PL177981B1

PL177981B1 - Kompozycja farmaceutyczna do zapobiegania i leczenia chorób rakowych

Info

Publication number: PL177981B1
Application number: PL94309600A
Authority: PL
Inventors: Gyula Kulcsar
Original assignee: Immunal Kft
Priority date: 1993-11-09
Filing date: 1994-11-08
Publication date: 2000-02-29
Also published as: DE4498692T1; SE521049C2; EP0679081A1; FI953369A0; EP0679081B1; KR100363779B1; CN1116406A; HU213677B; DE69429806D1; CZ177395A3; RU2138257C1; ATA900894A; SE9502474D0; FI953369A; AU682735B2; ES2094702B1; SE9502474L; AU1074995A; PL309600A1; CN1128615C

Abstract

1 . Kompozycja farmaceutyczna do zapobiegania i leczenia chorób rakowych, zawie- rajaca substancje aktywne i srodki pomocnicze stosowane w farmacji, znamienna tym, ze ma co najmniej trzy aktywne zwiazki wystepujace w ukladzie krazenia, którymi sa co najmniej je- den aminokwas w ilosci 0,002-70%, wybrany z grupy obejmujacej L-metionine, L-tryptofan, L-tyrozyne, L-fenyloalanine, L-arginine, L-histydyne, N-benzoiloglicyne i/lub ich sole, co najmniej jedna witamina w ilosci 0,0004-80% wagowo, wybrana z grupy obejmujacej d-bio tyne, pirydoksyne, ryboflawine, fosforan 5'-ryboflawiny, kwas lipoilowy, kwas orotowy i/lub ich sole i co najmniej jeden skladnik z grupy obejmujacej adenine, 2-dezoksy-D-ryboze, D-mannoze, kwas jablkowy, kwas szczawiooctowy, trifosforan adenozyny, w ilosci 0,003-80% wagowo i/lub ich farmaceutycznie dopuszczalne sole. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna stosowana do zapobiegania i leczenia chorób rakowych. W leczeniu raka najczęściej stosowane są metody chirurgiczne, napromienianie i leczenie chemioterapeutyczne [The Pharmacological Basis of Therapeutics, Pergamon Press, Inc., New York, str. 1202-1263 (1990); Hamson's Principles ofInternal Medicine, wydanie XII, International Edition, McGraw-Hill, Inc., New York, tom 2, str. 1587-1599 (1991; Scientific American Medicine, Scientific American, Inc., New York, tom. 2(12 (V), stu 1-14 (1984)]. W leczeniu przez napromienianie, poza szeroko stosowanymi jonizacjami, w szczególnych przypadkach stosowane są fototerapia i lokalna hipertermia w połączeniu z napromienianiem i chemioterapią, np. przy raku skóry. Wśród środków chemioterapeutycznych klasyfikowanych według ich działania, pochodzenia i budowy, można znaleźć środki alkilujące, alkaloidy roślinne, antybiotyki, antymetabolity oraz inne remedia (np. asparaginazę) i często stosowane różne hormony. Ostatnio stosowane w chemioterapii strategie obejmują : kombinowaną chemioterapię; długoterminowe infuzje dożylne lub dotętnicze małych dawek leków chemioterapeutycznych o zredukowanej toksyczności; chemioterapię \vysokodawkow'ądki uniknięcia oporności na leki i taką samą terapię

177 981 połączoną z autologiczną transplantacją szpiku kostnego; leki chemioterapeutyczne w połączeniu z modyfikatorami reakcji biologicznych; stosowanie w chemioterapii w szerszym zakresie adjuwantów i neoadjuwantów. Najczęściej stosowanymi modyfikatorami reakcji biologicznych są interferony, czynnik martwicy nowotworowej, limfokiny np. interleukina-2 i przeciwciała monoklonalne. Do obecnie stosowanych metod w leczeniu chorób nowotworowych należąróżne metody dietetyczne, mało rozpoznane preparaty surowicze i metoda Simontona wykorzystująca efekty psychogeniczne, ale skuteczność ich nie została jeszcze udowodniona.

Najbardziej charakterystyczną wadą obecnie stosowanych metod, wyszczególnionych w wyżej podanej literaturze, są toksyczność, znaczne szkodliwe działania uboczne, niska specyficzność guzowa, rozwinięcie się oporności i ograniczony zakres skuteczności. Większość leków cytotoksycznych stosowanych w terapii rakowej nie rozróżnia komórek nowotworowych od normalnych rozrastających się komórek; zatem, aby uniknąć nieodwracalnych szkód w życiowo ważnych tkankach gospodarza (np. szpiku kostnym, jelitach) leki muszą być podawane w dawkach, które zwykle dowodzą, że są niewystarczające do zniszczenia wszystkich obecnych komórek nowotworowych [Pharmac. Ther., 49, 43-54 (1991)]. Terapia przez napromienianie może powodować uszkodzenia radiacyjne a jednocześnie nie jest skuteczna przy komórkach hypoksemicznych i pewnym typie guzów. Leki stosowane w chemioterapii mają również różne toksyczne działania uboczne. Mogą one uszkadzać ośrodkowy układ nerwowy, organy krwiotwórcze, błony śluzowe żołądka i jelit oraz wszystkie rozrastające się komórki. Ponadto mogą one również uszkadzać wątrobę, nerki, płuca i mięsień sercowy. Prawie wszystkie skuteczne środki przeciw guzom sąimmunosupresyjne [Proc. Roy. Soc. Med, 63, 1063-1066 (1970)]. Wiele z nich ma działania powodujące wady rozwojowe lub rakotwórcze, okazjonalnie mogą powodować bezpłodność lub zwiększać częstotliwość wtórnego powstawania guzów. Jest trudne lub niemożliwe wpływanie na 60-70% guzów za pomocą chemioterapii a w trakcie leczenia może się również rozwinąć oporność lub oporność skrzyżowana (cross-resistance).

Niestety, leczenie przy użyciu modyfikatorów reakcji biologicznych z wykorzystaniem własnego mechanizmu obronnego organizmu wykazuje podobne wady, ponieważ stwierdzono, że są one skuteczne tylko w kilku typach guzów a poza tym mają również toksyczne działania uboczne [Harrisods Principles of internal Medicine, wydanie XII, International Edition, McGraw-Hill, Inc., New York., tom 2 str. 1587-1599 (1991)]. Interferony również mająliczne i poważne działania szkodliwe, między innymi np. kardiotoksyczność [Chest, 99, 55 7-561 (1991)]. Podobnie, nadzieje związane z przeciwciałami monoklonalnymi również nie zmaterializowały się [Eur. J. Cancer, 27,936-939 (1991)]. Mimo, że od roku 1980 przeprowadzono zarejestrowanych więcej niż czterysta prób klinicznych immunoterapii żadna z nich nie została dotychczas wprowadzona do leczenia jakiegokolwiek typu raka [J. R. oc. Med., 84, 321 (1991)].

Publikacja PCT nr WO 86/025555 opisuje lek stosowany w leczeniu chorób rakowych, zawierający L-cysteinę, L-metioninę, L-histydynę, L-fenyloalamnę, L-lizyne, L-tryptofan, L-waline, L-leucynę, L-treonine, kwas L-jabłkowy i kwas L-askorbinowy. Kwas L-jabłkowy i kwas L-askorbinowy jako aktywatory buforują i stabilizująaminokwasy w ich postaci kwasowej a zatem powodują one modyfikację wartości pH krwi w zakresie kwasowości poniżej 6,8. W publikacji tej niema danych potwierdzających zatrzymanie rozwoju lub nawet regresję guzów złośliwych.

Opublikowane japońskie zgłoszenie patentowe nr 62-135421 dotyczy aminokwasowego roztworu transfuzyjnego zawierającego specyficzne aminokwasy, z wyjątkiem L-izoleucyny, zdolnego do wykazywania działania inhibitującego mnożenie się guzów. Możliwe, ale nie dowiedzione działanie tego preparatu, mogło bazować na restrykcji aminokwasu, np. izoleucyny,

Celem obecnego wynalazku było wytworzenie kompozycji farmaceutycznych zawierających substancje naturalne, w celu wyeliminowania wad np. toksyczności, niskiej specyficzności i ograniczonego zakresu skuteczności, znanych kompozycji i metod w leczeniu guzów.

Wynalazek bazuje na rozpoznaniu biernego układu obronnego [nazywanego dalej PADS (Passive Antitumour Defence System)] przeciw komórkom rakowym w różnych organizmach. Układ ten jest zdolny do zniszczenia powstających lub już istniejących komórek rakowych.

177 981

Substancjami biorącymi udział w PADS są naturalne substancje endogenne i egzogenne pojawiające się w układzie krążenia, mianowicie aminokwasy, witaminy, zasady nukleinowe, węglowodany i produkty metabolizmu komórki. Stwierdzono, że stosując razem co najmniej trzy z tych substancji - będących składnikami układu krążenia, a zatem substancjami mogącymi dotrzeć i wejść do wszystkich komórek - można synergicznie zwiększać wzajemne działanie tych składników i tym sposobem osiągnąć zdolność do niszczenia komórek rakowych.

Wynalazek bazuje na rozpoznaniu, że z uwagi na synergizm działania, wystąpi znacząca jakościowa różnica pomiędzy komórkami normalnymi i rakowymi, odnośnie do ich zachowania wobec uczestników PADS, na skutek czego te dwa rodzaje komórek będąrozróżnialne. Podczas, gdy klasyczny układ immunologiczny rozpozna i selektywnie zniszczy komórki rakowe z uwagi na ich zewnętrzne różnice w stosunku do komórek normalnych, nowo rozpoznany bierny mechanizm obrony przeciwrakowej może zrobić to samo w rezultacie dewiacji wewnętrznych.

Wynalazek dalej bazuje na rozpoznaniu, że przez podanie kompozycji farmaceutycznej według wynalazku nastąpi wzrost stężenia składników PADS w układzie krążenia do takiego stopnia, że nastąpi ich nadmiar dla komórek rakowych, który spowoduje śmiertelny stres metaboliczny, selektywnie w komórkach rakowych.

Ponadto wynalazek bazuje na rozpoznaniu, że w zależności od stosowanej dawki i drogi podawania, można uzyskać działanie zapobiegawcze lub przeciwguzowe w różnych komórkach guzowych. W przypadku różnych typów guzów, które różnią się w różnym stopniu od komórek normalnych, można określić ilościowy i jakościowy skład najbardziej skutecznej mieszaniny, stosując jako kryterium synergizm.

Zgodnie z wynalazkiem kompozycja farmaceutyczna do zapobiegania i leczenia chorób rakowych zawiera w swym składzie substancje aktywne i środki pomocnicze stosowane w farmacji. Charakteryzuje się tym, że ma co najmniej trzy aktywne związki występujące w układzie krążenia, którymi są co najmniej jeden aminokwas w ilości 0,002-70% wagowo, wybrany z grupy obejmującej L-metioninę, L-tryptofan, L-tyrozynę, L-fenyloalaninę, L-argininę, L-histydynę, N-benzoiloglicynę i/lub ich sole, co najmniej jedna witamina w ilości 0,0004-80% wagowo, wybrana z grupy obejmującej d-biotynę, pirydoksynę, ryboflawinę, fosforan 5'-ryboflawiny, kwas lipoilowy, kwas orotowy, i/lub ich sole i co najmniej jeden składnik z grupy obejmującej adeninę, 2-dezoksy-D-rybozę, D-mannozę, kwas jabłkowy, kwas szczawiooctowy, trifosforan adenozyny w ilości 0,003-80% wagowo, i/lub farmaceutycze dopuszczalne sole.

Korzystnie kompozycja według wynalazku zawiera 0,9-25% wagowo L-metioniny, 0,8-19% wagowo L-tryptofanu, 1,1-48% wagowo L-argininy, 0,9-46%, wagowo d-biotyny, 1 ,2-16%, wagowo piiydoksyny, 0,03-42% wagowo fosforanu 5'-ryboflawiny, 0,5-60% wagowo 2 -dezoksy-D-rybozy, 0,7-68% wagowo kwasujabłkowego. 0,6-40%, wagowo D-mannozy i/lub ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli.

Korzystnie też kompozycja według wynalazku zawiera 0,005-34%o wagowo L-metioniny, 0,002-25% wagowo L-tryptofanu, 0,02-23% wagowo L-tyrozyny, 0,04-3-% wagowo L-fenyloalamny, 0,04-50%o wagowo L-argininy, 0,03-34% wagowo L-histydyny, 0,05-22%o wagowo N-benzoiloglicyny, 0,01-60%, wagowo d-biotyny, 0,01-20%, wagowo pi-zdoksyny, 0,0004-45%, wagowo pobawmy, 0,0005-45%, wagowo fosforanu 5'--yboflawiny. 0,004-15%, wagowo kwasu lipoilowego, 0,01-17% wagowo kwasu orotowego, 0,001-10% wagowo adeniny, 0,01-63%, wagowo 2-dezoksr-D--ybozy, 0,08-42%, wagowo D-mannozy, 0,01-80%, wagowo kwasu jabkkowego, 0,02-60% wagowo kwasu szczawiooctowego, 0,001-10% wagowo trifosforanu adenozyny i/lub ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli.

Korzystnie kompozycja według wynalazku zawiera 30-44% wagowo L-argininy, 21-35% wagowo fosforanu 5'-ryboflawiny, 38-62%, wagowo kwasu jabłkowego i/lub ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli.

Kompozycje według wynalazku wytwarza się przez zmieszanie jej związków aktywnych oraz dodanie i zmieszanie nośników, rozcieńczalników i/lub innych środków pomocniczych powszechnie stosowanych w farmacji, w ilości koniecznej do uzupełnienia masy kompozycji do 100%.

177 981

Kompozycje według wynalazku stosuje się w lecznictwie jako kompozycje farmaceutyczne, tzn. po zmieszaniu ich z nietoksycznymi obojętnymi, stałymi lub ciekłymi nośnikami, rozcieńczalnikami, spoiwami i/lub innymi dodatkami powszechnie stosowanymi w przemyśle farmaceutycznym do podawania dojelitowego lub pozajelitowego, przekształca się je w jeden ze zwykłych preparatów farmaceutycznych. Nośnikami, rozcieńczalnikami i spoiwami są np. woda, żelatyna, laktoza, sacharoza, skrobia, pektyna, kwas stearynowy, stearynian magnezu, talk, różne oleje roślinne jak również glikole takie jak glikol propylenowy lub glikol polietylenowy. Farmaceutycznymi dodatkami i substancjami pomocniczymi są np. środki konserwujące takie jak 4-hydroksybenzoesan metylu, różne naturalne lub syntetyczne środki emulgujące, dyspergujące i zwilżające, środki barwiące i aromatyzujące, substancje buforowe, jak również środki zapoczątkowujące dezintegrację lub rozpuszczanie oraz inne substancje poprawiające pożądany efekt.

Zwykłe preparaty lecznicze stanowią kompozycje doustne sporządzone przez zastosowanie wyżej wymienionych dodatków farmaceutycznych; kompozycje te mogą mieć postać stałą, np. tabletek, kapsułek, proszków, drażetek, pigułek lub granulek lub ciekłą, np. syropów, roztworów, emulsji lub zawiesin; ponadto kompozycji doodbytnicznych takich jak czopki; jak również kompozycji pozajelitowych, np. roztworów do iniekcji lub infuzji.

Korzystna dawka dzienna kompozycji według wynalazku zależy od kilku czynników takich jak charakter leczonej choroby, stan pacjenta, droga podawania leku itd. Korzystna dawka dzienna wynosi 30-3000 mg/kg wagi ciała. Zgodnie z tym, odpowiednie jest podawanie dziennie 1-4 tabletek, kapsułek lub drażetek, z których każda zawiera 0,2-3 g aktywnej kompozycji lub 0,5-3 l roztworu infuzyjnego zawierającego 10-200 g/l aktywnej kompozycji.

Wynalazek zostanie wyjaśniony szczegółowo w nawiązaniu do przedstawionych tabel, figur i przykładów.

Komórki stosowane w wykonywanych próbach otrzymano z „American Type Culture Collection” (Rockville, MD, St. Zjedn.).

Tabela 1 przedstawia działanie zabijające komórki guzów i synergiczne współdziałanie różnych zestawów składników PADS, sporządzonych w postaci roztworów, opisanych w przykładach 1-20, zawierających odpowiednio cztery i pięć składników aktywnych, na komórki szpiczaka Sp2/0-Ag14 (ATCC CRL 1581).

Tabela 2 przedstawia, na bazie przykładów 21-37, zwiększone działanie kompozycji zawierających pięć składników aktywnych na komórki Sp2/0-Ag14, po dodaniu dalszych składników.

Występujący w przykładowych kompozycjach kwas askorbinowy może być zastąpiony innym składnikiem wybranym z grupy obejmującej d-biotynę, pirydoksynę, ryboflawinę, kwas lipoilowy, kwas orotowy i/lub ich sole bez zmiany skuteczności oddziaływania kompozycji. Analogicznie zastąpienie D-glukozaminy innym składnikiem wybranym z grupy obejmującej adeninę, 2-dezoksy-D-rybozę, D-mannozę, kwas jabłkowy, kwas szczawiooctowy, trifosforan adenozyny nie zmienia skuteczności oddziaływania kompozycji. Kwas askorbinowy i D-glukozoamina mogą być też usunięte ze składu przykładowych kompozycji bez zmiany skuteczności ich oddziaływania, jeżeli w składach tych kompozycji występują już składniki wybrane odpowiednio z grupy obejmującej d-biotynę, pirydoksynę, ryboflawinę, kwas lipoilowy, kwas orotowy i/lub ich sole oraz z grupy obejmującej adeninę, 2-dezoksy-D-rybozę, D-mannozę, kwas jabłkowy, kwas szczawiooctowy i trifosforan adenozyny.

Figura 1 pokazuje działanie i synergiczne współdziałanie składników kompozycji zawierających cztery i pięć aktywnych składników odpowiednio, według przykładów 1-20.

Figura 2 porównuje działanie in vitro kompozycji zawierających pięć aktywnych składników według przykładów 102-106 i kompozycji zawierających dwadzieścia jeden aktywnych składników według przykładów 107-111 na komórki szpiczaka mysiego Sp2/0-Ag14, w stosunku do odpowiadającej mieszaniny kontrolnej.

Figura 3 pokazuje działanie kompozycji zawierających dwadzieścia jeden aktywnych składników według przykładu 107 na komórki szpiczaka mysiego Sp2/0-Ag14 w funkcji czasu, w stosunku do komórek nietraktowanych i do odpowiedniej mieszaniny kontrolnej.

177 981

Figura 4 pokazuje działanie in vitro kompozycji zawierających dwadzieścia jeden aktywnych składników według przykładów 107-111 na ludzkie komórki K-562 choroby di Gugliemo (ATCC CCL 243) w stosunku do odpowiadających mieszanin kontrolnych.

Figura 5 pokazuje działanie in vitro kompozycji zawierających dwadzieścia jeden aktywnych składników według przykładów 107-111 na ludzkie komórki HeLa raka nabłonka szyjki macicy (ATCC CCL2) w stosunku do odpowiadających mieszanin kontrolnych.

Figura 6 pokazuje działanie in vitro kompozycji zawierających dwadzieścia jeden aktywnych składników według przykładów 107-111 na ludzkie komórki HEp-2 raka naskórzaka krtani (ATCC CCL 23) w stosunku do odpowiadających mieszanin kontrolnych.

Figura 7 pokazuje działanie in vitro kompozycji zawierających dwadzieścia jeden aktywnych składników według przykładów 107-111 na normalne komórki nerkowe zielonej małpy Vero African (ATCC CCL 81) w stosunku do odpowiadających mieszanin kontrolnych.

Figura 8 pokazuje działanie in vivo kompozycji zawierających dwadzieścia jeden aktywnych składników według przykładu 112 na guz wywołany komórkami szpiczaka mysiego Sp2/0-Agl4 wstrzykniętymi i.p. myszy BALB/c w stosunku do odpowiadającej grupy kontrolnej.

Figura 9 pokazuje działanie in vivo kompozycji zawierających dwadzieścia jeden aktywnych składników według przykładu 112 na stały guz wywołany pod skórą z ludzkich komórek HeLa raka nabłonka szyjki macicy wstrzykniętych s.c. myszy BALB/c (nu/nu) w stosunku do odpowiadającej grupy kontrolnej.

Do badań stosowano następujące środowiska: w przypadku komórek Sp2/0-Ag14 i K-562 środowisko RPMI1640 (Sigma Chemie GmbH, D-8024 Deisenhofen, Niemcy, produkt nr R 6504), w przypadku komórek HEp-2, HeLa i Vero środowisko MEM (Sigma Chemie GmbH, D-8024 Deisenhofen, Niemcy, produkt nr M 4655).

Przykład 1-37. Do aparatu wyposażonego w mieszadło środków aktywnych zważono w ilościach podanych i pokazanych w tabelach 1 i 2, po czym do otrzymanej sproszkowanej mieszaniny dodano wodorowęglan sodu również w ilości podanej w tabelach 1 i 2, koniecznej do zneutralizowania składników typu kwaśnego. Podczas kontynuowania mieszania do mieszaniny dodano odpowiednie środowisko w celu uzupełnienia masy kompozycji do 100%. Działanie roztworów sporządzonych w ten sposób można zobaczyć w tabelach 1 i 2 oraz na figurze 1.

Przykłady88-67. Postępowano według przykładów 1-37 z tą różnicą, że do zneutralizowania składników typu kwaśnego stosowano odpowiednie ilości wodorowęglanu potasu, w miejsce wodorowęglanu sodu. Działanie roztworów sporządzonych w ten sposób nie różniło się znacząco w żadnym przypadku od działania roztworów z przykładów 1-37 przedstawionych w tabelach 1 i 2 i na figurze 1, odpowiednio.

Przykłady 68-97. Postępowano według przykładów 1-37 z tą różnicą, że do zneutralizowania składników typu kwaśnego stosowano odpowiednie ilości węglanu wapnia, zamiast wodorowęglanu sodu. Działanie roztworów sporządzonych w ten sposób nie różniło się znacząco w żadnym przypadku od działania roztworów z przykładów 1-37 przedstawionych w tabelach 1 i 2i na figurze 1, odpowiednio.

Przykłady98-101. Postępowano według przykładów 23,24,271 28 z tą różnicą, że stosowano 0,053%o wagowo chlorowodorku L-argnunyi 0,052% wagowo chlorowodorku L-histydynY) 0,009% wagowo chlorowodorku L-metioniny i 0,025%) wagowo chlorowodorku Lttyrozynyi odpowiednio, zamiast odpowiednio, L-argininy, L-histydyny, L-metioniny i L-tyrozyny, stosowanych w przykładach 23, 24, 27 i 28 odpowiednio. Odpowiadająca ilość wodorowęglanu sodu w każdym przypadku wynosiła 0,054% wagowo. Działanie roztworów sporządzonych w ten sposób nie różniło się znacząco w żadnym przypadku od działania roztworów z przykładów 23,24,27 i 28 przedstawionych w tabeli 2.

Przykład 102. Do aparatu wyposażonego w mieszadło zważono 0,01 % wagowo L-tryptofanu, 0,034%) wagowo 2-dezoksy-D-iybo;yi 0,003% wagowo adcnnty) 0,065%) wagowo kwasu jabłkowego, 0,007%o wagowo kwasu L-askorbinowego i 0,091%> wagowo wodorowęglanu sodu. Wówczas, podczas ciągłego mieszania, dodano do tej mieszaniny odpowiednie środowi177 981 sko w celu uzupełnienia masy kompozycji do 100%. Działanie roztworu sporządzonego w ten sposób pokazano na figurze 2 przy 100% kompozycji.

Przykład 103. Postępowano według przykładu 102 z tą różnicą, ze zwazono tylko 80% ilości każdego składnika. Następnie do tej mieszaniny dodano odpowiednie środowisko w celu uzupełnienia masy kompozycji do 100%. Działanie roztworu sporządzonego w ten sposób pokazano na figurze 2 przy 80% kompozycji.

Przykład 104. Postępowano według przykładu 102 z tą różnicą, że zważono tylko 60% ilości każdego składnika. Następnie do tej mieszaniny dodano odpowiednie środowisko w celu uzupełnienia masy kompozycji do 100%. Działanie roztworu sporządzonego w ten sposób pokazano na figurze 2 przy 60% kompozycji

Przykład 105. Postępowano według przykładu 102 z tą różnicą, że zważono tylko 40% ilości z każdego składnika. Następnie do tej mieszaniny dodano odpowiednie środowisko w celu uzupełnienia masy kompozycji do 100% Działanie roztworu sporządzonego w ten sposób pokazano na figurze 2 przy 40% kompozycji.

Przykład 106. Postępowano według przykładu 102 z tą różnicą, że zważono tylko 20% ilości z każdego składnika. Następnie do tej mieszaniny dodano odpowiednie środowisko w celu uzupełnienia masy kompozycji do 100%. Działanie roztworu sporządzonego w ten sposób pokazano na figurze 2 przy 20% kompozycji.

Przykład 107. Do aparatu wyposażonego w mieszadło zważono 0,011 % wagowo L-metioniny, 0,01% wagowo L-tryptofanu, 0,036% wagowo L-tyrozyny, 0,041% wagowo L-fenyloalaniny, 0,044% wagowo L-argininy, 0,039% wagowo L-histydyny, 0,089% wagowo N-benzoiloglicyny, 0,007% wagowo kwasu L-askorbinowego, 0,012% wagowo d-biotyny, 0,010% wagowo pirydoksyny, 0,0004% wagowo ryboflawiny, 0,0006% wagowo fosforanu 5'-ryboflawiny, 0,0006% wagowo kwasu lipoilowego, 0,017% wagowo kwasu orotowego, 0,003% wagowo adeniny, 0,034% wagowo 2-dezoksy-D-rybozy, 0,090% wagowo D-mannozy, 0,053% wagowo D-glukozaminy, 0,065% wagowo kwasu jabłkowego, 0,040% wagowo kwasu szczawiooctowego, 0,0015% wagowo trifosforanu adenozyny i 0,087% wagowo wodorowęglanu sodu. Następnie, podczas ciągłego mieszania, do tej mieszaniny dodano odpowiednie środowisko w celu uzupełnienia masy kompozycji do 100%. Działanie roztworu sporządzonego w ten sposób pokazano na figurach 2, 3, 4, 5, 6 i 7 przy 100% kompozycji.

Przykład 108. Postępowano według przykładu 107 z tą różnicą, ze zważono tylko 80% ilości każdego składnika. Następnie do tej mieszaniny dodano odpowiednie środowisko w celu uzupełnienia masy kompozycji do 100%. Działanie roztworu sporządzonego w ten sposób pokazano na figurach 2, 3, 4, 5, 6 i 7 przy 80% kompozycji.

Przykład 109. Postępowano według przykładu 107 z tą różnicą, ze zważono tylko 60% ilości każdego składnika. Następnie do tej mieszaniny dodano odpowiednie środowisko w celu uzupełnienia masy kompozycji do 100%. Działanie roztworu sporządzonego w ten sposób pokazano na figurach 2, 3, 4, 5, 6 i 7 przy 60% kompozycji.

Przykład 110. Postępowano według przykładu 107 z tą różnicą, że zważono tylko 40% ilości każdego składnika. Następnie do tej mieszaniny dodano odpowiednie środowisko w celu uzupełnienia masy kompozycji do 100%. Działanie roztworu sporządzonego w ten sposób pokazano na figurach 2, 3, 4, 5, 6 i 7 przy 40% kompozycji.

Przykład 111. Postępowano według przykładu 107 z tą różnicą, że zważono tylko 20% ilości każdego składnika. Następnie do tej mieszaniny dodano odpowiednie środowisko w celu uzupełnienia masy kompozycji do 100%. Działanie roztworu sporządzonego w ten sposób pokazano na figurach 2, 3, 4, 5, 6 i 7 przy 20% kompozycji.

Przykład 112. Do aparatu wyposażonego w mieszadło zważono 1,47% wagowo L-metioniny, 1,01% wagowo L-tryptofanu, 0,036% wagowo L-tyrozyny, 163% wagowo L-fenyloalaniny, 1,71% wagowo L-argininy, 1,53% wagowo L-histydyny, 0,18% wagowo benzoiloglicyny, 1,94% wagowo kwasu L-askorbinowego, 1,21% wagowo d-biotyny, 2,02% wagowo pirydoksyny, 0,038% wagowo ryboflawiny, 0,05% wagowo fosforanu 5'-ryboflawiny, 0,02% wagowo kwasu lipoilowego, 0.09% wagowo kwasu orotowego, 0,068% wagowo adeniny, 1,32% wago8

177 981 wo 2-dezoksyD-rybozy, 1,8% wagowo D-mannozy, 1,1% wagowo D-glukozaminy, 1,32% wagowo kwasu jabłkowego, 0,040% wagowo kwasu szczawiooctowego, 0,11% wagowo trifosforanu adenozyny, 1,34% wagowo wodorowęglanu sodu i 0,04% wagowo wodorowęglanu potasu. Następnie podczas ciągłego mieszania do tej mieszaniny dodano 83,168% wagowo buforu zawierającego 0,02% wagowo KH₂PO₄ i 0,3% wagowo Na₂HPO₄. Działanie roztworu sporządzonego w ten sposób i stosowanego do traktowania zwierząt przedstawiono na figurach 8 i 9.

Przykład 113. Do miksera zważono 20% wagowo L-tryptofanu, 62% wagowo kwasu askorbinowego i 18% wagowo D-glukozaminy. Po starannym wymieszaniu otrzymaną sproszkowaną mieszaninę stosowano z próbach prewencyjnych.

Przykład 114. Postępowano według przykładu 113 z tą różnicą, że stosowano 32% wagowo L-argininy, 28% wagowo fosforanu 5'-ryboflawiny i 40% wagowo kwasu jabłkowego.

Przykład 115. Postępowano według przykładu 113 z tą różnicą, że stosowano 23% wagowo L-tryptofanu, 0,2% wagowo pirydoksyny, 17,8% wagowo N-benzoiloglicyny i 59% wagowo kwasu szczawiooctowego.

Przykład 116. Postępowano według przykładu 113 z tą różnicą, że stosowano 19% wagowo L-tyrozyny, 61 % wagowo kwasu L-askorbinowego, 0,2% wagowo adeniny i 19,8% wagowo L-histydyny.

Przykład 117. Postępowano według przykładu 113 z tą różnicą, że stosowano 31 % wagowo L-metioniny, 53% wagowo d-biotyny, 0,2% wagowo adeniny i 15,8% wagowo kwasu orotowego.

Przykład 118. Postępowano według przykładu 113 z tą różnicą, że stosowano 27% wagowo L-fenyloalamny, 33% wagowo ryboflawiny, 0,2% wagowo triofosforanu adenozyny i 39,8% wagowo D-mannozy.

Przykład 119. Postępowano według przykładu 113 z tą różnicą, że stosowano 32% wagowo L-histydyny, 9% wagowo kwasu lipoilowego i 59% wagowo 2-dezoksy-D-rybozy.

Przykład 120. Postępowano według przykładu 113 z tą różnicą, że stosowano 12% wagowo L-argininy, 11% wagowo pirydoksyny i 77% wagowo kwasu jabłkowego.

Przykład 121. Do miksera zważono 10% wagowo L-metioniny, 3% wagowo L-tryptofanu, 0,2% wagowo L-tyrozyny, 10,9% wagowo L-fenyloalaniny, 22,7% wagowo L-argininy, 10% wagowo L-histydyny, 1,1% wagowo N-benzoiloglicyny, 119% wagowo kwasu L-askorbinowego, 0,1 % wagowo d-biotyny, 0,2% wagowo pirydoksyny, 0,05% wagowo ryboflawiny, 0,35% wagowo fosforanu 5'-ryboflawiny, 0,1% wagowo kwasu lipoilowego, 0,6% wagowo kwasu orotowego, 0,3% wagowo adeniny, 0,9% wagowo 2-dezoksy-D-rybozy, 11,5% wagowo D-mannozy, 7% wagowo D-glukozaminy, 8% wagowo kwasu jabłkowego, 0,4% wagowo kwasu szczawiooctowego i 0,7% wagowo trifosforanu adenozyny. Po starannym wymieszaniu otrzymaną sproszkowaną mieszaninę stosowano w próbach prewencyjnych

Działanie kompozycji z przykładów 1-37 i synergiczne współdziałanie aktywnych składników (w porównaniu z działaniem składników przedstawionych osobno) badano na komórkach szpiczaka mysiego Sp2/0-Ag14.

W doświadczeniach stosowano najnowocześniejsze metody zaaprobowane w literaturze naukowej. W przypadku linii Sp2/0-Ag14 i K562, logarytmicznie rosnące komórki zbierano ze środowiska i ponownie zawieszano w 96 wgłębieniach płytki stosowanej do hodowli komórkowej do końcowego stężenia 4x10⁴ komórek Sp2/0-Ag14 i 2x10⁴ komórek K562, odpowiednio, w 250 pl odpowiedniego środowiska na wgłębienie, zawierające badany materiał we wskazanych stężeniach. W przypadku komórek, HeLa, HEp-2 i Vero, komórki hodowlane zbierano z 75% zlewającej się hodowli tkankowej w kolbie z 0,2% trypsyny i ponownie zawieszono w odpowiednim środowisku przy gęstości 1(0 komórek/ml. Jednakowe porcje (100 pl) rozdzielono do 96 wgłębień na mikropłytkach i inkubowano przez 24 godziny. Wówczas środowisko odrzucono i zastąpiono 250 pl świeżego środowiska zawierającego badane związki we wskazanych stężeniach Pozwolono, aby wszystkie rodzaje komórek rozrastały się przez 48 godzin. Następnie mikroskopowo policzono liczbę żywych komórek Sp2/0-Ag141 K562 sposobem wykluczenia barwnikiem błękitu trypano177 981 wego. Komórki HeLa, HEp-2 i Vero, które przeżyły mierzono przez ocenę aktywności endogenicznej alkalicznej fosfatazy komórek Wyniki oceniano stosując test Studenta. Dane po średnich wartościach w tabelach i znaki na rysunkach oznaczają „standardowy błąd przeciętnej (SEM).

Pierwsza kolumna w tabeli 1 pokazuje numer przykładu, druga pokazuje numer próby kontrolnej podczas, gdy w dalszych sześciu kolumnach przedstawiono ilości składników stosowanych w próbach, wyrażonych w % wagowych. Mieszaniny kontrolne skomponowano z tych samych ilości chemicznie podobnych, ale farmakologicznie nieskutecznych substancji (0,026% wagowo L-seryny, 0,033% wagowo L-asparaginy, 0,029% wagowo L-waliny, 0,018% wagowo L-alaniny, 0,006% wagowo glicyny, 0,059% wagowo trimetyloglicyny i 0,006% wagowo L-prolinyjako aminokwasów; 0,017% wagowo chlorowodorku tiaminy, 0,006% wagowo niacyny, 0,019% wagowo soli sodowej kwasu foliowego, 0,001% wagowo soli hemiwapniowej kwasu D-pantotenowego, 0,012% wagowo uracylu i 0,0008% wagowo kwasu oktanowego jako witamin, 0,003% wagowo hipoksantyny, 0,038% wagowo D-rybozy, 0,090% wagowo glukozy, 0,55% wagowo N-acetyloglukozoaminy, 0,081% wagowo soli dwusodowej kwasu bursztynowego, 0,080% wagowo soli dwusodowej kwasu fumarowego i 0,0015% wagowo soli trójsodowej trifosforanu guanozyny jako składników aktywnych kompozycji. Dwie ostatnie kolumny pokazują działanie kompozycji zawierającej cztery i pięć składników aktywnych, odpowiednio, i działanie składników jako takich (próby kontrolne), mianowicie liczbę komórek po 48 godzinach inkubowania i odpowiednio udział procentowy tych komórek w stosunku do ilości komórek nietraktowanych (ilość nietraktowanych komórek wynosi 100%). Próby kontrolne 2-4 wykazują działanie na liczbę komórek dla przypadku, gdy ilość samego L-tryptofanu wynosi odpowiednio 0,002; 0,006; i 0,01% wagowo. W przykładach 2-4 pokazano działanie L-tryptofanu stosowanego w tych samych ilościach, ale stosowanego razem z innymi czterema składnikami aktywnymi.

Z danych z dwóch ostatnich kolumn tabeli 1 można zobaczyć, ze stosując wyżej wymienione substancje same, żadna z nich nie wykazała działania zabijającego komórki guza: w rzeczywistości stosując podane ilości L-tryptofanu rozrastanie komórek nawet nieznacznie wzrosło. Jednocześnie można zauważyć z danych zawartych w kolumnach będących przedmiotem zainteresowania, ze każda substancja zwiększa działanie pozostałych czterech składników proporcjonalnie do jej ilości w sposób synergiczny. Na przykład dodatek 0,01% wagowo L-tryptofanu zwiększyło działanie czterech innych składników z 73,1 % do 92,3%. Ta sama ilość (0,01 % wagowo) samego L-tryptofanu, ale bez innych czterech składników, nawet nieco zwiększyła rozrastanie komórek To niedwuznacznie potwierdza działanie synergistyczne

Różnica pomiędzy działaniem kompozycji zawierających cztery aktywne składniki (przykłady 15,9117) a kompozycji zawierających piąty aktywny składnik (przykłady 4, 8, 12, 161 20) w maksymalnych stosowanych tu ilościach (np. L-tryptofanu 0,01% wagowo) była znaczna we wszystkich przypadkach (p<0,01), zatem wszystkie substancje znacząco zwiększały działanie pozostałych czterech składników.

Tabela 1

Działanie kompozycji i poszczególnych składników aktywnych na komóiki szpiczaka mysiego Sp2/0-Ag14

Przykład	Próba *K	Ilość składników w piocentach wagowych	Skutek
L-tryptofan	2-Dezoksy ryboza	Adenina	Kwas jabłkowy	Kwas askorbi- nowy	Na- wodo- rowę- glan	zmiana liczby komórek (x 10⁴)	w % komórek nietraktowanych
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
1		-	0,034	0,003	0,065	0,007	0,091	15,9 ± 1,2	26,9 ±2.0
	1	-	-	-	-	-	-	59,1 ±3,2	100,0

177 981

Tabela 1 (ciąg dalszy)

1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
2		0,002	0,034	0,003	0,065	0,007	0,091	10,7 ±2,9	18,1 ±4,8
	2	0,002	-	-	-	-	-	61,7 ±3,0	104,4 ±5,0
3		0,006	0,034	0,003	0,065	0,007	0,091	6,0 ± 1,4	10,1 ±2,4
	3	0,006	-	-	-	-	-	62,6 ±2,0	106,0 ±3,4
4		0,010	0,034	0,003	0,065	0,007	0,091	4,5 ±0,3	7,7 ± 0,6
	4	0,010	-	-	-	-	-	63,0 ± 3,4	106,6 ±5,8
5		0,010	-	0,003	0,065	0,007	0,091	14,8 ±0,4	25,1 ±0,7
	5	-	-	-	-	-	-	59,1 ±3,2	100,0
6		0,010	0,013	0,003	0,065	0,007	0,091	12,2 ±0,3	20,6 ±0,6
	6	-	0,013	-	-	-	-	59,3 ±2,3	100,4 ±4,1
7		0,010	0,025	0,003	0,065	0,007	0,091	8,7 ±0,8	14,8 ± 1,3
	7	-	0,025	-	-	-	-	59,8 ± 1,2	101,1 ±2,2
8		0,010	0,034	0,003	0,065	0,007	0,091	4,5 ±0,3	7,7 ± 0,6
	8	-	0,034	-	-	-	-	59,0 ±3,2	99,9 ± 5,9
9		0,010	0,034	-	0,065	0,007	0,091	12,6 ± 1,3	21,4 ±2,3
	9	-	-	-	-	-	-	59,1 ±3,2	100,0
10		0,010	0,034	0,001	0,065	0,007	0,091	10,1 ± 1,8	17,1 ±3,2
	10	-	-	0,001	-	-	-	60,5 ± 1,4	102,4 ±2,5
11		0,010	0,034	0,002	0,065	0,007	0,091	7,9 ± 1,7	13,4 ±2,9
	11	-	-	0,002	-	-	-	58,2 ± 1,8	98,5 ±3,2
12		0,010	0,034	0,003	0,065	0,007	0,091	4,5 ±0,3	7,7 ±0,6
	12	-	-	0,003	-	-	-	58,6 ± 1,5	99,1 ±2,8
13		0,010	0,034	0,003	-	0,007	0,007	16,6 ± 1,2	28,1 ±2,1
	13	-	-	-	-	-	-	59,1 ±3,2	' - 100,0
14		0,010	0,034	0,003	0,013	0,007	0,024	13,1 ±2,2	22,2 ±4,0
	14	-	-	-	0,013	-	-	58,7 ±2,1	99,3 ±3,7
15		0,010	0,034	0,003	0,039	0,007	0,057	9,9 ± 1,1	16,7 ±2,0
	15	-	-	-	0,039	-	-	60,4 ± 1,7	102,2 ±3,0
16		0,010	0,034	0,003	0,065	0,007	0,091	4,5 ±0,3	7,7 ±0,6
	16	-	-	-	0,065	-	-	58,8 ±2,5	99,5 ±4,5
17		0,010	0,034	0,003	0,065	-	0,084	13,2 ±0,8	22,3 ± 1,3
	17	-	-	-	-	-	-	59,1 ±3,2	100,0
18		0,010	0,034	0,003	0,065	0,003	0,087	11,9 ±2,1	20,2 ±3,7
	18	-	-	-	-	0,003	-	58,2 ± 1,4	98,5 ±2,5
19		0,010	0,034	0,003	0,065	0,005	0,089	6,8 ±2,0	11,6 ±3,5
	19	-	-	-	-	0,005	-	56,7 ±2,1	96,0 ±3,7
20		0,010	0,034	0,003	0,065	0,007	0,091	4.5 ±0,3	7,7 ±0,6
	20	-	-	-	-	0,007	-	,56,3 ±2,6	95,2 ±4,8

* Kontrolna

177 981

Działanie synergiczne kompozycji z przykładów 1-20 zawierających pięć składników aktywnych przedstawiono na figurze 1, gdzie na osi pionowej pokazano ilości komórek Sp2/0-Ag14 wyrażone w % ilości komórek nietraktowanych (ilość komórek nietraktowanych wynosi 100%). Na osi poziomej pokazano ilości L-tryptofanu, 2-dezoksy-D-rybozy, kwasu jabłkowego i kwasu askorbinowego wyrażone w % wagowych. Białe kolumny reprezentują ilości komórek wyrażone w % ilości komórek nietraktowanych po 48 godzinach inkubowania przy użyciu wyżej wymienionych substancji samych zaś czarne kolumny pokazują otrzymane wyniki, przy stosowaniu ich razem z innymi czterema składnikami aktywnymi. Zmiany w różnych stopniach (w przypadkach L-tryptofanu nawet w kierunku przeciwnym) białych i czarnych kolumn przy wzrastających ilościach indywidualnych substancji dowodzą działania synergicznego a czarne kolumny demonstrują silne działanie kompozycji zabijające komórki guza

Na podstawie przykładów 21-37 pokazano jak działanie kompozycji zawierającej pięć aktywnych składników zwiększy się w przypadku komórek Sp2/0-Ag14, po dodaniu dalszych składników. W tabeli 2 przedstawiono ilości materiałów wyrażonych w % wagowych i pomnożonych przez 1000, zatem liczby w tabeli powinno się czytać przez pomnożenie przez 10'³ na przykład w przykładzie 21 w przypadku L-tryptofanu liczba 6 oznacza 6 x 10'3, to znaczy 0,006% wagowo. Warunki prób były takie same jak poprzednio.

Podobnie jak w tabeli 1, również tutaj, można zobaczyć z danych dwóch ostatnich kolumn tabeli 2 (liczba komórek i %), że ze stosowanych wyżej wymienionych substancji samych żadna nie ma działania obniżającego rozrost komórek, ponadto przez działanie L-fenyloalaniny (próba kontrolna 22), L-argininy (próba kontrolna 23), L-histydyny (próba kontrolna 24) i ryboflawiny (próba kontrolna 29) liczba komórek w porównaniu z komórkami nietraktowanymi (próba kontrolna 21) nawet nieco wzrosła. Można również zauważyć, że te same substancje, gdy stosuje się je w tych samych ilościach synergicznie zwiększają działanie kompozycji z przykładu 21. Bez substancji potęgujących działanie kompozycji z przykładu 21 zawierającego pięć składników aktywnych były we wszystkich przypadkach znacząco mniejsze niż wszystkich innych związków razem.

Porównano również działanie kompozycji z przykładów 107-111 zawierających dwadzieścia jeden składników aktywnych i działanie kompozycji z przykładów 102-106 zawierających pięć składników aktywnych. Aby pomóc w porównywalności z wcześniejszymi wynikami zastosowano również komórki Sp2/0-Ag 14 oraz takie same warunki próby jak poprzednio. Wyniki przedstawiono na figurze 2. Na osi pionowej pokazano zmiany ilości komórek wyrażone w % ilości komórek nietraktowanych. Na osi poziomej pokazano zmiany wyrażone w % kompozycji (zmiany ilości składników aktywnych) Kompozycję z przykładu 102 zawierającą pięć składników aktywnych uznano za 100%. Zatem 80% kompozycja z przykładu 103 zawiera 80% każdego ze składników.. W przypadkach kompozycji zawierających dwadzieścia jeden składników aktywnych kompozycja z przykładu 107 uważana jest za 100%.

177 981

Tabela 2

Działania kompozycji i indywidualnych składników na komórki szpiczaka mysiego Sp2/0-Ag14

	Ilość składników w procentach wagowych (x 10’)	Skutek
Przykład	Próba kontrolna	L-tryptofan j	2-dezoksy-d--ybrza	Adenina	Kwas jabłkowy	Kwas L-askorbinowy	Na-wodorowęglan	L-fenyloalanina	L-arginina -1	L-hitydyna	Biotyna	Pirydoksyna	L-metionina	L-tyrozyna	1 Ryboflawina	Kwas szczawiow^^^y	Zirnana liczby komórek (x 10⁴>	w % komórek nietraktowanych
21		6	20	2	39	4	54										49,8 ± 0,4	67,0 ± 0,6
	21																74,3 ± 3,9	100,0
22		6	20	2	39	4	54	41	-	-	-	-	-	-	-	-	30,4 ± 1,4	40,9 ± 1,9
	22							41									81,3 ± 3,0	109,4 ±4,0
23		6	20	2	39	4	33	-	44	-	-	-	-	-	-	-	33,8 ± 1,1	45,4 ± 1,5
	23	-	-	-	-	-	-	-	44	-	-	-	-	-	-	-	76,8 ± 1,3	103,4 ± 1,8
24		6	20	2	39	4	33	-	-	39	-	-	-	-	-	-	40,1 ±0,7	54,0 ± 0,9
	24	-	-	-	-	-	-	-	-	39	•	-	-		-	-	80,7 ±2,0	108,7 ±2,7
25		6	20	2	39	4	54	-	-	-	12	-	-	-	-	-	31,2 ± 1,7	42,0 ± 2,2
	25										12						74,2 ± 2,3	99,9 ±3,1
26		6	20	2	39	4	54	-	-	-	-	10	-	-	-	-	33,9 ± 1,2	45,6 ± 1,6
	26											10	-	-	-		67,6 ± 1,6	91,0 ± 2,1
27		6	20	2	39	4	52	-	-	-	-	-	11	-	-	-	31,1 ± 1,1	41,8 ± 1,5
	27	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	11	-	-	-	73,3 ±2,7	98,7 ±3,6
28		6	20	2	39	4	54	-	-		-	-	-	36	-	-	33,6 ± 1,0	45,3 ± 1,3
	28	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	36	-	-	70,5 ± 1,1	94,9 )+ 1,5
29		6	20	2	39	4	54	-	-	-	-	-	-	-	0,4	-	24,9 ±2,1	33,6· ±2,8
	29														0,4	-	76,9 ± 1,7	103,5 ±2,2
30		6	20	2	39	4	54									40	35,4 ±1,6	47,6 ±2,2
	30															40	72,4 ± 1,3	97,4 ± 1,7

177 981

Tabela 2a

Działania kompozycji i indywidualnych składników na komórki szpiczaka mysiego Sp2/O-Ag14

Ilość składników w procentach wagowych (x 10”)

Skutek

T3 c<3

N

C

O

D03

O

-O

I •Ό

I >>

CZC

-iż

O

N ω

•Ό

Cd

C c

ω

-O <

cd £

id _1 w

Cd ź

id $

O u

O

-O

O ?

cd

Z

a.

F— cd t

o

-o o

-o cc cd

C >.

1,5

1,5 cd

N

O

4<!

o

N

C

U

X)

O s

cd

C e

o

Ul.

0,

0, _o

o.

£ id

0,6

0,6 >>

£ o

&

id o

-iż >,

X)

N

49,8 ± 0,4 74,3 ± 3,9

27,5 ±0,5 71,0 ± 1,1

24.5 ± 0,9 73,1 ± 1,1

20,1 ±0,8 71,7 ± 1,3

24,0 ± 0,6 74,2 ± 1,6

16,3 ±0,5 73,5 ± 1,3

23,8 ± 1,0 73,1 ± 1,6

26,4 ± 0,6 70,0 ± 1,3

3=

O >,

C cd £

O cd

C u

u.

•O £

xc

67,6 ± 0,6 100,0

55,3 ± 1,1 95,6 ± 1,5

49,2 ± 1,2 98,4 ± 1,5

40,3 ± 1,1 96,5 ± 1,8

48,2 ±0,8 99,8 ±2,1

32,7 ±0,7 98,9 ± 1,8

47,8 ± 1,3 98,4 ±2,1

53.1 ±0,8

94.2 ± 1,7

W celu wykluczenia możliwości, iż oznaczane działanie jest rezultatem efektu osmotycznego lub niespecyficznego przeciążenia składnikami odżywczymi lub zaburzenia równowagi aminokwasowej, sporządzono również próby kontrolne. Mieszaniny kontrolne zawierały substancje, które w poprzednich próbach okazały się nieskuteczne w PADS. Skład mieszanin kontrolnych podano z związku z tabelą 1. Otrzymane wyniki prób z kompozycjami z przykładów 102-1061107-111Ϊ mieszanin kontrolnych przedstawiono na figurze 2, na której krzywa z zaznaczonymi pustymi kółkami pokazuje zmianę ilości komórek po 48 godzinnej inkubacji, w przypadku mieszanin kontrolnych, krzywa z wypełnionymi kółkami pokazuje zmiany w przypadku kompozycji zawierającej pięć składników aktywnych z przykładów 102-106 a krzywa zaznaczonymi pustymi trójkątami pokazuje zmianę w przypadku kompozycji zawierającej dwadzieścia jeden składników aktywnych z przykładów 107-111. W próbach prowadzonych ze 100% kompozycjami z przykładów 102,107 i przedstawionymi na figurze 2 indywidualnymi składnikami aktywnymi, stosowano ilości takie, żeby nie wpływały zasadniczo na liczbę komórek (jak można to zauważyć na podstawie wyników z poprzednich prób przedstawionych w tabelach 1 i 2). Na fi14

177 981 gurze 2 można zobaczyć, ze te ilości składników w przypadku, gdy są stosowane razem, mają znaczące działanie przeciwguzowe. Fakt ten raz jeszcze dowodzi synergicznego sposobu współdziałania składników aktywnych. Zatem, bazując na tych próbach można wykluczyć, że oznaczane działania są wynikiem efektu osmotycznego lub niespecyficznego przeciążenia składnikami odżywczymi albo zaburzenia równowagi aminokwasowej.

Dla stwierdzenia, czy jon kompensacyjny odgrywa jakąś rolę w działaniach kompozycji przeprowadzono próby, w których stosowano jony K+ (przykłady 38-67) lub Ca++ (przykłady 68-97) w miejsce jonów Na+. Nie stwierdzono znaczących różnic pomiędzy działaniami kompozycji z różnymi jonami kompensacyjnymi i w rzeczywistości wyniki były dokładnie takie same.

Przebadano, w funkcji czasu, działanie 100% kompozycji z przykładu 107 na komórki Sp2/0-Ag141 porównano ze 100% mieszaniną kontrolną i komórkami nietraktowanymi Warunki prób były takie same jak w poprzednich próbach, z tym wyjątkiem, ze w tym przypadku komórki liczono nie tylko po 48 godzinach, ale także po 6, 12, 26 i 36 godzinach. Wyniki tych prób kinetycznych przedstawiono na figurze 3. Na osi pionowej pokazano liczbę komórek/ml Na osi poziomej pokazano czas w godzinach. Krzywa z pustymi kółkami pokazuje zmianę ilości komórek w przypadku komórek nietraktowanych, krzywa z zaznaczonymi wypełnionymi kółkami pokazuje zmianę w przypadku mieszaniny kontrolnej a krzywa z zaznaczonymi wypełnionymi trójkątami pokazuje zmianę w przypadku kompozycji z przykładu 107 zawierającej dwadzieścia jeden składników aktywnychjako funkcję czasu. Na figurze 3 można zobaczyć, ze mimo, iż mieszanina kontrolna nie ma żadnego działania istotnego na liczbę komórek, ponieważ zwiększa się wykładniczo w czasie i kształt krzywej koresponduje z kształtem krzywej pokazującej rozrastanie nietraktowanych komórek, kompozycja według wynalazku jest toksyczna dla komórek guza powodując zmniejszenie ich liczby w czasie. Zatem, kompozycja według wynalazku nie tylko inhibituje rozrastanie komórek, ale ma działanie cytotoksyczne Ilości składników aktywnych w wyżej wymienionej kompozycji zawierającej dwadzieściajeden substancji były dobrane tak, aby oddzielnie nie miały żadnego znaczącego działania na komórki guza. (Naturalnie, jest to nawet bardziej prawdziwe dla kompozycji 80%, 60 ltd. gdzie ilości składników aktywnych są 20%, 40% ltd. mniejsze). Ponieważ takie same kompozycje stosowane były w próbach in vitro, wyniki we wszystkich przypadkach dowodzą synergicznego współdziałania składników aktywnych.

Powyższe wyniki dowodzą, że efekt spowodowany jest działaniem synergicznym substancji dobranych według rozpoznania stanowiącego podstawę wynalazku. Ponadto, wyniki te również dowodzą, że rozpoznanie to jest poprawne Ponieważ różne komórki rakowe różnią się od komórek normalnych w różnym stopniu, najskuteczniejsze kompozycje według wynalazku przeciw komórkom rakowym również różnią się od siebie. Oznacza to, że przeciw każdemu guzowi najodpowiedniejsza kompozycja może być dobrana za pomocą kryteriów sznergicrnego działania zabijającego komórki guza. Jednak zapobiegawczo lub gdy typ guza może nie być sprawdzony albo z powodu upływu czasu, korzystne jest stosowanie ogólnych kompozycji zawierających dwadzieścia jeden składników. Tak więc, w następnej próbie przebadano jak ogólne jest działanie tych kompozycji i jaka jest ich skuteczność.

Działanie kompozycji z przykładu 107-111 zawierającej dwadzieścia jeden składników na komórki K-562 ludzkiej choroby di Gugliemo badano i porównano z działaniem wyżej wymienionej mieszaniny kontrolnej. Wyniki próby przedstawiono na figurze 4 Podobnie jak na figurze 2, na osi pionowej zaznaczono zmiany ilości komórek wyrażone w % ilości komórek nietraktowanych Na osi poziomej podano zmiany wyrażone w % kompozycji (zmiany ilości składników aktywnych). Krzywa z zaznaczonymi pustymi kółkami pokazuje działanie mieszanin kontrolnych podczas, gdy krzywa z zaznaczonymi wypełnionymi kółkami pokazuje działanie kompozycji zawierających dwadzieścia jeden składników aktywnych. Na figurze 4 można zauważyć, że kompozycje według wynalazku mają znaczące działanie zabijające komórki guza również w przypadku komórek K-562 ludzkiej choroby di Gugliemo

Następnie działanie kompozycji z przykładów 107-111 zawierających dwadzieścia jeden składników badano w przypadku ludzkich komórek HeLa nabłonkowego raka szyjki macicy i ludzkich komórek HEp-2 raka naskórzaka krtani i porównano z działaniem mieszaniny

177 981 kontrolnej. Próba ta była konieczna do pokazania czy poprzednie wyniki były ogólne i niezależne od zaburzającego działanie stosowanego środowiska, sposobu sporządzania zawiesiny, zliczania i wykrywania. Komórki, które przeżyły HeLa, HEp-2 i Vero mierzono przez ocenę endogennej aktywności fosfatazy alkalicznej komórek. W skrócie, po okresie inkubacji, komórki nieprzylegające (przypuszczalnie uszkodzone) wyeliminowano przez przemycie. Następnie 150 pg substratu fosfatazy alkalicznej (4-nitrofenylofosforan, tabletki Sigma nr 111^112) rozpuszczono w 150 ml świeżego 10% buforu dietanoloaminowego (pH 9,8) dodano do każdego wgłębienia. Płytki inkubowano w temperaturze 30°C dopóty, aż wartość absorbancji w przypadku nietraktowanych komórek osiągnęła około 1. Reakcję wstrzymano przez dodanie 50 μΐ 3m NaOH do każdego wgłębienia. Absorbancję mierzono przy 405 nm zapomocączytnika Dynatech ELISA. Z każdego odczytu odejmowano wartości tła. Wyniki przedstawiono na figurze 5 (w przypadku komórek HeLa) i figurze 6 (w przypadku komórek HEp-2). Podobnie jak na figurach 2 i 4, oś pionowa obu figur pokazuje zmianę ilości komórek wyrażoną w % ilości komórek nietraktowanych. Zmiana liczby komórek w tych przypadkach wykrywana była przez pomiar ekstynkcji Pozioma oś pokazuje zmiany wyrażone w % kompozycji (zmiany w ilościach składników aktywnych). Na obu figurach 5 i 6 krzywe zaznaczone pustymi kółkami pokazują działanie mieszanin kontrolnych podczas, gdy krzywe z oznaczeniami w postaci wypełnionych kółek pokazują działanie kompozycji z przykładów 107-111 zawierających dwadzieścia jeden składników aktywnych. Z figur tych można zobaczyć, że kompozycje te są skuteczne przeciw obu liniom komórkowym Wyniki te są nawet cenniejsze biorąc pod uwagę, że HEp-2 jest znane jako „trudna linia komórkowa” odporna na działania zewnętrzne (American Type Culture Collection Catalogue of CellLines andHybridomas, wyd. V, sir. 15-16 (1985)].

Zgodnie z podstawami teoretycznymi wynalazku, kompozycje selektywnie działajątylko na komórki rakowe. Dla dalszego udowodnienia tego stwierdzenia przebadano również działanie kompozycji z przykładów 107-111 zawierających dwadzieścia jeden składników aktywnych i mieszaniny kontrolne na normalnej linii komórkowej komórek nerkowych zielonej małpy Vero African. Wyniki doświadczenia przedstawiono na figurze 7. Na osi pionowej podano zmiany ilości komórek wyrażone w % ilości komórek nietraktowanych. -Na osi poziomej pokazano zmiany wyrażone w % kompozycji (zmiany ilości składników aktywnych). Krzywa ze znakami w postaci pustych kółek pokazuje działanie mieszaniny kontrolnej: podczas, gdy krzywa z zaznaczonymi wypełnionymi kółkami pokazuje działanie kompozycji z przykładu 107-111 zawierającej dwadzieścia jeden składników aktywnych. Na figurze 7 widać, że kompozycje według wynalazku nie wywierają działania cytotoksycznego na normalną linię .komórkową Vero- ponieważ t^^ałbuiKi 100% kompozycji z przykładu 107 na rozrastanie byłaby po wykreśleniu w funkcji czasu podobna do pokazanej na figurze 3 w przypadku mieszanin kontrolnych. Verojest linią komórkowąo szybkim rozrastaniu się [American Type Culture Collection Catalogue of Celi Lines and Hybridomas, wyd. V str. 45-46)] ten eksperyment dowodzi, że w przeciwieństwie do substancji cytostatycznych, kompozycja według wynalazku jest nietoksyczna dla wszystkich komórek o szybkim rozrastaniu się komórek, ale wpływają one selektywnie tylko na komórki guzów-. W oparciu o wyżej wymienione wyniki, kompozycje według wynalazku mogą być uważane za przeciwnowotworowe i nie za preparaty cytotoksyczne.

Dla udowodnienia skuteczności kompozycji według wynalazku przeprowadzono również próby farmakologiczne. W trakcie prób zawsze stosowano sposoby i warunki zgodne z literaturą naukową. Próby prowadzono z komórkami SP2/0-Ag14. Próby prowadzono na 5-6 tygodniowych samicach myszy BALB/c. Próby prowadzono w dwóch grupach zawierających po 10 myszy każda. Myszom wstrzyknięto i.p. 5 x 104 komórek Sp2/0-Ag14 zawieszonych w 200 pl niekompletnej pożywki RPMI 1640. Dzień iniekcji przyjęto za dzień 0 eksperymentu. Liczbę komórek potrzebnych do eksperymentu określano za pomocą testu niszczenia onkogenezy. Traktowanie zwierząt rozpoczęto 24 godziny po iniekcji komórek (jest to pierwszy dzień eksperymentu) i kontynuowano przez 10 kolejnych dni. Grupie kontrolnej wstrzyknięto i.p. 200 pl PBS (solanki buforowanej fosforanem) przy każdym traktowaniu, podczas gdy traktowanej grupie

177 981 wstrzykiwano i.p. tę samą objętość kompozycji według przykładu 112 zawierającej dwadzieścia jeden składników aktywnych.

Najbardziej skutecznądrogątraktowaniabyłaby ciągła infuzja utrzymująca stężenie składników kompozycji na dosyć wysokim poziomie. Z powodu trudności praktycznych, stosowano w przybliżeniu ciągłe podawanie periodyczne np. zwierzęta traktowano sześć razy dziennie. Wyniki próby przedstawiono na figurze 8. Na osi poziomej zaznaczono ilość dni, które upłynęły od początku eksperymentu. Na osi pionowej zaznaczono wartości przeżycia w % t.j. ilość myszy, które były żywe w danym dniu. Zatem 10 myszy znaczy 100 a 8 myszy znaczy 80%, odpowiednio. Białe kolumny pokazują przeżycie traktowanych myszy, czarne kolumny myszy nietraktowanych. Można zobaczyć na figurze 8, że np w dniu 16 żadna z myszy nietraktowanych nie przeżyła a myszy traktowane były stale jeszcze żywe. Wszystkie nietraktowane myszy zdechły do 16 dnia, myszy traktowane dopiero dnia 25 Można zauważyć, że z uwagi na traktowanie uzyskano znaczący przedłużenie życia. Mediana przeżycia czasu przeżycia wynosiła 21 dni dla grupy traktowanej podczas, gdy dla grupy nietraktowanej 14 dni. Wartość % T/C obliczona z tych median czasu przeżycia (150%) jest znacznie wyższa niż 125% zaaprobowane jako kryterium skuteczności. Zgodnie z literaturą, bazując na tej wartości, kompozycja według wynalazku może być uważana za preparat o silnym działaniu przeciwguzowym przeciw danej linii komórkowej.

W celu udowodnienia, że zwiększenie czasu przeżycia jest wynikiem toksycznego działania kompozycji z przykładu 112 na komórki guza nie zaś silne działanie tonizujace, przeprowadzono następny eksperyment. 10-10 myszy traktowano w ten sam sposób. Po 10 dniowym okresie traktowania, komórki usunięto z jamy brzusznej obu grup muszy i następnie policzono. Różnica pomiędzyliczb komórek 5,55 x 10^? i 5,95 x 10⁷, odpowiednio jest znacząca (p<0,001) i dowodzi skuteczności in vivo kompozycji według wynalazku

Dla udowodnienia dalszej skuteczności kompozycji według wynalazku i wykluczenia możliwości, że wyniki są tylko konsekwencjądziałania lokalnego (komórki byłyby w jamie brzusznej i były traktowane i.p.) przeprowadzono inną próbę z brakiem wrodzonej odporności myszy (brak grasicy) (goła), której wstrzyknięto s.c. ludzki stały guz. Do tej próby użyto komórki HeLa i 6-8 tygodniowe samice myszy BALB/c (nu/nu) i wstrzyknięto 5 x 10' komórek s.c. w niższej partu myszy. Traktowanie rozpoczęto kompozycją z przykładu 112, gdy wielkość guzów osiągnęła przeciętnie objętość 50 mm3. Harmonogram traktowania, czas traktowania i stosowane roztwory (przykład 112) dla tego traktowania były takie same jak w poprzednich próbach farmakologicznych. Wielkość guzów [długość (L), szerokość (W), wysokość (H)] mierzono dwa razy tygodniowo za pomocą sprawdzianu szczękowego z podziałką cyfrową (Mitutoyo, Inc., Tokio, Japonia). Obliczono objętości guzów (z równania LWH/2) a także obliczono względne objętości guza N/V₀[Eur. J. Cancer. Clin. Oncol, 21, 1253-1260 (1988)], gdzie V₍oznacza aktualną objętość guza a V_o oznacza objętość guza na początku leczenia. Wyniki zsumowano na figurze 9. Na osi pionowej zaznaczono przeciętne wartości Vt/V0 podczas, gdy na osi poziomej dnie po rozpoczęciu traktowania. Krzywa oznaczona pustymi kółkami pokazuje względne powiększenie objętości guza po rozpoczęciu traktowania, w przypadku myszy kontrolnych, a krzywa oznaczona wypełnionymi kółkami pokazuje to samo z przypadku zwierząt traktowanych. Z figury 9 widać, że traktowanie znacznie spowalnia wzrost guza. Na przykład w przypadku myszy kontrolnych objętość guza powiększyła się w ciągu 16,5 dnia dziewięciokrotnie, podczas, gdy w przypadku myszy traktowanych na taki sam dziewięciokrotny wzrost potrzeba było 33 dni. Z wartości Vt,/V₀ obicczono również TC % grup traktowanej i lot^ittroh^^ji Waitoćci T/C % we wszyttkich przypadkach wynosiły poniżej 42% co jest akceptowalnym kryterium skuteczności [Europ. J Cancer. 17, 129-142 (1981)]. Eksperyment ten raz jeszcze wykazał, że kompozycje według wynalazku mają znaczące działanie przeciwguzowe. Wyniki te są szczególnie obiecujące biorąc pod uwagę, że z uwagi na problemy technicznejest się daleko od optymalnej procedury traktowania i maksymalnej tolerowanej dawki i ze to samo traktowanie w warunkach szpitalnych mogłyby przebiegać bardziej efektywnie (dłuższy czas traktowania, stałe działanie np. przez mfuzję ltd.).

177 981

Zmiana ciężaru ciała w trakcie traktowania jest dobrym i ogólnie stosowanym wskaźnikiem do charakteryzowania toksyczności traktowania; zatem w trakcie powyższych prób mierzono wagę zwierząt. Zgodnie z literatura, gdy przeciętny ciężar ciała zmniejszy się o 10-15%, preparat uważanyjest za toksyczny [Ew. J. Cancer. Clin. Oncol., 21,1253-1260 (1988)]. W przeprowadzonych próbach zmiana przeciętnego ciężaru ciała wynosiła -5,9 ± 4,1 % w przypadku grupy kontrolnej i -6,6 ± 3,9% w przypadku grupy traktowanej. Zatem nie ma znaczącej różnicy pomiędzy dwoma grupami a to oznacza, że kompozycja według wynalazku nie ma toksycznego działania ubocznego.

Dla dowiedzenia przydatności prewencyjnej kompozycji według wynalazku 2-2 grupy myszy BALB/c (10 myszy na grupę) traktowano w taki sposób, ze zmieszano pożywienie traktowanych zwierząt w stosunku 1:1 z kompozycjami z przykładów 113-121 i zwierzęta karmiono ad libitum. Pięć dni po rozpoczęciu traktowania 1x 10⁴ komórek Sp2/0-Ag 14 zaszczepiono i .pi obu grupom zwierząt. Traktowanie kontynuowano przez 100 dni. Myszy żywione mieszaniną 1: 1 kompozycji z przykładów 113-121 i normałnąkarmąnie wykazały oznak wzrostu guza wszczepionego i.p., po zabiciu 100 dni po wstrzyknięciu komórek. Jednocześnie czasy przeżyciazwierząt kontrolnych w różnych grupach eksperymentów wynosiły od 21 do 26 dni po iniekcji komórek Sp2/'0-Ag114.

W zależności od dawki i drogi podawania kompozycje według wynalazku można wykorzystywać do zapobiegania chorobom rakowym, do inhibitowania rozwoju guza w przypadku AIDS i przeszczepów organów, w celu przeszkodzenia tworzeniu się przerzutów i jako substancję pomocniczą, w kombinowanej lub bezpośredniej terapii guzów u pacjentów.

Głównymi korzyściami z kompozycji według wynalazku są:

a) Stosując odpowiednie dawkowanie kompozycja może być stosowana do zapobiegania chorobom rakowym, do inhibitowania rozwoju guza w przypadku AIDS i przeszczepów organów, w celu przeszkodzenia tworzeniu się przerzutów i do stosowania bezpośredniego, jako substancji pomocniczej lub w kombinowanym traktowaniu lub leczeniu chorób rakowych.

b) Są one nietoksyczne. Próby toksyczności, bazujące na pomiarze utraty wagi ciała zwierząt dowiodły, że kompozycje sąnietoksyczne. Według danych literaturowych, toksyczność indywidualnych składników kompozycji jest bardzo niska i nawet ta niska toksyczność obniża się po łącznym zastosowaniu substancji. Poza tym naczelne tolerująte substancje lepiej niż małe zwierzęta stosowane do oznaczenia wartości toksyczności. Biorąc pod uwagę wszystkie te fakty, można stwierdzić, że kompozycje powinny być uważane za nietoksyczne.

c) Nie mają, lub mają nieznaczne działanie szkodliwe. Zebrano wiele obserwacji odnośnie ubocznego działania składników, ponieważ prawie wszystkie z nich (za wyjątkiem 2-dezoksy-D-rybozy) stosowano w niektórych rodzajach leczenia (w terapii przeciwrakowej tylko kwas askorbinowy) lub jako dodatek do żywności. Zgodnie z zebranymi w tych zastosowaniach doświadczeniami, jest całkowicie jasne, że kompozycje praktyczne nie mają działania ubocznego

d) Są one selektywne. Selektywność wykazano w próbach pokazujących, że kompozycje toksyczne dla różnych komórek raka nie są toksyczne dla normalnych komórek Vero oraz dla zwierząt kontrolnych lub ich normalnych komórek, odpowiednio. Ta selektywność wzmożona jest faktem, że jest znacznie więcej normalnych komórek i te ostatnie komórki akumulują składniki kompozycji mimo, że w przypadku normalnych komórek ich pobór jest regulowany.

e) Mogą one być szeroko stosowane, ich działanie jest ogólne. Działania kompozycji badano w przypadku linii komórkowej szpiczaka mysiego (Sp2/0-Ag14), ludzkiej choroby di Gugliemo (K-562), ludzkiego naskórkowego raka szyjki macicy (HeLa) i ludzkiego naskórkowego raka krtani (HEp-2). Komórki te reprezentują szerokie spektrum, ponieważ wiążą się zarówno z chorobami rakowymi ludzi i zwierząt a nawet z ludzkimi rakami reprezentowanymi przez białaczkę i dwa bardzo różne stałe guzy. Rezultaty otrzymane z prób przeprowadzonych na tych liniach komórkowych podtrzymują powyższe stwierdzenie, że kompozycje mają działanie ogólne i mogą być szeroko stosowane.

f) Mogą być sporządzone bez jakiejkolwiek trudności. Składniki kompozycji są substancjami o bardzo niskich ciężarach cząsteczkowych i sąłatwo dostępne tak, że łatwo jest zrobić kompozycję

g) Są one rozpuszczalne w wodzie a zatem łatwe do dawkowania

177 981

FIG. 3

Komórki nietraktowane

Komórki Sp2/0-Agl4 —⁰— Mieszaniny kontrolne —v— Mieszaniny aktywne

Liczba żywotnych komórek

FIG. 4

Ilość mieszaniny (%)

177 981

FIG. 5

FIG. 6

Ilość mieszaniny (%)

177 981

FIG. 7

FIG. 8 | | Traktowane

Komórki Sp2/0-Agl4 in vivo Kontrolne

Dni po zaszczepieniu guza

177 981

FIG.

Traktowane

Nietraktowane

Komórki HeLa in vivo

Dni po traktowaniu

FIG. 1

177 981

Tryptofan Dezoksyryboza Adenina Jabłczan Askorbinian

FIG. 2 —⁰— Mieszaniny kontrolne

Komórki Sp2/0-Agl4 —o— Mieszaniny aktywne (5 składników) _? Mieszaniny aktywne (4 składników)

Ilość mieszanin (%)

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1,2-16% wagowo pirydoksyny, 0,03-42% wagowo fosforanu 5'-ryboflawmy, 0,5-60% wagowo 2-dezoksy-D-rybozy, 0,7-68% wagowo kwasu jabłkowego, 0,6-40% wagowo D-mannozy i/lub ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli.

1. Kompozycja farmaceutyczna do zapobiegania i leczenia chorób rakowych, zawierająca substancje aktywne i środki pomocnicze stosowane w farmacji, znamienna tym, że ma co najmniej trzy aktywne związki występujące w układzie krążenia, którymi są co najmniej jeden aminokwas w ilości 0,002-70%, wybrany z grupy obejmującej L-metioninę, L-tryptofan, L-tyrozynę, L-fenyloalaninę, L-argininę, L-histydynę, N-benzoiloglicynę i/lub ich sole, co najmniej jedna witamina w ilości 0,0004-80% wagowo, wybrana z grupy obejmującej d-biotynę, pirydoksynę, ryboflawinę, fosforan 5'-ryboflawiny, kwas lipoilowy, kwas orotowy i/lub ich sole i co najmniej jeden składnik z grupy obejmującej adeninę, 2-dezoksy-D-rybozę, D-mannozę, kwas jabłkowy-, kwas szczawiooctowy, trifosforan adenozyny, w ilości 0,003-80% wagowo i/lub ich farmaceutycznie dopuszczalne sole.

2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera 0,9-25% wagowo L-metioniny, 0,8-19% wagowo L-tryptofanu, 1,1-48% wagowo L-argininy, 0,9-46% wagowo d-biotyny,

3. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera 0,005-34% wagowo L-metioniny, 0,002-25% wagowo L-tryptofanu, 0,02-23% wagowo L-tyrozyny, 0,04-30% wagowo L-fenyloalaniny, 0,04-50% wagowo L-argininy, 0,03-34°% wagowo L-histydyny, 0,05-22% wagowo N-benzoiloglicyny, 0,01-60% wagowo d-biotyny, 0,01-20% wagowo pirydoksyny, 0,0004-45% wagowo ryboflawiny, 0,005-45%) wagowo fosforanu 5'-rybofla\viriy, 0,004-15% wagowo) kwasu lipoilowego, 0,01-17% wagowo kwasu orotowego, 0,001-10% wagowo adeniny, 0,01-63% wagowo 2-dezoksy-D-rybozy, 0,08-42% wagowo D-mannozy, 0,01 -80% wagowo kwasu jabłkowego, 0,02-60% wagowo kwasu szczawiooctowego, 0,001-10% wagowo trifosforanu adenozyny i/lub ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli.

4. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera 30-44% wagowo L-argininy, 27-35% wagowo fosforanu 5'-ryboflawiny, 38-62% wagowo kwasu jabłkowego i/lub ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli.