NL9420013A - Farmaceutische preparaten voor het voorkomen en behandelen van kankerachtige ziekten en werkwijze voor de bereiding ervan. - Google Patents

Description

Farmaceutische preparaten voor het voorkomen en behandelen van kankerachtige ziekten en werkwijze voor de bereiding ervan

Deze uitvinding heeft betrekking op farmaceutische preparaten voor het voorkomen en de behandeling van kankerachtige ziekten en een werkwijze voor de bereiding ervan.

In de kankertherapie zijn de meest frequent toegepaste methoden de chirurgische, de bestralings- en de chemothe-rapeutische behandelingen {The Pharmacological Basis of Therapeutics, Pergamon Press, Inc., New York, hlz. 1202-1263 (1990); Harrison's Principles of Internal Medicine, 12e uitg., International Edition, McGraw-Hill, Inc., New York, deel 2, biz. 1587-1599 (1991); Scientific American Medicine, Scientific American, Inc., New York, deel 2, 12(V), biz. 1-14 (1984)]. Bij radiotherapie, worden, naast de breed toegepaste ionisaties, in speciale gevallen fototherapie en plaatselijke hyperthermie in combinatie met bestraling en chemotherapie toegepast, bijvoorbeeld bij huidcarcinoom. Ingedeeld naar de effecten, oorsprong en structuur, kunnen onder de middelen voor chemotherapie alkylerende middelen, plantenalkaloïden, antibiotica, antimetabolieten, andere remedies (bijv. asparaginase) en de vaak toegepaste verschillende hormonen worden aangetroffen. De recent toegepaste strategiën bij chemotherapie zijn de volgende: combinatiechemotherapie; langdurige, veneuse of arteriële infusie van chemotherapeutische geneesmiddelen met geringe dosis voor het verminderen van de toxiciteit; hoge dosis chemotherapie om geneesmiddelresistentie te overwinnen en dezelfde therapie in combinatie met autologe transplantatie van beenmerg; chemotherapeutische geneesmiddelen in combinatie met biologische responswijzigende middelen; toepassing van adjuvans en neoadjuvans chemotherapie in grotere mate. De meest frequente toegepaste biologische responswijzigende middelen zijn: interferonen, tumornecrosefactor, lym-fokinen, bijv. interleukine-2, en monoclonale antilichamen. Verschillende dieetmethoden, enigszins opgehélderde serumpre-paraten en de Simonton methode waarbij gebruik gemaakt wordt van psychogene effecten behorend tot de momenteel toegepaste werkwijzen voor de behandeling van tumorachtige ziekten, waarvan de doelmatigheid nog niet is bewezen.

De meest kenmerkende nadelen van de momenteel toegepaste in de hier bovengenoemde referenties toegepaste methoden zijn: toxiciteit, aanzienlijke nadelige effecten, geringe tumor specificiteit, ontwikkeling van resistentie en beperkte omvang van de effectiviteit. De meeste bij kankertherapie gebruikte cytotoxische geneesmiddelen maken geen onderscheid tussen neoplastische en zich normaal vermenigvuldigende cellen; derhalve moeten, om onherstelbare schade aan de vitale gastheerweefsels (bijv. beenmerg, ingewanden) te vermijden, geneesmiddelen worden toegediend in doses die gewoonlijk onvoldoende zijn om alle aanwezige neoplastische cellen uit te roeien [Pharmac. Ther., 49, 43-54 (1991)]. Radiotherapie kan stralingsschade veroorzaken en is tegelijkertijd niet zo doelmatig bij hypoxiale cellen en bepaalde soorten tumoren. Bij chemotherapie gebruikte geneesmiddelen hebben eveneens uiteenlopende toxische neveneffecten. Zij kunnen het centraal zenuw-stelstel, hematopoiëtische organen, slijmvliezen van maag en ingewanden en alle zich vermenigvuldigende cellen beschadigen. Daarenboven kunnen zij eveneens schade aanrichten aan lever, nier, long en hartspier. Vrijwel alle doelmatige antitumormid-delen zijn immuunsystemen onderdrukkend [Proc. Roy. Soc. Med., 63. 1063-1066 (1970)]. Veel ervan hebben teratogene of carcin-ogene effecten, zij kunnen soms onvruchtbaarheid veroorzaken of het optreden van de secundaire toename van tumoren verhogen. Het is moeilijk of onmogelijk 60-70% van de tumoren middels chemotherapie te beïnvloeden en tijdens behandeling kan zich ook resistentie of kruis-resistentie ontwikkelen.

Ongelukkigerwijs hebben behandelingen die gebruikmaken van biologische responswijzigendemiddelen waarbij van het eigen afweersysteem van het organisme gebruik wordt gemaakt vergelijkbare nadelen, aangezien zij alleen doelmatig blijken te zijn voor een paar soorten tumoren en daarnaast eveneens toxische neveneffecten hebben [Harrison's Principles of internal Medicine, 12de nitg., International Edition McGraw-Hill, Inc., New York, deel 2, biz. 1587-1599 (1991)]. Interferonen kunnen eveneens veel en ernstige ongewenste effecten hebben, waaronder bijv. cardiotoxiciteit [Chest, 99. 557-561 (1991)]. Ook de verwachtingen van monoclonale antilichamen worden niet gerealiseerd [Pur. J. Cancer, 27. 936-939 (1991)]. Ofschoon sinds 1980 meer dan vierhonderd geregistreerde klinische immu- notherapie-experimenten zijn uitgevoerd, is er nog geen één geïntroduceerd als behandeling voor enige soort kanker [J.R. Soc. Med., 84, 321 (1991)].

De PCT publikatie nr. WO 86/025555 heeft betrekking op een bij de behandeling van kankerachtige ziekten gebruikt geneesmiddel dat L-cysteïne, L-methionine, L-histidine, L-fe-nylalanine, L-lysine, L-tryptofaan, L-valine, L-leucine, L-threonine, L-appelzuur en L-ascorbinezuur omvat. L-appelzuur en L-ascorbinezuur werken als activatorbuffer en stabiliseren de aminozuren in de zure vorm ervan en zij veroorzaken derhalve een wijziging van de bloed pH-waarde in het zuurbereik beneden 6,8. In deze publikatie staan geen gegevens die het stoppen van de groei of zelfs regressieve van kwaadaardige tumoren bevestigen.

De gepubliceerde Japanse octrooiaanvrage Nr. 62-135.421 heeft betrekking op een aminozuurtransfusie oplossing die specifieke aminozuren bevat, met uitzondering van L-isoleucine, welke in staat is een remmende werking uit te oefenen op tumorvermeerdering. Het mogelijke maar onbewezen effect van dit preparaat kan zijn gebaseerd op een aminozuur, bijv. isoleucine, beperking.

Het doel van de onderhavige uitvinding is om farmaceutische preparaten te bereiden die natuurlijke stoffen bevatten om de nadelen, bijv. toxiciteit, geringe specifiteit en beperkte omvang van de effectiviteit, van de bekende samenstellingen en werkwijzen voor tumortherapie op te heffen.

De uitvinding is gebaseerd op de herkenning van een passief afweersysteem [hierna Passief Antitumor Afweer Systeem (PADS) genoemd] tegen tumorcellen in verschillende organismen. Dit systeem is in staat de tumorcellen die ontstaan en reeds bestaan te vernietigen. De stoffen die aan PADS deelnemen zijn endogene en exogene natuurlijke stoffen die in het vaatstelsel voorkomen, namelijk aminozuren, vitaminen, nucleïnezuurbazen, koolhydraten en metabole produkten van cellen. Er is ingezien dat het gezamelijk gebruik van ten minste drie van deze stoffen - die bestanddelen zijn van het vaatstelsel en derhalve alle cellen kunnen bereiken en binnendringen - het effect van elkaar synergistisch vergroten en derhalve in staat zijn tumorcellen te vernietigen.

De uitvinding is verder gebaseerd op het inzicht dat tengevolge van het synergisme er een significant kwalitatief verschil zal zijn tussen normale en tumorcellen in hun gedrag ten aanzien van aan PADS deelnemende stoffen, waarbij twee soorten cellen onderscheidbaar worden.

Terwijl het klassieke immuumsysteem tumorcellen kan herkennen en selectief vernietigen vanwege de uitwendige afwijkingen ten opzichte van normale cellen ervan, kan het nieuw gevonden passieve antitumor afweermechanisme hetzelfde doen als reactie op interne afwijkingen.

De uitvinding is verder gebaseerd op het inzicht dat., ten gevolge van de toename van de concentratie van de bestanddelen ervan in het vaatstelsel in een zodanige mate dat er te veel aan tumorcellen worden toegevoerd, de bovengenoemde samenstelling selectieve fatale metabolische belasting in kankercellen veroorzaakt.

De uitvinding is tenslotte gebaseerd op het inzicht dat, afhankelijk van de toegepaste dosering en de wijze van toediening, in verschillende tumorcellen een preventief of anti-tumor effect kan worden bereikt. In het geval van verschillende soorten tumoren die in verschillende mate van normale cellen afwijken, kan de kwalitatieve en kwantitatieve samenstelling van het meest doelmatige mengsel worden bepaald onder gebruikmaking van synergie als criterium.

Op basis van het bovenstaande heeft de uitvinding betrekking op farmaceutische preparaten voor het voorkomen en behandelen van kankerachtige ziekten, die ten minste drie actieve bestanddelen die in het vaatstelsel voorkomen bevatten: ten minste één aminozuur, ten minste één vitamine en ten min-ste één lid gekozen uit de groep bestaande uit adenine, 2-de-soxy-D-ribose, D-mannose, D-glucosamine, appelzuur, oxaal-azijnzuur, adenosinetrifosfaat en/of de farmaceutische aanvaardbare zouten ervan, onder de voorwaarde dat indien de samenstelling naast aminozuur(en) alleen appelzuur en een vitamine bevat, de vitamine die geen ascorbinezuur kan zijn. De preparaten kunnen eveneens dragers, verdunningsmiddelen en/of andere gebruikelijk in de farmacie toegepaste hulpmiddelen bevatten.

De samenstelling volgens de uitvinding kan L-methio-nine, L-tryptofaan, L-tyrosine, L-fenylalanine, L-arginine, L-histidine, N-benzoylglycine en/of een zout daarvan als amino- zuur en d-biotine, pyridoxine, riboflavine, ribofavine-5'-fosfaat, L-ascorbinezuur, liponzuur, orootzuur en/of een zout daarvan als vitamine bevatten.

Een samenstelling volgens de uitvinding dié de voorkeur geniet omvat L-tryptofaan, L-ascrobinezuur, ten minste één lid gekozen uit de groep bestaande uit adenine, 2-desoxy-D-ribose, D-glycosamine en/of de farmaceutische aanvaardbare zouten ervan.

Een andere samenstelling volgens de uitvinding die de voorkeur geniet omvat L-arginine, ribofavine-5'-fosfaat, ten minste één lid gekozen uit de groep bestaande uit D-mannose, appelzuur, adenosinetrifosfaat en/of de farmaceutische aanvaardbare zouten ervan.

Een andere samenstelling volgens de uitvinding die de voorkeur geniet omvat 30-44 gew.% L-arginine, 27-35 gew.% ribof avine-5 '-fosfaat, 38-62 gew.% appelzuur en/of de farmaceutisch aanvaardbare zouten ervan.

Een verdere samenstelling volgens de uitvinding die de voorkeur geniet omvat 0,002-70 gew.% van ten minste één lid gekozen uit de groep bestaande uit L-methionine, L-tryptofaan, L-tyrosine, L-fenylalanine, L-arginine, L-histidine, N-ben-zoylglycine en/of de zouten ervan als aminozuur, 0,0004-80 gew.% van ten minste één lid gekozen uit de groep bestaande uit d-biotine, pyridoxine, riboflavine, riboflavine-5'-fosfaat, L-ascorbinezuur, liponzuur, orootzuur en/of de zouten ervan als vitamine en 0,003-80 gew.% van ten minste één lid gekozen uit de groep bestaande uit adenine, 2-desoxy-D-ribose, D-mannose, D-glucosamine, appelzuur, oxaalazijnzuur, adenosi-netrifosfaat en/of de farmaceutisch aanvaardbare zouten ervan.

Een andere samenstelling volgens de uitvinding die de voorkeur geniet omvat 0,9-25 gew.% L-methionine, 0,8-19 gew.% L-tryptofaan, 1,1-48 gew.% L-arginine, 0,9-46 gew.% d-biotine, 1,2-16 gew.% pyridoxine, 0,03-42 gew.% riboflavine-5'-fosfaat, 0,05-18 gew.% D-glucosamine, 0,5-60 gew.% 2-desoxy-D-ribose, 0,7-68 gew.% appelzuur, 0,6-40 gew.% D-mannose en/of de farmaceutisch aanvaardbare zouten ervan.

Een zeer doelmatige samenstelling volgens de uitvinding omvat 0,005-34 gew.% L-methionine, 0,002-25 gew.% L-tryptofaan, 0,02-23 gew.% L-tyrosine, 0,04-30 % L-fenylalanine, 0,04-50 gew.% L-arginine, 0,03-34 gew.% L-histidine, 0,05-22 gew.% N-benzoylglycine, 0,01-60 gew.% d-biotine, 0,01-20 gew.% pyridoxine, 0,0004-45 gew.% riboflavine, 0,0005-45 gew.% ri-boflavine-5'-fosfaat, 0,003-70 gew.% L-ascorbinezuur, 0,004-15 gew.% liponzuur, 0,01-17 géw.% orootzuur, 0,001-10 gew.% adenine, 0,01-63 gew.% 2-desoxy-D-ribose, 0,08-42 gew.% D-manno-se, 0,05-20 gew.% D-glucosamine, 0,01-80 gew.% appelzuur, 0,02-60 gew.% oxaalazijnzuur, 0,001-10 gew.% adenosinetrifos-faat en/of de farmaceutisch aanvaardbare zouten ervan.

Een verder doel van deze uitvinding is een werkwijze voor het bereiden van de bovengenoemde samenstelling welke omvat het mengen van van de actieve verbindingen die in het vaatstelstel voorkomen ten minste één aminozuur, ten minste één vitamine en ten minste één lid gekozen uit de groep bestaande uit adenine, 2-desoxy-D-ribose, D-mannose, D-glucosa-mine, appelzuur, oxaalazijnzuur, adenosinetrifosfaat en/of de farmaceutische aanvaardbare zouten ervan tot een farmaceutisch preparaat. Dragers, verdunningsmiddelen en/of andere gebruikelijk in de farmacie toegepaste hulpmiddelen kunnen eveneens met het actieve preparaat worden samengemengd in een hoeveelheid die nodig is om het gewicht van de samenstelling tot 100% aan te vullen.

Een uitvoeringsvorm van de werkwijze die volgens de uitvinding die de voorkeur geniet omvat het mengen van L-tryp-tofaan, L-ascorbinezuur, ten minste één lid gekozen uit de groep bestaande uit adenine, 2-desoxy-D-ribose, D-glucosamine en/of de farmaceutische aanvaardbare zouten ervan voor het bereiden van een farmaceutisch preparaat.

Een andere uitvoeringsvorm van de werkwijze volgens ^ de uitvinding die de voorkeur geniet omvat het mengen van L-arginine, riboflavine-5'-fosfaat, ten minste één lid gekozen uit de groep bestaande uit D-mannose, appelzuur, adenosinetrifosfaat en/of de farmaceutisch aanvaardbare zouten ervan voor de bereiding van een farmaceutisch preparaat.

Een verdere uitvoeringsvorm van de werkwijze omvat het mengen 30-44 gew.% L-arginine, 27-35 gew.% riboflavine-5'-fosfaat, 38-62 gew.% appelzuur en/of de farmaceutische aanvaardbare zouten ervan voor de bereiding van een farmaceutisch preparaat.

Een voorkeursuitvoeringsvorm van de werkwijze volgens de uitvinding omvat het mengen van 0,002-70 gew.% van ten min- ste één lid gekozen uit de groep bestaande uit L-methionine, L-tryptofaan, L-tyrosine, L-fenylalanine, L-arginine, L-histi-dine, N-benzoylglycine en/of de zouten ervan als aminozuur, 0,0004-80 gew.% van ten minste één lid gekozen uit de groep bestaande uit d-biotine, pyridoxine, riboflavine, riboflavine-5'-fosfaat, L-ascorbinezuur, liponzuur, orootzuur en/of de zouten ervan als vitamine en 0,003-80 gew.% van ten minste één lid gekozen uit de groep bestaande uit adenine, 2-desoxy-D-ribose, D-mannose, D-glucosamine, appelzuur, oxaalazijnzuur, adenosinetrifosfaat en/of de farmaceutisch aanvaardbare zouten ervan om een farmaceutisch preparaat te bereiden.

Een andere voorkeursuitvoeringsvorm van de werkwijze volgens de uitvinding omvat het mengen van 0,9-25 gew.% L-methionine, 0,8-19 gew.% L-tryptofaan, 1,1-48 gew.% L-argini-ne, 0,9-46 gew.% d-biotine, 1,2-16 gew.% pyridoxine, 0,03-42 gew.% riboflavine-5'-fosfaat, 0,05-18 gew.% D-glucosamine, 0,5-60% gew.% 2-desoxy-D-ribose, 0,7-68 gew.% appelzuur, 0,6-40 gew.% D-mannose en/of de farmaceutisch aanvaardbare zouten ervan om een farmaceutisch preparaat te bereiden.

Een uitvoeringsvorm van de werkwijze volgens de uitvinding die sterk de voorkeur geniet omvat het mengen van 0,005-34 gew.% L-methionine, 0,002-25 gew.% L-tryptofaan, 0,02-23 gew.% L-tyrosine, 0,04-30 gew.% L-fenylalanine, 0,04-50 gew.% L-arginine, 0,03-34 gew.% L-histidine, 0,05-22 gew.% N-benzoylglycine, 0,01-60 gew.% d-biotine, 0,01-20 gew.% pyridoxine, 0,0004-45 gew.% riboflavine, 0,0005-45 gew.% ribofla-vine-5'-fosfaat, 0,003-70 gew.% L-ascorbinezuur, 0,004-15 gew.% liponzuur, 0,01-17 gew.% orootzuur, 0,001-10 gew.% ade-nine, 0,01-63 gew.% 2-desoxy-D-ribose, 0.08-42 gew.% D-mannose, 0,05-20 gew.% D-glucosamine, 0,01-80 gew.% appelzuur 0,02-60 gew.% oxaalazijnzuur, 0,001-10 gew.% adenosinetrifosfaat en/of de farmaceutisch aanvaardbare zouten ervan om een farmaceutisch preparaat te bereiden.

Voor therapeutisch gebruik worden de samenstellingen volgens de uitvinding geschikt op een zodanige wijze tot farmaceutische preparaten verwerkt dat, na het mengen ervan met niet-toxische inerte, vaste of vloeibare dragers, verdunnings-middelen, bindmiddelen en/of andere gebruikelijk in de farmaceutische industrie voor enterale of parenterale toediening toegepaste toevoegingen, zij tot één van de gebruikelijke ge- neesmiddelsamenstellingen worden omgezet. Dragers, verdun-ningsmiddelen en bindmiddelen geschikt voor de bovengenoemde eisen zijn bijv. water, gelatine, lactose, saccharose, zetmeel, pectine, stearinezuur, magnesiumstearaat, talk, uiteenlopende plantaardige oliën alsmede glycolen zoals propyleen-glycol of polyethyleenglycol. Farmaceutische toevoegingen en hulpstoffen zijn bijv. conserveringsmiddelen zoals methyl-4-hydroxybenzoaat, uiteenlopende natieve of synthetische emulgeer-, dispergeer- en bevochtigingsmiddelen, kleur en smaakstoffen, bufferstoffen alsmede middelen voor het bevorderen van het uiteenvallen of oplossen, en andere stoffen die het gewenste effect verbeteren.

De gebruikelijke geneesmiddelsamenstellingen zijn orale preparaten bereid onder gebruikmaking van de hier bovengenoemde farmaceutische toevoegingen; deze samenstellingen kunnen vaste vormen zijn, bijv. tabletten, capsules, poeders, dragees, pillen of granules, of vloeibare vormen, bijv. siropen, oplossingen, emulsies of suspensies; verder rectale samenstellingen zoals zetpillen, alsmede parenterale samenstellingen, bijv. injecteerbare oplossingen of infusievloeistof-fen.

De dagelijkse dosis van de samenstellingen volgens de uitvinding die de voorkeur geniet hangt van de verscheidene factoren af, zoals de aard van de te behandelen ziekte, de toestand van de patiënt, de wijze van behandeling enz. De dagelijkse dosis die de voorkeur geniet beloopt 30-3000 mg/kg lichaamsgewicht. In overeenstemming daarmee is het geschikt dagelijks 1-4 tabletten, capsules of dragees die elk 0,2-3 g van de actieve samenstelling of 0,5-3 1 infusieoplossingen die 10-200 g/1 van de actieve samenstelling bevatten toe te dienen.

De uitvinding heeft verder betrekking op een werkwijze voor het voorkomen en behandelen van kankerachtige ziekten. Deze werkwijze omvat het toedienen van een therapeutisch doelmatige hoeveelheid van de samenstelling volgens de uitvinding aan de te behandelen patiënt.

De uitvinding zal in nader detail in de volgende tabellen, figuren, en voorbeelden worden toegelicht. De bij de volgende experimenten gebruikte cellen zijn verkregen bij de I "American Type Culture Collection" (Rockville, MD, VS).

Tabel A laat de tumorceldodende effecten en synergis-tische samenwerking van de bestanddelen van de samenstellingen volgens de voorbeelden 1-20 welke vier resp. vijf actieve bestanddelen bevatten zien bij Sp2/0-Agl4 myelomacellen (ATCC CRL 1581).

Tabel B laat, op basis van voorbeelden 21-37, de toename van het effect van een samenstelling dié vijf actieve bestanddelen bevat op Sp2/0-Agl4 cellen zien wanneer verder bestanddelen worden toegevoegd.

Fig. 1 laat de effecten en synergistische samenwerking van bestanddelen van samenstellingen die resp. vier en vijf actieve bestanddelen volgens voorbeelden I-XX bevatten zien.

Fig. 2 vergelijkt de in vitro effecten van samenstellingen die vijf actieve bestanddelen volgens voorbeelden CII-CVI bevatten en samenstellingen die éénentwintig actieve bestanddelen volgens voorbeelden CVTI-CXI bevatten zien bij Sp2/0-Agl4 muizemyelomacellen in vergelijking met een overeenkomstig controlemengsel.

Fig. 3 laat het effect zien van samenstellingen die éénentwintig actieve bestanddelen volgens voorbeeld CVII bevatten bij Sp2/0-Agl4 muizemeylomacellen als functie van de tijd ten opzichte van onbehandelde cellen en een geschikte controlemengsel.

Fig. 4 laat de in vitro effecten zien van samenstellingen die éénentwintig actieve bestanddelen volgens voorbeelden CVII-CXI bevatten bij K-562 menselijke erythroleukemiecel-len (ATCC CCL 243) in vergelijking met overeenkomstige contro-lemengsels.

Fig. 5 laat de in vitro effecten zien van samenstelling die éénentwintig actieve bestanddelen volgens voorbeelden CVII-CXI bevatten bij HeLa humane epitheloïde cervixcarcinoom-cellen (ATCC CCL 2) zien in vergelijking met de overeenkomstige controlemengsels.

Fig. 6 laat het in vitro effect zien van samenstellingen die éénentwintig actieve bestanddelen volgens voorbeelden CVII-CXI bevatten bij HEp-2 humane epidermoïde larynxcar-cinoomcellen (ATCC CCL 23) ten opzichte van overeenkomstige controlemengsels.

Fig. 7 laat de in vitro effecten zien van samenstel- lingen die éénentwintig actieve bestanddelen volgens voorbeelden CVII-CXI bevatten bij normale Vero-niercellen van de Afrikaanse groene aap (ATCC CCL 81) ten opzichte van overeenkomstige controlemengsels.

Fig. 8 laat de in vivo effecten zien van samenstellingen die éénentwintig actieve bestanddelen volgens voorbeeld CXII bevatten bij een tumor ontwikkeld uit Sp2/0-Agl4 muizemy-elomacellen i.p. geïnjecteerd in BALB/C muizen ten opzichte van een overeenkomstige controlegroep.

Fig. 9 laat de in vivo effecten zien van samenstellingen die éénentwintig actieve bestanddelen volgens voorbeeld CXII bevatten bij een vaste tumor die zich onder de huid heeft ontwikkeld uit HeLa humane epitheloïde cervixcarcinoomcellen s.c. geïnjecteerd in BALB/c (nu/nu) muizen ten opzichte van een overeenkomstige controlegroep.

Voor de experimenten werden de volgende media gebruikt: in het geval van Sp2/0-Agl4 en K-562 cellen RPMI 1640 medium (Sigma Chemie GmbH, D-8024 Deisenhofen, Duitsland, pro-duktnummer: R 6504), in het geval van HEp-2, HeLa en Vero-cel-len MEM medium (Sigma chemie GmbH, produktnummer: M 4655).

Voorbeelden I-XXXVII

In een inrichting uitgerust met een roerder werden actieve agentia in de in tabellen A en B weergegeven hoeveelheden toegevoegd, vervolgens werden aan het verkregen poe-dermengsel de eveneens in tabellen A en B weergegeven hoeveelheden natriumwaterstofcarbonaat benodigd voor de neutralisatie van zure bestanddelen toegevoegd. Onder continue roeren wordt het geschikte medium aan het mengsel toegevoegd om de massa ^ van de samenstelling op 100% te brengen. De effecten van de op deze wijze bereide oplossingen zijn te zien in de tabellen A en B en in fig. 1.

Voorbeelden XXXVIII-LXVII

Men gaat te werk zoals in de voorbeelden I-XXXVII, met dit verschil dat voor de neutralisatie van de zure bestanddelen geschikte hoeveelheden caliumwaterstofcarbonaat worden gebruikt in plaats van natriumwaterstofcarbonaat. De effecten van de op deze wijze bereide oplossingen verschillen in geen enkel geval significant van de effecten van de oplossingen volgens voorbeelden I-XXXVII weergegeven in resp. ta- bellen A en B en in fig. 1.

Voorbeelden LXVIII-XCVII

Men gaat te werk zoals in de voorbeelden I-XXXVII, met dit verschil dat voor de neutralisatie van de zure bestanddelen geschikte hoeveelheden kalciumcarbonaat worden gebruikt in plaats van natriumwaterstofcarbonaat. De effecten van de op deze wijze bereide oplossingen verschillen in geen enkel geval significant van de effecten van de oplossingen volgens voorbeelden I-XXXVII weergegeven in resp. tabellen A en B en in fig. 1.

Voorbeelden XCVIII-CI

Men gaat te werk volgens de voorbeelden XXIII, XXIV, XXVII en XXVIII, met dit verschil dat 0,053 gew.% L-arginine-hydrochloride, 0,052 gew.% L-histidinehydrochloride, 0,009 gew.% L-methioninehydrochloride en resp., 0,025 gew.% L-tyrosinehydrochloride worden gebruikt in plaats van resp. L-arginine, L-histidine, L-methionine en L-tyrosine, in voorbeelden XXIII, XXIV, XXVII en resp. XXVIII. In elk van de gevallen was de corresponderende hoeveelheid natriumwaterstof-carbonaat 0,054 gew.%. De effecten van de op deze wijze bereide oplossingen verschillen niet significant van de effecten van de oplossingen volgens voorbeelden XXIII, XXIV, XXVII en resp. XXVIII als weergegeven in tabel B.

Voorbeeld CII

In een met een roerder uitgeruste inrichting werd 0,01 gew.% L-tryptofaan, 0,034 gew.% 2-desoxy-D-ribose, 0,003 gew.% adenine, 0,065 gew.% appelzuur, 0,007 gew.% L-ascorbine-zuur en 0,091 gew.% natriumwaterstofcarbonaat gebracht. Vervolgens werd onder continu roeren het geschikte medium aan dit mengsel toegevoegd om de massa van de samenstelling op 100% te brengen. Het effect van de op deze wijze bereide oplossing in weergegeven in fig. 2 bij de 100% samenstelling.

Voorbeeld CIII

Men gaat te werk volgens voorbeeld CII met dit verschil dat slechts 80% van de hoeveelheden van elk bestanddeel wordt afgewogen. Vervolgens wordt het geschikte medium aan dit mengsel toegevoegd om het gewicht van de samenstelling op 100% te brengen. Het effect van de op deze wijze bereide oplossing is in fig. 2 bij de 80% samenstelling weergegeven.

Voorbeeld CIV

Men gaat te werk volgens voorbeeld CII met dit verschil dat slechts 60% van de hoeveelheden van elk bestanddeel wordt afgewogen. Vervolgens wordt het geschikte medium aan dit mengsel toegevoegd om het gewicht van de samenstelling op 100% te brengen. Het effect van de op deze wijze bereide oplossing is in fig. 2 bij de 60% samenstelling weergegeven.

Voorbeeld CV

Men gaat te werk volgens voorbeeld CII met dit verschil dat slechts 40% van de hoeveelheden van elk bestanddeel wordt afgewogen. Vervolgens wordt het geschikte medium aan dit mengsel toegevoegd om het gewicht van de samenstelling op 100% te brengen. Het effect van de op deze wijze bereide oplossing is in fig. 2 bij de 40% samenstelling weergegeven.

Voorbeeld CVI

Men gaat te werk volgens voorbeeld CII met dit verschil dat slechts 20% van de hoeveelheden van elk bestanddeel wordt afgewogen. Vervolgens wordt het geschikte medium aan dit mengsel toegevoegd om het gewicht van de samenstelling op 100% te brengen. Het effect van de op deze wijze bereide oplossing is in fig. 2 bij de 20% samenstelling weergegeven.

Voorbeeld CVII

In een inrichting uitgerust met een roerder wordt 0,011 gew.% L-methionine, 0,01 gew.% L-tryptofaan, 0,036 gew.% L-tyrosine, 0,041 gew.% L-fenylalanine, 0,044 gew.% L-argini-ne, 0,039 gew.% L-histidine, 0,089 gew.% N-benzoylglycine, 0,007 gew.% L-ascorbinezuur, 0,012 gew.% d-biotine, 0,010 gew.% pyridoxine, 0,0004 gew.% riboflavine, 0,0006 gew.% riboflavine-5'-fosfaat, 0,0006 gew.% liponzuur, 0,017 gew.% orootzuur, 0,003 gew.% adenine, 0,034 gew.% 2-desoxy-D-ribose, 0,09 gew.% D-mannose, 0,053 gew.% D-glucosamine, 0,065 gew.% appelzuur, 0,040 gew.% oxaalazijnzuur, 0,0015 gew.% adenosine-trifosfaat en 0,087 gew.% natriumwaterstofcarbonaat gebracht.

Vervolgens wordt onder continu roeren het geschikte medium aan dit mengsel toegevoegd om de massa van de samenstelling tot 100% aan te vullen. Het effect van de op deze wijze bereide oplossing is weergegeven in fig. 2,3,4,5,6 en 7 bij de 100% samenstelling.

Voorbeeld CVIII

Men gaat te werk volgens voorbeeld CVII met dit verschil dat slechts 80% van de hoeveelheden van elk bestanddeel wordt afgewogen. Vervolgens wordt het geschikte medium aan dit mengsel toegevoegd om de massa van de samenstelling op 100% te brengen. Het effect van de op deze wijze bereide oplossing is weergegeven in fig. 2,3,4,5,6 en 7 bij de 80% samenstelling.

Voorbeeld CIX

Men gaat te werk volgens voorbeeld CVII met dit verschil dat slechts 60% van de hoeveelheden van elk bestanddeel wordt afgewogen. Vervolgens wordt het geschikte medium aan dit mengsel toegevoegd om de massa van de samenstelling op 100% te brengen. Het effect van de op deze wijze bereide oplossing is weergegeven in fig. 2,3,4,5,6 en 7 bij de 60% samenstelling.

Voorbeeld CX

Men gaat te werk volgens voorbeeld CVII met dit verschil dat slechts 40% van de hoeveelheden van elk bestanddeel wordt afgewogen. Vervolgens wordt het geschikte medium aan dit mengsel toegevoegd om de massa van de samenstelling op 100% te brengen. Het effect van de op deze wijze bereide oplossing is weergegeven in fig. 2,3,4,5,6 en 7 bij de 40% samenstelling.

Voorbeeld CXI

Men gaat te werk volgens voorbeeld CVII met dit verschil dat slechts 20% van de hoeveelheden van elk bestanddeel wordt afgewogen. Vervolgens wordt het geschikte medium aan dit mengsel toegevoegd om de massa van de samenstelling op 100% te brengen. Het effect van de op deze wijze bereide oplossing is weergegeven in fig. 2,3,4,5,6 en 7 bij de 20% samenstelling.

Voorbeeld CXII

In een inrichting uitgerust met een roerder wordt 1,47 gew.% L-methionine, 1,01 gew.% L-tryptofaan, 0,036 gew.% L-tyrosine, 1,63 gew.% L-fenylalanine, 1,71 gew.% L-arginine, 1,53 gew.% L-histidine, 0,18 gew.% N-benzoylglycine, 1,94 gew.% L-ascorbinezuur, 1,21 gew.% d-biotine, 2,02 gew.% pyri-doxine, 0,038 gew.% riboflavine, 0,05 gew.% riboflavine-5'-fosfaat, 0,02 gew.% liponzuur, 0,09 gew.% orootzuur, 0,068 gew.% adenine, 1,32 gew.% 2-desoxy-D-ribose, 1,8 gew.% D-man-nose, 1,1 gew.% D-glucosamine, 1,32 gew.% appelzuur, 0,040 gew.% oxaalazijnzuur, 0,11 gew.% adenosinetrifosfaat, 1,34 gew.% natriumwaterstofcarbonaat en 0,04 gew.% kaliumwaterstof-carbonaat gebracht. Onder continu roeren wordt 83,168 gew.% van een buffer die 0,02 gew.% KH2P04 en 0,3 gew.% Na2HP04 bevat aan dit mengsel toegevoegd. Het effect van de op deze wijze bereide en voor de behandeling van dieren gebruikte oplossing in weergegeven in fig. 8 en 9.

Voorbeeld CXIII

In een menger wordt 20 gew.% L-tryptofaan, 62 gew.% L-ascorbinezuur en 18 gew.% D-glucosamine gebracht. Na grondig mengen wordt het resulterende poedermengsel gebruikt voor preventie experimenten.

Voorbeeld CXIV

Men gaat te werk zoals in voorbeeld CXIII met dit verschil, dat 32 gew.% L-arginine, 28 gew.% riboflavine-5'-fosfaat en 40 gew.% appelzuur worden gebruikt.

Voorbeeld CXV

Men gaat te werk volgens voorbeeld CXIII met dit verschil dat 23 gew.% L-tryptofaan, 0,2 gew.% pyridoxine, 17,8 gew.% N-benzoylglycine en 59 gew.% oxaalazijnzuur worden gebruikt .

Voorbeeld CXVI

Men gaat te werk volgens voorbeeld CXIII met dit verschil dat 19 gew.% L-tyrosine, 61 gew.% L-ascorbinezuur, 0,2 gew.% adenine en 19,8 gew.% L-histidine worden gebruikt.

Voorbeeld CXVII

Men gaat te werk volgens voorbeeld CXIII met dit ver- schil dat 31 gew.% L-methionine, 53 gew.% d-biotine, 0,2 gew.% adenine en 15,8 gew.% orootzuur worden gebruikt.

Voorbeeld CXVIII

Men gaat te werk zoals in voorbeeld CXIII, met dit verschil dat 27 gew.% L-fenylalanine, 33 gew.% riboflavine, 0,2 gew.% adenosinetrifosfaat en 39,8 gew.% D-mannose wordt gebruikt.

Voorbeeld CXIX

Men gaat te werk zoals in voorbeeld CXIII, met dit verschil dat 32 gew.% L-histidine, 9 gew.% liponzuur en 59 gew.% 2-desoxy-D-ribose wordt gebruikt.

Voorbeeld CXX

Men gaat te werk volgens voorbeeld CXIII, met dit verschil dat 12 gew.% L-arginine, 11 gew.% pyridoxine en 77 gew.% appelzuur worden gebruikt.

Voorbeeld CXXI

In een menger wordt 10 gew.% L-methionine, 3 gew.% L-tryptofaan, 0,2 gew.% L-tyrosine, 10,9 gew.% L-fenylalanine, 22,7 gew.% L-arginine, 10 gew.% L-histidine, 1,1 gew.% N-ben-zoylglycine, 11,9 gew.% L-ascorbinezuur, 0,1 gew.% d-biotine, 0,2 gew.% pyridoxine, 0,05 gew.% riboflavine, 0,35 gew.% ri-boflavine-5'-fosfaat, 0,1 gew.% liponzuur, 0,6 gew.% orootzuur, 0,3 gew.% adenine, 0,9 gew.% 2-desoxy-D-ribose, 11,5 gew.% D-mannose, 7 gew.% D-glucosamine, 8 gew.% appelzuur, 0,4 gew.% oxaalazijnzuur en 0,7 gew.% adenosinetrifosfaat gebracht. Na grondig mengen wordt het resulterende poedermengsel gebruikt voor preventie experimenten.

De effecten van de samenstellingen volgens voorbeelden I-XXXVII en de synergistische samenwerking van de actieve bestanddelen (in vergelijking met de effecten van de hier bovengetoonde bestanddelen afzonderlijk) werden onderzocht bij SP2/0-Agl4 muizemyelomacellen.

Bij de experimenten werden de nieuwste door de wetenschappelijke literatuur goedgekeurde werkwijzen toegepast. In geval van Sp2/0-Agl4 en K562 lijnen werden logarithmisch groeiende cellen uit het medium geoogst en in een voor celkweek gebruikte plaat met 96 putjes geresuspendeerd tot een eindconcentratie van 4xl04 Sp2/0-Agl4 cellen resp. 2xl04 K562 cellen in 250 μΐ geschikt medium per putje dat de te testen materialen in de aangegeven concentraties bevatte. In het geval van HeLa, HEp-2 en Vero-cellen werden de gekweekte cellen geoogst uit voor 75% samenkomend weefselkweekflessen met 0,2% trypsine en geresuspendeerd in het geschikte medium met een dichtheid van 105 cellen/ml. Monsters (100 μΐ) werden in micro-platen met 96 putjes gebracht en gedurende 24 uur geïncubeerd. Vervolgens werd het medium weggegooid en vervangen door 250 μΐ vers medium dat de te testen verbindingen in de aangegeven concentraties bevatte. Alle soorten cellen konden zich gedurende 48 uur vermeerderen. Het aantal levende Sp2/0-Agl4 en K562 cellen werden microscopisch met de trypaan blauw kleurstof uitsluitingswerkwij ze geteld. De overleving van HeLa, HEp-2 en Vero-cellen werd gemeten door het bepalen van de endogene alkalische fosfatase activiteit van de cellen. De resultaten werden beoordeeld onder gebruikmaking van Student's t-test. Gegevens na de gemiddelde waarden in de tabellen en tekens in de figuren betekenen: "standaardfout van het gemiddelde" (SEM).

De eerste kolom van tabel A laat het voorbeeldnummer zien, de tweede laat het aantal controle-experimenten zien, terwijl in de verdere zes kolommen hoeveelheden van in de experimenten gebruikte bestanddelen uitgedrukt in gew.% zijn weergegeven. De controlemengsels werden samengesteld uit dezelfde hoeveelheden van chemisch vergelijkbare maar farmacologisch ineffectieve stoffen (0,026 gew.% L-serine, 0,033 gew.% L-asparagine, 0,029 gew.% L-valine, 0,018 gew.% L-alanine, 0,006 gew.% glycine, 0,059 gew.% trimethylglycine en 0,006 gew.% L-proline als aminozuren; 0,017 gew.% thiaminehydrochlo-ride, 0,006 gew.% niacine, 0,019 gew.% van het natriumzout van folinezuur, 0,001 gew.% D-pantotheenzuur hemicalciumzout, 0,012 gew.% uracil en 0,0008 gew.% octaanzuur als vitaminen; 0,003 gew.% hypoxanthine, 0,038 gew.% D(-)ribose, 0,090 gew.% glucose, 0,055 gew.% N-acetylglucosamine, 0,081 gew.% dinatri-umsuccinaat, 0,080 gew.% dinatriumfumaraat en 0,0015 gew.% guanosinetrifosfaat, trinatriumzout) als de actieve samenstelling. De laatste twee kolommen laten de effecten zien van samenstellingen die vier resp. vijf actieve bestanddelen bevat ten en de effecten van de bestanddelen zelf (controle-experi-menten), namelijk het aantal cellen na 48 uur incubatie respectievelijk het aantal cellen uitgedrukt als percentage van de hoeveelheid onbehandelde cellen (de hoeveelheid onbehandelde cellen is 100%). Bijvoorbeeld in het geval van L-tryptofaan laten de 2-4e controle-experimenten de effecten zien van alleen resp. 0,002; 0,006 en 0,01 gew. L-tryptofaan op het aantal cellen. In het geval van voorbeelden II-IV is het effect weergegeven van in dezelfde hoeveelheden toegepast maar tezamen met de andere vier actieve bestanddelen toegediend L-tryptofaan weergegeven.

Uit de gegevens van de laatste twee kolommen van tabel A kan worden gezien dat bij gebruik van de hier bovengenoemde stoffen alleen geen enkele ervan een tumorceldodend effect laat zien: bij het gebruik van de gegeven hoeveelheden L-tryptofaan nam de vermeerdering van cellen zelfs licht toe. Tegelijkertijd kan uit de gegevens van de betreffende kolommen worden gezien, dat elke stof het effect van de andere vier actieve bestanddelen evenredig met de hoeveelheid ervan op een synergistische wijze vergrootte. 0,01 gew.% L-tryptofaan vergrootte bijvoorbeeld het 73,1% effect van de vier andere actieve bestanddelen tot 92,3%. Dezelfde hoeveelheid (0,01 gew.%) L-tryptofaan zonder de andere vier bestanddelen vergrootte de vermeerdering van cellen zelfs enigzins. Dit bewijst het synergistische effect ondubbelzinnig.

Het verschil tussen de effecten van samenstellingen die vier actieve bestanddelen bevatten (voorbeelden I,V,IX, XIII en XVII) en samenstellingen die het vijfde actieve bestanddeel bevatten (voorbeelden IV, VIII, XII, XVI en XX) in de maximum hoeveelheden zoals die hier worden gebruikt (bijv. in het geval van L-tryptofaan 0,01 gew.%) was in alle gevallen significant (p<0,01), derhalve vergrootten alle stoffen de effecten van de andere vier bestanddelen significant.

Tabel A

Effecten van samenstellingen volgens de uitvinding en de afzonderlijke actieve bestanddelen op Sp2/0-Agl4 muizemyelomacellen

Het synergistische effect van samenstellingen volgens de voorbeelden I-XX die vijf actieve bestanddelen bevatten is weergegeven in fig. 1, waarbij op de verticale as de aantallen Sp2/0-Agl4 cellen zijn uitgedrukt als percentage van de aantallen onbehandelde cellen (het aantal onbehandelde cellen in 100%). Op de horizontale as zijn de in gew.% uitgedrukte hoeveelheden L-tryptofaan, 2-desoxy-D-ribose, adenine, appelzuur en L-ascorbinezuur weergegeven. Witte kolommen laten de aantallen cellen zien uitgedrukt als percentage van de aantallen onbehandelde cellen na 48 uur incubatie onder gebruikmaking van alleen de bovengenoemde stoffen en zwarte kolommen laten de resultaten zien verkregen wanneer zij worden gebruikt samen met de andere vier actieve bestanddelen. De veranderingen in verschillende mate (in geval van L-tryptofaan zelfs in tegengestelde richting) van de witte en zwarte kolommen met toenemende hoeveelheden van de afzonderlijke stoffen bewijst het synergistische effect, en de zwarte kolommen laten het krachtige tumorceldodende effect van de samenstellingen zien.

Op basis van de voorbeelden XXI-XXXVÏI laat tabel B zien hoe het effect van een samenstelling die vijf actieve bestanddelen bevat in het geval van Sp2/0-Agl4 cellen toeneemt wanneer verdere bestanddelen worden toegevoegd. In tabel B zijn de hoeveelheden materialen uitgedrukt in gew.% en met 1000 vermenigvuldigd weergegeven, derhalve moeten de getallen in de tabel worden gelezen door met 10'3 te vermenigvuldigen; bijvoorbeeld betekent in voorbeeld XXI in het geval van L-tryptofaan het getal 6 6xlO'3, d.w.z. 0,006 gew.%. De omstan digheden van de experimenten waren hetzelfde als hiervoor.

Overeenkomstig tabel A kan uit de gegevens van de laatste twee kolommen van tabel B (in aantal cellen en in %) worden gezien dat bij gebruik van alleen de hier bovengenoemde stoffen geen enkel een celvermeerdering-verlagend effect heeft, en bovendien dat door het effect van L-fenylalanine (controle 22), L-arginine (controle 23), L-histidine (controle 24) en riboflavine (controle 29) het aantal cellen in vergelijking met het aantal onbehandelde cellen (controle 21) zelfs licht toenam. Ook is te zien dat dezelfde stoffen bij gebruik in dezelfde hoeveelheden het effect van de samenstelling volgens voorbeeld XXI synergistisch vergroot. Zonder potentiëren-de stoffen waren de effecten van voorbeeld XXI dat vijf actie ve bestanddelen bevat in alle gevallen significant minder dan samen met de andere verbindingen.

De effecten van de samenstelling volgens voorbeelden CVII-CXI die éénentwintig actieve bestanddelen bevatten en de effecten van samenstellingen volgens voorbeelden CII-CVI die vijf actieve bestanddelen bevatten met dezelfde hoeveelheden van de gezamelijke actieve bestanddelen zijn eveneens vergeleken. Om beter te kunnen vergelijken met de eerdere resultaten werden weer Sp2/0-Agl4 cellen gebruikt en de experimentele omstandigheden waren hetzelfde als hiervoor. De resultaten zijn weergegeven in fig. 2. Op de verticale as zijn de veranderingen van de hoeveelheden cellen uitgedrukt als percentage van de hoeveelheden onbehandelde cellen weergegeven. Op de horizontale as zijn de veranderingen uitgedrukt in % van de samenstellingen (veranderingen van de hoeveelheden van de actieve bestanddelen) weergegeven. De samenstelling volgens voorbeeld CII die vijf actieve bestanddelen bevat wordt als 100% genomen. Derhalve bevat de 80% samenstelling volgens voorbeeld CIII elke bestanddeel in een hoeveelheid van 80%. In het geval van samenstellingen die éénentwintig actieve bestanddelen bevatten werd de samenstelling volgens voorbeeld CVII als 100% genomen.

Tabel B

Effecten van samenstellingen volgens de uitvinding en de afzonderlijke actieve bestanddelen op Sp2/0-Agl4 xnuizemyelomacellen

Tabel B (vervolg) fvan samenstellingen volgens de uitvinding en de afzonderlijke actieve bestanddelen op Sp2/0-Agl4 muizemyelomacellen

Om de mogelijkheid uit te sluiten dat het gemeten effect het resultaat is van een osmotisch effect of een aspecifieke overbelasting aan voedingsstoffen of een aminozuur onbalans, werden ook controlemengsels bereid. Deze controle-mengsels bevatten stoffen die bij voorgaande experimenten in PADS ondoelmatig bleken. De samenstelling van de controlemengsels is gegeven in samenhang met tabel A. De uit de experimenten met de samenstellingen volgens de voorbeelden CII-CVI en CVII-CXI en met de controlemengsels verkregen resultaten zijn weergegeven in fig. 2 waarbij de lijn met open rondjes de verandering van de celhoeveelheden na 48 u incubatie in het geval van controlemengsels laat zien, de lijn met volle rondjes de verandering in het geval van samenstellingen die vijf actieve bestanddelen volgens de voorbeelden CII-CVI bevatten laat zien en de lijn met open driehoekjes de verandering laat zien in het geval van samenstellingen die éénentwintig actieve bestanddelen volgens de voorbeelden CVII-CXI bevatten. Bij de experimenten uitgevoerd met de 100% samenstellingen volgens de voorbeelden CII en CVII en weergegeven in fig. 2 werden de afzonderlijk actieve bestanddelen in zodanige hoeveelheden gebruikt dat het celaantal niet wezenlijk werd beïnvloed (zoals te zien uit de resultaten van eerdere experimenten weergegeven in de tabellen A en B). Uit Fig. 2 is te zien dat deze bestanddelen wanneer zij samen waren gebruikt een significant antitumor effect hebben. Alleen dit feit al bewijst weer de synergistische wijze van samenwerking van de actieve bestanddelen. Ook kan uit fig. 2 worden gezien dat de controlemengsels geen enkel wezenlijk effect op het aantal cellen uitoefenen. Derhalve kan op basis van deze experimenten worden uitgesloten dat de gemeten effecten het gevolg zijn van een osmotisch effect of een aspecifieke overbelasting van nutriënten of een aminozuur onbalans.

Om uit te zoeken of tegen-ionen een rol spelen bij de effecten van de samenstellingen werden experimenten uitgevoerd waarbij K+ (voorbeelden XXXVIII-LXVII) of Ca++ (voorbeelden LXVIII-XCVII) ionen werden gebruikt in plaats van Na+ ionen.

Er waren geen significante verschillen tussen de effecten van de samenstellingen bij gebruik van verschillende tegen-ionen, de resultaten waren in feite precies hetzelfde.

Het effect van de 100% samenstelling volgens voor- beeld CVII op Sp2/0-Agl4 cellen als functie van de tijd werd onderzocht en vergeleken met het 100% controlemengsel en met onbehandelde cellen. De experimentele omstandigheden waren hetzelfde als die in de voorgaande experimenten met dit verschil dat in dit geval de cellen niet alleen na 48 uur werden geteld maar ook na 6; 12; 24; en 36 u. De resultaten van deze kinetische experimenten zijn weergegeven in fig. 3. Op de verticale as is het celaantal/ml weergegeven. Op de horizontale as staat de tijd weergegeven in uren. De lijn met de open rondjes laat de verandering van het aantal cellen zien in het geval van onbehandelde cellen, de lijn met de volle rondjes laat de verandering zien in het geval van het controlemengsel en de lijn met de gevulde driehoekjes laat de verandering zien in het geval van samenstellingen volgens voorbeeld CVII die éénentwintig actieve bestanddelen bevatten als functie van de tijd. Uit fig. 3 is te zien dat terwijl het controlemengsel geen wezenlijk effect heeft op het celaantal aangezien het exponentieel in de tijd toeneemt en de vorm van de lijn overeenkomt met die van de lijn die de vermeerdering van onbehandelde cellen weergeeft, de samenstelling volgens de uitvinding toxisch voor de tumorcellen is en een afname van het aantal ervan in de tijd veroorzaakt. Derhalve remt de samenstelling volgens de uitvinding niet alleen de celgroei maar heeft deze ook een cytotoxisch effect. De hoeveelheden van de actieve bestanddelen in de bovengenoemde samenstelling die éénentwintig stoffen bevat werd zodanig gekozen dat zij afzonderlijk geen enkel significant effect op tumorcellen hebben. (Vanzelfsprekend is dit zelfs nog meer waard voor de 80%, 60% enz. samenstellingen waarbij de hoeveelheden actieve middelen 20%, 40% enz. minder is). Aangezien dezelfde samenstellingen bij alle in vitro experimenten werden gebruikt, bewijzen de resultaten in alle gevallen de synergistische samenwerking van de actieve bestanddelen.

De bovenstaande resultaten tonen aan dat het effect wordt veroorzaakt door de synergistische werking van de stoffen die zijn gekozen aan de hand van de inzichten die de basis van de uitvinding vormen. Verder tonen deze resultaten ook aan dat de inzichten juist zijn. Aangezien de verschillende kankercellen in verschillende mate van normale cellen verschillen, verschillen de meest doelmatige samenstellingen volgens de uitvinding tegen kankercellen eveneens van elkaar. Dit betekent dat tegen elke tumor de meest geschikte samenstelling kan worden gekozen onder gebruikmaking van het synergistische tumordodende effect als criterium. Echter, voor preventie of wanneer het soort tumor niet kan worden vastgesteld of wanneer er weinig tijd meer is, geniet het de voorkeur de algemene samenstellingen die éénentwintig actieve bestanddelen bevatten te gebruiken. Derhalve werd in de volgende experimenten onderzocht hoe algemeen het effect van deze samenstellingen is en hoe de doelmatigheid ervan is.

Het effect van de samenstellingen volgens voorbeeld CVII-CXI die éénentwintig actieve bestanddelen bevatten op K-562 menselijke erythroleukemiecellen werd onderzocht en vergeleken met het effect van het hier bovengenoemde controlemeng-sel. De resultaten van de experimenten zijn weergegeven in fig. 4. Evenals voor fig. 2 is op de verticale as de veranderingen van de celhoeveelheden uitgedrukt als percentage van de hoeveelheden onbehandelde cellen weergegeven. Op de horizontale as staan de veranderingen uitgedrukt in % van de samenstellingen (veranderingen van de hoeveelheid van de actieve bestanddelen) weergegeven. De lijn met open rondjes laat het effect van de controlemengsels zien, terwijl de lijn met de volle rondjes de effecten laat zien van samenstellingen die éénentwintig actieve bestanddelen bevatten. Uit fig. 4 is te zien dat de samenstellingen volgens de uitvinding ook in het geval van K-562 menselijke erythroleukemiecellen een significant tumorceldodend effect hebben.

Daarna werd het effect van de samenstellingen volgens voorbeelden CVII-CXI die éénentwintig actieve bestanddelen bevatten onderzocht bij HeLa menselijke epitheloïde cervixcar-cinoomcellen en HEp-2 menselijke epidermoïde larynxcarcinoom-cellen en vergeleken met het effect van het controlemengsel. Dit experiment was nodig om te laten zien of de eerdere resultaten algemeen waren en onafhankelijk van de storende effecten van het gebruikte medium, van de suspensiewerkwijze, van het tellen en van de detectie. De overleving van HeLa, HEp-2 en Vero-cellen werd gemeten door de endogene alkalische fosfatase activiteit van cellen te bepalen. In het kort, na incubatieperiode werden niet-hechtende (kennelijk beschadigde) cellen door wassen verwijderd. Vervolgens werd 150 /zg alkalische fos- fotasesubstraat (4-nitrofenylfosfaat, Sigma tabletten nr. 111-112) opgelost in 150 μΐ verse 10% diethanolaminebuffer (pH 9,8) aan elk putje toegevoegd. De platen werden bij 30°C ge-incubeerd tot de absorptie in het geval van onbehandelde cellen een waarde van circa 1 bereikte. De reactie werd gestopt door 50 βΐ 3 M NaOH aan elk putje toe te voegen. De absorptie werd gemeten bij 405 nm met behulp van een Dynatech ELISA uit-lezer. Achtergrondwaarden werden van elke meting afgetrokken. De resultaten zijn weergegeven in fig. 5 (in geval van HeLa cellen) en fig. 6 (in het geval van HEp-2 cellen). Evenals bij de figuren 2 en 4 laat in beide figuren de verticale as de verandering van de hoeveelheden cellen zien uitgedrukt als percentage van de hoeveelheden onbehandelde cellen. De verandering van het celaantal in deze gevallen werd bepaald door de extinctie te meten. De horizontale as laat de veranderingen zien uitgedrukt als % van de samenstellingen (veranderingen in de hoeveelheden van de actieve bestanddelen). In zowel fig. 5 als 6 laten de lijnen met de open rondjes de effecten van de controlemengsels zien, terwijl de lijnen met gesloten rondjes de effecten van de samenstellingen volgens voorbeelden CVII-CXI die éénentwintig actieve bestanddelen bevatten laten zien. Uit de figuren is de zien dat de samenstellingen tegen beide cellijnen doelmatig zijn. Dit resultaat is des te waardevoller gezien het feit dat HEp-2 bekend staat als een "sterke cellijn" die tegen omgevingseffecten resistent is [(American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines en Hybridomas, 5de uitg.f biz. 15-16 (1985)].

Volgens de theoretische uitgangspunten van de uitvinding hebben de samenstellingen alle selectief invloed op kankercellen. Om deze beweging verder te staven werd ook het effect van samenstellingen volgens voorbeeld CVII-CXI die éénentwintig actieve bestanddelen bevatten en controlemengsels op de normale cellijn Vero niercellen van de Afrikaanse groene aap onderzocht. De resultaten van het experiment zijn weergegeven in fig. 7. Op de verticale as is de verandering van de hoeveelheid cellen uitgedrukt als percentage van de totale hoeveelheid onbehandelde cellen weergegeven. Op de horizontale as zijn de veranderingen uitgedrukt als % van de samenstellingen weergegeven (veranderingen van de hoeveelheden actieve bestanddelen). De lijn met open rondjes laat de effecten van controlemengsels zien, terwijl de lijn met gevulde rondjes de effecten laat zien van samenstellingen volgens voorbeeld CVïï-CXI die éénentwintig actieve bestanddelen bevatten. Uit fig. 7 is te zien dat de samenstellingen volgens de uitvinding geen cytotoxische effecten op de normale Vero-cellijn uitoefenen, omdat het effect van de 100% samenstelling volgens voorbeeld CVII op de vermeerdering, wanneer uitgezet tegen de tijd, vergelijkbaar zou zijn met die weergegeven in fig. 3 in het geval van controlemengsels. Aangezien Vero een zeer snel vermeerderende cellijn is [American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas, 5de uitg., biz. 45-46 (1985)] toont dit experiment aan dat, in tegenstelling tot de cytostatica, de samenstelling volgens de uitvinding niet voor alle snel vermeerderende cellen toxisch is, maar selectief alleen tumorcellen beïnvloedt. Op basis van de hier bovengenoemde resultaten kunnen de samenstellingen volgens de uitvinding worden beschouwd als antineoplastische, en niet als cytotoxische, preparaten.

Om ook de in vivo doelmatigheid van de samenstelling volgens de uitvinding aan te tonen werden farmacologische experimenten uitgevoerd. Tijdens deze experimenten werden altijd door de wetenschappelijk literatuur goedgekeurde werkwijzen en omstandigheden toegepast. De experimenten werden uitgevoerd met Sp2/0-Agl4 cellen. Voor de experimenten werden 5-6 weken oude vrouwelijke BALB/c muizen gebruikt. De experimenten werden uitgevoerd met twee groepen van elk 10 muizen. Bij de muizen werden i.p. met 5xl04 Sp2/0-Agl4 cellen gesuspendeerd in 200 μΐ onvolledig RPMI 1640 medium geïnjecteerd. De dag van injectie werd beschouwd als dag 0 van het experiment. Het voor de experimenten benodigde celaantal werd bepaald met de tumor-verwekkendheidstest. De behandeling van de dieren begon 24 u na de injectie van de cellen (dit was de eerste dag van het experiment) en werd gedurende 10 achtereenvolgende dagen voortgezet. De controlegroep werd bij elke behandeling i.p. geïnjecteerd met 200 μΐ PBS (met fosfaat gebufferde zoutoplossing) , terwijl de behandelde groep i.p. werd geïnjecteerd met hetzelfde volume van de samenstelling volgens voorbeeld CXII die éénentwintig actieve bestanddelen bevat.

De meest doelmatige wijze van behandelen zou een continue infusie zijn geweest waardoor de concentratie van de bestanddelen van de samenstellingen op een vrij hoog niveau wordt gehouden. Vanwege praktische moeilijkheden werd een bij benadering continue, periodieke behandeling toegepast, d.w.z. de dieren werden zes keer per dag behandeld. De resultaten van de experimenten zijn weergegeven in fig. 8. Op de horizontale as is het aantal dagen na het begin van het experiment weergegeven. Op de verticale as staan de waarden van het % overleving, d.w.z. het aantal muizen dat op een gegeven dag leeft. Derhalve betekent 10 muizen 100% en resp. 8 muizen betekent 80%. Witte kolommen laten de overleving van behandelde muizen zien, zwarte kolommen die van onbehandelde muizen. Uit fig. 8 is te zien dat bijv. tot de 16de dag geen van de onbehandelde muizen leefde en dat alle behandelde muizen nog leefden. Alle behandelde muizen waren op de 16de dag gestorven, de behandelde slechts op de 25ste dag. Te zien is dat ten gevolge van de behandeling een significante toename van de levensduur kan worden bereikt. De mediane overlevingsduur was voor de behandelde groep 21 dagen, terwijl die 14 dagen was voor de onbehandelde groep. De T/C % waarde berekend uit deze mediane overlevingsduren (150%) is veel hoger dan 125%, goedgekeurd als criterium voor doelmatigheid. Volgens de literatuur kan op basis van deze waarde de samenstelling volgens de uitvinding worden beschouwd als een preparaat met krachtig antitumor effect tegen de gegeven cellijn.

Om te bewijzen dat de toename van de overlevingsduur een resultaat is van het toxische effect van de samenstelling volgens voorbeeld CXII op tumorcellen en niet een sterk versterkend effect werd een ander experiment uitgevoerd. 10-10 muizen werden op dezelfde wijze behandeld. Na 10 dagen behan-delingsperiode werden de cellen uit de buikholten van beide groepen muizen verwijderd en vervolgens geteld. Het verschil tussen de gemiddelde celaantallen (5,55xl0;' resp. 5,95xl07) is significant (p<0,001) en bewijst de in vivo doelmatigheid van de samenstelling volgens de uitvinding.

Om de doelmatigheid van de samenstelling volgens de uitvinding verder te staven en om de mogelijkheid uit te sluiten dat de resultaten alleen het gevolg zijn van een plaatselijk effect (de cellen bevonden zich in de buikholte en werden i.p. behandeld), werd een ander experiment uitgevoerd met aangeboren immunodeficiënte (thymus deficiënte) (naakte) muizen s.c. geïnjecteerd met menselijke vaste tumor. Voor het experiment werden HeLa cellen en 6-8 weken oude vrouwelijke BALB/c (nu/nu) muizen gebruikt en 5xl06 cellen werden s.c. in de lagere ledematen van de muizen geïnjecteerd. De behandeling startte met de samenstelling volgens voorbeeld CXII wanneer de grootte van de tumoren het gemiddelde volume van 50 mm3 bereikte. Het behandelingsschema, de behandelingstijd en de voor de behandeling gebruikte oplossingen (voorbeeld CXII) waren hetzelfde als bij het vorige farmacologische experiment. De afmetingen van de tumoren [(lengte (L), breedte (W) , hoogte (H)] werden twee keer per week gemeten met een digitale schuifmaat (Mitutoyo, Inc., Tokyo, Japan). Tumorvolumes (berekend met de vergelijking LWH/2) en ook de relatieve tumorvolumes Vt/V0 [Eur. J. Cancer. Clin. Oncol., 21, 1253-1260 (1988)] waarbij Vt het werkelijke tumorvolume en V0 het tumorvolume is aan het begin van de behandeling, werden berekend. De resultaten zijn samengevat in fig. 9. Op de verticale as is het gemiddelde van de Vt/V0 waarden aangegeven en op de horizontale as het aantal dagen na het begin van de behandeling. De lijn met open rondjes laat de relatieve tumorvolumetoename zien na het begin van de behandeling in het geval van controlemuizen en de lijn met gevulde rondjes laat hetzelfde zien in geval van behandelde dieren. Uit fig. 9 is te zien dat de behandeling de tumorgroei aanzienlijk vertraagt. Bijvoorbeeld in het geval van controlemuizen nam het tumorvolume gedurende 16,5 dagen tot een negenvoudige waarde toe, terwijl in het geval van behandelde muizen voor dezelfde negenvoudige groei 33 dagen nodig waren. De T/C % werd eveneens berekend uit de Vt/V0 waarden van de behandelde en controlegroepen. De waarden van T/C % waren in alle gevallen onder de 42%, wat aanvaardbaar is als criterium voor doelmatigheid [Europ. J. Cancer, 17, 129-142 (1981)]. Het experiment laat weer zien dat de samenstellingen volgens de uitvinding significante antitumor effecten hebben. De resultaten zijn in het bijzonder veelbelovend gezien het feit dat we ten gevolge van technische problemen nog ver zijn van de optimale behandelingsprocedure en de maximum verdraagbare dosis en dat dezelfde behandelingen onder klinische omstandigheden meer doelmatig kunnen worden uitgevoerd, (langere behandelingstijd, permanent effect bijv. door infusie enz.).

Verandering van lichaamsgewicht tijdens een behande- ling is een goede en algemeen toegepaste indicator om de toxiciteit van de behandeling te karakteriseren; derhalve werd het gewicht van de dieren tijdens de bovengenoemde experimenten gemeten. Volgens de literatuur wordt, wanneer het gemiddelde lichaamsgewicht met 10-15% afneemt, het preparaat als toxisch beschouwd [Eur. J. Cancer. Clin. Oncol., 21. 1253-1260 (1988)]. Bij ons experiment was de verandering van het gemiddelde lichaamsgewicht -5,9±4,1% in het geval van de controlegroep en -6,6±3,9% in het geval van de behandelde groep. Derhalve is er geen significant verschil tussen de twee groepen en dit betekent dat de samenstelling volgens de uitvinding geen toxisch neveneffect heeft.

Om de doelmatigheid van de samenstelling volgens de uitvinding voor preventie aan te tonen werden 2-2 groepen van BALB/c muizen (10 muizen per groep) op een zodanige wijze behandeld dat het voedsel van de behandelde dieren in een 1:1 verhouding werd gemengd met de samenstellingen volgens voorbeelden CXIII-CXXI en de dieren werden ad libitum gevoerd. 5 dagen na het begin van de behandeling werden bij beide groepen lxlO4 Sp2/0-Agl4 cellen i.p. ingespoten. De behandeling werd gedurende 100 dagen voortgezet. Met het 1-1 mengsel van samenstellingen volgens voorbeelden CXIII-CXXI en met normaal voedsel gevoerde muizen lieten geen bewijs van i.p. tumorgroei zien bij offeren 100 dagen na injectie van de cellen. Tegelijkertijd lagen de overlevingsduren van de controledieren bij de verschillende experimentele groepen in het bereik van 21 tot 26 dagen na injectie van Sp2/0-Agl4 cellen.

Afhankelijk van de dosis en de wijze van behandeling kunnen de samenstellingen volgens de uitvinding worden gebruikt voor het voorkomen van kankerziekten, voor het remmen van tumorontwikkeling in het geval van AIDS en orgaan-transplantaties, voor het remmen van de vorming van metastasen en voor aanvullende, gecombineerde en directe therapie van kankerpatiënten.

De belangrijkste voordelen van de samenstellingen volgens de uitvinding zijn de volgende: a) Onder gebruikmaking van een geschikte dosering kunnen de samenstellingen worden toegepast voor het voorkomen van kankerziekten, voor de remming van tumorvorming in het geval van AIDS en transplantaties, voor het remmen van meta- stasevorming en voor directe, aanvullende of gecombineerde behandeling en genezing van kankerziekten.

b) Zij zijn niet toxisch. Toxiciteitsexperimenten, gebaseerd op het meten van het verlies aan lichaamsgewicht van de dieren, heeft aangetoond dat de samenstellingen niet toxisch zijn. Volgens literatuurgegevens is de toxiciteit van de afzonderlijke bestanddelen van de samenstellingen zeer gering, en zelfs deze lage toxiciteit neemt af wanneer deze stoffen gezamenlijk worden gebruikt. Daarenboven tolereren primaten deze stoffen beter dan voor de bepaling van toxici-teitswaarden gebruikte kleine dieren. In het licht van al deze feiten kan worden gesteld dat de samenstellingen als niet toxisch moeten worden beschouwd.

c) Zij hebben geen of slechts verwaarloosbare negatieve effecten. Er zijn veel waarnemingen verzameld over de neveneffecten van de bestanddelen omdat ze vrijwel allemaal (met uitzondering van 2-desoxy-D-ribose) voor enige vorm van therapie zijn gebruikt (in de anti-kankertherapie alleen as-corbinezuur) of als voedingssupplement. Volgens de bij deze toepassingen vergaarde ervaringen is het volledig duidelijk dat de samenstellingen vrijwel geen neveneffecten hebben.

d) Ze zijn selectief. De selectiviteit wordt gestaafd door onze eigen experimenten die laten zien dat samenstellingen die toxisch zijn voor uiteenlopende kankercellen niet toxisch zijn voor resp. normale Vero-cellen en voor de proefdieren of voor hun normale cellen. Deze selectiviteit wordt versterkt door het feit dat er veel meer normale cellen zijn dan kankercellen en dat de laatste cellen de bestanddelen van de samenstellingen ophopen terwijl in het geval van normale cellen de opname ervan gereguleerd is.

e) Zij kunnen breed worden toegepast, de effecten ervan zijn algemeen. De effecten van de samenstellingen werden onderzocht in het geval van muizemyeloma (Sp2/0-Agl4), menselijke erythroleukemie (K-562), menselijke epitheloïde cervixcarcinoom (HeLa) en menselijke epidermoïde larynxcarcinoom (HEp-2) cellijnen. Deze cellen vertegenwoordigen een breed scala omdat zij zowel menselijke als dierlijke tumoren omvatten en van de menselijke tumoren een leukemie en twee sterk verschillende vaste tumoren zijn vertegenwoordigd. De uit de experimenten met deze cellijnen verkregen resultaten onder steunen de bovengenoemde stelling dat de samenstellingen algemene effecten hebben en breed kunnen worden toepast.

f) Zij kunnen zonder enige moeilijkheid worden bereid. De bestanddelen van de samenstellingen zijn stoffen met laag molecuulgewicht en zijn gemakkelijk verkrijgbaar, zodat de samenstellingen gemakkelijk kunnen worden bereid.

g) Zij zijn in water oplosbaar en derhalve gemakkelijk te doseren.

Claims (30)

1. Farmaceutische preparaten voor het voorkomen en de behandeling van kankerziekten die ten minste drie actieve bestanddelen die in het vaatstelstel voorkomen bevatten: ten minste één aminozuur, ten minste één vitamine en ten minste één lid gekozen uit de groep bestaande uit adenine, 2-desoxy-D-ribose, D-mannose, D-glucosamine, appelzuur, oxaalazijnzuur, adenosinetrifosfaat en/of de farmaceutisch aanvaardbare zouten ervan, onder de voorwaarde dat indien de samenstelling naast aminozuur(en) alleen appelzuur en een vitamine bevat, het vitamine geen ascorbinezuur mag zijn.

2. Samenstelling volgens conclusie 1, waarbij naast de actieve bestanddelen ook dragers, verdunningsmiddelen en/of andere gebruikelijk in de farmacie hulpstoffen bevat.

3. Samenstelling volgens conclusie 1, waarbij het aminozuur L-methionine, L-tryptofaan, L-tyrosine, L-fenylala-nine, L-arginine, L-histidine, N-benzoylglycine en/of een zout daarvan is.

4. Samenstelling volgens conclusie 1, waarbij het vitamine d-biotine, pyridoxine, riboflavine, riboflavine-5'-fosfaat, L-ascorbinezuur, liponzuur, orootzuur en/of een zout daarvan is.

5. Samenstelling volgens conclusie 1, welke L-trypto-faan, L-ascorbinezuur en ten minste één lid gekozen uit de groep bestaande uit adenine, 2-desoxy-D-ribose, D-glucosamine en/of de farmaceutische aanvaardbare zouten daarvan bevat.

6. Samenstelling volgens conclusie 1, welke L-arginine, riboflavine-5'-fosfaat en ten minste één lid gekozen uit de groep bestaande uit D-mannose, appelzuur, adenosinetrifosfaat en/of de farmaceutisch aanvaardbare zouten daarvan bevat.

7. Samenstelling volgens conclusie 1, welke 0,002-70 gew.% van ten minste één lid gekozen uit de groep bestaande uit L-methionine, L-tryptofaan, L-tyrosine, L-fenylalanine, L-arginine, L-histidine, N-benzoylglycine en/of de zouten ervan als aminozuur, 0,0004-80 gew.% van ten minste één lid gekozen uit de groep bestaande uit d-biotine, pyridoxine, riboflavine, riboflavine-5'-fosfaat, L-ascorbinezuur, liponzuur, orootzuur en/of de zouten ervan als vitamine en 0,003-80 gew.% van ten minste één lid gekozen uit de groep bestaande uit adenine, 2-desoxy-D-ribose, D-mannose, D-glucosamine, appelzuur, oxaal-azijnzuur, adenosinetrifosfaat en/of de farmaceutisch aanvaardbare zouten ervan bevat.

8. Samenstelling volgens conclusie 1, welke 0,9-25 gew.% L-methionine, 0,8-19 gew.% L-tryptofaan, 1,1-48 gew.% L-arginine, 0,9-46 gew.% d-biotine, 1,2-16 gew.% pyridoxine, 0,03-42 gew.% riboflavine-57-fosfaat, 0,05-18 gew.% D-glucosamine, 0,5-60 gew.% 2-desoxy-D-ribose, 0,7-68 gew.% appelzuur, 0,6-40 gew.% D-mannose en/of de farmaceutisch aanvaardbare zouten ervan bevat.

9. Samenstelling volgens conclusie 1, welke 0,005-34 gew.% L-methionine, 0,002-25 gew.% L-tryptofaan, 0,02- 23 gew.% L-tyrosine, 0,04-30 % L-fenylalanine, 0,04-50gew.% L-arginine, 0,03-34 gew.% L-histidine, 0,05-22 gew.% N-benzoyl-glycine, 0,01-60 gew.% d-biotine, 0,01-20 gew.% pyridoxine, 0,0004-45 gew.% riboflavine, 0,0005-45 gew.% riboflavine-5'-fosfaat, 0,003-70 gew.% L-ascorbinezuur, 0,004-15 gew.% lipon-zuur, 0,01-17 gew.% orootzuur, 0,001-10 gew.% adenine, 0,01-63 gew.% 2-desoxy-D-ribose, 0,08-42 gew.% D-mannose, 0,05-20 gew.% D-glucosamine, 0,01-80 gew.% appelzuur, 0,02-60 gew.% oxaalazijnzuur, 0,001-10 gew.% adenosinetrifosfaat en/of de farmaceutisch aanvaardbare zouten ervan bevat.

10. Werkwijze voor het voorkomen en behandelen van kankerziekten welke omvat het toedienen van een therapeutisch doelmatige hoeveelheid van de samenstelling volgens conclusie 1 aan een te behandelen patiënt.

11. Samenstelling volgens conclusie 1, welke 30-44 gew.% L-arginine, 27-35 gew.% riboflavine-5'-fosfaat, 38-62 gew.% appelzuur en/of de farmaceutisch aanvaardbare zouten daarvan bevat.

12. Werkwijze voor de bereiding van de samenstelling volgens conclusie 1, welke omvat het samenmengen van van de actieve verbindingen die in het vaatstelsel voorkomen ten minste één aminozuur, ten minste één vitamine, ten minste één lid gekozen uit de groep bestaande uit adenine, 2-desoxy-D-ribose, D-mannose, D-glucosamine, appelzuur, oxaalazijnzuur, adenosinetrifosfaat en, indien gewenst, eveneens dragers, verdun-ningsmiddelen en/of andere gebruikelijk in de farmacie toegepaste hulpstoffen tot een farmaceutisch preparaat.

13. Werkwijze volgens conclusie 12, welke omvat het mengen van L-tryptofaan, L-ascorbinezuur, ten minste één lid gekozen uit de groep bestaande uit adenine, 2-desoxy-D-ribose, D-glucosamine en/of de farmaceutisch aanvaardbare zouten ervan om een farmaceutisch preparaat te bereiden.

14. Werkwijze volgens conclusie 12, welke omvat het mengen van L-arginine, riboflavine-5'-fosfaat, ten minste één lid gekozen uit de groep bestaande uit D-mannose, appelzuur, adenosinetrifosfaat en/of de farmaceutisch aanvaardbare zouten ervan om een farmaceutisch preparaat te bereiden.

15. Werkwijze volgens conclusie 12, welke omvat het samenmengen van 30-44 gew.% L-arginine, 27-35 gew.% riboflavine-5 '-fosfaat, 38-62 gew.% appelzuur en/of de farmaceutisch aanvaardbare zouten daarvan om een farmaceutisch preparaat te bereiden.

16. Werkwijze volgens conclusie 12, welke omvat het samenmengen van 0,002-70 gew.% van ten minste één lid gekozen uit de groep bestaande uit L-methionine, L-tryptofaan, L-tyro-sine, L-fenylalanine, L-arginine, L-histidine, N-ben-zoylglycine en/of de zouten ervan als aminozuur, 0,0004-80 gew.% van ten minste één lid gekozen uit de groep bestaande uit d-biotine, pyridoxine, riboflavine, riboflavine-5'-fosfaat, L-ascorbinezuur, liponzuur, orootzuur en/of de zouten ervan als vitamine en 0,003-80 gew.% van ten minste één lid gekozen uit de groep bestaande uit adenine, 2-desoxy-D-ribose, D-mannose, D-glucosamine, appelzuur, oxaalazijnzuur, adenosinetrifosfaat en/of de farmaceutisch aanvaardbare zouten ervan.

17. Werkwijze volgens conclusie 12, welke omvat het samenmengen van 0,9-25 gew.% L-methionine, 0,8-19 gew.% L-tryptofaan, 1,1-48 gew.% L-arginine, 0,9-46 gew.% d-biotine, 1,2-16 gew.% pyridoxine, 0,03-42 gew.% riboflavine-5'-fosfaat, 0,05-18 gew.% D-glucosamine, 0,5-60 gew.% 2-desoxy-D-ribose, 0,7-68 gew.% appelzuur, 0,6-40 gew.% D-mannose en/of de farmaceutisch aanvaardbare zouten ervan.

18. Werkwijze volgens conclusie 12, welke omvat het samenmengen van 0,005-34 gew.% L-methionine, 0,002-25 gew.% L-tryptofaan, 0,02-23 gew.% L-tyrisone, 0,04-30 % L-fenylalani-ne, 0,04-50 gew.% L-arginine, 0,03-34 gew.% L-histidine, 0,05-22 gew.% N-nenzoylglycine, 0,01-60 gew.% d-biotine, 0,01-20 gew.% pyridoxine, 0,0004-45 gew.% riboflavine, 0,0005-45 gew.% riboflavine-5'-fosfaat, 0,003-70 gew.% L-ascorbinezuur, 0,004-15 gew.% liponzuur, 0,01-17 gew.% orootzuur, 0,001-10 gew.% adenine, 0,01-63 gew.% 2-dexosy-D-ribose, 0,08-42 gew.% D-man-nose, 0,05-20 gew.% D-glucosamine, 0,01-80 gew.% appelzuur, 0. 02-60 gew.% oxaalazijnzuur, 0,001-10 gew.% adenosinetrifos-faat en/of de farmaceutisch aanvaardbare zouten ervan.

19. Samenstelling volgens conclusie 1 voor toepassing als een geneesmiddel.

20. Samenstelling volgens conclusie 19 voor toepassing bij de behandeling van kanker.

21. Samenstelling volgens conclusie 1 en farmaceutische dragers en/of hulpstoffen voor toepassing als geneesmiddel.

22. Samenstelling volgens conclusie 21 voor toepassing als antitumormiddel.

23. Samenstelling volgens conclusie 1 voor toepassing als aanvullend middel bij de behandeling van kanker.

24. Samenstelling volgens conclusie 1 in de vorm van een tablet, dragee, zetpil, capsule of infusieoplossing voor de behandeling van kanker.

25. Samenstelling volgens conclusie 23 welke een therapeutische actieve hoeveelheid van het produkt volgens conclusie 1 bevat.

26. Samenstelling volgens conclusie 25 welke 0,2-420 g van het produkt volgens conclusie 1 bevat.

27. Toepassing van de samenstelling volgens conclusie 1 voor de bereiding van een geneesmiddel voor de behandeling van kanker.

28. Toepassing van de samenstelling volgens conclusie 1 voor de bereiding van een geneesmiddel voor orale toediening in de vorm van een tablet of capsule voor de behandeling van kanker.

29. Toepassing van de samenstelling volgens conclusie 1, voor de bereiding van een geneesmiddel voor parenterale toediening in de vorm van een infusieoplossing voor de behandeling van kanker.

30. Toepassing van de samenstelling volgens conclusie 1, voor de bereiding van een geneesmiddel voor orale toediening in de vorm van een tablet of capsule voor het voorkomen van kanker.