ; 3,31 (t, 1H) ; 2,32 (t, 2H) ; 1,90 - 1,11 (m, 31H) ; 0,93 (q, 6H) .
·· • t • ·* • M • * • · • tt f f * · • «f ««· • · • » ·· • β • t· • ···· • m • * * * ·· • » so 1 1 8325
Esimerkki 40 10 - syaani - 2 - syklopentyylidekanoyyli -N®-ni tro-L-ar-ginyyliboorileusiinipinakoliesteri 0¾¾
Sia'S·'"0’ 10
Liuokseen, jossa oli 467 mg (1,0 ml) 10-syaani-2-syklopentyylidekanoyyli-I^-nitro-L-arginiinia (esimerkki 39, osa "B" edellä) ja 264 mg (1,0 mmol) boorileusiinipi-15 nakoliesterihydrokloridia, joka valmistettiin Shenvin menetelmän mukaan, US-patenttijulkaisu 4 537 773, 440 mg (1-,0 mmol) B0P:tä ja 135 mg (1,0 mmol) H0Bt:tä 5,0 ml:ssa DMF:ä, lisättiin 0,33 ml (3 mmol) NMM:ää. 2 tunnin kuluttua seosta laimennettiin lisäämällä 75 ml etyyliasetaattia 20 ja se pestiin NaHC03:n 2-%:isella vesiliuoksella ja vedellä, ja orgaaninen faasi erotettiin, kuivattiin (MgS04) ja ,··*. haihdutettiin kuiviin, jolloin saatiin 410 mg vaaleanrus- • · · . keaa jauhetta. Tämä kiinteä aine pestiin kloroformilla, • ·· J„* jolloin saatiin 290 mg tuotetta likaisenvalkoisena kiin- • ·
**·*[ 25 teänä aineena, josta saatiin yksi piikki HPLC:ssä. ^-NMR
!·**! (300 MHz, CDC1,) 6 8,53 (leveä s, 1H) ; 7,65 (leveä s, 2H) ; f# 3 : *·· 6,71 (t, 1H) ; 4,61 (m, 1H) ; 3,52 (m, 1H) ; 3,31 (m, 2H) ; V ·’ 3,05 (m, 1H) ; 2,82 (m, 1H) ; 2,38 (t, 2H) ; 2,06 - 1,42 (m, 28H); 1,22 (S, 12H); 1,15 (m, 2H); 0,92 (m, 6H).
·· • · 4 ·· 4 ··· • · 4 f 444 • • f • · 4 *« 444 • 4 • · • · · 4 • 4 SS 4 4444 4 4 4 4# 4 4# 4 # 118325 81
Esimerkki 41 10 - syaani - 2 - syklopentyylidekanoyyli-l^-nitro-L-ar-ginyyli-L-leusi ini-aifa-ketoetyyli amidi cuV/V' S.H'V"0’ 10 A) 10-syaani-2-syklopentyylidekanoyyli-M9-nitro-L- arginyyli-(l-etyyliaminokarbonyyli-l-hydroksi-4-metyyli)-2-pentyyliamidi
Liuokseen, jossa oli 467 mg (1,0 mmol) 10-syaani-2-syklopentyylidekanoyyli-N9-nitro-L-arginiinia ja 225 mg 3-15 amino-2-hydroksi-5-metyyliheksaanihappo-N-etyyliamidihy-drokloridia [joka valmistettiin Harbesonin et ai. menetelmällä, J. Med. Chem. 37 (1994) 2918 - 2929] 5,0 ml:ssa DMF:ää, lisättiin 440 mg (1 mmol) BOP:tä, 135 mg (1 mmol) HOBt:tä ja 0,33 ml (3 mmol) NMM:ää* 2 tunnin sekoituksen 20 jälkeen liuosta laimennettiin lisäämällä 75 ml etyyliasetaattia ja se pestiin NaHC03:n 2-%:isella vesiliuoksella, t...# vedellä, sitruunahapon 3-%:isella vesiliuoksella, vedellä • · · t' . ja kuivattiin (MgS04) , jolloin haihdutuksen jälkeen saatiin 540 mg hydroksiyhdistettä likaisenvalkoisena kiinteänä !;··[ 25 aineena. 1H-NMR (300 MHz, CDC13) 5 8,53 (leveä s, 1H) / 7,73 i.**j (leveä s, 2H) ; 7,04 (leveä m, 1H) ; 6,83 (t, 1H) ; 4,52 (m, f*M 1H) ; 4,19 (m, 1H) ; 4,11 (q, 2H) ; 3,46 (q, 2H) ; 3,26 (m, !.*"·* 2H) ; 2,35 (t, 2H) ; 1,91 (m, 2H) / 1,83 (m, 2H) ; 1,8 - 1,2 (m, 28H); 1,13 (t, 3H); 0,88 (m, 6H).
**·,. 30 B) 10-syaani-2-syklopentyylidekanoyyli-N®-nitro-L- ·1· arginyyli-L-leusiini-alfa-ketoetyyliamldi ··· ..* Liuos, jossa oli 250 mg hydroksiyhdistettä osasta • t *t4]* "A" edeltä 6,0 ml:ssa kuivaa dikloorimetaania, jäähdy- *···* tettiin 0 °C:seen ja mukaan sekoitettiin 225 mg (noin
• M
»IM
• * « · t • ·» • « 82 1 1 8 3 2 5 0,5 mmol) Dess-Martin-reagenssia [D.B. Dess ja J.C. Martin, J. Orq. Chem. 48 (1983) 4156 - 4158.
Reaktioseoksen annettiin lämmetä huoneenlämpötilaan ja sitä sekoitettiin 2 tunnin ajan. Sameaa suspensiota 5 laimennettiin lisäämällä 50 ml etyyliasetaattia ja se suodatettiin hienohuokoisen lasisintterin läpi. Suodos pestiin Na2S203:n 10-%:isella vesiliuoksella ja sitten NaCl:n kyllästetyllä vesiliuoksella. Se kuivattiin (MgS04) ja haihdutettiin kuiviin, jolloin saatiin 180 mg valkeaa 10 kiinteää ketoamidituotetta. Sitä puhdistettiin preparatii-visella RP-HPLC:llä käyttäen vesi-asetonitriiligradientti-systeemiä (40 - 70 % asetonitriiliä 40 minuutissa). Talteen otettiin piikit ajankohtina 18,07 min (diastereoiso-meeri a) ja 19,54 min (diasteroisomeeri b).
15 Diastereoisomeeri a: 1H-NMR (300 MHz, CDC13) δ 8,45 (leveä s, 1H) ; 7,58 (leveä s, 2H) ; 7,04 (leveä m, 2H) ; 6,57 (t, 1H) ; 5,33 (t, 1H) ; 4,60 (m, 1H) ; 3,51 (m, 1H) ; 3,33 (m, 3H) ; 2,35 (t, 2H) ; 1,91 - 1,11 (m, 34 H); 0,94 (m, 6H).
20 Diastereoisomeeri b: ’h-NMR (300 MHz, CDCl3) Ö 8,45 (leveä S, 1H); 7,48 (leveä s, 2H); 7,25 (m, 1H); 7,04 (t, 1H) ; 6,85 (m, 1H) ; 6,62 (d, 1H) ; 5,32 (t, 1H) ; 4,81 (m, • * · J 1H) ; 4,58 (m, 1H) ; 3,51 (m, 1H) ; 3,35 (m, 3H) ; 2,35 (t, 2H) ; 1,95 - 1,11 (m, 32H) ; 0,98 (m, 6H) .
25 Esimerkki 42 * · · *· 10-syaani-2-syklopentyylidekanoyyli-Ne-nitro-L-ar- • · : ** ginyylifenyylialaniinifluorimetyyliketoni • S · e · ·
f··· ·· Q
? :: V. ·· V’ : ·.. cn ^ r nh2
Sre-V"02 ··· 1 • S·· • · • et • ·· • · 118325 83 A) l-nitro-2-fenyylietaanin synteesi
Sekoitettuun seokseen, jossa oli trans-S-nitrosty-reeniä (5,25 g, 0,035 mol) ja silikageeliä (10 g, 230 -400 mesh) kloroformissa (400 ml) ja isopropanolissa (75 5 ml) huoneenlämpötilassa, lisättiin hitaasti natriumboori-hydridiä (5,50 g, 0,145 mol) 45 minuutissa. Reaktioseosta sekoitettiin vielä 15 minuutin ajan, minkä jälkeen reaktio keskeytettiin varovaisesti lisäämällä 10-%:ista kloorive-tyhappoa (20 ml) . Erotettu kiinteä aine suodatettiin eroon 10 ja pestiin kloroformilla (50 ml) . Yhdistetyt suodos ja pesuerät pestiin vedellä (1 x 20 ml), suolaliuoksella (1 x 20 ml) ja kuivattiin kidevedettömällä natriumsulfaatilla. Haihduttamalla liuotin eroon alipaineessa saatiin raakama-teriaalia, jota puhdistettiin paisuntakromatografisesti 15 (silikageeli, 8 % etyyliasetaatti-heksaani), jolloin saa tiin 2,86 g l-nitro-2-fenyylietaania värittömänä öljynä (mausteinen tuoksu).
Rf (10 % etyyliasetaattia heksaanissa): 0,40. 1H- NMR (300 MHz, CDC13) 7,40 - 7,20 (m, 5H) ; 4,60 (t, 2H) ; 20 3,30 (t, 2H).
B) 1-fluori-2-hydroksi-3 -ni tro-4-fenyy1ibutaanin :T: synteesi ·*·,{ Jäähdytettyyn liuokseen (-78 °C) , jossa oli oksa- e · .···. lyylikloridia (2 M) metyleenikloridissa (11,60 ml, 0,0232 • e· ,·, · 25 mol), lisättiin hitaasti dimetyylisul f oksidia (3,65 g, • ·· * 3,32 ml, 0,0467 mol). Reaktioseosta sekoitettiin 15 minuu- • ·· tin ajan. Sitten reaktiokolviin lisättiin hitaasti liuos, • · e ’·* * jossa oli 2-fluorietanolia (1,16 g, 0,0181 mol) metyleeni kloridissa (10 ml). Vielä 15 minuutin sekoituksen jälkeen se • " 30 reaktioseosta laimennettiin vedettömällä metyleeniklori- «·· dilla (180 ml) ja siihen lisättiin trietyyliamiinia (9,20 J*.tt grammaa, 12,63 ml, 0,090 mol). Sekoittamista jatkettiin ,··*. vielä 2 tunnin ajan, jonka ajan jälkeen lämpötila oli ko- • · '·* honnut huoneneelämpötilaan. Tänä ajankohtana reaktioseok- 35 seen lisättiin liuos, jossa oli l-nitro-2-fenyylietaania • · • · · • ·* • · 118325 84 (2,74 g, 0,0181 mol) vedettömässä metyleenikloridissa (10 ml), ja sekoittamista jatkettiin yön yli. Sitten seos pestiin vedellä (1 x 30 ml), 4-%:isella kloorivetyhapolla (3 x 20 ml), vedellä (1 x 20 ml), kyllästetyllä natriumbikar-5 bonaattiliuoksella (2 x 20 ml) ja suolaliuoksella (1 x 20 ml). Kuivaamalla vedettömällä natriumsulfaatilla ja haihduttamalla liuotin eroon saatiin raakamateriaalia, jota puhdistettiin paisuntakromatografisesti (silikageeli, 25 % etyyliasetaatti/heksaani) tuotteen saamiseksi erytro- ja 10 treoisomeereinä. Yhdistetty saanto oli 3,01 g. Yleinen kuvaus tästä menettelystä voidaan löytää julkaisuista Imperiali, B., et ai.. Tetrahedron Lett. 27;2 (1986) 135; ja Revesz, L., et ai. Tetrahedron Lett. 35:52 (1994) 9693.
Isomeeri a oli valkoinen kiinteä aine, sp. 71 - 15 73 °C.
Rf (30 % etyyliasetaattia heksaanissa): 0,46. 1HNMR (300 MHz, CDC13) δ 7,40 - 7,10 (m, 5H) ; 4,90 (m, 1H) ; 4,60 (m, 1H); 4,50 - 4,30 (m, 2H) ; 3,45 - 3,25 (m, 2H); 2,70 (d, 1H) - 20 C) 3-amino-l-fluori-2-hydroksi-4-fenyylibutaanin synteesi !tT: Seosta, jossa oli edeltävää isomeeriä a (0,48 g, ♦*·,· 2,25 mmol) , absoluuttista etanolia (20 ml) ja Raney-nik- • · .
keliä (katalyyttinen määrä), hydrattiin (paine 4,2 kp/cm ) s·· : 25 Parr-laitteessa 5 tunnin ajan. Suodattamalla Celite-kakun • e· •I, * läpi ja haihduttamalla liuotin eroon saatiin 410 mg amii- I s· *... nia isomeeri a. Edeltävän isomeerin b (800 mg, 3,75 mmol) • I « f f · • samankaltaisella käsittelyllä saatiin 510 mg amiini-isomeeriä b.
ee • · • ·* 30 Amiini-isomeeri a oli valkoinen kiinteä aine; sp.
• ee !„.J 64 - 67 °C. 1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7,40 - 7,10 (m, 5H) ; J\# 4,70 (d, 1H); 4,50 (d, 1H); 3,90 - 3,70 (m, 1H); 3,30 - !···. 3,10 (m, 1H) ; 2,95 (kaksois-d, 1H) ; 2,60 - 2,45 (q, 1H) ; • · T 2,20 - 1,70 (leveä, 3H).
··· ···· • · • · ·
• M
• · 85 1 1 8325
Amiini-isomeeri b oli valkoinen kiinteä aine, sp. 67 - 70 °C. 1H-NMR (300 MHz, CDClj) δ 7,40 - 7,10 (m, 5H) ; 4,70 (d, 1H) ; 4,55 (d, 1H) ; 3,70 - 3,50 (m, 1H) ; 3,20 - 3.00 (m, 1H) ,- 2,95 (kaksois-d, 1H) ; 2,60 - 2,45 (q, 1H) ; 5 2,20 - 1,65 (leveä, 3H).
D) 10 - syaani - 2 - syki open tyy 1 idekanoyy 1 i-N^nitro-L- arglnyyli-(4-fluori-3-hydroksi-l-fenyyli)-2-butyyliamidi Liuokseen, jossa oli 467 mg (1,0 mmol) 10-syaani-2-syklopentyylidekanoyyli-l^-nitro-L-arginiinia ja 183 mg 10 (1,0 mmol) 3-amino-l-fluori-2-hydroksi-4-fenyylibutaania 5.0 ml:ssa DMF:ää, lisättiin 440 mg (1,0 mmol) BOP:tä, 135 mg (1,0 mmol) HOBt:tä ja 0,33 ml (3 mmol) NMM:ää. 2 tunnin sekoituksen jälkeen liuosta laimennettiin lisäämällä 75 ml etyyliasetaattia ja se pestiin NaHC03:n 2-%:isella vesi- 15 liuoksella, vedellä, sitruunahapon 3-%:isella vesiliuok sella, vedellä sekä kuivattiin (MgS04), jolloin kuiviin haihdutuksen jälkeen saatiin 480 mg hydroksiyhdistettä likaisenvalkoisena kiinteänä aineena.
’h-NMR (300 MHz, CDClj, +d6-DMSO) δ 8,15 (leveä S, 1H) ; 20 7,82 (leveä s, 2H); 7,21 (m, 6H); 5,05 (t, 1H); 4,51 (m, 1H) ; 4,22 (m, 1H) ; 3,82 (m, 1H) ; 3,75 (m, 2H) ; 2,95 (q, 2H) ; 2,35 (t, 2H) ; 2,04 - 1,13 (m, 31H) .
,·, : E) 10-syaani-2-syklopentyyli-l-dekanoyyli-Ne-nitro- ,··*! L-arginyylifenyylialaniinif luor ime tyylike töni • · 25 Liuos, jossa oli 250 mg hydroksiyhdistettä osas t a : "C" edeltä 6,0 ml:ssa vedetöntä dikloorimetaania, jäähdy- • · • ** tettiin 0 °C:seen ja sekoitettiin 225 mg:aan (noin 0,5 mm- • * · *·* * oi) Dess-Martin-reagenssia. Reaktioseoksen annettiin lämm etä huoneenlämpötilaan ja sitä sekoitettiin 2 tunnin ajan.
• *·· 30 Sameaa suspensiota laimennettiin lisäämällä 50 ml etyyli- asetaattia ja se suodatettiin hienojakoisen lasisintterin ·/ läpi. Suodos pestiin Na2S203: n 10-%:isella vesiliuoksella ja sitten kyllästetyllä NaCl-liuoksella. Se kuivattiin (MgSO,) | I ** *;** ja haihdutettiin, jolloin saatiin 180 mg valkoista kiin- m „*·* 35 teää ainetta. HPLC-puhdistuksen jälkeen saatiin 42 mg puh- • · • · · • «· • · 118325 86 dasta fluorimetyyliketonituotetta. ’h-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8,56 (leveä s, 1H) ; 7,62 (leveä s, 2H) ; 7,42 (t, 1H) ; 7,21 (m, 5H); 6,63 (m, 1H); 5,05 - 4,53 (m, 4H); 3,46 (m, 1H) / 3,18 (m, 2H); 2,98 (q, 2H); 2,33 (t, 2H) ; 2,04 - 1,13 5 (m, 27H) .
Kukin julkaistu asiakirja, johon tässä spesifikaatiossa viitataan, sisällytetään tähän kokonaisuudessaan viitteeksi.
Alan ammattilaiset huomaavat, että lukuisia rauutok-10 siä ja modifikaatioita voidaan tehdä keksinnön edullisiin suoritusmuotoihin, ja että tällaiset muutokset ja modifikaatiot voidaan tehdä poikkeamatta keksinnön hengestä. Tämän vuoksi tarkoitus on, että oheiset patenttivaatimukset kattavat kaikki samanarvoiset variaatiot, jotka kuulu-15 vat keksinnön todelliseen henkeen ja suojapiiriin.
M1 2 3 • « 1
• · I
• m • · · • ·1 • · ··» ♦ · • · ··· ♦ · f · · • ·1 • « ·· • · • ·· ··· • · ♦ • · · ·· • f • ·· ··· • · • · « ·· f · • «· · 2 • · *«· » 3 • s·· • · • · · ♦ ·· • · 118325 87
Sekvenssi1istaus (1) YLEISET TIEDOT: (i) HAKIJAT: Mohamed Iqbal
Sankar Chatterjee James L. Diebold James C. Kauer Robert Siman (ii) KEKSINNÖN NIMITYS: Multikatalyyttisen proteaa- sin inhibiittoreita (lii) SEKVENSSIEN LUKUMÄÄRÄ: 10 (iv) KIRJEENVAIHTO-OSOITE: (A) VASTAANOTTAJA: Woodcock Washburn Kurtz
Mackiewicz and Norris (B) KATU: One Liberty Place - 46th Floor (C) KAUPUNKI: Philadelphia
(D) OSAVALTIO: PA
(E) MAA: USA
(F) POSTINUMERO: 19103 (v) KONEKOODIMUOTO: (A) VÄLINETYYPPI: Disketti 3,5", 720 Kb (B) TIETOKONE: IBM PC -yhteensopiva
(C) KÄYTTÖJÄRJESTELMÄ: PC-DOS/MS-DOS
(D) OHJELMISTO: Wordperfect 5.1 (Vi) NYKYISEN HAKEMUKSEN TIEDOT:
,···, (A) HAKEMUSNUMERO: N/A
* (B) TEKEMISPÄIVÄ: tällä
(C) LUOKITUS: N/A
• · £.*: (viii) ASIAMIESTÄ KOSKEVAT TIEDOT: ,·, ; (A) NIMI: Michael P. Straher *. *i (B) REKISTERINUMERO: 38 325 I*·.. (C) VIITE/LUETTELONUMERO: CEPH-0148 :]ϊ*ϊ (ix) TIETOLIIKENNEYHTEYSTIEDOT: (A) PUHELIN: 215-568-3100 (B) TELEFAX: 215-568-3439 ·· • · • ·· O (2) SEKVENSSIN NRO 1 TIEDOT: Γ·.. (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: #···# (A) PITUUS: 36 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo *·β (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen ..ΓΓ (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • « • · · • #· • · 118325 88 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 1: TCGATCGAAG CTTGCCGCCA CCATGGCGAT GAAAGC 36 (2) SEKVENSSIN NRO 2 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 30 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 2: AGCTAGCCTC GAGCAGATTA CAGTTTAATG 30 (2) SEKVENSSIN NRO 3 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 21 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 3: TTAATCCTCA CTCTAAGAAA C 21 ··· V : (2) SEKVENSSIN NRO 4 TIEDOT: • · " (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 24 emäsparia !*’. (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • · · * (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 4: * TTGTACGGCC AGTGATGGAA TGCT 24 ·· • · I ·· (2) SEKVENSSIN NRO 5 TIEDOT: • · · ' ' • (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: \..t (A) PITUUS: 24 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo *. (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen * · • · · • ·· • · 89 1 1 8325 (Xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 5: AGCATTCCAT CACTGGCCGT ACAA 24 (2) SEKVENSSIN NRO 6 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 20 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 6: TAATACGACT CACTATAGGG 20 (2) SEKVENSSIN NRO 7 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 41 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 7: GCACACCACT TTCATCGCCA TGGTGGCGGC AAGCTTCGAT C 41 • · · V ** (2) SEKVENSSIN NRO 8 TIEDOT: • · • · · (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 2 0 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo ·. ·: (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen ·**,, (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • :T: (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 8: ATTAACCCTC ACTAAAGGGA 20 • · • · • · · (2) SEKVENSSIN NRO 9 TIEDOT: j’*.. (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: .···. (A) PITUUS: 41 emäsparia *..·* (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen ...:* (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • m • · · • t· • · 90 1 1 8325 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 9: GATCGAAGCT TGCCGCCACC ATGGCGATGA AAGTGGTGTG C 41 (2) SEKVENSSIN NRO 10 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 18 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 10: CTTCAGTTAA TCCTGTAA 18 ··· • 1 * · · • · • · · 1· • · «I# • · • · ··· • · • · · • · · • · «· • f • ·· ··· • · • · · f · • · • 1· » · · • • · * · · • ♦ • 1 • · · »·· • · • m • · 1 • · · « M·· • · I » » * 1· • ·

Claims (18)

118325 91
1. Yhdiste, jonka kaava on: O O n n R —(CH;)— CH- C — NH— CH— C — NH— R 1 ' 2'a | | 4 5 *» *» jossa Ri valitaan ryhmästä, jonka muodostavat -C^N, -C(=0)0R9, ftalimido, -NH-S02R9 ja -NH-J; R2 valitaan ryhmästä, jonka muodostavat H, hydrok-10 syyli, alkyyli, jossa on 1 - 10 hiiltä, ja sykloalkyyli, jossa on 3 - 7 hiiltä; R3 valitaan ryhmästä, jonka muodostavat -(CH2)m-NH-C(=N-RS) -NH2, -Rs-N02, -R6-J ja -R6-CN; R4 on -CH(CH2-R7) -Q; 15. valitaan ryhmästä, jonka muodostavat -CH-R8, -C(=0)CH3, -C(=0) CH2C1, -C(=0) CH2Br, -C(=0)CH2F, -C(=0)CHF2, -C(=0)CF3, -C (=0) C (=0) R7, -C(=0)C(=0)-NH-R7, -C (=0) C02-R7, -C(=0)C02H, -B(0H)2, • •e • · · • · I 0 -9—<> -B—o ? 9 ·...· Il II II o (C(OJj)2)2 , o—(CHj)p , o—W ja °\ * (cm m ·· 20 • · · joissa p ja q ovat toisistaan riippumatta 2 tai 3; yt W on sykloalkyyli; e ·♦ *... Rs valitaan ryhmästä, jonka muodostavat -N02, -CN ja • * T _J; Γ·.. 25 Re on - (CH2)m-NH-C(=NH)-NH-; R7 valitaan ryhmästä, jonka muodostavat fenyyli ja *. alkyyli, jossa on 1 - 8 hiiltä, joka mainittu alkyyliryhmä "·*, on mahdollisesti substituoitu yhdellä tai useammalla halo- • · · *· geeniatomilla, aryyli- tai heteroaryyliryhmällä; 118325 92 Rs valitaan ryhmästä, jonka muodostavat =0, =N- NHC(=0)-NH2, -N-OH, =N-OCH3, =N-0-CH2-C6H5, =nnh-c(=s)-nh2 ja =N-NH-J; R9 valitaan ryhmästä, jonka muodostavat vety ja al-5 kyyli, jossa on 1 - 6 hiiltä, joka mainittu alkyyliryhmä on mahdollisesti substituoitu yhdellä tai useammalla halo-geeniatomilla, aryyli- tai heteroaryyliryhmällä; J on suojaryhmä; n on kokonaisluku 3 - 10; ja 10 m on kokonaisluku 2-5.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdiste, jossa Ri valitaan ryhmästä, jonka muodostavat -CäN, -C(=0)0CH3, fta-limido ja -NH-S02CF3.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdiste, jossa R2 15 valitaan ryhmästä, jonka muodostavat H ja syklopentyyli.
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdiste, jossa R3 on - (CH2)3-NH-C(=N-R5) -nh2.
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen yhdiste, jossa R5 valitaan ryhmästä, jonka muodostavat -N02, CN, -PMC, -MTR,
20 -MTS ja Tos.
6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdiste, jossa R? *.* * valitaan ryhmästä, jonka muodostavat -CH(CH3)2, -C(CH2)2-CH3 :.* l ja -C6h5. e··
7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdiste, jossa Q :\j 25 valitaan ryhmästä, jonka muodostavat -CH-R8, -B(OH)2, -c(=o)C(=o)nh-r7, • • e· • · t • · · —B O —B O :·. I I 33 I I : ·· o—(ctCHrf* o—(<36)p «•e • · • · ··» ·· e
8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdiste, jossa R8 • · *·;·* valitaan ryhmästä, jonka muodostavat =0, =N-NHC(=0) -NH2, ·:· 30 =N-0H, =N-0CH3, «N-0-CH2-C6Hs ja =NNH-C(=S) -NH2.
·«»· ·*·,· 9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdiste, jossa Rx • · valitaan ryhmästä, jonka muodostavat -C(=0)0CH3, ftalimido 118325 93 ja -NH-SO2CF3; R2 on syklopentyyli; R3 on - (CH2)3-NH-C(=N-N02)-NH2; Q on -CH-R8; R7 on -CH(CH3)2; ja R8 on =0; tai jossa Ri on -C^N; R2 on syklopentyyli; R3 valitaan ryhmästä, jonka muodostavat - (CH2)3-NH-C(=N-N02) -NH2 ja -(CH2)3-NH-5 C(=N-J)-NH2; Q on -CH-R8; R7 on -CH(CH3)2; ja R8 on =0,- tai jossa Ri on -ON; R2 on syklopentyyli; R3 valitaan ryhmästä, jonka muodostavat - (CH2)3-NH-C(=N-N02) -NH2 ja -(CH2)3-NH-C(=N-J)-NH2; Q valitaan ryhmästä, jonka muodostavat -B(0H)2, -C(=0)C(=0)NH-R7, —g o , —B 0 Il ja I I O-(C(CHj>j)2 o-(C%)p 10 R7 valitaan ryhmästä, jonka muodostavat -CH(CH3)2 ja -CH2-CH3 tai jossa Ri on -C=N; R2 on syklopentyyli; R3 valitaan ryhmästä, jonka muodostavat - (CH2) 3-NH-C(=N-N02) -NH2 ja 15 - (CH2) 3-NH-C (=N-J) -NH2; Q On -CH-R8; R7 on -CH(CH3)2; ja R8 valitaan ryhmästä, jonka muodostavat =N-NHC(=0)-NH2, =N-OH, =N-0CH3 ja =N-0-CH2-C6H5.
10 R7 valitaan ryhmästä, jonka muodostavat fenyyli ja alkyyli, jossa on 1 - 8 hiiltä, joka mainittu alkyyliryhmä on mahdollisesti substituoitu yhdellä tai useammalla halo-geeniatomilla, aryyli- tai heteroaryyliryhmällä; R8 valitaan ryhmästä, jonka muodostavat =0, =N-
10 Ri valitaan ryhmästä, jonka muodostavat -C=N, -C(=0)0R9, ftalimido, -NH-S02R9 ja -NH-J; R2 valitaan ryhmästä, jonka muodostavat H, hydrok-syyli, alkyyli, jossa on 1 - 10 hiiltä, ja sykloalkyyli, jossa on 3 - 7 hiiltä; 15 r3 valitaan ryhmästä, jonka muodostavat -(CH2)m-NH- C(=N-RS) -NH2, -R6-N02, -R6-J ja -R6-CN; R4 on -CH(CH2-R7) -Q; Q valitaan ryhmästä, jonka muodostavat -CH-R8, V* * -C(=0)CH3, -C(=0)CH2C1, -C (=0) CH2Br, -C(=0)CH2F, -C(=0)CHF2, • · *.’»! 20 -C(=0) CF3, -C(=0) C(=0)R7, -C(=0) C(=0)-nh-r7, -C(=0)C02-R7, O -C(=0)C02H, -B(0H)2, i ·· *: vOv —B—0 —B—0 —b—0 —B (CB^P l'“t I [_ Il II 1 Jg • 0—(C(CHi* , 0—(C%)p, 0—V ja \ ,m (Oöq ·· « · • ·· ·*** joissa p ja q ovat toisistaan riippumatta 2 tai 3; W on sykloalkyyli; ,···. 25 Rs valitaan ryhmästä, jonka muodostavat -N02, -CN ja ··** • -J; ···:’* R6 on - (CH2)m-NH-C(=NH)-NH-; • · *.**: R7 valitaan ryhmästä, jonka muodostavat fenyyli ja alkyyli, jossa on 1 - 8 hiiltä, joka mainittu alkyyliryhmä 118325 95 on mahdollisesti substituoitu yhdellä tai useammalla halo-geeniatomilla, aryyli- tai heteroaryyliryhmällä ,- R8 valitaan ryhmästä, jonka muodostavat =0, =N- NHC(=0)-NH2, =n-oh, =n-och3, =n-o-ch2-c6h5, =nnh-c(=s)-nh2 ja 5 =N-NH-J; R9 valitaan ryhmästä, jonka muodostavat vety ja al-kyyli, jossa on 1 - 6 hiiltä, joka mainittu alkyyliryhmä on mahdollisesti substituoitu yhdellä tai useammalla halo-geeniatomilla, aryyli- tai heteroaryyliryhmällä; 10. on suojaryhmä; n on kokonaisluku 3 - 10; ja m on kokonaisluku 2-5.
16. Koostumus häiriön hoitamiseksi, jolle on tunnusomaista vähennys Cu/Zn-superoksididismutaasi-l-entsyymi- 15 aktiivisuudessa, joka koostumus käsittää patenttivaatimuk sen 1 mukaista multikatalyyttisen proteaasin inhibiittoria ja farmaseuttisesti hyväksyttävää kantajaa.
17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen koostumus, jossa multikatalyyttisen proteaasin inhibiittori on yhdiste, 20 jonka kaava on: 0 0 R—(CH£— CH-C —NH-CH— C — NH-R^ R, R, • · * 3 • »· • ·· * jossa • ·· Rx valitaan ryhmästä, jonka muodostavat -Ce=N, • I · -C (=0) OR9, ftalimido, -NH-S02R9 ja -NH-J;
25 R2 valitaan ryhmästä, jonka muodostavat H, hydrok- i *·· syyli, alkyyli, jossa on 1 - 10 hiiltä, ja sykloalkyyli, ··· jossa on 3 - 7 hiiltä; ;·. R3 valitaan ryhmästä, jonka muodostavat -(CH2)m-NH- • · · C(-N-Rb) -NHa, -R6-N02, -R6-J ja -R6-CN; *"* 30 R4 on -CH(CH2-R7)-Q; Q valitaan ryhmästä, jonka muodostavat -CH-R8, ·*/.: -C(=0)CH3, -C(=0)CH2C1, -C(=0)CH2Br, -C(=0)CH2F, -C(=0)CHF2, 118325 96 -C(=0)CF3, -C(=0)C(=0)R7, -C(=0)C(=0) -nh-r7, -C(=0)C02-R7, -c(=o)co2h, -B(OH)2, —B—0 —B—0 -B—0 —ο Ndöp II II II I l 0 (C(CH&)2 , 0 (Oiz)p , 0—W ja °\ (CRM 5 joissa p ja q ovat toisistaan riippumatta 2 tai 3; W on sykloalkyyli; Rs valitaan ryhmästä, jonka muodostavat -N02, -CN ja “J; R6 on - (CH2)m-NH-C(=NH) -NH-;
10. Koostumus multikatalyyttisen proteaasin inhi- :1·*· boimiseksi, joka koostumus käsittää patenttivaatimuksen 1 : 20 mukaista yhdistettä ja farmaseuttisesti hyväksyttävää kan- * 1! ,···. tajaa.
• · !*** 11. Koostumus lihasmassan häviämisen vähentämisek- • 1 · • M .I 1 si, joka koostumus käsittää patenttivaatimuksen 1 mukaista *„]1 yhdistettä ja farmaseuttisesti hyväksyttävää kantajaa. • t · *·' 25
12. Koostumus lihasten surkastumishäiriöiden hoita miseksi, joka koostumus käsittää patenttivaatimuksen 1 mu- ·· • '·· kaista yhdistettä ja farmaseuttisesti hyväksyttävää kanta- ··· ! : jaa.
··] 13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen koostumus, jos- • ·· *... 30 sa häiriö on lihas surkastuma, sydämen näivettyminen, keuh- • 1 kolaajentuma, diabetes, lepra, aliravitsemus, luun pehmene- ,,1·1 minen tai syöpään liittyvä kuihtuminen. • 1 • · · · 118325 94
14. Koostumus Cu/Zn-superoksididismutaasi-l-entsyy-mihajoamisen vähentämiseksi, joka koostumus käsittää patenttivaatimuksen 1 mukaista multikatalyyttisen proteaasin inhibiittoria ja farmaseuttisesti hyväksyttävää kantajaa.
15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen koostumus, jos sa multikatalyyttisen proteaasin inhibiittori on yhdiste, jonka kaava on: O O » n r—(CH-)— CH C — NH— CH— C — NH— R 2n I 1 R2 R3 jossa
15 NHC(=0)-NH2, =N-0H, =N-0CH3, =N-0-CH2-C6Hs, =NNH-C(=S)-NH2 ja =N-NH-J; R9 valitaan ryhmästä, jonka muodostavat vety ja al- ·*·*· kyyli, jossa on 1 - 6 hiiltä, joka mainittu alkyyliryhmä on ,*. : mahdollisesti substituoitu yhdellä tai useammalla halo- *· ·· .··· 20 geeniatomilla, aryyli- tai heteroaryyliryhmällä; • J on suojaryhmä; • · ί ,* * n on kokonaisluku 3 - 10; ja • · • m on kokonaisluku 2-5. t · · *·* * 18. Patenttivaatimuksen 16 mukainen koostumus, jos- 25 sa häiriö on amyotrofinen lateraaliskleroosi, Parkinsonin ·· • ’.· tauti, Alzheimerin tauti, Huntingtonin tauti, halvaus, :1: trauma tai iskeemia. ··· ·« • 9 • 99 9 ··* • * • · ·«· #♦·· • 9 • · « • ·· • 9 97 1 1 8325
FI972029A 1994-11-14 1997-05-13 Multikatalyyttisen proteaasin inhibiittoreita FI118325B (fi)

Applications Claiming Priority (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US33779594 1994-11-14
US08/337,795 US5550262A (en) 1994-11-14 1994-11-14 Multicatalytic protease inhibitors
US46439895A 1995-06-05 1995-06-05
US46439895 1995-06-05
US08/552,794 US5614649A (en) 1994-11-14 1995-11-03 Multicatalytic protease inhibitors
US55279495 1995-11-03
PCT/US1995/014921 WO1996014857A1 (en) 1994-11-14 1995-11-14 Multicatalytic protease inhibitors
US9514921 1995-11-14

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI972029A FI972029A (fi) 1997-05-13
FI972029A0 FI972029A0 (fi) 1997-05-13
FI118325B true FI118325B (fi) 2007-10-15

Family

ID=27407222

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI972029A FI118325B (fi) 1994-11-14 1997-05-13 Multikatalyyttisen proteaasin inhibiittoreita

Country Status (18)

Country Link
US (3) US5614649A (fi)
EP (1) EP0789578B1 (fi)
JP (2) JP3056258B2 (fi)
KR (1) KR100420774B1 (fi)
CN (1) CN1166403C (fi)
AT (1) ATE241998T1 (fi)
BR (1) BR9509665A (fi)
CA (1) CA2202760A1 (fi)
DE (1) DE69530993T2 (fi)
DK (1) DK0789578T3 (fi)
ES (1) ES2200010T3 (fi)
FI (1) FI118325B (fi)
HK (1) HK1004638A1 (fi)
MX (1) MX9703564A (fi)
NO (1) NO324066B1 (fi)
NZ (1) NZ296479A (fi)
PT (1) PT789578E (fi)
WO (1) WO1996014857A1 (fi)

Families Citing this family (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6083903A (en) 1994-10-28 2000-07-04 Leukosite, Inc. Boronic ester and acid compounds, synthesis and uses
US5614649A (en) * 1994-11-14 1997-03-25 Cephalon, Inc. Multicatalytic protease inhibitors
ATE230275T1 (de) 1995-10-25 2003-01-15 Senju Pharma Co Angiogense-inhibitor
US6214800B1 (en) 1995-10-25 2001-04-10 Senju Pharmaceutical Co., Ltd. Angiogenesis inhibitor
CA2279651A1 (en) 1996-09-05 1998-03-12 Massachusetts Institute Of Technology Compositions and methods for treatment of neurological disorders and neurodegenerative diseases
US6184248B1 (en) 1996-09-05 2001-02-06 Robert K. K. Lee Compositions and methods for treatment of neurological disorders and neurodegenerative diseases
US5939581A (en) * 1997-08-20 1999-08-17 First Chemical Corporation Processes for preparing hydrocinnamic acid
US6083944A (en) * 1997-10-07 2000-07-04 Cephalon, Inc. Quinoline-containing α-ketoamide cysteine and serine protease inhibitors
US6096778A (en) * 1997-10-07 2000-08-01 Cephalon, Inc. α-ketoamide multicatalytic protease inhibitors
US6150378A (en) * 1997-10-07 2000-11-21 Cephalon, Inc. Peptidyl-containing α-ketoamide cysteine and serine protease inhibitors
GB9723407D0 (en) * 1997-11-05 1998-01-07 Ciba Geigy Ag Organic compounds
US20010012854A1 (en) * 1997-12-16 2001-08-09 Robert Siman Multicatalytic protease inhibitors for use as anti-tumor agents
JP2002501889A (ja) 1998-02-02 2002-01-22 トラスティーズ オブ タフツ カレッジ グルコース代謝を調節する方法、およびそれに関連する試薬
US6096711A (en) * 1998-02-25 2000-08-01 Sherman; Michael Hsp72 induction and applications
EP1123412B1 (en) 1998-10-20 2004-10-06 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Method for monitoring proteasome inhibitor drug action
US20030054977A1 (en) * 1999-10-12 2003-03-20 Cell Therapeutics, Inc. Manufacture of polyglutamate-therapeutic agent conjugates
US6358928B1 (en) 1999-11-22 2002-03-19 Enzyme Systems Products Peptidyl sulfonyl imidazolides as selective inhibitors of serine proteases
GB0003111D0 (en) * 2000-02-10 2000-03-29 Novartis Ag Organic compounds
EP1360189A1 (en) 2001-01-25 2003-11-12 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Formulation of boronic acid compounds
CN100415770C (zh) * 2001-05-30 2008-09-03 诺瓦提斯公司 2－{[n－(2－氨基－3－(杂芳基或芳基)丙酰基)－氨基酰基]－氨基}－烷基硼酸衍生物
AU2002360453C1 (en) 2001-11-26 2009-06-18 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Methods for treating autoimmune disorders, and reagents related thereto
CA2837936A1 (en) 2001-11-26 2003-06-05 Trustees Of Tufts College Peptidomimetic inhibitors of post-proline cleaving enzymes
US7223745B2 (en) * 2003-08-14 2007-05-29 Cephalon, Inc. Proteasome inhibitors and methods of using the same
US7576206B2 (en) 2003-08-14 2009-08-18 Cephalon, Inc. Proteasome inhibitors and methods of using the same
US7468383B2 (en) * 2005-02-11 2008-12-23 Cephalon, Inc. Proteasome inhibitors and methods of using the same
FR2914920B1 (fr) 2007-04-11 2011-09-09 Clariant Specialty Fine Chem F Procede de deacetalisation d'alpha-aminoacetals.
US7939505B2 (en) * 2007-05-04 2011-05-10 Marina Biotech, Inc. Amino acid lipids and uses thereof
FR2916441B1 (fr) 2007-05-22 2009-08-28 Clariant Specialty Fine Chem Procede de racemisation d'alpha-aminoacetals optiquement actifs.
US7442830B1 (en) 2007-08-06 2008-10-28 Millenium Pharmaceuticals, Inc. Proteasome inhibitors
FR2927900B1 (fr) 2008-02-27 2010-09-17 Clariant Specialty Fine Chem Procede de preparation d'alpha-aminoacetals optiquement actifs.
EP2730579A1 (en) 2008-06-17 2014-05-14 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Boronate ester compounds and pharmaceutical compositions thereof
US20110143375A1 (en) 2008-08-11 2011-06-16 Banyan Blomakers, Inc. Biomarker detection process and assay of neurological condition
AR075090A1 (es) 2008-09-29 2011-03-09 Millennium Pharm Inc Derivados de acido 1-amino-2-ciclobutiletilboronico inhibidores de proteosoma,utiles como agentes anticancerigenos, y composiciones farmaceuticas que los comprenden.
CA2774999A1 (en) 2009-09-30 2011-04-07 President And Fellows Of Harvard College Methods for modulation of autophagy through the modulation of autophagy-enhancing gene products
AU2010341530B2 (en) 2009-12-22 2016-03-10 Cephalon, Inc. Proteasome inhibitors and processes for their preparation, purification and use
US8354548B2 (en) * 2010-02-19 2013-01-15 Bristol-Myers Squibb Company Glycine chroman-6-sulfonamides for use as inhibitors of diacylglycerol lipase
JP5933523B2 (ja) 2010-03-31 2016-06-08 ミレニアム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッドＭｉｌｌｅｎｎｉｕｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． １−アミノ−２−シクロプロピルエチルボロン酸の誘導体
KR102481856B1 (ko) 2014-05-20 2022-12-26 밀레니엄 파머슈티컬스 인코퍼레이티드 일차 암 치료법 후 사용하기 위한 붕소-함유 프로테아좀 저해제
WO2015195950A1 (en) * 2014-06-20 2015-12-23 Principia Biophamram Inc. Lmp7 inhibitors

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5754157A (en) * 1980-09-19 1982-03-31 Nippon Kayaku Co Ltd L-argininal derivative and its preparation
US4518528A (en) * 1983-05-19 1985-05-21 Rasnick David W α Amino fluoro ketones
US4499082A (en) * 1983-12-05 1985-02-12 E. I. Du Pont De Nemours And Company α-Aminoboronic acid peptides
US4537773A (en) * 1983-12-05 1985-08-27 E. I. Du Pont De Nemours And Company α-Aminoboronic acid derivatives
US4636492A (en) * 1984-08-29 1987-01-13 E. I. Du Pont De Nemours And Company Inhibition of viral protease activity by peptide halomethyl ketones
US4652552A (en) * 1984-09-10 1987-03-24 E. I. Du Pont De Nemours And Company Tetrapeptide methyl ketone inhibitors of viral proteases
NZ222755A (en) * 1986-12-23 1989-11-28 Warner Lambert Co Renin inhibiting acyl peptide derivatives containing two to four amino acid residues, and pharmaceutical compositions
US5024994A (en) * 1986-12-23 1991-06-18 Warner-Lambert Company Renin inhibitors IV
US5296468A (en) * 1989-10-30 1994-03-22 The Salk Institute For Biological Studies GnRH analogs
US5169932A (en) * 1989-10-30 1992-12-08 The Salk Institute For Biological Studies Gnrh analogs
WO1991013904A1 (en) * 1990-03-05 1991-09-19 Cephalon, Inc. Chymotrypsin-like proteases and their inhibitors
JPH04202170A (ja) * 1990-11-29 1992-07-22 Taisho Pharmaceut Co Ltd トリペプチド誘導体
US5340736A (en) * 1991-05-13 1994-08-23 The President & Fellows Of Harvard College ATP-dependent protease and use of inhibitors for same in the treatment of cachexia and muscle wasting
US5614649A (en) * 1994-11-14 1997-03-25 Cephalon, Inc. Multicatalytic protease inhibitors
US5550262A (en) * 1994-11-14 1996-08-27 Cephalon, Inc. Multicatalytic protease inhibitors

Also Published As

Publication number Publication date
ATE241998T1 (de) 2003-06-15
ES2200010T3 (es) 2004-03-01
US5990083A (en) 1999-11-23
DK0789578T3 (da) 2003-09-22
AU710437B2 (en) 1999-09-23
WO1996014857A1 (en) 1996-05-23
EP0789578A4 (en) 2000-09-20
PT789578E (pt) 2003-10-31
DE69530993D1 (de) 2003-07-10
MX9703564A (es) 1997-08-30
BR9509665A (pt) 1997-10-28
CN1166403C (zh) 2004-09-15
FI972029A (fi) 1997-05-13
JP2000290197A (ja) 2000-10-17
US5614649A (en) 1997-03-25
CA2202760A1 (en) 1996-05-23
JP3056258B2 (ja) 2000-06-26
HK1004638A1 (en) 1998-11-13
JPH10507465A (ja) 1998-07-21
EP0789578A1 (en) 1997-08-20
CN1164192A (zh) 1997-11-05
EP0789578B1 (en) 2003-06-04
DE69530993T2 (de) 2004-05-19
US5830870A (en) 1998-11-03
NZ296479A (en) 1999-06-29
FI972029A0 (fi) 1997-05-13
NO972104L (no) 1997-06-13
KR100420774B1 (ko) 2004-07-05
AU4110496A (en) 1996-06-06
NO972104D0 (no) 1997-05-07
NO324066B1 (no) 2007-08-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI118325B (fi) Multikatalyyttisen proteaasin inhibiittoreita
CN110809467B (zh) Sestrin-gator2相互作用的调节剂及其用途
CZ2001515A3 (cs) Peptidové inhibitory viru hepatitidy typu C
JPWO2008066070A1 (ja) ジペプチジルペプチダーゼｉｖ阻害剤
KR20000048577A (ko) 인다논으로 26ｓ 및 20ｓ 프로테아좀을 억제하는 방법
US5550262A (en) Multicatalytic protease inhibitors
EP1967526B1 (en) Inhibitor of TGF-ß activation reaction
US12006321B2 (en) Substituted pyrazolo[1,5-a]pyrimidines as apelin receptor agonists
US20090227521A1 (en) Use of compounds in the treatment of ischemia and neurodegeneration
CA2833082C (en) Selective cysteine protease inhibitors and uses thereof
EP0391999A1 (en) Peptidyl inhibitors of the initiation of coagulation
JP2009536611A (ja) ホルモン依存性障害の処置のための作用物質及びその使用
JP2002508321A (ja) 抗腫瘍薬としての使用のための多触媒性プロテアーゼ阻害剤
US20120196892A1 (en) Novel caspase-2 inhibitors
JP6945546B2 (ja) 新規誘導体、及びカスパーゼ−２の選択的阻害剤としての使用
JP6143270B2 (ja) マイオスタチン阻害ペプチド
AU2003282660A1 (en) Vasoregulating compounds and methods of their use
AU710437C (en) Multicatalytic protease inhibitors
RU2232809C1 (ru) Способ прямого ингибирования каспаз
CN116554263A (zh) Sirt1激动剂及其在相关疾病治疗中的应用
JPH09508365A (ja) マラリア原虫アスパラギン酸プロテアーゼ阻害剤
JP2003212894A (ja) テロメラーゼ阻害剤

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Ref document number: 118325

Country of ref document: FI

MM Patent lapsed