NL1004939C2

NL1004939C2 - Gebruik van een Eriobotrya japonica extract, in het bijzonder in het gebied van de cosmetica, voor het stimuleren van de synthesen van glucosaminoglycanen.

Info

Publication number: NL1004939C2
Application number: NL1004939A
Authority: NL
Inventors: Frederic Bonte; Marc Dumas
Original assignee: Lvmh Rech
Priority date: 1996-01-03
Filing date: 1997-01-06
Publication date: 1997-07-07
Also published as: NL1004939A1; BE1010042A3; GB2314272A; DE19780092T1; ES2129014A1; IT1290991B1; US5955083A; FR2742987A1; WO1997006659A3; DE19780092B3; ES2129014B1; FR2742987B1; WO1997006659A2; AU1181097A; JPH11501325A; CH692902A5; ITTO970001A1; GB9718684D0

Description

Gebruik van een Eriobotrya japonica extract, in het bijzonder in het gebied van de cosmetica, voor het stimuleren van de synthese van glycosaminoglycanen

De uitvinding heeft betrekking op een nieuw gebruik, in het bijzonder in het gebied van de cosmetica, van een Eriobotrya japonica extract, als middel dat bestemd is voor het stimuleren van de synthese van de 5 glycosaminoglycanen.

De Eriobotrya japonica plant is een boom met een hoogte van 5 tot 7 meter, met onbehaarde takken, en wisselende, langwerpige en dikke bladeren, welke bloeit tussen de maanden september en februari. De bladeren zijn 10 bekend in de Vietnamese geneesmiddelenlijst voor hun anti-hoest en anti-spasmodische eigenschappen. Het aftreksel wordt eveneens gebruikt voor het wassen van wonden. Volgens literatuur bezit deze plant eveneens een anti-inflammatoire werking. De cosmetische werking voor 15 de haren of voor de huid werden eveneens weergegeven.

Meer nauwkeurig, voor wie interesse heeft voor de reeds bekende toepassingen van de Eriobotrya japonica plant in het gebied van de farmacie, verwijzen we naar de volgende referenties: 20 - de monografie met betrekking tot deze plant verschenen in het Chinese Herbal Medicine, pagina 296, waarin men de anti-hoest en de stomacale werking als toepassingen, - de monografie verschenen op pagina 171 van 25 Medicinal Plants in Vietnam, gepubliceerd onder de beschermheerschap van de Wereld Gezondheidsorganisatie van Manilla en het Instituut van medisch materiaal van Hanoi die eveneens toepassingen op het therapeutische gebied als anti-hoest en anti-spasmodische werking noemt, 30 - Chinese Medicine Series 1, Chinese Materi

Medica Vegetable Kingdom die eveneens op pagina's 164-165 toepassingen beschrijft van dezelfde plant als anti-hoest en anti-vomitief, 1004939 2 - het Japanse octrooi JP 56-073027 (TEIJIN Ltd) beschrijft toepassingen van de bladeren van dezelfde plant voor de bereiding van een anti-flogiston.

Meer recent heeft men toepassingen van extrac-5 ten van dezelfde plant beschreven in het gebied van de cosmetica, in het bijzonder voor de huid- en haarverzor-ging.

Zo beschrijft het Japanse octrooi JP 05-071206 toepassingen van het extract van dezelfde plant als een 10 middel bestemd voor het voorkomen of voor het behandelen van exfolatie van de epidermis bij ruwe huid, en bewijst de werking van deze plant voor de reproduktie van huidcellen.

Het Japanse octrooi JP 62-249907 beschrijft 15 toepassingen van bladeren van Eriobotrya japonica voor het bereiden van cosmetische produkten die in het bijzonder bestemd zijn voor de verbetering van de microcircula-tie van het bloed.

Het Japanse octrooi JP 03-188008 beschrijft 20 toepassingen in het cosmetische gebied van een zeer brede plantenfamilie, te weten de rosaceae, welke planten een verbetering veroorzaken voor de soepelheid en de hydrata-tie van de huid en voor de behandeling van papuls.

Het Japanse octrooi JP 03-188014 beschrijft 25 eveneens cosmetische samenstellingen die bestemd zijn in het bijzonder voor de behandeling van de haren, en die een extract van verschillende planten van een zeer brede familie van de rosaceae. Deze extracten van planten zijn verbonden met twee tensio-actieve bijzondere middelen, te 30 weten een anionisch middel en tenminste een middel dat stikstof bevat.

Heden werd gevonden dat de extracten van de Eriobotrya japonica plant een bijzondere toepassing kent voor de cosmetica en de farmacie, in het bijzonder voor 35 de dermatologie, door eigenschappen voor de stimulatie van de produktie van de glycosaminoglycanen door de fibroblasten en de keratinosites, in het bijzonder de 1004939 3 fibroblasten van de huid, in het bijzonder van de menselijke huid, en de menselijke keratinosites.

De vakman weet dat de glycosaminoglycanen (GAG) polymeren zijn uit disaccharide-eenheden. In de menselij-5 ke huid zijn de meest voorkomende GAG's het hyaluronzuur die de overgrote hoeveelheid vormen. Men vindt eveneens chondroitine -4 en -6 sulfaat, het dermataansulfaat en in een kleine hoeveelheid heparine en heparaansulfaat.

De disaccharide-eenheden van GAG worden gevormd 10 uit een hexosamin (D-glucosamine of D-galactosamine), die regelmatig van sulfaatgroepen zijn voorzien afwisselend met een urozuur (D-glucoronzuur of L-iduronzuur).

De GAG's zijn in het algemeen gebonden door covalente bindingen aan proteïnen, tot de vorming van 15 proteoglycanen. Onder de bekende GAG's wordt enkel hyaluronzuur dat reeds hierboven werd vernoemd, niet in een binding met een centraal proteïne gesynthetiseerd.

De structuur van de proteoglycanen wordt beschreven in de publikatie van E.D. Hay met als titel 20 "Cell Biology of Extracellular Matrix", uitgegeven bij Plenum Press, New York in 1991 en in de publikatie J.E. SILBERT, met als titel "Structure and Metabolism of Proteoglycans and Glycosaminoglycans", verschenen in J. Invest. Dermatol., 1982, 79, pagina's 31s-37s.

25 De proteoglycanen worden in het bijzonder voorgesteld in alle weefsels van zoogdieren, waaronder begrepen de huid en zijn aanhangsels (J.R. COUCHMANN, J. Invest. Dermatol. 1993 juli 101 (1 Suppl) 60S-64S) . Er werd heden bevestigd dat de proteoglycanen via verschil-30 lende processen bijdragen tot de groei, tot de bescherming en tot de herstelling van weefsels. Er werd aangetoond dat verscheidene proteoglycanen mediums vormen de cellulaire adhesie en voor de transmembrane communicatie, daar waar anderen met andere structuurelementen van de 35 extracellulaire matrix interageren. Zoals dit reeds hierboven werd weergegeven, zijn de proteoglycanen opgebouwd uit een centraal proteïne waaraan zij op een cova-lente wijze gebonden zijn met een of meerdere glycosami- 1004939 4 noglycaanketens. Aldus zijn de glycosaminoglycanen aanwezig ter hoogte van de huid, en nemen zij deel aan de samenstelling van de extracellulaire matrix en werden in gebonden toestand aangetroffen met verscheidene colageen 5 vezelsites, zoals beschreven door J.E. SCOTT in Int. J. Biol. Macromol., 1991, Ü, pagina's 157-161. Zij werden eveneens geïdentificeerd tussen de keratinosites ter hoogte van de epidermis zoals beschreven door J.G. HAGGERTY et al. in het blad J. Invest. Dermatol., 1992, 22, 10 pagina's 374-380, 22, pagina's 374-380. Tenslotte werden glycosaminoglycanen aangetroffen in de extracellulaire matrix van het huidpapille van haarzakjes. Hun hoeveelheid varieet in functie van de haarcyclus. Zij vertoont een maximum tijdens de anagene fase die overeenstemt met 15 de groei van het haar. Voor zij die interesse hebben voor proteoglycanen en glycosaminoglycanen van haarfollicules, kan men terecht bij de publikatie van J.R. COUCHMANN die hierboven reeds is geciteerd, en deze van M. TAYLOR et al., "Glycosaminoglycan synthesis by cultured human hair 20 follicle dermal papilla cells: comparison with non-folli-cular dermal fibroblasts", Brit. J. Dermatol. 1992 (mei) 126 (5) 479-84). Men merkt op dat reeds werd aangetoond dat het minoxidil, een stof dat welbekend is voor een zekere werking bij de groei en bij het uitdrijven van 25 haar, de biosynthese van glycosaminoglycanen stimuleert (Y. MORI et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1991 (Dec.26) 642 473-5) . Deze observaties van de hierboven genoemde auteurs, gecombineerd met andere klinische proeven, geven aan dat de glycosaminoglycanen deelnemen aan de regulatie 30 van de haargroei.

De GAG'S, die zich krachtig met watermoleculen verbinden tot de vorming van gels, verzekeren de hydrata-tie van de huid en van de opperhuid. Een huid die goed gehydrateerd is, kent een goede uitzicht, en een fysiolo-35 gische toestand waarbij dit functioneel is op een bevredigende wijze, in het bijzonder goede mechanische eigenschappen heeft. De afname van GAG's tijdens de cutaine veroudering werd aangetoond door verscheidene auteurs 1004939 5 (zoals bijvoorbeeld: SMITH et al. in J. Invest. Dermatol., 1962, 39, pagina's 347-350; of FLEISCHMAJER et al. in Biochim Biophys. Acta, 1972, 39, pagina's 265-275; of nog door LONGAS et al. in Carbohydr. Res.; 1987, 159, 5 pagina's 127-136).

Aldus is het interessant de synthese van glyco-saminoglycanen te stimuleren voor in het bijzonder de huid die een deficiëntie vertoont ter hoogte van zijn mechanische eigenschappen of van zijn hydridische bar-10 rière zoals een gedehydrateerde huid of een verouderde huid, de kwaliteiten en de eigenschappen van een normale en jonge huid toe te kennen, of voor het voorkomen of het behandelen van moeilijkheden in de haargroei, of nog voor het herstellen of het versterken van de glans en van de 15 soepelheid van de haarplooi.

De onderhavige uitvinding heeft in hoofdzaak tot doel het oplossen van nieuwe technische problemen die bestaan door de verschaffing van een oplossing welke een stimulatie van de produktie van glycosaminoglycanen door 20 de huidcellen, in het bijzonder van menselijke huidcellen, zoals fibroblasten of keratinosites, welke produktie in het bijzonder geschikt is in het gebied bij vervaardiging van produkten voor cosmetische of farmaceutische behandelingen, in het bijzonder dermatologische behande-25 lingen.

De uitvinding is gebaseerd op de verrassende ontdekking dat een extract van de Eriobotrya japonica plant de produktie van glycosaminoglycanen stimuleert door huidcellen, in het bijzonder door de fibroblasten en 30 de keratinosites, wat deze aldus in het bijzonder geschikt maakt voor de vervaardiging van behandelingspro-dukten voor cosmetica of farmacie, in het bijzonder dermatologische produkten.

Er werd in het bijzonder gevonden dat een 35 extract van Eriobotrya japonica synthese van hyaluronzuur door de keratinosites stimuleert.

Volgens een van de essentiële karakteristieken heeft de uitvinding betrekking op het gebruik van een 1004939 6 extract van de Eriobotrya japonica plant als een cosmetisch middel dat bestemd is voor de stimulatie van de synthese van de glycosaminoglycanen (GAG). Door de huidcellen, in het bijzonder door fibroblasten en/of door 5 keratinosites, welke cosmetisch middel wordt ingebracht in een cosmetisch aanvaardbaar excipiênt.

Zij heeft meer in het bijzonder betrekking op toepassingen waar dit cosmetisch middel bestemd is voor de stimulatie van de synthese van hyaluronzuur door 10 keratinosites, wat dit in het bijzonder interessant maakt voor de verbetering van de hydratatie van de epidermis.

Als een voorbeeld werden extracten van Eriobotrya japonica gebruikt volgens de uitvinding, onder de commerciële extracten, in het bijzonder het hydroethan-15 olisextract van bladeren van deze plant, uit de catalogus Maruzen Pharmaceutical, Hiroshima, Japan.

Volgens een voorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding, wordt het extract van de plant verkregen uitgaande van aan de lucht fijngemalen delen van de 20 Eriobotrya japonica plant, bij voorkeur uitgaande van bladeren, bloemen, stengels of nog van stengels of vruchten.

Volgens een andere voorkeursuitvoeringsvorm, is het algenoemde extract een extract van fijngemalen blade-25 ren van de Eriobotrya japonica plant.

Volgens nog een andere voorkeursuitvoeringsvorm, is het algenoemde extract van de Eriobotrya japonica plant een extract dat wordt verkregen door een extractie door een polair solvent of door een mengsel van 30 polaire solventen. Bij voorkeur maakt men gebruik van een alcohol zoals het methanol, het ethanol, het propanol, het isopropanol, het propyleenglycol of het butyleengly-col of een mengsel van deze alcoholen of nog een hydro-alcoholisch mengsel.

35 Men kiest bij voorkeur als een solvent voor het verkrijgen van deze extractie het l-3butyleenglycol of een mengsel van dit solvent met water, bij voorkeur een mengsel in een verhouding van 50:50 volgens het volume.

1004939 7

In dit gebied, zijn de bekende extractieproce-dures welbekend door de vakman. In het bijzonder kan de extractie worden verkregen door het vermalen produkt, bij voorkeur uitgaande vein lucht del en, zoals de bladeren, de 5 bloemen, de stengels, of nog de stengels of de vruchten. Bij voorkeur wordt de extractie verkregen uitgaande van bladeren. Het vermalen plantaardige materiaal wordt ingebracht in het extractiesolvent, dat bij voorkeur bestaat uit het algenoemde solvent of een mengsel van de 10 algenoemde polaire solventen. De extractie kan worden hernomen voor een aantal keren tot er een uitputting van het materiaal optreedt, overeenkomend aan de bekende werkwijzen voor de vakman. De extractie kan worden verkregen bij een omgevingstemperatuur, of door verwarming 15 in het bijzonder met een reflux van het solvent. De gewichtsverhouding van het solvent ten opzichte van het te extraheren materiaal kan variëren tussen brede grenzen. Meer in het bijzonder kan zij gelegen zijn tussen 1:1 en 50:1, en bij voorkeur tussen 5:1 en 20:1.

20 Er werd echter reeds waargenomen dat de stimu latie van de synthese van de glycosaminoglycanen een klein opzwellingseffeet voor de huid veroorzaakt, in het bijzonder voor de dermis, en daardoor worden er verschillende voordelige cosmetische resultaten verkregen, zoals 25 een verbetering van de huiddichtheid, het voorkomen van de rimpels of een verzachting ervan dankzij een vermindering van hun diepte, de gladheid van het oppervlak van de huid dankzij het onderliggende spanningseffect.

Hierdoor draagt een verbetering van de synthese 30 van GAG bij tot een verbetering van de hydratatie van de huid.

Hierdoor heeft de uitvinding eveneens volgens een andere essentiële eigenschap van de uitvinding betrekking op een werkwijze voor de cosmetische of farma-35 ceutische behandeling, in het bijzonder voor een dermatologische behandeling, waarin men tracht de synthese van de glycosaminoglycanen te stimuleren, in het bijzonder voor een verbetering van de dichtheid en de soepelheid 1004939 8 van de huid, als een behandeling tegen de vorming van rimpels of voor vermindering van de diepte voor het verschaffen van een gladder oppervlak van de huid dankzij het spanningseifeet of voor de verbetering van de hydra-5 tatie van de huid.

De uitvinding heeft eveneens betrekking op elke werkwijze voor de therapeutische behandeling van de huid waarbij een stimulatie van de synthese van glycosamino-glycanen wordt nagestreefd.

10 De uitvinding heeft eveneens betrekking op het gebruik van Eriobotrya japonica extracten voor de bereiding van cosmetische samenstellingen evenals farmaceutische samenstellingen, in het bijzonder dermatologische samenstellingen die bestemd zijn voor het stimuleren van 15 de synthese van glycosaminoglycanen met de hierboven weergegeven resultaten.

Deze extracten en de samenstellingen kunnen worden toegepast in elke cosmetische of therapeutische behandelingswerkwijze waar men tracht de synthese van de 20 GAG de stimuleren. Deze werkwijzen bestaan uit het toepassen van een cosmetische of een farmaceutische efficiënte hoeveelheid van het extract of van de samenstelling deze op te sluiten op het huidweefsel dat wordt behandeld voor het verschaffen van een stimulatie van 25 deze synthese, welk extract zich desgewenst in een cosmetisch respectievelijk farmaceutisch aanvaardbaar recipiënt opgesloten ligt.

Verscheidene formulaties kunnen worden verkregen. Een van deze vormen die meestal gebruikt wordt, is 30 een topische aangepaste vorm om te worden toegepast op het huidweefsel waaronder de huid en de externe of interne slijmafscheidingen. De topische aangepaste formulaties omvatten zonder beperkingen, emulsies, crèmes, melken, zalven, gels, lotions, cellen, evenals samenstellingen 35 voor de werkzame opmaak zoals mascara's, lippenrood, waarbij deze verschillende soorten formulaties welbekend zijn voor de vakman.

1004939 9

Deze samenstellingen bevatten van 0,001 tot 10 gewichts%, en bij voorkeur van 0,01 tot 5 gewichts% ten opzichte van het totale gewicht van de samenstelling het extract, welk extract bij voorkeur in een cosmetisch of 5 farmaceutisch aanvaardbaar excipiênt wordt ingebracht.

Deze samenstellingen kunnen ondermeer verschillende toevoegingen bevatten, in het bijzonder deze gekozen uit de groep die bestaat uit de retinoiden, de bevocht igers of de hydratatiemiddelen, vitaminen, cerami-10 den, en samenstellingen die de synthese van collageen en van de zure amides bevoordeelt.

Volgens deze varianten, is het retinoïde gekozen onder de retinoidezuren en de zouten en de esters hiervan, het retinaldehyde, het retinol en zijn esters, 15 zoals het propionaat, palmitaat, acetaat; een bevochtigend middel of een hydraterend middel wordt gekozen uit glycerol, polyethyleenglycol en hyaloronzuur; het alge-noemde vitamine wordt gekozen uit vitamine A, vitamine C en zijn afgeleide verbindingen, in het bijzonder hun 20 natrium- of magesiumzouten, vitamine E, vitamine PP, en de vitaminen van de B-groep in het bijzonder B6 en B12; de stof die de synthese bevoordeelt van het collageen wordt gekozen uit een extract van centella aziatica, het madecassoside, het madecassidezuur, het aziatische zuur 25 en het aziaticoside; en het zuuramine wordt gekozen uit serine, het aspartaamzuur, lysine, proline en hydroxypro-line.

Het extract van Eriobotrya japonica kan eveneens op een voordelige wijze aan samenstellingen volgens 30 de uitvinding worden gebonden of aan meerdere van de actieve hierna weergegeven bestanddelen: - een hyaluronidase-inhibitor, zoals het extract van Echinacea angustifolia, - een elastase-inhibitor, zoals het extract van 35 soja of een algenextract genoemd aosaine, - een aminesuiker, zoals het glucosamine of het galactosamine, 1004939 10 - een adenylaatcyclase-activator die de synthese van het AMPc, zoals het forskoline, een extract van Coleus forskholii of een extract van Tephrosia, - het AMP of een extract dat dit omvat, zoals

C

5 een extract van Taisoh, - een fosfodiêsterase-inhibitor tegenwerkend aan de degradatie van het AMPc, zoals dat van het cafeïne of het theofiline.

Volgens een laatste aspect heeft de uitvinding 10 eveneens betrekking op een werkwijze voor de behandeling van cellen, in het bijzonder van fibroblasten of kerati-nosites, in cultuur, door een efficiënte concentratie van een Eriobotrya japonica extract voor het verschaffen van een stimulatie van de synthese van glycosaminoglycanen, 15 in het bij zonder van hyaluronzuur.

In de toepassing bijvoorbeeld voor de bereiding van een kunstmatige huid, in het bijzonder van een kunstmatige dermis in een cultuur van cellen, volgens welbekende technieken voor de vakman verkrijgt men dankzij een 20 werkwijze volgens de uitvinding een kunstmatige huid of dermis van een zeer goede kwaliteit in het bijzonder wat de biomechanische eigenschappen betreft.

Volgens een voorkeursuitvoeringsvorm van de werking van de algenoemde werkwijze behandelt men een 25 cultuur van cellen met een extract van Eriobotrya japonica in een concentratie gelegen tussen 0,3 ptg/ml en 30 /zg/ml cultuurmiddenstof.

Volgens een andere voordelige uitvoeringsvorm omvat de cultuurmiddenstof ondermeer een of meerdere van 30 de hierna volgende stoffen: glucosamine, galactosamine, L-proline en 4-hydroxy-L-proline waarbij deze stoffen elk in een concentratie tussen 2 en 10 mM gelegen kunnen zijn of nog dat de cultuurmiddenstof het ascorbinezuur of een van zijn afgeleide zouten in een niet-cytotoxische con-35 centratie, in het bijzonder in een concentratie gelegen tussen 0,001 mM en 0,5 mM omvatten.

Andere doelen, eigenschappen en voordelen volgens de uitvinding zijn duidelijk voor de vakman, 1004939 11 uitgaande van de verduidelijking in de beschrijving die hierna volgt verwijzend naar verscheidene uitvoerings-voorbeelden die slechts ter illustratie zijn weergegeven en die geen enkele beperking voor de uitvinding opleggen. 5 In de voorbeelden zijn de percentages weergegeven in gewichtspercentages op uitzondering wanneer anders weergegeven .

VOORBEELDEN

10 I. Bereiding van een extract van luchtdelen van Eriobot- rya

Voorbeeld 1

15 Bereiding van een extract A

Men brengt na vermaling 1 kg bladeren van de plant in contact met 10 liter methanol in reflux. Het extract wordt gefiltreerd. Het residu van de plant wordt gereëxtraheerd voor twee keer volgens dezelfde werkwijze. 20 De filtraten worden verzameld en geconcentreerd tot een droog extract genoemd A wordt verkregen.

Voorbeeld 2

Bereiding van een extract B

25 Men gaat zoals voorbeeld 1 te werk, maar men gebruikt als extractiesolvent een mengsel van water/etha-nol in 50/50 v/v.

voorbeeld 3

30 Bereiding van een extract C

Men verkrijgt een extractiefase op de volgende wijze. Men brengt na vermaling van l kg bladeren van de plant in contact met 15 liter methanol. Men brengt vervolgens een reflux aan gedurende 30 minuten waarna men 35 affiltreert. Het residu wordt vervolgens gereëxtraheerd gedurende 2 keer met 15 liter methanol, zoals weergegeven is in voorbeeld 1.

1004939 12

Men recupereert de verschillende filtraten. Men concentreert deze tot een minimale oplosbaarheid. Daarna mengt men het concentraat met 5 volumes aceton. Men wast het precipitaat door het aceton tot de verwijdering van 5 een visuele verkleuring. De verkregen taart wordt vervolgens in oplossing gebracht in water tot er een homogeen melk wordt verkregen dat men lyofiliseert. Men bereidt aldus een lyofilisaat genoemd extract C.

10 Voorbeeld 4

Bereiding van een extract D

Men extraheert l kg droge bladeren van de plant, die vooraf vermalen werd met 15 tot 20 liter van een mengsel van 1,3-butyleenglycol en water in 50/50 15 volumeverhouding bij 35°C gedurende 1 uur waarbij wordt geschud. Men recupereert een suspensie dat men filtreert voor de recuperatie van een extract genoemd extract D.

II - Verduidelijking van de activiteit voor de stimulatie 20 van de oroduktie van glvcosaminoglvcanen

Voorbeeld 5

Het bewijs van de activiteit in de stimulatie van de oroduktie van glvcosaminoglvcanen door de fibroblasten 25 van de mens met het extract van voorbeeld 1

Men beschrijft hieronder de gedane proef voor het bewijzen van een activiteit voor de stimulatie van de produktie van GAG door de fibroblasten. Deze in vitro test is echter herkend als betrouwbaar en significant 30 voor de vakman.

Protocol v^n fr?

Fibroblasten afkomstig van een plastische borstoperatie bij een vrouw van 49 jaar worden bereid 35 uitgaande van de micro-ontlede dermis zoals beschreven door R.I. Freshney, Culture of anima cells; A manual of basic technique, A.R. Liss, New York, 1983, 104-106.

1004939 13 10.000 fibroblasten per cultuurholte in een multiholtedoos (6 holten per doos) worden gedurende 24 uur bij 37eC gekweekt in een cultuurmiddenstof E199 C (Gibco) en welke 10% foetaal kalfsserura bevat.

5 Aan het einde van de 24 uur, wordt de midden stof afgenomen en verplaatst door 100 microliter van middenstof E199 C zonder serum en het te testen produkt in oplossing in DMSO bevat of dezelfde hoeveelheid DSMO in het geval van de referentieculturen en 4/*Ci van 3H-10 glucosamine (ref. TRK 398 Amersham). Men laat gedurende 48 uur bij 37eC incuberen. Daarna onttrekt men de overblijvende, en men hergroepeert deze per 2 welke men transfereert via schroef Eppendorf buizen. In elk van deze buizen voegt men 200 μΐ van een oplossing van 0,2 15 mg/ml pronase (Sigma P5147) in een PBS dat 0,02% natrium-azide bevat. Men laat gedurende een nacht reageren bij 37°c. Het pronase wordt nadien geïnactiveerd door de buizen 5 minuten in kokend water onder te dompelen.

Na een afkoeling tot een omgevingstemperatuur 20 coprecipiteert men de GAG's, die gemerkt werden met een waterige oplossing van een hyaluronzuurmengsel, dermat-aansulfaat, chondroïtinesulfaat l/l/l, 8 mg/ml per 40 μΐ van een oplossing bij 100 mg/ml van CPC (Sigma C 9002). Men schudt en men laat incuberen gedurende 30 minuten bij 25 een omgevingstemperatuur. Men centrifugeert de neerslag, en men zuigt het bovendrijvende af en men recupereert het bezinksel met 400 μΐ van een oplossing CPC van 10 mg/ml. Men schudt 5 minuten en men herneemt het bezinksel in 500 μΐ methanol. Men schudt en men brengt in de scintillatie-30 kolf waarna men 10 ml scintillatievloeistof toevoegt en men berekent de radio-activiteit.

Op een parallelle wijze wordt de cytotoxiteit van het te testen produkt geëvalueerd door een XTT-test (tetrazoliumzout) zoals beschreven door Roehm N.W. et al. 35 in Journal of Immunological Methods 1991, 142, 257-265. Deze test berekent de cellulaire levensvatbaarheid. Het resultaat van deze activiteit wordt slechts gegeven per 1004939 14 concentratie welke niet de cellulaire levensvatbaarheid verandert.

Resultaten: 5

Gehalte aan GAG % activiteit Significantie uitgedrukt in cptn

Referentie 6977 ±771

ÏJ5 |jg/ml 11808 ± 647 + 69 S

10 Mg/ml 12764 ± 734 + 83 S

10

De hierboven weergegeven tabel toont op een duidelijke wijze aan, dat het geteste extract de produk-tie van de totale GAG door de menselijke dermische fibro-blasten stimuleert.

15

Voorbeeld 6

Aantonen van de activiteit in de stimulatie voor de produktie van alycosaminoqlvcanen door fibroblasten van de mens met een commercieel extract 20

Men veroorzaakt een proef zoals beschreven in voorbeeld 5 door het gebruik van een commercieel extract ethanol-water 50-50 in volumeverhouding verkregen bij Maruzen (Japan).

25 Dit extract werd op een blinde wijze getest.

Dit extract werd gelyofiliseerd en daarna hernomen door DMSO voor een oplossing gelijk aan 10 mg/ml te verschaffen en werd getest over dezelfde stam fibroblasten zoals deze in voorbeeld 5 werd toegepast in dezelfde condities. 30 Men merkt op dat een oplossing van 10 /xg/ml de synthese van GAG stimuleert van meer dan 22,5% uitgedrukt in cmp.

III - Toepassincrsvoorbeelden 35 Voorbeeld 7 1004939 15

Cosmetische crème bestemd ter verbetering van de dichtheid van de huid: alcoholisch extract C van Eriobotrya bladeren volgens 5 voorbeeld 3....................2 g centella aziatica extract ............. 0,5g parfum excipiênt.........aanvullen tot 100 g

Deze crème wordt gebruikt als een topische 10 toepassing op het aangezicht, de hals en de borststreek. Deze samenstelling verbetert eveneens de soepelheid van de huid.

voorbeeld 8 15 Gel bestemd voor het veroorzaken van een spanninaseffeet op de huid: glycolextract D van Eriobotrya bladeren japonica verkregen in voorbeeld 4................3 g 20 asocorbinezuurzout van magnesiumfosfaat ...... l g aziaticoside ................... 0,lg geparfumeerd gel-excipiênt met bewaarmiddelen .......... aanvullen tot 100 g 25 Deze gel wordt toegepast als een plaatselijke toepassing op het aangezicht.

Voorbeeld 9

Lotion voor het versterken van de toniciteit van de 30 dermis en voor het verminderen van de diepte van rimpels: glycolextract van Eriobotrya japonica bladeren verkregen volgens voorbeeld 4 ............... 0,8 g panax ginseng extract..............0,2 g 35 capsicum extract................0,01 g waterig geparfumeerd excipiênt . . aanvullen tot 100 g 1004939 » 16

Deze lotion wordt gebruikt in verstuiver als preventief middel na het wassen.

Voorbeeld 10 5 Agti-riTTOelcEêntg: glycolextract van Eriobotrya japonica bladeren volgens voorbeeld 4................... 2 g AMP ...................... 0,05 g 10 Taisoh extract................. l g theofiline.................. 0,1 g in een emulsie gebracht excipiënt met parfum en bewaarmiddelen ..... aanvullen tot 100 g 15 Deze crème verbetert bij dagelijkse toepassing de structuur van de dermis en geeft aan de huid zijn dichtheid en zijn toniciteit terug.

1004939

Claims

1. Gebruik van een extract van de Eriobotrya japonica plant als cosmetisch middel bestemd voor het stimuleren van de synthese van glycosaminoglycanen (GAG), door huidcellen, in het bijzonder door fibroblasten en/of 5 keratinosites, welk cosmetisch middel wordt opgenomen in een cosmetische samenstelling welke een cosmetisch geschikte drager omvat.

2. Gebruik volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het cosmetische middel bestemd is voor het 10 stimuleren van de synthese van hyaluronzuur door de keratinosites.

3. Gebruik volgens één van de conclusies 1 of 2, met het kenmerk, dat het extract van de Eriobotrya japonica plant wordt gebruikt voor de bereiding van een 15 cosmetische samenstelling, welke de synthese van de glycosaminoglycanen (GAG) stimuleert en bestemd is voor het bestrijden van rimpels of voor de vermindering van hun diepte.

4. Gebruik volgens één van de conclusies 1 of 20 2, met het kenmerk, dat het extract van de Eriobotrya japonica plant gebruikt wordt in de bereiding van een cosmetische samenstelling, welke de synthese van de glycosaminoglycanenen (GAG) stimuleert en bestemd is ter verbetering van de dichtheid en de soepelheid van de huid 25 of ter verkrijging van een vergladding van het oppervlak van de huid dankzij een spanningseifect.

5. Gebruik volgens één van de conclusies 1 of 2, met het kenmerk, dat het extract van de Eriobotrya japonica plant gebruikt wordt voor de bereiding van een 30 cosmetische samenstelling, die bestemd is ter verbetering van de hydratering van de huid.

6. Gebruik volgens één van de conclusies 1 tot 5, met het kenmerk, dat het extract een extract is van de vermalen luchtdelen van de Eriobotrya japonica plant, 35 zoals bladeren, bloemen, stengels, korst van de stengels of vruchten. 1 0 0 4 9 3 9

7. Gebruik volgens één van de conclusies 1 tot 5, met het kenmerk, dat het extract een extract is van vermalen bladeren van de Eriobotrya japonica plant.

8. Gebruik volgens één van de conclusies 1 tot 5 7, met het kenmerk, dat het extract wordt verkregen door extractie door een polair solvent, zoals een alcohol bijvoorbeeld methanol, ethanol, propanol, isopropanol, glycopropyleen of butyleenglycol of een mengsel van deze alcoholen of een mengsel van basisalcoholen.

9. Gebruik volgens één van de conclusies 1 tot 8, met het kenmerk, dat de samenstelling van 0,001 tot 10 gewichts%, en bij voorkeur van 0,01 tot 5 gewichts%, het extract bevat in vergelijking met het volledige gewicht van de samenstelling, in een cosmetisch of farmaceutisch 15 aanvaardbaar excipiënt.

10. Gebruik volgens één van de conclusies 1 tot 9, met het kenmerk, dat de samenstelling ondermeer omvat: tenminste een toevoeging gekozen uit de groep die bestaat uit de retinoiden, de bevochtigers of de hydraterende 20 middelen, vitaminen, ceramiden, stoffen die de synthese van het collageen bevoordelen en zure amines.

11. Gebruik volgens conclusie 10, met het kenmerk, dat het algenoemde retinoide gekozen wordt uit het retinoïdezuur en zijn zouten en esters, het retinal- 25 dehyde, en het retinol en zijn esters, zoals propionaat, palmitaat, acetaat; het algenoemde bevochtigings- of hydratatiemiddel wordt gekozen uit glycerol, een polye-thyleenglycol en hyaluronzuur; het algenoemde vitamine wordt gekozen onder vitamine A, vitamine C en zijn deri- 30 vaten, in het bijzonder zijn natriumzouten of zijn magne-siumzouten, vitamine E, vitamine PP en de vitaminen van de groep B in het bijzonder B6 en B12; de stof die de synthese bevoordeelt van het collageen wordt gekozen uit een extract van centella aziatica, madecassoside, made- 35 cassidezuur, aziatisch zuur, aziaticozide; waarbij het zure amine gekozen wordt uit serine, threonine, leucine, proline en hydroxyproline. 1004939

12. Gebruik volgens één van de conclusies 1 tot 11, met het kenmerk, dat het Eriobotrya japonica extract met een of meerdere actieve bestanddelen: - een inhibitor voor hyaluronidase, 5. een inhibitor voor elastase, - een aminesuiker, - een adenylaatcyclase activator die de synthese bevoordeelt van het AMPc, - AMP of een extract hiervan, 10. een fosfodiêsterase inhibitor die de degrada tie van het AMPc tegenwerkt.

13. Gebruik volgens conclusie 12, met het kenmerk, dat de hyaluronidase inhibitor een extract is van Echinacea angustifolia: de elastase inhibitor een 15 extract is van soja of een extract van algen genoemd aosaïne,· het aminesuiker glucosamine of galactosamine is,· de adenylaatcyclase die de synthese van AMPc bevoordeelt, forskoline is, een extract van Coleus forskholii of een extract van Tephrosia is; het AMPc of een extract hiervan, 20 een extract van Taisoh is; de fosfodiêsterase inhibitor welke tegen de degradatie van het AMPc werkzaam is, cafeïne of theofyline is.

14. Werkwijze in een cosmetische behandeling die de synthese van glycosaminoglycanen (GAG) kan stimu- 25 leren, met het kenmerk, dat deze de toepassing van een cosmetisch geschikte hoeveelheid van een extract van de Eriobotrya japonica plant omvat voor het verkrijgen van een stimulatie van de synthese, welk extract in het bijzonder in een cosmetisch aanvaardbaar excipiênt ligt 30 opgesloten.

15. Werkwijze volgens conclusie 14, met het kenmerk, dat het extract in een samenstelling aanwezig is welke een concentratie van het extract bevat gelegen tussen 0,001 en 10 gewichts%, en bij voorkeur 0,01 en 5 35 gewichts% in vergelijking met het totale gewicht van de samenstelling.

16. Werkwijze volgens één van de conclusies 14 of 15, met het kenmerk, dat het gaat over een cosmetische 1004939 behandeling die bestemd is voor het verbeteren van de dichtheid en de soepelheid van de huid en welke tegen de vorming van rimpels werkzaam is of hun diepte vermindert of een glad oppervlak van de huid veroorzaakt dankzij een 5 spanningseifeet.

17. Werkwijze voor de behandeling van cellen, in het bijzonder van fibroblasten of keratinosites, in een cultuur voor het verkrijgen van een stimulatie van de synthese van glycosaminoglycanen, in het bijzonder van 10 hyarulonzuur, met het kenmerk, dat deze werkwijze bestaat in het inbrengen in een cultuurmiddenstof van een efficiënte concentratie van een Eriobotrya japonica extract ter verkrijging van de stimulatie van de genoemde synthese .

18. Werkwijze volgens conclusie 17, met het kenmerk, dat de cellen behandeld worden met een Eriobotrya japonica extract in een concentratie gelegen tussen 0,3 Mg/ml en 30 μg/ml van cultuurmiddenstof.

19. Werkwijze volgens conclusie 17 of 18, met 20 het kenmerk, dat men aan de cultuurmiddenstof tenminste een substantie toevoegt welke substantie gekozen wordt uit de groep die bestaat uit de glucosamine, de galacto-samine, het L-proline en het 4-hydroxy-L-proline in een concentratie gelegen tussen 2 en 10 mM evenals het ascor-25 binezuur of zijn afgeleide verbindingen in een niet-cytotoxische concentratie, in het bijzonder in een concentratie gelegen tussen 0,001 mM en 0,5 mM.

20. Toepassing van de werkwijze volgens één van de conclusies 17 tot 19 voor de bereiding van een kunst- 30 matige huid of kunstmatige dermis. 1004939