BRPI0613970B1 - composição para o tratamento ou para a prevenção de câncer de cólon compreende uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um sirna contra um polinucleotídeo de tom 34 - Google Patents

Abstract

gene t0m34 relacionado a câncer de cólon. a presente invenção refere-se a processos objetivos para a de- tecção e para o diagnóstico de câncer de cólon. em uma modalidade, o processo de diagnóstico envolve a determinação do nível de expressão de t0m34 que discrimina entre células de câncer de cólon e células normais. finalmente, a presente invenção fornece processos de seleção em relação a agentes terapéuticos úteis no tratamento de câncer de cólon, processos de tratamento de câncer de cólon e um processo para a vacinação de um indivíduo contra câncer de cólon.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “COMPOSIÇÃO PARA O TRATAMENTO OU PARA A PREVENÇÃO DE CÂNCER DE CÓLON COMPREENDE UMA QUANTIDADE FARMACEUTICAMENTE EFICAZ DE UM SIRNA CONTRA UM POLINUCLEOTÍDEO DE TOM 34”.

[001] Este pedido de patente reivindica o benefício do Pedido de Patente U.S. Provisório N² de Série 60/703.265 depositado em 27 de julho de 2005, cujo conteúdo é incorporado aqui como referência em sua totalidade.

Campo da Invenção [002] A presente invenção refere-se a métodos de detecção e de diagnóstico de câncer de cólon assim como a métodos de tratamento e de prevenção de câncer de cólon.

Antecedentes da Invenção [003] O câncer colorretal é uma das causas mais comuns de morta associada a câncer em todo o mundo. Apesar dos vários avanços no diagnóstico e no tratamento de cânceres colorretais, muitos pacientes com câncer colorretal avançado resultam em uma alta mortalidade. Para melhorar seu prognóstico, é desejado o desenvolvimento de marcadores biológicos para diagnóstico sensíveis e específicos para a detecção de carcinomas em estágio inicial e o de fármacos terapêuticos mais eficientes e menos nocivos. Para atingir esta finalidade, é necessário entender melhor os mecanismos moleculares da carcinogênese colorretal. Estudos moleculares recentes revelaram que a carcinogênese colorretal envolve um acúmulo de alterações genéticas que incluem modificações genéticas nos genes supressores de tumor e/ou oncogenes incluindo APC, p53, beta-catenina e K-ras (Nishisho I, e outros, Science 253: 665-669, 1991; Baker SJ e outros, Science 244: 217-221, 1989; Morin PJ e outros, Science 275: 1787-1790, 1997; Forrester K e outros, Nature 327: 298-303, 1987). Em adição a estes tipos

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1a/94 de modificações, eventos genéticos tais como a metilação alterada (Jones PA & Laird PW, Nat Genet 21:163-167, 1999) e perda de

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2/94 impressão (Cui H e outros, Nat Med 4: 1276-1280, 1998) e/ou controle transcricional desregulado por alterações genéticas ou outro(s) mecanismo(s) desconhecido(s) estão envolvidos na gênese de tumores colorretais. Dentre os genes envolvidos na carcinogênese, pode-se esperar que a inibição de produtos gênicos essenciais para a proliferação e/ou para a sobrevivência de células cancerosas resultará na inibição de seu crescimento ou em morte celular. Portanto, as moléculas que exercem atividade oncogênica e são especificamente expressas em células cancerosas representam alvos promissores para o desenvolvimento de novos fármacos anticâncer.

[004] A TOM34 humana foi descoberta partindo de bancos de dados de EST e cDNA humanos e prevista como um componente da maquinaria de importação de proteínas mitocondriais, uma vez que a proteína prevista compartilha homologia de sequência na região de um motivo de 62 resíduos com a família Tom70 de leveduras conhecida de receptores mitocondriais (Nuttal SD e outros, DNA Cell Biol 16: 10671074, 1997).

[005] Entretanto, um estudo recente divulgou que a TOM34 está incluída principalmente na fração citosólica e parcialmente na mitocôndria e uma fração de membrana após o fracionamento de tecidos e células (Chewawiwat N e outros, J Biochem (Tóquio) 125: 721727, 1999). Um outro estudo mostrou sua localização subcelular no citoplasma de células HeLa através da mancha imunohistoquímica (Chun-Song Yand Henry Y., Archives of Biochemistry and Biophysics 400: 105-110, 2002; Abhijit M e outros, Archives of Biochemistry and Biophysics 400: 97-104, 2002). O sistema de seleção de dois híbridos de levedura mostrou que TOM34 interage in vitro com a proteína contendo Valosina (VCP), um membro da família AAA (ATPases associadas com uma variedade de atividades celulares) (Chun-Song Y e outros, Archives of Biochemistry and Biophysics 400: 105-110, 2002)

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3/94 ou com a proteína de choque térmico de 90 kDa (hsp90) (Young JC e outros, J Biol Chem 273: 180007-18010, 1998). Entretanto, a função biológica de TOM34 permanece não-resolvida.

[006] Foi demonstrado que linfócitos T citotóxicos CD8+ (CTLs) reconhecem peptideos de epítopo derivados de antígenos associados a tumores (TAAs) apresentados na molécula de MHC de Classe I e lisam as células tumorais. Desde a descoberta da família MAGE como o primeiro exemplo de TAAs, muitos outros TAAs foram descobertos utilizando abordagens imunológicas (Boon T., Int J Câncer. 1993; 54(2): 177-80., Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med. 1996; 183(3): 725-9., van der Bruggen P e outros, Science. 1991; 254(5038): 1643-7., Brichard V e outros, J Exp Med. 1993; 178(2): 489-95., Kawakami Y e outros, J Exp Med. 1994; 180(1): 347-52) e alguns destes estão agora no processo de desenvolvimento clínico como alvos de imunoterapia. Os TAAs descobertos até agora incluem MAGE (van der Bruggen P e outros, Science. 1991; 254(5038): 1643-7), gp100 (Kawakami Y e outros, J Exp Med. 1994; 180(1): 347-52), SART (Shichijo S e outros, J Exp Med. 1998; 187(3): 277-88), NY-ESO-1 (Chen YT e outros, Proc Natl Acad Sei USA. 1997; 94(5): 1914-8). Ao mesmo tempo, foi mostrado que os produtos gênicos, que já mostraram ser superexpressos de alguma maneira especificamente por células tumorais, são reconhecidos como alvos para respostas imunológicas celulares. Estes incluem p53 (Umano Y e outros, Br J Câncer. 2001; 84(8): 1052-7), HER2/neu (Tanaka H e outros, Br J Câncer. 2001; 84(1): 94-9), CEA (Nukaya I e outros, Int J Câncer. 1999; 80(1): 92-7) e outros. [007] Embora estes sejam exemplos do progresso significativo que foi feito na pesquisa básica e clínica (Rosenberg SA e outros, Nat Med. 1998; 4(3): 321-7., Mukherji B e outros, Proc Natl Acad Sei USA. 1995; 92(17): 8078-82., Hu X e outros, Câncer Res. 1996; 56(11): 2479-83), há um número muito limitado de TAAs candidatos em geral para o

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4/94 tratamento de adenocarcinomas incluindo câncer de cólon. Se houvesse TAAs que fossem abundantemente expressos apenas nas células cancerosas, mas não nas células normais, seriam candidatos promissores para alvos imunoterapêuticos.

Sumário da Invenção [008] Para verificar a função molecular na carcinogênese colorretal e encontrar novos alvos terapêuticos para pacientes com carcinoma colorretal (CRC), foram produzidos perfis de expressão utilizando um microarranjo de cDNA consistindo de 23040 genes (Lin YM e outros, Oncogene 21: 4120-4128, 2002). Entre os genes que exibem uma expressão regulada para mais nos tumores colorretais, os presentes inventores se concentraram em TOM34 (Translocase de 34 kDa da membrana externa mitocontrial), porque seus níveis de expressão eram frequentemente aumentados em 16 de 20 amostras de CRC examinadas. Várias análises de northern blotting de tecidos revelaram que este gene era abundantemente expresso nos testículos e nos ovários e fracamente na próstata, no baço e no cólon, mas não em qualquer um dos 11 outros tecidos de adultos normais verificados. A mancha imunohistoquímica de TOM34 mostrou acúmulo significativo nos tecidos de CRC comparado com suas mucosas não-cancerosas correspondentes.

[009] Na presente invenção, foi confirmado que a TOM34 humana é frequentemente regulada para mais e que é expressa nos testículos e nos ovários, mas não nos outros 15 tecidos de adultos normais verificados. Uma vez que a supressão desta TOM34 por siRNA reduzia notavelmente o crescimento de células cancerosas, o produto gênico pode ser um alvo terapêutico potencial para tumores humanos assim como um marcador para diagnóstico útil.

[0010] Além disso, foi considerado que a TOM34 poderia servir como um TAA (Antígeno Associado a Tumor) que poderia induzir uma

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5/94 resposta imunológica celular significativa contra câncer de cólon. Para verificar esta hipótese, PBMCs coletadas de voluntários saudáveis foram estimuladas com peptídeos derivados de TOM34 e clones de CTL específicos ao peptídeo obtidos de forma bem-sucedida que também reconhecem e matam as células tumorais que expressam o antígeno. [0011] Especificamente, a transfecção de células de câncer de cólon HCT116 e RKO com RNA de interferência pequeno (siRNA) específico para TOM34, suprimiu eficientemente sua expressão e inibiu drasticamente o crescimento celular.

[0012] Além disso, foram verificados os peptídeos com sequências derivadas de TOM34 em relação ao seu potencial de servir como peptídeos com epítopos antigênicos e foi explorado um novo peptídeo com epítopo para imunoterapia eficiente para câncer que poderia induzir de forma significativa uma resposta imunológica celular contra câncer de cólon. As Células Mononucleares do Sangue Periférico (PBMC) de doadores saudáveis foram estimuladas utilizando os peptídeos que possuem sequências parciais de TOM34. Foram escolhidos tais peptídeos que foram previstos que se ligariam a HLA-A*2402. Foi identificado de forma bem-sucedida um antígeno específico cuja sequência derivava de TOM34 que poderia induzir linhagens de células de linfócitos T citotóxicos (CTL) exibindo citotoxicidade específica contra células que apresentam o antígeno da maneira restrita a HLA-A24. Os clones de CTL foram estabelecidos partindo destas linhagens de células CTL. A análise adicional dos clones de CTL mostrou que possuíam atividade citotóxica potente não apenas contra as células-alvo carregadas com o peptídeo, mas também contra as células que expressam de forma endógena TOM34. Além disso, o ensaio de inibição do alvo a frio indicou que os clones de CTL reconheciam especificamente o peptídeo de antígeno no complexo de molécula de MHC de Classe I. Estes resultados sugerem fortemente que o peptídeo

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6/94 é um peptídeo de epítopo restrito a HLA-A24 que pode induzir uma resposta imunológica potente e específica contra células de câncer de cólon que expressam TOM34.

[0013] Estas descobertas sugerem que TOM34 está envolvida no crescimento de células cancerosas e pode contribuir para o desenvolvimento de novos fármacos anticâncer e/ou para o diagnóstico para CRCs.

[0014] A presente invenção se baseia na descoberta de um padrão de expressão gênica de TOM34. A sequência de nucleotídeos e a sequência de aminoácidos de TOM34 são apresentadas na SEQ ID N°: 60 e 61, respectivamente. Estas sequências também estão disponíveis partindo do N² de Acesso do Genbank AB085681.

[0015] Consequentemente, a presente invenção fornece um método de diagnóstico ou de determinação de uma pré-disposição a câncer de cólon em um indivíduo através da determinação de um nível de expressão de TOM34 em uma amostra biológica derivada de um paciente, tal como uma amostra de tecido. Uma célula normal é uma obtida do tecido do cólon. Uma alteração, por exemplo, um aumento no nível de expressão de um gene quando comparado com um nível de controle normal do gene, indica que o indivíduo sofre de ou está em risco de desenvolver câncer de cólon.

[0016] Quando utilizado no contexto da presente invenção, o termo predisposição a câncer de cólon abrange a condição de um indivíduo de ser pré-disposto a, que tem uma tendência, uma prevalência, uma inclinação ou uma susceptibilidade a câncer de cólon. Além disso, o dito termo também abrange um indivíduo que está em risco de adquirir câncer de cólon.

[0017] No contexto da presente invenção, a expressão nível de controle se refere a um nível de expressão de proteína detectado em uma amostra de controle. Um nível de controle pode ser um único

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7/94 padrão de expressão derivado de uma única população de referência ou de um grande número de padrões de expressão. Por exemplo, o nível de controle pode ser um banco de dados de padrões de expressão de células testadas previamente. Um nível de controle normal se refere a um nível de expressão gênica detectado em um indivíduo saudável normal ou em uma população de indivíduos sabidos que não estão sofrendo de câncer de cólon. Um indivíduo normal é um sem sintomas clínicos de câncer de cólon.

[0018] Um aumento no nível de expressão de TOM34 detectado em uma amostra de teste quando comparado com um nível de controle normal indica que o indivíduo (do qual a amostra foi obtida) sofre ou está em risco de desenvolver CRC.

[0019] De acordo com a presente invenção, o nível de expressão gênica é considerado alterado quando a expressão do gene é aumentada em 10%, 25%, 50% quando comparado com o nível de controle. Alternativamente, um nível de expressão é considerado aumentado quando a expressão do gene é aumentada em pelo menos 0,1, pelo menos 0,2, pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 5 ou pelo menos 10 ou mais vezes quando comparado com um nível de controle. A expressão é determinada através da detecção de hibridização, por exemplo, uma sonda de TOM34 para um produto da transcrição gênica da amostra de tecido derivada do paciente.

[0020] No contexto da presente invenção, a amostra de tecido derivada do paciente é qualquer tecido obtido de um indivíduo de teste, por exemplo, um paciente que se sabe ou se suspeita que possua câncer de cólon. Por exemplo, o tecido pode conter uma célula epitelial. Mais particularmente, o tecido pode ser uma célula epitelial proveniente de um carcinoma colorretal.

[0021] A presente invenção fornece ainda métodos de identificação de um agente que inibe a expressão ou a atividade de TOM34, através

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8/94 do contato de uma célula de teste que expressa TOM34 com um composto de teste ou da determinação do nível de expressão de TOM34 ou da atividade de seu produto gênico. A célula de teste pode ser uma célula epitelial, tal como uma célula epitelial obtida de um carcinoma colorretal. Um decréscimo no nível de expressão de TOM34 ou da atividade de seu produto gênico quando comparado com um nível de controle do gene ou do produto gênico indica que o composto de teste é um inibidor de TOM34 e pode ser utilizado para reduzir um sintoma de câncer de cólon.

[0022] A presente invenção fornece ainda um kit que compreende um reagente de detecção que se liga aos ácidos nucléicos ou aos polipeptídeos de TOM34.

[0023] Os métodos terapêuticos da presente invenção incluem um método de tratamento ou de prevenção de câncer de cólon em um indivíduo que incluem a etapa de administração ao indivíduo de um antagonista ou inibidor de TOM34 que é, por exemplo, uma composição anti-senso ou uma composição de anticorpo. O antagonista ou o inibidor pode atuar no nível de ácido nucléico ou de proteína de forma a reduzir ou inibir a expressão ou a atividade de TOM34.

[0024] No contexto da presente invenção, a composição anti-senso reduz a expressão do gene alvo específico. Por exemplo, a composição anti-senso pode conter um nucleotídeo que é complementar à sequência TOM34. Alternativamente, o presente método pode incluir as etapas de administração a um indivíduo de uma composição de RNA de interferência pequeno (siRNA). No contexto da presente invenção, a composição de siRNA reduz a expressão de TOM34. Ainda em um outro método, o tratamento ou a prevenção de câncer de cólon em um indivíduo pode ser realizada através da administração a um indivíduo de uma composição de ribozima. No contexto da presente invenção, a composição de ribozima específica ao ácido nucléico reduz a expressão

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9/94 de TOM34. Atualmente, o efeito de inibição do siRNA para TOM34 foi confirmado. Por exemplo, foi claramente mostrado que o siRNA para TOM34 inibe a proliferação celular de células de câncer de cólon na seção de exemplos. Assim, na presente invenção, TOM34 é um alvo terapêutico preferível do câncer de cólon.

[0025] A presente invenção inclui ainda vacinas e métodos de vacinação. Por exemplo, um método de tratamento ou de prevenção de câncer de cólon em um indivíduo pode envolver a administração ao indivíduo de uma vacina que contém um polipeptídeo codificado por um ácido nucléico de TOM34 ou um fragmento imunologicamente ativo de tal polipeptídeo. No contexto da presente invenção, um fragmento imunologicamente ativo é um polipeptídeo que é mais curto em comprimento que a proteína que ocorre naturalmente de comprimento completo que ainda induz uma resposta imunológica análoga à induzida pela proteína de comprimento completo. Por exemplo, um fragmento imunologicamente ativa deve ter pelo menos 8 resíduos de comprimento e ser capaz de estimular uma célula imunológica tal como uma célula T ou uma célula B. O estímulo da célula imunológica pode ser medido através da detecção da proliferação celular, da elaboração de citocinas (por exemplo, IL-2) ou da produção de um anticorpo.

[0026] A não ser que seja definido de outra maneira, todos os termos técnicos e científicos utilizados aqui possuem o mesmo significado que é comumente entendido por um versado na técnica à qual esta invenção pertence. Embora os métodos e os materiais similares ou equivalentes aos descritos aqui possam ser utilizados na prática ou no teste da presente invenção, os métodos e os materiais adequados são descritos abaixo. Todas as publicações, os pedidos de patentes, as patentes e outras referências mencionados aqui são incorporados como referência aqui em sua totalidade. Nada aqui deve ser interpretado como uma admissão de que a invenção não é intitulada

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10/94 para antecipar tal divulgação em virtude da invenção anterior.

[0027] No caso de conflito, o presente relatório descritivo, incluindo as definições, controlará. Em adição, os materiais, os métodos e os exemplos são ilustrativos apenas e não-pretendidos como sendo limitantes.

[0028] Uma vantagem dos métodos descritos aqui é que a doença é identificada antes da detecção dos sintomas clínicos evidentes de câncer de cólon. Outras características e vantagens da invenção serão evidentes partindo da descrição detalhada a seguir e de acordo com as reivindicações.

Breve Descrição das Figuras [0029] A Figura 1 representa o nível de expressão do gene TOM34 em vários tecidos. (A) Análise de RT-PCR semi-quantitativa de TOM34 em tecidos de câncer de cólon e sua mucosa não-cancerosa correspondente. T, tecido tumoral; N, tecido normal. A expressão de GAPDH serviu como um controle interno. (B) Análise de northern blot de TOM34 de vários tecidos. O produto da transcrição de TOM34 tem aproximadamente 2,0 kb de tamanho.

[0030] A Figura 2 representa o nível de expressão da proteína codificada pelo gene TOM34 em vários tecidos. (A) Análise de Western Blot de TOM34 em tecidos de câncer de cólon e sua mucosa nãocancerosa correspondente. T, tecido tumoral; N, tecido normal. (B) Expressão de TOM34 em linhagens de células cancerosas. A expressão da beta-actina serviu como um controle interno.

[0031] A Figura 3 representa um resultado da mancha imunohistoquímica de TOM34 em tecidos de câncer de cólon. (A e B) Imagens representativas da mancha em células cancerosas e nãocancerosas. Aumento: X40, (C e D) Imagens de mucosa normal e tecidos cancerosos (C normal, D; tumor). Aumento: X200.

[0032] A Figura 4 representa o efeito de supressão do siRNA de

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TOM34 sobre a expressão do gene TOM34 ou sobre o crescimento celular da linhagem de células CRC. (A) Efeito dos siRNAs sobre a expressão de TOM34 em células HCT116. A expressão de TOM34 foi analisada através da análise de western blot. A expressão da betaactina serviu como um controle interno. O siRNA específico a EGFP (siEGFP) foi preparado para um controle negativo. (B) Efeito de TOM34siRNAs sobre o crescimento de células HCT116. A variabilidade de células HCT116 em resposta ao EGFP-siRNA ou aos TOM34-siRNAs foi medida através do ensaio MTT em triplicata. Barras de erro, SD; O asterisco significa uma diferença significativa (P<0,0001) determinada por um teste F de Scheff.

[0033] A Figura 5 represente o efeito citotóxico da linhagem CTL induzido pelo peptídeo 10-mer TOM34-299. As linhagens CTL produzidas pelo peptídeo 10-mer TOM34-299 exibiam citotoxicidade específica ao peptídeo. As linhagens CTL exibiam alta atividade citotóxica contra células-alvo (TISI) carregadas com TOM34-299, enquanto não exibiam atividade citotóxica significativa contra as mesmas células-alvo (TISI) sem o peptídeo carregado. Isto demonstra que as linhagens CTL possuem a citotoxicidade específica ao peptídeo. [0034] A Figura 6 representa a citotoxicidade potente e específica ao peptídeo das linhagens CTL produzidas por TOM34-299. As linhagens CTL exibiam citotoxicidade potente e específica ao antígeno detectável na proporção de E/T tão baixa quanto 1,2.

[0035] A Figura 7 representa a citotoxicidade potente de clones de

CTL. Podem ser estabelecidos os clones de CTL com citotoxicidade muito potente que são específicos para TOM34-299. Os clones de CTL estabelecidos partindo das linhagens CTL contra TOM34-299 exibiam atividades de morte variáveis, com algumas das quais possuindo atividade extremamente potente.

[0036] A Figura 8 representa a especificidade a HLA dos clones de

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CTL produzidos por TOM34-299. Os clones de CTL produzidos por TOM34-299 reconhecem e lisam as células tumorais que expressam de forma endógena TOM34 da maneira restrita por HLA. As atividades citotóxicas contra as linhagens de células de câncer de cólon DLD-1 e HT29, que expressam de forma endógena TOM34, foram testadas utilizando os dois clones de CTL produzidos por TOM34-299 como células efetoras. As células SNU-C2A foram utilizadas como o alvo que expressa de forma endógena TOM34, mas que não expressa HLA-A24. Os Clones de CTL exibiam altas atividades citotóxicas tanto contra células DLD-1 quanto HT29 que expressam TOM34 assim como HLAA24. Por outro lado, não exibiam atividade citotóxica significativa contra as células SNU-C2A que expressam TOM34, mas não HLA-A24.

[0037] A Figura 9 representa a especificidade a HLA dos clones de

CTL produzidos por TOM34-299. O clone de CTL produzido por TOM34299 reconhece especificamente TOM34 da maneira restrita a HLA-A24. O ensaio de inibição do alvo frio foi realizado como descrito nos Materiais e Métodos. As células HT29 rotuladas por Na2⁵¹CrO4 foram preparadas como o alvo quente, enquanto as células TISI com ou sem o peptídeo TOM34-299 carregado foram utilizadas sem a marcação com ⁵¹Cr como os alvos frios. A proporção de E/T foi fixada em 20. A atividade citotóxica do clone de CTL contra as células HT29 foi inibida pela adição de células TISI apenas quando carregadas com o peptídeo. [0038] A Figura 10 representa a especificidade da atividade citotóxica do clone de CTL produzida por TOM34-299. A atividade de citotoxicidade do clone de CTL produzido por TOM34-299 é especificamente bloqueada por anticorpos que reconhecem antígenos de superfície de células T HLA de classe I ou CD8. A atividade citotóxica do clone de CTL foi determinada contra as células HT29 na presença de anticorpos que reconhecem antígenos de superfície de células T. A atividade de CTL foi claramente bloqueada pela adição de anticorpos

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13/94 que reconhecem HLA de Classe I ou CD8 e foi marginalmente afetada pela adição de anticorpos para HLA de Classe II ou CD4, enquanto não era inibida de forma alguma através da adição do anticorpo de controle combinado com o isotipo.

Descrição Detalhada da Invenção [0039] As palavras um, uma, o e a como utilizado aqui significam pelo menos um a não ser que seja indicado especificamente de outra maneira. Ao longo de todo este relatório descritivo e as reivindicações a seguir, a não ser que o contexto requeira de outra maneira, a palavra compreendem e variações tais como compreende e compreendendo, serão entendidas como implicando a inclusão de um número inteiro ou etapa citada ou um grupo de números inteiros ou etapas, mas não a exclusão de qualquer outro número inteiro ou etapa ou grupo de números inteiros ou etapas.

[0040] A presente invenção se baseia em parte na descoberta da expressão elevada de TOM34 em células de tecidos do cólon de pacientes com CRC. A expressão gênica elevada foi indicada através da utilização de um sistema de microarranjo compreensivo de cDNA.

[0041] Utilizando um microarranjo de cDNA contendo 23.040 genes, os perfis de expressão gênica compreensivos de 20 pacientes foram construídos previamente. A TOM34 é expressa em altos níveis em pacientes com CRC.

[0042] A TOM34 identificada aqui é utilizada com a finalidade de diagnóstico como marcador de CRC e como alvo gênico, cuja expressão é alterada para tratar ou aliviar um sintoma de CRC.

[0043] Através da medida da expressão de TOM34 em uma amostra de células, é diagnosticado o CRC. Similarmente, medindo a expressão de TOM34 em resposta a vários agentes e podem ser identificados agentes para o tratamento de CRC.

[0044] A invenção envolve a determinação (por exemplo, a medida)

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14/94 da expressão de TOM34. Utilizando a informação de sequência fornecida pelas entradas no banco de dados GeneBank® para a sequência de TOM34, a TOM34 é detectada e medida utilizando técnicas bem-conhecidas por um versado na técnica. Por exemplo, a sequência dentro das entradas nos bancos de dados de sequências correspondente a TOM34, é utilizada para construir sondas para a detecção da sequência de RNA de TOM34, por exemplo, na análise de hibridização por northern blot. Como um outro exemplo, as sequências podem ser utilizadas para construir iniciadores para amplificar especificamente TOM34, por exemplo, em métodos de detecção baseados na amplificação tal como a reação em cadeia da polimerase baseada na transcrição inversa.

[0045] O nível de expressão de TOM34 na população de células de teste, por exemplo, uma amostra de tecidos derivada de um paciente é então comparada com o nível de expressão da TOM34 em uma população de referência. A população de células de referência inclui uma ou mais células para as quais o parâmetro comparado é conhecido, isto é, células de CRC ou células sem ser de CRC.

[0046] O fato ou não de um padrão de expressão gênica na população de células de teste comparado com o da população de células de referência indicar CRC ou uma pré-disposição ao mesmo depende da composição da população de células de referência. Por exemplo, se a população de células de referência for composta de células sem ser de CRC, um padrão de expressão gênica similar na população de células de teste e na população de células de referência indica que a população de células de teste não é de CRC. De forma inversa, se a população de células de referência for constituída de células de CRC, um perfil de expressão gênica similar entre a população de células de teste e a população de células de referência indica que a população de células de teste inclui células de CRC.

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15/94 [0047] Um nível de expressão de TOM34 em uma população de células de teste é considerado alterado em níveis de expressão se seu nível de expressão variar da população de células de referência em mais que 1,0, 1,5, 2,0, 5,0, 10,0 ou mais vezes partindo do nível de expressão da TOM34 correspondente na população de células de referência.

[0048] A expressão gênica diferencial entre uma população de células de teste e uma população de células de referência é normalizada em um ácido nucléico de controle, por exemplo, um gene de manutenção da casa. Por exemplo, um ácido nucléico de controle é um que é sabido que não difere dependendo da condição cancerosa ou não-cancerosa da célula. Os níveis de expressão do ácido nucléico de controle no ácido nucléico de teste e de referência podem ser utilizados para normalizar os níveis de sinal nas populações comparadas. Os genes de controle incluem β-actina, gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase ou proteína P1 ribossomal.

[0049] A população de células de teste é comparada com várias populações de células de referência. Cada uma das várias populações de referência pode diferir em relação ao parâmetro conhecido. Assim, uma população de células de teste pode ser comparada com uma segunda população de células de referência conhecida por conter, por exemplo, células de CRC, assim como uma segunda população de referência conhecida por conter, por exemplo, células sem ser de CRC (células normais). A célula de teste é incluída em um tipo de tecido ou uma amostra de células de um indivíduo que se sabe que contém ou é suspeito de conter, células de CRC.

[0050] A célula de teste é obtida partindo de um tecido corporal ou de um fluido corporal, por exemplo, fluido biológico (tal como sangue ou urina). Por exemplo, a célula de teste é purificada de um tecido. Preferencialmente, a população de células de teste compreende uma

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16/94 célula epitelial. A célula epitelial é proveniente de um tecido conhecido por ser ou suspeito de ser um CRC.

[0051] As células na população de células de referência são derivadas de um tipo de tecido que é similar ao da célula de teste. Opcionalmente, a população de células de referência é uma linhagem de células, por exemplo, uma linhagem de células de CRC (controle positivo) ou uma linhagem de células sem ser de CRC (controle negativo). Alternativamente, a população de células de controle é derivada de um banco de dados de informação molecular derivada de células para as quais o parâmetro ou o estado de saúde analisado é conhecido.

[0052] O indivíduo é preferencialmente um mamífero. O mamífero pode ser, por exemplo, um ser humano, um primata não-humano, um camundongo, um rato, um cachorro, um gato, um cavalo ou uma vaca. [0053] A expressão de TOM34 divulgada aqui é determinada no nível de proteína ou de ácido nucléico utilizando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, a análise de hibridização por Northern utilizando sondas que reconhecem especificamente a sequência pode ser utilizada para determinar a expressão gênica. Alternativamente, a expressão é medida utilizando ensaios da PCR baseados na transcrição inversa, por exemplo, utilizando iniciadores específicos para TOM34. A expressão é também determinada no nível de proteína, isto é, através da medida dos níveis de polipeptídeo codificado pelo produto gênico descrito aqui ou da atividade biológica do mesmo. Tais métodos são bem-conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, ensaios imunológicos baseados em anticorpos para a proteína codificada por TOM34. A atividade biológica da proteína codificada pelo gene também é bem-conhecida.

Diagnóstico de CRC:

[0054] No contexto da presente invenção, o CRC é diagnosticado

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17/94 através da medida do nível de expressão de TOM34 de uma população de células de teste, (isto é, uma amostra biológica derivada de um paciente). Preferencialmente, a população de células de teste contém uma célula epitelial, por exemplo, uma célula obtida de tecido de cólon. A expressão gênica também pode ser medida partindo do sangue ou outros fluidos corporais tal como a urina. Outras amostras biológicas podem ser utilizadas para medir os níveis de proteína. Por exemplo, o nível de proteína no sangue ou do soro derivado de um indivíduo que será diagnosticado pode ser medido através de ensaio imunológico ou outro ensaio biológico convencional.

[0055] A expressão de TOM34 é determinada na amostra de células de teste ou biológica e comparada com o nível de expressão de controle normal associado com a TOM34 analisada. Um nível de controle normal é um perfil de expressão de TOM34 tipicamente observado em uma população conhecida por não estar sofrendo de CRC. Uma alteração (por exemplo, um aumento) no nível de expressão na amostra de tecido derivada de paciente de TOM34 indica que o indivíduo está sofrendo de ou está em risco de desenvolver CRC. Por exemplo, um aumento na expressão de TOM34 na população de teste quando comparada com o nível de controle normal indica que o indivíduo está sofrendo de ou está em risco de desenvolver CRC.

[0056] A alteração de TOM34 na população de teste quando comparada com o nível de controle normal indica que o indivíduo sofre de ou está em risco de desenvolver CRC.

[0057] O nível de expressão de TOM34 em uma amostra biológica pode ser estimado através da quantificação do mRNA que corresponde a ou da proteína codificada por TOM34. Por exemplo, os níveis de mRNA de TOM34 podem ser estimados por Northern blotting ou RTPCR. Uma vez que as sequências de nucleotídeos de TOM34 são conhecidas, qualquer versado na técnica pode planejar as sequências

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18/94 de nucleotídeos para sondas ou iniciadores para a quantificação de TOM34. Por exemplo, o conjunto de iniciadores específicos para TOM34 compreendendo a sequência de nucleotídeos das SEQ ID N°^s: 43 e 44 é preferencialmente um iniciador.

[0058] Ainda, o nível de expressão da TOM34 pode ser analisado com base na atividade ou na quantidade da proteína TOM34. Um método para a determinação da quantidade da proteína TOM34 é mostrado abaixo. Por exemplo, os métodos de ensaio imunológico são úteis para a determinação das proteínas nos materiais biológicos. Quaisquer materiais biológicos podem ser utilizados como a amostra biológica para a determinação da proteína ou de sua atividade contanto que o gene TOM34 seja expresso na amostra de um paciente com câncer de cólon. Por exemplo, a amostra de tecido de cólon pode ser mencionada como tal amostra biológica. Entretanto, fluidos corporais tais como sangue e urina podem também ser analisados. Por outro lado, um método adequado pode ser selecionado para a determinação da atividade de uma proteína codificada pelo gene TOM34 de acordo com a atividade de uma proteína que será analisada.

[0059] O nível de expressão do gene TOM34 em uma amostra biológica é estimado e comparado com aquele em uma amostra normal (por exemplo, uma amostra derivada de um indivíduo que não está doente). Quando tal comparação mostra que o nível de expressão dos genes é maior que aquele na amostra normal, o indivíduo é julgado como estando afetado com câncer de cólon. O nível de expressão do gene TOM34 nas amostras biológicas de um indivíduo normal e de um indivíduo que será diagnosticado pode ser determinado ao mesmo tempo. Alternativamente, faixas normais dos níveis de expressão podem ser determinadas por um método estatístico baseado nos resultados obtidos através da análise do nível de expressão do gene em amostras previamente coletadas de um grupo de controle. Um resultado

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19/94 obtido através da comparação da amostra de um indivíduo é comparado com a faixa normal; quando o resultado não fica dentro da faixa normal, o indivíduo é julgado como estando afetado com ou como estando em risco de desenvolver câncer de cólon.

[0060] Na presente invenção, é também fornecido um agente de diagnóstico para diagnosticar câncer de cólon. O agente de diagnóstico da presente invenção compreende um composto que se liga com um polinucleotídeo ou um polipeptídeo do gene TOM34. Preferencialmente, um oligonucleotídeo que se hibridiza com o polinucleotídeo do gene TOM34 ou um anticorpo que se liga com o polipeptídeo codificado pelo gene TOM34 pode ser utilizado como tal composto. Além disso, também um aptâmero, tal como um aptâmero de RNA, DNA ou de peptídeo pode ser utilizado como tal composto. Preferencialmente, o agente de diagnóstico compreende uma marcação detectável tal como uma marcação fluorescente, luminescente ou bioluminescente que é comumente conhecida na técnica.

[0061] O presente método de diagnóstico de câncer de cólon pode ser aplicado para a avaliação da eficiência do tratamento de câncer de cólon em um indivíduo. De acordo com o método, uma amostra biológica, tal como uma população de células de teste, é obtida de um indivíduo sofrendo tratamento para câncer de cólon. O método para a avaliação pode ser realizado de acordo com métodos convencionais de diagnóstico de câncer de cólon.

[0062] Se desejado, as amostras biológicas são obtidas do indivíduo em vários pontos de tempo antes, durante ou depois do tratamento. O nível de expressão do gene TOM34, na amostra biológica é então determinado e comparado com um nível de controle derivado, por exemplo, de uma população de células de referência que inclui células cuja condição de câncer de cólon (isto é, célula cancerosa ou célula não-cancerosa) é conhecida. O nível de controle é determinado

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20/94 em uma amostra biológica que não foi exposta ao tratamento.

[0063] Se o nível de controle for derivado de uma amostra biológica que não contém célula cancerosa, uma similaridade entre o nível de expressão na amostra biológica derivada do indivíduo e o nível de controle indica que o tratamento é eficiente. Uma diferença entre o nível de expressão do gene TOM34 na amostra biológica derivada do indivíduo e o nível de controle indica um resultado ou um prognóstico clínico menos favorável.

Identificação de agentes que inibem a expressão de TOM34:

[0064] Um agente que inibe a expressão de TOM34 ou a atividade de seu produto gênico pode ser identificado através do contato de uma população de células de teste que expressa TOM34 com um agente de teste e então da determinação do nível de expressão de TOM34 ou da atividade de seu produto gênico. Um decréscimo no nível de expressão de TOM34 ou no nível de atividade de seu produto gênico na presença do agente quando comparado com o nível de expressão ou de atividade na ausência do agente de teste indica que o agente é um inibidor de TOM34 e que é útil na inibição de CRC.

[0065] A população de células de teste pode ser qualquer célula que expressa TOM34. Por exemplo, a população de células de teste pode conter uma célula epitelial, tal como uma célula derivada de tecido de cólon. Além disso, a célula de teste pode ser uma linhagem de células imortalizadas derivada de uma célula de carcinoma ou de câncer colorretal. Alternativamente, a célula de teste pode ser uma célula que foi transfectada com TOM34 ou que foi transfectada com uma sequência reguladora (por exemplo, uma sequência promotora) de TOM34 ligada de forma operacional a um gene repórter.

Avaliação da eficiência do tratamento de CRC em um indivíduo:

[0066] A TOM34 expressa de forma diferencial identificada aqui também permite que o curso de tratamento de CRC seja monitorado.

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Neste método, é fornecida uma população de células de teste proveniente de um indivíduo sofrendo tratamento para CRC. Se desejado, as populações de células de teste são obtidas do indivíduo em vários pontos de tempo, antes, durante e/ou depois do tratamento. A expressão de TOM34 na população de células é então determinada e comparada com uma população de células de referência que inclui células cuja condição de CRC é conhecida. No contexto da presente invenção, as células de referência não devem ter sido expostas ao tratamento de interesse.

[0067] Se a população de células de referência não contiver células de CRC, uma similaridade na expressão de TOM34 na população de células de teste e na população de células de referência indica que o tratamento de interesse é eficiente. Entretanto, uma diferença na expressão de TOM34 na população de teste e em uma população de células de referência de controle normal indica um resultado ou um prognóstico clínico menos favorável. Similarmente, se a população de células de referência contiver células de CRC, uma diferença entre a expressão de TOM34 na população de células de teste e na população de células de referência indica que o tratamento de interesse é eficiente, enquanto uma similaridade na expressão de TOM34 na população de teste e em uma população de células de referência de controle de câncer indica um resultado ou um prognóstico clínico menos favorável. [0068] Adicionalmente, o nível de expressão de TOM34 determinado em uma amostra biológica derivada de um paciente obtida após o tratamento (isto é, níveis pós-tratamento) pode ser comparado com o nível de expressão de TOM34 determinado em uma amostra biológica derivada do indivíduo obtida antes do início do tratamento (isto é, níveis predeterminados). Um decréscimo no nível de expressão de TOM34 em uma amostra pós-tratamento indica que o tratamento de interesse é eficiente enquanto que um aumento ou a manutenção no

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22/94 nível de expressão na amostra pós-tratamento indica um resultado ou um prognóstico clínico menos favorável.

[0069] Como utilizado aqui, o termo eficiente indica que o tratamento leva a uma redução na expressão de um gene patologicamente regulado para mais ou um decréscimo no tamanho, prevalência ou potencial metastásico de CRC em um indivíduo. Quando um tratamento de interesse é aplicado de forma profilática, o termo eficiente significa que o tratamento retarda ou previne um CRC de se formar ou retarda, previne ou alivia um sintoma de CRC clínico. A avaliação de tumores de cólon pode ser feita utilizando protocolos clínicos padronizados.

[0070] Em adição, a eficiência pode ser determinada em associação com qualquer método conhecido de diagnóstico ou de tratamento de CRC. O CRC pode ser diagnosticado, por exemplo, através da identificação de anomalias sintomáticas, por exemplo, perda de peso, dor abdominal, dor nas costas, anorexia, náusea, vômito e mal-estar, fraqueza e icterícia generalizados.

Seleção de um agente terapêutico para o tratamento de CRC que seja apropriado para um indivíduo particular:

[0071] As diferenças na constituição genética de indivíduos podem resultar em diferenças em suas capacidades relativas de metabolizar vários fármacos. Um agente que é metabolizado em um indivíduo para atuar como um agente anti-CRC pode se manifestar através da indução de uma alteração em um padrão de expressão gênica nas células do indivíduo partindo do característico de uma condição cancerosa para um padrão de expressão gênica característico de uma condição nãocancerosa. Consequentemente, a TOM34 expressa de forma diferencial divulgada aqui permite que um suposto inibidor terapêutico ou profilático de CRC seja testado em uma população de células de teste proveniente de um indivíduo selecionado a fim de determinar se o agente é um

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23/94 inibidor adequado de CRC no indivíduo.

[0072] Para a identificação de um inibidor de CRC que é apropriado para um indivíduo específico, uma população de células de teste proveniente do indivíduo é exposta a um agente terapêutico e a expressão de TOM34 é determinada.

[0073] No contexto do método da presente invenção, a população de células de teste contém uma célula de CRC que expressa TOM34. Preferencialmente, a célula de teste é uma célula epitelial. Por exemplo, uma população de células de teste pode ser incubada na presença de um agente candidato e o padrão de expressão gênica da população de células de teste pode ser medido e comparado com um ou mais perfis de referência, por exemplo, um perfil de expressão de referência de CRC ou um perfil de expressão de referência sem ser de CRC.

[0074] Um decréscimo na expressão de TOM34 em uma população de células de teste relativo a uma população de células de referência contendo CRC indica que o agente possui potencial terapêutico.

[0075] No contexto da presente invenção, o agente de teste pode ser qualquer composto ou composição. Os exemplos de agentes de teste incluem, mas não estão limitados a agentes imunomoduladores. Ensaios de seleção para a identificação de agentes terapêuticos: [0076] Utilizando o gene TOM34, as proteínas codificadas pelo gene ou pela região reguladora da transcrição do gene, podem ser selecionados compostos que alteram a expressão do gene ou a atividade biológica de um polipeptídeo codificado pelo gene. Tais compostos são utilizados como agentes farmacêuticos para o tratamento ou para a prevenção de CRC.

[0077] Portanto, a presente invenção fornece um método de seleção de um composto para o tratamento ou para a prevenção de CRC utilizando o polipeptídeo TOM34. Uma modalidade deste método de seleção compreende as etapas de:

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a) contato de um composto de teste com um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo de TOM34;

b) detecção da atividade de ligação entre o polipeptídeo e o composto de teste; e

c) seleção do composto de teste que se liga ao polipeptídeo.

[0078] O polipeptídeo de TOM34 que será utilizado para a seleção pode ser um polipeptídeo recombinante ou uma proteína derivada da natureza ou um peptídeo parcial da mesma. O polipeptídeo que será colocado em contato com o composto de teste pode ser, por exemplo, um polipeptídeo purificado, uma proteína solúvel, uma forma ligada a um veículo ou uma proteína de fusão fundida com outros polipeptídeos. [0079] Como um método de seleção de proteínas, por exemplo, que se ligam ao polipeptídeo de TOM34 utilizando o polipeptídeo de TOM34, podem ser utilizados muitos métodos bem-conhecidos por um versado na técnica. Tal seleção pode ser realizada, por exemplo, através do método de imunoprecipitação, especificamente, da maneira a seguir. O gene que codifica o polipeptídeo de TOM34 é expresso nas células hospedeiras (por exemplo, animal) e dessa maneira através da inserção do gene em um vetor de expressão para genes estranhos, tais como pSV2neo, pcDNA I, pcDNA3.1, pCAGGS e pCD8. O promotor que será utilizado para a expressão pode ser qualquer promotor que possa ser utilizado comumente e inclui, por exemplo, o promotor inicial de SV40 (Rigby em Williamson (ed.), Genetic Engineering, vol. 3. Academic Press, Londres, 83-141 (1981)), o promotor EF-α (Kim DW e outros, Gene 91: 217-23 (1990)), o promotor CAG (Niwa e outros, Gene 108: 193-9 (1991)), o promotor RSV LTR (Cullen, Methods in Enzymology 152: 684-704 (1987)) o promotor SRa (Takebe e outros, Mol Cell Biol 8: 466-72 (1988)), o promotor inicial imediato de CMV (Seed e Aruffo, Proc Natl Acad Sci USA 84: 3365-9 (1987)), o promotor tardio de SV40 (Gheysen e Fiers, J Mol Appl Genet 1: 385-94 (1982)), o promotor tardio

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25/94 de Adenovírus (Kaufman e outros, Mol Cell Biol 9: 946-58 (1989)), o promotor TK de HSV e assim por diante. A introdução do gene em células hospedeiras para a expressão de um gene estranho pode ser realizada de acordo com quaisquer métodos, por exemplo, o método de eletroporação (Chu e outros, Nucleic Acids Res 15: 1311-26 (1987)), o método de fosfato de cálcio (Chen e Okayama, Mol Cell Biol 7: 2745-52 (1987)), o método de DEAE dextran (Lopata e outros, Nucleic Acids Res 12: 5707-17 (1984); Sussman e Milman, Mol Cell Biol 4: 1641-3 (1984)), o método da Lipofectina (Derijard, B Cell 76: 1025-37 (1994); Lamb e outros, Nature Genetics 5: 22-30 (1993); Rabindran e outros, Science 259: 230-4 (1993)) e assim por diante. O polipeptídeo codificado pelo gene TOM34 pode ser expresso na forma de uma proteína de fusão que compreende um sítio de reconhecimento (epítopo) de um anticorpo monoclonal através da introdução do epítopo do anticorpo monoclonal, cuja especificidade foi revelada, para o terminal N ou C do polipeptídeo. Pode ser utilizado um sistema de epítopo-anticorpo disponível comercialmente (Experimental Medicine 13: 85-90 (1995)). Os vetores que podem expressar uma proteína de fusão com, por exemplo, βgalactosidase, proteína de ligação à maltose, glutationa S-transferase, proteína de fluorescência verde (GFP) e assim por diante através do uso de seus sítios de clonagem múltipla estão disponíveis comercialmente.

[0080] É também relatada uma proteína de fusão preparada através da introdução de apenas epítopos pequenos que consistem em vários até uma dúzia de aminoácidos de forma a não alterar a propriedade do polipeptídeo de TOM34 através da fusão. Os epítopos, tais como polihistidina (His-tag), HA agregado de influenza, c-myc humano, FLAG, glicoproteína do vírus da estomatite vesicular (VSV-GP), proteína 10 do gene T7 (T7-tag), glicoproteína do vírus herpes simples humano (HSVtag), E-tag (um epítopo no fago monoclonal) e tais e anticorpos

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26/94 monoclonais que reconhecem os mesmos podem ser utilizados como o sistema de epítopo-anticorpo para a seleção de proteínas que se ligam ao polipeptídeo TOM34 (Experimental Medicine 13: 85-90 (1995)).

[0081] Na imunoprecipitação, é formado um complexo imunológico através da adição destes anticorpos ao lisado de células preparado utilizando um detergente apropriado. O complexo imunológico consiste no polipeptídeo de TOM34, um polipeptídeo que compreende a capacidade de ligação com o polipeptídeo e um anticorpo. A imunoprecipitação também pode ser realizada utilizando anticorpos contra o polipeptídeo de TOM34, além da utilização de anticorpos contra os epítopos anteriores, cujos anticorpos podem ser preparados como descrito anteriormente.

[0082] Um complexo imunológico pode ser precipitado, por exemplo, pela Proteína A sepharose ou pela Proteína G sepharose quando o anticorpo for um anticorpo IgG de camundongo. Se o polipeptídeo codificado pelo gene TOM34 for preparado na forma de uma proteína de fusão com um epítopo, tal como GST, um complexo imunológico pode ser formado da mesma maneira que no uso do anticorpo contra o polipeptídeo TOM34, utilizando uma substância que se liga especificamente a estes epítopos, tal como a glutationa Sepharose 4B.

[0083] A imunoprecipitação pode ser realizada como a seguir ou de acordo com, por exemplo, os métodos na literatura (Harlow e Lane, Antibodies, 511-52, Cold Spring Harbor Laboratory publications, Nova York (1988)).

[0084] A SDS-PAGE é comumente utilizada para a análise de proteínas imunoprecipitadas e a proteína ligada pode ser analisada através do peso molecular da proteína utilizando géis com uma concentração apropriada. Uma vez que a proteína ligada ao polipeptídeo de TOM34 é difícil de detectar através de um método de

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27/94 mancha comum, tal como a mancha com Coomassie ou a mancha com prata, a sensibilidade da detecção para a proteína pode ser aumentada através do cultivo das células em meio de cultura contendo um isótopo radioativo, 35S-metionina ou 35S-cisteína, da marcação das proteínas nas células e da detecção das proteínas. A proteína alvo pode ser purificada diretamente do gel de SDS-poliacrilamida e sua sequência pode ser determinada, quando o peso molecular de uma proteína tiver sido revelado.

[0085] Como um método para a seleção de proteínas que se ligam ao polipeptídeo de TOM34 utilizando o polipeptídeo, por exemplo, pode ser utilizada a análise de West-Western (Skolnik e outros, Cell 65: 8390 (1991)). Especificamente, uma proteína que se liga ao polipeptídeo de TOM34 pode ser obtida através da preparação de uma biblioteca de cDNAs partindo de células, tecidos, órgãos (por exemplo, tecidos tais como testículos ou ovários) ou células cultivadas (por exemplo, CW2, DLD1, HCT116, HCT15, RKO, LS174T) esperadas que expressem uma proteína que se liga com o polipeptídeo de TOM34 utilizando um vetor de fato (por exemplo, ZAP), expressando a proteína em LB-agarose, fixando a proteína expressa em um filtro, reagindo o polipeptídeo de TOM34 purificado e rotulado com o filtro anterior e detectando as placas que expressam proteínas ligadas ao polipeptídeo de TOM34 de acordo com a marcação. O polipeptídeo da invenção pode ser rotulado através da utilização da marcação entre biotina e avidina ou através da utilização de um anticorpo que se liga especificamente ao polipeptídeo de TOM34 ou um peptídeo ou um polipeptídeo (por exemplo, GST) que é fundido com o polipeptídeo de TOM34. Os métodos que utilizam radioisótopo ou fluorescência e tal também podem ser utilizados.

[0086] Alternativamente, em uma outra modalidade do método de seleção da presente invenção, pode ser utilizado um sistema de dois híbridos utilizando células (MATCHMAKER Two-Hybrid system,

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MATCHMAKER Mammalian Two-Hybrid Assay Kit, MATCHMAKER one-Hybrid system (Clontech); HybriZap Two-Hybrid Vector System (Stratagene); as referências Dalton e Treisman, Cell 68: 597-612 (1992), Fields e Sternglanz, Trends Genet 10: 286-92 (1994)).

[0087] No sistema de dois híbridos, o polipeptídeo da invenção é fundido com a região de ligação de SRF ou com a região de ligação de GAL4 e expresso em células de levedura. Uma biblioteca de cDNAs é preparada partindo das células esperadas que expressem uma proteína que se liga ao polipeptídeo da invenção, de forma que a biblioteca, quando expressa, é fundida com a região de ativação da transcrição de VP16 ou de GAL4. A biblioteca de cDNAs é então introduzida nas células de levedura anteriores e o cDNA derivado da biblioteca é isolado dos clones positivos detectados (quando uma proteína que se liga ao polipeptídeo da invenção é expressa nas células de levedura, a ligação dos dois ativa um gene repórter, tornando os clones positivos detectáveis). Uma proteína codificada pelo cDNA pode ser preparada através da introdução do cDNA isolado anterior em E. coli e da expressão da proteína.

[0088] Como um gene repórter, por exemplo, o gene Ade2, o gene lacZ, o gene CAT, o gene da luciferase e tais podem ser utilizados em adição ao gene HIS3.

[0089] Um composto que se liga ao polipeptídeo codificado pelo gene TOM34 também pode ser selecionado utilizando cromatografia por afinidade. Por exemplo, o polipeptídeo da invenção pode ser imobilizado em um veículo de uma coluna de afinidade e um composto de teste, contendo uma proteína capaz de se ligar ao polipeptídeo da invenção, é aplicado na coluna. Um composto de teste aqui pode ser, por exemplo, extratos de células, lisados de células etc. Após o carregamento do composto de teste, a coluna é lavada e os compostos ligados ao polipeptídeo da invenção podem ser preparados.

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29/94 [0090] Quando o composto de teste for uma proteína, a sequência de aminoácidos da proteína obtida é analisada, um oligo DNA é sintetizado com base na sequência e as bibliotecas de cDNAs são verificadas utilizando o oligo DNA como uma sonda para a obtenção de um DNA que codifica a proteína.

[0091] Um biossensor que utiliza o fenômeno de ressonância de plasmon de superfície pode ser utilizado como um meio para a detecção ou para a quantificação do composto ligado na presente invenção. Quando tal biossensor for utilizado, a interação entre o polipeptídeo da invenção e um composto de teste pode ser observada em tempo real na forma de um sinal de ressonância de plasmon de superfície, utilizando apenas uma quantidade mínima de polipeptídeo e sem marcação (por exemplo, BIAcore, Pharmacia). Portanto, é possível avaliar a ligação entre o polipeptídeo da invenção e um composto de teste utilizando um biossensor tal como BIAcore.

[0092] Os métodos de seleção de moléculas que se ligam quando o polipeptídeo de TOM34 imobilizado é exposto a compostos químicos sintéticos ou bancos de substâncias naturais ou uma biblioteca de exibição de peptídeos em fagos aleatórios e os métodos de seleção utilizando uma alta circulação baseada em técnicas químicas combinatórias (Wrighton e outros, Science 273: 458-64 (1996); Verdine, Nature 384: 11-13 (1996); Hogan, Nature 384: 17-9 (1996)) para isolar não apenas proteínas, mas compostos químicos que se ligam com a proteína TOM34 (incluindo agonista e antagonista) são bem-conhecidos por um versado na técnica.

[0093] Alternativamente, a presente invenção fornece um método de seleção de um composto para o tratamento ou para a prevenção de CRC utilizando o polipeptídeo codificado pelo gene TOM34 que compreende as etapas a seguir:

a) o contato de um composto de teste com um polipeptídeo

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30/94 codificado por um polinucleotídeo de TOM34;

b) a detecção da atividade biológica do polipeptídeo da etapa (a); e

c) a seleção do composto de teste que suprime a atividade biológica do polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo de TOM34 quando comparada com a atividade biológica do dito polipeptídeo detectado na ausência do composto de teste.

[0094] Uma vez que a proteína TOM34 possui a atividade de promover a proliferação celular de células de CRC, um composto que inibe esta atividade desta proteína pode ser selecionado utilizando esta atividade como um índice.

[0095] Quaisquer polipeptídeos podem ser utilizados para a seleção contanto que compreendam a atividade biológica da proteína TOM34. Tal atividade biológica inclui a atividade de proliferação celular da proteína TOM34 humana. Por exemplo, uma proteína TOM34 humana pode ser utilizada e polipeptídeos funcionalmente equivalentes a estas proteínas também podem ser utilizados. Tais polipeptídeos podem ser expressos de forma endógena ou exógena pelas células.

[0096] O composto isolado através desta seleção é um candidato para agonistas ou antagonistas do polipeptídeo codificado pelo gene TOM34. O termo agonista se refere a moléculas que ativam a função do polipeptídeo através da ligação ao mesmo. Similarmente, o termo antagonista se refere a moléculas que inibem a função do polipeptídeo através da ligação ao mesmo. Além disso, um composto isolado através desta seleção é um candidato para compostos que inibem a interação in vivo do polipeptídeo de TOM34 com moléculas (incluindo DNAs e proteínas).

[0097] Quando a atividade biológica que será detectada no presente método for a proliferação celular, esta pode ser detectada, por exemplo, através da preparação das células que expressam o

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31/94 polipeptídeo de TOM34, do cultivo das células na presença de um composto de teste e da determinação da velocidade de proliferação celular, da medida do ciclo celular e tais, assim como através da medida da atividade de formação de colônias que é descrita nos Exemplos. [0098] Em uma modalidade adicional, a presente invenção fornece métodos para a seleção de compostos para o tratamento ou para a prevenção de CRC. Como discutido em detalhes anteriormente, através do controle dos níveis de expressão do TOM34, pode-se controlar o início e a progressão de CRC. Assim, os compostos que podem ser utilizados no tratamento ou na prevenção de CRC podem ser identificados através de verificações que utilizam os níveis de expressão de TOM34 como índices. No contexto da presente invenção, tal seleção pode compreender, por exemplo, as etapas a seguir:

a) o contato de um composto candidato com uma célula que expressa TOM34; e

b) a seleção do composto candidato que reduz o nível de expressão de TOM34 quando comparado com um nível de controle na ausência do composto candidato.

[0099] As células que expressam o TOM34 incluem, por exemplo, linhagens de células estabelecidas partindo de CRC; tais células podem ser utilizadas para a seleção anterior da presente invenção (por exemplo, CW2, DLD1, HCT116, RKO, LS174T). O nível de expressão pode ser estimado através de métodos bem-conhecidos por um versado na técnica. No método de seleção, um composto que reduz o nível de expressão de TOM34 pode ser selecionado como agentes candidatos que serão utilizados para o tratamento ou para a prevenção de CRC. [00100] Alternativamente, o método de seleção da presente invenção pode compreender as etapas a seguir:

a) contato de um composto candidato com uma célula em que um vetor, que compreende a região de regulação da transcrição de

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TOM34 e um gene repórter que é expresso sob o controle da região de regulação da transcrição, foi introduzido;

b) medida da expressão ou da atividade do dito gene repórter; e

c) seleção do composto candidato que reduz a expressão ou a atividade do dito gene repórter.

[00101] Os genes repórteres e as células hospedeiras adequados são bem-conhecidos na técnica. O constructo repórter necessário para a seleção pode ser preparado através da utilização da região de regulação da transcrição de um gene marcador. Quando a região de regulação da transcrição de um gene marcador é conhecida pelos peritos na técnica, pode ser preparado um constructo repórter através da utilização da informação de sequência anterior. Quando a região de regulação da transcrição de um gene marcador permanecer não identificada, um segmento de nucleotídeos contendo a região de regulação da transcrição pode ser isolado de uma biblioteca genômica com base na informação da sequência de nucleotídeos do gene marcador.

[00102] Os exemplos de suportes que podem ser utilizados para a ligação das proteínas incluem polissacarídeos insolúveis, tais como agarose, celulose e dextrana; e resinas sintéticas, tais como poliacrilamida, poliestireno e silício; preferencialmente esferas e placas disponíveis comercialmente (por exemplo, placas de multicavidades, chip de biossensor etc.) preparadas partindo dos materiais anteriores podem ser utilizadas. Quando são utilizadas esferas, estas podem ser preenchidas dentro de uma coluna.

[00103] A ligação de uma proteína a um suporte pode ser realizada de acordo com métodos de rotina, tais como a ligação química e a adsorção física. Alternativamente, uma proteína pode ser ligada a um suporte através de anticorpos que reconhecem especificamente a

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33/94 proteína. Além disso, a ligação de uma proteína a um suporte também pode ser realizada através de avidina e biotina.

[00104] A ligação entre proteínas é realizada em tampão, por exemplo, mas não está limitada ao tampão fosfato e ao tampão Tris, contanto que o tampão não iniba a ligação entre as proteínas.

[00105] Na presente invenção, um biossensor utilizando o fenômeno de ressonância de plasmon de superfície pode ser utilizado como um meio para a detecção ou para a quantificação da proteína ligada. Quando tal biossensor é utilizado, a interação entre as proteínas pode ser observada em tempo real como um sinal de ressonância de plasmon de superfície, utilizando apenas uma quantidade mínima de polipeptídeo e sem marcação (por exemplo, BIAcore, Pharmacia).

[00106] Altemativamente, o polipeptídeo de TOM34 pode ser rotulado e o rótulo da proteína ligada pode ser utilizado para detectar ou para medir a proteína ligada. Especificamente, após o pré-rótulo de uma das proteínas, a proteína rotulada é colocada em contato com a outra proteína na presença de um composto de teste e então as proteínas ligadas são detectadas ou medidas de acordo com o rótulo após a lavagem.

[00107] As substâncias de rótulo tais como radioisótopo (por exemplo, ³H, ¹⁴C, ³²P, ³³P, ³⁵S, ¹²⁵I, ¹³¹I), enzimas (por exemplo, fosfatase alcalina, peroxidase de raiz forte, β-galactosidase, βglucosidase), substâncias fluorescentes (por exemplo, isotiosianeto de fluoresceína (FITC), rodamina) e biotina/avidina podem ser utilizadas para a marcação de uma proteína no presente método. Quando a proteína é rotulada com radioisótopo, a detecção ou a medida pode ser realizada através de cintilação líquida. Alternativamente, as proteínas rotuladas com enzimas podem ser detectadas ou medidas através da adição de um substrato da enzima para detectar a alteração enzimática do substrato, tal como a produção de cor, com um medidor de absorção.

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Ainda, no caso em que uma substância fluorescente é utilizada como o rótulo, a proteína ligada pode ser detectada ou medida utilizando um fluorofotômetro.

[00108] No caso da utilização de um anticorpo na presente seleção, o anticorpo é preferencialmente rotulado com uma das substâncias de marcação mencionadas anteriormente e detectado ou medido com base na substância de rótulo. Alternativamente, o anticorpo contra o polipeptídeo de TOM34 ou a actina pode ser utilizada como um anticorpo primário que será detectado com um segundo anticorpo que é rotulado com uma substância de rótulo. Além disso, o anticorpo ligado à proteína na seleção da presente invenção pode ser detectado ou medido utilizando uma coluna com proteína G ou com proteína A.

[00109] Alternativamente, em uma outra modalidade do método de seleção da presente invenção, pode ser utilizado um sistema de dois híbridos utilizando células (MATCHMAKER Two-Hybrid system, MATCHMAKER Mammalian Two-Hybrid Assay Kit, MATCHMAKER one-Hybrid system (Clontech); HybriZap Two-Hybrid Vector System (Stratagene); as referências Dalton e Treisman, Cell 68: 597-612 (1992), Fields e Sternglanz, Trends Genet 10: 286-92 (1994)).

[00110] No sistema de dois híbridos, o polipeptídeo de TOM34 da invenção é fundido com a região de ligação de SRF ou com a região de ligação de GAL4 e expresso em células de levedura.

[00111] Como um gene repórter, por exemplo, o gene Ade2, o gene lacZ, o gene CAT, o gene da luciferase e tais podem ser utilizados além do gene HIS3.

[00112] Qualquer composto de teste, por exemplo, extratos de células, sobrenadante de cultura de células, produtos de microorganismo que fazem fermentação, extratos de organismo marinho, extratos vegetais, proteínas purificadas ou brutas, peptídeos, compostos que não são peptídeos, compostos micromoleculares

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35/94 sintéticos e compostos naturais podem ser utilizados nos métodos de seleção da presente invenção. Na presente invenção, o composto de teste também pode ser obtido utilizando qualquer uma das várias abordagens em métodos de bibliotecas combinatórias conhecidos na técnica, incluindo (1) bibliotecas biológicas, (2) bibliotecas em fase sólida ou em fase em solução paralelas que podem ser acessadas espacialmente, (3) métodos de bibliotecas sintéticas que requerem desconvolução, (4) o método de biblioteca uma esfera um composto e (5) métodos de bibliotecas sintéticas utilizando seleção por cromatografia por afinidade. Os métodos de bibliotecas biológicas utilizando seleção por cromatografia por afinidade são limitados a bibliotecas de peptídeos, enquanto que as outras quatro abordagens podem ser aplicadas a bibliotecas de peptídeos, de oligômeros sem ser peptídeos ou de moléculas pequenas de compostos (Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12: 145-67). Os exemplos de métodos para a síntese de bibliotecas moleculares podem ser encontrados na técnica (DeWitt e outros (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6909-13; Erb e outros (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11422-6; Zuckermann e outros (1994) J. Med. Chem. 37: 2678-85; Cho e outros (1993) Science 261: 1303-5; Carell e outros (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059; Carell e outros (1994) Angew. Chem. Int. Engl. 33: 2061; Gallop e outros (1994) J. Med. Chem. 37: 1233-51). As bibliotecas de compostos podem ser apresentadas em solução (ver Houghten (1992) Bio/Techniques 13: 412-21) ou em esferas (Lam (1991) Nature 354: 824), chips (Fodor (1993) Nature 364: 555-6), bactérias (Patente U.S. N^o 5.223.409), esporos (Patentes U.S. N— 5.571.698; 5.403.484 e

5.223.409), plasmídeos (Cull e outros (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865-9) ou fago (Scott e Smith (1990) Science 249: 386-90; Devlin (1990) Science 249: 404-6; Cwirla e outros (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6378-82; Felici (1991) J. Mol. Biol. 222: 301-10; Pedido de

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Patente U.S. N^o 2002103360).

[00113] Um composto isolado através dos métodos de seleção da presente invenção é um candidato para fármacos que inibem a atividade do polipeptídeo de TOM34, para o tratamento ou para a prevenção de doenças atribuídas, por exemplo, a doenças proliferativas, tal como CRC. Um composto em que uma parte da estrutura do composto obtido pelos presentes métodos de seleção da presente invenção é convertida através da adição, da deleção e/ou da substituição, é incluído nos compostos obtidos através dos métodos de seleção da presente invenção.

Composições Farmacêuticas para o Tratamento ou para a Prevenção de CRC [00114] Quando é administrado um composto isolado através do método da presente invenção na forma de um agente farmacêutico para seres humanos e outros mamíferos, tais como camundongos, ratos, porquinhos-da-Índia, coelhos, gatos, cachorros, ovelhas, porcos, gado, macacos, babuínos e chimpanzés, o composto isolado pode ser diretamente administrado ou pode ser formulado em uma forma de dosagem utilizando métodos de preparação farmacêutica conhecidos. Por exemplo, de acordo com a necessidade, os fármacos podem ser tomados oralmente, na forma de tabletes revestidos com açúcar, cápsulas, elixires e microcápsulas ou de forma não oral, na forma de injeções de soluções ou suspensões esterilizadas com água ou outro líquido farmaceuticamente aceitável. Por exemplo, os compostos podem ser misturados com veículos ou meios farmaceuticamente aceitáveis, especificamente, água esterilizada, solução salina fisiológica, óleos vegetais, emulsificantes, agentes de suspensão, tensoativos, estabilizantes, agentes flavorizantes, excipientes, veículos, conservantes, aglutinantes e tais, em uma forma de dose unitária necessária para a implementação do fármaco geralmente aceito. A

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37/94 quantidade do ingrediente ativo contida em tal preparação faz com que uma dose adequada fique dentro da faixa indicada que pode ser adquirida.

[00115] Os exemplos de aditivos que podem ser misturados em comprimidos e cápsulas incluem, mas não estão limitados a aglutinantes, tais como gelatina, amido de milho, goma tragacanto e goma arábica; excipientes, tal como celulose cristalina; agentes de intumescimento, tais como amido de milho, gelatina e ácido algínico; lubrificantes, tal como estearato de magnésio; adoçantes, tal como sacarose, lactose ou sacarina; e agentes flavorizantes, tais como hortelã-pimenta, óleo de Gaultheria adenothrix e cereja. Quando a forma de dose unitária for uma cápsula, um veículo líquido, tal como um óleo, pode ser adicionalmente incluído nos ingredientes anteriores. Os compósitos esterilizados para injeção podem ser formulados após as implementações normais de fármacos utilizando veículos, tal como água destilada, adequada para injeção.

[00116] A solução salina fisiológica, a glicose e outros líquidos isotônicos, incluindo adjuvantes, tais como D-sorbitol, D-manose, Dmanitol e cloreto de sódio, podem ser utilizados como soluções aquosas para injeção. Estes podem ser utilizados em associação com agentes de solubilização adequados, tais como álcool, por exemplo, etanol; poliálcoois, tais como propileno glicol e polietileno glicol; e tensoativos não-iônicos, tais como Polissorbato 80 (TM) e HCO-50.

[00117] O óleo de gergelim ou o óleo de soja pode ser utilizado como um líquido oleaginoso, pode ser utilizado em associação com benzoato de benzila ou álcool benzílico como um agente de solubilização e pode ser formulado com um tampão, tal como tampão fosfato e tampão de acetato de sódio; um analgésico, tal como cloridrato de procaína; um estabilizante, tal como álcool benzílico e fenol; e/ou um antioxidante. Uma injeção preparada pode ser preenchida dentro de uma ampola

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38/94 adequada.

[00118] Os métodos bem-conhecidos pelos peritos na técnica podem ser utilizados para administrar a composição farmacêutica da presente invenção aos pacientes, por exemplo, na forma de uma injeção intraarterial, intravenosa ou percutânea ou na forma de uma administração intranasal, transbronquial, intramuscular ou oral. A dosagem e o método de administração variam de acordo com o peso corporal e a idade de um paciente e com o método de administração; entretanto, um versado na técnica pode selecionar de forma rotineira um método adequado de administração. Se o dito composto puder ser codificado por um DNA, o DNA pode ser inserido em um vetor para terapia gênica e o vetor administrado a um paciente para realizar a terapia. A dosagem e o método de administração variam de acordo com o peso corporal, a idade e os sintomas do paciente; entretanto, um versado na técnica pode selecioná-los adequadamente.

[00119] Por exemplo, embora a dose de um composto que se liga a uma proteína da presente invenção e regula sua atividade dependa dos sintomas, a dose é geralmente de aproximadamente 0,1 mg até aproximadamente 100 mg por dia, preferencialmente de aproximadamente 1,0 mg até aproximadamente 50 mg por dia e mais preferencialmente de aproximadamente 1,0 mg até aproximadamente 20 mg por dia, quando administrada oralmente a um ser humano adulto normal (peso de 60 kg).

[00120] Quando o composto é administrado de forma parenteral, na forma de uma injeção a um ser humano adulto normal (peso de 60 kg), embora haja algumas diferenças de acordo com o paciente, o órgão alvo, os sintomas e o método de administração, é conveniente injetar de forma intravenosa uma dose de aproximadamente 0,01 mg até aproximadamente 30 mg por dia, preferencialmente de aproximadamente 0,1 até aproximadamente 20 mg por dia e mais

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39/94 preferencialmente de aproximadamente 0,1 até aproximadamente 10 mg por dia. No caso de outros animais, a quantidade de dosagem apropriada pode ser rotineiramente calculada através da conversão para 60 kg de peso corporal.

Avaliação do prognóstico de um indivíduo com CRC:

[00121] A presente invenção fornece ainda um método de avaliação do prognóstico de um indivíduo com CRC incluindo a etapa de comparação da expressão de TOM34 em uma população de células de teste com a expressão de TOM34 em uma população de células de referência derivada de pacientes ao longo de um espectro de estágios da doença. Comparando a expressão gênica de TOM34 na população de células de teste e na(s) população(ões) de células de referência ou através da comparação do padrão de expressão gênica ao longo do tempo nas populações de células de teste derivadas do indivíduo, o prognóstico do indivíduo pode ser avaliado.

[00122] Por exemplo, um aumento na expressão de TOM34 quando comparada com a de um controle normal indica um prognóstico menos favorável. De forma inversa, uma similaridade na expressão de TOM34 quando comparada com a de um controle normal indica um prognóstico mais favorável para o indivíduo.

Kits:

[00123] A presente invenção inclui ainda um reagente de detecção de CRC, por exemplo, um ácido nucléico que se liga especificamente a ou identifica ácidos nucléicos de TOM34, tais como sequências de oligonucleotídeos que são complementares a uma parte do ácido nucléico de TOM34 ou um anticorpo que se liga às proteínas codificadas pelo ácido nucléico de TOM34 ou um aptâmero. Os reagentes de detecção podem ser embalados juntos na forma de um kit. Por exemplo, os reagentes de detecção podem ser embalados em recipientes separados, por exemplo, um ácido nucléico ou um anticorpo (ligado a

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40/94 uma matriz sólida ou embalado separadamente com reagentes para a ligação do mesmo à matriz), um reagente de controle (positivo e/ou negativo) e/ou um rótulo detectável. Instruções (por exemplo, escritas, gravadas, VCR, CR-ROM etc.) para a realização do ensaio também podem estar incluídas no kit. O formato de ensaio do kit pode ser uma hibridização por Northern ou um ELISA em sanduíche, dos quais ambos são conhecidos na técnica.

[00124] Por exemplo, um reagente de detecção de CRC pode ser imobilizado em uma matriz sólida, tal como uma tira porosa, para formar pelo menos um sítio de detecção de CRC. A região de medida ou de detecção da tira porosa pode incluir um grande número de sítios, cada um contendo um ácido nucléico. Uma tira de teste também pode conter sítios para controles negativo e/ou positivo. Alternativamente, os sítios de controle podem estar localizados em uma tira separada da tira de teste. Opcionalmente, os sítios de detecção diferentes podem conter quantidades diferentes de ácidos nucléicos imobilizados, isto é, uma quantidade maior no primeiro sítio de detecção e quantidades menores nos sítios subsequentes. Após a adição da amostra de teste, o número de sítios que exibem um sinal que pode ser detectado fornece uma indicação quantitativa da quantidade de CRC presente na amostra. Os sítios de detecção podem ser configurados em qualquer formato de detecção adequado e estão tipicamente no formato de uma barra ou ponto que abrange a largura de uma tira de teste.

Métodos de Inibição de CRC:

[00125] A presente invenção fornece ainda um método para o tratamento ou para o alívio de um sintoma de CRC em um indivíduo através da diminuição da expressão de TOM34 (ou da atividade de seu produto gênico). Os compostos terapêuticos adequados podem ser administrados de forma profilática ou terapêutica a um indivíduo sofrendo de ou em risco de (ou susceptível a) desenvolver CRC. Tais

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41/94 indivíduos podem ser identificados utilizando métodos clínicos padronizados ou através da detecção de um nível aberrante de expressão de TOM34 ou de uma atividade aberrante de seu produto gênico. No contexto da presente invenção, os agentes terapêuticos adequados incluem, por exemplo, inibidores da regulação do ciclo celular e da proliferação celular.

[00126] Alternativamente, o método terapêutico da presente invenção pode incluir a etapa de diminuir a expressão, a função ou ambas, dos produtos gênicos de TOM34 cuja expressão é aumentada de forma aberrante (gene regulado para mais ou superexpresso) em células do cólon. A expressão pode ser inibida em qualquer uma das várias maneiras conhecidas na técnica. Por exemplo, a expressão pode ser inibida através da administração ao indivíduo de um ácido nucléico que inibe ou antagoniza a expressão do gene superexpresso, por exemplo, um oligonucleotídeo anti-senso ou um RNA de interferência pequeno que interrompe a expressão do gene superexpresso.

[00127] Evidentemente, as modalidades descritas aqui para os métodos de tratamento ou de alívio se aplicam, mudando o que deve ser mudado, ao uso de um composto que diminui a expressão de TOM34 (ou a atividade de seu produto gênico) como descrito aqui para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento ou para o alívio de câncer de cólon em um indivíduo. Tal composto poderia ser, por exemplo, uma composição anti-senso, de siRNA, de anticorpo, de aptâmeros ou de ribozima.

Ácidos Nucléicos Anti-Senso e siRNA:

[00128] Como citado anteriormente, os ácidos nucléicos anti-senso que correspondem à sequência de nucleotídeos de TOM34 podem ser utilizados para reduzir o nível de expressão do gene. Os ácidos nucléicos anti-senso que correspondem a TOM34 que é regulado para mais em CRC são úteis para o tratamento de CRC. Especificamente, os

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42/94 ácidos nucléicos anti-senso da presente invenção podem atuar através da ligação à sequência de nucleotídeos de TOM34 ou aos mRNAs que correspondem ao mesmo, inibindo assim a transcrição ou a tradução dos genes, promovendo a degradação dos mRNAs e/ou inibindo a expressão de proteínas codificadas por TOM34, inibindo assim a função das proteínas. O termo ácidos nucléicos anti-senso como utilizado aqui abrange tanto os nucleotídeos que são totalmente complementares à sequência alvo quanto aqueles que possuem um pareamento errado de um ou mais nucleotídeos, contanto que os ácidos nucléicos antisenso possam se hibridizar especificamente às sequências alvo. Por exemplo, os ácidos nucléicos anti-senso da presente invenção incluem polinucleotídeos que possuem uma homologia de pelo menos 70% ou superior, preferencialmente de pelo menos 80% ou superior, mais preferencialmente de pelo menos 90% ou superior, ainda mais preferencialmente de pelo menos 95% ou superior em relação a uma extensão de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos. Algoritmos conhecidos na técnica podem ser utilizados para determinar a homologia.

[00129] O ácido nucléico anti-senso da presente invenção atua sobre as células que produzem as proteínas codificadas por TOM34 através da ligação com o DNA ou com o mRNA que codifica a proteína, inibindo sua transcrição ou tradução, promovendo a degradação do mRNA e inibindo a expressão da proteína, resultando assim na inibição da função da proteína.

[00130] Um ácido nucléico anti-senso da presente invenção pode ser produzido em uma preparação externa, tal como um linimento ou cataplasma, através da mistura do mesmo com um material de base adequado que é inativo contra o ácido nucléico.

[00131] Ainda, quando necessário, os ácidos nucléicos anti-senso da presente invenção podem ser formulados em comprimidos, pós,

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43/94 grânulos, cápsulas, cápsulas de lipossomos, injeções, soluções, gotas nasais e agentes de secagem por congelamento através da adição de excipientes, agentes isotônicos, solubilizantes, estabilizantes, conservantes, analgésicos e tais. Estes podem ser preparados através dos métodos conhecidos a seguir.

[00132] Os ácidos nucléicos anti-senso da presente invenção podem ser fornecidos ao paciente através da aplicação direta sobre o sítio doente ou através de injeção em um vaso sanguíneo de forma que atingirão o sítio doente. Um meio de suporte anti-senso também pode ser utilizado para aumentar a durabilidade e a permeabilidade da membrana. Os exemplos incluem, mas não estão limitados a lipossomos, poli-L-lisina, lipídeos, colesterol, lipofectina ou derivados destes.

[00133] A dosagem do derivado de ácido nucléico anti-senso da presente invenção pode ser ajustada de forma adequada de acordo com o estado de saúde do paciente e utilizada em quantidades desejadas. Por exemplo, uma faixa de dose de 0,1 até 100 mg/kg, preferencialmente de 0,1 até 50 mg/kg pode ser administrada.

[00134] Os ácidos nucléicos anti-senso da presente invenção inibem a expressão de uma proteína da presente invenção e são assim úteis para a supressão da atividade biológica da proteína da invenção. Em adição, os inibidores de expressão, que compreendem ácidos nucléicos anti-senso da presente invenção, são úteis no fato de que podem inibir a atividade biológica de uma proteína da presente invenção.

[00135] A ligação do siRNA a um produto da transcrição correspondente a TOM34 na célula-alvo resulta em uma redução na produção da proteína pela célula. O comprimento do oligonucleotídeo é de pelo menos 10 nucleotídeos e pode ser tão longo quanto o produto da transcrição que ocorre naturalmente. Preferencialmente, o oligonucleotídeo possui menos que 75, 50, 25 nucleotídeos de

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44/94 comprimento. Mais preferencialmente, o oligonucleotídeo possui 19-25 nucleotídeos de comprimento.

[00136] Os ácidos nucléicos anti-senso da presente invenção incluem oligonucleotídeos modificados. Por exemplo, oligonucleotídeos tioados podem ser utilizados para conferir resistência à nuclease a um oligonucleotídeo.

[00137] Ainda, um siRNA contra TOM34 pode ser utilizado para reduzir o nível de expressão de TOM34. Aqui, o termo siRNA referese a uma molécula de RNA de fita dupla que previne a tradução de um mRNA alvo. As técnicas padronizadas para a introdução de siRNA na célula podem ser utilizadas, incluindo aquelas em que o DNA é um molde partindo do qual o RNA é transcrito. No contexto da presente invenção, o siRNA compreende uma sequência de ácido nucléico senso e uma sequência de ácido nucléico anti-senso contra um gene marcador regulado para mais, tal como TOM34. O siRNA é construído de forma que um único produto da transcrição possua ambas as sequências senso e anti-senso complementares do gene alvo, por exemplo, um grampo.

[00138] Um siRNA de TOM34 se hibridiza com o mRNA alvo e diminui ou inibe assim a produção dos polipeptídeos codificados por TOM34 através da associação com o produto da transcrição de mRNA de fita simples normal, interferindo assim com a tradução e assim, com a expressão da proteína. Assim, as moléculas de siRNA da invenção podem ser definidas por sua capacidade de se hibridizarem especificamente ao mRNA de TOM34 sob condições estringentes. Para as finalidades desta invenção, os termos se hibridiza ou se hibridiza especificamente são utilizados para se referirem à capacidade de duas moléculas de ácidos nucléicos de se hibridizarem sob condições de hibridização estringentes. A expressão condições de hibridização estringentes se refere às condições sob as quais uma molécula de

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45/94 ácido nucléico se hibridizará com sua sequência alvo, tipicamente em uma mistura complexa de ácidos nucléicos, mas não de forma detectável a outras sequências. As condições estringentes são dependentes da sequência e serão diferentes em circunstâncias diferentes. As sequências mais longas se hibridizam especificamente a temperaturas mais altas. Um guia extensivo para a hibridização de ácidos nucléicos é encontrado em Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Probes, Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays (1993). Geralmente, as condições estringentes são selecionadas como sendo aproximadamente 5-10°C mais baixas que o ponto de fusão térmico (Tm) para a sequência específica a um pH com força iônica definida. A Tm é a temperatura (sob a força iônica, o pH e a concentração de ácido nucléico definidos) em que 50% das sondas complementares ao alvo se hibridizam com a sequência alvo no equilíbrio (como as sequências alvo estão presentes em excesso, na Tm, 50% das sondas estão ocupados no equilíbrio). As condições estringentes podem também ser atingidas com a adição de agentes de desestabilização tal como formamida. Para a hibridização seletiva ou específica, um sinal positivo é pelo menos duas vezes o do fundo, preferencialmente 10 vezes da hibridização do fundo. Os exemplos de condições de hibridização estringentes podem ser como a seguir: 50% de formamida, 5x SSC e 1% de SDS, incubando a 42°C ou 5x SSC, 1% de SDS, incubando a 65°C, com lavagem em 0,2x SSC e 0,1% de SDS a 50°C. [00139] No contexto da presente invenção, um siRNA é preferencialmente menor que 500, 200, 100, 50 ou 25 nucleotídeos de comprimento. Mais preferencialmente, um siRNA possui 19-25 nucleotídeos de comprimento. Os exemplos de sequência de ácidos nucléicos para a produção de siRNA de TOM34 incluem as sequências de nucleotídeos da SEQ ID N°: 48 ou

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46/94 como a sequência alvo. No RNA ou derivados do mesmo, a base t deve ser substituída por u nas sequências de nucleotídeos. Consequentemente, por exemplo, a presente invenção fornece uma molécula de RNA de fita dupla que compreende a sequência de nucleotídeos 5’-gaaaguguucucuacucca-3’ (SEQ ID N°: 48) ou 5’ggauggaaacugcagagac-3’ (SEQ ID N°: 52). Para aumentar a atividade de inibição do siRNA, o nucleotídeo u pode ser adicionado na extremidade a 3’ da fita anti-senso da sequência alvo. O número de us que será adicionado é de pelo menos 2, geralmente de 2 até 10, preferencialmente de 2 até 5. Os us adicionados formam uma fita simples na extremidade a 3’ da fita anti-senso do siRNA.

[00140] Um siRNA de TOM34 pode ser diretamente introduzido nas células em uma forma que é capaz de se ligar aos produtos da transcrição de mRNA. Nestas modalidades, as moléculas de siRNA da invenção são tipicamente modificadas como descrito anteriormente em relação às moléculas anti-senso. Outras modificações também são possíveis, por exemplo, os siRNAs conjugados com colesterol mostraram propriedades farmacológicas melhoradas (Song e outros, Nature Med. 9: 347-351 (2003)). Alternativamente, um DNA que codifica o siRNA pode ser carregado em um vetor.

[00141] Podem ser produzidos vetores, por exemplo, através da clonagem da sequência alvo de TOM34 em um vetor de expressão que possui sequências reguladoras ligadas de forma operacional flanqueando a sequência de uma maneira que permite a expressão (através da transcrição da molécula de DNA) de ambas as fitas (Lee, N.S. e outros, (2002) Nature Biotechnology 20: 500-505). Uma molécula de RNA que é anti-senso em relação ao mRNA de TOM34 é transcrita por um primeiro promotor (por exemplo, uma sequência promotora a 3’ do DNA clonado) e uma molécula de RNA que é a fita senso em relação ao mRNA de TOM34 é transcrita por um segundo promotor (por

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47/94 exemplo, uma sequência promotora a 5’ do DNA clonado). As fitas senso e anti-senso se hibridizam in vivo para gerar constructos de siRNA para o silenciamento de TOM34. Alternativamente, os dois constructos podem ser utilizados para criar as fitas senso e anti-senso de um constructo de siRNA. Ο TOM34 clonado pode codificar um constructo que possui estrutura secundária, por exemplo, grampos, em que um único produto da transcrição possui ambas as sequências senso e anti-senso complementar do gene alvo.

[00142] Uma sequência em alça que consiste em uma sequência de nucleotídeos arbitrária pode estar localizada entre a sequência senso e a anti-senso a fim de formar a estrutura em alça de grampo. Assim, a presente invenção fornece ainda um siRNA que possui a fórmula geral 5’-[A]-[B]-[A’]-3’, em que [A] é uma sequência de ribonucleotídeos correspondente a uma sequência que se hibridiza especificamente a um mRNA ou a um cDNA de TOM34. Em modalidades preferidas, [A] é uma sequência de ribonucleotídeos que corresponde a uma sequência de TOM34.

[B] é uma sequência de ribonucleotídeos que consiste em 3 até 23 nucleotídeos e [A’] é uma sequência de ribonucleotídeos que consiste em sequência complementar de [A], A região [A] se hibridiza a [A’] e então é formada uma alça que consiste na região [Β], A sequência da alça pode ter preferencialmente 3 até 23 nucleotídeos de comprimento. A sequência da alça, por exemplo, pode ser selecionada do grupo que consiste nas sequências a seguir (http://www.ambion.com/techlib/tb/tb 506.html). Além disso, a sequência da alça que consiste em 23 nucleotídeos também fornece o siRNA ativo (Jacque, J.-M. e outros, (2002) Nature 418: 435-438).

CCC, CCACC or CCACACC: Jacque, J.M. e outros, (2002) Nature, Vol. 418: 435-438.

UUCG: Lee, N.S. e outros, (2002) Nature Biotechnology 20:

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500-505. Fruscoloni, P. e outros, (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100(4): 1639-1644.

UUCAAGAGA: Dykxhoorn, D.M. e outros, (2002) Nature Reviews Molecular Cell Biology 4: 457-467.

[00143] Consequentemente, a sequência em alça pode ser selecionada do grupo que consiste em CCC, UUCG, CCACC, CCACACC e UUCAAGAGA. A sequência em alça preferível é UUCAAGAGA (ttcaagaga no DNA). O exemplo de siRNA em grampo adequado para uso no contexto da presente invenção inclui:

[00144] para TOM34-SÍRNA-D (siD, para a sequência alvo da SEQ ID N°: 48) 5’-gaaaguguucucuacucca-[B]-uggaguagagaacacuuuc-3’ (SEQ ID N°: 49) e para TOM34-SÍRNA-E (siE, para a sequência alvo da SEQ ID N°: 50) 5’-ggauggaaacugcagagac-[B]-gucucugcaguuuccaucc-3’ (SEQ ID N°: 53).

[00145] A sequência de nucleotídeos de siRNAs adequados pode ser planejada utilizando um programa de computador para planejamento de siRNAs disponível no site da web da Ambion (http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA finder.html). O programa de computador seleciona sequências de nucleotídeos para a síntese de siRNAs com base no protocolo a seguir.

Seleção de Sítios Alvos de siRNA:

1. Começando com o códon de início AUG do produto da transcrição de objetivo, verificar a jusante em relação às sequências de dinucleotídeos AA. Registrar a ocorrência de cada AA e os 19 nucleotídeos adjacentes a 3’ como os sítios de alvo potenciais do siRNA. Tuschl e outros não recomendam contra o planejamento de siRNA nas regiões não traduzidas (UTRs) a 5’ ou a 3’ e regiões próximas ao códon de início (dentro de 75 bases) uma vez que estas podem ser mais ricas em sítios de ligação de proteínas reguladoras. As proteínas de ligação às UTRs e/ou os complexos de início da tradução podem

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49/94 interferir com a ligação do complexo da endonuclease de siRNA.

2. Comparar os sítios alvos potenciais com o banco de dados do genoma humano e eliminar da consideração quaisquer sequências alvos com homologia significativa com outras sequências codificadoras. A busca por homologia pode ser realizada utilizando BLAST, que pode ser encontrado no servidor do NCBI em: www.ncbi.nlm.nih.qov/BLAST/·

3. Selecionar sequências alvos de qualificação para a síntese. Na Ambion, preferencialmente várias sequências alvos podem ser selecionadas ao longo do comprimento do gene que será avaliado. [00146] As sequências reguladoras que flanqueiam as sequências do gene TOM34 podem ser idênticas ou diferentes, de forma que sua expressão pode ser modulada independentemente ou de uma maneira temporal ou espacial. Os siRNAs são transcritos de forma intracelular através da clonagem de moldes de TOM34, respectivamente, em um vetor que contém, por exemplo, uma unidade de transcrição da RNA polimerase III do RNA U6 nuclear pequeno (snRNA) ou do promotor de RNA H1 humano. Para a introdução do vetor dentro da célula, pode ser utilizado um agente que aumenta a transfecção. FuGENE (Rochediagnostics), Lipofectamine 2000 (Invitrogen), Oligofectamine (Invitrogen) e Nucleofector (Wako pure Chemical) são úteis como o agente que aumenta a transfecção.

[00147] O oligonucleotídeo anti-senso ou o siRNA da presente invenção inibe a expressão de um polipeptídeo da presente invenção e é assim útil para a supressão da atividade biológica de um polipeptídeo da invenção. Ainda, os inibidores de expressão, que compreendem o oligonucleotídeo anti-senso ou o siRNA da invenção, são úteis no ponto em que podem inibir a atividade biológica do polipeptídeo da invenção. Portanto, uma composição que compreende um oligonucleotídeo antisenso ou um siRNA da presente invenção é útil para o tratamento de um CRC.

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Anticorpos:

[00148] Alternativamente, a função do produto gênico de TOM34 que é superexpresso no CRC pode ser inibida através da administração de um composto que se liga a ou inibe de outra maneira a função dos produtos gênicos. Por exemplo, o composto é um anticorpo que se liga ao produto gênico de TOM34.

[00149] A presente invenção se refere ao uso de anticorpos, particularmente anticorpos contra uma proteína codificada por TOM34 ou um fragmento de tal anticorpo. Como utilizado aqui, o termo anticorpo se refere a uma molécula de imunoglobulina que possui uma estrutura específica, que interage (isto é, se liga) apenas ao antígeno que foi utilizado para a síntese do anticorpo (isto é, o produto gênico de um marcador regulado para mais) ou a um antígeno proximamente relacionado ao mesmo. Além disso, um anticorpo pode ser um fragmento de um anticorpo ou um anticorpo modificado, contanto que se ligue à proteína codificada por TOM34. Por exemplo, o fragmento de anticorpo pode ser Fab, F(ab')2, Fv ou Fv de cadeia simples (scFv), em que os fragmentos Fv de cadeias H e L são ligados através de um ligante apropriado (Huston J. S. e outros Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 5879-5883 (1988)). Mais especificamente, um fragmento de anticorpo pode ser produzido através do tratamento de um anticorpo com uma enzima, tal como papaína ou pepsina. Alternativamente, um gene que codifica um fragmento de anticorpo pode ser construído, inserido em um vetor de expressão e expresso em uma célula hospedeira adequada (ver, por exemplo, Co M. S. e outros J. Immunol. 152: 2968-2976 (1994); Better M. e Horwitz A. H. Methods Enzymol. 178: 476-496 (1989); Pluckthun A. e Skerra A. Methods Enzymol. 178: 497-515 (1989); Lamoyi E. Methods Enzymol. 121: 652-663 (1986); Rousseaux J. e outros Methods Enzymol. 121: 663-669 (1986); Bird R. E. e Walker B. W. Trends Biotechnol. 9: 132-137 (1991)).

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51/94 [00150] Um anticorpo pode ser modificado através da conjugação com uma variedade de moléculas, tal como polietileno glicol (PEG). A presente invenção fornece tais anticorpos modificados. O anticorpo modificado pode ser obtido através da modificação química de um anticorpo. Tais métodos de modificação são convencionais no campo.

[00151] Alternativamente, um anticorpo pode compreender um anticorpo quimérico que possui uma região variável derivada de um anticorpo não-humano e uma região constante derivada de um anticorpo humano ou um anticorpo humanizado, que compreende uma região de determinação de complementaridade (CDR) derivada de um anticorpo não-humano, uma região estrutural (FR) e uma região constante derivada de um anticorpo humano. Tais anticorpos podem ser preparados através da utilização de tecnologias conhecidas. A humanização pode ser realizada através da substituição de CDRs ou de sequências de CDR de roedor pelas sequências correspondentes de um anticorpo humano (ver, por exemplo, Verhoeyen e outros, Science 239: 1534-1536 (1988)). Consequentemente, tais anticorpos humanizados são anticorpos quiméricos, em que substancialmente menos que um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente de uma espécie não humana.

[00152] Os anticorpos completamente humanos que compreendem regiões variáveis humanas em adição às regiões estruturais e constantes humanas também podem ser utilizados. Tais anticorpos podem ser produzidos utilizando várias técnicas conhecidas na técnica. Por exemplo, os métodos in vitro envolvem o uso de bibliotecas recombinantes de fragmentos de anticorpos humanos exibidos em bacteriófago (por exemplo, Hoogenboom & Winter, J. Mol. Biol. 227: 381-8 (1991). Similarmente, os anticorpos humanos podem ser produzidos através da introdução de loci de imunoglobulinas humanas em animais transgênicos, por exemplo, camundongos em que os genes

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52/94 de imunoglobulina endógenos foram parcialmente ou completamente inativados. Esta abordagem é descrita, por exemplo, nas Patentes U.S. N— 6.150.584; 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016.

[00153] As terapias para câncer direcionadas para alterações moleculares específicas que ocorrem nas células cancerosas foram validades através do desenvolvimento clínico e da aprovação de reguladoras de fármacos anticâncer tais como trastuzumab (Herceptin) para o tratamento de câncer de mama avançado, mesilato de imatinib (Gleevec) para leucemia mielóide crônica, gefitinib (Iressa) para câncer pulmonar de células que não são pequenas (NSCLC) e rituximab (mAb anti-CD20) para linfoma de células B e linfoma de células do manto (Ciardiello F. e outros, Clin. Cancer Res. 2001 Out; 7(10): 2958-70. Slamon DJ. e outros, N Engl J Med. 2001 Mar 15; 344(11): 783-92.; Rehwald U. e outros, Blood. 2003 Jan 15; 101(2): 420-424.; Fang G. e outros, (2000). Blood, 96, 2246-2253). Estes fármacos são clinicamente eficientes e melhor tolerados que os agentes anticâncer tradicionais porque se direcionam apenas às células transformadas. Consequentemente, tais fármacos não apenas aumentam a sobrevivência e a qualidade de vida para os pacientes com câncer, mas também validam o conceito de terapia de câncer direcionada de forma molecular. Além disso, os fármacos direcionados podem aumentar a eficiência da quimioterapia padronizada quando utilizada em combinação com a mesma (Gianni L. (2002). Oncology, 63 Supl 1, 4756.; Klejman A. e outros, (2002). Oncogene, 21, 5868-5876.). Portanto, os tratamentos futuros para câncer envolverão provavelmente a combinação de fármacos convencionais com agentes específicos ao alvo direcionados para características diferentes de células tumorais tais como a angiogênese e a capacidade de invasão.

[00154] Estes métodos moduladores podem ser realizados ex vivo

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53/94 ou in vitro (por exemplo, através do cultivo da célula com o agente) ou, alternativamente, in vivo (por exemplo, através da administração do agente a um indivíduo). Os métodos envolvem a administração de uma proteína ou de uma combinação de proteínas ou uma molécula de ácido nucléico ou uma combinação de moléculas de ácidos nucléicos como terapia para agir contra a expressão aberrante dos agentes expressos de forma diferencial ou a atividade aberrante de seus produtos gênicos. [00155] As doenças ou os distúrbios que são caracterizados por maiores níveis de expressão (em relação a um indivíduo que não está sofrendo da doença ou do distúrbio) ou atividades biológicas de genes e produtos gênicos, respectivamente, podem ser tratados com agentes terapêuticos que antagonizam (isto é, reduzem ou inibem) a atividade do gene ou genes superexpressos. Os agentes terapêuticos que antagonizam a atividade podem ser administrados de forma terapêutica ou profilática.

[00156] Consequentemente, os agentes terapêuticos que podem ser utilizados no contexto da presente invenção incluem, por exemplo, (i) um polipeptídeo do gene superexpresso ou análogos, derivados, fragmentos ou homólogos do mesmo; (ii) anticorpos para o gene superexpresso ou produtos gênicos; (iii) ácidos nucléicos que codificam o gene superexpresso; (iv) ácidos nucléicos anti-senso ou ácidos nucléicos que são disfuncionais (isto é, devido a uma inserção heteróloga dentro dos ácidos nucléicos do gene superexpresso); (v) RNA de interferência pequeno (siRNA); ou (vi) moduladores (isto é, inibidores, antagonistas que alteram a interação entre um polipeptídeo superexpresso e seu parceiro de ligação). As moléculas anti-senso disfuncionais são utilizadas para nocautear a função endógena de um polipeptídeo por recombinação homóloga (ver, por exemplo, Capecchi, Science 244: 1288-1292 1989).

[00157] Os níveis aumentados podem ser facilmente detectados

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54/94 através da quantificação do peptideo e/ou do RNA, através da obtenção de uma amostra de tecido do paciente (por exemplo, partindo do tecido de biópsia) e da avaliação da mesma in vitro em relação aos níveis de RNA ou de peptídeos, à estrutura e/ou à atividade dos peptídeos expressos (ou mRNAs de um gene cuja expressão é alterada). Os métodos que são bem-conhecidos na técnica incluem, mas não estão limitados a ensaios imunológicos (por exemplo, por análise de Western blot, imunoprecipitação seguida por eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (SDS) etc.) e/ou ensaios de hibridização para detectar a expressão de mRNAs (por exemplo, ensaio de Northern, dot blots, hibridização in situ etc.).

[00158] A administração profilática ocorre antes da manifestação dos sintomas clínicos evidentes da doença, de forma que uma doença ou um distúrbio é prevenido ou, alternativamente, retardado em relação a sua progressão.

[00159] Os métodos terapêuticos da presente invenção podem incluir a etapa de colocar uma célula em contato com um agente que modula uma ou mais das atividades dos produtos gênicos dos genes expressos de forma diferencial. Os exemplos de agente que modula a atividade da proteína incluem, mas não estão limitados a ácidos nucléicos, proteínas, ligantes cognatos que ocorrem naturalmente de tais proteínas, peptídeos e outra molécula pequena.

Vacinação contra CRC:

[00160] Na presente invenção, foi mostrado que o peptídeo derivado de TOM34 era epítopos TAA restritos por HLA-A24 que é um alelo comum em populações japonesas e caucasianas. Os candidatos de peptídeos que se ligam a HLA-A24 derivados de TOM34 foram identificados utilizando a informação sobre suas afinidades de ligação com HLA-A24. Após a estimulação in vitro de células T por células dendríticas (DCs) carregadas com este peptídeo, as CTLs foram

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55/94 estabelecidas de forma bem-sucedida utilizando TOM34-299 (KLRQEVKQNL (SEQ ID N°: 7)). Estas CTLs exibiram atividade citotóxica potente contra as células de carcinoma colorretal. Além disso, os clones de CTL e as linhagens derivadas destas células também exibiram citotoxicidade específica contra linhagens de células de carcinoma colorretal positivas para HLA-A24 superexpressando de forma endógena TOM34. As atividades citotóxicas destes clones e linhagens de CTL não foram mostradas contra as linhagens de células que não possuíam expressão de HLA-A24 ou um TAA alvo. As atividades citotóxicas específicas destes clones e linhagens de CTL eram significativamente inibidas pelo alvo frio. Estes resultados demonstram que TOM34 é útil como TAAs de CRC e que TOM34 é peptídeos de epítopo de TAA restritos por HLA-A24. Uma vez que o antígeno TOM34 é superexpresso na maior parte de CRC e está associado com a proliferação de células tumorais, são bons alvos a serem utilizados para a imunoterapia contra CRC.

[00161] Consequentemente, a presente invenção fornece ainda métodos de tratamento ou de prevenção de CRC, os ditos métodos compreendendo etapas de administração de um peptídeo imunogênico menor que aproximadamente 40 aminoácidos, frequentemente menor que aproximadamente 20 aminoácidos, geralmente menor que aproximadamente 15 aminoácidos compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 7. Alternativamente, o peptídeo imunogênico pode compreender um derivado da sequência da SEQ ID N°: 7 em que 1, 2, 3 ou vários aminoácidos estão modificados, substituídos ou adicionados. Em modalidades preferidas, o peptídeo imunogênico é um nonapeptídeo ou um decapeptídeo. Alternativamente, a presente invenção fornece um método de indução de imunidade antitumor para CRC, o dito método compreendendo as etapas de administração de um peptídeo imunogênico da invenção

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56/94 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 7 ou um derivado da mesma como descrito anteriormente. Na presente invenção, o peptídeo ou o derivado do mesmo pode ser administrado a um indivíduo via in vivo ou ex vivo. Além disso, a presente invenção fornece ainda o uso de um decapeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 7 ou de um derivado do mesmo para a produção de uma composição imunogênica para o tratamento ou para a prevenção de CRC.

[00162] A análise de homologia de TOM34 mostrou que não possui homologia significativa com os peptídeos derivados de quaisquer produtos gênicos humanos conhecidos. Isto diminui a possibilidade de respostas imunológicas desconhecidas ou indesejáveis com imunoterapia contra estas moléculas.

[00163] Em relação aos antígenos de HLA, o uso do tipo A-24 que é altamente expresso entre os japoneses é favorável para a obtenção de resultados eficientes e o uso de subtipos tal como A-2402 é ainda mais preferível. Tipicamente, na clínica, o tipo de antígeno HLA do paciente que necessita de tratamento é investigado antes, o que possibilita a seleção apropriada de peptídeos que possuem altos níveis de afinidade de ligação a este antígeno ou que possuem capacidade de indução de células T citotóxicas (CTL) através da apresentação de antígenos. Além disso, para a obtenção de peptídeos que exibem alta afinidade de ligação e capacidade de indução de CTL, a substituição ou a adição de 1, 2, 3, 4 ou vários aminoácidos pode ser realizada com base na sequência de aminoácidos do peptídeo parcial de TOM34 que ocorre naturalmente. Aqui, o termo vários significa 5 ou menos ou preferencialmente 3 ou menos. Além disso, em adição aos peptídeos que são naturalmente exibidos, uma vez que a regularidade das sequências de peptídeos exibidas pela ligação aos antígenos HLA já é conhecida (Kubo e outros, J. Immunol., 152, 3913, 1994; Rammensee

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57/94 e outros, Immunogenetics. 41: 178-228, 1995; Kondo e outros, J.

Immunol. 155: 4307-12, 1995), as modificações baseadas em tal regularidade podem ser realizadas nos peptídeos imunogênicos da invenção. Por exemplo, os peptídeos que mostram alta afinidade de ligação a HLA-24 possuem seu segundo aminoácido do N-terminal substituído por fenilalanina, tirosina, metionina ou triptofano e peptídeos cujo aminoácido no C-terminal é substituído por fenilalanina, leucina, isoleucina, triptofano ou metionina também podem ser utilizados de forma favorável.

[00164] Entretanto, quando a sequência de peptídeo é idêntica a uma parte da sequência de aminoácidos de uma proteína endógena ou exógena que possui uma função diferente, efeitos colaterais tais como distúrbios autoimunes ou sintomas alérgicos contra substâncias específicas podem ser induzidos, portanto, preferencialmente, situações em que a sequência se combina com a sequência de aminoácidos de uma outra proteína são evitadas através da realização de uma busca por homologia utilizando bancos de dados disponíveis. Além disso, se for evidente partindo das buscas por homologias que nem mesmo os peptídeos em que 1 ou 2 aminoácidos são diferentes existem, não há perigo de que as modificações da sequência de aminoácidos mencionada anteriormente com a finalidade de aumentar a afinidade de ligação com antígenos HLA e/ou aumentar a capacidade de indução de CTL causarão tais problemas.

[00165] Embora seja esperado que os peptídeos que possuem alta afinidade de ligação com os antígenos HLA como descrito anteriormente sejam altamente eficientes como vacinas para câncer, os peptídeos candidatos, que são selecionados de acordo com a presença de alta afinidade de ligação como um indicador, têm que ser verificados em relação à presença real de capacidade de indução de CTL. A confirmação da capacidade de indução de CTL é realizada através da

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58/94 indução de células apresentadoras de antígenos que carregam antígenos de MHC humano (por exemplo, linfócitos B, macrófagos e células dendríticas) ou mais especificamente células dendríticas derivadas de leucócitos mononucleares de sangue periférico humano e após o estímulo com os peptídeos, da mistura com células positivas para CD8 e então da medida da atividade citotóxica contra as célulasalvo. Como o sistema de reação, podem ser utilizados animais transgênicos que foram produzidos para expressar um antígeno HLA humano (por exemplo, os descritos em BenMohamed L. e outros, Hum. Immunol. 2000 Ago.; 61(8): 764-79). Por exemplo, as células-alvo podem ser rotuladas radioativamente com ⁵¹Cr e tal e a atividade citotóxica pode ser calculada partindo da radioatividade liberada das células-alvos. Alternativamente, esta pode ser verificada através da medida do IFN-γ produzido e liberado pela CTL na presença de células apresentadoras de antígenos que carregam peptídeos imobilizados e da visualização da zona de inibição no meio utilizando anticorpos monoclonais anti-IFN-γ.

[00166] Como um resultado da verificação da capacidade de indução de CTL dos peptídeos como descrito anteriormente, aqueles que possuem alta afinidade de ligação a um antígeno de HLA não tinha necessariamente alta capacidade de indução. Além disso, um decapeptídeo compreendendo as sequências de aminoácidos indicadas por KLRQEVKQNL (SEQ ID N°: 7) exibia capacidade de indução de CTL particularmente alta.

[00167] Como citado anteriormente, a presente invenção fornece peptídeos que possuem capacidade de indução de células T citotóxicas e que compreendem a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 7 em que 1,2, 3, 4 ou vários aminoácidos são substituídos ou adicionados. A sequência de aminoácidos que compreende 9 ou 10 aminoácidos indicados na SEQ ID N°: 7 em que 1,2, 3, 4 ou vários aminoácidos são

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59/94 substituídos ou adicionados preferencialmente não se combina com a sequência de aminoácidos de outras proteínas. Em particular, a substituição de aminoácido por fenilalanina (F), tirosina (Y), metionina (M) ou triptofano (W) no segundo aminoácido do terminal N e por fenilalanina (F), leucina (L), isoleucina (I), triptofano (W) ou metionina (M) no aminoácido C-terminal e a adição de aminoácidos de 1 até 2 aminoácidos no terminal N e/ou no terminal C são exemplos favoráveis. Especificamente, a presente invenção fornece um decapeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos KLRQEVKQNL (SEQ ID N°:

7) ou K-[L, F, Y, M ou W]-RQEVKQN-[L, F, L, I, W ou M].

[00168] Os peptídeos da invenção podem ser preparados utilizando técnicas bem-conhecidas. Por exemplo, os peptídeos podem ser preparados de forma sintética, através da tecnologia do DNA recombinante ou de síntese química. O peptídeo da invenção pode ser sintetizado individualmente ou na forma de polipeptídeos mais longos que compreendem dois ou mais peptídeos. O peptídeo é preferencialmente isolado, isto é, substancialmente isento de outras proteínas das células hospedeiras que ocorrem naturalmente e fragmentos das mesmas.

[00169] Os peptídeos podem conter modificações tal como glicosilação, oxidação de cadeias laterais ou fosforilação; contanto que as modificações não destruam a atividade biológica dos peptídeos que são descritos aqui. Outras modificações incluem a incorporação de Daminoácidos ou outros imitadores de aminoácidos que podem ser utilizados, por exemplo, para aumentar a meia-vida no soro dos peptídeos.

[00170] Os peptídeos desta invenção podem ser preparados em uma combinação, que compreende 2 ou mais peptídeos da invenção, para uso como uma vacina para câncer que pode induzir CTL in vivo. Os peptídeos podem estar em um coquetel ou podem ser conjugados em

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60/94 cada outro utilizado técnicas padronizadas. Por exemplo, os peptídeos podem ser expressos na forma de uma única sequência de polipeptídeo. Os peptídeos na combinação podem ser o mesmo ou diferentes. Através da administração dos peptídeos desta invenção, os peptídeos são apresentados a uma alta densidade nos antígenos HLA de células apresentadoras de antígenos, então a CTL que reage especificamente em direção ao complexo formado entre o peptídeo exibido e o antígeno HLA é induzida. Altemativamente, as células apresentadoras de antígenos que imobilizaram os peptídeos desta invenção sobre sua superfície celular são obtidas através da remoção de células dendríticas dos indivíduos, estas são estimuladas pelos peptídeos desta invenção, a CTL é induzida nos indivíduos através de uma nova administração destas células aos indivíduos e como um resultado, a agressividade em direção às células-alvo pode ser aumentada.

[00171] Mais especificamente, a presente invenção fornece fármacos para o tratamento de tumores ou para a prevenção da proliferação, da metástase e tais de tumores, que compreendem 1 ou mais dos peptídeos desta invenção. Os peptídeos desta invenção podem ser utilizados para o tratamento de CRC.

[00172] Os peptídeos desta invenção podem ser administrados diretamente na forma de uma composição farmacêutica que foi formulada através de métodos de formulação convencionais. Em tais casos, em adição aos peptídeos desta invenção, veículos, excipientes e tais que são comumente utilizados para os fármacos podem ser incluídos quando apropriado sem limitações particulares. As composições imunogênicas desta invenção podem ser utilizadas para o tratamento e para a prevenção de CRC.

[00173] As composições imunogênicas para tratamento e/ou prevenção de CRC, que compreendem os peptídeos desta invenção como os ingredientes ativos, podem compreender um adjuvante de

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61/94 forma que a imunidade celular será estabelecida de forma eficiente ou podem ser administradas com outros ingredientes ativos tais como agentes antitumor e podem ser administradas através da formulação em grânulos. Um adjuvante que pode ser aplicado inclui aqueles descritos na literatura (Johnson, Clin. Microbiol. Rev., 7: 277-289, 1994). Os exemplos de adjuvantes incluem, fosfato de alumínio, hidróxido de alumínio ou alúmen. Além disso, as formulações de lipossomos, formulações granulares em que o fármaco é ligado a esferas de poucos pm de diâmetro e formulações em que um lipídeo é ligado ao peptídeo podem ser convenientemente utilizadas. O método de administração pode ser oral, injeção intradermal, subcutânea, intravenosa ou tal e administração sistêmica ou a administração local na vizinhança do tumor alvo é possível. A dose dos peptídeos desta invenção pode ser ajustada apropriadamente de acordo com a doença que será tratada, a idade do paciente, o peso, o método de administração e tais e é comumente de 0,001 mg até 1000 mg, preferencialmente de 0,01 mg até 100 mg, mais preferencialmente de 0,1 mg até 10 mg e é preferencialmente administrada uma vez em alguns dias até alguns meses. Um versado na técnica pode selecionar de forma apropriada a dose adequada.

[00174] Alternativamente, a presente invenção fornece vesículas intracelulares chamadas de exossomos, que apresentam complexos formados entre os peptídeos desta invenção e antígenos HLA em sua superfície. Os exossomos podem ser preparados, por exemplo, através da utilização dos métodos descritos em detalhes na Tradução Japonesa Publicada de Publicações Internacionais N— Hei 11-510507 e 2000512161 e são preferencialmente preparados utilizando células apresentadoras de antígenos obtidas de indivíduos que são alvos de tratamento e/ou de prevenção. Os exossomos desta invenção podem ser inoculados na forma de vacinas para câncer, similarmente aos

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62/94 peptideos desta invenção.

[00175] O tipo de antígenos HLA utilizados tem que se combinar com aqueles do indivíduo que precisa de tratamento e/ou prevenção. Por exemplo, para os japoneses, HLA-A24, particularmente HLA-A2402 é frequentemente apropriado.

[00176] Em algumas modalidades as composições vacinais da invenção compreendem um componente que ativa linfócitos T citotóxicos. Os lipídeos foram identificados como agentes capazes de ativar CTL in vivo contra antígenos virais. Por exemplo, resíduos do ácido palmítico podem ser ligados a grupos ε e α-amino de um resíduo de lisina e então ligados a um peptídeo imunogênico da invenção. O peptídeo lipidado pode ser então administrado diretamente em uma micela ou partícula, incorporado em um lipossomo ou emulsificado em um adjuvante. Como um outro exemplo de lipídeo que ativa respostas de CTL, lipoproteínas de E. coli, tal como tripalmitoil-Sglicerilcisteinaliseril-serina (P3CSS) pode ser utilizada para ativar CTL quando ligada covalentemente com um peptídeo apropriado (ver, por exemplo, Deres e outros, Nature 342: 561-4, 1989).

[00177] As composições imunogênicas da invenção também podem compreender ácidos nucléicos que codificam os peptideos imunogênicos descritos aqui. Ver, por exemplo, Wolff e outros (1990) Science 247: 1465-1468; Patentes U.S. N— 5.580.859; 5.589.466; 5.804.566; 5.739.118; 5.736.524; 5.679.647; e WO 98/04720. Os exemplos de tecnologias de fornecimento baseadas no DNA incluem DNA nu, fornecimento facilitado (bupivicaína, polímeros, mediado por peptideos), complexos lipídicos catiônicos e fornecimento mediado por partículas (pistola gênica) ou mediado por pressão (ver, por exemplo, a Patente U.S. N- 5.922.687).

[00178] Os peptideos imunogênicos da invenção também podem ser expressos por vetores virais ou bacterianos. Os exemplos de vetores de

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63/94 expressão incluem hospedeiros virais atenuados, tal como vaccinia e fowlpox. Esta abordagem envolve o uso de vírus vaccinia, por exemplo, como um vetor para expressar sequências de nucleotídeos que codificam o peptídeo. Após a introdução em um hospedeiro, o vírus vaccinia recombinante expressa o peptídeo imunogênico e ativa assim uma resposta imunológica. Os vetores de vaccinia e os métodos úteis nos protocolos de imunização são descritos, por exemplo, na Patente U.S. N² 4.722.848. Um outro vetor é BCG (Bacille Calmette Guerin). Os vetores de BCG são descritos em Stover e outros (1991) Nature 351: 456-460. Uma ampla variedade de outros vetores úteis para administração terapêutica ou imunização, por exemplo, vetores adenovirais e associados a adeno, vetores retrovirais, vetores de Salmonella typhi, vetores da toxina de antraz detoxificada e similares serão evidentes. Ver, por exemplo, Shata e outros (2000) Mol. Med. Today 6: 66-71; Shedlock e outros (2000) J. Leukoc. Biol. 68: 793-806; e Hipp e outros (2000) In Vivo 14: 571-85.

[00179] A presente invenção fornece ainda métodos de indução de células apresentadoras de antígenos utilizando os peptídeos desta invenção. As células apresentadoras de antígenos podem ser induzidas através da indução de células dendríticas provenientes de monócitos de sangue periférico e então do contato (estímulo) das mesmas com os peptídeos desta invenção in vitro, ex vivo ou in vivo. Quando os peptídeos desta invenção são administrados aos indivíduos, as células apresentadoras de antígenos que possuem os peptídeos desta invenção imobilizados às mesmas são induzidas no corpo do indivíduo. Alternativamente, após a imobilização dos peptídeos desta invenção às células apresentadoras de antígenos, as células podem ser administradas ao indivíduo como uma vacina. Por exemplo, a administração ex vivo pode compreender as etapas de:

a: coleta das células apresentadoras de antígenos do

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64/94 indivíduo; e b: contanto das células apresentadoras de antígenos da etapa a; com o peptideo.

[00180] As células apresentadoras de antígenos obtidas através da etapa b podem ser administradas ao indivíduo como uma vacina.

[00181] Esta invenção fornece ainda um método para a indução das células apresentadoras de antígenos que possuem um alto nível de capacidade de indução de células T citotóxicas, em que o método compreende a etapa de transferência dos genes que compreendem polinucleotídeos que codificam os peptídeos desta invenção para as células apresentadoras de antígenos in vitro. Os genes introduzidos podem estar na forma de DNAs ou de RNAs. Para o método de introdução, sem limitações particulares, vários métodos convencionalmente realizados neste campo, tais como a lipofecção, a eletroporação e o método de fosfato de cálcio podem ser utilizados. Mais especificamente, pode ser realizado como descrito em Reeves e outros, Câncer Res., 56: 5672, 1996; Butterfield e outros, J. Immunol., 161: 5607, 1998; Boczkowski e outros, J. Exp. Med., 184: 465, 1996; Tradução Japonesa Publicada da Publicação Internacional N² 2000509281. Transferindo o gene para células apresentadoras de antígenos, o gene sofre transcrição, tradução e tal na célula e então a proteína obtida é processada pelo MHC de Classe I ou de Classe II e prossegue através de uma via de apresentação para apresentar peptídeos parciais. [00182] Além disso, a presente invenção fornece métodos para a indução de CTL utilizando os peptídeos desta invenção. Quando os peptídeos desta invenção são administrados a um indivíduo, a CTL é induzida no corpo do indivíduo e a força do sistema imunológico em direção às células de CRC nos tecidos tumorais é aumentada. Alternativamente, podem ser utilizados para um método terapêutico ex vivo, em que as células apresentadoras de antígenos derivadas do

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65/94 indivíduo e as células positivas para CD8 ou os leucócitos mononucleares de sangue periférico são colocados em contato (estimulados) com os peptídeos desta invenção in vitro e após a indução de CTL, as células são devolvidas para o indivíduo. Por exemplo, o método pode compreender as etapas de:

a: coleta das células apresentadoras de antígenos do indivíduo;

b: contanto das células apresentadoras de antígenos da etapa a, com o peptídeo;

c: mistura das células apresentadoras de antígenos da etapa b com as células T CD⁸⁺ e co-cultivo para a indução das células T citotóxicas; e d: coleta das células T CD⁸⁺ da co-cultura da etapa c. [00183] As células T CD⁸⁺ que possuem atividade citotóxica obtidas através da etapa d podem ser administradas ao indivíduo como uma vacina. Consequentemente, a presente invenção se refere a células CD8+ que são capazes de reconhecer os peptídeos descritos aqui que são apresentados por moléculas de MHC, por exemplo, HLA-24. Além disso, a presente invenção se refere ainda às células, por exemplo, APCs que compreendem uma molécula do tipo HLA-24 de MHC de classe I que apresenta o peptídeo descrito aqui.

[00184] Além disso, a presente invenção fornece células T citotóxicas que são induzidas utilizando os peptídeos desta invenção. As células T citotóxicas, que foram induzidas através do estímulo das células apresentadoras de antígenos que apresentam os peptídeos desta invenção, são preferencialmente derivadas de indivíduos que são alvos de tratamento e/ou de prevenção e podem ser administradas por si só ou em combinação com outros fármacos incluindo os peptídeos desta invenção ou exossomos com a finalidade de efeitos antitumorais. As células T citotóxicas obtidas atuam especificamente contra células

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66/94 alvo apresentadoras dos peptídeos desta invenção ou preferencialmente alguns peptídeos utilizados para a indução. As células-alvo podem ser células que expressam TOM34 de forma endógena ou células que são transfectadas com genes TOM34 e as células que apresentam os peptídeos desta invenção na superfície celular devido ao estímulo por estes peptídeos também podem ser tornar alvos de ataque.

[00185] A presente invenção fornece ainda células apresentadoras de antígenos que compreendem a apresentação de complexos formados entre antígenos HLA e os peptídeos desta invenção. As células apresentadoras de antígenos que são obtidas através do contato dos peptídeos desta invenção ou dos nucleotídeos que codificam os peptídeos desta invenção são preferencialmente derivadas de indivíduos que são alvos de tratamento e/ou de prevenção e podem ser administradas como vacinas por si só ou em combinação com outros fármacos incluindo os peptídeos desta invenção, exossomos ou células T citotóxicas.

[00186] Na presente invenção, a expressão vacina (também referida como uma composição imunogênica) se refere a uma substância que possui a função de induzir imunidade antitumor ou imunidade para suprimir CRC após a inoculação em animais. De acordo com a presente invenção, foi sugerido que os polipeptídeos que compreendem a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 7 eram peptídeos de epítopos restritos a HLA-A24 que podem induzir uma resposta imunológica potente e específica contra células de CRC que expressam TOM34. Assim, a presente invenção abrange ainda um método de indução de imunidade antitumor utilizando polipeptídeos que compreendem a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 7. Em geral, a imunidade antitumor inclui respostas imunológicas tais como as seguintes:

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- indução de linfócitos citotóxicos contra tumores que compreendem células que expressam TOM34,

- indução de anticorpos que reconhecem tumores que compreendem células que expressam TOM34 e

- indução de produção de citocina antitumor.

[00187] Portanto, quando uma certa proteína induz qualquer uma destas respostas imunológicas após a inoculação em um animal, é decidido que a proteína possui um efeito indutor de imunidade antitumor. A indução da imunidade antitumor por uma proteína pode ser detectada através da observação in vivo ou in vitro da resposta do sistema imunológico no hospedeiro contra a proteína.

[00188] Por exemplo, é bem-conhecido um método para a detecção da indução de linfócitos T citotóxicos. Uma substância estranha que entra no corpo vivo é apresentada para as células T e para as células B através da ação de células apresentadoras de antígenos (APCs). As células T que respondem ao antígeno apresentado pela APC de uma maneira específica ao antígeno se diferenciam em células T citotóxicas (ou linfócitos T citotóxicos; CTLs) devido ao estímulo pelo antígeno e então se proliferam (isto é referido como a ativação de células T). Portanto, a indução de CTL por um certo peptídeo pode ser avaliada através da apresentação do peptídeo a uma célula T por APC e da detecção da indução de CTL. Além disso, as APCs possuem o efeito de ativação de células T CD4+, de células T CD8+, macrófagos, eosinófilos e células NK. Uma vez que as células T CD4+ são também importantes na imunidade antitumor, a ação de indução da imunidade antitumor do peptídeo pode ser avaliada utilizando o efeito de ativação destas células como indicadores.

[00189] Um método para a avaliação da ação de indução de CTL utilizando células dendríticas (DCs) como APC é bem-conhecido na técnica. A DC é uma APC representativa que possui a ação indutora de

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CTL mais forte entre as APCs. Neste método, o polipeptídeo de teste é inicialmente colocado em contato com a DC e então esta DC é colocada em contato com células T. A detecção de células T que possuem efeitos citotóxicos contra as células de interesse após o contato com a DC mostra que o polipeptídeo de teste possui uma atividade de indução das células T citotóxicas. A atividade de CTL contra tumores pode ser detectada, por exemplo, utilizando a lise de células tumorais rotuladas com ⁵¹Cr como o indicador. Alternativamente, o método de avaliação do grau de danos das células tumorais utilizando a atividade de captação de ³H-timidina ou liberação de LDH (lactose desidrogenase) como o indicador é também bem-conhecido.

[00190] Além da DC, as células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) podem ser utilizadas como a APC. A indução de CTL é relatada como sendo aumentada através do cultivo de PBMC na presença de GM-CSF e IL-4. Similarmente, foi mostrado que a CTL é induzida através do cultivo de PBMC na presença de hemocianina da lapa do buraco da fechadura (KLH) e IL-7.

[00191] Os polipeptídeos de teste confirmados de possuírem atividade indutora de CTL através destes métodos são polipeptídeos que possuem efeito de ativação de DC e atividade indutora de CTL subsequente. Portanto, os polipeptídeos que induzem CTL contra células tumorais são úteis como vacinas contra CRC. Além disso, as APCs que adquiriram a capacidade de induzir CTL contra CRC através do contato com os polipeptídeos são úteis como vacinas contra CRC. Ainda, a CTL que adquiriu citotoxicidade devido à apresentação dos antígenos de polipeptídeos por APC também pode ser utilizada como vacinas contra CRC. Tais métodos terapêuticos para CRC utilizando imunidade antitumor devido à APC e à CTL são referidos como imunoterapia celular.

[00192] Geralmente, quando se utiliza um polipeptídeo para a

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69/94 imunoterapia celular, é sabido que a eficiência da indução de CTL aumenta através da combinação de um grande número de polipeptídeos que possuem estruturas diferentes e do contato dos mesmos com DC. Portanto, quando as DCs são estimuladas com fragmentos de proteínas, é vantajoso utilizar uma mistura de vários tipos de fragmentos.

[00193] Alternativamente, a indução de imunidade antitumor por um polipeptídeo pode ser confirmada através da observação da indução da produção de anticorpos contra tumores. Por exemplo, quando os anticorpos contra um polipeptídeo são induzidos em um animal de laboratório imunizado com o polipeptídeo e quando crescidos, a proliferação ou a metástase de células tumorais é suprimida por tais anticorpos, o polipeptídeo pode ser determinado como possuindo uma capacidade de induzir imunidade antitumor.

[00194] A imunidade antitumor é induzida através da administração da vacina desta invenção e a indução da imunidade antitumor possibilita o tratamento e a prevenção de CRC. A terapia contra ou a prevenção do início de CRC inclui qualquer uma das etapas, tal como a inibição de crescimento de células de CRC, a involução de células de CRC e a supressão da ocorrência de células de CRC. O decréscimo na mortalidade de indivíduos que possuem CRC, o decréscimo de marcadores de CRC no sangue, o alívio de sintomas detectáveis que acompanham o CRC e tais são também incluídos na terapia ou na prevenção de CRC. Tais efeitos terapêuticos e preventivos são preferencialmente estatisticamente significativos. Por exemplo, na observação, em um nível de significância de 5% ou menos, em que o efeito terapêutico ou preventivo de uma vacina contra CRC é comparado com um controle sem administração de vacina. Por exemplo, o teste t de Student, o teste U de Mann-Whitney ou ANOVA pode ser utilizado para as análises estatísticas.

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70/94 [00195] A proteína mencionada anteriormente que possui atividade imunológica ou um polinucleotídeo ou um vetor que codifica a proteína pode ser combinado com um adjuvante. Um adjuvante se refere a um composto que aumenta a resposta imunológica contra a proteína quando administrado junto (ou sucessivamente) com a proteína que possui atividade imunológica. Os exemplos de adjuvantes incluem a toxina do cólera, a toxina de salmonela, alúmen e tais, mas não estão limitados aos mesmos. Além disso, a vacina desta invenção pode ser combinada apropriadamente com um veículo farmaceuticamente aceitável. Os exemplos de tais veículos são água esterilizada, solução salina fisiológica, tampão fosfato, fluido de cultura e tais. Além disso, a vacina pode conter, quando necessário, estabilizantes, suspensões, conservantes, tensoativos e tais. A vacina é administrada de forma sistêmica ou local. A administração da vacina pode ser realizada através de uma única administração ou reforçada por várias administrações.

[00196] Quando se utiliza APC ou CTL como a vacina desta invenção, o CRC pode ser tratado ou prevenido, por exemplo, através do método ex vivo. Mais especificamente, as PBMCs do indivíduo que recebe o tratamento ou a prevenção são coletadas, as células são colocadas em contato com o polipeptídeo ex vivo e após a indução de APC ou de CTL, as células podem ser administradas ao indivíduo. A APC pode ainda ser induzida através da introdução de um vetor que codifica o polipeptídeo nas PBMCs ex vivo. A APC ou a CTL induzida in vitro pode ser clonada antes da administração. Através da clonagem e do cultivo das células que possuem alta atividade de danificar as células-alvos, a imunoterapia celular pode ser realizada mais eficientemente. Além disso, a APC e a CTL isoladas desta maneira podem ser utilizadas para a imunoterapia celular não apenas contra indivíduos dos quais as células são derivadas, mas também contra tipos similares de doenças em outros indivíduos.

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Composições farmacêuticas para a inibição de CRC:

[00197] No contexto da presente invenção, as formulações farmacêuticas adequadas incluem aquelas adequadas para administração oral, retal, nasal, tópica (incluindo bucal e sublingual), vaginal ou parenteral (incluindo intramuscular, subcutânea e intravenosa) ou para administração por inalação ou insuflação. Preferencialmente, a administração é intravenosa. As formulações são opcionalmente embaladas em unidades de dosagem distintas.

[00198] As formulações farmacêuticas adequadas para a administração oral incluem cápsulas, cachês ou comprimidos, cada um contendo uma quantidade predeterminada de ingrediente ativo. As formulações adequadas incluem ainda pós, grânulos, soluções, suspensões e emulsões. O ingrediente ativo é opcionalmente administrado na forma de um bolo, eletuário ou pasta. Os comprimidos e as cápsulas para administração oral podem conter excipientes convencionais, tais como agentes de ligação, recheios, lubrificantes, agentes de desintegração e/ou umectantes. Um comprimido pode ser produzido através da compressão ou da moldagem, opcionalmente com um ou mais ingredientes da formulação. Os comprimidos comprimidos podem ser preparados através da compressão em uma máquina adequada os ingredientes ativos em uma forma de escoamento livre, tal como um pó ou grânulos, opcionalmente misturados com um agente aglutinante, um lubrificante, um diluente inerte, um agente de lubrificação, um tensoativo e/ou um agente de dispersão. Os comprimidos moldados podem ser feitos através da moldagem em uma máquina adequada de uma mistura do composto em pó umedecido com um diluente líquido inerte. Os comprimidos podem ser revestidos de acordo com os métodos bem-conhecidos na técnica. As preparações fluidas orais podem estar na forma de, por exemplo, suspensões aquosas ou oleosas, soluções, emulsões, xaropes ou elixires ou podem

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72/94 ser apresentadas na forma de um produto seco para constituição com água ou outro veículo adequado antes do uso. Tais preparações líquidas podem conter aditivos convencionais, tais como agentes de suspensão, agentes emulsificantes, veículos não-aquosos (que podem incluir óleos comestíveis) e/ou conservantes. Os comprimidos podem ser opcionalmente formulados de forma a fornecerem liberação lenta ou controlada do ingrediente ativo contido nos mesmos. Uma embalagem de comprimidos pode conter um comprimido que será tomado em cada um dos meses.

[00199] As formulações adequadas para a administração parenteral incluem soluções para injeção esterilizadas aquosas e não-aquosas, opcionalmente contêm antioxidantes, tampões, bacterioestáticos e solutos que tornam a formulação isotônica com o sangue do receptor pretendido; assim como suspensões esterilizadas aquosas e nãoaquosas que incluem agentes de suspensão e/ou agentes espessantes. As formulações podem ser apresentadas em recipientes de dose unitária ou de várias doses, por exemplo, na forma de ampolas e frascos selados e podem ser armazenadas em uma condição seca por congelamento (liofilizada), requerendo apenas a adição do veículo líquido esterilizado, por exemplo, solução salina, água-para-injeção, imediatamente antes do uso. Alternativamente, as formulações podem ser apresentadas para infusão contínua. As soluções e as suspensões para injeção extemporânea podem ser preparadas partindo de pós esterilizados, grânulos e comprimidos do tipo descrito anteriormente.

[00200] As formulações adequadas para a administração retal incluem supositórios com veículos padronizados tal como manteiga de cacau ou polietileno glicol. As formulações adequadas para administração tópica na boca, por exemplo, de forma bucal ou sublingual, incluem pastilhas, contendo o ingrediente ativo em uma base aromatizada tal como sacarose e goma acácia ou adragante e pastilhas,

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73/94 que compreendem o ingrediente ativo em uma base tal como gelatina e glicerina ou sacarose e goma acácia. Para a administração intranasal, os compostos da invenção podem ser utilizados na forma de um spray líquido, um pó que pode ser disperso ou na forma de gotas. As gotas podem ser formuladas com uma base aquosa ou não-aquosa que compreende ainda um ou mais agentes de dispersão, agentes solubilizantes e/ou agentes de suspensão.

[00201] Para a administração através de inalação os compostos podem ser convenientemente fornecidos partindo de um insuflador, um nebulizador, embalagens pressurizadas ou outros meios convenientes de fornecimento de um spray em aerossol. As embalagens pressurizadas podem compreender um agente de propulsão adequado tal como diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluorometano, dióxido de carbono ou outro gás adequado. No caso de um aerossol pressurizado, a unidade de dosagem pode ser determinada através do fornecimento de uma válvula para fornecer uma quantidade medida.

[00202] Alternativamente, para a administração por inalação ou insuflação, os compostos podem tomar a forma de uma composição em pó seco, por exemplo, uma mistura de pós do composto e uma base em pó adequada, tal como lactose ou amido. A composição em pó pode ser apresentada na forma de dosagem unitária, por exemplo, na forma de cápsulas, cartuchos, gelatina ou embalagens em bolha, partindo das quais o pó pode ser administrado com o auxílio de um inalador ou de insufladores.

[00203] Outras formulações incluem dispositivos que podem ser implantados e emplastros adesivos que liberam um agente terapêutico. [00204] Quando desejado, as formulações descritas anteriormente, adaptadas para fornecer a liberação controlada do ingrediente ativo, podem ser empregadas. As composições farmacêuticas podem conter

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74/94 ainda outros ingredientes ativos, tais como agentes antimicrobianos, imunossupressores e/ou conservantes.

[00205] Deve ser entendido que em adição aos ingredientes particularmente mencionados anteriormente, as formulações desta invenção podem incluir outros agentes convencionais na técnica em relação ao tipo de formulação em questão. Por exemplo, as formulações adequadas para administração oral podem incluir agentes flavorizantes. [00206] As formulações de dosagem unitária preferidas contêm uma dose eficiente, como citado abaixo ou uma fração apropriada da mesma, do ingrediente ativo.

[00207] Para cada um dos estados de saúde mencionados anteriormente, as composições, por exemplo, polipeptídeos e compostos orgânicos, podem ser administrados oralmente ou através de injeção a uma dose que varia de aproximadamente 0,1 até aproximadamente 250 mg/kg por dia. A faixa de doses para seres humanos adultos é geralmente de aproximadamente 5 mg até aproximadamente 17,5 g/dia, preferencialmente de aproximadamente 5 mg até aproximadamente 10 mg/dia e mais preferencialmente de aproximadamente 100 mg até aproximadamente 3 g/dia. Os comprimidos ou outras formas de dosagem unitárias de apresentação fornecidas em unidades distintas podem conter convenientemente uma quantidade que é eficiente em tal dosagem ou na forma de um múltiplo da mesma, por exemplo, unidades que contêm aproximadamente 5 mg até aproximadamente 500 mg, geralmente de aproximadamente 100 mg até aproximadamente 500 mg.

[00208] A dose empregada dependerá de um número de fatores, incluindo a idade e o sexo do indivíduo, o distúrbio preciso que está sendo tratado e sua gravidade. Ainda a via de administração pode variar dependendo do estado de saúde e sua gravidade. Em qualquer evento, as dosagens apropriadas e ótimas podem ser rotineiramente calculadas

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75/94 pelos peritos na técnica, levando em consideração os fatores mencionados anteriormente.

[00209] Os aspectos da presente invenção são descritos nos exemplos a seguir, que não são pretendidos como limitantes do âmbito da invenção descrito nas reivindicações. Os exemplos a seguir ilustram a identificação e a caracterização de genes expressos de forma diferencial em células de CRC.

Exemplos

Linhagens de células e Materiais Clínicos [00210] As linhagens de células de câncer de cólon humano HCT116 e RKO foram obtidas na American Type Culture Collection (Rockville, MD). Todas estas células foram cultivadas na forma de monocamadas em meios apropriados, McCoys 5A (Invitrogen, Carlsbad, CA) para HCT116 e RPMI 1640 (Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO) para RKO, suplementado com 10% de soro fetal bovino (Cansera International Inc., Ontário, Canadá) e 1% de solução de antibiótico/antimicótico (Sigma-Rich). As células foram mantidas a 37°C em uma atmosfera de ar umedecido com 5% de CO2. Os tecidos cancerosos e as mucosas não-cancerosas correspondentes foram cortados de 12 pacientes durante a cirurgia, após 0 consentimento informado ter sido obtido.

[00211] As células TISI (HLA-A24/24) e EHM (HLA-A3/3), as linhagens de células de linfoblastóide B humanas, foram doações generosas da Takara Shuzo Co, Ltd. (Otsu, Japão). As células TISI foram utilizadas para os ensaios de citotoxicidade mediada por peptídeo. As linhagens de células de carcinoma colorretal DLD-1 (HLAA24/02), HT29 (HLA-A24/01) e SNU-C2A (HLA-A31/26) foram obtidas na ATCC. Uma linhagem de células de leucemia mielogênica crônica K562 foi obtida na ATCC.

RT-PCR Semiquantitativa

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76/94 [00212] O RNA total foi extraído de células cultivadas ou de tecidos clínicos utilizando o reagente TRIZOL (Invitrogen) de acordo com o protocolo do fabricante. O RNA extraído foi tratado com DNaseI (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha) e transcrito de forma inversa em cDNAs de fita simples utilizando o iniciador oligo(dT)12-18 e a transcriptase reversa Superscript II (Invitrogen). Foram preparadas diluições apropriadas de cada cDNA de fita simples para a amplificação da PCR subsequente monitorando o gene GAPDH como um controle quantitativo. As sequências de iniciadores utilizadas são, 5'ACAACAGCCTCAAGATCATCAG-3’ (SEQ ID N°: 41) e 5’GGTCCACCACTGACACGTTG-3’ (SEQ ID N°: 42) para GAPDH; 5’TGGTATAAACCTAAGGCCCTGAT-3' (SEQ ID N°: 43) e 5'TAAACAGCTTAGGTGCCTCTCTG-3’ (SEQ ID N°: 44) para TOM34. Todas as reações de amplificação foram precedidas pela desnaturação inicial a 94°C durante 2 min, seguidos por 18 (para GAPDH) ou 29 ciclos (para TOM34) de amplificação a 94°C durante 30 s, 60°C durante 30 s e 72°C durante 30 s em um GeneAmp PCR system 9700 (PE Applied Biosystems, Foster, CA).

Northern Blotting [00213] Os blots com vários tecidos humanos (BD Bioscience, Palo Alto, CA) foram hibridizados com um produto da PCR de TOM34 rotulado com ³²P. A sonda foi preparada através de RT-PCR utilizando um conjunto de iniciadores, 5’-GAACGTGAAGGCATTCTACAGA-3’ (SEQ ID N°: 45) e 5’-TAAACAGCTTAGGTGCCTCTCTG-3’ (SEQ ID N°: 44) e o rótulo de oligonucleotídeos aleatório subsequente com ³²P-dCTP com um Mega Label kit (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Reino Unido). A pré-hibridização, a hibridização e a lavagem foram realizadas de acordo com as recomendações do fabricante. Os blots foram autorradiografados com telas de intensificação a -80°C durante 10 dias.

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Preparação de Anticorpo Policlonal contra TOM34 [00214] A região codificadora inteira de TOM34 foi amplificada utilizando um conjunto de iniciadores, 5'CATAAGCTTGCATGGCCCCCAAATTCCCA-3' (SEQ ID N°: 58) e 5'GTTAAGCTTTTAGTGTAGGTTCT-3', (SEQ ID N°: 59) e subsequentemente clonada em um sítio de clonagem apropriado do vetor pET28 (Novagen, Madison, WI) para gerar plasmídeos expressando a proteína TOM34 His-tagged. A proteína recombinante foi expressa na cepa de Escherichia coli BL21-CodonPlus (DE3)-RIL (Stratagene, LaJolla, CA) e purificada utilizando TALON Superflow Metal Affinity Resin (BD Bioscience) de acordo com o protocolo do fabricante. A proteína foi inoculada em coelhos e os soros imunizados foram purificados em colunas de afinidade de acordo com o método padronizado. A análise de Western blot foi realizada utilizando proteínas extraídas das células utilizando 0,1% de tampão similar a RIPA contendo 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 250 mM de NaCl, 0,1% de SDS e 0,5% de NP40 com Protease Inhibitor Cocktail Set III (CALBIOCHEM, La Jolla, CA).

Imunohistoquímica [00215] A mancha imunohistoquímica foi realizada utilizando o anticorpo policlonal purificado por afinidade contra TOM34 humana. As seções de tecido embebidas em parafina foram submetidas ao sistema de imunomancha com SAB-PO peroxidase (Nichirei, Tóquio, Japão), após os antígenos serem recuperados dos tecidos desparafinizados e reidratados através do pré-tratamento da lâmina em 0,01 M de tampão citrato (pH 6,0) a 108°C durante 10 minuto por autoclave.

Construção de psiU6BX Expressando siRNAs para TOM34 [00216] Os plasmídeos expressando siRNAs foram preparados através da clonagem de oligonucleotídeos de fita dupla no sítio de BbsI no vetor psiU6BX com descrito anteriormente (WO2004/076623). As sequências dos oligonucleotídeos pareados são:

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5’-CACCGAAAGTGTTCTCTACTCCATTCAAGAGATGGAGTAGAGAACACTTTC-3’ (SEQ ID N°; 46) e

5’-AAAAGAAAGTGTTCTCTACTCCATCTCTTGAATGGAGTAGAGAACACTTTC-3’ (SEQ ID N°; 47) para siD;

5’-CACCGGATGGAAACTGCAGAGACTTCAAGAGAGTCTCTGCAGTTTCCATCC-3’ (SEQ ID N°; 50) e 5’-AAAAGGATGGAAACTGCAGAGACTCTCTTGAAGTCTCTGCAGTTTCCATCC-3’ (SEQ ID N°; 51) para siE.

[00217] Após serem fosforilados com a T4-polinucleotídeo quinase, os oligonucleotídeos pareados foram fervidos durante cinco min e foram subsequentemente anelados para produzir oligonucleotídeos de fita dupla através do resfriamento lentamente. Um plasmídeo de controle, psiU6BX-EGFP foi preparado utilizando oligonucleotídeos consistindo nas sequências a seguir. Cada uma das sequências de nucleotídeos, as sequências alvos do siRNA e as SEQ ID N°^s são mostradas na tabela

1.

5’-CACCGAAGCAGCACGACTTCTTCTTCAAGAGAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3’ (SEQ ID N°; 54) e

5’-AAAAGAAGCAGCACGACTTCTTCTCTCTTGAAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3’ (SEQ ID N°; 55).

[00218] Para verificar o efeito dos TOM34-siRNAs, a análise de western blotting foi realizada utilizando anticorpo anti-TOM34 cinco dias após a transfecção com os plasmídeos.

Tabela 1. Sequência de oligonucleotídeos de fita dupla específicos inseridos no vetor de expressão de siRNA e sequências alvos de cada siRNA.

	SEQ ID N°:	sequência
TOM34 siD posição	seq de inserção	46	CACCGAAAGTGTTCTCTACTCCATTCAAG AGATGGAGTAGAGAACACTTTC
seq de inserção	47	AAAAGAAAGTGTTCTCTACTCCATCTCTT GAATGGAGTAGAGAACACITTC

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	SEQ ID N°:	sequência
288-306	alvo	48	GAAAGTGTTCTCTACTCCA
siRNA com grampo	49	GAAAGTGTTCTCTACTCCATTCAAGAGAT GGAGTAGAGAACACTTTC
TOM34 siE posição 329-347	seq de inserção	50	CACCGGATGGAAACTGCAGAGACTTCAA GAGAGTCTCTGCAGITTCCATCC
seq de inserção	51	AAAAGGATGGAAACTGCAGAGACTCTCT TGAAGTCTCTGCAGTTTCCATCC
alvo	52	GGATGGAAACTGCAGAGAC
siRNA com grampo		GGATGGAAACTGCAGAGACTTCAAGAGA GTCTCTGCAGTTTCCATCC
Controle de EGFP	seq de inserção		CACCGAAGCAGCACGACTTCTTCTTCAAG AGAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC
seq de inserção		AAAAGAAGCAGCACGACTTCTTCTCTCTT GAAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC
alvo		GAAGCAGCACGACTTCTTC
siRNA com grampo		GAAGCAGCACGACTTCTTCTCTCTTGAAG AAGAAGTCGTGCTGCTTC

Ensaio de Formação de Colônias [00219] As células HCT116 plaqueadas em placa de 10 cm (4x105 células/placa) foram transitoriamente transfectadas com plasmídeos expressando TOM34-siRNAs utilizando o reagente FuGENE6 (Roche Diagnostics) e mantidas em um meio contendo 10% de soro fetal bovino com 800 pg/mL de Geneticina durante duas semanas. As células sobreviventes foram fixadas com 100% de metal e coradas com solução de Giemsa. Em um outro experimento, as células viáveis foram medidas com um kit de contagem de células (DOJINDO, Kumanoto, Japão). Análise Estatística [00220] A significância estatística foi analisada por ANOVA com o teste F de Scheffes, utilizando um software disponível comercialmente (Statview; SAS Institute, Cary, NC).

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Peptídeo derivado de TOM34 [00221] Peptídeos em nonâmero e 10-mer derivados da sequência peptídica de TOM34 que se ligariam à molécula de HLA-A24 foram previstos através do software de previsão de ligação (http://bimas.dcrt.nih.Qov/cqi-bin/molbio/ken parker comboform) (Parker KC e outros, J Immunol. 1994; 152(1): 163-75). Estes peptídeos foram sintetizados por Mimotopes, San Diego, CA, de acordo com o método de síntese em fase sólida padronizado e purificados por HPLC em fase inversa. A pureza (>90%) e a identidade dos peptídeos foram determinadas por HPLC analítica e pela análise de espectrometria de massa, respectivamente. Os peptídeos foram dissolvidos em dimetilsulfóxido (DMSO) a 20 mg/mL e armazenados a -80°C.

Indução de CTL in vitro [00222] As células dendríticas (DCs) derivadas de monócitos foram utilizadas como células apresentadoras de antígenos (APCs) para induzir CTLs contra peptídeos apresentados em HLA. As DCs foram geradas in vitro como descrito em outro lugar (Nukaya I e outros, Int J Câncer. 1999; 80(1): 92-7; Tsai V e outros, J Immunol. 1997; 158(4): 1796-802). Sucintamente, as células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) foram isoladas de voluntários normais (HLA-A24) por solução de Ficoll-Paque (Pharmacia) e separadas por aderência em um frasco de cultura de tecido de plástico (Becton Dickinson) de forma a enriquecê-las em relação à fração de monócitos. A população enriquecida em relação aos monócitos foi cultivada na presença de 1.000 U/mL de GM-CSF (fornecido por Kirin Brewery Company) e 1.000 U/mL de IL-4 (Genzyme) em AIM-V (Invitrogen) contendo 2% de soro autólogo inativado por calor (AS). Após 7 dias na cultura, as DCs geradas por citocinas foram carregadas com 20 pg/mL de peptídeos de ligação a HLA-A24 na presença de 3 pg/mL de p2-microglobulina durante 4 h a 20°C em AIM-V. Estas DCs carregadas com peptídeos

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81/94 foram então irradiadas (5.500 rad) e misturadas a uma proporção de 1:20 com células T CD8+ autólogas, obtidas através da seleção positiva com Dynabeads M-450 CD8 (Dynal) e Detachabead (Dynal). Esta mistura foi subdividida e as alíquotas foram incubadas em placas de 48 cavidades (Corning); cada cavidade continha 1,5x10⁴ DCs carregadas com peptídeos e 3x10⁵ células T CD8+ em 0,5 mL de AIM-V/2% de AS contendo 10 ng/mL de IL-7 (Genzyme). Três dias depois, estas culturas foram suplementadas com IL-2 (CHIRON) até uma concentração final de 20 IU/mL. Nos dias 7 e 14, as células T foram adicionalmente estimuladas novamente com as DCs carregadas com peptídeos autólogos. As DCs foram preparadas cada vez através da mesma maneira como descrito anteriormente. A citotoxicidade foi testada contra células TISI carregadas com peptídeos após a 3^a rodada de estímulo com peptídeos no dia 21.

Procedimento de Expansão de CTL [00223] As CTLs foram expandidas em cultura utilizando o método similar ao descrito por Riddell e outros (Walter e outros, N Engl J Med 333: 1038-1044, (1995), Riddel e outros, Nature Med. 2: 216-223, (1996)). Um total de 5 x 10⁴ CTLs foi ressuspenso em 25 mL de AIMV/5% de AS com 25 x 106 PBMCs irradiadas (3.300 rad) e 5 x 106 células EHM irradiadas (8.000 rad) na presença de 40 ng/mL de anticorpo monoclonal anti-CD3 (Pharmigen). Um dia depois do início da cultura, 120 IU/mL de IL-2 foram adicionados à cultura. A cultura foi alimentada com AIM-V/5% de AS fresco contendo 30 IU/mL de IL-2 nos dias 5, 8 e

11.

Estabelecimento de clones de CTL [00224] As culturas de CTL expandidas foram diluídas e as células foram distribuídas nas cavidades de placas para microtitulação com fundo arredondado de 96 cavidades (Nalge Nunc International) ajustando o número das células como sendo de 0,3, 1 e 3

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CTLs/cavidade. As CTLs foram então cultivadas com 7x10⁴ células/cavidade de PBMCs alogênicas, 1x10⁴ células/cavidade de EHM, 30 ng/mL de anticorpo anti-CD3 e 125 U/mL de IL-2 no total de 150 pL/cavidade de AIM-V contendo 5% de AS. 50 pL/cavidade de IL-2 foram adicionados no meio 10 dias depois de forma que a IL-2 ficou em 125 U/mL na concentração final. A atividade citotóxica das CTLs foi testada no 14^o dia e os clones de CTL foram expandidos utilizando o mesmo método que foi descrito anteriormente.

Ensaio de Citotoxicidade [00225] As células-alvo foram rotuladas com 100 pCi de Na2⁵¹CrÜ4 (Perkin Elmer Life Sciences) durante uma hora a 37°C em uma incubadora de CO2. As células-alvo carregadas com o peptídeo foram preparadas através da incubação das células com 20 pg/mL do peptídeo durante 16 horas a 37°C antes da marcação. As células-alvo rotuladas foram lavadas e misturadas com células efetoras em um volume final de 0,2 mL em placas para microtitulação com o fundo arredondado. As placas foram centrifugadas (4 minutos a 800 x g) para aumentar o contato célula-a-célula e colocadas em uma incubadora de CO2 a 37°C. Após 4 horas de incubação, 0,1 mL do sobrenadante foi coletado de cada cavidade e a radioatividade foi determinada com um contador gama. No caso da avaliação da citotoxicidade para as célulasalvo que expressam de forma endógena TOM34, a atividade citotóxica foi testada na presença de um excesso de 30 vezes de células K562 não rotuladas para eliminar qualquer lise inespecífica causada por efetores similares a NK. A especificidade do antígeno foi confirmada através do ensaio de inibição de alvo frio, que utilizava células TISI não rotuladas que foram carregadas com o peptídeo do antígeno (20 pg/mL durante 16 h a 37°C) para competir pelo reconhecimento de células tumorais HT29 rotuladas com ⁵¹ Cr.

[00226] A porcentagem de citotoxicidade específica foi determinada

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83/94 através do cálculo da porcentagem de liberação específica de ⁵¹Cr através da fórmula a seguir: {(com da liberação da amostra de teste com da liberação espontânea)/(com da liberação máxima - com da liberação espontânea)} x 100. A liberação espontânea foi determinada através da incubação das células-alvo isoladamente, na ausência de células efetoras e a liberação máxima foi obtida através da incubação dos alvos com HCl a 1 N. Todas as medidas foram feitas em duplicata e os erros padrões das médias eram coerentemente abaixo de 10% do valor da média.

Resultados

Expressão elevada de TOM34 em CRCs [00227] No estudo anterior dos presentes inventores, foi identificado um número de genes cujos níveis de expressão eram frequentemente alterados em tumores de cólon através da análise do perfil de expressão ampla do genoma de 11 CRCs e nove adenomas do cólon utilizando um microarranjo de cDNA consistindo em 23040 genes. Entre os genes cujos níveis de expressão eram frequentemente regulados para mais nos 11 carcinomas, a presente invenção se centraliza em um gene com um número de identificação em casa de D3124 que correspondia a TOM34 (N^o de Acesso do GeneBank: AB085681, SEQ ID N°: 60, 61) (Translocase da Membrana Mitocondrial Externa de 34 kDa). A análise de RT-PCR semiquantitativa subsequente revelou sua expressão aumentada em 16 de 20 amostras clínicas de CRC verificadas (Figura 1A). Em adição, TOM34 também estava significativamente regulado para mais em todos os oito carcinomas hepatocelulares, cinco de 19 cânceres de pulmão, 3 de 9 cânceres de bexiga, sete de 27 leucemias mielóides agudas e nove de 49 sarcomas de tecidos moles nos dados de microarranjo de cDNAs dos presentes inventores. Para investigar sua expressão nos tecidos normais humanos, foi realizada uma análise de Northern blot com vários tecidos utilizando o cDNA de TOM34 como

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84/94 uma sonda. Como um resultado, a análise revelou um produto da transcrição de aproximadamente 2,0 kb de tamanho, que foi abundantemente expresso nos testículos e nos ovários e fracamente na próstata, no baço e no cólon, mas não expresso em qualquer um dos outros 11 tecidos examinados (Figura 1B).

Proteína TOM34 acumulada em linhagens de células de câncer colorretal e tecidos de CRC [00228] Foi preparado um anticorpo policlonal anti-TOM34 e foi verificada a expressão da proteína TOM34 em oito linhagens de células de CRC e 12 tecidos de CRC através da mancha imunohistoquímica. A análise de imunoblot detectou uma banda de 34 kDa de TOM34 que era abundantemente expressa em todas as linhagens de células de CRC examinadas. Por outro lado, foram mostrados baixos níveis de expressão em NIH3T3 e COS7, duas linhagens de células que não são cancerosas (Figura 2B). A análise de Western blot utilizando 16 CRC e tecidos de mucosa não-cancerosos correspondentes demonstrou sua maior expressão em 15 dos 16 tumores comparados com a mucosa normal (Figura 2A). Para verificar a localização subcelular de TOM34, foi realizada a mancha imunocitoquímica utilizando células HCT116 e RKO com o anticorpo anti-TOM34, que exibia localização citoplásmica da proteína. Em adição, foi realizada a mancha imunohistoquímica utilizando 12 tecidos de câncer de cólon embebidos em parafina. Em 11 dos 12 tumores, TOM34 foi fortemente corada nos citoplasmas de células cancerosas, mas foi fracamente corada na mucosa nãocancerosa (Figura 3).

Efeito de TOM34-siRNAs sobre o crescimento de células de câncer de cólon [00229] Para elucidar a função de TOM34 em células de câncer, foram preparados plasmídeos expressando siRNA para TOM34 e foi verificado seu efeito sobre o crescimento de células de câncer. Foram

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85/94 preparadas duas formas de plasmídeos expressando siRNAs planejados para suprimir TOM34 (psiU6BX-TOM34-siD e —siE) e um plasmídeo de controle (psiU6BX-siEGFP). Foram transfectadas células HCT116 com psiU6BX-TOM34-siD, psiU6BX-TOM34-siE ou psiU6BXsiEGFP. A análise de Western blot de extratos de células transfectadas revelou que o psiU6BX-TOM34-siD e o psiU6BX-TOM34-siE suprimiam significativamente a expressão de TOM34 nas células transfectadas comparados com psiU6BX-siEGFP (Figura 4A). Foi realizada a transfecção com os plasmídeos co-expressando o gene de resistência à neomicina em células HCT116 e estas foram cultivadas com uma concentração apropriada de Geneticina durante 13 dias. De acordo com a expressão reduzida de TOM34, tanto psiU6BX-TOM34-siD quanto psiU6BX-TOM34-siE retardaram notavelmente o crescimento de células transfectadas comparadas com psiU6BX-siEGFP (Figura 4B). Estes dados indicavam que a expressão de TOM34 está associada com o crescimento de células cancerosas.

Previsão de peptídeos que se ligam a HLA-A24 derivados de TOM34 [00230] As Tabelas 2 e 3 mostram os peptídeos previstos para o antígeno com a finalidade de ligação com alta afinidade. Vinte peptídeos 10-mer (Tabela 2) e vinte peptídeos 9-mer (Tabela 3) foram selecionados em relação ao antígeno e verificados como descrito abaixo.

Tabela 2. Previsão de Candidatos a Epítopos de HLA de Classe I (HLAA24: 10 mer)

Posição de Início	Sequência	Escore de Ligação (BIMAS)	SEQ ID N°:
229	TYSNRALCYL	200,0	1
53	LYSNRAACHL	200,0	2
94	AYEAKEKYPM	37,5	3
194	RVLKEEGNEL	15,8	4

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Posição de Início	Sequência	Escore de Ligação (BIMAS)	SEQ ID N°:
215	KYSESLLCSN	14,4	5
211	KAIEKYSESL	14,4	6
299	KLRQEVKQNL	13,4	7
127	RMTRALMDSL	9,6	8
242	QYTEAVKDCT	8,4	9
80	LVPFSIKPLL	8,4	10
278	KSSFADISNL	8,0	11
216	YSESLLCSNL	7,2	12
79	ALVPFSIKPL	7,2	13
279	SSFADISNLL	6,7	14
69	DCIKDCTSAL	6,0	15
212	AIEKYSESLL	6,0	16
245	EAVKDCTEAL	6,0	17
22	NGQYAEASAL	6,0	18
123	EGINRMTRAL	6,0	19
272	KALKDYKSSF	6,0	20

Tabela 3. Previsão de Candidatos a Epítopos de HLA de Classe I (HLAA24: 9 mer)

Posição de Início	Sequência	Escore de Ligação (BIMAS)	SEQ ID N°:
104	AYVDYKTVL	360,0	21
31	LYGRALRVL	200,0	22
4	KFPDSVEEL	79,2	23
276	DYKSSFADI	60,0	24
280	SFADISNLL	40,3	25
100	KYPMAYVDY	15,0	26
215	K.YSESLLCS	12,0	27
236	CYLVLKQYT	10,8	28
141	RLKLPSIPL	8,0	29

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Posição de Início	Sequência	Escore de Ligação (BIMAS)	SEQ ID N°:
136	LGPEWRLKL	7,9	30
153	SAQKRWNSL	7,2	31
195	VLKEEGNEL	6,3	32
242	QYTEAVKDC	6,0	33
134	DSLGPEWRL	6,0	34
24	QYAEASALY	6,0	35
54	YSNRAACHL	6,0	36
80	LVPFSIKPL	6,0	37
230	YSNRALCYL	6,0	38
124	GJNEJMETKAJL·	6,0	39
212	AIEKYSESL	6,0	40

Estímulo das células T utilizando os peptídeos previstos [00231] As células T citotóxicas que reconhecem os peptídeos derivados de TOM34 foram geradas da maneira descrita em Materiais e Métodos. As CTLs resultantes com atividade citotóxica detectável foram expandidas e foram estabelecidas aquelas linhagens de CTL que exibiam maiores atividades citotóxicas contra o alvo carregado com o peptídeo quando comparado com o alvo sem o pulso de peptídeo.

[00232] As linhagens de CTL estimuladas com o peptídeo 10-mer TOM34-299 (KLRQEVKQNL (SEQ ID N°: 7)) exibiam atividade citotóxica potente contra o alvo carregado com o peptídeo sem exibir qualquer atividade citotóxica significativa contra alvos não carregados com o peptídeo (Figura 5). As linhagens de CTL exibiam citotoxicidade potente e específica ao antígeno detectável na proporção de E/T tão baixa quanto 1,2 (Figuras 6).

Estabelecimento de clones de CTL [00233] Os clones de CTLs foram estabelecidos através da diluição limitante de culturas de linhagens de CTL seguida pela expansão que é descrita em Materiais e Métodos. Os clones de CTL específicos para

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TOM34-299 obtidos dessa maneira continham tais clones com atividades citolíticas muito altas, com átomos de carbonos dos clones gerais variando de 20% até 70% de lise na proporção de E/T de 1,2 e 40% até >90% na proporção de E/T de 10 (Figura 7).

Atividade citotóxica contra linhagens de células de câncer de cólon expressando de forma endógena TOM34 como alvos [00234] Os clones de CTL produzidos contra o peptídeo TOM34-299 foram verificados em relação a sua capacidade de reconhecer e matar as células tumorais expressando de forma endógena TOM34. A Figura 8 mostra o resultado com os dois clones de CTL produzidos contra TOM34-299. Ambos os clones de CTL exibiam potente atividade citotóxica contra linhagens de células de câncer de cólon DLD-1 e HT29, que expressam TOM34 assim como HLA-A24. Por outro lado, nenhum dos dois clones de CTL exibiu qualquer atividade citotóxica relevante contra a linhagem de células de câncer de cólon SNU-C2A, que expressa TOM34, mas não HLA-A24 (Figura 8).

Ensaio de inibição do alvo frio [00235] O ensaio de inibição do alvo frio foi realizado para confirmar a especificidade das linhagens de CTL. As células HT29 rotuladas por ⁵¹Cr foram utilizadas como um alvo quente, enquanto as células TISI com ou sem o peptídeo carregado foram utilizadas sem a marcação com ⁵¹Cr como alvos frios. A lise específica contra células HT29 alvos foi significativamente inibida quando as células-alvo frias carregadas com o peptídeo foram adicionadas no ensaio em várias proporções, mas não inibidas de forma alguma pela adição de células-alvo frias sem o peptídeo carregado. O resultado é mostrado como a porcentagem de lise específica na proporção de Alvo Efetor/Quente de 20 (Figura 9). Análise de homologia dos peptídeos antigênicos [00236] Os clones de CTL estabelecidos contra TOM34-299 exibiam atividade citotóxica muito potente. Isto poderia significar que a sequência

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89/94 deste peptideo é homóloga às derivadas de outras moléculas que são conhecidas por sensibilizarem o sistema imunológico humano. Para excluir esta possibilidade, foi realizada uma análise de homologia com as sequências do peptideo como uma busca utilizando o algoritmo BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.Qov/blast/blast.cqi) (Altschul SF e outros, Nucleic Acids Res. 1997; 25(17): 3389-402; Altschul SF e outros, J Mol Biol. 1990; 215(3): 403-10) e não revelou qualquer sequência com homologia significativa.

[00237] Isto indica que a sequência de TOM34-299 é exclusiva e há pouca possibilidade, no melhor conhecimento dos presentes inventores, de produzir uma resposta imunológica não pretendida a qualquer molécula não relacionada.

[00238] Bloqueio da atividade de CTL por anticorpos que se ligam aos antígenos de superfície de células T [00239] Para verificar se a atividade de morte observada é mediada pelas células T citotóxicas, foram investigados os efeitos de anticorpos na atividade de morte, utilizando anticorpos que neutralizam as funções de antígenos de superfície de células T relacionadas à atividade de CTL. A atividade de CTL foi claramente bloqueada através da adição de anticorpos que reconhecem HLA de Classe I ou CD8 e até uma extensão menor por anticorpos para HLA de Classe II ou CD4, como mostrado na Figura 10. Este resultado mostra que a atividade citotóxica do clone de célula T observada contra as células de carcinoma colorretal HT29 é a atividade de morte restrita a HLA de linfócitos T positivos para CD8.

Discussão [00240] Na presente invenção, foi demonstrado que TOM34 é frequentemente regulado para mais em CRCs e que é abundantemente expresso nos testículos e ovários normais e fracamente expresso na próstata, no baço e no cólon, mas raramente detectado em outros

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90/94 tecidos de adultos normais examinados.

[00241] Uma das abordagens terapêuticas promissoras é a imunoterapia para câncer, que inclui a vacinação antitumor mediada por células T. O reconhecimento de antígenos peptídicos apresentados por moléculas do complexo de histocompatibilidade principal (MHC), as células T citotóxicas CD8⁺ se direcionam para células que exibem os antígenos. Uma vez que as células tumorais se originam de células autólogas não-cancerosas, a maior parte das células tumorais escapa da vigilância imunológica. É de grande importância identificar antígenos especificamente expressos em células cancerosas para a aplicação da imunoterapia para câncer. Os antígenos não são expressos nos testículos devido à falta de moléculas de MHC de classe I (Jassim A e outros, Eur J Immunol 19: 1215-1220, 1989). Consequentemente, os genes especificamente expressos no câncer e nos testículos devem ser alvos para imunoterapia. Uma vez que TOM34 não é abundantemente expresso em órgãos normais exceto nos testículos e nos ovários e é regulado para mais na maior parte de cânceres de cólon, TOM34 pode servir como um alvo terapêutico para CRC como um novo antígeno de câncer-testículos.

[00242] A Tom34 foi inicialmente considerada como funcionando como um componente da translocase para a importação de proteínas para dentro das mitocôndrias, porque esta proteína exibia homologia de sequência com a proteína Tom de levedura (Nuttal SD e outros, DNA Cell Biol 16: 1067-1074, 1997). Embora tenha sido previsto que a Tom34 se localiza em uma membrana mitocondrial externa, um estudo recente revelou que estava incluída no citosol de células HeLa (ChunSong Y & Henry W, Archives of Biochemistry and Biophysics 400: 105110, 2002; Abhijit M e outros, Archives of Biochemistry and Biophysics 400: 97-104, 2002). De forma coerente com estes dados, foi descoberto que a localização subcelular de TOM34 era no citoplasma nas células

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91/94 de CRC através da mancha imunohistoquímica utilizando um anticorpo policlonal anti-Tom34. Em um outro relato, a seleção utilizando o sistema de dois híbridos de levedura identificou a Proteína Contendo Valosina (VCP) e hsp90 como proteínas que interagem com TOM34. VCP, um membro da família de AAA (ATPases associadas com uma variedade de atividades celulares) também conhecida como p97, forma um complexo com Ικβα ubiquinada e subunidades do proteossomo 26S, sugerindo que a VCP pode estar envolvida na translocação do fator de transcrição NFkB para o núcleo através da degradação de Ικβα (Dai RM e outros, J Biol Chem 273: 3562-3573, 1998). A HSP90 é uma chaperona molecular cuja interação é necessária para a estabilidade e a função de um grande número de moléculas. Portanto, TOM34 poderia ser estabilizada pela ligação com HSP90. Uma vez que a HSP90 se associa com moléculas oncogênicas tais como Raf1, AKT e SMYD3, foi desenvolvido um número de inibidores de HSP90 para o tratamento de câncer humano. É assumido que estes inibidores causam efeitos adversos graves através do impedimento da HSP90 funcional normal, porque a HSP90 é expressa de forma ubíqua na maior parte dos tecidos normais.

[00243] Em conclusão, a TOM34 é regulada para mais em CRCs, mas quase não é expressa em órgãos normais exceto nos testículos e nos ovários. Portanto, é provável que a inibição de TOM34 não traga efeitos adversos graves para as células normais. Em adição, a supressão de TOM34 resultou na inibição do crescimento celular de células cancerosas, sugerindo que TOM34 desempenha uma função essencial em seu crescimento. Estes dados implicaram que TOM34 é um alvo promissor para a imunoterapia e para o desenvolvimento de fármacos anticâncer para câncer colorretal humano.

[00244] Em adição, a identificação de novos TAAs, que induzem respostas imunológicas antitumor potentes e específicas, permite o

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92/94 desenvolvimento adicional de aplicação clínica de estratégia de vacinação com peptideos em vários tipos de câncer (Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med. 1996; 183(3): 725-9), van der Bruggen P e outros, Science. 1991; 254(5038): 1643-7., Brichard V e outros, J Exp Med. 1993; 178(2): 489-95., Kawakami Y e outros, J Exp Med. 1994; 180(1): 347-52., Shichijo S e outros, J Exp Med. 1998; 187(3): 277-88, Chen YT e outros, Proc Natl Acad Sei USA. 1997; 94(5): 1914-8., Harris CC., J Natl Câncer Inst. 1996; 88(2): 1442-55., Butterfield LH e outros, Câncer Res. 1999; 59(13): 3134-42., Vissers JL e outros, Câncer Res. 1999; 59(21): 5554-9., van der Burg SH e outros, J Immunol. 1996; 156(9): 3308-14., Tanaka F e outros, Câncer Res. 1997; 57(2): 4465-8., Fujie T e outros, Int J Câncer. 1999; 80(2): 169-72., Kikuchi M e outros, Int J Câncer. 1999; 81(3): 459-66., Oiso M e outros, Int J Câncer. 1999; 81(3): 387-94.).

[00245] Foram analisados os peptideos derivados de TOM34 como epitopos TAA restritos por HLA-A24, um dos alelos de HLA frequentes na população japonesa assim como caucasiana (Date Y e outros, Tissue Antigens, 1996; 47: 93-101., Kondo A e outros, J Immunol, 1995; 155: 4307-12, Kubo RT e outros, J Immunol, 1994; 152: 3913-24). Na presente invenção, foram selecionados os candidatos de peptideos de epitopos restritos a HLA-A24 derivados de TOM34 utilizando a informação sobre suas afinidades de ligação previstas com HLA-A24. Após o estímulo in vitro das células T por DCs carregadas com estes peptideos candidatos, as CTLs foram estabelecidas de forma bemsucedida utilizando um peptídeo TOM34-299 (KLRQEVKQNL) (SEQ ID N°: 7) que exibia atividade citotóxica potente contra as células TISI carregadas com o peptídeo. Além disso, os clones de CTL derivados destas CTLs exibiam citotoxicidade específica também contra linhagens de células de carcinoma colorretal superexpressando de forma endógena TOM34 e positivas para HLA-A24. As atividades citotóxicas

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93/94 destes clones de CTL não eram exibidas contra as linhagens de células que não possuíam expressão de HLA-A24 ou de TAA alvo e são significativamente inibidas pelo alvo frio. Estes resultados sugerem fortemente que TOM34 é uma nova TAA de câncer de cólon e que TOM34-299 é um peptídeo de epítopo específico desta TAA restrita por HLA-A24. Uma vez que este antígeno é superexpresso na maior parte dos casos de câncer de cólon e está associado com a proliferação de células tumorais, parece ser um alvo muito bom para ser utilizado na imunoterapia contra cânceres de cólon.

[00246] A análise de homologia de TOM34-299 mostrou que não possui homologia significativa com os peptídeos derivados de quaisquer produtos gênicos humanos conhecidos.

Aplicabilidade Industrial [00247] A análise da expressão gênica de câncer de cólon descrita aqui, obtida através de uma combinação de dissecação por captura a laser e microarranjo de cDNAs do genoma inteiro, identificou genes específicos como alvos para a prevenção e a terapia para câncer. Com base na expressão de um subconjunto destes genes expressos de forma diferencial, a presente invenção fornece marcadores para diagnóstico molecular para a identificação e para a detecção de CRC.

[00248] Os métodos descritos aqui são também úteis na identificação de alvos moleculares adicionais para a prevenção, o diagnóstico e o tratamento de CRC. Os dados relatados aqui se adicionam a um entendimento compreensivo de CRC, facilitam o desenvolvimento de novas estratégias de diagnóstico e fornecem pistas para a identificação de alvos moleculares para fármacos terapêuticos e agentes preventivos. Tal informação contribui para um entendimento mais profundo da tumorigênese de cólon e fornece indicadores para o desenvolvimento de novas estratégias para o diagnóstico, o tratamento e em última análise para a prevenção de CRC.

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94/94 [00249] Por exemplo, os agentes que bloqueiam a expressão de TOM34 ou previnem sua atividade encontram utilidade terapêutica como agentes anticâncer, particularmente agentes anticâncer para o tratamento de CRC. Os exemplos de tais agentes incluem oligonucleotídeos anti-senso, RNAs de interferência pequenos e ribozimas contra o gene TOM34 e anticorpos que reconhecem TOM34. Alternativamente, a identificação de novas TAAs, que induzem respostas imunológicas antitumor potentes e específicas, garante o desenvolvimento adicional de aplicação clínica da estratégia de vacinação com peptídeos em CRC.

[00250] Além disso, embora a invenção tenha sido descrita em detalhes e com referência a modalidades específicas da mesma, deve ser entendido que a descrição anterior é um exemplo e tem natureza explicativa e é pretendida que ilustre a invenção e suas modalidades preferidas. Através de experimentos de rotina, um versado na técnica reconhecerá facilmente que várias alterações e modificações podem ser feitas aqui sem sair do espírito e do âmbito da invenção. Assim, é pretendido que a invenção seja definida não pela descrição anterior, mas pelas reivindicações a seguir e seus equivalentes.

Claims (3)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Composição para o tratamento ou para a prevenção de câncer de cólon, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um siRNA contra um polinucleotídeo de TOM34, e um excipiente farmaceuticamente aceitável em que o referido siRNA compreende a fita senso que compreende uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID N°: 48 ou da SEQ ID N°: 52.
2. 2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido siRNA possui a fórmula geral 5’-[A][B]-[A’]-3’, em que [A] é uma sequência de ribonucleotídeo que corresponde a uma sequência da SEQ ID N°: 48 ou da SEQ ID N°: 52, [B] é uma sequência de alça de ribonucleotídeo que consiste de 3 a 23 nucleotídeos, e [A’] é uma sequência de ribonucleotídeo que consiste na sequência complementar de [A].
3. 3. Composição farmacêutica para o tratamento ou para a prevenção de câncer de cólon, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um peptídeo consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 7, como o ingrediente ativo e um adjuvante.