NL8101587A - Zoetstof. - Google Patents

Description

* c a Λ

Zoetstof.

De uitvinding heeft "betrekking op een -weinig ka-riogene zoetstof (dat wil zeggen een zoetstof met weinig of geen neiging tot het veroorzaken van tandafbraak), die oligo-sacchariden omvat, verkregen door reaktie van fruetosyl trans-5 ferase met saccharose en met 1 tot U aan saccharose gebonden fructos emulekulen en op werkwij zei tot het "bereiden en gebruik van de zoetstof.

Saccharose is tot dusver uitgebreid in suikerwerken en voedingsmiddelen toegepast vanwege zijn uitstekende 10 zoetheid, stevige smaak, kristallijnheid, enz. Saccharose kan echter een substraat vormen voor dextran sucrase, dat door intraorale microorganismen wordt geproduceerd en dientengevolge leidt konsumptie van saccharose vaak tot de vorming van onoplosbaar dextran in de mond, zodat de vorming van tandplak wordt j* 15 versneld. Men zegt dan ook dat saccharose kariogeen is.

Het mechanisme van het optreden van tandkariës schijnt de volgende trappen te omvatten: 1. een trap waarbij saccharose in oplosbaar dextran wordt omgezet door de inwerking van dextransucrase, geproduceerd door een kariogeen microorga-20 nisme, bijvoorbeeld Streptococcus Muntans, of iets dergelijks en tegelijkertijd het kariogene microorganisme adsorbeert onder vorming van tandplak en 2. een trap, waarbij fermenteerbare suikers als glucose en saccharose door de microorganismen in het tandplak, dat op het tandoppervlak is afgezet, worden 25 gefermenteerd onder produktie van organische zuren (in hoofdzaak bestaande/melkzuur) die de pH verlagen en een ontkalking veroorzaken.

Polyolen als xylitol en saccharine en synthetische zoetstoffen als cyclamaat en aspartam zijn bekende, weinig 30 kariogene zoetstoffen. Deze zoetstoffen hebben echter nadelen, omdat, bijvoorbeeld, de eerstgenoemde gemakkelijk diarree veroorzaakt en de tweede geen stevige smaak heeft. Er bestaat dan % \81 01587 V f 2 ook behoefte aan een weinig kariogene zoetstof met de uitstekende eigenschappen van saccharose, maar zonder bovengenoemde gebreken.

De uitvinding voorziet nu in een wéinig kariogene 5 zoetstof, die oligosacchariden omvat met 1 tot k aan saccharose gebonden fructosemolekulen.

De uitvinding heeft ook betrekking op een werkwijze voor het bereiden van een wéinig kariogene zoetstof, waarbij men saccharose in aanwezigheid van fructosyltransferase 10 laat reageren.

De uitvinding heeft ook betrekking op een werkwijze voor het bereiden van weinig kariogene voedingsmiddelen (waaronder zowel vast voedsel als dranken) en met name op een werkwijze voor het bereiden van weinig kariogene voedingsmid-15 delen onder gebruikmaking van de nieuwe zoetstof van de uitvinding.

De uitvinding heeft voorts betrekking op een werkwijze voor het bereiden van een weinig kariogene zoetstof, die sorbitol en mannitol bevat, door selektïeve katalystische 20 reduktie van glucose en fructose, die als bijprodukten aanwezig zijn in een oligosaccharidepreparaat, dat is verkregen door saccharose in aanwezigheid van fructosyltransferase te laten reageren en oligosacchariden met 1 tot U aan saccharose gebonden fructosemolekulen, niet gereageerde saccharose, glu-25 cose en fructose bevat.

Er werd gevonden, dat olisacchariden, verkregen door reaktie van saccharose in aanwezigheid van fructosyltransferase en in het bijzonder oligosacchariden , waarin 1 molekuul fructose aan saccharose is gebonden (in het vervolg aangeduid 30 als GF^), 2 molekulen fructose aan saccharose zijn gebonden (in het vervolg aangeduid als GF^), 3 molekulen fructose aan saccharose zijn gebonden (in het vervolg aangeduid als GF^), of 5 molekulen fructose aan saccharose zijn gebonden (in het vervolg aangeduid als GF^), nagenoeg geen effekten vertonen 35 van dextransucrase, dat door intraorale microorganismen (bijvoor- & \ 8101587 * * 3 beeld Streptococcus Mutans) geproduceerd is en de door dextran-sucrase veroorzaakte vorming van onoplosbaar dextran uit saccharose vermindert. De oligosacchariden GF^s GF^, GF^ en GF,_ van de uitvinding kunnen worden gewonnen en gezuiverd door bij-5 voorbeeld koolchromatografie (bijvoorbeeld chromatografie met aktieve poederkool), ionenuitwisselingschromatografie, enz., vanuit het suikermengsel verkregen door reaktie van fructosyl-transferase met saccharose. Uit praktisch oogpunt gebruikt men echter bij voorkeur het oligosaccharide mengsel als zodanig.

10 Het suikermengsel bevat ook enige niet gereageerd hebbende saccharose, oligosacchariden GF,,, GF^, enz., geproduceerd door de overdraehtsreaktie en de bijprodukten van glucose en fructose, geproduceerd als bijprodukten van de reaktie.

Dit suikermengsel vertoont echter ook de effekten 15 van dextransucrase, geproduceerd door intraorale mieroorganismen, maar vanwege de aanwezigheid van de oligosacchariden wordt het onoplosbare dextran in mindere hoeveelheid geproduceerd.

Dit wordt toegeschreven aan het feit, dat de oligosacchariden GF^, GF^, enz. in weerwil van de aanwezigheid 20 van saccharose vorming van onoplosbare dextranen uit saccharose onderdrukken en het onoplosbare dextran niet geproduceerd wordt uit de oligosacchariden GFg, GF^, enz..

Aldus produceert een mengsel of preparaat, dat oligosacchariden bevat met 1 tot 4 aan saccharose gebonden 25 fruetosemolekulen minder onoplosbaar dextran, waarvan men aanneemt, dat het een hoofdoorzaak van tandkariës is en de oligosacchariden GF^, GF^, enz. onderdrukken vorming van dextran uit saccharose.

Bovendien heeft het preparaat van de uitvinding 30 uitstekende eigenschappen als zoetstof, zoals een goede zoetheid, een juiste stevige smaak, een goede vochtretentie, enz., naast een geringe kariogene werking.

Het preparaat vertoont in het bijzonder een zoetheid van 60 tot 80, wanneer men de zoetheid van saccharose op 35 100 stelt en heeft een specifiek aroma. De zoetheid wordt

J

I 8101587 t * k beoordeeld volgens de Threshold methode, beschreven in Sweeteners and Dental Caries, geschreven door J.H.Shaw, blz. k5» Information Retrieval Incorporation. Ook worden GF^, GF^ 5 enz. bij verwerking moeilijk gekleurd, · omdat zij geen 5 reducerende suikers zijn. Voorts vertoont deze zoetstof ongeveer dezelfde viscositeit en osmotische druk als saccharose en zij is niet kristallijn. Wanneer men haar dan ook vermengt, met saccharose, vruchtensuiker, lactose, enz. , kan dit kristal-li s at i «^inhibit er en. Deze eigenschap wordt in de praktijk voor-10 delig geacht. Ook vertoont deze zoetstof ongeveer dezelfde vriespuntsverlaging als saccharose en heeft zij uitstekende vochtretentie eigenschappen.

Als bovenbeschreven heeft deze zoetstof verschillende eigenschappen, die voor konventionele zoetstoffen vereist 15 zijn en men kan haar dan ook in elk voedingsprodukt gebruiken inplaats van de konventionele zoetstoffen als suiker, met zuur versuikerde tarwegluten, geisomeriseerde suiker, enz. en het daarbij verkregen voedingsprodukt is dan minder kariogeen dat een voedingsprodukt, dat met de gebruikelijke zoetstoffen is 20 verkregen.

Als boven beschreven is het preparaat, dat oligo-sacchariden bevat met 1 tot ij- aan saccharose gebonden fructose-molekulen (in het vervolg aangeduid als weinig kariogene zoetstof) een minder tandkariës veroorzakend zoetstofpreparaat.

25 De uitvinding heeft ook betrekking op een werk wijze voor het op technische schaal produceren van deze weinig kariogene zoetstof, waarbij men de zoetstof verkrijgt door re-aktie van saccharose in aanwezigheid van fructosyltransferase.

Het fructosyltransferase werkt op de saccharose 30 hoofdzakelijk in onder verbreking van de β-1,2-binding tussen fructose en glucose en brengt de resulterende fructose over naar saccharose onder verkrijging van GF^ en brengt verder fructose over naar GF^ onder vorming van GF^· Het verschilt van inulosucrase ]_ 2.k. 1.9_/ en levansucrase J_ 2Λ. 1.10_/ beschre-( J 35 ven in Enzyme Nomenclature (Academic Press, 1978), omdat de \ 8101587 f \ 5 reaktieprodukten oligosacchariden zijn, waarin fructose aan saccharose is gebonden, zoals GF^, GF^, enz..

Bronnen voor het enzyme zijn microorganismen als fungi j_ bijvoorbeeld genus Aspergillus (Aspergillus niger ACE-5 2.1. ATCC 20612, enz.), genus Penicillium (Penicillium nigricans, enz.), genus Fusarium (Fusarium lini IAM 5008, enz.), genus Gloeosporium (Gloeosporium kaki IAM 5011, enz.), enz._/ en gisten bijvoorbeeld _/genus Saccharomyces (Saccharomyces cerevi-siae, enz.), genus Rhodotorulla (Rhodotorulla glutinis, enz.), 10 genus Pichia (Pichia miso, enz.), genus Hansenula (Hansenula miso, enz.), genus Candida (Candida tropicalis. enz.), Aureobasidium pullulans var. melanigenum A-8, ATCC 20612_/ en plantaardig geproduceerde enzymen, bijvoorbeeld uit Asparagus officinalis, Helianthus tuberosus L., enz. Fructosyltransferase 15 kan uit microorganismen worden verkregen door het microorganis-me bij een voor het microorganisme optimale temperatuur, bijvoorbeeld 25-30°C, gedurende 2h uur tot 96 uur te kweken onder gebruikmaking van een bekend geschikt medium, bijvoorbeeld een medium, dat 5*0 % saccharose, 1,0 % pepton, 0,7 % vleesextrakt 20 en 0,3 % ïïaCl bevat en na voltooiing van de kweek de micro-organismecellen af te filtreren of af te centrifugeren onder verkrijging van een cultuurfiltraat. Men kan gebruik maken van het filtraat zelf of van enzyme, dat is verkregen door het filtraat op bekende wijze te zuiveren, bijvoorbeeld door ultra-25 filtratie, uitzouting (dat wil zeggen waarbij zout en andere verontreinigingen worden verwijderd) met natriumsulfaat, op-losmiddelprecipitatie, gelfiltratie of ionenuitwisseling.

Enzyme van plantaardige oorsprong kan worden verkregen door planteweefsel te vernietigen, bijvoorbeeld door het 30 te vermalen en het enzyme te extraheren. Men kan gebruik maken van het ruwe extrakt zelf of van het enzyme, verkregen door zuivering van het extrakt op bekende wijze (bijvoorbeeld etha-nolprecipitatie, uitzouting met (M^^SO^, enz.).

De weinig kariogenezoetstof kan daarna worden 35 verkregen door saccharose te laten reageren in aanwezigheid \ 8101587 6 van het aldus verkregen enzyme. Het is gebleken, dat daarbij de volgende omstandigheden de voorkeur verdienen. Men stelt de saccharoseconcentratie bij de overdrachtsreaktie in het algemeen in op 5 tot 70 gew.% en bij voorkeur op 30 tot 60 5 gev.%. De pH en de reaktietemperatuur bedragen in het algemeen respektievelijk 1+,0 tot 7*0 en 25 tot 65°C, bij voorkeur 50 tot 60°C, hoewel, afhankelijk van de oorsprong van het enzyme, de omstandigheden, die de meeste voorkeur verdienen, kunnen variëren. Per gram saccharose gebruikt men 5 tot 200 eenheden 10 en bij voorkeur 20 tot 80 eenheden enzyme. De hoeveelheid enzyme wordt hier uitgedrukt in "eenheden”, waarbij men als 1 eenheid een hoeveelheid enzyme neemt met een aktiviteit, die 1 ymol glucose per 2,5 ml reaktieoplossing oplevert, wanneer men de reaktie uitvoert door 0,5 ml enzymeoplossing toè te 15 voegen aan 1,0 ml 5l saccharoseoplossing en 1,0 ml bufferop-lossing met pH 5j0, gevolgd door 60 minuten reaktie bij 1+0°C.

Ha voltooiing van de overdrachtsreaktie wordt het reaktiemengsel op 100°C verhit teneinde het enzyme te deaktiveren, met aktieve kool ontkleurd, met een ionenuitwis-20 selende hars ontzouten en geconcentreerd onder verkrijging van het eindprodukt. Analyse van de samenstelling van de ‘overdrachtsreaktie kan bijvoorbeeld worden uitgevoerd door grote snelheidsvloeistofchromatografie onder gebruikmaking van een Microbondapack CH kolom(van Waters Associates Incorporation) 25 en azijnzuurnitril/water (volumeverhouding 80/20) als oplosmiddel.

De aldus verkregen weinig kariogene zoetstof heeft bij een goed voorbeeld de volgende samenstelling: 28 gew. % glucose, 2 gev.% fructose, 11 gew.% saccharose, 28 gev.% 30 GFg, 25 gev.% GF^, 5 gev.% GF^ en 1 gev.% GF^. De samenstelling van het suikerpreparaat varieert sterk met de reaktieomstandig-heden.

Voorbeelden van oligosacchariden met de formule GF2 zijn Ο-β-D-fructofuranosy1-(241)-0-3-fructofuranosy1-(241)- 8101587 ·» « τ -α-D-glucopyranosi de, Ο-β-D-fructofuranosyl- (2*6) -Ο-β-glucopyra-nosyl-(1*2)-6-D-fructofuranoside, Ο-β-fructofuranosyl-(2->1 )-a-D-glucopyranoside, enz. Voorbeelden van oligosacchariden met de formule GF^ zijn Ο-β-D-fructofuranosyl- (2-V1 -0-B.-D-fruct ofu-5 ranosy^/g *1 )-a-D-glucopyranoside, 0-B-D-fructofuranosyl-(2}6)-0-/_6-D-fructorfuranosyl- (2*2_)/-O-a-D-glucopyranosyl- (1»2)-β-D-fructofuranoside, enz.. Voorbeelden van oligosacchariden met de formule GF^ zijn Ο-β-D-fructofuranosyl-(2-5»/1 -Ο-β-D-fructofu-ranosyl-2^^1 )-a-D-glucopyranoside enz.. Voorbeelden van oligo-10 sacchariden met de formule GF^ zijn 0-B-D-fructofuranosyl-(2* [\-0-6-D-fructofuranosyl-2_/^-»1 )-a-D-glucopyranoside, enz..

De effekten van de zoetstof van de onderhavige uitvinding en de effekten van de afzonderlijke bestanddelen GFg, GF^, GF^ en GF^ zullen nader worden beschreven.

15 Tabel A in onderstaand proefvoorbeeld I toont de hoeveelheden onoplosbaar dextran, die werden verkregen uit GFg, GF^j GF^ en GF^ onder gebruikmaking van dextransucras e, verkregen door het kweken van Streptococcus Mutans, ATCC 25175 stam, vergeleken bij het resultaat met saccharose. Als uit de 20 tabel blijkt wordt uit GF^, GF^, GF^ en GF^ geen onoplosbaar dextran verkregen.

De resultaten van het onderzoek naar de vraag of GFg en GF^ wel of niet de produktie van onoplosbaar dextran uit saccharose door dextransucras e onderdrukken, zijn samen-25 gevat in tabel B van onderstaand proefvoorbeeld II. Als uit tabel B blijkt , werd gevonden, dat GF^ en GF^ de produktie van onoplosbaar dextran uit saccharose onderdrukken.

Tabel D in onderstaand proefvoorbeeld III toont de hoeveelheid onoplosbaar dextran , die werd verkregen uit 30 het zoetstof preparaat, dat onder andere omstandigheden werd bereid en dan ook een andere samenstelling heeft, vergeleken bij het resultaat met saccharose. Als duidelijk uit de tabel blijkt , leverden de overdrachtpreparaten kleinere hoeveelheden onoplosbaar dextran op dan saccharose. Het verdient de bijzon-35 dere voorkeur, dat de totale gewichtshoeveelheid van de

A

* 8101587 * 8 oligosacchariden GF^, GF^, GF^, enz. tweemaal zoveel of nog meer bedraagt dan de gewichtshoeveelheid vrije saccharose in het zoetstofpreparaat. Wanneer de gewichtsverhouding van de totale hoeveelheid oligosacchariden tot de hoeveelheid vrije 5 saccharose tenminste 2,0/1 bedraagt, is de geproduceerde hoeveelheid onoplosbaar dextran 50% of minder dan de onder gebruikmaking van saccharose geproduceerde hoeveelheid, zodat dergelijke preparaten de bijzondere voorkeur verdienen.

Als reeds gezegd produceert een mengsel of pre-10 paraat, dat de oligosacchariden bevat, waarin 1 tot k molekulen fructose aan saccharose zijn verbonden, minder onoplosbaar dextran, dat de hoofdoorzaak van tandkariës is en de oligosacchariden GFg, GF^, enz. onderdrukken de dextranvorming uit saccharose.

15 Een dergelijk suikerpreparaat vertoont niet de effekten van dextransucrase, die door Streptococcus Mutans, enz. en zodoende wordt er geen onoplosbaar dextran geproduceerd als het suikerpreparaat wordt gekonsumeerd en in die zin is het preparaat minder kariogeen. Hoewel echter oligosacchariden 20 als GFg,- GF^, enz. , in het preparaat nagenoeg niet gefermenteerd worden door het microorganisme Streptococcus Mutans, enz. en daaruit dus slechts kleine hoeveelheden organische zuren worden geproduceerd, kunnen niet gereageerd hebbende saccharose en glucose en fructose,.die als bijprodukten bij de overdrachts-25 reaktie worden gevormd, in organische zuren worden omgezet. Aldus levert het suikerpreparaat vergeleken bij saccharose een kleinere hoeveelheid organisch zuur op, maar voldoet nog niet geheel.

Er werd echter ook gevonden, dat glucose en fruc-30 tose slechts in een kleine hoeveelheid in het preparaat voorkomen en selektief in sorbitol en mannitol kunnen worden omgezet door katalytische reduktie van het suikerpreparaat, dat is verkregen door reaktie van saccharose in aanwezigheid van fruc-tosyltransferase, onder specifieke omstandigheden en dat de 35 hoeveelheid melkzuur, die uit het aldus verkregen zeetstofpre-

H

* 81015 8 7 Λ * 9 paraat wordt geproduceerd door de inwerking van mieroorganismen slechts ongeveer 20# bedraagt van de door saccharose geproduceerde hoeveelheid. (Zie proefvoorheeld IV.) Dat wil zeggen dat de uitvinding ook betrekking heeft op een werkwijze voor 5 het bereiden van een nieuwe zoetstof, die sorbitol en mannitol bevat, waarbij men saccharose in aanwezigheid van fructosyl-transferase laat reageren onder verkrijging van een suikeroplossing, die glucose, fructose, saccharose en oligosacchariden met 1 tot k aan saccharose gebonden fructosemolekulen bevatten 10 en deze suikeroplossing aan katalytische reduktie onderwerpt onder handhaving van de pH van de oplossing op 7 tot 9·

Er werd in het bijzonder gevonden, dat glucose en fructose selektief worden gereduceerd onder verkrijging van sorbitol uit glucose en sorbitol en mannitol uit fructose, zonder 15 dat daarbij de oligosacchariden GF^, GF^, GF^, enz., worden ontleed, door bijvoorbeeld dinatriumwaterstoffosfaat aan de oplossing in water van bovenbeschreven suikerpreparaat toe te voegen teneinde de pH van deze oplossing op 7 tot 9 in te stellen en het mengsel in aanwezigheid van, berekend op de vaste 20 stoffen 3 tot 10$ nikkelkatalysator (Raney nikkel, nikkelformiaat, nikkel-op-biatomeenaarde, enz.) bij 50 tot 130°C onder een waterstofdruk van 50 tot 120 kg/cm roeren teneinde de reduktie-reaktie uit te voeren. Van de reaktieomstandigheden is de pH-instelling bijzonder belangrijk. Als de katalytische reduktie 25 bijvoorbeeld bij een pH van 6 of minder wordt uitgevoerd, worden de oligosacchariden GF^, GF^, GF^, enz. ontleed tot grote hoeveelheden sorbitol en mannitol en dus voert men de selektieve reduktie van glucose en fructose bij voorkeur bij een pH van 7 tot 9 uit.

30 Een goed voorbeeld van een aldus verkregen zoet- stofpreparaat bevat 37# sorbitol, 2# mannitol, 10# saccharose, 22# GFg, 22# GF^ en 7# GF^. Als uit proefvoorheeld IV blijkt, werd aangetoond, dat de hoeveelheid melkzuur, die uit het preparaat geproduceerd wordt onder inwerking van Streptococcus 35 Mutans, veel minder is dan uit saccharose of uit het suikerpre- \81015 8 7 10 paraat, dat is verkregen door reaktie van fructosyltransferase met saccharose.

Als hoven beschreven is het zoetstofpreparaat van de uitvinding, dat sorbitol, mannitol, de oligosacchariden 5 GFg, GF^, GFjj, enz. en een geringe hoeveelheid saccharose bevat, een slecht substraat voor dextransucrase, dat wordt geleverd door Streptococcus Mutans en zodoende staat het produktie van onoplosbaar dextran slechts in kleine hoeveelheden toe. Bovendien vermindert de geringere gevoeligheid van het preparaat 10 voor fermentatie door Streptococcus Mutans de hoeveelheid kariogeen melkzuur, die wordt geproduceerd.

Aldus is het preparaat een zoetstof met sterk antikariogene eigenschappen.

15 Proefvoorbeeld I.

Men kweekte Streptococcus Mutans ATCC 25175 onder anaerobe omstandigheden onder gebruikmaking van een glucose en triptocase bevattend medium en na afscheiding van de cellen 20 van het microorganisme werd het filtraat geconcentreerd en gezuiverd door ultrafiltratie ter bereiding van dextransucrase.

Daarna vermengde men 1,0 ml 1$ suikeroplossing, 1,5 ml 0,6f· M fosfaat buff er oplos sing (pH 7>0) en 0,25 ml 25 bovenbeschreven enzymeoplossing en liet het geheel k uur bij 37°C reageren. Het aldus geproduceerde in water onoplosbare dextran werd geprecipiteerd en gewonnen door centrifugering bij 3000 omwentelingen per minuut. Het precipitaat werd twee maal gewassen, telkens met 5 ml 70$ ethanol, opgelostr.in 2,5 ml 30 1 M kaliumhydroxydeoplossing en onderworpen aan de fenol- zwavelzuurmethode ter bepaling van de dextranopbrengst. Daarna gebruikte men als suikeroplossing respektievelijk 1$ oplossingen van GFg, GF^, GF^ en GF^. Als GF^, GF^, GF^ en GF^ gebruikte men frakties, die waren gezuiverd, door een suikerpreparaat 35 (verkregen door reaktie van saccharose in aanwezigheid van \ 8101587 11 fruetosyitransferase) te onderwerpen aan koolchromatografie (onder gebruikmaking van aktieve poederkool) onder verkrijging van één enkele vlek "bij dunnelaag chromatografie. De aldus verkregen resultaten zijn weergegeven in talel A.

5

Talel A

Dextran oplrengst in

Monster reaktieonlossing.

(Y)

Saccharose 7^0 gf2 0 gf3 0 GFh 0 GF^ 0 15 5

Als uit talel A Hij kt, werd geen dextran verkregen uit GFgj GF^, GF^ en GF^.

Proefvoorleeld II.

20

In dit voorleeld werd onderzocht of GF^ en GF^ al of niet de produktie onderdrukten van onoploslaar dextran uit saccharose, wanneer saccharose in aanwezigheid van GF2 en GF_ wordt blootgesteld aan dextransucrase, dat lereid is 25 ^ volgens proefvoorleeld I. De verdere reaktieomstandigheden waren als volgt: 1,0 ml van elke suikeroplossing (die de suiker bevatte als aangegeven in talel B), 1,5 ml 0,67 M fosfaatluffer- oplossing (pH 7S0) en 0,25 ml enzymeoplossing werden met elkaar vermeng! en ^ uur lij 37°C in reaktie gebracht. In de reaktie-30 oplossing verkregen onoploslaar dextran werd op dezelfde wxjze bepaald als in proefvoorleeld I.

35 | 8101587 12

Tabel B

Suikergehalte in Hoeveelheid in reaktieoplossing reaktieoplossing verkregen déxtran (y) ^ Saccharose 10 mg 740 (100)

Saccharose 10 mg+GFg 30 mg 300 ( 4θ)

Saccharose 10 mg+GF^ 30 mg 350 ( 47)

De getallen tussen haakjes in tahel B geven de 10 indices aan van de hoeveelheden onoplosbaar dextran, -wanneer men de uit saccharose verkregen hoeveelheid op 100 stelt.

Proefvoorbeeld III.

15 ' Men bereidde zoetstoffen van de volgende samen stellingen door saccharose onder verschillende omstandigheden te laten reageren met fructosyltransferase.

Tabel C

20 Έ

No. Fructose Glucose Saccharose GF^ GF^ GF^ GF^ Ratio 1 — 5,9 81,9 12,2......15,0 2 — 13,7 58,5 27,8 ......47,5 25 3 — 17,4 41,8 35,7 5,0 — — 97,0 4 — 23,5 23,9 41,2 11 ,4— — 220 5 — 28,4 14,9 39,2 17,4— — 380 6 0,8 31 ,5 11 ,0 26,4 25,1 5,0— 514 7 0,9 31,6 10,0 23,5 24,1 7,0 29 575 30 GF- + GF + GF. + GF (*) * —é-2---2.- x 100 vrije saccharose {%)

De hoeveelheden onoplosbaar dextrine, die werden /fi| oc verkregen uit bovenbeschreven suikerpreparaten werden op dezelf- «l 35 8101587 13 de wijze gemeten als in voorbeeld I onder verkrijging van de resultaten weergegeven in tabel D.

Tabel D 5

In reaktieoplossing verkregen

Monster _dextran_ (¾) ï

Saccharose U90 (100)

Suiker no. 1 U36 (89)

Suiker no. 2 298 (61)

Suiker no. 3 289 (59)

Suiker no. U 201 (1+1)

Suiker no. 5 1^2 (29)

Suiker no. 6 Ut ( 9)

Suiker no. 7 4θ ( 8) 3E De getallen tussen haakjes geven de indices aan van de hoeveelheden onoplosbaar dextran, wanneer men die van saccharose 2Q op 100 stelt.

Proefyoorbeeld IV.

Men kweekte Streptococcus Mutans Serotype C 2^ anaëroob onder gebruikmaking van een medium, dat 0,27 % maltose, 0,01 ¾ L-eysteine hydrochloride , 0,1¾ natrium L-gluta-maat, 0,2¾ NH^PO^, 0,02¾ MgSO^.T^O, 0,001¾ Had, 0,01¾ MnSO^, en 0,01¾ FeSO^.7-^0 bevatte. Daarna werden de cellen van het microorganisme afgecentrifugeerd en vervolgens gedispergeerd 2q in een 0,05 M fosfaatbuffer in een concentratie van 10 mg/ml.

0,9 ml 0,2 M fosfaatbuffer, 0,1^ ml 22,5 mM MgCl2, 0,2 ml 1,7¾ suikeroplossing en 0,5 ml celdispersie werden vermengd en ter reaktie 30 minuten bij 37°C geschud. Daarna werd het mengsel 15 minuten gekookt teneinde de reaktie te onderbreken en „ na afcentrifugering van de cellen bepaalde men melkzuur in de φ \ 81 01 587 X * r

1U

bovenstaande vloeistof volgens een enzymatische methode.

Tahel E

5 Melkzuur Produktie-

Substraat μ mol/Reaktieoplossing verhouding

Saccharose 16,8 100

GF 8,0 bS

10 ®3 °’1 0

Preparaat-1 12,β 75

Preparaat-212 3,7 22 * Preparaat-1: (suikerpreparaat verkregen door reaktie van saccharose met fructosyltransferase)

Glucose 37$

Fructose 2$

Saccharose 10$ GF2 22% 20 GF3 23% GFj^ 6% Y 81015 87

Preparaat-2: (door katalytische reduktie verkregen preparaat)

Sorbitol 38%

Mannitol 1$

Saccharose 10$ GF2 22$ GF3 23$ 30 «

Voorbeeld I.

Men goot 10 ml porties BS medium, dat 5,0$ saccha-35 rose, 1,0 $ pepton, 0,7$ vleesextrakt en 0,3$ KaCl bevatte 15 respektievelijk uit in twee proefbuisjes en na 30 minuten steriliseren bij 120°C entte men elk vein de media met een platina draadlus Aspergillus niger ACE-2-1, ATCC 20611 en weekte 2h uur bij 28°C.

5 10 ml porties van de resulterende kweekoplossing werden respektievelijk toegevoegd aan 2 Erlenmeyer-kolven, die 200 ml BS medium (30 minuten gesteriliseerd bij 120°C ) bevatten en voerde gedurende 2k uur een schudkultuur uit bij 28°C ter voorkultivering.

10 20 1 BS medium werd in een 30 ml fermenteerbad gebracht en na 30 minuten sterilisatie bij 120°C afgekoeld en geënt met kOQ ml bovengenoemde kultuuroplossing. De kweek werd 72 uur bij 28°C bij 300 omwentelingen per minuut uitgevoerd. Na voltooiing van de kweek werden de cellen afgefiltreerd 15 onder verkrijging van 20 1 kultuurfiltraat. 20 1 van dit filtraat werd geconcentreerd en door ultrafiltratie gezuiverd onder verkrijging van 2 1 enzymeoplossing met een enzymeaktiviteit van 2k0 eenheden/ml.

Men voegde 6,7 1 water toe aan 10 kg saccharose 20 teneinde een oplossing te verkrijgen en na instelling van de pH op 5,0 voegde men het enzyme toe in een hoeveelheid van ^8 eenheden per gram saccharose en voerde de overdrachtsreaktie k8 uur bij 50°C uit. Na voltooiing van de overdrachtsreaktie werd het reaktiemengsel 15 minuten op 100°C verhit teneinde 25 het enzyme te deaktiveren waarna men ter ontkleuring aktieve kool toevoegde in een hoeveelheid van 0,5 % , berekend op de vaste stoffen. Na verwijdering van de aktieve kool behandelde men de oplossing met de ionenuitwisselende harsen Amberlite IR.120B en Amberlite IRA.Ul1, en concentreerde tot 30 75 gew.$ onder verkrijging van 12 kg weinig kariogene zoetstof.

De aldus verkregen zoetstof had de volgende suikersamenstelling: 2&fo glucose, 2% fructose, 18$ saccharose, U055 GF2 en ïk % GF3- 'Λ 35 »v 8101587 * \ 16

Voorbeeld II.

Men kweekte Fusarium lini IAM 5008 op dezelfde wijze als in voorbeeld II onder verkrijging van 20 1 kultuur-5 oplossing. Deze oplossing werd geconcentreerd en door ultrafiltratie gezuiverd onder verkrijging van 2 1 enzymeoplossing met een enzymeaktiviteit van 200 eehhe.den/ml.

Men voegde 7 1 water toe aan 3 kg saccharose en na instelling op pH 6,0 voegde men het enzyme toe in een hoe-10 veelheid van 16 eenheden per gram saccharose, waarna men de overdrachtsreaktie 2h uur bij 50°C uitvoerde. Ha voltooiing van de reaktie werd de oplossing 15 minuten op 100°C verhit teneinde het enzyme te deaktiveren en men voegde ter ontkleuring aktieve kool toe in een hoeveelheid van 0,5%, berekend op de 15 vaste stoffen. Daarna werd de oplossing ontzouten met een ionenuitwisselende hars en geconcentreerd tot 75 gew.% onder verkrijging van 3,7 kg weinig kariogene zoetstof.

De aldus verkregen zoetstof had een suikersamen-stelling van : 38,2% glucose, 7,8% fructose, 17,2% saccharose, 20 25,¾% GFg en 11,¾% GF^

Voorbeeld III.

Men kweekte Gloeosporium kaki IAM 5011 op dezelfde 25 wijze als in voorbeeld I onder verkrijging van 20 1 filtraat.

Dit filtraat werd geconcentreerd en door ultrafiltratie gezuiverd onder verkrijging van 1,5 13enzymeoplossing met een enzymeaktiviteit van 200 eenheden/ml.

Men voegde 7 1 water toe aan 3 kg saccharose 30 onder verkrijging van een oplossing en na instelling van de pH op 6,0 voegde men het enzyme toe in een hoeveelheid van 20 eenheden per gram saccharose, waarna men de overdrachtsreaktie 2h uur bij 50°C uitvoerde. Ha voltooiing van de reaktie werd de oplossing op dezelfde wijze als in voorbeeld I ontkleurd 35 en ontzouten en geconcentreerd tot 75 gew.% onder verkrijging \

81 0 1 5 87 X

17 van 3s8 kg weinig kariogene zoetstof.

De aldus verkregen zoetstof had een suikersamen-stelling van: 25$ glucose, 9$ fructose, 36$ saccharose, 2k% GF2 en 6$ GF .

5 Voorbeelden van het toepassen van de zoetstof op verschillende voedingsmiddelen en dranken worden onder gegeven.

Voorbeeld IV.

10

Bereiding van hard snoepgoed.

Een weinig kariogene zoetstof met een suikersamen-stelling van 37$ glucose, 2% fructose, 10$ saccharose, 22$ GFg, 15 23$ GF^ en 6$ GF^ (watergehalte 25 gew.$) werd in vacuum ge concentreerd tot een definitief watergehalte van 8 tot 10 gew.

$ en na afkoeling tot 80°C werden een aroma en een eetbare kleurstof toegevoegd, waarna het geheel uitgegoten en bij kamertemperatuur werd af gekoeld onder verkrijging van hard snoepgoed. 20 Dit snoepgoed vormde geen suikerkristallen zoals bij snoepgoed, dat vervaardigd is onder gebruikmaking van suiker en was weinig kariogeen.

Voorbeeld V.

25

Bereiding van oranje-marmelade.

200 g sinaasappelvlees werd toegevoegd aan 90 g sinaasappelschillen, die een nacht in 3$ natriumchlorideoplos-30 sing in water hadden gelegen ter verwijdering van de bittere smaak, waarna men ter verwijdering van zout met water waste en 20 minuten kookte. Na toevoeging van 370 ml water werd het mengsel 30 minuten ingekookt terwijl men 320 gr weinig kariogene zoetstof toevoegde van dezelfde suikers amenstelling als 35 in voorbeeld IV (watergehalte 25 gew.$). De verkregen oranje-

Cf Λ 8101587 18 marmelade had een suikergehalte van 65 g&w.%. Het produkt had een aangename verfrissende zure sinaasappelsmaak.

Voorbeeld VI.

5

Bereiding van zoete pasta van gestoomde bonen.

12 gr agar agar werd 3 uur in water geweekt en na verwijdering van water fijngemalen. Daarna voegde men 260 ml 10 water toe en verhitte teneinde een oplossing te verkrijgen. Vervolgens voegde men 960 g..· weinig kariogene zoetstof toe met dezelfde suikersamenstelling als in voorbeeld IV (watergehalte 25 gew.%) en filtreerde, waarna de agar-agar geheel was opgelost. Men plaatste dit agar agar mengsel op het vuur en voegde 15 500 g rauwe bonenpasta toe en kneedde, waarna men inkookte tot een suikergehalte van 70 tot 71 %·, uitgoot in een doos en liet verstarren onder verkrijging van een zoete pasta van gestoomde bonen. Het produkt was weinig kariogeen.

20 Voorbeeld VII.

Bereiding van konsumptie-ijs.

Men gebruikte 10 delen magere melk, 75*5 delen 25 water, 0,25 delen stabilisator, 0,25 delen emulgator, 1 ij· delen weinig kariogene zoetstof met dezelfde suikersamenstelling als voorbeeld II en een geschikte hoeveelheid aroma voor het bereiden van een konsumptie-ijs mengsel. Ha filtratie werd het mengsel 30 minuten bij 70°C gesteriliseerd en daarna afgekoeld. Ha 30 6 uur rijpen bij 3 tot 5°C.werd de temperatuur onder roeren ter bevriezing verlaagd. Aldus bereidde men konsumptie-ijs. Aangezien de weinig kariogene zoetstof ongeveer dezelfde vriespunt-verlaging vertoonde, had het verkregen konsumptie-ijs een goede vormretentie, vergeleken bij gebruik van suiker.

35 ^ 81015 8 7 19

Voorbeeld IIX.

Vervaardiging van biscuits.

5 Men bereidde deeg uit 1kg tarwebloem, 100 g.

maïszetmeel, 333 gr weinig kariogene zoetstof met dezelfde suikersamenstelling als voorbeeld IV (watergehalte 25 gew.%), 125 g margarine, 5 g·' natriumchloride, 2,5 g natriumcarbonaat, 8,8 g ammoninmcarbonaat, 6,3 g- sojaleehitine, T5 g ei, 6,3 10 g- vanilleolie en 267 g water, waarna men het deeg nadat het had gerezen vormde en bakte tot biscuits. De toestand van het deeg was hetzelfde als bij gebruikmaking van suiker en de biscuits hadden een goed volume en een goede bakkleur vergeleken bij gebruik van suiker.

15

Voorbeeld XI.

Bereiding alkoholvrije drank.

20 1,5 delen citroenzuur en 970 delen water werden toegevoegd aan 133 delen weinig kariogene zoetstof met dezelfde suikersamenstelling als voorbeeld IV (watergehalte 25 %) onder verkrijging van een oplossing, waaraan men een kleurstof en een aroma in de juiste hoeveelheden toevoegde. Daarna werd 25 het mengsel van. koolzuur voorzien. Aldus verkrijgt men een weinig kariogene alkoholvrije drank, die slechts de weinig kariogene zoetstof bevat.

Voorbeeld X.

30

Bereiding van kauwgom.

75 delen weinig kariogeen zoetstofpoeder met dezelfde samenstelling als voorbeeld IV en 22 delen chicle^rubber 35 werden opgelost en vermengd. Daarna werden een aroma en mental \ 8101587 \\ ___ ï * 20 toegevoegd en werd het mengsel gekneed. Nadat het mengsel in een walsmolen tot de definitieve dikte was gewalsd, werd het gewalste produkt gesneden en gedroogd tot platen gom. Dit gom was weinig kariogeen, omdat slechts de weinig kariogene zoetstof was 5 gebruikt.

Voorbeeld XI.

Bereiding van chocolade.

10 100 delen bittere chocolade, 116 delen weinig kariogene zoetstöfpoeder met dezelfde samenstelling als voorbeeld IV, 23 delen cacaoboter, 90 delen melkpoeder en kleine hoeveelheden vanille en lechitine werden op de gebruikelijke wijze 15 tot chocolade verwerkt. Deze chocolade had een verfijnde smaak en gaf hetzelfde aroma als bij gebruik van suiker.

Voorbeeld XII.

20 Bereiding van gekonserveerd voedsel, ingekookt in sojasap._ 1 liter sojasap en 900 g weinig kariogene zoetstof van dezelfde suikers amenstelling als in voorbeeld IV werden 2^ vermengd en ingekookt. Daarna voegde men 800 g fijngehakte mosselen en 50 g. gember toe en kookte Uo tot 6θ minuten in drijvende toestand onder verkrijging van gekonserveerde fijngehakte mossel, ingekookt in sojasap met een goede kleur en smaak.

2o Voorbeeld XIII.

Bereiding van gekonfijte kastanjes.

De basten van kastanjes werden verwijderd, waarna men de geschilde kastanjes 8 tot 10 uur kookte. Daarna werd de \ 8101587 21 bittere huid verwijderd en werd kO% hete oplossing van weinig kariogene zoetstof van dezelfde suikers amenstelling als in voorbeeld IV erop uitgegoten. Na 1 dag staan goot men over het geheel een # suikeroplossing uit waarna men weer een dag 5 liet staan. Op dezelfde wijze werd de concentratie van de suikeroplossing verhoogd tot 70# ter bereiding van gekonfijte kastanjes. Aangezien de osmotische druk van de weinig kariogene zoetstof hetzelfde was als die van suiker, verkreeg men goede produkten.

10

Voorbeeld XIV.

Men goot 10 ml porties BS medium, dat 5,0# saccharose, 1,0# pepton, 0,7# vleesextrakt en 0,3# UaCl bevatte 15 respektievelijk uit in twee proefbuisjes en na 30 minuten steriliseren bij 120°C entte men elk van de media met een platina draadlus Aspergillus niger en weekte 2b uur bij 28°C.

10 ml porties van de resulterende kweekoplossing werden respektievelijk toegevoegd aan 2 Erlenmeyer-kolven, 20 die 200 ml BS medium (30 minuten gesteriliseerd bij 120°C) bevatten en voerde gedurende 2b uur een schudkultuur uit bij 28°C ter voorkultivering.

20 1 BS medium werd in een 30 ml fermenteerbad gebracht en na 30 minuten sterilisatie bij 120°C afgekoeld 25 en geënt met U00 ml bovengenoemde kultuuroplossing. De kweek werd 72 uur bij 28°C bij 300 omwentelingen per minuut uitgevoerd. Na voltooiing van de kweek werden de cellen afgefiltreerd onder verkrijging van 20 1 kultuurfiltraat. 20 1 van dit filtraat werd geconcentreerd en door ultrafiltratie gezuiverd onder 30 verkrijging van 2 1 enzymeoplossing met een enzymeaktiviteit van 2^0 eenheden/ml.

Men voegde 3,3 1 water toe aan 5 kg saccharose onder verkrijging van een oplossing en na instelling van de pH op 6,0 voegde men de enzymeoplossing toe in een hoeveelheid van 35 60 eenheden/g saccharose, waarna men de overdrachtsreaktie ' 8101587 c 22 72 uur "bij 50°C uitvoerde. Na voltooiing van de overdrachts-reaktie werd de oplossing ter deaktivering van het enzyme 15 minuten op 100°C verhit. Daarna voegde men ter ontkleuring aktieve kool toe in een hoeveelheid van 0,5$ berekend op de 5 vaste stoffen. Na verwijdering van de aktieve kool werd de oplossing behandeld met de ionenuitwisselende harsen Amberlite IR·120 en Amberlite IRA-411 en geconcentreerd tot een concentratie van 75 gew.$ onder verkrijging van 6 kg zoetstof. Deze zoetstof had een suikersamenstelling van: 37$ glucose, 2$ fructose, 10 10$ saccharose, 22$ GFg, 23$ GF^ en 6$ GF^.

Men voegde aan bovengenoemd zoetstofpreparaat 700 ml water toe en vervolgens 15 ml 10$ Na^HPO^, waarna men de pH op 9,0 instelde met h $ NaOH. Men voegde 50 g Raney nikkel toe en voerde de reduktiereaktie 50 minuten bij 80 tot 90°C onder 15 roeren uit bij een waterstofdruk van 60 tot 120 kg/cm . Na voltooiing van de reaktie werd de nikkelkatalysator verwijderd en de oplossing behandeld met de ionenuitwisselende harsen Amberlite IR-120B en Amberlite IRA—Ui 1 gevolgd door concentratie tot 75 gew.$ onder verkrijging van 1 kg produkt. Deze zoetstof 20 had een suikersamenstelling van 38$ sorbitol, 2$ mannitol, 9$ saccharose, 22$ GF^, 23$ GF^ en 6$ GF^.

Voorbeeld XV. - 25 10 ml BS medium, dat 0,5$ saccharose, 1,0$ pepton, 0,7$ vleesextrakt en 0,3$ NaCl bevatte werd respektievelijk uitgegoten in twee proefbuisjes en na 30 minuten sterilisatie bij 120°C werd elk van de media geënt met een platina draadlus van Aureobasidium pullulans var. melanigenum A-8 ATCC 20612, 30 en men kweekte 2k uur bij 28°C.

. 10 ml van de verkregen kweekoplossingen werden respektievelijk toegevoegd aan twee Erlenmeyerkolven, die 300 ml BS medium (30 minuten bij 120°C gesteriliseerd) bevatten en men kweekte 2h uur bij 28°C onder schudden ter voorkultivering. 35 20 1 medium, dat 10$ saccharose, 1,0$ pepton, 1 8101587 23 0,7$ vleesextrakt, 0,3$ NaCl en 0,1$ CoCl^·6E^0 tevat te, werd gebracht in een 30 liter fermenteerbad en na 30 minuten sterilisatie bij 120°C afgekoeld en geënt met 600 ml bovengenoemde kuituur oplos s ing. Men voerde de kweek 2k uur bij 28°C uit bij 5 2h0 omwentelingen per minuut. Na de kweek werden de cellen af gecentrifugeerd onder verkrijging van 1*00 g ruw enzyme. Dit ruwe enzyme (door centrifugering verkregen cellen) had een enzymeaktiviteit van 12.000 eenheden/g .

Men voegde 6,7 1 water toe aan 10 kg saccharose 10 teneinde een oplossing te verkrijgen en na instelling van de pH op 6,0 voegde men het enzyme toe in een hoeveelheid van 300 eenheden per gram saccharose en voerde de overdrachtsreaktie U8 uur bij 60°C uit. Na voltooiing van de overdrachtsreaktie verhitte men het reaktiemengsel 15 minuten op 100°C ter inakti-15 vering van het enzyme, waarna men ter ontkleuring aktieve kool toevoegde in een hoeveelheid van 0,5$, berekend op de vaste stof. Na verwijdering van de aktieve kool behandelde men de oplossing met de ionenuitwisselende harsen Amberlite-120B en Amberlite IRA-U11 en concentreerde tot 75$ onder verkrijging 20 van 11 kg weinig kariogene zoetstof.

De aldus verkregen zoetstof had een suikersamen-stelling van 0,8$ fructose, 31,5$ glucose, 11,0$ saccharose, 2h,61 GF2, 25,1$ GF3 en 7,0$ GF^.

25 9 ® 8101587

Claims (11)

1. Weinig kariogene zoetstof met het kenmerk, dat oligosacchariden "bevat met 1 tot k aan saccharose gebonden fructosemolekulen.

2. Zoetstof volgens conclusie 1 met het kenmerk, 5 dat de gewichtsverhouding, van het totale gehalte aan óligo- sacchariden met 1 tot U aan saccharose gebonden fructosemolekulen in de vaste bestanddelen tot vrije saccharose tenminste 2,0/1 bedraagt.

3. Werkwijze voor het bereiden van een weinig 10 kariogene zoetstof, met het kenmerk,dat men saccharose laat reageren met fructosyltransferase.

4. Werkwijze volgens conclusie 3 met het kenmerk, dat de fructosyltransferase is verkregen van het genus Aspergillus. 15

5· Werkwijze volgens conclusie 3 met het kenmerk, dat de. fructosyltransferase is verkregen van het genus Fusarium.

6. Wèrkwijze volgens conclusie 3 met het kenmerk, dat de fructosyltransferase is verkregen van het genus Gloeosporium.

7. Werkwijze volgens conclusie 3 met het kenmerk, dat de fructosyltransferase afkomstig is van Aureobasidium Pullulans var. melanigenum A-8 ATCC 20612.

8. Werkwijze voor het bereiden van een weinig kariogeen voedingsmiddel, met het kenmerk, dat men als zoetstof 25 een mengsel gebruikt, dat in hoofdzaak oligosacchariden bevat met 1 tot U aan saccharose gebonden fructosemolekulen.

9· Werkwijze volgens conclusie 8 met het kenmerk, dat de gewichtsverhouding van de som van de oligosacchariden met 1 tot ^ aan saccharose gebonden fructosemolekulen tot vrije 30 saccharose tenminste 2,0/1 bedraagt.

10. Werkwijze volgens conclusie 8 of 9 met het kenmerk, dat het mengsel in hoofdzaak een mengsel omvat y Jy van oligosacchariden met 1 tot k aan saccharose gebonden fruc- 8101587 tosemolekulen.

11. Werkwijze voor het bereiden van sorbitol en mannitolbevattende zoetstof, met het kenmerk, dat men saccharose met fructosyltransferase laat reageren onder verkrijging 5 van een suikeroplossing, die glucose, fructose, saccharose en oligosaechariden met 1 tot b aan saccharose gebonden fructose-molekulen bevat en deze suikeroplossing onderwerpt aan katalytische reduktie, terwijl men de pH van de oplossing op 7 tot 9 houdt. 10 \ 8101587