NO148340B - Fremgangsmaate og reagens for bestemmelse av substrater eller enzymaktiviteter i naervaer av ascorbinsyre - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte ved bestemmelse av substrater eller enzymaktiviteter under anvendelse av en red/ox-reaksjon som målereaksjon.

I den kliniske og farmasøytiske kjemi, biokjemien og nærings-middelkjemien, er red/ox-reaksjonen for bestemmelse av enzym- hhv. substratkonsentrasjoner av stor interesse. Anvendelsen av disse reaksjoner kan følges ved fotometriske målinger. Er der i for-søkssystemet foruten de interesserende Redox-deltagere tilstede bare ytterligere reduserende forbindelser, må der regnes med forstyrrelser. Særlig hyppig finnes ascorbinsyre i prøvematerialet. Den gir som sterkt reduksjonsmiddel, foranledning til forstyrrelser, når farmasøytiske midler eller fysiologiske væsker, som serum eller urin, ascorbinholdige plantesafter eller andre nærings-midler som inneholder eller er tilsatt ascorbinsyre, skal under-søkes. Det er således kjent at følgende reaksjoner forstyrres av ascorbinsyre: A. Reaksjoner ved hvilke H^O^ og en hydrogendonator omsettes med peroxydase (POD), forstyrres ved reaksjonen:

ascorbinsyre + H202 POD> dehydroascorbinsyre + H.,0

B. Reaksjoner ved hvilke tetrazoliumsalter reduseres med reduk-sjonsmidler til formazaner, forstyrres ved reaksjonen: ascorbinsyre + tetrazoliumsalt ^formazan + dehydroascorbin syre . C. Reaksjoner ved hvilke fenoler kobles oxydativt med nucleofile reagenser, forstyrres ved at ascorbinsyre på ennu ikke klarlagt vis fører til bireaksjoner, slik at uenhetlige koblingsprodukter dannes, som i deres absorpsjonsforhold i normalt og UV-lys avviker fra de vanligvis dannede koblingsprodukter.

Ror å fjerne ascorbinsyren fra prøvematerialet er de vanlige oxydasjonsmetoder som regel uegnet. Oxydasjonsmidler angriper også substrater og enzymer og ødelegger dem. Deres reaksjonsprodukter, for det meste to- eller tre-verdige metallioner, hemmer ofte enzymene som anvendes i indikatorreaksjonen. Ødeleggelsen av ascorbinsyre med oxygen krever sterkt alkalisk miljø, f.eks. 25%-ig natriumhydroxyd. Dette fører likeledes til ødeleggelse av substrater og enzymer.

Til grunn for foreliggende oppfinnelse ligger den oppgave å fremskaffe en fremgangsmåte for bestemmelse av substrater eller enzymaktiviteter under anvendelse av en red/ox-reaksjon som målereaksjon, som ikke lengre forstyrres av ascorbinsyre.

Ifølge oppfinnelsen løses denne oppgave ved at reaksjons-satsen tilsettes ascorbatoxydase.

Ascorbatoxydase katalyserer reaksjonen:

,. , , /o _ ascorbatoxydasev , , , , . , TT _ ascorbinsyre + 1/2 02 > dehydroascorbinsyre + H^ O

Ifølge opplysninger i litteraturen om ascorbinsyre-oxydase vil det ventes at dette enzym ikke lar seg anvende for formålet ifølge oppfinnelsen. Alle hittil utvundne enzympreparater produserer nemlig i en bireaksjon H^O^. Samtidig undergår ascorbatoxydasen en meget hurtig inaktivering, hvilket tilskrives den samtidige dannelse av H202 (Biochemical Copper Proceedings Symposium Harriman New York 1965, s. 305-337)• Dette gjelder

også for de mest rene preparater, som i ultrasentrifuge og ved elektroforese ikke lenger viser noen forurensninger (Biochem. 4» 1362-1370 (1965)). Reaksjonsinaktiveringen tilbakeføres til ^Omdannelsen (Biochem. Biophys. Acta 56, 427-439 (1962)). Efter beregninger av de sistnevnte forfattere kan 1 U ascorbatoxydase i 1 mmol/l ascorbinsyreoppløsning produsere 0,7-10~ mmol/l H,,02. Slike ascorbatkonsentrasjoner er hyppig tilstede i prøveoppløs-ninger. Det dannede H202 står uten videre til forføyning for enzymatiske reaksjoner, som f.eks. er påvist for katalase.

I syst emet:

hydrogendonator + H202<P0D> > farvastoff + 2 H20

for fotometrisk påvisning av HO bevirker det ved en molar ekstinksjonskoeffisient på ca. 20 cm 2/uraol en ekstinksjonsdiffer-anse på 0,l4. Da måleområdet ved normale fotometriske reaksjoner

strekker seg fra 0,01 til 1,00, bevirkes herved en ikke god-tagbar feil. På lignende måte forstyrres reaksjoner ved hvilke der istedenfor H,,02 anvenc^es organiske hydroperoxyder og istedenfor POD anvendes hemoglobin eller andre oxydasjonskatalysa-to rer.

Men bortsett fra disse feil fremkalt av hydrogenperoxyd,

var der fra de sistnevnte av de ovenfor anførte publikasjoner kjent at omsetningen av ascorbinsyre stanser allerede lenge før dens fullstendige fjernelse.

Særlig graverende måtte dette være ved alle slike red/ox-reaksjoner ved hvilke der dannes H^ O^, da dette H^O^ jo på den ene side måtte påskynde inaktiveringen av enzymet enda mere, og på den annen side må nydannelsen av av ascorbatoxydase selv føre til fullstendig uoversiktige resultater. Det er derfor høyst overraskende at det mot forventningene er mulig fullstendig å fjerne forstyrrelsene som beror på nærvær av ascorbat ved ascorbatoxydasetilsetningen, uten at andre forstyrrelser opptrer, som tilintetgjør fordelene ved ascorbatfjernelsen.

Foreliggende oppfinnelse bygger på det forhold at ascorbat-oxydase fra Cucurbita pepo medullosa ikke danner H,0, ved omset-ning av ascorbinsyre med luft-oxygen til dehydroascorbinsyre ved hvilken reaksjon det ellers foruten vann dannes betraktelige mengder av H2°2' Der var' før foreliggende oppfinnelse, ingen publikasjoner som tydet på at Cucurbita pepo medullosa inneholdt en ascorbatoxydase som ikke førte til H202-dannelse ved spaltning av ascorbinsyre. Det henvises i denne forbindelse til Oxidases and Related Redox Systems, 1965, hvor på side 222 dannelsen av H2°2 er beskrevet og på side 224 anvendelsen av Cucurbita pepo medullosa som utgangsmateriale er angitt.

I Biochemistry 1965 er det på side 1362 igjen omtalt anvendelse av Cucurbita pepo medullosa og på side 1369 dannelsen av H202.

\

Oppfinnelsen angår således en fremgangsmåte ved kvantitativ bestemmelse av substrater eller enzymaktiviteter i nærvær av ascorbinsyre slik at ascorbinsyren ikke forstyrrer bestemmelsen når det anvendes en red/ox-reaksjon som målereaksjon, som ved bestemmelsen hvor det anvendes et I^C^-dannende enzym, et tetrazoliumsalt eller en fenol som kan koples oxydativt med nucleofile reagenser, hvilken fremgangsmåte er kjennetegnet ved at der arbeides i nærvær av en ascorbatoxydase som ikke danner H202, i en mengde på 0,002 - 100 U ascorbatoxydase/ml testprøve og ved en pH-verdi mellom 4,0 og 8,5.

Fortrinnsvis anvendes foreliggende fremgangsmåte ved enzymatiske reaksjoner, særlig slike ved hvilke ^ £<>2. dannes, altså ved reaksjoner som katalyseres ved oxydaser som glucoseoxydase, uricase, cholesterinoxydase og lignende, videre ved reaksjoner ved hvilke tetrazoliumsalter reduseres og ved reaksjoner ved hvilke fenoler kobles oxydativt med nucleofile reagenser. Den tilsatte ascorbatoxydasemengde retter seg efter størrelsen av den •ventede ascorbinsyremengde i prøven. Som regel anvendes 0,002 til lOO U ascorbatoxydase/ml, fortrinnsvis 0,01 til 30 U/ml forsøksmateriale. Reaksjonens pH-verdi retter seg i første linje efter den pH-verdi som er nødvendig for det eller de andre del-tagende enzymer. pH-verdier mellom 4,0 og 8,5 har vist seg egnet for foreliggende fremgangsmåte. Særlig foretrukket ved foreliggende oppfinnelse er anvendelsen av en ascorbatoxydase fra Zucchini (Cucurbita pepo medullosa). Men også ascorbatoxydase fra andre kilder er egnet.

En videre gjenstand for oppfinnelsen er et reagens for kvantitativ enzymatisk bestemmelse av substrater eller enzymaktiviteter og inneholdende et system for bestemmelse av et substrat eller enzym ved en red/ox-reaksjon som målereaksjon, som kjennetegnes ved at det dessuten inneholder en ascorbat-oxydase som ikke danner H,,02, i en mengde på 0,002 - 100 U ascorbatoxydase/ml testprøve og ved en pH-verdi mellom 4,0 og 8,5.

Foretrukne reagenser av denne type inneholder, i tilfelle glucose er substratet som skal bestemmes, peroxydase, glucoseoxydase, o-dianisidin eller azino-di-3-ethylbenzylthiazolin-sulfonat (6) sammen med puffer eller hexokinase, glucose-6-fosfatdehydrogenase, diaforase, NADP, et tetrazoliumsalt slik som: 3-(4-jodf enyl)-2-(4-nitrof enyl)-5-f enyl-2H-tetrazoliumklorid (INT) og puffer. Når urinsyre er substratet som skal bestemmes, består systemet fortrinnsvis av peroxydase, uricase, en fenol som f.eks. 2,4-diklorfenol, aminoantipyrin og puffer. I tilfelle glutamat-bestemmelse består systemet fortrinnsvis av glutamatdehydrogenase, diaforase, NAD, INT og puffer. For tyrosin foretrekkes tyrosinase, 3-methyl-6-kaliumsulfonyl-benzthiazolonhydrazon(2), for pyrocate-chinbestemmelsen difenoloxydase, 3-methyl-6-kaliumsulfonyl-benz-thiazolonhydrazon(2), i hvert tilfelle sammen med puffer. Alle disse systemer for bestemmelse av substrater er imidlertid kjente. Istedenfor dem kan imidlertid også andre kjente systemer for bestemmelse av substrater eller enzymer anvendes innenfor rammen av reagensene ifølge oppfinnelsen.

Av særlig betydning er oppfinnelsen også for anvendelsen på området hurtigdiagnostikk. Slike hurtigdiagnostika inneholder som regel de forskjellige reagenser som er nødvendige for gjennom-føring av fremgangsmåten, enten impregnert i en oppsugningsdyktig bærer eller som et overtrekk anbrakt på en bærefolie med et egnet bindemiddel. Den foretrukne utførelsesform er herved tilsetning av ascorbatoxydasen til blandingen av de øvrige reagenser med påfølgende impregnering på en oppsugningsdyktig bærer. På denne måte fåes f .eks. testpapirer som ikke forstyrres av tilstedeværende ascorbinsyre for påvisning av glucose i urin (f.eks. ifølge DT-OS 23 38 932), av blod i urin (f.eks. ifølge P 24 6o 903-8 eller DBP 22 35 152) og av blod i avføring. At ascorbatoxydasen i testpapirene for blod i urin forblir funksjonsdyktig og lager-stabil, må ansees som høyst overraskende. Disse testpapirer inneholder nemlig overskuddsmengder av organiske hydroperoxyder, av hvilke man skulle vente en inaktivering av ascorbatoxydasen i likhet med den av ^ 2®2'

Ascorbatoxydasen kan imidlertid også anbringes på en adskilt bærer, som er forenet med bæreren for de øvrige reagenser, eksem-pelvis pålagt , påklebet eller forseglet sammen. Særlig foretrukket som bærer for ascorbatoxydasen er i dette tilfelle et såkalt vannoppløselig papir (f.eks. ifølge DT-OS 24 36 598), som særlig godt gjør det mulig å observere farvereaksjonen av de andre reagenser på bærerpapiret. Denne utførelsesform er særlig fordelaktig når der i reagenskombinasjonen er tilstede stoffer som er uforlikelige med ascorbatoxydasen, f.eks. sure reagenser,

slik som de anvendes ved fremgangsmåtene for bestemmelse av uro-bilinogen, bilirubin og nitrit.

Ved de ovenfor angitte utførelsesformer anvendes inntil

5000 U ascorbatoxydase pr. ml impregneringsoppløsning, fortrinnsvis inntil 2000 U/ml impregneringsoppløsning for reagensfremstillingen. Under 1 U/ral sikrer i alminnelighet ikke den tilstrebede virkning.

Dessuten kan også adskilte soner på bærermaterialet impregneres med ascorbatoxydasen, hhv. med andre testreagenser. I dette tilfelle blir fortrinnsvis bæreren brakt i berøring med oppløs-ningen som skal undersøkes ved at oppløsningen først kommer i berøring med den ascorbatoxydaseholdige sone og derfra suges ut i sonen som inneholder de øvrige testreagenser.

Ifølge en videre utførelsesform bindes ascorbatoxydasen til bærermaterialet ved kjente metoder for enzymfiksering til uopp-løselige bærere. Egnede metoder er kjent fra DT-offentliggjørelses-skrifter 17 68 512, 21 28 743, 22 6o 185, 22 6o 184, 24 26 988, 26 03 158 og 19 15 970.

Foretrukne metoder for foreliggende fremgangsmåte er glucose-bestemmelsen med peroxydase og glucoseoxydase og o-dianisidin eller 2,2'-azino-di-3-ethylbenzthiazolinsulfonat-(6) (ABTS), glucose-bestemmelsen ved hexokinase/glucose-6-fosfatdehydrogenase-metoden, påvisningen av urinsyre ved hjelp av fenol, aminoantipyrin, peroxydase og uricase, bestemmelsen av tyrosin eller pyrocatechin ved hjelp av SMBTH (4-methyl-6-kaliumsulfonyl-benzthiazolon-hydrazon-(2) og tyrosinase hhv. difenoloxydase.

De følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen ytterligere.

Eksempel 1

. Bestemmelse av glucose med o-dianisidin, peroxydase (POD) og glucoseoxydase (GOD), målt i fotometer, bølgelengde 432 nm, måle-tein perat ur 25°C.

Kyvette 1 tilsvarer en uforstyrret måling (ingen ascorbinsyre) .

Kyvette 2 og 3 viser at 1, hhv. 0,1 umol ascorbat hemmer testen praktisk talt fullstendig, hhv. 4l»5%, kyvette 4 og 5 viser den fullstendige eliminering av denne ascorbatkonsentrasjon ved tilsetning i hvert tilfelle av 10 U ascorbatoxydase.

Eksempel 2

Påvisning av glucose med 2,2'-azino-di-[3~ethyl-benzthia-zolihsulfonat(6)] (ABTS), POD og GOD i fotometer, bølgelengde 432 nm, måletemperatur 25°C.

Kyvette 1 tilsvarer en uforstyrret måling (intet ascorbat). Kyvette 2 og 3 viser at 0,1 hhv. 0,01 umol ascorbat hemmer testen fullstendig, hhv. med 21%.

Kyvette 4 og 5 viser den fullstendige eliminering av denne ascorbatkonsentrasjon i hvert tilfelle med 10 U ascorbat-oxydase .

Eksempel 3

Påvisning av urinsyre ved hjelp-av fenol, aminoantipyrin, POD og uricase ved analyseautomater ("AutoAnalyzer").

Testprinsipp

Urinsyre + Q>2 + Vi£> <uricase> y allantoin + H202

2 H202 + 2,4-diklorf enol + 4-aminoantipyrin ■■^0D > kinoider farvestoff + 2 H20

Fremstilling av oppløsningene

1. Ascorbat-oxydase-reagens

I 6oo ml dobbeltdestillert vann oppløses innholdet av en flaske 11. Tilsetning av 0,3 ml Brij -35. Holdbar i mørk flaske ved ca. 4°C i 4 uker, ved ca. 25°C i 1 uke.

2. Uricase-reagens

I 800 ml dobbelt destillert vann oppløses innholdet av en flaske 2. Tilsetning av 2,0 ml Brij -35. Holdbar i mørk flaske ved ca. 4°C i 4 uker, ved ca. 25°C i 1 uke.

Konsentrasjonene av oppløsningene

1. 50 mM fosfatpuffer, pH 5,6

Ascorbatoxydase ^i de på fig. 2 angitte mengder.

2. 31 mM tris/citronsyre, pH 8,9

Uricase ^-0,08 u/ml

POD >0,015 U/ml

3,0 mM 2,4-diklorfenol, 4,0 mM 4-aminoantipyrin

Ved utførelse av bestemmelsen kobles slangesystemet av automat som vist i flytdiagrammet på fig. 1.

Fig. 2 viser en grafisk fremstilling av resultatene av forsøkene.

Eksempel 4

Påvisning av glucose med HK/G6P-DH, NADP, INT og diaforase i fotometer. Målebølgelengde 492 nm, inkubasjonstemperatur 25°C.

Kyvette 1 tilsvarer en uforstyrret måling. Kyvette 2 viser at 0,01 (imol ascorbat bringer forsøket til å vise 34% for høyt, kyvette 3 viser at 1 U ascorbatoxydase opphever denne forstyrrelse.

Eksempel 5

Bestemmelse av glutamat ved hjelp av G1DH, NAD/lNT/diaforase i fotometer. Målebølgelengde 492 nm, temperatur 25°C

Kyvette 1 tilsvarer en uforstyrret måling. Kyvette 2 og 3 viser at 0,5 hhv. 0,05 umol ascorbat bringer prøven til å falle ut 7CO %, hhv. 100% for høy. Kyvette 4 og 5 viser den fullstendige eliminering av denne forstyrrelse ved 2 U ascorbatoxydase.

Eksempel 6

Bestemmelse av tyrosin med S-^ethyl-é-kaliumsulfonyl-benz-thiazolon-hydrazon-(2) (SMBTH) og tyrosinase i fotometer, måle-bølgelengde 492 nm, måletemperatur 25°C.

Kyvette 1 tilsvarer en uforstyrret måling, i kyvette 2 senker 1 |imol ascorbat den teoretiske verdi med 35%, i kyvette 3 er denne forstyrrelse fullstendig eliminert ved 10 U ascorbat-oxydase .

Eksempel 7

Bestemmelse av pyrocatechin med SMBTH og difenoloxydase

Kyvette 1 tilsvarer en uforstyrret måling. I kyvette 2 senker 2 [imol ascorbat den teoretiske verdi med 47%, denne forstyrrelse er fullstendig opphevet i kyvette 3 av 10 U ascorbat-oxydase .

Eksempel 8

Testpapir for påvisning av glucose i urin

Filtrerpapir bløtes med en oppløsning av følgende sammensetning og tørres ved 50°C:

Testpapiret reagerer med glucoseholdig urin med rødorange til sortlig-røde farvetoner. Efter en reaksjonstid på 2 minutter gir urin med samme glucoseinhhold med ascorbinsyreinnhold inntil 150 mg/dl praktisk talt samme reaksjonsfarver.

Med testpapirer av analog sammensetning, men uten ascorbat-oxydase, blir alt efter glucoseinnhold reaksjonsfarven ved ascorbinsyrekonsentrasjoner fra 50 mg/dl avsvekket eller fullstendig undertrykt.

Eksempel 9

Testpapir for påvisning av blod i urin

Filtrerpapir blir efter hverandre impregnert med følgende oppløsninger og tørret ved 40°C.

Oppløsning 1

Oppløsning 2

Med dette testpapir kan nærvær av 5 erythrocyter/mm i urin påvises i nærvær av 30 - 50 mg ascorbinsyre/lOO ml. Med et testpapir av samme sammensetning, men uten ascorbatoxydase lykkes denne påvisning ikke lengre allerede i nærvær av 10 - 20 mg ascorbinsyre/100 ml.

Eksempel 10

Testpapir A

Testpapir som eksempel 9, uten ascorbatoxydase.

Testpapir B

Vannoppløselig papir av carboxymethylcellulose (flatevekt

6o g/m ) bløtes med en oppløsning av 20% iseddik i methanol for nøytralisasjon, og tørres. Derpå besprøytes med en vandig oppløs-ning av ascorbatoxydase (lo<3> U/ml) og tørres straks.

Testpapir B legges på testpapir A, og begge forsegles mellom en polyesterfolie og et nylonnett. Urinen som skal undersøkes, dryppes på den således fremstilte teststrimmel.

Resultatene tilsvarer dem i eksempel 9-

Eksempel 11

Testpapir for påvisning av blod i avføring

Filtrerpapir impregneres med følgende oppløsninger og tørres ved 40°C.

Oppløsning 1

Oppløsning 2

Oppløsningen filtreres, og bare filtratet anvendes til impregnering.

Man får et testpapir som best rykes med avføring. Når der på baksiden pådryppes en 3%-ig vandig oppløsning av hydrogenperoxyd, får man en blåfarve når avføringen inneholder ca. 2% blod. Denne farve opptrer også ved ascorbinsyreholdige avføringer (ca. 15 mg/100 g), mens den i disse tilfelle uteblir ved et testpapir uten ascorbatoxydase.

Claims (4)

1. Fremgangsmåte ved kvantitativ bestemmelse av substrater eller enzymaktiviteter i nærvær av ascorbinsyre slik at ascorbinsyren ikke forstyrrer bestemmelsen når det anvendes en red/ox-reaksjon som målereaksjon, som ved bestemmelsen hvor det anvendes et H202~dannende enzym, et tetrazoliumsalt eller en fenol som kan koples oxydativt med nucleofile reagenser, karakterisert ved at det arbeides i nærvær av en ascorbatoxydase som ikke danner H202, *~ en ^^g^6 på 0,002 - 100 U ascorbatoxydase/ml testprøve og ved en pH-verdi mellom 4,0 og 8,5.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at der anvendes en ascorbat-oxydase fra Cucurbita pepo medullosa.

3. Reagens for kvantitativ enzymatisk bestemmelse av substrater eller enzymaktiviteter ved fremgangsmåten ifølge krav 1, og inneholdende et system for bestemmelse av et substrat eller enzym ved en red/ox-reaksjon som målereaksjon, karakterisert ved at det dessuten inneholder en ascorbatoxydase som ikke danner H202, i en mengde på 0,002 - 100 U ascorbatoxydase/ml testprøve og ved en pH-verdi mellom 4,0 og 8,5.

4. Reagens ifølge krav 3, karakterisert ved at systemet inneholder en ascorbatoxydase fra Cucurbita pepo medullosa.