CN101083990A - 破坏brca2－rad51相互作用的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

所考虑的化合物破坏了BRCA2和RAD51之间的相互作用，很可能是通过结合RAD51。基于BRCA2－RAD51复合物形成在DNA修复中的关键作用和RAD51在从G1进入S－期中的控制作用，呈现了多种组合物和方法。在这些有利的用途中，所考虑的化合物可以用作化疗中细胞暴露于化疗药物之前的非肿瘤细胞的保护剂和/或作为肿瘤细胞的DNA－损伤敏化剂。

Description

破坏BRCA2-RAD51相互作用的组合物和方法
本申请享有我们2004年10月19日申请的未决的申请系列号60/620496的U.S.临时专利的优先权，在此将其引入作为参考。
本发明在来自防御部门的拨款号44510-78004和拨款号DAMD17-01-0409下的政府支持形成。政府在本发明中具有一定的权利。
发明领域
本发明的领域是涉及哺乳动物中DNA修复的组合物和方法，尤其是它们涉及RAD51和BRCA2。
发明背景
认为DNA双链破坏是由放射和/或暴露于交联药物(例如，顺铂、丝裂霉素、阿霉素、博莱霉素等)引起的主要致命损伤。通常，双链破坏导致细胞周期进程的停止和细胞DNA修复机制的激活，且DNA修复的失败通常导致基因组异常，并最终导致细胞死亡。
在这些机制中，同源重组显著地有助于DNA损伤尤其是双链破坏的修复。同源重组涉及几个基因并包括BRCA1、BRCA2、RAD51、XRCC2和XRCC3。在这些基因突变的情况中，细胞经常呈现出高水平的基因组不稳定性和对放射和/或交联剂的超敏性。另一方面，在许多癌细胞中，尤其是基因组不稳定的那些，观察到了升高的同源重组比率。在这些癌细胞中，观察到升高的野生型RAD51表达水平，这看来似乎表明了RAD51(其还涉及维持基因组稳定性)还可以引起癌细胞对DNA-损伤放疗或化疗的抵抗力。
RAD51是真核重组酶并与E.coli RecA蛋白同源。RAD51具有ATP-依赖性DNA结合活性，在单链DNA上聚合(multimerize)成核蛋白细丝，并报道了能在体外催化同源DNA配对和链交换反应。用放射和/或DNA损伤剂处理细胞后，可以在DNA损伤的部位观察到大量的RAD51-焦点，这可以进一步包括与同源重组相关的其它蛋白质(例如，BRCA1、Rad54、BLM和RPA)，尤其是BRCA2。
基于家族性乳癌的各种研究将BRCA2鉴定为乳房肿瘤抑制因子，且BRCA2缺陷的特征通常在于累积的染色体异常，包括染色体破坏、异常的有丝分裂交换和非整倍体。最近已经证明了染色体破坏的同源定向修复也需要BRCA2。与其在DNA修复中的牵连相一致，缺乏BRCA2的小鼠胚胎呈现出放射超敏性，这也是缺乏RAD51的小鼠胚胎的特征。
首先通过鉴定它与RAD51的相互作用来揭示DNA修复中BRCA2的可能作用。已经显示出RAD51和BRCA2之间的相互作用涉及六个高度保守的BRC重复，且BRCA2的BRC重复和RAD51之间的相互作用对于对由甲基甲烷磺酸盐引起的DNA损伤的细胞应答是关键的。在这些支持中，在BRCA2-缺陷细胞中和使用BRC肽破坏BRCA2和RAD51之间相互作用的细胞中减少了放射诱导的RAD51焦点形成的发现中反映出这样的临界性。此外，在过量BRC肽存在下在体外特异性地消除RAD51-DNA结合能力，以及破坏了RAD51核蛋白细丝形成。
因此，尽管大量数据似乎突出了BRCA2/RAD51相互作用在DNA修复中的重要性，但选择性干扰这样相互作用的作为BRCA2-相关癌症治疗形态的有效策略是难以捉摸的。因此，仍然需要干扰DNA修复中BRCA2/RAD51相互作用的组合物和方法，尤其是在肿瘤疾病的治疗和化学预防的范围中。
发明概述
本发明涉及组合物和方法，其中化合物干扰，更通常地破坏或防止BRCA2/RAD51相互作用，和/或RAD51聚合。通常，这样的干扰将导致肿瘤细胞对DNA损伤提高的敏感性，和非肿瘤细胞不能从G1期继续到S-期。
本发明主题的一方面中，药物组合物包括药物学上可接受的载体和根据通式1的化合物：
Figure A20058004361900101
                         通式1
其中R是选自烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、烷芳基和
Figure A20058004361900102
的基团，
其中Y不存在或者是具有1至4个碳原子的亚烷基(和其中通式1的R与亚烷基共价结合，或在Y不存在情况中，通式1的R与包括Z的环的任何一个原子共价结合)；Q是N或C-R2；Z选自-C(R12)＝C(R13)-、-CH＝N-、-N＝CH-、O、S或NR14，其中R14是H、烷基、芳基、芳烷基或酰基；X选自CH2、O、S或NR14，其中R14独立地如上所定义；R’和R1至R13独立地选自H、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、卤素、硝基、羟基、烷氧基、烯氧基、氰基、羧基、烷氧基羰基、羧基烷基、氨基、酰基氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、N-烷基、N-环烷基、氨基、巯基、烷硫基和卤代烷基；前提条件是R12和R13任选地结合来形成碳环或杂环；其中n为0至4，包括0和4，其中*表示R或S构型。更具体地，R1至R11是H，X是NR14，且R是
在这样的化合物中，尤其优选Z是-C(R12)＝C(R13)-，且Y不存在。因此，特别优选的化合物包括根据通式2和通式3的那些：
Figure A20058004361900112
通式2                                         通式3
进一步考虑在这样的组合物中，(a)当细胞暴露于化合物时，化合物以有效提高肿瘤细胞对放射和/或DNA-损伤剂敏感性的浓度存在，或(b)当BRCA2-RAD51复合物暴露于化合物时，化合物以有效降低BRCA2与RAD51结合的浓度存在。在理想的情况中，所考虑的化合物可以进一步包括一种或多种DNA-损伤剂。或者，还考虑了当细胞接触化合物时，化合物以有效停滞细胞(更常见是非肿瘤细胞)于G1期的浓度存在组合物中。在这样的情况中，考虑将化合物以有效降低植入装置附近大多数细胞的细胞增殖的浓度结合可植入的装置(例如，血管内支架)。
因此，本发明主题的另一方面中，涉及处理肿瘤细胞的方法，其中当肿瘤细胞暴露于化合物时，将肿瘤细胞接触有效提高肿瘤细胞对放射和/或DNA-损伤剂敏感性浓度(例如，1μM至100μM)的所涉及化合物。在该方法进一步的步骤中，然后可以将肿瘤细胞暴露于放射(例如，γ放射或UV-C放射)和/或DNA损伤剂(例如，烷化剂或交联剂)。通常，优选的肿瘤细胞包括乳癌细胞和卵巢癌细胞。
本发明主题的再进一步的方面，停止非肿瘤细胞于G1期的方法包括其中将细胞接触所涉及化合物、其前药或代谢物的步骤，且其中这样的化合物以有效停滞非肿瘤细胞于G-期的浓度存在。更优选，这样的方法将进一步包括在接触步骤后将非肿瘤细胞暴露于DNA-损伤剂的步骤，其中在与没有使用接触步骤获得的DNA损伤相比较减少细胞DNA损伤的条件下进行接触步骤。如上，合适的DNA损伤条件是，特别是，放射(例如，γ-放射或UV-C)和/或暴露于DNA损伤剂(例如，顺铂、丝裂霉素、阿霉素、苯丙氨酸氮芥、环磷酰胺、苯丁酸氮芥和博莱霉素)。在理想的情况中，还可以进行接触细胞的步骤使得细胞接触结合了化合物的植入装置。
本发明的各种目的、特征和方面将从以下本发明优选实施方案的详细描述变得更清楚。
附图简述
图1A是示例反向酵母双杂交筛选系统的示意图。
图1B是使用图1A的反向酵母双杂交筛选系统的培养平板的照片。
图1C描绘了使用反向酵母双杂交筛选系统鉴定的选定化合物的示例结构。
图1D左图描绘了BRC4-Rad51复合物的计算机模拟，右图为IBR2-Rad51复合物的计算机模拟。
图1E描绘了IBR2与BRC4和RAD51寡聚基序的结构排列的计算机模拟。
图1F是显微照片，描绘了使用所涉及的化合物处理的细胞对对照中Rad51焦点的减少。
图1G描绘了所测试的化合物的示例结构及其在酵母筛选测定中的活性。
图2A和2C是测定IBR2结合伴侣的表面等离子共振(SPR)实验的图示。
图2B和2D是描绘了选定的表面等离子共振实验结果的图。
图2E是IBR2介导的Rad51多聚体解离的点印迹分析，如通过凝胶过滤所分析的。
图2F是描绘了Rad51-BRC1重复结合的抑制的图，以用于IC50测定的溶液竞争形式使用SPR。
图3A是系列图，描绘了IBR2对乳房上皮细胞系(MDA-MB-231、MCF-7、MDA-MB-468、SKBR3和MDA-MB-435)生长的作用。
图3B是描绘了各种剂量的IBR2对带有人乳房癌异种移植物(MDA-MB-468)裸鼠的体内抗肿瘤活性的图。
图3C是描绘了图3B实验中所用动物的体重的图。
图3D是描绘了IBR2对各种细胞系的IC50值的图。
图3E是描绘了使用各种浓度IBR2的各种癌细胞系增殖的图。
图4A是列出了通过FACS对20μM IBR2或DMSO孵育细胞的细胞周期分布结果的表。
图4B是描绘了用IBR2处理的BrdU阳性细胞百分比的图。
图4C-4E是描绘了BrdU吸收(C)、有丝分裂指数(排除前期)(D)和用IBR2处理的BrdU阳性细胞的活细胞数目(E)的图。
图4F和4G是描绘IBR2处理过细胞的蛋白质特征的蛋白质印迹。
图4H是表示图4G实验结果的图。
图5A是IBR2处理过的超表达外源Rad51来拯救S-期进入的MCF-7细胞的显微照片。
图5B是描绘以总GFP表达细胞的分数来表示的BrdU阳性细胞的图。
图5C是描绘Rad51表达水平的蛋白质印迹。
图5D是描绘选定细胞系的相对敏感性的图。
图5E描绘了选定的细胞系中剩余的Rad51量。
图5F描绘了在选定的处理条件下MCF-7细胞中具有Rad51焦点的细胞数。
图5G描绘了在选定的处理条件下MCF-7细胞中具有H2AX焦点的细胞数。
图5H至5J是描绘了所涉及的化合物和选定化疗剂的协同效果的图。
图5K是描绘了γ-放射后MCF-7细胞克隆发生存活的图。
详述
DNA损伤剂和放射对于晚期转移性癌症是其中最广泛使用的疗法，通常在根除至少部分肿瘤细胞中是有效的。不幸地，肿瘤细胞还使用各种机制来修复因此诱导的DNA损伤。在修复机制中，本发明人已经在对DNA损伤剂和放射的癌症抵抗力中暗示了BRCA2-介导的修复。
BRCA2通过其BRC重复结合RAD51，且这种相互作用似乎对于DNA修复是关键的。本发明人现在考虑可以制备小分子来破坏BRC重复和RAD51之间的相互作用，因此降低影响以至消除最基本的无误差DNA修复机制中的一种，因此使得癌细胞对放射或DNA-损伤化疗更敏感。
最近解决了BRC4-RAD51复合物的晶体结构，其中BRC重复模拟RAD51寡聚基序。因此，最近表明了BRCA2对RAD51-介导的同源重组起控制作用。还知道BRCA2含有三个寡核苷酸-结合(OB)折叠和螺旋-转折-螺旋(HTH)基序。基于这些观察和其他因素，本发明人考虑当DNA损伤发生时，BRCA2将识别ssDNA/dsDNA连接，然后结合的BRCA2的BRC重复将RAD51带至损伤部位，其然后在ssDNA上形成核蛋白细丝，导致RND51焦点的形成，因此能够进行随后的同源重组过程。因此，本发明人考虑理想的是产生干扰(即，降低)以至阻断BRCA2-RAD51复合物形成的分子，因此使BRCA2-完整(非突变的)乳癌细胞对放射和其他DNA损伤剂的作用敏感。
本发明人目前已经发现通过将BRCA2-RAD51复合物暴露于特定的分子和包括这些分子的组合物，可以破坏以至完全抑制BRCA2-RAD51复合和/或复合物形成。此外，还证明了这些分子干扰RAD51聚合的能力。
因此，通常考虑通过给药这样的分子可以改变与BRCA2-RAD51复合物形成和/或RAD51聚合相关的疾病和所有过程。在所考虑的过程和疾病中，特别考虑到根据本发明主题的化合物和组合物可以用来(a)使肿瘤细胞对化疗药物的作用敏感，(b)通过破坏细胞分裂来干扰肿瘤细胞的生长，(c)通过将细胞停止于G1期来保护非肿瘤细胞免受化疗药物的作用，和(d)降低其他刺激细胞生长的环境中细胞(通常是非肿瘤细胞)的增殖。
所考虑的化合物和组合物
通常考虑到所有分子适于防止、降低或另外破坏BRCA2-RAD51复合物的形成或存在。因此，在多种其他分子中，考虑了肽(例如，BRC重复及其类似物、抗体或其他高特异性/亲和性结合肽等)和小分子药物(例如，源自可购得的化合物文库)及其衍生物，包括前药和代谢物。然而，特别考虑的分子包括根据以下通式1的那些
Figure A20058004361900151
                           通式1
其中R是选自烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、烷芳基(其中每个可以由R1取代并可以进一步包括杂原子，如N、S、O、Se或O)，和
Figure A20058004361900152
的基团，
其中Y不存在或者是具有1至4个碳原子的亚烷基(和其中通式1的R与亚烷基共价结合，或在Y不存在的情况中，通式1的R与包括Z的环的任何一个原子共价结合)；Q是N或C-R2；Z选自-C(R12)＝C(R13)-、-CH＝N-、-N＝CH-、O、S或NR14，其中R14是H，或任选取代的烷基、芳基、芳烷基或酰基；X选自CH2、O、S或NR14，R14独立地如上所定义；R’和R1至R13独立地是任选取代的并选自H、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、卤素、硝基、羟基、烷氧基、烯氧基、氰基、羧基、烷氧基羰基、羧基烷基、氨基、酰基氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、N-烷基、N-环烷基、氨基、巯基、烷硫基和卤代烷基；前提条件是R12和R13任选地结合来形成碳环或杂环；其中n为0至4，包括0和4。当然，应当认识到考虑了所有异构形式(例如，非对映体、对映体、互变异构体等)及其混合物。例如，在所考虑的分子具有手性中心(例如，通式1中的C*)的情况中，在此特别地考虑R和S构型及其组合。还应当认识到通式1中的每一个芳香环系统(异喹啉、吲哚和苯环)可以进一步包括一个或多个杂原子，或可以进一步与另一个(任选芳族)环系统稠合。
更进一步优选的化合物将具有根据通式1的结构，其中R1至R11是H，其中X是NR14，且其中R是
Figure A20058004361900161
且最优选就是以上那些化合物，其中Z是-C(R12)＝C(R13)-，且Y不存在。因此，特别考虑的化合物包括各种取代的和未取代的苯基磺酰吲哚异喹啉，尤其是具有根据以下通式2和3结构的那些
通式2                                        通式3
如在此所用的，术语“卤素”指的是氟、溴、氯或碘，其通常与另一个原子(例如，碳)共价结合。如在此进一步所用的，术语“羟基”指的是-OH基团。如在此更进一步所用的，术语“羰基原子”指的是与三个原子共价连接的碳原子，其中三个原子之一通过双键结合碳原子(其可以是部分非定域的)。因此，特别考虑的羰基原子包括氨甲酰基团、甲脒基团和硫代氨甲酰基团中的碳原子。
如在此所用的术语“烷基”指的是环状、支链或直链烃，其中所有的碳-碳键是单键，且术语“低级烷基”指的是一至十个碳原子的环状、支链或直链烷基(例如，甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁级、异丁基(或2-甲丙基)、环丙甲基、异戊基、正戊基、己基等)。如在此所用的术语“亚烷基”指的是比相应烷烃少两个氢原子的烷基(即，CnH2n)。例如，合适的亚烷基包括亚甲基、亚乙基、亚丙基等。如在此所用的术语“环烷基”指的是含有3至15个碳的环状或多环状烷基。对于多环基团，这些可以是多个稠合的环，其中远端环之一可以是芳香族的(例如，茚满基、四氢萘等)。如在此所用的术语“烷芳基”指的是共价结合芳基部分的烷基。例如，根据在此提供的定义，将苄基认为是烷芳基。
相似地，如在此所用的术语“烯基”指的是其中至少一个碳-碳键是双键的烷基。因此，术语“低级烯基”包括所有具有一至十个碳原子的烯基。如在此所用的术语“环烯基”指的是含有3至15个碳和至少一个双键的环状或多环状基团。同样地，如在此所用的术语“炔基”指的是其中至少一个碳-碳键是三键的烷基或烯基。因此，术语“低级炔基”包括具有一至十个碳原子的炔基。
如在此更进一步所用的，术语“烷氧基”指的是-OR基团，其中R是低级烷基、取代的低级烷基、酰基、芳基、取代的芳基、芳烷基、取代的芳烷基、杂芳烷基、环烷基、取代的环烷基、环杂烷基或取代的环杂烷基。相似地，术语“芳氧基”指的是-OAr基团，其中Ar是芳基、取代的芳基、杂芳基或取代的杂芳基。
此外，术语“芳基”指的是具有至少一个芳香族环(例如，苯基或二苯基)或多个稠合环的芳香族碳环基团，其中至少一个环是芳香族的，(例如，1，2，3，4-四氢萘、萘、蒽或菲基)。如在此所用的术语“杂原子”指的是碳以外的原子(例如，S、O或N)，其可以任选地由例如氢、卤素、低级烷基、烷氧基、低级烷硫基、三氟甲基、氨基、胺基、羧基、羟基、芳基、芳氧基、杂环、杂芳基、取代的杂芳基、硝基、氰基、烷硫基、巯基、磺氨基等取代。
再进一步，如在此所用的术语“取代的”意思是共价结合基团或原子(或游离电子对或原子双键的电子对)的氢原子由共价结合的非氢取代基替代，取代基包括羟基、巯基、烷硫基、卤素、烷氧基、氨基、胺基、硝基、羧基、环烷基、杂环、环杂烷基、酰基、羧基、芳基、芳氧基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、烷基、烯基、炔基和氰基。
如在此所用的术语“前药”指的是所考虑化合物的改变，其中改变的化合物呈现出较低的药物活性(与改变的化合物相比较)，和其中改变的化合物在目标细胞(例如，肿瘤细胞)或目标器官(例如，卵巢)中转变回改变的形式。例如，在活性药物对于安全的全身给药毒性太大的情况中，或在所考虑的化合物在消化道或其他区隔或细胞中吸收差的情况中，或在达到目标之前身体降解所考虑的化合物的情况中，所考虑的化合物转化成前药可能是有用的。因此，应当认识到可以以多种方式来改变根据本发明主题的化合物，尤其优选的改变包括提高一种或多种药物代谢动力学和/或药物动力学参数的那些。例如，可以添加或替换一个或多个取代基来获得血清中较高的AUC。另一方面，尤其是在需要提高的稳定性的情况中，可以添加亲水性基团。用于将所考虑的化合物转化成相应的前药形式的合适示例方案可以在“Prodrugs(Drugs and the Pharmaceutical Sciences：a Series ofTextbooks and Monographs)”(前药(药物和药物科学：系列教科书和论文)中找到，Kenneth B.Sloan(ISBN：0824786297)，和“Hydrolysisin Drug and Prodrug Metabolism：Chemistry，Biochemistry，andEnzymology”(药物和前药代谢中的水解：化学、生物化学和酶学)，Bernard Testa，Joachim M.Mayer(ISBN：390639025X)，在此将两篇都引入作为参考。更进一步，尤其在化合物代谢(例如，羟基化、葡糖苷酸化等)时，所考虑的化合物具有较高活性的情况中，应当认识到在此还专门考虑了所考虑化合物的代谢物。
根据特定的目的，应当认识到可以将所考虑的化合物混合(在体内或药物制剂或给药方案中)至少一种其他的药物学上的活性成分，尤其是所考虑的其他成分包括DNA损伤剂、抑制细胞生长和/或细胞毒性药物、抗代谢物、核苷酸类似物等。例如，合适的试剂包括烷化剂和/或交联剂，如顺铂、丝裂霉素、阿霉素、苯丙氨酸氮芥、环磷酰胺、苯丁酸氮芥和/或博莱霉素。第二种药物学活性成分的浓度是通常标准单独给药推荐的那些，然而，认为较低(而在一些情况中较高)的浓度也适用于在此的用途。
因此，所考虑的药物组合物尤其将包括其中和合适的载体一起提供所考虑的化合物(和另外的药物活性成分)的那些，其中所考虑的化合物优选在细胞暴露于化合物时，以有效提高肿瘤细胞对放射(例如，UV-C放射和/或γ放射)或DNA损伤剂(例如，交联剂或烷化剂)敏感性的浓度存在。在进一步优选的组合物中，还考虑当BECA2、RAD51和/或BRCA2-RAD51复合物暴露于化合物时，化合物以有效降低或防止BRCA2与RAD51结合的浓度存在。当所考虑的组合物是用来至少暂时停滞细胞周期中的细胞时，优选当细胞接触化合物时，化合物以有效停止(通常是非肿瘤)细胞于G1期的浓度存在。因此，可以选择浓度使得它们以有效降低细胞(例如，结合了化合物的植入装置附近的细胞，特别包括血管内支架附近的亲密接触的细胞)的细胞增殖的浓度存在。
根据特定的用途和结构，因此考虑到根据本发明主题的化合物以每单个剂量单位1微克至1000毫克的含量存在于组合物中，更常见为10微克至500毫克，最常见为50微克至500毫克。因此，所考虑的化合物在体内或体外的优选浓度通常为0.1nM至500微M，更常见为50nM至400微M，最常见为100nM至200微M。
此外，应当认识到认为所有制剂适于在此的用途，尤其是包括口服制剂和非肠道制剂。例如，对于口服给药，所考虑的组合物可以是片剂、胶囊、悬浮液或液体的形式。优选以含有特定含量活性成分的剂量单位形式来制得药物组合物。这样剂量单位的实例是片剂或胶囊。还可以作为组合物通过注射来给药活性成分，其中例如，盐水、葡萄糖或水可以用作合适的载体。
给药的治疗活性化合物的含量和使用本发明的化合物和/或组合物治疗病症的剂量方案取决于各种因素，包括患者的年龄、体重、性别和医疗条件、疾病的严重程度、给药的途径和频率，以及所使用的特定化合物，因此可以广泛地改变。然而，以上提供了尤其合适的含量，因此可以允许约0.001(以至更低)至100mg/kg体重的每日剂量，优选0.01至约50mg/kg体重，和最优选约0.1至20mg/kg体重。通常，日剂量可以给药每天一至四剂。
对于治疗或预防的目的，所考虑的化合物通常与一种或多种适于所确定给药途径的佐剂混合。如果口服给药，可以将化合物与乳糖、蔗糖、淀粉、链烷酸的纤维素酯、纤维素烷基酯、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、氧化镁、磷酸和硫酸的钠盐和钙盐、明胶、阿拉伯胶、藻朊酸钠、聚乙烯吡咯烷酮和/或聚乙烯醇混合，然后成片剂或胶囊，用于常规给药。这样的胶囊或片剂可以含有受控释放的制剂，如可以以活性化合物在羟丙甲基纤维素中的分散体来提供。用于非肠道给药的制剂可以是含水或非含水等渗无菌注射液或悬浮液的形式。可以从具有一种或多种提及的用于口服给药制剂中的载体或稀释剂的无菌粉末或颗粒制得这些溶液和悬浮液。可以将化合物溶解于水、聚乙二醇、丙二醇、乙醇、玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、苯甲醇、氯化钠和/或各种缓冲剂中。其他佐剂和给药方式是制药领域公知的。
所考虑的用途
通常考虑的是可以使用根据本发明主题的化合物和组合物来影响任何与BRCA2-RAD51相互作用相关的病症和/或疾病。因此，特别考虑的病症和疾病包括其中需要给予细胞对放射和/或DNA损伤剂敏感性和/或其中细胞分裂应答刺激而调节失调或转化成肿瘤表型的那些。其他优选的情况包括其中暂时停滞细胞生长的那些。
例如，在所考虑的化合物和组合物在化疗中特别有用的情况下，其中这样的化合物和组合物给予肿瘤细胞对DNA损伤剂和/或放射更敏感。因此，可以降低这种治疗中化疗剂的剂量和/或提高杀伤率。另一方面，所考虑的化合物还将非肿瘤细胞停止于G1期，应当认识到这样的化合物可以作为暂时停滞细胞生长的化学预防剂来给药，并因此保护非肿瘤细胞免受其他由化疗剂诱导的损伤。此外，还可以将细胞周期停止用于植入装置中(例如，血管内支架)来降低再狭窄的发生和/或严重程度。在这样的方法中，考虑到可以将根据本发明主题的化合物涂覆在植入的装置上。当然，认为将这样的化合物结合在植入装置中的各种可替换方式也是合适的并包括共价连接支架或释放结合装置的部分，掺入生物可侵蚀或生物可降解材料中等。
因此，以及从分子透视看到的，所考虑的方法将使用干扰BRCA2-Rad51相互作用的化合物，结合顺铂时，作为治疗活性分子来抑制放射诱导的RAD51焦点，促进抑制细胞生长，提供细胞死亡的协同诱导，和/或将这样处理过的细胞(最常见是癌细胞)停止于G1期。因为所考虑的化合物可以抑制BRC重复与RAD51的结合，它们还可以用来防止或降低Rad51聚合，这最终将导致BRCA2和RAD51的降解。因此，合适的方法包括其中细胞中的BRCA2和RAD51降解将产生所需结果的所有方法。
示例化合物的合成
应当认识到各种所考虑化合物的合成将按照如下所列出的一般方案，其中通过化合物的三个部分的直接反应来制备化合物。例如，合适的反应将包括(a)任选取代的和受保护的(在适当的情况中)异喹啉，(b)任选取代的和受保护的(在适当的情况中)α-苄基磺酰氯或α-苯基-磺酰氯，和(c)任选取代和受保护的(在适当的情况中)吲哚，其中按照以下反应方案1中示例性列出的来化合每个部分。
                    实施例1
Figure A20058004361900211
                    反应方案1
2-(苄基磺酰基)-1-(1H-吲哚-3-基)-1，2-二氢异喹啉(IBR2)：将异喹啉(10.3g，80mmol)溶解于无水苯(140ml)中。将α-苯基甲基磺酰氯(7.64g，40mmol)分批加入。将反应混合物在室温搅拌30分钟。加入吲哚(4.68g，40mmol)并在室温将反应持续20hr。在反应过程中，形成淡颜色的沉淀物。然后收集固体并用甲苯和己烷洗涤(各自50ml)。使用快速色谱(硅胶，100％二氯甲烷)将所得到的粗产物进一步纯化，产生11.1g(97.5％)淡黄色固体。通过从乙醇(200ml)再结晶来进一步纯化产物(6.0g)，获得白色固体的终产物。
MS(m/e)：423.05(m+Na+).1HNMR(500MHz，δ/ppm)：4.00(d，1H，J＝13.88Hz)，4.16(d，1H，J＝13.92Hz)，6.06(d，1H，J＝7.53Hz)，6.30(d，1H，J＝7.45Hz)，6.37(s，1H)，6.70(d，1H，J＝2.53Hz)，6.86(d，1H，J＝8.1Hz)，6.91(d，2H，J＝7.78Hz)，7.08(t，2H，J＝7.76Hz)，7.13-7.32(m，7H)，7.96(d，1H，J＝9.02Hz)，8.00(s，br，1H).
                        实施例2
按照实施例1的程序，用0.5mmol任选取代的异喹啉和0.25mmolα-苯基甲基磺酰氯处理0.25mmol任选取代的吲哚来产生取代的2-(苄基磺酰基)-1-(1H-吲哚-3-基)-1，2-二氢异喹啉，就在下表中显示了(产量源自单次实验且不是最佳的)。
R R1  R2  R3  R4  R5  R6  R7  R8  R9  R10  R11  R14  mg ％产率
苄基 H  H  H  OMe  H  H  H  H  H  H  H  H  34.81  33
苄基 H  Br  H  H  H  H  H  H  H  H  H  H  37.68  32
苄基 H  H  H  H  Br  H  H  H  H  H  H  H  91.85  78
苄基 H  H  H  COOMe  H  H  H  H  H  H  H  H  30.38  27
苄基 H  H  H  NH2  H  H  H  H  H  H  H  H  55.96  55
苄基 H  H  H  Br  H  H  H  H  H  H  H  H  32.97  28
苄基 H  H  H  H  H  H  H  H  H  H  Me  73.08  72
苄基 H  H  H  NHAc  H  H  H  H  H  H  H  30.31  27
苄基 H  H  H  NHCOPh  H  H  H  H  H  H  H  63.88  50
苄基 COOEt  H  H  H  H  H  H  H  H  H  H  H  35.96  31
苄基 H  H  H  H  H  H  H  H  H  Br  H  H  37.68  32
苄基 H  H  H  H  Br  H  H  H  H  Br  H  H  77  56
苄基 H  H  H  Br  H  H  H  H  H  Br  H  H  38.5  28
苄基 H  H  H  OMe  H  H  H  H  H  Br  H  H  35.07  28
苄基 H  H  H  COOMe  H  H  H  H  H  Br  H  H  33.06  25
                        实施例3
2(苄基磺酰基)-1-(7-氮杂-1H-吲哚-3-基)-1，2-二氢异喹啉：按照实施例1的程序，用64.58mg(0.5mmol)异喹啉和47.67mg(0.25mmol)α-苯基甲基磺酰氯处理29.54mg(0.25mmol)7-氮杂吲哚来产生58.95mg(60％产率)的2-(苄基磺酰基)-1-(7-氮杂-1H-吲哚-3-基)-1，2-二氢异喹啉。
                        实施例4
2-(苄基磺酰基)-1-(7-氮杂-1H-吲哚-3-基)-4-溴-1，2-二氢异喹啉：按照实施例的程序，用104.03mg(0.5mmol)的4-溴异喹啉和47.67mg(0.25mmol)α-苯基甲基磺酰氯处理29.54mg(0.25mmol)7-氮杂吲哚来产生71.98mg(61％产率)的2-(苄基磺酰基)-1-(7-氮杂-1H-吲哚-3-基)-4-溴-1，2-二氢异喹啉。
实验
干扰BRCA2-RAD51复合物的化合物的鉴定
为了鉴定能够抑制BRC-Rad51相互作用的化合物，通过诱导型反向酵母双杂交方法(Proc Natl Acad Sci USA 94，13396-13401)筛选了24,000种合成化合物的文库(Nanoscale CombinatorialSynthesis，Inc.Palo Alto，CA)，图1A中用图表描绘了这。两种融合蛋白，TetR-BRC融合蛋白(TetR/NCB，组成型表达)，和Rad51-激活结构域融合蛋白(在GAL1启动子下表达的AD/Rad51)，一起工作来作为带有TetOp-驱动的URA3基因的酵母菌株中的转录激活因子(Proc Natl Acad Sci USA 94，12473-12478)。这两种融合蛋白之间的相互作用诱导了URA3基因的表达；然后，来自培养基中5-FOA的毒性代谢物引起了细胞死亡(Methods Enzymol 154，164-175)。如果所测试的小分子抑制了TetR/BRC/AD/Rad51相互作用，消除URA3表达并使细胞生长。图1B中显示了来自反向酵母双杂交筛选的阳性发现(positive hit)的实例。在筛选文库时，发现十六种化合物在低于10μM的浓度促进酵母生长。然后测试这些化合物对MCF-7乳癌细胞中IR-诱导的Rad51焦点形成的作用。两种化合物(IBR1和IBR2，图1C中描绘了结构)显著地降低了Rad51焦点形成(图1F)并选择用于进一步的调查研究。特别地，在该论文中进行的大部分实验中研究了IBR2，其具有比IBR1略强的活性。
显著地，IBR1和IBR2的分子结构相似。它们都包括三个芳香环、异喹啉、吲哚和苯环，这形成了性质上非常疏水的化合物。这两种化合物之间仅有的差异在于连接苯环和核心结构的亚甲基。结构相似性表明了这些化合物在它们的功能中共享相似的机理。令人感兴趣的，用其他基团替代苯环不能破坏RAD51/BRC相互作用，如通过一些IBR化合物类似物的反向酵母双杂交筛选所揭示的，这表明了苯环在结合其目标物中起着作用。在最初的筛选中，还发现在苯环上具有较大取代基的其他IBR类似物不能破坏BRC/Rad51相互作用。图1G描绘了选定的测试化合物的示例结构。这些和其他结果表明苯环在目标结合中起着作用。在吲哚环的N-位置具有取代基的IBR类似物在克隆发生测定中失去了活性(数据未显示)，表明NH基团可能的结合作用，可能是通过氢键。
                结合机理的调查研究
BRC重复具有高度保守的发夹结构，(例如，BRC4中的1524-FHTASGK-1530)，其涉及与RAD51的结合。BRCA2序列1524-FHTA-1527通过抗平行β-链配对与RAD51的B3相互作用；在Rad51细丝形成中也观察到了相似的结合模式。重要地，BRC4-RAD51复合物中BRC4的F1524或人RAD51的F86(等于酵母Rad51中的F144或P.furiosus Rad51中的F97)可以深入地到达B3和A4之间的疏水口袋，由RAD51的M210、M158、A207、A190、A192、Q206、L203和I160形成。IBR2结构与BRC4发夹结构和Rad51寡聚基序的仔细比对表明苯环可以模拟BRC4的F1524，同时保留的环系统替代了邻近的β链。IBR2和RAD51的分子入坞还表明了IBR2通过将其苯基延伸至用于BRCA2结合或寡聚的相同结合口袋来结合RAD51(参见图1D和1E)。基于IBR化合物的苯环似乎对它们的有效性是必要的观察，发明人进一步假设IBR1/2作用机理的一种可能性是通过模拟BRCA2的F1524并阻断F1524疏水性口袋的进入，因此引起BRCA2/RAD51入坞的失败。
                    结合目标的调查研究
发明人然后研究了所考虑的化合物是否结合Rad51，而不是结合BRCA2。为此，使用表面等离子共振(SPR)来直接测定是否Rad51或BRC重复结合相同的化合物。替代直接检测小分子的结合，这将产生非常弱的信号，使用可替换的方法来检测蛋白质结合的抑制。简而言之，将蛋白之一连接传感器芯片，并使IBR化合物通过表面。然后，测定第二种蛋白的结合。如果IBR化合物结合固定的蛋白质，第二种蛋白的结合将降低，图2A和2C中用图表描绘了这。如图2B和2D中所示的，在IBR化合物预处理时，固定的Rad51失去了结合BRC重复的能力(图2B)，尽管化合物预处理没有影响固定的BRC重复与Rad51的结合(图2D)。这些结果表明IBR化合物结合Rad51，而不是结合BRC重复。
如果IBR化合物真正地占据了用于BRCA2中Phe524进入的疏水性口袋，Rad51的寡聚也应当受到影响，因为它们共享相同的结合片段。之前的研究表明显示BRC重复可以引起Rad51多聚体的解离。因此，如果IBR2模拟BRC发夹结构，Rad51聚合也将受到IBR2的抑制。我们比较了用和不用IBR2之间的Rad51的凝胶过滤特征。Rad51呈现出宽的洗脱特征，表示多聚和单体物质的存在，和之前所述的一样。然而，在IBR2存在下，Rad51洗脱特征呈现出与单体分子量相一致的主峰，如图2E中所示的。这些结果表明IBR2，和BRC重复一样，解离了Rad51多聚体。以溶液竞争形式通过SPR技术来进一步分析Rad51和BRC重复结合的抑制，如之前所述的(参见，例如，Science 303，844-848)。如从图2F可以看到的，IBR2化合物替代了来自与Rad51的复合物的BRC重复，具有约115nM的中数抑制浓度(IC50)值。
基于上述观察，发明人考虑IBR化合物的苯环是否真正地模拟BRC4重复的Phe1524并到达结合口袋，苯基部分的合适大小对活性是关键的。这样的假设受到各种实验的支持，其中发现当苯环不存在(NS16856)或异喹啉和苯环之间的连接物太长(NS7786、NS7787、NS7788、NS34240和NS40298)时，这些化合物在反向酵母双杂交测定中的活性是可忽略的(参见图1G)。发明人进一步检测在苯环的对位具有大取代基(叔-丁基)的IBR2类似物(NS35552)，其已经在反向酵母双杂交测定中显示出阴性结果。在NS35552存在下，Rad51仍然能够形成多聚体，如图2E中所示的，进一步表明了所考虑化合物上的苯环结构的大小至少在一定程度上对于它们的效果是关键的。
因此，发明人考虑所考虑的化合物的机理至少一定程度上基于与Rad51核心结构域上相同结合口袋的疏水相互作用，来防止BRC重复的结合以及破坏Rad51多聚体形成。
     所考虑的化合物对各种细胞和动物模型的生物效果
在各种其他生物效果中(数据未显示)，所考虑的化合物，特别是IBR2，阻止了培养物中乳房肿瘤细胞的生长并显著降低了裸鼠中的肿瘤发生。此外，用所考虑的化合物处理过的癌细胞呈现出停止于G1期和缺少有丝分裂的进入。这还与通过蛋白体途径加速的Rad51降解相关。所考虑的化合物进一步增大了所选定化疗剂和电离放射处理肿瘤细胞时的细胞毒活性，化疗剂包括VP-16、紫杉醇、喜树碱。基于以下的数据和其他考虑，因此发明人考虑根据本发明主题的化合物适于瞄准BRCA2和Rad51之间的相互作用，并用其来治疗与BRCA2-Rad51复合物形成和/或Rad51作用的异常相关的疾病。
            使用所考虑的化合物抑制癌细胞的生长
发明人检测了IBR2对一组乳癌细胞系的生长和存活力的作用。用各种浓度(0、5、10和20μM)的IBR2将五种指数生长的乳癌细胞系(MDA-MB-231、MCF-7、MDA-MB-468、SKBR3和MDA-MB-435)孵育不同的时间段(1、2、3、4和5天)。然后通过锥虫蓝排除测定来计数活细胞数。结果显示IBR2以剂量和时间依赖性方式显著抑制了所有五种乳癌细胞系的生长，如图3A中所示的。我们还使用3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物(MTT)测定检测了IBR2对培养的乳癌细胞(MDA-MB-468、MDA-MB-435、MCF-7、T47D)的生长和存活力的作用。结果显示了所测试的细胞系中IBR2的IC50值为约10μM(参见图3D)。此外，通过IBR2处理还显著抑制了非小细胞肺癌细胞系(CALU-1、A427、Sklu-1和CALU-6)、骨肉瘤细胞系(SaoS2和U2OS)和成胶质细胞瘤细胞系(T98G)的增殖(参见图3E)。
为了测试IBR2对裸鼠中所建立的肿瘤异种移植物生长的抑制效果，我们选择了人乳癌细胞系MDA-MB-468用于该研究。每隔一天用三个剂量的IBR2(10、50和150mg/kg i.p.)处理肿瘤大小大约为85mm3的小鼠，达五周。与对照组(只有载体)相比较，IBR2处理的组呈现出剂量依赖性方式的肿瘤生长的显著抑制，达65％(参见图3B)，而裸鼠的平均体重几乎保持恒定(参见图3C)。这些结果证明了IBR2可以用来抑制乳房肿瘤生长而对动物没有明显毒性。
        IBR2对MCF-7细胞的细胞周期的作用
为了研究IBR2怎样抑制癌细胞生长的机理，发明人通过流式细胞计数(FACS)分析了IBR2处理的MCF-7细胞的细胞周期进程。如图4A中所示的，以时间依赖性方式，提高了G1部分，耗尽了S和G2/M部分，并显著提高了次-G1部分，与凋亡性细胞无关。
为了测试IBR2处理过的细胞是否停止于G1并因此不能进入S期，通过nocodazole处理使MCF-7细胞同步于M期，然后重新涂布使其进入G1期。在不同的时间点，用BrdU标记脉冲细胞来监控S期进入。如图4B中所示的，将IBR2处理过的细胞完全停止于G1且不能进入S期。
为了进一步检测IBR2处理时S期细胞的命运，通过羟基脲处理使MCF-7细胞同步于G1/S过渡，然后通过洗掉试剂释放来允许S期进入。用20μM IBR2和BrdU处理这些细胞，且在18-小时的时间过程中，为了DNA合成测量BrdU吸收，以及有丝分裂指数和活细胞数量。如图4C中所示的，模拟物和IBR2处理细胞中的DNA合成以相似的速率降低，表明IBR2处理没有干扰S期进程。模拟物处理的细胞在12小时时达到最大M期，而没有或少许IBR2处理过的细胞进入M期(图4D)。此外，模拟物处理细胞的数量在M期完成时加倍，而IBR2处理细胞的数量降低至约50％。这表明IBR2处理的S期细胞不能进入M期，可能是由于S/G2期的细胞死亡(图4E)。
为了检测IBR2对Rad51蛋白表达的影响，通过直接的蛋白质印迹检测了IBR2处理过的MCF-7细胞，用一组抗BRCA2、Rad51、Rad50、p84和Rb的抗体做探针。如图4F中所示的，BRCA2和Rad51以时间依赖性方式显著降低，而p84和Rad50保持恒定。与我们的FACS分析相一致(图4A)，Rb的亚磷酸化(hypo-phosphorylated)形式，G1期的一种标记，是在后期的时间点观察到的主要形式，进一步证实IBR2将细胞停止于G1期(图4A)。已经报道了BRCA2水平是细胞周期依赖性的，其在G1期表达低和在G1/S边界达到峰值。因此，IBR2处理细胞中BRCA2降低的水平可能是由于G1期停止。不同于BRCA2蛋白，Rad51表达在MCF-7细胞中的整个细胞周期恒定(数据未显示)。因此，Rad51蛋白的丢失可以是IBR2处理的直接效果，替代G1停止的结果。为了测试通过失去稳定IBR2是否降低了Rad51水平，发明人通过加入放线菌酮(CHX)来抑制蛋白质的重新合成进行了稳定性测定。然后观察到与对照细胞中的5.5小时相比较，Rad51而不是Rad50的半衰期，缩短至1.5小时，如图4G和4H中所示的。加入蛋白体抑制剂MG132，将Rad51的半衰期延长至与IBR2处理和对照细胞中Rad50相似的程度(图4G和4H)，表明IBR2瞄准Rad50用于蛋白体介导的降解。因此，发明人考虑将IBR2处理的MCF-7细胞停止于G1，阻断M期进入，并死于S/G2期。
所考虑的化合物对Rad51和体内IR-诱导的Rad51焦点的作用
基于在此呈现的观察，发明人发现IBR2在体外结合Rad51并破坏BRCA2-Rad51复合物的形成。在细胞中，IBR2处理导致Rad51的降解、G1停止和S期的细胞死亡。如果体内效果来自IBR2瞄准Rad51，期望IBR2处理细胞中内源Rad51蛋白的超表达拯救这样的效果。为了测试这种可能性，发明人在MCF-7细胞中表达Rad51和GFP以及GFP单独。用IBR2处理后，细胞超表达Rad51，如可以从图5C看到，并显著恢复S期进入基于BrdU吸收分析如从图5A和B所示的，其随后表明Rad51通过IBR2特异性地瞄准。
接着，发明人检测了对等基因MEF的IBR2处理的敏感性，与BRCA1-/-：p53-/-和p53-/-MEF相比较时，具有BRCA2-/-：p53-/-，BRCA1-/-：p53-/-。BRCA2-/-：p53-/-MEF表型对IBR2最敏感的，可以从图5D中看到。然后比较了这些MEF中Rad51蛋白质的稳定性，发现BRCA2-/-：p53-/-MEF中的Rad51半衰期短于其他的(参见图5E)。这些结果表明内源BRCA2可以通过其结合稳定Rad51，而没有BRCA2，Rad51具有缩短的半衰期且容易通过IBR2瞄准来降解。
因为BRCA2和Rad51之间的相互作用似乎对于IR-诱导的Rad51焦点的形成是关键的，考虑到IBR2可以模拟BRC重复来破坏BRCA2-Rad51相互作用且因此消除IR-诱导的Rad51焦点形成。为了测试这种可能性，在IBR2处理后测量形成的IR-诱导的Rad51焦点的MCF-7细胞数量。如图5F中所示的，IBR2处理显著降低了IR-诱导的Rad51焦点形成，表明IBR2削弱了Rad51的双链破坏(DSB)修复功能。为了测试这种效果是否适用于DSB修复中涉及的其他分子，发明人然后检测了g-H2AX的IR-诱导的焦点形成，这是在丝氨酸139通过ATM磷酸化的组蛋白H2AX，用于NBS1、53BP和BRCA1的补充，而不是Rad51。如图5G中所示的，IR处理时，IBR2对g-H2AX焦点形成没有作用，表明IBR2特异性地干扰Rad51 HR途径而没有影响g-H2AX补充至DNA损伤部位。
        所考虑的化合物和化疗剂的协同作用
IBR2显著抑制了细胞周期进程以及HR中的Rad51功能。因此很可能IBR2和其他化疗剂的结合具有协同效果。为了测试这种可能性，测量了用8μM IBR2加上不同剂量的VP-16、紫杉醇、喜树碱或γ-放射处理的MCF-7乳癌细胞的存活。发现IBR2和VP-16(图5H)、紫杉醇(图5I)、喜树碱(Camp)(图5J)和γ-放射(图5K)对杀灭乳癌细胞的显著协同作用。因此，应当认识到IBR2和其他常规治疗剂的结合在治疗各种癌症中具有潜在的临床应用。
之前的研究显示出癌细胞比正常细胞具有较高的S部分。这种差异对于发展瞄准这种性质的许多传统药物是有用的。还观察到许多癌细胞中Rad51增大的表达水平。这种癌细胞和正常细胞之间Rad51功能的显著差异因此可以提供潜在的用于癌症治疗的Rad51治疗窗口。一贯地，在我们的动物研究中，所考虑的化合物在50mg/kg的剂量能够阻止肿瘤生长高达65％，而没有明显体重丢失直达150mg/kg。该结果似乎证实了所考虑的化合物抑制乳房肿瘤生长，同时对身体的组织具有低的影响且没有明显的一般毒性。然而，用IBR单独处理不足以消除癌细胞，因为IBR自身在G0/G1期具有小的杀伤活性。因此，和其他化疗剂的结合对获得更好的结果是必需的。在这点上，IBR2和其他化疗剂如VP-16、紫杉醇和喜树碱，或电离放射的共同治疗，可以产生协同效果，表明化合物可以用作常规化疗或放疗的敏化剂。
细胞中BRCA2的不存在还似乎对Rad51稳定性具有显著影响，给予它们对IBR2处理更敏感。一贯地，初步结果表明胰腺癌细胞系，CAPAN-1，其含有平截的BRCA2，显示出对IBR2显著的敏感性。因此所考虑的是IBR2在处理缺乏功能BRCA2(或具有降低的BRCA2表达)的癌细胞中特别有用，尽管只有小部分癌症。
实验程序
反向酵母双杂交筛选：从Nanosyn，Inc.(Menlo Park，CA)购买化学文库。组成型表达含有BRC1-4重复的TetR/NCB；AD/Rad51的表达在GAL1启动子下是半乳糖诱导型的。将酵母生长于含有5-FOA的半乳糖培养基中。在96孔平板上进行测定，在100μl总体积中使用10μM化合物。通过酵母的存活力鉴定可以破坏BRC-Rad51相互作用的化合物。
分子模型化：使用Sybyl(Tripos co.ltd.)产生IBR2结构，并使用Gasteiger-Huckel方法(Gastiger和Marsili，1980)添加电荷。通过弹性入坞方法使用UCSF Dock(Ewing和Kuntz，1997)进行分子入坞，并用Chimera(Huang等，1996)观察结果。Rad51和BRC4坐标来自PDB(登录号No：1N0W)。Rad51寡聚基序坐标来自PDB(登录号No：1PZN)。对于3D结构比对，IBR2坐标来自入坞构型之一。
表面等离子共振结合测定：在Biacore3000(Biacore Inc.)上在HBSD缓冲剂(10mM HEPES，150mM NaCl，0.1％DMSO)中在25℃进行测定。使用传感器芯片NTA或谷胱甘肽-修饰的CM5来各自捕获His-Rad51或GST-BRC1。捕获水平在5μl/min的低速大约是130共振单位。对于连续结合测定，用化合物(1μM)和然后蛋白质(50μg/ml)处理芯片。记录保持的共振单位(RU)并从重复三次的实验获得平均值。对于竞争测定(Vassilev等，2004)，在使用之前用50μg/ml BRC在25℃孵育IBR2 15分钟。相对于没有使用IBR2的结合计算相对结合百分比，并从两个独立的实验获得平均值。
凝胶过滤：将Rad51(3.2μg)和小化合物(摩尔比1∶10)的混合物在37℃孵育15分钟，补充缓冲剂(50mM三乙醇胺-HCl[pH7.5]，0.5mM Mg(OAc)2，1mM二硫苏糖醇，2mM ATP和100μg/mlBSA，总体积20μl)并再孵育15分钟。然后将混合物装载在用相同缓冲剂平衡的2.4ml Superdex 200 PC 3.2/30柱上(Pharmacia)，如所述的(Davies等，2001)。收集级分(50μl)并将0.5μl的每个级分点在PVDF膜上。使用抗Rad51抗体(mAb 14B4)检测Rad51。
细胞培养、细胞同步、BrdU标记和有丝分裂指数的测定：在含有10％胎牛血清的高葡萄糖Dulbecco改良Eagle培养基中培养乳癌细胞系和MEF细胞系。按照之前所述的培养MCF-10A细胞(Debnath等，2003)。通过用0.1μg/ml nocodazle处理8小时来获得M期的细胞同步。用1mM羟基脲处理17小时、9小时的释放和再次用1mM羟基脲处理14小时来获得G1/S期边界的细胞同步。对于BrdU标记，使用BrdU标记试剂盒(Amersham Biosciences)用BrdU孵育细胞30分钟并固定BruD免疫染色。对于有丝分裂指数的测定，将细胞在室温固定于含有0.1μg/ml DAPI的PBS中的4％多聚甲醛中30分钟，并通过荧光显微镜来检测。计数每个样品500-1000个核来测定M期细胞的数目，M期细胞只包括前中期、中期、后期和末期。
细胞增殖测定和克隆发生存活测定：为了获得细胞生长曲线，将1×104细胞接种于12孔平板中24小时。然后在0.4％DMSO存在下用各种浓度的IBR2处理细胞，重复双份。每日通过锥虫蓝排除测定来计数活细胞。按照之前所述的进行MTT测定(Alley等，1988)。
为了进行克隆发生存活测定，将1.5×103个MCF-7细胞接种于10-cm培养皿中24小时。然后用5μM IBR2处理细胞12小时，然后g-放射，重复双份。将细胞连续暴露于5μM IBR2并每4天用新鲜培养基和IBR2再次喂养。14-16天后，将细胞固定并用2％亚甲基蓝染色。计数由多于50个细胞组成的克隆。
蛋白质印迹分析：用20mM IBR2或50μg/ml放线菌酮(CHX)或1μM MG132处理细胞并在不同时间点收集用于蛋白质印迹分析。将悬浮于Lysis 250缓冲剂中的细胞接受三次冻/融循环(液氮/37℃)，然后在室温14,000rpm离心2分钟。测量蛋白质浓度后，将等量总细胞蛋白接受SDS-PAGE，并按照之前所述的进行免疫印迹分析(Chen等，1999)。所用的抗体是：Rad51(兔子5952)；BRCA2(兔子PC146，Oncogene)；Rb(mAb 11D7)；Rad50(mAb 13B3)和p84(mAb 5E10)。使用Labworks 4.5软件通过密度测定法来定量条带的强度。用p84信号标准化后，相对于未处理样品来计算条带强度的相对值。
免疫染色Rad51和g-H2AX焦点：用20μM IBR2处理MCF-7细胞7或19小时，然后在20Gy g-放射。用20μM IBR2将细胞另外孵育5小时，然后用含有0.5％曲通X-100的PBS中的4％多聚甲醛固定。用a-Rad51抗体(mAb 1F5)或a-g-H2AX抗体(Upstate)孵育固定的细胞。随后按照所述的(Chen等，1999)计数Rad51和g-H2AX焦点阳性细胞。
通过流式细胞术的细胞周期分析：为了分析细胞周期分布，将5’105个MCF-7细胞接种于10-cm培养皿中24小时，并用20mM IBR2处理不同的时间。然后将细胞胰蛋白酶化，并用70％乙醇(-20℃)固定，用碘化丙啶(PI)染色溶液染色30分钟(Yun等，2005)(PBS中50μg/ml PI，0.1％柠檬酸钠，50μg/ml RNase A，0.03％NP-40)。使用FACScalibur流式细胞计数器进行流式细胞计数分析并用CellQuest软件(Beckton Dickson)分析细胞周期分布。分析每个样品10000个事件并将实验重复两次。
MCF-7细胞中Rad51蛋白的构建和超表达：通过将1.1kb Rad51片段插入逆转录载体pCLpGKEFP中来产生Rad51-EGFP。然后产生Rad51-EGFP逆转录病毒并感染至MCF-7细胞中。用20μM IBR2处理Rad51-EGFP稳定感染的细胞24小时，然后用BrdU标记或裂解用于蛋白质印迹分析。
裸鼠中肿瘤抑制测定：将100μl PBS中5×106个MDA-MB-468细胞注射至6-8周大的无胸腺雌性BALB/c-裸鼠(nu/nu)(Charles RiverLaboratories)的乳房脂垫中。肿瘤生长至85mm3(12天)后，将小数随机分成四组(每组n＝5)，每隔一天接受腹膜内注射IBR2(10、50或150mg/kg)或载体(15％DMSO、20％吐温20、10％PEG400、55％盐水)，持续5周。在药物治疗的过程中，每周两次测量小鼠的体重和肿瘤体积。使用Student’st测试来测定P值。
因此，已经公开了破坏BRCA2-Rad51相互作用的组合物和方法的特定实施方案和应用。然而，本领域技术人员应当清楚除了已经描述的那些以外的许多其他的改变是可能的，且没有脱离在此的本发明概念。因此，本发明的主题没有受到限制，除了在所附权利要求的精神内。此外，在解释说明书和权利要求书中，应当以与内容相一致的最可能宽的方式来解释所有术语。特别地，术语包括和包含应当解释为以非排他的方式涉及要素、成分或步骤，表明所参照的要素、成分或步骤可以存在或利用或结合其他没有专门提及的要素、成分或步骤。此外，在通过在此引入作为参考的参考文献中术语的定义或使用与在此提供的术语定义不一致或相反的情况中，使用在此提供的术语定义而不使用参考文献中的术语定义。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.用于治疗诊断为患有癌症的人的药物组合物，所述组合物包括：药物学上可接受的载体和根据通式1的化合物
Figure A20058004361900411
                                                通式1
其中R是
Figure A20058004361900412
其中Y不存在或者是亚甲基；
Z选自-C(R12)＝C(R13)-、-CH＝N-、-N＝CH-、O、S或NR14，其中R14是H；
Q是N或C-R2；
X选自CH2、O、S或NR14，其中R14独立地如上所定义；
R1至R13独立地选自H、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、卤素、硝基、羟基、烷氧基、烯氧基、氰基、羧基、烷氧基羰基、羧基烷基、氨基、酰基氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、N-烷基、N-环烷基、氨基、巯基、烷硫基和卤代烷基；前提条件是R12和R13任选地结合来形成碳环或杂环；
R’是H、C1-C3烷基、C1-C3烯基、C1-C3炔基、卤素、硝基、羟基、C1-C3烷氧基、C1-C3烯氧基、氰基、羧基、氨基、C1-C3酰基氨基、C1-C3烷基氨基、C1-C3二烷基氨基、N-C1-C3烷基、氨基、巯基、C1-C3烷硫基和卤代烷基；
其中n为0至4，包括0和4，且其中*表示R或S构型；和
其中化合物以有效实现以下至少一种的浓度存在：(a)提高肿瘤细胞对放射和DNA-损伤剂中至少一种的敏感性，和(b)停滞非肿瘤细胞于G-期。
2.权利要求1的药物组合物，其中R1至R11是H，其中X是NR14，且其中R是
Figure A20058004361900421
3.权利要求2的药物组合物，其中Z是-C(R12)＝C(R13)-，且Y不存在。
4.权利要求1的药物组合物，其中化合物具有根据通式2的结构
Figure A20058004361900422
                                    通式2。
5.权利要求1的药物组合物，其中化合物具有根据通式3的结构
                                        通式3。
6.权利要求1的药物组合物，其中将细胞暴露于化合物时，化合物以有效提高肿瘤细胞对放射和DNA损伤剂中至少一种的敏感性的浓度存在于组合物中。
7.权利要求1的药物组合物，其中将BRCA2-RAD51复合物暴露于化合物时，化合物以有效降低BRCA2与RAD51结合的浓度存在于组合物中。
8.权利要求1的药物组合物，其中所述组合物还包括DNA-损伤剂。
9.权利要求1的药物组合物，其中将细胞接触化合物时，化合物以有效停滞细胞于G1期的浓度存在于组合物中。
10.权利要求1的药物组合物，其中将化合物以有效降低植入装置附近多个细胞的细胞增殖的浓度结合植入装置。
11.处理肿瘤细胞的方法，所述方法包括：
将肿瘤细胞接触根据通式1的化合物、其前药或代谢物，其中将肿瘤细胞暴露于化合物时，化合物以有效提高肿瘤细胞对放射和DNA-损伤剂中至少一种的敏感性的浓度存在；
Figure A20058004361900441
                                             通式1
其中R是
Figure A20058004361900442
其中Y不存在或者是亚甲基；
Z选自-C(R12)＝C(R13)-、-CH＝N-、-N＝CH-、O、S或NR14，其中R14是H；
Q是N或C-R2；
X选自CH2、O、S或NR14，其中R14独立地如上所定义；
R1至R13独立地选自H、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、卤素、硝基、羟基、烷氧基、烯氧基、氰基、羧基、烷氧基羰基、羧基烷基、氨基、酰基氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、N-烷基、N-环烷基、氨基、巯基、烷硫基和卤代烷基；前提条件是R12和R13任选地结合来形成碳环或杂环；
R’是H、C1-C3烷基、C1-C3烯基、C1-C3炔基、卤素、硝基、羟基、C1-C3烷氧基、C1-C3烯氧基、氰基、羧基、氨基、C1-C3酰基氨基、C1-C3烷基氨基、C1-C3二烷基氨基、N-C1-C3烷基、氨基、巯基、C1-C3烷硫基和卤代烷基；和
其中n为0至4，包括0和4，且其中*表示R或S构型。
12.权利要求11的方法，所述方法还包括将细胞暴露于放射和DNA损伤剂中至少一种的步骤。
13.权利要求11的方法，其中放射是γ放射或UV-C放射，且其中DNA损伤剂是烷化基或交联剂。
14.权利要求11的方法，其中肿瘤细胞是乳癌细胞或卵巢癌细胞。
15.权利要求11的方法，其中所述浓度为1μM至100μM。
16.停滞非肿瘤细胞于G-期的方法，所述方法包括：
将细胞接触根据通式1的化合物、其前药或代谢物，其中化合物以有效停滞非肿瘤细胞于G-期的浓度存在；
Figure A20058004361900451
                                                     通式1
其中R是
其中Y不存在或者是亚甲基；
Z选自-C(R12)＝C(R13)-、-CH＝N-、-N＝CH-、O、S或NR14，其中R14是H；
Q是N或C-R2；
X选自CH2、O、S或NR14，其中R14独立地如上所定义；
R1至R13独立地选自H、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、卤素、硝基、羟基、烷氧基、烯氧基、氰基、羧基、烷氧基羰基、羧基烷基、氨基、酰基氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、N-烷基、N-环烷基、氨基、巯基、烷硫基和卤代烷基；前提条件是R12和R13任选地结合来形成碳环或杂环；
R’是H、C1-C3烷基、C1-C3烯基、C1-C3炔基、卤素、硝基、羟基、C1-C3烷氧基、C1-C3烯氧基、氰基、羧基、氨基、C1-C3酰基氨基、C1-C3烷基氨基、C1-C3二烷基氨基、N-C1-C3烷基、氨基、巯基、C1-C3烷硫基和卤代烷基；
其中n为0至4，包括0和4，且其中*表示R或S构型。
17.权利要求16的方法，所述方法还包括在接触步骤后将非肿瘤细胞暴露于DNA-损伤条件的步骤，其中在与没有使用接触步骤获得的DNA损伤相比较降低细胞DNA损伤的条件下进行接触步骤。
18.权利要求17的方法，其中DNA损伤条件是放射和暴露于DNA损伤剂中的至少一种。
19.权利要求18的方法，其中DNA损伤剂选自顺铂、丝裂霉素、阿霉素、苯丙氨酸氮芥、环磷酰胺、苯丁酸氮芥和博莱霉素。
20.权利要求16的方法，其中进行接触细胞的步骤使得细胞接触结合了化合物的植入装置。

Claims (20)

1.包括药物学上可接受的载体和根据通式1的化合物的药物组合物，
Figure A2005800436190002C1
通式1
其中R是选自烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、烷芳基和
Figure A2005800436190002C2
的基团；
其中Y不存在或者是具有1至4个碳原子的亚烷基基团；
Z选自-C(R12)＝C(R13)-、-CH＝N-、-N＝CH-、O、S或NR14，其中R14是H、烷基、芳基、芳烷基或酰基；
Q是N或C-R2；
X选自CH2、O、S或NR14，其中R14独立地如上所定义；
R’和R1至R13独立地选自H、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、卤素、硝基、羟基、烷氧基、烯氧基、氰基、羧基、烷氧基羰基、羧基烷基、氨基、酰基氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、N-烷基、N-环烷基、氨基、巯基、烷硫基和卤代烷基；前提条件是R12和R13任选地结合来形成碳环或杂环；和
其中n为0至4，包括0和4，且其中*表示R或S构型。
2.权利要求1的药物组合物，其中R1至R11是H，其中X是NR14，且其中R是
3.权利要求2的药物组合物，其中Z是-C(R12)＝C(R13)-，且Y不存在。
4.权利要求1的药物组合物，其中化合物具有根据通式2的结构
Figure A2005800436190003C2
通式2。
5.权利要求1的药物组合物，其中化合物具有根据通式3的结构
通式3。
6.权利要求1的药物组合物，其中将细胞暴露于化合物时，化合物以有效提高肿瘤细胞对放射和DNA损伤剂中至少一种的敏感性的浓度存在于组合物中。
7.权利要求1的药物组合物，其中将BRCA2-RAD51复合物暴露于化合物时，化合物以有效降低BRCA2与RAD51结合的浓度存在于组合物中。
8.权利要求1的药物组合物，其中所述组合物还包括DNA-损伤剂。
9.权利要求1的药物组合物，其中将细胞接触化合物时，化合物以有效停滞细胞于G1期的浓度存在于组合物中。
10.权利要求1的药物组合物，其中将化合物以有效降低植入装置附近多个细胞的细胞增殖的浓度结合植入装置。
11.处理肿瘤细胞的方法，包括：
将肿瘤细胞接触根据通式1的化合物、其前药或代谢物，其中将肿瘤细胞暴露于化合物时，化合物以有效提高肿瘤细胞对放射和DNA-损伤剂中至少一种的敏感性的浓度存在；
通式1
其中R是选自烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、烷芳基和
Figure A2005800436190005C1
的基团；
其中Y不存在或者是具有1至4个碳原子的亚烷基基团；
Z选自-C(R12)＝C(R13)-、-CH＝N-、-N＝CH-、O、S或NR14，其中R14是H、烷基、芳基、芳烷基或酰基；
Q是N或C-R2；
X选自CH2、O、S或NR14，其中R14独立地如上所定义；
R’和R1至R13独立地选自H、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、卤素、硝基、羟基、烷氧基、烯氧基、氰基、羧基、烷氧基羰基、羧基烷基、氨基、酰基氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、N-烷基、N-环烷基、氨基、巯基、烷硫基和卤代烷基；前提条件是R12和R13任选地结合来形成碳环或杂环；和
其中n为0至4，包括0和4，且其中*表示R或S构型。
12.权利要求11的方法，所述方法还包括将细胞暴露于放射和DNA损伤剂中至少一种的步骤。
13.权利要求11的方法，其中放射是γ放射或UV-C放射，且其中DNA损伤剂是烷化基或交联剂。
14.权利要求11的方法，其中肿瘤细胞是乳癌细胞或卵巢癌细胞。
15.权利要求11的方法，其中浓度为1μM至100μM。
16.停滞非肿瘤细胞于G-期的方法，包括：
将细胞接触根据通式1的化合物、其前药或代谢物，其中化合物以有效停滞非肿瘤细胞于G-期的浓度存在；
Figure A2005800436190006C1
通式1
其中R是选自烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、烷芳基和
Figure A2005800436190006C2
的基团；
其中Y不存在或者是具有1至4个碳原子的亚烷基基团；
Z选自-C(R12)＝C(R13)-、-CH＝N-、-N＝CH-、O、S或NR14，其中R14是H、烷基、芳基、芳烷基或酰基；
Q是N或C-R2；
X选自CH2、O、S或NR14，其中R14独立地如上所定义；
R’和R1至R13独立地选自H、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、卤素、硝基、羟基、烷氧基、烯氧基、氰基、羧基、烷氧基羰基、羧基烷基、氨基、酰基氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、N-烷基、N-环烷基、氨基、巯基、烷硫基和卤代烷基；前提条件是R12和R13任选地结合来形成碳环或杂环；和
其中n为0至4，包括0和4，且其中*表示R或S构型。
17.权利要求16的方法，所述方法还包括在接触步骤后将非肿瘤细胞暴露于DNA-损伤条件的步骤，其中在与没有使用接触步骤获得的DNA损伤相比较降低细胞DNA损伤的条件下进行接触步骤。
18.权利要求17的方法，其中DNA损伤条件是放射和暴露于DNA损伤剂中的至少一种。
19.权利要求18的方法，其中DNA损伤剂选自顺铂、丝裂霉素、阿霉素、苯丙氨酸氮芥、环磷酰胺、苯丁酸氮芥和博莱霉素。
20.权利要求16的方法，其中进行接触细胞的步骤使得细胞接触结合了化合物的植入装置。
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