NO318982B1

NO318982B1 - Makrolider med anti-inflammatorisk aktivitet, farmasoytisk sammensetning som inneholder disse og anvendelse av 3'-desdimetylamino-3', 4'-dehydroerytromycin A- oksim og 3'-desdimetylamino-3', 4'dehydroerytromycin A-9-O-metyloksim som anti-inflammatoriske forbindelser

Info

Publication number: NO318982B1
Application number: NO20013517A
Authority: NO
Inventors: Lorenzo Pradella; Ermanno Moriggi; Franco Pellacini; Daniela Botta; Stefano Romagnano
Original assignee: Zambon Spa
Priority date: 1999-01-15
Filing date: 2001-07-16
Publication date: 2005-05-30
Also published as: ATE308552T1; ES2251966T3; JP4568433B2; CA2368400C; NO20013517D0; NO20013517L; AU2663600A; HUP0105105A2; SK286772B6; IT1306205B1; HUP0105105A3; MXPA01007164A; EP1144427B1; DE60023647D1; EP1144427A3; BR0007514A; ITMI990061A1; IL144044A0; DE60023647T2; CA2368400A1

Description

Den foreliggende oppfinnelse angår makrolider med anti-inf lammatorisk aktivitet og, nærmere bestemt, angår den desdimetylaminomakrolid-derivater med anti-inflammatorisk aktivitet, deres farmasøytisk akseptable salter og farmasøytiske sammensetninger inneholdende disse som aktive forbindelser.

Det er kjent at mange antibiotika, spesielt klassen av makrolider med 14 atomer derivert fra erytromycin, har anti-inflammatoriske egenskaper i tillegg til den antibakterielle aktiviteten [Clin.Immunother., (1996), 6, 454-464],

Erytromycin er et naturlig makrolid (The Merck Index, XII utgave, nr. 3720, side 625)som har hatt en veldig bred klinisk anvendelse ved behandling av infeksjoner som skyldes gram-positive bakterier, noen gram-negative bakterier eller Mykoplasma. Nylig har interessene i det vitenskapelige miljøet fokusert på de anti-inflammatioriske og immunomodulerende komponentene i erytromycin og derivatene derav [Journal of Antimicrobial Chemotherapy, (1998), 41, Suppl.B, 37-46]. Slik aktivitet er godt dokumentert i både kliniske studier og in vivo- og in vi tro-eksperimenter.

Makrolider er f eks vist å være effektive i behandling av inflammatoriske sykdommer, slik som panbronchiolitt [Thorax,

(1997), 52, 915-918], bronkial astma [Chest, (1991), 99, 670-

673] og cystisk fibrose [The Lancet, (1998), 351, 420], eller i dyremodeller for inflammasjon slik som f eks zymosanindusert peritonitt hos mus [Journal of Antimicrobial Chemotherapy,

(1992), 30, 339-348] og neutrofil rekruttering indusert av endotoksin i rotteluftrør [Antimicrobial Agents and Chemotherapy, (1994), 38, 1641-1643] eller i in-vitro-studier av immunsystemceller, slik som neutrofiler [The Journal of Immunology, (1997), 159, 3395-4005] og T-lymfocytter [Life Sciencies, (1992) 51, PL 231-236] eller i modulering av

cytokiner, slik som interleukin 8 (IL-8) [Am. J. Respir. Crit. Care Med., (1997), 156, 266-271] eller interleukin 5 (IL-5) (EP

0 775 489 og EP 0 771 564, Taisho Pharmaceutical Co., Ltd).

Den særegne terapeutiske effekten av makrolider på

sykdommer hvor de konvensjonelle anti-inflammatoriske medika-mentene, slik som f eks kortekosteroider, har vist seg å være

ineffektive [Thorax, (1997), 52, 915-918, allerede omtalt]

rettferdiggjør den store interessen i mot disse nye potensielle klassene av anti-inflammatoriske forbindelser. På grunn av rask dannelse av resistente stammer vil ikke desto mindre den sterke antibakterielle aktiviteten av de konvensjonelle makrolidene

ikke tillate en utvidet anvendelse i kronisk behandling av inflammatoriske prosesser som ikke er en følge av patogener.

Det ville derfor være ønskelig å ha nye forbindelser med en makrolidstruktur som viser anti-inflammatoriske aktiviteter, og som samtidig er fri for antibiotiske egenskaper. For en bedre forståelse vises formelen av erytromycin hvor nummereringen som er anvendt innen foreliggende oppfinnelse, er indikert.

Noen klasser av erytromycinderivater som har en høy anti-inf lammatorisk aktivitet, er beskrevet i litteraturen. I den allerede siterte patentsøknaden til Taisho kreves f eks derivater av erytromycin som er modifisert ved 3-, 9-, il- og 12-posisjon, som sterke hemmere av interleukin 5-syntesen. N-alkylderivater av azitromycin, uten kladinos og desosamin, med formel

hvor

Ri er hydrogen, et lavere alkyl eller et lavere alkanoyl; R2, R3 og R< er like eller forskjellige, og er hydrogen eller et lavere alkanoyl; blir beskrevet som anti-inflammatoriske forbindelser i EP 0 283 055 (Sour Pliva).

Anvendelse av erytromycin som anti-inflammatorisk middel som virker ved å redusere frigjøringen av interleukin 1 gjennom hemming av pattedyr-mdr-P- glykoproteinet, kreves i WO 92/16226 fra Smith-Kline Beecham Corporation.

Blant makrolidderivatene beskrevet i litteraturen er noen få 3-desdimetylamin-9-oksyiminoderivater. Den begrensede interessen mot denne klassen av forbindelser er rettferdiggjort ved det faktum at det er kjent at dimetylaminogruppen til denne typen makrolider virker på ribosomal binding [Tetrahedron Letters, (1994), 35, 3837-3840]. I US 3.929.387 (Hoffmann-La Roche Inc.) beskrives 3'-desdimetylamino-3',4'-dehydroerytro-mycin-A-oksim som et intermediat som er anvendelig for frem-stillingen av antibiotikum 1745A/X.

I EP 0 254 534 (Robinson, William S.) kreves en veldig vid klasse av makrolider med antiviral aktivitet. Blant dem er forbindelser med formel hvis korrekte kjemiske navn er 3'-desdimetylamino-3',4'-dehydroerytromycin A 9-0-metyloksim, til tross for det i teksten til EP 0 254 534 beskrives feilaktig som desdimetylaminoerytro-mycin-9-0-metyloksim (side 10, linje 46). Vi har nå funnet at man ved å fjerne dimetylamino-gruppen fra 3-posisjonen i desosamin av 9-oksyimino-makrolider, oppnår forbindelser med anti-inflammatorisk aktivitet og som i det vesentlige er fri for antibiotiske egenskaper.

Foreliggende oppfinnelse gjelder dermed forbindelsene 3'-desdimetylamino-34'-dehydroerytromycin A- oksim og 3'-desdimetylamino-3',4'dehydroerytromycin A-9-0-metyloksim for anvendelse som anti-inflammatoriske forbindelser.

Gjenstand for den foreliggende oppfinnelse er derfor forbindelser med formel

hvor

R er hydrogen eller metyl,

Ri og R2 er begge hydrogen eller de danner sammen en binding, R3 er hydrogen, eller en kjede med formel

hvor

A er hydrogen eller en fenylgruppe, en benzyloksykarbonylgruppe, en tiazolylgruppe eller en med Ci-C6-alkyl og/eller fenyl-substituert imidazolylgruppe;

X og Y, like eller forskjellige, er 0, S, SO, S02 eller NR4, hvor R4 er hydrogen, en lineær eller forgrenet Ci-C5 alkylgruppe, en C1-C5 alkoksykarbonylgruppe, en benzyloksykarbonylgruppe;

r er et tall fra 1 til 6;

m er et tall fra 1 til 8;

n er et tall fra 0 til 2;

og deres farmasøytisk akseptable salter;

forutsatt at forbindelsene 3'-desdimetylamino-3' ,4' - dehydroerytromycin A-oksim og 3'-desdimetylamino-3',4'dehydroerytromycin A-9-0-metyloksim er unntatt.

En ytterligere gjenstand ved den foreliggende oppfinnelse er anvendelsen av forbindelsene 3'-desdimetylamino-31,41 - dehydroerytromycin-A-oksim og 3'-desdimetylamino-3',4'-dehydroerytromycin-A-9-0-metyloksim som anti-inflammatoriske midler.

Forbindelsene med formel I er anti-inflammatoriske makrolider fri for antibiotisk aktivitet som derfor er anvendelige i behandling av inflammatoriske sykdommer. Uttrykket lineær eller forgrenet Ci-C5-alkylgruppe betyr en gruppe valgt blant metyl, etyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sek.-butyl, tert.-butyl, n-pentyl og isopentyl. Uttrykket 5- eller 6-leddet heterosyklus betyr heterosyklus som pyrrol, tiofen, furan, imidazol, pyrazol, tiazol, isotiazol, isoksazol, oksazol, pyridin, pyrazin, pyrimidin, puridazin, triazol, tiadiazol, mettede eller umettede, inneholdende fra 1 til 3 heteroatomer valgt blant nitrogen, oksygen og svovel, og deres delvis eller totalt mettede former.

Foretrukne forbindelser med formel I er forbindelser hvor R, Ri og R2 er hydrogen. Mer foretrukket er klassen av forbindelser hvor R3 er en kjede med formel

hvor

X, Y, A, r, m og n har den ovenfor angitte betydning. Ytterligere mer foretrukket er forbindelser hvor R3 er en kjede med formel

hvor

r er 2, m er 2 eller 6, n er 1, Y er NR4/ X er 0 eller NR4( R4 er hydrogen og A er fenyl eller tiazolyl.

Eksempler på farmasøytisk akseptable salter av forbindelser med formel (I) er salter med organiske eller uorganiske syrer, slik som saltsyre, hydrobromsyre, hydrojodsyre, salpetersyre, svovelsyre, fosforsyre, eddiksyre, vinsyre, sitronsyre, benzosyre, ravsyre og glutarsyre.

Forbindelsene med formel (I), gjenstand for den foreliggende oppfinnelse, fremstilles ved å følge et synteseskjema som omfatter (a) fjerning av dimetylaminogruppen ved 3'-posisjon og (b) valgfri funksjonalisering av oksim.

Fjerning av dimetylaminogruppen utføres ved oksidasjon, pyrolyse og valgfri reduksjon, i henhold til kjente metoder. Det er åpenbart for fagmann på område, for å unngå interferens med de funksjonelle grupper valgfritt til stede på R3-substituenten, at fjerningen av dimetylaminogruppen foretrukket fullføres ved å starte fra intermediatene med formel

hvor

R har den allerede angitte betydning og R3' er hydrogen eller en lineær eller forgrenet Ci-C5-alkylgruppe.

Ved oksidasjon fås de korresponderende N-oksider med formel

hvor

R og R3' er som definert over, som ved pyrolyse, valgfritt fulgt av reduksjon, gir hhv. forbindelsene med formel som er gjenstand i den foreliggende oppfinnelse (I-R3=hydrogen eller Ci-C5-alkyl) .

Ifølge kjente teknikker kan forbindelsene med formel I hvor R3 er forskjellig fra hydrogen, fremstilles fra forbindelser med formel I-A og I-B hvor R3' er hydrogen ved funksjonalisering av oksimet.

Generelt blir funksjonaliseringen utført ved reaksjon med en forbindelse med formel

hvor R3" har alle betydningene av R3' bortsett fra hydrogen og W er en uttredende gruppe, foretrukket et klor- eller bromatom eller en mesylgruppe. En alternativ syntesevei spesielt egnet for fremstilling av forbindelsene med formel I hvor R3 er en kjede med formel

hvor

X, Y, A, r, m og n har de allerede angitte betydninger; omfattende omsetting av en forbindelse for formel I hvor R3 er hydrogen med' et intermediat med formel

W, X, Y, m og n har den allerede angitte betydning og Z representerer en beskyttelsesgruppe; som gir intermediatet med formel hvor R, Ri, R2, X, Y, Z, r og m har den allerede angitte betydning; og som etter fjerning av den Z-beskyttende gruppe omsettes med et derivat med formel

hvor A, W og n har den allerede angitte betydningen;

gir forbindelsene med formel I.

Forbindelsene med formel I hvor Y er NR4, kan fremstilles ifølge den ovenfor angitte syntetiske ruten også ved å anvende aldehyd med formel

hvor A har den allerede angitte betydning;

i stedet for intermediatet med formel VII, under forutsetning av fjerning av Z-beskyttelsesgruppen fra intermediatet med formel

VI.

Dessuten kan forbindelsene med formel I hvor Ri=R2=H fremstilles ved reduksjon av de korresponderende forbindelsene med formel I hvor Ri og R2 danner en binding.

Forbindelsene med formel I, gjenstand for den foreliggende oppfinnelse, har anti-inflammatorisk aktivitet og er fri for antibiotisk aktivitet.

Den farmakologiske aktiviteten av forbindelsene med formel I har blitt evaluert ved in vi tro- og in vivo-tester i sammenligning med kjente makrolider, slik som erytromycin, claritromycin og roxitromycin, som både har anti-inflammatorisk og antibiotisk aktivitet.

Den anti-inflammatoriske aktiviteten er blitt evaluert in vitro som hemming av IL-8-frigjøring og superoksidanion-frigjøring (eksempel 11) og in vivo som hemming av LPS-indusert neutrofili etter gjentatt administrasjon (eksempel 12).

Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse har i alle eksperimentene vist seg å være svært aktive som anti-inflammatoriske forbindelser, og den anti-inflammatoriske aktiviteten har vært lik eller større enn de for referanseforbindelsene.

For terapeutisk anvendelse kan forbindelser med formel I anvendes i en farmasøytisk form egnet for oral eller parenteral administrering.

Derfor er en gjenstand for den foreliggende oppfinnelse farmasøytiske sammensetninger inneholdende en terapeutisk effektiv mengde av en forbindelse med formel I eller et salt derav i blanding med en farmasøytisk akseptable bærer.

Med sikte på å illustrere den foreliggende oppfinnelse bedre, gis de følgende eksempler.

EKSEMPEL 1

Fremstilling av [6-(2-hydroksyetylamino)-heksyl]-karbaminsyrebenzylester

Til en løsning av [6-(2-hydroksyheksyl]-karbaminsyrebenzylester (25 g, 99,47 mmol), fremstilt som beskrevet i WO 96/18633, i CH2C12 (350 ml), kjølt med is ved omtrent 10 °C, ble først en løsning av KBr (1,18 g, 9,94 mmol) i vann (20 ml) og TEMPO (0,155 g, 0,994 mmol) tilsatt, og deretter ble en løsning fremstilt med NaHC03 (7,5 g, 89,28 mmol) og NaCIO (4,5 % vann-løsning, 197 ml, 125 mmol) tilsatt dråpevis i omtrent 15-20 min. og ved å holde temperaturen ved 10-12 °C. 15 min. etter at dryppingen var ferdig, ble fasene separert og vannfasen ble ekstrahert én gang med CH2C12 (100 ml) . Den oppsamlede organiske ekstrakten ble vasket to ganger med salt-løsning (20 % NaCl) og tørket på natriumsulfat.

En løsning av 2-aminoetanol (35,9 ml, 0,597 mol) i etanol (600 ml) ble tilsatt til den oppnådde løsningen (omtrent 800 ml) med en 3 Å molekylær sikt (30 g) og deretter raskt tilsatt dråpevis og ved kjøling med vann og is. Når dryppingen var ferdig, ble blandingen oppbevart med røring ved romtemperatur i 2 timer og så filtrert.

NaBH4 (4,54 g, 120 mmol) ble tilsatt porsjonsvis under røring i en nitrogenatmosfære til den oppnådde løsningen, og kjølt med vann og is, under røring i en nitrogen-atmosfære. Etter tilsettingen ble reaksjonsblandingen oppbevart under røring ved romtemperatur i 2 timer, og deretter ble løsningen fordampet. Resten ble samlet med vann og etylacetat og fasene ble separert, og igjen ble den vandige fasen ekstrahert to ganger med etylacetat. Den samlede organiske ekstrakten ble vasket med saltløsning (20 % NaCl), tørket på natriumsulfat og konsentrert til den var oppnådd og ga en oljeaktig rest som var tilbøyelig til å størkne. Resten ble knust med heksan, filtrert og vasket med en blanding av heksan og etyleter, hvilket ga [6-(2-hydroksyetylamino)-heksyl]-karbaminsyrebenzylester (26,22 g, utbytte 89 %) som et hvitt, fast stoff.

<1>H-NMR (200 MHz, CDC13) 5 (ppm): 7,33-7,25 (m, 5H, Ar); 5.05 (s, 2H, COOCHa) ; 4,96 (bred-t, 1H, NH); 3,63-3,58 (m, 2H,

<*>CH2-OH); 3,19-3,09 (m, 2H, CH2NCO) ; 2,72-2,67 (m,N-CH2-*CH2-CH20) ; 2,59-2,52 (m, 4H, OH og CH3) ; 1,53-1,23 (m, 8H, 4CH2) .

EKSEMPEL 2

Fremstilling av (6-(benzyloksykarbonylaminoheksyl)-(2-hydroksy-etyl) -karbaminsyrebenzylester

En løsning av benzylklorformiatbenzylester (50 % i toluen, 42,5 ml; 0,128 mol) i etylacetat (85,5 ml) og IN NaOH (128 ml, 0,128 mol) ble samtidig dråpevis tilsatt en løsning av [6-(2-hydroksyetylamino)-heksyl]-karbaminsyrebenzylester (31,5 g, 0,107 mol), fremstilt som beskrevet i eksempel 1, i en blanding av vann (87 ml), IN NaOH (17 ml) og etylacetat (180 ml), kjølt til 0-5 °C, og ved kontrollert temperatur og pH (omtrent 8).

Etter dryppingen ble reaksjonsblåndingen oppbevart under røring i 30 min. ved 0-5 °C, deretter ble kjølingen fjernet og det ble videre tilsatt IN NaOH (15 ml) for igjen å bringe pH til 8, og deretter fikk blandingen stå under røring ved romtemperatur over natten. Fasene ble separert og den vandige fasen ble ekstrahert en gang med etylacetat. De samlede organiske ekstrakter ble vasket med en saltløsning, tørket på natriumsulfat og konsentrert under vakuum, hvorved det ble oppnådd en oljeaktig rest.

Ved kromatografisk rensing (elueringsmiddel etylacetat: petrolatum fra 60:40 til 70:30) ble 6(benzyloksykarbonylamino-heksyl) - (2 -hydroksyetyl) -karbaminsyrebenzylester (42,5 g, utbytte 92 %) oppnådd som en olje.

^-NMR (200 MHz, CDC13) 8 (ppm): 7,39-7,25 (m, 10H, Ar); 5,10 og 5,07 (2S, 4H, 2COOCH2) ; 3,71 (bredt signal, 2H, *CH2-OH) ; 3,43-3,01 (m, 4H, 2CH2NCO) ; 1,57-1,19 (m, 8H, 4CH2) .

På lignende måte ble de følgende forbindelser oppnådd: (2-benzyloksykarbonylaminoetyl)-(2-hydroksyetyl)-karbaminsyrebenzylester

ved å starte fra 2-(2-aminoetylamino)-etanol.

(utbytte 32 %)

<X>H-NMR (200 MHZ, CDCl3) 8 (ppm): 7,33-7,28 (m, 10H, 2Ph) ; 5.06 og 5,04 (2s, 4H, 2CH2-Ph); 3,73-3,34 (bred m, 8H, 4CH2) .

[2-(benzyl-benzyloksykarbonylamino)-etyl]-(2-hydroksyetyl)-karbaminsyrebenzylester

ved å starte fra 2-[2-(benzylamino)-etylamino)-etanol fremstilt som beskrevet i WO 96/18633,

(utbytte 50 %).

^-NMR (200 MHz, CDC13) 6 (ppm): (svært bredt signal) 7,42-7,13 (m, 15H, 3Ar) ; 5,12 og 5,09 (2s, 4H, CO0CH2<*>) ; 4,55 (s, 2H, N-*CH2-Ph) .

[2-(2-hydroksyetoksy)-etyl)- karbaminsyrebenzylester ved å starte fra 2-(2-aminoetoksy)-etanol,

(utbytte 85 %).

<X>H-NMR (200 MHZ, CDC13) 8 (ppm): 7,36-7,28 (m, 5H, Ar); 5,18 (bredt signal, 1H, NH) ; 5,08 (s, 2H, Ph-*CHO) ; 3,74-3,34 (m, 8H, *CH2-*CH2-O-*CH2-*CH2-0H) ; 2,13 (bred-t, 1H, OH) .

EKSEMPEL 3

Fremstilling av metansulfonsyre 2-[benzyloksykarbonyl-(6-benzyloksykarbonylaminoheksyl) -amino] -e ty les ter

Trietylamin (8,95 ml; 64,31 mmol) ble tilsatt til en løsning av 6-(benzyloksykarbonylaminoheksyl)-(2-hydroksyetyl)-karbaminsyrebenzylester (13,78 g; 32,15 mmol), fremstilt som beskrevet i eksempel 2, i CH2C12 (140 ml) . Blandingen ble kjølt til 0-5 °C og ble deretter dråpevis tilsatt til en løsning av metansulfonylklorid (3,36 ml; 43,41 rnrnol) i CH2C12 (20 ml).

Etter tilsettingen ble blandingen oppbevart under røring ved romtemperatur i 60 min., deretter vasket med 5 % vandig sitronsyre, med saltløsning (2 0 % NaCl), med 5 % vandig NaHC03 og endelig med saltløsning igjen. Etter tørking på natriumsulfat og fordamping under vakuum, ble metansulfonsyre-2-[benzyloksyka-rbonyl- (6-benzyloksykarbonylaminoheksyl)-amino]-etylester (16,37 g; utbytte 100 %) oppnådd som en brun olje.

^-NMR (200 MHz, CDCl3) 8 (ppm): 7,35-7,27 (m, 10H, Ar); 5,11 og 5,07 (2s, 4H, 2COOCH2) ; 4,36-4,19 (m, 2H, CH20S02) ; 3,57-3,51 (m, 2H, SO-CH2-<*>CH2N) ; 3,32-3,07 (m, 4H, 2CH2N) ; 2,91 og 2,85 (2s-"conformers" , 3H, CH3) ; 1,50-1,20 (m, 8H, 4CH2) .

På samme måte blir de følgende forbindelser oppnådd: metansulfonsyre-2- [2- (benzyloksykarbonylamino) -etoksy] -etylester

ved å starte fra [2-(2-hydroksyetoksy)-etyl]-karbaminsyrebenzylester, fremstilt som beskrevet i eksempel 2.

(utbytte 98 %).

<1>H-NMR (200 MHz, CDCl3) 8 (ppm): 7,36-7,28 (m, 5H, Ar);

5,16 (bredt signal, 1H, NH) ; 5,08 (s, 2H, COOCH2) ; 4,34-4,30 (m, 2H, SO3CH2) ; 3,72-3,67 (m, 2H, S03CH2-*CH2) ; 3,60-3,34 (m, 4H, N-<*>CH2-<*>CH2); 2,98 (s, 3H, S03CH3) .

metansulfonsyre-2-[[2-(benzyl-benzyloksykarbonylamino)-etyl] - benzyloksykarbonylamino]-etylester

ved å starte fra [2-(benzyl-benzyloksykarbonylamino)-etyl]-(2-hydroksyetyl)-karbaminsyrebenzylester, fremstilt som beskrevet i eksempel 2,

(utbytte 72 %).

<X>H-NMR (200 MHz, CDC13) 8 (ppm): 7,40-7,00 (m, 15H, 3Ar) ;

5,13-5,01 (bredt Bignal, 4H, 2COOCH2) ; 4,51-3,30 (bred-m, 10H, 4CH2N og CH2S03) ,- 2,92-2,76 (bredt signal, 3H, CH3) .

metansulfonsyre-2-[benzyloksykarbonyl(2-benzyloksykarbonylamino-etyl)-amino]-etylester

ved å starte fra 2-(benzyloksykarbonylaminoetyl)-(2-hydroksy-etyl) -karbaminsyreetylester, fremstilt som beskrevet i eksempel i 2,

(utbytte 100 %) .

^-NMR (200 MHz, CDC13) 8 (ppm): 7,35-7,27 (m, 10H, 2Ar) ;

5,10 og 5,04 (2s, 4H, 2COOCH2) ; 4,41-4,15 (m, 2H, *CH2-MeS02) ;

3,63-3,23 (m, 6H, N-<*>CH2-<*>CH2-N-<*>CH2) ; 2,90 (s-bred, 3H, MeS02) 1

EKSEMPEL 4

Fremstilling av erytromycin A-oksim-K-oksid

En løsning av H202 (72,00 g, titer 34 % v/v, 0,72 mol) i vann (780 ml) ble dråpevis tilsatt i 1 time til en løsning av

i erytromycin A oksim (35,00 g, 0,0467 mol) i metanol (1400 ml)

under mekanisk røring, og ved å holde temperaturen ved 20-25 °C. Ved slutten av tilsettingen ble reaksjonsblandingen oppbevart under røring og ved romtemperatur i 24 timer. Etter å ha tilsatt

mer H202 (8 ml), ble blandingen oppbevart under røring i ytterligere 6 timer.

Metanol ble fordampet under vakuum ved en temperatur på omtrent 40 °C og ved å opprettholde volumet av vann konstant (omtrent 700 ml).

Etter filtrering, vasking med vann og tørking, ble erytromycin A-oksim-N-oksid (36,3 g, utbytte 99 %)oppnådd som et hvitt krystallinsk fast stoff.

<X>H-NMR (200 MHz, DMS0-d6) 8 (ppm): 10,71-10,19 (bredt signal, 2H, skiftende H); 5,14-5,08 (m, 1H, H-13) ; 4,72 (d, 1H, Jhh=4,4 Hz, H-l"); 4,45 (d, 1H, Jhh=7,0 Hz, H-l').

EKSEMPEL 5

Fremstilling av 3'-de(dimetylamino)-3',4'-dehydroerytromycin A-oksim (forbindelse 1)

En løsning av erytromycin A-oksim-N-oksid (30,00 g; 38,3 mmol), fremstilt som beskrevet i eksempel 4, i dimetylformamid (235 ml) ble varmet til 150 °C i et på forhånd varmet oljebad (175-180 °C) og etterlatt ved en slik temperatur under mekanisk røring i 15-20 min. Etter kjøling og fordamping av dimetylformamid, ble den oljeaktige resten samlet med demineralisert vann (500 ml), varmet og kjølt. Det filtrerte faste stoffet ble knust og tørket under vakuum ved 40-45 °C og ga en råekstrakt (25,5 g) . Råekstrakten ble først krystallisert fra acetonitril (110 ml), filtrert, og vasket med vann og tørket under vakuum ved 50 °C, hvilket ga et krystallprodukt (20 g), som ble krystallisert igjen fra metanol/vann = 65/35 (400 ml), filtrert og tørket under vakuum ved 40-50 °C. Forbindelse 1 som et krystallprodukt ble oppnådd (10,3 g; utbytte 38,2 %). Mer produkt (3,7 g) ble deretter gjenvunnet fra krystalliseringsvæsken med et totalt utbytte på 51,8 %.

<X>H-NMR (200 MHz, CDCl3) 8 (ppm): 5,67-5,55 (m, 2H, <*>CH= *CH) ; 4,44 (d, 1H, Jhh=7,0 Hz, H-l'); 4,33-4,22 (m, 1H, H-5'); 4,13-4,04 (m, 1H, H-2'); 3,84-3,73 (m, 1H, H-8); 3,69 (s, 1H, H-11) .

<13>C-NMR (200 MHz, CDCl3) 8 (ppm): 171,11 (s, C-9) ; 132,2 og 126,1 (2s, C-3' og C-4').

EKSEMPEL 6

Fremstilling av 3'-de (dimetylamino)-erytromycin A-oksim

(forbindelse 2)

Platinaoksid (0,615 g) ble tilsatt ved romtemperatur til en løsning med forbindelse 1 (20,00 g; 28,4 mmol), fremstilt som beskrevet i eksempel 5 i etanol (850 ml) (den fullstendige oppløsning ble oppnådd etter en liten oppvarming). Blandingen ble hydrogenert i et Parr-apparat (1,36 atm) og absorpsjonen var øyeblikkelig. Etter filtrering av katalysatoren og fordampning av løsningen under vakuum ble den hvite krystallresten knust med petrolatum, filtrert og tørket under vakuum ved 50 °C og ga forbindelse 2 (19,8 g; utbytte 99 %).

<1>H-NMR (200 MHz, CDCl3) 8 (ppm): 5,05-4,98 (m, 1H, H-13); (d, 1H, Jhh=4,4 Hz, H-l"); 4,23 (d, 1H, JKH=7,4 Hz, H-l'); 3,44-3,30 (m, 1H, H-2'); 2,07-1,21 (m, 2H, H-3'); 1,65-1,45 (m, 2H, H-4') .

<13>C-NMR (200 MHz, CDCl3) 8 (ppm): 171,2 (s, C-9)> 104,7 (s, C-l'); 31,8 (s, C-3'); 29,5 (s, C-4').

EKSEMPEL 7

Fremstilling av 3' -de (dime tyl amino) -erytromycin A- (E) -9 [0- [2-[benzyloksykarbonyl-(6-benzyloksykarbonylaminoheksyl) -amino}-etyl]-oksim] (forbindelse 3)

Forbindelse 2 (12,51 g; 17,73 mmol) fremstilt som beskrevet i eksempel 6, ble tilsatt til en 95 % løsning av kalium-tert.-butylat (2,45 g; 19,48 mmol) i vannfritt THF (120 ml), under røring og i en nitrogenatmosfære, og ved en opprettholdt temperatur på omtrent 25 °C. Reaksjonsblandingen ble oppbevart under røring i 30 min ved romtemperatur, og deretter ble 18-krone-6-eter (4,69 g; 17,73 mmol) og en løsning av metansulfonsyre-2- [benzyloksy-karbonyl-(6-benzyloksykarbonylaminoheksyl)-amino]-etylester (8,98 g; 17,73 mmol), fremstilt som i eksempel 3, i vannfritt THF (60 ml) tilsatt og deretter ble det oppbevart under røring ved romtemperatur over natten. Etter fordampning av løsningen under vakuum ble resten tatt opp med en blanding av etylacetat og saltløsning (20 % NaCl), og fasene ble separert. Den vandige fasen ble igjen ekstrahert med etylacetat. Den samlede og tørkede organiske ekstrakten ble konsentrert under vakuum og et råstoff (23,4 g)ble oppnådd. Ved kromatografisk rensing (elueringsmiddel CH2Cl2:CH3OH=97,3) oppnådde man forbindelse 3 (15,42 g) som fortsatt var litt uren, og som ble anvendt uten videre rensing.

"""H-NMR (200 MHZ, CDCl3) 8 (ppm): 7,35-7,28 (m, 10H, Ar); 5,14-5,06 (m, 1H, H-13); 5,11 og 5,07 (2s, 4H, 2COOCH2) ; 4,84 (d, 1H, Jhh=4,4 Hz, H-l"); 4,28 (d, 1H, Jhh=7,4 Hz, H-l').

På liknende måte ble de følgende forbindelser oppnådd: 3'-de(dimetylamino)-erytromycin A-(E)-9-[0[2- [2-(benzyloksykarbonylamino) etoksy)-etyl] oksim] (forbindelse 4) fra metansulfonsyre-2-[2-(benzyloksykarbonylamino)-etoksy]-etylester,

(utbytte 62 %).

^-NMR (200 MHz, CDC13) 8 (ppm): 7,34-7,27 (m, 5H, Ar); 6,09 (bredt signal, 1H, NH); 5,13-5,05 (m, 1H, H-13); 5,06 (s, 2H, COOCH2) ; 4,79 (d, 1H, Jhh=4,4 Hz, H-l"); 4,26 (d, 1H, Jhh=7,4 Hz, H-l').

3' -de(dimetylamino)-erytromycin A-(E)-9-[O-[2-metoksy-etoksy]-metyl]-oksim]

(forbindelse 5) fra metoksyetoksymetylklorid,

(utbytte 32,5 %).

"""H-NMR (200 MHZ, CDC13) 8 (ppm): 5,21-5,12 (m, 2H, 0-CH2-0) ; 5,12-5,05 (m, 1H, H-13); 4,85 (d, 1H, Jhh=5,4 Hz, H-l"); 4,39 (d, 1H, Jhh=7,5 Hz, H-l'); 3,40 (s, 3H, CH2-0-*CH3) ; 3,27 (s, 3H, H-3") .

"C-NMR (200 MHz, CDCl3) 8 (ppm): 172,5 (s, C-9) ; 97,44 (s, NO-C-O); 32,12 (s, C-3'); 29,84 (s, C-4').

3'-de(dimetylamino)-erytromycin A-(E)-9-[0[2-[[2-(benzylbenzyl-oksykarbonylamino)-etyl]-benzyloksykarbonylamino] -etyl] -oksim]

(forbindelse 12) fra metansulfonsyre-2-[[2-(benzylbenzyloksykarbonylanu.no)-etyl]benzyloksykarbonylamino]-etylester.

^-NMR (200 MHz, CDCl3) 8 (ppm): 7,40-7,16 (bred m, 15H, 3Ph) ; 5,17-5,00 (m, 5H, 2<*>CH2-Ph og H-13) .

3' -de (dime tyl amino) -erytromycin A- (E) - 9- [0 [2- [ [2- (benzyloksykarbonylamino) -etyl]-benzyloksykarbonylamino]-etyl]-oksim]

(forbindelse 13) fra metansulfonsyre-2-[benzyloksykarbonyl-(2-benzyloksykarbonylaminoetyl)-amino]-etylester,

(utbytte 42 %).

<1>H-NMR (200 MHz, CDCl3) 5 (ppm): 7,38-7,25 (m, 10H, 2Ph) ; 5,11 og 5,05 (2s, 4H, 2COOCH2) ; 5,14-5,00 (m, 1H, H-13); 4,89-4,79 (bred-m, 1H, Hl"); 2,26 (d, 1H, JHH=:7,4 Hz, Hl')-

EKSEMPEL 8

Fremstilling av 3'-de(dimetylamino)-erytromycin A-(E)-9-[O[2-[ (6-aminoheksyl)-amino]-etyl] oksim] (forbindelse 6_) 10 % Pd/C (1,6 g) ble tilsatt til en løsning av forbindelse 3 (15,42 g; 13,8 mmol), oppnådd som beskrevet i eksempel 7, i etanol (160 ml). Blandingen ble hydrogenert i et Parr-apparat (1,02 atm). Etter 2 timer ble katalysatet filtrert og løsningen ble fordampet. Resten ble renset ved hurtigkromatografi (elueringsmiddel CH2C12: CH30H :NH3=85:15:1, 5 deretter 80:20) og ga forbindelse 6 (8,48 g) som et amorft hvitt, fast stoff.

<X>H-NMR (200 MHZ, CDCl3) 8 (ppm): 5,07-5,00 (m, 1H, H-13); 4,79 (d, 1H, Jhh=4,4 Hz, H-l<w>); 4,21 (d, 1H, Jhh=7,4 Hz, H-l').

"C-NMR (200 MHz, CDC13) 8 (ppm): 171,8 (s, C-9) ; 71,6 (s=N-0-C) ; 49,43 og 49,0 (2s=N-0-C-*C-N-*C) ; 41,1 (s, C-NH2) .

På samme måte ble følgende forbindelser oppnådd: 3' -de(dimetylamino)-erytromycin A-(E)-9-[0[2(2-aminoetoksy) - etyl]-oksim]

(forbindelse 7) ved å starte fra forbindelse 4

(utbytte 85 %)

■""H-NMR (200 MHz, CDC13) 8 (ppm): 5,12-5,05 (m, 1H, H-13); 4,83 (d, 1H, Jhh=4,4 Hz, H-l";4,26 (d, !h, Jhh=7,5 Hz, H-l'). 3'-de(dimetylamino)-erytromycin A-(E)-9-[0[2-[(2-benzyl-aminoetyl) -amino-etyl] oksim] (forbindelse 14) ved å starte fra forbindelse 12,

(utbytte 48 %) .

<1>H-NMR (200 MHz, CDC13) 8 (ppm): 7,32-7,17 (m, 5H, Ph); 5,08-5,00 (m, 1H, H-13); 4,74 (d, 1H, JHH=4,6 Hz, H-l"); 4,22 (d, 1H, JHH=7,4 Hz, H-l'); AB-system: Va=3,80, Vb=3,76, Jab=13,7 Hz, <*>CH2Ph.

<13>C-NMR (200 MHz, CDCl3) 8 (ppm): 171,3 (s, C-9) ; 105,0 (s, C-l'); 32,2 (s, C-3'J; 29,8 (s, C-4').

3'-de(dimetylamino)-erytromycin A-(E)-9-[0- [2- [ (2-aminoetyl)-amino]etyl]-oksim] (forbindelse 15) ved å starte fra forbindelse il'

(utbytte 70 %) .

"""H-NMR (200 MHz, CDCl3) 8 (ppm): 5,08-5,00 (m, 1H, H-13) ; 4,76 (d, 1H, JHH=4,6 Hz, H-l"); 4,23 (d, 1H, JHH=7,4 Hz, H-l').

EKSEMPEL 9

Fremstilling av 3'-de(dimetylamino)-erytromycin A-(E)-9-[0-[2-[6- [ (tiazol-2-ylmetyl) -amino] -heksylamino] -etyl] -oksim]

(forbindelse 8)

En oppløsning av forbindelse 6 (3 g; 3,53 mmol), fremstilt som beskrevet i eksempel 8, 97 % 2-tiazolkarbal-dehyd (0,412 g; 3,53 mmol) og molekylsikter (3 Å, 3,75 g) i etanol (60'ml) ble satt under omrøring i 3 timer. Etter filtrering av molekyl-siktene på celitt, ble 10 % Pd/C (0,3 g) tilsatt og blandingen ble hydrogenert i Parr- hydrogenator (1,02 atm). Etter 20 timer ble katalysatoren filtrert og løsningen fordampet.

Ved kromatografisk rensing av resten (elueringsmiddel CHCI3: petrolatum:trietylamin=90:10:10) ble forbindelse 8 oppnådd (1,66 g; utbytte 49,8 %) som et amorft fast stoff.

^-NMR (200 MHz, CDCI3) 8 (ppm): 7,66 (d, 1H, Jhh=3,2 Hz, CHN); 7,22 (d, 1H, CHS); 5,08-5,02 (m, 1H, H-13); 4,78 (d, 1H, Jkh=4,4 Hz, H-l"); 4,21 (d, 1H, Jhh=7,4 Hz, H-l');4,07 (s, 2H,

<*>CH2-tiaz.) .

<13>C-NMR (200 MHz, CDC13) 8 (ppm): 172,0 (s, S-C=N) ; 171,7 (S, C-8); 142,4 (s, CHN); 118,7 (s, CHS); 104,9 (s, C-l"); 96,3 (s,C-l'') ; 71,7 (s, N-O-C).

På samme måte ble de følgende forbindelser oppnådd: 3'-de(dimetylamino)-erytromycin A-(E)-9-[0-[2-[6-(benzylamino)-heksylamino]-etyl]oksim] (forbindelse 9) fra forbindelse 6 og benzaldehyd.

"""H-NMR (200 MHz, CDCl3) 8 (ppm): 7,27-7,17 (m, 5H, Ar) ; 5,07-5,01 (m, 1H, H-13); 4,75 (d, 1H, Jhh=4 ,4 Hz, H-l"); 4,19 (d, 1H, Jhh=7,4 HZ, H-l'); 3,73 (s, 2H, *CH2-Ph) .

"C-NMR (200 MHz, CDCl3) 8 (ppm): 171,8 (s, C-9) ; 104,9 (s, C-l'); 96,3 (S, C-l"); 71,8 (s, =N-0-C); 53,8 (s, N-*C-Ph) ; 49,7, 49,2 og 49,1 (3s, 3N-C).

3' -de(dimetylamino) -erytromycin A- (E) -9- [O- [2- [2- [ (tiazol^-ylmetyl)-amino]-etoksy]-etyl]-okøim] (forbindelse 10) fra forbindelse 7 og 2-tiazolkarbaldehyd.

^-NMR (200 MHz, CDCl3) 8 (ppm): 7,64 (d, 1H, Jhh=3 ,2 Hz, CHN); 7,19 (d, 1H, CHS); 5,10-5,02 (m, 1H, H-13); 4,78 (d, 1H, Jhh=4,4 Hz, H-l"); 4,21 (d, 1H, Jhh=7/4 Hz, H-l'); 4,13 (s, 2H,

<*>CH2-tiaz.) .

<13>C-NMR (200 MHz, CDCI3) 8 (ppm): 172,7 (s, SC=N) ; 171,5 (s, C-9); 142,4 (s, CHN'); 118,6 (s, CHS); 104,7 (s, C-l'); 96,4 (s,

C-l"); 50,7 (s, N-<*>C-tiaz.).

3'-de(dimetylamino)-erytromycin A-(E)-9-[0- [2-[2-(benzylamino)-etoksy]-etyl]oksim] (forbindelse 11) fra forbindelse 7 og benzalaldehyd

"""H-NMR (200 MHZ, CDCl3) 8 (ppm): 7,33-7,10 (m, 5H, Ar); 5,12-5,04 (m, 1H, H-13); 4,78 (d, 1H, Jhh=4,4 Hz, H-l"); 4,72 (d, 1H, Jhh=7,4 Hz, H-l'); 3,80 (s, 2H, NHC2) .

<13>C-NMR (200 MHz, CDC13) 8 (ppm): 171,5 (s, C-9); 104,8 (s, C-l'); 96,5 (s, C-l"); 69,4 70,8 og 72,4 (3s, 30CH2) ; 53,6 (s, C-Ph); 48,2 (s, 0-C-<*>C-N).

3' -de(dimetylamino)-erytromycin A-(E)-9-[O-[2-[2-[(tiazol-2-yImetyl)-amino]-etylamino]-etyll-oksim] (forbindelse 16) fra forbindelse 15 og 2-tioazolkarbaldehyd.

hl-NMR (200 MHz, CDC13) 8 (ppm): 7,62 (d, 1H, JHH=3,0 Hz, N-*CH=CH) ; 7,18 (d, 1H, S-*CH=CH) ; 4,18 (d, 1H, JHH=7,4 Hz, Hl').

<13>C-NMR (200 MHz, CDCl3) 8 (ppm): 172,6 (s, SC=N) ; 171,3 (s,C-9), 142,4 (s, CHN); 118,6 (s, CHS); 104,9 (s, C-l'); 96,4 (S, C-l"); 32,17 (s, C-3'); 29,8 (s, C-4').

3'-de(dimetylamino)-erytromycin A-(E)-9-[O-[2-[6-[(2-fenyl-lH-imidazol-4- ylmetyl) -amino] -heksylamino] -etyl] -oksim]

(forbindelse 17) fra forbindelse 6 og 2-fenyl-lH-imidazol-4-karba1dehyd.

<1>H-NMR (200 MHZ, CDCl3) 5 (ppm): 7,86-7,21 (m, 5H, AR); 6,91 (s, 1H, CH-imid.); 5,11-5,02 (m, 1H, H13); 4,76 (d, 1H, JHH=4,2 Hz, Hl"),-4,21 (d, 1H, JHH=7,4 Hz, Hl'); 3,76 (s, 2H,

<*>CH2-imid.); 3,23 (s, 3H, OMe).

<13>C-NMR (200 MHz, CDC13) 5 (ppm): 171,7 (s, C-9); 104,8 (s, C-l'); 96,3 (s, C-l"); 32,1 (s, C-3'); 29,9 (s, C-4').

3'-de(dimetylamino)-erytromycin A-(E)-9-[O-[2-[6-[(l-metyl-2-fenyl-lH-imidazol-4-ylmetyl) -amino] -heksylamino] -etyl] -oksim]

(forbindelse 18) fra forbindelse 6 og l-metyl-2-fenyl-lH-imidazol-4-karbaldehyd.

hl-NMR (200 MHz, CDCl3) 8 (ppm): 7,57-7,31 (m, 5H, Ar); 6,87 (s, 1H, CH-imid.); 5,09-5,00 (m, 1H, H13); 4,76 (d, 1H, JHH=4,2 Hz, Hl"); 4,20 (d, 1H, JHH=7,4 Hz, 1H'); 3,71 (s, 2H,

<*>CH2-imid.); 3,62 (s, 3H, NMe); 3,21 (s, 3H, OMe).

<13>C-NMR (200 MHz, CDC13) 8 (ppm): 171,8 (s, C-9); 104,9 (s, C-l'); 96,3 (s, C-l"); 32,1 (s, C-3'); 29,7 (s, C-4').

EKSEMPEL 10

Fremstilling av 3'-de(dimetylamino)-erytromycin A-(E)-9-[O-[2-[2-[(tiazol-2-ylmetyl)-(metyl)-amino]-etoksy]-etyl]-oksim]

(forbindelse 19)

Forbindelse 10 (0,23 g,- 0,258 mmol), formaldehyd (37 % vekt/volum; 42 ul; 0,516 mmol), 10 % Pd på trekull (25 mg) og en 4:1 blanding av etanol og vann (10 ml) ble overført i et Parr-apparat ved 1,02 atm. Etter 2 og 3 timer ble ytterligere formaldehyd tilsatt (42 fil + 21 ul) . På slutten av reaksjonen (i alt 6 timer) ble katalysatoren filtrert av og løsningen fordampet. Den resulterende resten ble renset ved hurtigkromatografi (elueringsmiddel CH2Cl2:CH3OH=95:5) og ga forbindelse 19 som et amorft fast stoff.

<1>H-NMR (200 MHz, CDCl3) 8 (ppm): 7,64 (d, 1H, JHH=3,6 Hz, N-*CH=CH) ; 7,21 (d, 1H, S-*CH=CH) ; 5,10-5,00 (m, 1H, H13) ; 4,80 (d, 1H, JHH=4,6 Ha, Hl"); 4,23 (d, 1H, JHH=7,4 Hz, Hl'); 3,94 (s,2H, <*>CH2-tiaz.).

<13>C-NMR (200 MHz, CDCl3) 8 (ppm): 172,0 (s, SC=N) ; 171,8 (s, C-9); 142,2 (s, CHN); 119,3 (s, CHS); 104,9 (s, C-l'); 96,4 (s, C-l"); 32,2 (s, C-3'); 29,9 (s, C-4').

EKSEMPEL 11

In vitro farmakologisk aktivitet

A) Frigjering av interleukin ( IL- 8)

En human endotelial udødeliggjort cellelinje (ECV304) ble oppnådd fra ATTC (Rockville, Md) og dyrket i Medium 199, modifisert Earle's salter (GIBCO, Life Technologies, Grand Island, N.Y., supplert med 20 % føtalt kalveserum (GIBCO), 100 U/ml penicillin og 100 mg/ml streptomycin (SIGMA, St. Louis, MO) i våt atmosfære med 5 % C02 ved 37 °C.

Cellene ble kultivert på en 96 brønns plate for å oppnå et sammenhengende monolag. Forbindelsene som ble evaluert, ble løst i DMSO ved 10"<2>M og fortynnet med kulturmedium. Forbindelsene ble pre-inkubert med celler i 1 time før utfordring. Frigjøring av IL-8 ble indusert ved tilsetting av 0,66 mg/ml lipopolysakkarid B (E. coli 055:B5, Difco, Detroit, Mi) i et endelig volum på 200 ml. Etter en natt ble supernatanten samlet for IL-8-testen. Den spesifikke immunoreaktiviteten til IL-8 i kultursuper-natanten ble målt med ELISA analysesett (Amersham, UK). Resultatet ble uttrykt som den høyeste oppnådde inhibering (effektivitet) og, om mulig, som den konsentrasjon hvor

50 % av' en slik effekt (IC50) ble oppnådd.

B) Frigjøring av superoksidanioner

Neutrofiler ble separert fra venøst blod fra friske frivillige ved sentrifugering på en Ficoll-Hypaque, fulgt av sedimentering på 6 % dekstran og osmotisk lysering av erytrocytter. Neutrofilene ble så vasket og resuspendert i et medium laget av RPMI-1640 supplert med 5 % føtalt kalveserum og 1,34 mmol/1 dinatriumdihydrat EDTA. Cellene ble opprettholdt i 24 timer ved 4 °C og før testen ble suspensjonen sentrifugert og resuspendert i HBSS (Hanks' balanserte saltløsning). Neutrofilpreparatets vitalitet og renhet ble verifisert ved farging med tryptanblått og tyrkisk blått.

Superoksidanionene ble målt ved anvendelse av Lucigenin (bis-N-metylacridiniumnitrat)-forsterket chemiluminiscencteknikk. Neutrofiler (2 x IO<6> celler/ml) ble preinkubert i 30 minutter ved 37 °C i 900 ml HBSS, med og uten testforbindelsene (avlesningssystem).

Produksjonen av superoksidanioner ble målt med en Lumac/3M bioteller etter tilsetting av 100 ml av en løsning i HBSS av Lucigenin (2 mmol/1) og N-formyl-L-metionyl-L-leucyl-L-fenylalanin (FLMP) som stimulerende middel ved en konsentrasjon på 1 x IO"<5> M til avlesningssystemet. FLMP ble løst i DMSO (1 x IO"<2> M) og videre fortynnet i HBSS. Forbindelsene som ble testet, ble løst i DMSO ved en konsentrasjon på IO"<2> M. Lavere konsentrasjoner i DMSO ble fremstilt fra denne løsningen, og testet. DMSO-mengden til stede i avlesningssystemet var mindre enn 1 %. Den maksimale lysstyrkeverdien som ble oppnådd for hver testet konsentrasjon av forbindelsen, ble omgjort til inhiberings-prosent sammenlignet med referansen. Den konsentrasjon som er i stand til å hemme produksjonen av superoksidanioner ved 50 % (ICso) ble beregnet fra den oppnådde doserespons-kurven.

I den følgende tabell er det vist resultatene som ble oppnådd for enkelte forbindelser med formel I, og som representerer alle klassene med erytromycin, claritromycin og roxitromycin.

EKSEMPEL 12

Ju vivo farmakologisk aktivitet

• Dyr

Sprague-Dawley hannrotter som veide mellom 200 og 300 g ble anvendt. Rottene som ble anvendt i eksperimentene var ikke synlig infisert. Dyrene ble oppbevart under standardbetingelser i 7 dager før de ble ofret.

Endotoksinadministreringr

LPS {E. coli lipopolysakkarid) {endotoksin; 055:B5 serumtype; Sigma chemical Co., St. Louis, MO) ble løst i steril saltløsning og ble administrert ved intraperitoneal injeksjon (i.p.) ved en dose på 6 mg/kg (1 ml/kg). Analogt ble salt-løsningen og/eller bæreren (saltløsning + 0,5 % Tween 20) injisert i kontrol1dyrene.

Administrering av forbindelsen ( profylaktisk behandling)

Hver forbindelse ble administrert ved i.p. injeksjon to ganger daglig i 6 dager, og den 7. dagen 1 time før og 5 timer etter LPS-administrering. Forbindelsene var suspendert med 0,5 % Tween 20 i saltløsningen.

Bronkoalveolær skylling

24 timer etter LPS-injeksjonen ble rottene ofret med en overdose nembutal (100 mg/kg i.p.). Et rør ble ført gjennom luftrøret og lungen ble vasket ved dråpevis å helle to 5 ml aliquoter med PBS (fosfatbuffersaltløsning) ved 37 °C, og væsken ble umiddelbart fjernet. Væsken ble igjen injisert og fremgangs-måten ble totalt gjentatt tre ganger for hver aliguot.

Celletelling og differensiering

200 ul av BALF (bronkoalveolær skyllevæske) ble fortynnet i 1 ml kaldt vann og 19 ml isoton. Det totale antall celler ble telt to ganger ved anvendelse av "Contraves autolyser 800". Når det totale antall var lavere enn 2000, ble BALF'en sentrifugert ved 800 rpm i 10 minutter for å separere cellene fra supernatanten. Supernatantene ble tømt av og cellene resuspendert i en liten mengde PBS. For cytologisk evaluering ble 50 ul av løsningen med de resuspenderte cellene sentrifugert i 1 minutt ved 1300 rpm ved anvendelse av Shandon Cytospin sentrifuge. Prøvene ble fiksert i aceton og farget med DiffQuick. Differen-siell telling av cellene ble utført på hver prøve ved å telle 200 celler tilfeldig; celletyper ble klassifisert som neutro-file, eosinofile eller mononukleære celler i henhold til morfologiske standardkriterier.

1 den følgende tabellen er det vist resultater oppnådd med enkelte forbindelser med formel I som er representative for alle klassene.

Claims

1. Forbindelse, karakterisert ved formel hvor R er hydrogen eller metyl; Ri og R2 er begge hydrogen eller de sammen danner en binding; R3 er hydrogen, eller en kjede med formel hvor A er hydrogen eller en fenylgruppe, en benzyloksykarbonylgruppe, en tiazolylgruppe eller en med Ci-C6-alkyl og/eller fenylsub-stituert imidazolylgruppe; X og Y, like eller forskjellige, er 0, S, SO, S02 eller NR4, hvor R4 er hydrogen, en lineær eller forgrenet C1-C5 alkylgruppe, en C1-C5 alkoksykarbonylgruppe, en benzyloksykarbonylgruppe; r er et tall fra 1 til 6; m er et tall fra 1 til 8; n er et tall fra 0 til 2; og deres farmasøytisk akseptable salter; forutsatt at forbindelsene 3'-desdiaretylamino-3',4'-dehydroerytr-omycin A-oksim og 3'-desdimetylamino-3',4'dehydroerytromycin A-9-O-metyloksim er unntatt.

2. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at R, Ri og R2 er hydrogen.

3. Forbindelse ifølge krav 2, karakterisert ved at R3 er en kjede med formel hvor X, Y, A, r, m og n har samme betydning som i krav 1.

4. Forbindelse ifølge krav 2, karakterisert ved at R3 ér en kjede med formel hvor r er 2, m er 2 eller 6, n er 1, Y er NR*, X er 0 eller NR*, R« er hydrogen og A er fenyl eller tiazolyl.

5. Forbindelsene 3'-desdimetylamino-3',4'-dehydroerytromycin A-oksim og 3'-desdimetylamino-3',4'dehydroerytromycin A-9-0-metyl-oksim for anvendelse som anti-inflammatoriske forbindelser.

6. Farmasøytisk sammensetning, karakterisert ved at den inneholder en farmasøytisk aktiv mengde av en forbindelse ifølge krav 1 blandet med en farmasøytisk akseptabel bærer.