JP2009510131A - Ｓｕｍｏ化制御剤及びその用途 - Google Patents

Abstract

本発明は、ＳＵＭＯ化を制御するために有用な新規な薬剤に関する。特に、本発明は：（i）医薬的に有効な量のＨＬＳ−５ポリペプチド、そのアイソフォーム、その機能フラグメント、又はその医薬組成物；又は（ii）ＨＬＳ−５又はその活性の、内在性のレベルを調整することが可能な化合物又は組成物；又は（iii）それらの組合せ、を含んでなるＳＵＭＯ化制御剤に関する。

Description

本発明は、ＳＵＭＯ（スモ）化を制御するために有用な新規な薬剤に関する。特に、本発明は、医薬的に有効な量のＨＬＳ−５ポリペプチド又はその機能フラグメント又はその医薬組成物か；又は、ＨＬＳ−５又はその活性の、内在性のレベルを調整することができる化合物又は組成物、のいずれかを含んでなるＳＵＭＯ化制御剤に関する。

タンパク質の翻訳後修飾は、既存の、個々のタンパク質、複合体、及び細胞内構造物の機能に、迅速な変化を引き起すことが可能であることから、多くの細胞プロセスにおいて重要な役割をもつ。したがって、タンパク質の翻訳後修飾は、タンパク質の活性、安定性、又は局在化を調節する重要な手段である。最近、ユビキチンに配列類似性をもち、かつ標的タンパク質を修飾する、いくつかの小型タンパク質が同定されている。いくつかのユビキチン様修飾因子（ＵＢＬ）は、ＳＵＭＯ（小型ユビキチン関連修飾因子）、Ｒｕｂｉ（Ｎｅｄｄ８とも呼ばれる）、Ａｐｇ８、及びＡｐｇ１２を包含する。哺乳類では、ＳＵＭＯファミリーの４つのメンバー：ＳＵＭＯ−１であって、ＰＩＣ−１、セントリン、又はＧＭＰ１としても知られ、ヒトでは１０１アミノ酸ポリペプチドである；及び、相同性の高いポリペプチド、ＳＵＭＯ−２、ＳＵＭＯ−３、及びＳＵＭＯ−４、が記述されている。ＳＵＭＯ−１は、ユビキチンと約１８％の配列同一性を共有するのみであるが、双方のポリペプチドは共通の三次元構造を共有する。

ＳＵＭＯ化によるタンパク質修飾の経路は、ユビキチン化による充分にキャラクタライズされた修飾経路に類似してはいるが、異なる酵素のセットが関与している。ＳＵＭＯは、最初は不活性な前駆体として作られる。前駆体は次に、タンパク質分解性の切断によりプロセスされ、露出されたカルボキシ末端グリシン残基をもつ、活性のある修飾因子ポリペプチドを生じる。露出されたグリシンは、ＳＵＭＯのカルボキシル末端と標的タンパク質のリジン残基との間のイソペプチド結合の形成に必要である。このＳＵＭＯプロセッシング反応は、ＳＵＭＯ活性化酵素Ｅ１（ＳＡＥ１／ＳＥＡ２）として知られるシステインプロテアーゼ、ＳＵＭＯコンジュゲート化酵素Ｅ２（ＵＢＣ９）、ＳＵＭＯリガーゼＥ３、及びＳＵＭＯ切断酵素によって触媒される。Ｅ１活性化酵素及びＥ２コンジュゲート化酵素は、基質特異性を与えるＥ３ユビキチンリガーゼにより、ＳＵＭＯに基質への結合を準備させる（デステッロ（Ｄｅｓｔｅｒｒｏ）ら著、「フェブス・レターズ（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．）」、１９９７年、第４１７巻、２９７−３００；ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）ら著、「ディ・エンボ・ジャーナル（Ｅｍｂｏ Ｊ．）」、１９９７年、第１６巻、ｐ．５５０９−５５１９）。ＳＵＭＯ化については、ＲＩＮＧドメイン含有タンパク質、特に活性化ＳＴＡＴのタンパク質阻害剤（ＰＩＡＳ）ファミリーが、Ｅ３リガーゼ酵素として同定された（ジョンソン及びグプタ（Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｇｕｐｔａ）著、「セル（Ｃｅｌｌ）」、２００１年、第１０６巻、ｐ．７３５−７４４。核輸送におけるその機能について先にキャラクタライズされているヌクレオポリンＲａｎＢＰ２はまた、ＳＵＭＯ１のためのＥ３リガーゼであり、ＲＩＮＧフィンガーモチーフに対し、何ら機能上の相同性をもたないように見える。ＲａｎＢＰ２は、インビトロではいくつかのＳＵＭＯ標的に対しＥ３リガーゼ活性を作用させるが（例えばＳｐ１００）それらの全てに対してではなく（事実ｐ５３は、ＰＩＡＳ１によりＳＵＭＯ化されたが、ＲａｎＢＰ２ではＳＵＭＯ化されなかった）、基質特異性を示している（ピクラー（Ｐｉｃｈｌｅｒ）ら著、「セル」、２００２年、第１０８巻、ｐ．１０９−１２０；ピクラーら著、「ネイチャー・ストラクチャー・アンド・モレキュラー・バイオロジー（Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．）」、２００４年、第１１巻、ｐ．９８４−９９１）。

ＰＩＡＳタンパク質は、多くの転写因子、例えばＬＥＦ−１及び核受容体のトランス活性化を、少なくとも一部はＳＵＭＯ化により調節する（コタヤ（Ｋｏｔａｊａ）ら著、「ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ）」、２００２年、第２７７巻、ｐ．１７７８１−１７７８８；ニシダ及びヤスダ（Ｎｉｓｈｉｄａ＆Ｙａｓｕｄａ）著、「ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー」、２００２年、第２７７巻、ｐ．４１３１１−４１３１７；ロジャース（Ｒｏｇｅｒｓ）ら著、「ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー」、２００３年、第２７８巻、ｐ．３００９１−３００９７；サクデフ（Ｓａｃｈｄｅｖ）ら著、「ジーンズ・アンド・ディベロプメント（Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．）」、２００１年、第１５巻、ｐ．３０８８−３１０３）。最近、ＧＡＴＡ−１及びＧＡＴＡ−２が、ＳＵＭＯ−１及びＰＩＡＳｙにより翻訳後修飾され、転写活性の抑制をもたらすこと（チュン（Ｃｈｕｎ）ら著、「サーキュレイション・リサーチ（Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ」、２００３年、第９２巻、ｐ．１２０１−１２０８；コラビン（Ｃｏｌｌａｖｉｎ）ら著、「プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）」、２００４年、第１０１巻、ｐ．８８７０−８８７５）；逆に、ＳＵＭＯ化がＧＡＴＡ−４のトランス活性化能力を増大すること（ワン（Ｗａｎｇ）ら著、「ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー」、２００４年、第２７９巻、第４７号、ｐ．４９０９１）が示された。転写装置の成分へのＳＵＭＯ付加は、転写を活性化すること及び抑制することの双方が可能である。しかしながら殆どの場合、転写因子のＳＵＭＯ修飾は抑制をもたらしており、核小体内での保持から、ヒストン脱アセチル化酵素の動員にいたるまで、このことを説明するために種々のモデルが提案されてきた（バージャー（Ｖｅｒｇｅｒ）ら著、「エンボ・レポーツ（ＥＭＢＯ Ｒｅｐ」、２００３年、第４巻、ｐ．１３７−１４２）。

ＳＵＭＯ化は、ポリ−ユビキチン化とは対照的に、ユビキチン様の動的及び可逆的な翻訳後修飾系であり、変性をもたらすことはないが、タンパク質相互作用、細胞内局在、又は安定性に影響を及ぼすことが可能であって、転写調節をもたらし、核局在化に変化をもたらす（バージャーら著、２００３年、上記）。

いくつかの既知のＳＵＭＯ基質は、アポトーシスの重要なモジュレータである。アポトーシス又はプログラムされた細胞死は、多細胞生物の発生及びホメオスタシスに関与している。アポトーシスの正常なプロセスにおける変化は、癌、自己免疫疾患、炎症症状、変性症候群、及び感染性疾患を含む、種々の病理学的症状において起こる。

ウイルスは、宿主細胞内の本質的な生化学的経路を標的とすることが可能な、多機能タンパク質を有する。いくつかのウイルスタンパク質はまた、宿主細胞タンパク質のＳＵＭＯ修飾のための、並びにＳＵＭＯ化状態を変えるための基質として同定されている（ウイルソン及びランガサミ（Ｗｉｌｓｏｎ＆Ｒａｎｇａｓａｍｙ））著、「ウイルス・リサーチ（Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．」、２００１年、第８１巻、ｐ．１７−２７。ヒトパピローマウイルス、サイトメガロウイルス、アデノウイルス、及びヘルペスウイルスのようなウイルスは、それ自身の有害な目的のために細胞のＳＵＭＯを利用することがある。いくつかの場合には、ウイルスタンパク質のＳＵＭＯ化は、それらに核を標的とさせて細胞の複製機構を支配できるようにし、ウイルスの繁殖を可能にする。興味深いことに、ウイルス及び細胞双方の遺伝子の強力なグローバルな転写活性化因子であるアデノウイルスタンパク質、Ｇａｍ１はまた、Ｅ１ヘテロダイマー（ＳＡＥ１／ＳＡＥ２）の活性を妨害することにより、ＳＵＭＯ経路を阻害し、ＳＵＭＯ未修飾の基質の蓄積をもたらす（ボッギオ（Ｂｏｇｇｉｏ）ら著、「モレキュラー・セル（Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ」、２００４年、第１６巻、ｐ．５４９−５６１）。

ＳＵＭＯ基質が、細胞増殖及び分化の調節に重要な役割をもつ多くのタンパク質を包含しているという発見は、ユビキチン化と同様に、変化したＳＵＭＯ化が疾病の発症又は進行に寄与してもよいことを示唆している。事実、最近のデータは、病原感染、癌、及び神経変性疾患を含むいくつかの疾患が、ＳＵＭＯ化の変化に関連することを示唆している。細胞のＳＵＭＯ化系は、いくつかのウイルス及び細菌性病原体により、複製及び感染を優先するべく搾取される（ウイルソン及びランガサミ、２００１年、上記）。１つの顕著な実例は、ブラック・プラーク（Ｂｌａｃｋ Ｐｌａｑｕｅ）用の細菌剤、ペスト菌（エルシニア・ペスティス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ））のＹｏｐＪタンパク質が、ＳＵＭＯプロテアーゼ同族体をコードしており、その活性が宿主の免疫応答の阻害に寄与しているという知見である（オルト（Ｏｒｔｈ）ら著、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、２０００年、第２９０巻、ｐ．１５９４−１５９７）。いくつかの腫瘍抑制因子及び癌遺伝子の活性及び／又は局在が、ＳＵＭＯ修飾によって調節されるという観測は、ＳＵＭＯコンジュゲート化マシーナリの変化、又は特異基質のＳＵＭＯ修飾における変化が、癌に寄与するかもしれないという可能性を提起している。この仮説にはさらなる研究が必要であるが、急性前骨髄性白血病では、ＰＭＬ−ＲＡＲ融合タンパク質がＳＵＭＯ修飾されないのに対し、この疾患の有効な治療法である三酸化ヒ素が、該融合タンパク質のＳＵＭＯ化を回復させることに注目するのは興味深い（ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）ら著、「ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）」、１９９８年、第９２巻、ｐ．４３０８−４３１６）。ＳＵＭＯは、ハンチントン病、パーキンソン病及びニューロン核内封入体病を含む、いくつかの神経変性疾患を特徴づける、核内封入体に局在することが示されている（パウントニー（Ｐｏｕｎｔｎｅｙ）ら著、「エクスペリメンタル・ニューロロジー（Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ）」、２００３年、第１８４巻、ｐ．４３６−４４６；テラシマ（Ｔｅｒａｓｉｍａ）ら著、「ニューロレポート（Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ）」、２００２年、第１３巻、ｐ．２３５９−２３６４；ウエダ（Ｕｅｄａ）ら著、「バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ）」、２００２年、第２９３巻、ｐ．３０７−３１３）。ＳＵＭＯ−２の過剰発現は、アルツハイマー病の発症に関係する事象であるα−アミロイド前駆体タンパク質のプロセッシングに影響を及ぼし、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）におけるＳＵＭＯコンジュゲート化経路の遺伝的操作は、少なくとも２つのポリグルタミン反復性疾患、脊髄延髄性筋委縮（ＳＢＭＡ）及びハンチントンにおいて、ＳＵＭＯ化が神経変性に寄与することを示している（チャン（Ｃｈａｎ）ら著、「ヒューマン・モレキュラー・ジェネティクス（Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ）」、２００２年、第１１巻、ｐ．２８９５−２９０４；リー（Ｌｉ）ら著、「プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）」、２００３年、第１００巻、ｐ．２５９−２６４；ステファン（Ｓｔｅｆｆａｎ）ら著、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、２００４年、第３０４巻、ｐ．１００−１０４）。

したがって、翻訳後修飾因子ＳＵＭＯの調節及び機能をますます理解すること、及び標的タンパク質へのその付加を制御することは、遺伝子発現、ゲノム維持、及びシグナル伝達を調節する機構への新たな洞察を示す可能性に加えて、いくつかのヒトの疾患における治療的介入のための新規な標的を提供するかもしれない。

本発明者らは、ＨＬＳ−５がＳＵＭＯ化に影響を及ぼし得ることを見出した。いくつかの例においてＨＬＳ−５は、ＳＵＭＯ化経路のメンバーに影響を及ぼすことにより、及び／又は、基質、例えばＰＩＡＳ１、ＳＵＭＯ１，及びＵｂｃ９と競合することにより、いくつかの分子がＳＵＭＯ化されるのを阻害する。一方、他の例では、ＨＬＳ−５はいくつかのタンパのＳＵＭＯ化を増大する。本発明者らはまた、ＨＬＳ−５がＳＵＭＯ化に対しグローバルな影響をもつことが可能であること、すなわち多様なタンパク質のＳＵＭＯ化に影響を及ぼすことを示している。

したがって、本発明の第１の観点は：
（i）医薬的に有効な量のＨＬＳ−５ポリペプチド、そのアイソフォーム、その機能フラグメント、又はその医薬組成物；又は
（ii）ＨＬＳ−５又はその活性の、内在性のレベルを調整することが可能な化合物又は組成物；又は
（iii）それらの組合せ、
を含んでなるＳＵＭＯ化制御剤である。

いくつかの実施態様においては、ＨＬＳ−５ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、又は配列番号６に示された配列、又はそれと実質的に相同なポリペプチドか、或いはその機能フラグメントを含んでなることができる。

本発明のＨＬＳ−５ポリペプチドはまた、制限されることなく以下の：
１．その１以上のアミノ酸がその対応するＤ−アミノ酸により置き換えられているＨＬ
Ｓ−５ポリペプチド。当業者は、標準的な方法により、レトロ−インベルソ・アミノ酸配列が合成可能であることを認識するであろう。例えば、コレブ及びグッドマン（Ｃｈｏｒｅｖ＆Ｇｏｏｄｍａｎ）著、「アカウンツ・オブ・ケミカル・リサーチ（Ａｃｃ Ｃｈｅｍ Ｒｅｓ）」、１９９３年、第２６巻、ｐ．２６６−２７３参照；
２．そのペプチド結合が、代謝分解に対しさらに抵抗性な構造によって置き換えられて
いる、ＨＬＳ−５のペプチドミメティック化合物。例えば、オルソン（Ｏｌｓｏｎ）ら著、「ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．）」、１９９３年、第３６巻、ｐ．３０３９−３０４９参照；
３．個々のアミノ酸が類似構造物により置き換えられている、ＨＬＳ−５ポリペプチド、例えば、その電荷を修飾するための、修飾された末端か、アルキル、アシル、又はアミノ置換基をもつかもたないｇｅｍ−ジアミノアルキル基、もしくはアルキルマロニル基
を含む、ポリペプチド類似体も包含することが明確に理解されるべきである

かかる代替え構造物の使用は、それが生理的条件下の分解に対し、より耐性があることから、有意に長い体内半減期を提供することが可能である。

ポリペプチド類似体コンビナトリアル合成のため、及び、ポリペプチド及びポリペプチド類似体のスクリーニングのための方法は、当該技術分野において周知である（例えば、ガロップ（Ｇａｌｌｏｐ）ら著、「ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー」、１９９４年、第３７巻、ｐ．１２３３−１２５１参照）。本発明のＨＬＳ−５ポリペプチドが、改良された活性、安定性、及びバイオアベイラビリティをもつ化合物のデザイン及び合成のための鋳型として有用であることは、特に検討されている。

好ましくは、アミノ酸置換基が使用される場合、置換基は保存性であり、すなわち、アミノ酸は同様のサイズ及び電荷特性をもつもので置き換えられる。

いくつかの実施態様においては、ＨＬＳ−５ポリペプチドは、ＨＬＳ−５をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターから、インビボで発現されることができる。いくつかの実施態様では、ＨＬＳ−５ポリヌクレオチドは：
（ａ） 配列番号１、配列番号３、又は配列番号５に示されたヌクレオチド配列か、又はその機能フラグメントを含んでなるポリヌクレオチド；
（ｂ） 配列番号１、配列番号３、又は配列番号５に示されたヌクレオチド配列か、又はその機能フラグメントに対し、選択的にハイブリダイズすることが可能なヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド；
（ｃ） （ａ）又は（ｂ）に定義されたポリヌクレオチドへの遺伝コードの結果としての縮重である、ポリヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド；及び
（ｄ） （ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチドに対し相補的なポリヌクレオチド、
からなる１以上の群より選択されることができる。

本発明はまた、ＨＬＳ−５ポリヌクレオチドを含んでなるベクター、例えば、宿主細胞において前記ポリヌクレオチドの発現を指示することが可能な制御配列に対しオペラブリーに結合されたＨＬＳ−５ポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクターも提供する。

したがって、第２の観点においては、本発明は、宿主細胞において前記ポリヌクレオチドの発現を指示することができる調節配列に対しオペラブリーに結合された、ＨＬＳ−５ポリヌクレオチドを含んでなるベクターを含んでなる、ＳＵＭＯ化制御剤を提供する。

第３の観点においては、本発明は、インビボにおいてＳＵＭＯ化を制御する方法であって、それを必要とする患者に対し：
（i）医薬的に有効な量のＨＬＳ−５ポリペプチド、そのアイソフォーム、その機能フラグメント、又はその医薬組成物；又は
（ii）ＨＬＳ−５又はその活性の、内在性のレベルを調整することが可能な化合物又は組成物；又は
（iii）それらの組合せ、
を、投与する段階を含んでなる方法を提供する。

いくつかの態様においては、ＳＵＭＯ化制御剤は、ＳＵＭＯ化をネガティブに制御する、すなわち直接又は間接的に、ＳＵＭＯ化を防止する、及び／又は、脱ＳＵＭＯ化プロセスによりＳＵＭＯ化を逆転させることができる。なおもう１つの実施態様においては、ＳＵＭＯ化制御剤は、ＳＵＭＯ化をポジティブに制御する、すなわち直接又は間接的にＳＵＭＯ化をもたらすことができる。

第４の観点においては、本発明は、インビトロにおいてＳＵＭＯ化を制御する方法であって、細胞に対し：
（i）医薬的に有効な量のＨＬＳ−５ポリペプチド、そのアイソフォーム、その機能フラグメント、又はその医薬組成物；又は
（ii）ＨＬＳ−５又はその活性の、内在性のレベルを調整することが可能な化合物又は組成物；又は
（ｉｉｉ）それらの組合せ、
を、投与する段階を含んでなる方法を提供する。

第５の観点においては、本発明は、症状を治療又は予防するための方法であって、患者に対し：
（i）医薬的に有効な量のＨＬＳ−５ポリペプチド、そのアイソフォーム、その機能フラグメント、又はその医薬組成物；又は
（ii）ＨＬＳ−５又はその活性の、内在性のレベルを調整することが可能な化合物又は組成物；又は
（iii）それらの組合せ、
を、投与する段階を含んでなる方法を提供する。

いくつかの実施態様においては、症状は、ＳＵＭＯ化により直接的に影響又は制御されることができる。別の実施態様においては、症状は、ＳＵＭＯ化により直接的に影響又は制御されることはできない；しかしながら、ＳＵＭＯ化制御剤の投与は、該症状に関連するか又は影響を及ぼされるポリペプチドのＳＵＭＯ化を制御することにより、該症状を改善、緩和、又は治療する。

本発明のＳＵＭＯ化制御剤は、任意の好適な経路により投与されてよく、当業者は、治療されるべき症状のための最も好適な経路及び投薬量を、容易に決定することができるであろう。投薬量は、指導医又は獣医の自由裁量であり、治療されるべき症状の性質及び状態、治療されるべき患者の年齢および全身の健康状態、投与経路、及び、すでに投与されている可能性がある任意の先行治療に依存する。

ＳＵＭＯ化制御剤は、医薬的に許容される担体をさらに含んでなる組成物の形状で、投与されてもよい。これは通常、例えば、滅菌水、リン酸ナトリウム、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウム、及びそれらの任意の組合せからなる群より選択される、少なくとも１つの賦形剤を含んでなる。

医薬組成物の調製のための方法及び医薬担体は、当該技術分野において周知であり、「レミントンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＳｃｉｅｎｃｅ）」、第２０版、ウィリアムズ・アンド・ウィルキンズ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ）、米国、ペンシルベニア州のような教科書に示されているとおりである。

担体又は希釈剤、及び他の賦形剤は、投与経路に依存することができ、また再度、当業者は各個別の症例に最も好適な製剤を容易に決定することができるであろう。

患者は、ヒトであってよく、又は家畜、コンパニオンアニマル、又は動物園の動物であってもよい。本発明のＳＵＭＯ化制御剤は、ヒトの医学的治療における使用に好適であることが特に考察されているが、それらはまた、イヌ及びネコのようなコンパニオンアニマル、ウマ、ウシ、及びヒツジのような家畜、又は、非ヒト霊長類、ネコ科、イヌ科、ウシ科、及び有蹄類のような動物園の動物の治療を含めた獣医学的治療にも適用可能である。

第６の観点においては、本発明は、ＨＬＳ−５ポリペプチド、そのアイソフォーム、又はその機能フラグメントの、ＳＵＭＯ化活性の修飾因子を同定するためのアッセイであって：
（i） 基質ポリペプチドとｓｕｍｏとを含むＳＵＭＯ化−コンジュゲート系を、ｓｕｍｏによる基質ポリペプチドのＳＵＭＯ化を促進する条件下に提供すること；
（ii） ＳＵＭＯ化−コンジュゲート系をＨＬＳ−５と接触させること；
（iii） ＨＬＳ−５の存在下に、基質ポリペプチドのＳＵＭＯ化のレベルを測定すること；
（iv） ＳＵＭＯ化−コンジュゲート系を候補薬剤と接触させること；
（v） 候補薬剤の存在下に、基質ポリペプチドのＳＵＭＯ化のレベルを測定すること；及び
（vi） 測定された候補薬剤の存在下のＳＵＭＯ化レベルを、ＨＬＳ−５の存在下及び／又は候補薬剤の不在下の、基質ポリペプチドのＳＵＭＯ化と比較すること、
を含んでなるアッセイであって、候補薬剤の存在下での基質ポリペプチドのＳＵＭＯ化における統計学的に有意な変化が、ＨＬＳ−５ポリペプチド、そのアイソフォーム、又はその機能フラグメントのＳＵＭＯ化活性の修飾因子を表しているアッセイを提供する。

第７の観点においては、本発明は、ＨＬＳ−５ポリペプチド、そのアイソフォーム、又はその機能フラグメントの、内在レベルの修飾因子を同定するためのアッセイであって、
（i） 患者からの生物学的試料中のＨＬＳ−５のレベルを測定すること；
（ii） 該生物学的試料を候補薬剤と接触させること；
（iii） （ii）の接触された試料中のＨＬＳ−５のレベルを測定すること；及び
（iv） 測定された（i）及び（ii）のＨＬＳ−５レベルを比較すること、
を含んでなるアッセイであって、該レベルにおける統計学的に有意な差異が、ＨＬＳポリペプチド、そのアイソフォーム、又はその機能フラグメントの内在レベルの修飾因子を表しているアッセイを提供する。

第８の観点においては、本発明は、症状についてのＨＬＳ−５治療の適合性を測定する方法であって：
（i） 被験者からの生物学的試料中を用意すること；
（ii） 該生物学的試料中の基質ポリペプチドのＳＵＭＯ化レベルを測定すること；及び
（iii） 該生物学的試料中をＨＬＳ−５と接触させて基質ポリペプチドのＳＵＭＯ化レベルを測定すること、及び、ＨＬＳ−５存在下で測定されたＳＵＭＯ化レベルを、ＨＬＳ−５不在下の基質ポリペプチドのＳＵＭＯ化と比較すること、
を含んでなる方法であって、ＨＬＳ−５存在下の基質ポリペプチドのＳＵＭＯ化における統計学的に有意な差異が、該症状についてのＨＬＳ−５治療の適合性を表している方法を提供する。

本発明を詳細に記述するに先立ち、本発明が、特別に例示されたＨＬＳ−５配列、発現技術、又は方法に制限されないこと、及びもちろん変更してよいことが理解されるべきである。また、本文に使用された述語は、本発明の特定の実施態様を記述する目的のためであって、制限となることを意図したものではなく、それは添付のクレームによってのみ制限されることも理解されたい。

本文に引用された全ての出版物、特許、及び特許出願は、上記であれ下記であれ、その全てが参考として本明細書に含まれる。しかしながら、本文において言及された出版物は、該出版物において報告されかつ本発明に関連して使用されるかもしれないプロトコール及び試薬を、記述及び開示する目的のために引用されている。本文におけるいかなるものも、本発明が先行発明を理由に、かかる開示に先行する権利が与えられないことを承認するものとして解釈されるべきではない。

本発明の実施は、他に示されない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、組換えＤＮＡ、薬理学、及び免疫学の、通常の技術を用いることができ、それらは当該技術分野の技術の範囲内にある。かかる技術は、文献において記述されている。例えば、バイレイ及びオリス（Ｂａｉｌｅｙ＆Ｏｌｌｉｓ）著、「バイオケミカル・エンジニアリング・ファンダメンタルズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ）」、第２版、マグローヒル（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ）、トロント、１９８６年；コリガン（Ｃｏｌｉｇａｎ）ら著、「カレント・プロトコールズ・イン・プロテイン・サイエンス（Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、第１及びＩＩ巻（ジョンウイリー・アンド・サンズ社（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．））、１９９９年；グローバー（Ｇｌｏｖｅｒ）編、「ＤＮＡクローニング：ア・プラクティカル・アプローチ（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）」、第１及びＩＩ巻、１９８５年；ウィア及びブラックウェル（Ｗｅｉｒ＆Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ）編、「ハンドブック・オブ・エクスペリメンタル・イムノロジー（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、第Ｉ−ＩＶ巻、１９８６年；メイヤー及びウォーカー（Ｍａｙｅｒ＆Ｗａｌｋｅｒ）編、「イムノケミカル・メソズ・イン・セル・アンド・モレキュラー・バイオロジー（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ）」、アカデミックプレス、ロンドン、１９８７年；ウー（Ｗｕ）ら編、「メソヅ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」、第１５４及び１５５巻、１９８７年；サンブルック、フリッチ、及びマニアチス（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ）編、「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、１９８９年；ハムス及びヒギンス（Ｈａｍｅｓ＆Ｈｉｇｇｉｎｓ）編、「ヌクレイック・アシド・ハイブリダイゼーション（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）」、１９８４年；ガイト（Ｇａｉｔ）編、「オリゴヌクレオチド・シンセシス（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、１９８４年；「レミントンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＳｃｉｅｎｃｅｓ）」、第１７版、マック・パブリッシング・カンパニー（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ）、米国、ペンシルベニア州、イーストン；「メルク・インデックス（Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ）」、第１２版、セラピューティック・カテゴリー・アンド・バイオロジカル・アクティビティ・インデックス（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｃａｔｅｇｏｒｙ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ）、１９９６年；及び、ハムス及びヒギンス編、「トランスクリプション・アンド・トランスレーション（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ＆Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）」、１９８４年参照。

本文及び添付のクレームにおいて用いられたように、単数形「１つの（“ａ”、“ａｎ”）」及び「該（“ｔｈｅ”）」は、文脈が明らかに他に指示しない限り、複数の言及も包含することに留意されるべきである。したがって、例えば、「１つの核酸分子」への言及は、複数のかかる分子を包含しており、「１つの薬剤」への言及は、１以上の薬剤などへの言及を包含する。他に定義されない限り、本文において用いられた全ての技術的及び化学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者により共通して理解されるものと、同一の意味を有する。本文に記述されたものと同様又は同等の、任意の材料及び方法が、本発明を実施又は試験するべく使用可能であるが、好ましい材料及び方法が次に記述される。

本発明は、以下の観点を包含する：本発明のＨＬＳ−５ＳＵＭＯ化制御剤の調製；前記ＨＬＳ−５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は前記ポリヌクレオチドを運びかつ発現する組換えベクターの調製；前記ベクターを運ぶトランスフォーマント；前記トランスフォーマントを産生する方法；ＨＬＳ−５ポリペプチドを検出する方法；前記ＨＬＳ−５ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ又はポリヌクレオチドを検出する方法；及び、制御されないＳＵＭＯ化により引き起こされるか悪化される症状を治療する方法が、以下に説明される。

以下の記載において、何ら指示がない場合、遺伝子組換え技術、動物細胞、昆虫細胞、酵母、及び大腸菌における組換えポリペプチドの産生、分子生物学的方法、発現されたＨＬＳ−５ポリペプチドの分離及び精製法、アッセイ、及び免疫学的方法のような技術は、この分野において周知であり、任意のかかる技術が採用されてよいことが理解されよう。

その最も広い観点において、本発明は、医薬的に有効な量のＨＬＳ−５ポリペプチド、そのアイソフォーム、又はその機能フラグメントを含んでなる、ＳＵＭＯ化制御剤を提供する。

本文において用いられる用語「ＳＵＭＯ化制御剤」は、直接又は間接的に、タンパク質のＳＵＭＯ化に影響を及ぼすことができる化合物又は物質の組成物を指す。上述のように、ＳＵＭＯ化はタンパク質の翻訳後修飾であり、ユビキチン様タンパク質「ＳＵＭＯ−１」は、標的タンパク質中のリジン残基へ連結される。

本発明のいくつかの実施態様においては、「ＳＵＭＯ化制御剤」はＨＬＳ−５である。ＨＬＳ−５は、リングフィンガー・Ｂボックス・コイルドコイル（ＲＢＣＣ）タンパク質ファミリーのメンバーである（ラロンデ（Ｌａｌｏｎｄｅ）ら著、「ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ）」、２００４年、第２７９巻、ｐ．８１８１−８１８９）。この分子群はまた、高等な真核生物に保存されている特徴的なドメイン構造の故に、３要素モチーフファミリー（ＴＲＩＭ）のタンパク質とも呼ばれる（レイモンド（Ｒｅｙｍｏｎｄ）ら著、「ディ・エンボ・ジャーナル（Ｅｍｂｏ Ｊ）」、２００１年、第２０巻、ｐ．２１４０−２１５１）。マウス及びヒトのゲノムの配列分析は、多くの未知の機能をもつＲＢＣＣタンパク質の多岐にわたる配列を同定してきた（レイモンドら著、２００１年、上記）。

ＰＭＬ、ＴＩＦ１α、及びＲｆｐを含め、いくつかのＲＢＣＣファミリーメンバーは、ヒトの癌において突然変異されており、ＲＢＣＣタンパク質を細胞増殖及び分化の極めて重要なレギュレーターとして関係づけている（ドテ（ｄｅＴｈｅ）ら著、「セル（Ｃｅｌｌ）」、１９９１年、第６６巻、ｐ．６７５−６８４）。ＨＬＳ−５は、様々な腫瘍においてしばしば欠失されている領域、染色体８ｐ２１にマップしており、ヒーラ（ＨｅＬａ）細胞におけるこの遺伝子の強制発現は、細胞増殖、クローン原性、及び腫瘍原性を低減し、それが腫瘍抑制遺伝子であることを示唆している（ラロンデら著、２００４年、上記）。最近の研究は、いくつかのＲＢＣＣメンバーが、パートナータンパク質の活性又は定常状態レベルを、細胞内局在又は翻訳後修飾に影響を及ぼすことにより、調節することを証明している（ディアモンティ（Ｄｉａｍｏｎｒｉ）ら著、「プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ、ＵＳＡ」、２００２年、第９９巻、ｐ．２８６６−２８７１；ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）ら著、「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、２０００年、第４０６巻、ｐ．２０７−２１０；ウラノ（Ｕｒａｎｏ）ら著、「ネイチャー」、２００２年、第４１７巻、ｐ．８７１−８７５）。

ＨＬＳ−５は、元来、Ｊ２Ｅ赤血球系細胞系の赤血球系−骨髄系スイッチの間に、著しくアップレギュレートされる遺伝子として同定された（クリンケン（Ｋｌｉｎｋｅｎ）ら著、「プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ、ＵＳＡ」、１９８８年、第８５巻、ｐ．８５０６−９５１０；ラロンデら著、２００４年、上記）。骨髄系の変異株は、単芽球様の形態を示し、エリスロポエチン（ＥＰＯ）に応答せず、ＧＡＴＡ−１及びＥＫＬＦを含め、赤血球系特異転写因子の発現が低減されていた（キール（Ｋｅｉｌ）ら著、「セル・グロース・アンド・ディフェレンシエーション（Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．）」、１９９５年、第６巻、ｐ．４３９−４４８；ウィリアムズ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）ら著、「ディ・エンボ・ジャーナル」、１９９９年、第１８巻、ｐ．５５５９−５５６６）。意味深いことに、ＨＬＳ−５は、マクロファージコロニー刺激因子に開始される骨髄性細胞の成熟の間に誘導される遺伝子として、独立して単離された（キムラ（Ｋｉｍｕｒａ）ら著、「ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー」、２００３年、第２７８巻、ｐ．２５０４６−２５０５４）。

それ故、本発明のいくつかの実施態様においては、「ＳＵＭＯ化制御剤」は、単離された完全長のＨＬＳ−５ポリペプチドを含んでなる。用語「ポリペプチド」は、アミノ酸のポリマー及びその同等物を指し、特定の長さの生成物を指すのではない；したがって、ペプチド、オリゴペプチド、及びタンパク質は、ポリペプチドの定義内に包含される。この用語はまた、ポリペプチドの修飾、例えばグリコシル化、アセチル化、及びリン酸化などを指さないか、又は除外する。この定義に含まれるのは、例えば、１以上のアミノ酸類似体（例えば、天然アミノ酸などを含む）、置換連結並びに、当該技術分野において周知の他の修飾をもつ、天然及び非天然産のポリペプチドである。

本発明において使用される完全長のＨＬＳ−５ポリペプチドは、約５００アミノ酸を有し、動物、特に哺乳類において、腫瘍抑制因子をコードしており、アレル変異体又は相同体を包含する。完全長ＨＬＳ−５ポリペプチドはまた、典型的には、リングフィンガーモチーフ、Ｂボックス、コイルドコイルモチーフ、及びＳＰＲＹモチーフを含んでなる。本発明に使用されるＨＬＳ−５ポリペプチドはまた、完全長ＨＬＳ−５ポリペプチドのフラグメント及び誘導体、特に実質的に同じ生物活性を有するフラグメント又は誘導体も包含する。該ポリペプチドは、組換え又は化学合成法により、調製されることが可能である。いくつかの実施態様においては、ＨＬＳ−５ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、又は配列番号６のアミノ酸配列を含んでなるもの、或いは、そのフラグメントを含め、アレル変異体又は相同体を包含する。さらなる実施態様においては、ＨＬＳ−５ポリペプチドは、本質的に、配列番号４に示されたようなアミノ酸配列のアミノ酸１２−５０４か、或いはそのアレル変異体、相同体、又はフラグメントからなる。

本発明の文脈においては、相同配列は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、又は配列番号８に示されたアミノ酸配列をもつ、少なくとも２０、５０、１００、２００、３００、又は４００アミノ酸にわたるアミノ酸レベルにおいて、少なくとも６０、７０、８０、又は９０％同一、好ましくは少なくとも９５又は９８％同一であるアミノ酸配列を包含するものと理解される。特に、相同性は、典型的には、非本質的な隣接配列よりもむしろ、そのタンパク質の機能にとり本質的であることが公知の配列からなる領域について、考えられるべきである。したがって、例えば相同性の比較は、好ましくは、配列番号２、配列番号４、又は配列番号８に示されたＨＬＳ−５アミノ酸配列の、リングフィンガー、Ｂボックス、コイルドコイル及び／又はＳＰＲＹドメインに対応する領域にかけて行われる。リングフィンガーは、およそ、配列番号２のアミノ酸３６−７５に対応する。Ｂボックスは、およそ、配列番号２のアミノ酸１１１−１５２に対応する。コイルドコイルは、およそ、配列番号２のアミノ酸２１９−２６６に対応する。

ＳＰＲＹドメインは、およそ、配列番号２のアミノ酸３６８−５０７に対応する。いくつかの実施態様においては、本発明のポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１１１−１５２、２１９−２６６、又は３６８−５０７の１以上のアミノ酸か、或いは配列番号４又は配列番号６の相当する領域に対し、５０、６０、又は７０％を超える相同性、さらに好ましくは８０又は９０％を超える相同性を有する連続配列を含んでなる。

いくつかの実施態様においては、ポリペプチドは、代替えとして又は付加的に、配列番号２のアミノ酸３６−７５か、或いは配列番号４又は配列番号６の相当する領域に対し、８０又は９０％を超える相同性を有する連続配列を含んでなる。他のポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１−３５、７６−１１０、又は１５３−２１８、及び／又は２６７−３６７のアミノ酸か、或いは配列番号４又は配列番号６の相当する領域に対し、４０、５０、６０、又は７０％を超える相同性、さらに好ましくは８０又は９０％を超える相同性を有する連続配列を含んでなる。相同性はまた、類似性（すなわち、類似した化学的性質／機能を有するアミノ酸残基）という用語で考えられることも可能であるが、本発明の文脈においては、相同性を配列同一性という用語で表現することが好ましい。用語「実質的な相同性」又は「実質的な同一性」は、ポリペプチドについて言及する場合、問題のポリペプチド又はタンパク質が、天然産タンパク質全体又はその一部と、少なくとも約７０％の同一性、通常は少なくとも約８０％の同一性、及び好ましくは少なくとも約９０又は９５％同一性を示すことを示している。

相同性比較は、目で、或いは、さらに通常には、容易に入手可能な配列比較プログラムの助けを借りて、行われることが可能である、これらの市販のコンピュータプログラムは、２以上の配列の間のパーセント相同性を計算することが可能である。

パーセント（％）相同性は、連続配列について計算されてよく、すなわち、１つの配列は他の配列と一直線に合され、一方の配列中の各アミノ酸が、他方の配列中の対応するアミノ酸と、一度に１残基ずつ直接的に比較される。これは、「アンギャップド」アライメントと呼ばれる。典型的には、かかるアンギャップドアライメントは、比較的短い残基数（例えば５０未満の連続したアミノ酸）にわたってのみ行われる。

これは非常に単純で着実な方法であるが、例えば、他の点では同一である一対の配列においては、１つの挿入又は欠失が、それ以降のアミノ酸残基をアライメントから消すことになり、したがって、全体的なアライメントが行われる場合、潜在的に、％相同性に大きな減少を生じる結果となることを考慮することができない。それ故、殆どの配列比較法は、全体の相同性スコアを過度にペナライズすることなく、可能な挿入及び欠失を考慮する、最適アライメントを生成するべくデザインされている。これは、配列アライメントに「ギャップ」を挿入して、局所的相同性を最大化するべく試みることにより達成される。

しかしながら、これらのより複雑な方法は、アライメント中に生じる各ギャップに「ギャップペナルティ」を代入して、同じ数の同一のアミノ酸について、できるだけ少ないギャップをもつ配列アライメント−２つの比較配列の間により高い関連性を反映する−が、多くのギャップをもつものより高いスコアを達成できるようにする。典型的には、「アフィンギャップコスト」が使用され、これは、ギャップの存在に対し相対的に高いコストを、該ギャップにおける後続の残基には、より小さいペナルティを課す。これは、最も一般に使用されるギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティは、もちろん、よりギャップの少ない最適化アライメントを生成することができる。殆どのアライメントプログラムは、ギャップペナルティが修正されるようにしている。しかしながら、配列比較のためにかかるソフトウエアを使用する場合、デフォルト値を使用することが好ましい。例えば、ＧＣＧウイスコンシン・ベストフィット（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔ）パッケージを使用する場合、アミノ酸配列についてのデフォルトギャップペナルティは、ギャップについて−１２であり、各延長については−４である。

それ故最大％相同の計算は、第１に最適アライメントの、ギャップペナルティを考慮した生成を必要とする。かかるアライメントを実行するための好適なコンピュータプログラムは、ＧＣＧウイスコンシン・ベストフィット・パッケージ（米国、ウイスコンシン大学；デブロー（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ）ら著、「ヌクレイック・アシズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、１９８４年、第１２巻、ｐ．３８７）。配列比較を行うことが可能な他のソフトウエアの実例は、制限されることなく、ＢＬＡＳＴ（ブラスト）パッケージ（オーズベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら著、上記参照）、ＦＡＳＴＡ（ファスタ）（アチュル（Ａｔｓｃｈｕｌ）ら著、「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）」、１９９０年、ｐ．４０３−４１０）、及び比較ツールのジーンワーク（ＧＥＮＥＷＯＲＫ）スイートを包含する。ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡは、オフライン及びオンライン検索に利用可能である（オーズベルら、上記、ｐ．７−５８−７６０参照）。しかしながら、ＧＣＧベストフィットプログラムを使用することが好ましい。

最終的な％相同性は、同一性という用語で測定可能であるが、アライメントプロセス自体は、典型的には全か無かの対比較に基づくのではない。代わりに、スケールされた類似性のスコアマトリックスが一般に使用されており、化学的類似性又は進化的距離に基づき、それぞれのペアワイズ比較にスコアを代入する。一般的に使用される、かかるマトリックスの実例は、プログラムのＢＬＡＳＴスイート用のデフォルトマトリックス、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスである。ＧＣＧウイスコンシンプログラムは、一般に、公のデフォルト値か、又は添付されている場合には個別のシンボル比較テーブルを使用する（さらなる詳細についてはユーザーマニュアルを参照）。ＧＣＧパッケージ用には、公のデフォルト値を、他のソフトウエアの場合には、ＢＬＯＳＵＭ６２のようなデフォルトマトリックスを使用することが好ましい。

ひとたびソフトウエアが最適アライメントを生成すれば、％相同性、好ましくは％配列同一性を計算することが可能である。ソフトウエアは、典型的には、配列比較の一部としてこれを行い、数値結果を生成する。

ＨＬＳ−５ポリペプチド相同体は、アミノ酸配列を有するものであって、１以上のアミノ酸がもう１つのアミノ酸で置換されており、その置換が実施的に分子の生物活性を変えないものを包含する。

本発明のＨＬＳ−５ポリペプチド相同体は、好ましくは、配列番号４又は配列番号６に示されたヒトＨＬＳ−５ポリペプチドアミノ酸配列に対し、８０％以上のアミノ酸配列同一性を有する。本発明の範囲内のＨＬＳ−５ポリペプチド相同体の実例は、配列番号４又は配列番号６のアミノ酸配列であって：（ａ）１以上のアスパラギン酸残基が、グルタミン酸で置換されており；（ｂ）１以上のイソロイシン残基が、ロイシンで置換されており；（ｃ）１以上のグリシン又はバリン残基が、アラニンで置換されており；（ｄ）１以上のアルギニン残基がヒスチジンで置換されており；或いは、（ｅ）１以上のチロシン又はフェニルアラニン残基が、トリプトファンで置換されている配列、を包含する。

「タンパク質修飾物又は機能フラグメント」もまた、それがＨＬＳ−５ポリペプチドを指す場合には、用語「ＳＵＭＯ化制御剤」によって包含される。ＨＬＳ−５ポリペプチドの修飾物は、ＨＬＳ−５ポリペプチドの相同体、変異体、及び誘導体か、又はそのフラグメントを包含し、それらは実質的に一次構造配列に対し相同性であるが、例えば、インビボ又はインビトロの化学又は生化学的修飾を包含するもの、或いは、通常ではないアミノ酸を取込んでいるものである。かかる修飾は、当業者により容易に理解されるような、例えば、アセチル化、カルボキシル化、リン酸化、グリコシル化、ユビキチン化、標識化、例えば放射性ヌクレオチドによる、及び、種々の酵素的修飾を包含する。

ＨＬＳ−５ポリペプチド「フラグメント」、「部分」、又は「セグメント」は、少なくとも約５−７個の連続したアミノ酸、しばしば少なくとも約７−９個の連続したアミノ酸、典型的には少なくとも約９−１３個の連続したアミノ酸、及び、最も好ましくは少なくとも約２０−３０個以上の連続したアミノ酸からなる、アミノ酸残基の一つづきであって、前記「フラグメント」、「部分」、又は「セグメント」は、野生型完全長のＨＬＳ−５ポリペプチドと実質的に類似した機能を有する。

「実質的に類似した機能」は、野生型ＨＬＳ−５ポリペプチドに関連した、ＨＬＳ−５のポリペプチド修飾物又はフラグメントの機能を指す。ＨＬＳ−５の「フラグメント」、「部分」、又は「セグメント」は、（ボッギオ（Ｂｏｇｇｉｏ）ら著、「モレキュラー・セル（Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ）」、２００４年、第１６巻、ｐ．５４９−５６１）によって示されるように、ＳＵＭＯ化タンパク質を制御する能力を保持するはずである。いくつかの実施態様においては、「フラグメント」、「部分」、又は「セグメント」は、他のタンパク質において、機能に関し重要であるとして同定されている、１以上のドメインを含んでなることができる。例えば、ＴＲＩＭモチーフのアミノ末端リング及びＢボックス成分を含んでなる、ｈｕＴＲＩＭ５ａｌｐｈａのＢ３０．２／ＳＰＲＹドメイン及び付加的なドメインは、Ｎ−ＭＬＶ制限活性に必要であることが示されているのに対し、介在するコイルドコイルドメインは、ｈｕＴＲＩＭ５ａｌｐｈａのマルチマー形成に必要充分である。Ｎ−末端リング／Ｂ−ボックス、又はＣ−末端Ｂ３０．２／ＳＰＲＹドメインの、一方又は両方を欠く、トランケートされたｈｕＴＲＩＭ５ａｌｐｈａタンパク質は、完全長のｈｕＴＲＩＭ５ａｌｐｈａとヘテロマルチマーを形成し、そのＮ−ＭＬＶ制限活性の有力な阻害剤であり、インタクトなｈｕＴＲＩＭ５ａｌｐｈａのホモマルチマー形成が、Ｎ−ＭＬＶ制限に必要であることを示唆している。しかしながら、大型の細胞質小体中に局在することは、ｈｕＴＲＩＭ５ａｌｐｈａによるＮ−ＭＬＶの阻害には、或いは、キメリック又はｒｈＴＲＩＭ５ａｌｐｈａによるＨＩＶ−１の阻害には、必要ではない（ヤプ（Ｙａｐ）ら著、「カレント・バイオロジー（Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ）」、２００５年、第１５巻、ｐ．７３−７８）。ジェミニンは、細胞タンパク質であり、Ｃｄｔ１と結合し、Ｓ期の間にＭｃｍ２−７のローディングを阻害する。それは、細胞周期当たりの多重の複製周期を防止し、エピソームの複製を阻害する。ジェミニンは、ダイマーインターフェース中の異型の残基により、平行なコイルドコイルホモダイマーを形成する。ダイマー形成を破壊する点突然変異は、Ｃｄｔ１との相互作用及び複製の阻害を廃止させる。この相互作用は、複製阻害に不可欠である（サクセナ（Ｓａｘｅｎａ）ら著、「モレキュラー・セル」、２００４年、第１５巻、ｐ．２４５−２５８）。それゆえ、ＨＬＳ−５の機能フラグメント、部分、又はセグメントが、前文に定義された１以上の領域をもつことができることは非常にありそうに思われる。さらに、これらの領域の活性を同定又は試験するための、当該技術分野において周知の技術は、本発明のＨＬＳ−５フラグメント、部分、又はセグメントが機能性であるかどうかを試験又は同定するべく使用可能である。

機能の類似性に加えて、修飾されたポリペプチドは、より長い半減期のような、他の有用な特性を有してもよい。

いくつかの実施態様においては、ＨＬＳ−５フラグメントは、ＨＬＳ−５のアイソフォームである。他のＴＲＩＭタンパク質のように、ＨＬＳ−５は３つの異なるＲＢＣＣ又はＴＲＩＭタンパク質モチーフのクラスターにより定義される：リングモチーフ、これはシステインリッチであり亜鉛を結合する；１又は２個のいわゆるＢボックス、これも亜鉛を結合する；及び、コイルドコイルドメインであり、タンパク質複合体の形成におそらく関与している。全ての個々のＴＲＩＭタンパク質がホモオリゴマー化（ ）、いくつかはまた、他のＴＲＩＭタンパク質とアライアンスを形成（ヘテロオリゴマー化）するのかもしれない。ヒトでは、少なくとも３７のＴＲＩＭファミリーメンバーがある（レイモンドら著、「ディ・エンボ・ジャーナル」、２００１年、第２０巻、ｐ．２１４０−２１５１）。多くのＴＲＩＭファミリーメンバーは、オルタナティブ・スプライシングを有しており、最もキャラクタライズされたメンバーは、ＴＲＩＭ３９（ＰＭＬ）（デュプレイ（Ｄｕｐｒｅｚ）ら著、「ジャーナル・オブ・セル・サイエンス（Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ）」、１９９９年、第１１２巻、ｐ．３８１−３９３）、ＴＲＩＭ１８（ＭＩＤ１）（ベルティ（Ｂｅｒｔｉ）ら著、ＢＭＣセル・バイオロジー（ＢＭＣ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ））、２００４年、第５巻、ｐ．９）、ＴＲＩＭ３２（ＬＧＭＤ−２Ｈ）（スコウザー（Ｓｃｈｏｓｅｒ）ら著、「アナルズ・オブ・ニューロロジー（Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ）」、２００５年、第５７巻、ｐ．５９１−５９５；及びＴＲＩＭ５（シュー（Ｘｕ）ら著、「エクスペリメンタル・セル・リサーチ（Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ）」、２００３年、第２８８巻、ｐ．８４−９３）である。種々のＴＲＩＭタンパク質の各々は、細胞内の特定の区画に局在しており、そこへ、異なるタンパク質のサブセットを潜在的に引き寄せる異なるアイソフォームをもちかつ代替えの機能をもつ異なるタンパク質を、誘引する別個の構造を形成するように見える。

配列番号６に示されたＨＬＳ−５アイソフォームは、配列番号４に示されたＨＬＳ−５に比較して、フレームシフト及び早期停止コドンの結果として生じる、代替えのエクソンをコーディング領域に包含する。配列番号６アイソフォームは、配列番号４のＨＬＳ−５に比較してより短く、かつ異なるＣ−末端を有する。

いくつかの実施態様においては、ＨＬＳ−５ＳＵＭＯ化制御剤は、ＨＬＳ−５のペプチジル化合物（ペプチドミメティクスを包含する）であり、それらはタンパク質分解酵素などによる分解に対し、抵抗するか又はより抵抗性にするべく修飾されている。これらのペプチジル化合物は、切れやすいペプチド結合の代わりなどに、官能基を包含してもよく、そのことはセリン−、システイン−、又はアスパルテート型プロテアーゼの阻害を適宜促進する。例えば、ＨＬＳ−５ペプチジル化合物は、ペプチジルジケトン又はペプチジルケトエステル、ペプチドハロアルキルケトン、ペプチドスルホニルフルオリド、ペプチジルボロナート、ペプチドエポキシド、ペプチジルジアゾメタン、ペプチジルホスホナート、イソクマリン、ベンゾオキサジン−４−オン、カルバマート、イソシアナート、及び無水イサト酸であることが可能である。かかる官能基は、他のペプチド分子において提供されており、それらの合成のための一般的な経路は公知である。例えば、アンジェエラストロ（Ａｎｇｅｌａｓｔｒｏ）ら著、「ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー」、１９９０年、第３３巻、ｐ．１１−１３；ベイ（Ｂｅｙ）ら著、「ＥＰＯ」、第３６３巻、ｐ．２８４；ベイら著、「ＥＰＯ」、第３６４巻、ｐ．３４４；グラブ（Ｇｒｕｂｂ）ら、ＷＯ／１０２６６；ヒグチ（Ｈｉｇｕｃｈｉ）ら著、「ＥＰＯ」、第３９３巻、ｐ．４５７；エウォルト（Ｅｗｏｌｄｔ）ら著、「モレキュラー・イムノロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、１９９２年、第２９巻第６号、ｐ．７１３−７２１；ヘルナンデス（Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ）ら著、「ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー」、１９９２年、第３６巻、第６号、ｐ．１１２１−１１２９；ブラサク（Ｖｌａｓａｋ）ら著、「ジャーナル・オブ・ビロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）」、１９８９年、第６３巻、第５号、ｐ．２０５６−２０６２；フディグ（Ｈｕｄｉｇ）ら著、「ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）」、１９９１年、第１４７巻、第４号、ｐ．１３６０−１３６８；オダック（Ｏｄａｋｃ）ら著、「バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９９１年、第３０巻、第８号、ｐ．２２１７−２２２７；ビジャヤーラクシュミ（Ｖｉｊａｙａｌａｋｓｈｍｉ）ら著、「バイオケミストリー」、１９９１年、第３０巻、第８号、ｐ．２１７５−２１８３；カム（Ｋａｍ）ら著、「トロンボーシス・アンド・ヘマトスタシス（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ＆Ｈａｅｍａｔｏｓｔａｓｉｓ）」、１９９０年、第６４巻、第１号、ｐ．１３３−１３７；パワーズ（Ｐｏｗｅｒｓ）ら著、「ザ・ジャーナル・オブ・セル・バイオケミストリー（Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．）」、１９８９年、第３９巻、第１号、ｐ．３３−４６；パワーズら著、「プロテイナーゼ・インヒビターズ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）」、バレット（Ｂａｒｒｅｔｔ）ら編、エルゼビア、１９８６年、ｐ．５５−１５２；パワーズら著、「バイオケミストリー」、１９９０年、第２９巻、第１２号、ｐ．３１０８−３１１８；オエイダ（Ｏｗｅｉｄａ）ら著、「トロンボーシス・リサーチ（Ｔｈｒｏｍｂｏｉｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、１９９０年、第５８巻、第２号、ｐ．３９１−３９７；フディグら著、「モレキュラー・イムノロジー」、１９８９年、第２６巻、第８号、ｐ．７９３−７９８；オルローフスキー（Ｏｒｌｏｗｓｋｉ）ら著、「アーカイブズ・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジックス（Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ）」、１８９８年、第２６９巻、第１号、ｐ．１２５−１３６；ズニーノ（Ｚｕｎｉｎｏ）ら著、「バイオキミカ・エ・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ）」、１９８８年、第９６７巻、第３号、ｐ．３３１−３４０；カムら著、「バイオケミストリー」、１９８８年、第２７巻、第７号、ｐ．２５４７−２５５７；パルケス（Ｐａｒｋｅｓ）ら著、「ザ・バイオケミカル・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．）」、１９８５年、第２３０巻、ｐ．５０９−５１６；グリーン（Ｇｒｅｅｎ）ら著、「ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー」、１９８１年、第２５６巻、ｐ．１９２３−１９２８；アングリカー（Ａｎｇｌｉｋｅｒ）ら著、「ザ・バイオケミカル・ジャーナル」、１９８７年、第２４１巻、ｐ．８７１−８７５；プリ（Ｐｕｒｉ）ら著、「アーカイブズ・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジックス（Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ）」、１８９８年、第２７巻、ｐ．３４６−３５８；ハナダ（Ｈａｎａｄａ）ら著、「プロテイナーゼ・インヒビターズ：メディカル・アンド・バイオロジカル・アスペクツ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：Ｍｅｄｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ）」、カツヌマ（Ｋａｔｕｎｕｍａ）ら編、スプリンガー・バーラグ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）、１９８３年、ｐ．２５−３６；カジワラ（Ｋａｊｉｗａｒａ）ら著、「バイオケミストリー・インタナショナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．）」、１９８７年、第１５巻、ｐ．９３５−９４４；ラオ（Ｒａｏ）ら著、「トロンボーシス・リサーチ」、１９８７年、第４７巻、ｐ．６３５−６３７；ツジナカ（Ｔｓｕｊｉｎａｋａ）ら著、「バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．）」、１９８８年、第１５３巻、ｐ．１２０１−１２０８）。また、米国特許第４，９３５，４９３号；米国特許第５，４６２，９２８号；米国特許第５，５４３，３９６号；米国特許第５，２９６，６０４号；及び米国特許第６，２０１，１３２号参照。

もう１つの実施態様においては、ＨＬＳ−５ポリペプチドは、非ペプチジル化合物であり、例えば、本文に記述されたような薬物スクリーンアッセイにより、同定可能なものである。これらの非ペプチジル化合物は、単なる例証にすぎないが、合成有機物、天然産物、核酸、又は炭水化物であることが可能である。

オレフィン、ホスホナート及びアザアミノ酸類似体のような、ペプチドミメティクスもまた包含される。

また、同等物であると考えられるのは、ＨＬＳ−５ベースの任意の化合物であって、任意の前述のＨＬＳ−５化合物へ加水分解的に転換可能なものであり、ボロン酸エステル及びハロゲン、及び、アセタール、ヘミアセタール、ケタール、及びヘミケタールを含むカルボニル同等物、及び環式ジペプチド類似体を包含する。

本発明はまた、該化合物の、例えば、非毒性の有機又は無機酸からの、通常の非毒性塩又は第四級アンモニウム塩を含む、ＨＬＳ−５化合物の医薬的に許容される塩も包含する。例えば、かかる通常の非毒性塩は、無機酸、例えば塩酸塩、臭化水素酸、硫酸、スルホン酸、リン酸、及び硝酸など、から誘導されるもの；及び、有機酸、例えば酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パルミチン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、２−アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、及びイソチオン酸などから調製される塩を包含する。

本発明の医薬的に許容される塩は、塩基性又は酸性成分を含有するＨＬＳ−５化合物から、通常の化学的方法により合成可能である。一般に塩は、遊離の塩基または酸を、化学両論的な量の、又は過剰な、所望の塩形成性の無機又は有機の、酸又は塩基と、適当な溶媒中で反応させることにより調製される。

前文に記述されたＨＬＳ−５化合物の考察された同等物は、他の点ではそれと一致する化合物であって、それと同一の一般特性（例えば、ＳＵＭＯ化を制御する能力）を有するものであり、１以上の単純な置換基の変異がなされており、そのことが、考察された方法における使用において、ＨＬＳ−５分子の有効性に悪影響を及ぼさないものを包含する。一般に、本発明のＨＬＳ−５ポリペプチドは、下文に記述される方法により、或いはその修正法により、容易に入手可能な出発材料、試薬、及び通常の合成法を用いて調製されてよい。これらの反応においては、それ自体が公知であるが、本文には言及されていない変異形を利用することも可能である。

用語「アミノ酸残基」及び「ペプチド残基」により、そのカルボキシル基の−ＯＨがないアミノ酸又はペプチド分子が意味される。一般に、アミノ酸及び保護基を指定するために本文において使用される略号は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会の推奨に基づくものである（「バイオケミストリー」、１９７２年、第１１巻、ｐ．１７２６−１７３２参照）。例えば、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、及びＧｌｙは、それぞれメチオニン、イソロイシン、ロイシン、アラニン、及びグリシンを表す。残基により、カルボキシル基のＯＨ部分、及びα−アミノ基のＨ部分を除去することによって、対応するアミノ酸から誘導される、ラジカルが意味される。用語「アミノ酸側鎖」は、コップル（Ｋｏｐｐｌｅ）著、「ペプチズ・アンド・アミノアシズ（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ）」、ＷＡ ベンジャミン・インク（Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｉｎｃ．）、ニューヨーク＆アムステルダム、１９６６年、ｐ．２及び３３によって定義されたように、−ＣＨ（ＮＨ_２）ＣＯＯＨ部分を除いたアミノ酸の部分であり、一般的なアミノ酸の、かかる側鎖の実例は、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＳＣＨ_３（メチオニンの側鎖）、−ＣＨ_２（ＣＨ_３）−ＣＨ_２ＣＨ_３（イソロイシンの側鎖）、−ＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３）_２（ロイシンの側鎖）、又はＨ−（グリシンの側酸）である。

本発明の出願において使用されたアミノ酸の殆どは、タンパク質中に検出される天然産のもの、又は、アミノ及びカルボキシル基を含有するかかるアミノ酸の、天然に生じる同化又は異化生成物である。

用語「アミノ酸残基」はさらに、本文において言及された任意の特定のアミノ酸、並びに、Ｃ−末端又はＮ−末端保護されたアミノ酸誘導体（例えば、Ｎ−末端又はＣ−末端保護基で修飾された）の、類似体、誘導体、及び同族体を包含する。例えば、本発明は、側鎖が延長又は短縮されてはいるが、環化のための、カルボキシル、アミノ、又は他の反応性の前駆体官能基をなお提供することができるアミノ酸類似体、並びに、適切な官能基をもつ種々の側鎖を有するアミノ酸類似体の使用を考察している。例えば、ＨＬＳ−５ポリペプチドは、例えば、シアノアラニン、カナバニン、ジエンコル酸、ノルロイシン、３−ホスホセリン、ホモセリン、ジヒドロキシフェニルアラニン、５−ヒドロキシトリプトファン、１−メチルヒスチジン、３−メチルヒスチジン、ジアミノピメリン酸、オルニチン、又はジアミノ酪酸といった、アミノ酸類似体を包含することが可能である。本文に好適な側鎖を有している、他の天然産のアミノ酸代謝物、又は前駆体は、当業者により認識されるであろうし、それらもまた本発明の範囲内に包含される。

アミノ酸の構造が立体異性体型を許す場合には、かかるアミノ酸の（Ｄ）及び（Ｌ）立体異性体もまた包含される。本文のアミノ酸及びアミノ酸残基の立体配置は、適正な記号（Ｄ）、（Ｌ）、又は（ＤＬ）によって指定されており、さらに、立体配置が指定されていない場合には、アミノ酸又は残基は、立体配置（Ｄ）、（Ｌ）、又は（ＤＬ）を有することが可能である。本発明のいくつかの化合物の構造が、不斉炭素原子を包含することは注目されるであろう。したがって、かかる不斉性から生じる異性体が、本発明の範囲内に含まれることは理解されるべきである。

かかる立体異性体は、古典的な分離技術により、また立体化学的に制御された合成により、実質的に純粋な形状で取得可能である。本出願では、特に反対に表示されない限り、指名されたアミノ酸は（Ｄ）又は（Ｌ）立体異性体の双方を包含すると解釈するものとする。

本文に使用される語句「保護基」は、反応性の官能基を、望ましくない化学反応から保護する置換基を意味する。かかる保護基の実例は、カルボン酸及びボロン酸のエステル、アルコールのエーテル、及び、アルデヒド及びケトンのアセタール及びケタールを包含する。例えば、本文に使用される語句「Ｎ末端保護基」又は「アミノ末端保護基」は、合成手順を通して、アミノ酸又はペプチドのＮ末端を、望ましくない反応に対し保護するべく使用可能な、種々のアミノ保護基を指す。好適な基の実例は、アシル保護基、例えばホルミル、ダンシル、アセチル、ベンゾイル、トリフルオロアセチル、スクシニル、及びメトキシスクシニル；芳香族ウレタン保護基、例えば、ベンジルオキシカルボニル（ｃｂｚ）；及び脂肪族ウレタン保護基、例えばｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）又は９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）を包含する。

本発明のいくつかのポリペプチドは、特定の幾何又は立体異性体の形状で存在してもよい。本発明は、シス−及びトランス−異性体、Ｒ−及びＳ−エナンチオマー、ジアステレオマー、（Ｄ）−異性体、（Ｌ）−異性体、それらのラセミ混合物、及びそれらの他の混合物を含め、かかる形状の全てを、本発明の範囲内に入るものとして考察する。付加的な不斉炭素原子が、アルキル基のような置換基に存在してもよい。全てのかかる異性体、並びにそれらの混合物は、本発明に包含されるべく意図されている。

修飾されたＨＬＳ−５ポリペプチドの機能（活性）の類似性は、実質的に、野生型ＨＬＳ−５ポリペプチドの活性と同じである。代替えとして、修飾されたポリペプチドの機能（活性）の類似性は、野生型ＨＬＳ−５ポリペプチドの活性よりも高くてもよい。相同体、変異体、誘導体、又はフラグメントの機能／生物活性は、野生型に比較して、例えば、バイオアッセイにより測定されてよい。例えば、ヒーラ又はコス（ＣＯＳ）細胞へ投与された場合、ＨＬＳ−５は、ＰＩＡＳ１、ＵＢＣ９、及びＳＵＭＯ−１のレベルを低減し、結果として、いくつかのタンパク質産物の全体的なＳＵＭＯ化の低減と、他のものの誘導とを生じる。したがって、１つのインビボのＳＵＭＯ化アッセイは、ヒーラ又はコス細胞、すなわち組織など、に対する変異体の投与と、該細胞が、個々のタンパク質産物のＳＵＭＯ化の変更されたレベルを有するかどうかを、ウエスタン分析により測定することにより、タンパク質ＳＵＭＯ化のＨＬＳ−５修飾を試験することを包含する。好ましい相同体、変異体、及びフラグメントは、完全長のＨＬＳ−５に比較して少なくとも０．５倍、好ましくは少なくとも０．９倍、ＳＵＭＯ化を阻害することが可能である。ＨＬＳ−５と、ＳＵＭＯ化マシーナリの要素との相互作用に基づくもう１つの試験は、ＳＵＭＯ−１修飾アッセイをインビトロで行うことである。基本的には、１μｇの当該タグ付きタンパク質を基質として、並びに１μｇのＥ１（ＧＳＴ−Ｕｂａ２，Ｈｉｓ_６−Ａｏｓ１）、２μｇのＥ２（Ｕｂｃ９）、及び１μｇのＳＵＭＯ−１を、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＡＴＰ、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、及び０．１ｍＭジチオスレイトールを含んでなる溶液中に含有する、２０μｌの反応混合物は、３０℃で２時間インキュベートされる（例えば、ハタケヤマ（Ｈａｔａｋｅｙａｍａ）ら著、「ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー」、２００１年、第２７６巻、ｐ．３３１１１−３３１２０参照）。このアッセイは、ＨＬＳ−５の存在下又は不在下におこなわれることが可能である。反応は、５％β−メルカプトエタノールを含有するＳＤＳ試料緩衝液の添加により終了され、８８℃で５分間加熱される。試料は次に、１２％ゲル上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画され、用いたタグにしたがって、ＳＵＭＯ−１（２μｇ／ｍｌ、抗ＧＭＰ−１）、Ｍｙｃ（１μｇ／ｍｌ、９Ｅ１０）、又はＧＳＴ（１μｇ／ｍｌ）に対するマウスモノクローナル抗体を用いたイムノブロット分析を受けることが可能である。免疫複合体は、マウス免疫グロブリンに対する、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート・ウサギポリクローナル抗体を用いて検出可能である。タンパク質基質の阻害の程度を測定するための、インビトロのＳＵＭＯ化アッセイにおいて、ＨＬＳ−５に対する変異体又はフラグメント。好ましい相同体、変異体、及びフラグメントは、完全長ＨＬＳ−５に比較して、少なくとも０．５倍、好ましくは少なくとも０．９倍、ＨＬＳ−５に結合することが可能である。適切なインビトロのＳＵＭＯ化アッセイは、当業者に周知であり、例えば、１つの基質がＳＵＭＯ化マシーナリの成分へ添加され、修飾された、又は「ＳＵＭＯ化」生成物が定量又は観察される、「ＳＵＭＯ化」アッセイである。

修飾されたポリペプチドは、通常の技術を用いて合成されてよく、或いは、修飾された核酸によりコードされ、かつ通常の技術を用いて産生される。修飾された核酸は、通常の技術を用いて調製される。野生型ＨＬＳ−５遺伝子機能と実質的に類似した機能をもつ核酸は、上述の修飾されたタンパク質を産生する。

実質的に完全長のポリペプチドの他に、本発明は該ポリペプチドの生物活性フラグメントを提供する。生物活性フラグメントは、ＳＵＭＯ化制御活性を保持しているポリペプチドフラグメントである。

本発明はまた、ＨＬＳ−５ポリペプチド及びフラグメントを含んでなる、融合ポリペプチドも提供する。同種ポリペプチドは、２以上のＨＬＳ−５ポリペプチド配列間か、又はＨＬＳ−５と関連タンパク質配列間の融合物であってよい。同様に、誘導体タンパク質の特性又は活性の組合せを示すであろう異種融合物が構築されてよい。

例えば、リガンド結合性の、又は他のドメインは、別々の新しい融合ポリペプチド又はフラグメント間で「交換」されてもよい。かかる同種又は異種融合ポリペプチドは、例えば、修正された、結合の強さ又は特異性を示してもよい。融合相手は、免疫グロブリン、細菌のβガラクトシダーゼ、ｔｒｐＥ、プロテインＡ、β−ラクタマーゼ、アルファアミラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、及び酵母アルファ接合因子を包含する。

融合タンパク質は、典型的には、下文に記述されるような、組換え核酸法によって製されるか、又は化学的に合成されてもよい。

「タンパク質精製」は、ＨＬＳ−５ポリペプチドの、他の生物材料からの、例えばＨＬＳ−５をコードしている組換え核酸で形質転換された細胞からの、単離のための種々の方法を指し、当該技術分野において周知である。例として、かかるポリペプチドは、例えば本発明により提供された抗体を用いた、イムノアフィニティクロマトグラフィーにより精製されてもよい。種々のタンパク質精製法が、当該技術分野において周知である。

用語「単離された」、「実質的に純粋な」、及び「実質的に均一な」は、天然の状態でＨＬＳ−５ポリペプチドに随伴している成分から分離された、ＨＬＳ−５ポリペプチドを表すべく、交換可能として使用されている。モノマータンパク質は、試料の少なくとも約６０−７５％が単一のポリペプチド配列を示す場合、実質的に精製されている。実質的に精製されたタンパク質は、典型的にはタンパク質試料の約６０−９０％ Ｗ／Ｗを含んでなり、通常は約９５％、好ましくは約９５％を超える。タンパク質純度又は均一性は、当該技術分野において周知の多くの手段により示されてよく、例えば、タンパク質試料のポリアクリルアミドゲル電気泳動と、それに続くゲル染色時に単一のポリペプチドバンドを可視化することによる。いくつかの目的のためには、より高い解像力が、ＨＰＬＣ又は、当該技術分野において周知の実用されている他の手段を用いることにより、提供されてもよい。

ＨＬＳ−５ポリペプチドは、天然の状態でＨＬＳ−５ポリペプチドに随伴している天然の不純物から分離される場合、天然に随伴する成分が実質的にないものである。

したがって、化学的に合成されるか、又は、そこから天然に発生された細胞とは異なる細胞系において合成されるＨＬＳ−５ポリペプチドは、その天然に会合していた成分を実質的に有さない。タンパク質はまた、当該技術分野において周知のタンパク質精製技術を用いた単離による、天然に会合していた成分を実質的に有さなくてもよい。

単離されかつ操作された遺伝配列の、発現産物として産生されたＨＬＳ−５ポリペプチドは、たとえ同種の細胞タイプにおいて発現された場合でも、本文に用いたように「単離されたポリペプチド」である。合成により製された形状、又は異種の細胞により発現された分子は、本来、単離された分子である。

本発明のいくつかの実施態様においては、用語「ＨＬＳ−５タンパク質」又は「ＨＬＳ−５ポリペプチド」は、ＨＬＳ−５ポリヌクレオチド配列によってコードされたタンパク質又はポリペプチドか、或いはその変異体又は機能フラグメントを指す。また、ＨＬＳ−５をコードするポリヌクレオチドに対し高ストリンジェント条件下にハイブリダイズするＤＮＡによってコードされたＨＬＳ−５ポリペプチド、及び、ＨＬＳ−タンパク質に対する抗血清により回収される、密に関連したポリペプチドも包含される。したがって、いくつかの態様においては、用語「ＳＵＭＯ化制御剤」は、ＨＬＳ−５ポリペプチドをコードしているＨＬＳ−５ポリヌクレオチド分子、アレル変異体、又はその類似体を、機能フラグメントを含めて、含んでなる。

本発明の好ましいポリヌクレオチド分子は、配列番号１又は配列番号３に示されたポリヌクレオチド分子配列か、又はその機能フラグメントを包含する。

ポリヌクレオチドは、もし、その天然の状態において、又は当業者に周知の方法により操作された場合、対応するＲＮＡ及び／又はポリペプチドか、又はそのフラグメントを産生するべく、転写及び／又は翻訳されることが可能であれば、ポリペプチドを「コードしている」と言われる。アンチセンス鎖は、かかる核酸の相補体であって、コードしている配列はそこから演繹されることが可能である。

「単離された」又は「実質的に純粋な」核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、又は混合ポリマー）は、天然のヒト配列又はタンパク質に天然に随伴する他の細胞成分、例えばリボソーム、ポリメラーゼ、多くの他のヒトゲノム配列、及びタンパク質から、実質的に分離されたものである。この用語は、その天然に生じた環境から除去された核酸配列又はタンパク質を包含し、組換え又はクローンされたＤＮＡ単離体、及び、化学的に合成された類似体、又は異種の系により生物学的に合成された類似体を包含する。

「ＨＬＳ−５遺伝子配列」、「ＨＬＳ−５遺伝子」、「ＨＬＳ−５核酸」、又は「ＨＬＳ−５ポリヌクレオチド」は、コーディング配列、介在配列、及び、転写及び／又は翻訳を制御する調節エレメントを包含する。この用語は、その配列の全てのアレル変異体を包含するべく意図されている。

これらの用語は、ＨＬＳ−５ポリペプチド、フラグメント、相同体、又は変異体を、例えば、タンパク質融合物又は欠失物を含めて、コードしている核酸を指す。本発明の核酸は、天然のＨＬＳ−５コーディング遺伝子に、由来するか又は実質的に類似した配列か、或いは、天然のＨＬＳ−５をコードする遺伝子又はその一部と実質的に相同性を有する配列をもつことができる。マウスＨＬＳ−５ポリペプチドのためのコーディング配列は、配列番号１に示されており、そのアミノ酸配列は、配列番号２に示されている。ヒトＨＬＳ−５ポリペプチドのためのコーディング配列は、配列番号３及び配列番号７に示されており、そのアミノ酸配列は、配列番号４及び配列番号８に示されている。

核酸又はそのフラグメントは、別の核酸（又はその相補鎖）と最適にアラインされたとき（適当なヌクレオチド挿入又は欠失を用いて）、少なくとも約６０％のヌクレオチド塩基、通常は少なくとも約７０％、さらに通常では少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、及び最も好ましくは少なくとも約９５−９８％のヌクレオチド塩基において、ヌクレオチド配列の同一性があれば、別の核酸に対し「実質的に相同」（「又は実質的に類似」である。

別法として、実質的な相同性又は（同一性）は、核酸又はそのフラグメントが、選択的ハイブリッド形成条件下に、別の核酸（又はその相補鎖）に対し、別の鎖に対し、又はその相補体に対し、ハイブリッド形成することができる場合に存在する。ハイブリッド形成の選択性は、全くの特異性の欠如よりも実質的により選択的であるハイブリッド形成が起こる場合に存在する。典型的には、選択的ハイブリッド形成は、少なくとも約１４個のヌクレオチドの範囲にわたり、少なくとも約５５％、好ましくは少なくとも約６５％、さらに好ましくは少なくとも約７５％、及び最も好ましくは少なくとも約９０％の、同一性がある場合に起こることができる。相同性比較の長さは、記述されたように、より長い範囲にわたってよく、いくつかの実施態様においては、しばしば、少なくとも約９ヌクレオチド、通常は少なくとも約２０ヌクレオチド、さらに通常は少なくとも約２４ヌクレオチド、典型的には少なくとも約２８ヌクレオチド、さらに典型的には少なくとも約３２ヌクレオチド、及び好ましくは少なくとも約３６以上のヌクレオチドの範囲にわたることができる。

したがって、本発明のポリヌクレオチドは、本文にリストされている配列中に示された配列に対し、好ましくは少なくとも７５％、さらに好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％の相同性を有する。さらに好ましくは、少なくとも９５％、さらに好ましくは、少なくとも約９８％の相同性がある。ヌクレオチド相同性比較は、下文に記述されたように、ポリペプチドについて行われてもよい。好ましい配列比較プログラムは、下文に記述されたＧＣＧウィスコンシン・ベスト・フィット・プログラムである。デフォルトスコアリングマトリックスは、各同一ヌクレオチドにつきマッチバリュー１０を、各ミスマッチには−９を有する。デフォルトギャップ生成ペナルティは、−５０であり、デフォルトギャップ伸長ペナルティは、各ヌクレオチドにつき−３である。

本発明の文脈においては、相同配列は、配列番号１又は配列番号３に示されたヌクレオチド配列をもつ、少なくとも２０、５０、１００、２００、３００、５００、又は１０００ヌクレオチドにわたるアミノ酸レベルで、少なくとも６０，７０，８０、又は９０％同一、好ましくは少なくとも９５又は９８％同一である、ヌクレオチド配列を包含するものと理解される。特に、相同性は、典型的には、非本質的な隣接配列よりもむしろ、タンパク質の機能にとり本質的であることが公知の、連続したアミノ酸配列をコードしている配列の領域について検討されるべきである。したがって、例えば相同性比較は、好ましくは、配列番号２、配列番号４、または配列番号８に示されたＨＬＳ−５アミノ酸配列の、リングフィンガー、Ｂボックス、コイルドコイル、及び／又はＳＰＲＹドメインに対応する領域にかけて行われる。

本発明の好ましいポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１１１−１５２、２１９−２６６、又は３６８−５０７をコードする１以上の配列番号１のヌクレオチド配列、又は配列番号３の同等のヌクレオチド配列に対し、５０、６０、又は７０％を超える相同性、さらに好ましくは、８０、９０、９５、又は９７％を超える相同性を有する連続配列を含んでなる。

好ましいポリヌクレオチドは、配列番号２のアミノ酸３６−７５をコードする、配列番号１の配列か、または配列番号３の対応するヌクレオチド配列に対し、８０、９０、９５、又は９７％を超える相同性を有する連続配列を、代替え的に、又は付加して含んでなってもよい。別の好ましいポリヌクレオチドは、配列番号２のアミノ酸１−３５、７６−１１０、１５３−２１８、及び／又は２６７−３６７をコードする、配列番号１の配列か、または配列番号３の対応するヌクレオチド配列に対し、４０、５０、６０、又は７０％を超える相同性、さらに好ましくは、８０、９０、９５、又は９７％を超える相同性を有する連続配列を含んでなる。

ヌクレオチド配列は、好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド長、さらに好ましくは少なくとも２０、３０、４０、５０、１００、又は２００ヌクレオチド長である。

一般に、ポリヌクレオチドの長さが短いほど、選択的ハイブリッド形成に必要な相同性は大きい。結果として、本発明のポリヌクレオチドが約３０未満のヌクレオチドからなる場合、％同一性は、本文にリストされた配列中に示されたＨＬＳ−５ヌクレオチド配列に比較して、７５％を超え、好ましくは９０％又は９５％を超えることが好ましい。

逆に、本発明のポリヌクレオチドが、例えば５０又は１００を超えるヌクレオチドからなる場合、本文にリストされた配列中に示されたＨＬＳ−５ヌクレオチド配列に比較した％同一性は、低くてよく、例えば、５０％より大きく、好ましくは６０％又は７５％より大きい。

核酸ハイブリッド形成は、当業者に容易に理解されるように、塩基組成、相補鎖の長さ、及びハイブリッド形成している核酸間のヌクレオチド塩基ミスマッチの数に加えて、塩濃度、温度、又は有機溶媒といった条件により影響されることがある。ストリンジェントな温度条件は、一般に、３０℃を超える、典型的には３７℃を超える、及び好ましくは４５℃を超える温度を包含することができる。ストリンジェントな塩条件は、通常１０００ｍＭ未満、典型的には５００ｍＭ未満、及び好ましくは２００ｍＭ未満であることができる。しかしながら、任意の単独のパラメータの尺度よりも、パラメータの組合せの方がはるかに重要である。ストリンジェントなハイブリッド形成条件の実例は、６５℃及び０．１ｘＳＳＣ（１ｘＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム ｐＨ７．０）である。

本発明の「ポリヌクレオチド」組成物は、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成フォーム、及び混合ポリマー、センス及びアンチセンス鎖双方、を包含しており、当業者に容易に理解されるように、化学的又は生化学的に修飾されてよく、或いは非天然又は誘導されたヌクレオチド塩基を含有してもよい。かかる修飾は、例えば、標識、メチル化、類似体による１以上の天然産のヌクレオチドの置換、インターヌクレオチド修飾、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスファート、ホスホトリエステル、ホスホアミダート、カルバマートなど）、荷電結合（例えば、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアートなど）、ペンダント成分（例えば、ポリペプチド）、インターカレーター（例えば、アクリジン、プソラレンなど）、キレート化剤、アルキル化剤、及び修飾結合（例えば、アルファアノマー核酸など）を包含する。また、水素結合及び他の化学的相互作用により所望の配列に対し結合するその能力において、ポリヌクレオチドを模倣する合成分子も包含される。

かかる分子は、当該技術分野において公知であり、例えば、分子の主鎖において、そのペプチド結合がリン酸結合を置換しているものである。本発明は、全ての、又は一部のＨＬＳ−５領域を含んでなる、組換え核酸を提供する。組換え核酸構築物は、宿主細胞内で自律的に複製することができよう。別法として、組換え構築物は、宿主細胞の染色体ＤＮＡ内へインテグレートされるようにしてもよい。かかる組換えポリヌクレオチドは、ゲノム、ｃＤＮＡ、半合成、又は合成起源のポリヌクレオチドであって、その起源又は操作によって：１）自然界でそれが随伴しているポリヌクレオチドの全て又は一部と随伴していないもの；及び／又は、２）自然界でそれが結合しているもの以外のポリヌクレオチドに対し結合されているもの；又は、３）自然界に生じないもの、を含んでなる。

それゆえ、さもなければ天然には生じない配列を含んでなる組換え核酸が、本発明によって提供される。野生型配列もまた使用されてよいが、それは、例えば欠失、置換、又は挿入により、しばしば変更されることがある。

「組換え核酸」は、天然には生じない核酸か、又は２つの、さもなければ分離された配列のセグメントの人為的な組合せにより製されるものである。この人為的な組合せは、化学的合成手段によるか、或いは、単離された核酸のセグメントの、遺伝子工学技術による人為的操作により、しばしば達成される。かかる操作は、通常、典型的には配列認識部位を導入又は除去すると同時に、コドンを、同じか又は保存アミノ酸をコードしている重複コドンで置換えるべく行われる。別法として、所望の機能をもつ核酸セグメントをつなぎ合わせて、所望の機能の組合せを生じることが行われる。種々のタイプのｃＤＮＡ又はゲノムライブラリが、本発明の核酸の天然の供給源としてスクリーンされてよく、或いは、かかる核酸は、ゲノムＤＮＡ又は他の天然の供給源に内在する配列の、例えばＰＣＲによる増幅によって提供されてもよい。ｃＤＮＡライブラリの選択は、標準的には、所望のタンパク質のためのｍＲＮＡに富む組織供給源に対応する。ファージライブラリが、標準的には好ましいが、他のタイプのライブラリが使用されてもよい。ライブラリのクローンは、プレート上に広げられ、スクリーニング用のサブストレートへ移され、変性され、所望の配列の存在についてプローブされる。

本発明に使用された核酸配列は、通常、少なくとも約５コドン（１５ヌクレオチド）、さらに通常には少なくとも約７−１５コドン、及び最も好ましくは少なくとも約３５コドンを含んでなることができる。このヌクレオチド数は、通常はほぼ、本文に記述されたＳＵＭＯ化を制御することがなお可能な良好なＨＬＳ−５フラグメントに必要な、最低限の長さである。

核酸操作のための技術は、全盤的に、例えばサンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら著、１９８９年、上記、又はアズベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら著、「カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、１９９２年、に記述されている。制限酵素などといった、かかる技術の適用において有用な試薬は、当該技術分野において広く知られており、ニューイングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）、ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、プロメガ・バイオテック（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ）、ＵＳバイオケミカルズ（ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、ニューイングランド・ヌクレアー（Ｎｅｕ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ）のような供給業者、及び多くの他の供給源から市販されている。本発明の融合タンパク質を産生するべく使用される組換え核酸配列は、天然の、又は合成による配列から由来してよい。多くの天然の遺伝子配列が、種々のｃＤＮＡから、又はゲノムライブラリから、適当なプローブを用いて取得される。ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）参照。

本文に使用されたように、用語「ＨＬＳ−５遺伝子配列」は、当該遺伝子配列又は領域を含んでなる二本鎖ＤＮＡ、並びに、当該遺伝子配列又は領域を含んでなるどちらかの一本鎖ＤＮＡ（すなわち、コーディング鎖及び非コーディング鎖のどちらか）を含んでなる。

本文に使用されたように、ＨＬＳ−５遺伝子配列又は領域の一「部分」は、少なくとも約８ヌクレオチド、又は好ましくは約１５ヌクレオチド、又は、さらに好ましくは少なくとも約２５ヌクレオチドの最小サイズを有するものと定義され、少なくとも約４０ヌクレオチドの最小サイズを有してもよい。

ＨＬＳ−５ポリペプチド又はそのフラグメントは、任意の公知の分子技術により取得されてよい。ＰＣＲは、ＨＬＳ−５遺伝子配列を得るべく使用されてよい、かかる技術の１つである。この技術は、例えば、メッセンジャーＲＮＡを含めてＤＮＡ又はＲＮＡを増幅してよく、該ＤＮＡ又はＲＮＡは、単鎖か、または二本鎖でもよい。ＲＮＡが鋳型として使用されるべき事象においては、該鋳型をＤＮＡへ逆転写するために最適な、酵素及び／又は条件が利用されることとなる。加えて、それぞれの一方の鎖を含有するＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドが利用されてもよい。核酸の混合物もまた使用されてよく、本文に記述された先行する増幅反応において、同じか又は異なるプライマーを用いて産生された核酸も、同様に使用されてよい。

増幅されるべき特定の核酸配列、すなわちＨＬＳ−５遺伝子配列は、より長い分子の一部であってよく、或いは、最初は個別の分子として存在し、特定の配列が全核酸を構成するようにすることも可能である。増幅されるべき配列が最初に純粋な形状で存在することは必要ではない；全ヒトＤＮＡ中に含有されるような、複合混合物の小部分であってよい。

本文において利用されるＤＮＡは、血液、及び組織材料などといった、身体試料から、多様な技術、例えばマニアチスらによって記述されたもの、１９８２年、上記、により、抽出されてよい。抽出された試料が精製されていない場合、増幅に先立ち、細胞又は試料の動物細胞膜を開けるべく、かつ鎖を露出及び／又は分離させるべく、有効な量の試薬で処理されてもよい。鎖を露出及び分離させるための、溶解及び核酸変性段階は、増幅がよりに容易に起こるようにすることができる。

デオキシリボヌクレオチド三リン酸、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰは、合成混合物に対し、別々に、又はプライマーと一緒に、適切な量で添加され、結果として得られた溶液は、約９０℃−１００℃に、約１から１０分間、好ましくは１から４分間加熱される。この加熱時間の後、溶液は冷却されるが、これはプライマーのハイブリッド形成にとり好ましい。冷却された混合物に対し、プライマー伸長反応を引き起すために適切な薬剤（本文では「重合用薬剤」と呼ばれる）が添加され、反応は、当該技術分野において公知の条件下に起こるようにする。重合用薬剤は、もし熱安定性であれば、他の試薬と一緒に添加されてもよい。この合成（又は増幅）反応は、室温から、それより上では重合用試薬がもはや機能しない温度まで、行われてよい。

したがって、例えば、もしＤＮＡポリメラーゼが薬剤として使用されるなら、温度は一般に約４０℃を超えない。最も好都合には、反応は室温で行われる。

重合用薬剤は、酵素を含め、プライマー伸長産物の合成を達成するべく機能する、任意の化合物又は系であってよい。

この目的のために好適な酵素は、例えば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメント、ポリメラーゼ突然変異タンパク質、逆転写酵素、他の、熱安定酵素（すなわち、変性を引き起すべく充分に上げられた温度にさらされた後に、プライマー伸長を行う酵素）を含めた酵素、例えばＴａｑポリメラーゼを包含する。好適な酵素は、適正な方法でヌクレオチドの組合せを促進して、各ＨＬＳ−５遺伝配列核酸鎖に対し相補的な、プライマー伸長産物を形成することができる。一般に、合成は各プライマーの３’末端で開始され、合成が終了するまで、鋳型鎖に沿って５’方向へ進行することができ、異なる長さの分子を産生する。

新たに合成されたＨＬＳ−５鎖と、その相補的核酸鎖は、上記のハイブリッド形成条件下に二本鎖分子を形成することができ、このハイブリッドが、プロセスのその後の段階において使用される。次の段階では、新たに合成されたＨＬＳ−５二本鎖分子は、上述の任意の方法を用いた変性条件にさらされ、単鎖分子を与える。

変性、アニーリング、及び伸長産物合成の段階は、標的多形遺伝子配列核酸配列を、検出に必要な程度まで増幅するべく必要な回数だけ反復されることが可能である。産生される特定の核酸配列の量は、指数的に蓄積することができる。増幅は、例えば、マクファーソン（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ）ら編、「ＰＣＲ。ア・プラクティカル・アプローチ（ＰＣＲ．Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）」、ＩＬＲプレス（ＩＬＲ Ｐｒｅｓｓ）、１９９２年、に記述されている。

本発明の方法により増幅された配列は、溶液中で、又は固形支持体へ結合された後、ＰＣＲ、オリゴマーレストリクション（サイキ（Ｓａｉｋｉ）ら著、「バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、１９８５年、第３巻、ｐ．１００８−１０１２）、アレル特異オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）プローブ分析（コナー（Ｃｏｎｎｅｒ）ら著、「プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）」、１９８３年、第８０巻、ｐ．２７８）、及びオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡｓ）（ランドグレン（Ｌａｎｄｇｒｅｎ）ら著、「サイエンス」、１９８８年、第２４１巻、ｐ．１００７）などといった、通常特定のＤＮＡ配列を検出するべく適用される任意の方法により、さらに、評価され、検出され、クローン化され、及び配列決定されることなどが可能である。ＤＮＡ分析用の分子技術は、総説されている（ランドグレンら著、「サイエンス」、１９８８年、第２４２巻、ｐ．２２９−２３７）。

本発明のＨＬＳ−５ポリヌクレオチドを取得する方法は、本文に記述され、かつ当業者により一般的に使用される、ＰＣＲを包含する。代替えの増幅法が記述されており、本発明のプライマーを用いたＰＣＲにより増幅されるＨＬＳ−５遺伝子配列が、代替え手段によって同様に増幅される限り、また使用可能である。かかる代替えの増幅システムは、制限されることなく自己持続配列複製を包含するが、これは当該ＲＮＡの短い配列及びＴ７プロモーターを用いて開始する。逆転写酵素はＲＮＡをｃＤＮＡへコピーして該ＲＮＡを分解し、続いて逆転写酵素が第２のＤＮＡ鎖を重合する。もう１つの核酸増幅技術は、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）であり、これは逆転写及びＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用し、そのサイクリングスキームを標的とするべく、２つのプライマーを取り入れる。ＮＡＳＢＡは、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれを用いても開始可能であり、いずれを用いても終了可能であって、６０分―１００分以内に１０８コピーまで増幅する。

別法として、ＨＬＳ−５ポリヌクレオチドは、連結活性化転写（ｌｉｇａｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ，ＬＡＴ）により増幅可能である。ＬＡＴは、単鎖の鋳型と、部分的に単鎖でありかつ部分的に二本鎖である単一のプライマーとを用いて作動する。増幅は、ｃＤＮＡのプロモーターオリゴヌクレオチドへの連結により開始され、数時間以内の増幅は１０８−１０９倍である。ＱＢレプリカーゼ系は、ＭＤＶ−１と呼ばれるＲＮＡ配列を、当該ＤＮＡ配列に相補的なＲＮＡに対し、結合することによって利用可能である。試料との混合に際し、ハイブリッドＲＮＡは、その標本のｍＲＮＡの中からその相補体を検出して結合し、レプリカーゼを活性化し、当該タグづたいの配列をコピーする。もう１つの核酸増幅技術、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）は、２つの個別に標識された、当該配列の半分を使用することにより作動するが、それらは試料中の連続配列の存在下での連結により共有結合されて、新たな標的を形成する。修復連鎖反応（ＲＣＲ）核酸増幅技術は、２つの相補的及び標的特異なオリゴヌクレオチドプローブペア、熱安定性のポリメラーゼ及びリガーゼ、及び、標的配列を幾何学的に増幅するためのＤＮＡヌクレオチドを使用する。２塩基のギャップがオリゴヌクレオチドプローブペアを分離しており、ＲＣＲは、このギャップを埋めて結合させ、正常なＤＮＡ修復を模倣する。鎖置換活性化（ＳＤＡ）による核酸増幅は、ＨｉｎｃＩＩ用の認識部位を含有し、５’末端に標的ＤＮＡと結合する短い突出をもつ、短いプライマーを利用する。ＤＮＡポリメラーゼは、該突出の反対側のプライマー部分を、硫黄を含有するアデニン類似体で埋める。ＨｉｎｃＩＩが添加されるが、未修飾のＤＮＡ鎖のみを切断する。５’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＤＮＡポリメラーゼは、このニック部位に侵入し、重合化を開始し、最初のプライマー鎖を下流に向けて置き換え、さらなるプライマーとして役立つ新たな１つを構築する。ＳＤＡは、３７℃において、２時間に１０７倍を超える増幅をもたらす。ＰＣＲ及びＬＣＲと異なり、ＳＤＡは、器具を装備された温度サイクリングを必要としない。本発明の方法において有用なもう１つの増幅系は、ＱＢ複製系である。ＰＣＲは、本発明において使用される好ましい増幅法であるが、これらの別の方法もまた、本発明の方法において記述されたように、ＨＬＳ−５遺伝子配列を増幅するべく使用可能である。

本発明の大量のＨＬＳ−５ポリヌクレオチドはまた、好適な宿主細胞における複製により、産生されてもよい。所望のフラグメントをコードしている、天然又は合成のポリヌクレオチドフラグメントは、原核又は真核細胞内に導入及び複製可能な、組換えポリヌクレオチド構築物、通常はＤＮＡ構築物中へ取り込まれることができる。通常、ポリヌクレオチド構築物は、酵母又は細菌のような、単細胞宿主内での複製に好適であろうが、原核細胞系以外の培養哺乳類又は植物細胞系への導入（ゲノム内への組込み有り及び無しの）用に意図されてもよい。

二本鎖フラグメントは、化学合成の単鎖産物から、相補鎖を合成すること、及び適当な条件下に鎖を一緒にアニールすることにより、或いは、ＤＮＡポリメラーゼを適当なプライマー配列と共に用いて相補鎖を加えることにより取得されてよい。

本発明のＨＬＳ−５ポリヌクレオチドは、原核及び真核宿主内への導入のための、組換え体の複製が可能なベクター内へ導入されてもよい。かかるベクターは、典型的には、所望のポリペプチドをコードしている意図されたポリヌクレオチドフラグメントを含む、宿主により認識される複製系を含んでなってもよく、好ましくはまた、該ポリペプチドをコードしているセグメントに対しオペラブルに連結された、転写及び翻訳開始調節配列を包含することもできる。発現ベクターは、例えば、複製の起点又は自律複製配列（ＡＲＳ）、及び発現制御配列、プロモーター、エンハンサー、及び、必要なプロセシング情報部位、例えばリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、転写終止配列、及びｍＲＮＡ安定化配列を包含してよい。分泌シグナルもまた、天然のＨＬＳ−５タンパク質からか、又は他の受容体からか、或いは、同じか又は関連する種の分泌されたポリペプチドであるかによって、適切な場合には包含されてよく、それにより、該タンパク質が細胞膜を横切ること、及び／又は、細胞内に留まることが可能になり、したがってその機能性のトポロジーを獲得し、或いは細胞から分泌されるようにする。かかるベクターは、当該技術分野において周知の標準的な組換え技術により調製されてよく、例えば、サンブルックら著、１９８９年、上記、又はアズベルら著、１９９２年、上記、において議論されている。

適当なプロモーター及び他の必要なベクター配列は、宿主において機能性であるべく選択されることができ、適切である場合には、ＨＬＳ−５遺伝子に天然に随伴しているものが包含されてよい。細胞系と発現ベクターとの、実行可能な組合せの実例は、サンブルックら著、１９８９年、上記、又はアズベルら著、１９９２年、上記に記述されている。数多くの有用なベクターが当該技術分野において公知であり、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ニューイングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、及びバイオテック（Ｂｉｏｔｅｃ）などの供給業者から入手されてよい。ｔｒｐ、ｌａｃのようなプロモーター、及び、ファージプロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、及び多糖分解酵素プロモーターが、原核宿主において使用されてよい。

有用な酵母プロモーターは、メタロチオネイン、ホスホグリセレートキナーゼ又は他の多糖分解酵素、例えばエノラーゼ又はグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、マルトース及びガラクトース利用に関与する酵素などのプロモーター領域を包含する。酵母発現における使用に好適なベクター及びプロモーターは、ヒッツマン（Ｈｉｔｚｍａｎ）ら著、「サイエンス」、１９８３年、第２１９巻、ｐ．６２０−６２５、にさらに記述されている。

好適な非天然の哺乳類プロモーターは、ＳＶ４０からの初期及び後期プロモーター、又は、ネズミモロニー白血病ウイルス、マウス腫瘍ウイルス、トリ肉腫ウイルス、アデノウイルスＩＩ，ウシパピローマウイルス、又はポリオーマから由来したプロモーターを包含してもよい。加えて、構築物は、増幅可能な遺伝子（例えば、ＤＨＦＲ）を接合して、遺伝子の多数のコピーが製されるようにしてもよい。

当該発現ベクターは自律的に複製してもよいが、それらはまた、当該技術分野において周知の方法により、宿主細胞のゲノム内へ挿入されることにより複製されてもよい。

発現及びクローニングベクターはたいてい、該ベクターで形質転換された宿主細胞の生存又は増殖に必要なタンパク質をコードしている遺伝子である、選択可能マーカーを含有することができる。この遺伝子の存在は、インサートを発現する宿主細胞のみの増殖を保証する。典型的な選択遺伝子は、ａ）抗生物質又は他の毒性物質、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート、その他に対し抵抗性を与える、ｂ）栄養要求性欠陥を補足する、又は、ｃ）複合培地から入手できない重大な栄養物を与える、タンパク質をコードしており、例えば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｉ）に対するＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子である。適切な選択可能マーカーの選択は、宿主細胞に依存することがあり、また種々の宿主のための好適なマーカーは、当該技術分野において周知である。

本発明の当該核酸を含有するベクターは、インビトロで転写されることが可能であり、結果として得られたＲＮＡは、周知の方法、例えば注入により、宿主細胞内へ導入されるか、或いはベクターが直接に、当該当該技術分野において周知の方法により、宿主細胞内へ導入されることが可能であって、その方法は細胞宿主のタイプに依存して異なり：エレクトロポレーション；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、又は他の物質を用いたトランスフェクション；マイクロプロジェクタイル・ボンバードメント；リポフェクション；感染（ベクターが感染性媒介物である場合、例えばレトロウイルスゲノム）；及び、他の方法を含む。宿主細胞に対するポリヌクレオチドの、当該技術分野において周知の、とりわけ、上述のものを含めた、任意の方法による導入は、本文において「形質転換」と呼ばれることがある。その中にポリヌクレオチドが導入されている細胞は、かかる細胞の子孫を包含する。

したがって本発明は、本発明の核酸分子により形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。好ましい宿主細胞は、細菌、酵母、哺乳類細胞、植物細胞、昆虫細胞、及びヒト細胞を包含する。

実例として、かかる宿主細胞は、大腸菌、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バチルス（Ｂａｉｌｌｕｓ）、ストレプトミケス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、酵母、ＣＨＯ、Ｒ１．１、Ｂ−Ｗ、Ｌ−Ｍ、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＢＭＴ１０、及びＳｆ９細胞からなる群より選択される。

本発明の大量のＨＬＳ−５ポリペプチドは、ベクター又は他の発現ビヒクル内の、ＨＬＳ−５ポリヌクレオチド又はその一部を、適合性の原核又は真核宿主細胞において発現させることにより調製されてよい。最も一般に使用される原核宿主は、大腸菌株（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）であるが、他の原核生物、例えばバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）又はシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）もまた使用されてよい。

また、ＨＬＳ−５ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含有する哺乳類細胞であって、発現調節配列を、ＨＬＳ−５ポリペプチドコード配列に対し機能的に近接して挿入することからなる相同組換え事象によって、ＨＬＳ−５ポリペプチドのより高い発現を許すべく、インビトロで修飾された細胞も提供する。該発現調節配列は、ＨＬＳ−５ポリペプチド発現調節配列であることが可能であり、さもなければ、細胞内の突然変異型のＨＬＳ−５ポリペプチド現調節配列を置き換えることも可能である。

したがって、本発明はまた、ＨＬＳ−５ポリペプチドを調製するための方法であって：（ａ）上述の細胞を、上記の、ＨＬＳ−５ポリペプチドの発現に備えた条件下に培養すること；及び（ｂ）発現されたＨＬＳ−５ポリペプチドを回収すること、を含んでなる方法も提供する。この方法はまた：（ｃ）当該技術分野において公知の、好適な任意の手段を用いて、ポリペプチドをクロマトグラフィーにかけること；及び、（ｄ）例えばゲル濾過により、ポリペプチドを精製すること、の段階を伴うことも可能である。

哺乳類、又は他の、酵母、糸状菌、植物、昆虫、又は両生類又は鳥類のような真核宿主もまた、本発明のタンパク質の産生のために有用であってよい。培養にある哺乳類細胞の増殖は、本質的に周知である。一般に使用される哺乳類宿主細胞系の実例は、ベロ（ＶＥＲＯ）及びヒーラ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、及び、Ｗ１３８、ＢＨＫ、及びコス細胞系であるが、当業者には、より高い発現、所望のグリコシル化パターン、又は他の特徴を提供するために、他の細胞系も好適であってよいことが理解されよう。

クローンは、ベクター構築の様式に依存して、マーカーを使用することにより選択される。マーカーは、同じか又は異なるＤＮＡ分子上、好ましくは同じＤＮＡ分子上であってよい。原核宿主においては、形質転換体は、例えばアンピシリン、テトラサイクリン、又は他の抗生物質に対する抵抗性により選択されてよい。

温度感受性に基づく特定の生成物の産生もまた、好適なマーカーとして役立ってよい。

本発明のポリヌクレオチドにより形質転換された原核又は真核細胞は、本発明の核酸及びポリペプチドの産生のためだけでなく、有用である。

いくつかの実施態様においては、「ＳＵＭＯ化制御剤」は、ＨＬＳ−５及び／又はＨＬＳ−５活性の、内在レベルを修飾することが可能な、化合物又は組成物である。用語「修飾する」は、ＨＬＳ−５の内在レベルについて本文に使用されるように、化合物又は組成物が、野生型及び／又は通常のレベルに比較して、ＨＬＳ−５及び／又はＨＬＳ−５活性の内在レベルを増大又は低減する能力を指す。ＨＬＳ−５及び／又はＨＬＳ−５活性の内在レベルを修飾することが可能な、化合物及び／又は組成物は、まず、インビトロの細胞ベースのアッセイを用いて同定されることが可能である。例えば、Ｃｈｒｏｍａ−Ｌｕｃ（登録商標）、Ｌｕｃ（登録商標）、又はＧＦＰ（登録商標）レポーター遺伝子のような系は、多数の異なるクローニングベクターフォーマットにおいて、提供されることが可能である。ベーシック（Ｂａｓｉｃ）ベクターバージョンは、そのデザインに基づく汎用性のレポーターベクターであって、例えば、ｐＧＬ３−ベーシックベクターのデザインは、真核プロモーター及びエンハンサー配列を欠いており、レポーター遺伝子の５’末端のＨＬＳ−５プロモーターのような、推定上の制御配列のクローニングを可能にする。ルシフェラーゼ、又は任意のレポーター遺伝子の発現、この「ｐＧＬ３−プロモーターベクター」でトランスフェクトされた細胞における活性は、ＨＬＳ−５プロモーターのような当該クローン化されたプロモーターを介して直接又は間接的に発現を誘導することができるエレメント又は化合物に依存する。ベーシックベクターの構造に加えて、他の系、例えばＣｈｒｏｍａ−Ｌｕｃ（登録商標）遺伝子が、ｐＧＬ３−コントロール（Ｃｏｎｔｒｏｌ）ベクターに類似した、ＳＶ４０プロモーター及びＳＶ４０エンハンサーを含有するベクター構造において利用可能である。ＳＶ４０プロモーター及びＳＶ４０エンハンサー配列の存在は、哺乳類の多くの細胞タイプにおいて、結果としてｌｕｃ＋の強力な発現を生じる。したがって、この技術及び任意の他のベクター修飾は、ＨＬＳ−５プロモーターの下流のレポーター遺伝子を測定することにより、ＨＬＳ−５タンパク質の発現を潜在的に修飾することができる化合物についてアッセイするための、マルチウエルプレートにおける、及びハイスループットアプリケーションにおける、迅速な定量化のために好適である。これらの同定された化合物は次に、内在性のＨＬＳ−５プロモーターもつ細胞内で試験され、ウエスタンブロットのような方法により、タンパク質発現がアッセイされることが可能である。一般に、フィルターされたルミネッセンスを測定することが可能な、任意のルミノメータは、二色アッセイを行うことができるはずであり、当該技術分野の熟練の科学者はこれらのアッセイを再現することができるはずである。

ＨＬＳ−５の修飾因子は、ＳＵＭＯ化コンジュゲート化系を、ＨＬＳ−５と接触させること、及び、ＨＬＳ−５の存在下に基質ポリペプチドのＳＵＭＯ化レベルを測定すること、により検出されてよい。本文に用いたように、用語「接触させること」は、ＳＵＭＯ化コンジュゲート化剤とＨＬＳ−５との、直接及び間接的な接触を包含する。接触は、当該技術分野において公知の任意の方法により行われてよく、例えば、ＳＵＭＯ化コンジュゲート化剤をＨＬＳ−５へ添加すること、或いはその逆である。本文に用いた用語「測定すること」は、コラビンら（２００４年、上記）の方法を含め、ＳＵＭＯ化のレベルを測定する任意の方法を包含し、内在性のＨＬＳ−５のアップレギュレーション又はダウンレギュレーション（すなわち、修飾されたレベル）を検出してもよい。「内在性ＨＬＳ−５」は、身体により産生されたＨＬＳ−５を指し、すなわち、外来の供給源からのものではない。

ＨＬＳ−５の修飾されたレベルは、統計的に有意でよく、すなわち、偶然にのみ起こると期待できるものよりも大きい。有意性は、典型的には、相応に小さいｐ値によって、ｐ＜０．０５のように定義される。統計的に有意な発見が、かならずしも臨床的に有意でないことがあり、すなわち、それは患者の症状に対する測定可能なインパクトをもつものではない。

ひとたびＳＵＭＯ化制御剤が、例えば、ＨＬＳ−５ポリペプチド、適当なベクター中のＨＬＳ−５ポリヌクレオチド、及び／又は、ＨＬＳ−５及び／又はＨＬＳ−５活性の内在レベルを修飾することができる化合物／組成物、が取得されれば、それらは次に、ＳＵＭＯ化を制御する目的で、患者へ投与される。いくつかの実施態様においては、患者は、ＳＵＭＯ化により影響されるか、制御されるか、又は悪化される症状を患っており、それゆえ、投与の段階は症状の治療を助ける。

一般に、用語「治療すること」及び「治療」などは、本文において、患者、例えばヒトの個体又は動物、その組織又は細胞に影響を及ぼし、所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を得ることを意味するべく使用される。該効果は、症状又はそのサイン又は徴候を、完全又は部分的に防止するという面で、予防的であってよく、及び／又は、部分的又は完全な症状の治癒という面では、治療的であってよい。本文において用いられた「治療すること」は、脊椎動物、哺乳類、特にヒトにおいて、ＳＵＭＯ化に関連するか、又はそれにより悪化される症状の、任意の治療、又は予防をカバーしており、かつ：（ａ）その症状の素因があってよいが、まだ症状があると診断されていない患者において、症状の発生を防止すること；（ｂ）症状を阻害すること、すなわちその発生を止めること；又は、（ｃ）症状を緩和又は軽減すること、すなわち症状の後退を引き起すこと、を包含する。

本文において使用される「患者」は、それにおいてＳＵＭＯ化活性の制御が所望される、動物患者を指す。患者は、ヒトでよく、或いは家畜、又は動物園の動物であってもよい。本発明のＳＵＭＯ化制御剤は、ヒトの医学的治療における使用に好適であることが特に考察されているが、それらはまた、イヌ及びネコのようなコンパニオンアニマル、ウマ、ウシ、及びヒツジのような家畜、又は、非ヒト霊長類、ネコ科、イヌ科、ウシ科、及び有蹄類のような動物園の動物の治療を含めた獣医学的治療にも適用可能である。

ＳＵＭＯ化制御剤は、当該技術分野において周知のように、治療されるべき症状、および患者の年齢、条件、及び体重に依存して、種々の形状で投与可能である。例えば、ＳＵＭＯ化制御剤が経口的に投与される場合、それらはタブレット、カプセル、顆粒、粉末、又はシロップとして製剤されてよく；或いは、非経口投与用には、それらは注射液（静脈内、筋肉内、又は皮下）、点滴注射製剤、又は坐剤として製剤されてよい。眼粘膜経路による適用には、それらは点眼薬又は眼軟膏として製剤されてもよい。これらの製剤は、通常の手段により調製されてよく、所望であれば、活性成分は、任意の通常の添加物、例えば賦形剤、結合剤、崩壊剤、潤滑剤、矯正剤、可溶化剤、懸濁剤、乳化剤、又はコーティング剤と混合されてもよい。用量は、症状、患者の年齢及び体重、治療又は予防されるべき症状の性質及び厳しさ、投与経路、及びＳＵＭＯ化制御剤の形状に依存して異なることができるが、一般に、約０．１から２０００ｍｇの一日用量のＳＵＭＯ化制御剤が、成人患者用に推奨され、これは単回用量又は分割用量で投与されてもよい。

ＳＵＭＯ化制御剤を投与するための有効な時間は、特定される必要がある。このことは、決まり切った実験により達成可能である。例えば、動物では、ＳＵＭＯ化制御剤によるＳＵＭＯ化活性の制御は、ＳＵＭＯ化制御剤を１日の特定な時間に投与すること、及び投与の効果を（もしあれば）、ＳＵＭＯ化に付随する１以上の指標を測定すること、及びこれらの指標の処置後の値を処置前の同じ指標の値と比較することにより測定すること、によって査定されることが可能である。

所与の患者において、治療の有効性の点で最も効果的な結果を生じることができる、ＳＵＭＯ化制御剤の厳密な投与時間、及び／又は、量は、特定のＳＵＭＯ化制御剤の活性、薬物動態、及びバイオアベイラビリティ、患者の生理学的条件（年齢、性別、疾患タイプ、及び病期、全身の物理的状態、所与の投薬量及び薬物投与に対する応答性を包含する）、投与経路その他に依存するであろう。しかしながら、上記のガイドラインは、治療を微調整するため、例えば、最適な、時間及び／又は投与量を決定するための、ベースとして使用可能であって、それは、患者をモニターすること、及び用量及び／又はタイミングを調整することを含んでなる、決まりきった実験法以上のものを必要としない。

本文において使用される語句「医薬的に有効な量」及び「治療上有効な量」は、ある所望の医薬的及び／又は治療的効果、例えば、任意の医学的治療に適用可能な妥当な利益／リスク比でのタンパク質のＳＵＭＯ化の阻害、をもたらすために有効な、ＳＵＭＯ化制御剤の量を意味する。

語句「医薬的に許容される」は、本文において、妥当な利益／リスク比に見合って、過剰な毒性、刺激、アレルギー性応答、又は他の問題又は合併症なしに、ヒト及び動物の組織と接触した使用に好適な、ＳＵＭＯ化制御剤、物質、組成物、及び／又は、剤形であって、堅実な医学的評価の範囲内にあるものを指す。

本文において用いられる語句「医学的に許容される担体」は、医薬的に許容される物質、組成物、又はビヒクルであって、例えば、１つの臓器又は身体の一部から、もう１つの臓器又は身体の部分への、ＳＵＭＯ化制御剤の運搬又は輸送に関与する、液体又は固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、又は封入剤を意味する。各担体は、製剤の他の成分と適合性であり、患者に対し有害ではないという意味で、「許容される」べきである。医薬的に許容される担体として役立つことが可能な材料のいくつかの実例は：（１）糖、例えばラクトース、グルコース、及びスクロース；（２）デンプン、例えばコーンスターチ及び馬鈴薯デンプン；（３）セルロース及びその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、及びセルロースアセテート；（４）粉末トラガカント；（５）モルト；（６）ゼラチン；（７）タルク；（８）賦形剤、例えばカカオバター及び坐剤ワックス；（９）油例えばラッカセイ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、及び大豆油；（１０）グリコール、例えばプロピレングリコール；（１１）ポリオール、例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトール、及びポリエチレングリコール；（１２）エステル、例えばオレイン酸エチル及びラウリン酸エチル；（１３）寒天；（１４）緩衝剤、例えば水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウム；（１５）アルギン酸；（１６）パイロジェンフリー水；（１７）等張食塩水；（１８）リンガー溶液；（１９）エチルアルコール；（２０）リン酸緩衝溶液；及び（２１）医薬製剤において用いられる他の非毒性の適合性物質、を包含する。

湿潤剤、乳化剤、及び潤滑剤、例えばラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウム、並びに着色剤、剥離剤、コーティング剤、甘味剤、風味剤および着香剤、保存剤、及び酸化防止剤もまた、本発明の製剤中に存在することが可能である。

医薬的に許容される酸化防止剤の実例は：（１）水溶性酸化防止剤、例えばアスコルビン酸、システイン塩酸塩、二亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、及び亜硫酸ナトリウムなど；（２）油性酸化防止剤、例えばアスコルビン酸パルミテート、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン；プロピルガレート、及びアルファ−トコフェロールなど；及び（３）金属キレート剤、例えばクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、及びリン酸など、を包含する。

本発明の方法において有用な製剤は、経口、経鼻、局所（バッカル及び舌下）、直腸、経膣、エアロゾル、及び／又は非経口投与に適したものを包含する。製剤は、単位用量の形状で便利に提供されてよく、薬学の技術分野において周知の、任意の方法により調製されてよい。単一の剤形を製するべく、担体物質と組合されることが可能な活性成分の量は、治療される宿主及び、特定の投与様式に依存して変わることがある。単一の剤形を製するべく、担体物質と組合されることが可能な活性成分の量は、一般に、治療効果をもたらす化合物の量であろう。一般に、１００パーセントのうち、この量は、約１パーセント−約９９パーセントの活性成分、好ましくは約５パーセントから約７０％まで、最も好ましくは約１０パーセントから約３０％までの範囲であることができる。

これらの製剤又は組成物を調製する方法は、ＳＵＭＯ化制御剤を、担体及び、任意に、１以上の付属成分と一緒にする段階を包含する。一般に、製剤は均一にかつ密接に、ＳＵＭＯ化制御剤を、液体担体又は超微粒子固形担体、又は双方と結合状態にさせ、必要であれば生成物を成形することにより調製される。

経口投与に適した製剤は、カプセル、カシェ剤、ピル、タブレット、ロゼンジ（風味づけされた基剤、通常はスクロース及びアラビアゴム又はトラガカントを使用）、粉末、顆粒の形状でよく、或いは水性又は非水性液体中の溶液又は懸濁液として、或いは水中油型又は油中水型エマルジョンとして、或いはエリキシル又はシロップとして、或いは香錠（不活性基剤、例えばゼラチン及びグリセリン、又はスクロース及びアラビアゴム使用）、及び／又は、マウスウォッシュなどとしてであってよく、各々が予め決められた量のＳＵＭＯ化制御剤を、活性成分として含有する。化合物はまた、ボーラス、舐剤、又はペーストとして投与されてもよい。

経口投与用の固形剤形（カプセル、タブレット、ピル、粉末、及び顆粒など）では、活性成分は１以上の医薬的に許容される担体、例えばクエン酸ナトリウム又は第二リン酸カルシウム、及び／又は、任意の以下のもの：（１）充填剤又は増量剤、例えばデンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、及び／又はケイ酸；（２）結合剤、例えばカルボキシメチルセルロース、アルギナート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、及び／又はアラビアゴム；（３）保湿剤、例えばグリセロール；（４）崩壊剤、例えば寒天、炭酸カルシウム、馬鈴薯又はタピオカデンプン、アルギン酸、一部のケイ酸塩、及び炭酸ナトリウム；（５）溶解遅延剤、例えばパラフィン；（６）吸収促進剤、例えば第四級アンモニウム化合物；（７）湿潤剤、例えば、アセチルアルコール、及びモノステアリン酸グリセロール；（８）吸収剤、例えばカオリン及びベントナイトクレー；（９）潤滑剤、例えばタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固形ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、及びそれらの混合物；及び（１０）着色剤、と混合される。カプセル、タブレット、及びピルの場合、医薬組成物はまた、緩衝剤を含んでなってもよい。類似したタイプの固形組成物はまた、充填剤として、ラクトース又は乳糖、並びに高分子量ポリエチレングリコールなどを用いた軟及び硬−充填ゼラチンカプセルにおいて使用されてもよい。

タブレットはまた、任意に１以上の付属成分とともに、圧縮又は成形により製されてもよい。圧縮タブレットは、結合剤（例えば、ゼラチン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）、潤滑剤、不活性希釈剤、保存剤、崩壊剤（例えば、グリコール酸デンプンナトリウム、又は架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）、界面活性剤又は分散剤を用いて調製されてもよい。成型タブレットは、不活性液体希釈剤で加湿された、粉末化ペプチド又はペプチドミメティックの混合物を、適当な機械で成型することにより製されてもよい。

タブレット及び他の固形剤形、例えば糖衣丸、カプセル、ピル、及び顆粒は、任意に、スコアされるか、又は、コーティング及びシェル、例えば腸溶コーティング又は他の、医薬−製剤技術分野において周知のコーティング用いて調製されてよい。それらはまた、例えば、所望の放出プロフィールを提供するべく比率を変えた、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、リポソーム、及び／又はミクロスフェアを用いて、その中の活性成分の、緩徐な、又は制御された放出を提供するべく製剤されてもよい。それらは、例えば、細菌保持性のフィルタを通す濾過によるか、又は使用直前に、滅菌水又は他の無菌の注射可能な媒体中に溶解されることが可能である滅菌剤を、無菌の固形組成物の形状で取り込むことにより滅菌されてもよい。これらの組成物はまた、任意に乳白剤を含有してもよく、また、任意に遅延式に、胃腸管のある部位においてのみ、又は選択的に、活性成分を放出する組成物であってもよい。使用可能な包埋組成物の実例は、ポリマー物質及びワックスを包含する。活性成分はまた、適切であれば１以上の上述の賦形剤を用いて、マイクロカプセル化された形状であることも可能である。

経口投与用の液体剤形は、医薬的に許容されるエマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ、及びエリキシルを包含する。活性成分に加えて、液体剤形は、当該技術分野において一般に使用される不活性希釈剤、例えば、水又は他の溶媒、可溶化剤、及び乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（特に、綿実油、ラッカセイ油、コーン油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、及びゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール、及びソルビタンの脂肪酸エステル、及びそれらの混合物を含有してもよい。

不活性希釈剤の他に、経口用組成物はまた、アジュバント、例えば湿潤剤、乳化及び懸濁剤、甘味剤、着香剤、着色剤、風味剤、及び保存剤を包含してもよい。

懸濁液は、活性ＳＵＭＯ化制御剤に加えて、懸濁化剤、例えばエトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール及びソルビタンエステル、微結晶セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天、及びトラガカント、及びそれらの混合物を含有してもよい。

ＳＵＭＯ化制御剤の局所又は経皮投与用の剤形は、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチ、及び吸入剤を包含する。活性成分は、無菌条件下に、医薬的に許容される担体と、及び、必要であれば任意の保存剤、緩衝剤、又は噴射剤と混合されもよい。

軟膏、ペースト、クリーム、及びゲルは、ＳＵＭＯ化制御剤に加えて、賦形剤、例えば動物性及び植物性脂肪、油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、ケイ酸、タルク、及び酸化亜鉛、又はそれらの混合物を含有してもよい。

粉末及びスプレーは、ＳＵＭＯ化制御剤に加えて、賦形剤、例えばラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム、及びポリアミド粉末、又はこれら物質の混合物を含有することが可能である。スプレーは付加的に、通常の噴射剤、例えばクロロフルオロ炭化水素、及び、揮発性未置換炭化水素、例えばブタン及びプロパンを含有することが可能である。

ＳＵＭＯ化制御剤は、別法として、エアロゾルにより投与可能である。このことは、化合物を含有する水性アエロゾル、リポソーム標品、又は固形粒子を調製することにより達成される。非水性（例えばフルオロカーボン噴射剤）懸濁物が使用可能である。音波式ネブライザは、化合物の分解を生じる結果となることが可能な、剪断に対する薬剤の暴露を最小限にする理由から好ましい。

通常、水性エアロゾルは、薬剤の水性の溶液又は懸濁液を、通常の医薬的に許容される担体及び安定化剤と一緒に製剤することにより製される。担体及び安定化剤は、特定の化合物の必要に応じて変わるが、典型的には、非イオン性界面活性剤（ツイーン（Ｔｗｅｅｎｓ）、プルロニクス（Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ）、又はポリエチレングリコール）、血清アルブミンのような無害のタンパク質、ソルビタンエステル、オレイン酸、レシチン、アミノ酸例えばグリシン、緩衝剤、塩、糖、又は糖アルコールを包含する。エアロゾルは、一般に、等張溶液から調製される。

経皮パッチは、身体に対するＳＵＭＯ化制御剤の、制御された送達を提供するという、付加された利点をもつ。かかる剤形は、薬剤を適当な媒体中に溶解又は分散することにより製されることが可能である。吸収促進剤もまた、皮膚を横切るペプチドミメティックの流れを増大するべく使用可能である。かかる流れの速度は、速度制御膜を提供することか、又はペプチドミメティックをポリマーマトリックス又はゲル中に分散することにより、制御可能である。

眼用の製剤、眼軟膏、粉末、及び溶液などもまた、本発明の範囲内であると考えられる。

非経口投与に好適な本発明の医薬組成物は、１以上のＳＵＭＯ化制御剤を、１以上の医薬的に許容される無菌の等張の水性又は非水性溶液、分散物、懸濁物又はエマルジョン、又は、無菌の粉末と共に含んでなり、それらは使用直前に無菌の注射可能な溶液又は分散物へ再構成されてもよく、酸化防止剤、緩衝材、静菌剤、製剤を意図する受容者の血液と等張にする溶質、又は、懸濁化剤又は増粘剤を含有してもよい。

本発明の医薬組成物において用いられてよい好適な水性及び非水性担体は、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの好適な混合物、植物油、例えばオリーブ油、及び、注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルを包含する。適正な流動性は、例えば、コーティングマテリアル、例えばレシチンの使用により、分散物の場合には必要な粒子サイズの維持により、及び、界面活性剤の使用により維持可能である。

これらの組成物はまた、アジュバント、例えば保存剤、湿潤剤、乳化剤、及び分散剤を含有してもよい。微生物の活動の防止は、種々の抗細菌剤、及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール及びソルビン酸などを包含することにより保証されてよい。また、等張剤、例えば糖、及び塩化ナトリウムなどを組成物中に包含することも望ましい。さらに、注射可能な医薬製剤の吸収の遅延は、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンのような、吸収を遅らせる薬剤の含有によりもたらされてもよい。

ある場合には、ＳＵＭＯ化制御剤の効果を延長するため、皮下又は筋肉内注射からの、薬剤の吸収を遅くすることが望ましい。このことは、水溶性の少ない結晶性又はアモルファスな物質の懸濁液の使用により達成されてよい。薬物吸収の速度は、それゆえ、その溶解速度に依存し、さらに、結晶のサイズ及び結晶の形状に依存してよい。別法として、非経口投与薬の形状の吸収の遅延は、薬剤を油ビヒクル中に溶解又は懸濁することにより達成される。

注射可能なデポ形状は、ＳＵＭＯ化制御剤のマイクロカプセルマトリックスを、生分解性ポリマー、例えばポリラクチド−ポリグリコリド中に形成することにより製される。ポリマーに対する薬剤の割合、及び、用いた特定のポリマーの性質に依存して、薬剤放出の速度が制御されることが可能である。他の生分解性ポリマーの実例は、ポリ（オルトエステル）及びポリ（アンヒドリド）を包含する。注射可能なデポ製剤はまた、薬剤を、身体の組織と適合性の、リポソーム又はマイクロエマルジョン中に閉じ込めることにより調製される。

本文において使用される語句「非経口投与」及び「非経口的に投与された」は、腸内及び局所投与以外の投与様式を意味し、通常は注射によるものであり、また、制限されることなく、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、クモ膜下、脊椎内、胸骨内注射、及び点滴による投与を包含する。

本文おいて使用される語句「全身投与」、「全身へ投与された」「末梢投与」、及び「末梢へ投与された」は、ＳＵＭＯ化制御剤の、中枢神経系への直接の投与以外であって、それが患者の組織に侵入し、それゆえ、代謝及び他の同様のプロセスを受けるようにする投与、例えば皮下投与、を意味する。

本発明のもう１つの観点は、併用療法を提供することであって、これにおいて１以上の他の治療薬が、ＳＵＭＯ化制御剤と共に投与される。かかる併用治療は、個々の治療成分の、同時の、逐次の、又は分離した投薬により達成されてよい。

いくつかの実施態様においては、ＳＵＭＯ化制御剤は、抗癌剤又は他の、治療される症状の治療において有用であることが公知の治療薬と併用して投与される。例えば、ＨＬＳ−５発現ベクターを、抗癌剤と一緒に使用する遺伝子療法。

もう１つの例証となる実施態様においては、患者のコントロール薬が、ＳＵＭＯ化アゴニスト又はアンタゴニストと併用して投与されることが可能である。

前文に記述されたように、ある実施態様における、インビボの送達及び発現用の、本発明のＨＬＳ−５ポリヌクレオチド及びベクター。このアプローチはまた「遺伝子療法」とも呼ばれ、それ自体は当該技術分野において周知である。遺伝子療法のプロトコールは、ＨＬＳ−５ポリペプチドの発現を指示することができる、治療上有効な量のＨＬＳ−５ポリヌクレオチドベクターを患者に対し、インフルエンザウイルス感染の前か、実質的に同時か、又は後に投与することを包含してもよい。代替えとして、又は前述のものと組合せて使用されてよいもう１つのアプローチは、細胞の集団、例えば幹細胞、又は免疫系細胞を、患者から単離すること、任意に該細胞を組織培養において展開すること、及び、ＨＬＳ−５の発現を指示することができるＨＬＳ−５ポリヌクレオチベクターを、該細胞に対しインビトロで投与することである。次いで該細胞は、患者へ戻されてよい。任意に、ＨＬＳ−５ポリヌクレオチドを発現している細胞は、患者へそれを導入するに先立ち、インビトロにおいて選択されることが可能である。本発明のいくつかの実施態様においては、細胞系に由来するか、又は、患者ではない個体に由来してもよい細胞の集団が使用可能である。幹細胞、免疫系細胞、その他を単離し、それらを患者へ戻す方法は、当該技術分野において周知である。かかる方法は、例えば、骨髄移植、末梢血幹細胞移植、その他のため、化学療法を受けている患者において使用される。

なおもう１つのアプローチにおいては、経口遺伝子療法が使用されてよい。例えば、米国特許第６，２４８，７２０号は、プロモーターの制御下にある遺伝子が、マイクロパーティクル中に保護的に含有され、オペラティブな形状で細胞へ送達され、それにより非侵襲性の遺伝子送達を達成する方法及び組成物を記述している。マイクロパーティクルの経口投与に続き、遺伝子は、吸収性の腸上皮細胞を含む上皮細胞内へ取り込まれ、腸関連リンパ系組織中に取り込まれ、さらになお、粘膜上皮から離れた細胞へ輸送される。そこに記述されたように、マイクロパーティクルは、遺伝子を粘膜上皮から離れた部位へ送達することが可能であり、すなわち上皮障壁を横切って全身循環に侵入し、それにより、別の場所で細胞をトランスフェクトすることが可能である。

用語「症状」は、ＳＵＭＯ化が、一部役割を果たしており、かつ制御を必要としている、任意の疾患又は障害を指す。現在、ＳＵＭＯ化により影響を受けることが公知の数多くの症状があり、制限されることなく、パーキンソン病、糖尿病、ハンチントン病、家族性ニューロン核内封入病、アルツハイマー病、ニューロン核内封入病、癌、ポリグルタミン病、及びＨＩＶ感染症を包含する。

パーキンソン病においては、パーキンはユビキチンリガーゼであり、一般に神経変性の分子機構に特別な意味を与えている。パーキンソン病では、レビー（Ｌｅｗｙ）小体がユビキチンに関し免疫反応性がある。異常タンパク質の蓄積はまた、他の神経変性疾患において見られている。ユビキチンプロテアソーム系によるタンパク質分解の妨害が、神経変性に重大な役割をもつことが想定されてきた。アルファ−シヌクレイン突然変異は、稀ではあるが、アルファ−シヌクレインはレビー小体中に蓄積し、アルファ−シヌクレインフィブリルが２６Ｓプロテアソーム機能を損なう。ＵＣＨ−Ｌ１もまた脱ユビキチン化酵素であり、その突然変異はＰＡＲＫ５へ結びつけられている。さらに、ＤＪ−１はＳＵＭＯ−１と相互作用し、そのことがユビキチンの効果を打ち消し、２６Ｓプロテアソームによる分解に対しタンパク質を安定化させることが可能である（ハットリ及びミズノ（Ｈａｔｔｏｒｉ＆Ｍｉｚｕｎｏ）、「ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）」、２００４年、第３６４巻、ｐ．７２２−７２４。

糖尿病のいくつかの症例では、ＳＵＭＯ−４における単一ヌクレオチド多形が検出されており、高度に保存されたメチオニンをバリン残基で置換している（Ｍ５５Ｖ）。ＳＵＭＯ−４発現ベクターで一過性にトランスフェクトされたＨｅｐＧ２（肝臓癌）細胞では、Ｍｅｔ−５５は、Ｖａｌ−５５に比較して、高いレベルの活性化された熱ショック因子 転写因子に関連づけられたのに対し、ＮＦ−カッパＢは、同程度まで抑制された。ＳＵＭＯ−４Ｍ（Ｍｅｔ）変異体は、Ｉ型糖尿病の家族内の罹患性に関連しており、それがＩ型糖尿病の病因に関与する可能性を示唆している（ボーレン（Ｂｏｈｒｅｎ）ら著、「ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ」、２００４年、第２７９巻、ｐ．２７２３３−２７２３８）。ハンチントン病（ＨＤ）は、病原性タンパク質、ハンチントン（Ｈｔｔ）の蓄積によって特徴づけられ、それは異常なポリグルタミン伸長を含有する。Ｈｔｔの病原性フラグメント（Ｈｔｔｅｘｌｐ）は、ＳＵＭＯ−１によるか、又はユビキチンにより、同一のリジン残基について修飾されることが知られている。培養細胞では、ＳＵＭＯ化はＨｔｔｅｘｌｐを安定化し、凝集体を形成するその能力を低減し、転写を抑制するその能力を促進する。ＨＤのショウジョウバエモデルでは、ＨｔｔｅｘｌｐのＳＵＭＯ化は神経変性を悪化させ、一方Ｈｔｔｅｘｌｐのユビキチン化は、神経変性をやめさせる。ＨｔｔｅｘｌｐのＳＵＭＯ化及びユビキチン化の双方を妨害するリジン突然変異は、ＨＤの病理に対するＳＵＭＯ化の寄与が、Ｈｔｔユビキチン化の防止及び分解を超えて及んでいることを示している（ステファン（Ｓｒｅｆｆａｎ）ら著、２００４年、上記）。

ニューロン核内封入病（ＮＩＩＤ）は、進行性失調と、伸長ＣＡＧ反復疾患に検出される封入体に類似した、ニューロン核内封入体（ＮＩ）とによって特徴づけられる稀な神経変性障害である。家族性ＮＩＩＤの原因は、ＧＡＧ伸長が検出されていないことから、あまり理解されていない。３つの症例全てにおいて、ＮＩは、ＳＵＭＯ−１、グルココルチコイド受容体、及びユビキチンについて、強度に免疫陽性である。電子顕微鏡法は、ＳＵＭＯ−１がＮＩの１０ｎｍフィブリルに局在化されることを証明した。培養されたＰＣ１２細胞では、特異阻害剤によるプロテアソーム機能の阻害が、結果としてＳＵＭＯ−１免疫陽性の核封入体の出現を生じることが示されている。このことは、ＳＵＭＯ−１修飾されたタンパク質の不溶性核封入体への動員と、プロテアソームの機能障害とが、家族性ＮＩＩＤの症例におけるＮＩの病因に関与してもよいことを示唆している（パウントニー（Ｐｏｕｎｔｅｎｙ）ら著、２００３年、上記）。アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）から生じるアミロイドベータペプチド（Ａｂｅｔａ）は、アルツハイマー病（ＡＤ）の中核である。ＡＰＰアミロイド生成に影響を及ぼすシグナル経路は、ＡＤの病理において重大な役割を果たしており、治療的介入に利用されることが可能である。ＳＵＭＯ化がＡｂｅｔａ生成を調節することは、証明されている。ＳＵＭＯ−３の過剰発現からの結果として生じる、増大されたタンパク質ＳＵＭＯ化は、Ａｂｅｔａ産生を劇的に減少させる。さらに、ＳＵＭＯ−３の免疫反応性は、ＡＤ、ダウン症、及び非痴呆のヒトからの、脳のニューロン中に主として検出される。それゆえ、ポリＳＵＭＯ化は、Ａｂｅｔａ産生を低減し、一方モノＳＵＭＯ化又は低いＳＵＭＯ化は、Ａｂｅｔａ産生を増強する。これらの発見は、ＡＰＰアミロイド生成における調節機構を提供し、ＳＵＭＯ化経路の成分が、ＡＤの開始又は進行において重大であってよいことを示唆している（リー（Ｌｉ）ら著、２００３年、上記）。

若年性ＮＩＩＤは、おそらくＳＵＭＯ化における異常に関係する、脊髄小脳性脳幹失調疾患である（マクファデン（ＭｃＦａｄｄｅｎ）ら著、「ジャーナル・オブ・ニューロパソロジー・アンド・エクスペリメンタル・ニューロロジー（Ｊ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ）」、２００５年、第６４巻、ｐ．５４５−５５２）。ＤＲＰＬＡ、ＳＣＡ１、ＭＪＤ、及びハンチントン病の患者は、脳の侵された領域内に、ＳＵＭＯ−１に対し強く反応するニューロンを有することが検出される。突然変異体アタキシン−１を発現しているトランスジェニックマウスを用いたウエスタンブロットは、小脳皮質内に、ＥＳＣＡ１及びＥＳＣＡ２と名付けられたＳＵＭＯ化されたタンパク質の増大を示した。ＳＵＭＯ−１系の活性化は、ポリグルタミン病において、その病理における関与が予測された（ウエダら著、２００２年、上記）。ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）Ｇａｇポリタンパク質のｐ６ドメインは、クラスＥ空胞タンパク質選別因子、Ｔｓｇ１０１、及びＡＩＰ１／ＡＬＩＸとの、タンパク質−タンパク質接触により、感染細胞からのビリオンの出芽を仲介する。Ｔｓｇ１０１との相互作用は、一価のユビキチンのＨＩＶ−６に対する共有結合により強化される。ＨＩＶ−１ ｐ６は、ＳＵＭＯ−１、並びにＥ２ ＳＵＭＯ−１転移酵素、Ｕｂｃ９と相互作用することが見出された。ｐ６との相互作用はまた、ＳＵＭＯ−１が時としてそれへ共有結合している細胞タンパク質、Ｄａｘｘについても検出された。ＳＵＭＯ−１は、ＨＩＶ−１ビリオンへ取り込まれ、そこでビリオン膜内で外来プロテアーゼによる消化から保護された。ｐ６中の二つのリジン残基のうち、リジン２７は、共有結合性のＳＵＭＯ−１結合部位として独自に役立っていた。しかしながら、先に報告されたように、ｐ６−Ｋ２７Ｒ突然変異をもつＨＩＶ−１は、まさに野生型と同様に複製した。ＨＩＶ−１産生細胞におけるＳＵＭＯ−１の過剰発現は、ビリオン放出に対し、或いはビリオンタンパク質又はＲＮＡ含有量に対し、何ら見かけ上の影響をもたなかった。結果として生じたビリオンの感染性は、しかしながら、低減されており、その欠陥は、膜融合の後、ウイルスｃＤＮＡ合成の時点で起こっており、ＳＵＭＯ−１のｐ６に対する共有結合が、ＨＩＶ−１複製に有害であることを示唆している（ガーレー（Ｇｕｒｅｒ）ら著、「ジャーナル・オブ・ビロロジー（Ｊ Ｖｉｒｏｌ）」、２００５年、第７９巻、ｐ．９１０−９１７）。

本発明はまた、ＨＬＳ−５ポリペプチドに結合する物質（これに対する言及は、上述のように、相同体、変異体、誘導体、及びフラグメントを包含する）を同定するために好適なアッセイも提供する。さらに、ＳＵＭＯ化に関係する細胞成分へのＨＬＳ−５結合を妨害する物質、例えば、酵母２−ハイブリッドスクリーンにおいて、ＨＬＳ−５と相互作用するものとして同定されるタンパク質の同定に好適なアッセイも提供される。かかるアッセイは、典型的にはインビトロである。また、ホールセル（全細胞）アッセイにおける、インタクトな細胞に対する事前のインビトロアッセイにおいて同定された、候補物質の効果を試験するアッセイも提供される。

ＨＬＳ−５ポリペプチドとの相互作用の結果としてＳＵＭＯ化を変える物質は、いくつかの方法でそれを行ってよい。それは、例えば、ＨＬＳ−５に結合して他の成分との相互作用の部位をマスクするか、又は変更することにより、細胞周期マシーナリの細胞成分に対するＨＬＳ−５の結合を直接破壊してもよい。このタイプの候補物質は、例えば、以下に記述されるようなインビトロの結合圧政により事前に便利にスクリーンされ、次いで、例えば、以下に記述されるようなホールセルアッセイにおいて試験されてもよい。

先に記述されたように、細胞へ投与された場合、又はその発現レベルが高い場合、ＨＬＳ−５は、ＰＡＩＳ１、ＵＢＣ９、及びＳＵＭＯ−１のレベルを低減し、結果として、いくつかのタンパク質標的の全体的なＳＵＭＯ化及び他の誘導の低減を生じる。したがって、インビボのＳＵＭＯ化アッセイは、タンパク質ＳＵＭＯ化のＨＬＳ−５修飾についての１つの試験であり、例えばヒーラ又はコス細胞その他の、変異体への投与と、細胞が個々のタンパク質産物のＳＵＭＯ化レベルに変更を有するか否かを、ウエスタン分析により測定することにより、行われることが可能である。ＨＬＳ−５と、ＳＵＭＯ化マシーナリの要素との相互作用に基づく、もう１つの試験は、上述のインビトロのＳＵＭＯ−１修飾アッセイである。

「含んでなる」により、単語「含んでなる」に続くいかなるものも包含するが、それに限定されないことが意味される。したがって、用語「含んでなる」は、リストされた要素が必要又は必須であること、しかし他の要素は任意であって、存在してもしなくてもよいことを示している。「からなる」は、語句「からなるなる」に続くいかなるものも包含し、かつそれに限定されることが意味される。したがって、語句「からなる」は、リストされた要素が必要又は必須であること、かつ、他には何ら存在してもよい要素がないことを示している。「本質的に……からなる」により、この語句の後にリストされた任意の要素を含め、リストされた要素に関する開示において明記された活性又は作用に対し、妨害又は寄与しない、他の要素に限定されることが意味される。したがって、語句「本質的に……からなる」は、リストされた要素が必要又は必須であること、しかし他の要素は任意であって、リストされた要素の活性又は作用に影響を及ぼすか否かに依存して、存在しても存在しなくてもよいことを示している。

代表的な技術及び実験結果を記述している以下の実施例は、本発明を例証する目的で提供されており、制限するものと解釈されるべきではない。

ＳＵＭＯ化マシーナリのＨＬＳ−５結合成分
ＨＬＳ−５相互作用パートナーに関する酵母２−ハイブリッドスクリーンは、ＳＵＭＯ化経路に関与する２つのタンパク質、すなわち、Ｕｂｃ９及びＰＩＡＳ１を同定した。Ｕｂｃ９は、ＳＵＭＯ−１コンジュゲーション経路におけるＥ２酵素として作用することが示されており（デステッロ（Ｄｅｓｔｅｔｔｏ）ら著、「ＦＥＢＳレターズ」、１９９７年、第４１７巻、ｐ．２９７−３００、ジョンソンら著、１９９７年、上記）、一方ＰＩＡＳ１は、ｐ５３、Ｓｐ３、及びアンドロゲン受容体のような多数のタンパク質のためのその反応順序において、Ｅ３リガーゼとして作用することが証明されている（カーヨ（Ｋａｈｙｏ）ら著、「モレキュラー・セル（Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ）」、２００１年、第８巻、ｐ．７１３−７１８；ニシダ及びヤスダ著、２００２年、上記；サペチュニグ（Ｓａｐｅｔｓｈｎｉｇ）ら著、「ディ・エンボ・ジャーナル（Ｅｍｂｏ Ｊ）」、２００２年、第２１巻、ｐ．５２０６−５２１５）。

ＨＬＳ−５とＵｂｃ９との間の相互作用は、重要な結合ドメインを同定するべく、酵母２ハイブリッドアッセイにより、さらにキャラクタライズされた。これらのデータは図１ａに要約されており、ＨＬＳ−５のいくつかの領域がＵｂｃ９と結合することが可能であったことを示している。ＨＬＳ−５とＵｂｃ９が真正の結合相手であったことを確証するべく、その相互作用は、哺乳類細胞において、タンパク質：タンパク質相互作用を生きた細胞において検出することができる、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）を用いて調べられた（シューら著、「プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ）」、１９９９年、第９６巻、ｐ．１５１−１５６）。ＨＬＳ−５及びＵｂｃ９構築物がコス細胞において同時発現される場合、ポジティブなＢＲＥＴ比が観察され、これらのタンパク質が実際に細胞内で相互作用することを証明した（図１ｂ）。しかしながら、２つの分子は共免疫沈降することができず（データは示されず）、この相互作用は一過性の可能性がある。このことに関する有望な説明は、ＵＢＣ９の殆どの他の公表された標的も、ＲａｎＧＡＰ１は別にして、化学量論的な量を超えるＵＢＣ９を必要とするように見え（しばしば、μＭのレンジ）、その場合でも、ほんのわずかしか修飾されないということである。注目すべきは、ＵＢＣ９とＳＵＭＯ標的との間の２ハイブリッド相互作用は、多くの研究において報告されているが、細胞抽出物（例えば、網状赤血球ライゼート）不在下での、組換えＵＢＣ９の安定な相互作用は、ＲａｎＧＡＰ１とＥ３リガーゼ、ＲａｎＢＰ２、Ｓｉｚ１、及びＳｉｚ２に関してのみ示されていることである。また、ＵＢＣ９への結合は、ブリッジとして作用するような、ＳＵＭＯチオエステル荷電ＵＢＣ９と標的とを同時に結合する、その能力に依存することも示唆されている。

ＨＬＳ−５とＰＩＡＳ１との間の相互作用を仲介するために重要な領域もまた、酵母２ハイブリッドアッセイにより同定されており、図１ｃは、Ｂボックス及びコイルドコイルモチーフからなるＨＬＳ−５のアミノ末端部分が、この結合に必要であることを示している。逆に、そのＥ３ＳＵＭＯリガーゼ活性に関与しているリング様ドメインに対し遠位の、ＰＩＡＳ１のＣ−末端が、ＨＬＳ−５との相互作用に関与していた（データは示さず）。

完全長のタンパク質が哺乳類細胞内で結合したことを証明するべく、コス細胞はＨＬＳ５及びＰＩＡＳ１で一過性にトランスフェクトされ、免疫沈降された；しかしながら、このアッセイでは、結合は、最初は検出できなかった（図１ｄ、最初の６つのトランスフェクション）。ＰＩＡＳ１は主として核タンパク質であり（タン（Ｔａｎ）ら著、「モレキュラー・エンドクリノロジー（Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ）」、２０００年、第１４巻、ｐ．１４−２６）、ＨＬＳ−５は元来細胞質性であることから、これらの分子の相互作用の失敗は、細胞内の分離により生じたのかもしれない。ＧＡＴＡ−１は、ＨＬＳ−５の核への再局在化を促進することから（以下の図３ｂ参照）、ＨＬＳとＰＩＡＳ１との同時トランスフェクションにそれが含められた。図１ｃの最後の２つのトランスフェクションは、ＧＡＴＡ−１が存在するとき、ＨＬＳ及びＰＩＡＳ１が共免疫沈降できたことを示している。ＧＡＴＡ−１により誘導されたＨＬＳ−５の再分布が、核へのアクセス及びＰＩＡＳ１への結合を可能にしたこと、或いは、ＧＡＴＡ−１、ＨＬＳ−５、及びＰＩＡＳ１が、この相互作用に必要なタンパク質複合体を形成することが想定される。

本発明者らは、ＭＧ１３２によって引き起こされるＨＬＳ−５の蓄積を観察しており（図３ｃ）、この蓄積もまた、ＧＡＴＡ−１を添加した場合のように、結果としてＰＩＡＳ１とＨＬＳ−５との共免疫沈降を生じた（データは示さず）。興味深いことに、ＨＬＳ−５とＰＩＡＳ１との共免疫沈降及び同時局在化は、ＭＧ１３２の存在により増大され、この相互作用が核小体周辺でより効率的であることを示唆していた。また、Ｍｙｃ−タグＨＬＳ−５、又は、そのリングフィンガーを欠く突然変異型のＨＬＳ−５（ΔＮ６１）と、ＨＡ−タグＳＵＭＯ−１とを同時発現するコス７細胞が、ＭＧ１３２の存在下又は不在下に分析された。図６Ａは、抗ＨＡ抗体で検出されたＳＵＭＯ化された物質を示しており、それは、ＭＧ１３２の存在下に完全長ＨＬＳ−５を発現している、ＨＬＳ−５レーンに特異的であったが、リングフィンガーが突然変異されたか、又はＭＧ１３２がない場合には存在しなかった。このことは、相互作用が、リングフィンガーを介するタンパク質−タンパク質相互作用に依存すること、或いは、ＨＬＳ−５がＳＵＭＯＥ３リガーゼ活性を持つことを示唆している。

ＨＬＳ−５はＳＵＭＯ化され、かつＧＡＴＡ−１のＳＵＭＯ化に、またグローバルに影響を及ぼす
ＨＬＳ−５は、Ｕｂｃ９及びＰＩＡＳ１と相互作用することが可能であったため、ＨＬＳ−５がＳＵＭＯ化される可能性が次に検査された。ＰＭＬのような他のＲＢＣＣ／ＴＲＩＭファミリーメンバーと同様に（デュプレ（Ｄｕｐｒｅｚ）ら著、「ジャーナル・オブ・セル・サイエンス（Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．）」、１９９９年、第１１２巻、ｐ．３８１−３９３；キミタニ（Ｋｉｍｉｔａｎｉ）ら著、「ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ）」、１９９８年、第２７３巻、ｐ．２６６７５−２６６８２）、ＨＬＳ−５はいくつかのΨΚχＥ／ＤコンセンサスＳＵＭＯ化部位を有する（図２ａ）。ＨＬＳ−５がＳＵＭＯ−１に結合することができるかどうかを測定するべく、いくつかのＨＬＳ−５欠失突然変異体を用いる酵母２ハイブリッド系が使用された。このアッセイは、ＨＬＳ−５がＳＵＭＯ−１と相互作用することができたこと、及び、その結合が、２つの潜在的なＳＵＭＯ化モチーフを含有している、ＨＬＳ−５のコイルドコイルドメインに依存していたことを示した（図２ｂ）。興味深いことに、ＳＵＭＯ−２も、ＳＵＭＯ−３も、酵母ではＨＬＳ−５と結合しないことから、この相互作用はＳＵＭＯ−１に特異的であった（図２ｃ）。

これらの酵母２−ハイブリッドアッセイからは、ＨＬＳ−５が非共有結合的にＳＵＭＯ−１と相互作用したかどうか、又はＳＵＭＯ−１がインビボでコンジュゲートしたかどうか不明である。図２Ｄに示された結果は、さらに、同時トランスフェクション及びイムノブロッティングが、ＳＵＭＯ−１が哺乳類細胞においてＨＬＳ−５に対しコンジュゲートされたこと、この反応がＵＢＣ９の存在により増強されたこと、及び、ＰＩＡＳ１はＨＬＳ−５に対しＥ３の役を果たさなかったこと（ＨＬＳ−５の存在によって、ＨＬＳ−５のＳＵＭＯ化産物が減少したため）を示している。

いくつかのリングフィンガー含有タンパク質は、ＳＵＭＯ−１のためのＥ３リガーゼとして作用することが示されている（ジャクソン（Ｊａｃｋｓｏｎ）ら著、「ジーンズ・アンド・ディベロプメント（Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ）」、２００１年、第１５巻、ｐ．３０５３−３０５８）。ＨＬＳ−５が機能性のＥ３リガーゼであったかを調べるべく、ＳＵＭＯ−１及びＨＬＳ−５がコス細胞において同時発現され、全タンパク質ＳＵＭＯ化がイムノブロッティングにより確認された。図５Ｂ、中央のレーンは、ＨＬＳ−５がグローバルなＳＵＭＯ化に対し重要なインパクトを有していたことを示している。全体のＳＵＭＯ化は、ＨＬＳ−５の存在下に減少したが、いくつかのタンパク質は、上昇したＳＵＭＯ化レベルを示した（図６Ａ）。有意なことに、ＳＵＭＯ−１自体のレベルは、＞９５％まで低減された（図５Ｂ）。さらに、ＨＬＳ−５及びＰＩＡＳ１の同時発現は、結果として細胞からのほぼ完全なＰＩＡＳ１の除去を生じた（図５ｂ、最初の２つのトランスフェクション）。ＨＬＳ−５はまた、Ｕｂｃ９のレベルも低減したが、ＳＵＭＯ−１及びＰＩＡＳ１と同程度ではなかった（図５Ｂ、レーン５及び６）。本発明者らは次に、ＨＬＳ−５のどのドメインがＰＩＡＳ１タンパク質発現の除去に関与したかを調べた。図５ｃに示されたように、ＨＬＳ−５（ΔＮ１５０）欠失突然変異体により、ＰＩＡＳ１の発現は低減されたが、そのレベルはＨＬＳ−５（デルタＮ２６７）による対照レベルに近づいており、Ｂボックス及びコイルドコイルドメインが、ＨＬＳ−５機能に必要であったことを示しており、酵母２ハイブリッド実験におけるＰＩＡＳ１相互作用ドメインと一致する（図１Ｃ）。したがって、ＨＬＳ−５はグローバルなタンパク質ＳＵＭＯ化を変え、ＳＵＭＯ化マシーナリの重要な成分、ＳＵＭＯ−１、ＰＩＡＳ１、及びＵｂｃ９の細胞内含有量を低減し、かつこの作用は部分的に、そのＢボックス及びコイルドコイルドメインを介して達成される。

ＨＬＳ−５の細胞内局在はＳＵＭＯ−１及びＭＧ−１３２により影響される
前文に呈示されたデータは、ＨＬＳ−５がＵｂｃ９、ＰＩＡＳ１、及びＳＵＭＯ−１と結合することが可能であることを示している。ＨＬＳ−５は、主として細胞質顆粒中に局在するため、ＨＬＳ−５の区画化に対するＵｂｃ９、ＰＩＡＳ１、ＭＧ−１３２、及びＳＵＭＯ−１の影響が調べられた。Ｕｂｃ９は細胞全体に存在しており、ＨＬＳ−５の細胞内局在化には何ら影響を及ぼさなかった；同様に、核タンパク質ＰＩＡＳ１は、ＨＬＳ−５タンパク質の再局在化を開始しなかったが、ウエスタン分析及び共焦点顕微鏡によって見られたように、そのタンパク質発現の除去をもたらした（図５Ａ及び５Ｂ）。しかしながら、ＳＵＭＯ−１及びＨＬＳ−５が同時発現された場合、核内に出現するＨＬＳ−５の量の著しい増大があった（図３Ａ）。それゆえ、ＳＵＭＯ１は、細胞質顆粒から核内へのＨＬＳ−５の移動を促進した。この移動はまた、ＭＧ−１３２の存在下でも観察された（図６ｃ）。

Ｕｂｃ９、ＰＩＡＳ１、及びＳＵＭＯ−１の、ＨＬＳ−５誘導性のアポトーシスに対する生物学的効果を調べるため、コス細胞及びヒーラ細胞は、これらの分子で同時トランスフェクトされ、細胞死がモニターされた。有意なことに、ヒーラ細胞では、Ｕｂｃ９は、ＨＬＳ５により引き起こされるアポトーシスを、６０％からわずか１２％の細胞までに低減し；さらに、ＳＵＭＯ化に関与することができない優性ネガティブＵｂｃ９もまた、ＨＬＳ−５に促進される細胞死を４％に低減することができた。しかしながら、ＨＬＳ５に誘導される細胞死に対するＳＵＭＯ−１の効果は、それほど著しくなかった。これらの結果は、ＳＵＭＯ化されたＨＬＳ−５が、アポトーシスに対し、未修飾のタンパク質よりも著しい効果をもたないことを示している。

ＨＬＳ−５はＧＡＴＡ−１のＳＵＭＯ化及びトランスアクティベーションに影響する
最近、ＧＡＴＡ−１がＳＵＭＯ化されること、及びその活性がこの修飾によって抑制さることが示されている（コラビンら著、２００４年、上記）。ＨＬＳ５はＳＵＭＯ化マシーナリと相互作用することが可能であることから、ＧＡＴＡ−１との関係が調べられた。ＧＡＴＡ−１が、ＨＬＳ５の細胞内局在化に影響を及ぼすことができるかどうかを調べるため、コス細胞は一過性にトランスフェクトされ、共焦点顕微鏡により検査された。２つのタンパク質の同時発現は、ＨＬＳ−５タンパク質の殆どが核内へ移動する結果を生じたが、いくらかの残留性の顆粒状の細胞質染色が観察された（図３Ｂ）。ＧＡＴＡ−１及びＨＬＳ−５は、双方のタンパク質が排除された離散した領域を除いて、核全体に分布していた。

ＧＡＴＡ−１とＨＬＳ５との間の相互作用は、次に、コス細胞をｍｙｃ−タグＨＬＳ−５及びＧＡＴＡ−１でトランスフェクトすること、続いて、免疫沈降及びイムノブロッティングすることにより、生化学的に調べられた。ＧＡＴＡ−１は、ＨＬＳ−５免疫沈降物中に検出されたが、この相互作用は、イソペプチダーゼ阻害剤、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）及びヨードアセトアミド（ＩＡＡ）の不在下に破壊され、この結合にはチオール結合が重要であること、或いは、ＳＵＭＯ化された、又はユビキチン化された化学種のみが相互作用可能であることを示唆している（図４Ａ）。この結果は、ＨＬＳ−５及びＧＡＴＡ−１は、いずれかの、又は双方のタンパク質の、翻訳後修飾に依存して、複合体中に存在することが可能であることを示している。

コス細胞は次に、ＧＡＴＡ−１、ＳＵＭＯ−１、ＰＩＡＳ１、及びＨＬＳ−５の種々の組合せによりトランスフェクトされ、次いでＳＵＭＯ化されたＧＡＴＡ−１がイムノブロッティングにより同定された。図４Ｂは、より遅く移動するＧＡＴＡ−１タンパク質が、特に、ＳＵＭＯ−１及びＰＩＡＳ１を含有するライゼート中に検出されたことを示しており、ＧＡＴＡ−１がＳＵＭＯ化されたことを示している。この高分子量のＧＡＴＡ−１化学種は、ＧＡＴＡ−１及びＳＵＭＯ−１のみが組合された場合には、ずっと少なかったことから、ＰＩＡＳ１がこの反応の律側因子であったと考えられる。有意なことに、ＨＬＳ−５の添加は、高分子量のＧＡＴＡ−１種のほぼ完全なる消失を生じる結果となった（図４Ｂ）。

より大きい形状のＧＡＴＡ−１がＳＵＭＯ化されたＧＡＴＡ−１であったことを確認するため、トランスフェクトされたコス細胞は免疫沈降され、続いて、ＨＡ−タグＳＵＭＯ−１を同定するべくイムノブロッティングした。図４ｂに呈示されたデータは、より遅く移動する形状のＧＡＴＡ−１が、実際にＳＵＭＯ化されたＧＡＴＡ−１であったことを証明している。抗ＳＵＭＯ−１抗体を用いたブロットのリプロービングは、ＳＵＭＯ化されたタンパク質がＧＡＴＡ−１であったことを確証した（データは示さず）。少量のＳＵＭＯ化されたＧＡＴＡ−１が、ＧＡＴＡ−１及びＳＵＭＯ−１が同時トランスフェクトされた場合に観察された；重要なことに、ＨＬＳ５は、ＳＵＭＯ化されたＧＡＴＡ−１のレベルを７０％まで低減した（図４ｃ）。同様に、ＰＩＡＳ１の存在下に検出された、著しく高いレベルのＳＵＭＯ化されたＧＡＴＡ−１は、ＨＬＳ−５によりほぼ８０％抑制された（図４ｃ）。ＳＵＭＯ化が、イソペプチダーゼ阻害剤、ＮＥＭ及びＩＡＡの存在下にのみ検出されたことは注目に値する。これらの実験から、ＧＡＴＡ−１のＳＵＭＯ化はＨＬＳ−５により阻害されたことが結論づけられる。

次に、ＳＵＭＯ化されたＧＡＴＡ−１のトランスアクティベーションに対するＨＬＳ−５の効果が、ＭＩαプロモーター及びルシフェラーゼレポーターアッセイを用いて調べられた。最初の実験は、トランスフェクトされたコス細胞におけるＳＵＭＯ−１レベルの増大が、結果としてＧＡＴＡ−１トランスアクティベーションの増加を生じたことを示した；ＰＩＡＳ１の添加は、ＧＡＴＡ−１活性をさらに増強した（図４Ｄ）。これらの観察は、コラビンら（２００４年、上記）により報告された、トランスアクティベーションに対するＧＡＴＡ−１ＳＵＭＯ化の阻害効果とは異なるものである。有意なことに、ＨＬＳ５とＳＵＭＯ−１との同時発現は、結果として減少されたＧＡＴＡ−１活性を生じた（図５Ｄ）。さらに、ＨＬＳ５は、ＳＵＭＯ−１及びＰＩＡＳ１双方の存在下に、ＧＡＴＡ−１トランスアクティベーションを抑制した。匹敵するデータが、α−インテグリンプロモーターを用いて得られた（データは示さず）。一緒にすれば、データは、ＨＬＳ−５はＧＡＴＡ−１活性を、この重要な赤血球系転写因子のＳＵＭＯ化を妨害することにより、阻害している。これらの観察は、ＳＵＭＯ化におけるＨＬＳ５の調節的役割と一致する。

推定上のシス作用性エンハンサーエレメントが、当該遺伝子からのクローン化されたプロモーター領域に存在すると予想されたことから、レポーターアッセイを通じて観察されたルシフェラーゼ活性は、ヒト細胞内でのこの遺伝子の実際の調節に密接に類似している。細胞におけるプロモーター応答を測定するための手段として、また、ハイスループットスクリーニングにおけるその使用のため、ルシフェラーゼアッセイが、レポーターベクターｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ（プロメガ）の状況において使用された。安定な細胞系は、ヒトヒーラ細胞から、ＨＬＳ−５の応答エレメントによって調節されるルシフェラーゼレポーター構築物、及び選択マーカーとしてのピューロマイシン抵抗性遺伝子の、染色体組み込みによって派生された。これらのクローン細胞系は、ｐＨ５−３４−ｌｕｃの同時トランスフェクション（図７Ａ及びＢは、構築エレメントの説明図を表す）、及びｐＢａｂｅ−Ｐｕｒｏの同時トランスフェクション、それに続く、１μｇ／ｍｌでのピューロマイシン選択、及び単一クローンの単離により取得された。プロモーターレポーターベクターは、９６１Ｂｐのインサート（配列番号９）を含有し、ＨＬＳ−５の開始コドンの上流の、５’−フランキング配列に対応する。このインサートは、プロメガルシフェラーゼレポーター遺伝子の上流におかれた（ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ）。対照及び生成物として使用された細胞は：ヒーラ及びヒーラ・プロ（Ｈｅｌａ−ｐｕｒｏ）（選択可能マーカーのみを含有する）、クローンＡ１、クローンＢ２、クローンＦ２、クローンＣ７、及びクローンＣ２７（これらはＨＬＳ−５プロモーター発現クローン）であった。

ＥＰＯ、ＰＭＡ、ＩＮＦ−ガンマ、ＩＬ−６、及びルシフェラーゼ活性は、クローンごとに測定された（図７Ｃ）．これらの実験は、誘導及び抑制双方の能力を有するクローンを明らかにしたが、バックグラウンドの高いもの（クローンＡ１）、及び３倍前後の平均誘導レベルをもつもの（クローンＢ２）を示した。クローン２７は、低いバックグラウンド及びほぼ２０倍の誘導を有し、充分かつ再現可能以上のものである。このことは、フォールス・ポジティブ（誤検出）の少ない効率的なスクリーニングを可能にする。

培養及び、クローン及び細胞系の維持に使用される材料は：
フェノールレッド入りのＤＭＥＭ（テルモ（Ｔｈｅｒｍｏ）、カタログ番号５０−１２６−ＰＢ）
ウシ胎児血清（ギブコ（ＧＩＢＣＯ）、カタログ番号１００９９−１４１）
ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）（ギブコ、カタログ番号１５０７０−０６３）
ピューロマイシン・コントロール（Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ Ｃｏｎｔｒｏｌ）（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、カタログ番号Ｐ８８３３）
デュアル・ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイ・システム（Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ）（プロメガ、カタログ番号Ｅ１９１０）
トリプシン−ＥＤＴＡ（ギブコ、カタログ番号２５３００−０６２）
であった。

制御誘導用には、これらの製品は以下の終濃度で使用された：

方法は、６穴培養プレートにおけるルシフェラーゼアッセイ（プロメガ）用の、製造業者の指示から修正された。試料収集の２日前、１−３ｘ１０^５細胞は、２ｍｌの、その正常な増殖培地（１０％血清を、抗生物質及びピューロマイシンと共に含有するＤＭＥＭ）中にプレートされた。細胞は常に、各条件につき三重にプレートされた。この量は、誘導剤の使用の１日目で、５０−８０％コンフルエンスをもたらした。各細胞系の１群は、処置に使用され、他の群は対照として使用された。各ウエルに誘導剤が添加され、１８時間インキュベートされ、細胞はＣＯ_２インキュベータ内で、３７℃において一晩インキュベートされた。

インキュベーションの後、細胞はトリプシン処理され、培養プレートから培地を完全に除去する目的で、全ての材料が収集された。収集された材料は、９００ｒｐｍで遠心分離され、１ｍｌのＰＢＳに再懸濁された。材料は次に、清浄な１．５ｍｌのマイクロ遠心管へ移され、遠心分離の後、細胞は、３００μｌの受動溶解緩衝液（プロメガ、ルシフェラーゼ・アッセイ・システム）の添加により、各ウエルの内容物と共に溶解された。生成物は氷上に保持され、最終的に−２０℃に貯蔵された。３サイクルの凍結、融解、及びボルテックス混合の後、ライゼートは４℃で１５分間の遠心分離により透明化され、上清は次のルシフェラーゼアッセイに使用された。ルシフェラーゼアッセイには、９６穴プレートにおいて、ウエルあたり５０μｌの透明なライゼートが、５０μｌのＬＡＲ ＩＩと共に使用された。タンパク質定量の後（バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ））、ルシフェラーゼアッセイは、未処理又はベクターのみの対照に比較して、光単位／μｇタンパク質として測定された。

ＨＬＳ−５がＵｂｃ９及びＰｉａｓ１と結合することを示す図である。（Ａ）完全長Ｕｂｃ９は、示された種々のＨＬＳ−５構築物に対する結合について、酵母２−ハイブリッドを用いて検査された。結合は、β−ガラクトシダーゼ活性のためのフィルターアッセイにより測定された。（Ｂ）量の増加していくＧＦＰ−Ｕｂｃ９融合タンパク質を用いた、ＨＬＳ−５・Ｒｌｕｃ融合タンパク質を発現しているコス細胞のＢＲＥＴアッセイ。結果は、ＢＲＥＴ比として表されている。（Ｃ）Ｙ２Ｈスクリーンから単離されたＰＩＡＳ１（アミノ酸３０３−６５１）フラグメントは、示された種々のＨＬＳ−５構築物に対する結合について、酵母２−ハイブリッドを用いて検査された。結合は、β−ガラクトシダーゼ活性のためのフィルターアッセイにより測定された。（Ｄ）Ｍｙｃ−タグＨＬＳ−５、ＨＡ−タグＰＩＡＳ１、及び／又はＧＡＴＡ−１でトランスフェクトされたコス７細胞からのライゼートは、抗Ｍｙｃ抗体を用いて免疫沈降（ＩＰ）され、ＨＡ又はＭｙｃに対する抗体を用いて、ＮＥＭ／ＩＡＡの存在下及び／又は非在下に、イムノブロット（ＩＢ）された。 ＨＬＳ−５がＳＵＭＯ−１と結合し、かつインビボでＳＵＭＯ化されることを示す図である。（Ａ）ＨＬＳ−５の潜在的なＳＵＭＯ化部位が示されている。（Ｂ）ＨＬＳ−５欠失突然変異体の、完全長Ｓｕｍｏ−１に対する結合は、酵母系において、β−ガラクトシダーゼ活性のためのフィルターアッセイにより測定された。（Ｃ）ＨＬＳ−５と、Ｓｕｍｏ−１、２、又は３との間の相互作用は、酵母２−ハイブリッドを用いて調べられた。結合は、β−ガラクトシダーゼ活性を測定するための液体アッセイを用いて査定された。試料は三重に測定され、平均±標準偏差で示されている。（Ｄ）Ｍｙｃ−タグＨＬＳ−５、及び／又はＨＡ−タグＳｕｍｏ−１、ＨＡ−タグＵＢＣ９、ＨＡ−タグＰＩＡＳ１でトランスフェクトされたコス７細胞のライゼートは、Ｓｕｍｏ−１又はＭｙｃに対する抗体を用いてイムノブロット（ＩＢ）された。 ＨＬＳ−５局在化後のＧＡＴＡ−１、ＭＧ−１３２、及びＳＵＭＯ−１を示す図である。（Ａ）Ｍｙｃ−タグＨＬＳ−５及びＧＦＰ−ＳＵＭＯ−１を同時発現しているコス７細胞の共焦点顕微鏡法。ＨＬＳ−５は、抗Ｍｙｃ抗体により、赤色の二次抗体と一緒に検出され、ＳＵＭＯ−１は、緑色蛍光により検出された。（Ｂ）Ｍｙｃ−タグＨＬＳ−５及びＧＡＴＡ−１を同時発現しているコス７細胞の共焦点顕微鏡法。ＧＡＴＡ−１は、抗ＧＡＴＡ−１抗体により検出され、ＨＬＳ−５は、抗Ｍｙｃ抗体により、赤色及び緑色蛍光二次抗体と一緒に、それぞれ検出された。（Ｃ）ＭＧ１３２の存在下に、Ｍｙｃ−タグＨＬＳ−５を同時発現しているコス７細胞の共焦点顕微鏡法。ＨＬＳ−５は、抗Ｍｙｃ抗体により、赤色蛍光二次抗体と一緒に検出された。 ＧＡＴＡ−１がＨＬＳ−５と相互作用しその相互作用がイソペプチダーゼ阻害剤に依存的であることを示す図である。ＨＬＳ−５はまた、全体的なＧＡＴＡ−１のＳＵＭＯ化を阻害し、ＰＩＡＳ１はＳＵＭＯ化を誘導するとともに、ＧＡＴＡ−１の転写活性を抑制する。（Ａ）Ｍｙｃ−タグＨｌｓ５、及び／又はＧＡＴＡ−１でトランスフェクトされたコス７細胞からのライゼートは、抗Ｍｙｃ抗体を用いて免疫沈降（ＩＰ）され、ＧＡＴＡ−１又はＭｙｃに対する抗体を用いてイムノブロット（ＩＢ）された。（Ｂ及びＣ）Ｍｙｃ−タグＨＬＳ−５及び／又はＧＡＴＡ−１、及び／又はＨＡ−タグＳｕｍｏ−１、及び／又はＨＡ−タグＰＩＡＳ１でトランスフェクトされたコス７細胞からのライゼートは、ＧＡＴＡ−１、ＨＡ，又はＭｙｃＤに対する抗体を用いてイムノブロット（ＩＢ）された Ｄ）コス７細胞は、図１に示されたように、ｐＧＬ３−Ｍ１αファイヤフライルシフェラーゼレポーター構築物、及びｐＲＮ−ＣＭＶレニラルシフェラーゼ構築物の存在下にトランスフェクトされた。相対的なＧＡＴＡ−１活性は、ファイヤフライ活性をレニラ活性で割ることにより測定された。使用されたＤＮＡの量は、他に示されない限り、トランスフェクション（＋）あたり２００ｎｇであった。試料は二重に取られ、平均±標準偏差で示されている。示されたデータは、３つの別々の実験の代表的なものである。 局在化及び、ＨＬＳ−５が、そのコイルドコイルドメインを介し、Ｕｂｃ９及びＰＩＡＳ１の分解をもたらすことを示す図である。（Ａ）Ｍｙｃ−タグＨＬＳ−５及びＨＡ−タグＰＩＡＳ１を同時発現しているヒーラ細胞。ＰＩＡＳ１は、抗ＨＡ抗体で検出され、ＨＬＳ−５は、ＧＦＰ融合タンパク質として、赤色及び緑色蛍光二次抗体と一緒に、それぞれ検出された。（Ｂ）コス７細胞は、ＧＥＰ−タグＨＬＳ−５及び／又はＨＡ−タグＰＩＡＳ１、Ｕｂｃ９、又はＳＵＭＯ−１でトランスフェクトされ、ＨＡに対する抗体を用いてイムノブロット（ＩＢ）された。（Ｃ）異なるＭｙｃ−タグＨＬＳ−５欠失構築物、及びＨＡ−タグＰＩＡＳ１でトランスフェクトされた、コス７細胞からのライゼート、及び、トランスフェクション／ローディングコントロールとしてのヒストン２Ｂ。試料は、ＧＥＰ、ＨＡ，及びＭｙｃに対する抗体を用いてイムノブロット（ＩＢ）された。 ＭＧ１３２存在下のＨＬＳ−５発現が、Ｍｙｃ−タグＨＬＳ−５と共免疫沈降する基質のＳＵＭＯ化を増大することが可能であることを示す図である。（Ａ）Ｍｙｃ−タグＨＬＳ−５、又はそのリングフィンガーを欠くＨＬＳ−５の突然変異型（ΔＮ６１）と、ＨＡ−タグＳＵＭＯ１を、ＭＧ１３２の存在又は非存在下に同時発現しているコス７細胞。ＳＵＭＯ化された基質は、抗ＨＡ抗体で検出され、ＨＬＳ−５は、Ｍｙｃ抗体を用いることにより、それぞれ免疫沈降された。 ルシフェラーゼを発現しているＨＬＳ−５プロモーター安定細胞系の発生と、ハイスループットスクリーニング用のプライマリーアッセイの発生を示す図である。（Ａ）ＨＬＳ５ ５’ＵＴＲ（可能）な転写結合部位。（Ｂ）ルシフェラーゼレポーターベクターの上流にサブクローン化されたＨＬＳ−５プロモーターの構造。（Ｃ）親のヒーラ細胞及びＨＬＳ−５プロモーター発現細胞系は、種々の誘導化合物に対するそれらの応答について試験された。

Claims (17)

1. ＳＵＭＯ化制御剤であって：
   （i）医薬的に有効な量のＨＬＳ−５ポリペプチド、そのアイソフォーム、その機能フラグメント、又はその医薬組成物；
   （ii）ＨＬＳ−５又はその活性の、内在性のレベルを調整することが可能な化合物又は組成物；又は
   （iii）それらの組合せ、
   を含んでなるＳＵＭＯ化制御剤。
2. ＨＬＳ−５ポリペプチドが、配列番号２、配列番号４、又は配列番号６に示された配列、又はそれと実質的に相同なポリペプチドか、或いはその機能フラグメントを含んでなる、請求項１のＳＵＭＯ化制御剤。
3. ＨＬＳ−５ポリペプチドが、ＨＬＳ−５をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターから、インビボで発現される、請求項１のＳＵＭＯ化制御剤。
4. ＨＬＳ−５ポリヌクレオチドが：
   （ａ） 配列番号１、配列番号３、又は配列番号５に示されたヌクレオチド配列か、又はその機能フラグメントを含んでなるポリヌクレオチド；
   （ｂ） 配列番号１、配列番号３、又は配列番号５に示されたヌクレオチド配列か、又はその機能フラグメントに対し、選択的にハイブリダイズすることが可能なヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド；
   （ｃ） （ａ）又は（ｂ）に定義されたポリヌクレオチドへの遺伝コードの結果としての縮重である、ポリヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド；及び
   （ｄ） （ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチドに対し相補的なポリヌクレオチド、
   からなる１以上の群より選択される、請求項５のＳＵＭＯ化制御剤。
5. 宿主細胞において前記ポリヌクレオチドの発現を指示することが可能な制御配列に対しオペラブリーに結合された、請求項４のＨＬＳ−５ポリヌクレオチドを含んでなるベクターを含んでなるＳＵＭＯ化制御剤。
6. インビボにおいてＳＵＭＯ化を制御する方法であって、それを必要とする患者に対し：
   （i）医薬的に有効な量のＨＬＳ−５ポリペプチド、そのアイソフォーム、その機能フラグメント、又はその医薬組成物；又は
   （ii）ＨＬＳ−５又はその活性の、内在性のレベルを調整することが可能な化合物又は組成物；又は
   （iii）それらの組合せ、
   を、投与する段階を含んでなる方法。
7. 前記ＳＵＭＯ化制御剤が、ＳＵＭＯ化をネガティブに制御する、請求項６の方法。
8. 前記ＳＵＭＯ化制御剤が、ＳＵＭＯ化をポジティブに制御する、請求項６の方法。
9. 前記制御が直接制御である、請求項６−８のいずれか１項による方法。
10. 前記制御が間接制御である、請求項６−８のいずれか１項による方法。
11. インビトロにおいてＳＵＭＯ化を制御する方法であって、細胞に対し：
    （i）医薬的に有効な量のＨＬＳ−５ポリペプチド、そのアイソフォーム、その機能フラグメント、又はその医薬組成物；又は
    （ii）ＨＬＳ−５又はその活性の、内在性のレベルを調整することが可能な化合物又は組成物；又は
    （iii）それらの組合せ、
    を、投与する段階を含んでなる方法。
12. 症状を治療又は予防するための方法であって、患者に対し：
    （i）医薬的に有効な量のＨＬＳ−５ポリペプチド、そのアイソフォーム、その機能フラグメント、又はその医薬組成物；又は
    （ii）ＨＬＳ−５又はその活性の、内在性のレベルを調整することが可能な化合物又は組成物；又は
    （iii）それらの組合せ、
    を、投与する段階を含んでなる方法。
13. 前記患者が、ヒト又は家畜、コンパニオンアニマル、又は動物園の動物である、請求項６−１２のいずれか１項による方法。
14. 前記コンパニオンアニマルが、イヌまたはネコである、請求項１３の方法。
15. ＨＬＳ−５ポリペプチド、そのアイソフォーム、又はその機能フラグメントの、ＳＵＭＯ化活性の修飾因子を同定するためのアッセイであって：
    （i） 基質ポリペプチドとｓｕｍｏとを含むＳＵＭＯ化−コンジュゲート化系を、ｓｕｍｏによる基質ポリペプチドのＳＵＭＯ化を促進する条件下に提供すること；
    （ii） ＳＵＭＯ化−コンジュゲート化系をＨＬＳ−５と接触させること；
    （iii） ＨＬＳ−５の存在下に、基質ポリペプチドのＳＵＭＯ化のレベルを測定すること；
    （ｉｖ） ＳＵＭＯ化−コンジュゲート化系を候補薬剤と接触させること；
    （v） 候補薬剤の存在下に、基質ポリペプチドのＳＵＭＯ化のレベルを測定すること；及び
    （vi） 測定された候補薬剤の存在下のＳＵＭＯ化レベルを、ＨＬＳ−５の存在下及び／又は候補薬剤の不在下の、基質ポリペプチドのＳＵＭＯ化と比較すること、
    を含んでなるアッセイであって、候補薬剤の存在下での基質ポリペプチドのＳＵＭＯ化における統計学的に有意な変化が、ＨＬＳ−５のＳＵＭＯ化活性の修飾因子を表しているアッセイ。
16. ＨＬＳ−５ポリペプチド、そのアイソフォーム、又はその機能フラグメントの、内在レベルの修飾因子を同定するためのアッセイであって、
    （i） 患者からの生物学的試料中のＨＬＳ−５のレベルを測定すること；
    （ii） 該生物学的試料を候補薬剤と接触させること；
    （iii） （ii）の接触された試料中のＨＬＳ−５のレベルを測定すること；及び
    （iv） 測定された（i）及び（ii）のＨＬＳ−５レベルを比較すること、
    を含んでなるアッセイであって、前記レベルにおける統計学的に有意な変化が、ＨＬＳポリペプチド、そのアイソフォーム、又はその機能フラグメントの内在レベルの修飾因子を表しているアッセイ。
17. 症状についてのＨＬＳ−５治療の適合性を測定する方法であって：
    （i） 被験者からの生物学的試料中を用意すること；
    （ii） 前記生物学的試料中の基質ポリペプチドのＳＵＭＯ化レベルを測定すること；及び
    （iii） 前記生物学的試料をＨＬＳ−５と接触させて基質ポリペプチドのＳＵＭＯ化レベルを測定すること、及び、ＨＬＳ−５存在下で測定されたＳＵＭＯ化レベルを、ＨＬＳ−５不在下の基質ポリペプチドのＳＵＭＯ化と比較すること、
    を含んでなるアッセイであって、ＨＬＳ−５存在下の基質ポリペプチドのＳＵＭＯ化における統計学的に有意な差異が、前記症状についてのＨＬＳ−５治療の適合性を表しているアッセイ。

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