KR20130087639A - 대장암 관련 유전자 ｔｏｍ３４ - Google Patents

Abstract

본 발명은 대장암을 검출 및 진단하는 객관적인 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 대장암 세포 및 정상세포 사이를 구별하는 TOM34의 발현 수준을 결정하는 것과 관련된 진단 방법에 관한 것이다. 결국, 본 발명은 대장암의 치료에 이용가능한 치료제를 스크리닝하는 방법, 대장암 치료방법 및 대장암에 대항하는 개체를 백신하는 방법을 제공한다.

Description

대장암 관련 유전자 ＴＯＭ３４{Colon cancer related gene ＴＯＭ３４}

본 발명은 대장암 치료 및 예방 방법, 및 대장암 검출 및 진단 방법에 관한 것이다.

본 출원은 2005년 7월 27일 제출된 미국 가출원 번호 제 60/703,265호의 우선권 주장을 통해서 청구하고, 본 발명의 내용은 전체적으로 상기 문헌의 내용으로 통합된다.

대장암은 전세계의 암-사망의 가장 일반적인 원인 중 하나이다. 대장암의 진단 및 치료의 다양한 진보에도 불구하고, 진전된 대장암을 가진 많은 환자들은 높은 사망률을 야기한다. 상기 대장암의 예후를 향상시키기 위해서, 초기-단계 암의 검출을 위한 민감하고 특이적인 진단 바이오마커의 개발, 및 더 효과적이고 덜 해로운 치료제가 요구된다. 이를 달성하기 위해서, 대장암의 분자적인 메카니즘을 더 잘 이해하는 것이 필요하다. 최근 분자적인 연구는 대장암이 APC, p53, beta -catenin 및 K- ras을 포함하는 종양억제유전자 및/또는 종양유전자의 유전적인 변화를 포함하는 유전적 변형의 축적과 관련이 있음을 보고하였다(Nishisho I, et al . Science 253: 665-669, 1991; Baker SJ, et al ., Science 244: 217-221, 1989; Morin PJ, et al ., Science 275: 1787-1790, 1997; Forrester K, et al ., Nature 327: 298-303, 1987). 더불어, 변형된 메틸화(methylation)(Jones PA & Laird PW, Nat Genet 21: 163-167, 1999) 및 각인의 상실(loss of imprinting)(Cui H, et al., Nat Med 4: 1276-1280, 1998)과 같은 후생유전적 사건들, 및/또는 유전적 변화 또는 다른 알려지지 않은 메카니즘에 의해 철폐된 전사조절과 같은 유형의 변화들은 대장암의 발생과 관련된다. 본 발명자들은 발암과 관련된 유전자들 중에서 암세포의 증식 및/또는 생존에 필수적인 유전자 산물의 억제가 이들의 성장 억제 또는 세포 사멸을 야기하는 것을 예측할 수 있다. 그러므로, 발암 활성에 영향을 미치고 암세포에서 특이적으로 발현되는 분자들은 신규 항암제 개발을 위한 가능성 있는 표적을 나타낸다.

인간 TOM34는 인간 EST 및 cDNA 데이타베이스로부터 발견되었고, 예상되는 단백질이 미토콘드리아 수용체의 효모 Tom70 계열로 알려진 62-잔기 모티프(motif)의 부위에서 서열 상동성을 공유하고 있기 때문에 미토콘드리아 단백질 내포 장치(import machinery)의 성분으로 예측되었다(Nuttall SD, et al ., DNA Cell Biol 16: 1067-1074, 1997). 그러나, 최근 연구는 TOM34가 조직 및 세포로부터 분류한 결과 주로 세포질 분획을 포함하고, 일부 미토콘드리아 및 막 분획을 포함하고 있음을 규명하였다(Chewawiwat N, et al ., J Biochem(Tokyo) 125: 721-727, 1999). 또 다른 연구는 면역조직화학적 염색에 의해 HeLa 세포의 세포질에서 세포 내 분포를 보여주었다(Chun-Song Yand Henry Y., Archives of Biochemistry and Biophysics 400: 105-110, 2002; Abhijit M, et al ., Archives of Biochemistry and Biophysics 400: 97-104, 2002). 효모 2-하이브리드 스크리닝 시스템(Yeast two-hybrid screening system)은 TOM34가 시험관 내에서 발로신-포함 단백질(Valosin-containing protein; VCP), 많은 세포활성과 관련된 ATPases(ATPases associated with a variety of cellular activities; AAA) 계열(Chun-Song Y, et al., Archives of Biochemistry and Biophysics 400: 105-110, 2002), 또는 90-kDa 열충격 단백질(heat shock protein; hsp90)(Young JC, et al ., J Biol Chem 273: 18007-18010, 1998)과 상호작용하는 것을 보여주었다. 그러나 TOM34의 생물학적 기능은 아직 규명하지 못했다.

CD8+ 세포독성의 T 림프구들(CD8+ cytotoxic T lymphocytes; CTLs)은 MHC Class I 분자에서 제시되는 종양-관련 항원들(tumour-associated antigens; TAAs)으로부터 유래되는 에피토프(epitope) 펩티드들을 인지하고, 종양 세포들을 용해한다. TAA들의 첫 샘플로서 MAGE 계열의 발견 때문에, 많은 다른 TAA들이 면역학적 접근을 이용하여 발견되었고(Boon T., Int J Cancer. 1993;54(2):177-80., Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med . 1996;183(3):725-9., van der Bruggen P, et . al., Science . 1991;254(5038):1643-7., Brichard V, et . al ., J Exp Med . 1993;178(2):489-95., Kawakami Y, et . al ., J Exp Med . 1994;180(1):347-52), 이들 중 일부는 면역치료의 표적으로서 임상적 개발 과정에 있다. 지금까지 TAA들은 MAGE(van der Bruggen P, et . al ., Science . 1991;254(5038):1643-7), gp100(Kawakami Y, et . al ., J Exp Med . 1994;180(1):347-52), SART(Shichijo S, et. al ., J Exp Med . 1998;187(3):277-88) 및 NY-ESO-1(Chen YT, et . al ., Proc Natl Acad Sci U S A. 1997;94(5):1914-8)을 포함하고 있음을 규명되었다. 동시에, 암 세포에 의해 다소 상당히 과발현된 것을 이미 보여준 유전자 산물들은 세포적 면역반응을 위한 표적으로 인지되는 것을 보여졌다. 이것들은 p53(Umano Y, et. al ., Br J Cancer. 2001;84(8):1052-7), HER2/neu(Tanaka H, et . al ., Br J Cancer. 2001;84(1):94-9), CEA(Nukaya I, et . al ., Int J Cancer . 1999;80(1):92-7) 및 그 외 다른 것들을 포함한다.

이것들은 기초 및 임상연구에서 제조된 중요한 과정의 샘플들(Rosenberg SA, et. al ., Nat Med . 1998;4(3):321-7., Mukherji B, et . al ., Proc Natl Acad Sci U S A. 1995;92(17):8078-82., Hu X, et . al ., Cancer Res . 1996;56(11):2479-83)임에도 불구하고, 대장암을 포함한 선암(adenocarcinomas)의 치료용은 일반적으로 매우 제한된 수의 후보 TAA들이 존재한다. 만약 정상세포가 아닌 암세포에서만 풍부하게 발현되는 TAA들이 있다면, 이들은 면역치료학적 표적의 후보물질로 가능성이 있을 것이다.

대장암 발생에서 분자적 역할을 증명하고 대장암(colorectal carcinoma; CRC) 환자를 위한 신규 치료 표적을 규명하기 위해, 본 발명자들은 23040개의 유전자들로 구성된 cDNA 마이크로어레이를 이용한 발현 프로파일을 수행하였다(Lin YM, et al., Oncogene 21: 4120-4128, 2002). 상기 대장암에서 상향조절된 발현을 보여주는 유전자들 중, 본 발명자들은 TOM34(34kDa-Translocase of the outer mitochondrial membrane)가 검진된 CRC 시료 20개 중 16개에서 단백질 발현이 빈번하게 증진되기 때문에 상기 유전자에 초점을 맞추었다. 다수의 조직 노던 블랏 분석(northern blotting analysis)은 상기 유전자가 검진된 11개의 다른 정상의 성인 조직들 중 어떤 것에서도 발현되지 않고, 정소 및 난소에서 풍부하게 발현되고 전립선, 비장 및 대장에서 약하게 발현되는 것을 나타내었다. TOM34의 면역조직화학적 염색은 비-암 점막에 비해 CRC 조직에서 상당한 축적을 보여주었다.

본 발명에 있어서, 인간 TOM34은 CRC에서 빈번히 상향조절되고, 검진된 다른 15개의 정상 성인 조직이 아닌 정소 및 난소에서 발현되는 것을 확인하였다. 대장암 세포의 성장을 현저하게 감소시키는 siRNA에 의한 TOM34의 억제 때문에, 상기 유전자 산물은 진단 마커로서 유용할 뿐만 아니라 인간 종양에 대한 잠재적인 치료 표적이 될 수 있다.

또한, 상기 TOM34는 대장암에 대한 중요한 세포면역반응을 유도할 수 있는 종양 관련 항원(Tumor Associated Antigen; TAA)으로 제공할 수 있음이 고려되었다. 상기 가설을 조사하기 위해, 본 발명자들은 건강한 자원자로부터 획득한 PBMC를 TOM34로부터 유래한 펩티드들로 자극한 후, 항원을 발현하는 종양 세포를 인지 및 사멸시키는 펩티드-특이적 CTL 클론을 성공적으로 획득하였다.

특히, TOM34에 특이적인 작은 간섭 RNA(small-interfering RNA; siRNA)로 대장암 HCT116 및 RKO 세포들의 형질감염은 상기 TOM34의 발현을 효과적으로 감소시키고 세포 성장을 극적으로 억제하였다.

또한, 본 발명자들은 TOM34를 항원 에피토프(epitope) 펩티드로서 제공하기 위해 상기 TOM34 유래 서열을 가지는 펩티드들을 조사하였고, 대장암에 대한 중요한 세포면역반응을 유도할 수 있는 효과적인 암 면역치료용 신규 에피토프 펩티드를 탐구하였다. 건강한 자원자의 말초혈액단핵세포들(Peripheral Blood Mononuclear Cells; PBMC)은 TOM34의 일부 서열들을 포함하는 펩티드들을 이용하여 자극되었다. 상기 펩티드들은 HLA-A*2402에 결합하는 것이 예측되는 것이 선별되었다. 본 발명자들은 HLA-A24-제한 방식(restricted manner)으로 항원을 제시하는 세포에 대한 특이적 세포독성을 나타내는 세포독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocyte; CTL) 세포주를 유도할 수 있는 TOM34로부터 유래하는 특이적 항원 펩티드의 서열을 성공적으로 확인하였다. CTL 클론(clone)들은 상기 CTL 세포주들로부터 확립되었다. 또한, CTL 클론의 분석은 상기 CTL 클론이 펩티드-적재된 표적 세포뿐만 아니라 내생적으로 TOM34를 발현하는 세포에 대한 강한 세포독성 활성을 가지고 있음을 보여주었다. 또한, 저온표적억제분석(cold target inhibition assay)은 CTL 클론들이 MHC Class I 분자 복합체에서 항원 펩티드를 특이적으로 인지하는 것을 나타내었다. 상기 결과는 상기 펩티드들이 TOM34을 발현하는 대장암 세포에 대한 강하고 특이적인 면역반응을 유도할 수 있는 HLA-A24-제한 에피토프(restricted epitope) 펩티드인 것을 강하게 제시한다.

이런 규명들은 TOM34가 암 세포의 성장과 관련되고, 신규 항암제 개발 및/또는 CRC 진단에 기여할 수 있음을 제시한다.

본 발명은 TOM34의 유전자 발현 패턴의 발견을 기초로 한다. 상기 TOM34의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 각각 서열번호 60 및 서열번호 61로 나타낸다. 상기 서열들은 유전자은행 접근번호(Genbank Accession NO.) AB085681로부터 이용가능하다.

따라서, 본 발명은 조직 시료와 같은 환자-유래 생물학적 시료에서 TOM34의 발현 수준을 결정함으로써 개체에서 대장에 대한 성질을 진단 또는 결정하는 방법을 제공한다. 정상세포는 대장 조직으로부터 수득되었다. 예를 들어, 상기 유전자의 정상적인 대조군 수준에 비해 유전자의 발현 수준이 증가하는 변화는 대장암으로부터 고통받거나 대장암으로 진전되는 위험이 있는 개체를 나타낸다.

본 발명의 문맥에 사용된 용어 "대장암에 대한 성질(redisposition to colon cancer)"은 대장암에 대한 경향, 유행, 성향 또는 민감성을 가지는 경향이 되는 개체의 상태를 포함한다. 또한, 상기 용어는 대장암에 걸릴 위험이 있는 개체를 포함한다.

본 발명의 문맥에서, 구 "대조군 수준(control level)"은 대조군 시료에서 검출되는 단백질 발현 수준을 의미하는 것이다. 대조군 수준은 단일 참고 개체군 또는 다수 개체군의 발현 형태로부터 유래한 단일 발현 형태가 될 수 있다. 예를 들면, 상기 대조군 수준은 사전에 테스트된 세포들로부터 발현 형태 중 어느 하나의 데이타베이스가 될 수 있다. "정상적인 대조군 수준(normal control level)"은 정상적이고 건강한 개별 개체 또는 대장암으로부터 고통받지 않는 것으로 알려진 개별 개체에서 검출된 유전자 발현의 수준을 의미하는 것이다. 정상적인 개체는 대장암의 임상적인 증상을 가지지 않는다.

정상적인 대조군 수준에 비해 실험군 시료에서 검출되는 TOM34의 발현 수준의 증가는 CRC로부터 고통받거나 CRC로 진전되는 위험이 있는 개체(상기 시료가 수득되어지는 개체)를 나타낸다.

본 발명에 따르면, 유전자 발현 수준은 유전자 발현이 대조군 수준에 비해 10%, 25% 및 50%가 증가할 때 "변형된(altered)"것으로 간주된다. 또한, 발현 수준은 유전자 발현 수준이 대조군 발현에 비해 적어도 0.1, 적어도 0.2, 적어도 1, 적어도 2, 적어도 5, 또는 적어도 10 또는 그 이상의 배만큼 증가되었을 때 "증가된(increased)"것으로 간주된다. 발현은 예를 들어, 환자-유래 조직 시료의 유전자 전사에 대한 TOM34 프로브(probe)와 같은 하이브리드을 검출함으로써 결정된다.

본 발명의 문맥에서, 환자-유래 조직 시료는 예를 들어, 대장암을 가진 것으로 알려져 있거나 의심되는 실험 개체로부터 획득된 조직이다. 예를 들면, 상기 조직은 상피세포를 포함할 수 있다. 보다 바람직하게, 상기 조직은 대장암으로부터 유래한 상피세포가 될 수 있다.

또한, 본 발명은 TOM34을 발현하는 실험 세포와 실험 화합물을 접촉시킨 후 TOM34의 발현 수준 또는 상기 유전자 산물의 활성을 결정함으로써 TOM34의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 확인하는 방법을 제공한다. 상기 실험 세포는 대장암으로부터 획득되는 상피세포와 같은 상피세포가 될 수 있다. TOM34의 발현 수준 또는 상기 유전자 산물의 활성이 상기 유전자 또는 유전자 산물의 활성이 대조군 수준에 비해 감소하는 것은 실험 화합물이 TOM34의 억제제이고 대장암 증상을 줄이기 위해 사용될 수 있음을 나타낸다.

또한, 본 발명은 TOM34 핵산 또는 폴리펩티드에 결합하는 검출 시약을 포함하는 키트를 제공한다.

본 발명의 치료 방법은 예를 들면, 안티센스(antisense) 조성물 또는 항체 조성물과 같은 TOM34의 길항제(antagonist) 또는 억제제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체 내 대장암 치료 또는 예방 방법을 포함한다. 상기 길항제 또는 억제제는 TOM34 발현 도는 활성을 감소시키거나 억제하는 핵산 또는 단백질 수준에서 활동할 수 있다.

본 발명의 문맥에서, 상기 안티센스 조성물은 특이적 표적 유전자의 발현을 줄인다. 예를 들면, 상기 안티센스 조성물은 TOM34 서열에 상보적인 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 방법은 작은 간섭 RNA(siRNA) 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명의 문맥에서, siRNA 조성물은 TOM34의 발현을 감소시킨다. 또 다른 방법으로, 개체 내 대장암의 치료 또는 예방은 리보자임(ribozyme) 조성물을 개체에 투여함으로써 수행될 수 있다. 본 발명의 문맥에서, 상기 핵산-특이적 리보자임 조성물은 TOM34의 발현을 줄인다. 실제로, TOM34에 대한 siRNA의 억제 효과는 확인되었다. 예를 들면, TOM34에 대한 siRNA가 실시예에서 대장암 세포의 세포 증식을 억제하는 것을 분명히 보였다. 따라서, 본 발명에 있어서, TOM34는 대장암의 바람직한 치료적 표적이다.

또한, 본 발명은 백신 및 백신접종 방법을 포함한다. 예를 들면, 개체 내 대장암을 치료 또는 예방하는 방법은 TOM34의 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드의 면역학적 활성 단편을 포함하는 백신을 개체에 투여하는 것과 관련될 수 있다. 본 발명의 문맥에서, 면역학적 활성 단편은 전장 단백질에 의해 유도되는 것과 유사한 면역 반응을 유도하는 전장의 자연 발생 단백질 보다 길이가 더 짧은 폴리펩티드이다. 예를 들면, 상기 면역학적 활성 단편은 적어도 8개 잔기로 되어 있고, T 세포 또는 B 세포와 같은 면역 세포를 자극할 수 있는 것이다. 면역 세포 자극은 세포 증식, 사이토카인들(예를 들면, IL-2)의 합성, 또는 항체의 생산을 검출함으로써 측정될 수 있다.

별도의 정의가 있지 않으면, 본 발명에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당업계에서 일반적인 기술 중 하나로 이해되는 것과 같은 의미이다. 본 발명에서 기술된 것과 동일 또는 유사한 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 실험에 사용될 수 있음에도 불구하고, 바람직한 방법 및 물질들은 하기 기재된 것들이다. 본 발명에서 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 다른 참고문헌들은 전체적으로 본 발명의 참고 문헌의 내용으로 통합된다. 본 발명은 우선 발명의 이점에 의해 규명하는 것에 선행할 수 없는 권리로서 해석되는 것은 없다.

본 발명의 명세서에서 정의를 포함하여 대립하는 경우 조절할 수 있다. 또한, 본 발명의 명세서에서 물질, 방법 및 실험들은 단지 예증이고 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 기재된 방법들의 이점은 질병이 대장암의 명백한 임상적 증상들의 검출 이전에 확인되는 것이다. 본 발명의 다른 특징 및 이점들은 하기의 상세한 설명 및 청구항으로부터 명백해 질 것이다.

본 발명에 사용된 용어 "a", "an" 및 "the"는 별도의 특별한 설명이 없으면 "적어도 하나(at lest one)"를 의미한다. 하기 상세한 설명 및 청구항에 있어서, 별도의 특별한 설명이 없으면, 용어 "포함하다(comprise)", 및 이의 변형 "포함하다(comprises)" 및 "포함하는(comprising)"은 특정 다른 완전체 또는 단계, 또는 완전체 또는 단계의 군을 제외하지 않고, 정해진 완전체 또는 단계, 또는 완전체 또는 단계의 군을 포함하는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다.

본 발명은 CRC를 가진 환자들의 대장 조직들로부터 유래한 세포들에서 TOM34의 증가된 발현의 발견에 부분적으로 기초를 두고 있다. 상기 증가된 유전자 발현은 종합적인 cDNA 마이크로어레이를 사용함에 의해 확인되었다.

23,040개의 유전자들을 포함하는 cDNA 마이크로어레이를 사용하여, 20명의 환자의 종합적인 유전자-발현 프로파일을 미리 만들었다. TOM34은 CRC 환자들에서 높은 수준으로 발현되었다.

본 발명에서 확인된 TOM34는 CRC의 마커 및 유전자 표적으로서 진단적 목적을 위해 사용되고, 이의 발현은 CRC 증상을 치료 또는 완화하기 위해 변화된다.

세포들의 시료에서 TOM34의 발현을 측정함으로써, CRC는 진단되었다. 유사하게, 다양한 항원 및 CRC 치료용 항원에 대한 반응으로 TOM34의 발현을 측정함으로써 확인될 수 있다.

본 발명은 TOM34의 발현을 결정하는 것(예를 들면, 측정하는 것)과 관련된다. TOM34 서열에 대한 전체 GeneBank^TM 데이타베이스에 의해 제공되는 서열정보를 이용하여, TOM34는 당업계에서 일반적으로 알려진 기술을 이용하여 검색 및 측정된다. 하나의 예로서, TOM34에 대응하는 전체 서열 데이타베이스 내 서열은 예를 들어, 노던 블랏 하이브리드 분석(northern blot hybridization analysis)에서 TOM34를 특이적 증폭하기 위한 프라이머를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 또 다른 예로서, 상기 서열들은 예를 들어, PCR(polymerase chain reaction)을 기초로 하는 역-전사와 같은 증폭-기초로한 탐색에서 TOM34를 특이적으로 증폭하기 위한 프라이머를 제조하기 위해 사용될 수 있다.

환자 유래 조직 시료들과 같은 실험 세포군에서 TOM34의 발현 수준은 참조 세포군에서 TOM34의 발현 수준에 비교되었다. 상기 참조 세포군은 비교되는 매개변수가 알려진 하나 이상의 세포들 즉, CRC 세포 또는 비-CRC 세포들을 포함한다.

참조 세포군에 비교된 실험 세포군에서 유전자 발현의 형태가 CRC 또는 이의 성질을 나타내는지 아닌지는 참조 세포군의 조성물에 의존한다. 예를 들면, 만약 참조 세포군이 비-CRC로 구성되고, 실험 세포군 및 참조 세포군에서 유사한 유전자 발현 형태가 나타난다면, 상기 세포군은 비-CRC이다. 반대로, 만약 참조 세포군은 CRC로 구성되고, 실험 세포군 및 참조 세포군에서 유사한 유전자 발현 형태가 나타난다면, 상기 세포군은 CRC 세포들을 포함한다.

만약 TOM34의 발현 수준이 대응하는 참조 세포군에서 TOM34의 발현 수준 보다 1.0, 1.5, 2.0, 5.0, 10.0 또는 그 이상의 배만큼 참조 세포군으로부터 변화한다면 실험 세포군에서 TOM34의 발현 수준은 변화된 것으로 간주된다.

실험 세포군 및 참조 세포군 사이 차별적인 유전자 발현은 하우스키핑 유전자(housekeeping gene)와 같은 대조군 핵산으로 표준화된다. 예를 들면, 대조군 핵산은 세포의 암 또는 비-암인 상태에 따라 달라지지 않은 것으로 알려진 것이다. 실험 및 참조 핵산에서 대조군 핵산의 발현 수준은 상기 비교된 군에서 표준적인 신호 수준으로 이용될 수 있다. 대조군 유전자들은 베타-액틴(β-actin), 글리세르알데하이드 3-포스페이트 디하이드로제나제(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) 또는 리보좀 단백질 P1(ribosomal protein P1)을 포함한다.

실험 세포군은 다수의 참조 세포군에 비교되었다. 다수의 참조 세포군들은 알려진 매개변수가 각각 다르다. 따라서, 실험 세포군은 예를 들면, 비-CRC 세포들(정상 세포들) 등을 포함하는 것으로 알려진 두 번째 참조 세포군뿐만 아니라 예를 들면, CRC 세포들을 포함하는 것으로 알려진 두 번째 참조 세포군에 비교될 수 있다. 상기 실험 세포는 CRC 세포들을 포함하거나 포함할 수 있는 것으로 알려진 개체로부터 유래한 조직 유형 또는 세포 시료에서 유도된다.

실험 세포는 체조직, 또는 예를 들면 생물학적 유체(혈액 또는 소변 등)와 같은 체액으로부터 수득된다. 예를 들면, 상기 실험 세포는 조직으로부터 정제된다. 바람직하게, 상기 실험 세포군은 상피세포를 포함한다. 상기 상피세포는 CRC로 알려져 있거나 의심되는 조직으로부터 유래된다.

참조 세포군의 세포들은 실험 세포와 유사한 조직 유형으로부터 유래된다. 선택적으로, 상기 참조 세포군은 예를 들면, CRC 세포주(양성 대조군) 또는 비-CRC 세포주(음성 대조군) 등의 세포주이다. 대안으로, 상기 대조군 세포군은 매개변수가 분석되거나 조건이 알려진 세포들로부터 유래된 분자 정보의 데이타베이스로부터 유래된다.

개체는 포유류가 바람직하다. 상기 포유류는 예를 들면, 인간, 비인간 영장류, 마우스, 토끼, 개, 고양이, 말 또는 소 등이 될 수 있다.

본 발명에 기재된 TOM34의 발현은 당업계에 알려진 방법을 이용한 단백질 또는 핵산 수준에서 결정된다. 예를 들면, 서열을 특이적으로 인식하는 프로브를 이용하는 노던 하이브리드 분석(Northern hybridization analysis)은 유전자 발현을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 대안으로, 발현은 예를 들면, TOM34에 특이적인 프라이머를 사용하는 역전사 PCR 분석(reverse-transcription-based PCR assay)을 이용하여 측정된다. 또한, 발현은 본 발명에 기재된 유전자 산물에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 수준 또는 이의 생물학적 활성을 측정함으로써 단백질 수준에서 결정된다. 상기 방법들은 당업계에 잘 알려져 있고, TOM34에 의해 암호화되는 단백질에 대한 항체를 기초로 하는 면역분석 등을 포함한다. 또한, 상기 유전자에 의해 암호화된 단백질의 생물학적 활성은 잘 알려져 있다.

CRC 진단:

본 발명의 문맥에 있어서, CRC는 실험 세포군의 세포들(환자 유래 생물학적 시료 등)로부터 유래한 TOM34의 발현 수준을 측정함으로써 진단된다. 바람직하게, 상기 실험 세포군은 예를 들면, 대장암 조직으로부터 수득된 세포와 같은 상피 세포를 포함한다. 또한, 유전자 발현은 혈액 또는 소변과 같은 다른 체액으로부터 측정될 수 있다. 다른 생물학적 시료들은 단백질 수준을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 진단받은 개체로부터 유래된 혈액 또는 혈청 내 단백질 수준은 면역분석 또는 다른 보편적인 생물학적 분석에 의해 측정될 수 있다.

TOM34의 발현은 실험 세포 또는 생물학적 시료로 결정되고, 분석된 TOM34 와 연관된 정상적인 대조군 발현 수준에 비교된다. 정상적인 대조군 수준은 CRC로부터 고통받지 않는 것으로 알려진 군에서 일반적으로 발견되는 TOM34의 발현 프로파일이다. TOM34의 환자 유래 조직 시료에서 발현 수준의 변화(예를 들면, 증가)는 개체가 CRC로부터 고통받거나 CRC로 진전되는 위험이 있는 것을 나타낸다. 예를 들면, 정상적인 대조군 수준에 비해 실험 세포군에서 TOM34의 발현의 증가는 개체가 CRC로부터 고통받거나 CRC로 진전되는 위험이 있는 것을 나타낸다.

정상적인 대조군 수준에 비해 실험 세포군에서 TOM34의 변화는 CRC로부터 고통받거나 CRC로 진전되는 위험이 있는 것을 나타낸다.

생물학적 시료에서 TOM34의 발현 수준은 TOM34에 대응하는 mRNA 또는 TOM34에 의해 암호화되는 단백질을 정량함으로써 측정될 수 있다. mRNA에 대한 정량 방법들은 당업계에 알려진 기술들이다. 예를 들면, TOM34 mRNA의 수준은 노던 블랏팅(hern blotting) 또는 RT-PCR에 의해 측정될 수 있다. TOM34의 뉴클레오티드 서열들은 알려져 있기 때문에, 당업자는 TOM34을 정량하기 위한 프로브 또는 프라이머를 위한 뉴클레오티드 서열을 고안할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 43 및 서열번호 44의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 TOM34 특이적 프라이머들 세트가 바람직한 프라이머이다.

또한, TOM34의 발현 수준은 TOM34 단백질의 활성 또는 양을 기초로 분석될 수 있다. TOM34 단백질의 활성을 결정하는 방법은 하기에 보여주고 있다. 예를 들면, 면역분석 방법들은 생물학적 물질들에서 단백질들의 결정용으로 유용하다. 특정 생물학적 물질들은 TOM34 유전자가 대장암 환자의 샘플에서 발현되는 한 단백질 또는 이의 활성의 결정을 위한 생물학적 시료로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 대장 조직 시료는 상기 생물학적 시료로서 언급될 수 있다. 그러나, 혈액 및 소변과 같은 체액들은 또한 분석될 수 있다. 한편, 적절한 방법은 분석되는 단백질의 활성에 따르는 TOM34 유전자에 의해 암호화되는 단백질의 활성의 결정을 위해 선택될 수 있다.

생물학적 시료에서 TOM34 유전자의 발현 수준은 측정되고, 정상적인 시료(예를 들면, 질병이 없는 개체로부터 유래한 시료)의 발현 수준과 비교된다. 상기 비교는 유전자의 발현 수준이 정상적인 시료의 발현 수준보다 더 높은 것을 보일 때, 상기 개체는 대장암에 걸린 것으로 판단된다. 정상적인 개체 및 진단받은 개체로부터 유래한 생물학적 시료에서 TOM34 유전자의 발현 수준은 동시에 결정될 수 있다. 대안으로, 발현 수준의 정상적인 범위는 사전에 대조군으로부터 수집된 시료에서 유전자의 발현 수준을 분석함으로써 수득된 결과를 기초로 통계학적 방법에 의해 결정될 수 있다. 개체의 시료를 비교함으로써 수득된 결과는 정상적인 범위와 비교된다: 상기 결과가 정상적인 범위 내에 떨어지지 않을 때, 상기 개체는 대장암에 걸렸거나 대장암으로 진전되는 위험이 있는 것으로 판단된다.

또한, 본 발명은 대장암 진단용 진단제를 제공한다. 본 발명의 진단제는 TOM34 유전자의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드에 결합하는 화합물을 포함한다. 바람직하게, TOM34 유전자의 폴리뉴클레오티드에 하이브리드하는 올리고뉴클레오티드, 또는 TOM34 유전자에 의해 암호화되는 폴리펩티드에 결합하는 항체는 상기 화합물로 사용될 수 있다. 더불어, RNA와 같은 앱타머(aptamer), DNA 또는 펩티드 앱타머 또한 상기 화합물로 사용될 수 있다. 바람직하게, 진단제는 당업계에 일반적으로 알려진 형광(fluorescent), 발광(luminescent) 또는 생물발광(bioluminescent) 표지와 같은 탐지 표지를 포함한다.

본 발명의 대장암을 진단 방법은 개체에 대장암의 치료의 효능을 측정하기 위해 적용될 수 있다. 상기 방법에 의해서, 실험 세포군과 같은 생물학적 시료는 대장암에 대한 치료 중에 있는 개체로부터 수득된다. 측정 방법은 대장암을 진단하는 보편적인 방법들에 따라 수행될 수 있다.

원한다면, 생물학적 시료들은 치료 전, 중 또는 후의 다양한 시점에 개체로부터 수득된다. 생물학적 시료에서, TOM34 유전자의 발현 수준은 결정되고 예를 들면, 대장암 상태(암세포 또는 비-암세포)로 알려진 세포들을 포함하는 참조 세포군으로부터 유래된 대조군 수준에 비교된다. 상기 대조군 수준은 치료받지 않은 생물학적 시료로 결정된다.

만약 상기 대조군 수준이 비-암 세포를 포함하는 생물학적 시료로부터 유래된다면, 생물학적 시료 및 대조군 시료로부터 유래된 개체 내 발현 수준 사이 유사성은 치료가 효능이 있음을 나타낸다. 개체 유래 생물학적 시료 및 대조군 수준에서 TOM34 유전자의 발현 수준 사이 차이는 덜 유리한 임상적 결과 또는 예후를 나타낸다.

TOM34 발현을 억제제 확인:

TOM34의 발현 또는 상기 유전자 산물의 활성 억제제는 실험 물질과 TOM34을 발현하는 실험 세포군을 접촉시킨 후 TOM34의 발현 수준 또는 상기 유전자 산물의 활성을 결정함으로써 확인될 수 있다. 실험 물질 부재시 TOM34의 발현 수준 또는 상기 유전자 산물의 활성 수준에 비해 상기 물질 존재시 TOM34의 발현 수준 또는 상기 유전자 산물의 활성 수준의 감소는 상기 물질이 TOM34의 억제제이고 CRC 억제에 유용하다는 것을 나타낸다.

상기 실험 세포군은 TOM34을 발현하는 특정 세포일 수 있다. 예를 들면, 상기 실험 세포군은 대장 조직으로부터 유래된 세포와 같은 상피세포를 포함할 수 있다. 더불어, 상기 실험 세포는 암세포 또는 직장암 유래 불사화세포주(immortalized cell line)일 수 있다. 대안으로, 상기 실험 세포군은 TOM34로 형질감염되거나, 리포터 유전자에 작동가능하게 연결된(operably linked) TOM34로부터 유래한 조절 서열(예를 들면, 프로모터 서열)로 형질감염된 세포일 수 있다.

개체에서 CRC 치료의 효능 평가:

또한, 본 발명에서 확인된 차별적으로 발현된 TOM34는 CRC 치료의 과정을 모니터할 수 있게 한다. 상기 방법에 있어서, 실험 세포군은 CRC 치료중인 개체로부터 제공된다. 원한다면, 실험 세포군들은 치료 전, 중 및/또는 후의 다양한 시점에서 개체로부터 수득된다. 상기 세포군에서 TOM34의 발현은 결정된 후 CRC 상태로 알려진 세포들을 포함하는 참조 세포군에 비교된다. 본 발명의 문맥에 있어서, 상기 참조 세포군은 해당 치료를 받지 않은 것들이다.

만약 참조 세포군이 CRC 세포들을 포함하지 않는다면, 실험 세포군 및 참조 세포군에서 TOM34 발현의 유사성은 해당 치료가 효과가 있음을 나타낸다. 그러나, 실험 세포군 및 정상적인 대조군 세포군에서 TOM34 발현의 차이는 덜 유리한 임상적 결과 또는 예후를 나타낸다. 유사하게, 만약 참조 세포군이 CRC 세포들을 포함한다면, 실험 세포군 및 참조 세포군에서 TOM34의 발현 사이 차이는 해당 치료가 효과적임을 나타내는 반면에, 실험 세포군 및 참조 세포군에서 TOM34의 발현 사이 유사성은 덜 유리한 임상적 결과 또는 예후를 나타낸다.

추가적으로, 치료 후(치료 후 수준) 수득한 개체 유래 생물학적 시료에서 결정된 TOM34의 발현 수준은 치료 개시 이전(치료 전 수준)에 수득한 개체 유래 생물학적 시료에서 결정된 TOM34의 발현 수준에 비교될 수 있다. 치료 후 샘플에서 TOM34의 발현 수준의 감소는 해당 치료가 효과적임을 나타내는 반면에, 치료 후 시료에서 발현 수준의 증가 또는 유지는 덜 유리한 임상적 결과 또는 예후를 나타낸다.

본 발명에 사용된 용어 "효과적인(efficacious)"은 치료가 병리학적으로 상향조절된 유전자의 발현을 감소시키거나, 개체 내 CRC의 크기, 유병률(prevalence) 또는 전이 잠재성을 감소시킨다. 해당 치료가 병리학적으로 적용될 때, 상기 용어 "효과적인"은 치료가 임상적인 CRC의 증상을 형성하는 것으로부터 CRC 방해 또는 억제하거나, 또는 임상적인 CRC의 증상을 방해, 억제 또는 경감시키는 것을 의미한다. 대장암의 평가는 표준 임상적 프로토콜을 이용하여 수행되어질 수 있다.

추가적으로, "효과있음(efficaciousness)"은 CRC를 진단 또는 치료하기 위한 특정 알려진 방법과 관련하여 결정될 수 있다. CRC는 예를 들면, 체중 감량, 복통, 요통, 식욕감퇴(anorexia), 구역질(nausea), 구토(vomiting) 및 일반화된 불쾌감(malaise), 나약(weakness), 및 황달(jaundice) 등의 증상적인 비정상을 확인함으로써 진단될 수 있다.

특정 개체에게 적합한 CRC 치료용 치료제 선별:

개체별 유전적 구성의 차이들은 다양한 약제들을 대사하는 것에 대한 상대적인 능력의 차이를 야기한다. 항-CRC제로서 활동하기 위해 개체 내 대사되는 약제는 암 상태의 특성으로부터 비-암 상태의 특성까지 개체의 세포들에서 유전자 발현 형태의 변화를 유도함으로써 자체를 증명할 수 있다. 따라서, 본 발명에서 규명된 차별적으로 발현되는 TOM34는 추정되는 CRC의 치료 또는 예방 억제제가 특정 약제가 개체 내 CRC의 적절한 억제제인지 결정하기 위해서 선별된 개체로부터 유래한 실험 세포군에서 테스트하게 한다.

특정 개체에 적절한 CRC의 억제제를 확인하기 위해, 상기 개체 유래 실험 세포군을 치료제에 노출한 후 TOM34의 발현을 결정한다.

본 발명의 방법의 문맥에 있어서, 상기 실험 세포군은 TOM34를 발현하는 CRC 세포를 포함한다. 바람직하게, 상기 실험 세포는 상피세포이다. 예를 들면, 실험 세포군은 후보물질의 존재하에 배양될 수 있고, 실험 세포군의 유전자 발현의 형태는 측정된 후, 예를 들면 CRC 참조 발현 프로파일 또는 비-CRC 참조 발현 프로파일 등과 같은 하나 이상의 참조 프로파일에 비교될 수 있다.

CRC를 포함하는 참조 세포군에 비해 상대적으로 실험 세포군에서 TOM34 발현의 감소는 약제가 치료적 잠재성을 가지고 있음을 나타낸다.

본 발명의 문맥에서, 실험 약제는 특정 화합물 또는 조성물일 수 있다. 바람직한 실험 약제는 면역조절제를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

치료제를 확인하는 스크리닝 분석:

TOM34 유전자, 상기 유전자에 의해 암호화되는 단백질들 또는 상기 유전자의 전사 조절 부위를 이용하여, 화합물들은 상기 유전자의 발현 또는 상기 유전자에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 생물학적 활성을 변화시키는 것을 선별될 수 있다. 상기 선별된 화합물들은 CRC 치료 또는 예방용 약학 물질로서 사용될 수 있다.

그러므로, 본 발명은 TOM34 폴리펩티드를 이용한 CRC 예방 및 치료용 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 본 발명의 스크리닝 방법은 하기의 단계를 포함한다:

a) TOM34의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드와 실험 화합물을 접촉시키는 단계;

b) 상기 폴리펩티드 및 실험 화합물 사이 결합 활성을 검색하는 단계; 및

c) 상기 폴리펩티드에 결합하는 실험 화합물을 선별하는 단계.

상기 스크리닝에 사용되는 TOM34 폴리펩티드는 재조합 폴리펩티드, 또는 본래 또는 이의 부분적 펩티드로부터 유래된 단백질일 수 있다. 실험 화합물과 접촉된 상기 폴리펩티드는 예를 들면, 정제된 폴리펩티드, 가용성 단백질, 담체에 결합된 형태 또는 다른 폴리펩티드들과 융합된 융합 단백질 등일 수 있다.

예를 들면, TOM34 폴리펩티드를 이용하여 TOM34 폴리펩티드에 결합하는 등의 단백질들의 스크리닝 방법으로서, 당업자에게 잘 알려진 방법들이 사용될 수 있다. 상기 스크리닝은 예를 들면, 특히 하기의 방식인 면역침강(immunoprecipitation) 방법에 의해 수행될 수 있다. TOM34 폴리펩티드를 암호화하는 유전자는 pSV2neo, pcDNA I, pcDNA3.1, pCAGGS 및 pCD8과 같은 외래 유전자를 위한 발현 벡터에 상기 유전자를 삽입함으로써 숙주세포(예를 들면, 동물)에서 발현된다. 상기 발현에 사용되는 프로모터(promoter)는 일반적으로 사용될 수 있고, 예를 들면 SV40 조기(early) 프로모터(Rigby in Williamson (ed.), Genetic engineering , vol. 3. Academic Press, London, 83-141, 1981), EF-a 프로모터(Kim DW, et al., Gene 91: 217-23, 1990), CAG 프로모터(Niwa et al., Gene 108: 193-9, 1991), RSV LTR 프로모터(Cullen, Methods in Enzymology 152: 684-704, 1987), SRa 프로모터(Takebe et al., Mol Cell Biol 8: 466-72, 1988), CMV 최조기(immediate early) 프로모터(Seed and Aruffo, Proc Natl Acad Sci USA 84: 3365-9, 1987), SV40 후기(late) 프로모터(Gheysen and Fiers, J Mol Appl Genet 1: 385-94, 1982), 아데노바이러스(Adenovirus) 후기 프로모터(Kaufman et al., Mol Cell Biol 9: 946-58, 1989), HSV TK 프로모터 등을 포함하는 특정 프로모터일 수 있다. 외래 유전자를 발현하는 숙주 세포들 내로 상기 유전자의 삽입은 예를 들면, 전기천공법(electroporation method)(Chu et al., Nucleic Acids Res 15: 1311-26, 1987), 인산칼슘 방법(calcium phosphate method)(Chen and Okayama, Mol Cell Biol 7: 2745-52, 1987), DEAE 덱스트란 방법(dextran method)(Lopata et al., Nucleic Acids Res 12: 5707-17, 1984; Sussman and Milman, Mol Cell Biol 4: 1641-3, 1984), 리포펙틴 방법(Lipofectin method)(Derijard, B Cell 76: 1025-37, 1994; Lamb et al., Nature Genetics 5: 22-30, 1993; Rabindran et al., Science 259: 230-4, 199c) 등을 포함하는 특정 방법에 의해 수행될 수 있다. TOM34 유전자에 의해 암호화되는 폴리펩티드는 특이성이 상기 폴리펩티드의 N- 또는 C- 말단에 나타나는 단클론 항체(monoclonal antibody)의 에피토프(epitope)를 삽입함으로써 단클론 항체의 인지 부위(에피토프)를 포함하는 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 상업적으로 이용가능한 에피토프-항체 시스템이 사용될 수 있다(Experimental Medicine 13: 85-90, 1995). 융합 단백질을 예를 들면, 다중 클로닝 부위(multiple cloning site)들을 이용함으로써 베타-갈락토시다제(β-galactosidase), 말토오즈 결합 단백질(maltose binding protein), 글루타티온 S-트랜스퍼라제(glutathione S-transferase), 녹색 형광 단백질(green florescence protein; GFP) 등으로 발현할 수 있는 벡터는 상업적으로 이용가능하다.

융합에 의해 TOM34 폴리펩티드의 특성이 변화하지 않도록 몇 개 내지 12개의 아미노산으로 구성된 작은 에피토프들만 삽입함으로써 제조된 융합 단백질은 보고되고 있다. 폴리히스티딘(polyhistidine; His-tag), 임플루엔자 응집 HA(influenza aggregate HA), 인간 c-myc, FLAG, 수포성구내염바이러스 당단백질(Vesicular stomatitis virus glycoprotein; VSV-GP), T7 유전자 10 단백질(T7-tag), 인간 단순 포진 바이러스 당단백질(human simple herpes virus glycoprotein; HSV-tag), 단클론 파지의 에피토프(an epitope on monoclonal phage; E-tag) 등과 같은 에피토프들, 및 이들을 인지하는 단클론 항체들은 TOM34 폴리펩티드에 결합하는 단백질을 스크리닝하기 위한 에피토프-항체 시스템으로 사용될 수 있다(Experimental Medicine 13: 85-90, 1995).

면역침강(immunoprecipitation)에서, 면역 복합체(immune complex)는 적절한 세제를 이용하여 제조된 세포 용해물에 이들의 항체를 첨가함으로써 형성된다. 상기 면역 복합체는 TOM34 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드와 결합하는 능력을 포함하는 폴리펩티드, 및 항체로 구성된다. 또한, 면역침강은 상기와 같이 제조될 수 있는 에피토프에 대한 항체 외에, TOM34 폴리펩티드에 대한 항체들을 이용하여 수행될 수 있다.

면역 복합체는 항체가 마우스 IgG 항체일 때, 단백질 A 세파로즈(sepharose) 또는 단백질 G 세파로즈에 의해 촉진될 수 있다. 만약 TOM34 유전자에 의해 암호화되는 폴리펩티드가 GST와 같은 에피토프를 포함하는 융합 단백질로 제조된다면, 면역 복합체는 글루타티온-세파로오즈 4B(glutathione-Sepharose 4B)와 같은, 에피토프들에 특이적으로 결합하는 물질을 이용하여, TOM34 폴리펩티드에 대한 항체의 사용에서 같은 방식으로 형성될 수 있다.

면역침강은 예를 들면, 문헌에 있는 방법에 의해 수행될 수 있다(Harlow and Lane, Antibodies , 511-52, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York, 1988).

SDS-PAGE는 면역침강된 단백질들의 분석에 일반적으로 사용되고, 결합된 단백질은 적합한 농도의 겔(gel)을 이용하여 단백질의 분자량에 의해 분석될 수 있다. TOM34 폴리펩티드에 결합된 단백질은 쿠마시 염색(Coomassie staining) 또는 은염색(silver staining)과 같은 일반적인 염색 방법으로 탐지하기 어렵기 때문에, 상기 단백질용 탐지 민감성은 ³⁵S-메티오닌(methionine) 또는 ³⁵S-시스테인(cystein)과 같은 방사성 동위원소(radioactive isotope)를 포함하는 배양 배지에 세포를 배양, 세포 내 단백질을 표지, 및 단백질을 탐지함으로써 향상될 수 있다. 표적 단백질은 SDS-폴리아크릴아마이드 겔(polyacrylamide gel)로부터 직접 정제될 수 있고, 이의 서열은 단백질의 분자량을 규명할 때 결정될 수 있다.

TOM34 폴리펩티드에 결합하는 단백질을 스크리닝하는 방법으로서, 예를 들면 웨스트-웨스턴 블랏 분석(West-Western blotting analysis)(Skolnik et al., Cell 65: 83-90, 1991)이 사용될 수 있다. 특히, TOM34 폴리펩티드에 결합하는 단백질은 세포들, 조직들, 기관들(예를 들면, 정소 또는 난소와 같은 조직), 또는 LB-아가로즈(agarose)에서 단백질을 발현하고, 필터로 발현된 단백질을 고정하며, 상기 필터와 정제 및 표지된 TOM34 폴리펩티드를 반응하며, 표지에 의해 TOM34 폴리펩티드에 결합된 단백질을 발현하는 플라큐(plaque)들을 탐지하는 파지 벡터(phage vector)(예를 들면, ZAP)를 이용하여 TOM34 폴리펩티드에 결합하는 단백질을 발현시키는 것으로 기대되는 배양 세포(예를 들면, CW2, DLD1, HCT116, HCT15, RKO, LS174T)로부터 cDNA 라이브러리를 제조함으로써 수득될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 비오틴(biotin) 및 아비딘(avidin) 사이 결합을 이용함으로써, 또는 TOM34 폴리펩티드, 또는 TOM34 폴리펩티드에 융합되는 펩티드 또는 폴리펩티드(예를 들면, GST)에 특이적으로 결합하는 항체를 이용함으로써 표지될 수 있다. 또한, 방사성 동위원소 또는 형광을 이용한 방법들이 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 스크리닝 방법에 있어서, 세포들을 이용하는 투-하이브리드 시스템(two-hybrid system)이 이용될 수 있다("MATCHMAKER Two-Hybrid system", "MATCHMAKER Mammalian Two-Hybrid Assay Kit", "MATCHMAKER one-Hybrid system"(Clontech); "HybriZAP Two-Hybrid Vector System"(Stratagene); 참고문헌 Dalton and Treisman, Cell 68: 597-612, 1992; Fields and Sternglanz, Trends Genet 10: 286-92, 1994).

투-하이브리드 시스템에서, 본 발명의 폴리펩티드는 SRF-결합 부위(SRF-binding region) 또는 GAL4-결합 부위(GAL4-binding region)에 융합되고 효모 세포들에서 발현되는 것이다. cDNA 라이브러리는 본 발명의 폴리펩티드에 결합하는 단백질을 발현하는 것으로 기대되는 세포들로부터 제조되고, 발현될 때 상기 라이브러리는 VP16 또는 GAL4 전사 활성 부위에 융합된다. cDNA 라이브러리는 효모 세포 내로 삽입되고 상기 라이브러리로부터 유래된 cDNA는 탐지된 양성 클론들로부터 분리된다(본 발명의 폴리펩티드에 결합하는 단백질이 효모 세포들에서 발현될 때, 두 개의 결합은 탐지가능한 양성 클론들을 만드는 리포터 유전자를 활성화시킨다). cDNA에 의해 암호화되는 단백질은 상기 분리된 cDNA를 대장균(E. coli)에 삽입한 후 단백질을 발현함으로써 제조될 수 있다.

리포터 유전자는 예를 들면, Ade2 유전자, lacZ 유전자, CAT 유전자, 루시퍼라제(luciferase) 유전자 등은 HIS3 유전자에 첨가하여 사용될 수 있다.

또한, TOM34 유전자에 의해 암호화되는 폴리펩티드에 결합하는 화합물은 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)를 이용하여 선별될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 폴리펩티드는 친화성 컬럼의 담체에 고정된 후, 본 발명의 폴리펩티드에 결합할 수 있는 단백질을 포함하는 실험 화합물을 상기 컬럼에 사용되었다. 본 발명의 실험 화합물은 예를 들면, 세포 추출물, 세포 용해물 등일 수 있다. 실험 화합물을 적재(loading)한 후 상기 컬럼을 세척하여, 본 발명의 폴리펩티드에 결합된 화합물을 제조할 수 있다.

실험 화합물이 단백질일 때, 수득된 단백질의 아미노산 서열은 분석되고, 올리고 DNA는 서열을 기초로 합성되고, cDNA 라이브러리들은 단백질을 암호화하는 DNA를 수득하기 위해 프로브로서 올리고 DNA를 사용하여 선별된다.

표면 플라즈몬 공명 현상(surface plasmon resonance phenomenon)을 이용한 바이오센서(biosensor)는 본 발명에서 결합된 화합물을 탐지 또는 정량하기 위한 수단으로 사용될 수 있다. 상기 바이오센서가 사용될 때, 본 발명의 폴리펩티드와 실험 화합물 사이 상호작용은 표지 없이 폴리펩티드의 일분양(a minute amount)만을 이용한 표면 플라즈몬 공명 시그날(signal)로서 실시간 관찰될 수 있다(예를 들면, BIAcore, Pharmacia). 그러므로, BIAcore 등의 바이오센서를 이용하여 본 발명의 폴리펩티드와 실험 화합물 사이 결합을 측정하는 것이 가능하다.

고정된 TOM34 폴리펩티드가 합성 화학적 화합물에 노출되었을 때 결합하는 분자들, 또는 본래의 물질 집적(nature substance bank) 또는 무작위 파지 펩티드 정렬 라이브러리(random phage peptide display library)를 스크리닝하는 방법들, 및 단백질뿐만 아니라 TOM34 단백질에 결합하는 화학적 화합물들(작용제(agonist) 및 길항제(antagonist)를 포함하는)을 분리하기 위한 조합적인 화학 기술들을 기초로 하는 고-처리를 이용한 스크리닝 방법들(Wrighton et al., Science 273: 458-64 (1996); Verdine, Nature 384: 11-13 (1996); Hogan, Nature 384: 17-9 (1996))은 당업자에게 잘 알려져 있다.

또한, 본 발명은 하기와 같은 단계를 포함하는 TOM34 유전자에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 이용한 CRC 치료 또는 예방용 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공한다:

a) TOM34의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드와 실험 화합물을 접촉시키는 단계;

b) 단계 a)의 폴리펩티드의 생물학적 활성을 검색하는 단계; 및

c) 실험 화합물이 결핍된 상태에서 검출된 폴리펩티드의 생물학적 활성에 비해 TOM34의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 생물학적 활성을 억제하는 실험 화합물을 선별하는 단계.

TOM34 단백질은 CRC 세포들의 세포 증식을 촉진하는 활성을 가지고 있기 때문에, 상기 단백질의 활성을 억제하는 화합물은 지표(index)로서 상기 활성을 이용하여 선별될 수 있다.

특정 폴리펩티드들은 인간 TOM34 단백질의 생물학적 활성을 포함하는 한 스크리닝될 수 있다. 상기 생물학적 활성은 인간 TOM34 단백질의 세포-증식 활성을 포함한다. 예를 들면, 인간 TOM34 단백질이 사용될 수 있고, 상기 단백질에 기능적으로 동등한 폴리펩티드들 또한 사용될 수 있다. 상기 폴리펩티드들은 세포들에 의해 내생적 또는 외생적으로 발현될 수 있다.

상기 스크리닝에 의해 분리된 화합물은 TOM34 유전자에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 작용제 또는 길항제의 후보물질이다. 상기 용어 "작용제(agonist)"는 상기 폴리펩티드에 결합함으로써 이의 기능을 활성화하는 분자들을 의미한다. 유사하게, 상기 용어 "길항제(antagonist)"는 상기 폴리펩티드에 결합함으로써 이의 기능을 억제하는 분자들을 의미한다. 더불어, 상기 스크리닝에 의해 분리되는 화합물은 생체 내 TOM34 폴리펩티드와 분자들(DNA들 및 단백질을 포함하는)의 상호작용을 억제하는 화합물의 후보물질이다.

본 발명의 방법에서 검출된 생물학적 활성이 세포 증식일 때, 이것은 예를 들면 TOM34 폴리펩티드를 발현하는 세포를 제조하고, 실험 화합물이 존재하는 곳에 상기 세포를 배양한 후, 실시예에 기재된 바와 같이 콜로니 형성 활성을 측정하는 것뿐만 아니라 세포 주기를 측정함으로써 세포 증식의 속력을 결정함으로써 검출될 수 있다.

또한, 본 발명은 CRC의 치료 또는 예방용 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 상기 상세하게 설명된 바와 같이, TOM34의 발현 수준을 조절함으로써, CRC의 개시 및 진행을 조절할 수 있다. 따라서, CRC의 치료 또는 예방에 사용되는 화합물들은 지표로서 TOM34의 발현 수준을 이용하여 스크리닝함으로써 확인될 수 있다. 본 발명의 문맥에서, 상기 스크리닝은 예를 들면, 하기의 단계를 포함할 수 있다:

a) TOM34을 발현하는 세포와 후보 화합물을 접촉시키는 단계; 및

b) 실험 화합물이 결핍된 상태에서 검출된 TOM34의 발현 수준에 비해 TOM34의 발현 수준을 감소시키는 후보 화합물을 선별하는 단계.

TOM34을 발현하는 세포들은 예를 들면, 본 발명의 상기 스크리닝에 사용될 수 있는 CRC로부터 확립된 세포주(CW2, DLD1, HCT116, RKO, LS174T 등)를 포함한다. 상기 발현 수준은 당업자에 잘 알려진 방법으로 측정될 수 있다. 스크리닝 방법에 있어서, TOM34의 발현 수준을 감소시키는 화합물은 CRC의 치료 또는 예방용 후보 약제로서 선별될 수 있다.

또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 스크리닝 방법을 제공한다:

a) 전사조절부위의 통제하에 발현된 리포터 유전자(reporter gene) 및 TOM34의 전사조절부위(transcriptional regulatory region)를 포함하는 벡터가 삽입된 세포와 후보 화합물을 접촉시키는 단계;

b) 리포터 유전자의 발현 또는 활성을 측정하는 단계; 및

c) 리포터 유전자의 발현 또는 활성을 감소시키는 후보 화합물을 선별하는 단계.

적합한 리포터 유전자들 및 숙주 세포들은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 스크리닝용으로 요구되는 리포터 구성체는 마커 유전자의 전사조절부위를 사용함으로써 제조될 수 있다. 상기 마커 유전자의 전사조절부위가 당업자에게 알려질 땐, 리포터 구성체는 이전 서열 정보를 사용함으로써 제조될 수 있다. 마커 유전자의 전사조절부위가 규명되지 않을 땐, 전사조절부위를 포함하는 뉴클레오티드 단편은 마커 유전자의 뉴클레오티드 서열을 기초로 하는 게놈 라이브러리(genome library)로부터 분리될 수 있다.

결합 단백질을 위해 사용되는 지지체(support)의 예들은 아가로즈(agarose), 셀룰로즈(cellulose) 및 덱스트란(dextran) 등의 비가용성 폴리사카라이드(polysaccharide); 및 포리아크릴아마이드(polyacrylamide), 폴리스틸렌(polystyrene) 및 실리콘(silicon) 등의 합성수지(synthetic resin)를 포함한다; 바람직하게 상기 물질들로부터 제조된 상업적으로 이용가능한 비드(bead) 및 플레이트(plate)(예를 들면, 다중-웰 플레이트(multi-well plates), 바이오센서 칩(biosensor chip) 등)가 사용될 수 있다. 비드를 사용할 땐, 이들은 컬럼(column)으로 채워질 수 있다.

지지체에 대한 단백질의 결합은 화학적 결합 및 물리적 흡착 등의 일반적인 방법들에 의해 수행될 수 있다. 또한, 단백질은 단백질을 특이적으로 인지하는 항체에 의하여 지지체에 결합될 수 있다. 또한, 지지체에 대한 단백질의 결합은 아비딘(avidin) 및 비오틴(biotin)에 의해 수행될 수 있다.

상기 단백질 사이 결합은 완충용액이 단백질 사이 결합을 억제하지 않는 한, 예를 들면, 인산 완충용액(phosphate buffer) 및 트리스 완충용액(Tris buffer)이 있으나 이에 한정되지 않는 완충용액에서 수행된다.

본 발명에 있어서, 표면 플라즈몬 공명 현상(surface plasmon resonance phenomenon)을 이용한 바이오센서(biosensor)는 결합된 단백질을 탐지 또는 정량하기 위한 수단으로 사용될 수 있다. 상기 바이오센서가 사용될 때, 단백질들 사이 상호작용은 표지 없이 일 분양의 폴리펩티드만을 사용하여 표면 플라즈몬 공명 현상 시그널(signal)로서 실시간 관찰될 수 있다(예를 들면, BIAcore, Pharmacia).

또한, TOM34 폴리펩티드는 표지될 수 있고, 상기 결합된 단백질의 표지는 결합된 단백질을 탐지 또는 측정되기 위해 사용될 수 있다. 특히, 단백질 중 하나를 미리 표지하고, 상기 표지된 단백질이 실험 화합물의 존재 하에 다른 단백질과 접촉한 후, 결합된 단백질은 세척 후 표지에 의해 탐지 또는 측정된다.

방사성 동위원소(radioisotope)(예를 들면, ³H, ¹⁴C, ³²P, ³³P, ³⁵S, ¹²⁵I, ¹³¹I), 효소들(예를 들면, 알카라인 포스파타제(alkaline phosphatase), 호세라디쉬 퍼록시다제(horseradish peroxidase), 베타-갈락토시다제(β-galactosidase), 베타-글루코시다제(β-glucosidase)), 형광물질들(예를 들면, 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiosyanete; FITC), 로다민(rhodamine)) 및 비오틴(biotin)/아비딘(avidin) 등과 같은 표지 물질들은 본 발명의 방법에 있어서 단백질을 표지하기 위해 사용될 수 있다. 상기 단백질이 방사성 동위원소로 표지화될 때, 탐지 또는 측정은 액체 섬광(liquid scintillation)에 의해 수행될 수 있다. 또한, 효소들로 표지화된 단백질들은 흡수계(absorptiometer)로 색의 발생과 같은 기질의 효소적 변화를 탐지하기 위해 기질에 효소를 첨가함으로써 탐지 또는 측정될 수 있다. 또한, 형광물질이 표지로서 이용되는 경우, 결합된 단백질은 형광광도계(fluorophotometer)를 이용하여 탐지 또는 측정될 수 있다.

본 발명의 스크리닝에 있어서 항체를 사용하는 경우, 항체는 상기 언급된 표지물질 중 어느 하나로 표지되는 것이 바람직하고, 표지물질을 기초로 하여 탐지 또는 측정된다. 또한, TOM34 폴리펩티드 또는 액틴(actin)에 대한 항체는 표지물질로 표지화되는 2차 항체로 탐지되는 1차 항체로서 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 스크리닝에 있어서 단백질에 결합된 항체는 단백질 G 또는 단백질 A 컬럼을 이용하여 탐지 또는 측정될 수 있다.

또한, 본 발명의 스크리닝 방법에 있어서, 세포들을 이용하는 투-하이브리드 시스템(two-hybrid system)이 이용될 수 있다("MATCHMAKER Two-Hybrid system", "MATCHMAKER Mammalian Two-Hybrid Assay Kit", "MATCHMAKER one-Hybrid system"(Clontech); "HybriZAP Two-Hybrid Vector System"(Stratagene); 참고문헌 Dalton and Treisman, Cell 68: 597-612, 1992; Fields and Sternglanz, Trends Genet 10: 286-92, 1994).

투-하이브리드 시스템에서, 본 발명의 TOM34 폴리펩티드는 SRF-결합 부위(SRF-binding region) 또는 GAL4-결합 부위(GAL4-binding region)에 융합되고 효모 세포들에서 발현되는 것이다.

리포터 유전자는 예를 들면, Ade2 유전자, lacZ 유전자, CAT 유전자, 루시퍼라제(luciferase) 유전자 등은 HIS3 유전자에 첨가하여 사용될 수 있다.

실험 화합물인 예를 들면, 세포 추출물, 세포 배양 상청액, 식물 추출물, 정제되거나 정제되지 않은 단백질들, 펩티드들, 비-펩티드 화합물들, 합성 미분자 화합물들 및 자연 화합물들은 본 발명의 스크리닝 방법에 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 실험 화합물은 당업계에 알려진 (1) 생물학적 라이브러리들, (2) 공간적으로 주소화 병렬 고체상(spatially addressable parallel solid phase) 또는 용액상(solution phase) 라이브러리, (3) 디컨볼루션(deconvolution)을 요구하는 합성 라이브러리 방법, (4) "하나의 비드 하나의 화합물(one-bead one-compound)" 라이브러리 방법 및 (5) 친화성 크로마토그래피 선별을 이용한 생물학적 라이브러리 방법을 포함하는 조합적인 라이브러리 방법(combinatorial library method)들의 수적 접근들 중 어느 하나를 이용하여 수득될 수 있다. 상기 친화성 크로마토그래피 선별을 이용한 생물학적 라이브러리 방법은, 다른 네 개의 접근들이 펩티드, 비-펩티드 올리고머(oligomer) 또는 화합물의 작은 분자 라이브러리에 적용가능한 반면에 펩티드 라이브러리에 한정된다(Lam, Anticancer Drug Des. 12: 145-67, 1997). 분자 라이브러리들의 합성 방법의 예들은 당업계에서 찾을 수 있다(DeWitt et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90: 6909-13, 1993; Erb et al., Proc . Natl . Acad . Sci. USA 91: 11422-6, 1994; Zuckermann et al., J. Med . Chem . 37: 2678-85, 1994; Cho et al., Science 261: 1303-5, 1993; Carell et al., Angew . Chem . Int . Ed . Engl. 33: 2059, 1994; Carell et al., Angew . Chem . Int . Ed . Engl. 33: 2061, 1994; Gallop et al., J. Med. Chem . 37: 1233-51, 1994). 화합물들의 라이브러리들은 용액(Houghten, Bio/Techniques 13: 412-21, 1992)에, 또는 비드(bead)들(Lam, Nature 354: 82-4, 1991), 칩(chip)들(Fodor, Nature 364: 555-6, 1993), 박테리아(미국특허번호 제 5,223,409호), 포자(spore)들(미국특허번호 제 5,571,698호; 제 5,403,484호, 및 제 5,223,409호), 플라스미드(plasmid)들(Cull et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 89: 1865-9, 199b) 또는 파지(phage)(Scott and Smith, Science 249: 386-90, 1990; Devlin, Science 249: 404-6, 1990; Cwirla et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 87: 6378-82, 1990; Felici, J. Mol . Biol . 222: 301-10, 1991; 미국특허출원번호 제 2002103360호)로 존재할 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법에 의해 분리된 화합물은 예를 들면, CRC와 같은 세포 증식 질병들을 치료 또는 예방하기 위한, TOM34 폴리펩티드의 활성을 억제하는 후보 약제이다. 본 발명의 스크리닝 방법으로 수득된 화합물의 구조의 일부가 첨가, 결실 및/또는 대체에 의해 전환된 화합물은 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 수득한 화합물에 포함된다.

CRC 치료 또는 예방용 약학적 조성물

인간, 또는 마우스, 랫트, 기니아-피그(guinea-pig), 토끼, 고양이, 개, 양, 돼지, 소, 원숭이, 개코원숭이 및 침팬지와 같은 다른 동물을 위한 약학적 용도로서 본 발명의 방법에 의해 분리된 화합물을 투여할 때, 상기 분리된 화합물은 직접 투여되거나 알려진 약학적 제조방법을 이용한 투약 형태로 제형될 수 있다. 예를 들면, 필요에 따라, 상기 약제는 당-코팅 알약, 캡슐, 엘릭시르 및 마이크로캡슐 등으로 경구로 투여되거나, 살균 용액 또는 물 또는 다른 약학적으로 허용가능한 액체로 현탁액 등의 주사 형태로 비경구로 투여될 수 있다. 예를 들면, 상기 화합물들은 약학적으로 허용가능한 담체 또는 매개물, 특히 살균수, 생리적 식염수, 식물유, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정제, 착향료, 첨가제, 부형제, 보존제, 결합제 등이 일반적으로 허용되는 약제 실행을 위해 요구되는 단위 투약 형태로 혼합될 수 있다. 제조에 포함되는 활성 성분의 양은 허용되는 지시된 범위 내에서 적절한 투약량이 된다.

알약 및 갭슐 내로 혼합될 수 있는 첨가물은 젤라틴(gelatin), 옥수수 전분(corn starch), 트래거캔스 검(tragacanth gum) 및 아라비아 검(arabic gum) 등의 결합제; 크리스탈린 셀룰로즈(crystalline cellulose) 등의 첨가제; 옥수수 전분(corn starch), 젤라틴(gelatin) 및 알긴산(alginic acid) 등의 팽윤제; 스테아린산 마그네슘(magnesium stearate) 등의 윤활제; 슈크로즈(sucrose), 락토오즈(lactose) 또는 사카린(saccharin) 등의 감미료; 페퍼민트(peppermint), 가울테리아 아데노트릭스 오일(Gaultheria adenothrix oil) 및 체리(cherry) 등의 착향료를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 단위-투약 형태가 캡슐일 때, 오일과 같은 액체 담체가 상기 성분에 추가적으로 포함될 수 있다. 주사용 살균 조성물은 주사용으로 적합한 희석수와 같은 담체를 이용하여 일반적인 약제 실행을 따라서 제형될 수 있다.

*생리적 식염수, 당, 및 디-솔비톨(D-sorbitol), 디-만노오즈(D-mannnose), 디-만니톨(D-mannitol) 및 염화나트륨(sodium chloride) 등의 보조제를 포함하는 등장액은 주사용 수용액으로 사용될 수 있다. 이들은 예를 들면, 에탄올; 프로필렌 글리콜(propylene glycol) 및 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol) 등의 폴리알코올(polyalcohol) 등의 적절한 가용화제; 및 폴리솔베이트(Polysorbate) 80(TM) 및 HCO-50 등의 비-이온 계면활성제와 함께 사용될 수 있다.

참기름 또는 대두유는 유성액(oleaginous liquid)으로 사용될 수 있고, 가용화제로서 벤질 벤조에이트(benzyl benzoate) 또는 벤질 알코올(benzyl alcohol)과 함께 사용될 수 있으며, 인산 완충용액(phosphate buffer) 및 아세트산 나트륨 완충용액(sodium acetate buffer) 등의 완충용액; 염산 프로카인(procaine hydrochloride) 등의 진통제; 벤질 알코올(benzyl alcohol) 및 페놀(phenol) 등의 안정제; 및/또는 항-산화제(anti-oxidant)와 함께 제형화될 수 있다. 제조된 주사제는 적합한 앰풀(ampoule) 내로 채워질 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 예를 들면, 동맥(intraarterial) 주사, 정맥(intravenous) 주사 또는 경피(percutaneous) 주사, 또는 비강 내(intranasal) 투여, 경기관지(transbronchial) 투여, 근육 내(intramuscular) 투여 또는 경구(oral) 투여 등의 당업자에게 잘 알려진 방법들로 환자들에게 투여하기 위해 사용될 수 있다. 환자의 체중 및 나이, 및 투여 방법에 따라 투약량 및 투약 방법은 다르나 당업자는 적절한 투여 방법을 일반적으로 선택할 수 있다. 만약 상기 화합물이 DNA에 의해 암호화될 수 있으면, 상기 DNA는 유전자 치료를 위해 벡터 내로 삽입되고, 상기 벡터가 치료를 수행하기 위해 환자에게 투여된다. 투약량 및 투여방법은 환자의 체중, 나이 및 증상에 따라 다르나 당업자는 이를 적절하게 선택할 수 있다.

예를 들면, 본 발명의 단백질에 결합하고 이의 활성을 조절하는 화합물의 투약량은 증상에 의존함에도 불구하고, 상기 투약량은 정상적인 성인(체중 60 kg)에게 경구로 투약할 때, 일반적으로 하루 당 약 0.1 mg 내지 약 100 mg이고, 바람직하게 하루 당 약 1.0 mg 내지 약 50 mg이고, 더 바람직하게 하루 당 약 1.0 mg 내지 약 20 mg이다.

정상적인 성인(체중 60 kg)에게 비경구로 상기 화합물을 투여할 때, 환자, 표적 기관, 증상 및 방법들에 따라 일부 차이가 있음에도 불구하고, 하루 당 약 0.01 mg 내지 약 30 mg이고, 바람직하게 하루 당 약 0.1 mg 내지 약 20 mg이고, 더 바람직하게 하루 당 약 0.1 mg 내지 약 10 mg으로 정맥 내 주사하는 것이 바람직하다. 다른 동물의 경우에 있어서, 적절한 투약량은 체중 60 kg에 대한 변환에 의해 일반적으로 계산될 수 있다.

CRC 를 가지는 개체의 진단 평가:

또한, 본 발명은 실험 세포군에서 TOM34의 발현을 질병 단계의 범위 내 환자로부터 유래한 참조 세포군에서 TOM34의 발현에 비교하는 단계를 포함하는 CRC를 가지는 개체의 진단을 평가하는 방법을 제공한다. 실험 세포군 및 참조 세포군에서 TOM34의 유전자 발현을 비교하거나, 개체로부터 유래한 실험 세포군에서 유전자 과발현의 형태를 비교함으로써 개체의 진단이 평가될 수 있다.

예를 들면, 정상적인 대조군에 비해 TOM34의 발현의 증가는 덜 유리한 진단을 나타낸다. 반대로, 정상적인 대조군에 비해 TOM34의 발현의 유사성은 개체에 대한 더 유리한 진단을 나타낸다.

키트 ( Kit ):

또한, 본 발명은 예를 들면, TOM34 핵산의 일부분에 상보적인 올리고뉴클레오티드 서열, 또는 TOM34 핵산에 의해 암호화되는 단백질에 결합하는 항체, 또는 앱타머(aptamer)와 같은 TOM34 핵산에 특이적으로 결합하거나 확인하는 핵산 등의 CRC-탐지 시약을 포함한다. 상기 탐지 시약은 키트의 형태로 함께 패키지(package)될 수 있다. 예를 들면, 상기 탐지 시약인 핵산 또는 항체(고체 매트릭스에 결합되거나 상기 매트릭스에 결합하는 시약들이 개별적으로 패키지된 것 중 어느 하나), 대조군 시약(양성 및/또는 음성), 및/또는 탐지 표지 등은 개별 용기에 패키지될 수 있다. 또한, 분석을 수행하기 위한 설명서(예를 들면, 서면, 테이프, VCR, CD-ROM 등)는 키트에 포함될 수 있다. 상기 키트의 분석 구성은 당업계에 알려진 노던 하이브리드(Northern hybridization) 또는 샌드위치(sandwich) ELISA일 수 있다.

예를 들면, CRC 탐지 시약은 적어도 하나의 CRC 탐지 부위에서 형성하는 다공성 조각(porous strip)과 같은 고체 매트릭스에 고정될 수 있다. 상기 다공성 조각의 측정 또는 탐지 부위는 핵산을 포함하는 다수의 각 부위들을 포함할 수 있다. 또한, 실험 조각은 음성 및/또는 양성 대조군을 위한 부위들을 포함할 수 있다. 또한, 대조군 부위들은 실험 조각들로부터 분리된 조각에 위치될 수 있다. 선택적으로, 다른 대조군 탐지 부위들은 예를 들면, 첫 번째 탐지 부위는 높은 양이고 그 다음 부위는 더 낮은 양과 같이 고정된 핵산들의 다양한 양을 포함할 수 있다. 실험 시료의 첨가하는 즉시, 탐지 가능한 시그널을 나타내는 부위의 수는 시료에서 CRC 존재의 양을 정략적인 표시를 제공한다. 상기 탐지 부위들은 적절하게 탐지가능한 모양으로 배열될 수 있고, 일반적으로 실험 조각의 폭을 막대(bar) 또는 점(dot)의 형태로 배열될 수 있다.

CRC 억제 방법:

또한, 본 발명은 TOM34의 발현(또는 상기 유전자 산물의 활성)을 감소시킴으로써 개체 내 CRC의 증상을 치료 또는 완화하는 방법을 제공한다. 적절한 치료 화합물들은 CRC로부터 고통받거나 CRC로 진전되는 위험이 있는 개체에 예방적 또는 치료적으로 투여될 수 있다. 상기 개체들은 표준 임상적 방법들을 이용하거나 TOM34의 비정상적인 발현 수준 또는 상기 유전자 산물의 비정상적인 활성을 탐지함으로써 확인될 수 있다. 본 발명의 문맥에서, 적절한 치료제는 예를 들면, 세포주기 조절 및 세포증식의 억제제를 포함한다.

또한, 본 발명의 치료적 방법은 대장암 세포들에서 발현이 비정상적으로 증가되는 TOM34("상향조절된(up-regulated)" 또는 "과발현된(over-expressed)" 유전자)의 유전자 산물의 발현, 기능 또는 둘 모두를 감소시키는 단계를 포함할 수 있다. 발현은 당업계에 알려진 여러 방법들 중 어느 하나로 억제될 수 있다. 예를 들면, 발현은 과발현되는 유전자를 방해하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotide) 또는 작은 간섭 RNA(small interfering RNA)와 같은 과발현되는 유전자의 발현을 억제 또는 상쇄하는 핵산을 개체 내 투여함으로써 억제될 수 있다.

물론, 본 발명의 치료 또는 완화 방법은 개체 내 대장암을 치료 또는 완화용 약학적 조성물을 제조하기 위해 본 발명의 TOM34의 발현(또는 상기 유전자 산물의 활성)을 감소시키는 화합물의 사용에 대해 필요한 변경을 가할 수 있다.

안티센스 핵산 및 siRNA :

상기 기재된 바와 같이, TOM34의 뉴클레오티드 서열에 대응하는 안티센스 핵산은 상기 유전자의 발현 수준을 감소시키기는 것으로 사용될 수 있다. CRC에서 상향조절된 TOM34에 대응하는 안티센스 핵산들은 CRC의 치료용으로 사용될 수 있다. 특히, 본 발명의 안티센스 핵산들은 TOM34 또는 이에 대응하는 mRNA들의 뉴클레오티드 서열에 결합함으로써, 상기 유전자들의 전사 또는 번역을 억제, mRNA들의 분해를 촉진, 및/또는 TOM34에 의해 암호화되는 단백질의 발현 및 상기 단백질의 기능을 억제하는 활동을 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 용어 "안티센스 핵산(antisense nucleic acids)"은 상기 안티센스 핵산이 표적 서열에 특이적으로 하이브리드할 수 있는 한, 표적 서열에 전체적으로 상보적인 뉴클레오티드들 및 하나 이상의 뉴클레오티드에서 짝이 맞지 않은 뉴클레오티드들을 모두 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 안티센스 핵산은 적어도 15개의 연속적인 뉴클레오티드들의 길이에 있어서 적어도 70% 또는 그 이상의 상동성, 바람직하게 적어도 80% 또는 그 이상의 상동성, 더 바람직하게 적어도 90% 또는 그 이상의 상동성, 더욱 더 바람직하게 적어도 95% 또는 그 이상의 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드들을 포함한다. 당업계에 알려진 알고리즘은 상동성을 결정하는 것으로 사용될 수 있다.

본 발명의 안티센스 핵산은 TOM34에 의해 암호화되는 단백질을 생산하는 세포에서 상기 단백질을 암호화하는 DNA 또는 mRNA에 결합함으로써, 이들의 전사 또는 번역을 억제, mRNA들의 분해를 촉진, 및/또는 상기 단백질의 발현 및 상기 단백질의 기능을 억제하는 활동을 한다.

본 발명의 안티센스 핵산은 상기 핵산에 대하여 비활성인 적절한 함유제(base material)로 혼합한 바르는 약(liniment) 또는 습포제(poultice)와 같은 외용제로 제조될 수 있다.

또한, 필요에 따라, 본 발명의 안티센스 핵산은 첨가제, 등장제(isotonic agent), 가용제, 안정제, 보존제, 진통제 및 이와 유사한 물질을 첨가함으로써 정제, 분말제, 미립제, 캡슐제, 리포좀 캡슐제, 주사제, 용액제, 점비제 및 동결건조제로 제형화될 수 있다. 이들은 하기 알려진 방법들에 의해 제조될 수 있다.

본 발명의 안티센스 핵산들은 질병 부위에 도달하기 위해 질병 부위에 직접 적용 또는 혈관으로 주사함으로써 제공될 수 있다. 또한, 안티센스 축적 배양액은 내구성 및 막 투과성을 증가하기 위해 사용될 수 있다. 상기 배양액은 리포좀(liposomes), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine), 지질(lipids), 콜레스테롤(cholesterol), 리포펙틴(lipofectine) 또는 이의 유도체들을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 안티센스 핵산 유도체의 투약량은 환자의 조건 및 요구되는 양에 따라 적절하게 적용될 수 있다. 예를 들면, 0.1 내지 100 mg/kg, 바람직하게 0.1 내지 50 mg/kg의 투약량이 투여될 수 있다.

본 발명의 안티센스 핵산들은 본 발명의 단백질의 발현을 억제하여 상기 단백질의 생물학적 활성을 억제하는 것으로 이용할 수 있다. 더불어, 본 발명의 안티센스 핵산을 포함하는 발현-억제제들은 본 발명의 단백질의 생물학적 활성을 억제할 수 있는 것으로 이용할 수 있다.

표적 세포에서 TOM34에 대응하는 전사물에 siRNA의 결합은 세포에 의한 단백질 생산에서 감소시키는 결과를 야기한다. 상기 올리고뉴클레오티드의 길이는 적어도 10개의 뉴클레오티드이고 자연-발생적 전사물과 유사한 길이가 될 수 있다. 바람직하게, 상기 올리고뉴클레오티드는 75, 50, 25개의 뉴클레오티드 길이보다 더 짧고, 더 바람직하게, 상기 올리고뉴클레오티드는 19 내지 25개의 뉴클레오티드 길이보다 더 짧은 것이다.

본 발명의 안티센스 핵산들은 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 예를 들면, 티오화된(thioated) 올리고뉴클레오티드들은 올리고뉴클레오티드에게 뉴클레아제(nuclease) 내성을 제공하기 위해 사용될 수 있다.

또한, TOM34에 대한 siRNA는 TOM34의 발현 수준을 줄이는 것으로 사용될 수 있다. 상기 용어 "siRNA"는 표적 mRNA의 번역을 막는 이중 가닥 RNA 분자를 의미한다. 세포 내 siRNA를 삽입하는 표준 기술들은 전사되는 RNA의 주형인 DNA를 포함하는 것이 사용될 수 있다. 본 발명의 문맥에서, 상기 siRNA는 TOM34와 같은 상향조절된 마커 유전자에 대한 센스 핵산 서열 및 안티센스 핵산 서열을 포함한다. 상기 siRNA는 단일 전사물이 예를 들면, 헤어핀(hairpin)과 같은 표적 유전자의 센스 및 상보적인 안티센스 서열 모두를 가지는 것으로 구성된다.

TOM34의 siRNA는 표적 mRNA에 하이브리드하여 정상적으로 단일-가닥화된 mRNA 전사와 관련되어 번역 및 이에 의한 단백질의 발현을 간섭함으로써 TOM34에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 생산을 감소 또는 억제한다. 따라서, 본 발명의 siRNA 분자들은 엄격한 조건 하에서 TOM34의 mRNA에 특이적으로 하이브리드하는 능력에 의해 특정될 수 있다. 본 발명의 목적을 위한, 용어 "하이브리드하다(hybridize)" 또는 "특이적으로 하이브리드하다(hybridize specifically)"는 "엄격한 하이브리드 조건(stringent hybridization conditions)" 하에서 두 핵산 분자의 하이브리드 능력을 의미하는 것으로 사용된다. 어구 "엄격한 하이브리드 조건(stringent hybridization conditions)"은 핵산 분자가 전형적으로 핵산의 복합체에서 다른 서열을 탐지하지 않고, 표적 서열에 하이브리드할 것인 조건을 의미한다. 엄격한 조건들은 서열-의존적이고, 상황에 따라 다를 수 있다. 서열이 길수록 더 높은 온도에서 특이적으로 하이브리드한다. 핵산의 하이브리드에 관한 내용은 Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology -- Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays"(1993)에서 찾을 수 있다. 일반적으로, 엄격한 조건은 정의된 이온 강도 pH에서 특이적 서열에 대한 열융점(T_m) 보다 약 5 ~ 10℃ 낮은 것으로 선택된다. 상기 T_m은 평형(표적 서열이 과잉 존재, T_m에서, 프로브들의 50%가 평형하게 점유하고 있을 때)에서 표적에 상보적인 프로브들의 50%가 표적 서열에 하이브리드할 때의 온도(정의된 이온 강도, pH 및 핵산 농도)이다. 또한, 엄격한 조건은 포름아마이드(formamide)와 같은 불안정제(destabilizing agent)들의 첨가로 획득될 수 있다. 선택적 또는 특이적 하이브리드을 위해, 양성 시그널은 배경 하이브리드의 2배, 바람직하게 배경 하이브리드의 10배이다. 예시적인 엄격한 하이브리드 조건은 하기와 같이 될 수 있다: 50℃에서 0.2x SSC 및 0.1% SDS로 세척한, 42℃에서 배양하는 50% 포름아마이드(formamide), 5x SSC 및 1% SDS, 또는 65℃에서 배양하는 5x SSC, 1% SDS.

본 발명의 문맥에서, siRNA는 500, 200, 100, 50 또는 25개의 뉴클레오티드 길이인 것이 바람직하다. siRNA는 19 내지 25개의 뉴클레오티드 길이인 것이 더욱 바람직하다. TOM34 siRNA의 생산을 위한 예시적인 핵산 서열은 표적 서열로서 서열번호 48 또는 서열번호 52의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. RNA 또는 이의 유도체들에서, 염기 "t"는 뉴클레오티드 서열에서 "u"로 대체될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 본 발명은 뉴클레오티드 서열 5'-gaaaguguucucuacucca-3'(서열번호: 48) 또는 5'-ggauggaaacugcagagac-3'(서열번호: 52)를 포함하는 이중 가닥의 RNA 분자를 제공한다. siRNA의 억제 활성을 증가하기 위해서, 뉴클레오티드 "u"는 표적 서열의 안티센스 가닥의 3' 말단에 첨가될 수 있다. 첨가되는 "u"의 수는 적어도 2개, 일반적으로 2 내지 10, 바람직하게 2 내지 5이다. 상기 첨가된 "u"는 siRNA의 안티센스 가닥의 3' 말단에서 단일 가닥을 형성한다.

TOM34의 siRNA는 mRNA 전사물에 결합할 수 있는 형태로 세포 내에 직접 삽입될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 siRNA 분자들은 안티센스 분자들에 관해 상기 기재된 바와 같이 일반적으로 변형된다. 또한, 다른 변형들, 예를 들면 콜레스테롤-접합된 siRNA들은 진전된 약학적 특성을 보여주는 것이 가능하다(Song et al . Nature Med . 9:347-351, 2003).

또한, siRNA를 암호화하는 DNA는 벡터로 운반될 수 있다. 벡터들은 예를 들면, 두 가닥의 발현(DNA 분자의 전사에 의해)을 허용하는 방법에 있어서, 표적 서열을 플랭킹(flanking)하는 작동가능하게-연결된 조절 서열을 가지는 발현 벡터 내로 TOM34 표적 서열을 클로닝함으로써 생산될 수 있다(Lee, N.S.et al., Nature Biotechnology 20 : 500-505, 2002). TOM34의 mRNA에 대한 안티센스인 RNA 분자는 첫 번째 프로모터(예를 들면, 클론된 DNA의 프로모터 서열 3')에 의해 전사되고, TOM34의 mRNA에 대한 센스인 RNA 분자는 두 번째 프로모터(예를 들면, 클론된 DNA의 프로모터 서열 5')에 의해 전사된다. 상기 센스 및 안티센스 가닥들은 TOM34의 침묵시키는 siRNA 구성물을 생성하기 위해 생체 내에서 하이브리드한다. 또한, 상기 두 구성물은 siRNA 구성물의 센스 및 안티센스 가닥들을 만들기 위해 이용될 수 있다. 클론된 TOM34는 예를 들면, 단일 전사물이 센스와 표적 유전자에 상보적인 안티센스 서열 모두를 가지는 헤어핀(hairpin)과 같은 2차 구조를 가지는 구성물을 암호화할 수 있다.

임의의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 루프 서열(loop sequence)은 헤어핀 루프 구조를 형성하기 위해 센스 및 안티센스 서열 사이 위치될 수 있다. 따라서, 본 발명은 [A]가 TOM34의 mRNA 또는 cDNA에 특이적으로 하이브리드하는 서열에 대응하는 리보뉴클레오티드 서열인 일반식 5'-[A]-[B]-[A]-3'로 나타내는 siRNA를 제공한다. 구체적으로, [A]는 TOM34의 서열에 대응하는 리보뉴클레오티드 서열이고, [B]는 3 내지 23개의 뉴클레오티드들로 구성되는 리보뉴클레오티드 서열이며, [A']는 [A]의 상보적인 서열로 구성되는 리보뉴클레오티드 서열이다. 상기 부위 [A]는 [A']에 하이브리드한 후 부위 [B]로 구성되는 루프를 형성한다. 상기 루프 서열은 3 내지 23개의 뉴클레오티드 길이인 것이 바람직하다. 예를 들면, 루프 서열은 하기의 서열로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다(http://www. ambion. com/techlib/tb/tb_506. html). 또한, 23개의 뉴클레오티드들로 구성되는 루프 서열은 활성 siRNA를 제공한다(Jacque, J.-M., et al., Nature 418 : 435-438, 2002).

CCC, CCACC 또는 CCACACC: Jacque, J. M, et al., Nature , Vol. 418: 435-438, 2002

UUCG: Lee, N.S., et al., Nature Biotechnology 20 : 500-505, 2002; Fruscoloni, P., et al., Proc . Natl . Acad . Sci. USA 100(4): 1639-1644, 2003.

UUCAAGAGA: Dykxhoorn, D. M., et al., Nature Reviews Molecular Cell Biology 4: 457-467, 2002.

또한, 루프 서열은 CCC, UUCG, CCACC, CCACACC 및 UUCAAGAGA로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 루프 서열은 UUCAAGAGA(DNA에서 "ttcaagaga")이다. 본 발명의 문맥에서 사용되는 적절한 예시적인 헤어핀 siRNA는 하기를 포함한다:

TOM34-siRNA-D(siD, 서열번호 48의 표적 서열에 대한)에 대한 5'-gaaaguguucucuacucca-[B]-uggaguagagaacacuuuc-3'(서열번호: 49), 및 TOM34-siRNA-E(siE, 서열번호 52의 표적 서열에 대한)에 대한 5'-ggauggaaacugcagagac-[B]-gucucugcaguuuccaucc-3'(서열번호: 53).

상기 적합한 siRNA의 뉴클레오티드 서열은 엠비온(Ambion) 웹사이트(http://www. ambion. com/techlib/ misc/siRNA_finder. html)로부터 이용가능한 siRNA 고안 컴퓨터 프로그램을 이용하여 고안될 수 있다. 상기 컴퓨터 프로그램은 하기의 프로토콜(protocol)을 기초로 하는 siRNA 합성용 뉴클레오티드 서열들을 선별한다.

siRNA 표적 부위의 선별:

1. 전사 대상의 AUG 개시 코돈으로 시작하여, AA 디뉴클레오티드(dinucleotide) 서열을 위해 다운스트림(downstream) 스캔한다. 잠재적인 siRNA 표적 부위로서 각 AA 및 3'에 인접한 19개의 뉴클레오티드들의 생성을 기록한다. Tuschl 등은 5' 및 3' 번역지 않는 부위들(UTRs) 및 개시 코돈 근처 부위들(75개의 염기 내)이 조절 단백질 결합 부위들에서 더 많이 존재하기 때문에, 이들에 대한 siRNA를 고안하는 것을 권장하지 않는다. UTR-결합 단백질들 및/또는 번역 개시 복합체들은 siRNA 엔도뉴클레아제(endonuclease) 복합체의 결합을 방해할 수 있다.

2. 인간 게놈 데이타베이스에 대한 잠재적인 표적 부위들를 비교한 후 다른 암호화하는 서열에 상당한 상동성을 가지는 특정 표적 서열을 고려하여 제거한다. 상기 상동성 연구는 NCBI 서버(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)에서 찾을 수 있는 BLAST를 이용하여 수행될 수 있다.

*3. 합성을 위한 적격의 표적 서열을 선별한다. 엠비온(Ambion)에서, 바람직하게 여러 표적 서열들은 평가하기 위해 다양한 길이의 유전자 중에서 선별될 수 있다.

TOM34 유전자 서열들을 플랭킹(flanking)하는 조절 서열들은 이들의 발현이 독립적으로, 또는 시간적 또는 공간적 방식으로 조절되기 위해 확인 또는 구별될 수 있다. siRNA들은 예를 들면, 작은 핵 RNA(small nuclear RNA; snRNA) U6 또는 인간 H1 RNA 프로모터(human H1 RNA promoter) 유래 RNA 폴리머라아제(polymerase) Ⅲ 전사 유닛(unit)을 포함하는 벡터 내로 TOM34 주형들을 클로닝함으로써 세포 내에서 전사된다. 세포 내로 벡터를 삽입하기 위해, 형질감염-증진제가 사용될 수 있다. FuGENE(Rochediagnostices), 리포펙타민(Lipofectamine) 2000(Invitrogen), 올리고펙타민(Oligofectamine)(Invitrogen), 및 뉴클레오펙터(Nucleofector)(Wako pure Chemical)는 형질감염-증진제로 유용하다.

본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA는 본 발명의 폴리펩티드의 발현을 억제하고, 본 발명의 폴리펩티드의 생물학적 활성을 억제하는데 유용하다. 또한, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA를 포함하는 발현-억제제들은 본 발명의 폴리펩티드의 생물학적 활성을 억제하는 점에서 유용하다. 그러므로, 본 발명의 안티센스 뉴클레오티드 또는 siRNA를 포함하는 조성물은 CRC를 치료하는데 유용하다.

항체:

또한, CRC에서 과발현되는 TOM34의 유전자 산물의 기능은 상기 유전자 산물에 결합하거나 이의 기능을 억제하는 화합물을 투여함으로써 억제될 수 있다. 예를 들면, 상기 화합물은 TOM34의 유전자 산물에 결합하는 항체이다.

본 발명은 항체, 특히 TOM34에 의해 암호화되는 단백질에 대한 항체들, 또는 상기 항체들의 단편의 사용을 제공한다. 본 발명에 있어서, 용어 "항체(antibody)"는 항체(상향조절된 마커의 유전자 산물 등)를 합성하기 위해 사용되는 항원 또는 이에 밀접하게 관련된 항원과 상호작용(결합 등)하는 특이적 구조를 가지는 면역글로불린(immunoglobulin) 분자를 의미한다. 더불어, 항체는 TOM34에 의해 암호화되는 단백질에 결합하는 한, 항체의 단편 또는 변형된 항체일 수 있다. 예를 들면, 상기 항체 단편은 Fab, F(ab')₂, Fv, 또는 단일 사슬 Fv(scFv)일 수 있고, 여기서 H 및 L 사슬들 유래 Fv 단편들은 적절한 연결자(linker)에 의해 연결된다(Huston J. S. et al. Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 85:5879-5883, 1988). 더 구체적으로, 항체 단편은 파파인(papain) 또는 펩신(pepsin)과 같은 효소로 항체를 처리함으로 생성될 수 있다. 또한, 항체 단편을 암호화하는 유전자는 숙주 세포에 발현 벡터를 삽입한 후 발현함으로써 제조될 수 있다(예를 들면, Co M. S. et al. J. Immunol. 152:2968-2976, 1994; Better M. and Horwitz A. H. Methods Enzymol . 178:476-496, 1989; Pluckthun A. and Skerra A. Methods Enzymol. 178:497-515, 1989; Lamoyi E. Methods Enzymol. 121:652-663, 1986; Rousseaux J. et al. Methods Enzymol . 121:663-669, 1986; Bird R. E. and Walker B. W. Trends Biotechnol. 9:132-137, 1991 참조).

항체는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol; PEG)과 같은 다양한 분자들과 접합함으로써 변형될 수 있다. 본 발명은 상기 변형된 항체들을 제공한다. 상기 변형된 항체는 항체를 화학적으로 변형함으로써 획득될 수 있다. 상기 변형 방법들은 당업계에 일반적이다.

또한, 항체는 비인간 항체 유래 가변 부위(variable region), 및 인간 항체 또는 인간화된 항체 유래 보존 부위(constant region)를 가지거나, 비인간 항체 유래 상보성 결정 부위(complementarity determining region; CDR), 인간 항체 유래 구조 형성 부위(frame work region; FR) 및 보존 부위를 포함하는, 키메릭 항체(chimeric antibody)를 포함할 수 있다.

상기 항체들은 알려진 기술들을 이용하여 제조될 수 있다. 인간화는 인간 항체의 서열에 대응하는 설치류 CDR들 또는 CDR 서열들을 치환함으로써 수행될 수 있다(예를 들면, Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536, 1988). 따라서, 상기 인간화된 항체들은 본래의 인간 가변 도메인의 상당히 적은 일부가 비-인간 종 유래 대응 부위에 의해 치환된 키메릭 항체이다.

또한, 인간 구조 형성 부위 및 보존 부위에 인간 가변 부위를 포함하는 완전한 인간 항체들이 사용될 수 있다. 상기 항체들은 당업계에 알려진 다양한 기술을 이용하여 생성될 수 있다. 예를 들면, 시험관 내 방법들은 박테리오파지(bacteriophage)(예를 들면, Hoogenboom & Winter, J. Mol . Biol. 227:381-8, 1991)에 진열되는 인간 항체 단편들의 재조합 라이브러리의 이용과 관련된다. 유사하게, 인간 항체들은 예를 들면, 내생 면역글로불린 유전자가 부분적 또는 완벽하게 비활성인 마우스와 같은 이식유전자(transgenic) 동물 내로 인간 면역글로불린 유전자좌를 도입함으로써 제조될 수 있다. 상기 접근은 예를 들면, 미국 특허 번호 제 6,150,584호; 제 5,545,807호; 제 5,545,806호; 제 5,569,825호; 제 5,625,126호; 제 5,633,425호; 제 5,661,016호에 기재되어 있다.

대장암 세포들에서 발생하는 특이적 분자적 변화들에 관련된 암 치료법들은 진전된 유방암의 치료를 위한 트라스투주맙(trastuzumab, Herceptin), 만성 골수성 백혈병을 위한 이매티닙 메실레이트(imatinib mesylate, Gleevec), 비소세포폐암을 위한 제피티닙(gefitinib, Iressa), B-세포 임파선암 및 맨틀 세포 임파선암을 위한 리툭시맵(rituximab, anti-CD20 mAb)과 같이 항암제들의 임상 개발 및 정규 허가를 통해 인가된다(Ciardiello F. et al., Clin Cancer Res . Oct;7(10):2958-70, 2001; Slamon DJ. et al., N Engl J Med . Mar 15;344(11):783-92, 2001; Rehwald U.et al., Blood . Jan 15;101(2):420-424, 2003; Fang G.et al., Blood , 96, 2246-2253, 2000). 이런 약들은 단지 변형된 세포들을 표적으로 하기 때문에 임상적으로 효과적이고 구식의 항암제보다 더 내성이 있다. 따라서, 상기 약들은 암 환자들의 생존 및 삶의 질을 향상시킬 뿐만 아니라, 분자적으로 표적화되는 암 치료법의 구상을 입증한다. 더불어, 표적화된 약들은 표준 화학치료법과 조합하여 사용될 때 상기 치료법의 효능을 향상시킬 수 있다(Gianni L., Oncology , 63 Suppl 1, 47-56, 2002; Klejman A. et al., Oncogene , 21, 5868-5876, 2002). 따라서, 장래 암 치료들은 신생혈관형성(angiogenesis) 및 침습성(invasiveness)과 같은 종양 세포들의 다양한 특성들을 목적으로 하는 표적-특이적 약제들과 일반적인 약들이 겸하는 것과 관련될 것이다.

이런 조절 방법들은 예를 들면, 시험관 내(ex vivo 또는 in vitro)(약제와 함께 세포를 배양함으로써) 또는, 생체 내(in vivo)(개체에 약제를 투여함으로써) 수행될 수 있다. 상기 방법들은 차별적으로 발현되는 유전자들의 비정상적인 발현 또는 상기 유전자 산물들의 비정상적인 활성을 억제하기 위한 치료법으로서 단백질 또는 단백질의 조합 또는 핵산 분자 또는 핵산 분자의 조합을 투여하는 것과 관련된다.

유전자들 및 유전자 산물들의 발현 수준 또는 생물학적 활성들이 증가(질병 또는 장애로부터 고통받지 않은 개체에 비해 상대적인)함으로써 특정되는 질병 및 장애는 상대적으로 과발현 유전자 또는 유전자들의 활성을 방해(감소 또는 억제)하는 치료법으로 치료될 수 있다. 활성을 방해하는 치료법들은 치료적 또는 예방적으로 투여될 수 있다.

따라서, 본 발명의 문맥에서 이용될 수 있는 치료법들은 예를 들면, (i) 과발현 유전자의 폴리펩티드, 이의 유사체, 유도체, 단편 또는 동족체; (ii) 과발현 유전자 또는 유전자 산물에 대한 항체들; (iii) 과발현 유전자를 암호화하는 핵산; (iv) "기능장애(dysfunctional)"(과발현되는 유전자의 핵산 내로 이종의 삽입 때문에)를 야기하는 안티센스 핵산 또는 핵산; (v) 작은 간섭 RNA(siRNA); 또는 (vi) 조절자(modulator)(과발현 폴리펩티드 및 이의 결합 협력자 사이 상호작용을 변경하는 억제제, 길항제 등) 등을 포함한다. 기능장애적 안티센스 분자들은 동종 재조합에 의한 폴리펩티드의 내생적 기능을 "녹아웃(knockout)"하기 위해 이용된다(Capecchi, Science 244: 1288-1292, 1989 참조).

증가된 수준은 펩티드 및/또는 RNA를 정량함으로써, 및 환자 조직 시료(예를 들면, 생체검사 조직으로부터)를 획득하여 시험관 내에서 RNA 또는 폴리펩티드 발현, 발현된 펩티드(또는 발현이 변하는 유전자의 mRNA)의 구조 및/또는 이의 활성을 분석함으로써 용이하게 탐지될 수 있다. 당업계에 잘 알려진 방법들은 면역분석법[예를 들면, 웨스턴블랏 분석법(Western blot analysis), SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)에 의한 면역침강법 등) 및/또는 mRNA의 발현을 탐지하는 하이브리드분석법(hybridization assay)(예를 들면, 노던블랏 분석법(Northern assays), 도트 분석법(dot blots), 접합보인법(in situ Hybridization) 등]을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

예방적 투여는 질병 또는 장애가 진행함에 있어서 예방 또는 지연시키기 위해, 질병의 명백한 임상적 증상의 발현 이전에 수행하는 것이다.

본 발명의 치료적 방법은 차별적으로 발현되는 유전자들의 유전자 산물들의 하나 이상의 활성들을 조절하는 약제와 세포를 접촉시키는 단계를 포함한다. 단백질 활성을 조절하는 약제의 예는 핵산들, 단백질들, 자연 발생적인 상기 단백질의 동종 리간드(cognate ligand)들, 펩티드들, 펩티도미메틱스(peptidomimetic)들 및 다른 작은 분자들을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

CRC 에 대한 백신접종:

본 발명에 있어서, TOM34 유래 펩티드는 일본인(Japanese) 및 코카시안인(Caucasian) 군에서 공통의 HLA 대립유전자인 HLA-A24에 의해 한정된 TAA 에피토프(epitope)들을 나타낸다. TOM34 유래 펩티드를 결합하는 HLA-A24 후보물질들은 HLA-A24에 대한 결합 친화력 정보를 이용하여 확정될 수 있다. 상기 펩티드로 적재된 수지상세포들(dendritic cells, DCs)에 의한 T-세포들의 시험관 내 자극 후, CTL은 TOM34-299(KLRQEVKQNL; 서열번호 7)을 이용하여 성공적으로 확립되었다. 상기 CTL들은 직결장암 세포(Colorectal carcinoma cell)에 대한 강한 세포독성 활성을 나타내었다. 또한, CTL 클론들 및 이들 세포들로부터 유래한 세포주들은 TOM34을 내생적으로 과발현하는 HLA-A24 양성 직결장암 세포주들에 대한 특이적 세포독성을 나타내었다. 상기 CTL 클론들 및 세포주들의 세포독성 활성은 HLA-A24 또는 표적 TAA 중 어느 하나의 발현이 결핍된 세포주들에 대해서는 나타내지 않았다. 상기 CTL 클론들 및 세포주들의 특이적 세포독성 활성은 저온 표적에 의해 상당히 억제되었다. 상기 결과는 TOM34가 CRC의 TAA로서 이용가능하고 그것은 TOM34이 HLA-A24에 의해 한정된 TAA의 에피토프 펩티드인 것을 입증한다. TOM34 항원이 대부분의 CRC에서 과발현되고 종양 세포 증식과 연관되어 있기 때문에, 이들은 CRC에 대한 면역치료를 위해 사용되는 좋은 표적들이다.

또한, 본 발명은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 40개 이하의 아미노산들, 종종 20개 이하의 아미노산들, 일반적으로 15개 이하의 아미노산들의 면역성 펩티드를 투여하는 단계를 포함하는, CRC 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 또한, 상기 면역성 펩티드들은 1, 2 또는 여러 아미노산들이 치환 또는 첨가되는 서열번호 7의 유도체 서열을 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기 면역성 펩티드는 나노펩티드(nonapeptide) 또는 데카펩티드(decapeptide)이다. 또한, 본 발명은 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 상기 기재된 바와 같은 이의 유도체를 포함하는 본 발명의 면역성 펩티드를 투여하는 단계를 포함하는, CRC에 대한 항-종양 면역성을 유도하는 방법을 제공한다. 본 발명에 있어서, 상기 펩티드 또는 이의 유도체는 생체 내(in vivo) 또는 생체 외(ex vivo)에서 개체에 투여될 수 있다. 또한, 본 발명은 CRC 치료 또는 예방용 면역 조성물을 제조하기 위해 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 이의 유도체를 포함하는 데카펩티드의 용도를 제공한다.

TOM34의 상동성 분석은 특정 알려진 인간 유전자 산물 유래 펩티드들과 상당한 상동성을 가지지 않음을 나타내었다. 이는 상기 분자들에 대한 면역치료로 알려지지 않거나 요구되지 않는 면역반응의 가능성을 낮춘다.

HLA 항원에 관해서, 일본인들에서 고도로 발현되는 A-24 유형의 용도는 효과적인 결과를 획득하는 용도로 바람직하고, A-2402와 같은 아형들의 용도는 더 바람직하다. 일반적으로, 임상적으로 치료를 요하는 환자의 HLA 유형의 항원은 사전에 조사되고, 상기 항원에 높은 수준의 결합 친화성을 가지거나, 항원 제시에 의해 세포독성 T-세포(CTL) 유도성을 가지는 펩티드들의 적절한 선별이 가능하다. 또한, 높은 결합 친화성 및 CTL 유도성을 나타내는 펩티드를 수득하기 위해서, 1, 2, 3, 4 또는 몇몇 아미노산들의 치환 또는 첨가는 자연 발생적인 TOM34 부분 펩티드의 아미노산 서열을 기초로 수행될 수 있다. 상기 용어 "몇몇의(several)"는 5 내지 그 이하, 바람직하게, 3 내지 그 이하를 의미한다. 또한, 자연적으로 나타나는 펩티드들에 첨가하는 경우, HLA 항원들에 결합함으로써 나타내는 펩티드들의 서열의 규칙성이 이미 알려져 있기 때문에(Kubo, et al., J. Immunol., 152, 3913, 1994; Rammensee, et al., Immunogenetics . 41:178-228, 1995; Kondo, et al ., J. Immunol. 155:4307-12, 1995), 상기 규칙성을 기초로 하는 변형들은 본 발명의 면역성 펩티드들에서 수행될 수 있다. 예를 들면, 페닐알라닌(phenylalanine), 티로신(tyrosine), 메티오닌(methionine) 또는 트립토판(tryptophan)으로 치환된 N 말단 유래 두 번째 아미노산을 가지는 높은 HLA-24 결합 친화성을 나타내는 펩티드들, 및 C 말단의 아미노산이 페닐알라닌(phenylalanine), 루신(leucine), 이소루신(isoleucine), 트립토판(tryptophan) 또는 메티오닌(methionine)으로 치환된 펩티드들이 이용되는 것이 바람직하다.

그러나, 상기 펩티드 서열은 다른 기능을 가지는 내생적 또는 외생적 단백질의 아미노산 서열의 일부가 동일할 때, 특이적 물질에 대한 자가면역 질환 또는 앨러지 증상과 같은 부작용들이 야기될 수 있고, 따라서 또 다른 단백질의 아미노산 서열을 매치하는 서열은 이용가능한 데이타베이스를 이용하는 상동성 조사를 수행함으로써 피할 수 있다. 또한, 만약 1 내지 2개의 아미노산이 다른 펩티드가 존재하지 않는 것으로 상동성 조사가 명백하다면, HLA 항원들과 결합 친화성을 증가하기 위해서 상기 언급된 아미노산 서열의 변형, 및/또는 CTL 유도성을 증가가 상기 문제를 야기될 위험이 없다.

상기 기재된 바와 같이 HLA 항원들에 대한 높은 결합 친화성을 가지는 펩티드들이 암 백신으로 매우 효과적임에도 불구하고, 지표로서 높은 결합 친화성의 존재에 의해서 선별된 후보 펩티드들은 CTL 유도성의 실제적 존재에 대해서 조사될 수 있다. CTL 유도성의 확인은 인간 MHC 항원(예를 들면, B-림프구(B-lymphocytes), 대식세포(macrophages) 및 수지상세포(dendritic cells)), 또는 보다 구체적으로 인간 말초 혈액 단핵백혈구(human peripheral blood mononuclear leukocyte)를 운반하는 항원제시세포를 본 발명의 펩티드들로 자극하여 유도한 후, CD8-양성 세포(CD8-positive cell)와 혼합한 다음, 표적 세포들에 대한 세포독성 활성을 측정함으로써 달성될 수 있다. 반응 시스템으로서, 인간 HLA 항원을 발현하는 것으로 생산된 유전자이식동물(BenMohamed L., et al., Hum . Immunol . Aug.; 61(8):764-79, 2000)이 사용될 수 있다. 예를 들면, 표적 세포들은 ⁵¹Cr 등으로 방사성 표지화될 수 있고, 세포독성 활성은 표적 세포로부터 방출된 방사성 활성으로부터 계산될 수 있다. 또한, 고정된 펩티드들을 운반하는 항원제시세포의 존재 하에서 CTL에 의해 생성 및 방출된 IFN-γ을 측정하고, 항-IFN-γ 단클론 항체들을 사용한 배지에서 억제 지역(inhibition zone)을 시각화함으로써 조사될 수 있다.

상기 기재된 바와 같이 펩티드들의 CTL 유도성을 조사한 결과로서, HLA 항원에 높은 결합 친화성을 가지는 펩티드들이 반드시 높은 유도성을 가지지 않았다. 또한, KLRQEVKQNL(서열번호 7)로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 데카펩티드(decapeptide)는 특히 높은 CTL 유도성을 나타내었다.

상기 기재된 바와 같이, 본 발명은 세포독성 T- 세포 유도성을 가지고, 1, 2, 3, 4 또는 몇몇 아미노산들이 치환 또는 첨가된 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드들을 제공한다. 1, 2, 3, 4 또는 몇몇 아미노산들이 치환 또는 첨가된 서열번호 7로 기재되는 9 또는 10개의 아미노산들을 포함하는 아미노산 서열은 바람직하게 다른 단백질들의 아미노산 서열에 매치하지 않는다. 구체적으로, N-말단 유래 두 번째 아미노산이 페닐알라닌(phenylalanine(F)), 티로신(tyrosine(Y)), 메티오닌(methionine(M)) 또는 트립토판(tryptophan(W))으로 치환된 아미노산, C-말단 아미노산이 페닐알라닌(phenylalanine(F)), 루신(leucine(L)), 이소루신(isoleucine(I)), 트립토판(tryptophan(W)) 또는 메티오닌(methionine(M))으로 치환된 아미노산, 및 N 말단 및/또는 C 말단에 1 내지 2개의 아미노산이 첨가된 아미노산이 바람직한 예들이다. 특히, 본 발명은 아미노산 서열 KLRQEVKQNL(서열번호: 7), 또는 K-[L, F, Y, M 또는 W]-RQEVKQN-[L, F, L, I, W 또는 M]를 포함하는 데카펩티드(decapeptide)를 제공한다.

본 발명의 펩티드들은 잘 알려진 기술들을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들면, 상기 펩티드들은 재조합 DNA 기술 또는 화학적 합성에 의해 합성적으로 제조될 수 있다. 본 발명의 펩티드는 개별적으로 합성되거나 두 개 이상의 펩티드들을 포함하는 더 긴 폴리펩티드들이 될 수 있다. 상기 펩티드는 바람직하게 다른 자연 발생적인 숙주세포 단백질 및 이의 단편이 거의 없는 것과 같이 분리된 것이다.

상기 펩티드들은 변형이 본 발명에서 기재하는 폴리펩티드들의 생물학적 활성을 파괴하지 않는 한, 당화(glycosylation), 곁사슬산화(side chain oxidation) 또는 인산화(phosphorylation) 등의 변형을 포함한다. 또한, 상기 변형들은 펩티드들의 혈청 반감기를 증가하기 위해 사용될 수 있는 D-아미노산 또는 다른 아미노산 유사체의 결합을 포함한다.

본 발명의 펩티드들은 생체 내 CTL을 유도할 수 있는 암 백신의 용도로서, 본 발명의 2개 이상의 펩티드들을 포함하는 조합으로 제조될 수 있다. 상기 펩티드들은 혼합물(cocktail), 또는 표준 기술을 이용하여 각각을 결합한 것이 될 수 있다. 예를 들면, 상기 펩티드들은 단일 폴리펩티드 서열로서 발현될 수 있다. 조합에 포함되는 펩티드들은 동일하거나 다른 것일 수 있다. 본 발명의 펩티드들을 투여함으로써, 상기 펩티드들은 항원-제시 세포의 HLA 항원들에서 높은 밀도로 존재하고, 나타낸 펩티드 및 HLA 항원 사이 형성된 복합체를 향하여 특이적으로 반응하는 CTL이 유도된다. 또한, 세포 표면에 본 발명의 펩티드들을 고정한 항원 제시 세포들은 개체 유래 수지 상세포를 제거함으로써 획득되고, 이들은 본 발명의 펩티드들에 의해 자극되고, CTL은 개체에 이들 세포들을 투여함으로써 개체 내 유도되어 표적 세포를 향한 침입성이 증가될 수 있다.

보다 구체적으로, 본 발명은 한 개 이상의 본 발명의 펩티드들을 포함하는 종양의 증식 및 전이 등을 치료 또는 예방하는 약제를 제공할 수 있다. 본 발명의 상기 펩티드들은 CRC 치료용으로 사용될 수 있다.

본 발명의 펩티드들은 일반적인 제법에 의해 제형된 약학적 조성물로 직접 투여될 수 있다. 각 제형에 있어서, 본 발명의 펩티드에 담체, 첨가제 또는 일반적인 약학적으로 허용되는 물질의 첨가는 특별한 제약 없이 적절한 것으로 포함될 수 있다. 본 발명의 면역성 조성물은 CRC 치료 및 예방용으로 사용될 수 있다.

본 발명의 펩티드를 유효성분으로 포함하는 CRC의 치료 및/또는 예방용 면역성 조성물은 세포성 면역이 효과적으로 확립될 수 있기 위해 보조제를 포함할 수 있고, 상기 조성물은 항암제로서 다른 유효성분과 함께 투여될 수 있으며, 미립의 제형으로 투여될 수 있다. 상기 적용될 수 있는 보조제는 문헌에 기재된 것들을 포함한다(Johnson, C1in. Microbio1. Rev., 7: 277-289, 1994). 예시적인 보조제는 인산화 알루미늄(aluminum phosphate), 수산화 알루미늄(aluminum hydroxide) 또는 명반(alum)를 포함한다. 또한, 리포좀(liposome) 제형, 몇-um 직경 비드(bead)들로 결합된 약제인 과립(granular) 제형, 및 지질이 상기 펩티드에 결합된 제형들은 사용하기 편리할 수 있다. 투여 방법은 경구, 피내(intradermal), 피하(subcutaneous) 또는 정맥 내(intravenous) 주사 등이 될 수 있고, 표적 종양의 접근을 위해 전체적 투여 또는 부분적 투여가 가능하다. 본 발명의 펩티드들의 투여량은 치료받는 질병, 환자의 나이, 체중 및 투여 방법 등에 따라 적절하게 조절될 수 있고, 일반적으로 0.001 mg 내지 1000 mg, 바람직하게 0.01 mg 내지 100 mg, 더 바람직하게 0.1 mg 내지 10 mg이며, 며칠 내지 몇 달에 한번 투여되는 것이 바람직하다. 당업자는 적합한 투여량을 적절하게 선택할 수 있다.

또한, 본 발명은 표면에서 본 발명의 펩티드들과 HLA 항원들 사이 형성되는 복합체를 제시하는 엑소좀(exosome)으로 불리는 세포 내 소낭을 제공한다. 엑소좀들은 예를 들면, 국제 공개 번호 Hei 11-510507 및 2000-512161의 공개된 일본어 번역문에 구체적으로 기재된 방법을 이용함으로써 제조될 수 있고, 치료 및/또는 예방의 표적이 되는 개체로부터 획득된 항원제시세포를 이용하여 제조되는 것이 바람직하다. 본 발명의 엑소좀은 본 발명의 펩티드와 마찬가지로 암 백신으로서 접종될 수 있다.

사용된 HLA 유형의 항원은 치료 및/또는 예방을 요하는 개체의 항원에 매치되어야 한다. 예를 들면, 일본인에 대해서 HLA-A24, 바람직하게 HLA-A2402가 적절하다.

구체적으로, 본 발명의 백신 조성물은 세포독성 T-림프구들을 주성분으로 하는 구성성분을 포함한다. 지질들은 바이러스 항원들에 대한 생체 내 CTL이 주성분이 될 수 있는 항원으로서 확인되었다. 예를 들면, 팔미트산(palmitic acid) 잔기들은 라이신(lysine) 잔기의 e- 및 a-아미노 군들에 접합되어, 본 발명의 면역성 펩티드에 연결될 수 있다. 지질화된 펩티드는 리포좀으로 결합되거나 보조제로 유화된, 미셀(micelle) 또는 입자(particle) 중 어느 하나로 직접 투여될 수 있다. CTL 반응에 중요한 지질의 또 다른 예로서 트리팔미토일-에스-글리세릴시스테인리세릴-세린(tripalmitoyl-S-glycerylcysteinlyseryl-serine; P3CSS)과 같은 대장균(E. coli) 지질단백질(lipoprotein)은 적절한 펩티드에 공유적으로 접합할 때 CTL을 주성분으로 사용될 수 있다(Deres, et al., Nature 342:561-4, 1989 참조).

또한, 본 발명의 면역 조성물은 본 발명의 면역성 펩티드들을 암호화하는 핵산들을 포함할 수 있다(예를 들면, Wolff et. al. Science 247:1465-1468, 1990; 미국 특허번호 제 5,580,859호; 제 5,589,466호; 제 5,804,566호; 제 5,739,118호; 제 5,736,524호; 제 5,679,647호; 및 WO 98/04720 참조). DNA-기초운반기술(DNA-based delivery technology)의 예들은 "네이키드 DNA(naked DNA)", 촉진된(부피비카인(bupivicaine), 다량체(polymer)들, 펩티드-매개(peptide-mediated)) 운반, 및 입자-매개("유전자총(gene gun)") 또는 압력-매개 운반을 포함한다(미국 특허번호 제 5,922,687호 참조).

또한, 본 발명의 면역성 펩티드들은 바이러스 또는 박테리아 벡터들에 의해 발현될 수 있다. 발현 벡터들의 예들은 우두(vaccinia) 또는 계두(fowlpox)와 같은 약화된 바이러스 숙주들을 포함한다. 상기 접근은 예를 들면, 상기 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 발현하는 벡터와 같은 우두 바이러스의 사용과 관련된다. 숙주 내로 삽입하는 즉시, 재조합 우두 바이러스는 면역성 펩티드를 발현하고, 이에 따라 면역반응을 유도한다. 우두 벡터들 및 면역법 프로토콜에서 이용할 수 있는 방법들은 예를 들면, 미국 특허번호 제 4,722,848호에 기재되어 있다. 또 다른 벡터는 BCG(Bacille Calmette Guerin)이다. BCG 벡터들은 Stover 등, Nature 351:456-460, 1991에 기재되어 있다. 예를 들면, 아데노(adeno) 및 아데노-관련(adeno-associated) 바이러스 벡터, 리트로바이러스(retroviral) 벡터, 장티푸스(Salmonella typhi) 벡터 또는 독을 제거한 안트락스 독소(detoxified anthrax toxin) 벡터 등의 다양한 다른 벡터들은 치료적 투여 또는 면역을 위해 이용할 수 있다(Shata, et al., Mol . Med . Today 6:66-71, 2000; Shedlock, et al., J. Leukoc. Biol. 68:793-806, 2000; 및 Hipp, et al., In Vivo 14: 571-85, 2000 참조).

또한, 본 발명은 본 발명의 펩티드들을 이용하는 항원제시세포를 유도하는 방법을 제공한다. 상기 항원제시세포는 말초 혈액 단핵세포로부터 수지상세포를 유도한 후, 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서 본 발명의 펩티드들과 접촉(자극)시킴으로써 유도될 수 있다. 본 발명의 펩티드들이 개체에 투여될 때, 본 발명의 펩티드들이 고정된 항원제시세포들이 개체의 체내에서 유도된다. 또한, 항원제시세포에 본 발명의 펩티드들이 고정한 후, 상기 세포들은 백신으로서 개체에 투여될 수 있다. 예를 들면, 생체 외 투여는 하기의 단계를 포함할 수 있다:

a) 개체로부터 항원제시세포들을 수집하는 단계; 및

b) 단계 a)의 항원제시세포들을 본 발명의 펩티드들에 접촉시키는 단계.

단계 b)에 있어서, 상기 항원제시세포들은 백신으로 개체에 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 시험관 내에서 항원제시세포들에 본 발명의 펩티드들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드들을 포함하는 유전자들을 이동시키는 단계를 포함하는, 높은 수준의 세포독성 T 세포 유도성을 가지는 항원제시세포를 유도하는 방법을 제공한다. 상기 삽입된 유전자들은 DNA 또는 RNA의 형태가 될 수 있다. 상기 삽입 방법은 리포펙션(lipofection), 전기천공(electroporation) 및 인산칼슘(calcium phosphate) 방법과 같이 특별히 한정되지 않고 당업계에 일반적인 다양한 방법으로 수행될 수 있다. 보다 구체적으로, Reeves 등, Cancer Res ., 56:5672, 1996; Butterfield 등, J. Immunol ., 161:5607, 1998; Boczkowski 등, J. Exp . Med ., 184:465, 1996; 국제공개번호 제 2000-509281호의 공개된 일본 번역문에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 항원제시세포 내로 상기 유전자를 이동함으로써, 세포 내에서 전사 및 번역 등이 진행된 후, 획득된 단백질은 MHC Class I 또는 MHC Class II에 의해 처리된 다음, 부분적 펩티드들을 제시하기 위해 제시 과정을 통해 진행된다.

또한, 본 발명은 본 발명의 펩티드들을 이용한 CTL을 유도하는 방법들을 제공한다. 본 발명의 펩티드들이 개체에 투여될 때, CTL은 개체의 체내에서 유도되어 종양조직에서 CRC 세포들을 표적으로 하는 면역시스템의 강도는 증진된다. 또한, 상기 방법들은 개체-유래 항원제시세포들 및 CD8-양성 세포들, 또는 말초 혈액 단핵세포들이 시험관 내에서 본 발명의 펩티드들을 접촉(자극)한 후 CTL이 유도되고, 상기 세포들은 개체에 돌아오는, 생체 외 치료적 방법으로 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 방법은 하기의 단계를 포함할 수 있다:

a) 개체로부터 항원제시세포들을 수집하는 단계;

b) 단계 a)의 항원제시세포들을 본 발명의 펩티드들에 접촉시키는 단계;

c) 단계 b)의 항원제시세포와 CD^{8 +} T 세포를 혼합한 후 세포독성을 유도하기 위해 공동-배양(co-culture)하는 단계; 및

d) 단계 c)의 공동-배양으로부터 CD^{8 +} T 세포들을 수집하는 단계.

단계 d)에 의해 획득된 세포독성 활성을 가지는 CD^{8 +} T 세포들은 백신으로서 개체에 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명은 HLA-24과 같은 MHC 분자들에 의해 제시되는 본 발명의 펩티드들을 인지할 수 있는 CD8+ 세포들과 관련된다. 또한, 본 발명은 본 발명의 펩티드들을 제시하는 MHC-class I 유형 HLA-24 분자를 포함하는 APC와 같은 세포들과 관련된다. 또한, 본 발명은 본 발명의 펩티드들을 이용하여 유도되는 분리된 세포독성 T 세포들을 제공한다. 본 발명의 펩티드들을 제시하는 항원제시세포들로부터 자극에 의해 유도되는 상기 세포독성 T 세포들은 치료 및/또는 예방의 표적인 개체로부터 유래되고, 항암 효과의 목적을 위해 본 발명의 펩티드 또는 엑소좀을 포함하는 자체 또는 다른 약제와 조합으로 투여될 수 있다. 상기 획득된 세포독성 T 세포들은 본 발명의 펩티드들, 또는 바람직하게 유도되기 위해 사용되는 동일한 펩티드들을 제시하는 표적 세포들에 대항하여 특이적으로 활동한다. 상기 표적 세포들은 내생적으로 TOM34를 발현하는 세포들, 또는 TOM34 유전자들로 형질감염된 세포들이 될 수 있고, 상기 펩티들에 의한 자극 때문에 세포 표면에 본 발명의 펩티드들을 제시하는 세포들 또한 공격의 표적이 될 수 있다.

또한, 본 발명은 HLA 항원들 및 본 발명의 펩티드들 사이 형성되는 복합체들의 제시를 포함하는 항원제시세포들을 제공한다. 본 발명의 펩티드들 또는 상기 펩티드들을 암호화하는 뉴클레오티드들에 접촉함으로써 획득되는 항원제시세포들은 바람직하게 치료 및/또는 예방의 표적인 개체들로부터 유래되고, 본 발명의 펩티드들, 엑소좀 또는 세포독성 T 세포들을 포함하는 물질 자체 또는 다른 약제들과 조합에 의해 백신으로서 투여될 수 있다.

본 발명에 있어서, 어구 "백신(vaccine)"(또한, 면역 조성물로 나타낸다)은 동물 내로 주입하는 즉시 항-종양 면역 또는 CRC를 억제하는 면역을 유도하는 기능을 가지는 물질을 의미한다. 본 발명에 따라, 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드들은 TOM34을 발현하는 CRC 세포들에 대한 강하고 특이적인 면역반응을 유도하는 HLA-A24 제한적 에피토프(epitope) 펩티드들이 되는 것이 제시되었다. 따라서, 본 발명은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드들을 이용하는 항암 면역을 유도하는 방법을 포함한다. 일반적으로, 항암 면역은 하기와 같은 면역반응을 포함한다:

- TOM34을 발현하는 세포들을 포함하는 종양에 대항하는 세포독성 림프구의 유도,

- TOM34을 발현하는 세포들을 포함하는 종양을 인지하는 항체들의 유도, 및

- 항-종양 사이토카인(cytokine) 생산의 유도.

그러므로, 특정 단백질이 동물 내로 주입되는 즉시 상기 면역반응을 야기할 때, 상기 단백질은 항-종양 면역 효과를 가지는 것으로 결정된다. 단백질에 의한 항-종양 면역의 유도는 상기 단백질에 대항하는 숙주 내 면역시스템의 반응을 생체 내 또는 시험관 내에서 관찰함으로써 탐지될 수 있다.

예를 들면, 세포독성 T 림프구들의 유도를 탐지하는 방법은 잘 알려져 있다. 생체 내에 투입하는 외래 물질은 항원제시세포(APC)들의 활동에 의해 T 세포들 및 B 세포들에 제시된다. 항원 특이적 방식으로 APC에 의해 제시되는 항원에 반응하는 T 세포들은 항원에 의한 자극 때문에 세포독성 T 세포들(또는 세포독성 T 림프구들; CTLs)로 분화된 후 증식(이는 T 세포들의 활성을 의미한다)된다. 그러므로, 특정 펩티드에 의한 CTL 유도는 APC에 의한 T 세포에 펩티드를 제시한 후 CTL의 유도를 탐지함으로써 평가될 수 있다. 또한, APC들은 CD4+ T 세포들, CD8+ T 세포들, 대식세포(macrophage)들, 호산구(eosinophil)들 및 NK 세포들을 활성시키는 효과를 가진다. 또한, CD4+ T 세포들은 항-종양 면역에 중요하기 때문에, 상기 펩티드의 활동을 유도하는 항-종양 면역은 지표로서 상기 세포들의 활성 효과를 이용하여 평가될 수 있다.

APC로서 수지상세포(DC)들을 이용하여 CTL의 활동을 유도하는 것을 평가하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. DC는 APC들 사이 활동을 유도하는 가장 강한 CTL을 가지는 대표적인 APC이다. 상기 방법에 있어서, 실험 폴리펩티드는 DC와 먼저 접촉된 후 상기 DC는 T 세포들과 접촉된다. DC와 접촉한 후 원하는 세포에 대항하는 세포독성 효과를 가지는 T 세포들의 탐지는 실험 폴리펩티드가 세포독성 T 세포들을 유도하는 활성을 가지고 있음을 보여준다. 종양들에 대항하는 CTL의 활성은 예를 들면, 지표로서 ⁵¹Cr- 표지된 종양 세포들의 융해를 이용하여 탐지될 수 있다. 또한, ³H-티미딘 흡수 활성(thymidine uptake activity) 또는 LDH(lactose dehydrogenase)-방출을 이용하여 종양 세포 파괴의 정도를 평가하는 방법이 잘 알려져 있다.

또한, DC는 이외에, 말초 혈액 단핵세포들(peripheral blood mononuclear cells; PBMCs)이 APC로 사용될 수 있다. CTL의 유도는 GM-CSF 및 IL-4의 존재 하에서 PBMC을 배양함으로써 증진되는 것으로 보고된다. 유사하게, CTL은 케이홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin; KLH) 및 IL-7의 존재 하에서 PBMC을 배양함으로써 유도되는 것을 보여준다.

이런 방법들에 의해 CTL 유도 활성을 가지는 것으로 확정된 실험 펩티드들은 DC 활성 효과 및 이에 수반하는 CTL 유도 활성을 가지는 폴리펩티드들이다. 그러므로, 종양 세포들에 대항하는 CTL을 유도하는 폴리펩티드들은 CRC에 대항하는 백신으로 이용될 수 있다. 또한, 상기 폴리펩티드들과 접촉함으로써 CRC에 대항하는 CTL을 유도하는 능력이 획득된 APC는 CRC에 대항하는 백신으로 이용될 수 있다. 또한, APC에 의해 상기 폴리펩티드 항원들의 제시 때문에 세포독성이 획득된 CTL은 CRC에 대항하는 백신으로 이용될 수 있다. APC 및 CTL에 의한 항-종양 면역을 이용하는 CRC에 대한 치료 방법들은 세포 면역치료법으로 일컫는다.

일반적으로, 세포 면역치료법용 폴리펩티드들 사용할 때, CTL-유도의 효능은 다른 구조를 가지는 대다수의 폴리펩티드들을 결합 및 DC와 접촉함으로써 증가되는 것으로 알려져 있다. 그러므로, DC를 단백질 단편들로 자극할 때, 다양한 유형의 단편들의 혼합물을 사용하는 것이 유리하다.

또한, 폴리펩티드에 의한 항-종양 면역의 유도는 종양에 대항하는 항체 생산의 유도를 관찰함으로써 확인될 수 있다. 예를 들면, 폴리펩티드에 대한 항체들이 폴리펩티드로 면역된 실험 동물에서 유도된 후 성장할 때, 종양 세포들의 증식 또는 전이는 상기 항체들에 의해 억제되고, 상기 폴리펩티드는 항-종양 면역을 유도하는 능력을 가지는 것으로 결정될 수 있다.

항-종양 면역은 본 발명의 백신을 투여함으로써 유도되고, 항-종양 면역의 유도는 CRC의 치료 및 예방이 가능하다. CRC의 발병에 대한 치료 또는 예방은 CRC 세포들의 성장의 억제, CRC 세포들의 혼란 및 CRC 세포들의 발생의 억제 등의 단계들을 포함한다. 또한, CRC를 가지는 개체들의 사망률 감소, 혈액 내 CRC 마커들의 감소 및 CRC을 동반하는 탐지가능한 증상들의 완화 등은 CRC의 치료 또는 예방에 포함된다. 상기 치료 및 예방 효과들은 바람직하게 통계적으로 의미가 있다. 예를 들면, 관찰에 있어서, 5% 또는 그 이하의 유의 수준으로, CRC에 대한 백신의 치료 또는 예방 효과가 백신 투여 없는 대조군과 비교된다. 예를 들면, Student's t-test, Mann-Whitney U-test 또는 ANOVA는 통계적 분석으로 이용될 수 있다.

상기 기재된 면역학적 활성을 가지는 단백질, 또는 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 보조제와 함께 사용될 수 있다. 보조제는 면역활성을 가지는 단백질과 함께(또는 연속적으로) 투여될 때, 단백질에 대한 면역 반응을 증진하는 화합물을 의미한다. 보조제의 예들은 콜레라 독소(cholera toxin), 살모넬라 독소(salmonella toxin) 및 명반(alum) 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 또한, 본 발명의 백신은 약학적으로 허용가능한 담체와 적절하게 조합할 수 있다. 상기 담체의 예들은 살균수(sterilized water), 생리식염수(physiological saline), 인산완충용액(phosphate buffer) 및 배양액(culture fluid) 등이 있다. 또한, 상기 백신은 필요한 경우 안정제, 현탁제, 보존제 및 계면활성제 등을 포함할 수 있다. 상기 백신은 전체적 또는 구소적으로 투여된다. 백신 투여는 1회 투여 또는 다중 투여에 의한 증대에 의해 수행될 수 있다.

본 발명의 백신으로서 APC 또는 CTL을 사용할 때, 예를 들면, 생체 외 방법에 의해 CRC는 치료 또는 예방될 수 있다. 보다 구체적으로, 치료 또는 예방을 받는 개체의 PBMC들은 수집되고, 상기 세포들은 생체 외 폴리펩티드와 접촉된 후 APC 또는 CTL이 유도되고, 상기 세포들은 개체에 투여될 수 있다. 또한, APC는 생체 외 PBMC들 내로 폴리펩티드를 암호화하는 벡터를 삽입함으로써 유도될 수 있다. 시험관 내에서 유도되는 APC 또는 CTL는 투여 이전에 클론화될 수 있다. 표적 세포들에 대한 높은 파괴 활성을 가지는 세포들을 클로닝 및 성장시킴으로써, 세포 면역치료법은 더 효과적으로 수행될 수 있다. 또한, 상기 방식에서 분리된 APC 및 CTL은 상기 세포들이 유래한 개체들뿐만 아니라 유사한 질병의 다른 개체들에 대항하는 세포 면역치료법으로 이용될 수 있다.

CRC 억제용 약학적 조성물:

본 발명의 문맥에 있어서, 적합한 약학적 조성물 제형들은 경구, 직장, 코, 국부(구강(buccal) 및 설하선(sub-lingual)을 포함하는), 질(vaginal) 또는 비경구(근육 내, 피하, 및 정맥 내를 포함하는) 투여, 또는 흡입 또는 통기에 의한 투여를 위해 적합한 제형을 포함한다. 투여는 정맥 내인 것이 바람직하다. 상기 제형들은 개별 투약량 단위로 선택적으로 패키지된다.

경구 투여를 위해 적합한 약학적 제형들은 활성 성분의 사전 결정된 양을 포함하는 캡슐, 교갑(cachet) 또는 알약을 포함한다. 또한, 적합한 제형들은 분말, 과립, 용액, 현탁액 및 에멀젼(emulsion)을 포함한다. 상기 활성 성분은 선택적으로 덩어리 연약(bolus electuary) 또는 연고(paste)로 투여될 수 있다. 경구 투여용 알약 및 캡슐은 결합제(binding agent), 충전제(filler), 윤활제(lubricant), 붕해제(disintegrant) 및/또는 습윤제(wetting agent) 등의 첨가제를 포함할 수 있다. 알약은 선택적으로 하나 또는 그 이상의 제형 성분으로 압착(compression) 또는 몰딩(molding)에 의해 제조될 수 있다. 압착된 알약들은 선택적으로 바인더(binder), 윤활제(lubricant), 불활성 희석제(inert diluent), 윤활 및 표면 활성제 및/또는 분산제(dispersing agent)로 혼합된 분말 또는 과립 등의 프리-플로잉(free-flowing) 형태로 활성 성분들을 적절한 기계에서 압착함으로써 제조될 수 있다. 성형된 알약들은 분말화된 화합물을 비활성 희석액으로 적신 혼합물을 적절한 기계로 몰딩함으로써 제조될 수 있다. 상기 알약들은 당업계에 잘 알려진 방법으로 코팅될 수 있다. 경구용 액제(Oral fluid preparation)는 예를 들면, 수성(aqueous) 또는 유성(oily) 현탁액, 용액, 에멀젼, 시럽(syrup) 또는 엘릭시르(elixir)의 형태가 될 수 있거나, 사용하기 전에 물 또는 다른 적합한 담체와 함께 구성하기 위해 건조물(dry product)로서 제시될 수 있다. 상기 액제는 현탁제, 에멀션화제, 비수성 담체(식용유를 포함할 수 있는) 및/또는 보존제 등의 일반적인 첨가제들을 포함할 수 있다. 상기 알약들은 선택적으로 활성 성분이 느리게 또는 조절되게 방출하는 것을 제공하는 위해 제형화될 수 있다. 알약들의 패키지는 한 달에 한번 섭취하기 위한 알약을 포함한다.

비경구 투여를 위해 적합한 제형들은 수성 및 비수성 살균 주사 용액을 포함하고, 선택적으로 현탁제 및/또는 농유제를 포함하는 수성 및 비수성 살균 현탁액뿐만 아니라 예정된 수령자의 혈액과 등장의 제형이 되게 하는 항산화제, 완충용액, 세균발육저해제(bacteriosta) 및 용질을 포함한다. 상기 제형들은 예를 들면, 봉인된 앰풀(ampoule) 및 바이알(vial) 등의 단위 투약량 또는 다중-투약량 용기들로 제시될 수 있고, 사용 바로 전에 염(saline) 또는 주사액(water-for-injection) 등의 살균 액체 담체의 첨가를 요하는, 동결-건조된(감압하에 동결건조된) 상태로 저장될 수 있다. 또한, 상기 제형들은 연속적인 주입으로 제시될 수 있다. 즉석의 주입용액 및 현탁액들은 상기 기재된 종류의 살균 분말, 과립 및 알약들로부터 제조될 수 있다.

직장 투여를 위해 적합한 제형은 코코아 버터(cocoa butter) 또는 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol) 등의 표준 담체를 가지는 좌제(suppository)를 포함한다. 예를 들면, 구강 또는 설하 등의 입으로 국부적 투여를 위한 적절한 제형은, 활성 성분에 당 및 아카시아, 또는 트래거캔스(tragacanth), 및 선향(pastille)등의 향 베이스(flavored base)를 포함하고, 활성 성분에 젤라틴(gelatin) 및 글리세린(glycerin), 또는 당 및 아카시아 등의 염을 포함하는 마름모꼴(lozenge)을 포함한다. 비강 내 투여를 위한, 본 발명의 화합물들은 액체 스프레이, 분산제 또는 드롭(drop) 형태로 사용될 수 있다. 드롭(Drop)은 하나 이상의 분산제, 가용제 및/또는 현탁제를 포함하는 수성 또는 비수성 염으로 제형화될 수 있다.

설하 투여를 위한 화합물은 취입기(insufflator), 네뷸라이저(nebulizer), 압입된 팩(pressurized pack) 또는 다른 편리한 전달 수단의 에어로졸 스프레이(aerosol spray)로부터 편리하게 전달될 수 있다. 압입된 팩은 디클로로디플루오로메탄(dichlorodifluoromethane), 트리클로로플루오르메탄(trichlorofluoromethane), 디클로로테트라플루오로에탄(dichlorotetrafluoroethane), 이산화탄소(carbon dioxide) 또는 다른 적합한 가스 등의 적절한 추진제를 포함할 수 있다. 압입된 에어로졸의 경우, 투약량 단위는 측정된 양을 운반하는 밸브를 이용함으로써 결정될 수 있다.

또한, 설하 또는 통기에 의해 투여하기 위한 화합물은 예를 들면, 상기 화합물과 락토오즈(lactose) 또는 전분(starch) 등의 적합한 분말 베이스가 혼합된 분말과 같은 건조한 분말 조성물의 형태를 취할 수 있다. 상기 분말 조성물은 설하 또는 통기의 목적으로 투여될 수 있는 분말로부터 예를 들면, 캡슐, 카트리지(cartridge), 젤라틴 또는 발포 팩(blister pack)과 같은 단위 투약량 형태로 제시될 수 있다.

다른 제형들은 삽입가능한 장치 및 치료제를 방출하는 접착 패치(adhesive patche)를 포함한다.

활성 성분의 지속적인 방출을 주는 것이 요구될 땐, 이에 적당한 상기 기재된 제형들이 적용될 수 있다. 또한, 상기 약학적 조성물은 항균제, 면역보조제 및/또는 보존제 등의 다른 활성 성분을 포함할 수 있다.

상기 특별히 기재된 성분을 첨가하는 것은, 본 발명의 제형은 제형 유형과 관련된 당업계에서 보편적인 다른 약제를 포함할 수 있는 것으로 이해될 수 있다. 예를 들면, 경구 투여를 위한 적합한 제형은 착향료를 포함할 수 있다.

바람직한 단위 투약량 제형은 활성성분의 하기 기재된 바와 같은 유효량, 또는 이의 적절한 일부를 포함할 수 있다.

상기 기재된 각각의 조건들을 위해, 예를 들면, 폴리펩티드 및 유가 화합물 등의 조성물은 하루 당 약 0.1 매지 약 250 mg/kg의 범위로 경구 또는 주사로 투여될 수 있다. 성인에 대한 투약량 범위는 일반적으로 약 5 mg 내지 약 17.5 g/day이고, 바람직하게는 약 5 mg 내지 약 10 g/day, 및 가장 바람직하게 약 100 mg 내지 약 3 g/day이다. 분리된 단위들로 제공되는 알약 또는 다른 단위 투약량 형태들은 특정 투약량, 또는 예를 들면, 약 5 mg 내지 약 500 mg, 일반적으로 약 100 mg 내지 약 500 mg 등으로 동일 양으로 다수의 투약량에 효과적인 양을 편리하게 포함할 수 있다.

상기 적용되는 투약량은 개체의 나이 및 성별, 치료받을 정확한 질병, 및 이의 심각성을 포함하는 많은 인자에 의존할 것이다. 또한, 투여 루트는 조건 및 이의 심각성에 다양하게 의존할 수 있다. 반드시, 적절 및 최적의 투약량은 상기 기재된 인자들을 고려하여 당업자에 의해 일반적으로 계산될 수 있다.

도 1은 다양한 조직에서 TOM34 유전자의 발현 수준을 나타내는 그림이다. (A) 대장암 조직 및 이에 대응하는 비-암 점막에서 TOM34의 반-정량적(Semi-quantitative) RT-PCR 분석. T, 암조직(tumor tissue); 및 N, 정상조직(normal tissue). (B) TOM34의 다수-조직 노던 블랏(northern blot) 분석. TOM34의 전사체는 약 2.0-kb의 크기이다.
도 2는 다양한 조직에서 TOM34 유전자에 의해 암호화되는 단백질의 발현 수준을 나타내는 그림이다. (A) 대장암 조직 및 이에 대응하는 비-암 점막에서 TOM34의 웨스턴 블랏(Western Blot) 분석. T, 암조직(tumor tissue); 및 N, 정상조직(normal tissue). (B) 대장암 세포주에서 TOM34의 발현. 내부조절(internal control)에 의해 제공되는 베타-액틴(beta-actin)의 발현.
도 3은 대장암 조직에서 TOM34의 면역조직화학적 염색(immunohistochemical staining)의 결과를 나타내는 그림이다. (A 및 B) 암 및 비-암 세포들에서 상기 염색의 대표 이미지. 배율: X40, (C 및 D) 정상적인 점막 및 암 조직의 이미지(C: 정상; 및 D: 암). 배율:X200.
도 4는 TOM34 유전자의 발현 또는 CRC 세포주의 세포성장에 대한 TOM34 siRNA의 억제 효과를 나타내는 그림이다. (A) HCT116 세포들에서 TOM34의 발현에 대한 siRNA들의 효과. TOM34의 발현은 웨스턴 블랏 분석에 의해 분석되었다. 내부조절(internal control)에 의해 제공되는 베타-액틴(beta-actin)의 발현. EGFP-특이적 siRNA(siEGFP)는 음성대조군으로 준비되었다. (B) 상기 성장 HCT116 세포들에서 TOM34-siRNA들의 효과. EGFP-siRNA 또는 TOM34-siRNA들에 대한 반응에서 HCT116 세포들의 생존능력은 3중의 MTT 분석에 의해 측정되었다. 에러바(Error bars), SD; 별표(Asterisk)는 Scheff의 F 테스트에 의해 결정된 유의성 차이(P<0.0001)를 나타낸다.
도 5는 10-mer 펩티드 TOM34-299에 의해 유도되는 CTL주의 세포독성 효과를 나타내는 그래프이다. 10-mer 펩티드 TOM34-299에 의해 증가된 CTL주들은 펩티드-특이적 세포독성을 보여주었다. 상기 CTL주들은 TOM34-299로 적재된 표적세포(TISI)들에 대한 높은 세포독성 활성을 보여주는 반면에, 펩티드를 적재하지 않은 동일한 표적세포들에 대한 세포독성 활성을 보이지 않았다. 이것은 상기 CTL 주들은 펩티드-특이적 세포독성이 있음을 증명한다.
도 6은 TOM34-299에 의해 증가된 CTL주들의 강하고 펩티드-특이적인 세포독성을 나타내는 그래프이다. 상기 CTL주들은 1.2 보다 낮은 E/T 비율에서 검출가능한 강하고 항원-특이적인 세포독성을 보여주었다.
도 7은 CTL 클론(clone)들의 강한 세포독성을 나타내는 그래프이다. 많은 강한 세포독성을 가지는 CTL 클론들은 TOM34-299에 대한 특이적임을 확립될 수 있다. TOM34-299에 대한 CTL주들로부터 확립된 CTL 클론들은 매우 강한 활성을 가지는 일부에서 변화된 사멸 활성을 보여주었다.
도 8은 TOM34-299에 의해 증가된 CTL 클론들의 HLA 특이성을 나타내는 그래프이다. TOM34-299에 의해 증가된 CTL 클론들은 HLA 제한된 방법(restricted fashion)에서 내생적으로 TOM34을 발현하는 암세포를 인지 및 용해한다. 내생적으로 TOM34을 발현하는 DLD-1 및 HT29 대장암 세포주들에 대한 세포독성 활성들은 효과기 세포(effector cell)로서 TOM34-299에 의해 증가된 두 개의 CTL 클론들을 이용하여 실험되었다. SNU-C2A 세포들은 내생적으로 HLA-A24을 발현하지 않고 TOM34을 발현하는 표적으로서 사용되었다. 상기 CTL 클론들은 HLA-A24 뿐만 아니라 TOM34를 발현하는 DLD-1 및 HT29 세포 모두에 대한 높은 세포독성 활성을 보였다. 한편, 상기 CTL 클론들은 HLA-A24을 발현하지 않고 TOM34을 발현하는 SNU-C2A 세포들에 대한 세포독성 활성은 유의성을 보이지 않았다.
도 9는 TOM34-299에 의해 증가된 CTL 클론들의 HLA 특이성을 나타내는 그림이다. TOM34-299에 의해 증가된 CTL 클론들은 HLA-A24 제한된 방법(restricted manner)에서 TOM34을 특이적으로 인지한다. 저온표적억제분석(cold target inhibition assay)은 "시약 및 방법"에서 기재된 대로 수행되었다. Na₂ ⁵¹CrO₄로 표지된 HT29 세포들은 고온 표적(hot target)으로 제조되었고, 반면에 TOM34-299 펩티드를 적재하거나 적재하지 않은 TISI 세포들은 저온 표적(cold target)들로서 ⁵¹Cr 표지 없이 사용되었다. E/T 비율은 20에서 고정되었다. HT29 세포들에 대한 CTL 클론의 세포독성 활성은 단지 TOM34-299 펩티드로 적재되었을 때만 TISI 세포들의 첨가에 의해 억제되었다.
도 10은 TOM34-299에 의해 증가된 CTL 클론의 세포독성 활성의 특이성을 나타내는 그래프이다. TOM34-299에 의해 증가된 CTL 클론의 세포독성 활성은 T 세포 표면 항원 HLA class I 또는 CD8을 인지하는 항체들에 의해 특이적으로 억제된다. 상기 CTL 클론의 세포독성 활성은 T-세포 표면 항원들을 인지하는 항체의 존재 하에서 HT29 세포들에 대하여 결정되었다. 상기 CTL 활성은 HLA Class I 또는 CD8을 인지하는 항체를 첨가함으로써 명백히 억제되었고, HLA Class II 또는 CD4에 대한 항체를 첨가함으로써 거의 영향을 받지 않은 반면에, 아이소타입-매치된(isotype-matched) 대조군 항체를 첨가함으로써 모든 경우에서 억제되지 않았다.

본 발명의 관점은 하기 실시예에서 상세히 기재하고 있고, 이는 청구항에 기재된 본 발명의 범위를 한정하지 않는다. 하기 실시예는 CRC 세포들에서 차별적으로 발현된 유전자들의 확인 및 특성을 설명한다.

<실시예>

세포주 및 임상 시료

인간 암 세포주 HCT116 및 RKO은 ATCC(American Type Culture Collection(Rockville, MD))에서 획득하였다. 모든 상기 세포들은 적절한 배지, 즉 10% FBS(fetal bovine serum)(Cansera International Inc., Ontario, Canada) 및 1% 항세균/항진균 용액(Sigma-Rich)이 보충된, HCT116을 위한 McCoys 5A(Invitrogen, Carlsbad, CA) 및 RKO을 위한 RPMI 1640 (Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO)에서 단층(monolayer)으로 배양되었다. 세포들은 5% CO₂를 포함하는 습한 공기의 대기에서 37℃에서 관리되었다. 암 조직 및 대응하는 비암 점막(noncancerous mucosae)은 수술 중인 12명의 환자로부터 획득되었고, 환자의 동의를 받았다.

TISI 세포들(HLA-A24/24) 및 EHM(HLA-A3/3), 인간-B-림프아구성(human B-lymphoblastoid) 세포주들은 Takara Shuzo Co, Ltd.(Otsu, Japan)로부터 증여받았다. 상기 TISI 세포들은 펩티드-매개 세포독성 분석에 사용되었다. 직결장암(Colorectal carcinoma) 세포주인 DLD-1(HLA-A24/02), HT29(HLA-A24/0a) 및 SNU-C2A(HLA-A31/26)은 ATCC로부터 구입되었다. 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia) 세포주인 K562은 ATCC로부터 구입되었다.

반정량 ( Semiquantitative ) RT - PCR

전체 RNA는 제조업자의 프로토콜에 따라 TRIZOL 시약(Invitrogen)을 이용하여 배양된 세포들 또는 임상적 조직들로부터 추출되었다. 추출된 RNA는 DNaseI(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)로 처리된 후, 올리고(dT)_{12 -18} 프라이머 및 Superscript II 역전사효소(Invitrogen)를 이용하여 단일-가닥 cDNA들로 역전사된다. 본 발명자들은 정량적 대조군으로 GAPDH 유전자를 모니터함으로써 연속하는 PCR 증폭을 위한 적절한 각 단일-가닥 cDNA의 희석물을 제조하였다. 사용된 프라이머 서열은 GAPDH을 위한 5'-ACAACAGCCTCAAGATCATCAG-3'(서열번호: 4a) 및 5'-GGTCCACCACTGACACGTTG-3'(서열번호: 42); TOM34을 위한 5'-TGGTATAAACCTAAGGCCCTGAT-3'(서열번호: 4c) 및 5'-TAAACAGCTTAGGTGCCTCTCTG-3'(서열번호: 44)이다. 모든 증폭반응은 GeneAmp PCR system 9700(PE Applied Biosystems, Foster, CA)에서 우선, 2분 동안 94℃에서 최초 변성이 일어난 후, 30초 동안 94℃, 30초 동안 60℃ 및 30초 동안 72℃에서 18 사이클(GAPDH의 경우) 또는 29 사이클(TOM34의 경우)의 증폭이 이어진다.

노던 블랏팅( Northern Blotting )

인간 다중-조직 블랏(Human multiple-tissue blot)(BD Bioscience, Palo Alto, CA)은 TOM34의 ³²P-표지화된(labeled) PCR 산물과 하이브리드되었다. 상기 프로브(probe)는 프라이머 세트인 5'-GAACGTGAAGGCATTCTACAGA-3'(서열번호: 45) 및 5'-TAAACAGCTTAGGTGCCTCTCTG-3'(서열번호: 44), 및 Mega Label kit(Amersham Biosciences, Buckinghamshire, United Kingdom)에서 ³²P-dCTP로 표지한 연속적인 무작위-올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)를 이용한 RT-PCR에 의해 제조되었다. 사전하이브리드(Prehybridization), 하이브리드 및 세척은 공급자의 권고에 따라 수행되어졌다. 상기 블랏은 10일 동안 -80℃에서 스크린을 강화하여 방사능 사진화되었다.

TOM34 에 대한 다클론성 ( Polyclonal ) 항체의 제조

TOM34의 전체 암호화 부위는 5'-CATAAGCTTGCATGGCCCCCAAATTCCCA-3'(서열번호: 58) 및 5'-GTTAAGCTTTTAGTGTAGGTTCT-3'-(서열번호: 59)인 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 후, His-태그(tagged) TOM34 단백질을 발현하는 플라스미드를 생성하는 pET28 벡터(Novagen, Madison, WI)의 적합한 클로닝 부위 내로 클론되었다. 상기 재조합 단백질은 대장균(Escherichia coli), BL21-CodonPlus(DE3)-RIL 변종(Stratagene, LaJolla, CA)에서 발현되었고, 제조업체의 프로토콜에 따라 TALON Superflow Metal Affinity Resin(BD Bioscience)을 이용하여 정제되었다. 상기 단백질은 토끼 내로 접종되었고, 면역된 혈청은 표준 방법에 따라 친화성 컬럼에서 정제되었다. 웨스턴 블랏(Western blot) 분석은 50 mM Tris-HCl(pH7.5), 250 mM NaCl, 0.1% SDS, 및 Protease Inhibitor Cocktail Set III(CALBIOCHEM, La Jolla, CA)을 포함하는 0.5% NP40을 포함하는 0.1% RIPA 유사 완충용액을 이용하여 세포들로부터 추출된 단백질들을 이용하여 수행되었다.

면역조직화학법( Immunohistochemistry )

면역조직화학적 염색은 인간 TOM34에 대한 친화성으로 정제된 다클론성 항체를 이용하여 수행되었다. 파라핀-임베디드(paraffin-embedded) 조직 단편들은 SAB-PO peroxidase immunostaining system(Nichirei, Tokyo, Japan)에 대한 대상이 되었고, 항원들은 오토클레이브(autoclave)에 의해 10분 동안 108℃에서 0.01M 구연산염(citrate) 완충용액(pH 6.0)으로 슬라이드를 사전 처리함으로써 탈파라핀화(deparaffinized) 및 재-수화된(re-hydrated) 조직들로부터 회수되었다.

TOM34 에 대한 siRNA 들을 발현하는 psiU6BX 의 제조

siRNA를 발현하는 플라스미드들은 사전에 보고(WO2004/076623)된 바와 같이 psiU6BX 벡터의 BbsI 부위 내로 이중-가닥 올리고뉴클레오티드들을 클로닝함으로써 제조되었다. 쌍을 이루는 올리고뉴클레오티드들의 서열들은 하기와 같다:

siD를 위한 5'-CACCGAAAGTGTTCTCTACTCCATTCAAGAGATGGAGTAGAGAACACTTTC-3'(서열번호: 46) 및

5'-AAAAGAAAGTGTTCTCTACTCCATCTCTTGAATGGAGTAGAGAACACTTTC-3'(서열번호: 47);

siE를 위한 5'-CACCGGATGGAAACTGCAGAGACTTCAAGAGAGTCTCTGCAGTTTCCATCC-3'(서열번호: 50) 및

5'-AAAAGGATGGAAACTGCAGAGACTCTCTTGAAGTCTCTGCAGTTTCCATCC-3'(서열번호: 51).

상기 쌍을 이루는 올리고뉴클레오티드들은 T4-폴리뉴클레오티드 키나아제(T4-polynucleotide kinase)로 인산화된 후, 5분 동안 끓여진 다음, 천천히 냉각함으로써 이중-가닥 올리고뉴클레오티드들을 생산하기 위해 연속적으로 풀려졌다. 대조군 플라스미드인 psiU6BX-EGFP는 하기 서열로 구성되는 올리고뉴클레오티드를 이용하여 제조되었다. 각 뉴클레오티드 서열, siRNA의 표적 서열 및 서열번호들은 표 1에서 보여준다.

5'-CACCGAAGCAGCACGACTTCTTCTTCAAGAGAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3'(서열번호: 54) 및

5'-AAAAGAAGCAGCACGACTTCTTCTCTCTTGAAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3'(서열번호: 55).

TOM34-siRNA들의 효과를 조사하기 위해, 웨스턴-블랏 분석은 플라스미드로 형질감염한 5일 후, 항-TOM34 항체를 이용하여 수행되었다.

siRNA 발현 벡터 내로 삽입된 특이적 이중-가닥 올리고뉴클레오티드의 서열 및 각 siRNA들의 표적 서열

		서열번호	서열
TOM34 siD 위치 288-306	삽입 서열	46	CACCGAAAGTGTTCTCTACTCCATTCAAGAGATGGAGTAGAGAACACTTTC
	삽입 서열	47	AAAAGAAAGTGTTCTCTACTCCATCTCTTGAATGGAGTAGAGAACACTTTC
	표적	48	GAAAGTGTTCTCTACTCCA
	헤어핀(hairpin) siRNA	49	GAAAGTGTTCTCTACTCCATTCAAGAGATGGAGTAGAGAACACTTTC
TOM34 siE 위치 329-347	삽입 서열	50	CACCGGATGGAAACTGCAGAGACTTCAAGAGAGTCTCTGCAGTTTCCATCC
	삽입 서열	51	AAAAGGATGGAAACTGCAGAGACTCTCTTGAAGTCTCTGCAGTTTCCATCC
	표적	52	GGATGGAAACTGCAGAGAC
	헤어핀(hairpin) siRNA	53	GGATGGAAACTGCAGAGACTTCAAGAGAGTCTCTGCAGTTTCCATCC
EGFP 대조군	삽입 서열	54	CACCGAAGCAGCACGACTTCTTCTTCAAGAGAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC
	삽입 서열	55	AAAAGAAGCAGCACGACTTCTTCTCTCTTGAAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC
	표적	56	GAAGCAGCACGACTTCTTC
	헤어핀(hairpin) siRNA	57	GAAGCAGCACGACTTCTTCTCTCTTGAAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC

콜로니 -형성 분석( Colony - formation Assay )

10-cm 디쉬(dish)(4X10⁵ cells/dish)에 플레이트된 HCT116 세포들은 FuGENE6 시약(Roche Diagnostics)을 이용하여 TOM34-siRNA들을 발현하는 플라스미드들로 일시적으로 형질감염시킨 후, 2주 동안 800㎍/ml Geneticin을 포함하는 10% FBS(fetal bovine serum)를 포함하는 배지에서 유지되었다. 상기 생존 세포들은 100% 메탄올로 고정된 후 Giemsa 용액으로 염색되었다. 또 다른 실험에서, 생존 세포들은 cell-counting kit(DOJINDO, kumamoto, Japan)로 측정되었다.

통계적 분석

통계적 유효성은 상업적으로 이용가능한 소프트웨어(Statview; SAS Institute, Cary, NC)를 이용한 Scheffes F test로 ANOVA에 의해 분석되었다.

TOM34 유래 펩티드

HLA-A24 분자에 결합하는 TOM34 펩티드 서열 유래 나노머(Nonamer) 및 10-머(mer)는 결합 예측 소프트웨어(http:// bimas.dcrt.nih.gov/ cgi-bin / molbio/ ken_parker_comboform)에 의해 예측되었다(Parker KC, et . al ., J Immunol . 1994;152(1):163-75). 상기 펩티드들은 표준 고체상 합성 방법에 따라 Mimotopes, San Diego, CA,에 의해 합성되었고, 역상(reversed phase) HPLC에 의해 정제되었다. 상기 펩티드들의 정제(>90%) 및 확인은 각각 분석(analytical) HPLC 및 질량분석법(mass spectrometry analysis)에 의해 결정되었다. 펩티드들은 20 mg/ml의 디메틸설폭시드(dimethylsulfoxide; DMSO)에서 용해되었고 -80℃에서 저장되었다.

시험관 내( In vitro ) CTL 유도

단핵세포-유래 수지상세포(Monocyte-derived dendritic cell; DC)들은 HLA에 제시되는 펩티드들에 대항하는 CTL들을 유도하기 위해 항원제시세포(antigen-presenting cell; APC)들로 이용될 수 있다. DC들은 문헌에 기재된 바와 같이 시험관 내에서 생성되었다(Nukaya I, et al ., Int J Cancer ., 80(1):92-7, 1999; Tsai V, et al ., J Immunol ., 158(4):1796-802, 1997). 간략하게, 말초 혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell; PBMC)들은 단핵구 분획(monocyte fraction)을 위해 풍부하게 하기 위해 Ficoll-Paque(Pharmacia) 용액에 의해 정상적인 지원자 HLA-A24로부터 격리되었고, 플라스틱 조직배양 플라스크(Becton Dickinson)에 접착함으로써 분리되었다. 상기 단핵구-풍부군(monocyte-enriched population)은 2% 열-비활성 자기유래 혈청(heat-inactivated autologous serum(AS))을 포함하는 AIM-V(Invitrogen)에서 1,000 U/ml의 GM-CSF(Kirin Brewery Company에 의해 제공된) 및 1,000 U/ml의 IL-4(Genzyme)의 존재 하에서 배양되었다. 배양 7일 후, 사이토카인-생성 DC들은 AIM-V에서 20℃에서 4시간 동안 3 ㎍/ml의 베타-마이크로글로불린(β-microglobulin)의 존재 하에서 20 ㎍/ml의 HLA-A24-결합 펩티드(binding peptide)들로 적재(load)되었다. 상기 펩티드-적재된 DC들은 방사선이 조사(5,500 rad)된 후 자기유래 CD8+ T 세포들과 1:20의 비율로 혼합되고, Dynabeads M-450 CD8(Dynal) 및 Detachabead(Dynal)로 양성 선별(positive selection)에 의해 획득되었다. 상기 혼합물은 나누어졌고, 나누어진 것들은 48-웰 플레이트(Corning)에서 배양되었고; 각 웰은 10 ng/ml의 IL-7(Genzyme)을 포함하는 0.5 ml의 AIM-V/2% AS에서 1.5 x 10⁴ 펩티드-적재된 DC 및 3 x 10⁵ CD8+ T 세포들을 포함하였다. 3일 후, 상기 배양들은 20 IU/ml의 최종 농도를 위해 IL-2(CHIRON)로 보충되었다. 7일 및 14일에, 상기 T 세포들은 추가적으로 자기유래 펩티드-적재된 DC들로 재자극되었다. 상기 DC들은 상기 기재된 바와 같이 동일한 방법에 의해 매시간 제조되었다. 세포독성은 21일에 세 번째 펩티드 자극 후 펩티드-적재된 TISI 세포들에 대하여 실험되었다.

CTL 증식 절차

CTL들은 Riddell 등에 의해 보고된 바와 유사한 방법을 이용한 배양에서 증식되었다(Walter et al, N Engl J Med 333　:1038-1044, 1995; Riddel et al, Nature Med . 2　:216-223, 1996). 모든 5 x 10⁴ CTL들은 40 ng/ml의 항-CD3 단클론항체(Pharmingen)의 존재 하에서 25 x 10⁶ 방사선 조사된(3,300 rad) PBMC 및 5 x 10⁶ 방사선 조사된(8,000 rad) EHM 세포들을 포함하는 25 ml의 AIM-V/5% AS에 재현탁되었다. 배양 개시 1일 후, 120 IU/ml의 IL-2은 배양균에 첨가되었다. 상기 배양균은 5, 8 및 11일에 30 IU/ml의 IL-2를 포함하는 새로운 AIM-V/5% AS로 배양되었다.

CTL 클론들의 확립

증식된 CTL 배양들은 희석되었고, 상기 세포들은 0.3, 1 및 3 CTLs/well가 되도록 세포의 수를 조절하는 96-웰 둥근-바닥 마이크로타이터 플레이트(96-well round-bottom microtiter plate)(Nalge Nunc International)의 웰에서 분배되었다. CTL들은 전체 150 ㎕/well의 5% AS를 포함하는 AIM-V에서 7 x 10⁴ cells/well의 동종(allogenic) PBMC들, 1 x 10⁴ cells/well의 EHM, 30ng/ml의 항-CD3 항체 및 125 U/ml의 IL-2로 배양되었다. 50 ㎕/well의 IL-2는 IL-2가 최종 농도에서 125 U/ml가 되기 위해 10일 후 배지에 첨가되었다. CTL들의 세포독성 활성은 14일에 실험되었고, CTL 클론들은 상기 기재된 바와 같은 방법을 이용하여 증식되었다.

세포독성 분석

표적 세포들은 CO₂ 배양기에서 37℃에서 1시간 동안 100 uCi의 Na₂ ⁵¹CrO₄(Perkin Elmer Life Sciences)로 표지되었다. 펩티드-적재된 표적 세포들은 표지 전에 37℃에서 16시간 동안 20 ㎍/ml의 펩티드로 세포들을 배양함으로써 제조되었다. 표지된 표적 세포들은 세척되고, 둥근-바닥 마이크로타이터 플레이트(round-bottom microtiter plate)들에서 0.2 ml의 최종 부피에서 효과기 세포들과 혼합되었다. 상기 플레이트들은 세포 간(cell-to-cell) 접촉을 증가하기 위해 원심분리(800 x g에서 4분)된 후 37℃의 CO₂ 배양기에 방치하였다. 배양 4시간 후, 0.1 ml의 상층액은 각웰로부터 수집되었고 방사능 활성은 감마카운터(gamma counter)로 결정되었다. 내생적으로 TOM34을 발현하는 표적 세포들에 대한 세포독성을 평가하는 경우에 있어서, 세포독성 활성은 NK-유사 효과기(effector)에 의한 비-특이적 용해를 제거하기 위해 30배 이상의 표지되지 않은 K562 세포들의 존재하는 곳에서 실험되었다. 항원 특이성은 ⁵¹Cr-표지된(labeled) HT29 종양세포들의 인지에 대해 경쟁하기 위해 항원 펩티드로 적재된(37℃에서 16시간 동안 20 ㎍/ml) 표지되지 않은 TISI 세포들을 이용하는, 저온표적억제 분석(cold target inhibition assay)에 의해 수행되었다.

특이적 세포독성의 비율은 하기 공식에 의해 특이적 ⁵¹Cr-방출의 비율을 계산함으로써 결정되었다: {(실험 시료 방출의 cpm - 자발적인 방출의 cpm)/(최대방출의 cpm - 자발적인 방출의 cpm)} x 100. 자발적인 방출은 효과기 세포의 부재하에서 표적 세포만을 배양함으로써 결정되었고, 최대 방출은 표적을 1N HCl와 함께 배양함으로써 획득되었다. 모든 측정은 두 번 하였고, 평균의 표준 오차는 일관적으로 평균값의 10% 아래였다.

결과

CRC 들에서 TOM34 의 증가된 발현

본 발명자들의 이전 연구에서, 본 발명자들은 많은 유전자의 발현 수준들이 11개의 CRC들의 게놈-범위 발현 프로파일 분석 및 23040개의 유전자들로 구성되는 cDNA 마이크로어레이를 이용하는 9개의 대장암의 선종(adenomas)에 의해 대장암에서 빈번하게 변화하는 것을 확인하였다. 유전자들의 발현 수준들은 11개의 암종(carcinomas)에서 빈번하게 상향조절되는 유전자 중에서, 본 발명자들은 TOM34(GeneBanck 접근번호: AB085681, 서열번호: 60, 서열번호: 61)(미토콘드리아 외막의 34-kDa 수송단백질(Translocase))에 대응되는, D3124의 내부 확인 숫자를 가지는 유전자에 본 발명의 초점을 맞추었다. 연속적인 반정량(semi-quantitative) RT-PCR 분석은 20개의 검사된 CRC 임상적 시료 중 16개에서 발현이 증가함을 나타내었다(도 1A). 또한, TOM34은 본 발명자들의 cDNA 마이크로어레이에서 모든 8개의 간세포성 암종(hepatocellular carcinomas), 19개의 폐암(lung cancer) 중 5개, 9개의 유방암(bladder cancer) 중 3개, 27개의 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia) 중 7개, 및 49개의 연조직 육종(soft tissue sarcomas) 중 9개에서 상당히 상향조절되었다. 인간 정상 조직에서 상기 발현을 조사하기 위해서, 본 발명자들은 프로브로서 TOM34 cDNA을 이용하여 다중-조직 노던 블랏(Northern blot) 분석을 수행하였다. 그 결과, 상기 분석은 약 2.0 kb의 크기의 전사물을 나타내었고, 이는 정소 및 난소에서 풍부하게 발현되었고, 전립선, 비장 및 대장에서 약하게 발현되었으며, 조사된 11개의 다른 조직들 중 어느 곳에서도 발현되지 않았다(도 1B).

결장암 세포주( colorectal cancer cell line ) 및 CRC 조직들에서 축적된 TOM34 단백질

본 발명자들은 항-TOM34 다클론 항체를 제조한 후, 면역조직화학적 염색에 의해 8개의 CRC 세포주 및 12개의 CRC 조직들에서 TOM34 단백질들의 발현을 조사하였다. 면역블랏 분석(Immunoblot analysis)은 조사된 모든 CRC 세포주에서 풍부하게 발현된 34-kDa 밴드(band)의 TOM34가 탐지되었다. 반면에, 낮은 수준의 발현은 NIH3T3 및 COS7의 두 비-암 세포주에서 보였다(도 2B). 16개의 CRC 및 대응하는 비-암 점막 조직들을 이용한 웨스턴 블랏 분석(Western blot analysis)은 정상 점막에 비해 16개의 종양 중 15개에서 발현이 증가하였음을 증명하였다(도 2A). TOM34의 세포 내 분포를 조사하기 위해, 본 발명자들은 세포질의 단백질을 보여주는 항-TOM34 항체를 포함하는 HCT116 및 RKO 세포들을 이용하여 면역조직화학적 염색을 수행하였다. 또한, 본 발명자들은 12개의 파라핀-임베디드(paraffin-embedded) 대장암 조직을 이용하는 면역조직화학적 염색이 수행되었다. 12개의 종양 중 11개에서, TOM34은 세포질의 암세포에서는 강하게 염색되었으나, 이는 비-암 점막에서는 빈약하게 염색되었다(도 3).

대장암 세포의 성장에서 TOM34 - siRNA 들의 효과

대장암 세포에서 TOM34의 역할을 규명하기 위해, 본 발명자들은 TOM34에 대한 siRNA를 발현하는 플라스미드를 제조하고, 암세포들의 성장에서 이들의 효과를 조사하였다. 본 발명자들은 TOM34(psiU6BX-TOM34-siD, 및 -siE) 및 대조군 플라스미드(psiU6BX-siEGFP)를 억제하는 것으로 고안된 siRNA들을 발현하는 두 가지 형태의 플라스미드들을 제조하였다. 본 발명자들은 psiU6BX-TOM34-siD, psiU6BX-TOM34-siE 또는 psiU6BX-siEGFP으로 HCT116 세포들을 형질감염하였다. 형질감염된 세포들 유래 추출물의 웨스턴 블랏 분석(Western blot analysis)은 psiU6BX-TOM34-siD 및 psiU6BX-TOM34-siE이 psiU6BX-siEGFP에 비해 형질 감염된 세포들에서 TOM34 발현이 상당히 감소하였음을 나타내었다(도 4A). 본 발명자들은 HCT116 세포들 내로 네오마이신-내성(neomycin-resistance) 유전자를 공동-발현하는 플라스미드를 형징감염한 후, 13일 동안 적절한 농도의 제네티신(Geneticin)으로 배양되었다. TOM34의 감소된 발현과 일치하여, psiU6BX-TOM34-siD 및 psiU6BX-TOM34-siE 둘 모두는 psiU6BX-siEGFP에 비해 형질감염 세포들의 성장을 명백히 억제하였다(도 4B). 상기 데이타는 TOM34의 발현이 대장암 세포들의 성장과 관련되었음을 나타내었다.

TOM34 유래 HLA -A24 결합 펩티드들의 예측

표 2 및 표 3은 높은 결합 친화성의 순서로 항원에 대한 예측되는 펩티드들을 보여준다. 20개의 10-머(mer) 펩티드들(표 b) 및 20개의 9-머(mer) 펩티드들(표 3)은 하기 기재된 바와 같이 항원에 대해 선별되고 조사되었다.

HLA-Class I 에피토프(Epitope) 후보물질(HLA-A24: 10 mer)의 예측

개시 위치	서열	결합 점수(Binding Score; BIMAS)	서열번호
229	TYSNRALCYL	200.0	1
53	LYSNRAACHL	200.0	2
94	AYEAKEKYPM	37.5	3
194	RVLKEEGNEL	15.8	4
215	KYSESLLCSN	14.4	5
211	KAIEKYSESL	14.4	6
299	KLRQEVKQNL	13.4	7
127	RMTRALMDSL	9.6	8
242	QYTEAVKDCT	8.4	9
80	LVPFSIKPLL	8.4	10
278	KSSFADISNL	8.0	11
216	YSESLLCSNL	7.2	12
79	ALVPFSIKPL	7.2	13
279	SSFADISNLL	6.7	14
69	DCIKDCTSAL	6.0	15
212	AIEKYSESLL	6.0	16
245	EAVKDCTEAL	6.0	17
22	NGQYAEASAL	6.0	18
123	EGINRMTRAL	6.0	19
272	KALKDYKSSF	6.0	20

HLA-Class I 에피토프(Epitope) 후보물질(HLA-A24: 9 mer)의 예측

개시 위치	서열	결합 점수(Binding Score; BIMAS)	서열번호
104	AYVDYKTVL	360.0	21
31	LYGRALRVL	200.0	22
4	KFPDSVEEL	79.2	23
276	DYKSSFADI	60.0	24
280	SFADISNLL	40.3	25
100	KYPMAYVDY	15.0	26
215	KYSESLLCS	12.0	27
236	CYLVLKQYT	10.8	28
141	RLKLPSIPL	8.0	29
136	LGPEWRLKL	7.9	30
153	SAQKRWNSL	7.2	31
195	VLKEEGNEL	6.3	32
242	QYTEAVKDC	6.0	33
134	DSLGPEWRL	6.0	34
24	QYAEASALY	6.0	35
54	YSNRAACHL	6.0	36
80	LVPFSIKPL	6.0	37
230	YSNRALCYL	6.0	38
124	GINRMTRAL	6.0	39
212	AIEKYSESL	6.0	40

예측되는 펩티드들을 이용한 T 세포들의 자극

TOM34 유래 펩티드들을 인지하는 세포독성 T 세포들은 "시료 및 방법"에 기재된 방법으로 생성되었다. 탐지가능한 세포독성 활성을 가지는 CTL들이 증식되었고, 상기 CTL 세포주들은 펩티드 적용량(pulse)이 없는 표적에 비해 펩티드-적재된 표적에 대한 더 높은 세포독성 활성을 나타내는 것이 확립되었다.

10-머(mer) 펩티드 TOM34-299(KLRQEVKQNL; 서열번호: 7)에 의해 자극된 CTL주들은 펩티드가 적재되지 않은 표적에 대한 상당한 세포독성 활성을 나타내지 않고, 펩티드-적재된 표적에 대한 강한 세포독성 활성을 보여주었다(도 5). 상기 CTL주들은 1.2 보다 낮은 E/T 비율로 강하고 항원-특이적인 탐지가능한 세포독성을 나타내었다(도 6).

CTL 클론( clone )들의 확립

CTL들의 클론들은 "시료 및 방법"에 기재된 증식에 의해 CTL주들의 배양물의 제한된 희석에 의해 확립되었다. 획득된 TOM34-299에 대한 특이적인 CTL 클론들은 1.2의 비율에서 20% 내지 70% 용해, 및 10의 E/T 비율에서 40% 내지 >90% 용해 범위인 전체 클론들의 활성을 가지는, 매우 높은 세포독성 활성을 가지는 클론들을 포함하였다(도 7).

표적인 TOM34 을 내생적으로 발현하는 대장암 세포주들에 대한 세포독성 활성

TOM34-299 펩티드에 대항하여 증가된 CTL 클론들은 TOM34을 내생적으로 발현하는 종양 세포를 인지 및 사멸하는 능력에 대해 조사되었다. 도 8은 TOM34-299에 대한 2개의 증가된 CTL 클론을 나타낸다. 2개의 CTL 클론은 HLA-A24뿐만 아니라 TOM34을 발현하는 대장암 세포주 DLD-1 및 HT29에 대한 강한 세포독성 활성을 나타내었다. 반면에, 2개의 CTL 클론은 HLA-A24을 제외한 TOM34을 발현하는 SNU-C2A 대장암 세포주에 대한 적절한 세포독성 활성을 나타내지 않았다(도 8).

저온표적 억제 분석( Cold target inhibition assay )

저온표적 억제 분석은 CTL 세포주들의 특이성을 확인하기 위해 수행되었다. ⁵¹Cr에 의해 표지화된 HT29 세포들은 고온 표적으로 사용되는 반면에, 적재된 펩티드를 가지거나 가지지 않은 TISI 세포들은 ⁵¹Cr 표지화 없이 저온 표적으로서 사용되었다. 표적 HT29 세포들에 대한 특이적 세포 용해는 펩티드-적재된 저온 표적 세포들이 다양한 비율의 분석에서 첨가되었을 때 상당히 억제되었으나, 펩티드가 적재되지 않은 저온 표적 세포의 첨가에 의해서는 전혀 억제되지 않았다. 상기 결과는 20의 효과기(Effector)/고온 표적(Hot Target) 비율에서 특이적 용해의 비율로 보여진다(도 9).

항원 펩티드들의 상동성 분석

TOM34-299에 대항하는 확립된 CTL 클론들은 매우 강한 세포독성을 나타내었다. 이는 상기 펩티드의 서열이 인간면역계를 감작하는 것으로 알려진 다른 분자들로부터 유래된 서열과 상동성이 있음을 의미할 수 있다. 상기 가능성을 배제하기 위해, 상동성 분석은 BLAST 알고리즘(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/ blast.cgi)을 이용한 질문으로서 펩티드 서열로 수행되었고(Altschul SF, et al ., Nucleic Acids Res ., 25(17):3389-402, 1997; Altschul SF, et al ., J Mol Biol ., 215(3):403-10, 1990), 상당한 상동성을 가지는 서열이 없는 것으로 나타났다.

이는 TOM34-299의 서열이 유일하고, 관련되지 않은 분자에 대한 의도되지 않은 면역반응을 야기하는 가능성이 본 발명자들의 지식에서는 거의 없음을 나타낸다.

T-세포 표면 항원에 결합하는 항체들에 의해 CTL 활성의 억제( Blocking )

관찰되는 사멸 활성이 세포독성 T-세포들에 의해 매개되는지 알아보기 위해, 사멸 활성에 대한 항체들의 효과가 CTL 활성과 관련된 T-세포 표면 항원들의 기능을 중화하는 항체들을 이용하여 조사되었다. CTL 활성은 도 10에서 보는 바와 같이 HLA Class I 또는 CD8을 인지하는 항체들을 첨가함으로써 명백히 억제되었고, HLA Class II 또는 CD4에 대한 항체들에 의해 더 작은 정도로 억제되었다. 상기 결과는 HT29 직결장암(colorectal carcinoma) 세포들에 대항하는 관찰되는 T 세포 클론들이 CD8-양성 T 림프구들의 HLA-제한된 사멸 활성이 있음을 나타낸다.

토의

본 발명에 있어서, 본 발명자들은 TOM34이 CRC에서 빈번히 상향조절되고, 상기 TOM34이 정상적인 정소 및 난소에서 풍부하게 발현되고, 전립선, 비장 및 대장에서 약하게 발현되며, 조사된 다른 정상적인 성인 조직에서 드물게 탐지되는 것을 증명하였다.

한가지 포함하는 치료적 접근은 T-세포 매개된 항-종양 백신접종을 포함하는 암 치료법이다. 주요 조직적합 유전자 복합체(major histocompatibility complex; MHC)의 분자들에 의해 제시된 펩티드 항원을 인지하는 CD8⁺ 세포독성 T 세포는 항원을 제시하는 세포들을 표적으로 한다. 종양 세포들이 비-암 자기유래 세포로부터 생성되기 때문에, 대부분의 종양세포들은 면역감시(immune surveillance)로부터 피한다. 암 면역치료에 적용하기 위해 암세포에 특이적으로 발현하는 항원을 확인하는 것은 매우 중요한 일이다.

항원들은 MHC class I 분자의 결핍 때문에 정소에서 발현되지 않는다(Jassim A, et al ., Eur J Immunol 19: 1215-1220, 1989). 따라서, 암 및 정소에서 특이적으로 발현되는 유전자들은 면역치료를 위한 표적이 될 수 있다. TOM34은 정소 및 난소를 제외한 정상적인 기관에서 풍부하게 발현하지 않고 대부분의 대장암에서 상향조절되기 때문에, TOM34는 신규한 암-정소 항원으로서 CRC에 대한 치료적 표적으로 제공될 수 있다.

Tom34은 초기에는 효모 TOM 단백질과 서열 상동성을 보이기 때문에, 미토콘드리아 내로 단백질을 수송하는 트랜스로케이스(translocase)의 성분으로서 기능하는 것이 고려되었다(Nuttall SD, et al ., DNA Cell Biol 16: 1067-1074, 1997). Tom34은 미토콘드리아 외막에 위치하는 것으로 예측되었고, 최근 연구는 Hela 세포들의 세포질에 포함하고 있음을 보고하였다(Chun-Song Y & Henry W, Archives of Biochemistry and Biophysics 400: 105-110, 2002; Abhijit M, et al ., Archives of Biochemistry and Biophysics 400: 97-104, 2002). 상기 데이타와 일관하여, 본 발명자들은 TOM34의 세포 내 위치가 항-Tom34 다클론 항체를 이용한 면역조직화학적 염색에 의해 CRC 세포들의 세포질임을 규명하였다. 또 다른 보고에서는, 효모 투-하이브리드 시스템(yeast two hybrid system)을 이용한 스크리닝은 TOM34-상호작용하는 단백질로서 발로신-포함 단백질(Valosin-Containing Protein; VCP) 및 hsp90을 확인하였다. 또한, p97로 알려진 AAA(다양한 세포 활성과 관련된 ATPases) 계열은 편재된 IκBα 및 26S 프로테오좀(proteosome)의 서브유닛과 복합체를 형성하고, 이는 VCP가 IκBα을 분해함으로써 핵으로 전사인자 NFκB의 전좌에 관련될 수 있음을 제시하는 것이다(Dai RM, et al ., J Biol Chem 273: 3562-3573, 1998). HSP90는 많은 분자들의 안정성 및 기능을 위해 요구되는 분자적 샤페론(chaperone)이다. 그러므로, TOM34은 HSP90와 결합함으로써 안정될 수 있다. HSP90은 Raf1, AKT 및 SMYD3와 같은 종양성(oncogenic) 분자들과 연관되기 때문에, 많은 HSP90 억제제는 인간 암의 치료를 위해 개발되어왔다. 이런 억제제들은 HSP90가 대부분의 정상적인 조직들에서 편재되어 발현되기 때문에, 정상 기능적인 HSP90을 방해함으로써 심각한 역효과를 야기하는 것으로 추정된다.

결론적으로, TOM34은 정소 및 난소를 제외한 정상적인 기관들에서 드물게 발현하나 CRC들에서 상향조절되었다. 그러므로, TOM34의 억제는 정상적인 세포들에서 심각한 역효과를 야기하지 않을 것이다. 더불어, TOM34의 억제가 암 세포들의 세포 성장의 억제를 야기한 것은, TOM34이 상기 세포들의 성장에서 필수적인 역할을 한다는 것을 제시한다. 상기 데이타는 TOM34가 인간 대장직장암에 대한 면역치료 및 항암제 개발을 위한 장래성 있는 표적인 것을 암시하였다.

더불어, 강하고 특이적인 항종양 면역반응을 야기하는 새로운 TAA들의 확인은 다양한 종류의 암에서 펩티드 백신접종 전술의 임상적 적용의 추가적인 개발을 장담한다(Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med ., 183(3):725-9, 1996; van der Bruggen P, et al ., Science ., 254(5038):1643-7, 1991; Brichard V, et al ., J Exp Med ., 178(2):489-95, 1993; Kawakami Y, et al ., J Exp Med ., 180(1):347-52, 1994; Shichijo S, et al ., J Exp Med., 187(3):277-88, 1998; Chen YT, et al ., Proc Natl Acad Sci U S A., 94(5):1914-8, 1997, Harris CC., J Natl Cancer Inst., 88(20):1442-55, 1996; Butterfield LH, et al ., Cancer Res ., 59(13):3134-42, 1999, Vissers JL, et al ., Cancer Res ., 59(21):5554-9, 1999; van der Burg SH, et al ., J Immunol ., 156(9):3308-14, 1996; Tanaka F, et al ., Cancer Res ., 57(20):4465-8, 1997; Fujie T, et al ., Int J Cancer ., 80(2):169-72, 1999, Kikuchi M, et al ., Int J Cancer ., 81(3):459-66, 1999, Oiso M, et al., Int J Cancer ., 81(3):387-94, 1999).

본 발명자들은 코카시안군(Caucasian population)뿐만 아니라 일본인에서 빈번한 HLA 대립유전자(allele) 중 하나인, HLA-A24에 의해 제한된 TAA 에피토프(epitope)로서 TOM34 유래 펩티드들을 분석하였다(Date Y, et al., Tissue Antigens, 47: 93-101, 1996; Kondo A, et al., J Immunol , 155: 4307-12, 1995; Kubo RT, et al., J Immunol , 152: 3913-24, 1994). 본 발명에 있어서, 본 발명자들은 HLA-A24와 예측된 결합 친화성에 대한 정보를 이용하여 TOM34 유래 HLA-A24-제한된 에피토프 펩티드들의 후보물질들을 선별하였다. 이런 후보 펩티드들로 적재된 DC들에 의해 T 세포들의 시험관 내(in vitro) 자극 후, CTL들은 펩티드-적재된 TISI 세포들에 대한 강한 세포독성 활성을 나타내는 펩티드 TOM34-299(KLRQEVKQNL)(서열번호: 7)을 이용하여 성공적으로 확립되었다. 더불어, 이런 CTL들로부터 유래된 CTL 클론들은 TOM34을 내생적으로 과발현하고 HLA-A24에 양성인 직결장암 세포에 대한 특이적 세포독성을 나타내었다. 이런 CTL 클론들의 세포독성 활성들은 HLA-A24 또는 표적 TAA 중 어느 하나의 발현이 결핍한 세포주에 대항하여 나타내었고, 저온 표적에 의해 상당히 억제되었다. 이런 결과들은 TOM34가 대장암의 신규한 TAA이고, TOM34-299가 HLA-A24에 의해 제한된 TAA의 특이적 에피토프 펩티드인 것을 강하게 제시한다. 상기 항원은 대부분의 대장암에서 과발현되고 종양 세포 증식과 관련되기 때문에, 대장암에 대한 면역치료법에 사용되는 매우 좋은 표적이 된다.

TOM34-299의 상동성 분석은 알려진 인간 유전자 산물로부터 유래된 펩티드들과 상당한 상동성을 가지지 않는 것을 보여주었다.

레이저-캡쳐 분석(laser-capture dissection) 및 게놈 cDNA 마이크로어레이(genome-wide cDNA microarray)의 조합을 통해 획득된, 본 발명에 기재된 대장암의 유전자 발현 분석은 암 예방 및 치료를 위한 표적인 특정 유전자를 확인하였다. 이런 차별적으로 발현되는 유전자들 중 일부의 발현을 기초로 하여, 본 발명은 CRC를 확인 및 탐지하기 위한 분자적 진단 마커들을 제공한다.

또한, 본 발명에 기재된 방법들은 CRC의 예방, 진단 및 치료를 위한 분자적 표적들의 확인에 추가적으로 이용할 수 있다. 본 발명에 보고되는 데이타는 CRC의 종합적인 이해를 위해 추가하였고, 이는 새로운 진단 전술의 개발을 촉진하고, 치료제 및 예방제를 위한 분자적 표적의 확인을 위한 단서를 제공한다. 상기 정보는 대장종양형성(colon tumorigenesis)의 더 깊은 이해에 기여하고, CRC의 진단, 치료 및 결국 예방을 위한 새로운 전술들을 개발하기 위한 지표를 제공한다.

예를 들면, TOM34의 발현을 억제하거나, 또는 이의 활성을 방해하는 약제들은 항암제, 특히 CRC의 치료를 위한 항암제로서의 치료적인 유용을 찾는다. 상기 약제들의 예들은 안티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotide)들, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA)들, 및 TOM34 유전자에 대한 리보자임(ribozyme), 및 TOM34을 인지하는 항체들을 포함한다. 또한, 강하고 특이적인 항-종양 면역반응을 유도하는 새로운 TAA들의 확인은 CRC에서 펩티드 백신접종 전술의 임상적인 적용의 추가적인 개발을 장담한다.

더불어, 본 발명은 상세하고 이의 특정 실시예를 기재하고 있는 반면에, 상기 기재는 사실상 예시적이고 설명적인 것이고 본 발명 및 이의 바람직한 실시예를 보여주는 것을 의도한 것이다. 일반적인 실험에 있어서, 당업자는 본 발명의 사상 및 범위로부터 벗어나지 않은 점에서 발생하는 다양한 변화 및 변형들을 용이하게 인지할 것이다. 따라서, 본 발명은 상기 기재에 의해 한정되는 것이 아니고, 하기의 청구항 및 이와 동등한 것들에 의해 한정되는 것이 의도되어 진다.

<110> ONCOTHERAPY SCIENCE, INC. <120> Colon cancer related gene TOM34 <130> 13fpi-07-13 <150> US60/703,265 <151> 2005-07-27 <150> PCT/JP2006/314947 <151> 2006-07-21 <150> 10-2008-7004601 <151> 2008-02-26 <160> 61 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artifical synthesized peptide sequence <400> 1 Thr Tyr Ser Asn Arg Ala Leu Cys Tyr Leu 1 5 10 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artifical synthesized peptide sequence <400> 2 Leu Tyr Ser Asn Arg Ala Ala Cys His Leu 1 5 10 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artifical synthesized peptide sequence <400> 3 Ala Tyr Glu Ala Lys Glu Lys Tyr Pro Met 1 5 10 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artifical synthesized peptide sequence <400> 4 Arg Val Leu Lys Glu Glu Gly Asn Glu Leu 1 5 10 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artifical synthesized peptide sequence <400> 5 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aagaagaagt cgtgctgctt c 51 <210> 56 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target seqence for siRNA <400> 56 gaagcagcac gacttcttc 19 <210> 57 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA hairpin design <400> 57 gaagcagcac gacttcttct ctcttgaaga agaagtcgtg ctgcttc 47 <210> 58 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized primer for RT-PCR <400> 58 cataagcttg catggccccc aaattccca 29 <210> 59 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized primer for RT-PCR <400> 59 gttaagcttt tagtgtaggt tct 23 <210> 60 <211> 2205 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (141)..(1067) <400> 60 aggtctcgca ggccccgccc cctcgccgcg ggttcgctgt tgggcggaga tattcgccgc 60 cggcgcttgc gcccggaagg tgtgccgcac cacacggggg aggaaggaag gagctcccaa 120 ctcgccggcc tggccacggg atg gcc ccc aaa ttc cca gac tct gtg gag gag 173 Met Ala Pro Lys Phe Pro Asp Ser Val Glu Glu 1 5 10 ctc cgc gcc gcc ggc aat gag agt ttc cgc aac ggc cag tac gcc gag 221 Leu Arg Ala Ala Gly Asn Glu Ser Phe Arg Asn Gly Gln Tyr Ala Glu 15 20 25 gcc tcc gcg ctc tac ggc cgc gcg ctg cgg gtg ctg cag gcg caa ggt 269 Ala Ser Ala Leu Tyr Gly Arg Ala Leu Arg Val Leu Gln Ala Gln Gly 30 35 40 tct tca gac cca gaa gaa gaa agt gtt ctc tac tcc aac cga gca gca 317 Ser Ser Asp Pro Glu Glu Glu Ser Val Leu Tyr Ser Asn Arg Ala Ala 45 50 55 tgt cac ttg aag gat gga aac tgc aga gac tgc atc aaa gat tgc act 365 Cys His Leu Lys Asp Gly Asn Cys Arg Asp Cys Ile Lys Asp Cys Thr 60 65 70 75 tca gca ctg gcc ttg gtt ccc ttc agc att aag ccc ctg ctg cgg cga 413 Ser Ala Leu Ala Leu Val Pro Phe Ser Ile Lys Pro Leu Leu Arg Arg 80 85 90 gca tct gct tat gag gct ctg gag aag tac cct atg gcc tat gtt gac 461 Ala Ser Ala Tyr Glu Ala Leu Glu Lys Tyr Pro Met Ala Tyr Val Asp 95 100 105 tat aag act gtg ctg cag att gat gat aat gtg acg tca gcc gta gaa 509 Tyr Lys Thr Val Leu Gln Ile Asp Asp Asn Val Thr Ser Ala Val Glu 110 115 120 ggc atc aac aga atg acc aga gct ctc atg gac tcg ctt ggg cct gag 557 Gly Ile Asn Arg Met Thr Arg Ala Leu Met Asp Ser Leu Gly Pro Glu 125 130 135 tgg cgc ctg aag ctg ccc tca atc ccc ttg gtg cct gtt tca gct cag 605 Trp Arg Leu Lys Leu Pro Ser Ile Pro Leu Val Pro Val Ser Ala Gln 140 145 150 155 aag agg tgg aat tcc ttg cct tcg gag aac cac aaa gag atg gct aaa 653 Lys Arg Trp Asn Ser Leu Pro Ser Glu Asn His Lys Glu Met Ala Lys 160 165 170 agc aaa tcc aaa gaa acc aca gct aca aag aac aga gtg cct tct gct 701 Ser Lys Ser Lys Glu Thr Thr Ala Thr Lys Asn Arg Val Pro Ser Ala 175 180 185 ggg gat gtg gag aaa gcc aga gtt ctg aag gaa gaa ggc aat gag ctt 749 Gly Asp Val Glu Lys Ala Arg Val Leu Lys Glu Glu Gly Asn Glu Leu 190 195 200 gta aag aag gga aac cat aag aaa gct att gag aag tac agt gaa agc 797 Val Lys Lys Gly Asn His Lys Lys Ala Ile Glu Lys Tyr Ser Glu Ser 205 210 215 ctc ttg tgt agt aac ctg gaa tct gcc acg tac agc aac aga gca ctc 845 Leu Leu Cys Ser Asn Leu Glu Ser Ala Thr Tyr Ser Asn Arg Ala Leu 220 225 230 235 tgc tat ttg gtc ctg aag cag tac aca gaa gca gtg aag gac tgc aca 893 Cys Tyr Leu Val Leu Lys Gln Tyr Thr Glu Ala Val Lys Asp Cys Thr 240 245 250 gaa gcc ctc aag ctg gat gga aag aac gtg aag gca ttc tac aga cgg 941 Glu Ala Leu Lys Leu Asp Gly Lys Asn Val Lys Ala Phe Tyr Arg Arg 255 260 265 gct caa gcc cac aaa gca ctc aag gac tat aaa tcc agc ttt gca gac 989 Ala Gln Ala His Lys Ala Leu Lys Asp Tyr Lys Ser Ser Phe Ala Asp 270 275 280 atc agc aac ctc cta cag att gag cct agg aat ggt cct gca cag aag 1037 Ile Ser Asn Leu Leu Gln Ile Glu Pro Arg Asn Gly Pro Ala Gln Lys 285 290 295 ttg cgg cag gaa gtg aag cag aac cta cac taa aaacccaaca gggcaactgg 1090 Leu Arg Gln Glu Val Lys Gln Asn Leu His 300 305 aacccctgcc tgaccttacc cagagaagcc atgggccacc tgctctgtgc ccgctcctga 1150 aacccagcat gccccaagtg agctctgaag ccccctcctc aatcccttga tggcctccca 1210 ccctgtaaga ggctttgctt gttcaaatta aactcagtgt agtcaaacac agacatggtt 1270 gttgcaccag aaaggtcccc actagagcta agcgtgaagc tgaagctctg tccctattcc 1330 cccagcccag ctagctgatc acaccaacag atcctcatca gcaaagcatt tggctttgtc 1390 ctgcccaagt gggctgcaga ctgagtgctg cccttgtagc ttccccagac cccaactcac 1450 tgcagttcat ctgaacaacc tgagctcctg ggccggggtg gaaggagggg gataaaccta 1510 aggccctgat ccaaagcagc ctgttgagct ggttctccag ggctgcagtc tctccaggtg 1570 tacagctgct gtccctgccc tgtcctgtcc ttgcacagtc tcctatgtct gagccccagt 1630 gccttctgtt cgggccctcc tttggtggga aggcagagcc ctgacccttg aatggttgtc 1690 cttgactctg tgctgctgcc ttctgcagag aggcacctaa gctgtttaaa gagcccagtg 1750 attgtggctg ctcctcctag aggtgggagg gggcaagagg cctccttggt cagtgtccat 1810 gctttctggg cagggacttg gttttttgtt ccaacagtgg ccttctccgg gcttcatagt 1870 tctttgtaat atgttgaagt taatttgaat tgactgattt tgttgaactg tgtgtttaag 1930 ctgttgcatt aaaaagcttt cttctacatc aatatctgct gtgctttcat ttatgccttt 1990 tcagctttgc acctggaact ctgtagtaat aataaaagtt attgcttatt gggcattcaa 2050 tttgaattga ctgattttgt tgaactgtgt gtttaagctg ttgcattaaa aagctttctt 2110 ctacatcaat atctgctgtg ctttcattta tgccttttca gctttgcacc tggaactctg 2170 tagtaataat aaaagttatt gcttattggg cattc 2205

Claims (16)

1. TOM34 유전자의 mRNA 또는 TOM34 유전자에 의해 암호화되는 단백질에 결합하는 검출 시약을 포함하는 대장암의 진단 또는 대장암이 진전되는 경향의 예측용 약학적 조성물.
2. 하기와 같은 단계를 포함하는 대장암 치료 또는 예방용 화합물을 스크리닝하는 방법:
   a) TOM34 유전자의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드와 실험 화합물을 접촉시키는 단계;
   b) 폴리펩티드 및 실험 화합물 사이 결합 활성을 검출하는 단계; 및
   c) 폴리펩티드에 결합하는 실험 화합물을 선별하는 단계.
3. 하기와 같은 단계를 포함하는 대장암 치료 또는 예방용 화합물을 스크리닝하는 방법:
   a) TOM34 유전자를 발현하는 세포와 후보 화합물을 접촉시키는 단계; 및
   b) 실험 화합물이 결핍된 상태에서 검출된 TOM34 유전자의 발현 수준에 비해 TOM34 유전자의 발현 수준을 감소시키는 후보 화합물을 선별하는 단계.
4. 제 3항에 있어서, 상기 세포는 대장암 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 대장암 치료 또는 예방용 화합물을 스크리닝하는 방법.
5. 하기와 같은 단계를 포함하는 대장암 치료 또는 예방용 화합물을 스크리닝하는 방법:
   a) TOM34 유전자의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드와 실험 화합물을 접촉시키는 단계;
   b) 단계 1)의 폴리펩티드의 생물학적 활성을 검출하는 단계; 및
   c) 실험 화합물이 결핍된 상태에서 검출된 폴리펩티드의 생물학적 활성에 비해 TOM34 유전자의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 생물학적 활성을 억제하는 실험 화합물을 선별하는 단계로서, 여기서 상기 생물학적 활성은 대장선암 세포(colorectal carcinoma cell)의 세포증식의 촉진 활성인 것을 특징으로 하는 단계.
6. 하기와 같은 단계를 포함하는 대장암 치료 또는 예방용 화합물을 스크리닝하는 방법:
   a) 전사조절부위의 통제하에 발현된 리포터 유전자(reporter gene) 및 TOM34 유전자의 전사조절부위를 포함하는 벡터가 삽입된 세포와 후보 화합물을 접촉시키는 단계;
   b) 리포터 유전자의 발현 또는 활성을 측정하는 단계; 및
   c) 리포터 유전자의 발현 또는 활성을 감소시키는 후보 화합물을 선별하는 단계.
7. (a) TOM34 유전자, 또는 (b) TOM34 유전자에 의해 암호화되는 폴리펩티드에 결합하는 검출 시약을 포함하는 대장암 진단용 키트.
8. 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하고, 여기서 상기 폴리펩티드는
   (i) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 데카펩티드(decapeptide), 및
   (ii) 서열번호 7의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 두 번째 아미노산인 류신(leucine)이 페닐알라닌(phenylalanine), 티로신(tyrosine), 메티오닌(methionine) 또는 트립토판(tryptophan)로 치환; 또는 C-말단 아미노산인 류신이 페닐알라닌, 이소루신(isoleucine), 트립토판 또는 메티오닌으로 치환; 중 어느 하나 또는 둘 모두가 치환된 아미노산 서열을 포함하고 세포독성의 T 세포 유도성을 가지는 펩티드
   중 어느 하나 또는 둘 모두인 것을 특징으로 하는 대장암 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
9. 제 8항의 (i) 또는 (ii)에 정의된 펩티드와 접착된 항원제시세포를 포함하는 대장암 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
10. 약학적으로 유효한 양의 TOM34 유전자의 폴리뉴클레오티드에 대조하는 안티센스 폴리뉴클레오티드 또는 siRNA를 포함하는 대장암 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
11. 제 10항에 있어서, 상기 siRNA는 서열번호 48 또는 서열번호 52의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 센스 가닥(sense strand)을 포함하는 것을 특징으로 하는 대장암 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
12. 제 11항에 있어서, 상기 siRNA는, [A]는 서열번호 48 또는 서열번호 52의 서열에 대응하는 리보뉴클레오티드 서열, [B]는 3 내지 23 뉴클레오티드들로 구성되는 리보뉴클레오티드 루프(loop) 서열, 및 [A']는 [A]에 상보적인 서열로 구성되는 리보뉴클레오티드 서열인 일반식 5'-[A]-[B]-[A]-3'로 나타내는 것을 특징으로 하는 대장암 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
13. 약학적으로 유효한 양의 TOM34 유전자에 의해 암호화되는 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 포함하는 대장암 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
14. 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 데카펩티드(decapeptide).
15. 서열번호 7의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 두 번째 아미노산인 류신(leucine)이 페닐알라닌(phenylalanine), 티로신(tyrosine), 메티오닌(methionine) 또는 트립토판(tryptophan)로 치환; 또는 C-말단 아미노산인 류신이 페닐알라닌, 이소루신(isoleucine), 트립토판 또는 메티오닌으로 치환; 중 어느 하나 또는 둘 모두가 치환된 아미노산 서열을 포함하는 15개 이하의 아미노산으로 구성되고, 세포독성의 T 세포 유도성을 가지는 펩티드.
16. 약학적으로 유효한 양의 제 14항 또는 제 15항의 펩티드를 활성 성분으로서 포함하는 대장암 치료 또는 예방용 약학적 조성물.

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