CS235068B2

CS235068B2 - Agent for enzymatic determination of substrates

Info

Publication number: CS235068B2
Application number: CS781874A
Authority: CS
Inventors: Josef Danninger; Ulfert Deneke; Gunter Lang; Gerhard Michal; Peter Roeschlau
Original assignee: Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date: 1976-06-09
Filing date: 1977-05-06
Publication date: 1985-04-16
Also published as: SU797592A3; AU500988B2; US4168205A; DE2625834C3; ATA234077A; JPS5639198B2; CS207453B2; NL169503B; ZA772716B; FR2354561A1; IL52047A; PL114343B1; AR212763A1; IE45546B1; YU114477A; CA1084393A; ES458544A1; DE2625834B2; NL7704591A; PL109224B1

Description

Vynález se týká činidla k enzymatickému stanovení substrátů.

V . klinické a farmaceutické chemii, biochemii a potravinářské chemii mají redoxreakce ke stanovení koncentrace enzymu nebo substrátu velký význam. Vyhodnocení těchto reakcí je možno provádět fotometricky. V případě, že jsou ve zkušebním vzorku kromě žádané redox-reakce ještě další redukující látky, je nutné počítat s větší chybou vzhledem k rušení této reakce. Zvláště často se ve vzorku vyskytuje kyselina askorbová. Jako silné redukční či nidlo vede tato látka k chybám při vyšetřování farmaceutických přípravků nebo fyziologických kapalin, jako moči, rostlinných šťáv s obsahem kyseliny askorbové nebo některých potravinářských výrobků, které kyselinu askorbovou obsahují nebo k nimž byla tato kyselina přidána. Je například známo, že kyselina askorbová ruší následující reakce.

Reakce, při nichž se uvádí ve styk peroxid ' vodíku a donor vodíku s peroxidázou (POD) jsou rušeny následující reakcí peroxidáza

Kyselina askorbová + H2O2----► kyselina dehydroaskorbová + H2O.

Reakce, ipři nichž . se redukují tetrazoliové soli redukčními činidly na formazany jsou rušeny následující reakcí.

Kyselina askorbová + tetrazoliová sůl —> formazan + kyselina dehydroaskorbová.

Reakce, při nichž dochází ke styku fenolů s nukleofilními reakčními složkami s tím k jejich oxidativní vazbě jsou rušeny tím, že kyselina askorbová způsobuje zatím neznámým způsobem vznik vedlejších reakcí, takže· . vzniká nejednotný oxidativní produkt, který se liší u absorbcí v normálním i ultrafialovém světle od běžných produktů této reakce.

K odstranění kyseliny askorbové ze vzorku jsou běžné oxidační metody zpravidla nevhodné. Oxidační činidlo porušují také substráty a enzymy a rozrušují je. Redukční produkty, těchto činidel, většinou dvojvazné nebo trojvazné kovové ionty často askorbátoxidáza Kyselina askorbová + 1/2 O2--------->

Podle literárních údajů, týkajících se oxidázy kyseliny askorbové by bylo nutno očekávat, že se enzym k uvedenému účelu nehodí. Všechny dosud získané přípravky tohoto enzymu redukují jako vedlejší reakce peroxid vodíku. Mimoto se askorbátoxidáza velmi rychle inaktivuje vznikajícím peroxidem vodíku. (Biochemical Copper Proceedings Symposium Harriman New York 1963, str. 305 až 337).

To platí i pro velmi čisté přípravky, které při elektroforéze v ultraodstředivce již nemají žádné nečistoty. [Biochem. 4, 1362 až 1370 (1965)]. Příčinou inaktivace je tvorba peroxidu vodíku [Biochem. Biophys. Acta 56, 427 až 439 (1962)]. Podle této citace vzniká z jedné jednotky askorbátoxidázy v roztoku kyseliny askorbové o koncentraci 1 mmol/litr celkem 0,7 x 10^-2 mmolu/litr peroxidu vodíku. Tyto koncentrace jsou ve vzorcích často dosaženy. Vznikající peroxid vodíku dále ruší enzymatickou . reakci, jak je možno ukázat například na příkladu katalážy.

brzdí účinnost enzymů, užitých k indikační reakci. Rozrušení kyseliny askorbové kyslíkem je možno provádět pouze v silně alkalickém prostředí, například 25% hydroxidu sodného. Toto prostředí však rozruší substráty i enzymy.

Vynález si klade za úkol navrhnout činidlo ke stanovení substrátů nebo enzymatické účinnosti při použití ' redox-reakce, tak, aby tato reakce již nebyla rušena kyselinou askorbovou.

Podle vynálezu je tento úkol vyřešen tak, že se ke vzorku přidá askorbátoxidáza.

Askorbátoxidáza katalyzuje následující reakci:

kyselina · dehydroaskorbová · + H2O.

Při ' provádění následující reakce

POD .

donor vodíku + H2O2---> barvivo + 2 H2O

v. ‘ případě .fotometrickéhó zjištění peroxidu vodíku · dochází · při molárním'. ' éxtinkčním koeficientu přibližně 20 cm²/umol k diferenci 0,14. Protože rozsah měření fotometrických réakcí je 0,01 až 1,00, je tato chyba naprosto nepřijatelná. Stejným způsobem je rušena reakce i v tom případě, že místo peroxidu vodíku vznikají organické hydroperoxidázy a místo POD užije hemoglobin nebo jiný katalyzátor oxidace.

Kromě toho, že dochází k chybě, vyvolané přítomností peroxidu vodíku je z literatury také známo, že reakce kyseliny askorbové proběhne již dlouho' před odstraněním této kyseliny.

Zvláště nepříznivá · je tato skutečnost při těch redox-reakcích, při nichž vzniká peroxid vodíku, protože tento peroxid' na jedné straně podporuje inaktivaci enzymu a na druhé straně vede ke vzniku dalšího množství peroxidu působením askorbátoxidázy a tím к naprosto nepřehlednému průběhu reakce. Je proto překvapující, že oproti veškerému očekávání je možné úplně odstranit reakční chybu, způsobenou přítomností askorbátu přidáním askorbátoxidázy, aniž by přitom došlo к dalším chybám, které by rušily příznivý účinek askorbázy.

Činidlo podle vynálezu se s výhodou užívá při enzymatických reakcích, zvláště takových, u nichž vzniká peroxid vodíku, tj. při reakcích, katalyzovaných oxidázami jako jsou glukózooxidáza, urikáza, cholesteroloxidáza a podobné enzymy a dále při reakcích, při nichž jsou redukovány tetrazoliové soli nebo při nichž dochází к reakci mezi fenolem a nukleofilním reakčním činidlem za vzniku oxidativních produktů. Množství přidané askorbátoxidázy se řídí podle očekávaného množství kyseliny askorbové ve vzorku. Zpravidla se přidává 0,002 až 100, s výhodou 0,01 až 30 jednotek/ml vzorku.

Hodnota pH při reakci se řídí podle hodnoty, která je žádoucí vzhledem к použitému enzymu. Jinak je možno reakci provádět v rozmezí 4,0 až 8,5. Zvláště výhodné je použití askorbátoxidázy z Cucurbita pepo medullosa. Je však možné užít i askorbátoxidázu jiného původu.

Předmětem vynálezu je tedy činidlo к enzymatickému stanovení substrátů nebo enzymatické účinnosti sestávající ze systému pro stanovení substrátu nebo enzymu pomocí redox-reakce jako měřící reakce, vyznačující se tím, že obsahuje askorbátoxidázu.

Výhodné reakce tohoto typu obsahují v případě glukózy jako substrátu enzymy peroxidázu, glukózooxidázu, dále o-dianisidin nebo amino-di-3-ethylbenzylthiazolinsulfonát (6) s pufrem nebo hexokinázou, glukózo-6-fosfátdehydrogenázu, diaforázu, NADP, tetrazoliovou sůl jako 3-(4-jódfenyl)-2-(4-nitrofenyl )-5-fenyl-2H-tetrazoliumchlorid a pufr.

U kyseliny močové jako substrátu sestává systém s výhodou z peroxidázy, urikázy, fenolu jako 2,4-dichlorfenolu, aminoantipyrinu a pufru. V případě stanovení glutamátu sestává systém s výhodou z glutamátdehydrogenázy, diaforázy, NAD, INT a pufru. V případě tyrosinu se užije tyrosináza, 3-methyl-6-kaliumsulfonylbenzthiazolonhydrazon (2), při stanovení pyrokatechinu se užije difenoloxidáza, 3-methyl-6-kaliumsulfonylbenzthiazolonhydrazon (2) a pufr. Všechny tyto systémy ke stanovení substrátu jsou známé. Je možno užít tyto i jiné známé systémy ke stanovení substrátu nebo enzymu.

Činidlo podle vynálezu má zvláště velký význam i při použití к rychlé diagnostice některých poruch. Přípravky pro rychlou diagnostiku obsahují zpravidla různé reakční složky, nutné к provádění reakce v impregnované formě na nosiči, nebo· spolu s pojivém na nosné fólii jako povlak. Při výhodné formě provedení těchto reakcí se askorbátoxidáza přidává к reakční směsi před impregnací nosiče. Tímto způsobem je možno získat například papírky, u nichž není reakce rušena kyselinou askorbovou a jichž je možno užít ke stanovení glukózy v moči, (například podle DT—OS 2 338 932) ke stanovení krve v moči, například podle P 24 60 903—8 nebo podle NSR patentu 2 235 152 a ke stanovení krve ve výkalech.

Skutečnost, že askorbátoxidáza ve zkušebních papírcích na krev v moči je stabilní je nanejvýš překvapující. Tyto papírky totiž obsahují přebytek organických hydroperoxidů, které by měly způsobit inaktivaci askorbátoxidázy.

Askorbátoxidázu je však možno také nanést na oddělený nosič, který se pak smísí s nosičem pro zbývající reakční složky, například se převrství, stmelí apod. Zvláště výhodným nosičem pro askorbátoxidázu je v tomto případě tzv. ve vodě rozpustný papír, například podle DT—OS 2 436 598, při použití barevné reakce je pak možno výslednou barevnou změnu zvláště dobře odečíst.

Nosný materiál se popřípadě impregnuje v oddělených zónách askorbátoxidázou a ostatními reakčními složkami. V tomto případě se s výhodou uvádí nosič se zkoumaným vzorkem do styku tak, že se roztok nejprve uvede ve styk se zónou s obsahem askorbátoxidázy a pak teprve se zónou, která obsahuje reakční složky.

Podle dalšího výhodného provedení vynálezu se askorbátoxidáza váže běžnými metodami pro fixaci enzymů na nerozpustné nosiče. Tyto metody jsou známy z následujících literárních údajů.

DOS
1 768 512	2 426 988
2 128 743	2 603 158
2 260 185	1 915 970
2 260 184

Činidlo podle vynálezu se s výhodou užívá při stanovení glukózy peroxidázou a glukózooxidázou spolu s o-dianisidinem nebo 2,2‘-azino-di-3-ethylbenzthiazolinsulfonátem (6) (ABTS), při stanovení glukózy pomocí hexokinázy a glukózo-6-fosfátdehydrogenázy, při stanovení kyseliny močové směsí fenolu, aminoantipyrinu, peroxidázy a urikázy, ke stanovení tyrosinu nebo pyrokatechinu při použití (4-methyl-6-kaliumsulf onylbenzthiazolonhydrazn (2) (SMBTH) a tyrosinázy, popřípadě difenoloxidázy.

Vynález bude osvětlen následujícími příklady.

Příklad 1

Stanovení glukózy se provádí použitím o

-dianisidinu, peroxidázy (ROD) a glukózooxldázy (GOD) ve fotometru při vlnové délce 432 nm a 25 '°C.

Číslo kyvety	1	2	3	4	5
fosfátový pufr
pH 7,01 M	2,5	2,5	2,5	2,5	2,5
o-dianisidin
5 mg/ml	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1
POD, 180 jednotek/ml	0,05	0,05	0,05	0,05	0,05
roztok glukózy
1 mg/ml	0,03	0,03	0,03	0,03	0,03
roztok kyseliny askorbové
10 mmolů	—	0,1	0,01	0,1	0,01
voda	0,12	0,02	0,11		0,09
askorbátoxidáza
500 jednotek/ml	—	—	—	0,02	0,02
Inkubace 1 minuta při 25 °C,	odečte se Ei, pak se přidá
GOD 70 jednotek/ml	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1
Inkubace 30 minut při 25 °C,	odečte se Ež a vypočítá ΔΕ = Ez-	-Ei
ΔΕ	0,541	0,010	0,316	0,540	0,543

Měření v první kyvetě nebylo ničím rušeno, protože kyveta neobsahovala kyselinu askorbovou.

Další dvě kyvety ukazují, že přítomnost 1, popřípadě 0,1 ,/zmolu askorbátu ruší první zkoušku téměř úplně, ve druhém případě na 41,5 o/o.

Další dvě kyvety ukazují, že přidáním 10 jednotek askorbátoxidázy je možno úplně zrušit nepříznivý vliv askorbátu.

Příklad 2

Stanovení glukózy bylo prováděno při použití 2,2‘-azino-di- [ 3-e thylbenzthiazolinsulf onát (6)] (ABTS), POD a GOD ve fotometru při vlnové délce 432 nm a teplotě 25 °C.

Kyveta číslo	1	2	3	4	5
fosfátový pufr
pH 5,6, 0,1 M	2,75	2,75	2,75	2,75	2,75
ABTS 50 mmolů	0,05	0,05	0,05	0,05	0,05
POD 250 jednotek/ml	0,02	0,02	0,02	0,02	0,02
roztok glukózy 0,1 mg/ml	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1
roztok kyseliny askorbové 1 mmol	—	0,1	0,01	0,1	0,01
voda	0,12	0,02	0,11	—	0,09
askorbátoxidáza
500 jednotek/ml	—	—	—	0,02	0,02
Po inkubaci 1 minutu při 25 °C se	odečte Ej a přidá se
GOD 70 jednotek/ml	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1

Po inkubaci 30 minut při 25 °C se odečte E2 a vypočítá se ΔΕ = E₂ — Ej

ΔΕ

0,505 0,000 0,40

0,502 0,504

První kyveta odpovídá nerušenému stanovení bez askorbátu. Následující dvě kyvety ukazují, že 0,1 nebo 0,01 ^molu askorbátu brzdí zkoušku v prvním · případě úplně, ve druhém na 21 %.

V posledních dvou kyvetách je zkouška s nerušeným průběhem v důsledku toho, že rušivý vliv askorbátu v uvedených koncentracích byl · zrušen přidáním 10 jednotek askorbátoxidázy.

no směsí fenolu, aminoantipyrinu, POD a urikázy v automatickém analyzátoru.

P ř í k 1 a d 3

Stanovení kyseliny močové bylo prováděPrincip zkoušky ;

urikáza

Kyselina močová + O₂ + H₂O---allantoin + H₂O₂

POD

H₂O₂ + 2,4-dichlorfenol + · 4-aminoantipyrin · —► chinoidní barvivo + 2 H₂O

Výroba roztoků

1) Reakční činidlo s obsahem askorbátoxidázy

K 600 ml bidestilované vody se rozpustí obsah standardizované lahvičky. Přidá se 0,3 ml přípravku Brij—35 polyethylenglykollauryletheru.

Směs je skladovatelná ve tmavém skle při teplotě 4 °C 4 týdny při teplotě 25 °C 1 týden.

2) Reakční činidlo s obsahem urikázy

V 800 ml bidestilované vody se rozpustí obsah standardizované lahvičky 2. Přidá se 2,0 ml polyethylenglykollauryletheru. tok je stálý v tmavém skle při teplotě 4 týdny, při teplotě 25 °C 1 týden.

Koncentrace roztoku

1) 50 mmolů fosfátového pufru o pH

Roz4 °C

5,6

Obr. 2 znázorňuje výsledky zkoušek grafickým způsobem.

K provedení zkoušky se užije systému automatického zařízení z obr. 1.

Toto zařízení sestává z přívodu 1 pro vzduch, přívodu 2 pro vzorek, přívodu 3 pro svrchu uvedené reakční činidlo 1, přívodu 4 pro vzduch a přívodu 5 pro reakční činidlo 2. Za těmito přívody je zařazen dialyzátor 6 a za ním reakční trubice 7, na jejímž · konci se nachází fotometr 6 pro měření příslušných hodnot.

Přívodem 1 se přivádí · 0,32 ml vzduchu za minutu, přívodem 2 0,23 · ml vzorku za minutu, přívodem 3 0,6 ml reakčního činidla 1 za minutu, přívodem 4 za minutu a přívodem 5 činidla 2 za minutu.

Na obr. 2 jsou na ose něny mg kyseliny močové ve 100 ml, na ose úseček mg kyseliny askorbové na 100 mililitrů.

Jednotlivé křivky mají následující význam:

0,32 ml vzduchu

1,0 ml · reakčního pořadnic znázorAskorbátoxidáza v množství alespoň 0,056 až 0,9 jednotek množství vyplývá z grafu na obr. 2, pokud je lze odečíst. Lze užít i vyššího množství.

2) 31 mmolu tris/kyselina citrónová o pH 8,9 urukáza v množství 0,08 jednotek/ml nebo větším

PCD v množství 0,15 jednotek/ml nebo větším

3,0 mmolu 2,4-dichlorfenolu,

4,0 mmolu 4-aminoantipyrinu.

Vynález bude · osvětlen v souvislosti s přiloženými obr. 1 a 2.

Na obr. 1 je znázorněno automatické zařízení k provádění zkoušek.

křivka Γ: pufr bez askorbátoxidázy křivka 2‘: 0,056 jednotek/ml askorbátoxidázy křivka 3‘: 0,112 jednotek/ml askorbátoxidázy křivka 4‘: 0,225 jednotek/ml askorbátoxidázy křivka 5‘: 0,45 křivka 6‘: 0,67 křivka 7‘: 0,9 jednotek/ml askorbátoxidázy jednotek/ml · askorbátoxidázy jednotek/ml askorbátoxidázy

Příklad 4 stanoví směsí HK/G6P—DH, diaforázy ve fotometru. MěGlukóza se

NADP, INT a ření se provádí při vlnové délce 492 nm a při inkubační teplotě 25 °C.

Kyveta číslo 1 2 3 fosfátový pufr o pH 7,5,

01 molu	1,7	1,7	1,7
NADP/INT vždy 1 mg/ml	0,1	0,1	0,1
diaforáza 5 jednotek/ml	0,1	0,1	0,1
glukóza 0,05 mg/ml	0,1	0,1	0,1
roztok askorbátu 10 mmolů	—	0,01	0,01
askorbátoxidáza 35 jednotek/ /ml	—	—	0,03
voda	0,04	0,03	—

Po inkubaci 3 minut při 25 °C se odečte Ex a přidá se

HK/G6P—DH—roztok 56 jednotek/ml	0,05	0,05	0,05
Po 15 minutách inkubace se	odečte E2 a vypočítá se ΔΕ	— E2 — Ei
ΔΕ	0,234	0,307	0,231

Kyveta 1 znamená nerušené měření.

Kyveta· 2 znamená rušení zkoušky přítomností 0,01 //molu askorbátu na 34 % při tvorbě sraženiny, v kyvetě 3 je tento nepříznivý vliv zcela odstraněn přidáním 1 jednotky askorbátoxidázy.

Příklad 5

Stanovení glutamátu se provádí směsí G1DH, NAD/INT/diaforázy ve fotometru při vlnové délce 492 nm a teplotě 25 °C.

Kyveta číslo	1	2	3	4	5
fosfátový pufr pH 5,6, 0,01 mmolu	1,30	1,20	1,29	1,18	1,27
roztok glutamátu 0,2 mg/ml	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1
roztok askorbátu 5 mmolů	—	0,1	0,01	0,1	0,01
askorbátoxidáza 100 jednotek/ml	—		—	0,02	0,02
Po inkubaci 3 minuty při 25 °C se	do kyvet přidá 0,2 molu TRA,
0,05 molu fosforečnanu draselného	o pH 8,6 a 1,5 %
Triton—X—100 alkylarylpolyethylen-
glykolether	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0
roztok NAD 5 mg/ml	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
roztok diaforázy 10 jednotek/ml	0,05	0,05	0,05	0,05	0,05
G1DH 100 jednotek/ml	0,05	0,05	0,05	0,05	0,05
Odečte se E_b přidá se
roztok INT 2 mg/ml	0,05	0,05	0,05	0,05	0,05
po inkubaci 15 minut při 25 °C se odečte E₂ a vypočítá se ΔΕ	= E₂ — E[
ΔΕ	0,184	1,560	0,380	0,186	0,182

Kyveta 1 odpovídá nerušenému měření.

Z výsledků kyvet 2 a 3 je zřejmé, že 0,5 nebo 0,05 //molu askorbátu ruší test na 100 proč, při tvorbě sraženiny.

V kyvetách 4 a 5 dojde k úplnému odstranění tohoto rušivého· účinku přidáním 2 Jednotek askorbátoxidázy.

Příklad 6

Stanovení tyrosinu se provádí směsí 3-methyl-6-kaliumsulfonylbenzthiazolonhydrazonu (2) (SMBTH) a tyrosinázy ve fotometru při vlnové délce 492 nm a teplotě 25 stupňů Celsia.

Kyveta číslo	1	2	3
fosfátový pufr, pH 5,2,
0,25 molu	2,77	2,77	2,77
SMBTH 0,1 molu	0,05	0,05	0,05
kyselina askorbová
10 mmolů	—	0,1	0,1
voda	0,12	0,02	—·
askorbátoxidáza 500
jednotek/ml	—	—	0,02
tyrosináza 60 jednotek/ml	0,05	0,05	0,05
Po inkubaci 1 minutu při 25	°C . se odečte El a přidá se
tyrosin 2 mmoly	0,05	0,05	0,05

Po inkubaci 1 hodinu při 25 °C se odečte E2 a vypočítá se ΔΕ = E2—E1

ΔΕ 1,113 0,728- 1,100

První kyveta odpovídá nerušenému měřev druhé kyvetě sníží přídavek 1 //mol askorbátu teoretickou hodnotu o 35 %, v následující kyvetě je tato chyba zcela odstraněna přidáním 10 jednotek askorbátoxidázy.

Příklad 7

Stanovení pyrokagechinu se provádí smě sí SMBTH a difenoloxidázy.

Kyveta číslo .	1	2	3
fosfátový pufr, 0,25 molu,
pH 5,2	2,80	2,70	2,68
SMBTH 0,1	0,05	0,05	0,05
pyrokatechin 0,5 molu	0,10	0,10	0,10
roztok askorbátu 20 mmolů	—	0,1	0,1
askorbátoxidáza 500
jednotek/ml	—	—	0,02

Po 1 minutě inkubace při 25 °C se odečte Ej a přidá se difenoloxidáza 200 jednotek/ml

0,05 0,05 0,05

Po 17 minutách inkubace při 25 °C se odečte E2 a vypočítá se ΔΕ = E2 — E_t

ΔΕ

0,890 0,485 0,896

Kyveta 1 odpovídá nerušenému měření.

V kyvetě 2 sníží 2 ^moly askorbátu teoretickou hodnotu o 47 %, toto snížení je v kyvetě 3 zcela odstraněno přidáním 10 jednotek askorbátoxidázy.

Příklad 8

Testovací papírky ke stanovení glukózy v moči

Filtrační papír se ponoří do roztoku následujícího složení a pak se suší při 50 °C.

1,2 M. citrátový pufr o pH 5 50,0 ml

9- (y-dimethylaminopr opyl) -6-chlor-B-aminokarbazoldihydrochlorid 0,05g glukózooxidáza 104 jednotek/mg 0,25 g peroxidáza 63 jednotek/mg 0,0,g askorbátoxidáza 100 jednotek/mg 1,00 g vódá 100,00 ml

Papírek se po styku s močí, obsahující glukózu zbarví červenooranžově až červenočerveně. Po reakční době 2 minuty dávají moče s obsahem glukózy a . kyseliny askorbové až do . koncentrace 150 mg/dl totéž zbarvení.

Při použití papírků téhož složení bez askorbátoxidázy je podle obsahu glukózy reakční zbarvení při koncentraci kyseliny askorbové od 50 mg/dl oslabeno nebo zcela potlačeno.

Příklad 9

Zkušební papírky ke stanovení krve v moči

Fitrační papír se impregnuje následujícím roztokem a pak se suší při 40 °C.

Roztok 1

1,2 M citrátového pufru o pH 2,55 35,0 ml

dvojsodná sůl kyseliny ethylendiamintetraoctové 0,1g dioktylnatriumsulfosukcinát 0,5g

2,5-dimethylhexan-2,5-dihydro- peroxid (70 %) 1,6g trimorfolid kyseliny fosforečné 12,7g askorbátoxidáza 100 jednotek/mg 0,3g methanol 30,0 ml voda do 100,0 ml

Roztok 2

3,3‘,5,5‘-tetramethylbenzidin0,3 g fenanthridin0,2 g toluol/petrolether (30 : 70) do 100,0 ml

Při použití tohoto papírku je možno zjistit přítomnost 5 červených krvinek v 1 mm³ v moči i za přítomnosti 30 až 50 mg kyseliny askorbové na 100 ml. Při použití papírku téhož složení bez askorbátoxidázy není možno průkaz provádět již za přítomnosti 10 až 20 mg kyseliny askorbové/100 mililitrů moči.

Příklad 10

Zkušební papírek A

Papírek z příkladu 9 bez askorbátoxidázy.

Zkušební papírek В

Ve vodě rozpustný papír z karboxymethylcelulózy o plošné váze 60 g/cm² se nasytí roztokem 20% ledové kyseliny octové v methanolu za účelem neutralizace. Pak se papírek postříká vodným roztokem askorbátoxidázy o koncentraci 10³ jednotek/ml a usuší se.

Zkušební papírek В se položí na papírek A a oba papírky se uloží na podložní polyesterovou fólii a kryjí nylonovou sítí. Zkoumaný vzorek moči se kape na takto vzniklé proužky.

Byly získány tytéž výsledky jako v příkladu 9.

Příklad 11

Zkušební papírek ke zjištění krve ve stolici

Filtrační papír se postupně nasytí následujícími roztoky a suší při teplotě 40 ^CC.

Roztok 1

1,2 M citrátový pufr o pH 5,25 10 ml askorbátoxidáza 100 jednotek/mg 0,3 g voda do 100,0 ml

Roztok 2 guajaková pryskyřice 3 g toluol do 100,0 ml

Roztok se zfiltruje a filtrát se užije к impregnaci filtračního papíru.

Získá se zkušební papírek, na nějž se nanese vzorek stolice. V případě, že se na zadní stranu papírku nanese 3% vodný roztok peroxidu vodíku, vytvoří se modré zbarbení v případě, že stolice obsahuje alespoň 2 % krve. Toto zbarvení se vyvine také za přítomnosti kyseliny askorbové v množství 15 mg/100 g, kdežto při použití zkušebního papírku bez askorbátoxidázy se zbarvení vůbec nevyvine.

Claims

PŘEDMĚT

1. Činidlo к enzymatickému stanovení substrátů nebo enzymatické účinnosti sestávající ze systému pro stanovení substrátu nebo enzymu pomocí redox-reakce jako měřicí reakce, vyznačující se tím, že obsahuje askorbátoxidázu.

VYNÁLEZU
2. Činidlo podle bodu 1, vyznačující se tím, že je naneseno na impregnaceschopný nosný materiál, s výhodou papír.