FI81363B

FI81363B - Foerfarande foer pastoerisering av preparat av blodkoaguleringsfaktorerna ii, vii, ix och x.

Info

Publication number: FI81363B
Application number: FI843909A
Authority: FI
Inventors: Norbert Heimburger; Wilfried Wormsbaecher; Gerhardt Kumpe; Hans Martin Preis
Original assignee: Behringwerke Ag
Priority date: 1983-10-08
Filing date: 1984-10-04
Publication date: 1990-06-29
Also published as: EP0137428B1; US6346277B1; DK480184D0; NZ209784A; FI843909A0; FI81363C; FI843909L; IL73189A0; DE3336631A1; AU3388284A; PT79318B; DK167598B1; AU590191B2; ES536549A0; DK480184A; DE3478087D1; ES8605677A1; CA1246444A; MX167398B; ZA847823B

Description

1 81363

Menetelmä veren hyytymistekijöiden II, VII, IX sekä X valmisteen pastöroimiseksi

Keksintö koskee menetelmää veren hyytymistekijöi-5 den II, VII, IX sekä X käytännöllisesti katsoen virukset toman sekä hepatiitin suhteen turvallisen valmisteen valmistamiseksi lämmittämällä näitä tekijöitä sisältävää vesipitoista liuosta, aminohapon ja sakkaridin läsnäollessa. Tällaisia valmisteita voidaan käyttää veren hyytymis-10 häiriöiden hoitoon.

Veren hyytyminen on monimutkainen, asteittain etenevä tapahtuma, jonka erilaiset fysiologiset sekä patologiset syyt laukaisevat ja jonka kulku riippuu noin 20:stä edistävästä tai estävästä tekijästä. Näiden veren hyyty-15 mistekijöiden vähentyessä tai lisääntyessä esiintyy veren hyytymisen häiriöitä, jotka osittain ilmenevät sairauksina.

Tekijöiden II, VII, IX sekä X konsentraatit soveltuvat näiden tekijöiden synteesin sekä erilaisten synnyn-20 näisten että hankittujen häiriöiden hoitoon. Potilaiden hoitoon näiden tekijöiden konsentraateilla liittyi tähän saakka viruksen, erityisesti hepatiitti-viruksen siirtymisen vaara.

Albumiinia pidetään hepatiitin suhteen turvallise-25 na, kun se kuumennetaan vesiliuoksessa stabilisaattorien läsnäollessa 60°C:seen [S. S. Gellis et ai.; J. Clin. Invest. (1948), 27, 239]. Siksi on oletettavissa, että jokin tekijöiden II, VII, IX sekä X konsentraatti, joka on kuumennettu sopivien stabilisaattoreiden läsnäollessa, on 30 myös hepatiitin suhteen turvallinen.

DE-patenttijulkaisussa 2 916 711 kuvataan menetelmää muiden hyytymistekijöiden stabilisoimiseksi vesi-liuoksessa lämmön suhteen, lisäämällä jotakin aminohappoa tai mono- tai oligosakkaridia tai sokerialkoholia.

35 Tällä tavoin ei voida kuitenkaan estää, että teki jät II, VIII, IX ja X suurimmaksi osaksi inaktivoituvat 2 81 363 lämmitettäessä. Sen vuoksi havainto, että tekijöitä II ja VII voidaan suojata termiseltä inaktivoinnilta kelaatin-muodostajan avulla (DE 3 043 857) sekä tekijöitä IX ja X kalsiumin avulla (DE 3 045 153 AI), oli edistysaskel.

5 Kummallakaan menetelmällä ei kuitenkaan voitu valmistaa kaikkia neljää tekijää sisältävää valmistetta yhden työmenetelmän avulla, kuten on toivottavaa, koska kaikki neljä tekijää ovat vähentyneet K-vitamiinin puutteen sekä oraalisilla antikoagulanteilla suoritetun hoidon yhtey-10 dessä, ja ne täytyy siksi korvata samanaikaisesti.

Sen vuoksi tehtävänä oli löytää menetelmä tekijöiden II, VII, IX sekä X sisältävän vesiliuoksen stabili-soimiseksi termistä inaktivointia vastaan.

Yllättäen havaittiin, että kaikkia neljää tekijää 15 II, VII, IX sekä X sisältävä vesiliuos voitiin suojata lämpökäsittelyn haitallisilta seurauksilta lisäämällä kalsiumioneja sekä kelaatinmuodostajaa. Mahdollisesti voidaan lisätä antitrombiinia (AT) sekä hepariinia tekijöiden II ja VII aktivoitumisen estämiseksi.

20 Täten oli hankittu edellytykset valmistaa yhdessä työvaiheessa näitä neljää tekijää erittäin puhtaina ja korkein saannoin, sekä siten, etteivät ne sisällä aktiivisia viruksia.

Kelaatinmuodostajaa lisätään ylimääräisestä jo 25 olemassa olevaan sitraattiin.

On hämmästyttävää, että kalsiumionien ja kelaatin-muodostajan seos antaa kaikille tekijöille II, VII, IX sekä X tavoitellun suojan lämmityksen aikaansaamaa aktiivisuuden häviötä vastaan, vaikka DE 3 043 857:n mukaan 30 kelaatinmuodostaja on tarkoituksenmukainen tekijöiden II

ja VII suojaamiseksi, samalla kun tekijöitä IX ja X varten samaan tarkoitukseen käytetään kalsiumioneja (DE 3 045 153), ja kelaatinmuodostaja muodostaa kalsium-ionien kanssa komplekseja. Sen mukaisesti, onko kelaatin-35 muodostajaa tai kalsiumioneja ylimäärin, tulisi sen vuok si kulloinkin ainoastaan molempien vastaavien tekijöiden 3 81363 olla suojattuja lämmön aiheuttamaa hajoamista kohtaan, eikä kaikkien neljän.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että lämmitys suoritetaan kalsiumionien (1-50 5 mmol/1) sekä kelaatinmuodostajan (1-20 mmol/1) ja mah dollisesti antitrombiini III:n (0,2 - 2 E/ml) ja/tai he-pariinin (2-20 USP-E/ml) läsnäollessa.

Sellainen liuos voi olla jokin näitä tekijöitä sisältävä liuos tai niitä sisältävä konsentraatti, mutta se 10 voi olla myös plasma- tai istukkajae.

Kalsiumionien optimikonsentraatio on alueella 1 -50 mmol/1, edullisesti 25 - 50 mmol/1.

Sopivia kalsiumioneja tuottavia suoloja ovat esimerkiksi kloridi, nitraatti tai asetaatti sekä sokerihap-15 pojen, kuten glukonihapon tai laktonihapon vesiliukoiset kalsiumsuolat. Edullisesti käytetään kloridia ja asetaat-tia.

Sopivia kelaatinmuodostajia ovat esimerkiksi ety-leenidiamino-tetraetikkahappo (EDTA), etyleeniglykoli-20 bis-(2-amino-etyylieetteri)-tetraetikkahappo (EGTA), di- aminosykloheksaani-tetraetikkahappo (CDTA), diaminosyk-lopropaani-tetraetikkahappo tai nitriloetikkahappo sekä erityisesti niiden liukoiset alkalisuolat.

Edullisesti käytetään alifaattisia atsa-tri- tai -25 tetrakarboksyylihappoa, joissa on 6 - 20 hiiliatomia sekä 1 tai 2 typpiatomia, sekä niiden liukoisia alkalisuoloja sekä erityisesti etyleenidiamino-tetraetikkahappoa (EDTA) tai etyleeniglykoli-bis-(2-amino-etyylieetteri)-tetra-etikkahappoa (EGTA). Kelaatinmuodostajan optimikonsent-30 raatio on 1 - 20 mmol/1, edullisesti 5 mmol/1.

Erityisen soveliaiksi ovat osoittautuneet seokset, joissa on 25 mmol/1 kalsiumia sekä 5 mmol/1 EDTA:ta.

Antitrombiinia III käytetään 0,05 - 2 E/ml:n kon-sentraationa 1 ml:n sitraattiseosplasman (IE) aktiivi-35 suutta kohti sekä yhdessä hepariinin kanssa konsentraa- tiona 0,5 - 20 USP-E/ml, edullisesti 0,2 E-antitrombiini III:a 2 USP-E:n kanssa hepariinia.

4 81363

Kalsiumionien ja kelaatinmuodostajan sekä mahdollisesti antitrombiini ΙΙΙ-hepariinikompleksin läsnäollessa voidaan hyytymistekijöiden vesiliuosta kuumentaa niin kauan, että virusten siirtyminen ja erityisesti hepatii-5 tin aiheuttaja nykyisen tiedon tason mukaisesti on käy tännöllisesti katsoen poissuljettu. Tällä on merkitystä ennen kaikkea silloin, kun pastörointi yhdistetään adsorptio- ja saostusmenettelyn kanssa, jolloin vaikuttava aine jää liuokseen ja hepatiittivirukset voidaan erottaa 10 yhdessä liukenemattoman sakan kanssa. Valmiste, jota pidetään vähintään 10 tunnin ajan noin 60°C:ssa vesiliuoksessa, katsotaan nykyisin käytännöllisesti katsoen hepatiitin suhteen turvallisesksi, erityisesti kun lähtöaineena käytetään ihmisen kudosnestettä, jossa ei testin 15 perusteella voida osoittaa kolmannen sukupolven hepatiit tiviruksia .

Eräälle erittäin edulliselle keksinnön suoritusmuodolle on ominaista, että kaikkia neljää tekijää sisältävä liuos, lähinnä plasma tai plasma- tai istukkajae, 20 sekoitetaan antitrombiini III:n (0,2 - 2 E/ml), heparii- nin (2-20 USP-E/ml), kalsiumionien (25 - 50 mmol/1) sekä EDTA:n (1-20 mmol/1) kanssa, 1-3 mol/l:n kanssa vähintään yhtä aminohapoista glysiini, alaniini tai se-riini, mutta etupäässä glysiinin kanssa, sekä sakkaridin 25 kanssa (20 - 60 g/100 g liuosta), lähinnä glysiiniä 1-3 moolia/1 sekä sakkaroosia 20 - 60 g/100 g liuosta, kuumennetaan 30 - 100°C:seen, lähinnä 60 - 100°C:seen 1 minuutin - 48 tunnin ajaksi ja pidetään lähinnä 8 - 12 tuntia tässä lämpötilassa, jolloin korkeimmassa lämpötilassa 30 pidetään lyhyin aika ja päinvastoin.

pH pidetään arvossa 6-8. Tällä tavoin saadaan käytännöllisesti tekijöiden II, VII, IX sekä X käytännöllisesti katsoen virukseton valmiste.

Il 5 81363

Kalsiumsuolan, aminohapon tai hiilihydraatin liukoisuudesta riippuen voidaan vastaavia konsentraatioita 0,3 ja 3,0 mol/1 sekä 60 g/100 g lisätä suuremmiksi kon-sentraatioiksi siinä tapauksessa, että kalsiumsuolalla, 5 aminohapolla tai hiilihydraatilla toivotussa lämpötilassa on vastaavasti suurempi liukoisuus. Lämpökäsittelyt voidaan suorittaa myös useammissa toisiaan seuraavissa vaiheissa .

Edullisesti käytetyn antitrombiini III:n, heparii-10 nin, kalsiumkloridin sekä EDTA:n yhdistelmän avulla gly-siinin ja sakkaroosin kanssa saadaan kuumennuksen kautta hepatiitin suhteen turvallinen valmiste.

Jotta saadaan virukseton plasma, joka sisältää tekijät II, VII, IX sekä X natiivissa muodossa, sekoitetaan 15 plasma seoksen kanssa, joka sisältää kelaatinmuodostajän, lähinnä EDTA:ta sekä kalsiumioneja, ensisijassa sellaisina konsentraatioina, ettäEDTA:ta on 5 mmol/1 ja kalsiumklori-dia on 25 mmol/1, sekä lämmitetään sakkaroosi (60 g/100 g) - glysiini (2 moolia/1)-seoksessa 60°C:seen ja pidetään täs-20 sä lämpötilassa 10 tunnin ajan.

Jotta saadaan tekijöiden II, VII, IX ja X natiivi ja aktiivinen konsentraatti, sekoitetaan plasma- tai istuk-kajae, tarkoituksenmukaisesti yksi jae, joka on stabiloitavien tekijöiden suhteen rikastettu, kelaatinmuodostajien 25 seoksen, lähinnä EDTA:n ja kalsiumionien kanssa, ensisijassa konsentraatiosuhteissa 5 mmol/1EDTA:ta sekä 25 mmol/1 kalsiumioneja. Antitrombiini III:n, lähinnä 0,2 E/ml, sekä hepariinin, lähinnä 2 USP-E/ml, lisäyksen jälkeen seos lämmitetään 60°C:seen sakkaroosi (60 g/100 g)-glysiini (2 moo-30 lia/1)-seoksessa ja pidetään tässä lämpötilassa 10 tuntia.

Sellainen jae saadaan esimerkiksi Soulierin et ai. menetelmän mukaisesti; Thrombosis Diath. Haemorrh. Suppl. 35, 61 (1969). Tämän lisäksi adsorboidaan plasma, joka on saatu 6 81363 verestä, jonka hyytyminen on estetty EDTArlla (0,01 moo-lia/1), kalsiumfosfaattiin sekä poistetaan sentrifugoi-malla. Tällöin tekijät sitoutuvat kvantitatiivisesti ad-sorbenssiin ja ne voidaan saada eluoimallamonta kertaa tri-5 natriumsitraatilla (0,2 moolia/1). Yhdistetyt eluaa-it puhdistetaan edelleen yhdistetyn alkoholi- ja etikkahappo-saostuksen avulla -8°C - +4°C:ssa. Tällöin tekijät konsentroidaan samanaikaisesti.

Konsentraatti otetaan sopivaan puskuriin, edulli-1Q sesti keittosuola/natriumsitraattiin (0,06 ja vastaavasti 0,02 moolia/1, ja pH 7,5).

Hyytymistekijöiden takaisinsaanti ja puhdistus kuumennetusta liuoksesta voidaan suorittaa myös saostanalla ammoniumsulfaatin 30-45-% : isessakyllästyksessä, adsorboi-15 maila vapaa liuos kalsiumfosfaattiin (0,4-1 g/100 ml) sekä eluoimalla.

Tekijöiden II, VII, IX sekä X puhdistus- sekä ri-kastustoimenpiteiden kontrollointiin tutkijat ovat perehtyneet kyseessä olevien aineiden määritysmenetelmien tun-2Q temuksen perusteella. Näitä kontrollimenetelmiä käyttämällä voidaan menettelyedellytykset ohjata tuotteen tyydyttävän saannon ja tyydyttävän puhtauden huomioiden.

Tekijä II voidaan määrittää esimerkiksi von Koller, F. et al.:n menetelmän mukaisesti, Dtsch. Med. Wschr. 81, 25 516 (1956). Tätä varten sekoitetaan plasmaa, esimerkiksi 0,1 ml plasmaa, josta puuttuu tekijä II, sekä osa leiimen-nettua normaaliplasmaa keskenään. Tämän jälkeen lisätään kaksi osaa kalsiumpitoista tromboplastiinia, joka on valmistettu esimerkiksi DE-patenttijulkaisun 30 2 356 493 mukaisesti, sekä määritetään hyytymään muodostu miseen kuluva aika. Kvantitatiivista määritystä varten luetaan tekijän II sisältävällä liuoksella saatu hyytymisaika normaaliplasman laimennussarjän avulla saadulta kalibroin-tikäyrältä.

35 Yksi yksikkö tekijää II vastaa 1 ml:n normaaliplas maa sisältävää tekijä II:n aktiivisuutta.

Il 7 81 363

Tekijä VII voidaan määrittää esimerkiksi Koller, F. et al.:n menetelmän mukaisesti; Acta haemat. 6, 1 (1951). Tätä varten sekoitetaan osa, esimerkiksi 0,1 ml plasmaa, josta puuttuu tekijä VII, sekä osa laimennettua 5 normaaliplasmaa. Tätä seosta pidetään 30 sekunnin ajan 37°C:n 1 ämpöhauteessa. Tämän jälkeen lisätään kaksi osaa kalsiumpitoista tromboplastiinia, joka on valmistettu esimerkiksi DE-patenttijulkaisun 2 356 493 mukaisesti, sekä määritetään aika, joka kuluu hyytymän muo-10 dostumiseen. Kvantitatiiviseksi määrittämiseksi luetaan tekijän VII sisältävällä liuoksella saatu hyytymisaika normaaliplasman laimennussarjalla saadulta kalibrointi-käyrältä .

Yksi yksikkö tekijää VII vastaa 1 ml:n normaali-15 plasmaa sisältävää tekijä VII aktiivisuutta.

Tekijän IX määritys suoritetaan esimerkiksi seuraa-van menetelmän avulla: 1 osa, esimerkiksi 0.1 ml osittaista tromboplastiinia, joka on valmistettu esimerkiksi DE-patentti julkaisun 2 316 430 mu-20 kaisesti, sekoitetaan yhden osan kanssa laimennettua normaali-tekijä IX, sekä yhden osan kanssa laimennettua normaali-plasmaa. Tätä seosta pidetään 6 minuutin ajan 37°C:ssa.

Sen jälkeen kun on lisätty 3 7°C: seen esilämmitettyä 0,025-molaarista kalsiumkloridiliuosta, määritetään aika, joka 25 kuluu kalsiumkloridiliuoksen lisäämisestä hyytymän muodostumiseen. Kvantitatiivista määritystä varten luetaan tekijää IX sisältävällä liuoksella saatu hyytymisaika normaaliplasman laimennussarjalla saadulta kalibrointikäyräl-tä.

30 1 kansainvälinen yksikkö (= 1 IE) tekijää IX vastaa 1 ml:n normaaliplasmaa sisältämää tekijä IX:n aktiivisuutta.

Tekijä X voidaan määrittää esimerkiksi Duckert et al.:n menetelmän mukaisesti; Blood Coagulation, Hemorrhage and Thrombosis, julk. Tocantins, L.M. ja Kazal, L.A. (1964). 35 Tätä varten sekoitetaan esimerkiksi 0,1 ml plasmaa, josta 8 81 363 tekijä X puuttuu, sekä 1 osa laimennettua normaaliplas-maa. Tätä seosta pidetään 30 sekunnin ajan +37°C:ssa.

Tämän jälkeen lisätään kaksi osaa kalsiumpitoista trombo-plastiinia, joka on valmistettu esimerkiksi DE-patenttijulkai-5 sun 2 356 493 mukaisesti, sekä määritetään aika, joka kuluu hyytymän muodostumiseen. Kvantitatiivista määritystä varten luetaan tekijän X sisältävällä liuoksella saatu hyytymisaika normaaliplasman laimennussarjän avulla valmistetulta kaiibrointikäyrältä. Yksi yksikkö tekijää X 10 vastaa 1 ml:n normaaliplasmaa sisältämää tekijän X aktiivisuutta.

Hepatiittivirusten tappamiseksi lisätään liuokseen kalsiumioneja, EDTA:ta, glysiiniä sekä sakkaroosia ja mahdollisesti antitrombiini III:a sekä hepariinia ja liuosta 15 kuumennetaan.

Humaaniplasman pastöroinnin jälkeen (10 tuntia, 60°C), sakkaroosin (60 g/100 g) ja glysiinin (2 moolia/1) lisäyksen jälkeen sekä kalsiumkloridin (25 mmoolia/1) ja EDTArn (25 mmoolia/1) lisäyksen jälkeen saatiin seuraavat aktiivi-20 suudet käytetyn plasman suhteen: F II 90 %, F VII 85 %, F IX 83 %, F X 80 %.

Erilaisten stabilisaattoreiden vaikutus yksityisten protrombiinitekijoiden aktiivisuuden säilymiseen plasma-tai istukkajakeessa kuumennuksen yhteydessä on nähtävissä 25 taulukossa I. Pastörointi yksinään sakkaroosin ja glysiinin kanssa antaa huonon F IX:n saannon. Tämä on kuitenkin hyvin haitallista, koska protrombiini-konsentraattia etupäässä käytetään hemofiilia B:n hoitoon. Kalsium-ionien lisäkäyttö ilman kelaatinmuodostajaa, konsentraaticna 30 6,25 mmol/1, johtaa F VII:n sekä F IX:n aktivoitumiseen sekä vähentää myös F II:n sekä F X:n saantoja. Sellainen valmiste ei soveltuisi ihmisellä käytettäväksi mahdollisen tromboosivaaran vuoksi. Käyttämällä EDTA:ta ilman kalsium-ioneja, konsentraationa 5 mmoolia/1, sakkaroosin ja 35 glysiinin rinnalla saadaan hyvien F II :n ja F VII :r, saanto-

II

9 81363 jen rinnalla huonoja F IX:n ja F X:n saantoja. Yksinään antirombiini III:llä, hepariinilla, sakkaroosilla ja glysiinillä eivät protrombiini-tekijät ole stabiloitavissa.

Parhaan tuloksen antaa kalsiumionien yhdistelmä EDTA:n kanssa täydennettynä antitrombiini III:lla sekä hepariinilla sakkaroosin ja glysiinin kanssa. Näissä olosuhteissa ovat kaikkien neljän tekijän saannot suuruusluokaltaan noin 80 % , ja valmiste ei sisällä aktivoituja tekijöitä eikä trombiinia.

Hyytymistekijöiden konsentraatiot vesiliuoksessa, jolla kuvattu menetelmä on pantu täytäntöön, ovat erityisesti seuraavilla alueilla:

Tekijä II 0,3-50 E/ml

Tekijä VII 0,3-30 E/ml 15 Tekijä IX 0,5-60 E/ml

Tekijä X 0,4-60 E/ml

Erityisen edullisia ovat alueet 0,5-25, 0,5-15, 0,7-30 sekä 0,6-30 tekijöille II, VII, IX tai X.

Konsentraattina pidetään tavallisesti liuosta, jo-20 ka sisältää vaikuttavia aineita - siis kyseessä olevassa tapauksessa hyytymistekijöitä - korkeampina konsentraatioi-na kuin luonnolliset lähtömateriaalit.

ίο 81363 C :0

Q) -P

ω χ; X :3 3 h n o o r-~ n G X ^ ^ in oo n G rd tl C Pm

E -H

3 0) 3 -

X <#> X

h m -P ή m oo in c (N ϋ 'f m <f GO O Pm 3

3 o Q) tl) β +J •H X

> ' 3 H

•H X W H

•h > oo 4-> >h n in .μοβ m X oo in X <—I ·Η Pm 3 id ' I—) in id

•H G 3 H

Sdl-HM ro r~- ΓΟ IN IN

>i <D P oo ·π* r-- r- -P (1) Pm Γ>ί Ή -P >i :3 3 K 'n β G ^ •S e p w

3 J I I I IN <N

^ C/) ®

H

O H ,

λ; He IN CN

X III -- 5 gw 3 - id E-ι ^ 3 < 3

H n I I m in I

Q p ω g -P 3

CD Ή -P

05 -PJ '— -H

,Χ -H 3 O

>i G -H in >

:3 O H I in I m I -H

tn ·η o * ni +j

HIO IP X

•3 3 e 3 u e

II

•Hi—I ·

G --. -P

•H 3 X

H -H 3 tn h

>1 o <N (N (N CN IN

H O

o e

•H

in cp

O

O o MO o o o o o

Id I—I ID lO ID ID ID

X \

X CP

3 05 li 81363

Jatkopuhdistusta varten kuumennettu liuos voidaan mahdollisesti sentrifugoida. Epäpuhtaudet voidaan poistaa saostamalla ammoniumsulfaatin 30-45-%:isessa kyllästyksessä.

Jäljelle jäänyt liuos voidaan sitten absorboida kalsiumfosfaattiin, jota käytetään 0,04-1,0 g/100 ml liuos-5 ta, kuormitettu adsorbenssi pestään, eluoidaan sitraatti- puskurilla ja eluaatti dialysoidaan.

Ihmisillä suoritettavaa käyttöä varten tuote voidaan steriloida suodattamalla.

Tällä menetelmällä saatavissa oleva tekijä II-, VII-, 10 IX- sekä X-valmiste on vapaa aktiivisista viruksista.

Varastointipysyvyyden lisäämiseksi on tarkoituksenmukaista lisätä valmisteeseen proteiinia stabiloivia aineita, esimerkiksi proteiineja, aminohappoja tai hiilihydraatteja. Lopuksi voidaan tällä tavalla käsitelty valmiste 15 asettaa käyttöön kylmäkuivatussa muodossa, jolloin hyytymistä estävien aineiden, kuten esimerkiksi hepariiniin lisäys voi olla edullista.

Keksinnön mukaisesti valmistettu tuote, erityisesti konsentraatin muodossa on farmaseuttiseen annosteluun soveltuvas-20 sa liuoksessa hyytymisvajauksen hoitoon soveltuva lääkeaine ja sitä voidaan käyttää suonensisäisesti, edullisesti infuusiona, tekijöiden puutteesta johtuvien verenvuotojen hoitoon ja ehkäisyyn.

Lyofilisoidun, hyytymisaktiivisen plasman muodossa 25 pastöroitu tuote poistaa tuoreena jäädytetyn plasman haitat, esim. veren tilavuutta täytettäessä, ylläpidettäessä onkoottista painetta, verenhukan korvaamiseksi suurten leikkausten ja onnettomuuksien jälkeen, shokin erilaisia muotoja hoidettaessa sekä loukkaantumisten ensiavun yhtey-30 dessä.

Keksintöä valaistaan seuraavin esimerkein.

Esimerkki 1 1000 ml humaani-sitraattiplasmaa lämmitettiin 25-30°C:seen samalla sekoittaen ja siihen lisättiin 20 ml liuos- i2 81 363 ta, jossa oli 1,86 g EDTA:ta, ja jonka pH oli säädetty 7,8:ksi 2N NaOH:lla. 10 minuuttia myöhemmin sekoitettiin 30°C:seen lämmitettyyn liuokseen 1000 g sakkaroosia. Sakkaroosin liukenemisen jälkeen lisättiin hitaasti ja samalla 5 sekoittaen 150 g kiteistä glysiiniä; sen jälkeen kun liukeneminen oli täydellinen, lisättiin 25 ml 1 molaarista CaC^-liuosta, jonka pH oli säädetty 7,2:ksi 2N IJaOH:lla. Stabilisaattorien avulla 1,7 l:ksi täytetty liuos kuumennettiin 60°C:seen vesihauteessa 10 tunnin ajan, ja liuos 1Q oli myös kuumennuksen jälkeen kirkas.

Stabilisaattorien poistaminen.

Pastöroidun liuoksen jäähdyttämisen jälkeen se suodatettiin kirkkaaksi 3,0 ja 1,2 p:n Sartorius-membraani-suodattimen kautta; sitten liuos laimennettiin sitraatti-15 NaCl-puskurilla (0,01 moolia/1 tri-Na-sitraattia pH 7,5; Q,06 moolia/1 NaCl) 5 litraksi sekä samanaikaisesti konsentroiden dialysoitiin ultrasuodattimella 5 litraa vastaan puskuria, jolla oli samanlainen koostumus, sekä väke-voitiin 1000 ml:ksi.

2Q Sen jälkeen kun plasman lähtötilavuus 1000 ml saa vutettiin, suodatettiin kirkas liuos Sartorius-membraani-suodattimen kautta puhtaaksi ja steriiliksi, täytettiin 50 ml:n tilavuuteen sekä lyofilisoitiin. 50 ml:aan tislattua vettä liuotetussa kuiva-aineessa oli seuraavat aktii-25 visuudet standardi-humaaniplasmaan nähden: F II 87 %, F VII 31 %, F IX 83 %, F X 80 %.

Esimerkki 2 _ (r)

Protombiini-tekijoiden saanti DEAE-Sephadexilla ^ suoritetun adsorption sekä eluoinnin avulla. 550 1 sitraat-30 tiplasmaa sekoitettiin DEAE-Sephadex ® A 50:n (0,6 g/1) kanssa, joka fysiologisessa keittosuolaliuoksessa sisälsi 5 mmoolia/1 EDTA: ta ja jonka pH oli tasapainotettu 6:ksi. Adsorption aikaansaamiseksi suspensiota sekoitettiin 60 minuutin ajan 15°C:ssa. Adsorbenssin sedimentoinnin jälkeen 35 yläpuolinen liuos poistettiin lapon avulla ja DEAE-Sepha-dex ®, johon tekijät olivat adsorboituneet, pestiin 50

II

i3 81 363 litralla fysiologista keittosuolaliuosta, joka sisälsi 5 mmoolia/1 EDTAita, niin kauan kunnes se ei enää sisältänyt epäpuhtausproteiineja. Sitten adsorbenssia sekoitettiin 7 litran kanssa 1 molaarista NaCl (pH 8) , joka 5 sisälsi 5 mmoolia EDTA:ta; adsorbenssi poistettiin sentri-fugoiden sekä heitettiin pois.

2. Pastörointi

Yläpuoliseen liuokseen lisättiin 0,2 E AT III/ml ja 2 E/ml hepariinia. Sitten lisättiin 1050 g kiinteää glysiiniä, 1Q ja sen jälkeen kun tämä oli liuennut, 2 5,7 g CaC^. 21^0, siten että se vastasi loppukonsentraatiota 25 mmoolia/1. Vakio pH-arvon 7,2 saavuttamisen jälkeen liuos kuumennettiin 30-37°C:seen ja siihen lisättiin 10,5 kg sakkaroosia (loppukonsentraatio noin 60 g/100 g liuosta). Sen jälkeen 15 kun tämän erittäin viskoosisen liuoksen pH-arvo vielä kerran säädettiin 7,2 reen, kuumennettiin liuosta vesihauteessa 10 tunnin ajan 60°C:seen.

3. Ei-toivottujen proteiinien saostus ammonium-sulfaattisaostuksen avulla 2Q Pastöroitu liuos, noin 14 litraa, jäähdytettiin huo neen lämpötilaan sekä lisättiin 31,5 litraan tislattua vettä, joka sisälsi 334 g CaC^ ' 2H2O, mikä vastasi loppukonsentraatiota 50 mmoolia/1.

Tähän protrombiini-tekijoiden liuokseen lisättiin pH 25 7,5:ssä 24,5 1 kyllästettyä ammoniumsulfaattiliuosta; saostu ma poistettiin sentrifugoiden sekä heitettiin pois.

4. Protrombiini-tekijoiden viimeinen puhdistus kal-siumfosfaattiin suoritetun adsorption avulla

Yläpuolinen liuos, joka sisälsi protombiini-tekijät, 30 sekoitettiin 700 g:n kanssa kiinteää Ca^PO^^ pH 7,6:ssa, ja sitä sekoitettiin 20-30 minuuttia huoneenlämpötilassa. Kalsiumfosfaatti otettiin sentrifugoimalla sekä pestiin kolme kertaa 20 litralla liuosta, jossa oli 0,5 moolia/1 NaCl sekä 1 g/100 ml glysiiniä, pH 7,6.

35 Protrombiini-tekijoiden eluutio adsorbenssista suo- i4 81 363 ritettiin 750 ml :11a puskuria, jossa oli 0,2 mooli/L tri-natriumsitraattia, 0,15 moolia/1 NaCl, 1 g/lOQ ml gly-siiniä, 0,6 E/ml AT III sekä 28 E/ml hepariinia (pH noin 7,5), sekä sekoittamalla (20 minuuttia) huoneen lämpötilas-5 sa. Eluaatista poistettiin karkeat partikkelit sentrifu-goimalla 3000 g:ssä.

5. Valmisteen viimeistely

Yläpuolinen liuos sekoitettiin 0,15 g/100 ml:n kanssa aerosolia, ja siitä erotettiin kiinteät aineet 10 suorittamalla ultrasentrifugointi 30 000 g:ssä. Kirkkaaseen yläpuoliseen liuokseen lisättiin noin 0,6 g humaani-albumiinia 100 ml:aa kohti nestettä, jonka pH oli säädetty 6,8:ksi, ja sitä dialysoitiin 3 tunnin ajan 50 litraa vastaan fysiologista keittosuolaliuosta. Liuos säädettiin 15 60 E:hen F IX:a, 60 E:hen F II:a, 50 E:hen X:a sekä 25 E:hen F VII:a, steriloitiin suodattamalla, jaettiin 5 ml:n tilavuuksiin sekä lyofilisoitiin.

li

Claims

15 81 363

1. Menetelmä veren hyytymistekijöiden II, VII, IX sekä X käytännöllisesti katsoen viruksettoman sekä hepa- 5 tiitin suhteen turvallisen valmisteen valmistamiseksi läm mittämällä näitä tekijöitä sisältävää vesipitoista liuosta, aminohapon ja sakkaridin läsnäollessa, tunnet-t u siitä, että lämmitys suoritetaan kalsiumionien (1 -50 mmol/1) sekä kelaatinmuodostajan (1-20 mmol/1) ja 10 mahdollisesti antitrombiini III:n (0,2 - 2 E/ml) ja/tai hepariinin (2-20 USP-E/ml) läsnäollessa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kalsiumionien konsentraatio on 25 - 50 mmoolia/1.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kelaatinmuodostaja on ali-faattinen atsa-tri- tai -tetra-karboksyylihappo, jossa on 6-20 hiiliatomia sekä 1 tai 2 typpiatomia, tai sen liukoinen alkalisuola.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kelaatinmuodostajan konsentraatio on 5 mmoolia/1.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että antitrombiini III:n, heparii- 25 nin, kalsiumionien (25 - 50 mmoolia/1), EDTArn, glysiinin, alaniinin tai seriinin (1-3 moolia/1) ensisijassa glysiinin, sekä sakkaridin liuoksen (20 - 60 g/100 g liuosta), ensisijassa glysiinin (1-3 moolia/1) sekä sakkaroosin (20 - 60 g/100 g liuosta) läsnäollessa lämmitetään 30 30 - 100°C:n lämpötilaan, ensisijaisesti 60 - 100°C:seen 1 minuutin - 48 tunnin ajan, etupäässä 8-12 tunnin ajan.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vesipitoinen liuos on sit-raattiplasma tai jokin plasma- tai istukkajae.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vesipitoinen liuos on tekijöiden II, VII, IX sekä X konsentraatti. 16 81 363