NO20093386L

NO20093386L - Nye kanin antistoff humaniseringsmetoder og humaniserte kanin antistoffer

Info

Publication number: NO20093386L
Application number: NO20093386A
Authority: NO
Inventors: John Latham; Brian Kovacevich
Original assignee: Alder Bioholdings Llc
Priority date: 2007-05-21
Filing date: 2009-11-20
Publication date: 2010-02-18
Also published as: JP5859202B2; JP2010528589A; TW200911826A; WO2008144757A1; TWI501976B; EP2162469A1; CN101868477A; NZ601583A; KR20170036814A; TW200902720A; KR20160005134A; AU2008254578B2; KR20100028571A; US20090104187A1; MX2009012493A; MX343879B; CA2688829A1; AU2008254578A1; IL202232A; NZ581418A

Abstract

Foreliggende oppfinnelse angår nye og forbedrede metoder for humanisering av kanin tunge og lette variable regioner. De resulterende humaniserte kanin tunge og lettkjeder og antistoffer og antistoffragmenter inneholdende disse er velegnete for anvendelse i immunoterapi og immunodiagnose idet de beholder antigen-bindingsaffiniteten til opphavs antistoffet og basert på deres meget høye nivå av sekvensidentitet med humane antistoff- sekvenser skal være i det vesentlige ikke- immunogene i mennesker. Oppfinnelsen eksemplifiserer protokollen for fremstilling av terapeutiske humaniserte anti-humane TNF-alfa og anti-humane IL-6 antistoffer.

Description

BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN

Relaterte Søknader

[0001] Denne søknaden angår og krever prioritet fra provisional application US Serial nr. 60/924,550 og 60/924,551 og utility patentsøknad US Serial nr. 11/802,235 som hver ble innlevert 21.mai 21, 2007 og innholdet som er inntatt ved referanse i deres helhet her. I tillegg krever denne søknaden prioritet fra og inkorporert ved referanse i sin helhet til PCT-søknadene innlevert 21.mai, 2008 betegnet "IL-6 antistoffer og Anvendelse Derav" og TNF-alfa Antistoffer" idet disse PCT-søknadene ble innlevert under Attorney Docket Numbers 67858-701902 og 67858-701802.

Oppfinnelsens område

[0002] Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en ny og forbedret aminosyresekvens-og homologi-basert metode for modifikasjon av (humanisering) kanin antistoff aminosyre variabel tung og lettkjede polypeptidsekvenser eller antistoffer fra nær beslektede arter så som andre lagomorfer. De resulterende modifiserte antistoff-sekvensene er mindre eller ikke-immunogene i mennesker i forhold til opphavs antistoff, f.eks. kanin antistoff og beholder samme eller hovedsakelig samme antigen bindingsaffinitet i forhold til opphavs-antistoffet hvorifra de modifiserte (humaniserte) antistoff-sekvensene er avledet.

[0003] Oppfinnelsen tilveiebringer videre humaniserte variabel lett og variabel tung kjeder avledet fra kanin antistoffer som blir produsert ved slike metoder. Som vist nedenfor, gir metodene i gjeldende oppfinnelse reproduserbart utbytte av humaniserte antistoffer som beholder antigen spesifisiteten og affiniteten til de opprinnelige kanin antistoffer. Prosedyren ifølge foreliggende oppfinnelse bygger generelt på overføring av spesifikke aminosyrerestene ("selektivitetsbestemmende residuene") innbefattet i kanin antistoff komplementaritetsbestemmende regioner (CDR) fra kanin antistoffer på homolog human antistoff variabel tung og lettkjede polypeptidsekvenser.

[0004] Foreliggende oppfinnelse eksemplifiserer i mer spesifikke utførelsesformer humaniserte antistoffer og humaniserte antistoffragmenter og varianter derav som har bindingsspesifisitet til interleukin-6 (IL-6) eller tumornekrosefaktor alfa (nedenfor "TNF-alfa") som ble produsert ved anvendelse av de nye humaniseringsprotokollene gitt her. Imidlertid, skal det forstås at de nye humaniseringsprotokollene gitt her er anvendbare for humanisering av kanin eller andre lagomorfe avledete antistoffer som spesifikt binder til hvilket som helst ønsket antigen. Dette omfatter eksempelvis antistoffer spesifikke for antigener fra infeksiøse midler (virus, bakterier, sopp, parasitter og lignende), allergener, humane antigener så som enzymer, hormoner, autoantigener, vekstfaktorer, cytokiner, reseptorer, reseptor ligander, immunoregulerende og immunomodulerende molekyler, et al.

[0005] Oppfinnelsen angår også metoder for anvendelse av humaniserte antistoff og antistoffragmenter produsert ifølge oppfinnelsen som terapeutiske midler og for diagnostisk formål så som for in vitro og in vivo screeningsforsøk for detektering av sykdommer og lidelser forbundet med slike antigener. For eksempel omfatter dette in vivo avbildning-screeningsmetoder ved anvendelse av antistoffer mot IL-6 eller TNF-alfa og metoder for behandling av sykdommer eller lidelser forbundet med TNF-alfa eller IL-6 ved administrering av nevnte humaniserte antistoffer eller fragmenter derav.

Beskrivelse av Relatert Fagområde

[0006] Antistoffer spiller en vital rolle i våre immunresponser. De kan inaktivere virus og bakterielle toksiner og er essensielle for rekruttering av komplementsystemet og forskjellige typer av hvite blodceller til å drepe invaderende mikroorganismer og store parasitter. Antistoffer blir syntetisert utelukkende av B lymfocytter og blir produsert i millioner av former, hver med en forskjellig aminosyresekvens og et annet bindingssete for et antigen. Antistoffer, kollektivt betegnet immunoglobuliner (lg), er blant de mest hyppig forekommende proteinkomponenter i blodet. Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, 2<nd>ed., 1989, Garland Publishing, Inc.

[0007] Et typisk antistoffer et Y-formet molekyl med to identiske tunge (H) kjeder (hver inneholdende ca. 440 aminosyrer) og to identiske lette (L) kjeder (hver inneholdende ca. 220 aminosyrer). Fire kjeder er holdt sammen med en kombinasjon av ikke-kovalente og kovalente (disulfid) bindinger. Proteolytiske enzymer, så som papain og pepsin, kan splitte et antistoff molekyl i forskjellige karakteristiske fragmenter. Papain gir to separate og identiske Fab-fragmenter, hver med et antigen-bindende sete og et Fc-fragment. Pepsin gir et F(ab')2fragment. Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, 2<nd>ed., 1989, Garland Publishing, Inc.

[0008] Både L og H kjeder har en variabel sekvens ved deres amino-terminale ender, men en konstant sekvens ved deres karboksyl-terminale ender. L kjeder har en konstant region ca. 110 aminosyrer lang og en variabel region med samme størrelse. H kjeder har også en variabel region ca. 110 aminosyrer lang, men den konstante regionen av H kjedene er ca. 330 eller 440 aminosyrer lange, avhengig av klassen av H kjeden. Alberts et al, Molecular Biology of the Cell, 2<nd>ed., 1989, Garland Publishing, Inc. at pp 1019.

[0009] Bare del av den variable regionen deltar direkte i bindingen av antigen. Undersøkelser har vist at variabiliteten i variable regioner av både L og H kjeder er stort sett begrenset til tre små hypervariable regioner (også betegnet de komplementaritets-bestemmende regionene eller CDR) i hver kjede. De gjenværende deler av den variable regionen, kjent som rammeverk regioner (FR), er relativt konstant. Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, 2<nd>ed., 1989, Garland Publishing, Inc. at pp 1019-1020.

[00010] Naturlige immunoglobuliner har blitt anvendt i forsøk, diagnose og, i en mer begrenset grad, terapi. Imidlertid, er slike anvendelser, spesielt i terapi, forhindret av den polyklonale naturen av de naturlige immunoglobuliner. Fremkomst av de monoklonale antistoffene med den definerte spesifisiteten økte mulighetene for terapeutisk anvendelse. Imidlertid, blir de fleste monoklonale antistoffer produsert etter immunisering av en gnager vertsdyr med målproteinet og påfølgende fusjon av en gnager miltcelle som produserer antistoffet av interesse med en gnager myelomcelle. De er, derfor, i det vesentlige gnagerproteiner og er som sådanne naturlige immunogene i mennesker, som oftest gir opphav til en uønsket immunrespons betegnet HAMA (Human Anti-Mus Antistoff) respons.

[00011] Mange grupper har dannet teknikker for å redusere immunogenisiteten av terapeutiske antistoffer. Tradisjonelt blir et humant templat valgt fra graden av homologi med donor antistoffet, dvs. det mest homologe humane antistoffet mot det ikke-humane antistoffet i den variable regionen blir anvendt som templat for humanisering. Begrunnelsen er at rammeverk sekvenser tjener til å holde CDR i deres korrekte romlige orientering for interaksjon med et antigen og at rammeverksresiduene kan noen ganger til og med delta i antigenbinding. Således, hvis de valgte humane rammeverk sekvenser er mest lik sekvensene av donor rammeverkene, vil det maksimere sannsynlighet om at affinitet vil være beholdt i det humaniserte antistoff. Winter (EP nr. 0239400), for eksempel, foreslo dannelse av et humanisert antistoff ved sete-rettet mutagenese ved anvendelse av lange oligonukleotider for å pode tre komplementaritetsbestemmende regioner (CDR1, CDR2 og CDR3) fra hver av de tunge og lettkjede variable regionene. Selv om denne tilnærmingen er vist å virke begrenser den muligheten av valget av den beste humane templaten som understøtter donor CDR.

[00012] Selv om et humanisert antistoff er mindre immunogent enn dens naturlige eller kimære motstykke i et menneske, finner mange grupper at et CDR podet humanisert antistoff kan demonstrere en betydelig redusert bindingsaffinitet (f.eks. Riechmann et al., 1988, Nature 3 32:323-327). For eksempel, har Reichmann og kolleger funnet at overføring av CDR regionene alene ikke var tilstrekkelig for å gi tilfredsstillende antigen bindingsaktivitet i det CDR-podete produktet og at det også var nødvendig å omdanne et serin residue i stilling 27 av den humane sekvensen til det tilsvarende rotten fenylalaninresidue. Disse resultatene indikerte at endringer i residuene av den humane sekvensen utenfor CDR regionene kan være nødvendige for å oppnå effektive antigen bindingsaktivitet. Til tross for dette, var bindingsaffiniteten fortsatt betydelig mindre enn det til det opprinnelige monoklonale antistoffet.

[00013] For eksempel beskrev Queen et al (U.S. Pat. nr. 5,530,101) fremstilling av et humaniserte antistoff som binder til interleukin-2 reseptoren, ved å kombinere CDR av et murint monoklonal (anti-Tac MAb) med human immunoglobulin rammeverk og konstante regioner. De humane rammeverk regioner ble valgt for å maksimere homologin med anti-Tac MAb sekvensen. I tillegg, ble datamaskinmodelering anvendt for å identifisere rammeverk aminosyrerestene som det var sannsynlig at interagerte med CDR eller antigen og mus-aminosyrer ble anvendt i disse stillingene i det humaniserte antistoffet. Det humaniserte anti-Tac antistoffet oppnådd ble angitt å ha affinitet for interleukin-2 reseptoren (p55) av 3x 10"<9>M"<1>, som var fortsatt bare omtrent en-tredjedel av det til murin MAb.

[00014] Andre grupper identifiserte videre stillinger innen rammeverket til variable regioner (dvs. utenfor CDR og strukturelle løkker av de variable regionene) hvor aminosyreidentitetene av residuene kan bidra for å oppnå CDR-podete produkter med tilfredsstillende bindingsaffinitet. Se, f.eks. U.S. Pat. Nos. 6,054,297 og 5,929,212. Fortsatt er det umulig å vite på forhånd hvor effektivt et spesielt CDR podningsarrangement vil være for hvilket som helst gitt antistoff av interesse.

[00015] Leung (U.S. patentsøknad Publikasjon nr. US 2003/0040606) beskriver en rammeverk-patchingmetode hvor den variable regionen av immunoglobulinet er fordelt inn i FRI, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 og FR4 og de individuelle FR sekvensene blir valgt ved den beste homologin mellom det ikke-humane antistoffet og det humane antistofftemplatet. Denne metoden er imidlertid arbeidskrevende og optimale rammeverksregioner kan ikke bli lett identifisert.

[00016] Idet flere terapeutiske antistoffer er blitt utviklet og innehar mere lovende resultater er det viktig å kunne redusere eller eliminere kroppens immunrespons fremkalt av administrert antistoff. Således, gir metoder som muliggjør effektiv og rask konstruksjon av antistoffer å være human-lignende og/eller tillater en reduksjon i arbeid for å humanisere et antistoff store fordeler og medisinsk verdi.

[00017] Siteringer eller omtale av en referanse heri skal ikke bli konstruert som en innrømmelse av at dette er tidligere teknikk for foreliggende oppfinnelse.

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

[00018] Oppfinnelsen er basert, delvis, på en ny humaniseringsstrategi for å produsere humaniserte variable tunge og/eller lette regioner og humaniserte antistoffer eller antistoffragmenter inneholdende slike humaniserte variable tunge og lette regioner avledet fra kanin eller andre lagomorfe antistoffer. Fortrinnsvis er disse kanin eller andre lagomorf avledete antistoffer som blir anvendt for humanisering avledet fra en klonal B cellepopulasjon oppnådd fra immuniserte kaniner.

[00019] Mer spesifikt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en ny humaniseringsstrategi for humaniseringen av antistoff variabel lettkjeder avledet fra kanin eller en annen lagomorf antistoff som er basert på seleksjonen av passende homologe humane lettkjede variable sekvenser og retensjonen av spesifikke selektivitetsbestemmende residuer innbefattet i kanin lettkjede CDR som del av humaniseringsstrategi en.

[00020] "Selektivitetsbestemmende residues" er definert mer detaljert nedenfor, men tilsvarer i det vesentlige de spesifikke aminosyrerestene som er innbefattet i kanin CDR regioner som basert på deres struktur og/eller kjemiske egenskaper sammenlignet med en tilsvarende aminosyrerest innbefattet i et humant kimlinje CDR anvendt for oppnåelse av det humaniserte antistoffet er antatt å ha en betydelig effekt på antigen gjenkjennelse og/eller antigen binding.

[00021] Videre vedrører foreliggende oppfinnelse en ny strategi for humanisering av antistoff variabel tung kjeder avledet fra kanin eller et annet lagomorf antistoff som bygger på seleksjonen av passende homologe tungkjede variable sekvenser og retensjonen av spesifikke selektivitetsbestemmende residuer som del av humaniseringsstrategi en.

[00022] Også mer spesifikt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse nye humaniseringsstrategier for å produsere humaniserte antistoffer og antistoffragmenter omfattende humaniserte variable tung og/eller lettkjeder som er avledet fra kanin eller et annet lagomorf antistoff variabel tung og lettkjede polypeptider.

[00023] Enda mer spesifikt tilveiebringer oppfinnelsen en humaniseringsstrategi for å produsere en humanisert lettkjede antistoff sekvens avledet fra en lagomorf (kanin) lettkjede antistoffsekvens omfattende de følgende trinn: (i) oppnåelse av en kanin lettkjede antistoffsekvens fra et kanin antistoff som spesifikt binder til et ønsket antigen og identifikasjon av amino residuene som dekker begynnelsen av Rammeverk 1 (FRI) til slutten av Rammeverk 3 (FR3) inklusivt; (ii) utførelse av et homologisøk ved anvendelse av nevnte kanin lett antistoff aminosyresekvens som dekker begynnelsen av FRI til slutten av FR3 sekvensen mot et bibliotek inneholdende human lettkjede antistoff variabel sekvenser og identifikasjon av en human lettkjede antistoffsekvens som oppviser vesentlig sekvenshomologi dertil, dvs. som fortrinnsvis har minst 80%-90% identitet dertil og/eller som oppviser den største sekvensidentiteten på aminosyrenivået i forhold til andre humane lettkjede antistoff variabel sekvenser i biblioteket; (iii) identifisering av både kanin og humane lettkjede variabel sekvenser arrangementet og de spesifikke residuene derav som svarer til FRI, FR2, FR3, CDR1, CDR2 regionene og oppstilling av disse adskilte regionene i kaninen og valgte humane antistoff lettkjede ; (iv) konstruering av en DNA eller aminosyresekvens hvor minst aminosyrerestene i CDR1 og CDR2 regionene av den valgte homologe humane lettkjede sekvensen som skiller seg fra de tilsvarende selektivitetsbestemmende residuene i kanin lettkjede CDR1 og CDR2 er substituert med de tilsvarende selektivitetsbestemmende residuene i kanin CDR1 og CDR2 regionene; (v) videre kobling til DNA eller aminosyresekvens oppnådd i trinn (iv) en DNA-sekvens som koder for eller polypeptid inneholdende de tilsvarende aminosyrerestene av kanin CDR3 lettkjede antistoffsekvensen; (vi) videre selektering av human lettkjede rammeverk 4 region (FR4) som er homolog med FR4 innbefattet i kanin lettkjeden og som fortrinnsvis avviker derfra med maksimalt 2-4 aminosyrerestene og kobling av en DNA-sekvens som koder for nevnte humane FR4 eller de tilsvarende amino residuene av nevnte humane FR4 på DNA eller aminosyresekvens oppnådd etter trinn (v); og (vii) syntetisering av en DNA eller aminosyresekvens som koder for eller inneholdende den humaniserte kanin lettkjede sekvensen som er et resultat av trinn (i) til og med (vi).

[00024] Også mer spesifikt tilveiebringer oppfinnelsen en humaniseringsstrategi for å produsere en humanisert tungkjede antistoffsekvens fra en kanin tungkjede antistoffsekvens omfattende de følgende trinn: (i) oppnåelse av en kanin tungkjede antistoffsekvens fra et kanin antistoff som spesifikt binder til et ønsket antigen og identifikasjon av amino residuene som dekker begynnelsen av Rammeverk 1 (FRI) til slutten av Rammeverk 3 (FR3) inklusivt; (ii) utførelse av et homologisøk (f.eks. ved BLAST søking av human kimlinje antistoffsekvens inneholdende biblioteker) ved anvendelse av nevnte kanin tung antistoff aminosyresekvens som dekker begynnelsen av FRI til slutten av FR3 sekvensen og identifikasjon av en human tungkjede antistoffsekvens som er homolog dertil, dvs. som fortrinnsvis har minst 80%-90% identitet dermed på aminosyrenivået og/eller som oppviser den største sekvensidentiteten på aminosyrenivået i forhold til andre humane tungkjede antistoff variable sekvenser i biblioteket; (iii) identifisering i både kanin og humane tungkjede sekvenser arrangementet av og de spesifikke residuene derav som svarer til FRI, FR2, FR3, CDR1, CDR2 regioner og oppstilling av disse adskilte regioner av kaninet mot de tilsvarende regioner av den valgte homologe humane antistoff tungkj eden; (iv) konstruering av en DNA eller aminosyresekvens hvor minst aminosyrerestene i CDR1 og CDR2 regionene av den valgte homologe humane tungkjede sekvensen som skiller seg fra de tilsvarende selektivitetsbestemmende residuene i kanin tungkjede CDR1 og CDR2 regioner er substituert med de tilsvarende selektivitetsbestemmende residuene innbefattet i CDR1 og CDR2 regionene av kanin tungkjede sekvensen og videre eventuelt erstatning av de terminale 1-3 aminosyrene av den humane tung FRI regionen med de tilsvarende terminale 1-3 aminosyrene av kanin tungkj eden FRI; og/eller eventuelt erstatning av den terminale aminosyren av den humane tungkjede rammeverk 2 regionen med den tilsvarende terminale aminosyreresten av kanin tungkjede rammeverk 2 og/eller eventuelt erstatning av den fjerde aminosyren fra terminusen av kanin tungkjede CDR2 (typisk en tryptofan) med det tilsvarende humane CDR2 residuet (typisk en serin); (v) videre kobling til DNA eller aminosyresekvensen oppnådd i trinn (iv) en DNA-sekvens som koder for eller som har de tilsvarende aminosyrerestene av kanin tungkjede CDR3 som er innbefattet i samme kanin tungkjede antistoffsekvens; og idet kanin CDR3 er typisk 5-19 aminosyrer i lengde (og hvor nevnte CDR3 typisk går foran residuene WGXG og videre hvor X er typisk Q eller P); (vi) videre selektering av en human tungkjede rammeverk 4 region (FR4) som er homolog dertil (fortrinnsvis skiller seg fra FR4 innbefattet i den humaniserte kanin antistoff tungkjede sekvensen med maksimalt 4 aminosyrerester) og kobling av en DNA-sekvens som koder for nevnte valgte homologe humane FR4 eller de tilsvarende amino residuene av nevnte humane FR4 på DNA eller aminosyresekvensen oppnådd etter trinn (v) (ofte vil dette humane FR4 DNA eller polypeptidsekvensen kode for eller omfatte WGQGTLVTVSS); og (vii) syntetisering av et DNA eller aminosyresekvens som koder for eller inneholder den humaniserte kanin tungkjede sekvensen som er et resultat av trinn (i) til og med (vi).

[00025] Også mer spesifikt tilveiebringer oppfinnelsen en humaniseringsstrategi for å produsere et humanisert antistoff eller antistoffragment inneholdende minst én humanisert lettkjede antistoffsekvens avledet fra en kanin lettkjede antistoffsekvens og/eller minst én humanisert tungkjede sekvens avledet fra en kanin antistoff tungkjede hvor slike humaniserte lett og/eller tungkjede sekvenser er avledet fra kanin tunge og lette kjeder i henhold til de følgende trinn: (i) oppnåelse av en kanin lettkjede antistoffsekvens fra et kanin antistoff spesifikk for et ønsket antigen og identifikasjon av aminoresiduene som dekker begynnelsen av Rammeverk 1 (FRI) til slutten av Rammeverk 3 (FR3) inklusivt; (ii) utførelse av et homologisøk ved anvendelse av nevnte kanin lett antistoff aminosyresekvens som dekker begynnelsen av FRI til slutten av FR3 sekvensen mot et bibliotek inneholdende humane lettkjede antistoff-sekvenser og identifikasjon av en human lettkjede antistoffsekvens som er homolog dertil, dvs. som fortrinnsvis har minst 80%-90% identitet dermed på aminosyrenivået og/eller som oppviser den største sekvensidentiteten på aminosyrenivået i forhold til andre humane lettkjede antistoff variable sekvenser i biblioteket; (iii) identifisering i både kanin og humane lettkjede sekvenser arrangementet av og de spesifikke residuene derav som svarer til FRI, FR2, FR3, CDR1, CDR2 regioner og oppstilling av disse adskilte regioner av kanin lettkjede med de tilsvarende regioner av den valgte homologe humane lettkjede regionen; (iv) konstruering av en DNA eller aminosyresekvens hvor minst aminosyrerestene i CDR1 og CDR2 regionene av den valgte homologe humane lettkjede sekvensen som skiller seg fra de tilsvarende selektivitetsbestemmende residuene i kanin variabel lettkjede CDR1 og CDR2 regionene er substituert med de tilsvarende selektivitetsaminosyrerestene i kanin CDR1 og CDR2 regionene av kanin lettkjede sekvensen; (v) videre kobling til DNA eller aminosyresekvensen oppnådd i trinn (iv) en DNA-sekvens som koder for eller som har de tilsvarende aminosyrerestene av CDR3

innbefattet i kanin lettkjede antistoffsekvensen;

(vi) videre selektering av human lettkjede rammeverk 4 region (FR4) som er homolog med FR4 innbefattet i nevnte kanin antistoff lettkjede og hvor human FR4 fortrinnsvis skiller seg fra FR4 av kanin antistoff lettkjede sekvens ved maksimalt 2-4 aminosyrerestene og kobling av en DNA-sekvens som koder for nevnte humane FR4 eller de tilsvarende aminoresiduene av nevnte humane FR4 på DNA eller

aminosyresekvens oppnådd etter trinn (v); og

(vii) syntetisering av en DNA eller aminosyresekvens som koder for eller inneholdende den humaniserte kanin lettkjede sekvensen som er et resultat av trinn (i) til og med (vi); og/eller videre produsere en humanisert tungkjede antistoffsekvens fra en kanin tungkjede antistoffsekvens omfattende de følgende trinn: (i) oppnåelse av en kanin tungkjede antistoffsekvens fra et kanin antistoff spesifikt for et ønsket antigen og identifikasjon av aminoresiduene som dekker begynnelsen av Rammeverk 1 (FRI) til slutten av Rammeverk 3 (FR3) inklusivt; (ii) utførelse av et homologisøk f.eks. ved BLAST søking av human kimlinje antistoffsekvens inneholdende biblioteker ved anvendelse av nevnte kanin tung antistoff aminosyresekvens som dekker begynnelsen av FRI til slutten av FR3 sekvensen og identifikasjon av en human tungkjede antistoffsekvens som har minst 85%-90% identitet dermed på aminosyrenivået og/eller som oppviser den største sekvensidentiteten på aminosyrenivået i forhold til andre humane tungkjede antistoff variable sekvenser innbefattet i biblioteket; (iii) identifisering i både kanin og humane tungkjede sekvenser arrangementet av og de spesifikke residuene derav som svarer til FRI, FR2, FR3, CDR1, CDR2 regioner og oppstilling av disse adskilte regioner av kanin antistoffet mot den valgte homologe humane tungkj eden; (iv) konstruering av en DNA eller aminosyresekvens hvor minst aminosyrerestene innbefattet i CDR1 og CDR2 regionene av den valgte homologe humane tungkjede sekvensen som skiller seg fra de tilsvarende selektivitetsbestemmende residuene i kanin variabel tungkjede CDR1 og CDR2 regionene er substituert med de tilsvarende selektivitetsbestemmende residuene av CDR1 og CDR2 regionene av kanin tungkjede sekvensen og/eller eventuelt erstatning av de endelige 1-3 aminosyrer av den humane tunge FRI regionen med terminale 1-3 aminosyrer av kanin tungkjede FRI; og/eller eventuelt erstatning av den terminale aminosyren av den humane tungkjede rammeverk 2 regionen med terminale aminosyrerest av kanin tungkjede rammeverk 2; og/eller videre eventuelt erstatning av fjerde aminosyre fra terminusen av kanin tungkjede CDR2 (typisk en tryptofan) med den

tilsvarende human CDR2 residue (typisk en serin);

(v) videre kobling til DNA eller aminosyresekvens oppnådd i trinn (iv) en DNA-sekvens som koder for eller de tilsvarende aminosyrerestene av kanin tungkjede CDR3 innbefattet i samme kanin tungkjede antistoffsekvens; (som CDR3 er typisk

5-19 aminosyrer i lengde) (og som CDR3 videre typisk går foran WGXG);

(vi) videre selektering av human tungkjede rammeverk 4 region (FR4) som er homolog dertil (dvs. at de fortrinnsvis skiller seg fra FR4 innbefattet i den humaniserte kanin antistoffet tungkjede sekvensen med maksimalt 2-4 aminosyrerester) og kobling av en DNA-sekvens som koder for nevnte valgte homologe humane FR4 eller de tilsvarende aminoresiduene av nevnte humane FR4 på DNA eller aminosyresekvensen oppnådd etter trinn (v) (typisk det humane FR4

DNA eller polypeptidsekvensen vil kode for eller omfatte WGQGTLVTVSS); og (vii) syntetisering av en DNA eller aminosyresekvens som koder for eller inneholdende den humaniserte kanin tungkjede sekvensen som er et resultat av trinn (i) til og med (vi);

og ved anvendelse av nevnte syntetiserte humaniserte tung og lettkjede DNA eller aminosyresekvenser produsert som angitt ovenfor for å produsere et humanisert

antistoff eller fragment eller DNA-sekvenser kodende derav inneholdende minst én humanisert kanin lettkjede og/eller minst én humanisert kanin tungkjede.

[00026] Oppfinnelsen tilveiebringer også nye og forbedrete humaniserte antistoff tunge og lette kjeder og antistoffer omfattende nevnte humaniserte tunge og lette kjeder produsert av gjeldende humaniseringsmetoder og anvendelse derav i terapi og diagnostiske metoder.

[00027] Spesielt tilveiebringer oppfinnelsen humaniserte antistoff lettkjeder som inneholder de følgende: (i) aminosyrerestene som dekker den første residue av FRI til og med terminusen av FR3 omfattende CDR1 og CDR2 regionene av en human lettkjede kimlinje sekvens som er valgt fra et bibliotek av humane kimlinjesekvenser basert på dens større homologi (sekvensidentitet) på aminosyrenivået til aminosyrerestene som dekker FRI til og med FR3 (fortrinnsvis sekvensen som har størst prosent sekvensidentitet på aminosyrenivået i forhold til nevnte region i kanin variabel lettkjeden som dekker FRI til og med FR3 relaivt til de andre humane lettkjede kimlinjesekvenser i biblioteket) til de tilsvarende aminosyrerestene av lettkjeden av et opphavs-kanin antistoff som har spesifisitet til et ønsket antigen som skal humaniseres og (ii) videre hvor CDR residuene i CDR1 og CDR2 svarende til "selektivitetsbestemmende residuene" i lettkjeden av samme opphavskanin antistoffet blir erstattet med de tilsvarende kanin selektivitetsbestemmende residuene; (iii) aminosyrerestene omfattende hele CDR3 regionen av samme opphavskanin antistoffet; (iv) aminosyrerestene omfattende hele FR4 regionen av et antistoff lettkjede avledet fra et bibliotek av humane kimlinjesekvenser basert på dens større homologi (sekvensidentitet) til den tilsvarende FR4 regionen innbefattet i lettkjeden av samme opphavskanin antistoffet; og (v) videre hvor få eller ingen av FR residuene av de humane FRI, FR2, FR3 og FR4 regionene i de valgte homologe humane FR regioner er substituert med de tilsvarende kanin FR residuene (dvs. residuene til stede i det tilsvarende sete(er) i opphavs kanin lettkjede antistoffsekvens som blir humanisert).

[00028] I tillegg tilveiebringer oppfinnelsen humaniserte antistoff tungkjede polypeptider som inneholder minst de følgende (i) aminosyrerestene som dekker den første residue av FRI til og med terminusen av FR3 omfattende CDR1 og CDR2 regionene av en human kimlinje sekvens som er valgt fra et bibliotek av humane kimlinjesekvenser basert på dens større homologi (prosent sekvensidentitet på aminosyrenivået) av de valgte aminosyrerestene som dekker FRI til og med FR3 (i forhold til andre humane kimlinjesekvenser i biblioteket) til de tilsvarende aminosyrerestene av tungkj eden av et opphavs-kanin antistoff som har spesifisitet til et ønsket antigen som skal humaniseres og (ii) videre hvor CDR residuene i CDR1 og CDR2 regionene av den humane tungkj eden svarende til "selektivitetsbestemmende residuene" i CDR1 og CDR2 regionene av tungkj eden av samme opphavskanin antistoffet blir erstattet med de tilsvarende tungkjede selektivitetsbestemmende residuene innbefattet i CDR1 og CDR2 regionene av kanin tungkj eden; (iii) aminosyrerestene omfattende hele CDR3 regionen av samme opphavskanin antistoffet; (iv) FR4 regionen avledet fra et bibliotek av humane kimlinjesekvenser basert på dens større homologi (sekvensidentiteten) til den tilsvarende FR4 regionen innbefattet i tungkj eden av samme opphavskanin antistoffet; og (v) hvor de endelige 1-3 aminosyrer av den humane tunge FRI regionen eventuelt blir erstattet med terminale 1-3 aminosyrer av de tilsvarende kanin tungkjede FRI residuene; og/eller terminal aminosyre av den humane tungkjede rammeverk 2 regionen eventuelt blir erstattet med den tilsvarende terminale aminosyreresten av kanin tungkjede rammeverk 2; og/eller fjerde aminosyre fra terminusen av kanin tungkjede CDR2 (typisk en tryptofan) eventuelt blir erstattet med den tilsvarende humane CDR2 residue (typisk en serin); og (vi) hvor få eller ingen av de gjenværende FR residuene av de valgte homologe humane FR regioner er substituert med de tilsvarende kanin FR residuene (dvs. FR residuene til stede ved tilsvarende sete(er) i kanin antistoff tungkj eden som blir humanisert).

[00029] Videre tilveiebringer oppfinnelsen nye og forbedrete humaniserte antistoffer inneholdende foregående humaniserte tunge og lettkjede polypeptider og nukleinsyresekvenser som koder for nevnte humaniserte tung og lettkjede polypeptider og humaniserte antistoffer inneholdende nevnte humanisert tung og lettkjeder så vel som vektorer og vertsceller inneholdende nevnte vektorer og nukleinsyresekvenser og anvendelse derav i terapeutiske og diagnostiske metoder og preparater.

[00030] Oppfinnelsen vedrører videre koblling av nevnte humanisert tung eller lettkjede DNA eller polypeptid(er) eller til en DNA eller polypeptidsekvens inneholdende eller som koder for en ønsket antistoff konstant domene, fortrinnsvis et humant antistoff konstant domene og/eller binding (direkte eller indirekte) ved karboksy eller amino terminusen av antistoff polypeptidet eller nukleinsyresekvensen til en ønsket effektorgruppe f.eks. toksiner, medikamenter, radionuklider, fluoroforer, enzymer, cytokiner eller translokering av sekvenser så som signalpeptider og polypeptider for å lette affinitetsisolering.

Kort oppsummering av oppfinnelsen

[00031] Som beskrevet tilveiebringer oppfinnelsen nye og forbedrede metoder for å oppnå humaniserte variable lette og variable tunge kjeder avledet fra kanin antistoffer og humaniserte tung og/eller lettkjede polypeptider og DNAs kodende derfor produsert ved slike metoder. Metodene av foreliggende oppfinnelse gir reproduserbart utbytte av humaniserte antistoffer som bør være hovedsakelig ikke-immunogene i mennesker og som beholder antigen spesifisitet og hovedsakelig eller fullstendig bindingsaffiniteten av opphavskanin antistoffene. Den oppfinneriske prosedyren er generelt basert på overføring av spesifikke aminosyrerester fra donorkanin antistoffer (spesielt selektivitetsbestemmende residuene som er antagligvis instrumentale i antigengjenkjennelse og binding og om nødvendig noen få antall av rammeverksresiduene) på homolog akseptor human antistoff variabel tung og lettkjede sekvenser.

[00032] Mer spesifikt angår foreliggende oppfinnelse en ny humaniseringsstrategi for humanisering av antistoff variable lettkjeder avledet fra kanin antistoffer som inkorporerer et diskret antall av kanin lettkjede CDR residuene referert til her som "selektivitetsbestemmende residuer" og eventuelt noen eller meget få rammeverksresiduer på homologe humane antistoff lettkjede sekvenser.

[00033] Videre vedrører foreliggende oppfinnelse en ny strategi for humanisering av antistoff variable tunge kjeder avledet fra kanin antistoffer som inkorporerer ingen eller meget få adskilte antall av kanin CDR på homologe humane tungkjede sekvenser.

[00034] Ytterligere mer spesifikt angår foreliggende oppfinnelse nye og forbedrete humanisering av strategier for å produsere humaniserte antistoffer og humaniserte antistoffragmenter omfattende humaniserte variabel tung og/eller lettkjeder som er avledet fra kanin antistoff variabel tung og lettkjede polypeptider og passende homologe humane antistoff variabel tung og lettkjede polypeptider slik at minst spesifikke residuer innbefattet i den humane tung og lettkjede CDR som skiller seg fra de tilsvarende selektivitetsbestemmende residuene i kanin tung og lettkjede CDR (selektivitetsbestemmende residuene) er beholdt i de humaniserte tung og/eller lettkjede regioner og hvor meget få eller ingen av rammeverksresiduene i den humane lettkjeden og meget få av rammeverksresiduene i den humane tungkj eden er substituert med de tilsvarende kanin rammeverksresiduene.

[00035] Fortsatt mer spesifikt angår oppfinnelsen en humaniseringsstrategi for å produsere en humanisert lettkjede antistoffsekvens avledet fra en donor kanin lettkjede antistoffsekvens og akseptor human lettkjede antistoffsekvens omfattende de følgende trinn: (i) oppnåelse av en kanin lettkjede antistoffsekvens fra et kanin antistoff som spesifikt binder til et ønsket antigen og identifikasjon av aminoresiduene som dekker begynnelsen av Rammeverk 1 (FRI) til slutten av Rammeverk 3 (FR3) inklusivt; (ii) utførelse av et homologisøk ved anvendelse av nevnte kanin lett antistoff aminosyresekvens som dekker begynnelsen av FRI til slutten av FR3 sekvensen mot et bibliotek inneholdende humane lettkjede antistoff-sekvenser og identifikasjon av en human lettkjede antistoffsekvens som oppviser vesentlig sekvenshomologi dertil, dvs. som fortrinnsvis har minst 80%-90% identitet dertil på aminosyrenivået og/eller som fortrinnsvis har høyest prosent sekvensidentitet på aminosyrenivået i forhold til andre sekvenser i biblioteket inneholdende humane

lettkjede antistoff-sekvenser;

(iii) identifisering i både kanin og humane lettkjede sekvenser orienteringen av og de spesifikke residuene derav som svarer til FRI, FR2, FR3, CDR1, CDR2 regionene og oppstilling av disse adskilte regioner i kanin og valgte humane antistoff

lettkjede;

(iv) konstruering av en DNA eller aminosyresekvens hvor minst residuene i CDR1 og CDR2 regionene av den valgte homologe humane lettkjede sekvensen som skiller seg fra de tilsvarende selektivitetsbestemmende residuene innbefattet i kanin lettkjede CDR1 og CDR2 regionene er substituert med de tilsvarende selektivitetsbestemmende residuene innbefattet i CDR1 og CDR2 regionene av

kanin lettkjede sekvensen;

(v) videre kobling til DNA eller aminosyresekvensen oppnådd i trinn (iv) en DNA-sekvens som koder for eller polypeptid inneholdende de tilsvarende

aminosyrerestene av kanin CDR3 lettkjede antistoffsekvensen;

(vi) videre selektering av human lettkjede rammeverk 4 region (FR4) som er homolog med FR4 innbefattet i kanin lettkjeden og som fortrinnsvis avviker derifra ved maksimalt 2-4 av aminosyrerestene og kobling av en DNA-sekvens som koder for nevnte humane FR4 eller de tilsvarende aminoresiduene av nevnte humane FR4 på

DNA eller aminosyresekvensen oppnådd etter trinn (v); og

(vii) syntetisering av en DNA eller aminosyresekvens som koder for eller inneholder den humaniserte kanin lettkjede sekvensen som er et resultat av trinn (i) til og med (vi).

[00036] Også mer spesifikt tilveiebringer oppfinnelsen en humaniseringsstrategi for å produsere en humanisert tungkjede antistoffsekvens fra en kanin tungkjede antistoffsekvens omfattende de følgende trinn: (i) oppnåelse av en kanin tungkjede antistoffsekvens fra et kanin antistoff som spesifikt bindes til et ønsket antigen og identifikasjon av aminoresiduene som dekker begynnelsen av Rammeverk 1 (FRI) til slutten av Rammeverk 3 (FR3) inklusivt; (ii) utførelse av et homologisøk (f.eks. ved BLAST søking av human kimlinje antistoffsekvens inneholdende biblioteker) ved anvendelse av nevnte kanin tung antistoff aminosyresekvens som dekker begynnelsen av FRI til slutten av FR3 sekvensen og identifikasjon av en human tungkjede antistoffsekvens som er homolog dertil, dvs. som fortrinnsvis har minst 85%-90% identitet dermed på aminosyrenivået og/eller som fortrinnsvis har høyest prosent sekvensidentitet på aminosyrenivået i forhold til andre sekvenser i biblioteket inneholdende humane tungkjede antistoff-sekvenser; (iii) identifisering i både kanin og humane lettkjede sekvenser residuene derav som svarer til FRI, FR2, FR3, CDR1, CDR2 regionene og oppstilling av disse adskilte regioner av kanin mot de tilsvarende regioner av den valgte homologe humane antistoff tungkj eden; (iv) konstruering av en DNA eller aminosyresekvens hvor minst aminosyrerestene innbefattet i CDR1 og CDR2 regionene av den valgte homologe humane tungkjede sekvensen som skiller seg fra de tilsvarende selektivitetsbestemmende residuene i CDR1 og CDR2 regionene av kanin tungkjede sekvensen er substituert med de tilsvarende selektivitetsbestemmende residuene innbefattet i CDR1 og CDR2 regionene av kanin tungkjede sekvensen og eventuelt erstatning av de terminale 1-3 aminosyrene av den humane tunge FRI regionen med de tilsvarende terminale 1-3 aminosyrene av kanin tungkjede FRI; og/eller eventuelt erstatning av den

terminale aminosyren av den humane tungkjede rammeverk 2 regionen med den tilsvarende terminale aminosyreresten av kanin tungkjede rammeverk 2 og/eller

eventuelt erstatning av fjerde aminosyre fra terminusen av kanin tungkjede CDR2 (typisk en tryptofan) med den tilsvarende humane CDR2 residue (typisk en serin); (v) videre kobling til DNA eller aminosyresekvensen oppnådd i trinn (iv) en DNA-sekvens som koder for eller som har de tilsvarende aminosyrerestene av kanin tungkjede CDR3 som er innbefattet i samme kanin tungkjede antistoffsekvens; og hvor kanin CDR3 er typisk 5-19 aminosyrer i lengde (denne CDR3 går typisk foran residuene WGXG); (vi) videre selektering av human tungkjede rammeverk 4 region (FR4) som er homolog dertil (fortrinnsvis skiller seg fra FR4 innbefattet i den humaniserte kanin antistoff tungkjede sekvensen med maksimalt 1-4 aminosyrerester) og kobling av en DNA-sekvens som koder for nevnte valgte homologe humane FR4 eller de tilsvarende aminoresiduene av nevnte humane FR4 på DNA eller aminosyresekvensen oppnådd etter trinn (v) (ofte vil denne humane FR4 DNA eller polypeptidsekvens kode for eller omfatte WGQGTLVTVSS); og (vii) syntetisering av en DNA eller aminosyresekvens som koder for eller inneholdende den humaniserte kanin tungkjede sekvensen som er et resultat av trinn (i) til og med (vi).

[00037] Også mer spesifikt tilveiebringer oppfinnelsen en humaniseringsstrategi for å produsere et humanisert antistoff eller antistoffragment inneholdende minst én humanisert lettkjede antistoffsekvens avledet fra en kanin lettkjede antistoffsekvens og/eller minst én humanisert tungkjede sekvens avledet fra en kanin antistoff tungkjede hvor slike humaniserte lett og tungkjede sekvenser er avledet fra kanin tung og lettkjeder i henhold til de følgende trinn: (i) oppnåelse av en kanin lettkjede antistoffsekvens fra et kanin antistoff spesifikt for et ønsket antigen og identifikasjon av aminoresiduene som dekker begynnelsen av Rammeverk 1 (FRI) til slutten av Rammeverk 3 (FR3) inklusivt; (ii) utførelse av et homologisøk ved anvendelse av nevnte kanin lett antistoff aminosyresekvens som dekker begynnelsen av FRI til slutten av FR3 sekvensen mot et bibliotek inneholdende humane lettkjede antistoff-sekvenser og identifikasjon av en human lettkjede antistoffsekvens som er homolog dertil, dvs. som fortrinnsvis har minst 80%-90% identitet dermed på aminosyrenivået og/eller som fortrinnsvis har høyest prosent sekvensidentitet på aminosyrenivået i forhold

til andre sekvenser i biblioteket inneholdende humane lettkjede antistoff-sekvenser;

(iii) identifisering i både kanin og humane lettkjede sekvenser orienteringen av og de spesifikke residuene derav som svarer til FRI, FR2, FR3, CDR1, CDR2 regionene og oppstilling av disse adskilte regioner av kanin lettkjeden med de tilsvarende

regioner av den valgte homologe humane lettkjede regionen;

(iv) konstruering av en DNA eller aminosyresekvens hvor minst residuene innbefattet i CDR1 og CDR2 regionene av den valgte homologe humane lettkjede sekvensen som skiller seg fra de tilsvarende selektivitetsbestemmende residuene innbefattet i CDR1 og CDR2 regionene av kanin er substituert med de tilsvarende CDR1 og

CDR2 regionene av kanin lettkjede sekvensen;

(v) videre kobling til DNA eller aminosyresekvensen oppnådd i trinn (iv) en DNA-sekvens som koder for eller som har de tilsvarende aminosyrerestene av CDR3 innbefattet i kanin lettkjede antistoffsekvensen (dette CDR3 omfatter typisk 9-15

aminosyrerestene og går ofte foran FGGG residuene);

(vi) videre selektering av human lettkjede rammeverk 4 region (FR4) som er homolog med FR4 innbefattet i nevnte kanin antistoff lettkjeden og idet human FR4 fortrinnsvis skiller seg fra FR4 av kanin antistoffet lettkjede sekvensen med maksimalt 2-4 aminosyrerester og kobling av en DNA-sekvens som koder for nevnte humane FR4 eller de tilsvarende aminoresiduene av nevnte humane FR4 på

DNA eller aminosyresekvensen oppnådd etter trinn (v); og

(vii) syntetisering av en DNA eller aminosyresekvens som koder for eller inneholder den humaniserte kanin lettkjede sekvensen som er et resultat av trinn (i) til og med (vi); og/eller videre produsere en humanisert tungkjede antistoffsekvens fra en kanin tungkjede antistoffsekvens omfattende de følgende trinn: (i) oppnåelse av en kanin tungkjede antistoffsekvens fra et kanin antistoff spesifikt for et ønsket antigen og identifikasjon av aminoresiduene som dekker begynnelsen av Rammeverk 1 (FRI) til slutten av Rammeverk 3 (FR3) inklusivt; (ii) utførelse av et homologisøk f.eks. ved BLAST søking av human kimlinje antistoffsekvens inneholdende biblioteker ved anvendelse av nevnte kanin tung antistoff aminosyresekvens som dekker begynnelsen av FRI til slutten av FR3 sekvensen og identifikasjon av en human tungkjede antistoffsekvens som har minst 80%-90% identitet dermed på aminosyrenivået og/eller fortrinnsvis høyest prosent sekvensidentitet på aminosyrenivået i forhold til andre sekvenser i biblioteket inneholdende humane tungkjede antistoff-sekvenser; (iii) identifisering i både kanin og humane tungkjede sekvenser residuene derav som svarer til FRI, FR2, FR3, CDR1, CDR2 regioner og oppstilling av disse adskilte regioner av kanin antistoffet mot den valgte homologe humane tungkj eden; (iv) konstruering av en DNA eller aminosyresekvens hvor minst residuene innbefattet i CDR1 og CDR2 regionene av den valgte homologe humane tungkjede sekvensen som skiller seg fra de tilsvarende selektivitetsbestemmende residuene innbefattet i kanin tungkjede CDR1 og CDR2 regionene er substituert med de tilsvarende CDR1 og CDR2 regionene av kanin tungkjede sekvensen og/eller eventuelt erstatning av de endelige 1-3 aminosyrer av den humane tunge FRI regionen med terminale 1-3 aminosyrer av kanin tungkjede FRI; og/eller eventuelt erstatning av den terminale aminosyren av den humane tungkjede rammeverk 2 regionen med den terminale aminosyreresten av kanin tungkjede rammeverk 2; og/eller videre eventuelt erstatning av den fjerde aminosyren fra terminusen av kanin tungkjede CDR2 (typisk en tryptofan) med det tilsvarende humane CDR2 residue (typisk en serin); (v) videre kobling til DNA eller aminosyresekvensen oppnådd i trinn (iv) en DNA-sekvens som koder for eller de tilsvarende aminosyrerestene av kanin tungkjeden CDR3 innbefattet i samme kanin tungkjede antistoffsekvens; (som CDR3 er typisk 5-19 aminosyrer i lengde og typisk går foran (precedes)WGXG) (vi) videre selektering av human tungkjede rammeverk 4 regionen (FR4) som er homolog dertil (dvs. fortrinnsvis skiller seg fra FR4 innbefattet i det humaniserte kanin antistoffet tungkjede sekvensen med maksimalt 2-4 aminosyrerestene) og kobling av en DNA-sekvens som koder for nevnte valgt homolog human FR4 eller de tilsvarende aminoresiduene av nevnte humane FR4 på DNA eller aminosyresekvens oppnådd etter trinn (v) (ofte vil det humane FR4 DNA eller polypeptidsekvens kode for eller omfatte WGQGTLVTVSS); og (vii) syntetisering av en DNA eller aminosyresekvens som koder for eller inneholdende den humaniserte kanin tungkjede sekvens som er et resultat av trinn (i) til og med (vi); og produserende en nukleinsyresekvens eller polypeptid inneholdende minst én av nevnte humaniserte lettkjeder og tung kjeder; og

syntetisering av et DNA som koder for et humanisert antistoff eller et antistoffragment eller et polypeptid omfattende et humanisert antistoff eller et antistoffragment som inneholder en DNA som koder for eller polypeptid inneholdende minst humanisert lettkjede sekvens og/eller minst én humanisert tungkjede produsert i henhold til foregående trinn.

[00038] Oppfinnelsen vedrører videre kobling av nevnte humaniserte antistoff DNA eller polypeptider til ønsket konstante domener, fortrinnsvis humane konstante domener og/eller binding (direkte eller indirekte) til karboksy eller aminoterminusen til ønsket effektorgrupper f.eks. toksiner, medikamenter, radionuklider, fluoroforer, enzymer, cytokiner, translokering sekvenser så som signalpeptider og polypeptider som letter affinitetsisolering.

[00039] Oppfinnelsen angår i mere spesifikke utførelsesformer spesifikke humaniserte antistoffer og fragmenter derav som har bindingsspesifisitet for TNF-alfa eller IL-6 spesielt humaniserte antistoffer som har spesifikk epitope spesifisitet og/eller funksjonelle egenskaper.

[00040] En utførelsesform ifølge oppfinnelsen omfatter spesifikke humaniserte antistoffer og fragmenter derav i stand til å binde til IL-6 eller TNF-alfa og/eller TNF-alfa/TNFR eller IL-6/IL-6R kompleks.

[00041] En annen utførelsesform av oppfinnelsen angår de humaniserte antistoffer som har bindingsaffiniteter (Kds) mindre enn 50 pikomolar og/eller K0ffverdier mindre enn eller lik lO^S"1.

[00042] I foretrukne utførelsesformer ifølge oppfinnelsen vil disse humaniserte antistoffene og humaniserte antistoffragmentene og versjonene være avledet fra kaninimmunceller (B lymfocytter) eller mindre foretrukne hybridomer som utskiller kaninantistoffer spesifikke for et ønsket antigen. I tillegg kan kanin antistoffer anvendt for humanisering videre bli valgt basert på deres homologi (sekvensidentitet) med humane kimlinje antistoff-sekvenser. Disse antistoffene kan videre lette opprettholdelsen av funksjonelle egenskaper etter humanisering siden mindre aminosyrer blir modifisert ved anvendelse av gjeldende humaniseringsmetoder.

[00043] En ytterligere utførelsesform ifølge oppfinnelsen angår humaniserte antistoffragmenter produsert ifølge oppfinnelsen f.eks. spesifikke for IL-6 eller TNF-alfa . inneholdende humaniserte Vh, Vlog CDR polypeptider produsert ifølge oppfinnelsen, f.eks. avledet fra antistoffer utskilt av kaninimmunceller og polynukleotidene som koder for disse, så vel som anvendelse av disse antistoffragmenter og polynukleotidene som koder for dem ved dannelsen av de nye antistoffene og polypeptidpreparatene som er i stand til å gjenkjenne ønskete antigener så som IL-6, TNF-alfa og/eller TNF-alfa/TNFR eller IL-6/IL-6R komplekser.

[00044] Oppfinnelsen betrakter også konjugater av gjeldende humaniserte kanin antistoffer og fragmenter, f.eks. humaniserte anti-TNF-alfa eller anti-IL-6 antistoffer og bindingsfragmenter derav konjugert til én eller flere funksjonelle eller detekterbare grupper. Oppfinnelsen betrakter også metoder for dannelse av nevnte humaniserte anti-TNF-alfa, IL-6 eller anti-TNF-alfa/TNFR eller anti-IL-6/IL-6R kompleks antistoffer og bindingsfragmenter derav. I én utførelsesform, omfatter bindingsfragmenter, men er ikke begrenset til, humaniserte Fab, Fab', F(ab')2, Fv og scFv fragmenter.

[00045] Utførelsesformer ifølge oppfinnelsen vedrører videre anvendelse av gjeldende humaniserte antistoffer spesifikke for et ønsket antigen, f.eks. humaniserte anti-TNF-alfa eller anti-IL-6 antistoffer for diagnose, vurdering og behandling av sykdommer og lidelser forbundet med det spesielle antiget. f.eks. TNF-alfa, IL-6 eller avvikende ekspresjon derav. Oppfinnelsen betrakter også anvendelse av humaniserte antistoffragmenter ifølge oppfinnelsen, f.eks. humaniserte anti-TNF-alfa eller anti-IL-6 antistoffer for diagnose, vurdering og behandling av sykdommer og lidelser forbundet med et spesielt antigen, f.eks. IL-6, TNF-alfa eller avvikende ekspresjon derav.

[00046] Andre utførelsesformer ifølge oppfinnelsen angår fremstilling av humaniserte antistoffer og humaniserte antistoffragmenter produsert i henhold til de nye og forbedrete humaniseringsprotokollene avledet fra kanin antistoffet-sekvenser i rekombinante vertsceller, fortrinnsvis diploid gjær så som diploid Pichia og andre gjærstammer.

KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE

[00047] Figur 1 inneholder et strømningsskjema som viser skjematisk den oppfinneriske kanin antistoff humaniseringsprotokollen.

[00048] Figur 2 inneholder oppstillinger av spesifikke eksempler på variabel lett og variabel tungkjede polypeptidsekvens, dvs. antigen spesifikke kanin antistoff variabel lettkjede polypeptider og variable tungkjede polypeptidsekvenser og homologe humane sekvenser identifisert i et bibliotek av humane kimlinjesekvenser og de endelige humaniserte sekvenser produsert ved anvendelse av de oppfinneriske humaniseringsprotokollene. Rammeverksregioner er identifisert deri som FR1-FR4. Komplementaritetsbestemmende regioner (CDR) er identifisert som CDR1-CDR3. Aminosyrerester er nummerert som vist i figuren og er i samsvar med Kabat nummereringsskjema. De innledende kaninsekvensene blir referert til i figuren og heri RbtVL og RbtVh for kanin variabel lett og variabel tungkjede polypeptidsekvenser henholdsvis. Tre av de mest lignende humane kimlinje antistoff-sekvenser omfattende fra begynnelsen av FRI til slutten av FR3 identifisert i et bibliotek av humane kimlinjesekvenser er oppstilt under kaninsekvensene. Den humane sekvensen som er betraktet som mest lignende kaninsekvensen er rett under kaninsekvensen. I denne eksemplifiseringen av den oppfinneriske humaniseringsstrategien er de mest lignende humane kimlinjesekvenser L12A for lettkjeden og 3-64-04 for tungkjeden. Humane CDR3 sekvenser er ikke vist. Den nærmeste humane Rammeverk 4 sekvensen er oppstilt under kanin Rammeverk 4 sekvensen. Vertikale streker indikerer en rest hvor kaninresiduet er identisk med én eller flere av de humane residuene i samme stilling. Uthevete residuer indikerer at det humane residue i den stillingen er identisk med kaninresiduet i samme stilling. De endelige humaniserte sekvenser er betegnet VLh og VHh for variable lett og variable tung sekvenser, henholdsvis. I denne figuren indikerer understrekete residuer at residuet er det samme som kaninresiduet i den stillingen, men forskjellig fra de humane residuene i den stillingen i de tre oppstilte humane sekvenser.

[00049] Figur 3 inneholder likeledes en oppstilling av de samme opphavs- kanin variable tunge og lettkjede sekvenser avledet fra et IL-6 spesifikt antistoff, homologe humane kimlinjesekvenser og to humaniserte variable tunge og lettkjede sekvenser produsert derifra ved anvendelse av gjeldende humaniseringsstrategier. Spesifikt, inneholder denne figuren de opprinnelige kanin lette og tungkjede sekvenser, tre homologe humane kimlinjesekvenser og 2 humaniserte tunge og 2 humaniserte lettkjede sekvenser referert til deri som "aggres" og "consrv". Det kan sees fra oppstillingen at de humaniserte "aggres" og "consrv" sekvenser skiller seg fra hverandre i nærvær eller fravær av spesifikke kanin rammeverksresiduene.

[00050] Figur 4 sammenligner dissosiasjonskonstantene til kimære versus humaniserte antistoffer avledet fra kanin antistoffer spesifikk til hIL-6 og TNF-alfa. som ble produsert ved anvendelse av de oppfinneriske humaniseringsprosedyrene.

[00051] Figur 5 inneholder et forsøk som sammenligninger antagonismen av IL-6 avhengig Tl 165 celleproliferasjon til forskjellige humaniserte antistoffer avledet fra et spesifikt kanin anti-IL-6 antistoff produsert ved anvendelse av de oppfinneriske humaniseringsprosedyrer.

[00052] Figur 6 inneholder et forsøk som sammenligner antagonismen av hIL-6 avhengig Tl 165 celleproliferasjon til forskjellige humaniserte antistoffer avledet fra et spesifikt kanin anti-hIL-6 antistoff produsert ved anvendelse av de oppfinneriske humaniseringsprosedyrene.

[00053] Figur 7 inneholder et forsøk som sammenligner antagonismen av hTNF-alfa avhengig cytotoksisitet til et kimært anti-TNF-alfa antistoff avledet fra et kanin anti-hTNF-alfa til antistoffet til et humanisert antistoff avledet therefra produsert i henhold til de oppfinneriske humaniseringsprosedyrene.

DETALJERT BESKRIVELSE AV FORETRUKNE UTFØRELSESFORMER

[00054] Definisjoner

[00055] Det skal forstås at foreliggende oppfinnelse er ikke begrenset til den spesielle metodikken, protokoller, cellelinjer, dyrearter eller slekter og reagenser beskrevet, som sådanne kan variere. Det skal også forstås at terminologien anvendt her er for formålet av å beskrive kun de spesielle utførelsesformene og er ikke ment å begrense omfanget av foreliggende oppfinnelse som vil være begrenset kun til de vedlagte kravene.

[00056] Som anvendt her omfatter entallsformene "en", "og" et " flertallsreferenser hvis ikke sammenhengen klart tilsier noe annet. Således, omfatter for eksempel referanse til "en celle" en rekke slike celler og referanse til "proteinet" omfatter referanse til én eller flere proteiner og ekvivalenter derav kjent for fagfolk på området og så videre. Alle tekniske og vitenskapelige betegnelser anvendt her har samme betydning som vanlig forstått for en fagmann på området som foreliggende oppfinnelse tilhører hvis ikke klart angitt på annen måte.

[00057] Som anvendt her, refererer betegnelsene "akseptor" og "akseptor antistoff' eller "opprinnelig" eller "opphavs" antistoff til det humane antistoffet eller nukleinsyresekvensen som tilveiebringer eller som koder for sekvenser anvendt for å produsere humaniserte antistoff-sekvenser fra kanin antistoff variable sekvenser ifølge oppfinnelsen. Typisk akseptor antistoff vil gi minst 80%, minst 85%, minst 90%, minst 95%, minst 96, 97, 98, 99 eller 100% av aminosyresekvensene til én eller flere av rammeverksregionene. I noen utførelsesformer angir betegnelsen "akseptor" antistoffet eller nukleinsyresekvensen som tilveiebringer eller som koder for konstant region(er). I enda en annen utførelsesform, angir betegnelsen "akseptor" antistoffet eller nukleinsyresekvensen som tilveiebringer eller som koder for én eller flere av rammeverksregionene og konstant region(er). I en spesifikk utførelsesform, angir betegnelsen "akseptor" et humant antistoff eller nukleinsyresekvens som tilveiebringer eller koder for minst 80%, fortrinnsvis, minst 85%, minst 90%, minst 95%, minst 96, 97, 98, 99 eller 100% av aminosyresekvensene av én eller flere av rammeverksregioner. I henhold til denne utførelsesformen, kan en akseptor inneholde minst 1, minst 2, minst 3, least 4, minst 5 eller minst 10 aminosyrerester som ikke forekommer ved en eller flere spesifikke stillinger av et humant antistoff. En akseptor rammeverksregion og/eller akseptor konstantregion(er) kan være, f.eks. avledet eller oppnådd fra et kimlinje antistoffgen, et modent antistoffgen, et funksjonelt antistoff (f.eks. antistoffer velkjent på området, antistoffer under utvikling eller antistoffer som er kommersielt tilgjengelige).

[00058] Som anvendt her, refererer betegnelsene "antistoff og "antistoffer" til monoklonale antistoffer, multispesifikke antistoffer, humane antistoffer, humaniserte antistoffer, kameliserte antistoffer, kimære antistoffer, enkelt-kjede Fvs (scFv), enkelt kjede antistoffer, enkelt domene antistoffer, Fab-fragmenter, Fab' fragmenter, F(ab')2fragmenter, disulfid-bundet Fvs (sdFv), anti-idiotypiske (anti-Id) antistoffer og epitop-bindingsfragmenter av hvilken som helst av de ovenfor. Spesielt omfatter antistoffer immunoglobulinmolekyler og immunologiske aktive fragmenter av immunoglobulinmolekyler, dvs. molekyler som inneholder et antigen bindingssete. Immunoglobulinmolekyler kan være av hvilken som helst type (f.eks. IgG, IgE, IgM, IgD, IgA og IgY), klasse (f.eks. IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl og IgA2) eller underklasse. Som angitt angår oppfinnelsen generelt humaniserte antistoffer og humaniserte antistoffragmenter produsert ved kombinering av spesifikke residue kanin donor antistoffer spesifikke for et ønsket antigen og homologe humane (akseptor) antistoff-sekvenser.

[00059] Et typisk antistoff inneholder to tung kjeder parret med to lettkjeder. En full-lengde tungkjede er ca. 50 kD i størrelse (omtrent 446 aminosyrer i lengde) og blir kodet for av et tungkjede variabel regiongen (omtrent 116 aminosyrer) og et konstantregiongen. I foreliggende oppfinnelse er i det vesentlige to nukleinsyrer eller genetiske komponenter som koder for en humanisert variabel lett og et humanisert variabel tungkjede sekvens inneholdende spesifikke CDR residuene av et kanin antistoff av ønsket antigen spesifisitet og funksjonelle egenskaper og som kan refereres til som exoner blir kondensert sammen for å produsere en konstruksjon som koder for en humanisert variabel kjede som resulterer i ekspresjon av en humanisert variabel region når denne konstruksjonen blir uttrykt i et passende ekspresjonssystem.

[00060] Gjeldende humaniserte antistoffer hvis konstantregioner er til stede vil inneholde humane konstantregioner. Det er forskjellige konstantregion gener som koder for tungkjede konstantregion av forskjellig isotyper så som alfa, gamma (IgGl, IgG2, IgG3, IgG4), delta, epsilon og mu sekvenser. En full-lengde lettkjede er ca. 25 Kd i størrelse (omtrent 214 aminosyrer i lengde) og blir kodet for av et lettkjede variabel region gen (omtrent 110 aminosyrer) og en kappa eller lambda konstantregion gen. Variable regioner av lett og/eller tungkjede er ansvarlig for bindingen til et antigen og konstantregionene er ansvarlig for effektor funksjoner typisk for et antistoff.

[00061] Som anvendt her, angir betegnelsen "analog" i sammenheng med et proteinholdig middel (f.eks. proteiner, polypeptider og peptider, så som antistoffer) et proteinholdig middel som har en lignende eller identisk funksjon med et andre proteinholdig middel, men ikke nødvendigvis omfatte en lignende eller identisk aminosyresekvens av det andre proteinholdige midlet eller har en lignende eller identisk struktur av det andre proteinholdige midlet. Et proteinholdig middel som har en lignende aminosyresekvens angir et andre proteinholdig middel som tilfredsstiller minst én av de følgende: (a) et proteinholdig middel som har en aminosyresekvens som har minst 30%, minst 35%, minst 40%, minst 45%, minst 50%, minst 55%, minst 60%, minst 65%, minst 70%, minst 75%, minst 80%, minst 85%, minst 90%, minst 95% eller minst 96, 97, 98, 99 eller 100% identisk med aminosyresekvensen av et andre proteinholdig middel; (b) et proteinholdig middel kodet for av en nukleotidsekvens som hybridiserer under stringente betingelser til en nukleotidsekvens som koder for et andre proteinholdig middel på minst 5 påfølgende aminosyrerester, minst 10 påfølgende aminosyrerester, minst 15 påfølgende aminosyrerester, minst 20 påfølgende aminosyrerester, minst 25 påfølgende aminosyrerester, minst 40 påfølgende aminosyrerester, minst 50 påfølgende aminosyrerester, minst 60 påfølgende aminoresiduene, minst 70 påfølgende aminosyrerester, minst 80 påfølgende aminosyrerester, minst 90 påfølgende aminosyrerester, minst 100 påfølgende aminosyrerester, minst 125 påfølgende aminosyrerester eller minst 150 påfølgende aminosyrerester; og (c) et proteinholdig middel kodet for av en nukleotidsekvens som har minst 30%, minst 35%, minst 40%, minst 45%, minst 50%, minst 55%, minst 60%, minst 65%, minst 70%, minst 75%, minst 80%, minst 85%, minst 90%, minst 95% eller minst 96, 97, 98, 99 eller 100% identisk med nukleotidsekvensen som koder for et andre proteinholdig middel. En proteinholdig middel med lignende struktur som et andre proteinholdig middel angir et proteinholdig middel som har en lignende sekundær, tertiær eller kvaternær struktur som det andre proteinholdige midlet. Strukturen til et proteinholdig middel kan bestemmes ved metoder kjent for fagfolk på området, omfattende men ikke begrenset til, peptid sekvensering, røntgenkrystallografi, kjernemagnetisk resonans, sirkulær dichroisme og krystallografisk elektronmikroskopi.

[00062] For å bestemme prosentidentiteten til to aminosyresekvenser eller av to nukleinsyresekvenser, blir sekvensene oppstilt for optimalt sammenligningsformål (f.eks. kan gap innføres i sekvensen av en første aminosyre eller nukleinsyresekvens for optimal oppstilling med en andre aminosyre eller nukleinsyresekvens). Aminosyrerestene eller nukleotidene ved tilsvarende aminosyrestillinger eller nukleotidstillinger blir deretter sammenlignet. Når en stilling i den første sekvensen er okkupert av samme aminosyrerest eller nukleotid som den tilsvarende stillingen i den andre sekvensen, da er molekylene identiske i den stillingen. Prosent identitet mellom de to sekvensene er en funksjon av antallet identiske stillinger felles for sekvensene (dvs. % identitet=antall av identiske overlappende stillinger/totale antall av stillinger ganger 100%). I én utførelsesform har de to sekvensene lik lengde. Som angitt, velger foreliggende oppfinnelse i dens humaniseringsstrategier humane variable regioner som har høy sekvensidentitet eller homologi med den tilsvarende variable regionen av kanin lett eller tungkjede variabel region som blir anvendt for å oppnå en tilsvarende "humanisert" variant. Typisk vil den valgte humane variable regionen ha minst 80% eller større sekvensidentitet med den tilsvarende kanin variable sekvensen over en spesifisert del av den variable regionen inneholdende CDR1 og CDR2 regionene. Ideelt vil den valgte humane variable regionen ha den største homologi eller sekvensidentitet med kanin variabel region sammenlignet med alle andre medlemmer av en populasjon eller bibliotek av humane kimlinjesekvenser inneholdende human antistoff variabel region som koder for sekvenser som bestemt ved passende metoder så som BLAST søking. I tillegg kan et foretrukket eller ledende kandidat kanin antistoff anvendt i gjeldende humaniseringsstrategier velges fra en populasjon av kanin antistoffer (av sammenlignbare affiniteter og/eller funksjonelle karakteristika) basert på dens høye homologi eller sekvensidentitet med en human kimlinjesekvens. Dette er mulig idet foreliggende oppfinnelse i foretrukne utførelsesformer gir dens opphavs antistoffer ved anvendelse av en B celle immuniseringsprotokoll som er funnet å gi opphav til et antall (f.eks. 10 eller mer) av høy affinitet antistoffer spesifikke for målet som gjenkjenner forskjellige epitoper på antigenmål så som IL-6. I noen tilfeller kan denne identitet være så vesentlig at det humaniserte antistoffet og opphavsantistoffet ha lignende immunogenisitets egenskaper i mennesker gitt den høye sekvensidentiteten mellom humane og kanin antistoffer i forhold andre dyr typisk anvendt for humanisering så som gnagere og marsvin.

[00063] Bestemmelsen av prosent identitet mellom to sekvenser kan også oppnås ved anvendelse av en matematisk algoritme. Et foretrukket, ikke-begrensende eksempel på en matematisk algoritme anvendt for sammenligning av to sekvenser er algoritmen til Karlin og Altschul, 1990, Proe. Nati. Encad. Sei. U.S.A. 87:2264-2268, modifisert som i Karlin og Altschul, 1993, Proe. Nati. Encad. Sei. U.S.A. 90:5873-5877. En slik algoritme blir innført i NBLAST og XBLAST programmer av Altschul et al, 1990, J. Mol. Biol. 215:403. BLAST nukleotidsøk kan utføres med NBLAST nukleotid program parameter sett, f.eks. for score=100, ordlengde=12 for å oppnå nukleotidsekvenser homologe med et nukleinsyremolekyler ifølge foreliggende oppfinnelse. BLAST protein søk kan utføres med XBLAST program parameter sett, f.eks. til score-50, ordlengde=3 for å oppnå aminosyresekvenser homologe med et proteinmolekyl ifølge foreliggende oppfinnelse. For å oppnå gap oppstillinger for sammenligningsformål, kan Gapped BLAST anvendes som beskrevet i Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. Alternativt, kan PSI-BLAST anvendes for å utføre et iterert søk som detekterer fjerne relasjoner mellom molekyler (Id.). Ved anvendelse av BLAST, Gapped BLAST og PSI-Blast programmer, kan standard parametere til de respektive programmer (f.eks. av XBLAST og NBLAST) anvendes (se f.eks. NCBI website). Et annet foretrukket, ikke-begrensende eksempel på en matematisk algoritme anvendt for sammenligningen av sekvenser er algoritmen til Myers og Miller, 1988, CABIOS 4:11-17. En slik algoritme er inkorporert i ALIGN programmet (versjon 2,0) som er del av GCG sekvensoppstilling programvare pakke. Ved anvendelse av ALIGN programmet for sammenligning av aminosyresekvenser, kan en PAM120 vekt residue tabell, en gap lengde "penalty" på 12 og en gap "penalty" på 4 anvendes.

[00064] Prosent identitet mellom to sekvenser kan bestemmes ved anvendelse av teknikker lignende de beskrevet ovenfor, med eller uten å tillate gap. I beregningen av prosent identitet blir typisk bare nøyaktige matcher tellet.

[00065] Som anvendt her angir betegnelsen "CDR" komplement bestemmende region innenfor antistoff variable sekvenser. Det er tre CDR i hver av de variable regioner av tungkj eden og lettkjeden, som er betegnet CDR1, CDR2 og CDR3, for hver av de variable regioner. De nøyaktige grensene til disse CDR er definert forskjellig i henhold til forskjellige systemer. Systemet beskrevet av Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes av Helse, Bethesda, Md. (1987) og (1991)) ikke bare tilveiebringer et utvetydig residue nummereringsystem anvendbar for hvilken som helst variabel region av et antistoff, men tilveiebringer også nøyaktige residue grenser som definerer tre CDR. Disse CDR kan refereres til som Kabat CDR. Chotia og medarbeidere (Chotia & Leska, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987) og Chotia et al., Nature 342:877-883 (1989)) fant at visse sub-deler innen Kabat CDR får nesten identiske peptid ryggrad konformasjoner, til tross for at de har stor diversitet på nivået av aminosyresekvens. Disse sub-deler ble betegnet som LI, L2 og L3 eller Hl, H2 og H3 hvor "L" og "H" angir lettkjede og tungkjede regioner, henholdsvis. Disse regioner kan refereres til som Chotia CDR, som har grenser som overlapper med Kabat CDR. Andre grenser som definerer CDR overlappende med Kabat CDR er beskrevet av Padlan (FASEB J. 9:133-139 (1995)) og MacCallum (J Mol Biol 262(5):732-45 (1996)). Fortsatt andre CDR grense definisjoner behøver ikke å følge et av de ovenfor systemene slavisk, men vil til tross for dette overlappe med Kabat CDR, selv om de kan bli forkortet eller forlenget i lys av antagelse eller eksperimentelle funn om at spesielle residuer eller grupper av residuene eller hele CDR ikke i betydelig grad gir antigen binding. Metodene anvendt her kan anvende CDR definert i henhold til hvilke som helst av disse systemene, selv om foretrukne utførelsesformer anvender Kabat eller Chotia definert CDR. Som beskrevet nedenfor inneholder disse CDR diskrete residuer som er antatt å være betydelige for antigen binding eller gjenkjennelse referert til som "selektivitetsbestemmende residuer".

[00066] Uttrykket "selektivitetsbestemmende residuer" i foreliggende oppfinnelse angir spesifikke aminosyrerester innbefattet i kanin variabel tung og lettkjede polypeptider som er antatt å være betydelig involvert i antigen gjenkjennelse og/eller antigen binding. I de oppfinneriske humaniseringsstrategiene blir disse selektivitetsbestemmende residuene i kanin CDR regionene empirisk identifisert ved sammenligning av alle kanin CDR residuene til den tilsvarende residue i en valgt homolog human variabel region og basert på denne sammenligningen identifisere antatte "selektivitetsbestemmende residuene". Spesielt er en spesiell CDR residue sett å være et selektivitetsbestemmende residue hvis det avviker hovedsakelig fra det tilsvarende humane CDR residue i henhold til Kabat nummereringsskjemaet. "Hovedsakelig/vesentlig" angir her betydelige kjemiske eller strukturelle forskjeller mellom kanin og humane kimlinje CDR aminosyrerester, f.eks. forskjeller i ladning, ladet i forhold til ikke-ladete, tilstedeværelse eller fravær av bulk sidekjede og lignende. For eksempel hvis kanin CDR aminosyreresten inneholder en bulkete sidekjede og den tilsvarende humane CDR aminosyreresten ikke da vil kanin CDR residue være betraktet å være en selektivitetsbestemmende residue og vil bli beholdt i den humaniserte variable regionen. I tillegg hvis CDR aminosyreresten i kanin variabel region er en basisk aminosyre og den tilsvarende aminosyreresten i den humane CDR er en sur aminosyrerest da vil dette residuet i kanin CDR bli bestemt å være et selektivitetsbestemmende residue og vil bli beholdt i den humaniserte variable regionen. I kontrast til dette, hvis CDR residuet i kanin CDR og det tilsvarende residue i den humane CDR er begge sure eller begge inneholder analoge bulkete sidekjeder vil residuet bli bestemt ikke å være en selektivitetsbestemmende residue og den humane CDR residue vil ikke bli modifisert i den humaniserte variable regionen. Denne metoden for kategorisering av de spesifikke residuene i kanin CDR regionene som "selektivitetsbestemmende" eller "ikke-selektivitetbestemmende" anvendt i foreliggende humaniseringsstrategier for å selektere spesifikke kanin CDR residuer som bør bli beholdt i de humaniserte variable regioner er analoge med kriterier anvendt i protein mutagenese for å bestemme hvorvidt en aminosyre substitusjon modifikasjon kan bli ansett å være konservativ eller ikke-konservativ. Det skal imidlertid forstås at idet foreliggende oppfinnelse typisk beholder alle slike selektivitetsbestemmende residuer i den humaniserte variabel region polypeptid basert på den antagelsen at hver av disse residuene er instrumentalt for antigen gjenkjennelse og/eller binding som i noen tilfeller kan bestemmes ved syntese av forskjellige humaniserte variabel kjedevarianter at bibehold av en spesiell antatt selektivitetsbestemmende residue er ikke-essensiell med hensyn på antigenbindingen av et antistoff inneholdende den humaniserte variable regionen. For eksempel hvis opphavskanin antistoffet har meget høy antigen affinitet for målantigenet behøver ikke retensjonen av alle antatte selektivitetsbestemmende residuene være essensielt for å oppnå et humanisert antistoff som har ønskelig antigen bindingsgjenkjennelse og affinitet. Dette kan bestemmes empirisk ved syntetisering av forskjellige humaniserte variabel region polypeptider. I tillegg kan identifikasjon av en spesiell CDR residue som selektivitetsbestemmende eller ikke kan variere avhengig av den spesielle sekvensen eller sekvenser av de valgte homologe humane variable regioner.

[00067] Uttrykket "variabel region" eller "VR" angir domenene innen hvert par av lette og tunge kjeder i et antistoff som er involvert direkte i binding av antistoffet til antigenet. Hver tungkjede har i én ende en variabel domene (Vh) fulgt av flere konstante domener. Hver lettkjede har en variabel domene (Vl) i én ende og en konstant domene i dens andre ende; konstant domene av lettkjeden er oppstilt med den første konstante domenen av tungkjede og lettkjede variabel domene er oppstilt med den variable domenen av tungkj eden.

[00068] Uttrykket "rammeverkregion" eller "FR" angir én eller flere av rammeverksregionene innen variable regioner av lett og tung kjeder av et antistoff (Se Kabat, E. A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes av Helse, Bethesda, Md., (1987)). Rammeverksregioner eller FR omfatter aminosyresekvensregionene som er innkoblet mellom CDR omfattet innen variable regioner av lett og tung kjeder av et antistoff.

[00069] Som anvendt her, angir uttrykket "kanonikal" residue en rest i et CDR eller rammeverk som definerer en spesiell kanonikal CDR struktur som definert av Chotia et al. (J. Mol. Biol. 196:901-907 (1987); Chotia et al, J. Mol. Biol. 227:799 (1992), begge er inntatt her ved referanse). I henhold til Chotia et al., har kritiske deler av CDR av mange antistoffer nesten identisk peptidryggrad konformasjoner til tross for stort mangfold i nivået av aminosyresekvens. Hver kanonikale struktur spesifiserer primært et sett av peptidryggrad torsjons vinkler for et påfølgende segment av aminosyrerester som danner en sløyfe.

[00070] Som anvendt her, angir uttrykket "derivat" i sammenheng med proteinholdig middel (f.eks. proteiner, polypeptider og peptider, så som antistoffer) et proteinholdig middel som omfatter en aminosyresekvens som er endret ved innføring av aminosyrerest substitusjoner, delesjoner og/eller addisjoner. Uttrykket "derivat" som anvendt her angir også et proteinholdig middel som er modifisert, dvs. ved den kovalente bindingen av en hvilken som helst type av molekyl til det proteinholdige midlet. For eksempel men ikke som begrensning, et antistoff kan modifiseres, f.eks. ved aglykosylering, glykosylering, acetylering, pegylering, fosforylering, amidering, derivatisering med kjente beskyttelses/blokkeringsgrupper, proteolytisk spaltning, binding til en cellulær ligand eller annet protein, etc. Fortrinnsvis er antistoffet aglykosylert. Et derivat av et proteinholdig middel kan produseres ved kjemisk modifikasjoner ved anvendelse av teknikker kjent for fagfolk på området, omfattende, men ikke begrenset til spesifikk kjemisk spaltning, acetylering, formylering, metabolsk syntese av tunicamycin, etc. Videre kan et derivat av et proteinholdig middel inneholde én eller flere ikke-klassiske aminosyrer. Et derivat av et proteinholdig middel har en lignende eller identisk funksjon som det proteinholdige midlet som det ble avledet fra.

[00071] Som anvendt her, blir uttrykket "lidelse" eller "sykdom" anvendt om hverandre for en tilstand i et individ.

[00072] Som anvendt her, angir uttrykket "donor" eller "donor antistoff et antistoff som tilveiebringer én eller flere CDR. I en foretrukket utførelsesform, er donor antistoff et antistoff fra en art forskjellig fra antistoffet hvorifra rammeverksregioner blir oppnådd eller avledet. I sammenheng med et humanisert antistoff, angir betegnelsen "donor antistoff et ikke-humant (kanin) antistoff som tilveiebringer én eller flere CDR.

[00073] Som anvendt her, angir uttrykket "effektiv mengde" mengden av en terapi som er tilstrekkelig for å redusere eller forbedre alvorlighetsgraden og/eller varighet av en lidelse eller én eller flere symptomer derav, forhindre forverring av en lidelse, forårsake regresjon av en lidelse, forhindre tilbakekomst, utvikling, begynnelse eller progresjon av én eller flere symptomer forbundet med en lidelse, detektere en lidelse eller forøke eller forbedre profylaktisk eller terapeutisk effekt(er) av en annen terapi (f.eks. profylaktisk eller terapeutisk middel).

[00074] Som anvendt her, angir uttrykket "epitop" et fragment av et polypeptid eller protein som har antigen eller immunogen aktivitet i et dyr, fortrinnsvis i et pattedyr og mest foretrukket i et menneske. En epitop som har immunogen aktivitet er et fragment av et polypeptid eller protein som fremkaller en antistoffrespons i et dyr. En epitop som har antigen aktivitet er et fragment av et polypeptid eller protein hvortil et antistoff immunospesifikt binder som bestemt ved hvilken som helst metode velkjent for en fagmann på området, for eksempel ved immunoanalyser. Antigene epitoper trenger ikke nødvendigvis være immunogene. Som nevnt produserer foreliggende oppfinnelse fortrinnsvis kanin antistoffer mot et spesifikt målantigen ved anvendelse av en klonal B celle immuniseringsmetode som er funnet å gi opphav til antistoffer med høy affinitet til et område av forskjellige epitoper på antigenmålet.

[00075] Som anvendt her, angir uttrykket "fusjonsprotein" et polypeptid eller protein (omfattende, men ikke begrenset til et antistoff) som omfatter en aminosyresekvens av et første protein eller polypeptid eller funksjonelt fragment, analog eller derivat derav og en aminosyresekvens av et heterologt protein, polypeptid eller peptid (dvs. et andre protein eller polypeptid eller fragment, analog eller derivat derav forskjellig fra det første protein eller fragment, analog eller derivat derav). I én utførelsesform, omfatter et fusjonsprotein et profylaktisk eller terapeutisk middel kondensert til et heterologt protein, polypeptid eller peptid. I henhold til denne utførelsesformen, kan eller behøver ikke heterologt protein, polypeptid eller peptid være en annen type av profylaktisk eller terapeutisk middel. For eksempel kan to forskjellige proteiner, polypeptider eller peptider med immunomodulerende aktivitet kondenseres sammen for å danne et fusjonsprotein. I en foretrukket utførelsesform, beholder eller har fusjonsproteinene forbedret aktivitet i forhold til aktiviteten til det opprinnelige proteinet, polypeptid eller peptid før det blir kondensert til et heterologt protein, polypeptid eller peptid.

[00076] Som anvendt her, angir uttrykket "fragment" et peptid eller polypeptid (omfattende, men ikke begrenset til et antistoff) omfattende en aminosyresekvens med minst 5 påfølgende aminosyrerester, minst 10 påfølgende aminosyrerester, minst 15 påfølgende aminosyrerester, minst 20 påfølgende aminosyrerester, minst 25 påfølgende aminosyrerester, minst 40 påfølgende aminosyrerester, minst 50 påfølgende aminosyrerester, minst 60 påfølgende aminorerester, minst 70 påfølgende aminosyrerester, minst påfølgende 80 aminosyrerestene, minst påfølgende 90 aminosyrerestene, minst påfølgende 100 aminosyrerestene, minst påfølgende 125 aminosyrerestene, minst 150 påfølgende aminosyrerester, minst påfølgende 175 aminosyrerestene, minst påfølgende 200 aminosyrerestene eller minst påfølgende 250 aminosyrerestene av aminosyresekvensen av et annet polypeptid eller protein. I en spesifikk utførelsesform, beholder et fragment av et protein eller polypeptid minst en funksjon av proteinet eller polypeptid.

[00077] Som anvendt her, angir uttrykket "funksjonelt fragment" et peptid eller polypeptid (omfattende, men ikke begrenset til et antistoff) omfattende en aminosyresekvens på minst 5 påfølgende aminosyrerester, minst 10 påfølgende aminosyrerester, minst 15 påfølgende aminosyrerester, minst 20 påfølgende aminosyrerester, minst 25 påfølgende aminosyrerester, minst 40 påfølgende aminosyrerester, minst 50 påfølgende aminosyrerester, minst 60 påfølgende aminoresiduene, minst 70 påfølgende aminosyrerester, minst påfølgende 80 aminosyrerestene, minst påfølgende 90 aminosyrerestene, minst påfølgende 100 aminosyrerestene, minst påfølgende 125 aminosyrerestene, minst 150 påfølgende aminosyrerester, minst påfølgende 175 aminosyrerestene, minst påfølgende 200 aminosyrerestene eller minst påfølgende 250 aminosyrerestene av aminosyresekvensen av andre, forskjellige polypeptid eller protein, hvor nevnte polypeptid eller protein beholder minst en funksjon av den andre, forskjellige polypeptidet eller proteinet. I en spesifikk utførelsesform, beholder et fragment av et polypeptid eller protein minst to, tre, fire eller fem funksjoner av proteinet eller polypeptidet. Fortrinnsvis, beholder et fragment av et antistoff som immunospesifikt binder til et spesielt antigen beholder evnen til å immunospesifikt å bindes til antigenet.

[00078] Som anvendt her, angir uttrykket "kimlinje antistoffgen" eller "genfragment" en immunoglobulinsekvens kodet for av ikke-lymfoide celler som ikke har gjennomgått modningsprosessen som fører til genetisk omleiring og mutasjon for ekspresjon av et spesielt immunoglobulin. (se f.eks. Shapiro et al., Crit. Rev. Immunol. 22(3): 183-200 (2002); Marchalogennis et al., Adv Exp Med Biol. 484:13-30 (2001)). En av fordelene gitt i forskjellige utførelsesformer av foreliggende

oppfinnelse stammer fra gjenkjennelsen av at kimlinje antistoff gener har større sannsynlighet enn modne antistoffgener til å bevare essensielle aminosyresekvens

strukturer karakteristiske for individer i artene, således mindre sannsynlig å bli gjenkjent fra en fremmed kilde når anvendt terapeutisk i den arten.

[00079] Som anvendt her, angir uttrykket "nøkkel" residuene til visse residuer innen den variable regionen som har større innvirkning på bindingenspesifisiteten og/eller affiniteten til et antistoff, spesielt et humanisert antistoff. Dette omfatter de ovennevnte selektivitetsbestemmende residuene og omfatter videre, men er ikke begrenset til, én eller flere av de følgende: en rest som er i nabostilling til et CDR, et potensielt glykosyleringssete (kan være enten N- eller O-glykosyleringssete), et sjeidet residue, en rest som er i stand til å interagere med antigenet, en rest som er i stand til å interagere med et CDR, en kanonikal residue, en kontakt residue mellom tungkjede variabel region og lettkjede variabel region, en rest innen Vernier zon og en rest i regionen som overlapper mellom Chotia definisjonen av en variabel tungkjede CDR1 og Kabat definisjon av det første tungkjede rammeverket.

[00080] Som anvendt her omfatter uttrykket "Tumornekrosefaktor-alfa" eller (TNF-alfa) eller TNF-alfa ikke bare de følgende 233 aminosyresekvensene tilgjengelige som GenBank Protein Aksesjonsnummer CAA26669 (homo sapien TNF-alfa):

[00081] MSTESMIRDVELAEEALPKKTGGPQGSRRCLFLSLFSFLIVAGATTLFCL LHFGVIGPQREEFPRDLSLISPLAQAVRSSSRTPSDKPVAHWANPQAEGQLQ WLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHT ISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLS AEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL (SEKV ID NR: 1), men også hvilke som helst pre-pro, pro-, modne, oppløselige og/eller membran-bundete former av denne TNF-aminosyresekvensen, så vel som mutanter (muteiner), spleisevarianter, ortologer, homologer og varianter av denne sekvensen.

[00082] Uttrykket "Interleukin-6" eller (IL-6) omfatter her ikke bare de følgende 212 aminosyresekvensene tilgjengelige som GenBank Protein Aksesjonsnummer NP_000591: MNSFSTSAFGPVAFSLGLLLVLPAAFPAPVPPGEDSKDVAAPHRQPLTSSERID KQIRYILDGISALRKETCNKSNMCESSKEALAENNLNLPKMAEKDGCFQSGF NEETCLVKIITGLLEFEVYLEYLQNRFESSEEQARAVQMSTKVLIQFLQKKAK NLDAITTPDPTTNASLLTKLQAQNQWLQDMTTHLILRSFKEFLQSSLRALRQ M (SEKV ID NR: 2), men også hvilke som helst pre-pro, pro- og modne former av denne IL-6 aminosyresekvensen, så vel som mutanter og varianter omfattende alleliske varianter av denne sekvensen.

[00083] Uttrykket "parringskompetente gjærarter" skal blant annet omfatte hvilken som helst diploid gjær som kan bli stabilt holdt i kultur. Slik arter av gjær eksisterer i en haploid og en diploid form. De diploide cellene kan, under passende betingelser, proliferere i et ubestemt antall av generasjoner i diploid form. Diploide celler kan også sporulere for å danne haploidceller. I tillegg, kan sekvensiell parring resultere i tetraploide stammer gjennom ytterligere parring av auxotrofe diploider. I foreliggende oppfinnelse blir diploide eller polyploidale gjærceller fortrinnsvis produsert ved parring eller sfæroplast fusjon.

[00084] I én utførelsesform ifølge oppfinnelsen er parringskompetent gjær et medlem av Saccharomycetaceae familien, som omfatter slektene Arxiozyma;

Ascobotryozyma; Citeromyces; Debaryomyces; Dekkera; Eremothecium;

Issatchenkia; Kazachstania; Kluyveromyces; Kodamaea; Lodderomyces; Pachysolen;

Pichia; Saccharomyces; Saturnispora; Tetrapisispora; Torulaspora; Williopsis; og Zygosaccharomyces. Andre typer av gjær potensielt anvendelige i oppfinnelsen omfatter Yarrowia, Rhodosporidium, Candida, Hansenula, Filobasium, Filobasidellla, Sporidiobolus, Bullera, Leucosporidium og Filobasidella.

[00085] I en foretrukket utførelsesform ifølge oppfinnelsen er parringskompetent gjær et medlem av slekten Pichia. I en ytterligere foretrukket utførelsesform ifølge oppfinnelsen er parringskompetent gjær av slekten Pichia én av de følgende arter: Pichia pastoris, Pichia metanolica og Hansenula polymorfa (Pichia angusta). I en spesielt foretrukket utførelsesform ifølge oppfinnelsen er den parringskompetente gjæren av slekten Pichia artene Pichia pastoris.

[00086] Uttrykket "haploid gjærcelle" angir her en gjærcelle som har enkel kopi av hvert gen av dens normale genomiske (kromosomale) komplement.

[00087] Uttrykket "polyploid gjærcelle" her angir en gjærcelle som har mer enn én kopi av dens normale genomiske (kromosomal) komplement.

[00088] Uttrykket "diploid gjærcelle" angir her en gjærcelle som har to kopier (alleler) av hvert gen av dens normale genomiske komplement, typisk dannet ved fremgangsmåten for fusjon (parring) av to haploidceller.

[00089] Uttrykket "tetraploid gjærcelle" angir her en celle som har fire kopier (alleler) av hvert gen av dens normale genomiske komplement, typisk dannet ved fremgangsmåten for fusjon (parring) av to haploidceller. Tetraploider kan bære to, tre eller fire forskjellige kassetter. Slike tetraploider kan oppnås i S. cerevisiae ved selektiv parring av homozygote heterotallisk a/alfa og alfa/alfa eller a/a diploider og i Pichia ved sekvensiell parring av haploider for å oppnå auxotrofe diploider. For eksempel kan en [met his] haploid bli parret med [ade his] haploid for å oppnå diploid [his]; og en [met arg] haploid bli parret med [ade arg] haploid for å oppnå diploid [arg]; deretter diploid [his] x diploid [arg] for å oppnå en tetraploid prototrof. Det vil forstås av fagfolk på området at referanse til fordelene og anvendelser av diploide celler kan også gjelde for tetraploide celler.

[00090] Uttrykket "gjær parring" angir fremgangsmåten ved hvilken to haploide gjærceller naturlig fusjonerer for å danne én diploid gjærcelle.

[00091] Uttrykket "meiose" angir her fremgangsmåten ved hvilken en diploid gjærcelle gjennomgår reduktiv deling for å danne fire haploide spore produkter. Hver spore kan deretter spire og danne en haploid vegetativ voksende cellelinje.

[00092] Uttrykket "selekterbar markør" angir her en selekterbar markør er et gen eller genfragment som gir en vekst fenotype (fysisk vekst karakteristikk) på en celle som mottar det genet som for eksempel ved en transformasjonshendelse. Den selekterbare markøren tillater at cellen overlever og vokser i et selektivt vekst medium under betingelser hvor celler som ikke mottar det selekterbare markørgenet ikke kan vokse. Selekterbare markørgener faller generelt inn i mange typer, omfattende positive selekterbare markørgener så som et gen som gir cellen resistens mot et antibiotika eller annet medikament, temperatur når to ts mutanter blir krysset eller en ts mutant blir omdannet; negative selekterbare markørgener så som et biosyntetisk gen som gir en celle evnen til å vokse i et medium uten spesifikke nærings behov til alle celler som ikke har det biosyntetiske genet eller et mutagenisert biosyntetisk gen som gir cellen den manglende evnen til å vokse av celler som ikke har villtypegenet; og lignende. Egnete markører omfatter men er ikke begrenset til: ZEO; G418; LYS3;

MET1; MET3a; ADE1; ADE3; URA3; og lignende.

[00093] Uttrykket "ekspresjonsvektor" angir her DNA-vektorer inneholdende elementer som letter manipuleringen for ekspresjon av et fremmed protein innen målvertscellen. Hensiktsmessig, blir manipulering av sekvenser og produksjon av DNA for transformasjon først utført i en bakteriell vert, f.eks. E. coli og vanligvis vil vektorer omfatte sekvenser for å lette slike manipulasjoner, omfattende en bakteriell replikasjonsorigo og passende bakteriell seleksjonsmarkør. Seleksjonsmarkører koder for proteiner nødvendige for overlevelse eller vekst av transformerte vertsceller dyrket i et selektivt dyrkningsmedium. Vertsceller ikke transformert med vektoren inneholdende seleksjonsgenet vil ikke overleve i dyrkningsmediet. Typiske seleksjonsgener koder for proteiner som (a) gir resistens mot antibiotika eller andre toksiner, (b) komplement auxotrofe mangler eller (c) gir kritiske næringsstoffer ikke tilgjengelige fra kompleks media.

[00094] Ekspresjonsvektorer egnete for anvendelse ved metodene ifølge oppfinnelsen omfatter videre gjær spesifikke sekvenser, omfattende en selekterbar auxotrof eller medikament markør for å identifisere transformerte gjærstammer. En medikament markør kan videre anvendes for å amplifisere kopitallet av vektoren i en gjær vertscelle.

[00095] Polypeptid kodende sekvens av interesse er operabelt bundet til transkripsjonene og translasjonelle regulatorsekvenser som gir ekspresjon av polypeptidet i gjærceller. Disse vektorkomponenter kan omfatte, men er ikke begrenset til, én eller flere av de følgende: enhancer element, en promoter og en transkripsjons termineringssekvens. Sekvenser for sekresjon av polypeptidet kan også være omfattet, f.eks. en signalsekvens og lignende. En gjær replikasjonsorigo er valgfri, idet ekspresjonsvektorer ofte er integrert i gjærgenomet.

[00096] I én utførelsesform ifølge oppfinnelsen blir polypeptidet av interesse operabelt bundet eller kondensert, til sekvenser som tilveiebringer for optimalisert sekresjon av polypeptidet fra gjær diploidceller.

[00097] Uttrykket "operabelt bundet" i forbindelse med nukleinsyresekvenser betyr at disse sekvenser blir plassert i et funksjonelt slektskap med hverandre. For eksempel kan et DNA som koder for en signalsekvens være operabelt bundet til DNA for et polypeptid hvis det blir uttrykt som et preprotein som deltar i sekresjonen av polypeptidet; en promoter eller enhancer er operabelt bundet til en kodende sekvens hvis det påvirker transkripsjonen av sekvensen. Generelt, betyr "operabelt bundet" at DNA-sekvensene som er bundet er påfølgende og, i tilfellet av en sekretorisk leder, påfølgende og i leseramme. Imidlertid, behøver enhancere ikke være påfølgende. Linkingen blir oppnådd ved ligering ved hensiktsmessige restriksjonsseter eller alternativt via en PCR/rekombineringsmetode kjent for fagfolk på området (Gateway<R>Technology; Invitrogen, Carlsbad California). Hvis slike seter ikke eksisterer, blir syntetiske oligonukleotid adaptere eller linkere anvendt i henhold til konvensjonell praksis.

[00098] Uttrykket "promoter" angir en utranslatert sekvens lokalisert oppstrøms (5') for startkodonet til et strukturelt gen (generelt innen ca. 100 til 1000 bp) som kontrollerer transkripsjonen og translasjonen av spesielle nukleinsyresekvenser som de er operabelt bundet til. Slike promotere faller inn i mange klasser: induserbare, konstitutive og represserbare promotere (som øker nivåer av transkripsjon som respons på fravær av en repressor). Induserbare promotere kan initiere forhøyede nivåer av transkripsjon fra DNA under deres kontroll som respons på noen forandringer i kulturbetingelser, f.eks. nærvær eller fravær av et næringsmiddel eller en forandring i temperatur.

[00099] Gjær promoterfragmentet kan også tjene som sete for homolog rekombinering og integrering av ekspresjonsvektoren inn i samme sete i gjærgenomet; alternativt blir en selekterbar markør anvendt som sete for homolog rekombinering. Pichia transformasjon er beskrevet i Cregg et al. (1985) Mol. Celle. Biol. 5:3376-3385.

[000100] Eksempler på egnede promotere fra Pichia omfatter AOX1 og promoter (Cregg et al. (1989) Mol. Celle. Biol. 9:1316-1323); ICL1 promoteren (Menendez et al. (2003) Yeast 20(13):1097-108); glyceraldehyde-3-phosfate dehydrogenase promoter (GAP) (Waterham et al. (1997) Gen 186(l):37-44); og FLD1 promoter (Shen et al. (1998) Gen 216(1):93-102). GAP promoteren er en sterk konstitutiv promoter og AOX og FLD1 promotere er induserbare.

[000101] Andre gjærpromotere omfatter ADHI, alkohol dehydrogenase II, GAL4, PH03, PH05, Pyk og kimære promotere avledet derifra. I tillegg, kan ikke-gjær promotere anvendes i oppfinnelsen så som pattedyr, insekt, plante, reptil, amfibie, virale og fugle- promotere. Mest typisk vil promoteren omfatte en pattedyr-promoter (potensielt endogent for de uttrykte genene) eller vil omfatte en gjær eller viral promoter som tilveiebringer effektiv transkripsjon i gjærsystemer.

[000102] Polypeptidene av interesse kan produseres rekombinant ikke bare direkte, men også som et fusjonspolypeptid med et heterologt polypeptid, f.eks. en signalsekvens eller annet polypeptid som har et spesifikt spaltningssete ved N-terminusen av det modne proteinet eller polypeptidet. Generelt, kan signalsekvensen være en komponent av vektoren eller kan være en del av den polypeptid kodende sekvensen som blir innsatt i vektoren. Den heterologe signalsekvensen som er valgt er fortrinnsvis én som blir gjenkjent og prosessert ved én av standardbanene tilgjengelige innen vertscellen. S. cerevisiae alfa faktor pre-pro signalet har vist seg effektiv for sekresjonen av en rekke rekombinante proteiner fra P. pastoris. Andre gjær signalsekvenser omfatter parring faktor alfa signalsekvens, invertase signalsekvens og signalsekvenser avledet fra andre utskilte gjær polypeptider. I tillegg, kan disse signalpeptidsekvenser konstrueres for å gi forbedret sekresjon i diploide gjær ekspresjonssystemer. Andre sekresjonssignaler av interesse omfatter også pattedyr-signalsekvenser, som kan være heterologe for proteinet som blir utskilt eller kan være en nativ sekvens for proteinet som blir utskilt. Signalsekvenser omfatter pre-peptidsekvenser og kan i noen tilfeller omfatte propeptidsekvenser. Mange slike signalsekvenser er kjent på området, omfattende signalsekvensene funnet på immunoglobulinkjeder, f.eks. K28 preprotoksin sekvens, PHA-E, FACE, human MCP-1, human serum albumin signalsekvenser, human lg tungkjede, human lg lettkjede og lignende. Se for eksempel Hashimoto et. al. Protein Eng 11(2) 75 (1998);

og Kobayashi et. al. Therapeutic Apheresis 2(4) 257 (1998).

[000103] Transkripsjonen kan økes ved innsetting av en transkripsjonen aktivator sekvens inn i vektoren. Disse aktivatorer er cis- virkende elementer av DNA, vanligvis omtrent fra 10 til 300 bp, som virker på en promoter for å øke dens transkripsjon. Transkripsjonene enhancere er relativt orienterings og stillings uavhengige, funnet 5' og 3' for transkripsjonsenheten, innen et intron, så vel som innen selve den kodende sekvensen. Enhanceren kan bli spleiset inn i ekspresjonsvektoren i en stilling 5' eller 3' for den kodende sekvensen, men er fortrinnsvis lokalisert i et sete 5' fra promoteren.

[000104] Ekspresjonsvektorer anvendt i eukaryote vertsceller kan også inneholde sekvenser nødvendige for avslutningen av transkripsjon og for å stabilisere mRNA. Slike sekvenser er vanlig tilgjengelige fra 3' til translasjons termineringskodonet, i utranslaterte regioner av eukaryote eller virale DNA eller cDNA. Disse regioner inneholder nukleotidsegmenter transkribert som polyadenylerte fragmenter i den utranslaterte delen av mRNA.

[000105] Konstruksjon av egnede vektorer inneholdende én eller flere av de ovenfor opplistede komponenter anvender standard ligeringsteknikker eller PCR/rekombineringsmetoder. Isolerte plasmider eller DNA-fragmenter blir spaltet, skreddersydd og re-ligert i formen ønsket for å danne plasmidene nødvendige eller via rekombineringsmetoder. For analyse for å bekrefte korrekte sekvenser i konstruerte plasmider, blir ligeringsblandinger anvendt for å transformere vertsceller og vellykket transformanter valgt ved antibiotika resistens (f.eks. ampicillin eller Zeocin) hvor passende. Plasmider fra transformantene blir fremstilt, analysert ved restriksjon endonuklease fordøyelse og/eller sekvensert.

[000106] Som et alternativ til restriksjon og ligering av fragmenter, kan rekombineringsmetoder basert på att seter og rekombineringsenzymer kan anvendes for å innsette DNA-sekvenser inn i en vektor. Slike metoder er beskrevet, for eksempel av Landy (1989) Ann.Rev.Biochem. 58:913-949; og er kjent for fagfolk på området. Slike metoder anvender intermolekylær DNA rekombinering som blir mediert av en blanding av lambda og E.coli -enkodete rekombineringsproteiner. Rekombinering forekommer mellom spesifikk bindings (att) seter på de interagerende DNA-molekylene. For en beskrivelse av att seter se Weisberg og Landy (1983) Site-Specific Recombination in Phage Lambda, in Lambda II, Weisberg, ed.(Cold Spring Harbor, NY:Cold Spring Harbor Press), pp,211-250. DNA-segmenter som flankerer rekombineringsseter blir byttet, slik at etter rekombinering, er att seter hybrid sekvenser omfattet av sekvenser donert av hver parentale vektor. Rekombinering kan forekomme mellom DNA med hvilken som helst topologi.

[000107] Att seter kan innføres i en sekvens av interesse ved ligering av sekvensen av interesse inn i en passende vektor; generering av et PCR-produkt inneholdende att B seter ved anvendelse av spesifikke primere; generering av et cDNA-bibliotek klonet inn i en passende vektor inneholdende att seter; og lignende.

[000108] Folding, som anvendt her, angir den tre-dimensjonale strukturen av polypeptider og proteiner, hvor interaksjoner mellom aminosyrerestene virker slik at de stabiliserer strukturen. Mens ikke-kovalente interaksjoner er viktige for bestemmelse av strukturen, vil vanligvis proteinene av interesse ha intra- og/eller intermolekylære kovalente disulfidbindinger dannet ved to cysteinrester. For naturlig forekommende proteiner og polypeptider eller derivater og varianter derav, er riktig folding typisk arrangementet som resulterer i optimal biologisk aktivitet og kan hensiktsmessig bli overvåket med forsøk for aktivitet, f.eks. ligand-bindende, enzymatisk aktivitet, etc.

[000109] I noen tilfeller, for eksempel hvor det ønskede produktet er av syntetisk opprinnelse, vil forsøket basert på biologisk aktivitet være mindre meningsfull. Den riktige foldingen av slike molekyler kan bestemmes på basis av fysiske egenskaper, energetiske betraktninger, modeleringsundersøkelser og lignende.

[000110] Ekspresjonsverten kan bli ytterligere modifisert ved innføring av sekvenser som koder for ett eller flere enzymer som forøker folding og disulfidbinding dannelse, dvs. foldaser, chaperoniner, etc. Slike sekvenser kan bli uttrykt konstitutivt eller induserbart i gjærvertscellen, ved anvendelse av vektorer, markører, etc. som kjent på området. Fortrinnsvis blir sekvensene, omfattende transkripsjonene regulatoriske elementer tilstrekkelige for det ønskede mønster av ekspresjon, blir stabilt integrert i gjærgenomet ved en målrettet metodikk.

[000111] For eksempel er eukaryot PDI ikke bare en effektiv katalysator av protein cystein oksidasjon og disulfidbinding isomerisering, men oppviser også "chaperon" aktivitet. Ko-ekspresjon av PDI kan lette fremstillingen av aktive proteiner som har multiple disulfidbindinger. Også av interesse er ekspresjon av BIP (immunoglobulin tungkjede bindingsprotein); cyklophilin; og lignende. I én utførelsesform ifølge oppfinnelsen uttrykker hver av de haploide parentale stammene et distinkt foldingsenzym, f.eks. kan én stamme uttrykke BIP og den andre stammen kan uttrykke PDI eller kombinasjoner derav.

[000112] Betegnelsene "ønsket protein" eller "målprotein" blir anvendt om hverandre og refer generelt til et humanisert antistoff eller en bindingsdel derav beskrevet her. I foreliggende oppfinnelse er kilden for å produsere antistoffer anvendelige som utgangsmaterialet ifølge oppfinnelsen kaniner. En rekke antistoff kodende sekvenser er beskrevet; og andre kan bli dannet ved metoder velkjente på området. Eksempler omfatter kimære antistoffer, humane antistoffer og andre ikke-humane pattedyr-antistoffer, humaniserte antistoffer, enkelt kjede antistoffer (scFvs), kamellegemer, SIMPS og antistoffragmenter så som Fabs, Fab', F(ab')2og lignende.

[000113] For eksempel kan antistoffer eller antigen-bindingsfragmenter produseres ved genetisk konstruksjon. I denne teknikken, som med andre metoder, blir antistoff-produserende celler sensibilisert til det ønskede antigenet eller immunogenet. Messenger-RNA isolert fra antistoff produserende celler blir anvendt som et templat for å danne cDNA ved anvendelse av PCR amplifisering. Et bibliotek av vektorer, hver inneholdende et tungkjede gen og et lettkjede gen beholder den innledende antigen spesifisitet, blir produsert ved insersjon av passende deler av det amplifiserte immunoglobulin cDNA inn i ekspresjonsvektorene. Et kombinatorisk bibliotek blir konstruert ved å kombinere tungkjede genbiblioteket med lettkjede genbiblioteket. Dette resulterer i et bibliotek av kloner som ko-uttrykker en tung og lettkjede (som ligner Fab-fragmentet eller antigen-bindingsfragmentet av et antistoff molekyl). Vektoren som bærer disse genene blir ko-transfektert inn i en vertscelle. Når antistoff gensyntese blir infusert i den transfekterte verten, tung og lettkjede proteiner oppstilles selv for å produsere aktive antistoffer som kan detekteres ved screening med antigenet eller immunogenet.

[000114] De antistoff-kodende sekvensene av interesse omfatter de som blir kodet for av native sekvenser, så vel som nukleinsyrer som, i kraft av degenereringen av den genetiske koden, ikke er identisk i sekvens med de beskrevne nukleinsyrer og varianter derav. Variantpolypeptider kan omfatte aminosyre (aa) substitusjoner, addisjoner eller delesjoner. Aminosyresubstitusjoner kan være konservative aminosyresubstitusjoner eller substitusjoner for å fjerne ikke-essensielle aminosyrer, så som for å endre et glykosyleringssete eller å minimalisere feil-folding ved substitusjon eller delesjon av én eller flere cysteinrester som ikke er nødvendige for funksjon. Varianter kan utformes for å beholde eller ha forbedret biologisk aktivitet til en spesiell region av proteinet (f.eks. en funksjonell domene, katalytiske aminosyrerester, etc). Varianter omfatter også fragmenter av polypeptidene beskrevet her, spesielt biologiske aktive fragmenter og/eller fragmenter svarende til funksjonelle domener. Teknikker for in vitro mutagenese av klonete gener er kjent. Også omfattet i foreliggende oppfinnelse er polypeptider som er modifisert ved anvendelse av vanlige molekylære biologiske teknikker så som for å forbedre deres resistens mot proteolytisk nedbrytning eller for å optimalisere oppløselighetsegenskapene eller gjøre dem mere egnete som et terapeutisk middel.

[000115] Kimære antistoffer kan fremstilles ved rekombinante metoder ved å kombinere variable lett og tungkjede regioner (Vlog Vh), oppnådd fra antistoff produserende celler fra en art med de konstante lett og tungkjede regioner fra en annen. Typiske kimære antistoffer anvender gnager eller kanin variable regioner og humane konstantregioner, for å produsere et antistoff med overveiende humane domener. Fremstilling av slike kimære antistoffer er velkjent på området og kan oppnås ved standardmetoder (som beskrevet, f.eks. i U.S. Patent nr. 5,624,659, inntatt her ved referanse i sin helhet). Det er videre antatt at de humane konstante regioner av kimære antistoffer ifølge oppfinnelsen kan velges fra IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgG5, IgG6, IgG7, IgG8, IgG9, IgGlO, IgGl 1, IgG12, IgG13, IgG14, IgG15, IgG16, IgG17, IgGl8 eller IgGl9 konstantregioner.

[000116] Uttrykket "polyploid gjær som stabilt uttrykker eller uttrykker et ønsket utskilt heterologt polypeptid i forlenget tid" angir en gjærkultur som utskiller nevnte polypeptid i minst mange dager til en uke, mer foretrukket minst en måned, fortsatt mer foretrukket minst 1-6 måneder og enda mer foretrukket i mer enn et år ved terskelekspresjonsnivåer, typisk minst 10-25 mg/liter og fortrinnsvis hovedsakelig mer.

[000117] Uttrykket "polyploidal gjærkultur som utskiller ønskede mengder av rekombinant polypeptid" angir kulturer som stabilt eller i forlengete perioder utskiller minst 10-25 mg/liter heterologt polypeptid, mer foretrukket minst 50-500 mg/liter og mest foretrukket 500-1000 mg/liter eller mer.

[000118] En polynukleotidsekvens "korresponderer" med en polypeptidsekvens hvis translasjonen av polynukleotidetsekvensen i henhold til den genetiske koden gir polypeptidetsekvensen (dvs. polynukleotidetsekvensen "koder for" polypeptidsekvensen), én polynukleotidsekvens "korresponderer" med en annen polynukleotidsekvens hvis de to sekvensene koder for samme polypeptidsekvens.

[000119] Uttrykket en "heterolog" region eller "heterolog domene" av en DNA konstruksjon angir et identifiserbart segment av DNA innen et større DNA-molekyl som ikke finnes sammen med det større molekylet i naturen. Således, når den heterologe regionen koder for et pattedyrgen, vil genet vanligvis være flankert av DNA som ikke flankerer pattedyr- genomisk DNA i genomet til kildeorganismen. Et annet eksempel på en heterolog region er en konstruksjon hvor den kodende sekvensen selv ikke finnes i naturen (f.eks. en cDNA hvor den genomiske kodende sekvensen inneholder introner eller syntetiske sekvenser som har kodoner forskjellige fra det native genet). Alleliske variasjoner eller naturlig forekommende mutasjons hendelser gir ikke opphav til en heterolog region av DNA som definert her.

[000120] Uttrykket "kodende sekvensen" angir en i-ramme sekvens av kodoner som (i betraktning av den genetiske koden) svarer til eller koder for et protein eller peptidsekvens. To kodende sekvensene svarer til hverandre hvis sekvensene eller deres komplementær sekvenser koder for samme aminosyresekvenser. En kodende sekvens sammen med passende regulatorsekvenser kan transkriberes og translateres inn i et polypeptid. Et polyadenyleringssignal og transkripsjonstermineringssekvens vil vanligvis være lokalisert 3' for den kodende sekvensen.

[000121] Uttrykket "vektorer" angir her materialer anvendt for å innføre en fremmed substans, så som DNA, RNA eller protein, inn i en organisme eller vertscelle. Typisk omfatter vektorer rekombinant virus (for polynukleotider) og liposomer (for polypeptider). En "DNA-vektor" er et replikon, så som plasmid, fag eller kosmid, hvortil et annet polynukleotidsegment kan være tilknyttet for å tilveiebringe replikasjonen av det tilknyttede segmentet. Her er en "ekspresjonsvektor" en DNA-vektor som inneholder regulatorsekvenser som vil rette polypeptidsyntesen ved en passende vertscelle. Dette betyr vanligvis en promoter for å binde RNA polymerase og initiere transkripsjonen av mRNA, så vel som ribosom bindingsseter og initieringssignaler for å rette translasjonen av mRNA inn i et polypeptid(er). Innføring av en polynukleotidsekvens inn i en ekspresjonsvektor ved det riktige sete og i korrekt leseramme, fulgt av transformasjonen av en passende vertscelle ved vektoren, muliggjør fremstilling av et polypeptid kodet for av nevnte polynukleotidsekvens.

[000122] Betegnelsen "amplifisering" i sammenheng med polynukleotidsekvenser er in vitro produksjon av multiple kopier av en spesiell nukleinsyresekvens. Den amplifiserte sekvensen er vanligvis i form av DNA. En rekke teknikker for å utføre slik amplifisering er beskrevet i en oversiktsartikkel til Van Brunt (1990, Bio/Technol., 8(4):291-294). Polymerasekjedereaksjonen eller PCR er en prototype av nukleinsyre amplifisering og anvendelse av PCR her bør betraktes som eksempler på andre egnete amplifiseringsteknikker.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

[000123] Gjeldende humaniseringsmetoder er generisk anvendbare for humanisering av hvilket som helst kanin antistoff eller variabel region derav, dvs. disse antistoffer kan spesifikt bindes til forskjellige ønskete antigener. I tillegg kan gjeldende humaniseringsmetoder være anvendbare for humanisering av andre arter av antistoffer, f.eks. antistoffer fra dyr nær relatert til kaniner så som andre pattedyr i ordenen Lagomorfa eller familien Leporidae som omfatter forskjellige kaniner og harer. Disse pattedyr bør ettersom de er nært relaterte til husdyr kaniner ha variable sekvenser nært relatert til husdyr kaninarter anvendt her som en kilde eller kanin antistoffer for humanisering. Følgelig, er beskrivelsen nedenfor svarende til syntesen av humaniserte anti-TNF-alfa eller anti-IL-6 antistoffer eksempelvise. Den oppfinneriske humaniseringsprotokollen er vist skjematisk i Figur 1 og er beskrevet i detalj nedenfor. Beskrivelsen av metoden beskrevet nedenfor tilveiebringer både generelt anvendbare regler så vel som anvendelse av disse regler på en spesifikk sekvens vist i Figur 2, som et eksempel.

[000124] Oppfinnelsen betrakter anvendelse av gjeldende humaniseringsstrategi for å produsere humaniserte tunge og lettkjeder og antistoffer og antistoffragmenter som er spesifikke for et hvilket som helst ønsket antigen. Eksempler på egnede antigener omfatter humane proteiner så som vekstfaktorer, cytokiner, enzymer, hormoner, tumor spesifikke antigener, onkogener, et al., allergener, antigener fra infeksiøse midler så som bakterier, virus, sopp, gjær, parasitter, et al, toksiner, etc. Eksemplene nedenfor eksemplifiserer metoder anvendelige for å oppnå humaniserte kanin antistoffer spesifikke for TNF-og IL-6 og illustrerer de oppfinneriske metoder og dens intrinsiske fordeler.

[000125] Oppfinnelsen betrakter også antistoffragmenter som omfatter én eller flere av de humaniserte tunge eller lettkjeder produsert ifølge oppfinnelsen. Oppfinnelsen betrakter spesifikt humaniserte antistoffragmenter som har bindingsspesifisitet til TNF- . eller IL-6. Slike antistoffragmenter kan være til stede i én eller flere av de følgende ikke-begrensende formene: Fab, Fab', F(ab')2, Fv og enkel kjede Fv antistoff former.

[000126] Som nevnt tidligere i en foretrukket og eksemplifisert utførelsesform ifølge oppfinnelsen kommer antistoffene som blir anvendt for humanisering fra eller er valgt fra én eller flere klonale antigen spesifikke kanin B cellepopulasjoner før initiering av humaniseringensprosessen referert til her.

[000127] Som angitt ovenfor, kan antistoffer og fragmenter derav modifiseres post-translasjonelt for å tilsette effektorgrupper så som kjemiske linkere, detekterbare grupper så som for eksempel fluorescerende fargemidler, enzymer, substrater, bioluminescent materialer, radioaktive materialer og kjemiluminescent grupper eller funksjonelle grupper så som for eksempel streptavidin, avidin, biotin, et cytotoxin, et cytotoksisk middel og radioaktive materialer.

[000128] Angående detekterbare grupper, omfatter ytterligere eksempler på enzymer, men er ikke begrenset til, pepperrot peroksidase, acetylcholinesterase, alkalisk fosfatase, beta-galaktosidase og luciferase. Ytterligere eksempler på fluorescerende materialer omfatter, men er ikke begrenset til, rhodamin, fluorescein, fluorescein isotiocyanat, umbelliferon, diklortriazinylamin, phycoerythrin og dansylklorid. Ytterligere eksempler på kjemiluminescentgrupper omfatter, men er ikke begrenset til, luminol. Ytterligere eksempler på bioluminescent materialer omfatter, men er ikke begrenset til, luciferin og aequorin. Ytterligere eksempler på radioaktive materialer omfatter, men er ikke begrenset til, Jod 125 (<I25>I), Karbon 14 (<I4>C), Svovel 35(35S), Tritium (<3>H)og Fosfor 32(32P).

[000129] Angående funksjonelle grupper, omfatter eksempler på cytotoksiske midler, men er ikke begrenset til, metotrexat, aminopterin, 6-merkaptopurin, 6-tioguanin, cytarabin, 5-fluoruracil dekarbazin; alkyleringsmidler så som mechlorethamin, tioepa chlorambucil, melphalan, carmustin (BSNU), mitomycin C, lomustin (CCNU), 1-metylnitrosourea, cyklothosphamid, mechlorethamin, busulfan, dibrommannitol, streptozotocin, mitomycin C, cis-diklordiamin platina (II) (DDP) cisplatin og karboplatin (paraplatin); antracykliner omfatter daunorubicin (tidligere daunomycin), doxorubicin (adriamycin), detorubicin, carminomycin, idarubicin, epirubicin, mitoksantron og bisantren; antibiotika omfatter dactinomycin (actinomycin D), bleomycin, calicheamicin, mithramycin og antramycin (AMC); og antimytotiske midler så som vinca alkaloider, vincristin og vinblastin. Andre cytotoksiske midler omfatter paclitaxel (taxol), ricin, pseudomonas exotoxin, gemcitabin, cytochalasin B, gramicidin D, etidiumbromid, emetin, etoposid, tenoposid, colchicin, dihydroksy antracin dion, 1-dehydrotestosteron, glukokortikoider, prokain, tetracain, lidocain, propranolol, puromycin, prokarbazin, hydroksyurea, asparaginase, kortikosteroider, mytotan (0,P'-(DDD)), interferoner og blandinger av disse cytotoksiske midler.

[000130] Ytterligere cytotoksiske midler omfatter, men er ikke begrenset til, kjemoterapeutiske midler så som karboplatin, cisplatin, paclitaxel, gemcitabin, calicheamicin, doxorubicin, 5-fluoruracil, mitomycin C, actinomycin D, cyklofosfamid, vincristin og bleomycin. Toksiske enzymer fra planter og bakterier så som ricin, difteria toksin og Pseudomonas toksin kan bli konjugert til humaniserte antistoffer eller bindingsfragmenter derav, for å danne celle-type-spesifikk-drepe reagenser (Youle, et al, Proe. Nat'l Acad. Sei. USA 77:5483 (1980); Gilliland, et al, Proe. Nat'l Acad. Sei. USA 77:4539 (1980); Krolick, et al, Proe. Nat'l Acad. Sei. USA 77:5419(1980)).

[000131] Andre cytotoksiske midler omfatter cytotoksiske ribonukleaser som beskrevet av Goldenberg i U.S. Pat. nr. 6,653,104. Utførelsesformer ifølge oppfinnelsen angår også radioimmunokonjugater hvor et radionuklid som utstråler alfa eller beta partikler blir stabilt koblet til antistoffet eller bindingsfragmenter derav, med eller uten anvendelse av et kompleks-dannende middel. Slike radionuklider omfatter beta-utstrålere så som Fosfor-32 (<32>P), Scandium-47 (<47>Sc), Kobber-67 (<67>Cu), Gallium-67 (<67>Ga), Yttrium-88 (<88>Y), Yttrium-90 (<90>Y), Jod-125 (<I25>I), Jod-131 (<I3I>I), Samarium-153 (<I53>S<m>), Lutetium-177 (<I77>Lu), Rhenium-186 (<I86>Re) eller Rhenium-188 (<I88>Re) og alfa-utstrålere så som Astatin-211 (<2n>At), Lead-212 (<2I2>Pb), Vismut-212 (<2I2>Bi) eller -213 (<2I3>Bi) eller Actinium-225 (<225>Ac).

[000132] Metoder er kjent på området for konjugering av et antistoff eller bindingsfragment derav til en detekterbar gruppe og lignende, så som for eksempel de metoder beskrevet av Hunter et al, Nature 144:945 (1962); David et al, Biochemistry 13:1014 (1974); Pain et al, J. Immunol. Meth. 40:219 (1981); og Nygren, J., Histochem. og Cytochem. 30:407 (1982).

[000133] Utførelsesformer beskrevet her omfatter videre varianter og ekvivalenter som er hovedsakelig homolog med antistoffene, antistoffragmentene, polypeptider, variable regioner og CDR angitt her. Disse kan inneholde, f.eks. konservative substitusjonsmutasjoner, (dvs. substitusjonen av én eller flere aminosyrer med lignende aminosyrer). For eksempel angir konservativ substitusjon substitusjonen av en aminosyre med en annen innen samme generelle klasse, f.eks. én sur aminosyre med en annen sur aminosyre, én basisk aminosyre med en annen basisk aminosyre eller én nøytral aminosyre med en annen nøytral aminosyre. Hva som er tilsiktet med en konservativ aminosyre substitusjon er velkjent på området.

[000134] I en annen utførelsesform betrakter oppfinnelsen polypeptidsekvenser som har minst 90% eller større sekvenshomologi med hvilken som helst én eller flere av de humaniserte polypeptidsekvenser av antistoffragmenter, variable regioner og CDR angitt her. Mer foretrukket vedrører oppfinnelsen humaniserte polypeptidsekvenser som har minst 95% eller større sekvenshomologi, enda mer foretrukket minst 98% eller større sekvenshomologi og fortsatt mer foretrukket minst 99% eller større sekvenshomologi med hvilken som helst én eller flere av de humaniserte antistoffragmentene produsert ifølge oppfinnelsen.

[000135] En betydelig fordel med foreliggende humaniseringsprotokoll er at bindingsaffiniteten til antistoffene inneholdende humaniserte variable sekvenser produsert ifølge oppfinnelsen i forhold til det til opphavskanin antistoffet forblir hovedsakelig intakt (uendret). Fortrinnsvis, vil humaniserte antistoffer produsert ved foreliggende oppfinnelse så som humaniserte anti-IL-6 eller TNF-alfa antistoffer og fragmenter derav ha bindingsspesifisitet til IL-6, TNF-alfa eller et annet antigen anvendelig i human terapi og vil bindes til deres antigen med en dissosiasjonskonstant (KD) på mindre enn eller lik 5xl0"<7>M"<1>, IO"<7>M"<1>, 5xl0"<8>M"<1>, IO"<8>M"<1>, 5xl0"<9>M"<1>, 10"<9>M"\ 5x10"<10>M"\ IO"<10>M"<1>, 5xl0"<n>M"<1>, 10"" M"<1>, 5xl0"<12>M"<1>,10"12M"<1>, 5xl0"<13>M"

\ IO"<13>M"<1>, 5xl0"14M"<1>, 10"<1>4M"<1>, 5xl0"<15>M"<1>eller IO"<15>M"<1>. Fortrinnsvis, vil gjeldende humaniserte antistoffer binde deres antigenmål så som IL-6 eller TNF-antistoff med en dissosiasjonskonstant på mindre enn eller lik 5xl0"<10>M"<1>.

[000136] I en annen utførelsesform ifølge oppfinnelsen vil de humaniserte antistoffene og fragmenter produsert fra kaninantistoffer ha en bindingsspesifisitet til et antigen så som IL-6 eller TNF-alfa, med en off-rate på mindre enn eller lik 10"<4>S"<1>IO"<5>S"<1>, 5xl0"6 S"\ 10"<6>S"\ 5xl0"<7>S"<1>eller IO"7 S"1.

[000137] I en ytterligere utførelsesform ifølge oppfinnelsen blir aktiviteten til gjeldende humaniserte antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse og fragmenter derav ha bindingsspesifisiteten til et antigen så som TNF-alfa og viser aktivitet som agoniserer eller antagoniserer funksjonene av det spesielle antigenet. Fortrinnsvis vil antigenet være et terapeutisk mål og det humaniserte antistoffet vil forbedre eller redusere symptomene på eller alternativt behandlingen av, sykdommer og lidelser forbundet med det spesielle antigenet så som IL-6 eller TNF eller et annet terapeutisk mål så som et humant tumorpolypeptid, autoantigen, allergen eller et antigen spesifikt for et infeksiøst middel.

[000138] B-celle Screening og Isolering

[000139] Som angitt, tilveiebringer oppfinnelsen generelle metoder anvendbar for effektiv humanisering av hvilket som helst kanin antistoff, dvs. spesifikt for hvilket som helst ønsket antigen. Disse antistoffene kan avledes fra hybridomceller, sera eller fra immunceller som utskiller kaninantistoffer eller antistoffer av nær beslektede arter så som andre Lagomorfer. Hvis immunceller blir anvendt er det foretrukket at disse celler utgjør B-celler utskillende antistoffer spesifikke for et ønsket mål antigen som er avledet av den følgende B celle isoleringsprotokollen. Det er funnet at denne protokollen gir en populasjon av B-celler som gir opphav til seleksjon av antistoffer med gode bindingsaffiniteter og videre gir et helt repertoire eller mangfold av antistoffer, dvs. en populasjon av antistoffer som omfatter de som bindes til et bredt område av forskjellige epitoper. I denne foretrukne utførelsesform tilveiebringer foreliggende oppfinnelse metoder for isolering av en klonal populasjon av antigen-spesifikke B-celler oppnådd fra en immune kanin som kan anvendes for å isolere minst én antigen-spesifikk celle. Som beskrevet og eksemplifisert nedenfor, inneholder disse metoder en serie av kultur og seleksjonstrinn som kan anvendes separat, i kombinasjon, sekvensielt, repetitivt eller periodisk. Fortrinnsvis, blir disse metoder anvendt for å isolere minst én antigen-spesifikk celle, som kan anvendes for å produsere et monoklonalt antistoff, som er spesifikk for et ønsket antigen eller en nukleinsyresekvens svarende til et slikt antistoff.

[000140] I det vesentlige, omfatter disse metoder følgende trinn:

[000141] a. fremstilling av en cellepopulasjon omfattende minst én antigen-spesifikk B celle;

[000142] b. anrikning av cellepopulasjonen, f.eks. ved kromatografi, for å danne en anriket cellepopulasjonen omfattende minst én antigen-spesifikk B celle;

[000143] c. isolering av enkel B celle fra den anrikete B cellepopulasjonen; og

[000144] d. bestemmelse av hvorvidt den enkelte B cellen gir et antistoff spesifikt for antigenet.

[000145] Disse metoder gir en forbedring av en metode for å isolere en enkelt, antistoff-produserende B celle, idet forbedringen omfatter anrikning av en B cellepopulasjon oppnådd fra en vert som er immunisert eller naturlig eksponert for et antigen, hvor anrikningstrinnet går foran hvilket som helst seleksjonstrinn, omfatter minst et dyrkningstrinn og resulterer i en klonal populasjon av B-celler som gir et enkelt monoklonalt antistoff spesifikt for nevnte antigen.

[000146] Med hensyn til slike metoder som fortrinnsvis blir anvendt for å oppnå kanin B-celler utskillende antistoffer som blir anvendt i den oppfinneriske humaniseringstilnærmingen i hele denne søknaden, angir en "klonal populasjon av B-celler" en populasjon av B-celler som bare utskiller enkelt antistoff spesifikt for et ønsket antigen. Som vil si at disse celler produserer bare én type av monoklonalt antistoff spesifikt for det ønskede antigenet.

[000147] Ved beskrivelse av slike metoder betyr uttrykket "anrikning" av en cellepopulasjon celler å øke frekvensen av ønskete celler, typisk antigen-spesifikke celler, innbefattet i en blandet cellepopulasjon, f.eks. et B celle-inneholdende isolat avledet fra en vert som er immunisert mot et ønsket antigen. Således, omfatter en anriket cellepopulasjon en cellepopulasjon som har en høyere frekvens av antigen-spesifikke celler som et resultat av et anrikningstrinn, men denne populasjonen av celler kan inneholde og produsere forskjellige antistoffer.

[000148] Ved videre å beskrive slike metoder omfatter det generelle uttrykket "cellepopulasjon" pre- og en post-anriknings cellepopulasjoner, ved å bemerke at når multiple anrikningstrinn blir utført, kan en cellepopulasjon bli både pre- og post-anrikning. Mer foretrukket vil disse metoder for oppnåelse av en klonal populasjon av antigen spesifikke B-celler omfatte :

[000149] a. høsting av en cellepopulasjon fra en immunisert vert for å oppnå en høstet cellepopulasjon;

[000150] b. danne minst én enkel cellesuspensjon fra den nøstete cellepopulasjonen;

[000151] c. anrikning av minst én enkel cellesuspensjon for å danne en første anriket cellepopulasjon;

[000152] d. anrikning av den første anrikete cellepopulasjonen for å danne en andre anriket cellepopulasjon;

[000153] e. anrikning av den andre anrikete cellepopulasjonen for å danne en tredje anriket cellepopulasjon; og

[000154] f. selektering av et antistoff produsert av en antigen-spesifikk celle av den tredje anrikete cellepopulasjon.

[000155] Hver cellepopulasjon kan anvendes direkte i neste trinn eller kan bli delvis eller helt frosset for lang- eller kort- tids lagring eller for senere trinn. Videre kan celler fra en cellepopulasjon bli individuelt suspendert, hvilket gir enkel cellesuspensjoner. Enkelt cellesuspensjon kan bli anriket, slik at enkelt cellesuspensjon tjener som pre-anriknings-cellepopulasjon. Deretter, danner én eller flere antigen-spesifikke enkelt cellesuspensjoner sammen den anrikete cellepopulasjonen; antigen-spesifikke enkelt cellesuspensjoner kan grupperes sammen, f.eks. re-platet for videre analyse og/eller antistoff produksjon.

[000156] Antigen-spesifisiteten kan måles med hensyn til hvilket som helst antigen. Antigenet kan være hvilken som helst substans hvortil et antistoff kan binde omfattende, men ikke begrenset til, peptider, proteiner eller fragmenter derav; karbohydrater; organiske og uorganiske molekyler; reseptorer produsert av dyreceller, bakterieceller og virus; enzymer; agonister og antagonister av biologiske baner; hormoner; og cytokiner. Eksempler på antigener omfatter, men er ikke begrenset til, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, IL-18, IFN-a, IFN-y, BAFF, CXCL13, IP-10, VEGF, EPO, EGF, HRG, MIF og koloni stimulerende faktorer, TPA, interferoner, tumor assosierte antigener, HIV antigener så som env og gag og pol, influenzae antigener, fugle influense antigener, et al. Foretrukne antigener omfatter IL-6, IL-13, TNF-a, VEGF-a, hepcidin og hepatocytt vekstfaktor og tumor antigener spesifikke for de bestemte humane kreftformene. I en metode som anvender mer enn et anrikningstrinn, kan antigenet anvendt i hvert anrikningstrinn være det samme som eller forskjellig fra hverandre. Multiple anrikningstrinn med samme antigen kan gi en stor og/eller ulik populasjon av antigen-spesifikke celler; multiple anrikningstrinn med forskjellige antigener kan gi en anriket cellepopulasjon med kryss-spesifisitet til de forskjellige antigenene.

[000157] Anrikning av en cellepopulasjon kan utføres ved hvilken som helst celle-seleksjonsmetode kjent på området for å isolere antigen-spesifikke celler. For eksempel kan en cellepopulasjon bli anriket ved kromatografiske teknikker, f.eks. Miltenyi kule eller magnetisk kule teknologi. Kulene kan bli direkte eller indirekte bundet til antigenet av interesse. I en foretrukket utførelsesform omfatter metoden anrikning av en cellepopulasjon som omfatterar minst et kromatografisk anrikningstrinn.

[000158] En cellepopulasjon kan også bli anriket ved å utføre en hvilken som helst antigen-spesifisitetsforsøk teknikk kjent på området, f.eks. et ELISA forsøk eller et haloforsøk. ELISA forsøk omfatter, men er ikke begrenset til, selektiv antigen immobilisering (f.eks. biotinylert antigen oppfangning av streptavidin, avidin eller neutravidin belagt plate), uspesifikk antigen plate belegg og ved en antigen oppbygnings strategi (f.eks. selektiv antigen oppfangning fulgt av bindingspartner tilsetning for å danne et heteromert protein-antigen kompleks). Antigenet kan bli direkte eller indirekte bundet til en fast stoff matriks eller bærer, f.eks. en kolonne. Et haloforsøk omfatter kontakting av cellene med antigen-belagte kuler og merket anti-vert antistoff spesifikk for verten anvendt for høsting av B-cellene. Merket kan f.eks. være en fluorofor. I én utførelsesform blir minst et analyse anrikningstrinn utført på minst én enkel cellesuspensjon. I en annen utførelsesform omfatter metoden for anrikning av en cellepopulasjon minst et kromatografisk anrikningstrinn og minst et analyse anrikningstrinn.

[000159] Metoder for "anrikning" av en cellepopulasjon i størrelse eller densitet er kjent på området. Disse trinn kan anvendes i foreliggende metode i tillegg til anrikning av cellepopulasjonen ved antigen-spesifisitet.

[000160] Cellepopulasjonener anvendt i disse metodene vil inneholde minst én celle som er i stand til å gjenkjenne et antigen. Antigen-gjenkjennende celler omfatter, men er ikke begrenset til, B-celler, plasmaceller og avkom derav. Typisk vil disse metoder utføres under betingelser hvilket gir opphav til en klonal cellepopulasjon inneholdende en enkelt type av antigen-spesifikk B-celle, dvs. cellepopulasjonen gir et enkelt monoklonalt antistoff spesifikt for et ønsket antigen. I foreliggende oppfinnelse vil disse antigen-spesifikke B-celler typisk være kanin eller alternativt en B celle fra en nært relatert pattedyr-art.

[000161] Det er antatt at en klonal antigen-spesifikk populasjon av B-celler bestående overveiende av antigen-spesifikke, antistoff-utskillende celler, blir oppnådd ved den nye kulturen og seleksjonsprotokollen gitt her.

[000162] I slike metoder kan isoleringen av en enkel B celle utføres ved anrikning av en cellepopulasjon oppnådd fra en vert før hvilket som helst seleksjonstrinn, f.eks. selektering av en spesiell B celle fra en cellepopulasjon og/eller selektering av et antistoff produsert av en spesiell celle. Anrikningstrinnet kan utføres som et, to, tre eller flere trinn. I én utførelsesform blir en enkelt B celle isolert fra en anriket cellepopulasjon før bekreftelse på hvorvidt den enkelte B cellen utskiller et antistoff med antigen-spesifisitet og/eller en ønsket egenskap.

[000163] I en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen blir anrikete cellepopulasjoner oppnådd fra en kanin immunisert til et ønsket antigen anvendt i en metode for antistoff produksjon og/eller seleksjon som er kandidat-utgangsmaterialer for gjeldende humaniseringsstrategier. Metoden kan omfatte følgende trinn : preparing av en cellepopulasjon omfattende minst én antigen-spesifikk celle, anrikning av cellepopulasjonen ved isolering av minst én antigen-spesifikk celle for å danne en anriket cellepopulasjon og som fremkaller antistoff produksjon fra minst én antigen-spesifikk celle. I en foretrukket utførelsesform, inneholder den anrikete cellepopulasjonen mer enn én antigen-spesifikk celle. I én utførelsesform, blir hver antigen-spesifikk celle av den anrikete populasjonen dyrket under betingelser som gir en klonal antigen-spesifikk B cellepopulasjon før isolering av en antistoff produserende celle derifra og/eller produsere et antistoff ved anvendelse av nevnte B celle eller en nukleinsyresekvens svarende til et slikt antistoff som blir anvendt i foreliggende humaniseringsstrategier. I motsetning til tidligere teknikker hvor antistoffer blir produsert fra en cellepopulasjon med en lav frekvens av antigen-spesifikke celler, tillater foreliggende oppfinnelse antistoff seleksjon fra blant en høyfrekvens av antigen-spesifikke celler. Fordi et anrikningstrinn blir anvendt før antistoff seleksjonen er majoriteten av cellene, fortrinnsvis praktisk talt alle cellene, anvendt for antistoff produksjon antigen-spesifikke. Ved produsering av antistoffer fra en populasjon av celler med en øket frekvens av antigen spesifisitet blir mengden og varieteten av antistoffer således øket for derved å gi mere utgangsmaterialer for humanisering.

[000164] Ved anvendelse av disse antistoff-seleksjonsmetoder blir kanin antistoffer dannet for humanisering , blir et antistoff fortrinnsvis valgt etter et anrikningstrinn og et dyrkningstrinn som resulterer i en klonal populasjon av antigen-spesifikke B-celler. Metodene kan videre omfatte et sekvenseringstrinn av det valgte antistoffet eller deler derav fra én eller flere isolerte, antigen-spesifikke celler. Hvilken som helst metode kjent på området for sekvensering kan anvendes og kan omfatte sekvensering av tungkj eden, lettkjeden, variable region(er) og/eller komplementaritetsbestemmende region(er) (CDR).

[000165] I tillegg til anrikningstrinnet kan metoden for antistoff-seleksjon også omfatte et eller flere trinn for screening av en cellepopulasjon for antigen-gjenkjennelse og/eller antistoff-funksjonalitet. For eksempel kan de ønskede antistoffer ha spesifikke strukturelle trekk, så som binding til en spesiell epitope eller etterligning av en spesiell struktur; antagonist eller agonist aktivitet; eller nøytraliserende aktivitet, f.eks. hemmende binding mellom antigenet og en ligand. I én utførelsesform er antistoff-funksjonalitetssikten ligand-avhengig. Screening for antistoff funksjonalitet omfatter, men er ikke begrenset til, et in vitro protein-protein interaksjonsforsøk som gjendanner den naturlige interaksjonen av antigen-liganden med rekombinant reseptorprotein; og en celle-basert respons som er ligand avhengig og lett overvåket (f.eks. proliferasjonsrespons). I én utførelsesform omfatter metoden for antistoff seleksjon et trinn for screening av cellepopulasjonen for antistoff funksjonalitet ved å måle den hemmende konsentrasjonen (IC50). I én utførelsesform, gir minst én av de isolerte, antigen-spesifikke cellene et antistoff som har en IC50 på mindre enn ca. 100,50,30,25,10 ug/ml eller forøkelser derav.

[000166] I tillegg til anrikningstrinnet kan metoden for antistoff seleksjon også omfatte én eller flere trinn for screening av en cellepopulasjon for antistoff-bindingsstyrke. Antistoff-bindingsstyrke kan måles ved hvilken som helst metode kjent på området (f.eks. Biacore). I én utførelsesform gir minst én av de isolerte, antigen-spesifikke cellene et antistoff som har en høy antigen affinitet, f.eks. en dissosiasjonskonstant (Kd) på mindre enn ca. SxlO^M"<1>, fortrinnsvis ca. lxlO"<13>M"<1>til 5xl0"10 M"<1>, 1x10"<12>M^to 7,5xl0"<n>M"<1>,lxl0"<n>M"<1>til 2xl0"<n>M"<1>eller ca. I,5xl0"<n>M"<1>eller mindre eller forøkelser derav. I denne utførelsesformen er antistoffene angitt å være affinitets moden. I en foretrukket utførelsesform er affiniteten til antistoffene anvendt for humanisering sammenlignbar med eller høyere enn affiniteten til hvilket som helst et av Panorex® (edrecolomab), Rituxan® (rituximab), Herceptin® (traztuzumab), Mylotarg® (gentuzumab), Campath® (alemtuzumab), Zevalin™ (ibritumomab), Erbitux™ (cetuximab), Avastin™ (bevicizumab), Raptiva™ (efalizumab), Remicade® (infliximab), Humira™ (adalimumab) og Xolair™ (omalizumab). Fortrinnsvis, er affiniteten til antistoffene sammenlignbare med eller høyere enn affiniteten til Humira™. Affiniteten til et antistoff kan også bli øket ved kjente affinitetsmodningsteknikker. I én utførelsesform blir minst én cellepopulasjon screenet for minst en av, fortrinnsvis både, antistoff funksjonalitet og antistoff bindingsstyrke.

[000167] I tillegg til anrikningstrinnet kan metoden for antistoff seleksjon anvendt for å velge kandidater for humanisering også omfatte én eller flere trinn for screening av en kanin-cellepopulasjon for antistoffsekvenshomologi, spesielt human homologi. I én utførelsesform, gir minst én av de isolerte, antigen-spesifikke celler et antistoff som har en homologi med et humant antistoff på ca. 50% til ca. 100% eller forøkelser derav eller større enn ca. 60%, 70%, 80%, 85%, 90% eller 95% homolog.

[000168] I en annen foretrukket utførelsesform tilveiebringer foreliggende oppfinnelse også kanin avledete humaniserte antistoffer produsert fra antistoffer i henhold til hvilke som helst av utførelsesformene beskrevet ovenfor når det gjelder IC50, Kd og/eller homologi.

[000169] B celle seleksjonsprotokoll beskrevet her som fortrinnsvis er anvendt for å identifisere B-celler produserende antistoffer som har en affinitet og funksjonelle egenskaper som gjør dem til gode kandidater for humanisering har flere intrinsiske fordeler versus andre metoder for å oppnå antistoff-utskillende B-celler og monoklonale antistoffer spesifikke for det ønskete målantigenet. Disse fordeler omfatter, men er ikke begrenset til, de følgende:

[000170] Først er det funnet at når disse seleksjonsprosedyrene blir anvendt med et ønsket antigen så som IL-6 eller TNF-a, resulterer metodene reproduserbart til antigen-spesifikke B-celler f.eks. avledet fra kaniner som er i stand til å danne det som synes å være et hovedsakelig omfattende komplement av antistoffer, dvs. antistoffer som binder til de forskjellige ulike epitoper av antigenet. Uten å være bundet av teori, er det antatt at det omfattende komplementet kan tilskrives antigen anrikningstrinnet som blir utført før den innledende B celle gjenvinningen. Videre, tillater denne fordelen isoleringen og seleksjonen av antistoffer med forskjellige egenskaper idet disse egenskaper kan variere avhengig av den epitopiske spesifisiteten av det spesielle antistoffet. Disse antistoffene er ideelle utgangsmaterialer for de oppfinneriske humaniseringsstrategiene.

[000171] For det andre er det funnet at den oppfinneriske B celle seleksjonsprotokollen gir reproduserbart en klonal B cellekultur inneholdende en enkelt B celle eller dens avkom, som utskiller et enkelt monoklonalt antistoff som generelt binder til det ønskede antigenet med en relativ høy bindingsaffinitet. I kontrast til dette, har tidligere antistoff seleksjonsmetoder tendens til å gi relativt få høye affinitetsantistoffer og som derfor krever omfattende screeningsprosedyrer for å isolere et antistoff med terapeutisk potensiale. Uten å være bundet av noen teori, er det antatt at den oppfinneriske protokollen resulterer i både in vivo B celle immunisering av verten (primær immunisering) fulgt av en andre in vitro B celle stimulering (sekundær antigen primingstrinn) som kan øke evnen og tilbøyelighet av de isolerte klonale B-celler til å utskille et enkelt høy affinitet monoklonalt antistoff spesifikt for antigenmålet.

[000172] For det tredje, har det vært observert at den oppfinneriske B celle seleksjonsprotokollen gir reproduserbart anrikete B-celler som produserer IgG som er, i gjennomsnitt, meget selektiv (antigen spesifikk) for det ønskede målet. Delvis basert på dette, er antigen-anrikete B-celler isolert ved de oppfinneriske metoder antatt å inneholde B-celler som er i stand til å gi det ønskede hele komplementet av epitope spesifisitetene som beskrevet ovenfor.

[000173] For det fjerde, har det vært observert at denne B celle seleksjonsprotokoll, selv når anvendt med små antigener, dvs. peptider på 100 aminosyrer eller mindre, f.eks. 5-50 aminosyrer lange, gir reproduserbart opphav til en klonal B cellekultur som utskiller et enkelt høy affinitet antistoff til det lille antigenet, f.eks. et peptid. Dette er meget overraskende idet det er generelt veldig vanskelig, arbeidskrevende og noen ganger ikke mulig å produsere høy affinitet antistoffer mot små peptider. Følgelig, kan disse metoder anvendes for å produsere ideelle kandidater for oppnåelse av humaniserte terapeutiske antistoffer mot ønskete peptidmål, f.eks. virale, bakterielle eller autoantigene peptider, derved muliggjøre fremstillingen av monoklonale antistoffer med meget adskilte bindingsegenskaper eller til og med fremstilling av en cocktail av monoklonale antistoffer mot forskjellige peptidmål, f.eks. forskjellige virale stammer. Denne fordelen kan spesielt være anvendelig i sammenheng med fremstilling av en terapeutisk eller profylaktisk vaksine som har en ønsket valens, så som en HP V vaksine som fremkaller beskyttende immunitet til forskjellige HP V stammer.

[000174] For det femte, har denne B celle seleksjonsprotokollen, spesielt når anvendt med B-celler avledet fra kaniner, en tendens til å reproduserbart gi antigen-spesifikke antistoff-sekvenser som er meget lik endogene humane immunoglobuliner (rundt 90% likhet på aminosyrenivået) og som inneholder CDR som har en lengde meget analog med humane immunoglobuliner og som derfor krever liten eller ingen sekvens modifikasjon (typisk som beskrevet tidligere behøver bare maksimalt noen få CDR residuer bli modifisert i opphavs-antistoffsekvensen og ingen rammeverk eksogene residuer innført) for å eliminere potensiale betraktinger vedrørende immunogenisitet. Spesielt, vil rekombinant antistoff fortrinnsvis inneholde bare verten (kanin) CDR1 og CDR2 residuene nødvendig for antigen gjenkjennelse og hele CDR3 idet dette synes å være viktig for modning av antistoff affinitet. Derved, forblir høy antigen bindingsaffinitet av de isolerte antistoff-sekvensene produsert i henhold til den oppfinneriske B cellen og antistoff seleksjonsprotokoll intakt eller hovedsakelig intakt selv med humanisering.

[000175] Oppsummert, kan de oppfinneriske metodene anvendes for å produsere humaniserte antistoffer som har høyere bindingsaffiniteter til mere distinkte epitoper ved anvendelse av en mer effektiv protokoll enn det som var tidligere kjent.

[000176] I en spesifikk utførelsesform tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en metode for å identifisere en enkelt B celle som utskiller et antistoff spesifikt for et ønsket antigen for humanisering i de oppfinneriske protokollene og som eventuelt har minst én ønsket funksjonell egenskap så som affinitet, aviditet, cytolytisk aktivitet og lignende ved en fremgangsmåte omfattende de følgende trinn:

[000177] a. immunisering av en vert mot et antigen;

[000178] b. høsting av B-celler fra verten;

[000179] c. anrikning av nøstete B-celler for å øke frekvensen av antigen-spesifikke celler;

[000180] d. danne minst én enkel cellesuspensjon;

[000181] e. dyrkning av en sub-populasjon fra en enkelt cellesuspensjon under betingelser som favoriserer overlevelsen av en enkelt antigen-spesifikk B celle pr. kulturbrønn;

[000182] f. isolering av mindre enn 10 til 12 B-celler fra sub-populasjonen; og

[000183] g. bestemmelse av hvorvidt den enkelte B cellen gir et antistoff spesifikt for antigenet.

[000184] De oppfinneriske metodene vil videre omfatte et ytterligere trinn av isolering og sekvensering, helt eller delvis, polypeptidet og nukleinsyresekvenser som koder for det ønskede antistoffet for å identifisere de kritiske residuene så som selektivitetsbestemmende residuer og for å anvende denne sekvensen som del av et BLAST søk for å identifisere kandidat homologe humane variable sekvenser for anvendelse for å oppnå en ideell humanisert versjon derav. Disse sekvenser eller humaniserte versjoner eller deler derav kan uttrykkes i de ønskete vertscellene for å produsere rekombinante antistoffer mot et ønsket antigen så som IL-6, TNF- a, hepatocytt vekstfaktor, hepcidin et al.

[000185] Som angitt tidligere, er det antatt at den klonale populasjonen av B-celler overveiende omfatter antistoff-utskillende B-celler som produserer antistoff mot det ønskede antigenet. Det er også antatt basert på eksperimentelle resultater oppnådd med mange antigener og med forskjellige B cellepopulasjoner at de klonalt produserte B-celler og de isolerte antigen-spesifikke B-celler avledet derifra produsert ifølge oppfinnelsen utskiller et monoklonalt antistoff som er typisk for relativt høy affinitet og kan videre effektivt og reproduserbart produsere en seleksjon av monoklonale antistoffer med større epitopisk variabilitet sammenlignet med andre metoder for oppnåelse av monoklonale antistoffer fra dyrkete antigen-spesifikke B-celler. I foreliggende oppfinnelse vil populasjonen av immunceller anvendt i slike B celle seleksjonsmetoder være avledet fra en kanin eller et dyr nært relatert dertil så som en annen Leporidae art. Det er antatt at anvendelse av kaniner eller nært relaterte pattedyr som en kilde for B-celler kan øke mangfoldet av de monoklonale antistoffene som kan anvendes i foreliggende oppfinnelse for å oppnå humaniserte versjoner. Videre har antistoffsekvenser avledet fra kaniner ifølge oppfinnelsen typisk sekvenser som har en høy grad av sekvensidentitet med humane antistoff-sekvenser som gjør dem gunstige for anvendelse i mennesker siden de skal resultere i humaniserte varianter som har liten antigenisitet. I løpet av humaniseringen, inneholder det endelige humaniserte antistoffet en meget lavere fremmed/vert residue innhold, vanligvis begrenset til en underklasse av vertens CDR residuer som avviker dramatisk på grunn av deres nature versus den humane målsekvensen anvendt i podningen. Dette øker sannsynligheten for fullstendig isolering av aktivitet i det humaniserte antistoffproteinet produsert ved anvendelse av den oppfinneriske humaniseringsstrategi en.

[000186] Metodene for antistoffseleksjon ved anvendelse av et anrikningstrinn beskrevet her omfatter et trinn for oppnåelse av en immuncelle-inneholdende cellepopulasjon fra en immunisert vert. Metoder for oppnåelse av en immuncelle-inneholdende cellepopulasjon fra en immunisert vert er kjent på området og omfatter generelt indusering av en immunrespons i en vert og høsting av celler fra verten for å oppnå én eller flere cellepopulasjoner. Responsen kan fremkalles ved immunisering av verten mot et ønsket antigen. Alternativt, kan verten anvendt som en kilde for slike immunceller bli naturlig eksponert for det ønskede antigenet så som et individ som er blitt infisert med et spesielt patogen så som en bakterie eller virus eller som alternativt har dannet en spesifikk antistoff respons mot en kreftform som individet er rammet av. I foreliggende metoder er vertene kaniner.

[000187] Som nevnt kan immunrespons forekomme naturlig, som et resultat av sykdom eller den kan fremkalles ved immunisering med antigenet. Immunisering kan utføres ved hvilken som helst metode kjent på området, så som, ved én eller flere injeksjoner av antigenet med eller uten et middel for å forbedre immunresponsen, så som fullstendig eller ufullstendig Freund's adjuvans. Som et alternativ for å immunisere et vertsdyr in vivo, kan metoden omfatte immunisering av en vertscellekultur in vitro.

[000188] Etter å tillate tid for immunresponsen (f.eks. som målt ved serum antistoff deteksjon), blir vertsdyreceller høstet for å oppnå én eller flere cellepopulasjoner. I en foretrukket utførelsesform, blir en høstet cellepopulasjon screenet for antistoff bindingsstyrke og/eller antistoff funksjonalitet. En høstet cellepopulasjon er fortrinnsvis fra minst én av milten, lymfeknuter, benmarg og/eller perifert blod mononukleære celler (PBMCs). Cellene kan bli høstet fra mer enn én kilde og samlet. Visse kilder kan være foretrukket for visse antigener. For eksempel er milten, lymfeknuter og PBMC foretrukket for IL-6; og lymfeknuter er foretrukket for TNF. Cellepopulasjonen blir høstet ca. 20 til ca. 90 dager eller forøkelser derav etter immunisering, fortrinnsvis ca. 50 til ca. 60 dager. En høstet cellepopulasjon og/eller enkelt cellesuspensjon derfra kan bli anriket, screenet og/eller dyrket for antistoff seleksjon. Frekvensen av antigen-spesifikke celler innen en høstet cellepopulasjon er vanligvis ca. 1% til ca. 5% eller forøkelser derav.

[000189] I én utførelsesform, blir enkelt cellesuspensjon fra en høstet cellepopulasjon anriket, fortrinnsvis ved anvendelse av Miltenyikuler. Fra den nøstete cellepopulasjonen som har en frekvens av antigen-spesifikke celler på ca. 1% til ca. 5%, blir en anriket cellepopulasjon således avledet som har en frekvens av antigen-spesifikke celler tilnærmet 100%.

[000190] Metoden for antistoffseleksjon ved anvendelse av et anrikningstrinn omfatter et trinn for å produsere antistoffer fra minst én antigen-spesifikk celle fra en anriket cellepopulasjon. Metoder for å produsere antistoffer in vitro er velkjent på området og hvilken som helst egnet metode kan anvendes. I én utførelsesform, blir en anriket cellepopulasjon, så som en antigen-spesifikk enkelt cellesuspensjon fra en høstet cellepopulasjon, platet ved forskjellige celletettheter, så som 50, 100, 250, 500 eller andre forøkelser mellom 1 og 1000 celler pr. brønn. Fortrinnsvis, omfatter sub-populasjonen ikke mer enn ca. 10,000 antigen-spesifikke, antistoff-utskillende celler, mer foretrukket ca. 50-10,000, ca. 50-5,000, ca. 50-1,000, ca. 50-500, ca. 50-250 antigen-spesifikke, antistoff-utskillende celler eller forøkelser derav. Deretter, blir disse sub-populasjoner dyrket med egnet medium (f.eks. et aktivert T-celle kondisjonert medium, spesielt 1-5% aktivert kanin T-celle kondisjonert medium) på et feeder lag, fortrinnsvis under betingelser som favoriserer overlevelse av enkelt prolifererende antistoff-utskillende celle pr. kulturbrønn. Feederlaget omfatter generelt bestrålt cellemateriale, f.eks. EL4B-celler, utgjør ikke del av cellepopulasjonen. Cellene blir dyrket i et egnet media i en tid tilstrekkelig for antistoffproduksjon, for eksempel ca. 1 dag til ca. 2 uker, ca. 1 dag til ca. 10 dager, minst ca. 3 dager, ca. 3 til ca. 5 dager, ca. 5 dager til ca. 7 dager, minst ca. 7 dager eller andre forøkelser derav. I én utførelsesform, blir mer enn én sub-populasjon dyrket samtidig. Fortrinnsvis, overleverer en enkelt antistoff-produserende celle og avkom derav i hver brønn, som derved tilveiebringer en klonal populasjon av antigen-spesifikke B-celler i hver brønn. På dette stadiumet, er immunoglobulin G (IgG) produsert av den klonale populasjonen i samsvar med antigenspesifisiteten. I en foretrukket utførelsesform, viser IgGs en korrelasjon med antigen spesifisitet som er større enn ca. 50%, mer foretrukket større enn 70%, 85%, 90%, 95%, 99% eller forøkelser derav. Korrelasjoner er blitt demonstrert ved å sette opp B cellekulturer under begrensende betingelser for å etablere enkelte antigen-spesifikke antistoff produkter pr. brønn. Antigen-spesifikk versus generell IgG syntese ble sammenlignet. Tre populasjoner ble observert: IgG som gjenkjenner en enkelt formiat av antigen (biotinylert og direkte belegg), detekterbar IgG og antigen gjenkjennelse uavhengig av immobilisering og IgG produksjon alene. IgG produksjonen var helt i samsvar med antigen-spesifisiteten.

[000191] En supernatant inneholdende antistoffene blir eventuelt oppsamlet, som kan bli anriket, screenet og/eller dyrket for antistoff seleksjon i henhold til trinnene beskrevet ovenfor. I én utførelsesform, blir supernatanten anriket (fortrinnsvis ved en antigen-spesifisitetsforsøk, spesielt et ELISA forsøk) og/eller screenet for antistoff funksjonalitet.

[000192] I en annen utførelsesform, blir den anrikete, fortrinnsvis klonale, antigen-spesifikke B cellepopulasjonen hvorifra en supernatant beskrevet ovenfor eventuelt blir screenet for å detektere tilstedeværelsen av det ønskede utskilte monoklonale antistoffet blir anvendt for isoleringen av noen få B-celler, fortrinnsvis en enkelt B celle, som deretter blir testet i en passende analyse for å bekrefte tilstedeværelsen av enkelt antistoff-produserende B celle i den klonale B cellepopulasjonen. I én utførelsesform blir ca. 1 til ca. 20 celler isolert fra den klonale B cellepopulasjonen, fortrinnsvis mindre enn ca. 15, 12, 10, 5 eller 3 celler eller forøkelser derav, mest foretrukket enkelt celle. Screeningen blir fortrinnsvis utført ved et antigen-spesifisitetsforsøk, spesielt et haloforsøk. Haloforsøket kan utføres med et full lengde protein eller et fragment derav. Den antistofft-inneholdende supernatanten kan også bli screenet for minst én av: antigen bindingsaffinitet; agonisme eller antagonisme av antigen-ligand-binding, induksjon eller hemning av proliferasjonen av en spesifikk målcelletype; induksjon eller hemning av lyseringen av en målcelle og induksjon eller hemning av en biologisk bane som involverer antigenet.

[000193] Den identifiserte antigen-spesifikke cellen avledet fra en kaninvert kan anvendes for å oppnå de tilsvarende nukleinsyresekvenser som koder for det ønskede monoklonale antistoffet som kan anvendes i de oppfinneriske humaniseringsmetodene. (En Alul spaltning kan bekrefte at bare en enkelt monoklonal antistofftype blir produsert pr. brønn.) Som nevnt ovenfor, blir disse sekvenser deretter fortrinnsvis mutert, ved de oppfinneriske humaniseringsprotokollene , for å gjør dem mer egnet for anvendelse i humane medikamenter.

[000194] Som nevnt, kan den anrikete B cellepopulasjonen fra kaniner anvendt i den oppfinneriske prosessen også bli videre anriket, screenet og/eller dyrket for antistoff seleksjon i henhold til trinnene beskrevet ovenfor som kan gjentas eller bli utført i en annen rekkefølge. I en foretrukket utførelsesform, blir minst én celle av en anriket, fortrinnsvis klonal, antigen-spesifikk cellepopulasjon isolert, dyrket og anvendt for antistoffseleksj on.

[000195] Således, tilveiebringer foreliggende oppfinnelse i en annen utførelsesform en metode for å isolere antistoffkandidater for anvendelse i gjeldende humaniseringsmetoder omfattende:

[000196] a. høsting av en cellepopulasjon fra en immunisert kaninvert for å oppnå en høstet cellepopulasjon;

[000197] b. danne minst én enkel cellesuspensjon fra en høstet cellepopulasjon;

[000198] c. anrikning av minst én enkel cellesuspensjon, fortrinnsvis ved kromatografi, for å danne en første anriket cellepopulasjon;

[000199] d. anrikning av den første anrikete cellepopulasjonen, fortrinnsvis ved ELISA forsøk, for å danne en andre anriket cellepopulasjon som fortrinnsvis er klonal, dvs. den inneholder bare en enkelt type av antigen-spesifikk B celle;

[000200] e. anrikning av den andre anrikete cellepopulasjonen, fortrinnsvis med haloforsøk, for å danne en tredje anriket cellepopulasjon inneholdende en enkelt eller et lite antall B-celler som produserer et antistoff spesifikk for et ønsket antigen; og

[000201] f. selektering av et antistoff produsert av en antigen-spesifikk celle isolert fra den tredje anrikete cellepopulasjonen.

[000202] Metoden kan videre omfatte én eller flere trinn av screening av den høstete cellepopulasjonen for antistoff-bindingsstyrke (affinitet, aviditet) og/eller antistoff funksjonalitet. Egnet screeningstrinn omfatter, men er ikke begrenset til, forsøksmetoder som detektere: hvorvidt antistoffet produsert av den identifiserte antigen-spesifikke B cellen produserer et antistoff som har en minimal antigen bindingsaffinitet, hvorvidt antistoffet agoniserer eller antagoniserer bindingen av et ønsket antigen til en ligand; hvorvidt antistoffet fremkaller eller hemmer proliferasjonen av en spesifikk celletype; hvorvidt antistoffet fremkaller eller utløser en cytolytisk reaksjon mot målceller; hvorvidt antistoffet binder til en spesifikk epitop; og hvorvidt antistoffet modulerer (hemmer eller agoniserer) en spesifikk biologisk bane eller baner som involverer antigenet.

[000203] Tilsvarende, kan metoden omfatte én eller flere trinn for screening av den andre anrikete cellepopulasjonen for antistoff bindingsstyrke og/eller antistoff funksjonalitet.

[000204] Metodene omfatter videre et trinn for sekvensering av polypeptidsekvensen eller den tilsvarende nukleinsyresekvens av det valgte antistoffet for å identifisere de kritiske residuene og for å utføre BLAST søk av passende homologe humane kimlinje antistoff-sekvenser for anvendelse i den gjeldende humaniseringsmetoden. Metodene omfatter også et trinn for produsering av et rekombinant antistoff ved anvendelse av sekvensen, et fragment derav eller en genetisk modifisert humanisert versjon av det valgte antistoffet. Disse humaniseringsmutasjons-metodene kan gi rekombinante antistoffer som har ønsket effektor funksjon, immunogenisitet, stabilitet, fjerning eller tilsetning av glykosylering og lignende. Det rekombinante humaniserte antistoffet eller humaniserte antistoffragmenter beskrevet her kan produseres av hvilken som helst egnet rekombinant celle, omfattende, men ikke begrenset til pattedyrceller så som CHO, COS, BHK, HEK-293, bakterieceller, gjærceller, planteceller, insektceller og amfibieceller. I en foretrukket utførelsesform, bli opphavskanin antistoffet og humaniserte antistoffer avledet fra disse antistoffene og homologe humane variable sekvenser uttrykt i polyploidale gjærceller, dvs. diploide gjærceller, spesielt Pichia.

[000205] I det vesentlige, kan metoden utføres som følger:

[000206] a. immunisering av en kaninvert mot et antigen for å gi kaninantistoffer;

[000207] b. screening av de oppnådde kaninantistoffene for antigen spesifisitet og nøytralisering;

[000208] c. høsting av B-celler fra kaninen;

[000209] d. anrikning av de høstete kanin B-celler for å skape en anriket cellepopulasjon som har en øket frekvens av antigen-spesifikke celler;

[000210] e. dyrkning av én eller flere sub-populasjoner fra den anrikete cellepopulasjonen under betingelser som favoriserer overlevelsen av en enkelt B celle for å produsere en klonal populasjon i minst én kulturbrønn;

[000211] f. bestemmelse av hvorvidt den klonale populasjonen produserer et kanin antistoff spesifikt for antigenet;

[000212] g. isolering av en enkelt kanin B celle; og

[000213] h. sekvensering av nukleinsyresekvensen av kaninantistoffet produsert av den enkelte B cellen og

[000214] i. ved anvendelse av denne antistoffsekvensen for å oppnå humaniserte antistoffer som har affiniteten og eventuelt andre egenskaper til opphavskanin antistoffet ved anvendelse av de oppfinneriske humaniseringsstrategier.

[000215] Metoder for Humanisering AvAntistoffer

[000216] Som beskrevet tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en ny og forbedret metode for humanisering av kanin antistoff tung og lettkjeder. Metodene ifølge oppfinnelsen kan utføres som følger for humaniseringen av kanin antistoff tunge og lette kjeder:

[000217] Humanisering av kanin antistoff Lettkjede

[000218] 1. Identifiser aminosyren som er den første etter signalpeptidetsekvensen. Dette er starten på Rammeverk 1. Signalpeptidet starter ved første initieringsmetionin og er typisk, men ikke nødvendigvis 22 aminosyrer i lengde for kanin lettkjede proteinsekvenser. Starten av det modne polypeptidet kan også bestemmes eksperimentelt ved N-terminal proteinsekvensering eller kan bli forutsagte ved anvendelse av en forutsigelses algoritme. Dette er også starten på Rammeverk 1 som klassisk definert av de innenfor fagområdet.

[000219] Eksempel: RbtVL Aminosyrerest 1 i Figur 2, begynnende med 'AYDM...'

[000220] 2. Identifisere slutten av Rammeverk 3. Dette er typisk 86-90 aminosyrer etter starten av Rammeverk 1 og er typisk en cysteinrest med to tyrosinrester forut. Dette er slutten på Rammeverk 3 som klassisk definert av de innenfor fagområdet.

[000221] Eksempel: RbtVL aminosyrerest 88 i Figur 2, ender som 'TYYC

[000222] 3. Anvendelse av kanin lettkjede-sekvensen av polypeptidet ved å starte fra begynnelsen av Rammeverk 1 til slutten av Rammeverk 3 som definert ovenfor og danner et sekvenshomologisøk for de mest lignende humane antistoff proteinsekvenser. Dette vil typisk være et søk mot humane kimlinjesekvenser før antistoff modning for å redusere muligheten av immunogenisitet, imidlertid kan hvilke som helst humane sekvenser anvendes. Typisk kan et program som BLAST anvendes for søk av en database av sekvenser for den mest homologe. Databaser av humane antistoff-sekvenser kan finnes fra forskjellige kilder så som NCBI (National Center for Biotechnology Information).

[000223] Eksempel: RbtVL aminosyresekvensen fra residiene nummerert fra 1 t.o.m 88 i Figur 2 blir BLASTed mot en human antistoff kimlinje-database. De topp tre unike returnerte sekvenser er vist i Figur 2 som L12A, VI og Vx02.

[000224] 4. Generelt blir den mest homologe humane kimlinje variabel lettkjede sekvensen deretter anvendt som basis for humaniseringen. Imidlertid kan fagfolk på området bestemme å anvende en annen sekvens som ikke var den med høyest homologi som bestemt ved homologialgoritmen, basert på andre faktorer omfattende sekvensgap og rammeverk likheter.

[000225] Eksempel: I figur 2, var L12A den mest homologe humane kimlinje variabel lettkjede sekvensen og blir anvendt som basis for humaniseringen av RbtVL.

[000226] 5. Bestemme rammeverk og CDR arrangement (FRI, FR2, FR3, CDR1 & CDR2) for den humane homologen som blir anvendt for lettkjede humaniseringen. Dette er ved anvendelse av det tradisjonelle opplegget som beskrevet i området. Oppstill kanin variabel lettkjede sekvensen med den humane homologen, mens man opprettholder utformingen av rammeverket og CDR regioner.

[000227] Eksempel: I Figur 2, er RbtVL sekvensen oppstilt med den humane homologe sekvensen L12A og rammeverket og CDR domener er angitt.

[000228] 6. Erstatte de humane homologe lettkjedesekvens CDR1 og CDR2 regionene med CDR1 og CDR2 sekvenser fra kaninsekvensen. Hvis det er forskjeller i lengde mellom kanin og humane CDR sekvenser bruk da hele kanin CDR sekvenser og deres lengder. Det er mulig at spesifisiteten, affiniteten og/eller immunogenisitet av det resulterende humaniserte antistoffet kan være uendret hvis mindre eller større sekvens utvekslinger blir utført eller hvis spesifikke residue blir endret, imidlertid er de beskrevne endringene blitt anvendt med hell, men utelukker ikke muligheten av at andre endringer kan være tillatt.

[000229] Eksempel: I figur 2, blir CDR1 og CDR2 aminosyrerestene av den humane homologe variabel lettkjede L12A erstattet med CDR1 og CDR2 aminosyresekvenser fra RbtVLkanin antistoff lettkjede sekvensen. De humane L12A rammeverkene 1, 2 og 3 er uendrete. Den resulterende humaniserte sekvensen er vist nedenfor som VLh fra residiene nummerert fra 1 t.o.m 88. Merk at de eneste residuene som er forskjellige fra L12A human sekvens er understreket og er således kanin-avledete aminosyrerester. I dette eksemplet er bare 8 av de 88 residuene forskjellige fra den humane sekvensen.

[000230] . Etter rammeverk 3 av den nye hybridsekvensen dannet i Trinn 6, hele CDR3 av kanin lettkjede antistoffsekvensen kobles. CDR3 sekvensen kan ha forskjellige lengder, men er typisk 9 til 15 aminosyrerester i lengde. CDR3 regionen og begynnelsen av den følgende rammeverk 4 regionen er definert klassisk og identifiserbar av fagfolk på området. Typisk består begynnelsen av Rammeverk 4 og således etter slutten av CDR3 av sekvensen 'FGGG...', imidlertid kan viss variasjon eksistere i disse residuene.

[000231] Eksempel: I figur 2, blir CDR3 av RbtVL (aminosyrerestene nummerert 89-100) tilsatt etter slutten av rammeverk 3 i den humaniserte sekvensen angitt som VLh.

[000232] 8. Kanin lettkjede rammeverk 4, som er typisk de endelige 11 aminosyrerestene av variabel lettkjede og begynner som angitt i Trinn 7 ovenfor og ender typisk med aminosyresekvensen '...VVKR' blir erstattet med nærmeste humane lettkjede rammeverk 4 homolog, vanligvis fra kimlinjesekvensen. Ofte har denne human lettkjede rammeverk 4 sekvensen 'FGGGTKVEIKR'. det er mulig at andre humane lettkjede rammeverk 4 sekvenser som ikke er de mest homologe eller på annen måte forskjellige kan anvendes uten å påvirke spesifisiteten, affiniteten og/eller immunogenisiteten av det resulterende humaniserte antistoff. Denne humane lettkjede rammeverk 4 sekvensen blir tilsatt i slutten av variabel lettkjede humanisert sekvens umiddelbart etter CDR3 sekvensen fra Trinn 7 ovenfor. Dette er nå slutten av variabel lettkjede humanisert aminosyresekvens.

[000233] Eksempel: I figur 2, er Rammeverk 4 (FR4) av RbtVL kanin lettkjede sekvensen vist ovenfor en homolog human FR4 sekvens. Den humane FR4 sekvensen blir satt til den humaniserte variabel lettkjede sekvensen (VLh) rett etter slutten av CD3 regionen tilsatt i Trinn 7 ovenfor.

[000234] Humanisering av kanin antistoff tungkj eden

[000235] 1. Identifisere aminosyren som er den første etter signalpeptidetsekvensen. Dette er starten på Rammeverk 1. Signalpeptidet starter ved den første initierende metionin og er typisk 19 aminosyrer i lengde for kanin tungkjede proteinsekvenser. Typisk, men ikke nødvendigvis alltid, er de endelige 3 aminosyrerestene av et kanin tungkjede signalpeptid '...VQC, fulgt av starten av Rammeverk 1. Starten av det modne polypeptidet kan også bestemmes eksperimentelt ved N-terminal proteinsekvensering eller kan bli bestemt ved anvendelse av en antagelsesalgoritme. Dette er også starten av Rammeverk 1 som klassisk definert av de innenfor fagområdet.

[000236] Eksempel: RbtVH Aminosyrerest 1 i Figur 2, begynnende ved 'QEQL...'

[000237] 2. Identifisere slutten av Rammeverk 3. Dette er typisk 95-100 aminosyrer etter starten av Rammeverk 1 og har typisk den endelige sekvensen av '...CAR' (selv om alanin også kan være en valin). Dette er slutten på Rammeverk 3 som klassisk definert av de innenfor fagområdet.

[000238] Eksempel: RbtVH aminosyrerest 98 i Figur 2, ender som '...FCVR'.

[000239] 3. Anvendelse av kanin tungkjede sekvensen av polypeptidet ved å starte fra begynnelsen av Rammeverk 1 til slutten av Rammeverk 3 som definert ovenfor og danner et sekvenshomologisøk for de mest like humane antistoff proteinsekvenser. Dette vil typisk være mot en database av humane kimlinjesekvenser før antistoff modning for å redusere muligheten av immunogenisitet, imidlertid kan hvilke som helst humane sekvenser anvendes. Typisk kan et program som BLAST anvendes for å søke en database av sekvenser for den mest homologe. Databaser av humane antistoff-sekvenser kan finnes fra forskjellige kilder så som NCBI (National Center for Biotechnology Information).

[000240] Eksempel: RbtVH aminosyresekvens fra residiene nummerert fra 1 to.m 98 i

Figur 2 blir BLASTed mot en human antistoff kimlinje database. De topp tre unike returnerte sekvenser er vist i Figur 2 som 3-64-04, 3-66-04 og 3-53-02.

[000241] 4. Generelt blir den mest homologe humane kimlinje variabel tungkjede sekvensen deretter anvendt som basis for humaniseringen. Imidlertid kan fagfolk på området bestemme å anvende en annen sekvens som ikke var den mest homologe som bestemt ved homologialgoritmen, basert på andre faktorer omfattende sekvens gap og rammeverk similariteter.

[000242] Eksempel: 3-64-04 i Figur 2 var den mest homologe humane kimlinje variabel tungkjede sekvens og blir anvendt som basis for humaniseringen av RbtVH.

[000243] 5. Bestemme rammeverk og CDR arrangement (FRI, FR2, FR3, CDR1 & CDR2) for den humane homologen som anvendes for tungkjede humaniseringen. Dette er ved anvendelse av det tradisjonelle oppsettet som beskrevet i området. Oppstill kanin variabel tungkjede sekvens med den humane homologen, mens utformingen opprettholdes av rammeverk og CDR regioner.

[000244] Eksempel: I Figur 2, er RbtVH sekvensen oppstilt med den humane homolog sekvensen 3-64-04 og rammeverk og CDR domener er angitt.

[000245] 6. Erstatt humane homologe tungkjede sekvens CDR1 og CDR2 regionene med CDR1 og CDR2 sekvenser fra kaninsekvensen. Hvis det er forskjeller i lengde mellom kanin og humane CDR sekvenser da anvendes hele kanin CDR sekvenser og deres lengder. I tillegg, kan det være nødvendig å erstatte de endelige tre aminosyrene av den humane tungkjede Rammeverk 1 regionen med de endelige tre aminosyrene av kanin tungkjede Rammeverk 1. Typisk men ikke alltid, i kanin tungkjede Rammeverk 1 disse tre residuene følger en Glycin residue med en serin residue foran. I tillegg, kan det være nødvendig å erstatte den endelige aminosyren av den humane tungkjede rammeverk 2 regionen med den endelige aminosyren av kanin tungkjede Rammeverk 2. Typisk, men ikke nødvendigvis alltid, er dette en Glycin residue med forut en isoleucin residue i kanin tungkjede Rammeverk 2. Det er mulig at spesifisiteten, affiniteten og/eller immunogenisiteten av det resulterende humaniserte antistoffet kan være uendret hvis mindre eller større sekvensutvekslinger blir utført eller hvis spesifikke residue(er) er endret, imidlertid er utvekslinger som beskrevet blitt anvendt med hell, men utelukker ikke muligheten av at andre endringer kan være tillatt. For eksempel forekommer en tryptofan aminosyrerest typisk fire residuer før slutten av kanin tungkjede CDR2 regionen, mens i human tungkjede CDR2 er dette residuet typisk et serin residue. Endring av dette kanin tryptofan residue til det humane serin residue i denne stillingen er vist å ha minimal til ingen effekt på det humaniserte antistoffets spesifisitet eller affinitet og minimaliserer således videre innholdet av kaninsekvens-avledete aminosyrerestene i den humaniserte sekvensen.

[000246] Eksempel: I figur 2, blir CDR1 og CDR2 aminosyrerestene av den humane homologe variabel tungkj eden erstattet med CDR1 og CDR2 aminosyresekvenser fra RbtVHkanin antistoff lettkjede sekvensen, bortsett fra for residue i boksen, som er tryptofan i kaninsekvensen (stillingsnummer 63) og serin i samme stilling i den humane sekvensen og blir holdt som det humane serin residue. I tillegg til CDR1 og CDR2 endringer, blir de endelige tre aminosyrer av Rammeverk 1 (stillinger 28-30) så vel som det endelige residue av Rammeverk 2 (stilling 49) beholdt som kanin aminosyrerestene istedenfor human. Den resulterende humaniserte sekvens er vist nedenfor som VHh fra residiene nummerert fra 1 to.m 98. Merk at de eneste residuene som er forskjellige fra 3-64-04 humane sekvensen er understreket og er således kanin-avledete aminosyrerester. I dette eksemplet er bare 15 av 98 residuene forskjellige enn den humane sekvensen.

[000247] 7. Etter rammeverk 3 av den nye hybridsekvensen dannet i Trinn 6, hele CDR3 av kanin tungkjede antistoffsekvensen kobles. CDR3 sekvensen kan ha forskjellige lengder, men er typisk 5 til 19 aminosyrerester i lengde. CDR3 regionen og begynnelsen av den følgende rammeverk 4 regionen er definert klassisk og er identifiserbar av fagfolk på området. Typisk begynnelsen av rammeverk 4 og således etter slutten av CDR3 består av sekvensen WGXG...(hvor X er vanligvis Q eller P), imidlertid kan en viss variasjon eksistere i disse residuene.

[000248] Eksempel: CDR3 av RbtVH (aminosyrerestene nummerert 99-110) blir tilsatt etter slutten av rammeverk 3 i den humaniserte sekvensen angitt som VHh.

[000249] 8. Kanin tungkjede rammeverk 4, som er typisk de endelige 11 aminosyrerestene av variabel tungkjede og begynner som angitt i Trinn 7 ovenfor og typisk ender med aminosyresekvensen '...TVSS' blir erstattet med nærmeste humane tungkjede rammeverk 4 homolog, vanligvis fra kimlinjesekvensen. Ofte har denne humane tungkjede rammeverk 4 sekvensen 'WGQGTLVTVSS'. Det er mulig at andre humane tungkjede rammeverk 4 sekvenser som ikke er den mest homologe eller på annen måte forskjellig kan anvendes uten å påvirke spesifisiteten, affiniteten og/eller immunogenisitet av det resulterende humaniserte antistoff. Denne humane tungkjede rammeverk 4 sekvensen blir satt til slutten av variabel tungkjede humanisert sekvens umiddelbart etter CDR3 sekvensen fra Trinn 7 ovenfor. Dette er nå slutten av variabel tungkjede humanisert aminosyresekvens.

[000250] Eksempel: I Figur 2, er rammeverk 4 (FR4) av RbtVH kanin tungkjede sekvensen vist over en homolog human tung FR4 sekvens. Den humane FR4 sekvensen blir satt til den humaniserte variable tungkjede sekvensen (VHh) rett etter slutten av CD3 regionen tilsatt i Trinn 7 ovenfor.

[000251] Tidligere beskrevet humaniseringsmetoder gir betydelige fordeler i forhold til tidligere humaniseringsmetoder. For eksempel tilveiebringer oppfinnelsen en metode for humanisering av antistoff-sekvenser fra kanin antistoffsekvenser som erstatter en meget stor prosentdel av kanin aminosyrerestene med humane antistoffresiduene fra en valgt homolog oppstilt human antistoffsekvens. Følgelig er det mindre sannsynlig at de er immunogene i mennesker.

[000252] I tillegg er de oppfinneriske metodene basert kun på en sammenligning av primære sekvenser og er ikke basert på eller trenger (i) en forståelse av den tre dimensjonale strukturen av donor eller akseptor antistoff-sekvenser; (ii) en forståelse av lokaliseringen av residuene når det gjelder overflate mot bdekkete residuer; (iii) prøve ut forskjellige versjoner eller variasjoner av forskjellige rammeverk residue alternativer ved spesifikke eller tilfeldige seter. Følgelig er foreliggende oppfinnelse meget effektiv i forhold til de mer komplekse humaniseringsmetodene uten noen kompromis til de ønskede egenskaper til de resulterende humaniserte antistoffene så som bindingsaffinitet og andre funksjonelle egenskaper.

[000253] Videre og relatert til det foregående, har de resulterende humaniserte antistoffene produsert ved de oppfinneriske metodene identisk eller praktisk talt identisk bindingsspesifisitet i forhold til opphavskanin antistoffet.

[000254] Videre krever de oppfinneriske metodene ingen ytterligere "affinitetsmodning" for å optimalisere eller forøke antigen affinitet. I kontrast til dette er det i de fleste andre humaniseringsmetodene nødvendig å i betydelig grad øke antigen affinitet etter humanisering (for å være terapeutisk eller diagnostisk effektiv ved anvendbare doser) som bevirker gjentagelser av "affinitetsmodnings" protokoller som screener gjennom flere tilfeldige eller definerte sekvensvarianter for å identifisere varianter med øket bindingsaffinitet. Følgelig, er foreliggende oppfinnelse enklere og mer effektiv enn tidligere humaniseringsmetoder.

[000255] Videre er foreliggende humaniseringsmetoder fordelaktige siden de resulterende humaniserte variable lett og tungkjede sekvenser kan anvendes for å produsere full-lengde antistoffer så vel som humaniserte antistoffragmenter eller fusjonsproteiner innehold. Derfor, er disse humaniserte antistoffer, humaniserte antistoffragmenter og fusjonsproteiner inneholdende det som er bundet til terapeutiske eller diagnostiske midler er velegnet for immunoterapi så vel som in vivo immunodiagnose og immunoprognose så som for anvendelse i avbildning av tumorvev, metastaser, aterosklerotiske plaque, inflammatorisk seter og lignende.

[000256] Foretrukne metoder for å produsere de oppfinneriske humaniserte antistoffer og fragmenter derav rekombinant

[000257] Oppfinnelsen angår også foretrukne metoder for fremstilling av de humaniserte kanin antistoffer beskrevet her eller fragmenter derav. Rekombinante polypeptider svarende til antistoffene beskrevet her eller fragmenter derav blir fortrinnsvis utskilt fra polyploidale, fortrinnsvis diploide eller tetraploide stammer av parringskompetent gjær. Oppfinnelsen angår metoder for å produsere disse rekombinante polypeptider i utskilt form i forlengete perioder ved anvendelse av kulturer omfattende polyploid gjær, dvs. minst mange dager til en uke, mer foretrukket minst en måned eller mange måneder og enda mer foretrukket minst 6 måneder til et år eller lenger. Disse polyploide gjærkulturene vil uttrykke minst 10-25 mg/liter av polypeptidet, mer foretrukket minst 50-250 mg/liter, fortsatt mer foretrukket minst 500-1000 mg/liter og mest foretrukket et gram pr. liter eller mer av det rekombinante polypeptidet(ene).

[000258] I én utførelsesform ifølge oppfinnelsen blir et par av genetisk markert gjær haploidceller omdannet med ekspresjonsvektorer omfattende subenheter av et ønsket heteromultimer protein. En haploid celle omfatter en første ekspresjonsvektor og en andre haploid celle omfatter en andre ekspresjonsvektor. I en annen utførelsesform vil diploide gjærceller bli transformert med én eller flere ekspresjonsvektorer som gir ekspresjon og sekresjon av én eller flere av de rekombinante humaniserte polypeptider gitt i oppfinnelsen. I enda en annen utførelsesform kan en enkel haploid celle omdannes med én eller flere vektorer og anvendt for å produsere en polyploidal gjær ved fusjon eller parrings strategier. I enda en annen utførelsesform kan en diploid gjærkultur omdannes med én eller flere vektorer som tilveiebringer ekspresjon og sekresjon av et ønsket humanisert kanin tung eller lettkjede eller antistoff polypeptid eller polypeptider produsert ifølge oppfinnelsen. Disse vektorer kan omfatte plasmider som blir holdt ekstra-kromosomalt eller kan omfatte vektorer f.eks. lineariserte plasmider som integrerer tilfeldig inn i gjærcelles genom eller ved homolog rekombinering. Eventuelt, kan ytterligere ekspresjonsvektorer innføres i haploide eller diploide celler; eller de første eller andre ekspresjonsvektorer kan omfatte ytterligere kodende sekvenser; for syntese av heterotrimerer;

heterotetramerer; etc. Ekspresjonsnivåene av de ikke-identiske polypeptidene kan bli

individuelt kalibrert og regulert ved passende seleksjon, vektor kopitall, promoter styrke og/eller induksjon og lignende. De transformerte haploidceller blir genetisk krysset eller kondensert. De resulterende diploide eller tetraploide stammer blir anvendt for å produsere og utskille fullstendig oppstilte og biologisk funksjonelle proteiner, humaniserte antistoffer beskrevet her eller fragmenter derav.

[000259] Anvendelse av diploide eller tetraploide celler for proteinproduksjon tilveiebringer uventete fordeler. Cellene kan dyrkes for produksjonsformål, dvs. oppskalert og i forlenget tidsrom, ved betingelser som kan være skadelige for veksten av haploidceller, idet betingelsene kan omfatte høy celletetthet; vekst i minimalt media; vekst ved lave temperaturer; stabil vekst i fravær av selektivt trykk; og som kan gi opprettholdelse av heterolog gensekvens integritet og opprettholdelse av espresjon i høyt nivå over tid. Uten å ønske å være bundet derav, beskriver oppfinnerene at disse fordelene kan oppstå, i det minste delvis, fra dannelsen av diploide stammer fra to bestemte parentale haploidstammer. Slike haploidstammer kan omfatte en rekke mindre autotrofe mutasjoner, idet mutasjoner er komplementerte i diploid eller tetraploid, som muliggjør vekst under meget selektive betingelser.

[000260] Transformerte parringskompetente haploide gjærceller gir en genetisk metode som muligjør subenhetparring av et ønsket humanisert antistoffprotein. Haploide gjærstammer blir omdannet med hver av to ekspresjonsvektorer, en første vektor for direkte syntesen av en polypeptidkjede og en andre vektor for å lede syntesen av en andre, ikke-identisk polypeptidkjede, dvs. humaniserte kanin tung og lettkjede polypeptider. De to haploide stammer blir parret for å gi en diploid vert hvor optimalisert målprotein (humaniserte kanin antistoff eller humaniserte kanin antistoffragment) produksjon kan oppnås.

[000261] Eventuelt, er ytterligere ikke-identiske kodende sekvensen(er) gitt. Slike sekvenser kan være til stede på ytterligere ekspresjonsvektorer eller i de første eller andre ekspresjonsvektorer. Som kjent på området, kan multipelt kodende sekvenser bli uavhengig uttrykt fra individuelle promotere; eller kan bli uttrykt koordinat ved inklusjonen av et "indre ribosominnførselssete" eller "IRES", som er et element som fremmer direkte indre ribosominnførsel til initieringskodonet, så som ATG, av en cistron (et protein kodende region), som derved fører til cap-uavhengig translasjon av genet. IRES elementer funksjonell i gjær er beskrevet av Thompson et al. (2001) P. N. A. S. 98:12866-12868.

[000262] I én utførelsesform ifølge oppfinnelsen blir antistoff-sekvenser produsert i kombinasjon med en sekretorisk J kjede, som tilveiebringer forbedret stabilitet av IgA (se U.S. Patent nr. 5,959,177; og 5,202,422).

[000263] I en foretrukket utførelsesform er de to haploide gjærstammer hver auxotrofe og krever supplementering av media for vekst av haploidcellene. Parret av auxotrofer er komplementære, slik at det diploide produktet vil vokse i fravær av supplementer nødvendige for de haploide cellene. Mange slike genetiske markører er kjent i gjær, omfattende krav for aminosyrer (f.eks. met, lys, his, arg, etc), nukleosider (f.eks. ura3, adel, etc); og lignende. Aminosyremarkører kan bli foretrukket for metodene ifølge oppfinnelsen. Alternativt kan diploide celler som inneholder de ønskede vektorene velges ved andre metoder, f.eks. ved anvendelse av andre selekterbare markører, så som grønt fluorescerende protein, forskjellige dominante selekterbare markører og lignende.

[000264] De to transformerte haploidceller kan bli genetisk krysset og diploide stammer som oppstår fra denne parringshendelsen kan bli valgt ved deres hybride næringsmessige krav. Alternativt, blir populasjoner av de to transformerte haploide stammer sfæroplastet og kondensert og diploide avkom regenerert og valgt. Ved hvilken som helst metode kan diploide stammer identifiseres og bli selektivt dyrket fordi, i motsetning til deres haploide opphav, de ikke har samme næringsmessige krav. For eksempel kan diploide celler dyrkes i minimalt medium. Den diploide syntesestrategien har visse fordeler. Diploide stammer har potensialet til å produsere forbedrete nivåer av heterologt protein ved bredere komplementering til underliggende mutasjoner, som kan tilveiebringe produksjonen og/eller sekresjonen av rekombinant protein.

[000265] Som angitt ovenfor, kan i noen utførelsesformer en haploid gjær omdannes med enkelt eller multippel vektorer og parret eller kondensert med en ikke-transformert celle for å produsere en diploidcelle inneholdende vektoren eller vektorer. I andre utførelsesformer, kan en diploid gjærcelle omdannes med én eller flere vektorer som gir ekspresjon og sekresjon av et ønsket humanisert kanin antistoff polypeptid eller polypeptider til den diploide gjærcellen.

[000266] I én utførelsesform ifølge oppfinnelsen blir to haploide stammer omdannet med et bibliotek av polypeptider, f.eks. et bibliotek av humaniserte kanin antistoff tung eller lettkjeder produsert ifølge oppfinnelsen. Transformerte haploidceller som syntetiserer polypeptidene blir parret med komplementære haploidceller. De resulterende diploide celler blir screenet for funksjonelt protein. De diploide celler gir en metode for rask, hensiktsmessig og billig forening av et stort antall av kombinasjoner av polypeptider for funksjonell testing. Denne teknologien er spesielt anvendbar for dannelse av heterodimere proteinprodukter, hvor optimaliserte subenhet syntesenivåer er kritisk for funksjonell protein ekspresjon og sekresjon.

[000267] I en annen utførelsesform ifølge oppfinnelsen blir ekspresjonsnivåforholdet av de to subenhetene regulert for å maksimere produktdannelsen. Heterodimer subenhet proteinnivåer er vist tidligere å tilveiebringe dannelse av sluttproduktet (Simmons LC, J Immunol Metoder. 2002 Kan l;263(l-2): 133-47). Regulering kan oppnås før parringstrinnet ved seleksjon for en markør til stede på ekspresjonsvektoren. Ved stabilt økende kopitall av vektoren, kan ekspresjonsnivået økes. I noen tilfeller, kan det være ønskelig for å øke nivået av én kjede i forhold til den andre, for å nå en balansert proporsjon mellom subenhetene av polypeptidet. Antibiotisk resistens markører er anvendelige for dette formålet, f.eks. Zeocin resistens markør, G418 resistens, etc. og gir en metode for anrikning for stammer som inneholder multiple integrerte kopier av en ekspresjonsvektor i en stamme ved selektering for transformanter som er resistente mot høyere nivåer av Zeocin eller G418. Riktig forhold, f.eks. 1:1; 1:2; etc. av subenheten gener kan være viktig for effektiv protein produksjon. Selv når samme promoter blir anvendt for å transkribere begge subenhetene, bidrar mange andre faktorer til det endelige nivået av uttrykt protein og kan derfor være anvendelige for å øke antallet kopier av et kodet gen i forhold til det andre. Alternativt, blir diploide stammer som produserer høyere nivåer av et humanisert antistoff polypeptid, i forhold til enkelt kopi vektor stammer, dannet ved parring av to haploide stammer, som begge har multiple kopier av ekspresjonsvektorene.

[000268] Vertsceller blir omdannet med de ovenfor beskrevne ekspresjonsvektorer, parret for å danne diploide stammer og dyrket i konvensjonelle næringsmiddel media modifisert som passer for å fremkalle promotere, selektering av transformanter eller amplifisering av genene som koder for de ønskede sekvenser. Flere minimale media egnet for veksten av gjær er kjent på området. Hvilket som helst av disse media kan suppleres som nødvendig med salter (så som natriumklorid, kalsium, magnesium og fosfat), buffere (så som HEPES, Kaliumfosfat, Natriumfosfat), nukleosider (så som adenosin og thymidin), antibiotika, sporelementer og glukose eller en ekvivalent energikilde. Hvilke som helst andre nødvendige supplementer kan også være omfattet i passende konsentrasjoner som vil være kjent for fagfolk på området. Dyrkningsbetingelser, så som temperatur, pH og lignende, er de tidligere anvendt med vertscellen valgt for ekspresjon og vil være innlysende for fagpersoner innen dette området.

[000269] Utskilte proteiner blir gjenvunnet fra dyrkningsmediet. En proteaseinhibitor, så som fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) kan være anvendelig for å hemme proteolytisk nedbrytning under rensning og antibiotika kan omfattes for å forhindre veksten av ytre forurensninger. Preparatet kan konsentreres, filtreres, dialyseres, etc, ved anvendelse av metoder kjent på området.

[000270] De diploide celler ifølge oppfinnelsen blir dyrket for produksjonsformål. Slike produksjonsformål omfatter fortrinnsvis vekst i minimal media, idet media mangler for-dannente aminosyrer og andre komplekse biomolekyler, f.eks. media omfattende ammoniakk som en nitrogenkilde og glukose som energi og karbonkilde og salter som en kilde for fosfat, kalsium og lignende. Fortrinnsvis mangler slikt produksjonsmedia selektive midler så som antibiotika, aminosyrer, puriner, pyrimidiner, etc. Diploide celler kan dyrkes til høy celletetthet, for eksempel minst ca. 50 g/L; mer vanligvis minst ca. 100 g/L; og kan være minst ca. 300, ca. 400, ca. 500 g/L eller mer.

[000271] I én utførelsesform ifølge oppfinnelsen blir veksten av gjeldende celler for produksjonsformål utført ved lave temperaturer, idet temperaturene kan nedsettes under log fasen, under stasjonær fase eller begge. Betegnelsen "lav temperatur" angir temperaturer på minst ca. 15°C, mer vanligvis minst ca. 17°C og kan være ca. 20°C og er vanligvis ikke mer enn ca. 25°C, mer vanligvis ikke mer enn ca. 22°C. Veksttemperatur kan gi fremstilling av full-lengde utskilte proteiner i produksjonskulturer og reduksjon av kultur-veksttemperaturen kan sterkt forøke det intakte produktutbytte. Den reduserte temperaturen synes å assistere intracellulær trafikkering ved folding og post-translasjonell prosesseringsbaner anvendt av verten for å danne målproduktet, sammen med reduksjon av cellulær proteasenedbrytning.

[000272] Metodene ifølge oppfinnelsen tilveiebringer ekspresjon av utskilt, aktivt protein, fortrinnsvis et pattedyr-protein. I én utførelsesform, angir utskilt, "aktive antistoffer", som anvendt her, en korrekt foldet multimer med minst to riktig parrete kjeder, som nøyaktig binder til dens kognate antigen. Ekspresjonsnivåer av aktivt protein er vanligvis minst ca. 10-50 mg/liter kultur, mer vanligvis minst ca. 100 mg/liter, fortrinnsvis minst ca. 500 mg/liter og kan være 1000 mg/liter eller mer.

[000273] Metodene ifølge oppfinnelsen kan gi øket stabilitet av verten og heterologt kodende sekvenser under produksjon. Stabiliteten fremkommer, for eksempel ved opprettholdelse av høye nivåer av ekspresjonstid, når utgangsnivået av ekspresjon blir redusert med ikke mer enn ca. 20%, vanligvis ikke mer enn 10% og kan reduseres ved ikke mer enn ca. 5% over ca. 20 doblinger, 50 doblinger, 100 doblinger eller mer.

[000274] Stammestabiliteten tilveiebringer også opprettholdelse av heterolog gensekvens integritet over tid, hvor sekvensen av den aktivt kodende sekvensen og nødvendige transkripsjonene regulatoriske elementer blir opprettholdt i minst ca. 99% av de diploide celler, vanligvis i minst ca. 99,9% av de diploide celler og fortrinnsvis i minst ca. 99,99% av de diploide cellene over ca. 20 doblinger, 50 doblinger, 100 doblinger eller mer. Fortrinnsvis, opprettholder hovedsakelig alle diploide celler sekvensen til den aktivt kodende sekvensen og ønskete transkripsjonene regulatoriske elementer.

[000275] En andre ekspresjonsvektor blir produsert ved anvendelse av samme konvensjonelle metoder velkjente for fagfolk på området, nevnte ekspresjonsvektor inneholdende en operon og en DNA-sekvens som koder for en antistoff lettkjede hvor DNA-sekvensen som koder for CDR nødvendig for antistoff spesifisitet er avledet fra en kanin B-celle kilde, mens DNA-sekvensen som koder for de gjenværende deler av antistoffkjeden er avledet fra en human cellekilde.

[000276] Ekspresjonsvektorene blir transfektert inn i en vertscelle ved konvensjonelle metoder velkjent for fagfolk på området for å produsere en transfektert vertscelle, idet nevnte transfekterte vertscelle blir dyrket ved konvensjonelle metoder velkjente for fagfolk på området for å produsere nevnte antistoff polypeptider.

[000277] Vertscellen kan bli ko-transfektert med de to ekspresjonsvektorene beskrevet ovenfor, idet den første ekspresjonsvektoren inneholder DNA som koder for en operon og et humanisert kanin lettkjede-avledet polypeptid og den andre vektoren inneholder DNA som koder for en operon og et humanisert kanin tungkjede-avledet polypeptid. De to vektorene inneholder forskjellige selekterbare markører, men oppnår fortrinnsvis hovedsakelig lik ekspresjon av tung og lettkjede polypeptider. Alternativt kan en enkelt vektor anvendes idet vektoren som omfatter DNA som koder for både de humaniserte kanin tung og lettkjede polypeptider.

[000278] To transformerte haploidceller kan bli genetisk krysset og diploide stammer som oppstår fra denne parringshendelsen kan bli valgt ved deres hybride næringskrav og/eller antibiotiske resistensspektra. Alternativt, blir populasjoner av de to transformerte haploide stammer sfæroplasted og kondensert og diploide avkom regenerert og valgt. Ved hvilken som helst metode, kan diploide stammer identifiseres og selektivt dyrkes basert på deres evne til å vokse i forskjellige media enn deres foreldre. For eksempel kan diploide celler dyrkes i minimalt medium som kan omfatte antibiotika. Den diploide syntesestrategien har visse fordeler. Diploide stammer har potensialet for å produsere forbedrete nivåer av heterologt protein ved bredere komplementering til underliggende mutasjoner, som kan gi produksjonen og/eller sekresjon av rekombinant protein. Videre, når stabile stammer blir oppnådd, behøver hvilke som helst antibiotika anvendt for å velge stammene ikke nødvendigvis være kontinuerlig til stede i vekstmediet.

[000279] Vertscellene anvendt for å uttrykke antistoffpolypeptidene kan være enten bakteriecelle så som E. coli eller en eukaryot celle. I en spesielt foretrukket utførelsesform ifølge oppfinnelsen kan en pattedyrcelle av en veldefinert type for dette formålet, så som en myelomcelle eller en Kinesisk hamster eggstokk (CHO) cellelinje anvendes.

[000280] De generelle metodene hvorved vektorene kan konstrueres, transfeksjonsmetoder nødvendige for å produsere vertscellen og dyrkningsmetoder nødvendige for å produsere antistoffpolypeptidene fra nevnte vertsceller omfatter alle konvensjonelle teknikker. Selv om cellelinjen anvendt for å produsere antistoffet fortrinnsvis er en pattedyrcellelinje, kan hvilken som helst annen egnet cellelinje, så som en bakteriecellelinje så som en E. coli-avledet bakteriell stamme eller en gjærcellelinje, alternativt anvendes.

[000281] Tilsvarende, når produsert kan de humaniserte kanin antistoff polypeptider renses i henhold til standardprosedyrer på området, så som for eksempel kryss-strøm filtrering, ammoniumsulfatutfelling, affinitetskolonnekromatografi og lignende.

[000282] De humaniserte antistoff polypeptider beskrevet her kan også anvendes for design og syntese av enten peptid eller ikke-peptid mimetika som vil være anvendelige for samme terapeutiske applikasjoner som antistoffpolypeptidene ifølge oppfinnelsen. Se for eksempel Saragobi et al, Science, 253:792-795 (1991), idet innholdet inntas her ved referanse i sin helhet.

[000283] Administrering

[000284] Humaniserte kaninantistoffer og fragmenter og fusjoner derav produsert ifølge oppfinnelsen blir fortrinnsvis anvendt for human terapi eller for diagnostiske metoder så som in vivo avbildning av tumorseter. I én utførelsesform ifølge oppfinnelsen blir de humaniserte antistoffene beskrevet her eller humaniserte bindingsfragmenter derav, så vel som kombinasjoner av nevnte antistoffragmenter, administrert til et individ i en konsentrasjon på mellom ca. 0,05 og 10,0 mg/kg kroppsvekt av mottagerindividet. I en foretrukket utførelsesform ifølge oppfinnelsen blir de humaniserte antistoffene beskrevet her eller humaniserte bindingsfragmenter derav, så vel som kombinasjoner av nevnte antistoffragmenter, administrert til et individ i en konsentrasjon på ca. 0,1 -1,0 mg/kg kroppsvekt av mottageren.

[000285] I en annen utførelsesform ifølge oppfinnelsen blir de humaniserte kanin antistoffene beskrevet her eller bindingsfragmenter derav, så vel som kombinasjoner av nevnte antistoffragmenter, administrert til et individ i en farmasøytisk formulering.

[000286] Et "farmasøytisk preparat" angir et kjemisk eller biologisk preparat egnet for administrering til et pattedyr. Slike preparater kan bli spesifikt formulert for administrering via én eller flere ruter, omfattende men ikke begrenset til buckal, epikutan, epidural, inhalering, intraarteriell, intracardial, intracerebroventrikulær, intradermal, intramuskulær, intranasal, intraokulær, intraperitoneal, intraspinal, intratekal, intravenøs, oral, parenteral, rektalt via et klystér eller suppositorium, subkutan, subdermal, sublingual, transdermal og transmukosal. I tillegg, kan administrering forekomme ved hjelp av injeksjon, pulver, væske, gel, dråper eller andre metoder for administrering.

[000287] Et "farmasøytisk tilsetningsmiddel" eller et "farmasøytisk akseptabelt tilsetningsmiddel" er en bærer, vanligvis en væske, hvor i det aktive terapeutiske midlet er formulert. I én utførelsesform ifølge oppfinnelsen er det aktive terapeutiske midlet et humanisert antistoff spesifikt for IL-6 eller TNF- eller én eller flere fragmenter derav. Tilsetningsmidlet gir generelt ikke hvilken som helst farmakologisk aktivitet til formuleringen, selv om det kan gi kjemisk og/eller biologisk stabilitet og frigjøringskarakteristika. Eksempler på formuleringer kan finnes, for eksempel i Remington's Pharmaceutical sciences, 19* Ed., Grennaro, A., Ed., 1995 som er inntatt ved referanse.

[000288] Som anvendt her omfatter "farmasøytisk akseptabel bærer" eller "tilsetningsmiddel" hvilke som helst og alle løsningsmidler, dispersjonsmedia, belegg, antibakterielle og antifungale midler, isotoniske og absorpsjonsforsinkende midler som er fysiologisk kompatible. I én utførelsesform, er bæreren egnet for parenteral administrering. Alternativt, kan bæreren være egnet for intravenøs, intraperitoneal, intramuskulær eller sublingual administrering. Farmasøytiske akseptable bærere omfatter sterile vandige løsninger eller dispersjoner og sterile pulvere for ekstemporær fremstilling av sterile injiserbare løsninger eller dispersjoner. Anvendelse av slike media og midler for farmasøytiske aktive substanser er velkjent på området. Bortsett fra hvis hvilket som helst konvensjonelt media eller middel er inkompatibel med den aktive forbindelsen, blir anvendelse derav i de farmasøytiske preparatene ifølge oppfinnelsen betraktet. Supplementære aktive forbindelser kan også innføres i preparatene.

[000289] Farmasøytiske preparater må typisk være sterile og stabile under betingelsene for fremstilling og lagring. Preparatet kan formuleres som en løsning, mikroemulsjon, liposom eller annen ordnet struktur egnet for høy medikamentkonsentrasjon. Bæreren kan være et løsningsmiddel eller dispersjonsmedium inneholdende, for eksempel vann, etanol, polyol (for eksempel glycerol, propylenglykol og flytende polyetylenglykol) og egnede blandinger derav. Riktig fluiditet kan holdes, for eksempel ved anvendelse av et belegg så som lecitin, ved opprettholdelse av nødvendig partikkelstørrelse i tilfellet av dispersjon og ved anvendelse av overflateaktive midler.

[000290] I mange tilfeller, vil det være foretrukket å omfatte isotoniske midler, for eksempel sukkere, polyalkoholer så som mannitol, sorbitol eller natriumklorid i preparatet. Forlenget absorpsjon av de injiserbare preparatene kan være forårsaket av inkludering i preparatet et middel som forsinker absorpsjonen, for eksempel monostearatsalter og gelatin. Videre, kan det alkaliske polypeptidet formuleres i en formulering med tidsfrigjøring, for eksempel i et preparat som omfatter en polymer med langsom frigjøring. De aktive forbindelsene kan fremstilles med bærere som vil beskytte forbindelsen mot rask frigjøring, så som en formulering med kontrollert frigjøring, omfattende implantater og mikroinnkapslete leveringssystemer. Bionedbrytbare, biokompatible polymerer kan anvendes, så som etylenvinylacetat, polyanhydrider, polyglykolsyre, kollagen, polyortoestere, polymelkesyre og polymelke-, polyglykol kopolymerer (PLG). Mange metoder for fremstilling av slike formuleringer er kjent for fagfolk på området.

[000291] For hver av de angitte utførelsesformer, kan forbindelsene administreres ved en rekke doseformer. Hvilken som helst biologisk-akseptabel doseform kjent for personer innen dette fagområdet og kombinasjoner derav, er betraktet. Eksempler på slike doseformer omfatter, uten begrensning, rekonstituerbare pulvere, eliksirer, væsker, løsninger, suspensjoner, emulsjoner, pulvere, granuler, partikler, mikropartikler, dispergerbare granuler, pulverkapsler, inhaleringsmidler, aerosol inhaleringsmidler, plastere, partikkel inhaleringsmidler, implantater, depot implantater, injiserbare løsninger (omfattende subkutan, intramuskulær, intravenøs og intradermal), infusjoner og kombinasjoner derav.

[000292] Beskrivelsen ovenfor av forskjellige illustrerte utførelsesformer ifølge oppfinnelsen er ikke tilsiktede å være uttømmende eller å begrense oppfinnelsen til den nøyaktige beskrevne formen. Mens spesifikke utførelsesformer av og eksempler for, oppfinnelsen er beskrevet her for illustrative formål, er forskjellige ekvivalente modifikasjoner mulig innenfor omfanget ifølge oppfinnelsen, som fagpersoner i det relevante området vil forstå. Beskrivelser gitt her ifølge oppfinnelsen kan anvendes på andre formål, forskjellige fra eksemplene beskrevet ovenfor.

[000293] Disse og andre endringer kan gjøres i oppfinnelsen i lys av den detaljerte beskrivelsen overfor. Generelt, i de følgende kravene, skal betegnelsene anvendt ikke bli konstruert å begrense oppfinnelsen til de spesifikke utførelsesformer beskrevet i beskrivelsen og kravene. Følgelig, er oppfinnelsen ikke begrenset av beskrivelsen, men istedet skal omfanget ifølge oppfinnelsen bli helt bestemt av de følgende kravene.

[000294] Oppfinnelsen kan utføres på måter forskjellige fra de spesielt beskrevet i foregående beskrivelse og eksempler. En rekke modifikasjoner og variasjoner ifølge oppfinnelsen er mulig i lys av den ovenfor angitte beskrivelsen og er derfor innenfor omfanget av vedlagte krav.

[000295] Visse beskrivelser relatert til metoder for å oppnå en klonal populasjon av antigen-spesifikke B-celler er beskrevet i U.S. Provisional patentsøknad no. 60/801,412, innlevert mai 19, 2006, idet beskrivelsen inntas her ved referanse i sin helhet.

[000296] Visse beskrivelser relatert til produsering av antistoffer eller fragmenter derav ved anvendelse av parringskompetent gjær og tilsvarende metoder er beskrevet i U.S.

Patentsøknad no. 11/429,053, innlevert mai 8, 2006, (U.S. Patentsøknad Publikasjon nr. US2006/0270045), idet beskrivelsen inntas her ved referanse i sin helhet.

[000297] Hele beskrivelsen av hvert siterte dokument (omfattende patenter, patentsøknader, journal artikler, sammendrag, manualer, bøker eller andre beskrivelser) i Bakgrunn for oppfinnelsen, Detaljert Beskrivelse og Eksempler inntas her ved referanse i deres helhet.

[000298] De følgende eksempler er fremsatt for å gi fagfolk på området en fullstendig beskrivelse og beskrivelse av hvorledes man danner og anvender foreliggende oppfinnelse er ikke ment å begrense omfanget av det som er betraktet som oppfinnelsen. Anstrengelser er gjort for å sikre nøyaktighet med hensyn til nummerene anvendt (f.eks. mengder, temperatur, konsentrasjoner, etc.) men noen eksperimentelle feil og avvik er tillatt. Hvis ikke annet er angitt er deler vektdeler, molekylvekt er gjennomsnittlig molekylvekt, temperatur er i grader celsius; og trykk er ved eller nær atmosfærisk.

[000299] EKSEMPLER

[000300] Eksempel 1 Produksjon av Anriket Antigen-Spesifikk B Celle Antistoff Kultur

[000301] Paneler av antistoffer er avledet av immuniserende tradisjonelle antistoff vertsdyr for å utnytte den native immunresponsen på et målantigen av interesse. Typisk, er verten anvendt for immunisering en kanin eller annen vert som gir antistoffer ved anvendelse av en lignende modningsprosess og tilveiebringer en populasjon av antigen-spesifikk B-celle produserende antistoffer av sammenlignbart mangfold, f.eks. epitopisk mangfold. Den innledende antigenimmuniseringen kan utføres ved anvendelse av fullstendig Freund's adjuvans (CFA) og de påfølgende boostene ble utført med ufullstendig adjuvans. Omtrent 50-60 dager etter immunisering, fortrinnsvis på dag 55, blir antistofftitere testet og Antistoff Seleksjon (ABS) prosess blir initiert hvis hensiktsmessige titere er etablert. De to nøkkelkriteriene for ABS initiering er kraftig antigen gjenkjennelse og funksjons-modifiserende aktivitet i polyklonale sera.

[000302] På tidspunktet positive antistofftitere er etablert, blir dyr avlivet og B cellekilder isolert. Disse kilder omfatter: milten, lymfeknuter, benmarg og perifere blod mononukleære celler (PBMCs). Enkelt cellesuspensjoner blir dannet og cellesuspensjonener blir vasket for å gjøre dem kompatibel for langvarig lagring ved lav temperatur. Cellene blir deretter typisk frosset.

[000303] For å initiere antistoff-identifikasjonsprosessen blir en liten fraksjon av de frosne cellesuspensjoner tint, vasket og plassert i vevsdyrkningsmedier. Disse suspensjoner blir deretter blandet med en biotinylert form av antigenet som ble anvendt for å danne immunrespons i dyr og antigen-spesifikke celler blir gjenvunnet ved anvendelse av Miltenenyi magnetiske kulecelle seleksjonsmetodikk. Spesifikk anrikning blir utført ved anvendelse av streptavidinkuler. Den anrikete populasjonen blir gjenvunnet og ført inn i neste fase av spesifikk B celle isolering.

[000304] Eksempel 2: Produksjon av Klonal, Antigen-Spesifikk B Celle-Inneholdende Kultur

[000305] Anrikete B-celler produsert i henhold til Eksempel 1 blir deretter platet med varierende celletettheter pr. brønn i en 96-brønn mikrotiterplate. Generelt, er dette med 50, 100, 250 eller 500 celler pr. brønn med 10 plater pr. gruppe. Media blir supplert med 4% aktivert kanin T-celle kondisjonert media sammen med 5OK frosne bestrålte EL4B feederceller. Disse kulturer blir latt stå uforstyrret i 5-7 dager hvorpå supernatant-inneholdende utskilt antistoff blir oppsamlet og evaluert for målegenskaper i et separat forsøkssetting. Den gjenværende supernatanten blir latt være intakt og platen blir frosset ved -70°C. Under disse betingelsene, resulterer dyrkningsprosessen typisk i brønner inneholdende en blandet cellepopulasjon som omfatter en klonal populasjon av antigen-spesifikke B-celler, dvs. enkelt brønnen vil bare inneholde enkelt monoklonalt antistoff spesifikk til det ønskede antigenet.

[000306] Eksempel 3: Screening av Antistoffsupernatanter for Monoklonalt antistoff med Ønsket Spesifisitet og/eller Funksjonelle egenskaper

[000307] Antistoff-inneholdende supernatanter avledet fra brønnen inneholdende en klonal antigen-spesifikk B cellepopulasjon produsert i henhold til Eksempel 2 blir initielt screenet for antigengjenkjennelse ved anvendelse av ELISA metodene. Dette omfatter selektiv antigen immobilisering (f.eks. biotinylert antigen oppfangning ved streptavidin belagt plate), uspesifikt antigen platebelegg eller alternativt, ved en antigen oppbygningsstrategi (f.eks. selektiv antigen oppfangning fulgt av binding partner tilsetning for å danne et heteromerisk protein-antigen kompleks). Antigen-positive brønnsupernatanter blir deretter eventuelt testet i et funksjon-modifikasjonsforsøk som er kun avhengig av liganden. Et slikt eksempel er et in vitro protein-protein interaksjonsforsøk som gjendanner den naturlige interaksjonen av antigenliganden med rekombinant reseptorprotein. Alternativt, blir en celle-basert respons som er ligandavhengig og lett overvaket (f.eks. proliferasjonsrespons) anvendt. Supernatanten som oppviser betydelig antigen gjenkjennelse og potens er ansett som en positiv brønn. Celler avledet fra den opprinnelige positive brønnen blir deretter ført til antistoffet gjenvinningsfasen.

[000308] Eksempel 4: Gjenvinning av Enkelt, Antistoff-Produserende B Celle med Ønsket Antigen Spesifisitet

[000309] Noen få antall celler blir isolert fra en brønn som inneholder en klonal populasjon av antigen-spesifikke B-celler (produsert i henhold til Eksempel 2 eller 3), som utskiller en enkelt antistoffsekvens. De isolerte celler blir deretter undersøkt for å isolere en enkelt, antistoff-utskillende celle. Dynal streptavidinkuler blir belagt med biotinylert målantigen under bufret medium for å fremstille antigen-inneholdende mikrokuler kompatible med cellelevedyktighet. Deretter blir antigen-belastede kuler, antistoff-produserende celler fra den positive brønnen og et fluorescein isotiocyanat (FITC)-merket anti-vert H&L IgG antistoff (som angitt, kan verten være hvilken som helst pattedyr-vert, f.eks. kanin, mus, rotter, etc.) blir inkubert sammen ved 37°C. Denne blandingen blir deretter re-pipettert i aliquoter på et glasslokk slik at hver aliquot har i gjennomsnitt en enkelt, antistoff-produserende B-celle. Antigen- spesifikke, antistoff-utskillende celler blir deretter detektert ved fluorescensmikroskopi. Utskilt antistoff blir lokalt konsentrert på de nabostilte kuler på grunn av det bundete antigenet og tilveiebringer lokaliseringsinformasjon basert på det sterke fluorescerende signalet. Antistoff-utskillende celler blir identifisert via FITC deteksjon av antistoff-antigen komplekser dannet i nabostilling til den utskillende cellen. Enkelt cellen funnet i midten av dette komplekset blir deretter gjenvunnet ved anvendelse av en mikromanipulator. Cellen blir hurtig-frosset i et eppendorf PCR rør for lagring ved -80°C inntil antistoffsekvensgjenvinningen blir initiert.

[000310] Eksempel 5: Isolering av Antistoff-sekvenser Fra Antigen-Spesifikk B Celle

[000311] Antistoff-sekvenser blir gjenvunnet ved anvendelse av en kombinert RT-PCR basert metode fra en enkelt isolert B-celle produsert i henhold til Eksempel 4 eller en antigen spesifikk B celle isolert fra den klonale B cellepopulasjonen oppnådd i henhold til Eksempel 2. Primere blir utformet for å hybridisere i konserverte og konstante regioner av mål-immunoglobulingener (tung og lett), så som kanin-immunoglobulinsekvenser og et to-trinns "nested" PCR gjenvinningstrinn blir anvendt for å oppnå antistoffsekvensen. Amplikoner fra hver brønn blir analysert for gjenvinning og størrelsesintegritet. De resulterende fragmentene blir deretter fordøyet med Alul for å fingerprinte sekvensen klonalt. Identiske sekvenser utviser et felles fragmenteringsmønster i deres elektroforetiske analyse. Det er signifikant at dette felles fragmenteringsmønsteret som beviser celleklonalitet blir generelt observert selv i brønnene opprinnelig platet med opptil 1000 celler/brønn. De opprinnelige tung og lettkjede amplikonfragmenter blir deretter restriksjonsenzym fordøyet med Hindlll og Xhol eller Hindlll og BsiwI for å danne de respektive stykkene av DNA for kloning. De resulterende spaltningene blir deretter ligert inn i en ekspresjonsvektor og transformert inn i bakterier for plasmidpropagering og produksjon. Kolonier blir valgt for sekvenskarakterisering.

[000312] Eksempel 6: Rekombinant Produksjon av Monoklonalt antistoff med Ønsket Antigen Spesifisitet og/eller Funksjonelle egenskaper

[000313] Korrekte full-lengde antistoff-sekvenser for hver brønn inneholdende et enkelt monoklonalt antistoff blir etablert og miniprep DNA blir dannet ved anvendelse av Qiagen fastfase metodikk. Dette DNA blir deretter anvendt for å transfektere pattedyrceller for å produsere rekombinant full-lengde antistoff. Rått antistoffprodukt blir testet for antigengjenkjennelse og funksjonelle egenskaper for å bekrefte de opprinnelige karakteristika er funnet i det rekombinante antistoffproteinet. Hvor passende, blir stor-skala transient pattedyr-transfeksjoner fullført og antistoff blir renset ved Protein A affinitetskromatografi. Kd blir bedømt ved anvendelse av standardmetoder (f.eks. Biacore) så vel som IC50 i et potensforsøk.

[000314] Eksempel 7: Fremstilling av Antistoffer som binder et ønsket antigen Så som HuTNF-a eller IL-6

[000315] Ved anvendelse av antistoffseleksjonsprotokollen beskrevet her, kan én generere en samling av antistoffer som viser kraftig funksjonell antagonisme av TNF-a eller til IL-6 eller et annet ønsket antigen. Antistoffene belyser en rekke epitoper og kan således gi anvendelige alternativer til eller tillegg til, antistoffer som målsøker tidligere identifiserte epitoper for det spesielle antigenet så som i tilfellet av Hu-TNF-alfa, TNF-a epitoper, så som Remicade® (infliximab).

[000316] I det spesifikke tilfellet av enten IL-6 eller TNF- a, kan en screeningsmetode anvendes for å identifisere antistoffer som binder alternative IL-6 eller TNF-a epitoper, mens den beholder betydelig funksjonell antagonisme. For eksempel i tilfellet av TNF-a etter den primære antigen-gjenkjennelses-screening, kan positive BCC brønner testes for funksjonell antagonisme mot TNF-a så vel som for epitopkonkurranse, f.eks. konkurranse med infliximab. Unik epitope gjenkjennelse kan etableres ved ForteBio Oktet antistoff-TNF-a bindingskonkurranseundersøkelser. BCC brønner som utviser funksjonell aktivitet og også mangler konkurranse er betraktet og de kodende sekvensene for antistoffet til stede i disse brønnene blir isolert. Majoriteten av de gjenvunnete sekvenser vil utvise de opprinnelige målkarakteristika: kraftig antigen-gjenkjennelse, funksjonell antagonisme og distinkt epitope gjenkjennelse. Således, etablerer den resulterende antistoffkolleksjonen multiple nye epitopregioner forbundet med kraftig funksjonell antagonisme. Lignende resultater er demonstrert med IL-6 i provisional-søknad inntatt som referanse her.

[000317] Immuniseringsstrategi:

[000318] Kaniner kan bli immunisert med TNF-a (R&D # 210-TA) og human IL-6 som beskrevet i provisional patentsøknader US Serial nr. 60/924,551 og 60/924,551 innlevert mai 21,2007 og inntatt ved referanse i deres helhet her.

[000319] Antistoffseleksionstiter vurdering

[000320] Antigengjenkjennelsesforsøk kan bestemmes for TNF-a eller human IL-6 ved protokollen beskrevet deri.

[000321] Funksjonell Titervurdering

[000322] De funksjonelle aktivitetene av prøvene kan bestemmes som beskrevet i de siterte provisional søknadene. For eksempel i tilfellet av TNF-a separat, ble det i en rundbunnet 96-brønn plate tilsatt serumprøver ved en 1:100 fortynning (i beskrevet media) fulgt av 1:10 fortynning over platen (kolonnene 2-10, kolonne 11 var media kun for TNF-a kontroll), 50 ul/brønn i replikater av 5 (radene B-F, rad G var media kun for bakgrunnskontrollen). 50 ul/brønn av media inneholdende TNF-a i en konsentrasjon 4 ganger den endelige EC50 (konsentrasjonen ble tidligere bestemt for hver del) og 1 ug/ml Actinomycin D ble satt til alle prøvebrønner bortsett fra rad F. Plater ble inkubert i 1 time ved 37°C.

[000323] Etter 1 time blir 50 ul av Serum/Ag komplekset og kontroller overført til 96-brønn flat-bunnete plater inneholdende 50 ul/brønn av responder celler i en fiksert densitet (endelig volum: 100 ul/brønn) og inkubert i 24 timer ved 37°C. (Kolonnene 1 og 12 og radene A og H er fylt med 200 ul av media for å forhindre inndampning og forårsake kant effekt.)

[000324] Etter 24 timer blir 20 ul/brønn av CellTiter96 reagens (Promega) satt til alle testbrønner pr. produsenten protokoll og plater ble inkubert i 2 timer ved 37°C. Etter 2 timer blir plater forsiktig ristet for å tillate homogenitet i testbrønnene. Plater ble lest ved 490 nm bølgelengde. OD versus fortynning ble plottet ved anvendelse av Graph Pad Prizm (ikke-lineær sigmoid dose/respons kurve ble anvendt) og funksjonelle titre ble bestemt.

[000325] Vevshøsting

[000326] Kaninmilt, lymfeknuter og fullblod ble høstet, prosessert og frosset som beskrevet i provisional søknader sitert ovenfor.

[000327] B Cellekultur ( BCC)

[000328] B cellekulturer blir fremstilt som beskrevet i provisional patentsøknader inntatt som referanse.

[000329] Antigen Gienkjennelsesscreening

[000330] Antigen gjenkjennelsesscreening ble utført som beskrevet ovenfor som enkelte punkter.

[000331] Funksjonell Aktivitetsscreening

[000332] Funksjonell aktivitetsscreening blir utført som beskrevet i de siterte provisional søknadene. For eksempel i tilfellet av TNF-alfa blir det bestemt ved et WEHI cytotoksisk forsøk. Supernatant fra master plate(er) ble testet i TNF-a stimulert WEHI cytotoksisk forsøk (som beskrevet ovenfor) som enkelt punkter. Supernatanter ble testet alene som beskrevet deri.

[000333] Sekundær Funksjonell Aktivitetsforsøk for Rekombinante Antistoffer:

Blokkering av IL- 6 Ekspresjon av HUVEC celler behandlet med huTNF- q

[000334] TNF-a eller IL-6 spesifikke forsøk kan utføres som beskrevet i samme provisional patentsøknader inntatt her ved referanse. For eksempel i tilfellet av TNF-a humane navlestrengsvene endotel-celler (HUVECs) blir de rutinemessig holdt i endotel-vekst medium (EGM) medium og passende HUVEC supplementer (Cambrex). På forsøksdagen blir HUVEC levedyktighet bestemt av trypan blå. Cellene blir resuspendert ved 5E05/ml i det passende volum av medium nødvendig for forsøket (100 ul/brønn). Celler ble platet i midt brønner av 96-brønn flat-bunnete kulturplater og 200 ul medium ble satt til alle utside brønner for å forhindre inndampning. Platen ble inkubert i 24 timer ved 37°C.

[000335] Etter 24 timer blir de passende antistoffortynninger dannet i EGM ved 4 ganger den ønskede endelige konsentrasjonen. (Begynnende antistoffkonsentrasjon var 1 ug/ml; en 1:3 fortynning ble utført over platen, bortsett fra i siste rad.) Samme volum av rhuTNF-a i EGM (4 ganger den ønskede endelige konsentrasjonen) ble satt til brønnene. Platen ble inkubert i 1 time ved 37°C for å danne antistoff/antigen kompleks. Etter 1 time ble 50 ul av media fra HUVEC kulturplate fjernet og kastet. 50 ul Ab-Ag blanding ble tilsatt og platen ble inkubert i 48 timer ved 37°C. Standard positive og negative kontroller ble inkludert:

[000336] Etter 48 timer, ble kondisjonert medium IL-6 nivåer bedømt ved ELISA. En Immulon plate ble belagt med 1 ug/ml geit anti-huIL-6 med 50 ul/brønn, natten over ved 4°C eller romtemperatur i 1 time. Platen ble vasket i PBS + 0,5% Tween 20 i en platevasker (200 ul/brønn; 3 ganger). Platen ble blokkert med 200 ul/brønn FSG i 1 time ved romtemperatur. Blokkeringsløsningen ble aspirert og platen ble blottet. HuIL-6 standarden ble tilsatt, begynnende med 1 ug/ml og fortynnet 1:3 over platen (alle fortynninger gjort i FSG). Prøver fra HUVEC kultur ble satt til brønnene under standardkurven og inkubert i 1 time ved romtemperatur. Vask ble gjentatt. 1 ug/ml av et humanisert antistoff (anti-huIL-6) ble tilsatt med 50 ul/brønn til platen og inkubert i 1 time ved romtemperatur. Vask ble gjentatt. Sekundær anti-human IgG Fe HRP ved 1:5000 fortynning ble tilsatt med 50 ul/brønn og inkubert i 45 minutter ved romtemperatur. Vask ble gjentatt. Forsøk ble utviklet med 50 ul/brønn 3,3\5,5' tetrametylbenzidin (TMB) i et minimum av 5 minutter. Reaksjonen ble stanset med 50 ul/brønn HC1 og platen ble lest ved 450 nm i en plateleser. Data ble analysert ved anvendelse av Graph Pad Prizm.

[000337] B Celle Gjenvinning

[000338] Foci protokoll for huIL6 og for huTNF-a blir utført som beskrevet i ovenfor-siterte provisional søknader.

[000339] Eksempel 8: Fremstilling av Eksempler på Humaniserte kanin antistoff (Spesifikk til IL-6) Ifølge oppfinnelsen

[000340] Tung og lettkjeder avledet fra et kanin anti-huIL-6 antistoff produsert som beskrevet i inntatt ved referanse provisional patentsøknader og i henhold til foregående eksempler ble humanisert ved anvendelse av humaniseringsstrategien beskrevet her og vist skjematisk i Figur 1. Variabel lettkjederegion av et eksempel på kanin anti-IL-6 antistoff (en region inneholdende fra FRI ved terminusen av FR3 av dette IL-6 spesifikk antistoff) ble screenet mot et bibliotek av humane kimlinjesekvenser ved anvendelse av BLAST og identifisert tre kimlinjesekvenser som har betydelig homologi dertil, dvs. Vl-6, Vl-27 og VI-5 i forhold til andre humane kimlinjesekvenser i dette biblioteket. Kimlinjesekvens Vl-6 ble funnet å vise den største sekvensidentiten med kanin lettkjede variabel sekvens og ble derfor valgt som utgangsmaterialet for å produsere 2 humanisert lettkjede versjoner betegnet som "aggres" og "consrv" i Figur 3. Disse sekvenser ble avledet i det vesentlige ved modifikasjon av Vl-6 human kimlinjesekvens med spesifikke selektivitetsbestemmende residuer fra kanin opphavs anti-IL-6 CDR1 og CDR2 regionene som vist i øverste halvparten av figuren og som videre omfatter få (consrv versjon) eller ingen donor (kanin) FR residuer (aggres versjon). Spesielt, som vist i Figur 3 ble én humanisert lettkjede produsert (referert til som "aggres" i Figuren) hvor ingen av kanin FR residuene ble inkorporert og ved fusjon av Vl-6 sekvensen til kanin lettkjede CDR3 og en human FR4 sekvens homolog til kanin lettkjede FR4 sekvensen. FR4 . En annen versjon referert til som "consrv" vist i samme Figur ble produsert inneholdende 2 FR residuene fra kanin lettkjede FRI.

[000341] Ved anvendelse av lignende humaniseringsmetoder og som vist skjematisk i

Figur 1 ble variabel region av et foretrukket anti-IL-6 antistoff inneholdende CDR1 og CDR2 og assosierte FR regioner anvendt for å screene ved anvendelse av BLAST metoder mot et bibliotek av humane kimlinjesekvenser for å identifisere de humane kimlinjesekvenser mest homologe dertil. Som vist i figuren identifiserte denne screeningen tre homologe humane kimlinjesekvenser, V3-66, V3-53 og V3-23 inneholdende sekvensene i Figur 2. Den mest homologe humane kimlinjesekvensen V3-23 ble igjen anvendt som et utgangsmateriale for å produsere 2 humaniserte versjoner tilsvarende modifisert ved innføring av de spesifikke selektivitetsbestemmende residuene av CDR1 og CDR2 regionene av tungkj eden til fordel for de tilsvarende humane CDR1 og CDR2 residuene, den videre innføringen av noen få adskilte kanin FR residuer og fusjon til kanin CDR3 regionen og en homolog human FR4 region. De resulterende 2 humaniserte tunge kjeder igjen referert til som "aggres" og "consrv" er vist nederst i bunnen av Figur 3. Basert på oppstilte sekvenser kan det sees at disse humaniserte versjoner avvike bare i nærvær av mange kanin FR3 residuene i "consrv" versjonen som ikke er til stede i "aggres". Begge disse sekvenser varierer ved bare et relativt få antall av residuene sammenlignet med humane kimlinjesekvenser og skal derfor være hovedsakelig ikke-immunogen i mennesker.

[000342] Humaniserte anti-IL-6 antistoffer inneholdende enten "aggres" humaniserte tung og lettkjeder og "consrv" ble funnet å ha IL-6 bindings affiniteter meget omtrentlig som opphavskanin antistoffet. Dette validerer effektiviteten av de oppfinneriske humaniseringsstrategiene og indikerer videre at disse metoder kan anvendes for å produsere humaniserte antistoffer mot forskjellige antigener som har sekvenser som er meget "human-lignende" som skal være hovedsakelig ikke-immunogene i mennesker.

[000343] Eksempel 9: Beholdte Affinitetsegenskaper til Eksempler på Humaniserte kanin antistoffer (Spesifikke til hIL-6 og hTNF-alfa) Produsert Ifølge oppfinnelsen

[000344] Som beskrevet nedenfor er en betydelig fordel ved foreliggende oppfinnelse at gjeldende humaniseringsmetoder reproduserbart gir opphav til humaniserte antistoffer som har høye affininiteter, dvs. bindingsaffiniteten er sammenlignbar med den til opphavskanin eller kimære antistoff avledet derifra. Dette er illustrert ved dissosieringskonstantene innbefattet i Figur 4. Deri, blir dissosiasjonskonstantene av 2 forskjellige kanin kimære anti-hIL-6 antistoffer henholdsvis sammenlignet med 3 og 2 forskjellige humaniserte antistoffer avledet derifra idet alle ble produsert ved anvendelse av de oppfinneriske metodene. Fra dataene innbefattet i denne figuren kan det sees at dissosiasjonskonstantene er i de fleste tilfeller grovt uendret fra den kimære til den humaniserte varianten avledet derifra. I det verste tilfellet ble dissosiasjonskonstanten redusert med grovt 3,5 ganger. Dette er i kontrast til andre humaniseringsmetoder som typisk resulterer i vesentlige tap av antigen bindingsaffinitet, dvs. en størrelsesorden eller mer fra opphavet i forhold til den humaniserte versjonen.

[000345] I tillegg, inneholder samme Figur 4 datasammenligning av dissosiasjonskonstantene av to forskjellige kimære kanin anti-hTNF-alfa antistoffer mot et humanisert antistoff avledet derifra ved anvendelse av de oppfinneriske humaniseringsmetoder. Tilsvarende, er disssosiasjonskons tanter av opphavs kaninen avledet kimært anti-hTNF-alfa antistoff og de humaniserte antistoffene er hovedsakelig de samme. Disse resultatene illustrerer reproduserbarheten av gjeldende humaniseringsmetoder, dvs. deres brede anvendelighet for humanisering av forskjellige kanin antistoff-sekvenser og for humanisering av antistoffer spesifikke for de forskjellig antigener.

[000346] Eksempel 10: Beholdte Funksjonelle egenskaper til Eksempler på Humaniserte kanin antistoffer (Spesifikk for hIL-6 og hTNF-alfa) Produsert Ifølge oppfinnelsen

[000347] Som vist i det tidligere eksemplet, har de humaniserte antistoffene produsert ifølge oppfinnelsen antigen bindingskonstanter sammenlignbare med opphavs kanin antistoffer som de er avledet fra. Basert derpå, var det antatt at de antagonistiske egenskaper til opphavs kimært antistoff og de humaniserte varianter avledet derifra ville likeledes være sammenlignbar. Det er å bemerke at disse oppfinnerenes forventninger er bekreftet.

[000348] Som vist i Figurene 5 og 6 har oppfinnerene sammenlignet antagonistiske egenskaper til to forskjellige kimære antistoffer avledet fra kanin anti-IL-6 antistoffer henholdsvis til 2 forskjellige humaniserte antistoffer avledet fra hver. Antagonismen ble sammenlignet i et forsøk som detekterte effekten av disse anti-hIL-6 antistoffer på hIL-6 avhengig celleproliferasjon, et akseptert funksjonelt forsøk for detektering av antagonistisk aktivitet. Det kan sees fra dataene i Figur 5 og 6 at hemning av hIL-6 avhengig celleproliferasjon for de kimære og de humaniserte antistoffene avledet derfra er hovedsakelig identiske. (Celleproliferasjonsdatakurver er hovedsakelig overlappende eller meget lignende ved forskjellige antistoffkonsentrasjoner.)

[000349] Videre, som vist i Figur 7 har oppfinnerene sammenlignet de antagonistiske egenskapene til et kimært antistoff spesifikt for hTNF-alfa avledet fra et kanin anti-hTNF-alfa antistoff til et humanisert antistoff avledet derifra som ble produsert ved anvendelse av gjeldende humaniseringsmetoder. Antagonisme ble sammenlignet i et forsøk som detekterte effekten av disse anti-hTNF-alfa antistoffer på hTNF-alfa avhengig cytotoksisitet, et akseptert funksjonelt forsøk for detektering av anti-hTNF-alfa antistoff antagonistisk aktivitet. Det kan sees fra dataene i Figur 7 at hemning av hTNF-alfa avhengig cytotoksisitet for det kimære og det humaniserte anti-hTNF-alfa antistoffet avledet therefra er meget lignende. (Cytotoksisitetsdatakurver er hovedsakelig overlappende eller meget lignende ved forskjellige antistoffkonsentrasj oner.)

[000350] Disse eksempler skal være eksempelvise på foreliggende oppfinnelse og dens intrinsiske fordeler. Det er å bemerke at foreliggende humaniseringsmetoder kan anvendes for å humanisere hvilket som helst kanin antistoff (eller det fra en nært beslektede arter) som har spesifisitet til hvilket som helst ønsket antigen. Fortrinnsvis vil disse antistoffer være spesifikke for et målantigen egnet for human terapi og har høy affinitet til dette målantigenet. For eksempel kan slike antistoffer omfatte spesielt hvilke som helst av kanin antistoff tung og lettkjede sekvenser beskrevet i US Serial nr. 60/924,550 og 60/924,551 og PCT-søknader innlevert mai 21, 2008 henholdsvis som har fullmektig regristeringsnummer 67858,901902 og 67858,701802 betegnet IL-6 Antistoffer og Anvendelse Derav og Anti-TNF Antistoffer som provisional og PCT-søknader er inntatt ved referanse i deres helhet her omfattende alle antistoffsekvenser angitt deri. I tillegg, for å videre beskrive og eksemplifisere de krevde humaniseringsmetodene og de humaniserte antistoffproduktene som kan oppnås er sekvenslistene for begge av disse PCT-søknader satt før kravene her. Disse sekvenslistene inneholder kanin antistoff-sekvenser og humaniserte versjoner som er spesifikke for IL-6 og TNF-alfa produsert i henhold til de oppfinneriske metodene.

[000351] Videre kan de oppfinneriske humaniseringsprotokollene anvendes for å humanisere hvilken som helst tilgjengelig kanin tung eller lettkjede sekvens, dvs. mot hvilket som helst ønsket antigen så som peptider, proteiner, glykoproteiner, haptener, karbohydrater, et al. Det er foretrukket at antigenet er et humant antigen eller et antigen fra et middel som infiserer eller forårsaker eller forårsaker en sykdom i mennesker. Fortrinnsvis, vil kaninantistoffer være avledet fra kanin B-celler isolert ved ovenfor-beskrevet ABS screeningsprotokoller.

Claims

1.) Humanisert antistoff eller antistoffragment, karakterisert ved at det inneholder minst én tung og lettkjede polypeptid hvor lettkjede polypeptidet er et humanisert lettkjede polypeptid som inneholder minst de følgende (i) aminosyrerestene som dekker det første residue av FRI ved terminusen av FR3 omfattende CDR1 og CDR2 regionene av en human lettkjede kimlinjesekvens som er valgt fra et bibliotek av humane kimlinjesekvenser basert på dens større homologi (prosent sekvensidentitet) av de valgte aminosyrerestene som dekker FRI t.o.m FR3 (i forhold til andre humane kimlinjesekvenser i biblioteket) til de tilsvarende aminosyrerestene av lettkjeden av et opphavs-kanin antistoff som har spesifisiteten til et ønsket antigen som skal bli humanisert og (ii) videre hvor CDR residuene i CDR1 og CDR2 svarende til de "selektivitetsbestemmende residuene" i lettkjeden av samme opphavs kanin antistoff blir erstattet med de tilsvarende kanin selektivitetsbestemmende residuene; (iii) aminosyrerestene omfattende hele CDR3 regionen av samme opphavs kanin antistoff; (iv) aminosyrerestene omfattende hele FR4 regionen av en antistoff lettkjede avledet fra et bibliotek av humane kimlinjesekvenser basert på dens større homologi (sekvensidentitet) til den tilsvarende FR4 regionen innbefattet i lettkjeden av samme opphavs kaninantistoffet; og (v) hvor få eller ingen av FR residuene av de humane FRI, FR2, FR3 og FR4 regioner i de valgte homologe humane FR regioner er substituert med de tilsvarende kanin FR residuene.

2. ) Humanisert antistoff ifølge krav 1, karakterisert ved at opphavs kaninantistoffet er spesifikk for et humant, viralt eller bakterielle antigen.

3. ) Humanisert antistoff ifølge krav 2, karakterisert ved at det humane antigenet er et cytokin, vekstfaktor, hormon eller kreftantigen.

4. ) Humanisert antistoff ifølge krav 1, karakterisert ved at det er spesifikt for IL-6, hepcidin, hepatocytt vekstfaktor eller et TNF polypeptid.

5. ) Nukleinsyresekvens, karakterisert ved at det koder for den humaniserte antistoff lettkjeden innbefattet i det humaniserte antistoffet angitt i hvilket som helst av kravene 1,2, 3 eller 4.

6. ) Vektor, karakterisert ved at den inneholder en nukleinsyresekvens ifølge krav 5.

7. ) Celle, karakterisert ved at den inneholder en vektor ifølge krav 6.

8. ) Celle ifølge krav 7, karakterisert ved at den er valgt fra gjær, bakterier og pattedyrceller.

9. ) Celle ifølge krav 8, karakterisert ved at den er en diploid gjærcelle.

10. ) Celle ifølge krav 9, karakterisert ved at den er en Pichia eller annen metanol anvendende diploid gjær.

11. ) Humanisert antistoff eller antistoffragment, karakterisert ved at det inneholder minst et tungkjede og lettkjede polypeptid hvor tungkjeden er et humanisert tungkjede polypeptid som inneholder minst de følgende (i) minosyrerestene som dekker det første residue av FRI ved terminusen av FR3 omfattende CDR1 og CDR2 regionene kodet for av en human kimlinjesekvens som er valgt fra et bibliotek av humane kimlinjesekvenser basert på dens større homologi (prosent sekvensidentitet) av de valgte aminosyrerestene som dekker FRI t.o.m FR3 (i forhold til andre humane kimlinjesekvenser i biblioteket) til de tilsvarende aminosyrerestene av tungkjeden av et opphavs-kanin antistoff som har spesifisiteten til et ønsket antigen som skal bli humanisert og (ii) videre hvor CDR residuene i CDR1 og CDR2 regionene av den humane tungkjeden svarende til de "selektivitetsbestemmende residuene" i CDR1 og CDR2 regionene av tungkjeden av samme opphavs kaninantistoffet blir erstattet med de tilsvarende tungkjede selektivitetsbestemmende residuene innbefattet i CDR1 og CDR2 regionene av kanin tungkjeden; (iii) aminosyrerestene omfattende hele CDR3 regionen av samme opphavs kaninantistoffet; (iv) FR4 regionen avledet fra et bibliotek av humane kimlinjesekvenser basert på dens større homologi (sekvensidentitet) til den tilsvarende FR4 regionen innbefattet i tungkjeden av samme opphavs kaninantistoffet; og (v) hvor de endelige 1-3 aminosyrene av den humane tunge FRI regionen eventuelt blir erstattet med terminale 1-3 aminosyrer av de tilsvarende kanin tungkjede FRI residuene; og/eller den terminale aminosyren av den humane tungkjede rammeverk 2 regionen blir eventuelt erstattet med den tilsvarende terminale aminosyreresten av kanin tungkjede rammeverk 2; og/eller fjerde aminosyre fra terminusen av kanin tungkjede CDR2 (typisk en tryptofan) eventuelt blir erstattet med den tilsvarende humane CDR2 residue (typisk en serin); og (vi) hvor få eller ingen av de gjenværende FR residuene av de valgte homologe humane FR regioner er substituert med de tilsvarende kanin FR residuene.

12. ) Humanisert antistoff ifølge krav 11, karakterisert ved at opphavs kaninantistoffet er spesifikt for et humant, viralt eller bakterielt antigen.

13. ) Humanisert antistoff ifølge krav 12, karakterisert ved at det humane antigenet er et cytokin, vekstfaktor, hormon eller kreft antigen.

14. ) Humanisert antistoff ifølge krav 11, karakterisert ved at det er spesifikt for IL-6, hepcidin, hepatocytt vekstfaktor eller et TNF polypeptid.

15. ) Nukleinsyresekvens, karakterisert ved at den koder for den humaniserte antistoff tungkjeden innbefattet i det humaniserte antistoffet ifølge et hvilket som helst av kravene 11, 12,13 eller 14.

16. ) Vektor, karakterisert ved at den inneholder en nukleinsyresekvens ifølge krav 15.

17. ) Celle, karakterisert ved at den inneholder en vektor ifølge krav 16.

18. ) Celle ifølge krav 17, karakterisert ved at den er valgt fra gjær, bakterier og pattedyrceller.

19. ) Celle ifølge krav 18, karakterisert ved at den er en diploid gjærcelle.

20. ) Celle ifølge krav 19, karakterisert ved at den er en Pichia eller annen metanol anvendende diploid gjær.

21) Humanisert antistoff ifølge krav 1, karakterisert ved at det inneholder minst et humanisert lettkjede polypeptid og videre omfattende minst et tungkjede polypeptid hvor minst én tungkjede er et humanisert tungkjede polypeptid som inneholder minst de følgende (i) minosyrerestene som dekker den første residue av FRI ved terminusen av FR3 omfattende CDR1 og CDR2 regionene kodet for av en human kimlinje sekvens som er valgt fra et bibliotek av humane kimlinjesekvenser basert på dens større homologi (prosent sekvensidentitet) av de valgte aminosyrerestene som dekker FRI to.m FR3 (i forhold til andre humane kimlinjesekvenser i biblioteket) til de tilsvarende aminosyrerestene av tungkjeden av et opphavs-kanin antistoff som har spesifisiteten til et ønsket antigen som skal bli humanisert og (ii) videre hvor CDR residuene i CDR1 og CDR2 regionene av den humane tungkjeden svarende til "selektivitetsbestemmende residuer" i CDR1 og CDR2 regionene av tungkjeden av samme opphavs kaninantistoffet blir erstattet med de tilsvarende tungkjede selektivitetsbestemmende residuene innbefattet i CDR1 og CDR2 regionene av kanin tungkjeden; (iii) aminosyrerestene omfattende hele CDR3 regionen av samme opphavskanin antistoffet; (iv) FR4 regionen avledet fra et bibliotek av de humane kimlinjesekvenser basert på dens større homologi (sekvensidentitet) med den tilsvarende FR4 regionen innbefattet i tungkjeden av samme opphavskanin antistoffet; og (v) hvor de endelige 1-3 aminosyrene av den humane tunge FRI regionen eventuelt blir erstattet med de terminale 1-3 aminosyrene av de tilsvarende kanin tungkjede FRI residuene; og/eller den terminale aminosyren av de humane tungkjede rammeverk 2 regionen eventuelt blir erstattet med den tilsvarende terminale aminosyreresten av kanin tungkjede rammeverk 2; og/eller fjerde aminosyren fra terminusen av kanin tungkjede CDR2 (typisk en tryptofan) eventuelt blir erstattet med det tilsvarende humane CDR2 residue (typisk en serin); og (vi) hvor få eller ingen av de gjenværende FR residuene av de valgte homologe humane FR regioner er substituert med de tilsvarende kanin FR residuene.

22. ) Humanisert antistoff ifølge krav 21, karakterisert ved at det er spesifikt for IL-6, hepcidin, hepatocytt vekstfaktor eller et TNF polypeptid.

23. ) Humaniseringsstrategien for å produsere en humanisert lettkjede antistoffsekvens omfattende de følgende trinn: (i) oppnåelse av et DNA som koder for kanin lettkjede antistoffsekvensen fra et kaninantistoff som spesifikt binder til et ønsket antigen og identifikasjon av aminoresiduene som dekker begynnelsen av Rammeverk 1 (FRI) til slutten av Rammeverk 3 (FR3) inklusivt; (ii) utførelse av et homologisøk ved anvendelse av nevnte kanin lett antistoff aminosyresekvens som dekker begynnelsen av FRI til slutten av FR3 sekvensen mot et bibliotek inneholdende humane lettkjede antistoff-sekvenser og identifikasjon av en human lettkjede antistoffsekvens som oppviser vesentlig sekvenshomologi dertil i forhold til andre humane kimlinje antistoff lettkjede sekvenser; (iii) identifisering i både kanin og humane lettkjede sekvenser arrangement og de spesifikke residuene derav som svarer til FRI, FR2, FR3, CDR1, CDR2 regioner og oppstilling av disse adskilte regionene i kanin og valgte humane antistoff lettkjede; (iv) konstruering av et DNA eller aminosyresekvens hvor CDR1 og CDR2 regionene av den valgte homologe humane lettkjede sekvensen er substituert med de tilsvarende selektivitetsbestemmende residuene innbefattet i CDR1 og CDR2 regionene av kanin lettkjede sekvensen; (v) videre kobling til DNA eller aminosyresekvensen oppnådd i trinn (iv) en DNA-sekvens som koder for eller polypeptid inneholdende de tilsvarende aminosyrerestene av kanin CDR3 lettkjede antistoffsekvensen; (vi) videre selektering av human lettkjede rammeverk 4 region (FR4) som er homolog med FR4 innbefattet i kanin lettkjeden og som fortrinnsvis avviker derifra med maksimalt 2-4 aminosyrerester og kobling av en DNA-sekvens som koder for nevnte humane FR4 eller de tilsvarende aminoresiduene av nevnte humane FR4 på DNA eller aminosyresekvensen oppnådd etter trinn (v); og (vii) syntetisering av en DNA eller aminosyresekvens som koder for eller inneholdende den humaniserte kanin lettkjede sekvensen som er et resultat av trinn (i) t.o.m (vi).

24. ) Humaniseringsstrategien ifølge krav 23, karakterisert ved at aminosyren som initierer FRI er den første aminosyren etter kanin lettkjede signalsekvensen.

25. ) Humaniseringsstrategien ifølge krav 23, karakterisert ved at signalsekvensen omfatter ca. 20-22 aminosyrerester.

26. ) Humaniseringsstrategien ifølge krav 23, karakterisert ved at den humane lettkjede sekvensen er identifisert fra et bibliotek inneholdende humane kimlinje variable lettkjede sekvenser.

27. ) Humaniseringsstrategien ifølge krav 23, karakterisert ved at FRI, FR2, FR3 og CDR1 og CDR2 regionene i kaninsekvensen er identifisert ved oppstilling av kanin FRI, FR2, FR3 og CDR1 og CDR2 regionene med de tilsvarende humane lettkjede FRI, FR2, FR3, CDR1 og CDR2 regionene.

28. ) Humaniseringsstrategien ifølge krav 23, karakterisert ved at kanin CDR3 regionen omfatter fra 9 til 15 aminosyrerester.

29. ) Humaniseringsstrategien ifølge krav 23, karakterisert ved at kanin lettkjede FR4 regionen omfatter 11 aminosyrerester.

30. ) Humaniseringsstrategien ifølge krav 23, karakterisert ved at FR3 ender medYYC.

31. ) Humaniseringsstrategien ifølge krav 23, karakterisert ved at FR4 i kanin lettkjede starter med FGGGG.

32. ) Humaniseringsstrategien ifølge krav 31, karakterisert ved at nevnte kanin FR4 region starter med en VVKR aminosyresekvens.

33. ) Humaniseringsstrategien ifølge krav 23, karakterisert ved at den valgte humane FR4 lettkjede sekvensen omfatter FGGGTKVEIKR.

34. ) Humaniseringsstrategien ifølge krav 23, karakterisert ved at den resulterende humaniserte kanin lettkjeden blir anvendt ved fremstilling av et humanisert antistoff eller humanisert antistoffragment som binder et ønsket antigen.

35. ) Humanisert kanin lettkjede variabel aminosyresekvens eller et DNA som koder derav produsert ifølge hvilket som helst av kravene 23-34.

36. ) Humanisert kanin lettkjede variabel aminosyresekvens eller DNA-sekvens ifølge krav 35, karakterisert ved at den er spesifikk for et antigen valgt fra et mikrobielt antigen, et humant antigen, viralt antigen og et allergen.

37. ) Humanisert kanin lettkjede variabel aminosyre eller DNA-sekvens ifølge krav 36, karakterisert ved at det humane antigenet er valgt fra et humant autoantigen, cytokin, reseptorprotein, enzym, hormon, reseptor ligand, steroid, vekstfaktor og et onkogen.

38. ) Antistoff eller antistoffragment, karakterisert ved at det inneholder en humanisert kanin lettkjede variabel sekvens produsert ifølge hvilket som helst av kravene 23-34.

39. ) Humanisert kanin lettkjede eller antistoff, karakterisert ved at det blir produsert ifølge hvilket som helst av kravene 23-34 som er bundet til en effektorgruppe.

40. ) Humaniserte kanin lettkjede polypeptid ifølge krav 39, karakterisert ved a t effektorgruppen er valgt fra et medikament, et toksin, et enzym, et radionuklid, en fluorofore, et cytokin, en affinitetsmarkør og et translokeringspolypeptid.

41. ) Humanisert kanin lettkjede polypeptid eller antistoff inneholdende derav eller et DNA som koder derfor produsert ifølge hvilket som helst av kravene 23-34 som er avledet fra et kanin antistoff som spesifikt binder et cytokin, vekstfaktor eller et tumor spesifikk polypeptid.

42. ) Humaniserte kanin lettkjede polypeptid eller antistoff ifølge krav 41,karakte risert ved at det er avledet fra et kanin antistoff som spesifikt binder IL-6, TNF, VEGF, IL-12, Hepcidin eller Hepatocytt vekstfaktor.

43. ) Humaniseringsstrategi for å produsere en humanisert tungkjede antistoffsekvens fra en kanin tungkjede antistoffsekvens, karakterisert ved at den omfatter de følgende trinn: (i) oppnåelse av en kanin tungkjede antistoffsekvens fra et kaninantistoff som spesifikt binder til et ønsket antigen og identifikasjon av aminoresiduene som dekker begynnelsen av Rammeverk 1 (FRI) til slutten av Rammeverk 3 (FR3) inklusivt; (ii) utførelse av et homologisøk (f.eks. ved BLAST søking av human kimlinje antistoffsekvens inneholdende biblioteker) ved anvendelse av nevnte kanin tung antistoff aminosyresekvens som dekker begynnelsen av FRI til slutten av FR3 sekvensen og identifikasjon av en human tungkjede antistoffsekvens som er homolog dertil, dvs. som fortrinnsvis har minst 80%-90% identitet dermed på aminosyrenivået; (iii) identifisering i både kanin og humane tungkjede sekvenser arrangementet av og de spesifikke residuene derav som svarer til FRI, FR2, FR3, CDR1, CDR2 regionene og oppstilling av disse adskilte regioner av kanin mot de tilsvarende regioner av den valgte homologe humane antistoff tungkjeden; (iv) konstruering av en DNA eller aminosyresekvens, karakterisert ved at residuene i CDR1 og CDR2 regionene av den valgte homologe humane tungkjede sekvensen er substituert med selektivitetsbestemmende residuer innbefattet i de tilsvarende CDR1 og CDR2 regionene av kanin tungkjede sekvensen og eventuelt erstatning av de terminale 1-3 aminosyrene av den humane tunge FRI regionen med de tilsvarende terminale 1-3 aminosyrene av kanin tungkjede FRI; og/eller eventuelt erstatning av den terminale aminosyren av den humane tungkjede rammeverk 2 regionen med den tilsvarende terminale aminosyreresten av kanin tungkjede rammeverk 2 og/eller eventuelt erstatning av den fjerde aminosyren fra terminusen av kanin tungkjede CDR2 (typisk en tryptofan) med det tilsvarende humane CDR2 residue (typisk en serin); (v) videre kobling til DNA eller aminosyresekvensen oppnådd i trinn (iv) en DNA-sekvens som koder for eller som har de tilsvarende aminosyrerestene til kanin tungkjede CDR3 som er innbefattet i samme kanin tungkjede antistoffsekvens; (vi) videre selektering av en human tungkjede rammeverk 4 region (FR4) som er homolog dertil (som fortrinnsvis skiller seg fra FR4 innbefattet i det humaniserte kanin antistoff tungkjede sekvensen med maksimalt 4 aminosyrerester) og kobling av en DNA-sekvens som koder for nevnte valgte homologe humane FR4 eller de tilsvarende aminoresiduene av nevnte humane FR4 på DNA eller aminosyresekvensen oppnådd etter trinn (v)); og (vii) syntetisering av en DNA eller aminosyresekvens som koder for eller inneholdende det humaniserte kanin tungkjede sekvensen som er et resultat av trinnene (i) t.o.m (vi).

44. ) Humaniseringsstrategien ifølge krav 43, karakterisert ved at aminosyren som initierer FRI er den første aminosyren etter kanin tungkjede signalsekvens.

45. ) Humaniseringsstrategien ifølge krav 43, karakterisert ved at enden av FR3 er ca. 95-100 aminosyrerester etter det første residue av FRI.

46. ) Humaniseringsstrategien ifølge krav 43, karakterisert ved at signalsekvensen omfatter ikke mer enn 19 aminosyrerester.

47. ) Humaniseringsstrategien ifølge krav 43, karakterisert ved at den homologe humane tungkjede sekvensen er identifisert ved et BLAST søk av humane kimlinjesekvenser oppnådd før antistoff modning.

48. ) Humaniseringsstrategien ifølge krav 43, karakterisert ved at den valgte homologe humane tungkjeden har minst 90-95% sekvensidentitet med den tilsvarende regionen av kanin tungkjeden.

49. ) Humaniseringsstrategien ifølge krav 43, karakterisert ved at FRI, FR2, FR3 og CDR1 og CDR2 regionene i kanin tungkjede sekvensen er identifisert ved oppstilling av kanin FRI, FR2, FR3 og CDR1 og CDR2 regionene med de tilsvarende human tungkjede FRI, FR2, FR3, CDR1 og CDR2 regionene.

50. ) Humaniseringsstrategien ifølge krav 43, karakterisert ved at de endelige 3 aminosyrerestene av det humane FRI blir erstattet med de tilsvarende 3 residuene av kanin FRI.

51. ) Humaniseringsstrategien ifølge krav 50, karakterisert ved at de 3 residuene i kanin FRI kommer etter (preceded by) ser-gly.

52. ) Humaniseringsstrategien ifølge krav 43, karakterisert ved at det omfatter videre erstatning av den terminale aminosyreresten av det humane FR2 med den tilsvarende terminale aminosyreresten av kanin FR2.

53. ) Humaniseringsstrategien ifølge krav 52, karakterisert ved at det terminale kanin FR2 residue omfatter et glycin som eventuelt kommer etter (preceded by) et isoleucin residue.

54. ) Humaniseringsstrategien ifølge krav 43, karakterisert ved at det omfatter videre forandring av tryptofan residue som er lokalisert ca. 4 residuer fra slutten av kanin CDR2 med et serin residue.

55. ) Fremgangsmåte ifølge krav 43, karakterisert ved at kanin CDR3 omfatter 5-19 aminosyrerestene.

56. ) Humaniseringsstrategien ifølge krav 43, karakterisert ved at kanin CDR3 er fulgt av residuene WG"X"G, hvor "X" er fortrinnsvis Q eller P.

57. ) Humaniseringsstrategien ifølge krav 43, karakterisert ved at kanin FR4 omfatter 11 aminosyrerester.

58. ) Humaniseringsstrategien ifølge krav 57, karakterisert ved at kanin FR4 omfatter WGQGTLVTVSS.

59. ) Humaniserte kanin tungkjede variabel aminosyresekvens eller DNA-sekvens produsert ved hvilket som helst av kravene 43-58 som er avledet fra et kanin antistoff spesifikt for et antigen valgt fra et mikrobielt antigen, et humant antigen, viralt antigen og et allergen.

60. ) Humaniserte kanin tungkjede variabel aminosyresekvens eller DNA-sekvens ifølge krav 59, karakterisert ved at det er spesifikt for et humant antigen.

61. ) Humaniserte kanin tungkjede variabel aminosyre eller DNA-sekvens ifølge krav 59, karakterisert ved at det humane antigenet er valgt fra et humant autoantigen, cytokin, reseptorprotein, enzym, hormon, reseptor ligand, steroid, vekstfaktor og et onkogen.

62. ) Antistoff eller antistoffragment, karakterisert ved at det inneholder et humanisert kanin tungkjede variabel sekvens produsert ifølge hvilket som helst av kravene 43-58.

63. ) Humanisert kanin tungkjede, karakterisert ved at det blir produsert ifølge hvilket som helst av kravene 43-58 som er bundet til en effektorgruppe.

64. ) Humaniserte kanin tungkjede polypeptid ifølge krav 63, karakterisert ve dat effektorgruppen er valgt fra et medikament, et toksin, et enzym, et radionuklid, en fluorofore, et cytokin, en affinitetsmarkør og et translokeringspolypeptid.

65. ) Humaniserte kanin tungkjede polypeptid eller et DNA som koder derav produsert ifølge hvilket som helst av kravene 43-58 som er avledet fra et kanin antistoff som spesifikt binder et cytokin, vekstfaktor eller et tumor spesifikt polypeptid.

66. ) Humaniserte kanin tungkjede polypeptid ifølge krav 65, karakterisert ve d a t det er avledet fra et kanin antistoff som spesifikt binder IL-6, TNF-alfa, VEGF-alfa, IL-12, Hepcidin eller Hepatocycte vekstfaktor.

67. ) Humaniserte kanin tungkjede polypeptid ifølge krav 64, karakterisert ve d at det er aglykosylert.

68). Humanisert kanin antistoff, karakterisert ved at det omfatter minst én humanisert kanin lettkjede produsert i henhold til minst et av kravene 23-34 og minst én humanisert kanin tungkjede produsert ifølge ett av kravene 43-58.

69. ) Humanisert kanin antistoff ifølge krav 68, karakterisert ved at det omfatter humane konstant domener.

70. ) Humanisert kanin antistoff ifølge krav 69, karakterisert ved at det er valgt fra en IgGl, IgG2, IgG3 og IgG4.

71. ) Humanisert kanin antistoff ifølge krav 68, karakterisert ved at det binder et antigen valgt fra et humant antigen, bakterielt antigen, viralt antigen, patogen, parasitt, gjær antigen og et sopp antigen.

72. ) Fremgangsmåte for immunoterapi eller immunodiagnose, karakterisert v ed at den omfatter administrering av et humanisert antistoff, idet forbedringen omfatter administrering av et humanisert antistoff eller antistoffragment ifølge hvilket som helst av kravene 1-5, 11-14, 21 eller 22.

73. ) Fremgangsmåte ifølge krav 72, karakterisert ved at det omfatter forbedring eller reduksjon av symptomer på en sykdom eller lidelse forbundet med IL-6 eller TNF.

74. ) Fremgangsmåte ifølge krav 73, karakterisert ved at nevnte sykdom eller lidelse forbundet med IL-6 eller TNF-alfa er kreft eller en inflammatorisk tilstand.

75). Fremgangsmåte ifølge krav 73, karakterisert ved at antistoffet er et anti-IL-6 antistoff og blir anvendt for å behandle eller diagnostisere prognosen for IL-6 assosiert tretthet, kakeksi eller artritt.

76.) Fremgangsmåte ifølge krav 73, karakterisert ved at nevnte sykdom eller lidelse forbundet med IL-6 er valgt fra generell tretthet, trenings-fremkalt tretthet, kreft-relatert tretthet, inflammatorisk sykdoms-relatert tretthet, kronisk tretthetssyndrom, kreft-relatert kakeksi, hjerte-relatert kakeksi, respiratorisk-relatert kakeksi, nyre-relatert kakeksi, aldersrelatert kakeksi, revmatoid artritt, systemisk lupus erythematosus (SLE), systemisk ungdoms idiopatisk artritt, psoriasis, psoriatisk artropati, ankyloserende spondylitt, inflammatorisk tarmsykdom (IBD), polymyalgi rheumatica, kjempecelle arteritt, autoimmun vaskulitt, graft versus vert sykdom (GVHD), Sjøgrens syndrom, Stills sykdom hos voksne, revmatoid artritt, systemisk ungdoms idiopatisk artritt, osteoartritt, osteoporose, Pagefs sykdom i ben, osteoartritt, multippelt myelom, Hodgkin's lymfom, ikke-Hodgkin's lymfom, prostatakreft, leukemi, nyrecellekreft, multisentrisk Castleman's sykdom, eggstokkreft, medikament resistens i kreft kjemoterapi, kreft kjemoterapi toksisitet, ischemisk hjertesykdom, aterosklerose, fedme, diabetes, astma, multippel sklerose, Alzheimer's sykdom og cerebrovaskulær sykdom.

77.) Fremgangsmåte ifølge krav 73, karakterisert ved at nevnte sykdom eller lidelse er forbundet med TNF og er valgt fra generell tretthet, trenings-fremkalt tretthet, kreft-relatert tretthet, inflammatorisk sykdoms-relatert tretthet, kronisk tretthetssyndrom, kreft-relatert kakeksi, hjerte-relatert kakeksi, respiratorisk-relatert kakeksi, nyre-relatert kakeksi, aldersrelatert kakeksi, revmatoid artritt, systemisk lupus erythematosus (SLE), systemisk ungdoms idiopatisk artritt, psoriasis, psoriatisk artropati, ankyloserende spondylitt, inflammatorisk tarmsykdom (IBD), polymyalgi rheumatica, kjempecelle arteritt, autoimmun vaskulitt, graft versus vert sykdom (GVHD), Sjøgrens syndrom, Stills sykdom hos voksne, revmatoid artritt, systemisk ungdoms idiopatisk artritt, osteoartritt, osteoporose, Pagefs sykdom i ben, osteoartritt, multippelt myelom, Hodgkin's lymfom, ikke-Hodgkin's lymfom, prostatakreft, leukemi, nyrecellekreft, multisentrisk Castleman's sykdom, eggstokkreft, medikament resistens i kreft kjemoterapi, kreft kjemoterapi toksisitet, ischemisk hjertesykdom, aterosklerose, fedme, diabetes, astma, multippel sklerose, Alzheimer's sykdom og cerebrovaskulær sykdom.

78.) Fremgangsmåte ifølge krav 72, karakterisert ved at det humaniserte antistoffet eller antistoffragmentet blir uttrykt i en polyploid gjærkultur som stabilt uttrykker og utskilles inn i dyrkningsmediet minst 10-25 mg/liter av nevnte antistoff, omfattende: (i) innføring av minst én ekspresjonsvektor inneholdende én eller flere heterologe polynukleotider som koder for nevnte humaniserte antistoff eller fragment operabelt bundet til en promoter og et signalsekvens inn i en haploid gjærcelle; (ii) produsering ved parring eller sfæroplast fusjon en polyploidal gjær fra nevnte første og/eller andre haploide gjærcelle; (iii) selektering av polyploidale gjærceller som stabilt uttrykker nevnte humaniserte antistoff eller fragment; og (iv) produsering av stabile polyploidale gjærkulturer fra nevnte polyploidale gjærceller som stabilt uttrykker minst 10-25 mg/liter av nevnte humaniserte antistoff eller fragment inn i dyrkningsmediet.

79. ) Fremgangsmåte ifølge krav 78, karakterisert ved at nevnte gjær er valgt fra de følgende slekter: Arxiozyma; Ascobotryozyma; Citeromyces; Debaryomyces; Dekkera; Eremothecium; Issatchenkia; Kazachstania; Kluyveromyces; Kodamaea; Lodderomyces; Pachysolen; Pichia; Saccharomyces; Saturnispora; Tetrapisispora; Torulaspora; Williopsis; og Zygosaccharomyces.

80. ) Fremgangsmåte ifølge krav 79, karakterisert ved at nevnte gjærslekter er Pichia.

81. ) Fremgangsmåte ifølge krav 80, karakterisert ved at artene av Pichia er valgt fra Pichia pastoris, Pichia metanolica og Hansenula polymorfa (Pichia angusta).

82. ) Humaniserte antistoff eller antistoffragment, karakterisert ved at det inneholder et humanisert antistoff polypeptid produsert ifølge hvilket som helst et av kravene 23-34 eller 43-58, hvor nevnte humaniserte antistoff eller fragment binder til et antigen med en dissosiasjonskonstant (KD ) på mindre enn eller lik 5x1 <O> ^M" <1> , IO- <7> NT <1> , 5xl0'8 M"1, 10"8 M"1, 5xl0"9 M"1, IO"9 M"1, 5xl0"10 M"1, 10"10 M"1, 5xl0"n M"1, 10"11 M" <1> , 5xl0" <12> NT <1> , IO" <12> NT <1> , 5xl0" <13> M" <1> , IO" <13> M <_1> eller 5xl0" <14> NT <1> .

83. ) Humanisert antistoff ifølge krav 82, karakterisert ved at nevnte antistoff binder til et antigen med en dissosiasjonskonstant (Kd ) på mindre enn eller lik SxlO^M" <1> .

84. ) Humanisert antistoff ifølge krav 82, karakterisert ved at nevnte antistoff binder til et antigen med en off-rate (Koff ) på mindre enn eller lik 10" <4> S" <1> , 5x10" <5>S"<1> , 10" <5> S" <1> , 5xl0" <6> S" <1> , IO" <6> S" <1> , 5xl0" <7> S" <1> eller IO" 7 S" <1> .

85. ) Humanisert antistoff ifølge krav 82, karakterisert ved at opphavskanin antistoffet har opphav fra én eller flere kanin B cellepopulasjoner.

86. ) Humanisert antistoff ifølge krav 82, karakterisert ved at nevnte antistoff hemmer assosiering av IL-6 med IL-6R eller TNF og dens reseptor.

87. ) Humanisert antistoff ifølge krav 86, karakterisert ved at IL-6R er oppløselig IL-6R (sIL-6R).

88. ) Humanisert antistoff ifølge krav 86, karakterisert ved at TNF reseptoren (TNFR) er oppløselig.

89. ) Vektor, karakterisert ved at den uttrykker en humanisert kanin ifølge hvilket som helst av kravene 1-22 eller 82-88.

90. ) Vertscelle, karakterisert ved at den omfatter vektoren ifølge krav 89.

91. ) Vertscelle ifølge krav 90, karakterisert ved at nevnte vertscelle er en gjærcelle som tilhører slekten Pichia.