NO177774B - Fremgangsmåte for fremstilling av et preparat egnet for tilförsel av en hovedsakelig vannuopplöslig aktiv bestanddel - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av et preparat egnet for tilførsel av en hovedsakelig vannuoppløselig aktiv bestanddel, omfattende vesikler i en farmasøytisk tålbar bærer.

Disse og andre trekk fremgår av de etterfølgende patentkrav.

Ved oppfinnelsen fremstilles fosfolipidinnkapslede medisinske midler, og er i en utførelsesform rettet på fremstilling av fosfolipidinnkapslet heksametylmelamin. Ved fremgangsmåten i samsvar med oppfinnelsen tilveiebringes preparater for til-førsel av medisinske midler til kroppen, som f.eks. til tumorceller.

Selv om et betraktelig antall substanser er kjent å ha anti-tumoraktivitet har det i mange tilfeller vært problemer med utvikling av preparater og fremgangsmåter for sikker og effektiv tilførsel av slike substanser til tumorceller. Den generelle giftighet av mange anticancermidler forhindrer at de tilføres i fri form i kroppen. Mange anticancermidler er ikke tilstrekkelig oppløselige eller stabile i det vandige miljø til å tillate injeksjon eller annen effektiv tilførsel.

Videre er det ofte nyttig å kontrollere størrelsen av til-førselsmidler for å oppnå målretning til tumorceller eller tillate filtrering for å fjerne skadelige komponenter som f.eks. bakterier. Det er også viktig å oppnå et preparat som, bortsett fra at det er ikke-giftig, er bioforlikelig.

Fosfolipidinnkapslede tilførselsvehikler er kjent å ha vært anvendt for å overvinne slike problemer i visse tilfeller.

Det er f.eks. kjent at enkelte vannuoppløselige medisiner kan innlemmes i det lipofile område inne i fosfolipidbilaget av et liposom for å oppnå en vannoppløselig, forholdsvis ikke-giftig og bioforlikelig tilførselsvehikkel. Alle vannuoppløselige materialer er imidlertid ikke anvendelige i et slikt preparat.

Heksametylmelamin (HXM) er et eksempel på et anticancermiddel som har oppnådd bare begrenset bruk på grunn av sin dårlige vannoppløselignet. Oral tilførsel av HXM gir variabel ab-sorpsjon og feilaktige medisinkonsentrasjoner i plasma. Ames et al., Cancer Treatment Reports, vol. 66, nr. 7, sidene 1579-1581 (juli 1982). Gentisat og hydrokloridsalter av HXM har resultert i alvorlig lokal irritasjon etter intravenøs til-førsel i mennesker. Nylige forsøk på å sammensette HXM i et intravenøstålbart preparat har fokusert på innlemmelse av medikamentet i fettemulsjoner og har oppnådd HXM-konsentrasjoner på 2 mg/ml eller mer. Intraperitoneale preparater har også fokusert på fettemulsjoner slik som dem som dannes med oljeemulsjonsvehikkelen "Intralipid" (Cutter Laboratories, Berkeley, California), drøftet av Wickes et al. i Cancer Treatment Reports, vol. 69, nr. 6, sidene 657-662 (juni 1985). Selv om slike sammensetninger lykkes i å øke konsentrasjonen av HXM til nivåer egnet for påvirkning av tumorceller, er de ikke rettet på problemet med spesifikk målretning til tumorceller ved bruk av fosfolipidinnkapslede vesikler av en passende størrelse. Heller ikke er de rettet på problemet med sterilisering hvor den medisinske eller annen komponent kanskje ikke er varmestabil slik at et preparat ikke kan sterilfiltreres.

Det er følgelig et formål for den foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en fremgangsmåte for fremstilling av nye preparater egnet for tilførsel av vannuoppløselige medisinske midler til kroppen. Ved et aspekt tilveiebringer oppfinnelsen fremgangsmåter for fremstilling av preparater for tilførsel av anticancermidler, inklusive heksametylmelamin.

Det er et ytterligere formål for oppfinnelsen å tilveiebringe en fremgangsmåte for fremstilling og sterilisering av disse preparater for tilførsel av medisinske midler til kroppen, og spesielt til tumorceller.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører således en fremgangsmåte for fremstilling av et preparat egnet for tilførsel av en hovedsakelig vannuoppløselig aktiv bestanddel, omfattende vesikler i en farmasøytisk tålbar bærer, hvori nevnte vesikler har en størrelse på 30 til 200 nm i diameter, som er kjenne-tegnet ved (1) kombinering av den nevnte aktive bestanddel med trilauroylglyserol, et fosfolipidmaterial og en farma-søytisk tålbar bærer, (2) tildannelse av vesikler inneholdende den aktive bestanddel , og (3) fjerning av uønskede materialer fra den resulterende blanding.

Den ovennevnte fremgangsmåte vedrører i en utførelsesform en fremgangsmåte for fremstilling av et preparat egnet for til-førsel av heksametylmelamin som aktiv bestanddel, omfattende vesikler i en farmasøytisk tålbar bærer, hvori nevnte vesikler har en størrelse på 30 til 200 nm i diameter, som er kjenne-tegned ved

(1) 1 molfraksjon heksametylmelamin kombineres med omtrent

4 molfraksjoner trilauroylglyserol, 2-1 molfraks joner

distearoylfosfatidylcholin, omtrent 1 molfraksjon kolesterol, 0-1 molfraksjoner distearoylfosfatidylglyserol, og

en farmasøytisk tålbar bærer,

(2) det tildannes vesikler inneholdende heksametylmelaminet, og (3) uønskede materialer fjernes fra den resulterende blanding.

Ved fremgangsmåten i samsvar med den foreliggende oppfinnelse tilveiebringes preparater inneholdende vesikler egnet for tilførsel av medisinsk aktive bestanddeler til mennesker eller dyr. Preparatene inkluderer vesikler omfattende et ytre fosfolipidbelegg og en innesluttet fase omfattende en hovedsakelig vannuoppløselig medisinsk aktiv bestanddel og en lipid triglyseridkomponent. Vesiklene emulgeres i en farmasøytisk tålbar bærer. Det antas at de emulgerte vesikler har et stort sett kuleformet ytre monolag av fosfolipider med hydrofobe haler av fosfolipidmolekylene orientert innover mot den medisinsk aktive bestanddel/lipid triglyseridfasen.

En foretrukket aktiv bestanddel er anticancermidlet heksametylmelamin. Foretrukne triglyserider med heksametylmelamin er trimyristoylglyserol (trimyristin) og trilauroylglyserol (trilaurin). Det ytre fosfolipidbelegg omfatter et eller flere fosfolipidmaterialer med fra 12 til 20 karbonatomer i alkylkjedene. Distearoylfosfatidylcholin og distearoylfosfatidylglyserol foretrekkes i tilfellet av den aktive bestanddel heksametylmelamin. Kolesterol kan også tilsettes til preparatene.

Fremstillingen av preparatene kan gjennomføres under anvendelse av standard prosedyrer i en passende saltløsning eller sakkaridbasert bæreroppløsning. Glyserol kan også tilsettes til den vandige bærer for å nedsette aggregasjon av de endelige preparater til et minimum.

Den vedføyde fig. 1 illustrerer skjematisk et tverrsnitt av den teoretiske struktur av tilførselsvehikkelen fremstilt i henhold til den foreliggende oppfinnelse.

Som indikert i det foregående innbefatter oppfinnelsen inn-kapsling og forbedret tilførsel av vannuoppløselige aktive bestanddeler, og spesielt vannuoppløselige anticancermidler som f.eks. heksametylmelamin, i fosfolipidvesikler. De foreliggende fremstillbare preparater kan i enkelte tilfeller anvendes hvor andre tilførselsvehikler, som f.eks. liposomer, ikke er tilfredsstillende.

Heksametylmelamin (HXM), eller 2,4,6-tris(dimetylamino)-s-triazin, er en anticancerforbindelse som strukturelt er meget lik alkyleringsmiddelet trietylenmelamin. Dets struktur er

som følger:

Som drøftet i det foregående har den dårlige vannoppløselighet av HXM hindret dets brukbarhet ved anticancerterapi. Under-søkelser i forbindelse med den foreliggende oppfinnelse har vist at forbedret oppløseliggjøring av HXM i en fosfolipid-vesikkel kan oppnås med de foreliggende tilførselsvehikler sammenlignet med liposomale preparater.

De foreliggende fremstillbare preparater ansees å ha en struktur som vist i fig. 1 i tverrsnitt. Tilførselsvehikkelen kan være stort sett kuleformet. Den indre fase av tilførsels-vehikkelen inkluderer den aktive bestanddel oppløst i et lipid triacylglyserol (triglyserid). På grunn av at denne indre fase er hovedsakelig lipofil, vil den danne en stabil asso-siering med et innkapslet monolag av fosfolipider. Den hydrofile natur av den ytre overflate av det innkapslende lag tillater vandig og in vivo oppløseliggjøring og kan oppnå andre fordeler assosiert med liposomale strukturer (inklusive bioforlikelighet, isolasjon av aktiv bestanddelgiftighet og målretning til tumorceller).

Det er nødvendig å anvende et passende lipid triglyserid for å oppnå en tilfredsstillende tilførselsvehikkel. En gitt aktiv bestanddel kan være oppløselig i et antall triglyserider eller den kan være gjort oppløselig ved f.eks. endring av pH eller ionestyrke i blandingen eller ved kompleksdannelse av den aktive bestanddel med et andre lipidoppløselig middel. Ikke desto mindre vil ikke alle lipide triglyserider som kan oppløseliggjøre en gitt aktiv bestanddel nødvendigvis være forlikelig med en stabil fosfolipidemulsjon. F.eks. vil fullstendig mettede langkjedede triglyserider som f.eks. tripalmitin og tristearin oppløseliggjøre HXM ved oppvarming, men vil ha tendens til å danne en hard voksaktig sammensetning ved avkjøling og som ikke kan tilfredsstillende emulgeres med de testede fosfolipider. Motsatt vil den lange umettede alkylkjede i triglyseridet triolein tillate en emulsjon med fosfolipider, men triglyseridet er ikke effektivt for oppløse-liggj øring av HXM. Triglyserider med kortere kjedelengder som f.eks. triacetin og tributyrin vil dårlig oppløseliggjøre HXM og danner ikke stabile emulsjoner i de testede preparater.

I tilfellet av den aktive bestanddel HXM foretrekkes det at de lipide triglyserider trimyristin eller trilaurin anvendes. Disse triglyserider vil oppløseliggjøre den aktive bestanddel og er i stand til å danne stabile emulsjoner. Andre passende triglyserider, inklusive dem med blandede alkylkjeder, kan også anvendes og dette kan påvises ved forholdsvis enkelt rutineforsøk på basis av læren i henhold til den foreliggende oppfinnelse. Valget av et passende triglyserid vil selv-følgelig avhenge av et antall faktorer inklusive type og ønsket konsentrasjon av den aktive bestanddel, type av fosfolipid eller fosfolipidblanding som anvendes, og beskaffenheten av andre komponenter i blandingen som sammensettes for preparatet. Derfor er de spesielle triglyserider som omhandles og foretrekkes heri bare ment å eksemplifisere utførelsesformer som har vist seg å være effektive.

Den aktive bestanddel som anvendt heri vil typisk være en eller flere forbindelser som er uoppløselig i vandige media eller som krever forbedret oppløseliggjøring for å oppnå nyttige konsentrasjoner. Med hensyn til HXM er f.eks. opp-løseligheten av medikamentet i saltløsning rapportert å være så lav som 0,070 mg/ml (Wickes et al., Cancer Treatment Reports, vol. 69, nr. 6, sidene 657-662 (juni 1985)) og så høy som 0,20 mg/ml i vann (Ames et al., Cancer Treatment Reports, vol. 66, nr. 7, sidene 1579-1581 (juli 1982)). En ønskelig konsentrasjon ville overstige 1,0 mg/ml målt med hensyn til HXM-innholdet.

Selv om de aktive bestanddeler nyttige ved den foreliggende oppfinnelse typisk vil være midler som er vanskelig å opp-løseliggj øre i vandige media, behøver ikke dette være tilfellet. Så lenge den aktive bestanddel kan gjøres forlikelig med triglyseridfasen, og så lenge det er ønskelig å innkapsle bestanddelen i et fosfolipidmonolag, kan den foreliggende oppfinnelse tilveiebringe en nyttig tilførselsvehikkel. Som drøftet i det foregående kan modifikasjoner i pH eller ionestyrke i blandingen, eller modifikasjoner av den aktive bestanddel som f.eks. kompleksdannelse, anvendes for å gjøre bestanddelen triglyseridoppløselig. Lignende modifikasjoner kan gjøres for å tillate dannelse av en stabil fosfolipid-vesikkel.

Det ytre fosfolipidbelegg kan være sammensatt av en rekke for-skjellige fosfolipider inklusive nøytrale fosfolipider som f.eks. fosfatidylcholiner og fosfatidyletanolaminer, såvel som ioniske fosfolipider som f.eks. fosfatidylglyseroler og fos-fatidylseriner. Foretrukne fosfolipider er dem med fra 12 til 20 karbonatomer i deres alkylsidekjeder. Kolesterol kan også tilsettes som en komponent av det ytre lag og foretrekkes i mange tilfeller.

Distearoylfosfatidylcholin er et spesielt foretrukket fosfolipid med den aktive bestanddel HXM og den indre fase triglyseridtrilaurin. Anionet distearoylfosfatidylglyserol kan også tilsettes til å gi en heldig sammensetning. Kolesterol er en foretrukket komponent i det ytre belegg. Det molare forhold mellom bestanddeler i et slikt HXM-preparat vil foretrukket være som følger:

Dannelse av de emulgerte tilførselsvehikler kan oppnås i en saltløsning, som f.eks. en 0,9 % oppløsning av natriumklorid i vann, eller i en sakkarid- eller disakkaridoppløsning, som f.eks. 5 % dekstrose eller 9 % laktose i vann. I tillegg foretrekkes det ofte å tilsette glyserol til blandingen i en konsentrasjon på omtrent 100 mM for å redusere eller eliminere enhver skadelig tendens til aggregasjon av vesiklene. Dan-nelsen av vesiklene kan oppnås under anvendelse av standard lydbehandlingsteknikker. Dette er tilfellet med HXM-preparatene beskrevet heri.

Ikke-oppløseliggjort material kan fjernes fra blandingen ved sentrifugering. Ytterligere rensing kan inkludere filtrering, f. eks. gjennom en 5 jlm filternål for å sikre at preparatet kan sprøytes, og gjennom et 0,45 og/eller 0,22 (im filter for å fjerne f.eks. bakterieforurensninger. De endelige tilførsels-vehikkelvesikler vil foretrukket være mindre enn 100 nm i diameter og foretrukket i området 40 til 75 nm i diameter.

De etterfølgende eksempler viser fremstillingen og karakteri-seringen av en form av tilførselsvehiklene fremstillbare i henhold til oppfinnelsen. Eksempel 2 er gitt for å sammen-ligne et av de foreliggende fremstillbare preparater med en liposomtype tilførselsvehikkel testet for bruk med HXM.

EKSEMPEL 1

Fremstilling av en heksametylmelamintrilaurinholdig til-førselsvehikkel innkapslet med fosfolipid.

Heksametylmelamin ble levert av National Cancer Institute, forbindelse NSC-13875, porsjonsnummer H739646. Oppløselig-hetstester ble gjennomført med HXM i et antall rene triglyserider og det ble fastslått at HXM var meget oppløselig (mer enn 50 mg/ml) i tributyrin, triheksanoin, trikaprylin, trilaurin og tripalmitin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Emulsjoner av HXM ble tildannet ved å oppvarme en målt mengde av triglyseridet til en flytende tilstand og tilsetning under omrøring av målte mengder av HXM, fosfolipid (Avanti Biochemicals, Birmingham, AL), kolesterol (Sigma) og endelig den vandige oppløsningsfase. Oppløsningen ble så lydbehandlet under en inert atmosfære under anvendelse av en probetype sonikator (Sonics and Materials, modell VCS-500, Danbury, CT). Prøven ble så sentrifugert ved 750 G i ti minutter og mengden bunnfall anslått. Et alternativt preparat ble forsøkt hvis den totale utfelling var mer enn omtrent 20 % av utgangs-materialet. Foretrukket ville bunnfallsfraksjonen være mindre enn 10%.

Etter filtrering av emulsjonen av tilførselsvehiklene gjennom en 5 Jim filternål for å bekrefte brukbarheten i sprøyter, ble prøvene filtrert gjennom 0,45 og/eller 0,22 nm mikrofiltere. De ble så analysert for total HXM-konsentrasjon og for på-visning av eventuell HXM-spaltning under anvendelse av tynnsjiktskromatografi på silikagel 60 plater (Merck) høytrykks-væskekromatografi og/eller UV/synlig spektroskopi under anvendelse av et Perkin-Elmer Lambda 3B spektrofotometer.

Resultatene av slike prosedyrer er oppsummert i tabell 1.

Tabell 1 viser at brukbare konsentrasjoner av HXM i vandig opp-løsning kan oppnås under anvendelse av fremgangsmåten i henhold til den foreliggende oppfinnelse. Foretrukne fremstillbare preparater anvender tripalmitin i den indre fase og 100 mM glyserol oppløst i den vandige fase. Analyser under anvendelse av UV/synlig spektroskopi av de fire trilaurinpreparater testet for endelig HXM-konsentrasjon viste ingen merkbar forskjell fra utgangsmedikamentet. Tynnsjiktskromatografi var også i samsvar med intakt HXM i disse tilfeller. En gjentatt UV/synlig spektroskopisk analyse etter 24 timer indikerte nedsatt ad-sorbsjon ved 227 nm og antydet en nedsettelse i vandig HXM fra omtrent 3,0 til 2,2 mg/ml. De senere spektra var i samsvar med intakt HXM.

En alternativ prosedyre for fremstilling av de foreliggende fremstillbare preparater, særlig nyttig for små porsjoner, innbefatter oppløsning av hver ønsket komponent i et organisk løsningsmiddel som f.eks. kloroform, blanding av passende volum av hver kloroformoppløsning, avdamping av kloroform under vakuum for å oppnå en lipid medikament-triglyseridfilm og deretter tilsette denne film til den passende vandige fase som drøftet i det foregående.

EKSEMPEL 2

Innlemmelse av heksametylmelamin i liposomale tilførsels-vehikler

For sammenligning ble forsøk foretatt med å innlemme HXM i det intra-bilagfosfolipide område av et liposom uten bruk av noe triglyserid. Passende mengder av HXM, fosfolipid og kolesterol ble oppløst i et organisk løsningsmiddel som f.eks. kloroform (distearoylfosfatidylglyserol ble oppløst i 1:1 metanol:kloroform og deretter blandet med kloroformoppløsning). Løsnings-middelet ble så fjernet under redusert trykk til å gi en lipid-medikamentfilm. Denne film ble så blandet og lydbehandlet som i det foregående i et passende vandig løsningsmiddel til å gi små unilamellære liposomale vesikler. Som tidligere forhindret tilsetning av 100 mM glyserol agglomerering i enkelte tilfeller. Etter sentrifugering ble liposomene filtrert og analysert for HXM-konsentrasjoner i vandig oppløsning.

Resultater av disse tester viste at tilsetning av anionet distearoylfosfatidylglyserol økte mengden av membraninnlemmet HXM ved å fremme fordeling av medikamentet inn i lipidfasen. Den endelige konsentrasjon av HXM som ble oppnådd nådde imidlertid i disse tilfeller ikke det ønskede nivå på minst 1,0 mg/ml. Basert på disse resultater blir ønskeligheten av de alternative vandige oppløseliggjøringsvehikler omhandlet heri tydelig.

Claims (6)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et preparat egnet for tilførsel av en hovedsakelig vannuoppløselig aktiv bestanddel, omfattende vesikler i en farmasøytisk tålbar bærer, hvori nevnte vesikler har en størrelse på 30 til 200 nm i diameter, karakterisert ved

(1) kombinering av den nevnte aktive bestanddel med trilauroylglyserol, et fosfolipidmaterial og en farma-søytisk tålbar bærer,

(2) tildannelse av vesikler inneholdende den aktive bestanddel , og

(3) fjerning av uønskede materialer fra den resulterende blanding.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at det som aktiv bestanddel anvendes heksametylmelamin.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at fosfolipidmaterialet velges fra gruppen av fosfolipider med alkylsidekjeder med lengde 12 til 2 0 karbonatomer.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at vesiklene tildannes ved lydbehandling.

5. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at fjernelse av uønskede materialer oppnås ved hjelp av en eller flere behandlinger med sentr i fuger ing, filtrering gjennom et omtrent 5,0 |im eller mindre filter, filtrering gjennom et omtrent 0,45 (im eller mindre filter, og filtrering gjennom et omtrent 0,22 (im eller mindre filter.

6. Fremgangsmåte for fremstilling av et preparat som angitt i krav 1, egnet for tilførsel av heksametylmelamin som aktiv bestanddel, omfattende vesikler i en farmasøytisk tålbar bærer, hvori nevnte vesikler har en størrelse på 30 til 200 nm i diameter, karakterisert ved at

(1) 1 molfraksjon heksametylmelamin kombineres med omtrent 4 molfraksjoner trilauroylglyserol, 2-1 molfraksjoner dis-tearoylf osfatidylcholin, omtrent 1 molfraksjon kolesterol, 0-1 molfraksjoner distearoylfosfatidylglyserol, og en farmasøytisk tålbar bærer,

(2) det tildannes vesikler inneholdende heksametylmelaminet, og

(3) uønskede materialer fjernes fra den resulterende blanding.