DK167598B1 - Fremgangsmaade til pasteurisering af plasma eller af koncentrater af blodkoaguleringsfaktorerne ii, vii, ix og x - Google Patents

Description

DK 167598 B1 i o

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af et plasma-præparat, som praktisk taget er fri for aktive vira, eller et koncentrat, som praktisk taget er fri for sådanne vira, af blodkoaguleringsfaktorerne II, VII, 5 IX og X ved opvarmning i nærværelse af stabilisatorer samt et derved fremstillet præparat af disse faktorer. Sådanne præparater kan anvendes til behandling af blodkoaguleringsforstyrrelser.

Blodkoaguleringen er en kompleks proces, som for-10 løber i trin, og som udløses ved forskellige fysiologiske, f.eks. patologiske, årsager, og hvis forløb afhænger af ca. 20 fremmende eller hæmmende faktorer. Ved formindskelse eller forøgelse af disse blodkoaguleringsfaktorer optræder der forstyrrelser af blodkoaguleringen, som til 15 dels manifesterer sig som sygdomme.

Koncentrater af faktorerne II, VII, IX og X egner sig til behandling af forskellige medfødte eller erhvervede forstyrrelser af syntesen af disse faktorer. Behandlingen af patienter med koncentrater af disse faktorer 20 har hidtil været forbundet med risikoen for en virusoverføring og specielt af en hepatitis.

Albumin anses for hepatitissikkert, når det i vandig opløsning og i nærværelse af stabilisatorer opvarmes til 60°C, jf. S.S. Gellis et al., J. Clin. Invest. (1948) 27, 25 239. Det må derfor antages, at et i nærværelse af egnede stabilisatorer opvarmet koncentrat af faktorerne II, VII, IX og X ligeledes er hepatitissikkert.

I tysk offentliggørelsesskrift nr. 29 16 711 beskrives en fremgangsmåde til stabilisering af andre koa-30 guleringsfaktorer i vandig opløsning over for varme ved tilsætning af en aminosyre og et mono- eller oligosaccha-rid eller en sukkeralkohol.

Dog kan det på denne måde ikke forhindres, at faktorerne II, VII, IX og X for en stor dels vedkommende in-35 aktiveres ved opvarmningen. Derfor har det været et fremskridt at observere, at chelatdannere beskytter faktorerne II og VII (jf. DE-Al nr. 30 43 857), og calciumsalte beskytter

Ul\ I O / 9^0 s 2 o faktorerne IX og X (jf. DE-Al nr. 30 45 153) mod en termisk inaktivering i vandig opløsning.

Begge fremgangsmåder muliggør imidlertid ikke fremstillingen af et præparat af alle fire faktorer i én ar-5 bejdsproces, som er ønskelig, da alle fire faktorer er formindsket ved vitamin K-mangel eller under behandlingen med orale antikoaguleringsmidler og derfor skal erstattes samtidig.

Det har følgelig været en opgave at finde en frem-10 gangsmåde til stabilisering af en vandig opløsning indeholdende faktorerne II, VII, IX og X mod termisk inaktivering.

Det har overraskende vist sig, at en vandig opløsning indeholdende alle fire faktorer II, VII, IX og X 15 ved tilsætning af calciumioner og en chelat-danner kan beskyttes mod de skadelige følger af en varmebehandling. Eventuelt kan antithrombin III (AT) og heparin tilsættes for at forhindre en aktivering af faktorerne II og VII.

Dermed er der skaffet forudsætninger for at fremstille 20 disse fire faktorer fri for aktive vira i én arbejdsgang med høj renhed og udbytte.

Chelat-danneren sættes yderligere til det allerede tilstedeværende citrat.

Det er overraskende, at en blanding af calciumioner 25 og chelat-danner bevirker den tilstræbte beskyttelse af alle faktorerne II, VII, IX og X mod et aktivitetstab ved opvarmning, selv om ifølge DE-Al nr. 30 43 857 en chelat-danner er hensigtsmæssig til beskyttelse af faktorerne II og VII, medens der til det samme formål til 30 faktorerne IX og X anvendes calciumioner (jf. DE-Al nr.

30 45 153), og chelat-dannere også danner komplekser med calciumioner. Afhængigt af om chelat-danneren eller calciumionerne foreligger i overskud, skulle derfor kun de to tilsvarende faktorer være beskyttet mod en varmenedbrydning 35 og ikke alle fire.

Opfindelsen angår derfor en fremgangsmåde til frem- 3 DK 167598 B1

O

stilling af et praktisk taget virusfrit og hepatitissikkert præparat af blodkoaguleringsfaktorerne II, VII, IX og X ved opvarmning af en vandig opløsning, eventuelt i nærværelse af en aminosyre og/eller et saccharid eller en 5 sukkeralkohol, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at der opvarmes i nærværelse af calciumioner og en chelat-danner og eventuelt i nærværelse af antithrombin III og/eller heparin.

En sådan opløsning kan være en opløsning eller et koncentrat indeholdende disse faktorer, men den kan også 10 være plasma eller en plasma- eller placentafraktion.

Den optimale koncentration af calciumioner ligger 1 området 1-50 mmol/liter, fortrinsvis 25-50 mmol/liter.

Egnede salte, som giver calciumioner, er f.eks. chlorid, acetat eller nitrat samt alle vandopløselige 15 calciumsalte af sukkersyrer, såsom gluconsyre eller lac-tonsyre. Fortrinsvis anvendes chloridet og acetatet.

Egnede chelat-dannere er f.eks. ethylendiamino--tetraeddikesyre (EDTA), ethylenglycol-bis-(2-aminoethyl-ether)-tetraeddikesyre (EGTA), diaminocyclohexan-tetra-20 eddikesyre (CDTA), diaminopropan-tetraeddikesyre eller nitrilotrieddikesyre og især deres opløselige alkalimetalsalte.

Fortrinsvis anvendes aliphatiske aza-tri- eller -tetra-carboxylsyrer med 6-20 carbonatomer og 1 eller 2 25 nitrogenatomer og deres opløselige alkalimetalsalte og især natriumsaltene af ethylendiaminotetraeddikesyre (EDTA) eller ethylenglycol-bis-(2-amino-ethylether)-tetraeddikesyre (EGTA). Den optimale koncentration af chelat-danneren er 1-20 mmol/liter og fortrinsvis 5 mmol/liter.

30 Særlig egnet har blandinger af 25 mmol/liter cal cium med 5 mmol/liter EDTA vist sig.

Antithrombin III anvendes i en koncentration på 0,05-2 E/ml, beregnet på aktiviteten af 1 ml citratblandingsplasma, og sammen med heparin i koncentrationer på 35 0,5-20 USP-E/ml, fortrinsvis 0,2 E antithrombin III med 2 USP-E heparin.

I nærværelse af en blanding af calciumioner og en DK 167598 Bl

O

4 chelat-danner og eventuelt antithrombin Ill-heparin-kom-plekset kan den vandige opløsning af koaguleringsfaktorerne opvarmes så længe, at en overføring af vira og specielt hepatitis-fremkaldere ifølge teknikkens nuværende 5 stade kan udelukkes i praksis. Dette gælder især, når pasteuriseringen kombineres med adsorptions- og fældningsfremgangsmåder, ved hvilke det virksomme stof bliver i den ovenstående væske, og hepatitisviraene kan fraskilles sammen med det uopløselige bundfald. Et præparat, som holdes 10 mindst 10 timer ved ca. 60°C i vandig opløsning, anses i dag for praktisk taget hepatitissikkert, når der gås ud fra human vævsvæske, i hvilken der efter en test af den tredje generation ikke kan påvises hepatitisvira.

En særlig foretrukken udførelsesform for opfin-15 delsen er ejendommelig ved, at der til en opløsning indeholdende alle fire faktorer, fortrinsvis plasma eller en plasma- eller placentafraktion, sættes 0,2-2 E/ml antithrombin III, 2-20 USP-E/ml heparin, 25-50 mmol/liter calciumioner og 1-20 mmol/liter EDTA, 1-3 mol/liter af 20 mindst én af aminosyrerne glycin, a- eller β-alanin, lysin, leucin, valin, asparagin, serin, hydroxyprolin, prolin, glutamin, α-, β- eller γ -aminosmørsyre, dog fortrinsvis glycin, og 20-60 g/100 g opløsning af et monoeller oligosaccharid eller en sukkeralkohol, fortrins-25 vis 1-3 mol/liter glycin og 20-60 g/100 g opløsning saccharose, at der opvarmes til en temperatur på 30-100°C, fortrinsvis 60-100°C, og at blandingen holdes 1 minut til 48 timer, fortrinsvis 8-12 timer, ved denne temperatur, idet den korteste tid skal henføres til den højeste tempe-30 ratur og omvendt.

Der holdes en pH-værdi på 6-8. På denne måde fås et praktisk taget virusfrit præparat af faktorerne II, VII, IX og X.

Afhængigt af opløseligheden af calciumsaltet, amino-35 syren eller kulhydratet kan de tilsvarende koncentrationer på 0,3 og 3,0 mol/liter og 60 g/100 g udvides til højere koncentrationer, når calciumsaltet, aminosyren eller kul-

O

5 DK 167598 B1 hydratet ved den ønskede temperatur udviser en tilsvarende højere opløselighed. Temperaturbehandlingen kan også gennemføres i flere trin, som følger efter hinanden.

Med den fortrinsvis anvendte kombination af anti-5 thrombin III, heparin, calciumchlorid og EDTA med glycin og saccharose opnås ved opvarmning et hepatitissikkert præparat.

For at opnå et virus-frit plasma, som indeholder faktorerne II, VII, IX og X i naturlig og aktiv form, 10 sættes der til plasmaet en blanding af en chelat-danner, fortrinsvis EDTA og calciumioner, fortrinsvis i sådanne mængder, at disse foreligger i koncentrationer på 5 mmol/liter EDTA og 25 mmol/liter calciumchlorid, der opvarmes i en saccharose(60 g/100 g)-glycin(2 mol/liter)-15 blanding til 60°C, og blandingen holdes i 10 timer ved denne temperatur.

For at opnå et naturligt og aktivt koncentrat af faktorerne II, VII, IX og X sættes der til plasma- eller placentafraktionen, hensigtsmæssigt en fraktion, i hvil-20 ken faktorerne, som skal stabiliseres, er beriget, en blanding af en chelatdanner, fortrinsvis EDTA og calciumioner, fortrinsvis i koncentrationsforhold på 5 mmol/-liter EDTA og 25 mmol/liter calciumchlorid. Efter tilsætning af antithrombin III, fortrinsvis 0,2 E/ml og hepa-25 rin, fortrinsvis 2 USPE/ml, opvarmes der i en saccharose (60 g/100 g)-glycin(2 mol/liter)-blanding til 60°C, og blandingen holdes i 10 timer ved denne temperatur.

En sådan fraktion fås f.eks. ved fremgangsmåden ifølge Soulier et al., Thrombosis Diath. Haemorrh. Suppl.

30 _35, 61 (1969). Til dette formål adsorberes plasma, som er udvundet af blod antikoaguleret med 0,01 mol/liter EDTA, på calciumphosphat og f jacentrifugeres. Derved bindes faktorerne kvantitativt på adsorbenset og kan udvindes ved gentagne elueringer med 0,2 mol/liter tri-natriumcitrat.

35 De forenede eluater renses yderligere ved kombinerede alkohol- og eddikesyre-fældninger ved temperaturer på -8 til +4°C. Derved koncentreres faktorerne samtidigt.

O

6 υκ ib/b»» b i

Koncentratet optages i en egnet puffer, fordelagtigt natriumchlorid/natriumcitrat med 0,06 hhv. 0,02 mol/liter og en pH-værdi på 7,5.

Genudvindingen og rensningen af koaguleringsfaktorer-5 ne fra den opvarmede opløsning kan opnås ved fældning med ammoniumsulfat ved 30-45%’s mætning, adsorbering af den ovenstående væske på 0,4-1 g/100 ml calciumphosphat og eluering.

Kontrollerne af foranstaltningerne til berigelse og 10 rensning af faktorerne II, VII, IX og X er velkendte for en fagmand gennem kendskabet til bestemmelsesmetoder for de pågældende materialer. Under anvendelse af disse kontrolmetoder kan fremgangsmådebetingelserne styres ud frå synspunktet om et tilfredsstillende udbytte.og en til-15 fredsstillende renhed af produktet.

Faktor II kan f.eks. bestemmes ved metoden ifølge F. Koiler et al., Dtsch. med. Wschr. 8_1, 516 (1957). Dertil blandes én del, f.eks. 0,1 ml faktor II-mangelplasma, og én del fortyndet normalplasma. Denne blanding holdes i 20 30 sekunder ved 37°C. Derefter tilsættes der to dele cal- ciumholdigt thromboplastin, f.eks. fremstillet ifølge tysk patentskrift nr. 23 56 493, og tiden, der hengår indtil forekomsten af en koaguleret masse, bestemmes. Til den kvantitative bestemmelse aflæses koaguleringstiden, 25 som viser sig for opløsningen indeholdende faktor II, og henføres til en med en normalplasma-fortyndingsrække opnået kalibreringskurve.

En enhed faktor II svarer til faktor Il-aktiviteten af 1 ml normalplasma.

30 Faktor VII kan f.eks. bestemmes ved metoden ifølge F. Kolier et al., Acta haemat. 1 (1951) . Dertil blandes én del, f.eks. 0,1 ml faktor VII-mangelplasma, og én del fortyndet normalplasma. Denne blanding holdes i 30 sekunder ved 37°C. Derefter tilsættes der to dele calciumholdigt 35 thromboplastin, f.eks. fremstillet ifølge tysk patentskrift nr. 23 56 493, og tiden, som hengår indtil forekomsten af en koaguleret masse, bestemmes. Til den kvantitative be-

O

DK 167598 B1 7 stemmelse aflæses koaguleringstiden, som viser sig for opløsningen indeholdende faktor VII, og henføres til en med en normalplasma-fortyndingsrække opnået kalibreringskurve.

En enhed faktor VII svarer til faktor VII-aktiviteten 5 af 1 ml normalplasma.

Bestemmelsen af faktor IX sker f.eks. ifølge den følgende fremgangsmåde:

En del, f.eks. 0,1 ml partielt thromboplastin, f.eks. fremstillet ifølge DE fremlæggelsesskrift nr. 23 16 430, 10 blandes med én del faktor IX-mangelplasma og én del fortyndet normalplasma. Denne blanding holdes i 6 minutter ved 37°C. Efter tilsætning af én del af en til 37°C foropvarmet 0,025 molær calciumchlorid-opløsning bestemmes tiden, som hengår fra tilsætningen af calciumchlorid-opløsningen 15 indtil forekomsten af en koaguleret masse. Til den kvantitative bestemmelse aflæses koaguleringstiden, som viser sig for opløsningen indeholdende faktor IX, og henføres til en med en normalplasma-fortyndingsrække opnået kalibreringskurve .

20 Én international enhed (= 1 IE) faktor IX svarer til faktor IX-aktiviteten af 1 ml normalplasma.

Faktor X kan f.eks. bestemmes ved metoden ifølge Duckert et al., Blood Coagulation, Hemorrhage and Thrombosis, Ed. L.M. Tocantins og L.A. Kazal (1964). Dertil 25 blandes én del, f.eks. 0,1 ml faktor X-mangelplasma, og én del fortyndet normalplasma. Denne blanding holdes i 30 sekunder ved 37°C. Derefter tilsættes der to dele calcium-holdigt thromboplastin, f.eks. fremstillet ifølge DE patentskrift nr. 23 56 493, og tiden, som hengår indtil fore-30 komsten af en koaguleret masse, bestemmes. Til den kvantitative bestemmelse aflæses koaguleringstiden, som viser sig for opløsningen indeholdende faktor X, og henføres til en med en normalplasma-fortyndingsrække opnået kalibreringskurve. En enhed faktor X svarer til faktor X-aktiviteten 35 af 1 ml normalplasma.

Til ødelæggelse af hepatitisviraene sættes der calciumioner, EDTA, glycin og saccharose og eventuelt anti-

O

8 υκ ib/b»a bi thrombin III og heparin til opløsningen og opvarmes.

Efter pasteurisering (10 timer, 60°C) af humanplasma, efter tilsætning af saccharose (60 g/100 g) og glycin (2 mol/liter) og i nærværelse af 25 mmol/liter calcium-5 chlorid samt 5 mmol/liter EDTA findes de følgende aktiviteter, beregnet på det anvendte plasma: F II 90%, F VII 85%, F IX 83%, F X 80%.

De forskellige stabilisatorers indflydelse på bevarelsen af aktiviteten af de enkelte prothrombinfaktorer 10 i en plasma- eller placentafraktion ved opvarmningen fremgår af tabel I. Pasteuriseringen med saccharose og glycin alene giver et dårligt F IX-udbytte. Det er imidlertid meget uheldigt, da prothrombin-koncentratet overvejende anvendes til behandling af hæmofili B. Den yderligere an-15 vendelse af calciumioner uden chelatdanner i koncentrationen 6,25 mmol/liter fører til en aktivering af F VII og F IX og formindsker også udbytterne af F II og F X.

Et sådant præparat ville på grund af en mulig thrombose-risiko ikke være egnet til anvendelse hos mennesker. Ved 20 anvendelse af. EDTA uden calciumioner i koncentrationen 5 mmol/liter foruden saccharose og glycin opnås ved gode F II- og F VII-udbytter dårlige F IX- og F X-udbytter. Prothrombinfaktorerne lader sig ikke stabilisere alene med antithrombin III, heparin, saccharose og glycin.

25 Det bedste resultat giver kombinationen af calcium ioner med EDTA ved tilsætning af antithrombin III og heparin med saccharose og glycin. Under disse betingelser er udbytterne for alle fire faktorer af størrelsesordenen ca. 80%, og præparatet er også frit for aktive-30 rede faktorer og thrombin.

Koncentrationerne af koaguleringsfaktorerne i en vandig opløsning, med hvilken den beskrevne fremgangsmåde kan gennemføres, ligger især i de følgende områder: 35 9 DK 167598 B1

O

Faktor II 0,3-50 E/ml,

Faktor VII 0,3-30 E/ml,

Faktor IX 0,5-60 E/ml,

Faktor X 0,4-60 E/ml.

5 Særlig foretrukket er områderne 0,5-25, 0,5-15, 0,7-30 og 0,6-30 for henholdsvis faktor II, VII, IX og X.

Som koncentrat betegnes sædvanligvis en opløsning, 10 som indeholder de virksomme stoffer - altså i det foreliggende tilfælde koaguleringsfaktorerne - i en højere koncentration end de naturlige udgangsmaterialer.

15 20 25 30 35 DK 167598 B1 o 10

-P

- (D

}-i <jp —i X ro o o ro 5 (DdJ ^ i1 in to m -P -H -H fe

m P

(U (U * '

O -P

+? O 2 X in .ρ H ro ro D ^ g W CM li to ^ 4J VD ω ^ •H t7> pq

> ^ S

•H xj id >

-P tn H

m ^ 9 "S H co jj ri n in 1U S ^ 3 > Kl co CO Kl TO irf

Di «β ro S Di O) •Η £ P -H -p i# j § ϊ h ro Γ" ro cm cm D P §> 0° ^ f' ^

Di ccJ Φ w

cd > P

O O) <U .

15 x o |Q .ae ♦Η N,

P W I I I CM CM

cd i

Dj Pj Q) 03

ffi JD

H CM CM

H r—I

20 Hg I I I o o E-i P3

C

I—I

H

E-t 0 i i tn in i Q g w g

9*5 P

Λ <D

Di

S P

•Η G) H in

£ c \ CM

-P OH

fti h o i in i in i

1 S CM

1-1 όί g s 30

-P

C H £

•H P

D H g

>1 O CM CM CM CM CM

H g 6 ί λ: H dj Φ

XI II

35 g Q) ^ TO Di m 0 ί Ρ σ ti cd o o o o o o

ÆH Vi ID lO Ifl w V

θ'-s * O »l cd in DK 167598 B1 11 o

Til den videre rensning kan den opvarmede opløsning eventuelt centrifugeres. Urenheder kan fjernes ved udfældning med ammoniumsulfat og 30-45%'s mætning.

Den ovenstående væske kan derpå adsorberes på 0,04-5 1,0 g calciumphosphat pr. 100 ml opløsning, det opladede adsorbens vaskes, elueres med citratpuffer, og eluatet dialyseres.

Til anvendelse hos mennesker kan produktet underkastes en sterilfiltrering.

10 Opfindelsen angår især et ifølge denne fremgangs måde fremstilleligt faktor II-, VII-, IX- og X-præparat, som er frit for aktive vira.

Til forhøjelse af oplagrings stabiliteten er det hensigtsmæssigt at sætte protein-stabiliserende materialer, 15 f.eks. proteiner, aminosyrer eller kulhydrater til præparatet. Sluttelig kan præparatet underkastet denne behandling stilles til rådighed i frysetørret form, hvorved tilsætningen af antikoagulerende midler, f.eks. heparin, kan være fordelagtig.

20 Det her omhandlede produkt, specielt i form af et koncentrat, er, i en til farmaceutisk anvendelse egnet opløsning, et lægemiddel til behandling af koagulo-pathier og kan intravenøst, fordelagtigt som infusion, anvendes til behandling og profylakse af blødninger be-25 tinget af faktorer-mangel.

I form af et lyofiliseret, koaguleringsaktivt plasma dækker det pasteuriserede produkt indikationerne for frisk-frosset plasma, f.eks. ved opfyldning af blodvolumenet, opretholdelse af det onkotiske tryk, blodtab efter 30 store operationer og ulykker samt behandling af forskellige former for chok og førstehjælp til polytraumatisere-de.

Opfindelsen forklares ved de nedenstående eksempler.

35 DK 167598 B1

O

12

Eksempel 1 1000 ml Human-citratplasma opvarmes under omrøring til 25-30°C, der tilsættes 20 ml af en opløsning/ som indeholder 1/86 g EDTA/ og der indstilles med 2 N NaOH 5 til en pH-værdi på 7/8. 10 Minutter senere udrøres der langsomt i den til 30°C opvarmede opløsning 1000 g saccharose. Efter opløsning af saccharosen tilsættes der langsomt og under omrøring 150 g krystallinsk glycin. Efter at dette er fuldstændig opløst/ tilsættes der 25 ml Ι-ΙΟ -molær CaC^-opløsning, og opløsningen indstilles med 2 N NaOH til en pH-værdi på 7/2. Opløsningen, som af stabilisatorerne er forøget til 1,7 liter, opvarmes i vandbad i 10 timer til 60°C og er også klar efter opvarmningen.

Fjernelse af stabilisatorerne: 15 Efter afkøling af den pasteuriserede opløsning klarfiltreres denne over et 3,0 og 1,2 μ Sartorius-mem-bran-filter, hvorpå opløsningen fortyndes med en citrat-NaCl-puffer (0,01 mol/liter tri-NaCitrat pH-værdi 7,5; 0,06 mol/liter NaCl) til 5 liter, dialyseres på et ultra-20 filter under samtidig koncentrering 3 gange mod 5 liter af en puffer med den samme sammensætning og koncentreres til 1000 ml.

Efter opnåelse af plasma-udgangsvolumenet på 1000 ml klar- og sterilfiltreres den klare opløsning over 25 Sartorius-membran-filtre, af tappes i 50 ml-volumina og lyofiliseres. I det med 50 ml destilleret vand rekonstituerede tørre materiale findes de følgende aktiviteter, beregnet på et standard-human-plasma: F II 87%, F VII 81%, F IX 83%, F X 80%.

30

Eksempel 2 1. Udvinding af prothrombin-faktorerne ved adsorption på "DEAE-Sephadex" og eluering.

Til 550 liter citratplasma sættes "DEAE-Sephadex A 50" 35 (0,6 g/liter), som i fysiologisk natriumchloridopløsning inde holder 5 mmol/liter EDTA, og som er ækvilibreret ved en pH-værdi på 6. Suspensionen omrøres til adsorption 60 minut DK 167598 B1

O

13 ter ved 15°C. Efter udfældning af adsorbenset afpipetteres den ovenstående væske, og "DEAE-Sephadex"et med de adsor-berede faktorer vaskes med 50 liter fysiologisk natriumchloridopløsning, som indeholder 5 mmol/liter EDTA, 5 indtil det er fri for forurenende proteiner. Derpå omrøres adsorbenset med 7 liter 1 mol/liter NaCl, pH-værdi 8, indeholdende 5 mmol/liter EDTA, og adsorbenset fraskilles ved centriguering og bortkastes.

2. Pasteurisering.

10 Til den ovenstående væske sættes 0,2 E AT III/ml og 2 E/ml heparin. Derpå tilsættes der 1 050 g fast glycin, og, efter at dette er opløst, 25,7 g CaCl2 2H20 svarende til en slutkoncentration på 25 mmol/liter. Efter opnåelse af en konstant pH-værdi på 7,2 opvarmes opløsnin-15 gen til 30-37°C, og der tilsættes 10,5 kg saccharose (slutkoncentration ca. 60 g/100 g opløsning). Efter at pH-vær-dien af denne højviskose opløsning igen er indstillet til 7,2, opvarmes opløsningen i vandbad i 10 timer til 60°C.

3. Fraskillelse af uønskede proteinet ved fældning 20 med ammoniumsulfat.

Den pasteuriserede opløsning, ca. 14 liter, afkøles til stuetemperatur og sættes til 31,5 liter destilleret vand, som indeholder 334 g CaCl2 2Ε^Ο, svarende til en slutkoncentration på 50 mmol/liter.

25 I denne opløsning af prothrombin-faktorerne ind føres ved en pH-værdi på 7,5 24,5 liter mættet ammoniumsul-fatopløsning, bundfaldet afcentrifugeres og bortkastes.

4. Højrensning af prothrombinfaktorerne ved adsorption på calciumphosphat.

30 Til den ovenstående væske indeholdende prothrombin- faktorerne sættes 700 g fast Ca3(P04)2 ved en pH-værdi på 7,6, og der omrøres i 20-30 minutter ved stuetemperatur. Calciumphosphatet udvindes ved centrifugering og vaskes tre gange med 20 liter af en opløsning af 0,5 mol/liter 35 NaCl og 1 g/100 ml glycin med en pH-værdi på 7,6.

Elueringen af prothrombinfaktorerne fra adsorbenset sker med 750 ml af en puffer, som indeholder 0,2 mol/liter DK 167598 Bl

O

14 trinatriumcitrat, 0,15 mol/liter NaCl, 1 g/100 ml glycin, 0,6 E/ml AT III og 28 E/ml heparin (pH-værdi ca. 7,5), og omrøring (20 minutter) ved stuetemperatur. Eluatet befries for grove partikler ved centrifugering ved 3 000 5 g.

5. Konfektionering.

Til den ovenstående væske sættes 0,15 g/100 ml "Aerosil", og denne befries for faste stoffer ved ultra-centrifugering ved 30 000 g. Til den klare ovenstående 10 væske sættes ca. 0,6 g humanalbumin pr. 100 ml væske, der indstilles til en pH-værdi på 6,8, og der dialyseres i 3 timer mod 50 liter fysiologisk natriumchloridopløsning. Opløsningen indstilles på ca. 60 E F IX, 60 E F II, 50 E F X og 25 E F VII, sterilfiltreres, aftappes i 5 mlfs 15 volumina og lyofiliseres.

20 25 30 "Ά 35

Claims (7)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af et praktisk taget virusfrit og hepatitissikkert præparat af blodkoaguleringsfaktorerne II, VII, IX og X ved opvarmning af en vandig 5 væske indeholdende disse faktorer, eventuelt i nærværelse af en aminosyre og/eller et saccharid eller en sukkeralkohol, kendetegnet ved, at der opvarmes i nærværelse af calciumioner og en chelat-danner og eventuelt anti-thrombin III og/eller heparin.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg net ved, at koncentrationen af calciumioner er 1-50 mmol/liter, fortrinsvis 25-50 mmol/liter.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegne t ved, at chelat-danneren er en aliphatisk aza-tri- 15 eller -tetra-carboxylsyre med 6-20 carbonatomer og 1 eller 2 nitrogenatomer eller dens opløselige alkalimetalsalt.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at koncentrationen af chelat-danneren er 1-20, fortrinsvis 5 mmol/liter.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg net ved, at der i nærværelse af 0,2-2 E/ml antithrombin III, 2-20 USP-E/ml heparin, 25-50 mmol/liter calciumioner, 1-20 mmol/liter EDTA, 1-3 mol/liter af mindst én af amino-syrerne glycin, a- eller 3-alanin, lysin, leucin, valin, 25 asparagin, serin, hydroxyprolin, prolin, glutamin, α-, β-eller γ-aminosmørsyre, fortrinsvis glycin, og 20-60 g/100 g opløsning af et mono- eller oligosaccharid eller en sukkeralkohol, fortrinsvis 1-3 mol/liter glycin og 20-60 g/100 g opløsning saccharose, opvarmes til en temperatur 30 på 30-100°C, fortrinsvis 60-100°C, i 1 minut til 48 timer, fortrinsvis 8-12 timer.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den vandige væske er citratplasma eller en plasma- eller placenta-fraktion.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg net ved, at den vandige væske er et koncentrat af faktorerne II, VII, IX og X.