CS263655B1 - NNcttatickks stanovenidiagnosticky významných aouMctfMaloiicfcých - Google Patents

Abstract

Řešením je diagnostický prostředek ke stanoveni součásti biologických kapalin, které v průběhu pomocných reakci generují peroxid vodíku. Prostředek podle vynálezu se proti známému stavu techniky vyznačuje tím, že obsahuje jako akcelerátor oxidačně kopulačnl reakce povrchově aktivní látku kationaktivního typu, například cetyltrimethylamonium chlorid, cetylpyridinium bromid, benzyldimethylhexadecylamonium chlorid nebo p-terc-oktylfenoxyethoxyethyl-dimethylbenzylamonium chlorid.

Description

Předmětem vynálezu je diagnostický prostředek ke stanoveni diagnostických součástí biologických kapalin, které v průběhu vhodných pomocných reakcí generují peroxid vodíku a jejichž stanovení je založeno na principu barvotvorné oxidační kopulace.

Při stanovení řady diagnosticky významných součástí biologických kapalin, jako je např. krev, sérum nebo moč, se v klinické biochemii používá specifických enzymových reakcí, pomocí nichž se stanovovaná látka - analyt oxiduje vzduěným kyslíkem za současného vzniku peroxidu vodíku. Typickým příkladem je stanovení glukosy, která se za přítomnosti enzymu glukosaoxidasy oxiduje na kyselinu glukonovou případně glukoňolakton a ekvivalentní množství peroxidu vodíku. Obdobně lze však stanovit i kyselinu močovou, cholesterol nebo tzv. triglyceridy, použijí-li se specifické oxidoreduktasy, urikasa, cholesteroloxldasa nebo glycerofosfátoxidasa. Analyticky velmi obtížné stanovení původních složitých analytů se tak převádí na stanovení poměrně velmi jednoduché látky - peroxidu vodíku, k jehož stanovení se využívá jeho poměrně silných oxidačních vlastností. Nejvhodnější a také k tomuto stanovení nejvíce užívaný princip je oxidace vhodného bezbarvého redox-indikátoru na barevné oxidační produkty, jejichž množství je ekvivalentní množství peroxidu vodíku a tím i množství původního analytu. Po desítky let se k tomuto účelu užívaly prakticky výlučně redox-indikátory benzidinového typu, jako například o-tolidin, o-dlanlsidin nebo 3,3,5,5-tetramethylbenzidin. Nověji byly tyto Indikátory nahrazeny systémy, sestávajícími z nukleofilní dusíkaté sloučeniny, jako například primárního aromatického nebo heterocyklického aminu nebo heterocyklického hydrazonu a kopulace schopné sloučeniny, jako jsou například fenoly, naftoly, sekundární aromatické aminy nebo látky s aktivní methylenovou skupinou. Tyto bezbarvé složky chromogennlho systému vstupují působením peroxidu vodíku za přítomnosti specifického enzymu peroxidasy do oxidačně-kopulační reakce za vzniku intenzívně zbarvených chinoniminových nebo diazamerocyaninových barviv.

Uvedené oxidačně-kopulační reakce jsou v klinické biochemii užívány ke stanovení výše uvedených, diagnosticky významných součástí tělních kapalin jak v roztoku, kde se intenzita vzniklého zbarvení měří absorpciometricky, tak i na tzv. diagnostických proužcích, u nichž se vyhodnocování vybarvení vzniklého na porézním nosiči provádí bud vizuálně nebo změřením reflektance. V obou těchto případech má však uvedený chromogenní systém, jakkoliv výhodný proti dříve užívaným jednoduchým redox-indikátorům, nedostatek v tom, že oxidační kopulace probíhá i za katalytického působeni enzymu peroxidasy poměrně pomalu, neboř ke kvantitativnímu proběhnutí reakce a tím i ke vzniku maximálního zbarvení dojde teprve za delší dobu.

Tento nedostatek se zvlášř výrazně projevuje u zmíněných diagnostických proužků, u nichž všechna činidla potřebná pro žádoucí průběh stanovení jsou inkorpořována do porézního nosiče, například filtračního papíru. U těchto diagnostických prostředků je pak průběh oxidačně-kopulační reakce zpomalen zvláště tehdy, je-li nosič opatřen na svém povrchu semipermeabilní membránou, sloužící k zadržení krevních elementů na povrchu nosiče.

Uvedený nedostatek odstraňuje předložené řešení prostředku ke stanoveni diagnosticky významných součástí tělních kapalin, které se pomoci specifických enzymových reakcí převádějí na oxidační rpodukty za současného vzniku ekvivalentního množství peroxidu vodíku, jehož stanovení je založeno na principu oxidační kopulace. Jeho podstata spočívá v tom, že obsahuje jako akcelerátor oxidačně-kopulační reakce povrchově aktivní látku kationaktivního typu, jako například eetyltrimethylamonium chlorid nebo p-terc-oktylfenoxyethoxyethyl-dimethylbenzylamonium chlorid.

Prostředek dle tohoto vynálezu obsahuje vedle chromogennlho systému a výše uvedené povrchově aktivní látky kationaktivniho typu další o sobě známé a pro obdobné účely běžně užívané látky, jako jsou specifické oxidoreduktasy, peroxidasa, tlumič a popřípadě i vhodné stabilizátory.

Specifické oxidoreduktasy slouží, jak bylo uvedeno již výše, k enzymovému převedení původního analytu nebo jeho transformovaného produktu na oxidační produkt a ekvivalentní množství peroxidu vodíku. U prostředků pro stanovení glukosy je to enzym glukosaoxidasa (EC 1.1.3.4), pro stanovení kyseliny močové pak enzym urikasa (EC 1.7.3,3). V prostředcích pro stanovení cholesterolu a triglyceridů pak enzymy cholesteroloxidasa (EC 1.1.3.6), případně L-glycerofosfát-oxidasa (EC 1.1.3). Prostředky pro stanovení cholesterolu a triglyceridů však obsahují i další pomocné enzymy, jako je cholesterolesterasa (EC 3.1.1.13), v prostředku pro stanovení triglyceridů pak celá řada specifických enzymů, katalýzujících převedení původního analytu, triglyceridů, na glycerol-3-fosfát, přístupný kopulační oxidasové reakci. Tyto složitější enzymové systémy jsou o sobě známé a v klasické biochemii používané již po řadu let.

Jak bylo uvedeno již výše, peroxid vodíku vzniklý v průběhu popsané oxidasové reakce, oxiduje bezbarvý chromogenní systém za vzniku intenzívně zbarvených kopulačních produktů.

Tato reakce však rpobíhá velmi zvolna; běžnou součásti všech obdobných prostředků ke stanoveni výše uvedených analytů - a tudíž i prostředků dle vynálezu - proto je enzym peroxidasa (EC 1.11.1.7), která je katalyzátorem oxidačního účinku peroxidu vodíku.

Další nezbytnou složkou prostředku dle vynálezu je chromogenní systém, sestávající z bezbarvých komponent, schopných působením peroxidu vodíku vstoupit do oxidačně-kopulační reakce, jejímž výsledkem je intenzívně zbarvené chinoniminové nebo diazamerocyaninové barvivo Jako tzv. aktivní komponenty jsou k tomu nejčastěji užívány aromatické nebo heterocyklické aminy, zejména 4-aminoantipyrin a/nebo heterocyklické hydrazony, jako například N-methyl-2-benzthiazolinonhydrazon. Jako pasivní komponenty je pak možné použít různé fenoly nebo naftoly, sekundární nebo terciární aromatické nebo heterocyklické aminy a konečně i některé sloučeniny s aktivní methylenovou skupinou.

Prostředek dle vynálezu obsahuje dále tlumič, jehož úkolem je vytvářet nejen optimální pH pro konečnou oxidačně-kopulační reakci, ale i pro všechny výše popsané enzymové reakce, potřebné pro transformaci původního analytu na jeho oxidační produkt a peroxid vodíku. Pro tento účel může prostředek dle vynálezu obsahovat jakýkoliv z obecně známých a běžně užívaných tlumičů o pH 4,0 až 9,0, jako jsou například tlumiče citrátové, fosfátové, tlumiče na bázi tris-(hydroxymethyl)-aminomethanu a podobně.

Další účinnou složkou prostředku dle vynálezu mohou být tzv. zahuštovadla, což jsou přirozené nebo syntetické polymerní látky, jako například želatina, karaginan, alginát, polyvinylpyrrolidon, polyvinylalkohol aj. Tato zahuštovadla celý reakční systém prostředku stabilizují a mají i pozitivní vliv na zvýraznění vzniklého zabarvení.

Další nezbytnou a hlavní součástí prostředku, přinášející vlastní technický účinek vynálezu, je kationaktivní povrchově účinná látka, jako jsou například chloridy nebo bromidy cetyltrimethylamonia, cetylpyridinia, benzyldimethyl-hexadecylamonia, dimethyloktyl-benzylamonia apod. Použití povrchově aktivních látek v analogických prostředcích jako aktivátorů konečné barvotvorné reakce je sice principielně známé již řadu let, dosud se však pro tento účel vždy používaly výlučně látky neionogenního nebo anionaktivního typu. O povrchově aktivních látkách kationaktivního typu se dosud naopak soudilo, že jsou buč zcela bez účinku nebo naopak průběh oxidačně-kopulační reakce dokonce mírně zpomalují. Důvodem pro tento závěr byla skutečnost, že kationaktivní látky kvantitativně srážejí bílkoviny vyšetřovaných biologických kapalin a tím by mohly průběh všech potřebných reakcí negativně ovlivňovat. Zjištění, že kationaktivní látky naopak průběh oxidačně-kopulační reakce značně urychlují, je proto překvapivé a je také uplatněno v prostředku dle tohoto vynálezu. Tento nový a neočekávaný účinek se zvláště silně uplatňuje u dg. proužků, jejichž povrch je pokryt semipermeabilní membránou k oddělení krevních elementů, je možné reakční dobu zkrátit až na polovinu, obsahuje-li reakční systém vhodný kationaktivní tensid, jak je zřejmé z obr. 1, na němž je ukázán rozdíl v rychlosti vývoje zbarvení u proužků pro stanovení glukosy v krvi, obsahujících dosud užívaný neionogenní nebo anionaktivní tensid (křivky A, B) a tensid kationaktivního typu dle vynálezu (křivka C).

Význam tohoto vynálezu spočívá tedy v tom, že u všech dosud vyráběných proužků je nutné po odstranění krevních elementů s povrchu proužků, což je obvykle 30 až 60 s po nanesení krve, vyčkat ještě další 1 až 2 min, než může být vzniklé zabarvení vyhodnoceno. Tuto dobu je nutné velmi přesně dodržet, neboř jinak dochází ke zkresleným nálezům obsahu glukosy, lišícím se od správné hodnoty až o - 50 % relat. Naproti tomu u prostředku, obsahujícího dle vynálezu kationaktivní povrchově účinnou látku je možné výsledek vyhodnotit bu3 ihned, nebo nejdéle do 30 s po odstranění krevních elementů; navíc vzniklé zbarvení je přítomností kationativní povrchově účinné látky stabilizováno do té míry, že se dále již nemění po dobu až několika hodin nebo i dnů.

Přiklad l

Diagnostické proužky ke stanovení glukosy v kapilární krvi

Filtrační papír o plošné hmotnosti 180 g/m se naimpregnuje postupně roztoky o níže uvedeném složení do nasycení tak, že se mezi každou impregnací důkladně vysuší proudem vzduchu o teplotě 50 až 55 °C. Takto připravený papír se pak rozřeže na čtverečky o rozměru 6x6 mm, které se nalepí nakonec podložky z plstické hmoty o rozměrech 6x85 mm.

Impregnační roztok I;

Fosfátový tlumič o koncentraci

0,2 mol/1, pH = 6,0	30,0	ml
želatina; 1,5% vodný roztok	20,0	ml
glukosaoxidasa	40	ku
peroxidasa	5	kU
Impregnační roztok II:
methanol	25	ml
voda destilovaná	12	ml

l-(4'-sulfofenyl)-3-methyl-5-pyrazolon 1,10 g 4-aminoantipyrin 0,31 g benzyl-dimethyl-hexadecyl-amonium chlorid, 2% ethanolový roztok 17,0 ml

Impregnační roztok III:

methylhydroxymethylcelulosa, 3% roztok ve směsi methanol-dichlormethan 1:1 20,0 ml ethylcelulosa, 4% roztok v toluenu 15,0 ml polyvinylacetát B 20 H, 5% roztok v ethanolu 17,5 ml

Stanovení glukosy pomocí těchto proužků se provede tak, že se na indikační zónu proužku nanese kapka kapilární krve. Po 1 min se kapka 8 povrchu odstraní opláchnutím vodou nebo setřením pomocí navlhčené buničité vaty. Vzniklé červené zbarvení proužku se semikvantitativně vyhodnotí vizuálním porovnáním se zkusmo zhotovenou barevnou srovnávací stupnicí. Tyto. proužky, které indikují spolehlivě a přes ně obsah glukosy v kapilární krvi v koncentračním rozmezí 6 až 44 mmol/1 glukosy, je možné použít bu3 jako takové nebo v kombinaci uvedené indikační zóny sé zónou, obsahující jako chromogen například 3,3',5,5'-tetramethylbenzidin a která je vhodná ke stanovení koncentrací glukosy v rozmezí 2 až 10 mmol/1; výhodnou kombinaci obou těchto zón na jednom proužku popisuje například US patent č. 4 427 770.

Příklad 2

Proužky ke stanovení kyseliny močové v séru

Proužky se připraví způsobem uvedeným ΐ impregnačních roztoků:

Impregnační roztok I:

methanol voda destilovaná

4-aminoantipyrin primachin-difosfát p-terc-oktylfenoxy-ethoxy-ethyl-dimethyl-benzylamonium chlorid

Impregnační roztok II:

fosfátový tlumič o konc. 0,2 mol/1 a pH 7,0 urikasa hydroxypropylcelulosa, 28 vodný roztok peroxidasa

Příklad 3

Proužky ke stanovení glukosy v moči

Proužky se připraví způsobem uvedeným v nich roztoků:

Impregnační roztok I:

fosfátový tlumič pH 6,3 o konc. 0,2 mol/1 želatina; 1% vodný roztok tlukosaoxidasa peroxidasa

Impregnační roztok II:

methanol voda destilovaná l-fenyl-3-methyl-5-pyryzolon

4-aminoantipyrin tartrazin o-dianisidin

1-(4'-sulfofenyl)3,4-dimethyl-5-pyrazolon cetyltrimethylamonium bromid příkladu 1, avšak s použitím následujících

10,0 ml 10,0 ml 0,6 g 1,3 g

0,15 g

20,0 ml 1,6 U 10,0 ml 3,0 0 příkladu 1, avšak s použitím těchto impregnač36,0 ml 20,0 ml 39,6 kU

6,0 kU

30,0 ml 16,0 ml 0,9 g 0,2 g

0,02 g 0,80 g

0,40 g 0,40 g

Tyto proužky indikuji vznikem světle červeného až temně červenohnědého zbarvení přitom nost glukosy v moči v rozmezí 2 až 170 mmol/1, přičemž koncentraci glukosy ve vyšetřovaném vzorku lze s poměrně vysokou spolehlivostí stanovit vizuálním porovnáním zbarvení proužku se zkusmo zhotovenou srovnávací stupnicí.

Claims (1)

1. P ft E D Μ 6 T VYNÁLEZU

   Prostředek ke stanovení diagnosticky významných součástí biologických kapalin, které se pomocí specifických enzymových reakcí převádějí na své oxidační produkty za současného vzniku ekvivalentního množství peroxidu vodíku, jehož stanovení je založeno na principu oxidačně-kopulační reakce, vyznačený tím, že obsahuje jako akcelerátor oxidačně-kopulační reakce povrchově aktivní látku kationaktivního typu, jako například cetyltrimethylamonium chlorid, cetylpyridinium bromid, benzyldimethylhexadecylamonium chlorid nebo p-terc-oktylfenoxyethoxyethy1-dimethylbenzylamonium chlorid.