NL9100854A - Werkwijze voor de bereiding van tussenprodukten bruikbaar voor de synthese van benzodiazepinen. - Google Patents

Description

Titel: Werkwijze voor de resolutie van glycidine- zuurderivaten.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor de resolutie van glycidinezuurderivaten en, meer in het bijzonder, heeft deze betrekking op een werkwijze voor de resolutie van 3-(4-gesubstitueerd fenyl)-glycidine zuurderivaten zoals ester of amiden.

Zowel ester- als amidederivaten van 3-(4-methoxyfenyl)-glycidinezuur zijn tussenprodukten voor de synthese van verbindingen die actief werken op het cardiovasculair systeem zoals optisch actief 2,3-dihydro-2-(4-methoxyfenyl)-1,5-benzothiazepine-4(5H)-onen met de formule I-cis van het formuleblad, waarin R een waterstofatoom of een acetylgroep weergeeft;

Rl een waterstof of chlooratoom weergeeft; de asterisken de asymmetrische koolstofatomen aangeven.

Specifieke voorbeelden van de verbindingen met formule I zijn Diltiazem, (+)-(2S,3S)-3-acetoxy-5-[2-(dimethylamino)-ethyl]-2,3-dihydro-2-(4-methoxyfenyl)-1, 5-benzothiazepin-4(5H)-on (Merck Index, X Ed., No. 3189, blz. 466) en TA-3090, (+)-(2S,3S)-3-acetoxy-8-chloor-5-[2-(dimethylamino)-ethyl]-2,3-dihydro-2-(4-methoxyfenyl)-1, 5-benzothiazepin-4(5H)-on (Annual Drug Data Report 1987, page 507) .

Verschillende werkwijzen voor de bereiding van de verbindingen met formule I zijn bekend in de literatuur zoals bijvoorbeeld beschreven in Brits octrooischrift 1.236.467, Europees octrooischrift 127.882 en nr. 158.340 en Britse octrooiaanvrage nr. 2.167.063 die op naam staan van Tanabe Seiyaku Co. Ltd.

De meeste van deze werkwijzen voorzien in hoofdzaak in het reactieschema 1 van het formuleblad,waarbij Ri een waterstof of chlooratoom weergeeft; R2 een lager alkyl weergeeft en de asterisken de asymmetrische koolstofatomen aangeven.

Eveneens is reeds een synthese beschreven overeenkomstig die, weergegeven in schema 1 waarin een 2-nitro-thiofenol gebruikt wordt in plaats van verbinding II en waarin de nitrogroep van het condensatieprodukt gereduceerd wordt tot een aminogroep voor de cyclisatiereactie (Europees octrooischrift nr. 59.335 - Tanabe Seiyaku Co. Ltd.).

Elk van deze werkwijzen voorzien noodzakelijkerwijs in een optische resolutiestap, over het algemeen op het niveau van een tussenprodukt van de synthese, om het enantiomeer met de gewenste configuratie af te scheiden.

In feite zijn bekend de resolutie van de cyclische tussenprodukten met de formule VI door middel van 1-(2-naftylsulfonyl)-pyrrolidine-2-carbonylchloride, beschreven in de boven geciteerde Britse octrooiaanvrage nr. 2.167.063 en de resolutie van het tussenprodukt met de formule V door optisch actieve basen zoals 4-hydroxyfenyl-glycinemethylester en cinchonidine, beschreven in het boven geciteerde Europese octrooischrift nr. 127.882, door middel van a-fenethylamine, beschreven in het Europese octrooischrift nr. 98.892 (Tanabe Seiyaku Co. Ltd.) en door middel van L-lysine, beschreven in het Britse octrooischrift nr.2.130.578 (Istituto Luso Farmaco).

Het is duidelijk voor de deskundige dat een resolutie bij een eerdere stap van de synthese, dat is op het niveau van glycidine tussenprodukt III, zeer zeker interessant is.

Recentelijk is een enzymatische resolutie van esters met de formule III (R2 = lagere alkyl) beschreven (Europese octrooiaanvrage nr. 343.714 - Stamicarbon B.V.).

Echter enzymatische resoluties zijn zelden economisch voordeliger dan chemische resoluties omdat het enzym, dat een hoge prijs kan hebben, teruggewonnen moet worden en dat het zijn specifieke activiteit in de tijd verliest.

Chemische resoluties zijn beschreven op het niveau van het vrije zuur III (R2 = H) onder gebruikmaking van een optisch actieve base welke diastereo-isomere zouten levert. Echter in dit specifieke geval, is een dergelijke resolutie in het bijzonder bewerkelijk en moeilijk, omdat het vrije zuur III (R2 = H) instabiel is.

We hebben een kinetische resolutie werkwijze gevonden die het toelaat de verbindingen met de formule III of hun voorgangers met een hoge enantiomere zuiverheid te verkrijgen uitgaande van mengsels van cis enantiomeren (2S,3S) en 2R,3R) evenals trans enantiomere (2R,3S en 2S,3R).

Derhalve is het doel van de onderhavige uitvinding een werkwijze voor de kinetische resoluties van mengsels van cis of trans enantiomeren van de verbindingen met de formule III-A, waarbij R3 een lineaire of vertakte Ci-Cie alkoxygroep, een benzyloxy of een amino, mono of dialkylaminogroep weergeeft waarin de alkyleenheid van 1 tot 6 koolstofatomen bezit; X een methoxygroep of een groep die transformeerbaar is in een methoxygroep weergeeft, gekozen uit de groep bestaande uit hydroxy en beschermd hydroxy zoals benzyloxy of een ester met een zuur dat normalerwijze gebruikt wordt voor het beschermen van fenolen; de asterisken merken het asymmetrische koolstofatoom; omvattende de reactie tussen een racemisch mengsel van cis of trans enantiomeren van de verbindingen met formule III-A met een thiofenol van de formule II-A van het formuleblad, waarin R4 en R5, die hetzelfde of verschillend kunnen zijn, waterstof of chlooratomen weergeven, C1-C4 alkyl, amino, acetylamino en nitrogroepen weergeven; in de aanwezigheid van een catalytische hoeveelheid van een optisch actief tertiair amine in een inert oplosmiddel en bij een temperatuur tussen -20°C en +30°C.

Het bovenbeschreven proces is een kinetische resolutie omdat, onder de boven weergegeven omstandigheden, een van de twee enantiomeren sneller reageert met thiofenol II-A dan de ander onder vorming van een verbinding met de formule IV-A van het formuleblad, waarin R3, R4, R5 en X de boven weergegeven betekenissen bezitten; welke afgeleid is van een trans-type opening van de expoxyring. Door het quenchen van de reactie bij ongeveer 50% omzetting, blijft de andere enantiomeer in oplossing in een niet-gereageerde vorm en met een hoge enantiomere zuiverheid.

De aard van het optisch actieve tertiaire amine bepaalt welke van de twee enantiomeren sneller reageert.

Hoewel het reactiemechanisme nog niet bekend is, suggereren onze experimentele observaties dat de reactie loopt via een aanval van een ammonium thiofenaat (in situ verkregen door de reactie van thiofenol II-A met het optisch actieve tertiaire amine) op de epoxyring van verbinding III-A om de transopening van de ring. Aangezien de eerste reactie in schema 1 uitgevoerd kan worden door een cis opening (in basische omgeving) en ook door een transopening (thermisch) van het epoxide, is het duidelijk dat de onderhavige werkwijze in het bijzonder voordelig is omdat, in aanvulling op de goede resultaten van de kinetische resolutie, deze toelaat verbindingen III-A met de cis configuratie te gebruiken voor de synthese van de verbindingen van formule I.

In feite zoals boven gerapporteerd, bepaalt de keuze van het optisch actief tertiaire amine welk van de twee enantiomeren van verbindingen III-A sneller reageren.

Bijvoorbeeld uitgaande van een mengsel van trans enantiomeren III-A (2R,3S en 2S,3R) is het mogelijk de reactie op de (2S,3R) enantiomeer bij voorkeur uit te voeren waarbij de (2R,3S) enantiomeer onveranderd blijft, door thermische condensatie met 2-amino-thiofenol, hetgeen direct de verbinding IV van schema 1 geeft in de juiste configuratie.

Analoog uitgaande van racemisch cis-component III-A, geeft de kinetische resolutie (2R,3R) enantiomeer III-A welke, door vervolgens reactie met 2-amino-thiofenol in basische omgeving, tussenprodukt IV van schema 1 in de juiste configuratie geeft.

Van de andere kant wanneer de werkwijze volgens de uitvinding uitgevoerd wordt onder omstandigheden waarin de reactie op (2R,3R) enantiomeer III-A sneller gaat, geeft het gebruik van 2-aminothiofenol als verbinding met formule II-A direct de verbinding IV van schema 1 in de juiste configuratie.

Het zal duidelijk zijn dat, wat bovenbeschreven is, uitgevoerd kan worden volgens een werkwijze overeenkomstig die gerapporteerd in schema 1, door gebruikmaking, wanneer dit geschikt is, van 2-nitro-thiofenol, waarbij een tussenprodukt met formule IV aldus wordt gekregen waarin een nitrogroep in plaats van de aminogroep aanwezig is.

De kritische faktoren en de parameters van de werkwijze die het doel is van de onderhavige uitvinding worden hieronder gerapporteerd.

Substraat : (verbindingen met formule III-A) .

Zoals boven gerapporteerd is de werkwijze geschikt om te worden uitgevoerd op racemische mengsels van cis zowel als trans enantiomeren III-A. De twee substraten (cis of trans mengsels) zijn equivalent en dit is een voordeel omdat dit toelaat ook cis enantiomeren III-A in de synthese van de verbindingen met formule I te gebruiken.

In zoverre de substituenten van de verbindingen met formule III-A betreft, ligt de bruikbaarheid van het hebben van de carboxygroep in de vorm van een ester met alcoholen met een laag danwel hoog aantal koolstofatomen of in de vorm van een amide in de consekwente mogelijkheid om de lipofiliciteit te moduleren van verbinding III-A als funktie van de andere reactieparameters.

Substituent X kan eveneens gekozen worden afhankelijk van verschillende faktoren zoals bijvoorbeeld de mogelijkheid van het moduleren van de lipofiliciteit van verbinding III-A. Voor dit doel kan een geschikt beschermd hydroxygroep gebruikt worden.

Voor een begrijpelijke referentie van de bescherming van fenolen en hun ontscherming wordt verwezen naar Theodora W. Greene - Protective Groups in Organic Synthesis -Chapter 3, pages 87-108 - John Wiley & Sons.

Het is voor de handliggend dat voorkeurssubstituent X een methoxygroep is, omdat dit de substituent is aanwezig in de verbindingen met formule I.

Reagens

Specifieke voorbeelden van de thiofenolen met formule II- A zijn thiofenol, 4-methyl-thiofenol, 4-isopropyl-thiofenol, 4-tert.butyl-thiofenol, 2-amino-thiofenol, 2-nitro-thiofenol, 2-amino-5-chloor-thiofenol, 2-nitro-5-chloor-thiofenol, 2,4-dimethyl-thiofenol, 2,6-dimethyl-thiofenol.

De selectie uit de thiofenolen met formule II-A hangt af van het soort reactie dat uitgevoerd moet worden en, in het bijzonder, hangt deze er van af of het doel van de reactie is het verkrijgen van een niet gereageerd hebbend enantiomeer III- A met hoge zuiverheid (bijvoorbeeld de 2R, 3S enantiomeer) of direkt een produkt met de formule IV (schema 1).

In het eerste geval zal de reactie uitgevoerd worden tussen het racemisch mengsel en een geschikt thiofenol II-A terwijl in het tweede geval alleen 2-amino-thiofenol, 2-nitro-thiofenol, 2-amino-5-chloor-thiofenol of 2-nitro-5-chloor-thiofenol zal worden gebruikt.

De hoeveelheid thiofenol II-A die gebruikt moet worden ligt tussen 0,4 en 3 mol per mol substraat.

Aangezien het niet gewenst is dat de reactie loopt met een omzetting hoger dan 50% (om de reactie van de tweede enantiomeer na de eerste enantiomeer te vermijden) en verbinding II-A eveneens gebruikt kan worden in overmaat (meer dan 50% als molaire hoeveelheid) met betrekking tot substraat III-A, moet het verloop van de reactie gevolgd worden zodat de reactie gequenched wordt zodra de gewenste omzetting bereikt is.

Over het algemeen wordt geprefereerd een hoeveelheid thiofenol II-A te gebruiken tussen 0,4 en 1 mol per mol substraat en het wordt nog meer geprefereerd in een hoeveelheid tussen 0,5 en 0,7 mol verbinding II-A per mol verbinding III-A te gebruiken.

Katalysator

Voorbeelden van optische actieve tertiaire aminen bruikbaar voor de werkwijze van de uitvinding zijn optisch actieve cinchona basen, N,N-dialkyl-efedrinen dialkylfenylaminen, a- of ß-hydroxy-trialkylaminen.

Cinchona basen zoals cinchonine, dihydrocinchonidine, quinine, quinidine en cinchonidine worden geprefereerd.

Onder de cinchona basen, is cinchonidine de meest geprefereerde.

Kwaternaire ammoniumzouten van de bovengenoemde basen kunnen eveneens gebruikt worden, eventueel in de aanwezigheid van een andere base.

Wanneer synchonidine gebruikt wordt samen met bijvoorbeeld racemisch trans III-A, reageert de 2S,3R enantiomeer terwijl de gewenste 2R,3S enantiomeer in hoofdzaak overanderd in oplossing blijft, klaarblijkelijk door de reactie bij ongeveer 50% omzetting te quenchen.

De molaire hoeveelheid katalysator die gebruikt moet worden ligt tussen 3 en 50% met betrekking tot verbinding III-A, bij voorkeur tussen 10 en 50%.

Het tertiaire amine kan praktisch kwantitatief terug gewonnen worden bij het eind van de reactie.

Oplosmiddel

Het wordt geprefereerd verbinding II-A op te lossen in een reactiemedium, maar het is niet noodzakelijk dat substraat III-A en tertiaire amine volledig opgelost worden.

Vervolgens zijn geschikte oplosmiddelen deze die inert zijn onder de reactieomstandigheden en in staat zijn verbinding II-A evenals, ten minste gedeeltelijk substraat III-A en het tertiaire amine op te lossen.

Voorbeelden van voorkeursoplosmiddelen zijn benzeen, tolueen, o-xyleen, m-xyleen, p-xyleen, chloorbenzeen, o-dichloorbenzeen, m-dichloorbenzeen, p-dichloorbenzeen of mengsels daarvan.

Het geprefereerde temperatuurtraject ligt tussen -20°C en 30°C. Door te werken onder -20°C, loopt de reactie te langzaam uit een industrieel oogpunt, zelfs wanneer het de gewenste resultaten geeft. Aan de andere kant gaat, bij temperaturen boven 30°C, de selectiviteit die vereist is om de kinetische resolutie die het doel is van de uitvinding uit te voeren gedeeltelijk verloren.

Binnen de geprefereerde temperaturen wordt de gewenste mate van omzetting (50%) bereikt in een aantal uren (4-24 uur) .

Een praktische uitvoeringsvorm van de werkwijze volgens de onderhavige uitvinding bestaat uit het reageren van een mengsel van verbinding III-A, verbinding II-A en een optisch actief tertiair amine in een inert oplosmiddel, bijvoorbeeld een aromatisch oplosmiddel, bij de gekozen temperatuur.

De loop van de reactie wordt gevolgd en, wanneer de gewenste mate van omzetting bereikt is (ongeveer 50% verbinding III-A), wordt de reactie gequenched door het reactiemengsel in een waterig zuur te gieten. Het optisch actieve tertiare amine, welke gerecirculeerd wordt, wordt teruggewonnen uit de waterige laag.

Uit de organische laag wordt het niet gereageerd hebbend enantiomeer III-A afgescheiden van het reactieprodukt IV-A.

Wanneer verbinding IV-A de gewenste configuratie heeft wordt deze verder omgevormd als beschreven in schema 1 om de corresponderende verbinding met formule I te verkrijgen.

Aan de andere kant wanneer het niet-gereageerd hebbend enantiomeer III-A de juiste configuratie heeft wordt dit gereageerd met 2-amino-thiofenol (of 2-nitro-thiofenol) volgens schema 1.

De enantiomere zuiverheid van het verkregen produkt of van het niet-gereageerde enantiomeer is hoog en, derhalve, laat de gebruikelijke opwerking in de achtereenvolgende stappen van de werkwijze voor de synthese van de verbindingen van formule I (bijvoorbeeld schema 1) het toe het gewenste eindprodukt te verkrijgen met een optische zuiverheid volgens de farmacopoeia vereisten, zonder verdere optische scheidingen.

Derhalve vertoont de werkwijze volgens de onderhavige uitvinding verschillende voordelen welke bruikbaar zijn vanuit een industrieel oogpunt. In feite, zover wij weten, is de werkwijze volgens de uitvinding het eerste voorbeeld van niet-enzymatische kinetische resolutie om de enantiomeren met formule III-A af te scheiden en laat deze toe de optische afscheiding uit te voeren in de eerste stap van de werkwijze voor de synthese van verbindingen met formule I. Verder is de praktische realisatie van de werkwijze volgens de uitvinding simpel en vereist deze niet bijzondere reactieomstandigheden of inrichtingen; het optisch actief tertiair amine wordt gemakkelijk teruggewonnen en gerecirculeerd.

Om de onderhavige uitvinding beter te illustreren worden de volgende voorbeelden gegeven.

VOORBEELD T

Cinchonidine (1,5 g; 5 mmol) en vervolgens 2-amino-thiofenol (0,62 g; 5 mmol) werden onder roeren bij 20°C toegevoegd aan een oplossing van racemisch trans-3-(4-methoxyfenol)-glycidinezure methylester (2 g; 10 mmol) in tolueen (20 ml).

Het reactiemengsel werd onder roeren bij 20°C gehouden gedurende 20 uur en onder roeren in een IN zoutzuuroplossing (20 ml) gegoten.

De fasen werden afgescheiden en de waterige fase werd geëxtraheerd met methyleenchloride (20 ml).

De verzamelde organische fasen werden gewassen met water (20 ml) en gedroogd op natriumsulfaat.

De verdamping van het oplosmiddel onder vacuum geeft een ruwere verbinding bevattende, volgens HPLC en 1H-NMR analyse, (2R,3S)-trans-3-(4-methoxyfenyl)-glycidinezure methylester (0,95 g).

De ester werd geïsoleerd met chromâtografie op silica gel met een mengsel n-hexaan:ethylether=8:2 als eluens. (2R,3S)-3-(4-methoxyfenyl)-glycidinezure methylester (0,6 g) met een 60% enantiomere overmaat werd verkregen.

Vervolgens werd de methylester opgelost in tolueen (4,2 ml). 2-amino-thiofenol (0,36 g; 2,88 mmol) werd aan de oplossing toegevoegd, het mengsel werd verhit onder refluxen gedurende 2 uur en, vervolgens, afgekoeld tot kamertemperatuur.

Het onoplosbare residu werd afgefilterd en gedroogd onder vacuum in een oven. (2S,3S)-2-hydroxy-3-(2-aminofenylthio)-3-(4-methoxyfenyl)-propionzure methylester met 72% enantiomere zuiverheid ([α]π20=+72° - c=0,5% CHCI3) werd verkregen. De enantiomere zuiverheid bij HPLC met chirale kolommen bedroeg 80%.

VOORBEELD II

Cinchonidine (3,7 g; 12,6 mmol) en vervolgens 2-amino-thiofenol (2,4 g; 19 mmol) werden toegevoegd onder roeren en onder stikstof bij 0°C, aan een oplossing van racemisch trans- 3-(4-methoxyfenyl)-glycidinezure methylester (8 g; 38 mmol) in tolueen (80 ml).

Het reactiemengsel werd onder roeren bij 0°C gehouden gedurende 24 uur en onder roeren in IN zoutzuuroplossing (80 ml) gegoten. De fasen werden gescheiden en de waterige fase werd geëxtraheerd met methyleenchloride (80 ml).

De verzamelde organische fasen werden gewassen met water (80 ml) en gedroogd op natriumsulfaat.

De HPLC analyse (chirale kolom) van de oplossing werd uitgevoerd. De oplossing bevatte trans-3-(4-methoxyfenyl)-glycidinezure methylester (4,72 g; 22,7 mmol) in een verhouding (2R,3S) : (2S,3R)= 73:27.

VOORBEELD III

Cinchonidine (2,82 g; 9,6 mmol) en, vervolgens, 2-aminothiofenol (1,68 g; 13,44 mmol) werden onder roeren en onder stikstof bij 0°C toegevoegd aan een oplossing van racemisch trans-3-(4-methoxyfenyl)-glycidinezure methylester (4 g; 19,2 mmol) in tolueen (40 ml).

Het reactiemengsel werd onder roeren bij 0°C gehouden gedurende 24 uur en uitgegoten onder roeren in IN zoutzuuroplossing (40 ml). De fasen werden gescheiden en de waterige fase werd geëxtraheerd met methyleenchloride (40 ml).

De verzamelde organische fasen werden gewassen met water (40 ml) en gedroogd op natriumsulfaat.

De HPLC analyse (chirale kolom) van de oplossing werd uitgevoerd. De oplossing bevatte trans-3-(4-methoxyfenyl)-glycidinezure methylester (1,6 g; 7,7 mmol) met een verhouding (2R,3S) :(2 S,3R)=85:15.

CONCLUSIES 1. Werkwijze voor de kinetische resolutie van mengsels van cis of trans enantiomeren van de verbindingen met formule III-A waarbij R3 een lineaire of vertakte Ci-Cis alkoxygroep, een benzyloxy of een amino, mono of dialkylaminogroep weergeeft, waarin de alkyleenheid van 1 tot 6 koolstofatomen bevat; X een methoxygroep of een groep transformeerbaar in een methoxygroep weergeeft gekozen uit de groep bestaande uit hydroxy en beschermde hydroxy zoals benzyloxy of als een ester met een zuur dat normalerwijze gebruikt wordt voor het beschermen van fenolen; de asterisken de asymmetrische koolstofatomen weergeven; omvattende de reactie tussen een racemsich mengsel van cis of trans enantiomeren van de verbindingen met formule III-A met een thiofenol van de formule II-A van het formuleblad waarin R4 en R5, die gelijk of verschillend zijn, waterstof of chlooratomen, Ci~C4 alkyl, amino, acetylamino en nitrogroepen weergeven; in de aanwezigheid van een katalytische hoeveelheid van een optisch actief tertiaire amine in een inert oplosmiddel en bij een temperatuur tussen -20°C en +30°C. 2. Werkwijze volgens conclusie 1 waarin een verbinding met de formule IV-A geïsoleerd wordt, waarin R3, R4, R5 en X de betekenis hebben als beschreven in conclusie 1. 3. Werkwijze volgens conclusie 1 waarin, wanneer de molaire hoeveelheid thiofenol II-A hoger is dan 50% met betrekking tot verbinding III-A, de reactie gequenched wordt bij ongeveer 50% omzetting van verbinding III-A. 4. Werkwijze volgens conclusie 1 waarin het thiofenol van de formule II-A gekozen wordt uit de groep bestaande uit thiofenol, 4-methyl-thiofenol, 4-isopropyl-thiofenol, 4-tert.butyl-thiofenol, 2-amino-thiofenol, 2-nitro-thiofenol, 2-amino-5-chloor-thiofenol, 2-nitro-5-chloor-thiofenol, 2,4-dimethyl-thiofenol, 2, 6-dimethyl-thiofenol. 5. Werkwijze volgens conclusie 1 waarin de optisch actieve tertaire amine gekozen wordt uit de groep bestaande uit N,N-dialkyl-efedrinen, dialkylfenylaminen, a- of ß-hydroxy-trialkylaminen, cinchonine, dihydrocinchonidine, quinine, quinidine en chinchonidine of quaternaire ammoniumzouten daarvan. 6. Werkwijze volgens conclusie 1 waarin het optisch actieve tertiaire amine cinchonidine is. 7. Werkwijze volgens conclusie 1 waarin de molaire hoeveelheid van het optische actief tertiaire amine ligt tussen 3 en 50% met betrekking tot verbinding III-A. 8. Werkwijze volgens conclusie 1 waarin het oplosmiddel gekozen wordt uit de groep bestaande uit benzeen, tolueen, o-xyleen, m-xyleen, p-xyleen, chloorbenzeen, o-dichloorbenzeen, m-dichloorbenzeen, p-dichloorbenzeen of mengsels daarvan. 9. Werkwijze volgens conclusie 1 omvattende de reactie van een mengsel van verbinding III-A, verbinding II-A en het optisch actief tertiaire amine in een inert oplosmiddel bij een gekozen temperatuur, de quenching van de reactie bij 50% omzettingsgraad van verbinding III-A, de scheiding van niet-gereageerd hebbend verbinding III-A van verbinding IV-A.