NO165353B

NO165353B - Doerhengsel omfattende festeplate og to hengselblader.

Info

Publication number: NO165353B
Application number: NO870723A
Authority: NO
Inventors: Tore Killingstad
Original assignee: Grorud Jernvarefab As
Priority date: 1987-02-23
Filing date: 1987-02-23
Publication date: 1990-10-22
Also published as: NO870723D0; FI880798A0; FI89623B; US4982475A; SE8800560D0; NO870723L; CA1305596C; DK91188D0; GB2201457B; DE3805519A1; SE8800560L; GB8803615D0; FI880798A; DK91188A; FI89623C; ATA42388A; JPS63226477A; NO165353C; NL8800305A; GB2201457A

Description

Fremgangsmåte ved fremstilling av tylosin

ved fermentering av mikroorganismer.

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for å oppnå forbedrede tylosin-utbytter ved at det settes visse kjemiske stoffer som stimulerer dannelsen av det ønskede antibiotikum til fermenteringsmediet i hvilket det antibiotiske middel dannes.

Det er tidligere blitt foreslått i det norske patent

112 810 at det er mulig å fremstille tylosin ved fermentering av de tylosin-produserende organismer Streptomyces radiae NRRL 2702 eller NRRL 2703 i et passende fermenteringsmedium. Foreliggende fremgangsmåte er en videre utvikling av fremgangsmåten etter det-

te patent.,

Vi har oppdaget at visse nedbrytningsprodukter som dan-

nes ved hydrolytisk spaltning av tylosin og beslektede antibiotika på en uventet måte øker utbyttet av antibiotikumet i en forbausende

grad når de settes til fermenteringsmediet. Den mekanisme som gjør at slike tilsetningsstoffer øker tylosinutbyttet, er ukjent, og det vil ikke her bli fremmet noen teori som utgir seg for å forkla-re de oppnådde resultater. Det har imidlertid vist seg at slike økede utbytter oppstår tilsynelatende fra en virkelig stimulering av tylosindannelsen, og ikke bare ved omdannelse av tilsetningsma-terialet til tylosin. De økede mengder tylosin er i virkeligheten så meget som lo ganger så store som de mengder som vil resultere fra en enkel støkiometrisk omdannelse' av de tilsatte nedbrytningsprodukter til antibiotikumet.

Til de nedbrytningsprodukter som kan bli dannet ved hydrolytisk spaltning av tylosin hører desmycosin, O-mycaminosyl-tylonolid, myearose, mycaminose og mycinose. Både O-mycaminosyl-tylonolid, som herefter refereres til som OMT, og desmycosin er selv virkningsfulle antibakterielle stoffer. Mycinose, mycarose og mycaminose er sukkerderivater, den sistnevnte er et basisk aminosukker.

Alle de ovenfor nevnte nedbrytningsprodukter av tylosin stimulerer i noen grad dannelsen av tylosin, når de settes til fermenteringsmediet, men desmycosin og OMT er særlig foretrukne sti-muleringsmidler. Nedbrytningsproduktene kan settes til i ren form, eller hvis ønsket, kan råprodukter anvendes med tilfredsstillende resultat. Det rå tylosinhydrolysat kan fremstilles ved å opphete en vandig oppløsning av tylosin, eller et syreaddisjonssalt av denne, ved en pH på omkring 2, vaskning av reaksjonsblandingen med et med vann ublandbart organisk oppløsningsmiddel som f.eks. kloroform eller lignende, og inndampning av den vaskede, vandige fase til tørrhet.

De tilsvarende nedbrytningsprodukter som dannes av dihydrotylosin, som i alminnelighet dannes samtidig med tylosin ved tylosinfermenteringen, kan også anvendes for å stimulere tylosindannelsen. Disse omfatter dihydrodesmycosin og dihydro-OMT såvel som de ovenfor nevnte sukker.

Konsentrasjonen av nedbrytningsproduktet som anvendes i fermenteringsmediet for å øke tylosinutbyttet kan variere fra 25 til 1500 mikrogram/ml. Ved anvendelse av mengder opptil omkring 500 mikrogram/ml resulterer økende mengder tilsetningsstoff i pro-porsjonalt økende tylosinutbytter. Ved anvendelse av konsentrasjoner høyere enn omkring 500 mikrogram/ml, er imidlertid ikke de økende mengder av det dannede tylosin proporsjonal med mengden av tilsetningsstoff, og ved anvendelse av meget store mengder tilsetnings-s toff er den dannede mengde tylosin mindre enn det som dannes når de gunstigste konsentrasjoner av tilsetningsstoffet anvendes. Likevel er selv ved disse høye konsentrasjoner mengden av det dannede tylosin større enn den som oppnåes når det ikke anvendes et tilsetningsstoff. Størst mulig dannelse av tylosin later til å finne sted når det anvendes konsentrasjoner av tilsetningsstoffet som ligger mellom 100 og 200 mikrogram/ml og slike konsentrasjoner foretrekkes derfor ved utførelsen av foreliggende oppfinnelse .

Tidspunktet for tilsetning av tilsetningsstoffet til fermenteringsmediet kan varieres innenfor vide grenser. De utbytter

av tylosin som fåes når nedbrytningsproduktet settes til ved begyn-nelsen av fermenteringen er omtrent de samme som de utbytter som fåes når tilsetningen gjøres omtrent 20-24 timer efter starten av fermenteringen. Imidlertid avtar maksimumsutbyttet av tylosin når tilsetningsstoffet settes til så sent som 48 timer efter inokuleringen, og enda senere foretatte tilsetninger resulterer i stadig minkende stimulering.

Særlig fordelaktig finner tilsetningen til fermenteringsmediet sted før 24 timer efter starten av fermenteringen.

Stimuleringen av tylosindannelsen blir først tydelig efter at fermenteringen har pågått i omtrent 48 timer, og den blir

mer utpreget efter som fermenteringen fortsetter. Når tilsetningsstoffet anendes i, eller nær ved, den foretrukne konsentrasjon på omtrent 100 til 200 mikrogram/ml, kan det påvises i fermenteringsmediet i de første 48 timer av fermenteringen, men ingen påviselig mengde er tilbake efter at fermenteringen har pågått i omkring 72 timer eller mere. I konsentrasjoner som er høyere enn det foretrukne område, og særlig ved konsentrasjoner høyere enn omkring 500 mikrogram/ml kan noe uforandret tilsetningsstoff påvises i fermenteringsmediet under hele fermenteringen.

Den iakttatte stimulering av tylosindannelsen finner sted i et stort antall fermenteringsmedier. Nærvær av utbytteøkede tilsetningsstoffer har i alminnelighet en større innflytelse på de medier som gir høyere tylosinutbytter også uten stimulering. Avhen-gende av det anvendte fermenteringsmedium, fåes økede tylosinutbytter fra mellom omkring 10 % og omkring 40 % sammenlignet med ikke-stimulerte kontrollmedier.

Tilsetningen av nedbrytningsproduktene later til å være like virkningsfull for å øke tylosindannelsen enten fermenteringen finner sted i rystekolber eller under omrøring. De relative mengder av tylosinartene som dannes ved fermenteringen synes ikke i noen høy grad å bli påvirket av tilsetningen av noen av tilsetnings-stoffene. F.eks. er forholdet mellom tylosin og dihydrotylosin som dannes ved fermentering i alt vesentlig konstant, enten fermenteringen finner sted ved den tidligere anvendte fremgangsmåte eller ved den forbedrede fremgangsmåte i henhold til foreliggende oppfinnel-

se lander anvendelse av et utbytteøkende middel.

Utførelsen av foreliggende oppfinnelse krever praktisk

talt ingen avvikelse fra de vanlige fermenteringsprosesser for dannelse av tylosin uten fordelen av utbytteøkende tilsetningsstoffer. Mediet som anvendes i alle trinn av fermenteringsprosessen kan så-ledes f..eks. være identisk med de som tidligere ble anvendt unn-

tatt med hensyn til tilsetningen av nedbrytningsproduktet til det siste produksjonsmedium. Sporesuspensjoner av de tylosindannende mikroorganismer Streptomyces fradiae NRRL 2702 eller NRRL 2703 fremstilles fra agar-skråkulturer på vanlig måte. Sporesuspensjo-

nene anvendes derefter for å fremstille en intermediær vegetativ kultur, og den vegetative kultur som er fremstillet på denne måte, brukes for å inokulere fermenteringsmediet som anvendes for fremstilling av antibiotikumet. Hvis nedbrytningsproduktet er anvendt i konsentrasjoner under omtrent 500 mikrogram/ml, kan tilsetningsstoffet ikke påvises i fermenteringsvæsken efter fermenteringen,

og derfor utføres isoleringen og rensningen av tylosinet i henhold til de tidligere kjente fremgangsmåter.

For å fastslå virkningen av et bestemt tilsetningsstoff

på tylosindannelsen er det i alminnelighet ikke nødvendig å isole-re det krystallinske antibiotikum i ren form. Forløpet av fermenteringen og virkningen av tilsetningsstoffet på tylosinutbyttene kan lett bestemmes ved kloroformekstrahering av fermenteringsvæsken ved en pH på 5. Mengden av tylosin i ekstrakten kan bestemmes spektrofotometrisk ved å måle absorpsjonen av kloroformekstrakteri ved 283 nyu og så sammenligne disse verdier méd verdiene for stan-dardoppløsninger. Resultatene som ble oppnådd på denne måte, viste utmerket sammenheng med resultater som ble oppnådd ve£ virkelig isolering av antibiotikumet.

Utførelsen av foreliggende oppfinnelse illustreres ytterligere ved eksemplene som følger:

Det anvendte OMT kan fremstilles på følgende måte: En

vandig oppløsning av tylosin , enten i form av den frie base eller i form av et syreaddisjonssalt ble justert til en pH på 2 ved til-

i

setning av mineralsyre. Den resulterende sure oppløsning ble opphetet på dampbad i omtrent 100 timer, ble avkjølt og vasket med kloroform for å fjerne farvede bestanddeler. Den vandige fase ble inndampet til tørrhet for å gi et OMT-råprodukt som inneholdt tilnærmet 25 til 30 vektprosent OMT.

For fremstilling av rent OMT-produkt ble fremgangsmåten som er beskrevet foran, fulgt til og med trinnet som omfatter vasking med kloroform. Den vandige fase ble justert til en pH-verdi på 5 ved tilsetning av vandig base, og ble igjen vasket med kloroform for å fjerne eventuelt desmycosin som måtte være tilstede. pH-verdien av det vandige sjikt ble justert til 9 ved tilsetning av base, og den basiske oppløsning ble ekstrahert med kloroform. Kloroformsjiktet som inneholdt OMT, ble inndampet under vakuum til tørrhet. Ytterligere rensning av OMT ble utført kromatografisk av en kloroformoppløsning.på en aluminiumoksydsøyle.

Eksempel 1

En sporesuspensjon av Streptomyces fradiae NRRL 2702

ble fremstilt på vanlig måte fra en kultur av mikroorganismen på. limabønne-agar-skråkulturer ved 4°C. En 5 ml porsjon av sporesus-pens jonen ble anvendt for å inokulere 800 ml av et vegetativt medium i en 2 liters Erlenmeyer-kolbe. Det vegetative medium bestod av 1,5 % cerelose , 0,5 % maisstøp-faststoff, 0,5 % gjær og 0,3 % kalsiumkarbonat i destillert vann. Det inokulerte vegetative medium ble inkubert ved 28°C i 48 timer for å danne et podemedium. Dette ble anvendt for å inokulere et produksjonsmedium som består av 1,75 % fiskemel, 2,0 % sukkerroe-melasse, 3,0 % rå soyabønne-olje, 0,2 % kalsiumkarbonat, 0,04 % diammoniumfosfat og 0,1 % nat-riumklorid i vann. Mediet ble overført til flere 500 ml kolber med stor åpning, hver av disse ble fylt med 100 ml medium, og hver kolbe ble inokulert med 5 ml av det ovenfor beskrevne podemedium. De inokulerte kolber ble anbragt på roterende ristere som arbeidet ved 250 omdreininger pr. minutt og fermenteringen fikk foregå ved 28°C i 138 timer.

Parallelt med dette forsøk ble en serie kolber som inneholdt det sanane produks jonsmedium og som var inokulert på samme må-te inkubert under de samme betingelser med forskjellige konsentrasjoner OMT tilsatt ved inokuleringen.

Virkningen av OMT-konsentrasjonen på tylosinutbyttet fremgår av tabell 1.

Eksempel 2

Hastigheten med hvilken tylosindannelsen fant sted både

i nærvær og fravær av OMT, og virkningen av varierende tilsetnings-tider av OMT på den samlede mengde av det dannede tylosin ble fast-slått ved følgende forsøk:

Rystekolber som inneholdt det inokulerte produksjonsmedium , ble klargjort på samme måte som i eksempel 1. To fermenterings-serier ble utført, den første inneholdt bare det inokulerte produksjonsmedium, den annen inneholdt det inokulerte produksjonsmedium med tilsetning av 500 mikrogram pr. ml OMT. Unntatt hvor det er angitt på annen måte, ble OMT satt til umiddelbart efter inokuleringen. Kolbene ble undersøkt daglig i 6 dager for å kunne følge fermenteringen. Tylosinutbyttené er vist i tabell II.

Eksempel 3

Evnen av OMT til å stimulere tylosindannelsen i medier med forskjellig sammensetning ble vist på følgende måte: Den samme fremgangsmåte som er beskrevet i eksempel 1, ble anvendt med unntagelse av at sammensetningen av produksjons-mediet varierte.

Medium I var det samme som det som ble anvendt i eksempel

Medium II bestod av 2 % sukkerroe-melasse, 2 % gjæreks-trakt, 0,5 % maisstøpvæske, og 3 % ubehandlet soyabønneolje i vann.

Medium III hadde den følgende sammensetning:

pH-verdien i medium III ble justert til omtrent pH 7,5 før sterili-sering i autoklav.

Virkningen av OMT i forskjellige konsentrasjoner på tylosinutbyttene i hvert av de ovenfor nevnte fermenteringsmedier er vist i tabell III.

Eksempel 4

Stimulering av tylosinutbyttene ved hjelp av andre nedbrytningsprodukter av tylosin ble vist ved en fremgangsmåte lik den som er beskrevet i eksempel 1. Virkningen på tylosinutbyttet ved tilsetning av de antydede nedbrytningsprodukter er vist i tabell IV.

Eksempel 5

Evnen av OMT til å stimulere tylosindannelsen i en apparatur med omrøring ble vist i et 15 liters reaksjonskar av rustfritt stål som var utstyrt med en røreanordning. Apparatu-ren ble sterilisert ved 120°C i 30 minutter før chargering. En 3-trinns fermentering anvendtes. Et inkubert vegetativt podemedium med den samme sammensetning som det som ble anvendt i eksempel 1 ble brukt for å inokulere et vandig fremdrivningsmedium som bestod av 0,5 % gjær, 0,5 % fiskemel, 1 % maisstøpvæske, 0,5 % ubehandlet soyabønneolje og 0,3 % kalsiumkarbonat. Fremdrivnings-trinnet ble på sin side anvendt for å inokulere det siste fermenteringsmedium som ble anvendt, i eksempel 1. Virkningen på tylosinutbyttet efter en fermenteringstid på 136 timer ved 28°C er vist i tabell V.

Eksempel 6

Virkningen av dihydro-OMT på tylosinutbyttene ble bestemt ved en fremgangsmåte lik den som ble beskrevet i eksempel 1. Dihydro-OMT kunne ikke påvises i fermenteringsvæsken efter fermenteringen. Virkningen på tylosinutbyttene er vist i tabell VI.

Claims

1. Fremgangsmåte ved^fremstilling av tylosin ved fermentering av mikroorganismen Streptomyces fradiae NRRL 2702 eller NRRL 2703 i et næringsmedium, karakterisert ved at det til fermenteringsmediet tilsettes mellom 25 mikrogram/ml og 1500 mikrogram/ml av tylosinhydrolysatene desmycosin, O-mycaminosyl-tylonolid, dihydro-desmycosin, dihydro-O-mycaminosyl-tylonolid, mycarose, mycinose eller mycaminose.

2. Fremgangsmåte i henhold til krav 1, karakterisert ved at det til fermenteringsmediet tilsettes mellom 100 og 500 mikrogram/ml , fortrinnsvis 100 - 200 mikrogram/ml desmycosin.

3. Fremgangsmåte i henhold til krav 1, karakterisert ved at det til fermenteringsmediet tilsettes mellom 100 og 500 mikrogram/ml • fortrinnsvis 100 - 200 mikrogram/ml O-mycaminosyl-tylonolid.

4. Fremgangsmåte i henhold til krav 1-3, karakterisert ved at tilsetningen til fermenteringsmediet finner sted før 24 timer efter starten av fermenteringen.