KR101835939B1 - Wls 단백질의 특정 모티프를 인지하는 항체 및 이를 포함하는 약제학적 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 WLS 단백질의 특정 모티프를 인지하여 Wnt 신호전달계의 과활성화를 억제함으로써 Wnt 신호전달계와 관련된 질환을 예방 또는 치료하는 항체 및 이를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

Description

WLS 단백질의 특정 모티프를 인지하는 항체 및 이를 포함하는 약제학적 조성물{An antibody that recognizes a specific motif of WLS protein and a pharmaceutical composition comprising the same}
본 발명은 WLS 단백질의 특정 모티프를 인지하여 Wnt 신호전달계의 과활성화를 억제함으로써 Wnt 신호전달계와 관련된 질환을 예방 또는 치료하는 항체 및 이를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
세포 신호전달은 외부에서 오는 자극 (호르몬, 성장인자, 신경전달물질 등)이 세포 내로 전달되어, 유전자 발현, 세포분화 및 분열, 성장 및 사멸 등 다양한 세포 반응을 일으키는 여러 단계 과정으로 이중 한 가지 이상의 손상 및 비정상 반응은 종종 질환을 유발하는 원인이 된다. 현대인의 4대 질환 (암, 심혈관, 면역, 뇌질환)들이 거의 모두 세포 신호전달계의 이상에 의한 것이므로 신호전달 단백질들을 타겟으로 한 약물 발굴이나 세포 신호전달계의 활성을 조절하는 약물 스크리닝이 신약개발의 주 표적이 되고 있으며, 이러한 약물은 제약 산업의 50% 이상을 차지하고 있다.
이러한 세포 신호전달계 가운데 Wnt/β-카테닌 신호전달계는 척추동물의 발생, 성장, 항상성 유지에 있어 필수적인 역할을 하는 신호전달계이다. Wnt 신호전달은 성체 동물에서의 배아발생 및 항상성 모두에 중요하다. Wnt 경로는 일반적으로 하기 과정을 조절하는 단백질의 네트워크로 구성된다: 1. Wnt 단백질의 생산 및 분비; 2. Wnt의 세포 수용체와의 결합; 및 3. 상호작용에 의해 촉발된 생화학적 반응의 세포 내 전달(Mikels and Nusse, 2006; MacDonald, 2009; Moon, 2005).
Wnt 단백질이 세포 표면 공-수용체 프리즐드(Frizzled) LRP5/6에 결합함으로써 촉발되는 소위 표준 Wnt 경로는 핵에 도달하는 β-카테닌 양의 변화를 야기하며, 핵에서 그것은 TCF/LEF 패밀리 전사 인자와 상호작용하여 특정 유전자의 전사를 촉진한다.
다른 세트의 세포 내 단백질에 의해 전달되는 비-표준 Wnt 경로는 곤충에서의 평면 세포 극성(planar cell polarity) 및 척추동물에서의 낭포형성(gastrulation)과 같은 몇 가지 공정을 제어한다.
Wnt 신호전달은 또한 배아 및 성체 줄기 세포의 전분화능 및 분화를 제어하는 역할을 하는 것으로 공지되어 있다(Nusse, 2008). 예를 들면, 낭포형성 동안 원시선(primitive streak)의 형성은 배양체(embryoid body)에서의 국지화된 Wnt 활성화와 연관되었다(ten Berge, 2008). 심장 세포, 췌장 베타 세포, 도파민작용 뉴런 및 배아 줄기세포 또는 iPS 세포 유래의 간세포와 같은 많은 세포 유형의 유래는 Wnt 조절에 의해 영향을 받는다(Yang, 2008; D'Amour, 2006; Inestrosa and Arenas, 2010; Sullivan, 2010). Wnt 경로는 골 형성 및 연골형성과 같은 골격 조직 발달에서 특히 중요한 역할을 한다(Hoeppner, 2009; Chun, 2008). Wnt 신호전달은 또한 성인 중추신경계의 신경재생과 연관되어 있다(Lie, 2005).
질환은 변경된 Wnt 경로 활성으로부터 발생할 수 있다. 예를 들면, 표준 Wnt 경로의 과활성화는 비정상적인 세포 성장을 야기할 수 있다(Reya and Clevers, 2005). 특히, 결장직장암의 90%는 Wnt/β-카테닌 경로의 억제제인 선종증 결장 폴립증(APC) 유전자의 손실에 의해 개시된다(Kinzler and Vogelstein, 1996). Wnt 단백질의 발현 증가 및 정상적으로 Wnt 단백질 기능을 억제하는 세포 외 억제제의 손실은 Wnt-의존적 종양을 야기할 수 있다(Polakis, 2007). 한편, 비-표준 Wnt 경로 역시 특정 암의 진행에서 역할을 하는 것으로 나타났다(Camilli and Weeraratna, 2010). 보다 최근에, Wnt 신호전달은 또한 암 줄기세포와 연관되어 있다(Takahashi-Yanaga 및 Kahn, 2010).
증거는 Wnt-매개된 신호 전달 경로를 표적화하는 것이 광범위한 질환에서 치료적으로 유용할 것임을 제시한다(Barker and Clevers, 2006). 표준 Wnt 경로의 항시적 활성화를 야기하는 APC, 베타-카테닌 또는 악신-1의 돌연변이는 결장직장암, 흑색종, 간세포 암종, 위암, 난소암 등을 포함하는 다양한 인간 암에서 중요한 사건이다(Polakis, 2007). 유전적 또는 화학적 접근법을 이용한 다양한 암에서의 Wnt 경로의 차단은 비정상적인 세포 성장을 폐지하는 것으로 나타났다(Herbst and Kolligs, 2007). 더욱이, 이 경로의 억제는 암세포의 성장을 지속시키고 전이를 가능하게 하는 세포에 직접 영향을 미칠 수 있으며, 전통적인 화학치료제에 내성인 세포에 직접 영향을 미칠 수 있다.
수용체의 하류에 있는 유전자 생성물의 돌연변이에 의해 야기되는 활성화 외에도, 다른 기전에 의해 야기된 비정상적인 Wnt 경로 활성은 광범위한 암과 연관되어 왔다. 이들 암은 비제한적으로: 폐(소세포 및 비소세포), 유방, 전립선, 카르시노이드, 방광, 암종, 식도, 난소, 자궁경부, 자궁내막, 중피종, 흑색종, 육종, 골육종, 지방육종, 갑상선, 유건종, 만성 골수구성 백혈병(AML), 및 만성 골수구성 백혈병(CML)을 포함한다. 현재 상향조절된 자가분비 또는 측분비 Wnt 신호전달에 의존적인 암 세포의 다수의 예가 있으며, 골육종, 유방, 두경부 및 난소암 유래의 세포주들은 자가분비 또는 측분비 Wnt 신호전달에 의해 세포자멸사로부터 보호받는 것으로 나타났다(Kansara, 2009; Bafico, 2004; Akiri, 2009; DeAlmeida, 2007; Chan, 2007; Chen, 2009; Rhee, 2002).
더욱이, 비정상적인 Wnt 경로는 섬유증의 발달과 관련되어 왔으며, 이는 비제한적으로: 폐 섬유증, 예컨대 특발성 폐 섬유증 및 방사선-유도된 섬유증, 신장 섬유증 및 간 섬유증을 포함한다(Morrisey, 2003; Hwang, 2009; Cheng, 2008).
비정상적인 Wnt 신호전달과 연관된 다른 장애들은, 비제한적으로 골다공증 및 골관절염과 같은 골 및 연골 장애, 비만 연관된 II형 당뇨병, 및 알츠하이머병과 같은 신경퇴행성 질환을 포함한다(Hoeppner, 2009; Ouchi, 2010; Blom, 2010; Boonen, 2009). Wnt 신호전달은 또한 HSC의 자가-재생 및 유지에 기여하며, 기능부전인 Wnt 신호전달은 백혈병 및 다양한 다른 혈액 관련 암과 같은 HSC로부터 비롯된 다양한 장애의 원인이다(Reya, 2005).
본 발명의 목적은 Wnt 신호전달에 있어서 Wnt 단백질 분비를 조절하는 WLS 단백질의 특정 모티프를 인지하는 항체를 이용하여 Wnt 신호전달의 과활성화를 억제함으로써 Wnt 신호전달계와 관련된 질환을 예방 또는 치료하는 약학 조성물을 제공하고자 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.
명세서에서 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
본 발명의 일 구체예에서 Wnt 단백질이란, 신호전달 단백질로서 배발생(embryogenesis) 단계에서 줄기세포 조절과 같은 다양한 발생 과정에 관여하는 단백질이다. Wnt 단백질의 분자량은 ~40kDa 이고, 여러 개의 보존된 시스테인을 가지고 있다. 2003년에 처음으로 쥐 Wnt3a 단백질이 성공적으로 정제되었는데, 지질조절된 단백질임이 밝혀졌다. Wnt에 더해진 지질은 효과적인 신호전달에 필요한데, 이는 Wnt 단백질에서 수용체와 결합하는 영역 중 하나의 지질 부위가 주머니 구조의 수용체 안으로 뻗어 들어감으로써 수용체와 결합이 일어나기 때문이다. 인간을 포함한 대부분 포유류 유전자는 19개의 Wnt 유전자를 가지고 있고, 그 중 12개는 보존된 하위체(subfamily)에 속한다. 단세포 생물들은 Wnt 유전자를 가지고 있지 않은 것으로 보아, Wnt 신호전달이 다세포 동물의 진화가 시작되는데 매우 중요한 역할을 했을 것으로 추정된다.
본 발명의 일 구체예에서 WLS(wntless) 단백질이란, Wnt 신호전달에서 Wnt 단백질의 분비에 필수적인 단백질로, G 단백질 연관 수용체 177(G protein-coupled receptor 177, GPR177), C1orf139, EVI, MRP, sprinter 및 mig-14로도 명명된다. WLS 유전자는 Wnt 단백질을 분비하는 세포에서 Wnt 단백질에 대한 수용체를 코딩한다. WLS 단백질(Wnt 수용체)은 프리즐 단백질(Frizzled protein, Fz)과 지질단백 연관 단백질 5/6(Lipoprotein Receptor-related Proteins 5/6, LRP5/6)로 구성된 이질이합체 구조이다. Fz 단백질은 일곱 번 세포막을 통과하는 수용체로서 큰 세포바깥 N말단 시스테인 리치 도메인(cysteine rich domain, CRD)을 가지고 있는데, CRD를 통해 Wnt와 여러 위치에서 상호작용한다. Fz는 LRP군(LRP family)로 알려진 한번 세포막을 통과하는 수용체와 함께 Wnt에 결합한다. Wnt 수용체는 리간드가 결합함으로써 구조가 변화되고, 이에 의해 주요 타겟 단백질들이 인산화된다. 신호 전달에 있어서 핵심적인 단계가 엑신 단백질(Axin)이 LRP의 세포질 쪽 끝에 결합하는 것인데, 이는 LRP6 꼬리(LRP6 tail)의 인산화에 의해 조절된다. 다른 신호 전달 경로에서는 하나의 키나아제가 여러 기질을 인산화 시킴으로써 신호를 증폭하는 역할을 한다. 하지만, Wnt에 의한 LRP6 인산화는 파괴복합체(destruction complex)에서 음성 조절자로 작용할 수 있는 Axin을 희석시키는 역할을 한다. 즉, 촉매 기작보다는 화학량론적 기작(stoichiometric mechanism)을 이용하고 있는 점이 주요 차이점이다.
본 발명의 일 구체예세서 신생혈관이란, 혈관 내피세포가 증식하고 재구성되어 기존에 존재하는 혈관 네트워크로부터 새로운 혈관을 형성하는 세포 현상을 의미한다. 암세포가 증식 및 성장하기 위해서는 산소와 영양을 공급하는 새로운 혈관이 필요하므로, 신생혈관의 억제를 통해서 암의 전이 억제를 유도할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서 전이란, 암세포가 원발장기를 떠나 다른 장기로 가는 것이다. 암이 신체의 다른 부분으로 퍼지는 것은 크게 원발암에서 암조직이 성장하여 직접적으로 주위장기를 침윤하는 것과 멀리 있는 다른 장기로 혈관이나 림프관을 따라 원격전이를 하는 것으로 나눈다. 전이는 암 발생과 관련된 유전자의 발현 억제 또는 상기 유전자의 단백질 활성 억제를 통해 조절될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서 유전자의 발현 억제는 타켓 유전자에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 및 마이크로RNA 등으로 이루어질 수 있다.
상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 특정 DNA 또는 RNA 타겟에 대해 안티센스(또는 상보)인 짧은 길이의 DNA 합성 가닥(또는 DNA 아날로그)으로서, 생체 내뿐만 아니라 생체 외에서도 유전자-특이적 억제를 달성하기 위해 사용된다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 타겟에 결합하고 전사, 번역 또는 스플라이싱의 단계에서 발현을 멈추게 함으로써 DNA 또는 RNA 타겟에 의해 인코드된 단백질의 발현을 막기 위해 제안되었다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 세포 배양 및 질환의 동물 모델에서도 성공적으로 이용되어 왔다. 올리고뉴클레오타이드가 분해되지 않도록 더욱 안정하고 저항적이 되게 하기 위한 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 또 다른 변형이 당업자에게 알려져 있고 이해된다. 여기서 사용된 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 이중나선 또는 단일나선 DNA, 이중나선 또는 단일나선 RNA, DNA/RNA 하이브리드, DNA 및 RNA 아날로그 및 염기, 당 또는 백본 변형을 지닌 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 올리고뉴클레오타이드는 안정성을 증가시키고, 뉴클레아제 분해에 대한 저항성을 증가시키기 위해 당분야에 알려진 방법에 의해 변형된다. 이들 변형은 당분야에 알려져 있는 올리고뉴클레오타이드 백본의 변형, 당 모이어티의 변형 또는 염기의 변형을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
상기 siRNA(small interfering RNA)는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱(silencing)을 매개할 수 있는 핵산 분자로서, 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 녹다운방법 또는 유전자치료 방법으로 사용된다. 본 발명에서 siRNA 분자가 이용되는 경우, 센스 가닥(WLS mRNA 서열에 상응하는 서열)과 안티센스 가닥(WLS mRNA 서열에 상보적인 서열)이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조 또는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다. siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 불일치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 팽창/돌출(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. siRNA 말단 구조는 WLS 유전자의 발현을 RNA 간섭(RNA interference, RNAi) 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활 말단 혹은 점착 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3'-말단 돌출 구조와 5'-말단 돌출 구조 모두 가능하다. 상기 siRNA분자는 이에 제한되지는 않으나, 전체 길이가 15 내지 30 염기, 바람직하게는 19 내지 21 염기일 수 있다.
상기 shRNA(short hairpin RNA)는 45 내지 70 뉴클레오타이드의 길이를 가지는 단일가닥의 RNA로서, 타겟유전자 siRNA 염기서열의 센스가닥과 상보적인 안티센스가닥 사이에 3-10개의 염기 링커를 연결하는 올리고 DNA를 합성한 후, 플라스미드 벡터에 클로닝하거나 또는 shRNA를 레트로바이러스인 렌티바이러스 및 아데노 바이러스에 삽입하여 발현시키면 루프가 있는 헤어핀 구조의 shRNA가 만들어지고 세포내의 다이서(dicer)에 의해 siRNA로 전환되어 RNAi 효과를 나타낸다.
상기 마이크로 RNA(microRNA)는 발생, 분화, 증식, 보존 및 아폽토시스 등 다양한 생물학적 과정을 조절한다. 마이크로 RNA는 일반적으로 타겟 mRNA를 불안정하게 하거나, 번역을 방해함으로써 타겟 mRNA를 코딩하는 유전자의 발현을 조절한다.
상기 안티센스 올리고 뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 또는 마이크로RNA를 지닌 발현 컨스트럭트/벡터에 유용한 조절 서열(예를 들어, 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 조직 특이적 프로모터 또는 그의 결합) 역시 당분야에서 공지된 내용으로부터 적절히 선택할 수 있으며, 상기 유전자의 발현 억제제는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 또는 마이크로RNA 외에도 상기 유전자의 발현을 억제하는 물질이면 어떤 것이든 가능하다.
본 발명의 일 구체예에서 단백질의 발현 억제는 타켓 단백질에 특이적인 항체 또는 그 항원 결합 단편 등으로 이루어질 수 있다.
상기 항체란, 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 마커인 WLS 유전자로부터 발현되는 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 이러한 항체는 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩티드로는, 최소한 7개 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 보다 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다. 본 발명의 암 진단 마커의 검출에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.
본 발명의 일 구체예에서 진단이란, 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미하며, 본 발명의 목적상 진단은 위암의 발병 유무 및 전이 여부를 확인하는 것이다.
본 발명의 일 구체예에서 진단용 마커, 진단하기 위한 마커 또는 진단 마커란, 암세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로서, 정상 세포에 비하여 암을 가진 세포에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질 또는 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 암 진단 마커는 정상 대상 조직의 세포에 비하여, 위암 세포에서 특이적으로 높은 수준의 발현을 보이는 WLS 유전자의 mRNA 및 이에 의해 코딩되는 단백질이다.
본 발명의 일 구체예에서 mRNA 발현 수준 측정이란, 암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 암 마커 유전자들의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로서, mRNA의 양을 측정함으로써 알 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅 또는 DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제는 암세포에서 발현이 증가하는 WLS 유전자의 발현수준을 확인함으로써 마커의 검출에 사용될 수 있는 분자를 의미하며, 이에 제한되지는 않으나 바람직하게는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 것일 수 있다. WLS의 폴리뉴클레오타이드 서열을 바탕으로 당업자는 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.
상기 프라이머란, 짧은 자유 3말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명에서는 WLS 폴리뉴클레오타이드의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 암을 진단할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
또한 프로브란, mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며, 라벨링되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 WLS 폴리뉴클레오타이드와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 암을 진단할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
본 발명의 일 구체예에서 단백질 발현수준 측정이란, 암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 암 마커 유전자로부터 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 바람직하게는 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 단백질의 발현수준을 측정하는 제제는 Wnt 신호전달계의 과활성 시 발현이 증가하는 마커인 WLS 유전자로부터 발현되는 단백질의 발현수준을 확인함으로써 마커의 검출에 사용될 수 있는 분자를 의미하며, 이에 제한되지는 않으나 바람직하게는 상기 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 것일 수 있다. WLS 유전자로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 바탕으로 당업자는 상기 단백질에 특이적인 항체를 디자인할 수 있다.
상기 단백질에 대한 모노클로날 항체는 당업계에 통상적인 모노클로날 항체 제작 방법을 통해 제작되어 사용될 수도 있고, 시판되는 것을 사용할 수 있다. 또한, 모노클로날 항체 대신에 상기 단백질을 인식하는 폴리클로날 항체를 사용할 수도 있고, 이는 당업계에 통상적인 항혈청 제작 방법을 통해 제작되어 사용될 수도 있다.
본 발명의 일 구체예에서 키트란, 특정한 목적을 위해 필요한 조성물 및 부속품들을 모아놓은 세트를 의미한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 키트는 Wnt 신호전달계 이상의 진단 마커인 WLS의 발현수준을 mRNA 또는 이의 단백질의 발현수준을 확인함으로써 위암을 진단할 수 있다. 본 발명의 키트에는 위암 진단 마커의 발현수준을 측정하기 위한 프라이머, 프로브 또는 선택적으로 마커를 인지하는 항체뿐만 아니라 분석방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서 투여란, 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 경구 투여, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여, 강내 투여, 복강 내 투여, 경막 내 투여가 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 치료 방법은 상기 약제학적 조성물을 약제학적 유효량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명에서 유효량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 성인의 경우, 상기 유전자의 발현 억제제 또는 단백질의 활성 억제제를 1일 1회 내지 수회 투여시, siRNA일 경우 0.01ng/kg-10㎎/kg, 상기 유전자의 mRNA에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드인 경우 0.01ng/kg-10㎎/kg, 화합물일 경우 0.1ng/kg-10㎎/kg, 상기 단백질에 대한 모노클로날 항체일 경우 0.1ng/kg-10㎎/kg의 용량으로 투여될 수 있다.
상기 조성물은 총 중량에 대하여 서열번호 1 내지 3 중에서 어느 하나 이상의 단백질에 대한 항체의 유효성분을 0.1 내지 50 중량%로 포함한다. 본 발명의 조성물은 통상의 방법에 따른 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상세하게는, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 고분자 다당체 또는 토란추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose), 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에서 스크리닝이란, 여러 물질로 이루어진 후보군으로부터 목적으로 하는 어떤 특정한 성질을 갖는 물질을 특정한 조작 또는 평가 방법으로 선별하는 것이다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 스크리닝은, 암 발병 및 암 전이 의심 개체에 암 치료용 후보 물질의 투여 후 본 발명의 펩타이드 또는 본 발명의 핵산이 코팅하는 단백질의 활성이 저해되는 경우에, 후보 물질을 암 치료제로 결정하는 암 치료제의 스크리닝 방법이다. 분자생물학적 어쎄이(assay), 디지털 이미징, 세포학적 및 조직학적 검사와 같은 수단적 방법들이 암 발병 병소 또는 암 세포 전이 의심 조직에 대한 대한 본 발명의 유전자와 단백질의 활성을 측정하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, (ⅰ) 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열; (ⅱ) 상기 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 아미노산 서열 중 연속된 적어도 6개의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열; 및 (ⅲ) 상기 (ⅰ) 또는 (ⅱ)의 아미노산 서열과 상동성이 90% 이상인 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 표시되는 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 Wnt 신호전달계와 관련된 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 본 발명은 상기 WLS 단백질 중 서열번호 2로 표시되는 모티프 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 Wnt 신호전달계와 관련된 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
또한, 바람직하게는, 본 발명은 상기 WLS 단백질 중 서열번호 4 내지 6 중 적어도 하나, 보다 바람직하게는 서열번호 6으로 표시되는 모티프 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 Wnt 신호전달계와 관련된 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 제공하는 항체는 WLS 단백질 중 특정 모티프에 특이적으로 결합하여 Wnt 신호전달계의 과활성을 방지함으로써, 이로 인해 발병되는 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.
본 발명에서 상기 Wnt 신호전달계의 과활성으로 기인하는 질환으로는 예를 들어, 암, 망막병증, 황반 변성, 섬유증, 진균성 또는 바이러스 감염, 골 또는 연골 질환, 골관절염, 류마티스성 관절염, 신경성 질환, 당뇨병, 소화기계 질환, 심장혈관질환 및 신장 질환으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. (Science. 2005 Aug 19;309(5738):1256-9.; Gastroenterology. 2005 Aug;129(2):626-38.; GENES & DEVELOPMENT 19:1596-1611; Trends Cell Biol. 2006 Mar;16(3):151-8. Epub 2006 Feb 7.; J Physiol. 2013 Mar 15;591(Pt 6):1409-32.; IUBMB Life. 2007 Apr-May;59(4-5):316-21.; Organogenesis. 2008 Apr-Jun; 4(2): 55-59.; Mol Pharmacol 82:168-177, 2012; J Cell Biochem. 2012 January ; 113(1): 49-60.; Science. 2010 March 26; 327(5973): 1650-1653.; Life Sciences 89 (2011) 545-554.)
여기서, 상기 암으로는 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 유방암, 전립선암, 카르시노이드, 방광암, 위암, 췌장암, 간암, 직장결장암, 대장암, 신장암, 두부암, 골암, 목 편평상피 세포 암종, 식도암, 난소암, 자궁경부암, 자궁내막암, 중피종, 흑색종, 육종, 골육종, 지방육종, 갑상선암, 유건종, 급성 골수성 백혈병 (AML), 및 만성 골수성 백혈병 (CML)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 바람직하게는 위암, 유방암, 피부암, 신장암 또는 대장암일 수 있고, 보다 바람직하게는 위암 또는 대장암일 수 있다.
여기서, 상기 섬유증으로는 피부 섬유증; 경피증; 진행성 전신 섬유증; 폐 섬유증; 근육 섬유증; 신장 섬유증; 사구체경화증; 사구체신염; 비대한 반흔 형성; 자궁 섬유증; 신장 섬유증; 간 경화증, 간 섬유증; 유착, 이를 테면 복부, 골반, 척추 또는 힘줄에서 발생되는 유착; 만성 폐쇄성 폐 질환; 심근경색 후 섬유증; 폐 섬유증; 섬유증 및 미만성/간질성 폐 질환과 연합된 반흔형성; 중추 신경계 섬유증, 이를 테면 발작이후 섬유증; 신경-퇴행성 질환 이를 테면 알츠하이머 질환 또는 다발성 경화증과 연합된 섬유증; 증식성 유리체망막증(PVR)과 연합된 섬유증; 재협착증; 자궁내막증; 허혈 질환 및 방사선 섬유증으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 바람직하게는 폐 섬유증일 수 있다.
여기서, 상기 진균성 또는 바이러스 감염은 포진바이러스, 수두바이러스, Epstein-Barr 바이러스, Sindbis 바이러스 또는 아데노바이러스 감염일 수 있다.
여기서, 상기 신경성 질환은 알츠하이머 질환, 전두측두엽 치매, 루이 체와 함께 치매, 프리온 질환, Parkinson 질환, Huntington 질환, 진행성 핵상안근 마비, 피질기저 변성, 다발성 계 위축, 근위축성 측색 경화증 (ALS), 봉입체 근염, 자폐증, 퇴행성 근병증, 당뇨성 신경병증, 기타 대사성 신경병증, 내분비 신경병증, 기립성 저혈압, 다발성 경화증 및 Charcot-Marie-Tooth 질환으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
여기서, 상기 심장혈관질환은 심장 비대증 또는 심근 경색일 수 있다.
여기서, 상기 신장 질환은 낭성 신장 질환, 급성 신부전, 당뇨병성 신증 및 허혈성 손상으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 다른 구현 예에 따르면, (ⅰ) 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열; (ⅱ) 상기 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 아미노산 서열 중 연속된 적어도 6개의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열; 및 (ⅲ) 상기 (ⅰ) 또는 (ⅱ)의 아미노산 서열과 상동성이 90% 이상인 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 코딩하는 유전자에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 및 마이크로 RNA로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 Wnt 신호전달계와 관련된 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 본 발명은 상기 WLS 단백질 중 서열번호 2로 표시되는 모티프 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 및 마이크로 RNA로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 Wnt 신호전달계와 관련된 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
또한, 바람직하게는, 본 발명은 상기 WLS 단백질 중 서열번호 4 내지 6 중 적어도 하나, 보다 바람직하게는 서열번호 6으로 표시되는 모티프 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 및 마이크로 RNA로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 Wnt 신호전달계와 관련된 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 제공하는 상기 siRNA, shRNA 및 마이크로 RNA는 WLS 단백질 중 특정 모티프를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하여 Wnt 신호전달계의 과활성을 방지함으로써, 이로 인해 발병되는 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.
본 발명에서 상기와 같이 Wnt 신호전달계의 과활성에 기인하는 질환의 종류는 앞서 기재한 바와 중복되어 이하에서는 그 기재를 생략한다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, (ⅰ) 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열; (ⅱ) 상기 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 아미노산 서열 중 연속된 적어도 6개의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열; 및 (ⅲ) 상기 (ⅰ) 또는 (ⅱ)의 아미노산 서열과 상동성이 90% 이상인 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 표시되는 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 혈관 신생 억제용 약제학적 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 본 발명은 상기 WLS 단백질 중 서열번호 2로 표시되는 모티프 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 혈관 신생 억제용 약제학적 조성물을 제공한다.
또한, 바람직하게는, 본 발명은 상기 WLS 단백질 중 서열번호 4 내지 6 중 적어도 하나, 보다 바람직하게는 서열번호 6으로 표시되는 모티프 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 혈관신생 억제용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 제공하는 조성물은 Wnt 신호전달계의 과활성을 방지하여 이로 인해 유발되는 혈관 신생을 억제함으로써 최종적으로는 암의 성장 또는 전이를 예방 및/또는 치료할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, (ⅰ) 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열; (ⅱ) 상기 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 아미노산 서열 중 연속된 적어도 6개의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열; 및 (ⅲ) 상기 (ⅰ) 또는 (ⅱ)의 아미노산 서열과 상동성이 90% 이상인 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 코딩하는 유전자에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 및 마이크로 RNA로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 혈관신생 억제용 약제학적 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 본 발명은 상기 WLS 단백질 중 서열번호 2로 표시되는 모티프 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 및 마이크로 RNA로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 혈관 신생 억제용 약제학적 조성물을 제공한다.
또한, 바람직하게는, 본 발명은 상기 WLS 단백질 중 서열번호 4 내지 6 중 적어도 하나, 보다 바람직하게는 서열번호 6으로 표시되는 모티프 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 및 마이크로 RNA로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 혈관신생 억제용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 제공하는 조성물은 Wnt 신호전달계의 과활성을 방지하여 이로 인해 유발되는 혈관 신생을 억제함으로써 최종적으로는 암의 성장 또는 전이를 예방 및/또는 치료할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, (ⅰ) 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열; (ⅱ) 상기 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 아미노산 서열 중 연속된 적어도 6개의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열; 및 (ⅲ) 상기 (ⅰ) 또는 (ⅱ)의 아미노산 서열과 상동성이 90% 이상인 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 표시되는 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 암 전이 억제용 약제학적 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 본 발명은 상기 WLS 단백질 중 서열번호 2로 표시되는 모티프 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 암 전이 억제용 약제학적 조성물을 제공한다.
또한, 바람직하게는, 본 발명은 상기 WLS 단백질 중 서열번호 4 내지 6 중 적어도 하나, 보다 바람직하게는 서열번호 6으로 표시되는 모티프 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 암 전이 억제용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 제공하는 조성물은 Wnt 신호전달계의 과활성을 방지하여 이로 인해 유발되는 암의 전이를 효과적으로 예방 및/또는 치료할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, (ⅰ) 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열; (ⅱ) 상기 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 아미노산 서열 중 연속된 적어도 6개의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열; 및 (ⅲ) 상기 (ⅰ) 또는 (ⅱ)의 아미노산 서열과 상동성이 90% 이상인 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 코딩하는 유전자에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 및 마이크로 RNA로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 암 전이 억제용 약제학적 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 본 발명은 상기 WLS 단백질 중 서열번호 2로 표시되는 모티프 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 및 마이크로 RNA로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 암 전이 약제학적 조성물을 제공한다.
또한, 바람직하게는, 본 발명은 상기 WLS 단백질 중 서열번호 4 내지 6 중 적어도 하나, 보다 바람직하게는 서열번호 6으로 표시되는 모티프 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 및 마이크로 RNA로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 암 전이 억제용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 제공하는 조성물은 Wnt 신호전달계의 과활성을 방지하여 이로 인해 유발되는 암의 전이를 효과적으로 예방 및/또는 치료할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, (ⅰ) 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열; (ⅱ) 상기 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 아미노산 서열 중 연속된 적어도 6개의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열; 및 (ⅲ) 상기 (ⅰ) 또는 (ⅱ)의 아미노산 서열과 상동성이 90% 이상인 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 표시되는 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 암 또는 암 전이 진단용 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 본 발명은 상기 WLS 단백질 중 서열번호 2로 표시되는 모티프 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 암 또는 암 전이 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 바람직하게는, 본 발명은 상기 WLS 단백질 중 서열번호 4 내지 6 중 적어도 하나, 보다 바람직하게는 서열번호 6으로 표시되는 모티프 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 암 또는 암 전이 진단용 약제학적 조성물을 제공한다.
Wnt 신호전달계의 과활성으로 인해 발병 또는 전이되는 암 세포에서는 WLS 단백질의 발현량이 증가되는 양상을 보인다. 따라서, 본 발명의 진단용 조성물은 생리학적 시료에서 암의 성장 또는 전이 병리적 마커를 검출하기 위한 것으로, 상기 WLS 단백질의 발현 정도를 정량 분석하여 암의 성장 또는 전이를 진단할 수 있고, 보다 바람직하게는 위암 또는 대장암의 성장 또는 전이를 진단할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, (ⅰ) 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열; (ⅱ) 상기 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 아미노산 서열 중 연속된 적어도 6개의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열; 및 (ⅲ) 상기 (ⅰ) 또는 (ⅱ)의 아미노산 서열과 상동성이 90% 이상인 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 코딩하는 유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함하는 암 또는 암 전이 진단용 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 본 발명은 상기 WLS 단백질 중 서열번호 2로 표시되는 모티프 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함하는 암 또는 암 전이 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 바람직하게는, 본 발명은 상기 WLS 단백질 중 서열번호 4 내지 6 중 적어도 하나, 보다 바람직하게는 서열번호 6으로 표시되는 모티프 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함하는 암 또는 암 전이 진단용 조성물을 제공한다.
상기한 바와 같이 Wnt 신호전달계의 과활성으로 인해 발병 또는 전이된 암 세포에서는 WLS 단백질의 발현량이 증가되는 양상을 보인다. 따라서, 본 발명의 진단용 조성물은 WLS 단백질을 코딩하는 mRNA의 발현 정도를 정량 분석하여 암의 성장 또는 전이를 진단할 수 있고, 보다 바람직하게는 위암 또는 대장암의 성장 또는 전이를 진단할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, (ⅰ) 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열; (ⅱ) 상기 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 아미노산 서열 중 연속된 적어도 6개의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열; 및 (ⅲ) 상기 (ⅰ) 또는 (ⅱ)의 아미노산 서열과 상동성이 90% 이상인 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 표시되는 단백질에 특이적인 항체로 피검체의 단백질 발현 수준을 측정하여 암 또는 암 전이 여부에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, (ⅰ) 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열; (ⅱ) 상기 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 아미노산 서열 중 연속된 적어도 6개의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열; 및 (ⅲ) 상기 (ⅰ) 또는 (ⅱ)의 아미노산 서열과 상동성이 90% 이상인 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 코딩하는 유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브로 피검체의 WLS 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하여 암 또는 암 전이 여부에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 암 치료용 후보 물질과 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나로 표시되는 WLS(Wntless) 모티프 단백질에 특이적인 항체를 병용 투여 시, 상기 WLS 항체를 단일 투여했을 경우보다 WLS 단백질 발현이 저해되는 경우에 후보물질을 암 병용 치료제로 결정하는 암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 암 치료용 후보 물질과 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나로 표시되는 WLS(Wntless) 모티프 단백질을 코딩하는 유전자에 상응하는 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 및 마이크로 RNA로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 병용 투여 시, 상기 WLS 항체를 단일 투여했을 경우보다 WLS 단백질 발현이 저해되는 경우에 후보물질을 암 병용 치료제로 결정하는 암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, (ⅰ) 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열; (ⅱ) 상기 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 아미노산 서열 중 연속된 적어도 6개의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열; 및 (ⅲ) 상기 (ⅰ) 또는 (ⅱ)의 아미노산 서열과 상동성이 90% 이상인 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 표시되는 단백질을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, (ⅰ) 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열; (ⅱ) 상기 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 아미노산 서열 중 연속된 적어도 6개의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열; 및 (ⅲ) 상기 (ⅰ) 또는 (ⅱ)의 아미노산 서열과 상동성이 90% 이상인 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 표시되는 단백질에 특이적인 항체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, (ⅰ) 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열; (ⅱ) 상기 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 아미노산 서열 중 연속된 적어도 6개의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열; 및 (ⅲ) 상기 (ⅰ) 또는 (ⅱ)의 아미노산 서열과 상동성이 90% 이상인 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 표시되는 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.
이하 상기 본 발명을 단계별로 상세히 설명한다.
본 발명에서 제공하는 항체는 Wnt 신호전달에 있어서 Wnt 단백질의 분비를 조절하는 WLS 단백질의 특정 모티프를 인지하여 Wnt 신호전달의 과활성화를 억제함으로써 Wnt 신호전달계와 관련된 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 Wnt 결합 전 또는 후의 WLS 단백질의 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 WLS 단백질의 Wnt 결합 부위 모티프를 나타낸 모식도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 WLS의 발현과 위암 예후와의 상관성을 나타낸 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 WLS 단백질을 5개의 펩타이드로 구분하여 나타낸 것이다.
도 5a는 본 발명의 일 실시예에 따른 AGS 위암 세포주에서의 WLS#2, WLS#3, WLS#4 및 WLS#5 항체의 WLS 단백질 반응성을 확인한 결과이다.
도 5b는 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드와 함께 처리된 항체의 WLS 검출능 저하를 확인한 결과이다.
도 6a는 본 발명의 일 실시예에 따른 siWLS #1의 FLAG-WLS 발현 저하 효과를 확인한 결과이다.
도 6b는 본 발명의 일 실시예에 따른 면역침강된 FLAG-WLS 단백질과 단일클론 항체의 결합을 확인한 결과이다.
도 7a는 본 발명의 일 실시예에 따른 AGS 위암 세포주에서의 WLS 위치를 면역형광염색으로 확인한 결과이다.
도 7b는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포내 분획에서의 WLS 발현양상을 웨스턴 블랏팅으로 확인한 결과이다.
도 7c는 본 발명의 일 실시예에 따른 AGS 위암 세포주에서의 WLS 위치를 면역형광염색으로 확인한 결과이다.
도 7d는 본 발명의 일 실시예에 따른 AGS 위암 세포주에서의 WLS#3 항체와 내재성 WLS의 결합을 유동세포분석법으로 확인한 결과이다.
도 7e는 본 발명의 일 실시예에 따른 AGS 위암 세포주에서의 WLS#4 항체와 내재성 WLS의 결합을 유동세포분석법으로 확인한 결과이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 다양한 위암 세포주에서의 WLS, Axin2, 및 CyclinD1 발현 정도를 확인한 결과이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 AGS 위암 세포주에 1ug/ml 의 WLS 단일클론 항체를 처리하였을 때의 세포 생존 능력을 확인한 결과이다.
도 10a는 본 발명의 일 실시예에 따른 AGS 위암 세포주에 4ug/ml의 WLS 단일클론 항체를 처리하였을 때의 반감된 세포 생존 능력을 확인한 결과이다.
도 10b는 본 발명의 일 실시예에 따른 AGS 위암 세포주에 WLS 단일클론 항체를 처리하였을 때의 비정상 세포 형태를 확인한 결과이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 WLS#3과 WLS#4 항체의 암세포 생존 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 WLS 유전자의 발현 양상이 다른 두 위암 세포주에서의 단일클론항체 처리시 세포 생존 능력을 확인한 결과이다.
도 13a는 본 발명의 일 실시예에 따른 MKN74와 NI3-3 세포의 WLS 발현도를 qRt-PCR로 측정한 결과이다.
도 13b는 본 발명의 일 실시예에 따른 MKN74와 NI3-3 세포의 WLS 발현도를 웨스턴 블랏팅으로 측정한 결과이다.
도 13c는 본 발명의 일 실시예에 따른 MKN74와 NI3-3 세포의 Wnt 표적 유전자 발현도 측정 결과이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 MKN74와 NI3-3 세포에 WLS 단일클론 항체를 처리시 세포 생존 능력을 확인한 결과이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 WLS의 발현 저하시 세포 이동성 변화를 확인한 결과이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 WLS#4 단일클론항체의 암세포 이동성 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 WLS#3 단일클론항체의 암세포 이동성 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따른 MKN74세포를 WLS 발현량에 따라 분리한 유동세포분석 결과이다.
도 19는 본 발명의 일 실시예에 따른 AGS 세포를 CD44 발현량에 따라 분리한 유동세포분석 결과이다.
도 20은 본 발명의 일 실시예에 따른 CD44 의 발현이 높은 AGS 세포에서의 WLS 발현량을 확인한 결과이다.
도 21은 본 발명의 일 실시예에 따른 WLS#4 단일클론항체의 처리 후 대장암 세포의 β-카테닌의 아세틸화 정도를 확인한 결과이다.
도 22a는 본 발명의 일 실시예에 따른 WLS#4 단일클론항체의 처리 후 MKN74세포의 종양 크기를 확인한 결과이다.
도 22b는 본 발명의 일 실시예에 따른 WLS#3 단일클론항체의 처리 후 MKN74세포의 종양 크기를 확인한 결과이다.
도 23은 본 발명의 일 실시예에 따른 대사성 결핍 환경 여부에 따라 p-MKN74세포와 s-MKN74세포의 WLS mRNA 발현 정도를 확인한 결과이다.
도 24는 본 발명의 일 실시예에 따른 대사성 결핍 환경 여부에 따라 p-MKN74세포와 s-MKN74세포의 종양 크기를 확인한 결과이다.
도 25a는 본 발명의 일 실시예에 따른 WLS#3 및 WLS#4 단일클론항체의 처리 후 p-MKN74세포와 s-MKN74세포의 종양 크기를 확인한 결과이다.
도 25b는 본 발명의 일 실시예에 따른 WLS#3 및 WLS#4 단일클론항체의 처리 후 p-MKN74세포의 종양 크기를 확인한 결과이다.
도 25c은 본 발명의 일 실시예에 따른 WLS#3 및 WLS#4 단일클론항체의 처리 후 s-MKN74세포의 종양 크기를 확인한 결과이다.
도 26은 본 발명의 일 실시예에 따른 MCF7 세포에 WLS#4 단일클론항체의 처리 후 β-카테닌의 발현 정도를 확인한 결과이다.
도 27은 본 발명의 일 실시예에 따른 WiDr 세포에 WLS#4 단일클론항체의 처리 후 β-카테닌의 발현 정도를 확인한 결과이다.
도 28은 본 발명의 일 실시예에 따른 A431 세포에 WLS#4 단일클론항체의 처리 후 β-카테닌의 발현 정도를 확인한 결과이다.
도 29는 본 발명의 일 실시예에 따른 형질 주입된 MCF7 세포에 WLS#4 단일클론항체의 처리 후 β-카테닌의 발현 정도를 확인한 결과이다.
도 30은 본 발명의 일 실시예에 따른 형질 주입된 WiDr 세포에 WLS#4 단일클론항체의 처리 후 β-카테닌의 발현 정도를 확인한 결과이다.
도 31은 본 발명의 일 실시예에 따른 형질 주입된 A431 세포에 WLS#4 단일클론항체의 처리 후 β-카테닌의 발현 정도를 확인한 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: WLS 유전자의 동정
위암의 초기 단계에서의 표적 인자를 선별하기 위해, 위암 초기 단계의 환자 78명을 대상으로 위절제수술 후 정상 조직과 암 조직을 마이크로어레이를 통해 비교 분석하였다. 분석 결과 특정 유전자의 발현이 높거나 낮은 집단에서 예후의 차이가 나타남을 확인하였다. 특히 WLS 유전자의 경우 WLS 유전자가 높게 발현되는 군에서 암의 재발이 더 많이 일어났으며 예후가 좋지 않았다. 이에 대한 통계적 유의성을 확인하기 위하여 앞선 집단과 독립된 506명의 위암 환자를 WLS의 발현이 높은 군과 그렇지 않은 군으로 나누고 예후를 관찰한 결과, WLS이 높게 발현되는 군에서 생물학적 위험도(hazard ratio)가 높은 것을 확인하였고, 이를 나이, 성별, 암 진행도(기수)별 콕스(Cox) 분석을 통해 통계적으로도 유의함을 확인하였다(도 3).
실시예 2: WLS 단일클론항체의 제작
WLS 단백질의 구조에서 항원으로 제작 가능한 부분 중에서 (Wnt 결합 부위 라고 알려진 부분을 표적으로 하여) 총 5개의 펩타이드(펩타이드 1번 2번 3번 4번 5번)로 구분하고, 도 4 및 표 1에 나타내었다.
펩타이드 번호 아미노산 위치 아미노산 서열
펩타이드 1번 118-137 IAFKLNNQIRENAEVSMDVS
펩타이드 2번 138-157 LAYRDDAFAEWTEMAHERVP
펩타이드 3번(서열번호 2) 146-165 AEWTEMAHERVPRKLKCTFT
펩타이드 4번(서열번호 3) 163-181 TFTSPKTPEHEGRYYECDV
펩타이드 5번 202-222 PVNEKKKINVGIGEIKDIRL
상기 5개의 펩타이드를 대상으로 각각의 항체 제작을 시도하였다. 1번 펩타이드는 생산이 되지 않아 항체 제작이 불가하였고, 2 내지 5의 펩타이드를 이용하여 총 4 종류의 단일클론항체를 제작하였다. 각각의 항체에 대한 명명을 표 2에 나타내었다.
항체명(단일클론항체) 대상 펩타이드 번호
WLS#2 펩타이드 2번
WLS#3 펩타이드 3번(서열번호 2)
WLS#4 펩타이드 4번(서열번호 3)
WLS#5 펩타이드 5번
실시예 3: WLS 단일클론항체의 검정
pSG5-KF2M1 (앞 플래그 표지, 앞 FLAG tag) 플라스미드 벡터와 pSG-KM1F2 (뒤 플래그 표지, 뒤 FLAG tag) 플라스미드 벡터에 사람의 WLS (NM_024911) 전체 서열을 클로닝하였고, pSG5-공벡터(pSG5-empty vector)를 음성 대조군으로 사용하여 AGS 위암 세포주에 FLAG-WLS을 발현시킨 후 웨스턴 블랏팅을 통하여 확인하였다. 15ug 의 세포 라이세이트 시료를 SDS-PAGE 젤에 전기영동 하였고, WLS#2 내지 WLS#5의 단일클론항체는 5 중량% 스킴 밀크에 1:500 부피%로 희석하여 사용하였다. WLS#2 내지 WLS#5 의 항체가 FLAG 표지된 WLS 단백질을 검출하는 것을 확인하였다(도 5a). 이러한 특이적 검출반응은 WLS#4 항체와 펩타이드를 같이 처리하였을 때에는 웨스턴 블랏팅 상에서 검출되지 않는 것을 확인하였다(도 5b).
실시예 4: 내재성(Endogenous) WLS 단백질의 확인
사람의 WLS 유전자를 표적으로 하는 siRNA 5개를 제작하였고(제놀루션 pre-designed siRNA service 이용), 그 중에서 siWLS #1 (Sense 5' GUCAUCUUCUUCAUCGUUAUU 3' Antisense 5' UAACGAUGAAGAAGAUGACUU 3')이 FLAG-WLS의 발현을 낮추는 것을 WLS#4 항체를 이용한 웨스턴 블랏팅 실험으로 확인하였다(도 6a). 또한 FLAG-M2 비드를 이용하여 FLAG-WLS 단백질을 면역침강 시킨 후 WLS 단일클론 항체(WLS#4)를 이용하여 특이적 결합을 확인하였다(도 6b).
pEGFP-N1 플라스미드 벡터에 WLS을 클로닝 하고, AGS 위암 세포주에 발현하여 세포 내 위치를 확인 한 결과, 세포질에 넓게 분포하는 것을 WLS#4 항체를 이용한 세포면역형광 염색법으로 확인하였다(도 7a). 또한 표적(tag)이 없는 WLS 단백질을 FLAG-WLS와 발현시켜 비교한 결과 내재성(endogenous) WLS의 웨스턴 블랏팅 상에서의 위치를 예측할 수 있었다. 앞서서 제작 및 확인한 siRNA를 이용하여 AGS 위암 세포주에 WLS을 저 발현 시킨 후 세포 내 분획을 세포질과 세포막으로 나누어 WLS의 발현 양상을 웨스턴 블랏팅을 통해 확인 한 결과 세포막 분획에서 내재성 WLS이 발현하는 것을 확인하였다(도 7b).
앞선 pEGFP-WLS 단백질의 발현 양상과 같이, AGS 위암 세포주를 WLS#3과 WLS#4항체를 이용하여 형광염색법으로 확인한 결과 내재성 WLS 단백질이 세포막에 존재하는 것을 확인하였다(도 7c). 또한 유동세포분석법(FACS analysis)을 통해 확인한 결과, WLS#3과 WLS#4항체가 AGS 위암 세포주에서 내재성 WLS와 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다(도 7d, 도 7e).
실시예 5: 위암세포주의 분석
상기 제작한 단일클론항체를 세포실험에 적용하기 위해 위암세포를 선별하였고, 선택된 AGS, SNU-638, SNU-668, KATOIII, MKN28, MKN45 및 MKN74 세포주에서 RNA를 추출하고 cDNA를 합성 후 qRT-PCR 방법을 이용하여 세포 내 WLS 및 Wnt 표적 유전자인 Axin2와 CyclinD1의 mRNA 발현 정도를 확인하였다. 그 결과 AGS 세포주에서 WLS, Axin2, 및 CyclinD1의 발현이 공통적으로 높은 것을 확인하였고, SNU-668, KATOIII, MKN28, MKN45 및 MKN74 세포에서는 공통적으로 발현이 낮은 것을 확인하였다. 예외적으로 SNU-638 세포주의 경우 WLS의 발현은 높지만 WNT 표적 유전자의 발현은 낮은 것을 확인하였다(도 8).
실시예 6: WLS 단일클론항체의 세포 성장 감소 능력 확인
WLS와 Wnt 표적 유전자의 발현이 높은 AGS 위암 세포주에 WLS 단일클론 항체(WLS#4)를 0, 0.5 및 1 ug/ml 의 농도로 처리 한 뒤, 48시간 후에 세포의 생존 능력을 MTT 에세이(MTT assay)로 확인하였다(도 9). 그 결과, 세포는 1ug/ml 의 농도로 항체를 처리하였을 때 생존 능력이 감소하였다. 또한 1ug/ml 농도에서 항체를 펩타이드로 특이성을 저해시켰을 때 세포 생존능력의 감소가 나타나지 않는 것을 확인함으로써 항체의 특이적 결합이 세포의 생존 능력을 감소시킨다는 것을 확인하였다. 추가로, 단일클론 항체의 세포 생존 능력 감소 정도를 확인하기 위해 세포 생존 능력이 50 부피%로 저하될 때까지 항체의 농도를 증가시켜 처리한 결과, 약 4ug/ml의 WLS#4 항체가 처리된 농도에서 50 부피% 의 생존 능력 감소가 나타나는 것을 확인 하였다(도 10a). 또한 AGS 위암 세포주에 WLS 단일클론항체(WLS#4)를 처리하게 되면 대조군에 비하여 비정상 형태가 나타났다(도 10b). 상기 확인한 WLS 단일클론항체 #3 내지 #4를 각각 2ug/ml의 농도로 처리하여 세포 생존능력 감소를 비교한 결과, #3 내지 #4 모두 유의하게 암세포의 생존을 감소시키는 것을 확인하였다(도 11).
실시예 7: WLS 단일클론항체의 특이적 결합 및 세포 생존 능력 감소의 확인
WLS 유전자의 발현이 높은 AGS 위암 세포와 WLS 유전자의 발현이 낮은 MKN45 세포를 이용하여 WLS#4 단일클론항체 처리시 세포 생존 능력을 비교하였다. 그 결과, WLS이 높게 발현되는 경우에만 단일클론항체가 효과가 있었다(도 12). 이러한 현상이 AGS 와 MKN45 세포 자체의 특징에 의한 것일 수 있기 때문에, 동일한 유전적 배경을 가진 세포 모델을 제조하였다. WLS 유전자의 발현이 낮은 MKN74 세포를 쥐의 심장에 주입하고, 이 세포가 쥐의 뇌로 전이가 일어나게 한 후 뇌에서 자라난 MKN74세포를 배양하여 NI3-3로 명명하였다. 이 두 세포간의 WLS 유전자의 발현 정도를 WLS#4 항체를 이용한 qRt-PCR과 웨스턴 블랏팅을 통해 확인한 결과, 뇌 세포로 전이가 일어난 세포에서 WLS의 발현도가 높은 것을 확인하였다(도 13a, 도 13b). 또한 동일 세포에서 세포 내 WLS 및 Wnt 표적 유전자인 Axin2와 CyclinD1의 유전자 활성이 MKN74 원 세포에 비하여 높아진 것을 확인하였다(도 13c). 상기와 동일하게 WLS#4 단일클론항체의 세포 생존 능력 감소를 확인한 결과, WLS이 높게 발현되는 NI3-3 세포주에서만 세포 생존 능력이 감소되는 것을 확인하였으며, 항체 특이적인 결합에 의한 것임을 펩타이드 저해 실험을 통해 확인하였다(도 14).
실시예 8: WLS 단일클론항체의 세포 이동 감소 능력 확인
AGS 위암 세포주에 Wnt 유전자를 발현 시킨 후 세포의 이동성을 세포이동실험(Scratch and healing)을 통하여 확인하였다. AGS 위암 세포가 배양 접시에서 유합(confluency)될 때까지 배양한 후, 200ul 팁(tip)을 이용해 일직선으로 상처(scratch)를 낸 후 6시간 동안 세포가 이동한 면적을 계산하였다. 이 때 siWLS #1을 이용하여 WLS의 발현을 낮추었을 때 세포의 이동성이 감소되는 것을 확인하였다(도 15). 또한 siRNA를 대조군으로 사용하여 WLS#4 단일클론항체의 이동 능력 감소를 측정하였고, 측정 결과 siRNA를 통한 WLS의 발현이 감소된 군과 마찬가지로 WLS#4 단일클론항체를 처리한 군에서도 세포의 이동 능력이 감소되는 것을 확인하였다(도 16). 또한 WLS#4 단일클론항체와 마찬가지로, WLS#3 단일클론항체도 암세포의 Wnt 유전자가 발현되었을 때 세포의 이동성을 감소시키는 것을 확인하였다(도 17).
실시예 9: WLS 단일클론항체의 유동세포분석
상기의 실시예 결과를 통하여 WLS의 높은 발현이 위암환자의 예후와 세포실험 상에서의 전이 능력 향상에 영향을 미칠 수 있음을 확인하였기에, WLS이 높게 발현되는 세포의 특징을 분석하고자 유동세포분석법을 실시하였다. WLS#4 단일클론항체를 이용한 유동세포분석법을 통해, MKN74세포에서 WLS이 높게 발현되는 세포와 낮게 발현되는 세포를 분리하였고(도 18), 위암세포의 종양생성능력을 결정하는 단백질인 CD44를 이용하여 AGS 세포를 유동세포분석법으로 확인하였다(도 19). 그 결과, CD44 의 발현이 높은 AGS 세포에서 WLS의 발현 또한 높은 것을 확인하였다(도 20).
실시예 10: Wnt 신호전달계의 과활성화로 인한 대장암의 신호 전달 억제
상기 실시예 2에서 제작한 WLS#4 단일클론항체를 위암 세포주인 AGS와 Wnt 신호전달의 과활성화로 인한 대장암 세포주인 HT29, SW480 세포주에 처리시 신호 전달의 변화를 관찰하였다. 각 세포주에 WLS#4 단일클론항체를 0, 1, 2, 4ug/ml의 농도로 48시간 처리한 후 웨스턴 블럿을 이용하여 Wnt 신호 전달 체계의 주요 전사 조절자인 β-카테닌의 아세틸화를 확인하였다. 그 결과, Wnt 신호전달의 과활성화로인해 β-카테닌의 아세틸화가 증가되어 있다가 WLS#4 단일클론항체를 처리함에 따라 아세틸화가 감소하는 것을 확인하였다(도 21).
실시예 11: WLS 단일클론항체의 항암 효과 확인(1)
면역력 결핍 누드 마우스의 피하 조직에 마트리겔과 MKN45 세포주를 1:2의 비율(v/v)로 섞어 총 1 x 104개의 세포를 주입하여 위 종양을 형성시키고, 약 2주 후 종양의 부피가 100mm3가 되면 꼬리 정맥 주사를 통하여 실시예 2에서 제작한 WLS 단일클론항체를 주입하였다. WLS#4 단일클론항체의 경우 5mg/kg의 농도로 2주간 6번 주입하였고(n=8), WLS#3 단일클론항체의 경우 5mg/kg의 농도로 3주간 9번 주입하였다(n=20). 종양의 부피는 단일클론항체를 처음 주입한 날부터 마지막으로 주입한 날의 이틀 뒤까지 캘리퍼를 이용하여 단축2x장축/2의 계산법으로 측정하였다. 그 결과, 항체를 처리하지 않은 대조군에 비하여 WLS#3 또는 WLS#4 단일클론항체를 처리한 실험군의 종양 크기가 유의성 있게 감소한 것을 확인하였다(도 22a, 22b).
실시예 12: WLS 단일클론항체의 항암 효과 확인(2)
MKN45 세포주에 대사성 결핍 환경(metabolic starvation)을 주어 선별 MKN45 세포주(s-MKN45)를 확립하였다. 이러한 s-MKN45세포의 WLS의 mRNA 수준을 qRT-PCR 실험을 통해 확인 한 결과 결핍 환경을 부여하지 않은 대조군(p-MKN45)에 비하여 WLS의 발현이 높은 것을 확인하였다(도 23). 면역력 결핍 누드 마우스의 피하 조직에 마트리겔과 p-MKN45 세포주 또는 s- MKN45 세포주를 1:2의 비율(v/v)로 섞어 총 1 x 107개의 세포를 주입하여 위 종양을 형성시킨 결과, s-MKN45세포주가 p-MKN45에 비해 종양생성능력이 높은 것을 확인하였다(도 24). 또한, 면역력 결핍 누드 마우스의 피하 조직에 마트리겔과 p-MKN45 세포주 또는 s- MKN45 세포주를 1:2의 비율(v/v)로 섞어 총 4 x 106개의 세포를 주입하여 위 종양을 형성시키고, 약 2주 후 종양의 부피가 100mm3가 되면 꼬리 정맥 주사를 통하여 실시예 2에서 제작한 WLS 단일클론항체를 주입하였다. WLS#3 및 WLS#4 단일클론항체는 각각 1mg/ml의 농도를 100㎕의 양으로 2주간 3번 주입하였다. 종양의 부피는 단일클론항체를 처음 주입한 날부터 마지막으로 주입한 날의 이틀 뒤까지 캘리퍼를 이용하여 단축2x장축/2의 계산법으로 측정하였다. 그 결과, 항체를 처리하지 않은 대조군에 비하여 WLS#3 또는 WLS#4 단일클론항체를 처리한 실험군은 p-MKN45 세포주 및 s-MKN45세포주 모두에서 종양 크기가 유의성 있게 감소한 것을 확인하였다(도 25a ~ 25c).
실시예 13: WLS 단일클론항체의 β-카테닌 발현 변화 확인
유방암 세포주인 MCF7, 대장암 세포주 WiDr, 피부암 세포주 A431에 실시예 2에서 제작한 WLS#4 단일클론항체를 처리하였으며, 72 시간 후 세포주에서의 β-카테닌의 발현 정도의 변화를 실시간 PCR을 통해 확인하였다. 그 결과, 유방암 세포주, 대장암 세포주 및 피부암 세포주 모두에서 WLS#4 단일클론항체를 처리함에 따라 β-카테닌의 발현이 감소하는 것을 확인하였다(도 26 ~ 28).
실시예 14: WLS 단일클론항체의 β- 카테닌 발현 변화 확인
유방암 세포주인 MCF7, 대장암 세포주 WiDr, 신장 세포주 293T에 Wnt3a-pcDNA3.1 플라스미드를 형질 주입(transfection)시킨 뒤, 24시간 이후에 실시예 2에서 제작한 WLS#4 단일클론항체를 48시간 동안 처리하였으며, 처리 후 각 세포주에서의 β-카테닌의 발현 정도의 변화를 실시간 PCR을 통해 확인하였다.
유방암 세포주에서의 β-카테닌의 발현은 여러 문헌에서 보고된 바 있다(Carcinogenesis. 2000 Jul;21(7):1453-6). 상기 MCF7 세포에서도 β-카테닌의 상시 발현량이 높게 관찰되었으나, WLS#4 단일클론항체를 처리함에 따라 β-카테닌의 발현이 감소하는 것을 확인하였다(도 29).
대장암 세포주에서의 β-카테닌의 발현은 여러 문헌에서 보고된 바 있다(Nature Communications 4, Article number: 2610). 상기 WiDr 세포에서도 β-카테닌의 상시 발현량이 높게 관찰되었고, Wnt 단백질의 지속적인 자극에 의해 발현량이 더욱 증가하는 것을 확인할 수 있었으나, WLS#4 단일클론항체를 처리함에 따라 β-카테닌의 발현이 감소하는 것을 확인하였다(도 30).
신장 조직에서 Wnt 신호전달계의 이상은 신장암을 비롯한 다양한 질환의 원인이 된다는 보고가 있다(Organogenesis. 2008 Apr-Jun; 4(2): 55-59). 이를 확인하기 위하여, 상기와 같이 293T 세포에 β-카테닌의 상시 발현량이 높게 관찰되었고, Wnt 단백질의 지속적인 자극에 의해 발현량이 더욱 증가하는 것을 확인할 수 있었으나, WLS#4 단일클론항체를 처리함에 따라 β-카테닌의 발현이 감소하는 것을 확인하였다(도 31).
실시예 15: WLS 단일클론항체의 에피토프 맵핑 (mapping)
상기 실시예 2에서 제작한 WLS#4 단일클론항체에 대한 대상 펩타이드(펩타이드 4번)에 대하여 에피토프 맵핑을 수행하였다. 펩타이드 4번의 아미노산 서열을 하기 표 3과 같이 3 개의 아미노산 조각(재조합 펩타이드 4-1 내지 4-3번)으로 나눈 뒤 SNCA-6XHis 표적과 결합하여 재조합 펩타이드를 제작하였다. 웨스턴 블럿을 이용하여 각각의 재조합 펩타이드와 WLS#4 단일클론항체를 반응하여 결합하는 펩타이드를 선별하였다. 그 결과, 재조합 펩타이드 4-3번이 WLS#4 단일클론항체와 결합하는 것을 확인하였다
아미노산 서열 펩타이드 4번의 매핑 결과
TFTSPK 재조합 펩타이드 4-1번
TPEHEG 재조합 펩타이드 4-2번
RYYECDV 재조합 펩타이드 4-3번
서열번호 1: AEWTEMAHERVPRKLKCTFTSPKTPEHEGRYYECDV
서열번호 2: AEWTEMAHERVPRKLKCTFT
서열번호 3: TFTSPKTPEHEGRYYECDV
서열번호 4: TFTSPK
서열번호 5: TPEHEG
서열번호 6: RYYECDV
<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> An antibody that recognizes a specific motif of WLS protein and a pharmaceutical composition comprising the same <130> PCB154219PCT <150> KR 10-2014-0111398 <151> 2014-08-26 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 36 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 1 Ala Glu Trp Thr Glu Met Ala His Glu Arg Val Pro Arg Lys Leu Lys 1 5 10 15 Cys Thr Phe Thr Ser Pro Lys Thr Pro Glu His Glu Gly Arg Tyr Tyr 20 25 30 Glu Cys Asp Val 35 <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 2 Ala Glu Trp Thr Glu Met Ala His Glu Arg Val Pro Arg Lys Leu Lys 1 5 10 15 Cys Thr Phe Thr 20 <210> 3 <211> 19 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 3 Thr Phe Thr Ser Pro Lys Thr Pro Glu His Glu Gly Arg Tyr Tyr Glu 1 5 10 15 Cys Asp Val <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 4 Thr Phe Thr Ser Pro Lys 1 5 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 5 Thr Pro Glu His Glu Gly 1 5 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 6 Arg Tyr Tyr Glu Cys Asp Val 1 5

Claims (36)

  1. 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 암은 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 유방암, 전립선암, 카르시노이드, 방광암, 위암, 췌장암, 간암, 직장결장암, 대장암, 신장암, 두부암, 골암, 목 편평상피 세포 암종, 식도암, 난소암, 자궁경부암, 자궁내막암, 중피종, 흑색종, 육종, 골육종, 지방육종, 갑상선암, 유건종, 급성 골수성 백혈병 (AML), 및 만성 골수성 백혈병 (CML)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  8. 삭제
  9. 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 및 마이크로 RNA로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 혈관신생 억제용 약제학적 조성물.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 및 마이크로 RNA로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 혈관신생 억제용 약제학적 조성물.
  17. 삭제
  18. 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 암 전이 억제용 약제학적 조성물.
  19. 삭제
  20. 제 18항에 있어서,
    상기 암은 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 유방암, 전립선암, 카르시노이드, 방광암, 위암, 췌장암, 간암, 직장결장암, 대장암, 신장암, 두부암, 골암, 목 편평상피 세포 암종, 식도암, 난소암, 자궁경부암, 자궁내막암, 중피종, 흑색종, 육종, 골육종, 지방육종, 갑상선암, 유건종, 급성 골수성 백혈병 (AML), 및 만성 골수성 백혈병 (CML)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 암 전이 억제용 약제학적 조성물.
  21. 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 및 마이크로 RNA로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 암 전이 억제용 약제학적 조성물.
  22. 삭제
  23. 제 21항에 있어서,
    상기 암은 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 유방암, 전립선암, 카르시노이드, 방광암, 위암, 췌장암, 간암, 직장결장암, 대장암, 신장암, 두부암, 골암, 목 편평상피 세포 암종, 식도암, 난소암, 자궁경부암, 자궁내막암, 중피종, 흑색종, 육종, 골육종, 지방육종, 갑상선암, 유건종, 급성 골수성 백혈병 (AML), 및 만성 골수성 백혈병 (CML)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 암 전이 억제용 약제학적 조성물.
  24. 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 암 또는 암 전이 진단용 조성물.
  25. 삭제
  26. 제 24항에 있어서,
    상기 암은 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 유방암, 전립선암, 카르시노이드, 방광암, 위암, 췌장암, 간암, 직장결장암, 대장암, 신장암, 두부암, 골암, 목 편평상피 세포 암종, 식도암, 난소암, 자궁경부암, 자궁내막암, 중피종, 흑색종, 육종, 골육종, 지방육종, 갑상선암, 유건종, 급성 골수성 백혈병 (AML), 및 만성 골수성 백혈병 (CML)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 암 또는 암 전이 진단용 조성물.
  27. 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함하는 암 또는 암 전이 진단용 조성물.
  28. 삭제
  29. 제 27항에 있어서,
    상기 암은 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 유방암, 전립선암, 카르시노이드, 방광암, 위암, 췌장암, 간암, 직장결장암, 대장암, 신장암, 두부암, 골암, 목 편평상피 세포 암종, 식도암, 난소암, 자궁경부암, 자궁내막암, 중피종, 흑색종, 육종, 골육종, 지방육종, 갑상선암, 유건종, 급성 골수성 백혈병 (AML), 및 만성 골수성 백혈병 (CML)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 암 또는 암 전이 진단용 조성물.
  30. 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 단백질에 특이적인 항체로 피검체에서 분리된 시료의 상기 단백질의 발현 수준을 측정하여 암 또는 암 전이 여부에 관한 정보를 제공하는 방법.
  31. 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브로 피검체에서 분리된 시료의 상기 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하여 암 또는 암 전이 여부에 관한 정보를 제공하는 방법.
  32. 생체 외(ex-vivo)에서, 암 조직에 암 치료용 후보 물질과 서열번호 2로 표시되는 단백질에 특이적인 항체를 병용 처리 시, 상기 항체를 단일 처리했을 경우보다 상기 단백질의 발현이 저해되는 경우에 후보물질을 암 병용 치료제로 결정하는 암 치료제의 스크리닝 방법.
  33. 생체 외(ex-vivo)에서, 암 조직에 암 치료용 후보 물질과 서열번호 2로 표시되는 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 및 마이크로 RNA로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나를 병용 처리 시, 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 및 마이크로 RNA로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나를 단일 처리했을 경우보다 상기 단백질의 발현이 저해되는 경우에 후보물질을 암 병용 치료제로 결정하는 암 치료제의 스크리닝 방법.
  34. 삭제
  35. 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 단백질에 특이적인 암의 예방 또는 치료용 항체.
  36. 삭제
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