PL114343B1 - Preparation for determining enzymatic substrates or enzyme activity - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest preparat do ozna¬ czania substratów enzymatycznych albo aktywno¬ sci enzymów zawierajacy uklad do oznaczania substratu albo enzymu z reakcja redoksy jako reakcja pomiarowa, charakteryzujacy sie tym, ze dodatkowo zawiera oksydaze askorbdnianowa. 114 3433 Oksydaza asfcorbinianowa katalizuje reakcje: oksydaza kwas askorbinowy + 1/202 askorbinianowa kwas dehydroaskorbinowy + Hfi.Wedlug danych literaturowych na temat oksy¬ dazy askorbinianowej nalezalo oczekiwac, ze enzy¬ mu tego inie bedzie mozna stosowac w preparacie wedlug wynalazku. Wszystkie uzyskane dotychczas preparaty enzymatyczne produkuja mianowicie w reakcji ubocznej nadtlenek wodoru. Jednoczesnie oksydaza askoribdnianowa ulega bardzo szybkiej , dezaktywacja, która przypisywana jest tworzonemu jednoczesnie nadtlenkowi wodoru, na przyklad ? Biochemical Gopper Proceedinga Symposium Har- *ximan New York, strona 1065, strona 305-^337. To samo odnosi sie równiez do preparatów o bardzo wysokiej czystosci, które przy ultrawirowaniu i przy elektroforezie nie wykazuja zadnych zanie¬ czyszczen, na przyklad Biochem. 4, 1362—1370 (1965). Dezaktywacja reakcji sprowadza sie do tworzenia nadtlenku wodoru, na przyklad Biochem.Biophys Acta 56, 427—439 (1962). Wedlug obliczen autorów ostatniego artykulu 1 U oksydazy askor¬ binianowej w 1 mmoluylitr roztworu kwasu askor¬ binowego moze wytwarzac 0,7 102 mmoli/litr nad¬ tlenku wodoru. Takie stezenia kwasu askorbino¬ wego czesto wystepuja w badanych roztworach.Utworzony nadtlenek wodoru stoi oczywiscie do dyspozycji enzymatycznych reakcji, jak na przy¬ klad katalazy.W ukladzie peroksydaza donator wodoru + H2O2 barwnik + 2H20 do fotometrycznego oznaczania nadtlenku wodoru przy molowym wspólczynniku ekstynkcji okolo 20 om8/umol otrzymuje sie róznice ekstynkcji 0,14.Poniewaz zakres pomiarowy normalnych reakcji fotometrycznych wynosi okolo 0,01—1,00, zostaje tu wywolany niedopuszczalny blad. W podobny sposób zaklócane sa reakcje, w których zamiast nadtlenku wodoru stosuje sie organiczne wodoro- nadtlenki, a zamiast peroksydazy hemoglobine albo inne katalizatory utleniania.Ale pomijajac ten blad wywolany przez nadtle¬ nek wodoru wiadomo z wyzej przytoczonych na ostatnim miejscu danych literaturowych, ze reak¬ cja kwasu askorbinowego ustaje juz na dlugo przed calkowitym jego usunieciem.Szczególnie ciazacy we wszystkich tych reakcjach redoksy, w których powstaje nadtlenek, wodoru byl fakt, ze ten nadtlenek wodoru z jednej strony musial jeszcze przyspieszac dezaktywacje enzymu, a z drugiej strony nowe powstawanie nadtlenku wodoru przez sama oksydaze askorbimianowa pro¬ wadzi do zupelnie niejasnych zjawisk. Zaskakuja¬ cym jest wiec, ze wbrew oczekiwaniom!, przez do¬ datek oksydazy askorbinianowej mozliwe jest calkowite usuniecie innych zaklócen, które zniwe¬ czylyby korzysc usuwania askortodnów.Preparat wedlug wynalazku stosuje sie zwlasz¬ cza w enzymatycznych reakcjach, szczególnie ta¬ kich, w których tworzy sie nadtlenek wodoru, a 14 343 4 wiec w reakcjach, które katalizowane sa przez oksydazy, jak oksydaze glukozowa, urikaze, oksy¬ daze cholesterolowa i podobne, dalej w reakcjach, w których redukuje sie sole tetrazoliowe, i w re- 5 akcjach, w których fenole sprzega sie oksydacyj¬ nie z nukleofilowymi odczynnikami. Dodawana ilosc oksydazy askorbinianowej zalezy od oczeki¬ wanej ilosci kwasu askorbinowego w badanej pró¬ bie. Z reguly dodaje sie 0,002—100 U/ml desydazy 10 askorbinianowej, korzystnie 0,001—30 U/ml bada¬ nej próby. Wartosc pH reakcji dostosowuje sie w pierwszym rzedzie do wartosci pH, jaka jest wy¬ magana dla tego albo innych bioracych udzial enzymów, przy czym dla sposobu wedlug wyna- 15 lazku jako odpowiednia okazala sie wartosc pH 4,0—8,5. Zwlaszcza korzystne jest stosowanie w ramach wynalazku oksydazy askorbinianowej z Zucchini (Cucunbiita pepo medulloiza), z tym, ze odpowiednia jest równiez oksydaza askorbiniano- 20 wa innego pochodzenia.Wyrózniajace sie preparaty tego rodzaju zawie¬ raja, w przypadku oznaczania glukozy jako sub- stratu enzymatycznego peroksydaze, oksydaze glu¬ kozowa, o-dwuanizydyne albo azyno-dwu-/3-etylo- 25 benzylotiazolinosulfonian-6/ razem z buforem albo heksoMnaze, dehydrogenaze glukozo-6-fosforanowa, diaforaze, fosforan dwunukleotydu nikotynamido- -adeninowego (NADP) sól tetrazoliowa, jak chlo¬ rek 3-/4-jodofenylo/-2-/4-niitrofenylo/-5-fenyio- 30 -2H-tetrazoliowy i bufor. W przypadku kwasu moczowego jako substratu przeznaczonego do ba¬ dania, uklad sklada sie zwlaszcza z peroksydazy, urikazy, fenolu, jak na przyklad 2,4-dwuchlorofe- nolu, aminoantypiryny i buforu. Przy oznaczaniu 35 glutaminianu uklad sklada sie korzystnie z dehy¬ drogenazy glutaminianowej, diaforazy, dwunukleo¬ tydu nikotynamido-adeninowego, chlorku 3-/4-jo- dofenylo/-2-/4-nitrofenylo/-5-fenylo-2H-tetrazolio- wego i buforu. Dla oznaczania tyrozyny 'korzystna 40 jest tyrozynaza, 3-metylo-6-potasosuIfonylobenzo- tiazolonehydrazon-2, a dla oznaczania pirokatechi- ny eksydaza dwufenolowa, 3-metylo-6-potasosulfo- ' nylobenzotiazolonohydrazon-2, w danym przypad¬ ku z buforem. Te wszystkie uklady do uznaczania 45 substratów enzymatycznych sa znane. Jednakze na ich miejsce mozna stosowac inne znane uklady do oznaczania substratów enzymatycznych albo enzymów w ramach odczynnika wedlug wynalaz¬ ku. 50 Preparat wedlug wynalazku posiada szczególnie znaczenie w dziedzinie szybkiej diagnostyki. Tego rodzaju preparaty do szybkiej diagnostyki zawie¬ raja z reguly rózne odczynniki potrzebne do prze¬ prowadzenia sposobu i albo impregnuje sie nimi 55 chlonny nosnik, albo nanosi sie je z odpowiednim spoiwem jako powloke na nosnik w postaci folii.Przy tym korzystna forma jest dodanie oksydazy askorbinianowej do mieszaniny pozostalych od¬ czynników i nastepnie impregnacja chlonnego nos- 60 nika. W ten sposób wytwarza sie na przyklad praktycznie nie zaklócane kwasem askorbinowym papierki wskaznikowe do wykrywania glukozy w moczu, na przyklad wedlug ogloszeniowego opisu 65 patentowego RFN 23 38 932, krwi w moczu na114 343 przyklad wedlug opisu patentowego RFN 24 60 903 albo opisu patentowego RFN 22 35 152, i krwi w stolcu. Bardzo zasfcalkuijacy jest fakt, ze oksydaza askorbinianowa w papierkach wskaznikowych do oznaczania krwi w moczu pozostaje sprawna i trwala w czasie skladowania. Te papierki zawie¬ raja mianowicie nadmierne ilosci organicznych wodoronadtlenków, od których 'podobnie jak od nadtlenku wodoru nalezaloby oczekiwac dezakty¬ wacji oksydazy askorbmiainowe1}.Oksydaze askorbinianowa mozna takze nanosic na oddzielny nosnik, który laczy sie z nosnikiem zawierajacym pozostale odczynniki, na przyklad kladzie sie na nini, nakleja albo razem zapiecze- towuje. Szczególnie korzystnymi nosnikiem dla oksydazy askorbinianowej jest w tym przypadku tak zwany papier rozpuszczalny w wodzie, na przyklad wedlug ogloszeniowego opisu patentowe¬ go RFN 24 36 598, który pozwala szczególnie dobrze rozpoznac barwna reakcjena papierze nosnikowym innych odczynników. Ten sposób wykonania jest korzystny zwlaszcza wówczas, gdy w kombinacji, odczynników obecne sa substancje, które nie zno¬ sza sie z oksydaza asikorbinianowa, na przylklad silnie kwasowe odczynniki, jaskie stosuje sie w sposobie oznaczania urobilinogenu, bilirubiny i azotynu.W powyzszych formach wykonania w celu wy¬ tworzenia odczynnika na 1 ml roztworu impregna¬ cyjnego stosuje sie do 5000 U, a zwlaszcza do 2000 U oksydazy asikorbinianowej. Stosowanie mniej niz 1 U/ml na ogól nie zapewnia pozadane¬ go efektu. Poza tym postepuje sie ewentualnie w ten sposób, ze oddzielne strefy nosnika impregnuje sie oksydaza askorbinianowa wzglednie innymi odczynnikami testowymi. W tym przypadku nosnik doprowadza sie do zetkniecia z badanym roztwo¬ rem tak, ze roztwór najpierw styka sie z strefa zawierajaca oksydaze askorbinianowa i stad zasy¬ sany jest do strefy zawierajacej pozostale odczyn¬ niki.Wedlug innej formy wykonania oksydaza askor¬ binianowa zostaje zwiazana na nosniku znanymi metodami utrwalania enzym6w na nierozpuszczal¬ nych nosnikach. Odpowiednie metody znane sa z ogloszeniowych opisów patentowych RFN 17 68 512, 21,28743, 22160185, 212601814, 24 26 988, 26 03.;158 i 19 15 970.Korzystnymi metodami sposobu wedlug wyna¬ lazku jest oznaczanie glulkozy przy uzyciu peroksy- dazy i oksydazy glukozowej i o-dwuanizydyny al¬ bo 2,2,-azyno-dwu-/3-etyloibenzotiazolinosulfonia- nu-6, oznaczanie glukozy wedlug metody heksoki- naza/dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa, ozna¬ czanie kwasu moczowego za pomoca fenolu, ami- noiantypiryny!, peroksydazy i urilkazy, oznaczanie tyrozyny albo pirokatechiny za pomoca 4-metylo- -6-potasosulfonylo(benzotiaizolonohydrazonu-2 i ty- rozynazy wzglednie aksydazy dwufenolowej.Ponizsze przyklady objasniaja blizej wynalazek.Przyklad I. Papierki wskaznikowe do wy¬ krywania glukozy w moczu.Bibule filtracyjna nasyca sie roztworem o na¬ stepujacym skladzie i suszy w temperaturze 50°C: Bufor cytrynianowy, PH 5; 1,2 mola 50,0 ml Dwuchlorowodorek 9-/Y-dwumetyloaminoproppylo/^ -6-chloro-3-aminokarbazolu 0,75 g Oksydaza glukozowa (104 U/mg) 0,25 g 5 Peroksydaza (63 U/mg) 0,05 g Oksydaza askorbinianowa .(100 U/mig) 1,0O' g Woda 100,0 ml Papierek wskaznikowy reaguje z moczem za¬ wierajacym glukoze dajac zabarwienie czerwono- 10 pomaranczowe do czarniawoczerwonego. Po czasie reakcji trwajacym 2 minuty mocz o takiej samej zawartosci glukozy, zawierajacy kwas askorbino^ wy w ilosci do 150 mg/dl, daje praktycznie takie same zabarwienia. 15 Przy uzyciu papierków wskaznikowych o ana¬ logicznym skladzie, ale bez oksydazy askorbdnia- nowej, zaleznie od zawartosci glukozy, barwy reakcji przy stezeniach kwasu askorbinowego od 50 mg/dl sa oslabione albo calkowicie stlumione. 20 Przyklad II. Papierki wskaznikowe do wy^ krywania krwi w moczu.Bibule filtracyjna nasyca sie kolejno nastepuja¬ cymi roztworami i suszy w temperaturze 40°C; Roztwór 1 25 Bufor cytrynianowy, pH 5J25; 1^2 mola 35,0 ml Sól dwusodowa kwasu etylenodwuamino- czterooctowego 0,11 g Sulfobursztynian dwu-/2-etyloheksylo/- -sodowy 0,5 g 30 2,5-dwumetyloheiksano-2,5-dwuwodoronadtle- nek (okolo70%) 1,6 g Trójmorfolid kwasu fosforowego ' 12,7 g Oksydaza askorbinianowa (100 U/mg) 0,3 g Metanol 30,0 ml 35 Woda do 100,0 ml Roztwór 2 S^^S^-czterometylobenzydyna 0,3 g Fenantrydyna 0,2 g 40 Toluen/eter naftowy (30 :70) do 100,0 ml Za pomoca tego papierku wskaznikowego mozna wykryc obecnosc 5 erytrocytów/mm8 w moczu, równiez w obecnosci kwasu askorbinowego w ilo¬ sci 30—50 mg/100 ml. Papierkiem o takim samym 45 skladzie, ale bez aksydazy askorbinianowej nie udaje sie to wykrycie jiuz w obecnosci 10—20 mg kwasu askorbinowego na 100 ml.Przyklad III. Papierek wskaznikowy A — jak w przekladzie IX, bez aksydazy askorbinia- so nowej.Papierek wskaznikowy B — rozpuszczalny w wodzie papier z kariboksymetylocelulozy o grama¬ turze 60 g/m2 nasacza sie w celu zobojetnienia roz¬ tworem 20% lodowatego kwasu octowego w meta- 55 nolu i suszy. Nastepnie spryskuje sie go wodnym roztworem oksydazy askorbinianowej (10* U/ml) i zaraz suszy. Papier wskaznikowy B kladzie sie na papierze wskaznikowym A i obydwa razem wpie- czetowuje miedzy folie poliestrowa i siatke nylo- 60 nowa. Badany mocz nanosi sie kroplami na tak wytworzone paski wskaznikowe. Otrzymane wyni¬ ki odpowiadaja wynikom w przykladzie IX.Przyklad IV. Papierek wskaznikowy do wykrywania krwi w stolcu.114 343 Bitoule filtracyjna nasacza sie kolejno nastepu¬ jacymi roztworami i suszy w temperaturze 40°C: Roztwór 1 Bufor cytrynianowy, pH 5,25; 1,2 mola 10 ml Oksydaza askorbinianowa 100 U/mg 0,3 g Woda do 100,0 ml Roztwór 2 Zywica gwajakowa 3 g Toluen do 100,0 ml Roztwór saczy sie i tylko przesacz stosuje do nasycania.Tak otrzymany papierek wskaznikowy smaruje sie stolcem, a na odwrotna jego strone dodaje kroplami 3% wodny rozttwór nadtlenku wodoru.Jezeli stolec zawiera okolo 2% krwi, otrzymuje sie niebieskie zabarwienie. Zabarwienie to wystepuje takze przy stolcach zawierajacych kwas askorbi¬ nowy w ilosci okolo 15 mg/100 g, podczas gdy w takich samych przypadkach przy stosowaniu papierka wskaznikowego bez oksydazy askorbinia- nowej nie wystepuje zabarwienie. 10 15 20 25 8 Zastrzezenia patentowe 1. Preparat do enzymatycznego oznaczania sub- stratów enzymatycznych albo aktywnosci enzy¬ mów, zawierajacy uklad do oznaczania substratów enzymatycznych albo enzymu za pomoca reakcji redoksy jako reakcji pomiarowej, znamienny tym, ze zawiera dodatkowo oksydaze askorbinianowa. 2. Preparat wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze uklad do oznaczania substratu enzymatycznego zawiera peroksydaze, urikaze, fenol, jak 2,4-dwu- chlorofenol, aminoatypiryne i bufor. 3. Preparat wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze uklad do oznaczania s;ubstratu enzymatycznego i oksydaza askorbinianowa wystepuja jako impre¬ gnat chlonnego nosnika, zwlaszcza papieru. 4. Preparat; wedlug zastrz. 3, znamienny tym, ze sklada sie z nalozonych na siebie rozpuszczal¬ nego w wodzie nosnika w postaci plyty nasyconej oksydaza askorbinianowa i nierozpuszczalnego w wodzie chlonnego nosnika w postaci arkusza na¬ syconego ukladem do oznaczania substratu enzy¬ matycznego. 5. Preparat wedlug zastrz. 3, znamienny tym, ze sklada sie z papieru nasyconego oksydaza askor¬ binianowa, zywica gwajakowa i buforem.PZGraf. Koszalin D-269 100 egz. A-4 Cena 45 zl PL PL PL PL PL PL PL PL

Claims (1)

1.