TWI734814B

TWI734814B - Tifa拮抗劑及其治療疾病之用途

Info

Publication number: TWI734814B
Application number: TW106125168A
Authority: TW
Inventors: 蔡明道; 魏同佑; 吳沛宇
Original assignee: 中央研究院
Priority date: 2017-07-26
Filing date: 2017-07-26
Publication date: 2021-08-01
Also published as: TW201910348A

Abstract

本發明係有關具有FHA結構域之TRAF交互作用蛋白(TIFA)拮抗劑用於治療疾病之用途。具體而言，本發明係有關來自TIFA之分離的胜肽片段，其作為TIFA的顯性負抑制劑且有效治療癌症或發炎性疾病。本發明亦有關基於有需求之個體的TIFA表現量預測癌症預後之方法。本發明進一步有關經由TIFA靜默以治療疾病之方法。

Description

TIFA拮抗劑及其治療疾病之用途

癌症是全球的死亡主因之一。化療與分子標靶治療抗性為目前癌症研究與治療面臨的主要問題。舉例而言，急性骨髓白血病(AML)為群簇性血液惡性腫瘤(clonal hematologic malignancy)，其臨床特徵、發病機制、及治療結果具有極大變異性。此惡性疾病係由造血前驅細胞異常分化引起，使其喪失對增生調節因子的反應能力。AML病患的標準治療方法為初步以化療誘發，隨後進行緩解後治療，並配合額外化療週期或同種異體幹細胞移植以預防復發(1)。儘管取得重大進展，但目前AML治療僅提供有限的存活效益，而非提供完全令人滿意的反應，大概是由於化療抗藥性與疾病復發(1,2)。欲減少復發率及提高治療功效，迫切需要尋找新穎標靶(3,4)。

核因子-κB (NF-κB)控制各態樣之免疫反應，且優先調節細胞存活、增生、及分化(5)。最近的證據將越來越多的惡性腫瘤歸因於NF-κB異常活化，其與其他傳訊分子及途徑交叉作用(6)，因此視為幾種癌症包括白血病預後不良的危險因子(7)。一致認為，持續活化性NF-κB可保護腫瘤細胞免於凋亡刺激，並促進其對化學療法與電離輻射的抗性(8)，推測是通過轉錄活化抗凋亡/促生存因子Bcl-2與Bcl-X_L (9)。據此觀點，NF-κB在白血病生成過程中的角色亦應用於AML (10)，且NF-κB之抑制於此造血惡性腫瘤再次達到化學敏感性，這可能是由於促生存反應減弱及促凋亡信號活化所致(11)。彼等觀察集中指出NF-κB傳訊軸作為有希望的治療標靶(12)。

奧洛拉(Aurora)家族絲胺酸/蘇胺酸激酶於有絲分裂期間通過調節染色體排列、分離、及胞質分裂而促進腫瘤增生(13)，並視為抗癌標靶(14)。已有報導，AML病患的骨髓(BM)單核細胞之奧洛拉A係向上調節(15)，且顯示與不利的細胞遺傳學風險及較高白血球(WBC)計數相關聯(16)。此外，據顯示，奧洛拉A促進癌細胞於活體外與於活體內的化學抗性，其係通過活化NF-κB傳訊途徑減少化學療法誘發的細胞凋亡(17)。在支持下，報告了以奧洛拉A抑制劑VX680 進行治療(18)，該藥物對慢性骨髓性白血病(CML)顯示臨床效用(19)，提高Bax/Bcl-2之比率，其暗示促進細胞凋亡。

TIFA為TRAF-交互作用蛋白，其係NF-κB傳訊途徑之相對新穎的參與者。發明人先前研究發現，TIFA過度表現能以TNF-α-依賴性方式促進NF-κB活性，且TIFA靜默可減弱此TNF-α-刺激之NF-κB傳訊(20)。機制上而言，此信號軸起始於TIFA上蘇胺酸9 (pThr9)的TNF-α-依賴性磷酸化作用，其與TIFA的叉頭結合(forkhead-associated)(FHA)結構域交互作用，以促進TIFA二聚體的寡聚合作用(20,21)。TIFA寡聚合作用隨後支持TRAF家族組分的高序架構（high-ordered architecture），該家族如TNF受體相關聯因子2 (TRAF2)或TRAF6，以及調控TRAF6的泛蛋白化(ubiquitination)，以活化IκB激酶(IκK)複合體，藉此，IκB隨後磷酸化，且經歷泛蛋白化依賴性裂解，容許NF-κB的核轉位(nuclear translocation)以轉活化下游因子(22)。除了TNF-α刺激以外，據顯示，此種TIFA磷酸化作用依賴性寡聚合作用亦利用革蘭氏陰性菌衍生之單醣庚糖-1,7-雙磷酸酯(HBP)驅動，以活化先天免疫(23)，且該TIFA介導先天免疫反應，其係於內皮剪切應力(endothelial sheer stress)時經由組裝NLRP3發炎體(inflammasome)為之(24)，顯示TIFA在調控先天免疫反應與發炎反應的重要角色。

FHA結構域由約80-120個胺基酸組成，且習知可特異性辨識磷酸化蘇胺酸(pThr)以發揮傳訊功能。在不同的含FHA蛋白中的序列同源性相當低，然而，FHA結構域的整體結構性架構則相當保留，其中二個b股型b褶板形成β三明治結構。b股藉由環（loops）相連接，儘管長度差異很大，卻職司辨識特異性pThr配體。FHA-pThr結合作用習知可調節多樣生物功能，範圍由DNA損傷修復、細胞週期檢查點，乃至訊息傳遞。FHA結構域的特異性、生物功能、結構、及機制摘錄於近來的回顧文獻中(25)。

在本發明中，意外發現，於此提供之TIFA胜肽片段可作為TIFA顯性負抑制劑，以阻斷或減弱細胞介素刺激性NF-κB活化作用。具體而言，TIFA胜肽片段含有二聚合核心區段，其連接N端的Thr9區段或C端的TRAF6/TRAF 2交互作用區段，可有效治療癌症或發炎性疾病，其係經由靶向TIFA而阻斷或減弱細胞介素刺激性NF-κB活化作用。特定而言，發現到，TIFA胜肽片段之表現，可拮抗發炎性細胞介素分泌所刺激之癌細胞生長及增進化學毒性/降低化學抗性，達到促進的治療功效。本發明亦提供一種經由TIFA靜默的疾病/病況之治療，以及一種基於有需求之個體的TIFA表現量以預測癌症預後之方法。

因此，在一方面，本發明提供TIFA抑制劑，其係一分離之TIFA胜肽片段，包含二聚合核心胜肽區段，其N端結合Thr9胜肽區段或C端結合TRAF6/TRAF2交互作用胜肽區段，其中 (i) Thr9胜肽區段包含一N端磷酸化作用/寡聚合作用模體MX₁ X₂ FEDX₃ DTX₄ EX₅ X₆ T，其序列如SEQ ID NO: 13所示，其中X₁ 為絲胺酸(S)或蘇胺酸(T)、X₂ 為絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)、天門冬醯胺酸(N)、X₃ 為丙胺酸(A)或纈胺酸(V)、X₄ 為麩胺酸(E)或麩胺醯胺酸(Q)、X₅ 為蘇胺酸(T)或甲硫胺酸(M)，且X₆ 為纈胺酸(V)或白胺酸(L)； (ii) 二聚合核心胜肽區段包含六個b鏈，其包括 (a) 一b3鏈，其具有b3模體VKFG； (b) 一b4鏈，其具有b4模體YX₁ F，其中X₁ 為蘇胺酸(T)或異白胺酸(I)； (c) 一b5鏈，其具有b5模體QFX₁ LX₂ X₃ F，其中X₁ 為絲胺酸(S)、纈胺酸(V)、或丙胺酸(A)、X₂ 為麩胺醯胺酸(Q)或組胺酸(H)，且X₃ 為白胺酸(L)、脯胺酸(P)、或纈胺酸(V)； (d) 一b6鏈，其具有b6模體SFEIKN； (e) 一b7鏈，其具有b7模體LIV；以及 (f) 一b8鏈，其具有b8模體X₁ X₂ L，其中X₁ 為精胺酸(R)、麩胺醯胺酸(Q)、或離胺酸(K)，且X₂ 為麩胺酸(E)或蘇胺酸(T)；其中b3至b8鏈之每一者係利用複數個內部環序列從N端至C端依序連接至下一者；以及 (iii) TRAF6/TRAF2交互作用胜肽區段包含四個b鏈，其包括 (a) 一b9鏈，其具有b9模體LX₁ KX₂ D，其中X₁ 為天門冬醯胺酸(N)或組胺酸(H)，且X₂ 為甲硫胺酸(M)、白胺酸(L)、纈胺酸(V)、或異白胺酸(I)； (b) 一b10鏈，其具有b10模體X₁ CX₂ X₃ RF，其中X₁ 為精胺酸(R)或離胺酸(K)、X₂ 為甲硫胺酸(M)或白胺酸(L)，且X₃ 為纈胺酸(V)、白胺酸(L)、或異白胺酸(I)； (c) 一b11鏈，其具有b11模體YQX₁ LX₂ X₃ X₄ E ，其中X₁ 為苯丙胺酸(F)或異白胺酸(I)、X₂ 為甲硫胺酸(M)、白胺酸(L)、纈胺酸(V)、或異白胺酸(I)、X₃ 為麩胺酸(E)或麩胺醯胺酸(Q)，且X₄ 為離胺酸(K)或精胺酸(R)；以及 (d) 一b12鏈，其具有b12模體X₁ FX₂ X₃ X₄ FX₅ X₆ ，其中X₁ 為苯丙胺酸(F)或絲胺酸(S)、X₂ 為麩胺酸(E)或麩胺醯胺酸(Q)、X₃ 為蘇胺酸(T)或異白胺酸(I)、X₄ 為麩胺醯胺酸(Q)、組胺酸(H)、或麩胺酸(E)、X₅ 為異白胺酸(I)、纈胺酸(V)、絲胺酸(S)、或苯丙胺酸(F)，且X₇ 為白胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、或苯丙胺酸(F)；其中b9至b12鏈之每一者係利用複數個內部環序列從N端至C端依序連接至下一者；以及一C端環序列，連接至b12鏈C端；其中分離之TIFA胜肽片段不含Thr9胜肽區段與TRAF6/TRAF2交互作用胜肽區段兩者。

在一具體實施例中，N端Thr9-磷酸化作用模體係位於相對應於SEQ ID NO: 1的位置1-14。

在一具體實施例中，b3模體係位於相對應於SEQ ID NO: 1的位置47-50。

在一具體實施例中，b4模體係位於相對應於SEQ ID NO: 1的位置58-60。

在一具體實施例中，b5模體係位於相對應於SEQ ID NO: 1的位置69-75。

在一具體實施例中，b6模體係位於相對應於SEQ ID NO: 1的位置84-89。

在一具體實施例中，b7模體係位於相對應於SEQ ID NO: 1的位置96-98。

在一具體實施例中，b8模體係位於相對應於SEQ ID NO: 1的位置101-103。

在一具體實施例中，b9模體係位於相對應於SEQ ID NO: 1的位置106-110。

在一具體實施例中，b10模體係位於相對應於SEQ ID NO: 1的位置114-119。

在一具體實施例中，b11模體係位於相對應於SEQ ID NO: 1的位置122-129。

在一具體實施例中，b12模體係位於相對應於SEQ ID NO: 1的位置136-143。

在一些具體實施例中，Thr9胜肽區段更包含二個b鏈，其包括 (a) 一b1鏈，其具有b1模體X₁ LX₂ X₃ T X₄ Y，其中X₁ 為半胱胺酸(C)或絲胺酸(S)、X₂ 為麩胺醯胺酸(Q)或組胺酸(H)、X₃ 為甲硫胺酸(M)、異白胺酸(I)、白胺酸(L)或纈胺酸(V)，且X₄ 為纈胺酸(V)、異白胺酸(I)或白胺酸(L)；以及 (b) 一b2鏈，其具有b2模體位於位置X₁ X₂ X₃ P，其中X₁ 為麩胺酸(E)或天門冬胺酸(D)、X₂ 為離胺酸(K)或蘇胺酸(T)，且X₃ 為白胺酸(L)或苯丙胺酸(F)，其中b1鏈係利用一內部環序列從N端至C端依序連接至b2鏈。

在一具體實施例中，b1模體係位於相對應於SEQ ID NO: 1的位置15-21。

在一具體實施例中，b2模體係位於相對應於SEQ ID NO: 1的位置39-42。

在一些具體實施例中，TRAF6/TRAF2交互作用胜肽區段之C端環序列係位於相對應於SEQ ID NO: 1的位置144-184。

在一些具體實施例中，Thr9胜肽區段包含一胺基酸序列，係相對應於SEQ ID NO: 1之位置1-45，或一胺基酸序列，係具備與該序列至少70%相同度。在一些實例中，Thr9胜肽區段包含選自於由SEQ ID NOs: 23-34組成之群組的一胺基酸序列。

在一些具體實施例中，二聚合核心胜肽區段包含一胺基酸序列，係相對應於SEQ ID NO: 1之位置46-103，或一胺基酸序列，係具備與該序列至少70%相同度。在一些實例中，二聚合核心胜肽區段包含選自於由SEQ ID NOs: 35-46組成之群組的一胺基酸序列。

在一些具體實施例中，TRAF6/TRAF2交互作用胜肽區段包含一胺基酸序列，係相對應於SEQ ID NO: 1之位置104-184，或一胺基酸序列，係具備與該序列至少70%相同度。在一些實例中，TRAF6/TRAF2交互作用胜肽區段包含選自於由SEQ ID NOs: 47-58組成之群組的一胺基酸序列。

在一些具體實施例中，TRAF6/TRAF2交互作用胜肽區段之C端環序列包含一胺基酸序列，係相對應於SEQ ID NO: 1之位置144-184，或一胺基酸序列，係具備與該序列至少70%相同度。在一些實例中，TRAF6/TRAF2交互作用胜肽區段之C端環序列包含選自於由SEQ ID NOs: 59-70組成之群組的一胺基酸序列。

在一具體實施例中，本發明之TIFA胜肽片段為F1-F2胜肽片段，包含Thr9胜肽區段與二聚合核心胜肽區段，其中Thr9胜肽區段C端係聯結至二聚合核心胜肽區段N端，且缺少TRAF 6交互作用胜肽區段。在一些實例中，F1-F2胜肽片段包含選自於由SEQ ID NOs: 71-82組成之群組的一胺基酸序列。

在一具體實施例中，本發明之TIFA胜肽片段為F2-F3胜肽片段，包含二聚合核心胜肽區段與TRAF 6交互作用胜肽區段，其中二聚合核心胜肽區段C端係聯結至TRAF 6交互作用胜肽區段N端，且缺少Thr9胜肽區段。在一些實例中，F2-F3胜肽片段包含選自於由SEQ ID NOs: 83-94組成之群組的一胺基酸序列。

在另一方面，本發明提供一重組型核酸，其包含一核苷酸序列，係編碼本文所述胜肽之任一者。此一核酸可為一載體(vector)，包含本文所述之編碼序列。在一些實例中，載體為病毒載體。

可調配胜肽或核酸之任一者，以形成組合物，例如，醫藥組合物，其進一步包含生理上可接受載體(carrier)。

本文亦提供一種用於治療TIFA活化相關聯之疾病或病況的方法，包含投予個體一有效量之胜肽之任一者或編碼如本文所述核酸之任一者，或包含彼等之組合物。TIFA活化相關聯之疾病或病況可為TIFA活化相關聯之癌症或發炎性疾病，或者癌症或發炎性疾病相關聯之細胞介素刺激性NF-κB活化作用。在一些具體實施例中，個體患有癌症，且胜肽片段、編碼核酸、及含有胜肽或編碼核酸之組合物係結合抗癌治療投予。具體而言，所投予胜肽片段、編碼核酸、及組合物之量係有效增進抗癌治療之細胞毒性。在一些具體實施例中，抗癌治療涉及投予抗癌劑或放射線照射。抗癌劑包括但不侷限於，化學治療劑及分子標靶藥物。抗癌劑之實例為依托泊苷(etoposide)、伊達比星(idarubicin)、阿糖胞苷(cytarabine)、索拉非尼(sorafenib)、瑞格菲尼(regorafenib)、博萊黴素(bleomycin)、硼替佐米(bortezomib)、硫酸布他卡因(busulfan)、及甲磺酸酯(obatoclax)。

本發明亦發現，TIFA蛋白表現量與白血病之預後相關。具體而言，本發明提供一種預測白血病預後之方法，包含從白血病病患收集血液樣本、以FHA結構域(TIFA)測定血液樣本中TRAF-交互作用蛋白表現量、及根據血液樣本中TIFA表現量決定病患之白血病預後，其中血液樣本中TIFA量升高代表預後不良。

進一步提供一種用於抑制個體細胞介素刺激性NF-κB活化作用之方法，包含投予個體一有效量之TIFA拮抗劑。TIFA拮抗劑之實例包括靶向TIFA之干擾核酸或TIFA顯性負抑制劑，如本文所述之TIFA胜肽片段。在一些實例中，欲治療之個體可為具備細胞介素刺激性NF-κB活化作用相關聯之疾病或病況的人類病患。此類疾病或病況可為由於細胞介素刺激性NF-κB活化作用之癌症或發炎性疾病。

特定而言，本發明欲治療之癌症係相關於慢性發炎或發炎性疾病。本發明欲治療癌症之具體實例包括但不侷限於，血液癌症(如白血病或淋巴瘤)、肝癌、胃腸癌症(如胃癌或直腸癌)、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、卵巢癌、及乳腺癌。在一些具體實施例中，本文所述之TIFA拮抗劑可結合抗癌劑投予，其相較於抗癌劑單獨治療或結合抗發炎劑治療，如依那西普(entanercept)、抗存活標靶藥物，如ABT-263、及NF-kB抗體藥劑，如硼替佐米(bortezomib)，提供治療癌症時的協同效應。

在一些具體實施例中，發炎性疾病為肝炎、動脈粥樣硬化、肺動脈高壓、心肌病、類風濕性關節炎、發炎性腸病、及法布里病(Fabry disease)。

於本發明範疇內亦揭示一種用於治療細胞介素刺激性NF-κB活化作用相關疾病之醫藥組合物，該組合物包含本文所述胜肽或其編碼核酸之任一者，以及醫藥可接受載體。本發明進一步描述本文所述胜肽或其編碼核酸之用途，以製造藥劑用於本文所述之方法，如治療細胞介素刺激性NF-κB活化作用相關之疾病。

下列描述闡明本發明之一或多個具體實施例細節。本發明之其他特徵或優點將因以下幾個具體實施例之詳細描述及所附申請專利範圍而顯見。

除非另有定義，本文使用的所有技術及科學術語具有與本領域技術人員通常理解的相同含義。

本文中使用的單數形式「一」、「一者」、及「該」包括複數參考物，除非本文另有明確規定。因此，例如，提及「一組件」應包括本領域技術人員習知的複數個此類部件及其等同物。

「包含」或「包含有」等詞通常用於包括/涵蓋意指允許存在一或多個特徵、成分、或組分的意義。「包含」或「包含有」等詞涵蓋「組成」或「由～組成」等詞。

本文中使用的「多胜肽」乙詞意指由胜肽鍵連接的胺基酸殘基組成的聚合物。「胜肽」乙詞意指由連接的胺基酸所組成較短的多胜肽，例如，200個胺基酸以下、175個胺基酸以下、150個胺基酸以下，如140個以下、130個以下、120個以下、110個以下、100個以下、90個以下、80個以下、70個以下、60個以下、50個以下、或40個以下的胺基酸長度。

本文中使用的「約」或「近似」等詞意指本領域普通技術人員理解的可接受偏差程度，其可在一定程度上根據文中的使用而變化。一般而言，「約」或「近似」可指引用值附近±10%範圍的數值。

本文中使用的「相對應於」意指殘基在蛋白質或胜肽中的列舉位置，或殘基類似、同源、或等同於蛋白質或胜肽中的列舉位置。

本文中使用的「實質上相同」乙詞意指二序列具有超過70%、較佳為75%、更佳為80%、甚而更佳為85%、又甚而更佳為90%、及最佳為95%或100%同源性。

1. TIFA 蛋白

本文中使用的「TRAF-交互作用叉頭結合蛋白質A(FHA)」、「具有FHA結構域之TRAF-交互作用蛋白」、「TIFA」、「TIFA蛋白」、及「TIFA多胜肽」等詞可互換使用。本文所述的TIFA蛋白可包括如SQE ID NO: 1 (人類TIFA)所示之胺基酸序列，且亦可包括彼等所含胺基酸序列(i)實質上等同於構成本文所述之任何TIFA蛋白的胺基酸序列；以及(ii)由一核酸序列所編碼，該核酸序列能在至少中度嚴格條件下雜交至編碼本文所示之任何TIFA蛋白的任何核酸序列，或能在至少中度嚴格條件下雜交至編碼本文所示之任何TIFA蛋白的任何核酸序列，但使用同義密碼子(如密碼子不具有相同核苷酸序列但編碼相同胺基酸)。本文所述之TIFA蛋白包括人類TIFA及其源自脊椎動物的同源物（homologues），且具體而言彼等源自哺乳類動物的同源物。特定而言，本文所述之TIFA蛋白包括源自人類的TIFA胺基酸序列(SEQ ID NO: 1)，源自其他哺乳類動物的TIFA胺基酸序列(SEQ ID NOs: 2至12)，其具有至少70%、至少75%、或至少80%的SEQ ID NO: 1相同度(參見圖7)。本文所述之TIFA蛋白進一步包括由編碼TIFA之天然多核苷酸序列的cDNA拷貝子編碼之任何以重組方式(基因工程)衍生的TIFA多胜肽。

在結構上，於此揭示本文所用的TIFA蛋白，由N端至C端，包括(i)一F1結構域，亦即一Thr9胜肽區段，包含N端磷酸化作用/寡聚合作用模體，及視需要的b1-b2鏈；(ii)一F2結構域，亦即一二聚合核心胜肽區段，包含六個b鏈，其包括b3-b8鏈；以及(iii)一F3結構域，亦即一TRAF6/TRAF2交互作用胜肽片段，包含四個b鏈，其包括b9-b12鏈及一C端環序列。表1描述F1、F2、及F3結構域及其結構上特徵。

b鏈之每一者可利用環序列以N端至C端順序連接至下一者，該環序列長度上可以有變化且具有相對低程度的序列同源性。特定而言，前述TIFA蛋白模體之每一者大致位於以下位置：N端Thr9-磷酸化作用模體係位於相對應於SEQ ID NO: 1位置1-14之處；b1模體係位於相對應於SEQ ID NO: 1位置15-21之處；b2模體係位於相對應於SEQ ID NO: 1位置39-42之處；b3模體係位於相對應於SEQ ID NO: 1位置47-50之處；b4模體係位於相對應於SEQ ID NO: 1位置58-60之處；b5模體係位於相對應於SEQ ID NO: 1位置69-75之處；b6模體係位於相對應於SEQ ID NO: 1位置84-89之處；b7模體係位於相對應於SEQ ID NO: 1位置96-98之處；b8模體係位於相對應於SEQ ID NO: 1位置101-103之處；b9模體係位於相對應於SEQ ID NO: 1位置106-110之處；b10模體係位於相對應於SEQ ID NO: 1位置114-119之處；b11模體係位於相對應於SEQ ID NO: 1位置122-129之處；以及/或者b12模體係位於相對應於SEQ ID NO: 1位置136-143之處。在一些具體實施例中，TRAF6/TRAF2交互作用胜肽區段之C端環序列係位於相對應於SEQ ID NO: 1位置144-184之處。此外，F1、F2、及F3結構域之每一者可大致位於以下位置：F1結構域相對應於SEQ ID NO: 1位置1-45；F2結構域相對應於SEQ ID NO: 1位置46-103；以及/或者F3結構域相對應於SEQ ID NO: 1位置104-184。

功能上，TIFA蛋白可在細胞介素、細菌衍生糖(23,26)、或發炎條件(24)(如TNF-α)刺激後經磷酸化作用活化，從而驅動TIFA寡聚合作用，其致使與TRAF6或TRAF2交互作用，包括NF-κB活化作用。特定而言，於此揭示，二聚合核心區段(F2結構域)可在二個TIFA單體之間形成內在二聚體。此外，Thr9胜肽區段(F1結構域)可利用激酶(如奧洛拉A激酶)在N端磷酸化作用/寡聚合作用模體(SEQ ID NO: 13)的Thr9殘基處進行磷酸化，且一旦發生磷酸化作用，F1結構域N端磷酸化作用/寡聚合作用模體的磷酸化Thr9殘基可由位於F2結構域的pThr-辨識模體(如位於SEQ ID NO: 1約位置51-89，參見圖7-8)辨識，因此驅動TIFA之寡聚合作用(例如，一TIFA二聚體，係經由F1結構域N端磷酸化作用/寡聚合作用模體與F2結構域pThr辨識模體間之分子間交互作用，而結合額外的一或多個TIFA二聚體)。由至少二個以上的TIFA二聚體形成的TIFA寡聚體，可隨後與腫瘤壞死因子受體相關因子6 (TRAF6)或TRAF2相互作用，其係經由TIFA寡聚體各個TIFA單體之TRAF6/TRAF2交互作用胜肽片段(F3結構域)進行，從而促進TRAF2/TRAF6寡聚合作用。可由本領域習知方法測定F1、F2、及F3結構域每一者之功能特徵。舉例而言，可利用體外激酶試驗(20)分析Thr9磷酸化作用，TIFA單體經由F2結構域之二聚體作用可利用非變性PAGE (native PAGE)測定(20,23,24)，以及TIFA寡聚體經由F3結構域與TRAF6或TRAF2之交互作用可利用免疫沈澱法確認。

在一些具體實施例中，Thr9胜肽區段(F1結構域)包含一胺基酸序列，係相對應於SEQ ID NO: 1位置1-45 (亦即，SEQ ID NO: 23)，或一胺基酸序列，係具備與該序列至少70%、80%、或90%相同度。在一些實例中，Thr9胜肽區段包含選自於由SEQ ID NOs: 23-34組成之群組的一胺基酸序列。

在一些具體實施例中，聚合核心胜肽區段包含一胺基酸序列相對應於SEQ ID NO: 1位置46-103 (亦即，SEQ ID NO: 35)，或一胺基酸序列具備與該序列至少70%、80%、或90%相同度。在一些實例中，二聚合核心胜肽區段包含選自於由SEQ ID NOs: 35-46組成之群組的一胺基酸序列。

在一些具體實施例中，TRAF6/TRAF2交互作用胜肽區段包含一胺基酸序列相對應於SEQ ID NO: 1位置104-184 (亦即，SEQ ID NO: 47)，或一胺基酸序列具備與該序列至少70%、80%、或90%相同度。在一些實例中，TRAF6/TRAF2交互作用胜肽區段包含選自於由SEQ ID NOs: 47-58組成之群組的一胺基酸序列。

在一些具體實施例中，TRAF6/TRAF2交互作用胜肽區段的C端環序列包含一胺基酸序列，係相對應於SEQ ID NO: 1位置144-184，或一胺基酸序列，係具備與該序列至少70%相同度。在一些實例中，TRAF6/TRAF2交互作用胜肽區段的C端環序列包含選自於由SEQ ID NOs: 59-70組成之群組的一胺基酸序列。

2. TIFA 胜肽片段及含有其之組合物

TIFA胜肽片段(或可互換稱為TIFA片段)係指衍生自TIFA之非天然存在的截斷片段，或其功能變體。此類胜肽不同於天然存在之全長TIFA蛋白，至少係因此類胜肽片段可作為全長活化型TIFA蛋白的顯性負胜肽，其與活化型TIFA蛋白競爭，從而減少活化型TIFA蛋白的作用。具體而言，TIFA胜肽片段對細胞介素誘發之NF-κB活化作用呈現抑制效用。因此，TIFA胜肽片段可視為用於抑制TIFA介導之傳訊途徑的TIFA拮抗劑，從而有利於治療與TIFA異常活化相關聯的疾病與病症。

依據本發明，TIFA胜肽片段作為全長活化型TIFA蛋白之顯性負胜肽，必須包括二聚合核心胜肽區段(F2結構域)，其可在N端連接Thr9胜肽區段(F1結構域)，或在C端連接TRAF6/TRAF2交互作用胜肽區段(F3結構域)。在一具體實施例中，本發明TIFA胜肽片段包括Thr9胜肽區段(F1結構域)與二聚合核心胜肽區段(F2結構域)，其中Thr9胜肽區段的C端聯結至二聚合核心胜肽區段的N端，且缺少TRAF6/TRAF2交互作用胜肽區段(F3結構域)。在一些實例中，本發明TIFA胜肽片段選自於由SEQ ID NOs: 71-82組成之群組。

在另一具體實施例中，本發明TIFA胜肽片段包括二聚合核心胜肽區段(F2結構域)與TRAF6/TRAF2交互作用胜肽區段(F3結構域)，其中二聚合核心胜肽區段的C端聯結至TRAF6/TRAF2交互作用胜肽區段的N端，其缺少Thr9胜肽區段(F1結構域)。在一些實例中，本發明TIFA胜肽片段係選自於由SEQ ID NO: 83-94組成之群組。

在額外具體實施例中，本文所述TIFA片段可為TIFA片段之變體，其具一或多個突變。可理解的是，多胜肽可具有限數量的改變或修飾，其可在多胜肽特定部分內進行且無關其活性或功能，並仍產生具有可接受程度之等同或類似之生物活性或功能的變體。具體而言，本發明TIFA片段呈現的活性，係降低TIFA活化作用及隨後的NF-κB活化作用。因此，可辨別本發明TIFA片段的活性所必需或非必需胺基酸位置，該活性係減少TIFA活化作用/NF-κB活化作用。欲進行TIFA活化作用分析，可利用例如體外激酶試驗、非變性PAGE、免疫沉澱法、或螢光素酶報導基因試驗。利用發炎性細胞介素或病理壓力刺激細胞會致使NF-κB活化作用，其可利用例如NF-κB報導基因系統經由螢光素酶量測定。若TIFA活化作用/NF-κB活化作用程度在過度表現一測試TIFA片段時下降，其係相較於未過度表現測試TIFA片段而言，則該測試TIFA片段可視為有效降低TIFA活化作用/NF-κB活化作用。在一些實例中，胺基酸殘基突變為保留性胺基酸取代，意指胺基酸殘基化學結構與另一胺基酸殘基類似，且對於多胜肽功能、活性、或其他生物作用等性質的影響較小或實質上無影響。可以本領域普通技術人員習知之改變多胜肽序列的方法製備變體，例如採用此類方法的參考文獻，如Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989。舉例而言，胺基酸的保留性取代包括以下各群組中進行的胺基酸取代：(i) A、G；(ii) S、T；(iii) Q、N；(iv) E、D；(v) M、I、L、V；(vi) F、Y、W；以及(vii) K、R、H。

本發明TIFA片段可利用化學合成產生，其係使用蛋白質化學之習知技術，例如固相合成或在均勻溶液中合成。

或者，本發明TIFA片段可以重組技術製備。在這方面，提供包含有編碼本發明TIFA片段的核苷酸序列的重組型核酸及包含有此重組型核酸的宿主細胞。宿主細胞可在合適條件下培養，以表現感興趣的多胜肽。多胜肽的表現可為組成形式，使得其不斷產生或可誘發，其需要刺激以啟動表現。在可誘發表現的情況下，當需要時可，例如，在培養基中加入誘發物質，例如，異丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)或甲醇，以啟動蛋白質產生。多胜肽可利用本領域習知之多個技術，例如，層析法，如FPLC或親和性管柱，從宿主細胞中回收與純化。

「多核苷酸」或「核酸」等詞可指由核苷酸單元組成的聚合物。多核苷酸包括天然存在的核酸，如去氧核糖核酸(「DNA」)與核糖核酸 (「RNA」)，以及核酸類似物，包括彼等具有非天然存在的核苷酸者。多核苷酸之合成可利用，例如，自動化DNA合成儀。「核酸」乙詞典型上意指大型多核苷酸。應理解到，當核苷酸序列以DNA序列(亦即，A、T、G、C)表示時，其亦包括RNA序列(亦即，A、U、G、C)，其中「U」代替「T」。「cDNA」乙詞意指一DNA互補或等同於一mRNA，不論單鏈或雙鏈形式。

「互補」乙詞意指二多核苷酸的拓撲相容性或作用表面相匹配。因此，二個分子可描述為互補，此外，接觸面特徵彼此互補。若第一多核苷酸的核苷酸序列與第二多核苷酸之多核苷酸結合配偶體的核苷酸序列相同，則第一多核苷酸與第二多核苷酸互補。因此，序列為5′-TATAC-3′之多核苷酸互補於序列為5′-GTATA-3′之多核苷酸。

「編碼」乙詞意指多核苷酸(例如，基因、cDNA、或mRNA)中特定核苷酸序列之固有性質，其可作為模板，以合成生物過程的其他聚合物與巨分子，係具經定義的核苷酸序列(亦即，rRNA、tRNA、及mRNA)或經定義的胺基酸序列及由此產生之生物性質。因此，若一基因產生的mRNA轉錄與轉譯在細胞或其他生物系統中產生蛋白質，則稱該基因編碼蛋白質。本領域技術人員可理解到，由於遺傳密碼的簡併(degeneracy)，許多不同多核苷酸與核酸可編碼相同多胜肽。亦應理解到，技術人員可使用常規技術，進行不影響由所述多核苷酸編碼之多胜肽序列的核苷酸取代，以反映任何欲表現多胜肽之特定宿主生物體的密碼子使用(codon usage)。因此，除非另有說明，「編碼胺基酸序列之核苷酸序列」包括彼此為簡併形式且編碼相同胺基酸序列的所有核苷酸序列。編碼蛋白質與RNA的核苷酸序列可包括內含子(intron)。

「重組型核酸」乙詞意指具有非天然連接在一起之序列的多核苷酸或核酸。重組型核酸可以載體（vector）形式存在。「載體」可含有給定之感興趣核苷酸序列與調節序列。載體可用於表現給定之核苷酸序列(表現載體)或維持給定之核苷酸序列用於複製、操控、或使其在不同位置之間(例如，不同生物體之間)轉移。為了上述目的，可將載體導入適當宿主細胞。「重組型細胞」意指宿主細胞導入重組型核酸。「轉形作用」意指併入新DNA後之細胞遺傳變化(亦即，細胞外源性DNA)。「轉染」意指細胞以外源性DNA轉移的過程。「轉導」可特別意指外源性DNA經由病毒載體導入細胞的過程。「轉形細胞」意指利用重組DNA技術，導入編碼一感興趣蛋白質之DNA分子的細胞。

載體可為各類型，包括質體、黏質體、F型黏質體(fosmids)、游離基因體(episomes)、人造染色體、噬菌體、病毒載體等。典型上，在載體中，給定之核苷酸序列係可操作地鍵接至調節序列，使得當將載體導入宿主細胞時，給定之核苷酸序列可於調節序列控制下表現於宿主細胞。調控序列可包含，例如但不侷限於，啟動子序列(例如，巨細胞病毒(CMV)啟動子、猿猴病毒40 (SV40)早期啟動子、T7啟動子、及酒精氧化酶基因(AOX1)啟動子)、起始密碼子、複製起點、增強子、操縱子序列、分泌信號序列(例如，α-交配因子信號)、及其他控制序列(例如，夏因-達爾加諾(Shine-Dalgarno)序列與終止序列)。較佳地，載體可進一步含有用於隨後篩選程序的標記序列(例如，抗生素抗性標記序列)。欲生產蛋白質，在載體中，給定的感興趣核苷酸序列可連接至上述調節序列以外之另一核苷酸序列，使得產生融合多胜肽且有利於隨後的純化程序。該融合多胜肽包括用於純化之標籤，其可結合至多胜肽末端，且較佳地尺寸小，其不影響多胜肽所需活性。特定而言，標籤為約30個胺基酸殘基以下，具體而言約20個胺基酸殘基以下，更具體而言約10個胺基酸殘基以下的長度；或者具有分子量約10 kDa以下，具體而言約5 kDa以下，更具體而言約2.5 kDa以下。此標籤之實例包括但不侷限於，六(6)至十四(14)個His-標籤或一(1)至二(2)個Myc-標籤。標籤可連接至多胜肽N端或C端。在一些具體實施例中，標籤係體外或體內可切割。體外或體內切割可以蛋白酶進行。

在一些具體實施例中，若本發明胜肽實質上不含涉及胜肽製備過程之細胞材料或化學前驅物或其他化學物質，則可稱作「分離的」或「純化的」。應理解到，「分離的」或「純化的」等詞不一定反映胜肽經「絕對地」分離或純化的程度，如藉由除去所有其他物質(例如，雜質或細胞組分)。在一些情況下，例如，分離或純化之胜肽包括一含有胜肽之製備物，其具有小於50%、40%、30%、20%、或10% (重量)之其他蛋白(如細胞蛋白)、具有小於50%、40%、30%、20%、或10% (體積)之培養基、或具有小於50%、40%、30%、20%、或10% (重量)之化學前驅物或其他參與合成程序之化學物質。「分離的」或「純化的」等詞亦可應用於本發明之核酸。

依據本發明，一有效量之活性成分(TIFA片段)可以生理上可接受載體（carrier）配製成適當形式的組合物，用於遞送與吸收。本發明組合物具體而言包含約0.1重量%至約100重量%之活性成分，其中重量百分比係基於整個組合物的重量計算。在一些具體實施例中，本發明組合物可為用於治療之醫藥組合物或藥劑。

本文中使用的「生理上可接受」意指載體相容於組合物之活性成分，且較佳地可穩定該活性成分，且對接受個體而言是安全的。該載體可為活性成分之稀釋劑、載具、賦形劑、或基質。適用賦形劑之一些實例包括乳糖、蔗糖、葡萄糖、山梨糖、甘露糖、澱粉、阿拉伯膠、磷酸鈣、藻酸鹽、黃蓍膠、明膠、矽酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、無菌水、糖漿、及甲基纖維素。組合物可額外包含潤滑劑，如滑石、硬脂酸鎂、及礦物油；潤濕劑；乳化劑與懸浮劑；防腐劑，如羥基苯甲酸甲酯與丙酯；甜味劑；以及調味劑。本發明組合物可在投予病患後提供活性成分快速、持續、或延遲釋放的效果。

依據本發明，組合物之形式可為片劑、丸劑、粉末、錠劑、包裝、錠劑、酏劑、懸浮液、洗劑、溶液、糖漿、軟與硬明膠膠囊、栓劑、滅菌注射液、及包裝粉末。

本發明組合物可經由任何生理上可接受途徑遞送，例如經口、非經口(如肌肉、靜脈、皮下、及腹膜）、經皮、栓劑、及鼻內方法。關於非經口投予，較佳地係以無菌水溶液形式使用，其可包含其他物質，如鹽或葡萄糖，足以使溶液與血液等張。水溶液可視需求適當緩衝(如採用pH值3至9)。無菌條件下適用非經口組合物之製備，可以本領域技術人員習知標準藥理學技術完成。

在一些具體實施例中，將攜帶編碼本發明胜肽之核酸的病毒載體投予有需求之個體。許多病毒載體係本領域習知，包括例如，反轉錄病毒、慢病毒、腺病毒、腺相關病毒、單純皰疹病毒(HSV)、巨細胞病毒(CMV)、牛痘、脊髓灰白質炎病毒載體。較佳地，以複製缺陷病毒作為病毒載體，使得重組型細胞株與重組型病毒載體的轉形作用不導致產生複製勝任病毒，例如，利用重組型細胞株病毒序列之同源重組導入病毒載體。本發明DNA亦可利用非病毒載體投予，例如，DNA或RNA微脂體複合物配方。此類複合物包含脂質混合物，其結合核酸(DNA或RNA)，提供疏水外層，其容許將遺傳物質遞送至細胞中。

3. 以 TIFA 胜肽片段作為 TIFA 拮抗劑用於治療 TIFA 相關聯之疾病的治療用途

TIFA利用例如發炎性細胞介素或脂多醣(LPS)等各類刺激參與NF-κB活化作用。出乎意料的是，本發明發現，本文所述之TIFA片段能抑制TIFA活化作用及所產生之NF-κB活化作用(TIFA活化作用/NF-κB活化作用)。因此，本文所述TIFA片段之任一者，其具有對TIFA活化作用及所產生NF-κB活化作用的抑制活性，可用於抑制有此類治療需求之個體的TIFA活化作用與所產生NF-κB活化作用，從而有利於治療與異常TIFA活化作用及/或NF-κB活化作用相關聯之疾病或病症。

依據本發明，TIFA胜肽片段必須包括二聚合核心胜肽區段 (F2結構域)，其可在N端連接Thr9胜肽區段(F1結構域)或在C端連接TRAF6/TRAF2交互作用胜肽區段(F3結構域)。在一具體實施例中，本發明TIFA胜肽片段包括F1/F2片段，其中Thr9胜肽區段(F1結構域)與二聚合核心胜肽區段(F2結構域)連接，由N端至C端，其缺少TRAF6/TRAF2交互作用胜肽區段(F3結構域)。在另一具體實施例中，本發明TIFA胜肽片段包括F2/F3片段，其中二聚合核心胜肽區段(F2結構域)與TRAF6/TRAF2交互作用胜肽區段(F3結構域)連接，由N端至C端，其缺少Thr9胜肽區段(F1結構域)。本發明首先證明，此TIFA胜肽片段可作為TIFA的顯性負抑制劑，其有效干擾內源性TIFA的自身結合，從而可減弱TIFA活化及所產生之NF-κB活化，具體而言細胞介素誘發之NF-κB活化作用，因此可治療與異常TIFA活化作用及/或NF-κB活化作用相關聯之疾病或病症。

欲實施本文所揭示方法，可以一有效量之組合物如本文所述醫藥組合物，包含TIFA片段或其編碼核酸，投予經適用途徑治療之有需求個體(例如，人類)。本文中使用的「有效量」乙詞意指在治療的個體或細胞中賦予所需生物學效應之活性成分量。有效量可依據各原因而變，例如投予途徑與頻率、接受該醫藥個體之體重與物種、及投予目的。基於本文揭示內容、建立之方法、及其自身經驗，本領域技術人員可決定各情況下之劑量。

欲利用本文所述方法治療之個體可為哺乳類動物，更佳地為人類。哺乳類動物包括但不侷限於，農場動物、運動動物、寵物、靈長類動物、馬、狗、貓、小鼠、及大鼠。需要治療的人類個體可為患有風險或疑似患有標的疾病/病症(如癌症或發炎性疾病)的人類病患。疑似患有此標的疾病/病症任一者之個體可能顯示該疾病/病症之一或多個症狀。患有疾病/病症風險之個體可為具有該疾病/病症之一或多個危險因子的個體。

異常TIFA活化與各種疾病與病症相關聯。在一些具體實施例中，TIFA活化相關聯之疾病或病況為發炎性疾病，係因TIFA活化作用，如細胞介素刺激性NF-κB活化作用。此類疾病或病症之實例包括但不侷限於，肝炎、動脈粥樣硬化、肺動脈高壓、心肌病、類風濕性關節炎、發炎性腸病、及法布里病。在其他具體實施例中，TIFA活化相關聯之疾病或病況為癌症，具體而言為與慢性發炎或發炎性病況相關聯之癌症。本發明欲治療之癌症之一實例為血液癌症，其係選自於由淋巴瘤(包括霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、兒童淋巴瘤、及淋巴細胞與皮膚淋巴瘤)、白血病(包括兒童白血病、毛細胞白血病、急性淋巴細胞性白血病、急性骨髓細胞性白血病、慢性淋巴細胞性白血病、慢性骨髓細胞性白血病、及肥大細胞白血病)、骨髓腫瘤、及肥大細胞腫瘤組成之群組。本發明欲治療之癌症之其他實例為與慢性發炎或發炎性病況相關聯之癌症，包括直腸癌、肺癌、胃腸癌、前列腺癌、胰腺癌、淋巴瘤、卵巢癌、及乳癌。

在一特定具體實施例中，個體或受試者可為患有白血病風險的哺乳類動物。

本文中所用的「治療」乙詞意指將包括一或多個活性劑之組合物施加或投予個體，其患有病症(如糖尿病、動脈粥樣硬化、及其他發炎性疾病)、病症之症狀或病況、或病症之進展或傾向，目的在於治癒、癒合、減輕、緩解、改變、補救、改善、改進、或影響病症、病症之症狀或病況、病症引起之失能、或病症之進展或傾向。因此，「治療」乙詞亦可包括，取決於欲治療個體的病況，預防病症，包括預防病症發作或與其相關的任何症狀，以及降低或減輕疾病嚴重性或任何其發病前之症狀。

本文中使用的「抗癌治療」乙詞可指將抗癌劑或放射線照射投予具有腫瘤或癌症之個體，例如，提供抑制腫瘤或癌症細胞生長或增生，或誘發毒殺的作用。本文中使用的「抗癌劑」乙詞可包括化學治療劑或分子標靶劑。「化學抗性（chemoresistant）」乙詞可指腫瘤或癌症細胞對化學治療中使用的化學治療劑呈現很少或無顯著可檢測的治療反應。一些化學治療劑誘發化學抗性，其可導致腫瘤細胞群的存活，隨後於治療後復發。本文中使用的「標準劑量」可指治療劑之有效劑量，其由醫藥界權威來源(包括食品與藥物管理局)推薦且常用於常規實踐。本文中使用的「減少劑量」可指相同治療劑之一劑量低於標準劑量但仍保留實質上相同治療效果。特定而言，依據本發明，化學治療劑之減少劑量為相同藥劑標準治療劑量的約90%以下、80%以下、70%以下、60%以下、或50%以下。

一些癌症病患可能對抗癌劑反應不良，且可能需要高劑量以達到所需治療效果。本發明令人驚訝地發現，抑制TIFA活化可增進抗癌劑之化學毒性/降低化學抗性，其導致促進治療功效。特定而言，當抑制癌細胞之TIFA活化時(如利用TIFA片段作為TIFA顯性負抑制劑)，相較於未抑制TIFA活化，抑制癌細胞增生所需之抗癌劑劑量降低；且抗癌劑與TIFA拮抗劑(如本文所用的TIFA片段)之組合，相較於單獨使用抗癌藥物之治療，提供以協同方式增進抗癌作用，如減少腫瘤體積。

本文中使用的「TIFA拮抗劑」乙詞意指可實質上降低、抑制、阻斷、及/或減輕TIFA活化之物質或藥劑，其包括但不限於，磷酸化作用與寡聚合作用，及隨後的NF-κB活化作用，具體而言係由發炎性細胞介素或病理壓力之刺激引起者。除了TIFA片段作為上述TIFA顯性負抑制劑之外，TIFA拮抗劑可包括針對TIFA基因之反義核酸分子或針對TIFA核酸之小型干擾RNA (siRNA)，其可用於本發明。

在一些具體實施例中，TIFA拮抗劑包含至少一能阻斷或減少功能性TIFA表現的反義核酸分子。TIFA之核苷酸序列係習知，且易於由公眾可獲得數據庫中取得。常規上可製備反義寡核苷酸分子，其將特異性結合標靶mRNA而不與其他多核苷酸交叉反應。靶向之示例性位點包括但不侷限於，起始密碼子、5'調節區、編碼序列、及3'非轉譯區。在一特定具體實施例中，靶向之示例性位點位於TIFA之編碼序列。在一些具體實施例中，寡核苷酸長度為約10至100個核苷酸、長度為約15至50個核苷酸、長度為約18至25個核苷酸等。寡核苷酸可包含骨架修飾，例如硫代磷酸酯鍵，及本領域習知之2'-0糖修飾。

4. TIFA 作為 AML 預後不良之標記

本發明亦基於發現TIFA可作為AML預後不良之標記。如以下實例所示，具有較高TIFA蛋白量的AML病患看來是比具有比較低TIFA量之AML病患具有更高的白血球細胞(WBC)及爆發計數(blast counts)。此外，AML病患中較高TIFA表現者係與較低反應率相關聯，且在追蹤後，較高TIFA表現之患者與彼等較低TIFA表現者相比，總存活期(OS)及無病存活期(DFS)顯著縮短。

因此，本發明提供一種依據TIFA蛋白量預測白血病預後的方法。具體而言，本發明方法包含測定取自白血病病患樣本之TIFA表現量，且依據樣本中TIFA表現量確定病患之白血病預後，其中樣本中TIFA量升高表示預後不良。

本文中使用的量升高係指與無癌症或發炎性疾病問題或參考量或對照量之個體的量相比，具有提高的量。舉例而言，量升高可為高於參考量或對照量達大於10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、或100%。參考量或對照量可指在正常個體或樣本類型(如未患病之組織或細胞)所測定之量。

本文中使用的經本文所述之任何方法分析的生物樣本可為取自欲診斷個體之任何類型樣本，較佳地血液樣本。典型上，血液樣本可為全血或其分液，如周邊單核細胞，或血漿，其係經肝素化或EDTA處理以避免血液凝固(血清)。或者，生物樣本可為組織樣本或活檢樣本。

具體而言，本發明用於預測白血病病患預後之方法包含： (a) 在第一時間點測定取自病患之第一生物樣本的TIFA量； (b) 在第二時間點測定取自病患之第二生物樣本的TIFA量；以及 (c) 依據第一與第二生物樣本的量確定病患的白血病進展，其中與第一生物樣本相比，以第二生物樣本的TIFA量升高代表白血病的進展。

本發明進一步以下列實施例說明，其提供旨在證實而非侷限。鑑於本發明，本領域技術人員應理解到，在不背離本發明精神與範疇之情況下，所揭示之特定具體實施例可進行許多改變，且仍能獲得相似或類似之結果。

實施例

1.1 細胞培養、人類周邊血液單核細胞 (PBMCs) 之分離、及 TNF-α 刺激作用

Hela、293T、及HL-60細胞株取自中央研究院Li-Jung Juan博士(台北，台灣，2014)、KG-1細胞株取自台中榮民總醫院Shih-Lan Hsu教授(台中，台灣，2015)、及其餘細胞株取自中央研究院Shui-Tein Chen博士(台北，台灣，2015)。所有細胞株於收到時皆擴增並儲存於液態氮。將原始小瓶解凍用於彼等實驗，並同時利用Promega GenePrint^â 10 System進行STR DNA指紋鑑定，且以ABI PRISM 3730 GENETIC ANALYZER與GeneMapper^â 軟體分析。所有得到的STR輪廓與習知ATCC指紋(ATCC.org)吻合。各細胞株按照發明人先前方法維持(20,27,28)。293T與HeLa細胞維持在Dulbecco’s改良Eagle’s培養基(DMEM，Gibco)。初代PBMCs、HL-60、KG-1、THP-1、U937、Jurkat、及K562細胞維持在Roswell Park Memorial Institute培養基(RPMI-1640，Invitrogen)。所有培養基皆補充10%去補充之胎牛血清(FBS，Gibco)、200 mM L-麩胺醯胺酸(Gibco)、100 U/mL青黴素(Gibco)、及100 mg/mL鏈黴素(Gibco)。所有細胞培養於37°C及5% CO₂ 之潮濕環境中。欲分離人類PBMC，如前所述(28)，將新鮮獲得的全血在Ficoll (GE healthcare)上分層。依據先前所述方法維持分離之初代細胞(29)，並於二週內進行實驗分析。必要時，在加入10 ng/mL的TNF-α (R&D Systems) 30分鐘或指定時間點之前，細胞於無血清條件下飢餓8小時。

1.2 質體及 siRNA 合成

以pCDNA3.1載體攜帶全長TIFA野生型，接著為合成的HA-標籤，且將全長的奧洛拉A構築於相同的載體，除了使用Flag-標籤之外。針對反轉錄病毒轉導，以聚合酶鏈反應(PCR)擴增全長(具有TIFA siRNA抗性沉默突變之野生型或T9A突變體)及TIFA片段，並由pLNCX載體(Clontech)攜帶，接著為二連續Myc-標籤，如前述(27)。pNF-kB-Luc質體係贈自L.-P. Ting博士(國立陽明大學，台灣)。所有構築體在實驗應用前皆定序確認。雙股siRNA寡聚體相對應於序列5'-UCA GGA CAA ACA GGU UUC CCG AGU U-3' (SEQ ID NO: 95)以靶向TIFA (20)，其係由GeneScript合成，奧洛拉A標靶siRNA購自Cell Signalling (#8883)，且對照組寡聚體購自GeneScript。

1.3 反轉錄定量 PCR (RT-qPCR)

利用即時定量PCR檢查特定基因的轉錄程度，如前述，並進行微小修改(27)。在siRNA轉染後第3天，按照製造商說明書(Invitrogen)，以TRIzol試劑從收取的細胞中萃取總RNA，並自DNase I (Invitrogen)處理的總RNA中，於oligo-dT (Invitrogen)存在下，利用SuperScript® III套組(Invitrogen)合成第一鏈cDNAs，其係依據製造商的方法。以基因特異性引子補充SYBR Green (Roche)，進行RT-qPCR，並以LightCycler® 480 (Roche)進行分析。

1.4 質體與 siRNA 之短暫轉染

針對短暫轉染293T細胞，利用Jet-PEI (Polyplus Transfection)，將2 µg指示質體DNA轉染6 x 10⁵ 個細胞48小時(pCDNA3.1載體，HA-標籤之TIFA，及pNF-kB-Luc)或24小時(Flag-標籤之奧洛拉A)，其係按照製造商說明書。針對短暫轉染U937細胞，利用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)，將3 μg之pNF-kB-Luc質體DNA轉染10⁶ 個懸浮細胞48小時，其係按照製造商說明書。欲靜默特定基因，在Opti-MEM (Invitrogen)存在下，以30 pmol (293T細胞)或50 pmol (懸浮細胞)的指示siRNA補充9或15 μL的Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen)，轉染6 x 10⁵ 個293T細胞或10⁶ 個懸浮細胞，其係按照製造商說明書。首次轉染後6小時，將細胞培養於常規培養基24小時，並以相同方法進行第二次siRNA轉染。在培養72小時後，收集細胞或條件培養基。

1.5 反轉錄病毒系穩定株之製備

欲進行反轉錄病毒轉導，在VSV-G存在下，以泛嗜反轉錄病毒表現系統(pantropic retroviral expression system)包裝假型病毒，其係按照製造商說明書(Clontech)，並進行指定細胞之感染，如前述(27)。在以400 mg/mL G418篩選數週後，在實驗分析或siRNA轉染以進行表型救援實驗之前，利用西方墨點分析確認穩定細胞中的異位蛋白表現。

1.6 細胞處理

本研究使用的所有化療藥物取得如下：依托泊苷(VP-16)購自Sigma；伊達比星與阿糖胞苷(Ara-C)購自Phizer；順鉑購自The European Directorate for the Quality of Medicines & HealthCare (EDQM)；索拉非尼(Rafi)購自Santa Cruz Biotechnology；依那西普(Enbrel，TNF-α抑制劑)購自Wyeth；硼替佐米(Velcade，NF-κB抑制劑)購自Janssen Pharmaceutica；ABT-263 (Navitoclax，BCL-2抑制劑)購自AdooQ Bioscience。在以X光放射線照射細胞處理方面，係以Faxitron RX-650輻照器(Faxitron X-ray Corporation)進行，其劑量速率為0.46Gy/min。必要時，細胞在無血清條件下飢餓8小時，之後加入10 ng/mL的TNF-α (R&D Systems) 30分鐘或指定的時間點。

用於處理293T細胞的激酶抑制劑及條件如下：100 nM酪蛋白激酶II抑制劑III TBCA (CK2i)、500 nM 4-胺基-5-(溴甲基)-2-甲基嘧啶二氫溴酸鹽(GRKi)、及25 nM索拉非尼(Rafi)購自Santa Cruz Biotechnology；200 nM壞死他汀因子-1(necrostatin-1)(RIPK1i)與10 nM GÖ 6976 (PKCi)購自Tocris Bioscience；50 nM Akt抑制劑VI (Akti)、300 nM IRAK-1/4抑制劑(IRAK1/4i)、及10 nM (5Z)-7-氧基紫醇(oxozeaenol)(TAK1i)購自Merck Millipore；500 nM咖啡酸苯乙酯(CAPE，NF-κBi)購自Sigma；10 nM VX680 (奧洛拉Ai)購自Selleck Chemicals；50 nM MK-5108 (Aurora Ai)購自AdooQ Bioscience。

1.7 抗體

TIFA特異性單株抗體之引發如前述(20)。抗奧洛拉A、抗磷酸化奧洛拉A(Thr288)、抗Bcl-2、及抗Bcl-X_L 購自Cell Signalling。抗His-標籤購自SignalChem。抗Myc、抗Flag、及抗HA購自Sigma。抗IκKα(磷酸化T23)、抗IκBα(磷酸化S32+S36)、抗人類CD45 PerCP/Cy5.5、抗人類CD33 FITC、抗β-肌動蛋白、及抗Bax購自Abcam。抗NF-κB活化型p65次單元(殖株12H11)及山葵過氧化酶(HRP)共軛之抗小鼠或抗兔IgG購自Millipore。

1.8 體外激酶試驗

實驗係依據發明人先前建立之方法(20)。指示處理之293T細胞係以CHAPS裂解緩衝液裂解(20 mM PIPES、1 mM Na₃ VO₄ 、1 mM EGTA、50 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、50 mM NaF、1% CHAPS、及10%甘油)，其中補充蛋白酶抑制劑雞尾酒(Roche)與磷酸酶抑制劑(Sigma)。將細胞萃取物與重組型His-標籤之野生型或T9A突變體TIFA培養於反應緩衝液(40 mM HEPES pH 7.5、20 mM MgCl₂ 、及100 mM ATP)，其係於1 mCi/mL [g-³² P]ATP (Perkin-Elmer)存在下，於37°C下反應30-90分鐘。然後，以塗佈抗His mAb的M-280 Dynabeads捕捉His標籤之蛋白。利用加入SDS樣本緩衝液且在95°C下加熱10分鐘終止反應，然後進行SDS-PAGE。利用放射自顯影術，顯示重組型蛋白上磷酸化作用程度。

1.9 免疫沈澱法

免疫沈澱實驗之進行如前述(28)。利用Jet-PEI (Polyplus Transfection)，將5 µg載體或HA-TIFA轉染培養於p100培養盤之次滿293T細胞。於48小時後，將細胞以或不以10 ng/mL TNF-α (R&D Systems)處理30 min、以PBS清洗、及以CHAPS裂解緩衝液(20 mM PIPES、1 mM Na₃ VO₄ 、1 mM EGTA、50 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、50 mM NaF、1% CHAPS、及10%甘油)裂解，其中補充蛋白酶抑制劑雞尾酒(Roche)、磷酸酶抑制劑雞尾酒3 (Sigma)。於4°C下，將3 μg指示抗體事先塗佈100 mL M-280 Dynabeads (Invitrogen)整夜。於4°C下，將500 mg細胞萃取物培養於15 mL抗體塗佈的Dynabeads整夜。隨後，以Tris緩衝鹽水Tween 20 (TBST)緩衝液清洗蛋白-珠複合物，並進行西方墨點分析。

1.10 西方墨點法

欲取得完整細胞萃取物，以冰冷PBS清洗6 x 10⁵ 個293T細胞或10⁶ 個懸浮細胞，並於RIPA裂解緩衝液(50 mM Tris pH 7.4、150 mM NaCl、1% NP-40、0.5%去氧膽酸鈉、及0.1% SDS)中裂解，其中補充蛋白酶抑制劑雞尾酒(Roche)與磷酸酶抑制劑雞尾酒(Sigma)。在5次反覆凍融循環後，於4°C下離心清除細胞萃取物。利用Bradford試驗定量細胞萃取物，並將等量的可溶性蛋白與SDS樣本緩衝液混合、煮沸、通過SDS-PAGE分離，並墨點至PVDF薄膜(Millipore)上。隨後，薄膜以含有5%乾燥奶粉之PBST (其中補充0.1% Tween-20之PBS)緩衝液阻斷1小時，並於4°C下以初級抗體培養整夜，該抗體以含有1%牛血清白蛋白(Sigma)的PBST稀釋。在以PBST清洗三次後，將薄膜培養於HRP共軛鍵接之抗小鼠或抗兔IgG。薄膜以PBST清洗五次，且墨點蛋白層帶以ECL系統(Millipore)呈現。所有的西方墨點分析係獨立進行至少三次，除了初代PBMCs以外。

1.11 螢光素酶報導基因試驗

基於螢光素酶之NF-κB報導分析係如前述方式進行(20)。在收取前，培養於6孔培養盤各孔中全部6×10⁵ 個293T或10⁶ 個懸浮U937細胞於指定條件下，以2 mg的pNF-κB-Luc報導質體短暫轉染48小時。細胞以10 ng/mL TNF-α (R&D Systems)處理30 min，並以1x被動裂解緩衝液(Promega)裂解。將100 mg的細胞裂解液分配至96孔培養盤各孔中，接著加入100 mL的螢光素酶試驗緩衝液LARII (Promega)與100 mL的Stop & Glo試劑(Promega)。利用SpectraMax Paradigm多模式板讀數儀(Molecular Devices)三重複測定化學發光，並於細胞裂解液平行西方墨點分析中以相對應之β-肌動蛋白量進行標準化。實驗結果以三獨立實驗之相對發光單位(RLU)表示。

1.12 WST-1 細胞存活試驗

在指示條件下，將全部10⁵ 個懸浮細胞接種於96孔培養盤各孔中，並在處理後的指定時間點分析細胞存活率。WST-1試劑(Roche)以10倍稀釋方式混合於細胞，其係依據製造商說明書，並以SpectraMax Paradigm Plate Reader (Molecular Devices)讀取三重複結果之吸光度，其中標準化至第0天或模擬對照組。

1.13 病患樣本

將2007年12月至2014年3月在台中榮民總醫院(VGHTC；AML#1-9)與台大醫院(NTUH；AML#10-16)診斷為新生AML的16例病患納入西方墨點分析、WST-1細胞存活率、及細胞凋亡試驗。彼等患者的平均爆發率(average of blasts)超過60%±18，其中4例例外(病患#2、9、12、及16)，其於化療後採集血液樣本以抑制急性病症。欲進行免疫細胞化學染色分析，將2009年3月至2012年1月間在NTUH接受標準化療且有可用的冷凍保存BM細胞的85例成人AML病患納入(30,31)。依據「赫爾辛基宣言」，取得所有參與者的書面知情同意書，且所有實驗研究皆遵照機構協議(CE11166-2，VGHTC，No. 201408027RIND，NTUH，及AS-IRB02-103189與AS-IRB02-104147，中央研究院，台灣)。

1.14 免疫細胞化學染色法

免疫細胞化學染色法如前所述，並進行微小修改(32)。85例病患的BM白血病細胞的細胞分離(cytospin)抹片於福馬林丙酮(3%)中固定3分鐘。標本隨後以過氧化酶阻斷酵素培養(10 min)，接著使用TIFA單株抗體(1:200溶於阻斷溶液，4ºC下整夜)(20)。以生物素化驢抗小鼠IgG(1μg/ mL，以阻斷溶液稀釋，30分鐘；DAKO)作為二次抗體，並以鏈黴素-過氧化酶複合物(DAKO)檢測蛋白。標本以蘇木精進行對比染色。各標本以0至4計分，其係依據染色強度積分(0 = 無、1 = 弱、2 = 強)及骨髓細胞陽性染色百分比積分(0 = 0-25%、1 = 26-50%、2 = 51-00%)。

1.15 細胞凋亡及流式細胞術分析

在siRNAs轉染後第2天，PBMCs以每孔10⁶ 個接種於6孔培養盤，隨後處理不同化療藥物。在48小時後，以冰冷PBS清洗細胞，並利用FITC膜聯蛋白V細胞凋亡檢測套組進行細胞凋亡檢測，其係按照製造商說明書(BD Biosciences)。隨後，依據前述方法(33)，利用光散射門控(gated)細胞之骨髓譜系，以及細胞凋亡率，如利用碘化丙啶與FITC膜聯蛋白V的雙重染色，其係以BD FACSCalibur Flow Cytometer (BD FACSCalibur)分析，如前述(27)。欲分析異種移植模式中的U937細胞，BM細胞或小鼠PBMCs於冰上分別以抗人類CD33 FITC與CD45 PerCP/Cy5.5連續染色1小時。將細胞以冰冷PBS清洗，並進行流式細胞術，如上述。

1.16 細胞介素與趨化介素分泌之評估 ( 細胞介素陣列及 ELISA)

在指定處理後72小時，收集等量U937細胞培養的條件培養基，並利用人類細胞介素陣列C1評估，其係按照製造商說明書(AAH-CYT-1，RayBiotech)。以ImageJ軟體擷取數據，並以陽性對照組標準化。當指定時，以酵素結合免疫吸附分析(ELISA)測試套組測定條件培養基中分泌之細胞介素與趨化介素的量，其係按照製造商說明書(R&D Systems)。利用SpectraMax Paradigm Plate Reader (Molecular Devices)讀取三重複樣本之析光度。所有原始數據皆以PBS對照組進行標準化，且其結果表示為三個獨立實驗之細胞介素相對分泌。

1.17 人類白血病細胞之異種移植及體內化療藥物治療

將購自國家實驗動物中心(台灣)的6至8週大無胸腺裸鼠飬養於長庚紀念醫院無病原體設施(協議編號2014092305)。針對骨髓肉瘤模式，小鼠每隻皮下接種5×10⁶ 個U937穩定細胞，其溶於50%基質膠(Corning)，接著在接種後第6、第8、及第11天腹腔注射投予PBS或阿糖胞苷(Ara-C，50 mg/kg)。每週二次記錄腫瘤尺寸，計算式為寬度² × 長度 × 0.52 (34)。針對原位白血病模式，經由外科手術，通過下腔靜脈(IVC)將小鼠以每隻注射1.5×10⁵ 個U937穩定細胞，接著在移植後第5天，進行5天每日投予相同治療。小鼠在第60天犧牲，並以股骨BM細胞進行流式細胞術分析。

1.18 統計分析

所有數據皆以三個獨立實驗的平均值±標準差表示。統計顯著性係以獨立樣本之t檢定表示，如*P＜ 0.05、**P＜ 0.01、及***P＜ 0.001，除非另有指明。針對免疫細胞化學染色，變項間之相關性係以Spearman等級相關性評估。Mann–WhitneyU 檢定用於分析AML病患中TIFA表現之差異。從診斷首日起即測量整體存活率(OS)，直到任何原因之死亡，並從完全緩解(CR)時計算無病存活率(DFS)直到任何原因之復發、死亡、或研究結束。Kaplan-Meier估計係用於繪製存活曲線，並以對數等級檢定測試組間差異。利用Cox比例風險廻歸模型估計危險比與95%信賴區間(CI)，以確定多變量分析中與OS和DFS相關之獨立危險因子。雙側P值＜0.05視為具有統計上顯著性。

2. 結果

2.1 TIFA 參與奧洛拉 A 激酶依賴性 NF-κB 傳訊

發明人先前提出，TIFA在蘇胺酸9的磷酸化作用可涉及Ser/Thr激酶在PI3K/AKT的傳訊途徑(20)。欲確定職司TIFA之Thr9磷酸化作用最直接的激酶，發明人經由先前建立的方法篩選激酶抑制劑(20,23)，並發現到，奧洛拉A抑制劑能最有效對抗體外磷酸化作用，其係利用TNF-α處理293T細胞裂解液產生。發明人進一步驗證，奧洛拉A為TIFA之Thr9磷酸化作用所需，其係基於三實驗：首先，以奧洛拉A特異性siRNA及二不同奧洛拉A抑制劑處理的細胞裂解液皆顯示TIFA Thr9磷酸化作用能力減弱，其類似於未經磷酸化之T9A突變體的結果(圖1A，第5-7行)。其次，免疫螢光染色顯示，以TNF-α處理時，內源性TIFA斑點(20)與活化型奧洛拉A (磷酸化-Thr288)共同存在(數據未顯示)。再者，免疫沈澱法實驗顯示奧洛拉A與TIFA間之直接交互作用，其在TNF-α刺激時加強(圖1B)。

據報告，奧洛拉A調節NF-κB傳訊(17)，且奧洛拉A表現增加與胃癌的TNF-α、NF-κB、慢性發炎程度提昇相符(35)。發明人亦觀察到活化型NF-κB、磷酸化IκK與IκB、及NF-κB驅動之螢光素酶活性程度顯著升高，其響應於奧洛拉A或TNF-α治療的過度表現(圖1C-D，第2行)，且此外顯示，此升高在TIFA靜默時消失(第4行)。結果整體顯示，奧洛拉A在NF-κB傳訊調控中的角色需要TIFA。

2.2 TIFA 與奧洛拉 A 、促生存因子、及 AML 之預後不良相關

奧洛拉A發現可於AML高度表現(18)。由於發明人顯示，TIFA為AML細胞株U937與THP-1中NF-κB活化作用所必需(圖1C-D)，發明人進一步探討，在白血病發生過程中，TIFA蛋白量是否與奧洛拉A和NF-κB傳訊因子相關。由於AML (36)的細胞遺傳學群簇異質性及病患血液樣本的有限體積，發明人選擇以TIFA特異性單株抗體進行西方墨點分析(20)，並比較源自16例新生AML病患與16位正常個體的新鮮分離的PBMCs。發明人發現，在所有AML衍生的PBMC中，TIFA蛋白量顯著升高，但在正常供體中則保持不變。此外，TIFA升高伴隨著奧洛拉A蛋白、活化型奧洛拉A、磷酸化IκK/IκB、活化型NF-κB、及促存活因子Bcl-2/Bcl-X_L 程度的向上調節(圖2A)。在所有PBMCs中，所有測試蛋白量間之成對比較顯示強相關性，代表彼等因子在功能上與AML相關(皮氏相關係數 = 0.862-0.991)。

利用來自85例新生AML病患的冷凍保存BM白血病細胞的免疫細胞化學染色，進一步加強由非分級PBMCs觀察到的TIFA蛋白量預後。依據免疫細胞化學結果，將接受常規強化誘發化療的病患(31)分為低(評分0-2，n = 40)與高(評分3-4，n = 45)表現組。具有較高TIFA蛋白量的AML病患似乎具有比彼等較低TIFA量者更高的WBCs與爆發計數。此外，較高TIFA蛋白表現與FAB M4亞型密切相關(P = 0.0315)，但與白血病細胞中CD7表現(P = 0.0454)呈負相關。

在所有檢查的AML病患中，有54例(63.5%)達到CR。較高TIFA表現與較低反應率相關(CR率，51.1%比上77.5%，P = 0.0139)。在追蹤一中間期57.8個月(範圍為0.3至79.1個月)，TIFA表現較高的病患顯示，OS與DFS明顯低於TIFA表現較低者。在非M3亞型、中等風險細胞遺傳學、及正常核型的病患亞群中，差異仍然顯著，但DFS程度較低。在多變異分析中，較高的TIFA表現為OS預後不良的獨立因子，不論年齡、診斷時的WBC計數、細胞遺傳學、及NPM1/FLT3 -ITD (表2)。表2 OS與DFS之多變異分析(Cox廻歸)

縮寫：RR，相對風險；CI，信賴區間， *統計學上顯著(P ＜ 0.05)^† 年齡＞50相對於年齡£50 (參考體)^§ WBC大於50,000/mL對比50,000/mL以下 ^z NPM1 ^mut /FLT3-ITD ^neg 對比其他亞型^‡ 較高TIFA對比較低TIFA表現 ^Y 不利之細胞遺傳學對比其他

彼等結果共同顯示，TIFA表現不僅與奧洛拉A依賴性NF-κB傳訊有關，還與AML預後不良相關。

2.3 TIFA 靜默增進對 AML 與其他癌症細胞株之化學毒性

欲驗證TIFA致腫瘤作用與奧洛拉A傳訊相關性，發明人經由RNA干擾靶向TIFA依賴性傳訊，並以時間依賴性方式經由WST-1存活試驗檢測AML細胞株的增生情況。結果顯示，TIFA靜默可減弱AML細胞株HL-60、KG-1、THP-1、及U937的生長(圖3A)，其類似於VX680處理結果(圖3B) (18)。此外，亦可抑制急性淋巴細胞白血病(ALL)細胞株Jurkat與CML細胞株K562兩者之細胞增生，以響應TIFA靜默及VX680處理。

抑制奧洛拉A激酶可促進白血病化學敏感性，其視為抗癌策略(14,37)。欲測試靶向TIFA是否還能緩解血液惡性腫瘤的侵襲性與化學抗性，例如抑制奧洛拉A，發明人探討在TIFA靜默下各處理時的白血病細胞存活率。基於WST-1的存活率測試顯示，針對三個傳統AML化療藥物，依托泊苷、伊達比星、及阿糖胞苷的化學治療，所有四個受測AML細胞株IC50減少約50%，其類似於VX680的效果(圖3C)。奧洛拉A之靜默、非典型藥物治療、及ALL與CML細胞株亦得到類似結果。

發明人接著以新鮮分離的AML PBMCs測試TIFA抑制作用之效果。除了生長遲緩(圖4A，圖4B右側為計算結果)，從TIFA消耗的AML PBMCs中可以看到，升高的NF-κB傳訊因子具有顯著逆轉，即使是在奧洛拉A激酶過度表現與活化(圖4C)。有趣的是，TIFA靜默對正常PBMCs存活率的影響似乎比處理VX680的效果低，其與AML對應物中可比擬的化學毒性相反(比較圖4B中右側與左側部分)，顯示靶向TIFA對非白血病細胞的細胞毒性可能較小。更重要的是，靜默TIFA可持續促進病患衍生性PBMCs的化學敏感性，其類似於以VX680抑制奧洛拉A (圖4D)，顯示TIFA為白血病化學抗性所需，其類似於奧洛拉A (38)。彼等促進之化學敏感性最可能係因TIFA靜默時細胞凋亡增強(圖4E)與NF-κB傳訊因子向下調節(圖4C)所引起。發明人的研究結果顯示，TIFA為維持白血病細胞生長及化學抗性所需，且TIFA可作為潛在的治療標靶。

其他癌症細胞株亦被發現TIFA抑制作用可促進抗癌治療的細胞毒性效果。於存在或不存在TIFA靜默之情況下，以索拉非尼、順鉑、依托泊苷、或X光放射線照射各癌症細胞株，並進行WST-1試驗。細胞的第4天細胞毒性以無TIFA靜默處理組進行標準化並呈現。表3摘錄了不同癌症細胞株之抗癌治療下TIFA靜默的細胞毒性倍數變化。

* 細胞毒性利用(1-存活%)計算，並利用(TIFA靜默之細胞毒性/非靜默之細胞毒性)確定細胞毒性的倍數變化。

2.4 經由顯性負 (DN) 抑制作用靶向 TIFA

欲探討靶向TIFA的分子機制，發明人在表型上利用野生型TIFA與T9A突變體拯救TIFA耗竭之AML細胞株，其係經由一靜默互補策略(27)。在所有測試的AML細胞株中，表現野生型TIFA而非T9A突變體時，可有效緩解靜默依賴性化學敏感性(圖5A)，顯示pThr9定向TIFA寡聚合作用為AML化學抗性所需之關鍵步驟。

發明人接著試圖經由在AML細胞中異位表現TIFA的DN（dominant negative）片段以破壞TIFA寡聚合作用。發明人設計用於經反轉錄病毒轉導而精細定位AML細胞中分子靶向TIFA的最小有效區域(圖5B)。經轉導之U937細胞裂解液的免疫沉澱法顯示，片段F1F2與F2F3，兩者含有FHA二聚合核心並分別具有額外的C端與N端延伸，能捕捉內源性TIFA (圖5C)，顯示二片段能干擾內源性TIFA的自身結合(20)。其結果為，U937細胞之F1F2或F2F3片段能減弱TNF-α-依賴性NF-κB活化作用與NF-κB傳訊因子提升(圖5D-E)。更重要的是，該二DN片段亦顯著促進AML細胞株的化學敏感性，其中IC50降低50%以上(圖5F)。這些觀察結果共同表明，TIFA在AML中的分子靶向治療潛力。

2.5 靶向 TIFA 增強白血病骨髓母細胞之清除率

細胞介素異常分泌有助於白血病的發病(39)，且視為AML復發的預後指徵(39,40)。發明人探討TIFA的分子靶向是否可擾亂NF-κB依賴性白血病細胞介素分泌，且達到更好的治療功效。發明人進行細胞介素抗體陣列，以分析U937細胞分泌的細胞介素。結果顯示，處理阿糖胞苷可促進TNF-α、CXCL-1、及IL-8分泌，但抑制IL-6，而TIFA DN片段之表現明顯產生相反效果(圖6A，詳細的ELISA分析如圖6B)。關於處理阿糖胞苷促進TNF-α分泌方面，補充TNF-α能增進U937細胞存活率以響應阿糖胞苷處理效果，而TIFA DN片段之表現顯著拮抗TNF-α的作用(圖6C)。以依那西普(Enbrel，TNF-α抑制劑)、硼替佐米(Velcade，NF-κB抑制劑)、或ABT-263 (Navitoclax，BCL-2抑制劑)抑制TNF-α與下游NF-κB存活傳訊，可增強阿糖胞苷處理之U937細胞的細胞毒性，其類似TIFA DN片段之作用(圖6D)。這些結果顯示，TIFA DN片段在治療上可有效阻斷發炎性細胞介素分泌，導致AML中NF-κB存活因子去活化。

因此，發明人評估TIFA DN片段的體內治療潛力。儘管與NOD-SCID或NSG/NOG小鼠相比，移植的造血組織證實難以在裸鼠上繁殖(41)，但發明人選擇此一較困難的模式來驗證靶向TIFA的效果。此係因增生性骨髓先驅細胞所需的完整發炎性細胞介素可模擬微環境以支持化學抗性(42)。異位異種移植模式顯示，除了阿糖胞苷治療之外，TIFA DN片段的反轉錄病毒轉導，相較於單獨的阿糖胞苷治療，明顯預防骨髓肉瘤擴展(圖6E)。此預防體內AML擴增，亦可由TNF-α、NF-κB、或BCL-2抑制作用觀察到(圖6F)，支持了利用靶向TIFA而增進之化學毒性，可能係因阻斷TNF-α依賴性NF-κB存活途徑。此外，發明人亦經由IVC將U937穩定細胞直接注射裸鼠，建立原位異種移植模式，而毋須以化學或亞致死放射線照射進行免疫抑制。由受體小鼠BM細胞之流式細胞術分析顯示，靶向TIFA顯著促進移植之人類CD45⁺ CD33⁺ 骨髓母細胞在阿糖胞苷處理後的清除率(圖6G)。受限的白血病骨髓母細胞與波動的細胞介素共同顯示，TIFA之分子靶向能擾亂NF-κB與TNF-α間之正回饋，其為AML進展所需(43)。

TIFA為NF-κB傳訊途徑中相對新穎的成員。發明人的早期研究揭示TIFA寡聚合作用在TNF-α刺激下促進NF-κB傳訊途徑的關鍵角色，其機制上係經由TIFA二聚體的磷酸化Thr9與FHA結構域間之分子間結合作用(20)。最近的一項研究表明，此TIFA之磷酸化依賴性寡聚合作用亦可由革蘭氏陰性細菌衍生之單醣庚醣-1,7-二磷酸鹽(HBP)驅動，導致先天免疫的活化(23)。在另一文獻中(44)，發明人進一步顯示，TIFA經由組裝NLRP3發炎體而介導先天免疫反應。在本研究中，發明人發現TIFA為AML中奧洛拉A傳訊軸與NF-κB調節之促生存因子間之功能聯結。此外，發明人利用顯示TIFA抑制作用干擾白血病細胞介素分泌，證實TIFA靶向在治療AML上的治療潛力，其明顯增進AML細胞之化學毒性，並於異種移植模式中增強白血病骨髓母細胞之清除率。

發明人藉由西方墨點分析新鮮收集之病患樣本，以直接評估TIFA蛋白量，而非常規基於即時PCR的預後因子轉錄程度檢測。發明人觀察到，相較於正常供體，AML病患之TIFA蛋白量升高，類似其激酶奧洛拉A，並證實TIFA與NF-κB驅動之促存活因子間之緊密相關性。利用冷凍保存之病患骨髓細胞的免疫細胞化學染色，發明人亦推測，AML病患在BM中TIFA蛋白量升高係因OS預後不良之獨立因子，且與年齡、WBC計數、核型、及其他遺傳標記無關。彼等觀察結果證實，具有較高TIFA蛋白量之AML病患，化療難以治癒，且CR率較低及OS較差。基於彼等發現，BM中較高TIFA蛋白量亦可作為預測AML病患臨床結果的新穎生物標記。TIFA靜默或顯性負TIFA片段之表現皆可減少NF-κB活化，導致白血病細胞增生停滯且增進化學毒性。

DN蛋白的異位表現可拮抗信號傳導，並在癌症治療中引發治療潛力。具體而言，轉染IκB超抑制因子，其為DN IκB突變體且最終抑制NF-κB活性，顯示可選擇性增加對長春新鹼治療的ALL敏感性，其係經由NF-κB調節之細胞凋亡(45)。發明人同樣觀察到，在TIFA之二DN片段的異位表現時，白血病細胞中化學敏感性增強。發明人認為，最小DN片段必須包括FHA二聚合核心加上N端Thr9模體以破壞內源性TIFA寡聚合作用或C端TRAF6/TRAF2交互作用模體以中斷信號傳導(20,22)。有趣的是，轉錄抑制(經由TIFA siRNA；圖3與圖4)及分子抑制(經由DN片段；圖5與圖6)兩者對TIFA顯示出幾乎相同的靶向功效，顯示TIFA在彼等細胞過程中不可替代且非冗餘的角色。

發明人使用AML、ALL、及CML細胞株等結果一致證實，靶向TIFA在骨髓與白血病淋巴細胞譜系中的功效，顯示TIFA驅動的NF-κB傳訊軸可在白血病發生過程中扮演重要角色。此外，最近針對促進白血病發生之白血病起始細胞(LICs)，亦描述了NF-κB與TNF-α間之正回饋(43)。LIC富集之白血病BM細胞呈現組成性活化之NF-κB傳訊，其視為AML緩解後復發之原因(43)。發明人之圖6C結果顯示，處理TNF-α確實緩解阿糖胞苷對未分化之U937單核細胞的細胞毒性，而TIFA之分子抑制經由擾動NF-κB依賴性促存活傳訊而阻斷該作用(圖5D-E)。由於殘存的先天免疫，白血病細胞顯示難以在無胸腺裸鼠中繁殖(41)。然而，發明人觀察到彼等未分化單核細胞在小鼠股骨中的歸巢由於處理阿糖胞苷而抑制(圖6E)，且TIFA抑制顯著促進該作用。儘管此異種移植模式可能不表示LICs之真正幹性，但其可能意味著在化學藥物治療下未分化之白血病細胞的維持需要TIFA，且經由靶向TIFA，可削弱LICs的長期擴增及自我更新能力。

先天免疫與發炎性傳訊的去調節(deregulation)可導致骨髓增生異常症候群(MDS)，其為群簇性血液惡性腫瘤，可過度繁衍BM且進展為AML (46)。組成型NF-κB傳訊可能會致病性轉活化發炎性細胞介素與促存活因子，導致MDS BM先驅細胞之失調擴增，而於正常與MDS BM先驅細胞抑制NF-κB活性可誘發細胞凋亡(47)。因此，Bcl-2與Bcl-X_L 可視為骨髓惡性腫瘤(包括AML)的化學抗性指標(9,12,48,49)。由於TIFA調節NF-κB驅動之先天免疫(23)，發明人於AML中觀察到的TIFA於白血病發生之角色，較可能係經由NF-κB依賴性抗細胞凋亡/促存活途徑。發明人使用白血病細胞株與AML病患衍生之PBMCs的結果一致顯示，TIFA為化療時細胞存活所必需。靜默病患PBMCs之TIFA明顯阻斷NF-κB依賴性促存活因子，儘管過度表現奧洛拉A (圖4C)且處理化療藥物，顯示發明人在圖3C、圖4D、圖5A、及圖5F中觀察到的化學抗性能力喪失係因擾動的抗細胞凋亡/促存活因子Bcl-2與Bcl-X_L 。

腫瘤微環境係由許多發炎性因子(包括細胞介素與趨化介素)構成的前發炎性反應環境，且此促腫瘤發炎反應基本上使得癌症發展(50)。越來越多靶向促發炎性TNF超家族成員的抑制劑顯示治療上有效(51)。鑑於TIFA在TNF-α與NF-κB間之傳訊鏈上的重要角色，其抑制作用應能減弱由NF-κB轉錄調節之發炎性因子。發明人觀察到，在分子靶向TIFA時減弱CXCL-1與IL-8分泌物，與延遲白血病細胞生長及降低化學抗性相關聯(圖6A-B)，其支持先前建議的兩發炎性因子的致瘤功能(52,53)。

現已確定，奧洛拉A可於AML中過度表現(16,18,54)，且其抑制作用視為治療數種造血性惡性腫瘤之標靶治療(55-57)。儘管許多類型之實體瘤常觀察到奧洛拉A之基因擴增，導致過度表現與腫瘤進展(58)，但是奧洛拉A於AML中是否經由此方式向上調節仍未知。發明人經由功能上需要奧洛拉A激酶活性之位點特異性磷酸化作用，確定TIFA聯結至TNF-α依賴性NF-κB存活信號，其從而維持正回饋環以驅動發炎性反應並支持白血病細胞之化學抗性(40)。發明人在以TNF-α、NF-κB、BCL-2、及奧洛拉A抑制劑治療下，觀察到AML細胞的化學毒性增強，其類似於TIFA的轉錄抑制與分子靶向(圖3、4、5、6C)。藉由體內的阿糖胞苷與TNF-α、NF-κB、或BCL-2之抑制劑結合治療，進一步強化轉譯功效(圖6F)。

總體而言，發明人的研究結果證實TIFA在支持奧洛拉A依賴性NF-κB存活及發炎性途徑中的功能角色，可作為AML中白血病細胞生長及化學抗性的分子基礎。由於使用蒽環類藥物或阿糖胞苷的初始治療方法在幾十年內維持不變，且由於藥物抗藥性，CR仍然不足，未來以TIFA靶向策略的AML治療可提供降低化學抗性發生率的治療優勢，提高常規化學療法的功效，並改進長期臨床療效。序列資訊表4

無

當結合附圖閱讀時，將更好地理解本發明之上述摘錄及下列詳細描述。欲說明本發明，附圖顯示目前較佳之具體實施例。然而，應理解到，本發明未侷限於所示之精確安排與手段。

下圖中：

圖1A、1B、1C、及1D顯示TIFA為奧洛拉A依賴性NF-κB傳訊所必需。(圖1A) TIFA磷酸化作用之體外激酶試驗。上側，以Flag標記之奧洛拉A (Flag-奧洛拉A)或奧洛拉A siRNA (siAurora A)轉染，或以奧洛拉A抑制劑(VX-680與MK-5108)處理之293T細胞裂解液的蛋白質西方墨點分析。奧洛拉A pT288代表活化型激酶(18)。左側，利用重組型TIFA野生型(WT)與不可磷酸化之T9A突變體蛋白之體外激酶試驗，其係於[γ-³² P]ATP存在下以奧洛拉A抑制劑與TNF-α處理的293T細胞裂解液培養。WCE，全細胞萃取物；Si，奧洛拉A siRNA；VX，VX680；MK，MK5108；PPTase，鹼性去磷酸酶。右側，三個獨立實驗的量化及統計分析。(圖1B) 上側，293T細胞裂解液之奧洛拉A的免疫沉澱法，其係於不同時間之TNF-α刺激下轉染HA-標記之TIFA。下側，用於上側之全部裂解液的西方墨點分析。S，上清液；P，沈澱物。(圖1C) 左側，293T細胞裂解液之西方墨點分析，其係以Flag-標籤之奧洛拉A與TIFA siRNA轉染。右側，如同左側，除了檢驗以TIFA siRNA轉染並以10 ng/mL TNF-α處理30 min的U937細胞以外。(圖1D)如同(圖1C)，除了處理之細胞額外以pNF-κB-Luc質體轉染以外，並利用螢光素酶報導基因試驗分析NF-κB活性。圖示代表以非轉染或非TNF-α刺激之對照組標準化之相對亮度單位(RLU)。

圖2顯示TIFA蛋白之過度表現與AML病患之促存活因子及預後不良有關。正常組與AML PBMCs組中TIFA與促存活因子的代表性蛋白表現(各組n = 16)。將西方墨點分析結果(圖4C)量化，並以相對應之b-肌動蛋白量標準化，而在正常對照組中，各傳訊因子之相對強度係以中間值標準化。水平條帶，中間值。

圖3A、3B、及3C顯示TIFA靜默增進對AML細胞株之化學毒性。(圖3A) 以WST-1試驗檢測四個AML細胞株於TIFA靜默時細胞存活時間過程。圖示代表三個獨立實驗中以第0天標準化之相對細胞存活率。(圖3B)圖示代表(圖3A)實驗與處理VX680之相對應實驗中以第4天之模擬對照組標準化的相對細胞存活率。(圖3C) 用於(圖3A)與(圖3B)之AML細胞株係以WST-1試驗分析化療藥物處理下的細胞存活率。圖示代表經計算之化療藥物IC50。siCon，對照組siRNA；siTIFA，TIFA siRNA。

圖4A、4B、4C、4D、及4E顯示TIFA靜默增進對AML PBMCs化學毒性。(圖4A) 利用WST-1試驗檢測八個AML PBMCs於TIFA靜默時細胞存活時間過程。圖示代表以第0天標準化之相對細胞存活率。(圖4B) 圖示代表(圖4A)實驗與正常PBMCs之相對應實驗和VX680處理組(各組n = 8)中以第4天之模擬對照組標準化的相對細胞存活率。(圖4C) 8個AML PBMCs於TIFA靜默時及8個正常PBMCs之促存活因子量的西方墨點分析。(圖4D)用於(圖4A)與(圖4B)之AML PBMCs係以WST-1試驗分析化療藥物處理下的細胞存活率。圖示代表經計算之化療藥物IC50。(圖4E) 四個AML PBMCs (AML #9、10、13、及15)係於TIFA靜默處理10 μM依托泊苷(etoposide)、10 nM伊達比星(idarubicin)、或10 μM阿糖胞苷(cytarabine)，或處理VX680，並以流式細胞術分析。圖示代表細胞以膜聯蛋白V與碘化丙啶陽性染色的百分比。水平條帶，中間值。siCon，對照組siRNA；siTIFA，TIFA siRNA。

圖5A、5B、5C、5D、5E、及5F顯示TIFA之分子標靶抑制TIFA介導之NF-κB活化作用。(圖5A) 圖示代表AML細胞株在TIFA靜默及siRNA-抗性(siR) TIFA野生型(WT)或T9A突變體過度表現下經計算之化療藥物IC50。(圖5B) TIFA顯性負構築體之示意圖。AML細胞株分別以攜帶彼等構築體之假型反轉錄病毒感染，以產生穩定之細胞。2Myc，二連續Myc-標籤。(圖5C) 以抗Myc免疫微珠免疫沉澱及西方墨點法分析(圖5B)所示之穩定表現TIFA片段的U937細胞裂解液。(圖5D) 用於(圖5C)之細胞係額外以pNF-κB-Luc質體轉染，以10 ng/mL TNF-α處理30 min，並利用螢光素酶報導基因試驗分析NF-κB活性。螢光素酶活性係以非TNF-α刺激之對照組標準化。圖示代表三次獨立實驗取得之相對亮度單位(RLU)。(圖5E) 利用西方墨點法分析(圖5D)裂解液中NF-κB傳訊因子的量。(圖5F) 以劑量依賴性方式之化療藥物處理(圖5B)所述之穩定表現TIFA片段的AML細胞株，並利用WST-1試驗分析細胞存活率。圖示代表三次獨立實驗取得之經計算化療藥物IC50値。siCon，對照組siRNA；siTIFA，TIFA siRNA。

圖6A、6B、6C、6D、6E、6F、及6G顯示靶向TIFA增強白血病骨髓母細胞的清除率。(圖6A) 利用細胞介素-抗體陣列，分析圖5F中10μM阿糖胞苷處理之U937穩定細胞所收集的條件培養基的細胞介素分泌情形。將圈選的細胞介素定量，並顯示於右側。(圖6B) 用於(圖6A)之細胞所分泌的白血病細胞介素係以ELISA量化分析。條件培養基中細胞介素之量係以PBS對照組標準化，且圖示代表三次獨立實驗取得之細胞介素相對分泌量。siTIFA，TIFA siRNA轉染。(圖6C) 用於(圖6A)之U937細胞係以WST-1試驗分析在10 ng/mL TNF-α與10 μM阿糖胞苷存在下之細胞存活率。實驗結果以第0天標準化，且圖示代表相對細胞存活率之時間過程。(圖6D) 用於(圖6A)之U937細胞係以WST-1試驗分析在5 mg/mL依那西普(etanercept)、50 nM硼替佐米(bortezomib)、或1 mM ABT-263伴隨10 μM阿糖胞苷存在下之細胞存活率。實驗結果以第0天標準化，且圖示代表三次獨立實驗取得之相對細胞存活率之時間過程。(圖6E) 上側，裸鼠骨髓肉瘤生長之實驗程序。小鼠係皮下注射(圖6A)中使用之反轉錄病毒轉導的U937細胞，並以阿糖胞苷處理。腫瘤體積之時間過程。圖6(F) 上側，裸鼠骨髓肉瘤生長之實驗程序。小鼠係皮下注射(圖6A)中使用之反轉錄病毒轉導的U937細胞，並以腹腔注射處理5 mg/kg依那西普、0.5 mg/kg硼替佐米、或50 mg/kg ABT-263結合50 mg/kg阿糖胞苷。腫瘤體積之時間過程(各組n = 4)。(圖6G)如同(圖6E)，除了U937穩定細胞經由IVC注射，並分析BM植入情形。左側，利用流式細胞術評估處理小鼠之BM細胞，其係使用抗人類CD45與CD33抗體。右側，將左側(各組n = 7)分析之人類CD45⁺ CD33⁺ 細胞百分比繪圖。水平條帶，中間值。SC，皮下注射；IP，腹腔注射；IVC，經由下腔靜脈注射細胞。

圖7顯示在特定具體實施例中，不同物種TIFA胺基酸序列之比對，包括SEQ ID NO: 1源自智人、SEQ ID NO: 2源自家兔、SEQ ID NO: 3源自犬類、SEQ ID NO: 4源自小鼠、SEQ ID NO: 5源自大鼠、SEQ ID NO: 6源自灰倉鼠、SEQ ID NO: 7源自美洲河狸、SEQ ID NO: 8源自天竺鼠、SEQ ID NO: 9源自歐洲牛、SQE ID NO: 10源自山羊、SQE ID NO: 11源自豬、及SEQ ID NO: 12源自馬，其中指明F1片段(位置1-45，包含N端磷酸化作用/寡聚合作用模體與b1-b2鏈)、F2片段(位置46-103，包含b3-b8鏈)、及F3片段(位置104-184，包含b9-b12鏈)，以及位於F2結構域之pThr-辨識模體(如位於SEQ ID NO: 1之約位置51-89，底線之殘基)與位於F3結構域之C端環序列(如位於SEQ ID NO: 1之約位置144-184)。

圖8顯示TIFA的b-三明治結構拓撲型態，其係由十二股b褶板構成。

無

<110> 中央研究院

<120> TIFA拮抗劑及其治療疾病之用途

<130>

<140> 106125168

<141> 2017-07-26

<160> 95

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 184

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

<210> 2

<211> 185

<212> PRT

<213> 家兔

<400> 2

<210> 3

<211> 186

<212> PRT

<213> 犬類

<400> 3

<210> 4

<211> 184

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 4

<210> 5

<211> 185

<212> PRT

<213> 大鼠

<400> 5

<210> 6

<211> 185

<212> PRT

<213> 灰倉鼠

<400> 6

<210> 7

<211> 185

<212> PRT

<213> 美洲河狸

<400> 7

<210> 8

<211> 185

<212> PRT

<213> 天竺鼠

<400> 8

<210> 9

<211> 185

<212> PRT

<213> 歐洲牛

<400> 9

<210> 10

<211> 185

<212> PRT

<213> 山羊

<400> 10

<210> 11

<211> 184

<212> PRT

<213> 豬

<400> 11

<210> 12

<211> 185

<212> PRT

<213> 馬

<400> 12

<210> 13

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N端磷酸化作用/寡聚合作用模體(1-14aa)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa可為絲胺酸(S)或蘇胺酸(T)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> Xaa可為絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)或天門冬醯胺酸(N).

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(7)

<223> Xaa可為丙胺酸(A)或纈胺酸(V).

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (10)..(10)

<223> Xaa可為麩胺酸(E)或麩胺醯胺酸(Q).

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (12)..(12)

<223> Xaa可為蘇胺酸(T)或甲硫胺酸(M).

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (13)..(13)

<223> Xaa可為纈胺酸(V)或白胺酸(L).

<400> 13

<210> 14

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> b1模體

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa可為半胱胺酸(C)或絲胺酸(S).

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> Xaa可為麩胺醯胺酸(Q)或組胺酸(H).

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> Xaa可為甲硫胺酸(M)、異白胺酸(I)、白胺酸(L)或纈胺酸 (V).

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (6)..(6)

<223> Xaa可為纈胺酸(V)、異白胺酸(I)或白胺酸(L).

<400> 14

<210> 15

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> b2模體

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa可為麩胺酸(E)或天門冬胺酸(D).

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa可為離胺酸(K)或蘇胺酸(T).

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> Xaa可為白胺酸(L)或苯丙胺酸(F).

<400> 15

<210> 16

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> b3模體

<400> 16

<210> 17

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> b5模體

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> Xaa可為絲胺酸(S)、纈胺酸(V)或丙胺酸(A).

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

<223> Xaa可為麩胺醯胺酸(Q)或組胺酸(H).

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (6)..(6)

<223> Xaa可為白胺酸(L)、脯胺酸(P)或纈胺酸(V).

<400> 17

<210> 18

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> b6模體

<400> 18

<210> 19

<211> 5

<212> PRT

<213> a人工序列

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa可為天門冬醯胺酸(N)或組胺酸(H).

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> Xaa可為甲硫胺酸(M)、白胺酸(L)、纈胺酸(V)或異白胺酸(I).

<400> 19

<210> 20

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> b10模體

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa可為精胺酸(R)或離胺酸(K).

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> Xaa可為甲硫胺酸(M)或白胺酸(L).

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> Xaa可為纈胺酸(V)、白胺酸(L)或異白胺酸(I).

<400> 20

<210> 21

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> b11模體

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> Xaa可為苯丙胺酸(F)或異白胺酸(I).

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

<223> Xaa可為甲硫胺酸(M)、白胺酸(L)、纈胺酸(V)或異白胺酸(I).

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (6)..(6)

<223> Xaa可為麩胺酸(E)或麩胺醯胺酸(Q).

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(7)

<223> Xaa可為離胺酸(K)或精胺酸(R).

<400> 21

<210> 22

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> b12模體

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa可為苯丙胺酸(F)或絲胺酸(S).

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> Xaa可為麩胺酸(E)或麩胺醯胺酸(Q).

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> Xaa可為蘇胺酸(T)或異白胺酸(I).

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

<223> Xaa可為麩胺醯胺酸(Q)、組胺酸(H)或麩胺酸(E).

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(7)

<223> Xaa可為異白胺酸(I)、纈胺酸(V)、絲胺酸(S)或苯丙胺酸(F).

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (8)..(8)

<223> Xaa可為白胺酸(L)、甲硫胺酸(M)或苯丙胺酸(F).

<400> 22

<210> 23

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HS(人類)TIFA F1

<400> 23

<210> 24

<211> 46

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OC(兔)TIFA F1

<400> 24

<210> 25

<211> 47

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CL(犬)TIFA F1

<400> 25

<210> 26

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MM(小鼠)TIFA F1

<400> 26

<210> 27

<211> 46

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RN(大鼠)TIFA F1

<400> 27

<210> 28

<211> 46

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CG(倉鼠)TIFA F1

<400> 28

<210> 29

<211> 46

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CC(海狸)TIFA F1

<400> 29

<210> 30

<211> 46

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CP(天竺鼠)TIFA F1

<400> 30

<210> 31

<211> 46

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BT(牛)TIFA F1

<400> 31

<210> 32

<211> 46

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CH(山羊)TIFA F1

<400> 32

<210> 33

<211> 46

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SS(豬)TIFA F1

<400> 33

<210> 34

<211> 46

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> EC(馬)TIFA F1

<400> 34

<210> 35

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HS(人類)F2

<400> 35

<210> 36

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OC(兔)TIFA F2

<400> 36

<210> 37

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CL(犬)TIFA F2

<400> 37

<210> 38

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MM(小鼠)TIFA F2

<400> 38

<210> 39

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RN(大鼠)TIFA F2

<400> 39

<210> 40

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CG(倉鼠)TIFA F2

<400> 40

<210> 41

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CC(海狸)TIFA F2

<400> 41

<210> 42

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CP(天竺鼠)TIFA F2

<400> 42

<210> 43

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BT(牛)TIFA F2

<400> 43

<210> 44

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CH(山羊)TIFA F2

<400> 44

<210> 45

<211> 57

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SS(豬)TIFA F2

<400> 45

<210> 46

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> EC(馬)TIFA F2

<400> 46

<210> 47

<211> 81

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HS(人類)TIFA F3

<400> 47

<210> 48

<211> 81

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OC(兔)TIFA F3

<400> 48

<210> 49

<211> 81

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CL(犬)TIFA F3

<400> 49

<210> 50

<211> 81

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MM(小鼠)TIFA F3

<400> 50

<210> 51

<211> 81

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RN(大鼠)TIFA F3

<400> 51

<210> 52

<211> 81

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CG(倉鼠)TIFA F3

<400> 52

<210> 53

<211> 81

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CC(海狸)TIFA F3

<400> 53

<210> 54

<211> 81

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CP(天竺鼠)TIFA F3

<400> 54

<210> 55

<211> 81

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BT(牛)TIFA F3

<400> 55

<210> 56

<211> 81

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CH(山羊)TIFA F3

<400> 56

<210> 57

<211> 81

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SS(豬)TIFA F3

<400> 57

<210> 58

<211> 81

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> EC(馬)TIFA F3

<400> 58

<210> 59

<211> 41

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HS(人類)TIFA C端環序列

<400> 59

<210> 60

<211> 41

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OC(兔)TIFA C端環序列

<400> 60

<210> 61

<211> 41

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CL(犬)TIFA C端環序列

<400> 61

<210> 62

<211> 41

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MM(小鼠)TIFA C端環序列

<400> 62

<210> 63

<211> 41

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RN(大鼠)TIFA C端環序列

<400> 63

<210> 64

<211> 41

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CG(倉鼠)TIFA C端環序列

<400> 64

<210> 65

<211> 41

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CC(海狸)TIFA C端環序列

<400> 65

<210> 66

<211> 41

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CP(天竺鼠)TIFA C端環序列

<400> 66

<210> 67

<211> 41

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BT(牛)TIFA C端環序列

<400> 67

<210> 68

<211> 41

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CH(山羊)TIFA C端環序列

<400> 68

<210> 69

<211> 41

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SS(豬)TIFA C端環序列

<400> 69

<210> 70

<211> 41

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> EC(馬)TIFA C端環序列

<400> 70

<210> 71

<211> 103

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HS(人類)TIFA F1+F2

<400> 71

<210> 72

<211> 104

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OC(兔)TIFA F1+F2

<400> 72

<210> 73

<211> 105

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CL(犬)TIFA F1+F2

<400> 73

<210> 74

<211> 103

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MM(小鼠)TIFA F1+F2

<400> 74

<210> 75

<211> 104

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RN(大鼠)TIFA F1+F2

<400> 75

<210> 76

<211> 104

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CG(倉鼠)TIFA F1+F2

<400> 76

<210> 77

<211> 104

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CC(海狸)TIFA F1+F2

<400> 77

<210> 78

<211> 104

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CP(天竺鼠)TIFA F1+F2

<400> 78

<210> 79

<211> 104

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BT(牛)TIFA F1+F2

<400> 79

<210> 80

<211> 104

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CH(山羊)TIFA F1+F2

<400> 80

<210> 81

<211> 103

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SS(豬)TIFA F1+F2

<400> 81

<210> 82

<211> 104

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> EC(馬)TIFA F1+F2

<400> 82

<210> 83

<211> 139

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HS(人類)TIFA F2+F3

<400> 83

<210> 84

<211> 139

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OC(兔)TIFA F2+F3

<400> 84

<210> 85

<211> 139

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CL(犬)TIFA F2+F3

<400> 85

<210> 86

<211> 139

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MM(小鼠)TIFA F2+F3

<400> 86

<210> 87

<211> 139

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RN(大鼠)TIFA F2+F3

<400> 87

<210> 88

<211> 139

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CG(倉鼠)TIFA F2+F3

<400> 88

<210> 89

<211> 139

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CC(海狸)TIFA F2+F3

<400> 89

<210> 90

<211> 139

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CP(天竺鼠)TIFA F2+F3

<400> 90

<210> 91

<211> 139

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BT(牛)TIFA F2+F3

<400> 91

<210> 92

<211> 139

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CH(山羊)TIFA F2+F3

<400> 92

<210> 93

<211> 138

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SS(豬TIFA F2+F3)

<400> 93

<210> 94

<211> 139

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> EC(馬)TIFA F2+F3

<400> 94

<210> 95

<211> 25

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA靶向TIFA

<400> 95

Claims

一種TIFA抑制劑，其係一分離之TIFA胜肽片段，包含二聚合核心胜肽區段，其N端結合Thr9胜肽區段或C端結合TRAF6/TRAF2交互作用胜肽區段，其中(i)該Thr9胜肽區段包含一N端磷酸化作用/寡聚合作用模體MX₁X₂FEDX₃DTX₄EX₅X₆T，其序列如SEQ ID NO：13所示，其中X₁為絲胺酸(S)或蘇胺酸(T)、X₂為絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)、天門冬醯胺酸(N)、X₃為丙胺酸(A)或纈胺酸(V)、X₄為麩胺酸(E)或麩胺醯胺酸(Q)、X₅為蘇胺酸(T)或甲硫胺酸(M)，且X₆為纈胺酸(V)或白胺酸(L)；(ii)該二聚合核心胜肽區段包含六個β鏈，其包括(a)一β3鏈，其具有β3模體VKFG；(b)一β4鏈，其具有β4模體YX₁F，其中X₁為蘇胺酸(T)或異白胺酸(I)；(c)一β5鏈，其具有β5模體QFX₁LX₂X₃F，其中X₁為絲胺酸(S)、纈胺酸(V)、或丙胺酸(A)、X₂為麩胺醯胺酸(Q)或組胺酸(H)，且X₃為白胺酸(L)、脯胺酸(P)、或纈胺酸(V)；(d)一β6鏈，其具有β6模體SFEIKN；(e)一β7鏈，其具有β7模體LIV；以及(f)一β8鏈，其具有β8模體X₁X₂L，其中X₁為精胺酸(R)、麩胺醯胺酸(Q)、或離胺酸(K)，且X₂為麩胺酸(E)或蘇胺酸(T)；其中該β3至β8鏈之每一者係利用複數個內部環序列從N端至C端依序連接至下一者；以及 (iii)該TRAF6/TRAF2交互作用胜肽區段包含四個β鏈，其包括(a)一β9鏈，其具有β9模體LX₁KX₂D，其中X₁為天門冬醯胺酸(N)或組胺酸(H)，且X₂為甲硫胺酸(M)、白胺酸(L)、纈胺酸(V)、或異白胺酸(I)；(b)一β10鏈，其具有β10模體X₁CX₂X₃RF，其中X₁為精胺酸(R)或離胺酸(K)、X₂為甲硫胺酸(M)或白胺酸(L)，且X₃為纈胺酸(V)、白胺酸(L)、或異白胺酸(I)；(c)一β11鏈，其具有β11模體YQX₁LX₂ X₃ X₄E，其中X₁為苯丙胺酸(F)或異白胺酸(I)、X₂為甲硫胺酸(M)、白胺酸(L)、纈胺酸(V)、或異白胺酸(I)、X₃為麩胺酸(E)或麩胺醯胺酸(Q)，且X₄為離胺酸(K)或精胺酸(R)；以及(d)一β12鏈，其具有β12模體X₁FX₂X₃X₄ FX₅X₆，其中X₁為苯丙胺酸(F)或絲胺酸(S)、X₂為麩胺酸(E)或麩胺醯胺酸(Q)、X₃為蘇胺酸(T)或異白胺酸(I)、X₄為麩胺醯胺酸(Q)、組胺酸(H)、或麩胺酸(E)、X₅為異白胺酸(I)、纈胺酸(V)、絲胺酸(S)、或苯丙胺酸(F)，且X₆為白胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、或苯丙胺酸(F)；其中該β9至β12鏈之每一者係利用複數個內部環序列從N端至C端依序連接至下一者；以及一C端環序列連接至該β12鏈的C端；其中該分離之TIFA胜肽片段不含該Thr9胜肽區段與該TRAF6/TRAF2交互作用胜肽區段兩者。
如請求項1之TIFA抑制劑，其中該N端Thr9-磷酸化作用模體係位於相對應於SEQ ID NO：1位置1-14之處；該β3模體係位於相對應於SEQ ID NO：1位置47-50之處；該β4模體係位於相對應於SEQ ID NO：1位置58-60之處；該β5模體係位於相對應於SEQ ID NO：1位置69-75之處；該β6模體係位於相對應於SEQ ID NO：1位置84-89之處；該β7模體係位於相對應於SEQ ID NO：1位置96-98之處；該β8模體係位於相對應於SEQ ID NO：1位置101-103之處；該β9模體係位於相對應於SEQ ID NO：1位置106-110之處；該β10模體係位於相對應於SEQ ID NO：1位置114-119之處；該β11模體係位於相對應於SEQ ID NO：1位置122-129之處；該β12模體係位於相對應於SEQ ID NO：1位置136-143之處；以及/或該C端環序列係位於相對應於SEQ ID NO：1位置144-184之處。
如請求項1之TIFA抑制劑，其中該Thr9胜肽區段更包含二個β鏈，其包括(a)一β1鏈，其具有β1模體X₁LX₂X₃T X₄ Y，其中X₁為半胱胺酸(C)或絲胺酸(S)、X₂為麩胺醯胺酸(Q)或組胺酸(H)、X₃為甲硫胺酸(M)、異白胺酸(I)、白胺酸(L)或纈胺酸(V)，且X₄為纈胺酸(V)、異白胺酸(I)或白胺酸(L)；以及(b)一β2鏈，其具有β2模體位於位置X₁X₂X₃P，其中X₁為麩胺酸(E)或天門冬胺酸(D)、X₂為離胺酸(K)或蘇胺酸(T)，且X₃為白胺酸(L)或苯丙胺酸(F)，其中該β1鏈係利用一內部環序列從N端至C端依序連接至該β2鏈。
如請求項3之TIFA抑制劑，其中該β1模體係位於相對應於SEQ ID NO：1位置15-21之處；及/或該β2模體係位於相對應於SEQ ID NO：1位置39-42之處。
如請求項1之TIFA抑制劑，其中該Thr9胜肽區段包含一胺基酸序列，係相對應於SEQ ID NO：1之位置1-45，或一胺基酸序列，係具備與相對應於SEQ ID NO：1之位置1-45之胺基酸序列至少70%相同度；該二聚合核心胜肽區段包含一胺基酸序列，係相對應於SEQ ID NO：1之位置46-103，或一胺基酸序列，係具備與相對應於SEQ ID NO：1之位置46-103之胺基酸序列至少70%相同度；以及/或該TRAF6/TRAF2交互作用胜肽區段包含一胺基酸序列，係相對應於SEQ ID NO：1之位置104-184，或一胺基酸序列，係具備與相對應於SEQ ID NO：1之位置104-184之胺基酸序列至少70%相同度。
如請求項1之TIFA抑制劑，其中該Thr9胜肽區段包含一胺基酸序列，係選自於由SEQ ID NOs：23-34組成之群組；該二聚合核心胜肽區段包含一胺基酸序列，係選自於由SEQ ID NOs：35-46組成之群組；以及/或該TRAF6/TRAF2交互作用胜肽區段包含一胺基酸序列，係選自於由SEQ ID NOs：47-58組成之群組。
如請求項1之TIFA抑制劑，其係F1-F2胜肽片段，包含該Thr9胜肽區段與該二聚合核心胜肽區段，其中該Thr9胜肽區段C端係聯結至該二聚合核心胜肽區段的N端。
如請求項7之TIFA抑制劑，其包含一胺基酸序列，係選自於由SEQ ID NOs：71-82組成之群組。
如請求項1之TIFA抑制劑，其係F2-F3胜肽片段，包含該二聚合核心胜肽區段與該TRAF 6交互作用胜肽區段，其中該二聚合核心胜肽區段的C端係聯結至該TRAF 6交互作用胜肽區段的N端。
如請求項9之TIFA抑制劑，其包含一胺基酸序列，係選自於由SEQ ID NOs：83-94組成之群組。
一種重組型核酸，其包含一核苷酸序列，係編碼如請求項1至10中任一項之TIFA胜肽片段。
如請求項11之重組型核酸，其係載體。
如請求項12之重組型核酸，其中該載體係病毒載體。
一種組合物，其包含如請求項1至10中任一項之TIFA胜肽片段及生理上可接受載體。
一種如請求項1至10中任一項之TIFA胜肽片段、其編碼核酸、或包含該胜肽或該編碼核酸之組合物之用途，其用於製造藥劑，以於個體治療TIFA活化相關聯之疾病或病況，其中該疾病或病況為TIFA活化相關聯之癌症或發炎性疾病，或細胞介素刺激性NF-κB活化相關聯之癌症或發炎性疾病。
如請求項15之用途，其中該疾病或病況為癌症，選自於由白血病、肝癌、胃癌組成之群組。
如請求項15之用途，其中該疾病或病況為發炎性疾病，選自於由肝炎、動脈粥樣硬化、肺動脈高壓、心肌病、類風濕性關節炎、發炎性腸病、及法布里病(Fabry disease)組成之群組。
如請求項15之用途，其中該個體患有癌症，且該胜肽片段、該編碼核酸、及該含有該胜肽或該編碼核酸之組合物係結合抗癌治療投予該個體。
如請求項18之用途，其中該抗癌治療包含投予抗癌劑，選自於由依托泊苷(etoposide)、伊達比星(idarubicin)、阿糖胞苷(cytarabine)、索拉非尼(sorafenib)、瑞格菲尼(regorafenib)、博萊黴素(bleomycin)、硼替佐米(bortezomib)、硫酸布他卡因(busulfan)、及甲磺酸酯(obatoclax)組成之群組、或放射線照射。
如請求項19之用途，其中該胜肽片段、該編碼核酸、或該組合物係以有效增進該抗癌治療之細胞毒性之量投予。
一種預測白血病預後之方法，其包含測定取自白血病病患樣本中具有FHA結構域之TRAF-交互作用蛋白(TIFA)的蛋白表現量，及根據該樣本中TIFA的蛋白表現量決定該病患之白血病預後，其中該樣本中TIFA的蛋白表現量升高代表預後不良。
一種TIFA拮抗劑之用途，用於製造藥劑，以於個體治療TIFA活化相關聯之癌症或發炎性疾病，或細胞介素刺激性NF-κB活化相關聯之癌症或發炎性疾病。
如請求項22之用途，其中該TIFA拮抗劑為靶向TIFA之干擾核酸或TIFA顯性負抑制劑。
如請求項23之用途，其中該TIFA顯性負抑制劑為如請求項1之TIFA胜肽片段。
如請求項22之用途，其中該個體為患有發炎性疾病之病患，選自於由肝炎、動脈粥樣硬化、肺動脈高壓、心肌病、類風濕性關節炎、發炎性腸病、及法布里病(Fabry disease)組成之群組。
如請求項22之用途，其中該個體為患有癌症之病患。
如請求項26之用途，其中該TIFA拮抗劑係結合抗癌治療投予病患。
如請求項27之用途，其中該TIFA拮抗劑係以一量投予，相較於不以該TIFA拮抗劑之抗癌治療，可有效增加該抗癌治療對癌細胞之細胞毒性。
如請求項28之用途，其中該癌細胞係選自於由肺癌細胞、肝癌細胞、白血病細胞、乳癌細胞、睾丸胚胎癌細胞、及骨肉瘤細胞組成之群組。
如請求項27之用途，其中該病患對該抗癌治療呈現抗性。