NO159698B - Fremgangsmaate til pasteurisering av human-fibrinogen (hf). - Google Patents

Description

Oppfinnelsen vedrører fremgangsmåte til pas teurisering av human-fibrinogen (HP).

HF er én meget viktig blodkoaguleringsfaktor som står ved slutten av den såkalte koagulerlngskaskade: HP omdannes ved aktivering av koaguleringssystemet, eksempelvis etter skader, ved hjelp av trombln fra dets oppløselige form til et uoppløselig fibrin som vesentlig bidrar til hemostasen og sårhelbredning. HF er den koaguleringsfaktor som forekommer som eneste virkelige substrat av alle andre koaguleringsfak-torer og også i høyeste konsentrasjoner i plasmaet, nemlig mellom 250 og 400 mg#. På grunn av dets betydning for blodstopping og sårhelbredning anvendes HF klinisk, f.eks. ved forbruksreaksjoner som den disseminerte intravaskulære koagulasjon (DIC) ved septicemier. Dertil anvendes fibrinogenet i den nyere tid også som såkalt "kleber" istedet for sømmer resp. til avtetting av sømmer, overveiende ved kirurgiske inngrep og spesielt på myke organer som lever og milt.

Det fra plasma av Hepatitis-B-bærere utvunnede HF har i seg risikoen for en Hepatitis-overføring, da det utvinnes fra plasmafraksjoner hvor det forekommer i selskap med andre høymolekylære og tungtoppløselige proteiner som anses som såkalte Hepatitis-oppfanger-fraksjoner. Av nevnte grunner ble HF hittil bare anvendt ved utpreget vitale indikasjoner fordi nemlig risikoen for en Hepatitis-overføring ikke lot seg utelukke med absolutt sikkerhet. Dertil bidro at det hittil hverken for Hepatitis B og enda overhodet ikke for ikke-A/ikke-B-Hepatitis finnes en absolutt pålitelig prøve.

Av denne situasjon fremkom behovet for et hepatitisk sikkert HF slik det f.eks. lar seg fremstille ved kombinasjon av en fraksjoneringsfremgangsmåte med en etterfølgende pasteurisering. Nå er det imidlertid for enhver fagmann på området blodkoagulering kjent at man kan defibrinere plasma ved oppvarming ved 58<*>C (3 min.) fordi nemlig HF hører til de varmelabile proteiner. Således kommer man ved oppvarming av F VIII slik. det omtales i tysk patent 29 16 711 (Blod-koaguleringsfaktorer og fremgangsmåte til deres fremstilling"

(US-PS 4 297' 344) til et fibrinogenfritt preparat. I overensstemmelse hermed er også funnene i EP 00 35 204 hvor det på side 23/24 fastslås at HF bare i en konsentrasjon på 0,05-0,4$ kan beskyttes ved hjelp av kjente stabilisatorer som kullhydrater før termisk inaktivering.

I betraktning, av disse iakttagelser og erkjennelser var det meget overraskende at mån ifølge oppfinnelsen kan oppvarme HF i konsentrasjoner inntil 7$ over 10 timer ved 60° C uten at den største del av HF derved faller ut slik det omtales i EP 00 35 204.

Ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen optas HF i en renhet på 85$ i en konsentrasjon fra -17$ i en vandig oppløsning som minst inneholder 1 g atom kalsium/mol HF, av pH 6-8 og som stabilisatorer tilsettes kullhydrater (mono- eller oligosak-karider eller sukkeralkoholer) eller en blanding av slike kullhydrater og aminosyrer, fortrinnsvis sakkarose og glycin. Kalsium, kullhydratene og aminosyrene tilsettes 1 en for stabilisering tilstrekkelig konsentrasjon og i den hen-siktsmessige rekkefølge Ca<2+>, kullhydrater, f.eks. sakkarose og aminosyre, f.eks. glycin, til HF-oppløsningen. Slike oppløsninger lar seg pasteurisere over flere timer ved temperaturer Inntil 60°C.

Oppfinnelsens gjenstand er således en pasteuriseringsfrem-gangsmåte for human-fibrinogen (HF) i vandig oppløsning, idet fremgangsmåten er karakterisert ved at den ved siden av vanlige stabilisatorer gjennomføres i nærvær av Cå-ioner i en konsentrasjon fra 1-37,8 . IO<3> g atomer, fortrinnsvis 1-10 g atomer pr. mol humanfibrinogen.

Av de vanlige stabilisatorer foretrekkes sakkarose i en konsentrasjon på 35-60 g/100 ml oppløsning og glycin i en konsentrasjon på 0,5-3 mol/l.

Denne oppløsning oppvarmes på i og for seg kjent måte. Hensiktsmessig er oppvarmingen ved minst 60<*>C og maksimalt 100°C i minst 10 timer og maksimalt 24 timer.

De i de rensede HF-oppløsninger eventuelt tilstedeværende fibrin-polymere, hvis konsentrasjon under oppvarmingen til 60"C dessuten kan øke, adskilles etter oppvarmning eventuelt ved en felling fortrinnsvis med 0,25-1,5 mol/l glycin og HF utvinnes fra det overstående ved økning av konsentrasjonen av fellingsmidlet, f.eks. glycinkonsentrasjonen til minst 2,2 mol/l (2,0-2,7 mol/l) og adskilles samtidig fra stabilisator-ene .

Med disse trinn kommer man til et meget rent, nativt polymerfritt pasteurisert HF med gode oppløselighetsegenska-per som lar seg anvende ganske bredt terapeutisk, fortrinnsvis som infusjonsoppløsning med ca.2$ (vekt/volum) HF eller som vevkleber med ca. 10$ (vekt/volum) HF. Slike midler omfattes likeledes av oppfinnelsen.

Oppfinnelsen skal forklares nærmere ved hjelp av et eksempel.

Eksempel.

1. IJtgangsmaterial.

500 g fibrinogenholdig residu av en 2,7 mol/l glycinfell ing slik den fremkommer ved fremstilling av faktor VIII-kon-sentrat HS (tysk patent 29 16 711), ble under oppvarming ved 37°C og omrøring oppløst i 1250 ml 0,15 mol/l NaCl-oppløsning og innstilles med 2 N NaOH på pH 7,5. Etter oppløsning ble det dannet 1700 ml av en 6$-ig fibrinogenoppløsning.

2. Stabilisering og pasteurisering.

A) 1700 ml f ibrinogenoppløsning fra I ble blandet med 5 mmol/1 CaCl2.2H20 (1250 mg) og omrørt til oppløsning. Etter at det tilsatte CaCl2 var fullstendig oppløst, ble det under omrøring og oppvarming tilført 60$ (vekt/volum) sakkarose (1700 g).

Etter at sakkarosen hadde oppløst seg fullstendig, ble det tilsatt 1 mol/l gylcin (127,5 g). Etter fullstendig oppløs-ning av glycinet ble pH-verdien innstilt med 2 N NaOH på pH 7,5. Det fremkom en opalesent, meget viskøs oppløsning som deretter ble Inkubert 10 timer ved 60°C i et vannbad.

Den oppvarmede fibrinogenoppløsning ble viderebehandlet til adskillelse av fIbrinpolymeren (3) og isolering av fibrinogenet (4) som følger: 2,9 1 stabilisert, oppvarmet fIbrinogenoppløsning ble etter temperering ved 20°C fortynnet med 8,7 1 puffer (0,06 mol/l NaCl - 0,02 mol/l tri-Na-citrat) i forholdet 1:4 og dannet 11,6 1 oppvarmet, fortynnet fibrinogenoppløsning som ble utfelt, fraksjonert med glycin. B) Ovennevnte fremgangsmåte A) lar seg også gjennomføre med en forholdsvis høy konsentrasjon av Ca-ioner, f.eks. med 1,8 mol/l CaCl£ x 2H2O (499,8 g) med den ønskede stabiliserings-effekt. 3. Adskillelse av de høymol ekylaere bestanddeler, spesielt flbrlnpolvmere.

Til den oppvarmede og deretter fortynnede fibrinogenoppløs-ning ble det ved 37"C tilsatt 86,25 gglycin/1 (= 1,15 mol/l). Etter oppløsning ble det avkjølt ved 20 "C og den dannede utfelling adskilt i Stock-sentrifuge.

4. Isolering av fibrinogenet fra stabilisatormediet.

Det igjen til 37°C oppvarmede 1,15 mol/l glycinholdige overstående fra 3) ble med ytterligere glycin bragt til en sluttkonsentrasjon på 2,2 mol/l og omrørt så lenge (30 min.) inntil glycinet var fullstendig oppløst.

Utfellingen ble avkjølt til 20"C og adskilt i Stock-sentrifuge.

For anvendelse som humanfibrinogen for intravenøs infusjon ble fibrinogenreslduet oppløst 2#-Ig I 2500 ml 0,01 mol/l tri-Na-citrat - 0,15 mol/l NaCl, dialysert mot samme puffer og etter klar- og sterilfiltrering i 60 ml volumina (1 g HF) avfylt og lyofilisert.

For fremstilling av "Fibrinkleber" ble et etter samme fremgangsmåte utvunnet fibrinogenresidu opptak 4#-ig i 1250 ml følgende salt oppløsning: 0,05 mol/l NaCl, 0,005 mol/l tri-Na-citrat, 0,01 mol/l NaHCC-3, 0,33* L-arginin monohydro-klorid, pH 7,5, dialysert (oppløselig puffer) og deretter ultrasentrifugert: 1 time 35.000 x g. Etter klar- og sterilfiltrering foregår lyofilisering i 4 ml avfyllinger.

Dette produkt er etter rekonstitusjon og i forbindelse med F XIII og trombin egnet for klebing av mykdeler og avtetting av karsømmer.

Claims (4)

1. Fremgangsmåte til pasteurlserlng av human-fibrinogen i vandig oppløsning, karakterisert ved at human-fibrlnogenet 1 vandig oppløsning ved siden av vanlige stabilisatorer inneholder kalsium i en konsentrasjon på 1-37,8 . 10^ g atom/mol human-fibrinogen og deretter oppvarmes på i og for seg vanlig måte.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at de vanlige stabilisatorer er mono- eller oligosak-karider eller sukkeralkoholer og en aminosyre.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at det som oligosakkarid anvendes sakkarose i en konsentrasjon på 35-60 g/100 ml oppløsning.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at det som aminosyre anvendes glycin i en konsentrasjon På 0,5-3 mol/l.