JP2009536611A - ホルモン依存性障害の処置のための作用物質及びその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、ホルモン依存性障害を処置するために有効な新規作用物質に関する。特に、本発明は、ＨＬＳ−５の内因性レベル又はその活性を変更することが可能な化合物又は組成物を含む核内受容体変調剤を、それを必要とする被検者に投与するステップを含む、生体内で核内受容体を変調する方法に関する。

Description

優先権主張
本出願は、２００６年３月２８日に出願された米国仮特許出願第６０／７８７２８３号の３５ＵＳＣ１１９（ｅ）に基づく利益を主張し、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は、ホルモン依存性障害を処置するために有効な新規作用物質に関する。特に、本発明は、医薬的有効量のＨＬＳ−５ポリペプチド又はその機能的断片又はその医薬組成物；又はＨＬＳ−５の内因性レベル又はその活性を変調することが可能な化合物又は組成物を含む核内受容体変調剤であって、ホルモン依存性障害の処置に有効である核内受容体変調剤に関する。

ホルモン依存性障害は、１つの共通した特徴を有する状態の広い分類である：すなわち、それらは全て核内受容体の状態に関連がある。アンドロゲン依存性及び非依存性前立腺癌、乳癌、骨粗鬆症、アルツハイマー病、脳血管疾患、子癇前症及び子宮内膜症、悪性又は自己免疫成分が有る又は無い甲状腺機能亢進及び低下症関連疾患、クッシング症候群又は副腎機能亢進若しくは低下を含むが、それらに限定されない多数のホルモン依存性障害がある。

１つの特定の群のホルモン依存性障害が、他のものよりも遙かに多く研究され、かつそれは、ホルモン依存性癌である。乳癌及び前立腺癌が、ホルモン依存性癌の最も古典的な例である。乳癌の場合に、ホルモンエストロゲン（Ｅ２）が、大多数の乳癌の成長を調節し、他方で前立腺癌は、一般的にアンドロゲン又はジヒドロキシテストステロン（ＤＨＴ）によって調節される。ホルモン依存性癌の他の例には、子宮内膜癌、卵巣癌、甲状腺癌及び前立腺癌を含む（例えば、Ｓｈｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．２０００，Ｒｅｖ Ｅｎｄｏｃｒ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓｏｒｄ．１，１６５−７１；Ｍａｋａｒ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｌａｔ Ｃａｎｃｅｒ．７，８５−９３；Ｓｃｈｒｏｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９，ＢＪＵ Ｉｎｔ．，８３，１６１−７０；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．１３，１６６５−７０；Ｆｅｌｄｍａｎ ＆ Ｆｅｌｄｍａｎ，２００１，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ，１，３４−４５を参照）。

乳癌及び前立腺癌は、大部分の工業国で、それぞれ女性及び男性における癌死亡の主な原因に入る。ホルモン依存性腫瘍であるので、抗ホルモン治療は、通常予防及び処置に有効である。しかしながら、特に局所進行性腫瘍及び転移性腫瘍に関して、耐性の出現は、普通であり、その場合に耐性が予測可能である。これらの耐性腫瘍の表現型には、受容体陽性、リガンド依存性；受容体陽性、リガンド非依存性；及び受容体陰性、リガンド非依存性を含む。これらの表現型の根底にある機構は、複雑であり、性ホルモン及び性ホルモン受容体だけでなく、幾つかの成長因子及び成長因子受容体も関与させ、異なるシグナル伝達経路が単独で又は一緒に存在し、かつ各経路が、おそらく互いに連結している。

乳癌に関して、大多数の患者は、局所化疾患、別名原発性乳癌を示す。通常の処置は腫瘍の外科的切除であり、その後にアジュバント治療が続く。エストロゲン受容体α（ＥＲα）陽性疾患のアジュバント治療は、Ｔａｍｏｘｉｆｅｎ（商標）によって例証されるように、受容体に結合することによってエストロゲンレベルを低下させるか、又はその活性を遮断するように設計される。Ｔａｍｏｘｉｆｅｎ（商標）は、今や閉経前及び後の女性におけるＥＲα陽性疾患の第一アジュバント処置であり、かつ転移性疾患並びに局所化疾患の処置に有益である。しかしながら、ＥＲα陽性疾患を有する約３０％の患者は、Ｔａｍｏｘｉｆｅｎ（商標）に応答しない。その上、当初Ｔａｍｏｘｉｆｅｎ（商標）処置に応答する、局所化疾患を示す相当な割合の患者及び転移性疾患を示す全ての患者は、耐性を持つようになる。当初応答するが、Ｔａｍｏｘｉｆｅｎ（商標）に耐性を持つようになる患者の場合に、ＥＲα発現は、約１０％の場合にのみ失われる。その上、耐性患者の３分の１は、Ｆａｓｌｏｄｅｘ（商標）（ＩＣＩ １８２、７８０）のような異なる抗エストロゲン剤、又はアロマターゼ阻害剤、エストロゲン合成を阻害する薬剤の使用による処置に臨床応答を示す。それにもかかわらず、かつＴａｍｏｘｉｆｅｎ（商標）に対するデノボ又は獲得耐性の問題にもかかわらず、それは、第一選択のアジュバント剤になった（Ａｌｉ ＆ Ｃｏｏｍｂｅｓ，２００２，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ，２：１０１−１１２）。

幾つかの因子は、誘導物質及び阻害剤の両方とも、エストロゲン応答遺伝子の調節に重要な役割を果たす。核ホルモン受容体転写因子（ＮＲ）は、小分子リガンドに直接応答し、かつ発生及び動的恒常性を含む生体内での種々の機能を制御する（Ａｒａｎｄａ ＆ Ｐａｓｃｕａｌ，２００１，Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｖ，８１，１２６９−１３０４；Ｔｓａｉ ＆ Ｏ’Ｍａｌｌｅｙ，１９９４，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ，６３，４５１−４８６）。代謝病及び癌の両方とも、ＮＲによるシグナル伝達の調節の誤りと直接的に相関性があり、かつそれらは、多剤及び薬剤開発プログラムの理想的な標的である。リガンド依存性ＮＲ信号伝達は、ＮＲｓ及びステロイド受容体活性化補助因子（ＳＲＣ）の間の、保存ＳＲＣモチーフ（ＮＲボックス、Ｌ_１ＸＸＬ_２Ｌ_３）によって実行される直接相互作用を必要とする（Ｔｓａｉ ＆ Ｏ’Ｍａｌｌｅｙ，１９９４，前掲）。

エストロゲン受容体（ＥＲα及びＥＲβ）は、１７β−エストラジオール（Ｅ２）の効果を媒介し、かつ様々な組織及び器官における成長、発生、及び恒常性維持に関するＥ２の役割の原因となる。ＥＲα及びＥＲβは、ＤＮＡへ存在する特定のエストロゲン応答要素（ＥＲＥ）に直接結合するリガンド依存性転写因子の役目を果たし、かつ次にＥ２感受性遺伝子の転写を調節する。その上、ＥＲα及びＥＲβは、ＤＮＡへの直接結合なしに、Ｅ２依存性ＥＲＥに欠ける遺伝子の転写を活性化又は不活性化する他の転写因子に結合することによって間接的に転写を調節する。これら２つのＥ２メカニズムに加えて、細胞質タンパク質及び迅速な膜開始応答を含む第３のシグナル伝達経路が、分裂促進Ｅ２誘発効果に広く役立つことが最近発見された。これらの迅速なＥ２誘発効果におけるＥＲβの関与は、公然と討議されている。

前立腺癌に関して、それは、活性アンドロゲン又はジヒドロキシテストステロン（ＤＨＴ）の血中濃度が高い時に、３５歳という早い時期にすでに存在するクローンから多くの場合、発生する。疾患の進行は遅く、かつ癌は、より高齢で診断される。前立腺癌は、アンドロゲン依存性段階から、それが全ての抗アンドロゲン処置から逃れる段階へ進化する（Ｐｅｔｒｙｌａｋ，２００５，Ｕｒｏｌｏｇｙ，６５：６，ｐ８−１２）。患者は、通常進行性癌の診断後、２年以内に死ぬ。従ってアンドロゲン非依存性前立腺癌の新規治療を開発することは、非常に興味深い。前立腺癌のアンドロゲン非依存性進化は、細胞及び分子レベルでの複雑な現象である。それは、成長因子への感度増加、増殖経路、アポトーシス及び生存経路の制御、並びに血管形成の制御を含む。

前立腺癌における悪性に向かう形質転換及び進行は、増殖調節よりもむしろ、前立腺上皮細胞のアポトーシスを受けられないことに部分的に依存する。このアポトーシス抑制プロセスにおける不適当さの分子標的は、前立腺癌患者にとって治療的に非常に重要であると判明し得る。

従って、ホルモン依存性障害自体を予防及び／又は処置することが可能な他の作用物質を発見するか、又は「公知の」作用物質の作用を補助することが可能な作用物質を探し出すことが有用であろう。

本発明者らは、ＨＬＳ−５が、核内受容体、特にホルモン依存性障害と関連した核内受容体の作用及び活性に影響を及ぼし、かつ／又は変調することが可能であることを発見した。

従って、第１の形態において、本発明は、ＨＬＳ−５の内因性レベル又はその活性を変更することが可能な化合物又は組成物を含む核内受容体変調剤を提供する。

第２の形態において、本発明は、
（ｉ）医薬的有効量のＨＬＳ−５ポリペプチド又はアイソフォーム又はその機能的断片又はその医薬組成物；又は
（ｉｉ）ＨＬＳ−５の内因性レベル又はその活性を変更することが可能な化合物又は組成物；又はその組み合わせ、
を含む核内受容体変調剤であって、
ホルモン従属性障害の処置に有効である核内受容体変調剤を提供する。

幾つかの実施態様において、作用物質は、ＨＬＳ−５ポリペプチドを更に含む。幾つかの実施態様において、ＨＬＳ−５ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４又は配列番号６に示される配列又はそれと実質的に相同のポリペプチド、又はその機能的断片を含むことになる。

本発明のＨＬＳ−５ポリペプチドが、以下のものを含むが、それらに限定されないポリペプチド類似体も含むことが明瞭に理解されるべきである。
１． １種以上のアミノ酸が、その対応するＤ−アミノ酸によって置き換えられるＨＬＳ−５ポリペプチド。当業者は、レトロインバーソ（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ）アミノ酸配列が、標準的な方法によって合成できることに気が付くであろう。例えば、Ｃｈｏｒｅｖ ａｎｄ Ｇｏｏｄｍａｎ，１９９３，Ａｃｅ Ｃｈｅｍ Ｒｅｓ，２６：２６６−２７３を参照；
２． ペプチド結合が、代謝退化に更に耐性を持つ構造によって置き換えられるＨＬＳ−５のペプチド模倣化合物。例えば、Ｏｌｓｏｎ ｅｔ ａ１，１９９３，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３６，ｐ３０３９−３０４９を参照。
３． 個別のアミノ酸が、その電荷を修飾するために類似構造、例えば修飾終端又はアルキル、アシル若しくはアミン置換を有する又は有さない、ｇｅｍ−ジアミノアルキル基又はアルキルマロニル基によって置き換えられるＨＬＳ−５ポリペプチド。

かかる代替的構造の使用は、生理的状態において分解に更に耐性を持つので、体内で著しく長い半減期を提供し得る。

ポリペプチド類似体の組み合わせ合成、並びにポリペプチド及びポリペプチド類似体のスクリーニング方法は、当該技術分野において周知である（例えばＧａｌｌｏｐ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３７，ｐｌ２３３−１２５１を参照）。本発明のＨＬＳ−５ポリペプチドが、改善された活性、安定性及び生物学的利用能の化合物の設計及び合成のための鋳型として有用であることが特に予期される。

好ましくはアミノ酸置換が使用される場合、置換は、保存的である、すなわちアミノ酸は、類似した寸法の、かつ類似した電荷特性を有するものによって置き換えられる。

幾つかの実施態様において、ＨＬＳ−５ポリペプチドは、ＨＬＳ−５をコードするポリヌクレオチドを含むベクターから生体内で発現される。幾つかの実施態様において、ＨＬＳ−５ポリヌクレオチドは：
（ａ）配列番号１、配列番号３又は配列番号５に示されるヌクレオチド配列、又はその機能的断片を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１、配列番号３又は配列番号５に示されるヌクレオチド配列、又はその機能的断片に選択的にハイブリダイズすることが可能なヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）に定義されたポリヌクレオチドへの遺伝子コードの結果として縮退したポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ｄ）（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のポリヌクレオチドに相補的であるポリヌクレオチド
からなる群から選択される。

本発明は、本発明のＨＬＳ−５ポリヌクレオチドを含むベクター、例えば宿主細胞内に前記ポリヌクレオチドの発現を向けることが可能な調節配列に操作可能に結合された、本発明のＨＬＳ−５ポリヌクレオチドを含む発現ベクターも提供する。

従って、第３の形態において、本発明は、宿主細胞内に本発明のＨＬＳ−５ポリヌクレオチドの発現を向けることが可能な調節配列に操作可能に結合された、本発明のＨＬＳ−５ポリヌクレオチドを含む哺乳類発現ベクターを含む核内受容体変調剤を提供する。

第４の形態において、本発明は、
（ｉ）有効量のＨＬＳ−５ポリペプチド、そのアイソフォーム、その機能的断片又はその組成物；又は
（ｉｉ）ＨＬＳ−５又はアイソフォーム又は機能的修飾又はその機能的断片の内因性レベル及び／又は活性を変更することが可能な物質；又は
（ｉｉｉ）ＨＬＳ−５又はアイソフォーム又は機能的修飾又はその機能的断片を特異的に結合する抗体又はその断片；又は
（ｉｖ）ＨＬＳ−５又はアイソフォーム又は機能的修飾又はその機能的断片をコードするポリヌクレオチド分子にアンチセンスであるポリヌクレオチド分子；又は
（ｖ）その組み合わせ
を、それを必要とする被検者に投与するステップを含む、生体内で核内受容体を変調する方法を提供する。

第５の形態において、本発明は、生体内で核内受容体を変調するために、
（ｉ）医薬的有効量のＨＬＳ−５ポリペプチド、そのアイソフォーム、その機能的断片又はその組成物；又は
（ｉｉ）ＨＬＳ−５又はアイソフォーム又は機能的修飾又はその機能的断片の内因性レベル及び／又は活性を変更することが可能な物質；又は
（ｉｉｉ）ＨＬＳ−５又はアイソフォーム又は機能的修飾又はその機能的断片を特異的に結合する抗体又はその断片；又は
（ｉｖ）ＨＬＳ−５又はアイソフォーム又は機能的修飾又はその機能的断片をコードするポリヌクレオチド分子にアンチセンスであるポリヌクレオチド分子；又は
（ｖ）その組み合わせ
の１つ以上の使用を提供する。

幾つかの実施態様において、核内受容体変調剤は、直接的又は間接的手段によって核内受容体の活性を下方調節する。更に他の実施態様において、核内受容体変調剤は、核内受容体の活動を上方調節する。

第６の形態において、本発明は、
（ｉ）有効量のＨＬＳ−５ポリペプチド、そのアイソフォーム、その機能的断片又はその組成物；又は
（ｉｉ）ＨＬＳ−５又はアイソフォーム又は機能的修飾又はその機能的断片の内因性レベル及び／又は活性を変更することが可能な物質；又は
（ｉｉｉ）ＨＬＳ−５又はアイソフォーム又は機能的修飾又はその機能的断片を特異的に結合する抗体又はその断片；又は
（ｉｖ）ＨＬＳ−５又はアイソフォーム又は機能的修飾又はその機能的断片をコードするポリヌクレオチド分子にアンチセンスであるポリヌクレオチド分子；又は
（ｖ）その組み合わせ
を、細胞に投与するステップを含む、生体外で核内受容体を変調する方法を提供する。

第７の形態において、本発明は、
（ｉ）医薬的有効量のＨＬＳ−５ポリペプチド、そのアイソフォーム、その機能的断片又はその医薬組成物；又は
（ｉｉ）ＨＬＳ−５又はアイソフォーム又は機能的修飾又はその機能的断片の内因性レベル及び／又は活性を変更することが可能な物質；又は
（ｉｉｉ）ＨＬＳ−５又はアイソフォーム又は機能的修飾又はその機能的断片を特異的に結合する抗体又はその断片；又は
（ｉｖ）ＨＬＳ−５又はアイソフォーム又は機能的修飾又はその機能的断片をコードするポリヌクレオチド分子にアンチセンスであるポリヌクレオチド分子；又は
（ｖ）その組み合わせ
を、それを必要とする被検者に投与するステップを含む、ホルモン依存性障害を処置又は予防する方法を提供する。

幾つかの実施態様において、障害は、核内受容体変調剤によって直接的に影響を及ぼされるか、又は制御される。他の実施態様において、障害は、核内受容体変調剤によって直接的に影響を及ぼされないか、又は制御されない；しかしながら、核内受容体変調剤の投与は、障害と関連した、又は障害によって影響を及ぼされるポリペプチドの核内受容体を変調することによって障害を改善、軽減又は処置する。

本発明の核内受容体変調剤は、いかなる適切な経路によっても投与でき、かつ当業者は、処置すべき状態のための最も適切な経路及び用量を容易に決定できるであろう。投与量は、付き添い医師又は獣医の裁量により、かつ処置すべき状態の性質及び状況、処置すべき被検者の年齢及び全体的な健康状態、投与経路及び投与され得たいずれかの前処置によって決まる。

核内受容体変調剤は、医薬上許容し得る担体を更に含む組成物の形状で投与できる。これは、通常、例えば滅菌水、リン酸ナトリウム、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウム及びそのいずれかの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１種の賦形剤を含む。

医薬組成物の調製のための方法及び医薬担体は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，ＵＳＡのような教科書に示されるように、当該技術分野において周知である。

担体又は希釈液、及び他の賦形剤は、投与経路によって決まり、かつこの場合も当業者は、各特定のケースのために最も適切な製剤を容易に決めることができる

被検者は、ヒトであっても良いか、又は家畜、伴侶若しくは動物園の動物でも良い。本発明の核内受容体変調剤は、ヒトの医療処置での使用に適することが特に予期されるが、それらは、イヌ及びネコのような伴侶動物、及びウマ、ウシ及びヒツジのような家畜、又はヒト以外の霊長類、ネコ科、イヌ科、ウシ科及び有蹄類のような動物園の動物の処置を含む獣医学処置にも適用できる。

第８の形態において、本発明は、
（ｉ）ＨＬＳ−５又はその断片の応答要素への結合を可能にする条件で、ＨＬＳ−５又はその断片を結合することが可能な応答要素を含む核内受容体テストシステムを提供すること；
（ｉｉ）核内受容体テストシステムをＨＬＳ−５と接触させること；
（ｉｉｉ）ＨＬＳ−５の存在下で相互作用レベルを測定すること；
（ｉｖ）核内受容体システムをＨＬＳ−５核内受容体変調活性の候補修飾因子と接触させること；
（ｖ）候補修飾因子の存在下で相互作用レベルを測定すること；
（ｉｖ）候補修飾因子の存在下での測定された相互作用レベルを、ＨＬＳ−５の存在下及び／又は候補修飾因子の不存在下での測定された相互作用レベルと比較すること
を含む、ＨＬＳ−５核内受容体変調活性の修飾因子を識別するアッセイであって、候補修飾因子の存在下での相互作用の統計的に有意な変更は、ＨＬＳ−５核内受容体変調活性の修飾因子を示すアッセイを提供する。

幾つかの実施態様において、核内受容体テストシステムは、ＨＬＳ−５応答要素と、それに操作可能に結合されたレポーター遺伝子を含むレポーター遺伝子構成を有する細胞を含む。好ましくは、レポーター遺伝子は、蛍光タンパク質又は酵素レポーターである。更に好ましくは、レポーター遺伝子は、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−ラクタマーゼ、ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）からなる群から選択される。

第９の形態において、本発明は、
（ｉ）テスト被検者からの生体試料を提供すること；
（ｉｉ）生体試料内の核内受容体活性レベルを測定すること；及び
（ｉｉｉ）生体試料をＨＬＳ−５又はその機能的断片と接触させ、かつ核内受容体活性レベルを測定し、かつＨＬＳ−５の存在下での測定された核内受容体活性レベルを、ＨＬＳ−５の不存在下での核内受容体活性と比較すること
を含むホルモン依存性障害のＨＬＳ−５処置の適合性を決定する方法であって、ＨＬＳ−５の存在下での核内受容体活性の統計的に有意な差は、状態のＨＬＳ−５処置の適合性を示す方法を提供する。

第１０の形態において、本発明は、
（ｉ）ＨＬＳ−５又はそのアイソフォーム又は機能的修飾又はその機能的断片；
（ｉｉ）ＨＬＳ−５又はそのアイソフォーム又は機能的修飾又はその機能的断片をコードするポリヌクレオチド分子；
（ｉｉｉ）ＨＬＳ−５又はそのアイソフォーム又は機能的修飾又はその機能的断片の内因性レベル及び／又は活性を変更することが可能な物質；
（ｉｖ）ＨＬＳ−５又はそのアイソフォーム又は機能的修飾又はその機能的断片を特異的に結合する抗体又はその断片；及び／又は
（ｖ）ＨＬＳ−５又はそのアイソフォーム又は機能的修飾又はその機能的断片をコードするポリヌクレオチド分子にアンチセンスであるポリヌクレオチド分子
の１つ以上を含むマイクロアレイを提供する。

第１１の形態において、本発明は、
（ｉ）ＨＬＳ−５又はそのアイソフォーム又は機能的修飾又はその機能的断片；
（ｉｉ）ＨＬＳ−５又はそのアイソフォーム又は機能的修飾又はその機能的断片をコードするポリヌクレオチド分子；
（ｉｉｉ）ＨＬＳ−５又はそのアイソフォーム又は機能的修飾又はその機能的断片の内因性レベル及び／又は活性を変更することが可能な物質；
（ｉｖ）ＨＬＳ−５又はそのアイソフォーム又は機能的修飾又はその機能的断片を特異的に結合する抗体又はその断片；及び／又は
（ｖ）ＨＬＳ−５又はそのアイソフォーム又は機能的修飾又はその機能的断片をコードするポリヌクレオチド分子にアンチセンスであるポリヌクレオチド分子
の１つ以上を含むキットを提供する。

本発明を詳細に記載する前に、本発明が、特に例示されたＨＬＳ−５配列、発現技術又は方法に限定されず、かつ当然に異なり得ることが理解されるべきである。本明細書中で使用される専門用語が、本発明の特定の実施態様を記載されるためだけであり、かつ限定することが意図されず、それが添付の請求項によってのみ限定されることも理解されるべきである。

本明細書に引用された全ての公報、特許及び特許出願は、前掲又は後掲であれ、全体が参照によって、本明細書により組み込まれる。しかしながら、本明細書に言及された公報は、公報に報告され、かつ本発明に関連して使用されることがある手順及び試薬を記載及び開示する目的で引用される。本明細書のいかなるものも、本発明が先行発明により、かかる開示に先行する権利がないという自白として解釈されるべきでない。

本発明の実施は、特に明記しない限り、当該技術分野における技能の範囲内にある、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、組み換えＤＮＡ、薬理学及び免疫学の従来の技術を用いる。かかる技術は、文献に記載されている。例えば、Ｂａｉｌｅｙ ＆ Ｏｌｌｉｓ，１９８６，「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ」，２ｎｄ Ｅｄ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｔｏｒｏｎｔｏ；Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａ１．，１９９９，「Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ」Ｖｏｌｕｍｅ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．）；「ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．，１９８５）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＶ（Ｗｅｉｒ ＆ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６）；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ， １９８７），Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４ ａｎｄ １５５（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．１９８７）；「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」，２ｎｄ Ｅｄ．，（ｅｄ． ｂｙ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：１９８９）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」，（Ｈａｍｅｓ ＆ Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．１９８４）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｇａｉｔ ｅｄ．，１９８４）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７^ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，ＵＳＡ．；「Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ」，１２ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９６），Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｃａｔｅｇｏｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ；及び「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＆ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」，（Ｈａｍｅｓ ＆ Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．１９８４）を参照。

本明細書及び添付の請求項で使用されているように、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が別段の指図を明瞭にしない限り、複数の参照を含むことに注目されねばならない。それ故に、例えば「ａ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅ（１つの核酸分子）」の参照は、複数のかかる分子を含み、かつ「ａｎ ａｇｅｎｔ（１種の作用物質）」の参照は、１種以上の作用物質の参照である、等々。別段の定義がない限り、本明細書に使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する当該技術分野において通常の技能を有する者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと類似した、又は同等のいかなる材料及び方法も、本発明を実施又はテストするために使用できるが、好ましい材料及び方法は、ここで記載される。

本発明は、以下の形態を包含する：本発明の核内受容体変調剤の調製；前記作用物質をコードするポリヌクレオチド、又は前記ポリヌクレオチドを運搬及び発現する組み換えベクターの調製；前記ベクターを運搬する形質転換体；前記形質転換体を生成する方法；核内受容体変調剤を検出する方法；前記作用物質をコードするポリヌクレオチド又はｍＲＮＡを検出する方法；及び調節されない核内受容体活性によって引き起こされる又は悪化した状態を処置する方法が、以下に説明される。

以下に続く記載において、指示がなければ、遺伝子組み換え技術、動物細胞、昆虫細胞、酵母及び大腸菌中で組み換えポリペプチドの生成、分子生物学的方法、発現されたＨＬＳ−５ポリペプチドの分離及び精製方法、アッセイ及び免疫学的方法のような技術が、この分野において周知であり、かついずれかのかかる技術が採用できると認識される。

その最も広い形態において、本発明は、有効量のＨＬＳ−５、そのアイソフォーム又はその機能的断片を含む核内受容体変調剤を提供する。

本明細書で使用されるような用語「核内受容体変調剤」は、核内受容体の活性を直接又は間接的に変調することが可能な、ＨＬＳ−５、アイソフォーム、機能的断片又はその誘導体を含む物質の化合物又は組成物を指す。用語「変調する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」、「変調している（ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ）」又は「修飾因子」は、１つ以上の核内受容体を変更する又は影響を及ぼす（例えば機能及び／又は発現を上方調節する、すなわち増加させる、機能及び／又は発現を下方調節する、すなわち減少させる、阻害する、拮抗させる、作動させる（ａｇｏｎｉｚｅ）、誘発する、又は抑制する又は他の方法で制御する）、ＨＬＳ−５、そのアイソフォーム、機能的断片又はその誘導体の作用を参照するために本明細書において同じ意味で使用される。

本明細書（実施例を参照）に記載され、かつそうでなければ当該技術分野において公知のアッセイは、効果を引き出す、例えば細胞上で核内受容体を変調又は修飾するために、本発明の核内受容体変調剤及びその断片、変異体及び誘導体の能力を測定するために日常的に適用できる。例えば、幾つかの実施態様において、核内受容体に結合する又はＨＬＳ−５ポリペプチド全長と競合する核内受容体変調剤の能力は、当該技術分野において公知の種々のイムノアッセイによって評価できる。使用できるアッセイには、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、（例えばコロイド金、酵素又は放射性同位体標識を使用する）インサイチュイムノアッセイ、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えばゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ）、補体結合アッセイ、免疫蛍光検定、Ａタンパク質アッセイ及び免疫電気泳動アッセイ等のような技術を使用する競合及び非競合アッセイシステムを含むが、それらに限定されない。これらののアッセイの全ては、抗核内受容体抗体を利用できる。

ノーザンブロット分析、ｑＰＣＲ等を含む細胞及び／又は組織中の核内受容体発現レベルを評価する方法は、本明細書に開示されるか、又は当業者に周知である。かかるアッセイは、核内受容体に対する核内受容体変調剤の効果を決定するために使用できる。

本発明の核内受容体変調剤は、ホルモン活性受容体（特にエストロゲン及びアンドロゲン）の核内受容体活性を修飾することが可能であるので、ウェスタンブロット及び免疫組織化学によって組織及び細胞株中のエストロゲン受容体（ＥＲα及びＥＲβ）タンパク質レベルを監視することが可能である。ノーザンブロット分析又はｑＰＣＲは、核内受容体変調剤に応答して、並びにこれらの組織が１７β−エストラジオール（Ｅ２）によって処置された時にｍＲＮＡレベルで制御を示すことができる。

変調レベルを評価するために本発明で使用できるもう１つのアッセイは、レポーター遺伝子アッセイである。本明細書において使用されるような、用語「レポーター遺伝子」は、発現が、公知の方法を使用して検出できる遺伝子を意味する。緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−ラクタマーゼ、ワサビペルオキシダーゼのようなペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ＣＡＴ等）のような、蛍光タンパク質のための遺伝子を含む、多数の良く特徴付けされたレポーター遺伝子がある。ヒト分泌成分又はラットプロバシン（ｐｒｏｂａｓｉｎ）遺伝子から誘導されるアンドロゲン応答要素を含むレポータープラスミド、並びに前立腺特異抗原コンセンサス応答要素、及びエストロゲン受容体の場合、エストラゲン（ｏｅｓｔｒａｇｅｎ）応答要素を使用すること。これらの応答要素の活性を本発明の核内受容体変調剤と比較することが、可能である。ヒトｃＤＮＡ構成又は可溶性化合物によって一時的にトランスフェクトされた細胞は、検定できる。テストステロン又はそれぞれのリガンドの効力が、同様にテストできる。これは、転写調節因子の内分泌活性を分析するための、高感度の生体外テストシステムを提供する。

幾つかの実施態様において、有用なレポーター遺伝子アッセイは、グルココルチコイド応答要素（「ＧＲＥ」）又は甲状腺受容体エンハンサー様ＤＮＡ配列（「ＴＲＥ」）を利用するものである。ＧＲＥは、ＧＲとの相互作用を介してグルココルチコイド応答性を与えるエンハンサー様ＤＮＡ配列である。Ｐａｙｖａｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｃｅｌｌ，３５：３８１及びＳｃｈｉｅｄｅｒｅｉｔ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｎａｔｕｒｅ，３０４：７４９を参照。前立腺細胞中で優先的に機能するＴＲＥには、前立腺特異抗原遺伝子から誘導されるＴＲＥ（ＰＳＡ−ＴＲＥ）（米国特許第５６４８４７８号）、腺性カリクレイン−１遺伝子（ヒト遺伝子由来、ｈＫＬＫ２−ＴＲＥ）、及びプロバシン遺伝子（国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９８／０４１３２号）を含むが、それらに限定されない。これらの遺伝子の３種全部は、前立腺細胞中で優先的に発現され、かつ発現は、アンドロゲン誘発性である。一般的に、アンドロゲン誘発に応答する遺伝子の発現は、アンドロゲン受容体（ＡＲ）の存在を必要とする。

本発明の核内受容体変調剤の効果を監視するためのもう１つの有用なアッセイは、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイである。好ましくは、利用される手順は、Ｄａｓ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３７（６）：ｐ．９６１−９又はＭｅｔｉｖｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００６，ＥＭＢＯ Ｒｅｐ，７（２）：ｐ．１６１−７によって記載された方法の１つである。基本的に、細胞は、５０-６０％の密集度に成長させることができ、かつ室温で１５分間、１×ＰＢＳ中で１％のホルムアルデヒド溶液によって架橋できる。架橋は、１２５ｍＭの最終濃度までのグリシンの添加によって停止される。単層は、次に冷たいＰＳＢによって２回洗浄され、かつ１ ｍｌ当たり１千万個の細胞の懸濁液を発生させるために、放射性免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）緩衝液中［１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％ｖ／ｖのＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、０．５％ｗ／ｖのデオキシコレート、０．１％ｗ／ｖのＳＤＳ、５０ｍＭのトリスｐＨ８、５ｍＭのＥＤＴＡ、プロテアーゼ阻害剤カクテル、ホスファターゼ阻害剤（２０ｍＭのＮａＦ／０．２ｍＭのオルトバナジウム酸ナトリウム）、デアセチラーゼ阻害剤（５μＭのトリコスタチンＡ／５ｍＭの酪酸ナトリウム）及び０．５ｍＭのＰＭＳＦ］で収集される。懸濁液は、次に５００ｂｐ未満のＤＮＡ断片を発生させるために超音波で分解され、かつ１２０００ｇで１０分間の遠心分離によって浄化される。タンパク質溶液は、次にタンパク質及びＤＮＡ含有量に関して定量化でき、かつ１ｍｇ／ｍｌのタンパク質に調整できる。

免疫沈降のために、１ｍｇのタンパク質抽出物は、示された抗体の添加前に、５０:５０のタンパク質Ａ：タンパク質Ｇセファロースの４０μｌの５０％スラリーによって２時間、事前浄化される（ｐｒｅ−ｃｌｅａｒｅｄ）。抗体（Ａｂ）源は、次に添加され、かつ１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び０．３ｍｇ／ｍｌの超音波で分解されたサケ精子ＤＮＡによって事前に遮断された、５０:５０のタンパク質Ａ：タンパク質Ｇセファロースの４０μｌの５０％スラリーの存在下で、１２時間、４℃でインキュベートされる。セファロースビードは、６０００ｇで１分間の遠心分離によって回収され、かつＲＩＰＡ緩衝液によって２回、ＣｈＩＰ洗浄緩衝液［１００ｍＭのトリスＨＣｌ ｐＨ８．５、５００ｍＭのＬｉＣｌ、１％ｖ／ｖのＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、１％ｗ／ｖのデオキシコール酸］によって４回、ＲＩＰＡ緩衝液によって２回、及び１×ＴＥによって２回洗浄される。免疫複合体は、１％のＳＤＳの存在下で１０分間、６５℃で溶出され、かつ架橋は、２００ｍＭのＮａＣｌに調整し、かつ５時間、６５℃でインキュベートすることによって逆転する。試料は、プロテイナーゼＫによって処理され、その後にフェノールクロロホルム抽出が続く。ＤＮＡは、沈降し、かつ半定量ＰＣＲ反応において鋳型として使用される。

変調の程度を評価するために使用できた他のアッセイには、電気泳動移動度シフトアッセイ又はＥＭＳＡ（例えばＣｒｏｔｈｅｒｓ，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３２５：４６４−５；Ｇａｒｎｅｒ ＆ Ｒｅｖｚｉｎ，１９８６，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１１：３９５−６；Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ，１９８５，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３：１９８−２０７；Ｂｕｒａｔｏｗｓｋｉ ＆ Ｃｈｏｄｏｓｈ，ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｐｐ．１２．２．１−１２．２．７（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｄ．，１９９６）を参照；全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第５７８９５３８号、共有されるＷＯ００／４２２１９も参照）を含む。

ＨＬＳ−５又は造血系スイッチ５の遺伝子は、癌において多くの場合欠失した領域である、染色体座８ｐ２１．１上で発見される。この座の欠失は、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、結腸直腸癌及び肝臓癌に関与した（Ａｒｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２３，５６９７−５７０２；Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｏｎｃｏｌ，７４，９８−１０２；Ｂｒｕｉｘ ＆ Ｌｌｏｖｅｔ，２００２，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，３５，５１９−５２４；Ｃｈｕｇｈｔａｉ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１８，６５７−６６５；Ｃｏｕｒｔａｙ−Ｃａｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，６６，１５−２５；Ｎｉｈｅｉ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ，６２，３６７−３７０；Ｏｂａ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅｔ Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ，１２４，２０−２６；Ｓｅｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１４，７４１−７４３；Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１７，１１８５−１１８８）

ＨＬＳ−５は、リングフィンガーＢボックスコイルドコイル（ＲＢＣＣ）タンパク質ファミリーのメンバーである（Ｌａｌｏｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７９，８１８１−８１８９）。この分子群は、より高い真核生物の間で保存される特性ドメイン構造のため、タンパク質の三要素モチーフファミリー（ＴＲＩＭ）とも呼ばれる（Ｒｅｙｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｅｍｂｏ Ｊ，２０，２１４０−２１５１）。マウス及びヒトゲノムの配列分析は、多くは未知の機能を有するＲＢＣＣタンパク質の多様な配列を識別した（Ｒｅｙｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，２００１、前掲）。ＰＭＬ、ＴＩＦｌα及びＲｆＰを含む幾つかのＲＢＣＣファミリーメンバーは、ヒト癌において突然変異し、細胞成長及び分化の重大な調節因子としてＲＢＣＣタンパク質を関与させる（ｄｅ Ｔｈｅ ｅｔ ａｌ １９９１，Ｃｅｌｌ，６６：６７５−６８４）。最近の研究により、若干のＲＢＣＣメンバーが、細胞内局所性又は翻訳後修飾に影響を及ぼすことによって、パートナータンパク質の活性又は定常レベルを調節することが証明された（Ｄｉａｍｏｎｔｉ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９９，２８６６−２８７１；Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｎａｔｕｒｅ，４０６，２０７−２１０；Ｕｒａｎｏ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｎａｔｕｒｅ，４１７，８７１−８７５）。

ＨＬＳ−５は、Ｊ２Ｅ赤血球細胞種の赤血球から骨髄系統スイッチ中に著しく上方調節された遺伝子として当初、識別された（Ｋｌｉｎｋｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８５，８５０６−８５１０；Ｌａｌｏｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，２００４、前掲）。骨髄変異体は、単芽球様形態を示し、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）に応答せず、かつＧＡＴＡ−１及びＥＫＬＦを含む赤血球特異転写因子の発現減少を有した（Ｋｅｉｌ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．，６，４３９−４４８；Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｅｍｂｏ Ｊ．，１８，５５５９−５５６６）。意義深いことに、ＨＬＳ−５は、骨髄細胞のマクロファージコロニー刺激因子開始の成熟中に誘発された遺伝子として独立して単離された（Ｋｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７８，２５０４６−２５０５４）。

従って、本発明の幾つかの実施態様において、「核内受容体変調剤」は、単離したＨＬＳ−５ポリペプチド全長を含む。用語「ポリペプチド」は、アミノ酸の重合体及びその同等物を指し、かつ生成物の特定の長さを指さない；それ故に、ペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質は、ポリペプチドの定義に含まれる。この用語はまた、ポリペプチドの修飾、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化等を指さないか、又は除外しない。定義には、例えば（天然アミノ酸等を例えば含む）アミノ酸の１つ以上の類似体を含むポリペプチド、置換結合、並びに自然及び非自然の両方で発生する、当該技術分野において公知の他の修飾を有するポリペプチドが含まれる。

本発明のＨＬＳ−５ポリペプチド全長は、約５００のアミノ酸を有し、動物、特に哺乳動物において腫瘍抑制因子をコードし、かつ対立遺伝子変異体又は相同体を含む。ＨＬＳ−５ポリペプチド全長はまた、概してリングフィンガーモチーフ、Ｂボックス、コイルドコイルモチーフ及びＳＰＲＹモチーフを含む。本発明のＨＬＳ−５ポリペプチドは、ＨＬＳ−５ポリペプチド全長の断片及び誘導体、特に実質的に同じ生物学的活性を有する断片又は誘導体も含む。ポリペプチドは、組み換え又は化学合成法によって調製できる。幾つかの実施態様において、ＨＬＳ−５ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のアミノ酸配列、又はその断片を含む対立遺伝子変異体若しくは相同体を含むものを含む。更なる実施態様において、ＨＬＳ−５ポリペプチドは、配列番号４として示されるアミノ酸配列のアミノ酸１２から５０４、又はその対立遺伝子変異体、相同体若しくは断片から本質的になる。

本発明の文脈において、相同配列は、配列番号２、配列番号４、配列番号６又は配列番号８に示されたアミノ酸配列と、少なくとも２０、５０、１００、２００、３００又は４００のアミノ酸にわたるアミノ酸レベルで、少なくとも６０、７０、８０、又は９０％同一、好ましくは少なくとも９５又は９８％同一であるアミノ酸配列を含むように解釈される。特に、相同性は、非必須近接配列よりもむしろ、タンパク質の機能に必須であることが知られている配列の領域に対して概して考慮されるべきである。それ故に、例えば相同性比較は、好ましくは配列番号２、配列番号４又は配列番号８に示されたＨＬＳ−５アミノ酸配列のリングフィンガー、Ｂボックス、コイルドコイル及び／又はＳＰＲＹドメインに対応する領域にわたってなされる。リングフィンガーは、配列番号２のアミノ酸３６から７５にほぼ対応する。Ｂボックスは、配列番号２のアミノ酸１１１から１５２にほぼ対応する。コイルドコイルは、配列番号２のアミノ酸２１９から２６６にほぼ対応する。

ＳＰＲＹドメインは、配列番号２のアミノ酸３６８から５０７にほぼ対応する。幾つかの実施態様において、本発明のポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１１１から１５２、２１９から２６６若しくは３６８から５０７の１つ以上、又は配列番号４若しくは配列番号６の対応領域に対して５０、６０又は７０％を超える相同性、更に好ましくは８０又は９０％を超える相同性を有する隣接配列を含む。

幾つかの実施態様において、ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸３６から７５、又は配列番号４若しくは配列番号６の対応領域に対して８０又は９０％を超える相同性を有する隣接配列を代わりに、又は追加で含むことができる。他のポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１から３５、７６から１１０、１５３から２１８及び／又は２６７から３６７、又は配列番号４若しくは配列番号６の対応領域に対して４０、５０、６０又は７０％を超える相同性、更に好ましくは８０又は９０％を超える相同性を有する隣接配列を含む。相同性は、類似性（すなわち類似した化学特性／機能を有するアミノ酸残基）に関しても考慮できるが、本発明の文脈において、配列同一性に関して相同性を表現することが好ましい。用語「実質的な相同性」又は「実質的な同一性」は、ポリペプチドを指す時に、問題のポリペプチド又はタンパク質が、自然発生タンパク質全体又はその一部と少なくとも約７０％の同一性、通常少なくとも約８０％の同一性、かつ好ましくは少なくとも約９０又は９５％の同一性を示すことを示す。

相同性比較は、目測によって、又は大抵は、容易に入手可能な配列比較プログラムを用いて行うことができる。これらの市販されたコンピュータプログラムは、２つ以上の配列間の相同率を計算できる。

相同率（％）は、隣接配列にわたって計算でき、すなわち一方の配列が、他方の配列と整列させられ、かつ同時に１つの残基で、一方の配列中の各アミノ酸が、他方の配列中の対応するアミノ酸と直接比較される。これは、「ギャップの無い」アラインメントと呼ばれる。概して、かかるギャップの無いアラインメントは、比較的低い数の残基にわたってのみ実行される（例えば５０未満の隣接アミノ酸）。

これは非常に簡易かつ一貫した方法であるが、例えば他の点では同一の配列対において、１つの挿入又は欠失によって、続きのアミノ酸残基がアラインメントから追い出されることになり、それ故に全体的なアラインメントが実行された時に相同％に大きな減少を引き起こす可能性があることが考慮されていない。従って、大部分の配列比較方法は、全体的な相同性スコアを不当に不利にすることなく、可能な挿入及び欠失を考慮する最適なアラインメントを生成するように設計されている。このことは、局所相同性を最大にすることを試みるために、配列アラインメントに「ギャップ」を挿入することによって達成される。

しかしながら、これらのより複雑は方法は、同数の同一のアミノ酸に関して、−２つの比較される配列間の高い関連性を反映する−できるだけ少ないギャップを有する配列アラインメントが、多くのギャップを有するものよりも高いスコアを達成するように、アラインメント中に発生する各ギャップに「ギャップペナルティー」を割り当てている。ギャップの存在に比較的高いコストを、かつギャップ中の各々のその後の残基に小さなペナルティーを負わせる「アフィンギャップコスト」が、概して使用される。これが、最も一般に使用されるギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティーは、当然に少ないギャップを有する最適化されたアラインメントを生成する。大部分のアラインメントプログラムは、ギャップペナルティーが修正されることを可能にしている。しかしながら、かかる配列比較ソフトウェアを使用する時にはデフォルト値を使用することが好ましい。例えば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージを使用する時、アミノ酸配列のデフォルトギャップペナルティーは、ギャップに関して−１２であり、かつ各伸長に関して−４である。

最大相同％の計算は、それ故にギャップペナルティーを考慮して、第１に最適なアラインメントの生成を必要とする。かかるアラインメントを実行するための適切なコンピュータプログラムは、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージである（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ；Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２：３８７）。配列比較を実行できる他のソフトウェアの例には、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，前掲を参照）、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４０３−４１０）及び比較ツールのＧＥＮＥＷＯＲＫＳスイートを含むが、それらに限定されない。ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡの両方は、オフライン及びオンライン調査で利用可能である（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，前掲、ｐａｇｅｓ ７−５８ ｔｏ ７６０を参照）。しかしながら、ＧＣＧ Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用することが好ましい。

最終相同％は、同一性に関して測定できるが、アラインメントプロセス自体は、概してオール・オア・ナッシングの対比較に基づかない。代わりに、化学的類似性又は進化距離に基づき、各一対比較にスコアを割り当てる、目盛り付きの類似性スコアマトリックスが一般的に使用される。一般に使用されるかかるマトリックスの例は、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス−プログラムのＢＬＡＳＴスイートのためのデフォルトマトリックスである。ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムは、一般デフォルト値、又は提供されるならばカスタム記号比較表を一般的に使用する（更なる詳細に関しては使用者マニュアルを参照）。ＧＣＧパッケージに関して一般デフォルト値を、又は他のソフトウェアの場合にはＢＬＯＳＵＭ６２のようなデフォルトマトリックスを使用することが好ましい。

一旦ソフトウェアが、最適なアラインメントを生成すると、相同％、好ましくは配列同一％を計算することが可能である。ソフトウェアは、概して配列比較の一部としてこれを行い、かつ数値結果を発生させる。

ＨＬＳ−５ポリペプチド相同体は、１つ以上のアミノ酸が、他のアミノ酸によって置換され、その置換が、分子の生物学的活性を実質的に変更しないアミノ酸配列を有するものを含む。

本発明によるＨＬＳ−５ポリペプチド相同体は、好ましくは配列番号４又は配列番号６に示されるヒトＨＬＳ−５ポリペプチドアミノ酸配列に対して８０％以上のアミノ酸配列同一性を有する。本発明の範囲内のＨＬＳ−５ポリペプチド相同体の例には、（ａ）１つ以上のアスパラギン酸残基がグルタミン酸によって置換される；（ｂ）１つ以上のイソロイシン残基が、ロイシンによって置換される；（ｃ）１つ以上グリシン、又はバリン残基が、アラニンによって置換される；（ｄ）１つ以上のアルギニン残基が、ヒスチジンによって置換される；又は（ｅ）１つ以上のチロシン、又はフェニルアラニン残基が、トリプトファンによって置換される、配列番号４又は配列番号６のアミノ酸配列を含む。

「タンパク質修飾又は機能的断片」は、それがＨＬＳ−５ポリペプチドを指す時に、用語「核内受容体変調剤」によって同様に包含される。一次構造配列に実質的に相同であるが、例えば生体内又は生体外化学及び生化学的修飾を含むか、又は異常アミノ酸を組み込む、ＨＬＳ−５ポリペプチド又はその断片。かかる修飾は、当業者により容易に認識されるように、例えば放射性ヌクレオチド及び種々の酵素修飾による、例えばアセチル化、カルボキシル化、リン酸化、グリコシル化、スモイル化、ユビキチン化、標識化を含む。

ＨＬＳ−５ポリペプチド「断片」、「部分」又は「セグメント」は、前記「断片」、「部分」又は「セグメント」が、野生型ＨＬＳ−５ポリペプチド全長と実質的に類似した機能を有する、少なくとも約５から７の隣接アミノ酸、多くの場合少なくとも約７から９の隣接アミノ酸、概して少なくとも約９から１３の隣接アミノ酸、かつ非常に好ましくは少なくとも約２０から３０以上の隣接アミノ酸のアミノ酸残基のストレッチである。

「実質的に類似した機能」は、野生型ＨＬＳ−５ポリペプチドに関するＨＬＳ−５のポリペプチド相同体、変異体、誘導体又は断片の機能を指す。ＨＬＳ−５の「断片」、「部分」又は「セグメント」は、核内受容体を変調する、すなわち核内受容体の活性を上方調節又は下方調節する能力を保持するべきである。

幾つかの実施態様において、「断片」、「部分」又は「セグメント」は、機能に対して重要であるとして他のタンパク質中で識別された１つ以上のドメインを含む。例えば、ＴＲＩＭモチーフのアミノ末端リング及びＢボックス成分を含む、ｈｕＴＲＩＭ５α中のＢ３０．２／ＳＰＲＹドメイン及び追加のドメインが、Ｎ−ＭＬＶ制限活性に必要とされることが示され、他方で介在コイルドコイルドメインが、ｈｕＴＲＩＭ５α多量体化に必要かつ十分である。Ｎ末端リング／Ｂボックス又はＣ末端のＢ３０．２／ＳＰＲＹドメインの一方又は両方を欠く、切断ｈｕＴＲＩＭ５αタンパク質は、ｈｕＴＲＩＭ５α全長とのヘテロマルチマーを形成し、かつそのＮ−ＭＬＶ制限活性の優位な阻害剤であり、非損傷のｈｕＴＲＩＭ５α単量体のホモ多量体化が、Ｎ−ＭＬＶ制限に必要なことを示唆している。しかしながら、大きな細胞質体中での局所化は、ｈｕＴＲＩＭ５αによるＮ−ＭＬＶの阻害、又はキメラ若しくはｒｈＴＲＩＭ５αによるＨＩＶ−１の阻害のために必要でない（Ｙａｐ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ，１５，７３−７８）。ジェミニン（Ｇｅｍｉｎｉｎ）は、Ｃｄｔ１と結合し、かつＳ期中にＭｃｍ２−７装填を阻害する細胞タンパク質である。それは、細胞周期当たり複数の複製サイクルを妨げ、かつエピソーム複製を妨げる。ジェミニンは、二量体界面中で非定型残基と、平行コイルドコイルホモダイマーを形成する。二量体化を中断させる点突然変異は、Ｃｄｔ１による相互作用及び複製の阻害を廃止する。この相互作用は複製阻害にとって必須である（Ｓａｘｅｎａ ｅｔ ａｌ．，２００４，ＭｏＩ Ｃｅｌｌ，１５，２４５−２５８）。従って、ＨＬＳ−５の機能的断片、部分又はセグメントが、以上に識別された領域の１つ以上を有する可能性が非常に高い。その上、これらの領域の活性を識別又はテストする、当該技術分野において周知の技術は、本発明のＨＬＳ−５断片、部分又はセグメントが、機能的であるならば、テスト又は識別するために使用できる。

機能の類似性に加えて、修飾されたポリペプチドは、長い半減期のような他の有用な特性を有することができる。

幾つかの実施態様において、ＨＬＳ−５断片は、ＨＬＳ−５のアイソフォームである。他のＴＲＩＭタンパク質のように、ＨＬＳ−５は、一群の３つの異なるＲＢＣＣ又はＴＲＩＭタンパク質モチーフ：すなわちシステインが豊富であり、かつ亜鉛を結合するリングモチーフ；同じく亜鉛を結合する１つ又は２つのいわゆるＢボックス；及びタンパク質複合体の形成におそらく関与するコイルドコイルドメインによって定義される。全ての個別のＴＲＩＭタンパク質のホモオリゴマー化及び若干は、他のＴＲＩＭタンパク質との連合（ａｌｌｉａｎｃｅ）も形成することがある（ヘテロオリゴマー化）。ヒトには、少なくとも３７のＴＲＩＭファミリーメンバーがある（Ｒｅｙｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｅｍｂｏ Ｊ，２０，２１４０−２１５１）。多くのＴＲＩＭファミリーメンバーは、交互スプライシングを有し、最も特徴付けされたメンバーは、ＴＲＩＭ３９（ＰＭＬ）（Ｄｕｐｒｅｚ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ，１１２，３８１−３９３）、ＴＲＩＭ１８（ＭＩＤＩ）（Ｂｅｒｔｉ ｅｔ ａｌ．，２００４，ＢＭＣ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，５，９）、ＴＲＩＭ３２（ＬＧＭＤ−２Ｈ）（Ｓｃｈｏｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ，５７，５９１−５９５）及びＴＲＩＭ５（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ，２８８，８４−９３）である。種々のＴＲＩＭタンパク質の各々は、細胞中の特定の区画に局所化するように見え、それらが、潜在的に異なるサブセットのタンパク質を引き込む異なるアイソフォームを有し、かつ代替機能を有する他のタンパク質を引き付ける離散的構造を形成する（Ｒｅｙｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，２００１、前掲）。以上に基づき、ＨＬＳ−５は、少なくとも１つのアイソフォームを有する。

配列番号６に示されるＨＬＳ−５アイソフォームは、配列番号４に示されるＨＬＳ−５と比較して、フレームシフト及び初期終止コドンをもたらすコード領域に代替エキソンを含む。配列番号６のアイソフォームは、短く、かつ配列番号４中のＨＬＳ−５と比較して明白なＣ末端を有する。

幾つかの実施態様において、ＨＬＳ−５核内受容体変調剤は、それらがタンパク質分解等に抵抗する又はより耐性を持つように修飾されたＨＬＳ−５の（ペプチド模倣薬を含む）ペプチジル化合物である。これらのペプチジル化合物は、必要に応じてセリン、システイン又はアスパラギン酸塩タイプのプロテアーゼの阻害を促進する切断可能なペプチド結合の例えば代わりに官能基を含むことがある。例えば、ＨＬＳ−５ペプチジル化合物は、ペプチジルジケトン又はペプチジルケトエステル、ペプチドハロアルキルケトン、ペプチドスルホニルフルオリド、ペプチジルボロナート、ペプチドエポキシド、ペプチジルジアゾメタン、ペプチジルホスホナート、イソクマリン、ベンゾオキサジン−４−オン、カルバミン酸塩、イソシアン酸塩、イサト酸無水物等であっても良い。かかる官能基は、他のペプチド分子中で提供され、かつその合成の一般的経路は、知られている。例えば、Ａｎｇｅｌａｓｔｒｏ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．３３：１１−１３；Ｂｅｙ ｅｔ ａｌ．，ＥＰＯ３６３２８４；Ｂｅｙ ｅｔ ａｌ．，ＥＰＯ３６４３４４；Ｇｒｕｂｂ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ８８／１０２６６；Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，ＥＰＯ３９３４５７；Ｅｗｏｌｄｔ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２９（６）：７１３−７２１；Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５（６）：１１２１−１１２９；Ｖｌａｓａｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６３（５）：２０５６−２０６２；Ｈｕｄｉｇ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（４）：１３６０−１３６８；Ｏｄａｋｃ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０（８）：２２１７−２２２７；Ｖｉｊａｙａｌａｋｓｈｍｉ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０（８）：２１７５−２１８３；Ｋａｍ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ＆ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ，６４（１）：１３３−１３７；Ｐｏｗｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３９（１）：３３−４６；Ｐｏｗｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，Ｂａｒｒｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ｐｐ．５５−１５２（１９８６）；Ｐｏｗｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２９（１２）：３１０８−３１１８；Ｏｗｅｉｄａ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５８（２）：３９１−３９７；Ｈｕｄｉｇ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２６（８）：７９３−７９８；Ｏｒｌｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，２６９（１）：１２５−１３６；Ｚｕｎｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ．，９６７（３）：３３１−３４０；Ｋａｍ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７（７）：２５４７−２５５７；Ｐａｒｋｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．，２３０：５０９−５１６；Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５６：１９２３−１９２８；Ａｎｇｌｉｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２４１：８７１−８７５；Ｐｕｒｉ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２７：３４６−３５８；Ｈａｎａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：Ｍｅｄｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ，Ｋａｔｕｎｕｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ ｐｐ．２５−３６（１９８３）；Ｋａｊｉｗａｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．，１５：９３５−９４４；Ｒａｏ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．，４７：６３５−６３７；Ｔｓｕｊｉｎａｋａ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５３：１２０１−１２０８）を参照。米国特許第４９３５４９３号；米国特許第５４６２９２８号；米国特許第５５４３３９６号；米国特許第５２９６６０４号；及び米国特許第６２０１１３２号も参照。

他の実施態様において、ＨＬＳ−５ポリペプチドは、例えば本明細書に記載されたような薬剤スクリーニングアッセイによって識別できる非ペプチジル化合物である。これらの非ペプチジル化合物は、単に例証のためであるが、合成有機物、天然生成物、核酸又は炭水化物であっても良い。

オレフィン、ホスホナート、アザアミノ酸類似体等のようなペプチド模倣薬も含まれる。

環状ジペプチド類似体、及びアセタール、ヘミアセタール、ケタール及びヘミケタールを含むカルボニル同等物、及びボロン酸エステル及びハロゲン化物を含む上述のＨＬＳ−５化合物のいずれかに加水分解的に変換できるいずれかのＨＬＳ−５を主成分とする化合物も同等物とみなされる。

本発明は、例えば無毒性有機、又は無機酸からの化合物の従来の無毒性塩、又は第四級アンモニウム塩を含む、ＨＬＳ−５化合物の医薬上許容し得る塩も包含する。例えば、かかる従来の無毒性塩には、塩酸塩、臭化水素酸、硫酸、スルホン酸、リン酸、硝酸等のような無機酸から誘導されるもの；及び酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パルミチン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル（ｓａｌｉｃｙｃｌｉｃ）酸、スルファニル酸、２−アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタン二スルホン酸、シュウ酸、イソチオン酸等のような有機酸から調製された塩を含む。

本発明の医薬上許容し得る塩は、従来の化学的方法によって塩基又は酸性部分を含むＨＬＳ−５化合物から合成できる。一般的に、塩は、適切な溶剤中で遊離塩基又は酸を、化学量論量の、又は過剰の所望の塩形成無機又は有機酸又は塩基と反応させることによって調製される。

上記ＨＬＳ−５化合物の予期される同等物には、さもなければそれに相当し、かつその同じ一般的特性（例えばスモイル化を制御する能力）を有する化合物であって、予期される方法に使用中のＨＬＳ−５分子の有効性に悪影響を及ぼさない置換基の１つ以上の単純な変異が作られる化合物を含む。一般的に、本発明のＨＬＳ−５ポリペプチドは、容易に入手可能な出発原料、試薬及び従来の合成手順を使用して、下記の方法、又はその修正によって調製できる。これらの反応において、それ自体が公知であるが、本明細書に言及されない変異体を使用することも可能である。

用語「アミノ酸残基」及び「ペプチド残基」により、そのカルボキシル基の−ＯＨのないアミノ酸又はペプチド分子が意味される。一般的に、アミノ酸及び保護基を指し示すために本明細書で使用される略語は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅの勧奨に基づく（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７２）１１：１７２６−１７３２を参照）。例えばＭｅｔ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｌａ及びＧｌｙは、それぞれメチオニン、イソロイシン、ロイシン、アラニン及びグリシンの「残基」を表す。残基により、カルボキシル基のＯＨ部分、及びαアミノ基のＨ部分を取り除くことにより対応するαアミノ酸から誘導される基が意味される。用語「アミノ酸側鎖」は、Ｋｏｐｐｌｅ，１９６６，「Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ」，ＷＡ Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＆ Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ｐｐ ２ ａｎｄ ３３によって定義されたような、−ＣＨ（ＮＨ_２）ＣＯＯＨ部分を除くアミノ酸のその部分である；共通アミノ酸のかかる側鎖の例は、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＳＣＨ_３（メチオニンの側鎖）、−ＣＨ_２（ＣＨ_３）−ＣＨ_２ＣＨ_３（イソロイシンの側鎖）、−ＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３）_２（ロイシンの側鎖）、又はＨ−（グリシンの側鎖）である。

大部分において、本発明の出願に使用されるアミノ酸は、タンパク質中に見出される自然発生アミノ酸であるか、又はアミノ及びカルボキシル基を含むかかるアミノ酸の自然発生の同化又は異化生成物である。

用語「アミノ酸残基」は、本明細書に参照されたいずれかの特定のアミノ酸の類似体、誘導体及び同族体、並びに（例えばＮ末端又はＣ末端保護基によって修飾された）Ｃ末端又はＮ末端保護されたアミノ酸誘導体を更に含む。例えば、本発明は、環化のためのカルボキシル、アミノ又は他の反応前駆体官能基をなおも提供しながら、側鎖が、延長又は短縮される、アミノ酸類似体、並びに適切な官能基を有する変異側鎖を有するアミノ酸類似体の使用を予期する。例えばＨＬＳ−５ポリペプチドは、例えばシアノアラニン、カナバニン、ジェンコール酸、ノルロイシン、３−ホスホセリン、ホモセリン、ジヒドロキシフェニルアラニン、５−ヒドロキシトリプトファン、１−メチルヒスチジン、３−メチルヒスチジン、ジアミノピメリン酸（ｄｉａｍｉｎｉｏｐｉｍｅｌｉｃ ａｃｉｄ）、オルニチン又はジアミノ酪酸のようなアミノ酸類似体を含むことができる。本明細書において適切な、側鎖を有する他の自然発生アミノ酸代謝物又は前駆体は、当業者によって認識され、かつ本発明の範囲に含まれる。

アミノ酸の構造に立体異性体の余地がある時、かかるアミノ酸の（Ｄ）及び（Ｌ）立体異性体も含まれる。本明細書におけるアミノ酸及びアミノ酸残基の形態は、適切な記号（Ｄ）、（Ｌ）又は（ＤＬ）によって指し示され、更に形態が指し示されない時、アミノ酸又は残基は、（Ｄ）、（Ｌ）又は（ＤＬ）の形態を有し得る。本発明の化合物の幾つかの構造は、不斉炭素原子を含むことが注目される。従って、かかる不斉性から生じる異性体は、本発明の範囲内に含まれることが理解されるべきである。かかる異性体は、古典的な分離技術によって、かつ立体的に制御された合成によって実質的に純粋な形状で得ることができる。本出願のために、明示的に反対の言及をしない限り、指名されたアミノ酸は、（Ｄ）又は（Ｌ）立体異性体の両方を含むと解釈されるべきである。

本明細書で使用されるような語句「保護基」は、反応性官能基を、望ましくない化学反応から保護する置換基を意味する。かかる保護基の例には、カルボン酸及びボロン酸のエステル、アルコールのエーテル並びにアルデヒド及びケトンのアセタール及びケタールを含む。例えば、本明細書で使用されるような語句「Ｎ末端保護基」又は「アミノ保護基」は、合成手順中の望ましくない反応からアミノ酸又はペプチドのＮ末端基を保護するために用いることができる種々のアミノ保護基を指す。適切な基の例には、例証のために、ホルミル、ダンシル、アセチル、ベンゾイル、トリフルオロアセチル、スクシニル及びメトキシスクシニルのようなアシル保護基；例えばベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）のような芳香族ウレタン保護基；及びｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）又は９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）のような脂肪族ウレタン保護基を含む。

本発明のある種のポリペプチドは、特に幾何学的又は立体異性的形状で存在できる。本発明は、本発明の範囲に入るようなシス及びトランス異性体、Ｒ及びＳエナンチオマー、ジアステレオマー、（Ｄ）異性体、（Ｌ）異性体、そのラセミ混合物、及び他のその混合物を含む全てのかかる形状を予期する。追加不斉炭素原子は、アルキル基のような置換基中に存在しても良い。全てのかかる異性体、並びにその混合物は、本発明に含まれることが意図される。

修飾されたＨＬＳ−５ポリペプチドの機能（活性）の類似性は、野生型ＨＬＳ−５ポリペプチドの活性と実質的に同じであっても良い。あるいは、修飾されたポリペプチドの機能（活性）の類似性は、野生型ＨＬＳ−５ポリペプチドの活性より高くても良い。野生型に対する相同体、変異体、誘導体又は断片の機能／生物学的活性は、例えば生物学的アッセイによって決定できる。例えば、前掲で記載したように、核内受容体と相互に作用する能力に関するＨＬＳ−５修飾への効果を監視するために利用できる、多数の生体外及び生体内アッセイがある。

修飾されたポリペプチドは、従来の技術を使用して合成できるか、又は修飾された核酸によってコードされ、かつ従来の技術を使用して生成される。修飾された核酸は、従来の技術によって調製される。野生型ＨＬＳ−５遺伝子機能と実質的に類似する機能を有する核酸は、上記の修飾されたタンパク質を生成する。

実質的に全長のポリペプチドに加えて、本発明は、ポリペプチドの生物学的に活性な断片を提供する。生物学的に活性な断片は、核内受容体変調活性を保持するポリペプチド断片である。

本発明は、ＨＬＳ−５ポリペプチド及び断片を含む融合ポリペプチドも提供する。相同ポリペプチドは、２つ以上のＨＬＳ−５ポリペプチド配列間、又はＨＬＳ−５及び関連タンパク質の配列間の融合であっても良い。同様に、誘導タンパク質の特性又は活性の組み合わせを示すであろう異種融合が、構築され得る。

例えば、リガンド結合又は他のドメインは、異なる新規な融合ポリペプチド又は断片の間で「交換され」得る。かかる相同又は異種融合ポリペプチドは、例えば、変更された強度又は結合特異性を示すことがある。融合パートナーには、免疫グロブリン、細菌性βガラクトシダーゼ、ｔｒｐＥ、Ａタンパク質、β−ラクタマーゼ、アルファアミラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ及び酵母アルファ接合因子を含む。

融合タンパク質は、概して下記のような組み換え核酸方法によって作られるか、又は化学合成され得る。

「タンパク質精製」は、ＨＬＳ−５をコードする組み換え核酸によって形質転換された細胞からのような、他の生物学的材料からのＨＬＳ−５ポリペプチドの単離のための種々の方法を指し、かつ当該技術分野において周知である。例えば、かかるポリペプチドは、例えば本発明によって提供される抗体を用いる免疫アフィニティークロマトグラフィによって精製できる。タンパク質精製の種々の方法が、当該技術分野において周知である。

用語「単離された」、「実質的に純粋な」及び「実質的に均質の」は、その自然の状態でそれを伴う成分から分離されたＨＬＳ−５ポリペプチドを記載するために同じ意味で使用される。単量体タンパク質は、少なくとも約６０から７５％の試料が単一のポリペプチド配列を示す時に実質的に精製される。実質的に精製されたタンパク質は、概して約６０から９０％Ｗ／Ｗのタンパク質試料、大抵は約９５％を含み、かつ好ましくは約９９％純粋を超える。タンパク質純度又は均質性は、タンパク質試料のポリアクリルアミドゲル電気泳動、それに続くゲル染色後の、単一のポリペプチド帯の視覚化のような、当該技術分野において周知の多数の手段によって示すことができる。ある種の目的で、ＨＰＬＣ、又は適用のために利用される当該技術分野において周知の他の手段を使用することによって、高い解像度が提供できる。

ＨＬＳ−５ポリペプチドは、その自然の状態でそれを伴う天然汚染物質から分離される時、自然結合された成分が実質的にない。

従って、化学合成された、又はそれが自然発生する細胞と異なる細胞系中で合成されたＨＬＳ−５ポリペプチドは、その自然結合された成分を実質的に含まない。タンパク質は、当該技術分野において周知のタンパク質精製技術を使用して、単離によって自然結合された成分が実質的にないようにされ得る。

単離及び操作された遺伝配列の発現生成物として精製されるＨＬＳ−５ポリペプチドは、相同細胞型中で発現されたとしても、本明細書で使用されるような、「単離ポリペプチド」である。異種細胞によって発現される、合成で作られた形状又は分子は、本質的に単離された分子である。

本発明の幾つかの実施態様において、用語「ＨＬＳ−５タンパク質」又は「ＨＬＳ−５ポリペプチド」は、ＨＬＳ−５ポリヌクレオチド配列、変異体又はその機能的断片によってコードされるタンパク質又はポリペプチドを指す。ポリヌクレオチドをコードするＨＬＳ−５に高い厳密な条件でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるＨＬＳ−５ポリペプチド及びＨＬＳ−５タンパク質に抗血清によって回収される密接に関係したポリペプチドも含まれる。従って幾つかの実施態様において、用語「核内受容体変調剤」は、ＨＬＳ−５ポリペプチド、対立遺伝子変異体、又はその機能的断片を含む類似体をコードするＨＬＳ−５ポリヌクレオチド分子を含む。

本発明による好ましいポリヌクレオチド分子には、配列番号１及び配列番号３に示されたポリヌクレオチド配列又はその機能的断片を含む。

ポリヌクレオチドは、その自然状態で又は当業者に周知の方法によって操作された時に、それがＲＮＡ及び／又はポリペプチド又はその断片を生成するために転写及び／又は翻訳され得るならば、ポリペプチドを「コードする」と言われる。アンチセンス鎖は、かかる核酸の補体であり、かつコード化配列は、そこから推測できる。

「単離された」又は「実質的に純粋な」核酸（例えばＲＮＡ、ＤＮＡ又は混合重合体）は、天然ヒト配列又はタンパク質、例えばリボソーム、ポリメラーゼ、多くの他のヒトゲノム配列及びタンパク質を自然に伴う他の細胞成分から実質的に分離されたものである。用語は、その自然発生する環境から除去された核酸配列又はタンパク質を包含し、かつ組み換え又はクローン化ＤＮＡ単離物、及び化学合成された類似体又は異種系によって生物学的に合成された類似体を含む。

「ＨＬＳ−５遺伝子配列」、「ＨＬＳ−５遺伝子」、「ＨＬＳ−５核酸」又は「ＨＬＳ−５ポリヌクレオチド」は、コード配列、介在配列、並びに転写及び／又は翻訳を制御する調節要素を含む。用語「ＨＬＳ−５遺伝子配列」は、ＤＮＡ配列の全ての対立遺伝子変異体を含むことが意図される。

これらの用語は、核酸に適用される時、例えばタンパク質融合又は欠失を含む、ＨＬＳ−５ポリペプチド、断片、相同体又は変異体をコードする核酸を指す。本発明の核酸は、天然ＨＬＳ−５コード化遺伝子、又は天然ＨＬＳ−５コード化遺伝子と実質的な相同性を有するもの、又はその一部から誘導されたか、又はそれに実質的に類似する配列を持つ。マウスＨＬＳ−５ポリペプチドのコード配列は、配列番号１に示され、アミノ酸配列が、配列番号２に示される。ヒトＨＬＳ−５ポリペプチドのコード配列は、配列番号３及び配列番号７に示され、アミノ酸配列が、配列番号４及び配列番号８に示される。

核酸又はその断片は、他の核酸（又はその相補鎖）と、（適切なヌクレオチド挿入又は欠失によって）最適に整列された時、少なくとも約６０％のヌクレオチド塩基、通常少なくとも約７０％、大抵少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、かつ更に好ましくは少なくとも約９５−９８％のヌクレオチド塩基にヌクレオチド配列同一性があるならば、他方に対して「実質的に相同である」（又は「実質的に類似する」）。

あるいは、実質的な相同性又は（同一性）は、鎖又はその補体への選択的ハイブリダイゼーション条件で、核酸又はその断片が、他の核酸（又はその相補鎖）にハイブリダイズする時に存在する。ハイブリダイゼーションの選択性は、特異性の全体的欠落よりも実質的に選択的なハイブリダイゼーションが発生する時に存在する。概して、選択的ハイブリダイゼーションは、少なくとも約１４のヌクレオチドのストレッチにわたって少なくとも約５５％、好ましくは少なくとも約６５％、更に好ましくは少なくとも約７５％、かつ非常に好ましくは少なくとも約９０％の同一性がある時に発生する。記載されたような相同性比較の長さは、長いストレッチにわたっていても良く、かつある種の実施態様において、多くの場合少なくとも約９のヌクレオチド、通常少なくとも約２０のヌクレオチド、大抵少なくとも約２４のヌクレオチド、概して少なくとも約２８のヌクレオチド、大概少なくとも約３２のヌクレオチド、かつ好ましくは少なくとも約３６以上のヌクレオチドのストレッチにわたる。

従って、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書の配列表に示された配列に対して、好ましくは少なくとも７５％、更に好ましくは少なくとも８５％、更に好ましくは少なくとも９０％の相同性を有する。更に好ましくは、少なくとも９５％、更に好ましくは少なくとも９８％の相同性がある。ヌクレオチド相同性比較は、ポリペプチドに関して下記のように行うことができる。好ましい配列比較プログラムは、下記のＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔ ｆｉｔプログラムである。デフォルトスコアリングマトリックスは、各同一のヌクレオチドに関して１０、かつ各ミスマッチに関して−９のマッチ値を有する。デフォルトギャップ作成ペナルティーは、−５０であり、かつデフォルトギャップ伸長ペナルティーは、各ヌクレオチドに関して−３である。

本発明の文脈において、相同配列は、配列番号１又は配列番号３に示されたヌクレオチド配列と、少なくとも２０、５０、１００、２００、３００、５００又は１０００のヌクレオチドにわたるアミノ酸レベルで、少なくとも６０、７０、８０、又は９０％同一、好ましくは少なくとも９５又は９８％同一であるヌクレオチド配列を含むように解釈される。特に、相同性は、非必須近接配列よりもむしろ、タンパク質の機能に必須であることが知られている、隣接アミノ酸配列をコードする配列の領域に対して概して考慮されるべきである。それ故に、例えば相同性比較は、好ましくは配列番号２、配列番号４又は配列番号８に示されたＨＬＳ−５アミノ酸配列のリングフィンガー、Ｂボックス、コイルドコイル及び／又はＳＰＲＹドメインに対応する領域にわたってなされる。

本発明の好ましいポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１１１から１５２、２１９から２６６若しくは３６８から５０７をコードする配列番号１のヌクレオチド配列、又は配列番号３中の同等のヌクレオチド配列の１つ以上に対して５０、６０又は７０％を超える相同性、更に好ましくは８０、９０、９５又は９７％を超える相同性を有する隣接配列を含む。

好ましいポリヌクレオチドは、配列番号２のアミノ酸３６から７５をコードする配列番号１の配列、又は配列番号３の対応ヌクレオチド配列に対して８０、９０、９５又は９７％を超える相同性を有する隣接配列を代わりに、又は追加で含むことができる。他の好ましいポリヌクレオチドは、配列番号２のアミノ酸１から３５、７６から１１０、１５３から２１８及び／又は２６７から３６７をコードする配列番号１の配列、又は配列番号３の対応ヌクレオチド配列に対して４０、５０、６０又は７０％を超える相同性、更に好ましくは８０、９０、９５又は９７％を超える相同性を有する隣接配列を含む。

ヌクレオチド配列は、好ましくは長さが少なくとも１５のヌクレオチドであり、更に好ましくは長さが少なくとも２０、３０、４０、５０、１００又は２００のヌクレオチドである。

一般的にポリヌクレオチドの長さが短いほど、選択的ハイブリダイゼーションを得るために必要とされる相同性が、大きくなる。従って、本発明のポリヌクレオチドが、約３０未満のヌクレオチドからなる場合、同一％が、本明細書の配列表に示されたＨＬＳ−５ヌクレオチド配列と比較して、７５％より高く、好ましくは９０％又は９５％より高いことが好ましい。

反対に本発明のポリヌクレオチドが、例えば５０又は１００を超えるヌクレオチドからなる場合、本明細書の配列表に示されたＨＬＳ−５ヌクレオチド配列と比較した同一％は、低く、例えば５０％超、好ましくは６０又は７５％超である。

核酸ハイブリダイゼーションは、当業者によって容易に認識されるように、塩基組成、相補鎖の長さ、及びハイブリダイズする核酸の間のヌクレオチド塩基ミスマッチ数に加えて、塩濃度、温度、又は有機溶剤のような条件によって影響を及ぼされる。厳密な温度条件は、一般的に３０℃を超える、概して３７℃を超える、かつ好ましくは４５℃を超える温度を含む。厳密な塩条件は、通常１０００ｍＭ未満、概して５００ｍＭ未満、かつ好ましくは２００ｍＭ未満である。しかしながら、パラメータの組み合わせは、いかなる単一のパラメータの測定よりも遙かに重要である。厳密なハイブリダイゼーション条件の例は、６５℃及び０．１×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）である。

本発明の「ポリヌクレオチド」組成物は、当業者によって容易に認識されるように、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成型、及び混合重合体、センス及びアンチセンス両方の鎖を含み、かつ化学的又は生化学的に修飾されても良いか、又は非自然の、若しくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むことができる。かかる修飾には、例えば、標識、メチル化、類似体による、自然発生ヌクレオチドの１つ以上の置換、非荷電結合（例えばメチルホスホネート、リン酸トリエステル、ホスホアミダート、カルバメート等）、荷電結合（例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）、懸垂部分（例えばポリペプチド）、挿入剤（例えばアクリジン、ソラレン等）、キレート化剤、アルキル剤及び修飾結合（例えばアルファアノマー核酸等）のようなヌクレオチド間（ｉｎｔｅｒｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）修飾を含む。同様に、水素結合及び他の化学相互作用を介して指定された配列に結合するそれらの能力においてポリヌクレオチドを模倣する合成分子も含まれる。

かかる分子は、当該技術分野において公知であり、かつ例えばポリペプチド結合が分子の主鎖中でリン酸塩結合に置き換わるものを含む。本発明は、ＨＬＳ−５領域の全部または一部を含む組み換え核酸を提供する。組み換え構成は、宿主細胞中で自律的に複製することが可能であっても良い。あるいは、組み換え構成は、宿主細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれるようになっても良い。かかる組み換えポリヌクレオチドは、ゲノム、ｃＤＮＡ、半合成又は合成由来のポリヌクレオチドを含み、それは、その由来又は操作のために、１）それが事実上、結合されるポリヌクレオチドの全部又は一部と結合されない；２）それが事実上連結されるもの以外のポリヌクレオチドに連結される；又は３）事実上起こらない。

それ故に、さもなければ自然発生しない配列を含む組み換え核酸が、本発明により提供される。野生型配列を用いることができるが、それは、例えば欠失、置換、又は挿入により多くの場合変更される。

「組み換え核酸」は、自然発生しないか、又は配列の、２つのさもなければ分離したセグメントの人工的な組み合わせによって作られる核酸である。この人工的な組み合わせは、多くの場合化学合成手段か、又は遺伝子工学技術による核酸の単離セグメントの人工操作によって達成される。そのようなことは、概して配列認識部位を導入又は除去しながら、同じ又は保存アミノ酸をコードする冗長コドンと、コドンを置き換えるために、通常行われる。あるいは、機能の所望の組み合わせを発生させるために、所望の機能の核酸セグメントを一緒に繋ぐことが実行される。種々のタイプのｃＤＮＡ又はゲノムライブラリは、本発明の核酸の天然源としてスクリーニングできるか、又はかかる核酸は、例えばＰＣＲによってゲノムＤＮＡ又は他の天然源中に常在する配列の増幅によって提供できる。ｃＤＮＡライブラリの選択は、通常所望のタンパク質に関してｍＲＮＡ中に豊富である組織源に対応する。ファージライブラリが、通常好ましいが、他のタイプのライブラリが使用できる。ライブラリのクローンは、プレートに広げられ、スクリーニングのために基質に移され、変性させられ、かつ所望の配列の存在に関して探査される。

本発明で使用される核酸配列は、通常少なくとも約５のコドン（１５のヌクレオチド）、大抵少なくとも約７−１５のコドン、かつ非常に好ましくは少なくとも約３５のコドンを含む。このヌクレオチド数は、通常、本明細書に記載されるような核内受容体修飾がなおも可能な成功したＨＬＳ−５断片に必要とされるほぼ最小の長さである。

核酸操作の技術は、一般的に例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，前掲、又はＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙに記載されている。制限酵素等のような、かかる技術の適用に有用な試薬は、当該技術分野において広く知られており、かつＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ、ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒのような販売者及び多数の他のソースから市販されている。本発明の融合タンパク質を生成するために使用される組み換え核酸配列は、天然又は合成配列から誘導できる。多くの天然遺伝子配列は、適切なプローブを使用して、種々のｃＤＮＡ又はゲノムライブラリから得ることができる。ＧｅｎＢａｎｋ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈを参照。

本明細書で使用されるような、用語「ＨＬＳ−５遺伝子配列」は、遺伝子配列又は領域を含む二本鎖ＤＮＡ、並びに遺伝子配列又は領域を含む一本鎖ＤＮＡのいずれかを指す（すなわちコード又は非コード鎖）。

本明細書で使用されるような、ＨＬＳ−５遺伝子配列又は領域の「一部」は、少なくとも約８のヌクレオチド、又は好ましくは約１５のヌクレオチド、又は更に好ましくは少なくとも約２５のヌクレオチドの最小寸法を有するとして定義され、かつ少なくとも約４０のヌクレオチドの最小寸法を有することができる。

ＨＬＳ−５ポリペプチド又はその断片は、いかなる公知の分子技術を介しても得ることができる。ＰＣＲは、ＨＬＳ−５遺伝子配列を得るために使用できる、１つのかかる技術である。この技術は、メッセンジャーＲＮＡを含む、ＤＮＡ又はＲＮＡを例えば増幅でき、ＤＮＡ又はＲＮＡが、一本鎖又は二本鎖であっても良い。ＲＮＡが、鋳型として使用されるべき場合、ＤＮＡへの鋳型の転写を逆転させるために最適の酵素及び／又は条件が、利用できる。その上、各々の一本鎖を含むＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドが利用できる。核酸の混合物も、用いることができるか、又は同じ又は異なるプライマーを使用する、本明細書に記載された以前の増幅反応において生成された核酸が、このように利用できる。

増幅されるべき特定の核酸配列、すなわちＨＬＳ−５遺伝子配列は、大きな分子の断片であっても良いか、又は離散分子として当初存在でき、その結果特定の配列が、核酸全体を構成する。増幅されるべき配列が、純粋な形状で当初存在することは、必要でない；それは、完全なヒトＤＮＡに含まれるような、複雑な混合物の小さい断片であっても良い。

本明細書で利用されるＤＮＡは、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．１９８２、前掲によって記載されたような種々の技術によって血液、組織材料等のような身体試料から抽出できる。抽出された試料が、精製されなかったならば、試料の細胞、又は動物細胞膜を開放し、かつ核酸の鎖を露出及び／又は分離するために有効な試料の量によって増幅前に処理できる。鎖を露出及び分離するためのこの溶解及び核酸変性ステップは、増幅が、遙かに容易に起こることを可能にする。

デオキシリボヌクレオチド三リン酸ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰは、別個に、又はプライマーと一緒に合成混合物に添加される；適切な量で、かつ結果として生じた溶液は、約１から１０分間、好ましくは１から４分間、約９０°−１００℃に加熱される。この加熱期間後、溶液は、冷却することが可能にされ、それはプライマーのハイブリダイゼーションに好ましい。冷却混合物に、プライマー伸長反応を行うために適切な作用物質（本明細書では「重合剤」と呼ばれる）が、添加され、かつ反応は、当該技術分野において公知の条件で起こることが可能にされる。重合剤は、耐熱性であるならば、他の試薬と一緒にも添加できる。この合成（又は増幅）反応は、それを超えると重合剤がもはや機能しない温度までの室温で起こり得る。

従って、例えばＤＮＡポリメラーゼが、作用物質として使用されるならば、温度は、一般的に約４０℃以下である。非常に好都合には、反応は、室温で起こる。

重合剤は、酵素を含むプライマー伸長生成物の合成を達成するために機能するいかなる化合物又はシステムであっても良い。

この目的に適した酵素には、例えば大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片、ポリメラーゼ突然変異タンパク質、逆転写酵素、耐熱酵素を含む他の酵素（すなわち変性を引き起こすために十分上昇した温度を受けた後に、プライマー伸長を実行する酵素）、例えばＴａｑポリメラーゼを含む。適切な酵素は、各ＨＬＳ−５遺伝子配列核酸鎖に相補的であるプライマー伸長生成物を形成するために適切にヌクレオチドの組み合わせを促進する。一般的に、合成は、各プライマーの３’末端で開始され、かつ合成が終了するまで鋳型鎖に沿って５’方向に進み、異なる長さの分子を生成する。

新規に合成されたＨＬＳ−５鎖及びその相補的核酸鎖は、上記ハイブリダイズ条件で二重鎖分子を形成し、かつこのハイブリッドは、プロセスのその後のステップにおいて使用される。次のステップにおいて、新規に合成されたＨＬＳ−５の二重鎖分子は、一本鎖分子を提供するために、上記手順のいずれかを使用する変性条件を受ける。

変性、アニーリング及び伸長生成物合成のステップは、検出に必要な範囲で、標的多型遺伝子配列核酸配列を増幅するために必要な回数だけ反復できる。生成される特定の核酸配列量は、指数関数的に蓄積される。増幅は、「ＰＣＲ．Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」，ＩＬＲ Ｐｒｅｓｓ，Ｅｄｓ．ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２に記載される。

本発明の方法によって増幅される配列は、ＰＣＲ、オリゴマー制限（Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３：１００８−１０１２）、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）プローブ分析（Ｃｏｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８０：２７８）、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）（Ｌａｎｄｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：１００７）等のような特定のＤＮＡ配列の検出に通常使用されるいかなる方法によっても、溶液中で、又は固体担体に結合した後に評価、検出、クローン化、配列決定等が更にできる。ＤＮＡ分析のための分子技術は、総評された（Ｌａｎｄｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：２２９−２３７）。

本発明のＨＬＳ−５ポリペプチドを得る方法は、本明細書に記載されたような、かつ当業者によって一般に使用されるようなＰＣＲを含む。代替的増幅方法が、記載され、かつ本発明のプライマーを使用するＰＣＲによって増幅されたＨＬＳ−５遺伝子配列が、代替手段によって同様に増幅される限りにおいて同様に用いることができる。かかる代替的増幅システムには、興味の対象である短いＲＮＡ配列から始まる、自律的配列複製、及びＴ７プロモーターを含むが、それらに限定されない。逆転写酵素はｃＤＮＡにＲＮＡを複写し、かつＲＮＡを分解させ、その後にＤＮＡの第２鎖を重合する逆転写酵素が続く。他の核酸増幅技術は、逆転写及びＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用する核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）であり、かつその循環スキームを標的とするための２つのプライマーを組み込む。ＮＡＳＢＡは、ＤＮＡ又はＲＮＡから開始でき、かついずれで終了でき、かつ６０から９０分以内に１０８のコピーに増幅できる。

あるいは、ＨＬＳ−５ポリヌクレオチドは、ライゲーション活性化転写（ＬＡＴ）によって増幅できる。ＬＡＴは、部分的に一本鎖であり、かつ部分的に二本鎖である、単一のプライマーを有する一本鎖鋳型から機能する。増幅は、プロモーターオリゴヌクレオチドにｃＤＮＡを結紮することによって開始され、かつ数時間以内で増幅は１０８から１０９倍である。ＱＢレプリカーゼシステムは、ＭＤＶ−１と呼ばれるＲＮＡ配列を、興味の対象であるＤＮＡ配列に相補的なＲＮＡに取り付けることによって利用できる。試料と混合した後、ハイブリッドＲＮＡは、標本のｍＲＮＡ中でその補体を発見し、かつ結合し、興味の対象である付随（ｔａｇ−ａｌｏｎｇ）配列を複写するために、レプリカーゼを活性化する。もう１つの核酸増幅技術、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）は、試料中の隣接配列の存在下でリガーゼによって共有結合される、興味の対象である配列の２つの異なる標識を付された半分を使用して機能し、新規標的を形成する。修復連鎖反応（ＲＣＲ）核酸増幅技術は、２つの相補的、かつ標的特異的オリゴヌクレオチドプローブ対、耐熱性ポリメラーゼ及びリガーゼ、並びにＤＮＡヌクレオチドを使用して、標的配列を幾何学的に増幅する。２塩基ギャップは、オリゴヌクレオチドプローブ対を分離し、かつＲＣＲは、ギャップを充填及び接合し、かつ正常なＤＮＡ修復を模倣する。鎖置換活性化（ＳＤＡ）による核酸増幅は、標的ＤＮＡに結合する５’末端に短いオーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を有するＨｉｎｃ ＩＩの認識部位を含む短いプライマーを利用する。ＤＮＡポリメラーゼは、硫黄含有アデニン類似体を有するオーバーハングの反対側にプライマーの一部を充填する。Ｈｉｎｃ ＩＩは、添加されるが、未修飾ＤＮＡ鎖を切断するのみである。５’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＤＮＡポリメラーゼは、切れ目の部位に入り、かつ重合を開始し、初期プライマー鎖を下流に移動させ、かつ更なるプライマーとして役立つ新規のものを構築する。ＳＤＡは、２時間、３７℃で１０７倍を超える増幅を生成する。ＰＣＲ及びＬＣＲと異なり、ＳＤＡは、機器を備えた（ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｅｄ）温度サイクルを必要としない。本発明の方法において有用なもう１つの増幅システムは、ＱＢレプリカーゼシステムである。ＰＣＲは、本発明ならば好ましい増幅方法であるが、これら他の方法が本発明の方法に記載されたようなＨＬＳ−５遺伝子配列を増幅するためにも使用できる。

大量の、本発明のＨＬＳ−５ポリヌクレオチドが、適切な宿主細胞中の複製によっても生成できる。所望の断片をコードする天然又は合成ポリヌクレオチド断片は、原核又は真核細胞への導入及びその中での複製が可能な、組み換えポリヌクレオチド構成、通常ＤＮＡ構成に組み込まれる。通常ポリヌクレオチド構成は、酵母又は細菌のような単細胞宿主中の複製に適するが、（ゲノム内への組み込み有り及び無しで）培養された哺乳類又は植物又は他の真核細胞株への導入も対象とできる。

二本鎖断片は、相補鎖を合成し、かつ適切な条件下で鎖を一緒にアニーリングすることによるか、又は適切なプライマー配列を有するＤＮＡポリメラーゼを使用して、相補鎖を添加することによって、化学合成の一本鎖生成物から得ることができる。

本発明のＨＬＳ−５ポリヌクレオチドは、原核生物又は真核生物宿主に導入するために、組み換え複製可能ベクターに組み込むことができる。かかるベクターは、所望のポリペプチドをコードする意図されたポリヌクレオチド断片を含む、宿主によって認識される複製システムを概して含むことができ、かつポリペプチドコード化セグメントに操作可能に連結される転写及び翻訳開始調節配列も好ましくは含む。発現ベクターは、例えば、複製開始点又は自律複製配列（ＡＲＳ）及び発現制御配列、プロモーター、エンハンサー、及びリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、転写性終止配列及びｍＲＮＡ安定化配列のような必要な処理情報部位を含むことができる。タンパク質が、細胞膜を超え、かつ／又は内部に留まることを可能にし、かつそれ故にその機能トポロジーを達成するか、又は細胞から分泌される、分泌シグナルは、必要に応じて、天然ＨＬＳ−５タンパク質からであれ、又は他の受容体からであれ、又は同じ若しくは関連種の分泌ポリペプチドからであれ、同様に含まれ得る。かかるベクターは、当該技術分野において周知であり、かつ例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９前掲、又はＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．１９９２前掲で論じられる標準的組み換え技術によって調製できる。

適切なプロモーター及び他の必要なベクター配列は、宿主中で機能的であるように選択され、かつ必要な場合、ＨＬＳ−５遺伝子と自然結合されるものを含むことができる。細胞株及び発現ベクターの実行可能な組み合わせの例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９前掲、又はＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．１９９２に記載される。多くの有用なベクターが、当該技術分野において公知であり、かつＳｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｂｉｏｔｅｃｈ他のような販売者から得ることができる。ｔｒｐ、ｌａｃ及びファージプロモーター、ｔＲＮＡプロモーター及び解糖分解酵素プロモーターのようなプロモータは、原核生物宿主に使用できる。

有用な酵母プロモーターには、メタロチオネイン、ホスホグリセリン酸キナーゼ、又はエノラーゼ又はグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼのような他の糖分解酵素、マルトース及びガラクトース利用の原因となる酵素他のためのプロモーター領域を含む。酵母発現での使用に適したベクター及びプロモーターは、Ｈｉｔｚｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１９，ｐａｇｅｓ ６２０−６２５に更に記載されている。

適切な非天然哺乳類プロモーターには、ＳＶ４０からの早期及び後期プロモーター、又はマウスモロニー白血病ウイルス、マウス腫瘍ウイルス、トリ肉腫ウイルス、アデノウイルス１１、ウシパピローマウイルス又はポリオーマから誘導されたプロモーターを含むことがある。その上、構成は、遺伝子の複数のコピーが作られるように、増幅可能な遺伝子（例えばＤＨＦＲ）に接合できる。

かかる発現ベクターは、自律的に複製できるが、当該技術分野において周知の方法によって、宿主細胞のゲノムに挿入されることによっても複製できる。

発現及びクローニングベクターは、選択可能なマーカー、ベクターによって形質転換された宿主細胞の生存又は成長のために必要なタンパク質をコードする遺伝子を含む可能性が高い。この遺伝子の存在は、挿入断片を発現するそれらの宿主細胞のみの成長を確実にする。典型的な選択遺伝子は、ａ）抗生物質又は他の毒性物質、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート等に耐性を与え、ｂ）栄養要求性欠乏を補足し、又はｃ）複合培地、例えば桿菌のためのＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子から入手可能でない重大な栄養素を供給するタンパク質をコードする。適切な選択可能なマーカーの選択は、宿主細胞によって決まり、かつ異なる宿主のための適切なマーカーは、当該技術分野において周知である。

興味の対象である核酸を含むベクターは、生体外で転写でき、かつ周知の方法によって、例えば注射によって宿主細胞に導入された、結果として生じたＲＮＡ、又はベクターは、エレクトロポレーション；トランスフェクションを用いる塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン又は他の物質；微粒子銃；リポフェクション；感染（ベクターがレトロウイルスゲノムのような感染因子である場合）；及び他の方法を含む、宿主細胞のタイプによって変わる、当該技術分野において周知の方法によって宿主細胞に直接導入できる。とりわけ上記のものを含む当該技術分野において公知のいずれかの方法による宿主細胞へのポリヌクレオチドの導入は、本明細書において、「形質転換」と呼ばれる。上記核酸が導入された細胞は、かかる細胞の後代を含むことも意図される。

従って、本発明は、本発明の核酸分子によって形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。好ましい宿主細胞には、細菌、酵母、哺乳類細胞、植物細胞、昆虫細胞及びヒト細胞を含む。

例証として、かかる宿主細胞は、大腸菌、シュードモナス、桿菌、ストレプトマイセス、酵母、ＣＨＯ、Ｒ１．１、Ｂ−Ｗ、Ｌ−Ｍ、ＣＯＳ １、ＣＯＳ ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＢＭＴ１０及びＳｆ９細胞からなる群から選択される。

大量の、本発明のＨＬＳ−５ポリペプチドは、ベクター中にＨＬＳ−５ポリヌクレオチド若しくはその部分、又は適合性原核生物若しくは真核生物宿主細胞中の他の発現ビークルを発現することによって調製できる。最も一般に使用される原核生物宿主は、大腸菌株であるが、枯草菌又はシュードモナスのような他の原核生物も使用できる。

ＨＬＳ−５ポリペプチドコード化配列への機能的近傍に、発現調節配列を挿入することからなる相同組み換え事象によってＨＬＳ−５ポリペプチドの高度な発現を可能にするために、ＨＬＳ−５ポリペプチドコード化ＤＮＡ配列を含み、かつ生体外で修飾される哺乳類細胞も提供される。発現調節配列は、ＨＬＳ−５ポリペプチド発現であっても、そうでなくても良く、かつ細胞中の変異ＨＬＳ−５ポリペプチド調節配列を置き換えることができる。

従って、本発明は、（ａ）ＨＬＳ−５ポリペプチドの発現を提供する条件で、上記のように細胞を培養すること；及び（ｂ）発現されたＨＬＳ−５ポリペプチドを回収することを含むＨＬＳ−５ポリペプチドを調製する方法も提供する。この手順は、（ｃ）当該技術分野において公知のいずれかの適切な手段を使用してポリペプチドをクロマトグラフィを行うステップ；及び（ｄ）例えばゲル濾過によってポリペプチドを精製するステップを伴うこともできる。

酵母、糸状菌、植物、昆虫又は両生類若しくは鳥類のような、哺乳類又は他の真核生物宿主細胞も、本発明のタンパク質の生成に有用であり得る。培養中の哺乳類細胞の伝播は、それ自体が周知である。一般に使用される哺乳類宿主細胞株の例は、ＶＥＲＯ及びＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、及びＷ１３８、ＢＨＫ、及びＣＯＳ細胞株であるが、熟練した実務家は、例えば、高度の発現、望ましいグリコシル化パターン又は他の特徴を提供するために、他の細胞株も適当であり得ることが認識されるであろう。

クローンは、ベクター構造様式に応じて、マーカーを使用して選択される。マーカーは、同じ又は異なるＤＮＡ分子、好ましくは同じＤＮＡ分子上にあっても良い。原核生物宿主において、形質転換体は、例えばアンピシリン、テトラサイクリン又は他の抗生物質への耐性によって選択できる。

感温性に基づく、特定の生成物の生成はまた、適切なマーカーとして役立ち得る。

本発明のポリヌクレオチドによって形質転換された原核生物又は真核生物細胞は、核酸生成物にだけでなく、本発明のポリペプチドに有用である。

ＨＬＳ−５の細胞内量増加が、前掲の技術か、又はＨＬＳ−５の内因性レベルを増加させることによって得られることが当業者に認識されるであろう。従って、幾つかの実施態様において、「核内受容体変調剤」は、ＨＬＳ−５及び／又はＨＬＳ−５活性の内因性レベルを変更することが可能な化合物又は組成物である。ＨＬＳ−５活性の内因性レベルに関して本明細書で使用されているような、用語「変更する」は、野生型及び／又は正常レベルと比較したＨＬＳ−５及び／又はＨＬＳ−５活性の内因性レベルを増加又は減少させる化合物又は組成物の能力を指す。ＨＬＳ−５及び／又はＨＬＳ−５活性の内因性レベルを修飾することが可能な化合物及び／又は組成物は、生体外細胞に基づくアッセイを使用して最初に識別できる。例えば、Ｃｈｒｏｍａ−Ｌｕｃ（商標）、Ｌｕｃ（商標）又はＧＦＰ（商標）レポーター遺伝子のようなシステムが、複数の異なるクローニングベクターフォーマットで提供できる。ベーシックベクターバージョン（Ｂａｓｉｃ ｖｅｃｔｏｒ ｖｅｒｓｉｏｎ）は、真核生物プロモーター及びエンハンサー配列を欠き、レポーター遺伝子の５’末端でのＨＬＳ−５プロモーターのような、クローニング推定調節配列を可能にする、例えばｐＧＬ３−ベーシックベクターの設計に基づく、汎用レポーターベクターである。ルシフェラーゼ、又はいずれかのレポーター遺伝子の発現、この「ｐＧＬ３−プロモーターベクター」によってトランスフェクトされた細胞中の活性は、ＨＬＳ−５プロモーターのような、興味の対象であるクローン化プロモーターを通した発現を直接又は間接的に誘発することが可能な要素又は化合物によって決まる。基本ベクター形態に加えて、Ｃｈｒｏｍａ−Ｌｕｃ（商標）遺伝子のような他のシステムが、ｐＧＬ３−コントロールベクターと類似する、ＳＶ４０プロモーター及びＳＶ４０エンハンサーを含むベクター形態において入手可能である。ＳＶ４０プロモーター及びエンハンサー配列の存在は、多くの哺乳類細胞型中でｌｕｃ＋の強い発現をもたらす。従って、この技術及び他のいずれかのベクター修飾は、ＨＬＳ−５プロモーターの下流でレポーター遺伝子を測定することにより、ＨＬＳ−５タンパク質発現を修飾することが潜在的に可能な化合物のアッセイへのハイスループット適用において、かつ複数ウェルプレート中の迅速な計量に適している。これらの識別された化合物は、次に内因性ＨＬＳ−５プロモーター、及びウエスタンブロットのような方法によって検定されたタンパク質発現によって、細胞中でテストできる。一般的に、濾過されたルミネセンスを測定することが可能な、いかなるルミノメーターも、二色アッセイを実行することが可能であるべきであり、かつ当該技術分野において熟練したいかなる科学者も、これらのアッセイを再現できる。

一旦、ＨＬＳ−５及び／又はＨＬＳ−５活性の内因性レベルを変更することが可能な、適切なベクター又は化合物／組成物中の核内受容体変調剤、例えばＨＬＳ−５ポリペプチド、ＨＬＳ−５ポリヌクレオチドが、得られたならば、それらは、核内受容体を変調するために、それを必要とする被検者に次に投与される。幾つかの実施態様において、必要とする被検者は、調節されない核内受容体活性によって影響を及ぼされ、制御され、又は悪化した状態を患っており、かつそれ故に、投与ステップは、状態の処置に役立つ。

一般的に、用語「処置する」、「処置」等は、本明細書において、所望の薬理学的及び／又は生理的効果を得るために、被検者、例えばヒト個人又は動物、その組織又は細胞に影響を及ぼすことを意味するために使用される。効果は、その状態又は兆候又は症状を完全に又は部分的に予防することに関して予防的であっても良く、かつ／又は状態を部分的又は完全に治癒することに関して治療的であっても良い。本明細書に使用されるような「処置する」は、脊椎動物、哺乳動物、特にヒトにおける調節されない核内受容体活性に関連した、又はそれによって悪化した状態のいかなる処置又は予防もカバーし、かつ（ａ）状態を患う傾向があり得るが、それを有するとまだ診断されていなかった被検者において状態が起こることを予防すること；（ｂ）状態を阻害すること、すなわちその発生を止めること；又は（ｃ）状態を軽減又は改善すること、すなわち症状の退縮を引き起こすことを含む。

本明細書で使用されるような用語「被検者」は、核内受容体活性の制御が望ましい動物被検者を指す。被検者は、ヒトであっても良いか、又は家畜、伴侶若しくは動物園の動物でも良い。本発明の核内受容体変調剤は、ヒトの医療処置での使用に適することが特に予期されるが、それは、イヌ及びネコのような伴侶動物、及びウマ、ウシ及びヒツジのような家畜、又はヒト以外の霊長類、ネコ科、イヌ科、ウシ科及び有蹄類のような動物園の動物の処置を含む獣医学処置にも適用できる。

核内受容体変調剤は、当該技術分野において周知であるように、処置すべき状態、並びに被検者の年齢、状態及び体重に応じて、種々の形状で投与できる。例えば、核内受容体変調剤が、経口投与されるべきならば、それらは、錠剤、カプセル、顆粒、粉末又はシロップとして処方でき、あるいは非経口投与に関して、それらは、注射（静脈内、筋肉内、又は皮下）、点滴製剤又は坐薬として処方できる。眼の粘膜経路による適用のために、それらは、点眼液又は眼軟膏剤として処方できる。これらの製剤は、従来の手段によって調製でき、かつ所望であれば、活性成分は、賦形剤、結合剤、崩壊剤、潤滑剤、矯味剤、可溶化剤、懸濁補助剤、乳化剤又はコーティング剤のようないかなる従来の添加剤とも混合できる。投与量は、被検者の症状、年齢及び体重、治療又は予防すべき状態の性質及び重症度、投与経路及び核内受容体変調剤の形状に応じて変わるが、一般的に、０．０１から２０００ｍｇの核内受容体変調剤の１日投与量が、成人のヒト被検者に勧められ、かつこれは一回量又は分割量で投与できる。

核内受容体変調剤を投与するために有効な時間は、識別される必要がある。これは、日常的実験によって達成できる。例えば、動物において、核内受容体変調剤によるスモイル化活性の制御は、１日の特定の時間に核内受容体変調剤を投与し、かつ核内受容体活性と関連した１つ以上の指数を測定することによって投与の効果（もしあれば）を測定し、かつこれらの指数の処置後の値を、処置前の同じ指数の値と比較することによって評価できる。

所与の被検者における処置の有効性に関して最も有効な結果を生じる、核内受容体変調剤の正確な投与時間及び／又は量は、特定の核内受容体変調剤の活性、薬物動態学及び生物学的利用能、（年齢、性別、疾患タイプ及び段階、一般的な物理的状態、所与の投与量に対する応答性及び薬物のタイプを含む）被検者の生理的条件、投与経路等によって決まる。しかしながら、上記の指針は、処置を微調整するための、例えば被検者を監視し、かつ投与量及び／又はタイミングを調整することからなる、日常的実験の域を出ないものを必要とする投与の最適な時間及び／又は量を決定するための基盤として使用できる。

本明細書で使用されるような、語句「医薬的有効量」及び「治療的有効量」は、ある所望の治療効果、例えばいかなる医療処置にも適用できる妥当な利益／危険率でのタンパク質のスモイル化の阻害を生成するために有効である核内受容体変調剤の量を意味する。

語句「医薬上許容し得る」は、健全な医学判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー応答又は他の問題又は合併症なしに、妥当な利益／危険率と釣り合った、人間及び動物組織との接触する使用に適した、核内受容体変調剤、材料、組成物及び／又は剤形を指すために本明細書において用いられる。

本明細書において使用されるような語句「医薬上許容し得る担体」は、核内受容体変調剤を一方の器官又は身体部分から、他方の器官又は身体部分に運搬又は輸送することに関与する、液体又は固体充填剤、希釈液、賦形剤、溶剤又は封入材料のような、医薬上許容し得る材料、組成物又はビークルを意味する。各担体は、製剤の他の成分と適合性を持つという意味において「許容でき」なければならず、かつ被検者に有害であってはならない。医薬上許容し得る担体として役立ち得る材料の幾つかの例には：（１）ラクトース、グルコース及びショ糖のような糖；（２）コーンスターチ及びジャガイモデンプンのようなデンプン；（３）カルボキシルメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及び酢酸セルロースのようなセルロース及びその誘導体；（４）粉末トラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）タルク；（８）カカオ脂及び坐薬ワックスのような賦形剤；（９）落花生油、綿実油、サフラワー油、胡麻油、オリーブ油、トウモロコシ油及び大豆油のような油；（１０）プロピレングリコールのようなグリコール；（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコールのようなポリオール；（１２）オレイン酸エチル及びラウリン酸エチルのようなエステル；（１３）寒天；（１４）水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムのような緩衝剤；（１５）アルギン酸；（１６）発熱性物質を含まない水；（１７）等張食塩水；（１８）リンガー液；（１９）エチルアルコール；（２０）リン酸緩衝液；及び（２１）医薬製剤に用いられる他の非毒性適合物質を含む。

ラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウムのような湿潤剤、乳化剤及び潤滑剤、並びに着色剤、剥離剤、コーティング剤、甘味料、着香料、及び芳香剤、防腐剤、及び抗酸化剤も、組成物中に存在し得る。

医薬上許容し得る抗酸化剤の例には、（１）アスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等のような水溶性抗酸化剤；（２）アスコルビルパルミテート、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチンのような油溶性抗酸化剤；没食子酸プロピル、α−トコフェロール等；及び（３）クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸等のような金属キレート化剤を含む。

本発明の方法に有用な製剤には、経口、経鼻、局所（口腔及び舌下を含む）、直腸、膣内、エアロゾル及び／又は非経口投与を含む。製剤は、好都合には、単位剤形で提供でき、かつ薬学技術分野において周知のいかなる方法によっても調製できる。単一の剤形を生成するために担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、処置されている宿主、特定の投与様式に応じて変わる。単一の剤形を生成するために担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、一般的に治療効果を生成する化合物の量である。一般的に、１００パーセントの中から、この量は、約１パーセントから約９９パーセント、好ましくは約５パーセントから約７０パーセント、非常に好ましくは約１０パーセントから約３０パーセントの有効活性に及ぶ。

これらの製剤又は組成物を調製する方法には、核内受容体変調剤を、担体、及び任意には１種以上の副成分と結合させるステップを含む。一般的に、製剤は、核内受容体変調剤を、液体担体、又は微粉化した固体担体、又は両方と均一かつ密接に結合させ、かつ次に必要ならば生成物を成形することによって調製される。

経口投与に適した製剤は、カプセル、カシェ剤、丸薬、錠剤、菓子錠剤（香料添加主成分、通常ショ糖及びアカシア又はトラガカントを使用する）、粉末、顆粒の形状で、又は水性若しくは非水性液体中での溶液若しくは懸濁液として、又は水中油形若しくは油中水形液状エマルジョンとして、又はエリキシル剤若しくはシロップとして、又はトローチ（ゼラチン及びグリセリン又はショ糖及びアカシアのような不活性主成分を使用する）として、かつ／又は口内洗剤等としてでも良く、各々が活性成分として所定量の核内受容体変調剤を含む。化合物は、ボーラス、舐剤又はペーストとしても投与できる。

経口投与用の固体剤形（カプセル、錠剤、丸薬、粉末、顆粒等）において、活性成分は、クエン酸ナトリウム又はリン酸二カルシウムのような１種以上の医薬上許容し得る担体、及び／又は以下：（１）デンプン、ラクトース、ショ糖、グルコース、マンニトール及び／又はケイ酸のような充填剤又は増量剤；（２）例えばカルボキシメチルセルロース、アルギナート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ショ糖及び／又はアカシアのような結合剤；（３）グリセロールのような保湿剤；（４）寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモ又はタピオカテンプン、アルギン酸、ある種のケイ酸塩及び炭酸ナトリウムのような崩壊剤；（５）パラフィンのような溶解遅延剤；（６）第四級アンモニウム化合物のような吸収促進剤；（７）例えばアセチルアルコール及びグリセロールモノステアレートのような湿潤剤；（８）カオリン及びベントナイト粘土のような吸収剤；（９）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム及びそれらの混合物のような潤滑剤；及び（１０）着色剤のいずれかと混合される。カプセル、錠剤及び丸薬の場合、医薬組成物は、緩衝剤も含むことができる。類似のタイプの固体組成物は、ラクトース又は乳糖のような賦形剤、並びに高分子量ポリエチレングリコール等を使用して、軟質及び硬質充填ゼラチンカプセル中で充填剤としても用いることができる。

錠剤は、任意に１種以上の副成分と共に圧縮又は成形によって、作ることができる。圧縮錠剤は、結合剤（例えばゼラチン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）、潤滑剤、不活性希釈剤、防腐剤、崩壊剤（例えばナトリウムデンプングリコレート又は架橋カルボキシルメチルセルロースナトリウム）、界面活性剤又は分散剤を使用して調製できる。成形錠剤は、不活性液体希釈液によって湿らせた粉末ペプチド又はペプチド模倣薬の混合物を適切な機械中で成形するによって作ることができる。

錠剤、及び糖衣錠、カプセル、丸薬及び顆粒のような他の固体剤形は、任意に刻み目を付けられるか、又は腸溶コーティング及び医薬製剤技術において周知の他のコーティングのようなコーティング及びシェルによって調製できる。それらは、所望の放出プロフィール、他のポリマーマトリックス、リポソーム及び／又はマイクロスフェアを提供するために、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロースを種々の比率で使用して、内部の活性成分の徐放又は制御放出を提供するようにも処方できる。それらは、例えば細菌を保持するフィルタを通して、又は滅菌水中に溶解できる滅菌の固体組成物、若しくは他の何らかの滅菌の注射可能な培地の形状で、使用直前に滅菌剤を組み込むことによる濾過によって滅菌できる。これらの組成物は、任意に乳白剤も含むことができ、かつ活性成分のみを、又は優先的には胃腸管のある部分において任意に遅延して放出する組成物であっても良い。使用できる埋設組成物の例には、高分子物質及びワックスを含む。活性成分は、適当であるならば、上記の賦形剤の１種以上を有するマイクロカプセルの形状であっても良い。

経口投与用の液体剤形には、医薬上許容し得るエマルジョン、ミクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ及びエリキシル剤を含む。活性成分に加えて、液体剤形は、当該技術分野において一般に使用される、例えば水又は他の溶剤のような不活性希釈剤、エチルアルコール、イソドロピル（ｉｓｏｄｒｏｐｙｌ）アルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコールのような可溶化剤及び乳化剤、油（特に、綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油及び胡麻油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール、及びソルビタン脂肪酸エステル及びその混合物を含むことができる。

不活性希釈剤の他に、口腔用組成物は、湿潤剤、乳化剤及び懸濁剤、甘味料、着香料、着色剤、芳香剤及び防腐剤のようなアジュバントも含むことができる。

懸濁液は、活性核内受容体変調剤に加えて、例えばエトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール及びソルビタンエステル、微結晶性セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天及びトラガカント及びその混合物のような懸濁剤を含むことができる。

核内受容体変調剤の局所又は経皮投与用の剤形には、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチ及び吸入剤を含む。活性成分は、滅菌条件下で、医薬上許容し得る担体、及び必要とされ得るいかなる防腐剤、緩衝液、又は推進剤とも混合できる。

軟膏、ペースト、クリーム及びゲルは、核内受容体変調剤に加えて、動物性、及び植物性脂肪、油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルク及び酸化亜鉛又はその混合物のような賦形剤を含むことができる。

粉末及びスプレーは、核内受容体変調剤に加えて、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム及びポリアミド粉末、又はこれらの物質の混合物のような賦形剤を含むことができる。スプレーは更に、クロロフルオロ炭化水素のような慣習的な推進剤、並びにブタン及びプロパンのような揮発性の非置換の炭化水素を含むことができる。

核内受容体変調剤は、あるいはエアロゾルによって投与できる。これは、化合物を含む水性エアロゾル、リポソーム製剤又は固体粒子を調製することによって達成される。非水性（例えばフッ化炭素推進剤）懸濁液が、使用できる。音響噴霧器は、化合物の分解をもたらし得る、剪断すべき作用物質の露出を最小限に抑えるので、好ましい。

通常、水性エアロゾルは、従来の医薬上許容し得る担体及び安定剤と共に作用物質の水溶液または懸濁液を処方することによって作られる。担体及び安定剤は、特定の化合物の要件によって異なるが、概して非イオン性界面活性剤（ツイーン、プルロニック又はポリエチレングリコール）、無害性のタンパク質、例えば血清アルブミン、ソルビタンエステル、オレイン酸、レシチン、グリシンのようなアミノ酸、緩衝液、塩、糖又は糖アルコールを含む。エアロゾルは、一般的に等張液から調製される。

経皮パッチは、身体への核内受容体変調剤の制御送達を提供するという追加された利点を有する。かかる剤形は、適切な培地中で作用物質を溶解又は分散させることによって作ることができる。吸収促進薬は、皮膚を横切るペプチド模倣薬の流束を増加させるためにも使用できる。かかる流束の速度は、速度制御膜を提供するか、又はポリマーマトリックス若しくはゲル中でペプチド模倣薬を分散させることによって制御できる。

眼科製剤、眼軟膏剤、粉末、溶液等は、同様に本発明の範囲内にあると予期される。

非経口投与に適した本発明の医薬組成物は、１種以上の医薬上許容し得る滅菌の等張性水溶液又は非水溶液、分散液、懸濁液又はエマルジョン、又は意図された受容者の血液又は懸濁剤又は増粘剤によって製剤を等張性にする、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、溶質を含むことができる、使用直前に滅菌の注射可能な溶液又は分散液に再構成できる滅菌粉末と組み合わせて、１種以上の核内受容体変調剤を含む。

本発明の医薬組成物に用いることができる適切な水性、及び非水性担体の例には、水、エタノール、ポリオール、（例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、及びその適切な混合物、オリーブ油のような植物油、オレイン酸エチルのような注射可能な有機エステルを含む。適切な流動性は、例えばレシチンのようなコーティング材料の使用によって、分散液の場合に必要な粒径の維持によって、かつ界面活性剤の使用によって維持できる。

これらの組成物は、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、及び分散剤のようなアジュバントも含むことができる。微生物の作用の予防は、種々の抗菌及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸等の包含によって確実にできる。糖、塩化ナトリウム等のような等張剤を組成物に含むことも望ましいことがある。その上、注射可能な医薬形状の持続的吸収は、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンのような吸収を遅延させる作用物質の包含によってもたらされることがある。

幾つかの場合において、核内受容体変調剤の効果を延ばすために、皮下、又は筋肉注射からの作用物質の吸収を遅くすることが望ましい。これは、低い水溶性を有する結晶質又は非晶質材料の液体懸濁液を使用することによって達成できる。薬剤の吸収速度は、次にその溶解速度によって決まり、溶解速度は、次に結晶の寸法及び結晶形状によって決まり得る。あるいは、非経口投与された剤形の遅延吸収は、作用物質を油ビークル中で溶解又は懸濁することによって達成される。

注射可能な貯蔵形状は、ポリ乳酸ポリグリコリドのような生分解性高分子中で核内受容体変調剤のマイクロカプセル化マトリックスを形成することによって作られる。作用物質の重合体に対する比、及び用いられる特定の重合体の性質に応じて、作用物質放出速度が、制御できる。他の生分解性高分子の例には、ポリ（オルトエステル）及びポリ（無水物）を含む。貯蔵注射可能製剤は、身体組織と適合性を持つリポソーム又はミクロエマルジョン中に作用物質を取り込むことによっても調製される。

本明細書で使用されるような、語句「非経口投与」及び「非経口投与される」は、通常、注射による、腸内及び局所投与以外の投与様式を意味し、かつ静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹膜内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、脊髄内、及び胸骨内注射及び輸液を含むが、それらに限定されない。

本明細書で使用されるような、語句「全身投与」、「全身投与される」、「末梢投与」、及び「末梢投与される」は、核内受容体変調剤を中枢神経系に直接以外に、それが被検者の系に入り、かつ従って代謝及び他の同様のプロセスを受けるように、投与すること、例えば皮下投与を意味する。

本発明のもう１つの形態は、１つ以上の他の治療剤が、核内受容体変調剤によって投与される、共同治療を提供する。かかる共同治療は、処置の個別の成分の同時、順次又は別個の投薬によって達成できる。

幾つかの実施態様において、核内受容体変調剤は、抗癌剤、又は処置される状態の処置に有用であることが知られている他の治療剤と共同で投与される。例えば、抗癌剤と一緒にＨＬＳ−５発現ベクターを使用する遺伝子治療。

もう１つの例証的な実施態様において、被検者制御剤は、核内受容体作用剤又は拮抗剤と共同で投与できる。

前掲に記載したように、幾つかの実施態様において、生体内送達又は発現のための本発明のＨＬＳ−５ポリヌクレオチド及びベクター。このアプローチは、「遺伝子治療」とも呼ばれ、かつそのようなものとして当該技術分野において周知である。遺伝子治療手順は、インフルエンザウイルス感染前、実質的に同時期、又は後に、ＨＬＳ−５ポリペプチドの発現を被検者に向けることが可能な、治療的有効量のＨＬＳ−５ポリヌクレオチドベクターを投与することを含むことができる。代替的に、又は前述のものと組み合わせて使用できるもう１つのアプローチは、細胞、例えば幹細胞又は免疫系細胞の集団を被検者から単離し、任意に組織培養中で細胞を拡大し、かつＨＬＳ−５の発現を生体外で細胞に向けることが可能な、ＨＬＳ−５ポリヌクレオチドベクターを投与することである。細胞は、次に被検者に戻されても良い。任意に、ＨＬＳ−５ポリヌクレオチドを発現する細胞は、それらを被検者に導入する前に、生体外で選択できる。本発明の幾つかの実施態様において、細胞株から、又は被検者でない個人からの細胞であっても良い、細胞の集団が、使用できる。幹細胞、免疫系細胞等を被検者から単離し、かつそれらを被検者に戻す方法は、当該技術分野において周知である。かかる方法は、例えば化学治療を受けている患者において、骨髄移植、末梢血幹細胞移植等で使用される。

更にもう１つのアプローチにおいて、経口遺伝子治療が、使用できる。例えば、米国特許第６２４８７２０号は、プロモーターの制御下の遺伝子が、微小粒子中に保護されて含まれ、かつ細胞に操作形状で送達され、それにより非侵襲性遺伝子送達を達成する、方法及び組成物を記載している。微小粒子の経口投与に続き、遺伝子は、吸収腸上皮細胞を含む上皮細胞に取り込まれ、腸管関連リンパ組織に取り込まれ、かつ粘膜上皮から離れた細胞に輸送もされる。そこに記載されたように、微小粒子は、遺伝子を粘膜上皮から離れた部位に送達できる、すなわち上皮バリアを通過し、かつ全身循環に入ることができ、それにより細胞を他の位置でトランスフェクトする。

用語「状態」は、核内受容体活性が役割を果たし、かつ制御を必要とするいずれかの疾患又は障害を指す。現在のところ、アンドロゲン依存性及び非依存性前立腺癌、乳癌、骨粗鬆症、アルツハイマー病、脳血管疾患、子癇前症及び子宮内膜症、を含むが、それらに限定されない、調節されない核内受容体活性によって影響を受けることが知られている多数の状態がある。

本発明は、（その参照が、上記のように相同体、変異体、誘導体、及び断片を含む）ＨＬＳ−５ポリペプチドに結合する物質を識別することに適したアッセイも提供する。その上、核内受容体活性に関与する細胞成分へのＨＬＳ−５結合を妨げる物質、例えばＨＬＳ−５と相互作用するとして酵母２ハイブリッドスクリーンにおいて識別されるタンパク質を識別することに適したアッセイが提供される。全細胞アッセイでの非損傷細胞に対する予備生体外アッセイで識別された候補物質の効果をテストするアッセイも提供される。

ＨＬＳ−５ポリペプチドとの相互作用の結果として核内受容体活性を修飾する物質は、それを幾つもの方法で行うことができる。それは、例えばＨＬＳ−５に結合し、かつ他の成分との相互作用部位を遮蔽又は変更することによって、細胞周期機構の細胞成分へのＨＬＳ−５の結合を直接中断させることができる。このタイプの候補物質は、好都合には例えば上記のような生体外結合アッセイによって予備スクリーニングでき、かつ次に例えば前掲のような全細胞アッセイにおいてテストできる。

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」によって、単語「含む」に続くどのようなものも含むが、それに限定されないことが意味される。従って、用語「含む」の使用は、列挙された要素が、必要又は必須であるが、他の要素が、任意であり、かつ存在しても、しなくても良いことを示す。「からなる」によって、語句「からなる」に続くどのようなものも含み、かつそれに限定されることが意味される。従って語句「からなる」は、列挙された要素が、必要又は必須であり、かつ他の要素が存在できないことを示す。「から本質的になる」によって、この語句の後に列挙されたいかなる要素も含み、かつ列挙された要素の開示に特定された活性又は作用を妨げないか、又はそれに寄与する他の要素に限定されることが意味される。従って、語句「から本質的になる」は、列挙された要素が、必要又は必須であるが、他の要素が、任意であり、かつそれらが列挙された要素の活性又は作用に影響を及ぼすか否かに応じて存在しても、しなくても良いことを示す。

代表的な技術及び実験結果を記載する、以下の実施例は、本発明を例証する目的で提供され、かつ限定すると解釈されるべきではない。

実施例１ ヒト癌細胞株中で突然変異したＨＬＳ−５遺伝子
ＨＬＳ−５遺伝子がヒト癌中で突然変異したかを決定するために、多数の細胞株からのＤＮＡ、並びに原発性腫瘍が検査された。直接ＤＮＡ塩基配列決定によって分析された細胞株は、２１−ＭＴ、ＭＣＦ７、Ｔ４７Ｄ、及びＬＮＣＡＰであり、これらは、乳癌及び前立腺癌株であり、内３つが、８ｐ２１領域の喪失を示す。その上、２５の原発性の乳房の腫瘍及び１０の乳房の細胞株が、ｄＨＰＬＣによって分析された。しかしながら、全ての場合にｈＨＬＳ５ｖｌ Ｏｐｅｎ Ｒｅａｄｉｎｇ Ｆｒａｍｅへの突然変異は検出されなかった。従って、これまでのところ、ＨＬＳ−５への突然変異が、その癌への寄与を招いた可能性は低いように見える。

ＨＬＳ−５レベルが、ヒト癌中で減少したかを証明するために、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）アッセイが、Ｂボックス領域周辺のプライマーを使用して展開された：
５’−ＴＴＣＧＧＣＴＣＴＴＧＴＧＴＴＴＣＡＴＧＡＧ−３’ 配列番号９
３’−ＴＣＡＧＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＣＡＴＧ−５’ 配列番号１０

多種多様なヒト腫瘍を表す細胞株のパネルが、次にｑＰＣＲによって分析された。図１のパネル（Ａ）は、１１の異なる癌細胞株中でリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって測定された通りの、ＨＬＳ５ ｍＲＮＡのレベルを示す：結腸（ＨＴ−２９）、乳房（ＭＣＦ７）、前立腺（ＬＮＣａＰ、ＰＣ３）、ＮＯ８６（中皮腫）、Ａ２０５８（転移性黒色腫）、ＨｅＬａ（子宮頚癌）、ＪＡＭ（卵巣悪性腫瘍）、Ｃａｌｕ６（肺非小細胞癌）、７８６−０（腎癌）。パネル（Ｂ）は、正常なヒト乳房上皮細胞（ＨＭＥＣ）を示し、かつ残りは、乳癌細胞株である。重要なことに、データは、１０／１３の乳癌株が対照細胞よりも有意に低いＨＬＳ−５転写レベルを有することを示した。その上、ＨＬＳ−５発現は、１／２の前立腺癌株、１／１の中皮腫、１／１の子宮頸癌及び１／１の卵巣癌において低かった。

これらの観察を更に詳しく述べるために、ＲＮＡは、原発性乳癌、肺癌、卵巣癌、肝臓癌、並びに幾つかの白血病から得られた。有意に、ＨＬＳ５ ｍＲＮＡレベルは、原発性乳癌及び卵巣癌において広く抑制される（図２）。正常な周囲組織を有する個別の腫瘍は、ＡからＥの標識を付された。しかしながら、図３に示すように、ＨＬＳ５ ｍＲＮＡは、原発性結腸癌及び肺癌中で部分的に誘発された。正常な周囲組織を有する個別の腫瘍は、ＡからＥの標識を付された。

総合すると、細胞株及び原発性腫瘍からのデータは、ＨＬＳ−５レベルが、乳癌、卵巣癌、子宮癌及び前立腺癌中で著しく減少したことを示した。これらの腫瘍は、ホルモン依存性癌と分類され、かつアンドロゲン及びエストロゲン受容体を通した作用メカニズムを有する。

上記ｈＨＬＳ−５中での突然変異の可能性減少のために、これらのヒト癌中でのＨＬＳ−５転写の減少が、メチル化に起因するという仮説が立てられた。遺伝子のメチル化は、第１にＣｐＧアイランドで起こるので、ヒトＨＬＳ−５ゲノム構造の検査が、可能なＣｐＧアイランドを識別するために行われた。図４は、ＨＬＳ５の可能な後成的修飾の分析を示す。パネル（Ａ）は、Ｔｈｅ ＣｐＧ Ｉｓｌａｎｄ Ｓｅａｒｃｈｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏ．ｄｅ／ｉｓｂ／２００３／０３／００２１／ｍａｉｎ．ｈｔｍｌ）を使用して、ＨＬＳ５プロモーター、及びＣｐＧアイランドである可能性が高い第一エクソン中の領域を示す。パネル（Ｂ）は、ＭＤＡ−４３５細胞株中での５−アザシチジン誘発のＨＬＳ−５再発現を示す。

その上、これらの細胞株は、５−アザシチジン、脱メチル化剤によって処置された。低発現乳癌細胞株が、阻害メチル基の除去に続き、高いレベルのＨＬＳ−５を発現するという仮説が立てられた。図５パネル（Ａ）は、ＨＬＳ５発現ベクターｐｃＤＮＡ３−ＨＬＳ５（０．５μｇ）及びレポーターベクターｐＢＴ−ルシフェラーゼ（１μｇ）が、６ｃｍの皿においてＬＮＣａＰ細胞に共同トランスフェクトされたことを示し、かつＡＲトランス活性化に対するＨＬＳ５の効果が、ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）と組み合わせてテストされた。ＨｅＬａ細胞（７．５×１０^４）は、トランスフェクション前、２４時間、６ウェルプレート中で平板培養された。トランスフェクションは、製造業者の指示に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを使用して実行された。トランスフェクトされたＤＮＡは、５００ｎｇのレポータープラスミド（ＥＲＥ−Ｌｕｃ）、及び内部対照として使用される２５ｎｇのｐＲＬ−ＣＭＶレニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、示したように種々の量の発現ベクターと共に含んだ。トランスフェクトされたＤＮＡ全体は、空のｐＳＧ５−Ｆｌａｇベクター又はｐｃＤＮＡ３を添加することによって、一定に保たれた。細胞は、０．１ｎＭのジヒドロテストステロンの不存在下、又は存在下で、トランスフェクション後の２４時間、インキュベートされ、次に追加の２４時間後に採集され、かつ製造業者の指示に従ってルシフェラーゼ活性に関して検定された。ルシフェラーゼ活性は、内部対照、レニラルシフェラーゼの活性及び試料中のタンパク質量に正常化された。各実験セットは、３組で実行され、かつ少なくとも３回反復された。

ベクター単独では、ＡＲトランス活性化を阻害しなかった。図５パネル（Ｂ）は、ＨＬＳ５発現ベクターｐｃＤＮＡ３−ＨＬＳ５（０．５μｇ）及びレポーターベクターＥＲＥ−ルシフェラーゼ（１μｇ）が、６ｃｍの皿においてＭＣＦ−７細胞に共同トランスフェクトされたことを示し、かつＥＲトランス活性化に対するＨＬＳ５の効果が、エストラジオール（Ｅ２）と組み合わせてテストされた。細胞は、０．１ｎＭのＥ２の不存在下、又は存在下で、インキュベートされた。ＤＮＡは、等モル量のｐｃＤＮＡ３空ベクター又はｐｃＤＮＡ３−ＨＬＳ５によって平衡が保たれた。ベクター単独では、ＥＲトランス活性化を阻害しなかった。

ホルモン依存性癌は、これらの新生物の発生のために、ステロイドホルモン（例えばエストロゲン、アンドロゲン）によるステロイドホルモン受容体の活性化を必要とする。ＨＬＳ−５が、ステロイドホルモン受容体を阻害できたかを決定するために、ルシフェラーゼアッセイが、受容体の転写活性を測定するために利用された。印象的なことに、図６は、ＨＬＳ５が、用量依存的に、アンドロゲン及びエストロゲン受容体によって転写活性を阻害したことを示す。パネル（Ａ）アッセイは、（番号３−１０で示され、２５ｎｇから５μｇの）増加した量のｐｃＤＮＡ３−ＨＬＳ５−Ｍｙｃ発現ベクターＤＮＡのトランスフェクションによって；（対照１−２）、ｐｃＤＮＡ３＋ＰＢＴ−ルシフェラーゼ単独又はジヒドロテストステロンの存在下で、図５でのように実行された；グラフは、０．１ｎＭのジヒドロテストステロンの存在下で測定された活性を表す。パネル（Ｂ）は、（番号３−１０で示される）増加した量のｐｃＤＮＡ３−ＨＬＳ５発現ベクターＤＮＡのトランスフェクションによって；（対照１−２）、ｐｃＤＮＡ３＋ＥＲＥ−ルシフェラーゼ単独又はエストラジオールの存在下で図５でのように実行されたアッセイを表す；グラフは、０．１ｎＭのエストラジオールの存在下で測定された活性を表す。総合的に、これらのデータは、ＨＬＳ−５が、ステロイドホルモン受容体活性を減少させることが可能であることを証明する。それ故に、ホルモン依存性癌中のＨＬＳ−５の減少は、ステロイドホルモン作用の重要な負の調節要素を除去する。

ＨＬＳ−５分子のドメインマッピングは、ステロイドホルモン受容体活性の阻害を招き得る領域を定義するために着手された。図７は、Ｂボックス及びコイルドコイルドメインを包含するＨＬＳ−５タンパク質の中心部分が、受容体トランス活性化の抑制に第一に関与することを証明した。パネル（Ａ）は、ＨＬＳ５アミノ酸配列の略図である。以下のドメインが、強調される：リングフィンガー（ＲＦ）、Ｂボックス（ＢＢ）、コイルドコイルドメイン（ＣＣ）及びＳＰＲＹドメイン。パネル（Ｂ）のアンドロゲン受容体に対する転写活性の阻害に関するＨＬＳ５の突然変異分析は、ＨＬＳ５の欠失変異体（ΔＮ９３）のトランスフェクションが、ＨＬｓ５全長と比較して転写抑制をなおも有することを示している。残りの変異体、（ΔＮ１５０、ΔＮ１９２、ΔＮ２６７）は、抑制活性なしに、ＨＬＳ５タンパク質をコードした。パネル（Ｃ）は、その活性抑制機能を移転できる、複数のリプレッサードメインを含み、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）を補充する、ＨＬＳ５、Ｎ−ＣｏＲ及びＳＭＲＴ上に存在する核内受容体コリプレッサーの識別を示す。ＣｏＲＮＲボックス［１］あるいは、ＬＸＸΦΦＸＸＸ Ｉ／Ｌモチーフ［２］（ここでΦは疎水性残基である）と称される配列は、リガンドの結合後、コアクチベーターＬＸＸＬＬらせん形モチーフによって占められる、疎水ポケット中で結合するように見える。

アンドロゲン受容体活性は、Ｕｂｃ９及びＰＩＡＳ１を含む幾つかの分子によって強化される。これら２つのタンパク質は、酵母２ハイブリッドスクリーンにおいてＨＬＳ−５と相互作用することが示された。ＨＬＳ−５及びＵｂｃ９並びにＰＩＡＳ１の間の相互作用は、生化学的に確認された。重要なことに、Ｕｂｃ９又はＰＩＡＳ１によるステロイドホルモン受容体の強化された活性化は、ＨＬＳ−５によって著しく抑制された。図８は、ｈＳＫＩＰ及びＨＬＳ５の間の最小受容体相互作用ドメインの識別を示す。パネル（Ａ）は、ｈＳＫＩＰ及びドメイン構造の略図を示す（配列の番号付けは、ヒトＳｋｉｐ全長に対応する）。ＨＬＳ５との様々なＶＰ１６−ｈＳＫＩＰ融合構成の相互作用は、酵母２ハイブリッドシステムを使用して評価され、かつＳＮＷドメインを通して媒介されることが示された。その機能に必須であるこのＳＮＷドメインは、癌タンパク質Ｓｋｉ及びＥ６とのＳＫＩＰ相互作用に関しても重要であることが発見された（Ｐｒａｔｈａｐａｍ，Ｔ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２０：７６７７，２００１及びＰｒａｔｈａｐａｍ Ｔ．Ｎｕｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２９：３４６９，２００１）。パネル（Ｂ）は、ＨＡタグＳＫＩＰ及びＭｙｃタグＨＬＳ５を使用するＣｏｓ細胞中のｈＳＫＩＰ及びＨＬＳ５の間の免疫共沈降を示す。パネル（Ｃ）は、ＨＬＳ５発現が、エストロゲン応答要素ＥＲＥに対してＳＫＩＰ誘発トランス活性化を抑制することを示す。ＨＬＳ５発現ベクターｐｃＤＮＡ３−ＨＬＳ５（０．５μｇ）及びレポーターベクターＥＲＥ−ルシフェラーゼ（１μｇ）が、６ｃｍの皿においてＭＣＦ−７細胞に共同トランスフェクトされ、かつＥＲトランス活性化に対するＳＫＩＰ＋／−ＨＬＳ５の効果が、エストラジオール（Ｅ２）と組み合わせてテストされた。細胞は、０．１ｎＭのＥ２の不存在下、又は存在下で、同様にインキュベートされた。ＤＮＡは、等モル量のｐｃＤＮＡ３空ベクター又はｐｃＤＮＡ３−ＨＬＳ５によって平衡が保たれた。ベクター単独では、ＥＲトランス活性化を阻害しなかった。これらのデータは、ＨＬＳ−５が、ステロイドホルモン受容体の重大な負の調節因子であるという命題に重みを加えた。

ＨＬＳ−５全長を使用する酵母２ハイブリッドスクリーンは、ＨＬＳ−５と相互作用するステロイドホルモン受容体と関連する４つの他の分子、すなわちＲｈｏ−ＧＤＩ、ＢＣＡＳ ２、ＮＲＢＦ−２、ＳＫＩＰ及びＴＤＧも識別した。ここでも我々は、これらの活性化因子の少なくとも２つを通してコリプレッサーの役割を果たすＨＬＳ−５の証拠を示す。

核Ｓｋｉ相互作用タンパク質（ＳｋｉＰ）をコードするＳＫＩＰ。ＳｋｉＰは、キイロショウジョウバエ核タンパク質Ｂｘ４２のヒト相同体である（Ｄａｈｌ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１６，１５７９−１５８６）。最近の証拠は、ＳｋｉＰが、そのショウジョウバエ対応物のように、転写調節に重要な役割を果たしており、かつ多くの組織で広く発現されることを示唆している。それは、その形質変換活性を媒介するために、癌タンパク質ｖ−Ｓｋｉと相互作用した核タンパク質として最初に記載された（Ｄａｈｌ ｅｔ ａｌ．，１９９８，前掲）。最近の研究は、ＳｋｉＰが、転写を変調するために、多くの転写調節因子と相互作用することを証明した。最近識別されたＳｋｉＰパートナーの幾つかには、ＮｏｔｃｈＩＣ（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，２０，２４００−２４１０）、Ｓｍａｄタンパク質（Ｌｅｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７６，１８２４３−１８２４８）、膜芽細胞腫瘍抑制因子（Ｐｒａｔｈａｐａｍ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，３０，５２６１−５２６８）、ビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７６，４０６１４−４０６２０）、Ｎ−ＣｏＲ／ＳＭＲＴ、及びｐ３００（Ｌｅｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｗｍｕｎ，３１５，１０７０−１０７６）を含む。増加したＳＫＩＰ発現は、ビタミンＤ、レチノイン酸、エストロゲン及びグルココルチコイドにより媒介される遺伝子発現を強化することが発見された（Ｂａｕｄｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７３，１６４３４−１６４４１）。更に、ＳｋｉＰは、ヒトパピローマウイルスの主要な形質転換タンパク質であるＥ７の新規な結合パートナーとして識別された（Ｐｒａｔｈａｐａｍ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２０，７６７７−７６８５）。この相互作用は、ＳｋｉＰの転写活性化活性の阻害に繋がり、かつＥ７の形質転換活性を促進し得る。この研究からの発見は、ＳＫＩＰ発現がアンチセンスＯＤＮによって廃止された時の、ＯＶＣＡ細胞株中のＳＫＩＰの過剰発現及びこれらのＯＶＣＡ細胞中の足場依存性成長の廃止を証明する。これらの発見は、ＳＫＩＩＰが、ＯＣａ細胞中で発癌性を持つという概念と一致する。

図９は、ＴＤＧ及びＨＬＳ５の間の最小受容体相互作用ドメインの識別を示す。パネル（Ａ）は、チミンＤＮＡグリコシラーゼドメイン構造の略図を示す（配列の番号付けは、マウスＴＤＧ全長に対応する）。ＨＬＳ−５との様々なＶＰ１６−ＴＤＧ融合構成の相互作用は、酵母２ハイブリッドシステムを使用して評価された。Ｇ／Ｔグリコシラーゼ、Ｇ／Ｕグリコシラーゼは、この相互作用に必須であることが発見された。同じドメインが、ＲＡＲ及びＲＸＲ（Ｕｍ，ＪＢＣ ２７３：２０７２８，１９９８）、ＥＲα（Ｃｈｅｎ，ＪＢＣ ２７８：３８５８６，２００３）の、ＣＢＰ／ｐ３００（Ｔｉｎｉ，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ９：２６５，２００２）とのＴＤＧ相互作用に関して重要であった。パネル（Ｂ）は、ＨＬＳ５発現が、エストロゲン応答要素ＥＲＥに対してＴＤＧ誘発トランス活性化を抑制したことを示す。ＨＬＳ５発現ベクターｐｃＤＮＡ３−ＨＬＳ５（０．５μｇ）及びレポーターベクターＥＲＥ−ルシフェラーゼ（１μｇ）が、６ｃｍの皿においてＭＣＦ−７細胞に共同トランスフェクトされ、かつＥＲトランス活性化に対するｐＳＧ５−ＴＤＧ（０．５μｇ）＋／−ＨＬＳ５の効果が、エストラジオール（Ｅ２）と組み合わせてテストされた。細胞は、０．１ｎＭのＥ２の不存在下、又は存在下で、同様にインキュベートされた。ＤＮＡは、等モル量のｐｃＤＮＡ３空ベクター又はｐｃＤＮＡ３−ＨＬＳ５によって平衡が保たれた。ベクター単独では、ＥＲトランス活性化を阻害しなかった。

従って、ＨＬＳ−５は、ステロイドホルモン受容体活性の調節に関与する幾つかの分子と相互作用する。

様々な起源の癌細胞株におけるＨＬＳ５のレベルを示す。 ＨＬＳ５ ｍＲＮＡが、原発性乳癌及び卵巣癌において広く抑制されていることを示す。正常な周囲組織を有する個別の腫瘍は、ＡからＥに標識を付された。なお、図中、Ｎｏｒｍａｌ Ｒｅｆ．は、正常対照、Ｎｏｒｍａｌは、正常、Ｔｕｍｏｕｒは腫瘍を意味する。 ＨＬＳ５ ｍＲＮＡが、原発性結腸癌及び肺癌において部分的に誘発されることを示す。正常な周囲組織を有する個別の腫瘍は、ＡからＥに標識を付された。なお、図中、Ｎｏｒｍａｌ Ｒｅｆ．は、正常対照、Ｎｏｒｍａｌは、正常、Ｔｕｍｏｕｒは腫瘍を意味する。 ＨＬＳ５の可能な後成的修飾の分析を示す。パネル（Ａ）は、Ｔｈｅ ＣｐＧ Ｉｓｌａｎｄ Ｓｅａｒｃｈｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏ．ｄｅ／ｉｓｂ／２００３／０３／００２１／ｍａｉｎ．ｈｔｍｌ)を使用したＣｐＧアイランドである可能性が高い、ＨＬＳ５プロモーター及び第１エクソン内の領域を示す。パネル（Ｂ）は、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞株内のＨＬＳ５の５−アザシチジン誘発された再発現を示す。 ＨＬＳ５がアンドロゲン及びエストロゲン受容体の両方の活性に影響を及ぼすことを示す。 ＨＬＳ５が、用量依存的にアンドロゲン及びエストロゲン受容体によって転写活性を阻害したことを示す。 ＨＬＳ５転写抑制活性に関与するドメインをマッピングすることを示す。 ｈＳＫＩＰ及びＨＬＳ５の間の最小受容体相互作用ドメインの識別を示す。 ＴＤＧ及びＨＬＳ５の間の最小受容体相互作用ドメインの識別を示す。

Claims (13)

1. ＨＬＳ−５の内因性レベル又はその活性を変更することが可能な化合物又は組成物を含む核内受容体変調剤。
2. （ｉ）有効量のＨＬＳ−５ポリペプチド、そのアイソフォーム、その機能的断片又はその組成物；又は
   （ｉｉ）ＨＬＳ−５又はアイソフォーム又は機能的修飾又はその機能的断片の内因性レベル及び／又は活性を変更することが可能な物質；又は
   （ｉｉｉ）ＨＬＳ−５又はアイソフォーム又は機能的修飾又はその機能的断片を特異的に結合する抗体又はその断片；又は
   （ｉｖ）ＨＬＳ−５又はアイソフォーム又は機能的修飾又はその機能的断片をコードするポリヌクレオチド分子にアンチセンスであるポリヌクレオチド分子；又は
   （ｖ）その組み合わせ
   を、それを必要とする被検者に投与するステップを含む、生体内で核内受容体を変調する方法。
3. 前記核内受容体変調が、前記核内受容体の活性を上方調節する請求項２に記載の方法。
4. 前記核内受容体変調が、前記核内受容体の活性を下方調節する請求項２に記載の方法。
5. 前記変調活性が、直接的である請求項２から４のいずれかに記載の方法。
6. 前記変調活性が、間接的である請求項２から４のいずれかに記載の方法。
7. （ｉ）有効量のＨＬＳ−５ポリペプチド、そのアイソフォーム、その機能的断片又はその組成物；又は
   （ｉｉ）ＨＬＳ−５又はアイソフォーム又は機能的修飾又はその機能的断片の内因性レベル及び／又は活性を変更することが可能な物質；又は
   （ｉｉｉ）ＨＬＳ−５又はアイソフォーム又は機能的修飾又はその機能的断片を特異的に結合する抗体又はその断片；又は
   （ｉｖ）ＨＬＳ−５又はそのアイソフォーム又は機能的修飾又は機能的断片をコードするポリヌクレオチド分子にアンチセンスであるポリヌクレオチド分子；又は
   （ｖ）その組み合わせ
   を、細胞に投与するステップを含む、生体外で核内受容体を変調する方法。
8. 生体内で核内受容体を変調するために、
   （ｉ）医薬的有効量のＨＬＳ−５ポリペプチド、そのアイソフォーム、その機能的断片又はその組成物；又は
   （ｉｉ）ＨＬＳ−５又はアイソフォーム又は機能的修飾又はその機能的断片の内因性レベル及び／又は活性を変更することが可能な物質；又は
   （ｉｉｉ）ＨＬＳ−５又はアイソフォーム又は機能的修飾又はその機能的断片を特異的に結合する抗体又はその断片；又は
   （ｉｖ）ＨＬＳ−５又はアイソフォーム又は機能的修飾又はその機能的断片をコードするポリヌクレオチド分子にアンチセンスであるポリヌクレオチド分子；又は
   （ｖ）その組み合わせ
   の１つ以上の使用。
9. （ｉ）医薬的有効量のＨＬＳ−５ポリペプチド、そのアイソフォーム、その機能的断片又はその医薬組成物；又は
   （ｉｉ）ＨＬＳ−５又はアイソフォーム又は機能的修飾又はその機能的断片の内因性レベル及び／又は活性を変更することが可能な物質；又は
   （ｉｉｉ）ＨＬＳ−５又はアイソフォーム又は機能的修飾又はその機能的断片を特異的に結合する抗体又はその断片；又は
   （ｉｖ）ＨＬＳ−５又はアイソフォーム又は機能的修飾又はその機能的断片をコードするポリヌクレオチド分子にアンチセンスであるポリヌクレオチド分子；又は
   （ｖ）その組み合わせ
   を、それを必要とする被検者に投与するステップを含む、ホルモン依存性障害を処置又は予防する方法
10. 前記被検者が、ヒト又は家畜、伴侶若しくは動物園の動物である請求項９に記載の方法。
11. 前記伴侶動物が、イヌ又はネコである請求項９に記載の方法。
12. （ｉ）ＨＬＳ−５又はその断片の応答要素への結合を可能にする条件で、ＨＬＳ−５又はその断片を結合することが可能な応答要素を含む核内受容体テストシステムを提供すること；
    （ｉｉ）核内受容体テストシステムをＨＬＳ−５と接触させること；
    （ｉｉｉ）ＨＬＳ−５の存在下で相互作用レベルを測定すること；
    （ｉｖ）核内受容体システムをＨＬＳ−５核内受容体変調活性の候補修飾因子と接触させること；
    （ｖ）前記候補修飾因子の存在下で相互作用レベルを測定すること；
    （ｉｖ）前記候補修飾因子の存在下での前記測定された相互作用レベルを、ＨＬＳ−５の存在下及び／又は前記候補修飾因子の不存在下での前記測定された相互作用レベルと比較すること
    を含む、ＨＬＳ−５核内受容体変調活性の修飾因子を識別するアッセイであって、前記候補修飾因子の存在下での相互作用の統計的に有意な変更は、ＨＬＳ−５核内受容体変調活性の修飾因子を示すアッセイ。
13. （ｉ）テスト被検者からの生体試料を提供すること；
    （ｉｉ）前記生体試料内の核内受容体活性レベルを測定すること；及び
    （ｉｉｉ）前記生体試料をＨＬＳ−５又はその機能的断片と接触させ、かつ核内受容体活性レベルを測定し、かつＨＬＳ−５の存在下での前記測定された核内受容体活性レベルを、ＨＬＳ−５の不存在下での核内受容体活性と比較すること
    を含むホルモン依存性障害のＨＬＳ−５処置の適合性を決定する方法であって、ＨＬＳ−５の存在下での核内受容体活性の統計的に有意な差は、状態のＨＬＳ−５処置の適合性を示す方法。

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