DK145545B - Polyoxinderivat til anvendelse som plantebeskyttelsesmiddel fremgangsmaade til fremstilling deraf samt fungicid med indhold deraf - Google Patents

Description

(19) DANMARK (§! i

@ (12) FREMLÆGGELSESSKRIFT ου 145545 B

DIREKTORATET FOR PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Ansøgning nr. 1656/76 (51) Intel.3 C 07 Η 19/06 (22) Indleveringsdag 8. apr. 1976 A 01 N 43/54 (24) Løbedag 8. apr. 1976 C 12 P 19/38 (41) Aim. tilgængelig 21. feb. 1977 (44) Fremlagt 6. dec. 1982 ^ , (86) International ansøgning nr. - (86) International indleveringsdag - (85) Videreførelsesdag - (62) Stamansøgning nr. -

(30) Prioritet 20. aug. 1975, 2557028, DE

(71) Ansøger BAYER AKTIENGESELLSCHAPT, 5Ο9 Leverkusen, DE.

(72) Opfinder Ursula Daehn, DE: Hanspaul Hagenmaler, DE: Helmut

Hoehne, DE: Wilfried Koenig, DE: HanB Scheinpflug, DE: m. fl.

(74) Fuldmægtig Ingeniørfirmaet Budde, Schou & Co.

(54) Polyoxinderlvat til anvendelse som plantebeskyttelsesmiddel, fremgangsmåde til fremstilling deraf samt fungicid med ind= hold deraf.

·-. vi

Den foreliggende opfindelse angår et hidtil ukendt polyoxin-derivat til anvendelse som plantebeskyttelsesmiddel, en fremgangsmåde til dets fremstilling samt et fungicid med indhold deraf.

Det er kendt, at polyoxiner finder udbredt anvendelse som ® fungitoksiske midler inden for plantebeskyttelsessektoren. De har f imidlertid den ulempe, at de er alkali-labile og desuden kun fore- ^ kommer som blandinger af vekslende sammensætning og således er vault· skelige at dosere og standardisere nøjagtigt.

Det har vist sig, at et hidtil ukendt polyoxinderlvat, som £ kaldes nikkomycin, kan fremstilles ved dyrkning af Streptomyces i tendae CBS 354.75, ATCC 31.160, i vandigt næringsmedium på gængs 2 145545 måde med efterfølgende isolering.

Desuden har det vist sig, at nikkomycin har en kraftig fungicid virkning mod plantepatogene svampe.

Det er overraskende, at nikkomycin har en væsentlig større pH-stabilitet end de kendte polyoxiner. Desuden må det betegnes som overraskende, at nikkomycin i praksis kan udvindes som ensartet stof, da det måtte forventes, at der ved fermenteringen ligesom ved polyoxinerne ville dannes en blanding bestående af kemisk analoge stoffer. Nikkomycin udgør derfor en berigelse af teknikken.

I overensstemmelse hermed er polyoxinderivatet ifølge opfindelsen til anvendelse som plantebeskyttelsesmiddel ejendommeligt ved, at det er nikkomycin med følgende formel Λ

v, oV

I CH, COOH I

J 1 \ CH-CH-CH-CO-NH-CH j

OH HH S

1<ϊ—5Ί

H I I H

OH OH

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at Streptomyces tendae CBS 354.75, ATCC 31.160 dyrkes i vandigt næringsmedium på gængs måde, hvorpå nikkomycin isoleres. Det isoleres fra dyrkningsvæsken eller fra myceliet ved ekstraktion, adsorption og fældning og renses ved yderligere egnede metoder.

Fungicidet ifølge opfindelsen er ejendommeligt ved, at det indeholder nikkomycin.

Ved den foreliggende fremgangsmåde anvendes den nye stamme Streptomyces tendae Ettlinger et al Tu 901 af ordenen Actinomycetales, familien Streptomycetaceae og slægten Streptomyces. Denne stamme er blevet isoleret fra en jordprøve fra Nikko i Japan.

Den blev deponeret under nr. CBS 354.75 ved Centraalbureau voor Schimmelkultures, Baarn/Holland, under nr. ATCC 31160 ved American Type Culture Collection, Rockville, Maryland/USA og under nr.

3 145545 FRI 3136 ved Fermentation Research Institute Osaka/Japan. Denne stamme hører til slægten Streptomyces og er karakteriseret ved følgende egenskaber: a) Sporene er ellipsoidiske. De har en størrelse på 0,4-0,6 x 1,2-1,4 μ og en glat overflade.

b) Luftmyceliets farve er i begyndelsen kridhvid, i moden tilstand askegrå (cinereus).

c) Sporekæderne er monopodialt forgrenet og anordnet i bøsere skruer og slyngninger.

d) På en pepton-jern-agarplade dannes ved 27°C sort pigment.

Stammen er kromogen.

De sammenfattede bestemmelseskendetegn identificerer stammen Tu 901 som hørende til arten Streptomyces tendae Ettlinger.

Ved den foreliggende fremgangsmåde til fremstilling af nikkomycin anvendes næringsmedier, som indeholder de sædvanlige carbon- og nitrogenkilder samt nødvendige salte. Som carbonkilder kan der anvendes carbonhydrater, især polysaccharider som f.eks. stivelse, disaccharider som f.eks. maltose og rørsukker, mono-saccharider som f.eks. glucose og fruktose. Desuden kan der anvendes sukkeralkoholer, som f.eks. mannitol og glycerol, desuden også naturligt forekommende blandinger som f.eks. maltekstrakt. Som nitrogenkilde kan de sædvanlige nitrogenkilder anvendes, således f.eks. æggehvidestoffer, æggehvidehydrolysater, aminosyrer, ammoniumioner, nitrater, naturligt forekommende komplekse stoffer, som f.eks. peptoner, casein-hydrolysater, majsstøbevand, sojamel, kødpulver, kødekstrakt og lignende egnede blandinger.

Som hjælpestoffer anvendes i næringsmediet fortrinsvis salte, f.eks. phosphater, sulfater eller chlorider af magnesium, jern, zink og mangan. Disse stoffers koncentration kan varieres inden for vide grænser, og de findes delvis i de nødvendige koncentrationer i de nævnte carbon- eller nitrogenkilder eller i det anvendte vand som urenheder.

Desuden kan der som hjælpestoffer også anvendes antiskummidler af vidt forskellig art, som f.eks. sojaolie, polyoler eller silicone. Til overholdelse af et ønsket pH-område anvendes puffer, overvejende uorganiske phosphater og carbonater, men der kan også anvendes organisk puffer.

Som vigtigste fortyndingsmiddel til næringsmedierne skal' nævnes vand.

4 145545

Ved gennemførelsen af den foreliggende fremgangsmåde arbejdes der almindeligvis under aerobe betingelser. Dyrkningen kan gennemføres efter gængse metoder, f.eks. ved anvendelse af rystekulturer eller beliiftede gæringskulturer. Procentforholdene for næringsopløsningsbestanddelene kan varieres inden for vide områder, almindeligvis udgør carbonkilderne 1-10%, fortrinsvis 2-5%, nitrogenkilderne 0,1-4%, fortrinsvis 0,5-2% . Saltene foreligger i sædvanlige koncentrationer, fortrinsvis i området 0,01-1 vægtprocent. Antiskum-midlerne foreligger i en koncentration på 0-1 procent. De til steriliseringen anvendte temperaturer ligger på 100-140°C, fortrinsvis på 120-130°C.

pH-Værdien i de voksende kulturer ligger på 5,5-8, fortrinsvis på 7-7,5. Dyrkningstemperaturen kan ligge på 18-37°C, fortrinsvis på 27-30°C. Det har vist sig, at mængden af det i dyrkningsvæsken forekommende antibiotikum almindeligvis når sit maksimum ca. 1-14, fortrinsvis 3-5 dage efter dyrkningens begyndelse. Slutpunktet for dyrkningen konstateres ved hjælp af en biologisk test, nemlig ved virkningen mod Botrytis cinerea, testfremgangsmåde ifølge R. Hiitter et al, Arch. Mikrobiol. 51, side 1-8 (1965) og mod Mucor hiemalis, testfremgangsmåde ifølge dissertation af G. Kirst, Tubingen (1971), desuden ifølge Kneifel et al, J. Antib. A 27, side 20-27 (1974).

Ved gennemførelsen af den foreliggende fremgangsmåde kan der ved oparbejdningen af dyrkningsopløsningerne foretages filtrering, hvorved myceliet isoleres. Filtratet kan underkastes ionbytter-chromatografi på egnede ionbyttere. Chromatograferingen kan gennemføres i form af søjlechromatografi eller præparativ tyndtlagschromatografi. Som adsorptionsmidler kan der anvendes alle gængse (ikke sure) uorganiske eller organiske adsorptionsmidler som f.eks. aluminiumoxid, kiselgel, magnesiumsilicat, aktiv kul, cellulose, cellulosederivater, kunstharpiks som f.eks. polyamider, derivater af polyamider osv., f.eks. acetyleret polyamid eller dextrangeler. Som elueringsmidler ved den præparative tyndtlagschromatografi kan der anvendes forskellige opløsningsmidler eller opløsningsmiddelblandinger, hvori det her omhandlede antibiotikum er opløseligt. I tilslutning dertil kan der gennemføres en gelchromatografering og en renisolering på en yderligere søjle med derpå følgende frysetørring.

Det her omhandlede antibiotikum nikkomycin er nyt. Det kan karakteriseres på følgende måde: 5 14 5 5 A 5 a) Opløselighed og egenskaber: nikkomycin er et farveløst, i vand og pyrridin meget let opløseligt, i de andre gængse organiske opløsningsmidler uopløseligt stof. Det giver en positiv reaktion med nin-hydrin, natriummetaperiodat-benzidin og kaliumpermanganat. Med jern-(III)-chlorid fås en gulfarvning.

b) UV-spektret og IR-spektret foreligger, jfr. de tilsvarende afbildninger i fig. 1 og 2. I fig. 1 er vist UV-spektret af nikkomycin, optaget i (a) IN saltsyre og (b) i 0,1 N natriumhydroxidopløsning. Ordinaten angiver ekstinktionen, abscissen bølgelængden (nm-enheder).

I figur 2 er vist IR-spektret af nikkomycin, optaget i kaliumbromid. Ordinaten viser transmissionen i procent, abscissen bølgetallet (cm *) eller bølgelængden (jum-enheder) .

c) Ved hjælp af massespektrometrien og den kemiske nedbrydning ved sur hydrolyse er uracil, en amino-hexuronsyre og en hidtil ukendt aminosyre indeholdende en pyridinring blevet påvist.

d) Papirelektroforese: Antibiotiket er amfotert. Omkring en pH-, -værdi på 6 er vandringslængden lille, og her skulle det isoelek- ^ ^ triske punkt derfor ligge. Nikkomycins adfærd ved elektroforese er yist i nedenstående tabel, i hvilken løbestrækningerne ved papirelektro-foresen er angivet i afhængighed af puffersystemets pH-værdier.

Tid Løbestrækninger Puffer pH_(min)_(mm)_ .

pyridin-iseddike 3,9 60 - 12 pyridin-iseddike 6,1 60 - 1 barbital 8,9 60 +16 +) 5,5-diethyl-barbitursyre e) Tyndtlagschromatografi: Her fremkommer der i alle anvendte elueringsmidler, som indeholder eddikesyre, tre ninhydrin-positive pletter, hvor kun en plet korresponderer med det aktive stof i bioautogrammet. Denne kendsgerning kan skyldes antibiotikets labili-tet i eddikesyre opløsning. I neutrale elueringsmidler fremkommer imidlertid kun en ninhydrin-positiv plet.

U5545 6 f) Nikkomycin antages at have følgende strukturformel: 0

HO J I

s

UnA ?H3 f0011

CH-CH-CH-CO-NH-CH

°H NH2

Sk OH OH ,

Η H

Elementæranalysen af nikkomycin gav følgende værdier: C 48,21, H 5,08, N 13,58, O 31,58. Deraf beregnes en elementær-sammensætning på C^HgN02· Molekylvægten bestemmes kryoskopisk til 404. Den her antagede struktur for nikkomycin svarer imidlertid til en molekylvægt på 495 og til formlen C20H25N5°10 = ^C4H5N02^5*

Den deraf beregnede elementærsammensætning giver: C 48,49%, H 5,09%, N 14,14%, O 32,29%.

g) I modsætning til de kendte polyoxiner, jfr. J. Am. Chem.

Soc. 91, 7490, (1961), som kommer nikkomycin nærmest, mangler azacyclobutan-gruppen i nikkomycin. Den heterocycliske aminosyre er ikke indeholdt i nogen af de beskrevne polyoxiner.

Det her omhandlede virksomme stof udviser en kraftig fungi-toksisk virkning. Det beskadiger ikke kulturplanter i de nødvendige koncentrationer til bekæmpelse af svampe og bakterier, og det har en lav varmblodstoksicitet. Af denne grund er det egnet til anvendelse som plantebeskyttelsesmiddel til bekæmpelse af svampe.

Inden for plantebeskyttelsen anvendes fungitoksiske midler til bekæmpelse af Plasmodiophoromycetes, Chytridiomycetes, Zygomycetes, Ascomycetes, Basidiomycetes og Deuteromycetes.

Særlig god virkning udviser det her omhandlede virksomme stof mod rustsygdomme på forskellige kulturplanter, f.eks. Puccinia-arter, Uromyces-arter, Phragmidium mucronatum, Botrytis-arter, først og fremmest Botrytis cinerea på vin, jordbær og grøntsagskulturer, mod Sclerotinia-arter, mod ægte meldugsvampe, som f.eks. Erysiphe, og U 5545 7 mod Sphaerotheca-arter. Desuden kan det her omhandlede virksomme stof også anvendes mod Venturia-arter, Alternaria-arter, Pellicularia sasakii, Pyricularia oryzae og Cercospora arter. Foruden behandlingen af de overjordiske plantedele kan sygdomsfremkaldere, som angriber planterne fra jordbunden eller som bliver overført med såsæd, bekæmpes med det her omhandlede virksomme stof.

Det her omhandlede virksomme stof kan formuleres i form af gængse præparater, såsom opløsninger, emulsioner, suspensioner, pulvere, pastaer og granulater. Disse fremstilles på kendt måde, f.eks. ved blanding af det virksomme stof med strækkemidler, dvs. flydende opløsningsmidler, med kondenserede gasser under tryk og/eller faste bærestoffer, eventuelt ved anvendelse af overfladeaktive midler, dvs. emulgeringsmidler og/eller dispergeringsmidler og/eller skumdannende midler. Hvis vand anvendes som strækkemiddel kan der f.eks. også anvendes organiske opløsningsmidler som hjælpeopløsningsmidler . Som flydende opløsningsmidler kan der hovedsagelig anvendes stærkt polære opløsningsmidler, som f.eks. dimethylformamid, dimethylsulfoxid og vand. Til kondenserede gasformige strækkemidler eller bærestoffer hører sådanne væsker, som ved normal temperatur og under normalt tryk er gasformige, f.eks. aerosol-drivgas, blandt faste bærestoffer kan nævnes naturligt stenmel, som f.eks. kaoliner, lerjord, talkum, kridt, kvarts, attapulgit, montmorillonit og diatoméjord, og syntetisk stenmel, som f.eks. højdispers kiselsyre, aluminium-oxid og silicater, blandt emulgerings- og/eller skumdannende midler , kan nævnes ikke-ionogene og anioniske emulgatorer, som f.eks. polyoxy--ethylen-fedtsyreestere, polyoxyethylen-fedtalkohol-ethere^ f.eks, alkylaryl-polyglycol-ethere^ alkylsulfonater, alkylsulfater, arylsul-fonater samt æggehvidehydrolysater og blandt dispergeringsmidler kan nævnes f.eks. lignin, sulfitaffaldslud og methylcellulose.

Præparaterne indeholder almindeligvis 0,1-95 vægtprocent virksomt stof, fortrinsvis 0,5-90 vægtprocent.

Det virksomme stof kan anvendes som sådant, i form af præparater deraf eller i form af de deraf dannede anvendelsesformer, som brugsfærdige opløsninger, emulgerbare koncentrater, emulsioner, suspensioner, sprøjtepulvere, pastaer, opløselige pulvere, støvmidler og granulater. Anvendelsen kan ske på sædvanlig måde, f.eks. ved sprøjtning, fordråbning, tågedannelse, forstøvning, udstrøning, afrygning, afgasning, hældning, bejdsning eller inkrustation.

8 U 5545

Koncentrationen af virksomt stof i de brugsfærdige præparater kan varieres inden for et større område. Almindeligvis ligger den på 0,0001-10%, fortrinsvis på 0,001-0,1%.

Ved såsædsbehandling anvendes der almindeligvis en mængde virksomt stof på 0,1-10 g pr. kg såsæd, fortrinsvis 0,5-5 g pr. kg såsæd. Ved jordbundsbehandling er det nødvendigt at anvende en mængde virk- O o somt stof på 1-500 g pr. cm jordbund, fortrinsvis 10-200 g pr. cm'3 jordbund.

Eksempel A.

Spirebehandlings· test/kornrust/protektiv (bladødelæggende mykose)

Til fremstilling af et hensigtsmæssigt præparat af virksomt stof sættes der til 975 vægtdele vand 25 vægtdele dimethylformamid og 0,06 vægtdele emulgator (alkyl-aryl-polyglycolether). Det virksomme stof fortyndes med denne blanding indeholdende vand, dimethyl-formamid og emulgator til den ønskede slutkoncentration.

Ved undersøgelsen af den protektive virkning inokuleres unge hvédeplanter på étbladsstadiet af sorten Michigan Amber med en uredo-sporesuspension af Puccinia recondita i en 0,1 procents vandagar.

Efter tørring af sporesuspensionen sprøjtes hvedeplanterne dugvåde med præparatet af virksomt stof, og de stilles derpå til inkubering i 24 timer ved ca. 20°C i et væksthus med 100 procents luftfugtighed.

Planterne henstilles i 10 dage ved en temperatur på 20°C og med en luftfugtighed på 80-90%, hvorpå rustangrebet på planterne bedømmes. Angrebsgraden udtrykkes i procent af angrebet hos ubehandlede kontrolplanter. Her betyder 0% intet angreb og 100% den samme angrebsgrad som ved ubehandlet kontrol. Det virksomme stof er mere virksomt, desto mindre rustangrebet er.

9 145545

Virksomme stoffer, koncentrationer af virksomt stof i sprøjtevæsker og angrebsgrad fremgår af den nedenstående tabel A:

Tabel A

Spirebehandllngstest/kornrust/protektiv

Koncentration af Angreb i * af virksomt stof i den ubehandlede sprøjtevæsken i kontrol

Virksomt stof_vægtprocent_ ubehandlet 100 D_CH3 -C0-NH-/~\ 0,0025 70

✓"V W

0 0 (kendt)

Polyoxin 0,001 0 0,00025 20 (kendt) 0,0001 70

Nikkomycin 0,001 0 0,00025 15 0,0001 45 145545 ίο

Eksempel B

Botrytis-test (bønner)/protektiv

Vand 100 vægtdele

Den til den ønskede koncentration af virksomt stof i sprøjtevæsken nødvendige mængde virksomt stof blandes med den angivne mængde vand.

Med sprøjtevæsken sprøjtes planter, Vicia faba, med 2-4 bladpar til dråbevådhed. Efter 24 timer tages der fra hver plante 2 bladpar, som hver lægges i en med fugtigt trækpapir belagt petriskål. Der-på dyppes små filterpapirskiver med 1 cm i diameter i en vandig konidiésuspension af Botrytis cinerea og lægges derpå på bladene. Skålene dækkes til. Efter en inkuberingstid på 48 timer og en inkube-ringstemperatur på 20°C bedømmes de under skiverne synlige nekroser alt efter deres forekomst. De fremkomne bedømmelsesværdier omregnes til procentvise angreb. 0% betyder intet angreb, 100% betyder at planterne er fuldstændigt angrebet.

Virksomme stoffer, koncentration af virksomt stof og resultater fremgår af efterfølgende tabel B:

Tabel B

Botrytis-test; (bønner) /protektiv

Angreb i % ved en koncentration af virksomt stof på

Virksomt stof_0,0062%_o,0031%_

Polyoxin (kendt) 31 80

Nikkomycin 12 16 11 145545

Eksempel C

Uromyces-test (bønnerust)/protektiv

Vand; 100 vægtdele

Den til den ønskede koncentration af virksomt stof i sprøjtevæsken nødvendige mængde virksomt stof blandes med den angivne mængde vand.

Med sprøjtevæsken sprøjtes de unge bønneplanter, som befinder sig på 2. bladstadium, til dråbevådhed. Planterne forbliver i 24 timer ved 20-22°C og med en relativ luftfugtighed på 70% i væksthuset til tørring. Derpå inokuleres de med en vandig uredosporesuspension af bønnerustfremkalderen (Uromyces phaseoli) og inkuberes i 24 timer i et mørkt fugtekammer ved 20-22°C og med 100% relativ luftfugtighed.

Planterne henstilles derpå i væksthus under intensiv belysning i 9 dage ved 20-22°C og med en relativ luftfugtighed på 7()-80%.

10 dage efter inokuleringen konstateres planteangrebet i procent af de ubehandlede, imidlertid ligeledes inokulerede, kontrolplanter.

0% betyder intet angreb, 100% betyder at angrebet er det samme som på kontrolplanterne.

Virksomme stoffer, koncentrationer af virksomt stof og resultater fremgår af den efterfølgende tabel C:

Tabel C

Uromyces-test/protektiv

Angreb i % af angrebet af den libehandlede kontrol ved en koncentration af virksomt stof (i %) på

Virksomt stof_0,0031%_ 50 o o (kendt)

Nikkomycin 31 12 145545

Fremstilling af nikkomycin.

Næringsopløsningen, i hvilken den producerende stamme Streptomyces tendae Tu 901 dyrkes, indeholder 2% sojamel og 2% mannitol; pH-værdien indstilles før sterilisationen på 7,5. Erlenmeyerkolber på 10 x 500 ml med sideåbning, som hver indeholder 100 ml næringsopløsning, podes med den producerende stamme og inkuberes i 48 timer ved 27°C på en roterende rystemaskine ved 120 omdrejninger pr. minut. Med denne forkultur podes en 10 liter fermenteringsbeholder ("New Brunswick"), som indeholder 10 liter næringsopløsning, og inkuberes ved 220 omdrejninger pr. minut og 4 liter lufttilførsel pr. minut i 48 timer ved 27°C. En 100 liter fermenteringsbeholder ("New Brunswick"), som indeholder 100 liter næringsopløsning, podes med denne kultur og inkuberes ved 150 omdrejninger pr. minut og 450 liter lufttilførsel pr. minut i 78 timer ved 27°C.

Kulturen filtreres under tilsætning af 2% filterhjælpemiddel (R) ("Hyphlo Supercel" , Johns, Mansville) med en filterpresse, først gennem et forklaringsfilter (type C 150, Schenk) og derpå gennem et efterklaringsfilter (type U 1000, Schenk). Det klare kulturfiltrat syrnes med eddikesyre til en pH-værdi på 4,0 og sættes til en med "Dowex 50 W X 4"^ (50-100 mesh, Na+-£orm) fyldt søjle (100 x 450 mm). Strømningshastigheden udgør 10 liter pr. time. Det vaskes med afioniseret vand, til den fra søjlen udstrømmende væske er fuldstændig farveløs. Antibiotiket elueres med henholdsvis 30 liter 0,01 N-ammoniak og 0,05 N-ammoniak. Det biologisk aktive eluat befries for ammoniak på en rotationsfordamper, syrnes med eddikesyre til en pH-værdi på 4,0 og sættes til en med "Amberlite 252"^ (Na+-form) fyldt søjle (70 x 900 mm). Strømningshastigheden udgør 5 liter pr. time. Det vaskes med afioniseret vand, til den fra søjlen udstrømmende væske er fuldstændig farveløs. Antibiotiket elueres med 15 liter 0,05 N-ammoniak.

Det biologisk aktive eluat befries for ammoniak på en rotationsfordamper, koncentreres til et lille rumfang (1 liter), syrnes med eddikesyre til en pH-værdi på 4,0 og sættes til en med "SP-Sephadex C-25" fyldt søjle (25 x 850 mm). Strømningshastigheden udgør 100 ml pr. time. Der vaskes med afioniseret vand, til der ikke længere kan påvises nogen adsorption i UV-gennemstrømningsdetektoren ved 280 nm (Uvicord IX, LKB).

Urenheder elueres med 0,01 m-pyridin-acetat-puffer med en pH--værdi på 4,7, og antibiotiket elueres med 0,02 m-pyridin-acetat--puffer med en pH-værdi på 4,7. De biologisk aktive fraktioner forenes, befries for puffer på en rotationsfordamper og koncentreres til et meget lille rumfang. Koncentratet (10 ml) sættes til en med 13 145545 "Bio-Gel P 2" (200-400 mesh) fyldt søjle og elueres med afioniseret vand. Strømningshastigheden udgør 100 ml pr. time. Til kontrol af renheden detekteres der med en UV-gennemstrømningsdetektor ved 280 nm.

De biologisk aktive fraktioner forenes og lyofiliseres i et frysetørrings anlæg .