NO309267B1 - Substituerte oxazolidin-calpain- og/eller cathepsin B- inhibitorer og farmasöytisk preparat inneholdende disse - Google Patents

Description

Bakgrunn for oppfinnelsen

Neurologisk skade resulterende fra et kompromiss av den cerebrovaskulære tilførsel er ledende årsak til død og uførhet. Med hensyn til etiologien av ischemisk neuronal død er det blitt angitt at den forlengede økning av intracellulært calsium utløser et utall av intracellulære hendelser som kan svekke eller skade cellulær funksjon; Hong, Seung-Chyul et al., Stroke, 25, 663-669 (1994); Siesjo, B.K. et al., J. Cereb. Blood Flow Metab., 9, 127-140 (1989); Siesjo, B.K., J Neurosurg., 77,'169-184 (1992). Under fysiologiske betingelser reguleres den nøyaktige opprettholdelse av intracellulære calsiumnivåer omhyggelig. Tap av calsiumhomøostase og økning i intracellulært calsium under ischemi muliggjør uhensiktsmessig aktivering av flere calsiumfølsomme mekanismer som deretter blir ødeleggende for cellulær funksjon. Et hovedeksempel på en mekanisme av denne type er calsiumaktivert proteolyse. Kontinuerlig stimu-lering av calsiumaktiverte nøytrale proteaser, kjent som calpainer, under ischemi resulterer i unormal proteolyse av substrat-proteiner; Seubert, P., et al., Brain Res., 492, 366-370 (1989); Inuzuka, T., et al., Stroke, 21, 917-922 (1990);

Lee, K.S., Proe. Nati. Acad. Sei, USA, 88, 7233-7237 (1991).

Foretrukne substrater for calpain innbefatter cytoskeletale proteiner slik som mikrotubul-assosiert protein 2 (MAP2), spectrin og neurofilamentproteiner. Andre substrater innbefatter nøkkelregulerende enzymer slik som protein—kinase C og calsium/calmodulin-avhengig protein-kinase II. Angitte cytoskeletale proteiner nedbrytes og mengden av angitte regulerende enzymer reduseres etter ischemiske episoder.

Den uregulerte proteolyse av enhver eller alle av disse strukturelle og regulerende proteiner kan klart alvorlig påvirke cellulær levedyktighet. Inhibitorer av calsiumaktivert proteolyse utgjør en nyttig terapeutisk funksjon i ischemisk celleskade.

Nylig er dipeptidylaldehydet, Cbz-Val-Phe-H, blitt vist å være en cellepenetrerende inhibitor av calpain som _ utviser en lav K^ for calpain i både brutte membranpreparater og intakte cellesystemer; Mehdi, S., Trends Biochem. Sei, 16, 150-153 (1991). Cbz-Val-Phe-H er også anvendbar for inhibering av cathepsin B i pasienter; Europa-patentsøknad OPI nr. 0363284, med publikasjonsdato på 11. april 1990, oppfinnere Bey, P., et al. Enn videre utviser rotter behandlet med Cbz-Val-Phe-H signifikant mindre volumer av cerebral infarkt enn saltvann-behandlede eller bærer-behandlede kontrolldyr. Intra-venøse injeksjoner av kumulative doser på 30 mg/kg eller 60 mg/kg av Cbz-Val-Phe-H var effektive til å redusere infarkt, ødem og calsiumaktivert proteolyse. Den proteolytiske respons på ischemi etter halshugging ble også redusert med Cbz-Val-Phe-H; Hqng, Seung-Chyul et al.., Stroke, 25, 663-669 (1994).

Søkeren har funnet substituerte oxazolidinderivater av Cbz-Val-Phe-H med en lav for calpain, så vel som cathepsin B, samtidig som de utviser god cellepenetrerende evne. Et mål med foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe terapeutiske midler for inhibering av calpain og/eller cathepsin B

i en pasient med behov derav. Et ytterligere mål med oppfinnelsen er å tilveiebringe terapeutiske midler ved behandling av pasienter angrepet av en akutt eller kronisk neurodegenerativ sykdom.

Sammendrag av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse angår forbindelser som er kjennetegnet ved formelen:

hvori

R og Q hver uavhengig er hydrogen, OH, C^-C^-alkyl, C^ C^ alkoxy, N02, NH2 eller halogen;

Ri °9 R2 er hver uavhengig C^-C^-alkyl;

R3 er hydrogen, C^-Cg-alkanoyl,

R4 og R5 er hver uavhengig hydrogen, C^-C-alkyl eller benzyl; R6 er t-butyloxycarbonyl, carbobenzyloxy, eller

hvori

Z er N; og

B er en gruppe av formel

R7 er hydrogen eller methyl;

R8 er Ci-C-alkyl;

m er det hele tall null eller én;

n er det hele tall null eller én;

p er det hele tall null til tre; og q er det hele tall null til tre;

og farmasøytisk akseptable salter derav. Forbindelsene av formel (I) er calpain og/eller cathepsin B-inhibitorer og er

derfor anvendbare ved behandling av akutte eller kroniske neurodegenerative sykdommer slik som ischemisk slag (trombotisk eller embolisk i opprinnelse), hemoragisk slag og etterfølgende vaskulær femomena, myocardialt infarkt, neurologiske konsekvenser av coronare bypass- og transplantasjonsoperasjoner, hodeskade, Alzheimers sykdom, alders-asossiert demens, vaskulær demens, Parkinsons sykdom, amyotrofisk lateral sklerose og lignende.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Som anvendt her angir uttrykket "C^-C^-alkyl" et mettet rettkjedet eller forgrenet hydrocarbonradikal med 1 til 4 carbonatomer. Innbefattet innen rammen for dette uttrykk er methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl og lignende. Uttrykket "C^-C^-alkoxy" angir et alkoxy-radikal av et oxygenradikal som bærer et mettet rettkjedet eller forgrenet hydrocarbonradikal med 1 til 4 carbonatomer. Innbefattet innen rammen for dette uttrykk er methoxy, ethoxy, propoxy, n-butoxy, isobutoxy, sek-butoxy, t-butoxy og lignende. Uttrykket "C-^-Cg-alkanoyl" innbefatter foririyl, acetyl, propio-nyl, butyryl, pentanoyl, hexanoyl, 2-ethylhexanoyl og lignende. Uttrykkene "halo", "halogen" eller "halogenid" angir et fluor-, klor-, brom-eller jodatom.

Uttrykkene "Ts" eller "tosylat" angir en p-toluen-sulfonatfunksjonalitet av formelen:

Uttrykket "Bn" angir en benzylfunksjonalitet av formelen:

Uttrykket "CBz" eller "carbobenzyloxy" angir en carbobenzyloxyfunksjonalitet av formelen; Uttrykkene "BOC" eller "t-butyloxycarbonyl" angir en t-butyloxycarbonylfunksjonalitet av formelen;

Uttrykket "steroisomerer" er et generelt uttrykk for alle isomerer av individuelle molekyler som avviker bare i orienteringen av deres atomer i rommet. Det innbefatter speil-bildeisomerer (enantiomerer), geometriske (cis/trans) isomerer, og isomerer av forbindelser med mer enn ett chiralt senter som ikke er speilbilder av hverandre (diastereomerer). For aminosyrer kan betegnelsene L/D, eller R/S anvendes som beskrevet i IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature, Eur.

J. Biochem. 138: 9-37 (1984).

Uttrykket "farmasøytisk akseptabelt salt" angir de salter som ikke er vesentlig toksiske ved den administrerte dose for å oppnå den ønskede effekt, og som ikke uavhengig utviser signifikant farmakologisk aktivitet. Saltene innbefattet innen rammen for dette uttrykk er hydrobromid, hydro-klorid, svovelsyre, fosforsyre, salpetersyre, maursyre, eddiksyre, propionsyre, ravsyre, glykolsyre, melkesyre, eplesyre, vinsyre, sitronsyre, ascorbinsyre, oc-ketoglutarsyre, glutaminsyre, asparaginsyre, maleinsyre, hydroxymaleinsyre, pyruvsyre, fenyleddiksyre, benzosyre, p-aminobenzosyre, antranilsyre, p-hydroxybenzosyre, salicylsyre, hydroxyethan-sulfonsyre, ethylensulfonsyre, halbenzensulfonsyre, toluensulfonsyre, nafthalensulfonsyre, methansulfonsyre, sulfanil-syresalter og lignende.

De naturlige aminosyrer anvendt i foreliggende beskrivelse inneholder et chiralt carbonatom. Med mindre annet spesifikt er angitt anvender de foretrukne forbindelser de optisk aktive aminosyrer av L-konfigurasjonen, men det tas imidlertid i betraktning at de anvendte aminosyrer også kan være i D-konfigurasjonen. I tillegg kan forbindelsene av formel (I) hvori m og n begge er det hele tall én, være blandinger av D- og L-isomerer, innbefattende racemiske blandinger. Eksempler på de anerkjente forkortelser for ct-aminosyrene innbefattet innen beskrivelsens ramme er angitt i Tabell 1.

Utgangsmaterialer som er nødvendige for fremstilling av forbindelser av formel (I) hvori Rg er t-butyloxycarbonyl-carbobenzylo xy eller hvori substituentene er som tidligere beskrevet, er kommersielt tilgjengelige eller fremstilles ved hjelp av fagmannen. Eksempelvis er mellomproduktene av formelen

hvori

Z og B er som tidligere definert,

beskrevet i Europa-patentsøknad OPI nr. 0529568, oppfinnere Peet et al., med publikasjonsdato 3. mars 1993. Enn videre kan mellomproduktene av formel

fremstilles som beskrevet i Reaksjonsskjema I. Alle substituenter er som tidligere definert med mindre annet er angitt. Reagensene og utgangsmaterialene er lett tilgjengelige for fagmannen. Reaksjonsskjerna I tilveiebringer en generell syntese-prosedyre for fremstilling av de egnede mellomprodukter av forme

hvori Z er som tidligere definert.

I trinn A omdannes carboxylsyrefunksjonaliteten av den egnede 2,5-pyridindicarboxylsyre-2-methylester (1) (Nippon Kagaku Zasshi, 1967, 88, 563) til dens syreklorid under anvendelse av teknikker og prosedyrer vel kjent innen faget, under anvendelse av et reagens slik som thionylklorid, under dannelse av det tilsvarende 6-carbomethoxynikotinoylklorid (2).

I trinn B amideres syrekloridet (2) med morfolin ved teknikker og prosedyrer vel kjent innen faget for å gi den tilsvarende 5-(morfolin-4-carbonyl)-2-pyridincarboxylsyre-methylester (3).

I trinn C hydrolyseres 5-(morfolin-4-carbonyl)-2-pyridincarboxylsyre-methylester (3) ved teknikker og prosedyrer vel kjent innen faget, med for eksempel lithiumhydroxyd i methanol for å gi 5-(morfolin-4-carbonyl)-2-pyridincarboxylsyre (4) .

I tillegg kan det egnede mellomprodukt av formelen

fremstilles som beskrevet i Reaksjonsskjema II, hvori alle substituenter er som tidligere definert. Reagensene og utgangsmaterialene er lett tilgjengelige for fagmannen. Reaksjonsskjema II tilveiebringer en generell syntese-prosedyre for fremstilling av de egnede mellomprodukter av formel

Z er» som tidligere definert.

I trinn A omdannes den fri carboxylsyrefunksjonalitet av 2,5-pyridindicarboxylsyre-2-methyleser (1) (Nippon Kagaku Zasshi, 1967, 88, 563) til dens t-butylester under anvendelse av teknikker og prosedyrer vel kjent innen faget, slik som t-butylalkoholadduktet av dicyklohexylcarbodiimid (Synthesis 1979, 570), for å gi den tilsvarende 2,5-pyridindicarboxylsyre-2-methylester-5-t-butylester (5).

Eksempelvis kombineres 2,5-pyridindicarboxylsyre-2-methylesteren (1) med et molart overskudd av t-butylalkohol-adduktet av dicyklohexylcarbodiimid i et egnet organisk løs-ningsmiddel slik som methylenklorid. Reaksjonen utføres typisk ved et temperaturområde på fra 0° C til romtemperatur og i et tidsrom varierende fra 2-24 timer. 2,5-pyridin-dicarboxylsyre-2-methylester-5-t-butylesteren (5) isoleres fra reaksjonsblandingen ved standard ekstraktive metoder som er kjent innen faget, og kan renses ved krystallisering.

I trinn B amideres 2,5-pyridindicarboxylsyre-2-methylester-5-t-butylesteren (5) med morfolin for å gi den tilsvarende 6-(morfolin-4-carbonyl)nikotinsyre-t-butylester (6).

Eksempelvis bringes 2,5-pyridindicarboxylsyre-2-rmethylester-5-t-buty lesteren (5) i kontakt med et molart overskudd av morfolin i et egnet organisk løsningsmiddel slik som tetrahydrofuran. Reaksjonen utføres typisk ved et temperaturområde på fra romtemperatur til tilbakeløpstemperaturen og i et tidsrom varierende fra 5 timer til 3 dager. 6-(morfolin-4-carbonyl)nikotinsyre-t-butylesteren (6) isoleres fra reaksjonsblandingen ved standard ekstraktive metoder som kjent

innen faget, og kan renses ved krystallisering.

I trinn C hydrolyseres 6-(morfolin-4-carbonyl)-nikotinsyre-t-butylesteren (6) med for eksempel HC1 i nitro-methan for å gi den tilsvarende 6-(morfolin-4-carbonyl)-nikotinsyre (7).

Utgangsmaterialet for Reaksjonsskjema VI for fremstilling av forbindelser av formel (I) kan fremstilles som beskrevet i Reaksjonsskjema III. Alle substituenter er som tidligere definert med mindre annet er angitt. Reagensene og utgangs-matérialene er lett tilgjengelige for fagmannen.

Rg <=> R1 eller R2

P = beskyttende gruppe

X = egnet carboxylsyrebeskyttende gruppe eller en harpiks

I Reaksjonsskjema III, trinn A, koples forbindelser av struktur (8) med forbindelser av struktur (9a) under anvendelse av standard reaksjoner analogt kjent innen faget, slik som de som anvendes innen peptidsyntese. I en vanlig peptidsyntese forlenges for eksempel peptider ved avbeskyttelse av a-aminet av den N-terminale rest, og kopling av den neste egnede N-beskyttede aminosyre via en peptidbinding under anvendelse av de beskrevne metoder. Denne avbeskyttelse og koplingsprosedyre gjentas inntil den ønskede sekvens erholdes. Denne kopling kan utføres med konstituent-aminosyrene på en trinnvis måte som vist i Reaksjonsskjema III, eller ved konden-sasjon av fragmenter eller en kombinasjon av begge fremgangs-måter, eller ved fastfasepeptidsyntese i henhold til metoden opprinnelig beskrevet av Merrifield, J. Am. Chem. Soc, 1963, 85, 2149-2154, hvis beskrivelse herved er inkorporert ved referanse. Når en fastfase-syntesemetode anvendes bindes den C-terminale carboxylsyre til en uløselig bærer (vanligvis polystyren). Disse uløselige bærere danner en binding som er stabil overfor forlengelsesbetingelsene men som lett spaltes senere. Eksempler på slike bærere er: klor- eller brom-methylharpiks, hydroxymethylharpiks og aminomethylharpiks. Mange av disse harpikser er kommersielt tilgjengelige med den ønskede C-terminale aminosyre allerede inkorporert.

I tillegg til det foregående er peptidsynteser beskrevet i Stewart and Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", 2. utg., Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984); Gross, Meienhofer, Udenfriend, utg., "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology", Vol 1, 2, 3, 5 og 9, Academic Press,

New York, 1980-1987; Bodanszky, "Peptide Chemistry:

A Practical Textbook", Springer-Verlag, New York (1988);

og Bodanszky et al. "The Practice of Peptide Synthesis", Springer-Verlag, New York (1984), hvis beskrivelser herved

er inkorporert ved referanse.

Kopling mellom to aminosyrer, en aminosyre og et peptid, eller to peptidfragmenter kan utføres under anvendelse av standard koplingsprosedyrer slik som azidmetoden, blandet carbonsyre-carboxylsyreanhydrid (isobutylklorformiat)-metoden, carbodiimid (dicyklohexylcarbodiimid, diisopropyl-carbodiimid, eller vannløselig carbodiimid)-metoden, aktiv ester (p-nitrofenylester, N-hydroxysuccinimidester)-metoden, Woodward-reagens K-metoden, carbonyldiimidazolmetoden, fosforreagenser slik som B0P-C1, eller oxydasjons-reduksjons-metoder. Enkelte av disse metoder (spesielt carbodiimid-metoden). kan forbedres ved tilsetning av 1-hydroxybenzotriazol. Disse koplingsreaksjoner kan utføres enten i oppløsning (væske-fase) eller fast fase.

De funksjonelle grupper av konstituent-aminosyrene

må generelt beskyttes under koplingsreaksjonen for å unngå dannelse av uønskede bindinger. De beskyttende grupper som kan anvendes er angitt i Greene, "Protective Groups in Organic Chemistry", John Wiley & Sons, New York (1981) og "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology", Vol. 3, Academic Press, New York

(1981), hvis beskrivelse herved er inkorporert ved referanse.

a-carboxylgruppen av den C-terminale rest: beskyttes vanligvis med en ester som kan spaltes for å gi carboxylsyren. Beskyttende grupper som kan anvendes innbefatter: 1) alkyl-estere slik som methyl og t-butyl, 2) arylestere slik som benzyl og substituert benzyl, eller 3) estere som kan spaltes ved mild basebehandling eller milde reduktive midler slik som triklorethyl og fenacylestere.

a-aminogruppen av hver aminosyre som skal koples til den voksende peptidkjede må beskyttes. Enhver beskyttende gruppe kjent innen faget kan anvendes. Eksempler på disse beskyttende grupper innbefatter: 1) acyltyper slik som formyl, trifluoracetyl, fthaloyl og p-toluensulfonyl; 2) aromatiske carbamattyper slik som benzyloxycarbonyl (Cbz eller Z) og substituerte benzyloxycarbonyler, 1-(p-bifenyl)-1-methylethoxy-carbonyl og 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc); 3) alifatiske carbamattyper slik som tert-butyloxycarbonyl (Boe), ethoxycar-bonyl, diisopropylmethoxycarbonyl og allyloxycarbonyl;

4) sykliske alkylcarbamattyper slik som cyklopentyloxycarbonyl og adamantyloxycarbonyl; 5) alkyltyper slik som trifenyl-methyl og benzyl; 6) trialkylsilaner slik som trimethylsilan; og 7) thiolholdige typer slik som fenylthiocarbonyl og dithiasuccinoyl. Den foretrukne a-beskyttende gruppe er enten Boe, Cbz eller Fmoc, fortrinnsvis Boe. Mange amino-syrederivater hensiktsmessig beskyttet for peptidsynteser er kommersielt tilgjengelige.

Den a-aminogruppe-beskyttende gruppe av den nylig tilsatte aminosyrerest spaltes før kopling av den neste aminosyre. Betingelser for spalting av slike beskyttende grupper er beskrevet i Greene, "Protective Groups in Organic Chemistry", kapittel 7, John Wiley & Sons, New York (1981). Når Boc-gruppen anvendes er de valgte metoder trifluoreddiksyre, bar eller i diklormethan, eller HC1 i dioxan eller ethylacetat. Det resulterende ammoniumsalt nøytraliseres deretter enten før koplingen eller in situ med basiske løs-ninger slik som vandige buffere, eller tertiære aminer i diklormethan eller dimethylformamid. Når Fmoc-gruppen anvendes er de valgte reagenser piperidin eller substituert piperidin i dimethylformamid, men ethvert sekundært amin eller vandige basiske løsninger kan anvendes. Avbeskyttelsen utføres ved en temperatur på mellom 0° C og romtemperatur.

Enhver av aminosyrene som bærer sidekjedefunksjonaliteter må beskyttes under fremstillingen av peptidet under anvendelse av enhver av de ovenfor beskrevne grupper. Fagmannen vil erkjenne at valg og anvendelse av egnede beskyttende grupper for disse sidekjedefunksjonaliteter avhenger av aminosyren og nærvær av andre beskyttende grupper i peptidet. Valg av slike beskyttende grupper er viktig da de ikke må fjernes under avbeskyttelsen og koplingen av a-aminogruppen.

Når for eksempel Boe anvendes som den cc-amino-beskyttende gruppe kan benzyl (Bn)-ether anvendes for å beskytte de hydroxyholdige sidekjeder av aminosyrer slik som Tyr, Ser eller Thr.

Når fastfasesyntese anvendes spaltes peptidet fra harpiksen vanligvis samtidig med fjerning av den beskyttende gruppe. Når Boc-beskyttelsesskjemaet anvendes ved syntesen er behandling med vannfri HF-holdige additiver slik som dimethylsulfid, anisol, thioanisol eller p-cresol ved 0° C den foretrukne metode for spaltning av peptidet fra harpiksen. Spaltingen av peptidet kan også utføres med andre syrereagen-ser slik som trifluormethansulfonsyre/trifluoreddiksyre-blandinger. Hvis Fmoc-beskyttelsesskjemaet anvendes spaltes den N-terminale Fmoc-gruppe med reagenser beskrevet tidligere. De andre beskyttende grupper og peptidet spaltes fra harpiksen under anvendelse av en løsning av trifluoreddiksyre og forskjellige additiver slik som anisol etc.

I Reaksjonsskjema III, trinn A, oppløses nærmere bestemt en a-aminosyre av struktur (8) hvori X er en egnet a-carboxylbeskyttende gruppe slik som en methylester, i et egnet vannfritt organisk løsningsmiddel slik som vannfritt DMF eller vannfritt methylenklorid under en inert atmosfære slik som nitrogen. Til denne løsning tilsettes en ekvivalent av N-hydroxybenzotriazolhydrat, en ekvivalent av 1-(3-dimethyl-aminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-hydroklorid og en ekvivalent av den beskyttede a-aminosyre av struktur (9a) oppløst i et egnet vannfritt organisk løsningsmiddel, slik som vannfritt DMF eller vannfritt methylenklorid. Reaksjonsblandingen tillates deretter å omrøres i ca, l til 15 timer. Det koplede produkt av struktur (10) isoleres deretter og renses ved teknikker vel kjent innen faget slik som ekstraktive teknikker og flashkromatografi. Eksempelvis fortynnes reaksjonsblandingen med et egnet organisk løsningsmiddel slik som ethylacetåt, skylles med vann, tørkes over vannfritt magnesiumsulfat, filtreres og konsentreres under vakuum. Residuet renses ved flashkromatografi på silicagel med et egnet elueringsmiddel slik som ethylacetat/hexan under dannelse av det koplede produkt (10).

I Reaksjonsskjema III, trinn A, oppløses alternativt en egnet beskyttet a-aminosyre av struktur (9a) i et egnet organisk løsningsmiddel under en inert atmosfære slik som nitrogen. Eksempler på egnede organiske løsningsmidler er petroleumethere, et klorert hydrocarbon slik som carbontetra-klorid, ethylenklorid, methylenklorid eller kloroform; et klorert aromat slik som 1,2,4-triklorbenzen eller o-diklor-benzen; carbondisulfid; et etherisk løsningsmiddel slik som diethylether, tetrahydrofuran eller 1,4-dioxan, eller et aromatisk løsningsmiddel slik som benzen, toluen eller xylen. Methylenklorid er det foretrukne løsningsmiddel for denne koplingsreaksjon. Løsningen behandles deretter med én til fire ekvivalenter av et egnet amin. Eksempler på egnede aminer er tertiære organiske aminer slik som tri-(lavere alkyl)-aminer, for eksempel triethylamin; eller aromatiske aminer slik som picoliner, collidiner og pyridin. Når pyridiner, picoliner eller collidiner anvendes kan disse anvendes i høyt overskudd og derfor også virke som reaksjonsløsningsmidlet. Særlig egnet for koplingsreaksjonen er N-methylmorfolin (NMM). Løsningen avkjøles deretter til ca. 20° C og én ekvivalent isobutylklorformiat tilsettes. Reaksjonsblandingen tillates å omrøres i ca. 10 til 30 minutter, og 1 til 4 ekvivalenter av aminosyreesteren av struktur (8) (X er en estergruppe slik som methyl eller ethyl, og aminosyren kan være et syreaddi-sjonssalt eller en fri base) tilsettes til reaksjonsblandingen. Reaksjonsblandingen omrøres i fra 30 minutter til 2 timer ved ca. -20° C og tillates deretter å oppvarmes til romtemperatur og omrøres i fra 1 til 3 timer. Det koplede produkt (10) isoleres deretter og renses med teknikker vel kjent innen faget slik som ekstraktive teknikker og flashkromatografi. Eksempelvis fortynnes reaksjonsblandingen med et egnet organisk løs-ningsmiddel slik som methylenklorid, skylles med vann. tørkes over vannfritt magnesiumsulfat, filtreres og konsentreres under vakuum. Residuet renses ved flashkromatografi på silicagel med et egnet elueringsmiddel slik som ethylacetat/hexan under dannelse av det koplede produkt (10).

I Reaksjonsskjema III, trinn Al, fjernes den beskyttende gruppe (Pg) på det koplede produkt (10) under betingelser vel kjent innen faget, som beskrevet av T.W. Green, "Protective Groups in Organic Synthesis", kapittel 7, 1981, John Wiley & Sons, Inc, og det primære amin koples med Rg for

å gi det koplede produkt av struktur (11). Når for eksempel Pg er et tert-butylcarbamat (BOC) på det koplede produkt (10) oppløses forbindelsen i methanolisk saltsyre, omrøres i flere timer og konsentreres deretter under vakuum. Residuet opp-løses deretter i vann, nøytraliseres med mettet natriumbicarbonat og ekstraheres med ethylacetat. De organiske ekstrakter tørkes over vannfritt magnesiumsulfat, filtreres og konsentreres under vakuum. Residuet renses ved flashkromatografi på silicagel med et egnet elueringsmiddel slik

som ethylacetat/hexan under dannelse av det primære amin.

Når alternativt Pg er et tert-butylcarbamat (BOC)

på det koplede produkt (10) kan forbindelsen oppløses i trifluoreddiksyre og omrøres ved romtemperatur i 1 til 12 timer. Reaksjonsblandingen helles deretter forsiktig over i vann, nøytraliseres med bicarbonat og ekstraheres med ethylacetat. De kombinerte organiske ekstrakter tørkes over vannfritt magnesiumsuflat, filtreres og konsentreres under vakuum. Residuet kan renses ved flashkromatografi på silicagel med et egnet elueringsmiddel slik som ethylacetat/hexan under dannelse av det primære amin.

I Reaksjonsskjema III, trinn A2, koples det ovenfor fremstilte primære amin til Rg for å gi det koplede produkt (11) under betingelser vel kjent innen faget. Hvor for eksempel Rg er en syre av struktur (9c)

underkastes syren (9c) en koplingsreaksjon analog med prosedyrene beskrevet i Reaksjonsskjema III, trinn A, ovenfor. Eksempelvis oppløses syren (9c) i et egnet organisk løsnings-middel slik som methylenklorid, under en inert atmosfære slik som nitrogen. Løsningen behandles deretter med én til fire ekvivalenter av et egnet amin slik som N-methylmorfolin, avkjøles til ca. -20° C og én ekvivalent isobutylklorformiat tilsettes. Reaksjonsblandingen tillates å omrøres i ca. 10 til 30 minutter, og 1 til 4 ekvivalenter av det ovenfor fremstilte primære amin tilsetttes til reaksjonsblandingen. Reaksjonsblandingen omrøres i 30 minutter til 2 timer ved ca. 20° C og tillates deretter å oppvarmes til romtemperatur og omrøres i 1 til 3 timer. Det koplede produkt (11) isoleres deretter og renses ved teknikker vel kjent innen faget slik" som ekstraktive teknikker og flashkromatografi. Eksempelvis fortynnes reaksjonsblandingen med et egnet organisk løsnings-middel slik som methylenklorid, skylles med vann, tørkes over vannfritt magnesiumsulfat, filtreres og konsentreres under

vakuum. Residuet renses ved flashkromatografi på silicagel med et egnet elueringsmiddel slik som ethylacetat/hexan under dannelse av det koplede produkt (11).

Alterantivt oppløses det ovenfor fremstilte primære amin i et egnet vannfritt organisk løsningsmiddel slik som methylenklorid under en inert atmosfære slik som nitrogen.

Til denne løsning tilsettes en ekvivalent av N-hydroxybenz-triazolhydrat, en ekvivalent av 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-hydroklorid og en ekvivalent av syren av struktur (9c), oppløst i et egnet vannfritt organisk løsnings-middel slik som methylenklorid. Reaksjonsblandingen tilsettes der etter og omrøres i fra ca. 1 til 15 timer. Det koplede produkt av struktur (11) isoleres deretter og renses ved teknikker vel kjent innen faget slik som ekstraktive teknikker og flashkromatografi. Eksempelvis fortynnes reaksjonsblandingen med et egnet organisk løsningsmiddel slik som ethylacetat, skylles med vann, tørkes over vannfritt magnesiumsulfat, filtreres og konsentreres undec vakuum. Residuet renses ved flashkromatografi på silicagel med et egnet elueringsmiddel slik som ethylacetat/hexan under dannelse av det koplede produkt (11) .

Det koplede produkt (11) kan også fremstilles direkte i Reaksjonsskjema III, trinn B, ved en koplingsreaksjon av a-aminosyren av struktur (8) hvori X er en egnet a-carboxyl-beskyttende gruppe, slik som en methylester, med a-aminosyren av struktur (9b). a-aminosyren (9b) fremstilles lett ved kopling av R^-substituenten til aminosyren av struktur (9b<1>)

hvori X er en egnet a-carboxylbeskyttende gruppe, slik som en methylester, under betingelser vel kjent for fagmannen, slik som prosedyrene beskrevet i Reaksjonsskjema III, trinn A. Den a-carboxylbeskyttende gruppe av dette koplede produkt fjernes deretter under betingelser vel kjent innen faget for

å gi a-aminosyren av struktur (9b). Hvori for eksempel X er en methyl- eller ethylgruppe oppløses forbindelsen i ethanol, behandles med et likt volum vann og en ekvivalent lithiumhydroxyd. Reaksjonsblandingen tillates å omrøres i 1 til 6 timer. Den resulterende syre isoleres deretter ved teknikker vel kjent innen faget. Eksempelvis fjernes det organiske løsningsmiddel under vakuum, og den gjenværende vandige løsning surgjøres med fortynnet saltsyre. Den vandige fase ekstraheres deretter med et egnet organisk løsningsmiddel slik som ethylacetat, og de kombinerte organiske ekstrakter tørkes over vannfritt magne-siumsulf at, filtreres og konsentreres under vakuum under dannelse av a-aminosyren (9b).

I Reaksjonsskjema III, trinn C, avbeskyttes eller spaltes det koplede produkt (11) deretter fra den faste fase under betingelser vel kjent innen faget, for å gi syren av struktur (12). Hvor for eksempel X er en methyl- eller ethylgruppe på struktur (11) , oppløses forbindelsen i et egnet organisk løsningsmiddel slik som ethanol, og behandles med tilnærmet et likt volum vann. Til denne løsning tilsettes under omrøring 1 til 2 ekvivalenter lithiumhydroxyd, og reaksjonsblandingen tillates å omrøres i 1 til 6 timer. Den resulterende syre isoleres deretter og renses ved teknikker vel kjent innen faget. Det organiske løsningsmiddel fjernes for eksempel under vakuum og den gjenværende vandige løsning surgjøres med fortynnet saltsyre. Den vandige fase ekstraheres deretter med et egnet organisk løsningsmiddel slik som ethylacetat, og de kombinerte organiske ekstrakter tørkes over vannfritt magne-siumsulf at, filtreres og konsentreres under vakuum. Residuet kan deretter renses ved flashkromatografi på silicagel med et egnet elueringsmiddel slik som methanol/kloroform under dannelse av syren (12).

Ytterligere utgangsmateriale for Reaksjonsskjema VI for fremstilling av forbindelsene av formel (I) kan fremstilles som beskrevet i Reaksjonsskjema IV. Alle substituenter "er som tidligere definert med mindre annet er angitt. Reagensene og utgangsmaterialene er lett tilgjengelige for fagmannen.

Pg = beskyttende gruppe X = egnet carboxyl-beskyttende gruppe eller en harpiks

Pg = beskyttende gruppe

X = egnet carboxylbeskyttende gruppe eller en harpiks

I Reaksjonsskjema IV, trinn Al, avbeskyttes det koplede produkt (10a) (fremstilt i Reaksjonsskjema III, hvori R0 = R, og R-, er hydrogen) for å gi det primære amin under

ol /

betingelser analoge med de som er beskrevet i Reaksjonsskjema III, trinn Al. Det resulterende primære amin underkastes deretter en koplingsreaksjon med den beskyttede a-aminosyre av struktur (9a") på analog måte med prosedyren beskrevet tidligere i Reaksjonsskjema III, trinn A, for å gi det koplede produkt (13).

I Reaksjonsskjema IV, trinn Cl, avbeskyttes det ovenfor fremstilte koplede produkt (13) i det primære amin under betingelser analoge med prosedyren beskrevet i Reaksjonsskjema III, trinn Al. Det resulterende primære amin underkastes deretter en koplingsreaksjon med Rg på analog måte med prosedyrene beskrevet tidligere i Reaksjonsskjema III, trinn A, for å gi det koplede produkt (14).

Alternativt kan det ovenfor koplede produkt (14) fremstilles direkte som beskrevet i Reaksjonsskjema IV, trinn Bl og B2. Det koplede produkt (10a) avbeskyttes for å gi det primære amin under betingelser analoge med prosedyren beskrevet i Reaksjonsskjema III, trinn Al. Det resulterende primære amin underkastes deretter en kompleks reaksjon med a-aminosyren av struktur (9b") (som fremstilt i Reaksjonsskjema III, hvori Rg er R^) på analog måte med prosedyren beskrevet tidligere i Reaksjonsskjema III, trinn A, for å gi det koplede produkt (14).

I Reaksjonsskjema IV, trinn C, avbeskyttes det ovenfor fremstilte koplede produkt (14) eller spaltes fra den faste fase under betingelser vel kjent innen faget, slik som den som er beskrevet tidligere i Reaksjonsskjema III, trinn C, for å gi syren av struktur (15) .

Det skal forståes at sekvensen av koplingen av aminosyrene som beskrevet i Reaksjonsskjemaer III og IV er bare illustrativ og er ikke beregnet på å begrense oppfinnelsens ramme på noen måte. Det vil lett forståes og lett bestemmes av fagmannen at koplingssekvensen som angitt i Reaksjonsskjema III og IV kan forandres avhengig av det tilgjengelige utgangsmateriale. Eksempelvis kan det substituerte eller usubstitu-erte fenylalanin være den siste rest som koples til kjeden før syklisering i Reaksjonsskjema VI.

Utgangsmateriale som er nødvendig i Reaksjonsskjema III, IV og VI hvori R^ er methyl, kan fremstilles som beskrevet i Reaksjonsskjema V. Alle substituenter er som tidligere

) definert med mindre annet er angitt. Reagensene og utgangsmaterialene er lett tilgjengelig for fagmannen.

Rg = eller R2

X = en egnet carboxyl-beskyttende gruppe eller en harpiks

I Reaksjonsskjema V, trinn A, koples en a-aminosyre av struktur (16) hvori X er en egnet a-carboxylbeskyttende gruppe, slik som en methylester, med Rg på analog måte med prosedyrene beskrevet i Reaksjonsskjema III, trinn A, for å gi det koplede produkt.

I Reaksjonsskjema V, trinn B, avbeskyttes eller spaltes det koplede produkt fra den faste fase under betingelser vel kjent innen faget, slik som den som er beskrevet tidligere i Reaksjonsskjema III, trinn C, for å gi syren av struktur (17).

I Reaksjonsskjema V, trinn C, N-methyleres syren (17) for å gi den N-methylerte forbindelse av struktur (18). Eksempelvis oppløses syren (16) i et egnet organisk løsnings-middel slik som tetrahydrofuran, avkjøles til ca. 0° C og behandles med overskudd av methyljodid. 1 til 3 ekvivalenter natriumhydrid tilsettes deretter til løsningen som omrøres i ca.'10 minutter ved 0° C og deretter oppvarmes til romtemperatur og omrøres i 24 til 48 timer. Produktet isoleres deretter ved teknikker vel kjent innen faget slik som ekstraktive metoder. Eksempelvis tilsettes fortynnet vandig saltsyre og reaksjonsblandingen ekstraheres med et egnet organisk løsnings-middel slik som ethylacetat. De organiske ekstrakter kombineres deretter, vaskes med 5 % natriumthiosulfat, saltvann, tørkes over vannfritt magnesiumsulfat, filtreres gjennom en pute av silicagel og konsentreres under vakuum under dannelse av den N-methylerte forbindelse (18) .

Alternativt kan den N-methylerte forbindelse (18) fremstilles ved å følge prosedyren beskrevet i Reaksjonsskjema V, trinn D og E, fra syren (17).

I Reaksjonsskjema V, trinn D, sykliseres syren (17) for å gi oxazolidinet beskrevet ved struktur (17a). Eksempelvis oppløses syren (17) i et egnet organisk løsningsmiddel slik som benzen, og behandles med et overskudd av paraformaldehyd. Til dette tilsettes ca. 0,2 til 0,4 ekvivalenter p-toluensulfonsyre, og reaksjonsblandingen oppvarmes til tilbakeløpskokning i ca. 23 timer med kontinuerlig fjerning av vann under anvendelse av en Dean-Stark-felle. Reaksjonsblandingen tillates deretter å avkjøles til romtemperatur og produktet isoleres og renses ved teknikker vel kjent innen faget. Eksempelvis konsentreres den avkjølte reaksjonsblan-ding under vakuum, residuet taes opp i et egnet organisk løsningsmiddel slik som ethylacetat, skylles med mettet natriumbicarbonat, den organiske fase tørkes over vannfritt magnesiumsulfat, filtreres og konsentreres under vakuum. Residuet renses deretter ved flashkromatografi på silicagel med et elueringsmiddel slik som ethylacetat/hexan for å gi oxazolidinet (17a).

I Reaksjonsskjema V, trinn E, reduseres oxazolidinet (17a) under betingelser vel kjent innen faget for å gi den N-methylerte forbindelse av struktur (18). Eksempelvis oppløses oxazolidinet (16a) i et egnet organisk løsningsmiddel slik som kloroform og behandles med overskudd av trifluoreddiksyre. Til løsningen tilsettes et overskudd av triethylsilan under omrøring ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen tillates å omrøres i 1 til 7 dager og konsentreres deretter under vakuum under dannelse av den N-methylerte forbindelse (18).

Forbindelsene av formel (I) hvori R^ er hydrogen kan fremstilles som beskrevet i Reaksjonsskjema VI. Alle substituenter er som tidligere definert med mindre annet er angitt. Syre (19) i Reaksjonsskjema VI er tilgjengelig for fagmannen, enten kommersielt eller for eksempel ved generelt å følge prosedyrene angitt i Reaks jonsskjema I->-V. Reagensene er lett tilgjengelige for fagmannen.

I Reaksjonsskjema VI, trinn A, underkastes syren

av struktur (19) en sykliseringsreaksjon for å gi oxazolidinon av struktur (20). Eksempelvis kombineres syren (19) med 0,1 til 0,3 ekvivalenter p-toluensulfonsyre og et overskudd av et keton eller aldehyd av struktur

hvori R^ og R^ hver uavhengig er hydrogen, aryl, C^-C^-alkyl eller benzyl, i et egnet organisk løsningsmiddel. Eksempler på det ovenfor angitte keton og aldehyd er paraformaldehyd, acetaldehyd, aceton, propionaldehyd, butyraldehyd, isobutyr-aldehyd, 2-butanon, valeraldehyd, isovaleraldehyd, 2-methyl-butyraldehyd, 2-pentanon, 3-pentanon, 2-hexanon, 3-hexanon, 2- methyl-3-pentanon, 3-methyl-2-pentanon, 4-methyl-2-pentanon, 3- heptanon, 4-heptanon, 5-nonanon, benzaldehyd, fenylacet-aldehyd og lignende. Eksempler på de egnede organiske løs-

i ningsmidler er benzen, 1,2-diklorethan, toluen og lignende. Det foretrukne organiske løsningsmiddel er toluen. Mengden av 4Å molekylsiler lik tilnærmet tre ganger vekten av syren (19) kan eventuelt tilsettes reaksjonsblandingen.

Reaksjonsblandingen oppvarmes deretter til tilbakeløpskokning i i 2 til 24 timer med kontinuerlig fjerning av vann via en Deab-Stark-felle. Reaksjonsblandingen avkjøles deretter til romtemperatur og konsentreres under vakuum. Produktet isoleres og renses ved teknikker vel kjent innen faget slik som

ekstraktive metoder og flashkromatografi. Eksempelvis opp-løses residuet i et egnet organisk løsningsmiddel slik som ethylacetat, skylles med mettet natriumbicarbonat, tørkes over vannfritt magnesiumsulfat, filtreres og konsentreres under vakuum. Produktet renses deretter ved flashkromatografi

på silicagel med et egnet elueringsmiddel slik som hexan/

5 ethylacetat under dannelse av oxazolidinon (20). I trinn B reduseres oxazolidinon (20) under betingelser vel kjent innen faget under dannelse av oxazolidin av formel (Ia). Eksempelvis oppløses oxazolidinon (20) i et

organisk løsningsmiddel slik som toluen og avkjøles til

-78° C. Ca. 2,1 ekvivalenter av et egnet reduksjonsmiddel slik som diisobutylaluminiumhydrid tilsettes, og reaksjonsblandingen omrøres ved -78° C i 20 minutter til 2 timer. Reaksjonen stanses deretter forsiktig med fortynnet vandig saltsyre og reaksjonsblandingen tillates å oppvarmes til romtemperatur. Produktet isoleres deretter og renses ved teknikker vel kjent innen fget slik som ekstraktive metoder og flashkromatografi. Eksempelvis ekstraheres reaksjonsblandingen med et egnet organisk løsningsmiddel slik som ethylacetat. De kombinerte organiske ekstrakter tørkes over vannfritt magnesiumsulfat, filtreres og konsentreres under vakuum. Produktet renses deretter ved flashkromatografi på silicagel med et egnet elueringsmiddel slik som ethylacetat/hexan under dannelse av oxazolidin av formel (Ia).

Forbindelsene av formel (I) hvori R^ er 4-morfolincarbonyl kan fremstilles som beskrevet i Reaksjonsskjema VII. Alle substituenter er som tidligere definert med mindre annet angitt. Reagensene og utgangsmaterialene er lett tilgjengelige for fagmannen.

I Reaksjonsskjema VII 0-acyleres oxazolidinet av formel (Ia) under standard betingelser vel kjent innen faget for å gi det 0-acylerte oxazolidin av formel (Ib). Eksempelvis oppløses oxazolidinet av formel (Ia) i et egnet organisk løsningsmiddel slik som methylenklorid og behandles med et svakt overskudd av et egnet trialkylamin slik som triethylajnin. Et overskudd av et alkyleringsmiddel tilsettes ved romtemperatur og reaksjonsblandingen omrøres ved romtemperatur i 1 til 24 timer. Eksempler på O-acyleringsmidler er acetylklorid, propionylklorid, butyrylklorid, isobutyrylklorid, benzoyl-klorid, morfolincarbonylklorid, methylsuccinylklorid, methyl-oxalylklorid, ethyloxalylklorid, 2-ethylhexanoylklorid, 4-methoxyfenylacetylklorid og lignende. Reasjonsblandingen konsentreres deretter under vakuum. Produktet isoleres deretter og renses ved teknikker vel kjent innen faget slik som ekstraktive metoder og flashkromatografi. Eksempelvis oppløses residuet i fortynnet vandig saltsyre og et egnet organisk løsnings-middel slik som ethylacetat. Lagene separeres og det vandige lag ekstraheres med ethylacetat. Det organiske lag og organisk ekstrakt kombineres, tørkes over vannfritt magnesiumsulfat, filtreres og konsentreres under vakuum. Produktet renses ved flashkromatografi på silicagel med et egnet elueringsmiddel slik som ethylacetat/hexan under dannelse av det 0-acylerte oxazolidin av formel (Ib).

De etterfølgende eksempler representerer typiske syn-teser som beskrevet i Reaksjonsskjema I - VII. Disse eksempler skal forståes bare å være illustrative , Som anvendt her har følgende uttrykk de angitte betydninger: "g" angir gram; "mmol" angir millimol; "ml" angir milliliter; "kp" angir kokepunkt; "sm.p." angir smeltepunkt; "°C" angir grader Celsius; "mmHg" angir millimeter kvikksølv; "ul"

angir mikroliter; "jJg" angir mikrogram; og "uM" angir mikromolar; "Cbz" betyr carbobenzyloxy; "DMF" betyr dimethylformamid; "THF" betyr tetrahydrofuran; "TBAF" betyr tetra-butylammoniumfluorid; "NMM" angir N-methylmorfolin; "DMSO" betyr dimethylsulfoxyd; "HOBT" betyr hydroxybenzotriazol; "EDC" betyr 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-hydroklorid.

Eksempel 1

Fremstilling av [ 4S-[ 3( R*), 4a, 50]]-[!-[[ 5- hydroxy- 4-( fenyl-methy1)- 3- oxazolidinyl] carbony1]- 2- methylpropy1]- carbaminsyre-fenyImethylester. (MDL 104 903)

Trinn A

Reaksjonsskjema VI, trinn A; Cbz-Val-Phe-OH (4,67 g, 11,7 mmol, erholdt fra Sigma Chemical Company, St. Louis, MO 63178) ble kombinert med 5 g paraformaldehyd og p-toluensulfonsyremonohydrat (500 mg, 2,6 mmol) i 120 ml benzen. Reaksjonsblandingen ble oppvarmet til tilbakeløpskokning i 23 timer ved kontinuerlig fjerning av vann med en Dean-Stark-felle. Reaksjonsblandingen ble deretter avkjølt ved romtemperatur og konsentrert under vakuum. Residuet ble oppløst i 100 ml ethylacetat og 60 ml vandig mettet natriumbicarbonat ble tilsatt med blanding. Lagene ble deretter separert og det vandige lag ble ekstrahert med 2 x 50 ml ethylacetat.

Det organiske lag og de organiske ekstrakter ble kombinert og tørket over vannfritt magnesiumsuflat, ble ført gjennom en kort pute av silicagel og filtratet ble konsentrert under vakuum. Residuet ble deretter renset ved flashkromatografi

(hexan/ethylacetat, 95:5 til 90:10 til 80:20, silicagel)

under dannelse av [S-(R<*>,R<*>)]-[2-methyl-l-[[5-oxo-4-(fenyl-methyl)-3-oxazolidinyl]carbony1]propy1]-carbaminsyre, fenylmethylester (2,00 g, 42 %) som et skum; [a] <20>Q

+113,95 (c 0,55, CHC13); IR (CHC13) 3314, 3032, 2934, 1804,. 1714, 1659, 1437, 1233 cm"<1>; MS m/z 411 (M+H<+>), 367, 268, 234, 206, 178, 162, 91.

Analyse beregnet for C23H26<N>2°5:

C 67,31 H 6,38 N 6,83

Funnet: C 67,12 H 6,51 N 6,85,

Trinn B

.Reaksjonsskjema VI, trinn B: Den ovenfor fremstilte [S-(R<*>,R<*>)]-[2-methyl-l-[[5-OXO-4-(fenylmethyl)-3-oxazolidinyl]-carbonyl]propyl]-carbamlnsyre-fenylmethylester (1,93 g, 4,7 mmol) ble oppløst i 60 ml toluen og løsningen ble avkjølt til -78° C. Løsningen ble deretter behandlet med diisobutylaluminiumhydrid (10 ml, 10 mmol, IM løsning i toluen, DIBAL-H) og reaksjonsblandingen ble omrørt ved -78° C i 30 minutter. 60 ml IN HC1 ble deretter langsomt tilsatt til reaksjonsblandingen som deretter fikk oppvarmes til romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble ekstrahert med 3 x 50 ml ethylacetat.

De kombinerte organiske ekstrakter ble tørket over vannfritt magnesiumsulfat, ble ført gjennom en kort pute av silicagel og filtratet ble konsentrert under vakuum. Residuet ble deretter renset ved flashkromatografi (hexan/ethylacetat, 99:5 til 90:10 til 80:20 til 60:40, silicagel) under dannelse av den sluttelige tittelforbindelse (640 mg, 33 %) som en olje;

[ct]<20>D -46,13 (c 0,98, CHC13); IR (KBr) 3406 (br), 3032,

2964, 1710, 1640, 1529, 1454 cm<-1>; MS m/z 411 (M+H<+>), 383, 339, 275, 91.

Analyse beregnet for C23H28<N>2°5<:>

C 66,98 H 6,83 N 6,79

Funnet: C 66,88 H 7,07 N 6,81.

Eksempel 2

i Fremstilling av [ 4S-[ 3 ( R*) , 4a, 5[ 3 ]]-[!-[ [ 5- ( acetyloxy) - 4-( fenylmethyl)- 3- oxazolidinyl] carbonyl3- 2- methylpropyl]-carbaminsyre- fenyImethylester. (MDL 104 860)

Reaksjonsskjema VII; Tittelforbindelsen fremstilt i eksempel

1 (250 mg, 0,6 mmol) og 0,3 ml triethylamin ble oppløst i 20 ml methylenklorid. Acetylklorid (0,3 ml, 4,2 mmol) ble deretter tilsatt til løsningen ved romtemperatur og reaksjonsblandingen ble omrørt over natten. Reaksjonsblandingen ble deretter konsentrert under vakuum og residuet ble oppløst i 30 ml ethylacetat og 30 ml IN HC1. Lagene ble separert og det vandige lag ble ekstrahert med 3 x 30 ml ethylacetat. Det organiske lag og de organiske ekstrakter ble kombinert, ble tørket over vannfritt magnesiumsulfat, ført gjennom en kort pute av silicagel og filtratet ble konsentrert under vakuum. Residuet ble renset ved preparativ tynnsjiktskromatografi (hexan/ethylacetat, 80:20, silicagel) under dannelse av forbindelsen

20

(200 mg, 73 %) som en klebrig olje; [a] D -36,13 (c 0,64, CHC13); -"-H NMR (300 MHz, CDC13) 6 0,7, 0,89, 1,00 (tre d, 6H, J=6,6 Hz hver, CH(CH3)2/ rotamerer rundt amidbindingen),

1,98 og 1,87 (to s, 3H, C(=0)CH3), 2,00 (m, 1H, CH(CH3)2), 2,73, 2,93 og 3,14 (dd, d, d, 2H, J=13,6, 9,6, 7,1 Hz og 13,8, 3,9 Hz, CH2Ph), 3,89 og 4,01 (to t, 1H, J=8,4, 8,8 Hz, CHCH(CH3)2 for valin), 4,43 og 4,77 (dd og t, 1H, J=3,9,

9,5 Hz og 7,4 Hz, CHCH2Ph i oxazolidinring), 5,00-5,30 (sett av m, 4H, OCH2Ph og NCH20-), 5,34 og 5,53 (to d, 1H, J=9,0, 10,0 Hz, NH), 5,47 og 6,15 (to d, 1H, forhold 1:2,1, J=5,2

og 8,6 Hz, OCHOC(=0)CH3), 7,2-7,5 (sett av m, 10H, fenyler); <13>C NMR (75 MHz, CDC13) 6 171,71 (18,03), 18,97 (19,45), 20,86, 30,93, 35,80(38,32), 58,08 (58,91), 62,11 (62,28), 66,97 (67,03), 78,38 (78,76), 97,36 (97,92), 156,15 (156,26), 168,66 (169,48), 169,70 (170,89); IR (bar) 3298 (br), 3032, 2965, 1750, 1715, 1651, 1233 cm"<1>; MS m/z 455 (M+H<+>), 395, 351, 252, 234, 162, 91.

Analyse betegnet for C25H30N2°6:

C 66,07 H 6,65 N 6,16

Funnet: C 65,76 H 6,60 N 6,16,

Eksempel 3

Fremstilling av [ 4S-[ 3( R*), 4a, 53]]- 3-[ 3- methyl- l- oxo- 2-[[( fenylmethoxy) carbonyl] amino] butyl]- 4-( fenylmethyl)- 5- oxa-zolidinylester.-- 4- morfolincarboxylsyre ( MDL 105. 803)

Reaksjonsskjema VII; Tittelforbindelsen fremstilt i eksempel

1 (243 mg, 0,59 mmol) ble oppløst i 30 ml methylenklorid.

10 ml 4-dimethylaminopyridin (DMAP) ble tilsatt under omrøring. Triethylamin (0,2 ml, 1,2 mmol) og 4-morfolincarbonylklorid (0,1 ml, 0,86 mmol) ble deretter tilsatt og reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i ca. 20 timer. Reaksjonsblandingen ble konsentrert under vakuum og residuet ble oppløst i 50 ml ethylacetat og 20 ml IN HC1. Lagene ble separert, det organiske lag ble vasket med 50 ml saltvann, ble tørket over vannfritt magnesiumsulfat, ført gjennom en kort pute av silicagel og filtratet ble konsentrert under vakuum. Det resulterende hvite faste materiale ble omkrystallisert fra ethylacetat/hexan under dannelse av 200 mg av tittelforbindelsen som et hvitt fast materiale; [a]<20>Q -70,51 (c 0,91, DMSO), IR (KBr) 3302 (br), 3030, 2965, 1717, 1659, 1433, 1242 cm"<1>. Analyse beregnet for C^gH^N^C^: C 63,99 H 6,71 N 8,00

Funnet: C 63,50 H 6,70 N 7,93.

Eksempel 4

Fremstilling av [ 4S-[ 3( R*) , 4ot, 5Q]-( l-[[ 5- hydroxy- 4- ( fenyl-methyl^ - 3- oxazolidinyl ] carbonyl]- 2- methylpropyl] methy1-carbaminsyre- fenylmethylester ( MDL 105. 423)

Trinn A

Reaksjonsskjema V, trinn D; Kombiner Cbz-Val-OH (5,0 g, 20 mmol), p-toluensulfonsyre-monohydrat (300 mg) og 4,0 g paraformaldehyd i 200 ml 1,2-diklorethan og oppvarm til tilbakeløpskokning over natten med kontinuerlig fjerning av vann via en Dean-Stark-felle. Avkjøl reaksjonsblandingen til romtemperatur og konsentrer under vakuum. Oppløs residuet i 100 ml ethylacetat og vask med 100 ml mettet natriumbicarbonat. Ekstraher den vandige fase med 100 ml ethylacetat. Kombiner den organiske fase og ekstraktet, vask med 100 ml saltvann, tørk over vannfritt magnesiumsulfat, før gjennom en kort pute av silicagel og konsentrer under vakuum under dannelse av 5,40 g av den sykliserte forbindelse som en olje.

Trinn B

Reaksjonsskjema V, trinn E: Oppløs den ovenfor fremstilte sykliserte forbindelse (2,63 g, 10 mmol) i 100 ml kloroform og 30 ml trifluoreddiksyre. Tilsett triethylsilan (4,8 ml, 30 mmol) under omrøring ved romtemperatur. Konsentrer reaksjonsblandingen etter ca. 1 uke under vakuum under dannelse av 3,21 g av syren vist nedenfor

som en klebrig olje.

Den ovenfor angitte syre kan også fremstilles ved

å følge prosedyren nedenfor. (se generelt prosedyren beskrevet/av Pitzele, B.S. et al., J. Med. Chem., 37, 888-896 (1994).)

Trinn C

Reaksjonsskjema V, trinn C; Oppløs Cbz-Val-OH (10 g, 39,8 mmol) i 200 ml THF og avkjøl løsningen til 0° C. Tilsett natriumhydrid (5 g, 120 mmol, 60 % dispersjon i olje) og omrør i 20 minutter. Tilsett deretter methyljodid (3 ml, 48,2 mmol) og omrør reaksjonsblandingen ved 0° C i 3 timer og ved romtemperatur over natten. Tilsett langsomt 100 ml vann og vask blandingen med 50 ml diethylether. Surgjør det vandige lag med 6N HC1 til ca. pH 3 og ekstraher med 4 x 100 ml ethylacetat. Kombiner de organiske ekstrakter, vask med 100 ml 5 % natriumthiosulfat, 100 ml saltvann, tørk over magnesiumsulfat, før gjennom en kort pute av silicagel og konsentrer under vakuum under dannelse av en blanding av utgangsmateriale og ønsket syre (8,74 g). Denne blanding og ytterligere 1,5 g Cbz-Val-OH oppløses i 200 ml THF. Avkjøl, løsningen til 0° C. Tilsett natriumhydrid (5 g, 120 mmol, 60 % dispersjon i olje) og omrør i 10 minutter. Tilsett deretter methyljodid (6 ml,

96,4 mmol) og oppvarm reaksjonsblandingen til tilbakeløpskok-ning over natten. Tilsett langsomt 100 ml vann etter avkjø-ling til romtemperatur og 3 g lithiumhydroxydmonohydrat og omrør i 3 timer. Vask blandingen med 100 ml diethylether. Surgjør det vandige lag med 6N HC1 til ca. pH 3 og ekstraher med 3 x 100 ml ethylacetat. Kombiner de organiske ekstrakter, vask med 100 ml 5 % natriumthiosulfat, 100 ml saltvann, tør_k over magnesiumsulfat, før gjennom en kort pute av silicagel og konsentrer filtratet under vakuum. Residuet oppløses i 100 ml THF og 100 ml vann, behandles med 3 g lithiumhydroxyd-

monohydrat og omrør ved romtemperatur i 2 dager. Reaksjonsblandingen skylles deretter med 100 ml diethylether og sur-gjøres med 6N HC1 til ca. pH 3. Ekstraher det vandige lag med 3 x 100 ml ethylacetat. Kombiner de organiske ekstrakter, vask med 100 ml 5 % natriumthiosulfat, 100 ml saltvann, tørk over magnesiumsulfat, før gjennom en kort pute av silicagel og konsentrer filtratet under vakuum under dannelse av 1,19 g av syren.

Trinn D

Reaksjonsskjema III, trinn B: Oppløs HCl-Phe-OCH^

(2,92 g, 11 mmol) i 20 ml DMF og avkjøl løsningen til 0° C. Tilsett triethylamin (1,7 ml, 12 mmol) og omrør i 10 minutter. Tilsett deretter den ovenfor dannede syre (10 mmol, oppløst i 100 ml THF, syren dannet i enhver av de ovenfor angitte alter-native prosedyrer kan anvendes), etterfulgt av tilsetning av HOBt (1,62 g, 12 mmol) og EDC (2,3 g, 12 mmol). Omrør reaksjonsblandingen ved 0° C i 3 timer og deretter ved romtemperatur over natten. Konsentrer reaksjonsblandingen under vakuum og ta residuet opp i 100 ml IN HC1 og ekstraher med 3 x 100 ml ethylacetat. Kombiner de organiske ekstrakter, skyll med 100 ml mettet natriumbicarbonat, 100 ml saltvann, tørk over vannfritt magnesiumsulfat, før gjennom en kort pute av silicagel og konsentrer under vakuum. Rens residuet ved flashkromato-graf i (silicagel, hexan/ethylacetat, 95:5 deretter 9:1 deretter 8:2 deretter 6:4) under dannelse av det koplede produkt (3,65 g, 86

Trinn E

Reaksjonsskjema III, trinn C: Oppløs 3,30 g av det ovenfor fremstilte koplede produkt i 100 ml THF og 50 ml vann. Tilsett 900 mg lithiumhydroxydmonohydrat og omrør reaksjonsblandingen ved romtemperatur over natten. Vask reaksjonsblandingen deretter med 100 ml diethylether og surgjør det vandige lag med 6N HC1 til ca. pH 2. Ekstraher det surgjorte vandige lag deretter med 3 x 100 ml ethylacetat. Kombiner de organiske ekstrakter, tørk over vannfritt magnesiumsulfat, før gjennom en kort pute av silicagel og konsentrer filtratet under vakuum under dannelse av syren (2,47 g, 77 %) som en olje.

Trinn F

Reaksjonsskjema VI, trinn A: Kombiner den ovenfor fremstilte, syre (2,40 g, 5,8 mmol) med 4,0 g paraformaldehyd og 200 mg p-toluensulfonsyremonohydrat i 200 ml 1,2-diklorethan og oppvarm til tilbakeløpskokning i 6 timer med kontinuerlig fjerning av vann via en Dean-Stark-felle. Tilsett en ytterligere mengde av 2,0 g paraformaldehyd etter avkjøling og oppvarm reaksjonsblandingen til tilbakeløpskokning over natten med kontinuerlig fjerning av vann. Etter avkjøling konsentreres reaksjonsblandingen under vakuum. Residuet opp-løses i 200 ml ethylacetat, vaskes med 100 ml mettet natriumbicarbonat, 100 ml saltvann, tørkes over vannfritt magnesiumsulfat, føres gjennom en kort pute av silicagel og filtratet konsentreres under vakuum. Residuet renses ved flashkromato-graf i (silicagel, hexan/ethylacetat, 9:1 deretter 8:2) under dannelse av den sykliserte forbindelse (980 mg, 40 %) som en klebrig olje.

Trinn G

Reaksjonsskjema VI, trinn B; Oppløs den ovenfor fremstilte sykliserte forbindelse (1,90 g, 4,48 mmol) i 50 ml toluen og avkjøl løsningen til -78° C. Tilsett under omrøring diisobutylaluminiumhydrid (6 ml av en IM løsning i toluen, 6 mmol) og omrør i 1 time. Tilsett deretter 20 ml vann og hell blandingen over i 100 ml IN HC1. Ekstraher blandingen med 3 x 100 ml ethylacetat. Kombiner de organiske ekstrakter, vask med 100 ml saltvann, tørk over vannfri magnesiumsulfat, før gjennom en kort pute av silicagel og konsentrer filtratet. Rens residuet ved flashkromatografi (silicagel, hexan/ethylacetat, 8:2 deretter 6:4) under dannelse av den sluttelige tittelforbindelse (540 mg) som en olje; [a] 20D -93,49

(c 1,00, CHC13).

Eksempel 5

Fremstilling av [ 4S-[ 4a, 50]]- 5- hydroxy- 4-( fenylmethyl)- 3-oxazolidincarboxylsyre- fenylmethylester

Trinn A

Reaksjonsskjema VI, trinn A: Kombiner 2,5 g Cbz-Phe-OH med 5,0 g paraformaldehyd og 500 mg p-toluensulfonsyremonohydrat i 100 ml toluen og oppvarm til tilbakeløpskokning i 20 timer med kontinuerlig fjerning av vann via en Dean-Stark-felle. Avkjøl reaksjonsblandingen til romtemperatur og konsentrer under vakuum. Ta opp residuet i 100 ml ethylacetat, skyll med 100 ml mettet natriumbicarbonat, 100 ml saltvann, tørk over vannfritt magnesiumsulfat, før gjennom en kort pute av silicagel og konsentrer under vakuum. Rens residuet ved flashkromatografi (silicagel, hexan/ethylacetat, 9:1 deretter 8:2) etterfulgt av omkrystallisering fra ethylacetat/hexan med gjenvinning av en andre mengde av krystaller, under dannelse av den sykliserte forbindelse (2,10 g, 81 %) som et hvitt

20

fast materiale; [<*] D +201,5 (c 1,00, CHC13) ; IR (KBr)

3032, 2966, 1792, 1683, 1433 cm<-1>.

Analyse beregnet for C^gH-^NO^:

C 69,44 H 5,50 N 4,50

Funnet: C 69,30 H 5,51 N 4,46-

Trinn B

Reaksjonsskjema VI, trinn B; Den ovenfor sykliserte forbindelse (4,7 mmol) reduseres på analog måte med prosedyren beskrevet i Eksempel 1, under anvendelse av 10 mmol DIBAL i" 60 ml toluen under dannelse av den sluttelige tittelforbindelse.

Eksempel 6

Fremstilling av [ 4S-[ 3 ( R*) , 4a, 5( 3 ] ]-[ l-[ [ 5-( butyryl-oxy)- 4- feenylmethyl)- 3- oxazolidinyl] carbonyl]- 2- methylpropyl3-carbaminsyre- fenylmethylester (MDL 103. 821)

Reaks jonsskjema VII; Oppløs [4S-[3 (R*) ,4a,5|3] ]-[1-[[5-hydroxy-4-(fenylmethyl)-3-oxazolidinyl]carbonyl]-2-methylpropyl]-carbaminsyre-fenylmethylester (0,375 g, 0,909 mmol, fremstilt i Eksempel 1) i 3,6 ml methylenklorid. Tilsett N-methylmorfolin (0,202 g, 2,00 mmol) og butyrylklorid (0,194 g, 1,82 mmol) og omrør reaksjonsblandingen over natten ved romtemperatur i en forseglet mikroampulle. Overfør reaksjonsblandingen til en skilletrakt sammen med 25 ml IN HC1, 1 x 25 ml mettet NaHC03 og tørk over MgSO^. Fjern løsningsmidlet i vakuum og rens residuet ved flashkromatografi (silicagel, hexan/ethylacetat (2:1), fylt med methylenklorid) under dannelse av 0,328 g av tittelforbindelsen som en viskøs, farveløs olje. Rf = 0,56; [a]<20>D = -56,4 (CHC13, C = 0,700).

Eksempel 7

Fremstilling av [ 4S-[ 3 ( R*) , 4a, 53] ]-[!-[ [ 5- ( propionyloxy) - 4-( fenylmethyl)- 3- oxazolidinyl] carbonyl]- 2- methylpropyl]-carbaminsyre- fenylmethylester ( MDL 105. 837)

Reaksjonsskjema VII; Oppløs [4S-[3(R<*>),4a,53]]-[l-[[5-hydroxy-4-(fenylmethyl)-3-oxazolidinyl]carbonyl]-2-methylpropyl]-carbaminsyre-fenylmethylester (0,375 g, 0,909 mmol, fremstilt i Eksempel 1) i 9 ml i methylenklorid. Tilsett N-methylmorfolin (0,276 g, 2,73 mmol) og propionylklorid (0,126 g, 1,36 mmol) og omrør ved romtemperatur under N2 over natten. Fortynn reaksjonsblandingen med ytterligere 40 ml methylenklorid og vask med 2 x 25 ml IN HC1, 1 x 25 ml mettet NaHC03, 1 x 25 ml saltvann og tørk over MgS04. Fjern løsnings-midlet i vakuum og rens residuet ved flashkromatografi (silicagel, hexan/ethylacetat (2:1), fylt med methylenklorid) under dannelse av 0,299 g av tittelforbindelsen som en viskøs klar, fargeløs olje.

Rf = 0,56; [a]<20>D = -47,9 (CDC13, C = 0,514}.

Eksempel 8

Fremstilling av [ 4S-[ 3( R*), 4a, 53]]-[ l-[[ 5-( ethylsuccinyloxy)-4-( fenylmethyl)- 3- oxazolidinyl] carbonyl]- 2- methylpropf13 - carbamins<y>re- fenylmethylester ( MDL 105. 608)

Reaks jonsskjema VII; Oppløs [ 4S-[ 3 (R*) , 4a, 5(3 ] ]-[ 1-[[5-hydroxy-4-(fenylmethyl)-3-oxazolidinyl]carbonyl]-2-methy1-propyl]-carbaminsyre-fenylmethylester (0,57 g, 1,38 mmol, fremstilt i Eksempel 1), ethylsuccinylklorid (0,45 g, 2,77 mmol) og N-methylmorfolin (0,306 g, 3,04 mmol) i 5,4 ml methylenklorid. Omrør reaksjonsblandingen over natten, hell over i H20 og ekstraher med 2 x 150 ml diethylether. Vask de kombinerte ekstrakter med fortynnet HC1, fortynnet NaHCO-j, H20 og tørk over Na2S04. Fjern løsningsmidlet i vakuum og rens residuet ved flashkromatografi (silicagel, eluert med 25 % ethylacetat/hexan) under dannelse av tittelforbindelsen (totalt etter ansamling av tre fraksjoner = 468 mg).

Eksempel 9

Fremstilling av [ 4S-[ 3 ( R*) , 4a, 5( 3] ]-[!-[ [ 5- ( 2- ethylhexanoyloxy) - 4-( fenylmethyl)- 3- oxazolidinyl] carbonyl3- 2- methylpropyl]-carbaminsyre- fenylmethylester ( MDL 104. 092)

Reaks jonsskjema VII; Oppløs [4S-[3 (R*) ,4a,5(3] ]-[1-[[5-hydroxy-4-(fenylmethyl)-3-oxazolidinyl]carbonyl]-2-methylpropyl]-carbaminsyre-fenylmethylester (0,5 g, 1,21 mmol, fremstilt i Eksempel 1), i 5 ml methylenklorid. Tilsett N-methylmorfolin (0,27 g, 2,67 mmol) og 2-ethylhexanoylklorid (0,39 g, 2,4 mmol) og omrør reaksjonsblandingen over natten. Hell reaksjonsblandingen over i H20 og ekstraher med 3 x 50 ml ethylether. Vask de kombinerte ekstrakter med fortynnet HC1, ,NaHCO^ og tørk over Na^O^. Fjern løsningsmidlet i vakuum eg rens residuet ved flashkromatografi (silicagel, eluert med 25 % ethylacetat/hexan) under dannelse av 120 mg av tittelforbindelsen.

Eksempel 10

Fremstilling av [ 4S-[ 3 ( R*) , 4a, 5| 3 ] ]-[!-[ [ 5-( 4- methoxyfenyl-acetyloxy) - 4-( fenylmethyl)- 3- oxazolidinyl] carbonyl]- 2- methyl-propyl]- carbaminsyre- fenylmethylester ( MDL 105. 236)

Reaksjonsskjema VII; Oppløs [4S-[3(R<*>),4a,53]]-[1-[[5-hydroxy-4-(fenylmethyl)-3-oxazolidinyl]carbonyl]-2-methylpropyl]-carbaminsyre-fenylmethylester (0,5 g, 1,21

mmol, fremstilt i Eksempel 1), i 5 ml methylenklorid. Tilsett N-methylmorfolin (0,27 g, 2,67 mmol) og 0,44 g 4-methoxy-fenylacetylklorid og omrør reaksjonsblandingen over natten. Hell reaksjonsblandingen over i H2O overlagt med diethylether. Ekstraher det vandige lag med ytterligere 2 x 50 ml diethylether og vask de kombinerte organiske ekstrakter med fortynnet HC1, NaHCO^ og tørk over Na-pSO^. Fjern løsningsmidlet i vakuum og rens residuet ved flashkromatografi (silicagel, eluert med 25 % ethylacetat/hexan) under dannelse av 580 g av tittelforbindelsen.

En metode for inhibering av calpain i en pasient

med behov derav, eller behandling av en pasient angrepet av en akutt eller kronisk neurodegenerativ sykdom omfatter administrering dertil av en terapeutisk effektiv mengde av en forbindelse av formel (I). Uttrykket "akutt eller kronisk neurodegenerativ sykdom" refererer til sykdommer eller til-stander karakterisert ved utilstrekkelig og skadelig uttømming av neuroner i det modne voksne sentralnervesystem, og innbefatter, men er ikke begrenset til, ischemisk slag (trombotisk eller embolisk i opprinnelse), hemoragisk slag og etterfølgende vaskulære femomena, myokardialt infarkt, neurologiske konsekvenser av koronar bypass-og transplantasjonsoperasjoner, hodeskade, Alzheimers sykdom, aldersasso.siert demens, vaskulær demens, Parkinsons sykdom, amyotrofisk lateral sklerose og lignende. Forbindelser av formel (I) som er særlig foretrukket for behandling av akutte eller akutte neurodegenerative sykdommer innbefatter: [4S-[3(R<*>),4a,50]]-[l-[[5-hydroxy-4-(fenylmethyl)-3-oxazoli-dinyl ]carbonyl]-2-methylpropyl]carbaminsyre-fenylmethylester;

[4S-[3(R<*>),4a,50]]-[l-[[5-(acetyloxy)-4-(fenylmethyl)-3-oxazolidinyl]carbonyl]-2-methylpropyl]carbaminsyre-fenylmethylester ;

[4S-[3(R<*>),4a,50]]-3-[3-methyl-l-oxo-2-[[(fenylmethoxy)-carbonyl]amino]butyl]-4-(fenylmethyl)-5-oxazolidinylester-4-morfolincarboxylsyre;

[4S-[3(R<*>),4a,50]]-[l-[[5-hydroxy-4-(fenylmethyl)-3-oxazoli-dinyl ]carbonyl]-2-methylpropyl]methylcarbaminsyre-fenyImethylester og

[4S-[4a,50]]-5-hydroxy-4-(fenylmethyl)-3-oxazolidincarboxyl-syre-fenyImethylester.

Som anvendt her refererer uttrykket "pasient" til et varmblodig dyr slik som et pattedyr som er angrepet av en bestemt akutt eller kronisk neurodegenerativ sykdom. Det skal forstås at marsvin, hunder, katter, rotter, mus, hester, kveg, sauer og mennesker er eksempler på dyr innen rammen av betyd-ningen for uttrykket.

Uttrykket "terapeutisk effektiv mengde" refererer til en mengde som er effektiv etter kontinuerlig infusjon eller etter enkel eller multippel doseadministrering til pasienten, til å tilveiebringe en reduksjon i omfanget av skade assosiert med akutte eller kroniske neurodegenerative sykdommer, som fører til et forbedret resultat og/eller en forsinkelse eller forhindring av sykdomsforløpet sammenlignet med resultatene forventet i fravær av behandling. Uttrykket "terapeutisk effektiv mengde" indikerer ikke nødvendigvis en total elimine-ring eller legning av sykdommen. Ved bestemmelse av den terapeutisk effektive mengde eller dose taes et utall av faktorer i betraktning av den behandlende lege, innbefattende, men ikke begrenset til: arten av pattedyr; dets størrelse, alder og generelle helse; den spesifikke sykdom som er involvert; graden av eller innbefattelsen eller strengheten av sykdommen; responsen av den individuelle pasient; den bestemte forbindelse som administreres; administreringsmåte; biotilgjengelig-hetskarakteristikaene for det administrerte preparat; det valgte doseregime; anvendelse av ledsagende medikamentering og andre relevante omstendigheter.

En terapeutisk effektiv mengde av en forbindelse av formel (I) er forventet å variere fra ca. 0,1 milligram pr. kilogram kroppsvekt pr. dag (mg/kg/dag) til ca. 100 mg/kg/dag. Foretrukne mengder er forventet å variere fra ca. 0,5 til ca.

30 mg/kg/dag.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen er meget kraftige inhibitorer av calpain og cathepsin B. Det er antatt at forbindelsene ifølge oppfinnelsen utøver deres inhiberende effekt via inhibering av enzymet calpain, og derved forsinker eller forhindrer akutte eller kroniske neurodegenerative sykdommer innbefattende ischemisk slag (trombotisk eller embolisk opprinnelse), hemoragisk slag og etterfølgende vaskulær femomena, myokardialt infarkt, neurologiske konsekvenser av koronar bypass-og transplantasjonsoperasjoner, hodeskade, Alzheimers sykdom, alders-assosiert demens, vaskulær demens, Parkinsons sykdom, amyotrofisk lateral sklerose og lignende. Imidlertid skal det forståes at foreliggende oppfinnelse ikke er begrenset av noen bestemt teori eller foreslått mekanisme for å forklare dens effektivitet i den sluttelige anvendelse.

Ved utførelse av behandling av en pasient angrepet av én sykdomstilstand som beskrevet ovenfor kan en forbindelse av formel (I) administreres i enhver form eller måte som gjør forbindelsen biotilgjengelig i effektive mengder, innbefattende orale og parenterale ruter. Eksempelvis kan forbindelsene av formel (I) administreres oralt, subkutant, intramuskulært, intravenøst, transdermalt, intranasalt, rektalt, topisk og lignende. Oral eller intravenøs administrering er generelt foretrukket. Fagmannen vedrørende fremstilling av formuleringer kan lett velge den riktige form og administreringsmåte avhengig av de bestemte karakteristika av den valgte forbindelse for den sykdomstilstand som skal behandles, graden av sykdommen og andre relevante omstendigheter. Remington1 s-Pharmaceutical Sciences, 18. utg. Mack Publishing Co. (1990).

Forbindelsene kan administreres alene eller i form av et farmasøytisk preparat i kombinasjon med farmasøytisk akseptable bærere eller eksipienser, hvis mengde og art bestemmes av løseligheten og de kjemiske egenskaper av den valgte forbindelse, den valgte administreringsrute og standard farmasøytisk praksis. Selv om forbindelsene ifølge oppfinnelsen er effektive i seg selv, kan de formuleres og administreres i form av deres farmasøytisk akseptable salter, slik som for eksempel syreaddisjonssalter, av stabilitetsformål, hensiktsmessig krystallisering, forøket løselighet og lignende.

I en annen utførelsesform tilveiebringer foreliggende oppfinnelse preparater omfattende en forbindelse av formel (I) i blanding eller på annen måte i assosiasjon med én eller flere inerte bærere. Disse preparater er for eksempel anvendbare som prøvestandarder, som hensiktsmessige midler for fremstilling av masseforsendelser, eller som farmasøytiske preparater. En målbar mengde av en forbindelse av formel (I) er en mengde som er lett målbar ved standard prøveprosedyrer og teknikker som vel kjent innen faget. Målbare mengder av en forbindelse av formel (I) vil generelt variere fra ca. 0,001 % til ca. 75 % av preparatet på vektbasis. Inerte bærere kan være ethvert materiale som ikke nedbryter eller på annen måte reage-rer kovalent med en forbindelse av formel (I). Eksempler på inerte bærere er vann; vandige buffere slik som de som generelt er anvendbare i væskekromatografianalyse med høy ytelse (HPlIC) ; organiske løsningsmidler slik som acetonitril, ethylacetat, hexan og lignende; og farmasøytisk akseptable bærere eller eksipienser.

I særdeleshet tilveiebringer foreliggende oppfinnelse farmasøytiske preparater omfattende en terapeutisk effektiv mengde av en forbindelse av formel (I) i blanding eller på annen måte i assosiasjon med én eller flere farmasøytisk akseptable bærere eller eksipienser.

De farmasøytiske preparater fremstilles på kjent måte innen det farmasøytiske fag. Bæreren eller eksipiensen kan være et fast, halvfast eller væskeformig materiale som kan tjene som en bærer eller et medium for den aktive bestanddel. Egnede bærere eller eksipienser er vel kjent innen faget. Det farmasøytiske preparat kan være tilpasset for oral, parenteral eller topisk bruk og kan administreres til pasienten i form av tabletter, kapsler, stikkpiller, løsninger, suspensjoner eller lignende.

Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse kan administreres oralt, for eksempel med et inert fortynningsmid-del eller med en spiselig bærer. De kan være innelukket i gelatinkapsler eller sammenpresset i tabletter. For oral terapeutisk administrering kan forbindelsene inkorporeres med eksipienser som anvendes i form av tabletter, pastiller, kapsler, eliksirer, suspensjoner, siruper, kjeks, tyggegummi og lignende. Disse preparater skal inneholde minst 4 % av forbindelsen ifølge oppfinnelsen, den aktive bestanddel, men kan varieres avhengig av den bestemte form og kan hensiktsmessig være mellom 4 % til ca. 70 vekt% av enheten. Mengden av forbindelsen tilstedeværende i preparatene er slik at en egnet dose vil bli erholdt. Foretrukne preparater ifølge foreliggende oppfinnelse fremstilles slik at en oral doseringsenhets-form inneholder mellom 5,0 - 300 milligram av en forbindelse ifølge oppfinnelsen.

Tablettene, pillene, kapslene, pastillene og lignende kan også inneholde én eller flere av følgende adjuvanser: bindemidler slik som mikrokrystallinsk cellulose, gummitragant eller gelatin; eksipienser slik som stivelse eller cellulose, oppbrytende midler slik som alginsyre, 'Primogel", maisstivelse og lignende; smøremidler slik som magnesiumstearat eller 'sterotex^ glidemidler slik som kolloidalt siliciumdioxyd;

og søtningsmidler slik som sukrose eller sakkarin kan tilsettes, eller et smaksgivende middel slik som peppermynte, methylsali-cylat eller appelsinsmak. Når doseringsenhetsformen er en kapsel kan den i tillegg til materialer av den ovenfor angitte type inneholde en væskeformig bærer slik som polyethylenglykol eller en fettolje. Andre doseringsenhetsformer kan inneholde andre forskjellige materialer som modifiserer den fysikalske form av doseringsenheten, for eksempel som belegg. Således kan tabletter eller piller belegges med sukker, skjellakk eller andre enteriske belegningsmidler. En sirup kan i tillegg til foreliggende forbindelser inneholde sukrose som et søtnings-middel og visse konserveringsmidler, fargestoffer og smaksgivende midler. Materialer anvendt ved fremstilling av disse forskjellige preparater kan være farmasøytisk rene og ikke-toksiske i de anvendte mengder.

For parenteral terapeutisk administrering kan forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse inkorporeres i en løsning eller suspensjon. Disse preparater skal inneholde minst 0,1 % av en forbindelse ifølge oppfinnelsen, men kan

i variere til å være mellom 0,1 og ca. 50 % av vekten derav. Mengden av forbindelsen ifølge oppfinnelsen som er til stede

i slike preparater er slik at en egnet dose vil bli erholdt. Foretrukne preparater ifølge foreliggende oppfinnelse fremstilles slik at en parenteral doseringsenhet inneholder mellom 5,0 til 100 milligram av forbindelsen ifølge oppfinnelsen.

Forbindelsene av formel (I) ifølge oppfinnelsen kan også administreres topisk, og når dette foretas kan bæreren hensiktsmessig omfatte en løsning, salve eller gelbase.

Basen kan for eksempel omfatte én eller flere av følgende: petrolatum, lanolin, polyethylenglykoler, bivoks, mineralolje, fortynningsmidler slik som vann og alkohol og emulgeringsmidler og stabilisatorer. Topiske formuleringer kan inneholde en konsentrasjon av en forbindelse av formel (I) eller dens farmasøytiske salt på fra ca. 0,1 til ca. 10 % w/v (vekt pr. enhetsvolum).

Løsningene eller suspensjonene kan også inneholde én ellér flere av de følgende adjuvanser: sterile fortynningsmidler slik som vann for injeksjon, saltvannsløsning, fettoljer, polyethylenglykoler, glyserol, propylenglykol eller andre syntetiske løsningsmidler; antibakterielle midler slik som benzylalkohol eller methylparaben; antioxidanter slik som ascorbinsyre eller natriumbisulfitt; chelaterende midler slik som ethylendiamintetraeddiksyre; buffere slik som aceta-ter, sitrater eller fosfater og midler for justering av tonisi-teten slik som natriumklorid eller dextrose. Det parenterale preparat kan være innelukket i ampuller, éngansssprøyter eller multiple doseampuller fremstilt av glass eller plast.

Aktiviteten av forbindelsene ifølge oppfinnelsen til å inhibere calpain og/eller cathepsin B, og anvendeligheten av forbindelsene av formel (I) når det gjelder å forsinke eller forhindre akutte eller kroniske neurodegenerative sykdommer innbefattende ischemisk slag (trombotisk eller embolisk i opprinnelse), hemoragisk slag og etterfølgende vaskulær femomena, myokardialt infarkt, neurologiske konsekvenser av koronar bypass-og transplantatoperasjoner, hodeskade, Alzheimers sykdom, alderassosiert demens, vaskulær demens, Parkinsons sykdom, amyotropisk lateral sklerose og lignende, kan vises ved vel anerkjente og pålitelige in vitro og in vivo modeller.

In vitro bestemmelse av calpain i nærvær av calpaininhibitorer

Muskel- og erythrocytt- calpain ble utprøvet ved

en fluorometrisk prosedyre under anvendelse av t-Boc-Val-Leu-Lys-7-amido-4-methyl-cumarin som substrat, Sasaki et al.,

J. Biol.Chem. 259, 12489-12494 (1984). Enzymet calpain er kommersielt tilgjengelig og kan benyttes fra Sigma. Prøve-buffere, pH, utprøvningsteknikkene og beregningene av inhibe-ringskonstanten (K^) er lik de som er beskrevet av Mehdi et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 157, 1117-1123 (1988). Tabell 2 oppsummerer evnen av utvalgte forbindelser ifølge oppfinnelsen til å inhibere calpain.

Neurobeskyttelse in vivo med MDL 104. 903 i en modell av fokal cerebral ischemi

Effektiviteten av forbindelsene av formel (I) til å begrense neurologisk skade etter ischemisk slag og/eller til å inhibere calpain in vivo kan vises under anvendelse av aksepterte fokale og globale ischemiske modeller, innbefattende fokal ischemi fremkalt ved permanent tandem okklusjon av midtre cerebrale arterie og ipsilaterale felles halsarterie som illustrert av Hong et al., Stroke 25, 663-669 (1994); fokal ischemi under anvendelse av permanent og/eller reversibel okklusjon av den midtre cerebrale arterie og bilaterale felles halsarterie som beskrevet av Bartus et al., Stroke 25, 2265-2270 (1994); og global ischemi under anvendelse av reversibel okklusjon av den felles halsarterie og/eller vertebrale arterier som beskrevet av Lee et al., Proe. Nati. Acad. Sei. 88, 7233-7237 (1991).

Eksempelvis ble tolv spontant hypertensive hannrotter inndelt i to grupper: en bærer-behandlet gruppe og en calpain-inhibitor-behandlet gruppe (MDL 104.903; 4 x 30 mg/kg kumulative doser). Ischemi ble fremkalt ved permanent tandem-okklusjon av høyre midtre cerebrale arterie og høyre felles halsarterie. Dyrene ble avlivet 24 timer etter kirurgi, og kvantitative målinger av infarktvolumer ble utført under anvendelse av standard histologiske teknikker og kvantitativ bildeanalyse. For rotter gitt 4 x 30 mg/kg I.V. doser via lår-venen ved 2 timers intervaller som startet 5 minutter etter starten av ischemi, ble en 20,5 % reduksjon i infarktvolum observert. Resultatene som viser reduksjoner i cerebralt infarkt og ødem er illustrert i den følgende Tabell 3.

Claims (21)

1. Forbindelse, karakterisert ved formelen: hvori R og Q hver uavhengig er hydrogen, OH, Ci-C^-alkyl, C^-Q,- alkoxy, N02, NH2 eller halogen; Ri °9 R2 er hver uavhengig C^-C^-alkyl; R3 er hydrogen, C^-Ca-alkanoyl, R4 og R5 er hver uavhengig hydrogen, C^-Qj-alkyl eller benzyl; R6 er t-butyloxycarbonyl, carbobenzyloxy, eller hvori Z er N; og B er en gruppe av formel R7 er hydrogen eller methyl; R8 er Cj-C^-alkyl; m er det hele tall null eller én; n er det hele tall null eller én; p er det hele tall null til tre; og q er det hele tall null til tre; og farmasøytisk akseptable salter derav.

2. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved atR1ogR2 hver uavhengig er methyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl eller sek.-butyl og n er det hele tall én.

3. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at R3 er hydrogen.

4. Forbindelse ifølge krav 2, karakterisert ved at R er hydrogen, R4 er hydrogen, R5 er hydrogen og R7 er hydrogen.

5. Forbindelse ifølge krav 4, karakterisert ved at Rj er carbobenzyloxy.

6. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at forbindelsen er [4S-[3(R<*>),4a,5P]]-[1-[[5-hydroxy-4-(fenylmethyl)-3-oxazolidin-yl] carbonyl]-2-methylpropyl]carbaminsyre-fenylmethylester.

7. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at forbindelsen er [4S-[3(R<*>),4a,5p]]-[1-[[5-(acetyloxy)-4-(fenylmethyl)-3-oxazol-idinyl] carbonyl]-2-methylpropyl]carbaminsyre-fenylmethylester.

8. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at forbindelsen er [4S-[3(R<*>),4a,5P]]-3-[3-methyl-l-oxo-2-[[(fenylmethoxy)carbon-yl] amino]butyl]-4-(fenylmethyl)-5-oxazolidinylester-4-morfolincarboxylsyre.

9. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at forbindelsen er [4S-[3(R<*>),4a,53]]-[1-[[5-hydroxy-4-(fenylmethyl)-3-oxazolidin-yl] carbonyl]-2-methylpropyl]methylcarbaminsyre-fenylmethylester.

10. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at forbindelsen er [4S-[4a,5p] ]-5-hydroxy-4-(fenylmethyl)-3-oxazolidincarboxylsyre-fenylmethylester.

11. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at forbindelsen er [4S-[3(R<*>),4a,5p]]-[1-[[5-(butyryloxy)-4-(fenylmethyl)-3-oxa-zolidinyl] carbonyl]-2-methylpropyl]carbaminsyre-fenylmethylester.

12. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at forbindelsen er [4S-[3(R<*>),4a,5p]]-[1-[[5-(propionyloxy)-4-(fenylmethyl)-3-oxazolidinyl]carbonyl]-2-methylpropyl]carbaminsyre-fenylmethylester.

13. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at forbindelsen er [4S-[3(R<*>),4a,5p]]-[1-[[5-(ethylsuccinyloxy)-4-(fenylmethyl)-3-oxazolidinyl]carbonyl]-2-methylpropyl]carbaminsyre-fenylmethylester.

14. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at forbindelsen er [4S-[3(R<*>),4a,5p]]-[1-[[5-(2-ethylhexanoyloxy)-4-(fenylmethyl)-3-oxazolidinyl]carbonyl]-2-methylpropyl]carbaminsyre-fenyl-'t methylester.

15. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at forbindelsen er [4S-[3(R*),4a,5p]]-[1-[[5-(4-methoxyfenyl-acetyloxy)-4-(fenyl-methyl) -3-oxazolidinyl]carbonyl]-2-methylpropyl]carbaminsyre-fenylmethylester .

16. Preparat, karakterisert ved at det omfatter en forbindelse ifølge krav 1 og en bærer.

17. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at omfatter en forbindelse ifølge krav 1 og en farmasøytisk akseptabel bærer.

18. Anvendelse av en forbindelse ifølge hvilke som helst av kravene 1-15, eventuelt i kombinasjon med en farma-søytisk akseptabel bærer, for fremstilling av en calpain og/eller cathepsin B-inhibitor.

19. Anvendelse av en forbindelse ifølge hvilke som helst av kravene 1-15, eventuelt i kombinasjon med en farmasøytisk akseptabel bærer, for fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling av en akutt eller kronisk neurodegenerativ sykdom.

20. Anvendelse av en forbindelse ifølge hvilke som helst av kravene 1-15, eventuelt i kombinasjon med en farmasøytisk akseptabel bærer, for fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling av ischemisk slag.

21. Anvendelse av en forbindelse ifølge hvilke som helst av kravene 1-15, eventuelt i kombinasjon med en farmasøytisk akseptabel bærer, for fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling av hemoragisk slag.