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L-METIONINA COMO ESTABILIZADOR PARA PROTEINA ESTIMULANTE DE
ERITROPOYESIS NOVEDOSA/ERITROPOYETINA EN FORMULACIONES LIBRES DE ALBUMINA DEL SUERO HUMANO Antecedentes de la invención Debido a los recientes avances en tecnologías de ingeniería genética y celular, las proteínas que se sabe que exhiben varias acciones farmacológicas in vivo son capaces de ser producidas en grandes cantidades para aplicaciones farmacéuticas. Tales proteínas incluyen eritropoyetina (EPO) (por sus siglas en inglés) , factor estimulante de la colonia de granulocitos (G-CSF) (por sus siglas en inglés) , interferones (alfa, beta, gamma, de consenso) , proteínas de aglutinación del factor de necrosis del tumor (TNFbp) (por sus siglas en inglés) , antagonista del receptor de interleucina-1 (IL-lra) (por sus siglas en inglés) , factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) (por sus siglas en inglés) , factor de crecimiento de queratinocitos (KGF) , factor de las células madre (SCF) (por sus siglas en inglés) , el factor de diferenciación del crecimiento de megacariocitos (MGDF) (por sus siglas en inglés) , osteoprotegerina (OPG) (por sus siglas en inglés) , factor neurotrófico derivado de la línea celular glial (GDNF) (por sus siglas en inglés) , proteína de la obesidad (proteína OB) , y proteína estimulante de la eritropoyesis novedosa (NESP) . EPO es una hormona de glicoproteína necesaria para Ref .154307 la maduración de las células progenitoras eritroides en los eritrocitos. La misma es producida en el riñon y es esencial en la regulación de los niveles de las células rojas de la sangre en la circulación. Las condiciones marcadas por niveles bajos de la señal de oxigeno del tejido incrementaron la producción de EPO, lo cual a su vez estimula la eritropoyesis . Una pérdida de la función del riñon como es observada en la insuficiencia renal crónica (CRF) (por sus siglas en inglés), por ejemplo, típicamente conduce a una producción reducida de EPO y a una reducción concomitante en las células rojas de la sangre. La EPO urinaria humana fue purificada por Miyake et al., J. Biol. Chem. r 252:5558 (1977) de los pacientes con anemia aplástica. Sin embargo, la cantidad de proteína de EPO purificada obtenida de esta fuente fue insuficiente para aplicaciones terapéuticas. La identificación y clonación del gen que codifica la EPO humana y la expresión de proteína recombinante fue descrita en la Patente U.S. No. 4,703,008 de Lin, la descripción de la cual es incorporada aquí para referencia. Un método para la purificación de la eritropoyetina humana recombinante a partir del medio celular es descrita en la Patente U.S. No. 4, 667, 016 de Lai et al, la cual es incorporada aquí para referencia. La producción de EPO activa biológicamente de las células hospederas de mamífero ha hecho disponible, por primera vez, cantidades de EPO adecuadas para aplicaciones terapéuticas. Además, el conocimiento de la secuencia del gen y la disponibilidad incrementada de proteina purificada a conducido a un mejor entendimiento del modo de acción de esta proteina. Tanto la EPO derivada del sistema urinario humano
(Miyake et al, supra) como la EPO humana recombinante expresada en las células de mamífero contienen tres cadenas de oligosacárido N-enlazadas y una O-enlazada las cuales conjuntamente comprenden aproximadamente 40 % del peso molecular total de la glicoproteína . La glicosilación Erenlazada ocurre en los residuos de asparagina localizados en las posiciones 24, 38 y 83 mientras que la glicosilación Cíenlazada ocurre en un residuo de serina localizado en la posición/ 126 (véase Lai et al, J. Biol. Chem. r 21 ; 3116 (1986); Broudy et al, Arch. Biochem. Byóphys, 265:329 (1988) ) . Las cadenas de oligosacárido se ha mostrado que van a ser modificadas . con .residuos.. de cido . siálico terminales con cadenas N-enlazadas que tienen típicamente hasta cuatro ácidos siálicos por cadena y cadenas O-enlazadas que tienen hasta dos ácidos siálicos. Un polipéptido de EPO puede acomodar por lo tanto hasta un total de 14 ácidos siálicos. Varios estudios han mostrado que las alteraciones de las cadenas de carbohidratos de EPO pueden afectar la actividad biológica. En un estudio, sin embargo, la remoción de cadenas de oligosacáridos N-enlazados y O-enlazados de manera única o conjuntamente por mutagénesis de los residuos de asparagina o serina que son sitios de glicosilación reduce ampliamente la actividad in vitro de la EPO alterada que es producida en las células de mamífero; Dube et al, J. Biol. Chem. , 263:17516 (1988). Sin embargo, DeLorme et al, Biochemistry, 31:9871-9876 (1992) reportaron que la remoción de los sitios de glicosilación N-enlazados en la EPO redujo la actividad biológica in vivo pero no in vitro. La relación entre el contenido de ácido siálico de la EPO y la actividad biológica in vivo fue descrita por la determinación de la actividad in vivo de las isoformas de EPO aisladas . Se encontró que un incremento gradual en el contenido de ácido siálico por molécula de EPO dio un incremento gradual correspondiente en la actividad biológica in vivo como se mide por la capacidad de las concentraciones equimolares de las isoformas de EPO aisladas para elevar el conteo de hematocritos de los ratones normales, Egrie et al, Glycoconjugate J.r 10^:263 (1993). Estas isoformas de EPO que tienen un contenido de ácido siálico más elevado también exhibieron una vida media del suero más prolongada pero una afinidad reducida hacia el receptor de EPO, sugiriendo que la vida media del suero es una determinante importante de la actividad biológica in vivo. En los E.U.A., la EPO ha sido utilizada en el tratamiento de la insuficiencia renal crónica mantenida sobre la diálisis asi como pre-diálisis, y en el tratamiento de la anemia secundaria al tratamiento de quimioterapia en el cáncer y en la anemia asociada con el tratamiento con zidovudina de la infección de VIH. En todo el mundo, la EPO ha sido utilizada para tratar la anemia asociada con la premadurez, la anemia de hematíes falciformes, artritis reumatoide, y trasplante de la médula ósea; Markham et al, Drugs, 49:232-254 (1995). NESP es un análogo de eritropoyetina hiperglicosilada que tiene cinco cambios en la secuencia de aminoácidos de rHuEPo lo cual proporciona dos cadenas de carbohidratos adicionales. Más específicamente, NESP contiene dos cadenas de carbohidratos N-enlazadas adicionales en los residuos de aminoácidos 30 y 88 (numeración correspondiente a la secuencia de EPO humana) (véase la solicitud PCT No. US94/02957, incorporada aquí para referencia en su totalidad). NESP es distinta ..bioquímicamente, .de EPO, teniendo una vida media en el suero más prolongada y una actividad biológica in vivo más elevada; Egrie et al, ASH97, Blood, 90_:56a (1997). NESP se ha mostrado que tiene un incremento de ~3 veces en la vida media en el suero en los ratones, ratas, perros y seres humanos; Id. En los ratones, la vida media en el suero más prolongada y la actividad in vivo más elevada permite una dosificación menos frecuente (una vez por semana o una vez cada otra semana) comparado con rHuEPO para obtener la misma respuesta biológica; Id. ün estudio farmacocinético demostró que, de manera consistente con los estudios animales, NESP tiene una vida media en el suero significativamente más prolongada que rHuEPO en los pacientes con insuficiencia renal crónica, sugiriendo que un programa de dosificación menos frecuente también puede ser empleado en seres humanos; MacDougall, et al, J American Society of Neprhology, 8^:268A (1997). Un programa de dosificación menos frecuente podría ser más conveniente tanto para los médicos como para los pacientes, y podría ser particularmente útil para aquellos pacientes involucrados en la auto-administración. Otras ventajas de una dosificación menos frecuente puede incluir menos fármaco que es introducido en los pacientes, una reducción en la naturaleza o severidad de los pocos efectos secundarios observados con la administración de rHuEPQ, y un confort incrementado. Aunque las formulaciones de EPO y NESP disponibles comercialmente son generalmente bien toleradas y estables, una consideración debe ser tomada en cuanto al hecho de que, bajo condiciones extremas, tales proteínas pueden ser inestables y padecer varias degradaciones fisicoquímicas indeseables durante las condiciones de fabricación, manejo, y almacenamiento. Tales degradaciones incluyen la adición, inactivación, y oxidación de los residuos de metionina, y tales degradaciones pueden ser aceleradas por factores externos tales como el calor y la luz, o en formulaciones que están libres de los productos de la sangre humana tales como la albúmina, o en formulaciones de dosis múltiples las cuales contienen conservadores tales como alcohol bencílico. Los métodos para inhibir la oxidación en polipéptidos que contienen metionina han sido descritos; Takruri et al, Patente U.S. No. 5,272,135 (21 de diciembre de 1993) . Específicamente, Takruri describe métodos de inhibición de la oxidación del (de los) residuo (s) de metionina en preparaciones líquidas o semi-líquidas, las preparaciones comprenden polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos que comprenden al menos un residuo de metionina. La prevención de la oxidación de metionina se dice que va a ser efectuada por la adición de L-metionina libre a las preparaciones en una cantidad suficiente para inhibir la oxidación del (de los) ¦ residuo (s) de metionina en el polipéptido. La oxidación de, , los residuos de metionina se dice que va a estar asociada con los recipientes de plástico, por ejemplo, de polipropileno o de polietileno de densidad baja (LDPE) , los cuales son fácilmente permeables al oxígeno, y dentro de los cuales las preparaciones son almacenadas . Los polipéptidos contemplados para su uso en Takruri son factores de crecimiento, y las preparaciones probadas son preparaciones de base acuosa, oftálmicas, del factor de crecimiento epidérmico (EGF) . Las preparaciones que contienen 8
EPO o NESP, o cualquier otra proteína glicosilada no son descritas, ni son formulaciones que estén libres de HSA, de dosis múltiples, o de dosis múltiples libres de HSA descritas . Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona formulaciones farmacéuticas de EPO y/o NESP en donde la incorporación de metionina y otros agentes estabilizantes en dichas formulaciones proporciona una formulación más estable, aún en condiciones extremas en donde las degradaciones criticas inducidas por la luz, el calor, las impurezas en aditivos, los lixiviados en las jeringas prellenadas, el proceso de fabricación, almacenamiento, transporte, y manejo, pueden ocurrir de otra manera. De manera importante, las formulaciones también demuestran una estabilidad mejorada en las formulaciones libres de HSA y las formulaciones de dosis múltiples libres de HSA que contienen conservadores, en donde las degradaciones criticas pueden ser más pronunciadas . Breve Descripción de las Figuras : La figura 1 es una gráfica que muestra el efecto de la metionina libre sobre la adición de NESP durante la exposición a la luz. NESP en la solución salada amortiguada con fosfato fue expuesta a luz ultravioleta durante 4 horas a temperatura ambiente .
La figura 2 es una gráfica que muestra el efecto de la metionina libre sobre la adición de NESP en la presencia de 1% de alcohol bencílico durante el almacenamiento a 2-8 °C. Las muestras que contienen 500 µg/ml de NESP fueron almacenadas durante 13 meses. La figura 3 es una gráfica que muestra el efecto de varios aditivos y el tratamiento sobre la oxidación del residuo 54 de metionina en NESP durante la incubación durante 90 días a 37 °C. El % de oxidación fue determinado por mapeo tríptico seguido por CLAR de fase inversa y espectroscopia de masa . La figura 4 es una gráfica que muestra el efecto de la metionina libre sobre la oxidación de NESP en una formulación preservada que contiene 1% de alcohol bencílico. La metionina libre 0.20 mM fue probada y las muestras fueron incubadas a 4 °C durante 56 días. La figura 5 es una gráfica que muestra, el efecto de la metionina libre sobre la oxidación de NESP en una formulación preservada que contiene alcohol bencílico al 1%. La metionina libre 0-20 mM fue probada y las muestras fueron incubadas a 29 °C durante 56 días. La figura 6 compara los mapas trípticos de EPO en soluciones a pH 7.0 + alcohol bencílico y + L-metionina libre . La figura 7 es una gráfica que compara las velocidades de oxidación de metionina de NESP con y sin purga (10 minutos) con nitrógeno. El % de oxidación de metionina es graficado contra la concentración de benzaldehído . Se probó 0.1 mg/ml de NESP. La figura 8 compara los mapas trípticos de las muestras de NESP sobre-oxidadas. Met-54 fue oxidada totalmente para todas las muestras mostradas en la figura. Los números mostrados sobre la figura representan la concentración de metionina agregada a las muestras . Descripción Detallada de la Invención "Excipiente" está definido aqui como un agente no terapéutico agregado a una composición farmacéutica para proporcionar un efecto deseado, por ejemplo estabilización, isotonicidad. "Polipéptido" está definido aquí como proteínas o péptidos naturales, sintéticos, y recombinantes que tienen más de aproximadamente 10 aminoácidos, y - que tienen una actividad biológica deseada. Cuando se utilice aquí, agentes activos biológicamente se refiere a polipéptidos recombinantes o que están presentes de manera natural, ya sea de animales o de seres humanos, útiles para aplicación profiláctica, terapéutica o de diagnóstico. El agente activo biológicamente puede ser natural, sintético, semi-sintético o derivados de los mismos. Los agentes activos contemplados incluyen péptidos, moléculas pequeñas, carbohidratos, ácidos nucléicos, lipidos, proteínas, y análogos de los mismos. Un experto en el arte fácilmente será capaz de adaptar un agente activo biológicamente deseado a las composiciones de la presente invención. ¦ Las proteínas contempladas para su uso podrían incluir pero no están limitadas al interferón de consenso (véanse las Patentes U.S. Nos. 5,372,808, 5,541,293, 4,897,471, y 4,695,623 incorporadas por el presente para referencia incluyendo los dibujos) , factores estimulantes de las colonias de granulocitos (véanse las Patentes U.S. Nos. 4,810,643, 4,999,291, 5,581,476, 5,582,823, y la Publicación PCT No. 94/17185, incorporada por el presente para referencia incluyendo los dibujos) , interleucinas (véase, la Patente U.S. No. 5, 075,222, incorporada por el presente para referencia incluyendo los dibujos) , eritropoyetinas (véanse, las Patentes U.S. Nos. 4,703,008, 5,441,868, 5,618,698, 5,547,933, y 5,621,080 incorporadas por el presente para referencia incluyendo los dibujos), el factor de las células madre (Publicaciones PCT Nos. 91/05795, 92/17505 y 95/17206, incorporadas por el presente para referencia incluyendo los dibujos), osteoprotegerina (Publicación PCT No. 97/23614, incorporada por el presente para referencia incluyendo los dibujos) , proteína estimulante de la eritropoyesis novedosa (NESP) (Publicación PCT No. 94/09257, incorporada por el presente para referencia incluyendo los dibujos), leptina (proteina OB) (véanse las publicaciones PCT Nos. 96/40912, 96/05309, 97/00128, 97/01010 y 97/06816 incorporadas por el presente para referencia incluyendo las figuras) , factor de diferenciación del crecimiento de megacariocitos (véase, la publicación PCT No. 95/26746 incorporada por el presente para referencia incluyendo las figuras) , el factor de necrosis del tumor-proteina de aglutinación (TNF-bp) , antagonista del receptor de interleucina-1 (IL-lra) , factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) , factor neurotrófico derivado, glial (GDNF) , factor de crecimiento de queratinocitos (KGF) y trombopoyetina. El término proteínas, cuando se utiliza aquí, incluye péptidos,' polipéptidos, moléculas de consenso, análogos, derivados o combinaciones de los mismos. En general, la EPO útil en la presente invención tiene la secuencia de la eritropoyetina humana, o los análogos de la misma relacionados estrechamente. La EPO puede ser producida por las células de mamífero fuera del cuerpo, o puede ser aislada de las fuentes naturales. Preferentemente, la EPO es EPO humana recombinante (rHuEPO) producida como se describió en la Patente U.S. No. 4,703,008 de Lin, la descripción de la cual es incorporada aquí para referencia. La secuencia de aminoácidos de la EPO es aquella mostrada aquí en la SEC ID N0:1. Las células hospederas preferidas son células del Ovario del Hámster Chino (CHO) como se describen en el Ejemplo 10 de la patente de Lin. Otras células hospederas conocidas en el arte, por ejemplo células del riñon del hámster bebé, también pueden ser utilizadas para producir EPO útil en la presente invención. Aunque los procedimientos del Ejemplo 10 en la patente de Lin son el método preferido para producir rEPO, se podrían hacer modificaciones y cambios a este proceso como se sabe en el arte. La concentración preferida de la EPO es 50 IU/ml -500,000 IU/ml, y 750 IU/ml - 48,000 IU/ml es más preferida. NESP de la presente invención es un análogo de EPO hiperglicosilado que comprende dos sitios de glicosilación adicionales con una cadena de carbohidratos adicional fijada a cada sitio. NESP fue construido utilizando mutagénesis dirigida al sitio y expresado en células hospederas de mamífero. Los detalles de la producción de NESP son provistos en la Solicitud PCT co-poseída No. US94/02957. Los nuevos sitios de glicosilación N-enlazados para rHuEPO fueron introducidos por alteraciones en la secuencia de ADN que codifica los aminoácidos Asn-X-Ser/Thr en la cadena de polipéptidos. El ADN que codifica NESP fue transfectado en las células hospederas del Ovario del Hámster Chino (CHO) y el polipéptido expresado fue analizado para verificar la presencia de cadenas de carbohidratos adicionales. En una modalidad preferida, NESP tendrá dos cadenas de carbohidratos N-enlazadas adicionales en los residuos 30 y 88. La numeración de la secuencia de aminoácidos es aquella de la eritropoyetina humana (EPO) . La secuencia de aminoácidos de NESP es aquella mostrada en la SEC ID NO:2. Se entiende que NESP tendrá el complemento normal de sitios de glicosilación N-enlazados u O-enlazados además de los sitios nuevos. La concentración preferida de NESP es 1 g/ml - 5000 µ?/?a?, y 10 µg/ml - 500 µg/ml es más preferida.. La EPO y NESP de la presente invención también pueden incluir cambios de aminoácidos conservadores en uno o más residuos en las SEC ID NOs: 1 y 2. Estos cambios no conducen a la adición de una cadena de carbohidratos y tendrán un efecto pequeño sobre la actividad biológica del análogo. Estos son ' descritos en la Tabla 1, posterior. Véase en general, Creighton, Proteins, passim (W.H. Freeman and Company, N.Y., 1984); Ford et al, Protein Expression and Purification 2_:95-107 (1991), los cuales son incorporados aqui para referencia. Tabla 1 Substituciones de Aminoácidos Conservadores
Básicos : arginina lisina histidina Acidos : Acido glutámico Acido aspártico Polares : glutamina asparagina Hidrofóbicos : leucina isoleucina valina Aromáticos : fenilalanina triptófano tirosina Pequeños : glicina alani a serina treonina metionina
Los usos terapéuticos de las composiciones de la presente invención dependen del agente activo biológicamente utilizado. Un experto en el arte será capaz fácilmente de adaptar un agente activo biológicamente deseado a la presente invención para sus usos terapéuticos propuestos. Los usos terapéuticos para tales agentes son descritos con mayor detalle e las siguientes publicaciones incorporadas por el presente para referencia incluyendo los dibujos. Los usos terapéuticos incluyen pero no están limitados a los usos para proteínas semejantes al interferón de consenso (véanse, las Patentes U.S. Nos. 5,372,808, 5,541,293, incorporadas por el presente para referencia incluyendo los dibujos) , interleucinas (véase la Patente U.S. No. 5,075,222, incorporada por el presente para referencia incluyendo los dibujos), eritropoyetinas (véanse, las Patentes U.S. Nos.
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4,703,008, 5,441,868, 5,618,698, 5,547,933, 5,621,080, 5,756,349, y 5,955,422 incorporadas por el presente para referencia incluyendo los dibujos) , factores estimulantes de las colonias de granulocitos (véanse las Patentes U.S. Nos. 4,999,291, 5,581,476, 5,582,823, 4,810,643, y la Publicación PCT No. 94/17185, incorporadas por el presente para referencia incluyendo los dibujos) , factor de diferenciación del crecimiento de megacariocitos (véase, la publicación PCT No. 95/26746), el factor de las células madre (Publicaciones PCT Nos. 91/05795, 92/17505 y 95/17206, incorporadas por el presente para referencia incluyendo los dibujos) , proteína OB (véanse las publicaciones PCT Nos. 96/40912, 96/05309, 97/00128, 97/01010 y 97/06816 incorporadas por el presente para referencia incluyendo las figuras) , y proteína estimulante de la eritropoyesis novedosa (Publicación PCT No. 94/09257, incorporada por el presente para referencia incluyendo los dibujos) . Además, las presentes composiciones también pueden ser utilizadas para la fabricación de uno o más medicamentos para el tratamiento o mejora de las condiciones en las que el agente activo biológicamente está propuesto para el tratamiento . Por lo que se refiere específicamente a la NESP, la presente invención proporciona un método para elevar y mantener los hematocritos en un mamífero, que comprende administrar una cantidad efectiva terapéuticamente de NESP en una composición farmacéutica de la presente invención, en donde NESP es administrado menos frecuentemente que una cantidad molar equivalente de rHuEPO para obtener un hematocrito de redireccionamiento comparable. La frecuencia de dosificación de la presente invención para alcanzar un intervalo óptimo de hematocritos del paciente es menor que tres veces por semana. Las frecuencias de dosificación pueden ser dos veces por semana, una vez por semana, o menos de una vez por semana, tal como una vez cada otra semana, una vez por mes o una vez cada dos meses . La frecuencia de dosificación requerida para mantener un hematocrito de redireccionamiento del paciente es menor que tres veces por semana. Las frecuencias de dosificación pueden ser dos veces por semana, una vez por semana, o menos de una vez por semana, tal como una vez cada dos semanas, una vez por mes o una vez cada dos meses. La invención . puede . ser empleada con cualquier condición que conduzca a una reducción en los niveles de las células rojas de la sangre, tales como anemia asociada con ' una declinación o pérdida de la función del riñon, (insuficiencia renal crónica) , terapia mielosupresiva, cáncer, infección viral, enfermedad crónica y pérdida excesiva de sangre durante procedimientos quirúrgicos. Se contempla que las formulaciones de la presente invención contendrán adicionalmente un agente de amortiguación, por ejemplo, sales alcalinas (fosfato de sodio o potasio o sus sales de hidrógeno o dihidrógeno) , ácido citrico/citrato de sodio, acetato de sodio/ácido acético, y cualquier otro agente de' amortiguación del pH aceptable farmacéuticamente conocido en el arte, para mantener el pH de la solución dentro de un intervalo deseado . Las mezclas de estos agentes de amortiguación también pueden ser utilizadas . La cantidad del agente de amortiguación útil en la composición depende ampliamente del amortiguador particular utilizado y del pH de la solución. Por ejemplo, el acetato es un amortiguador más eficiente a pH 5 que a pH 6 de modo que menos acetato puede ser utilizado en una solución a pfi 5 que a pH 6.. El pH preferido de las formulaciones preferidas estará en el intervalo de 5.0 hasta 7.0, y los agentes de ajuste del pH tales como ácido clorhídrico, ácido cítrico, hidróxido de sodio, o una sal de los mismos, también pueden ser incluidos para obtener el pH deseado. · · Las formulaciones también contendrán derivados de sorbitán mono-9-octadecenoato poli (oxi-1, 2-etandiilo) , incluyendo pero sin estar limitado a, polisorbato 80 o polisorbato 20. Otros derivados son bien conocidos en el arte. La cantidad de polisorbato 20 u 80 que va a ser utilizada estará en el intervalo de 0.001% hasta 0.1% (p/v) . La cantidad preferida es 0.005% (p/v) en las formulaciones de uso único y de dosis múltiples.
Para proporcionar formulaciones farmacéuticas de EPO y/o NESP que tienen estabilidad superior, la L-metionina libre será incluida en las formulaciones. La cantidad de L-metionina libre incluida estará en el intervalo de 0.05 mM hasta 50 mM. En las formulaciones que contienen HSA, la cantidad preferida en las formulaciones de uso único es de 0.05 mM hasta 5 mM, y la cantidad preferida en las formulaciones de dosis múltiples es de 1 mM hasta 10 mM. En las formulaciones libres de HSA, la cantidad preferida en las formulaciones de uso único es de 0.05 mM hasta 5 mM, y la cantidad preferida en las formulaciones de dosis múltiples es de 1 mM hasta 10 mM. Los conservadores contemplados para su uso en las formulaciones de dosis múltiples de la presente invención incluyen alcohol bencílico, cloruro de benzalconio, clorobutanol, cresol, fenol y parabens . La cantidad de conservador incluido estará en el intervalo de 0% hasta 2% (p/v) y la cantidad preferida en las formulaciones es de 1% (p/v) . Las formulaciones de la presente invención pueden incluir además un agente de ajuste de la isotonicidad para hacer isotónica a la solución y más compatible para inyección. Los agentes de tonicidad típicos son bien conocidos en el arte e incluyen pero no están limitados a cloruro de sodio, manitol, glicina, y sorbitol. El agente preferido es cloruro de sodio dentro de un intervalo de concentración de 0 mM hasta 200 mM. Se contempla que otros anti-oxidantes pueden ser incluidos en las formulaciones de la presente invención. Los anti-oxidantes contemplados para su uso en la preparación de las formulaciones incluyen aminoácidos tales como glicina y lisina, agentes quelantes tales como EDTA y DTPA, y depuradores de radicales libres tales como sorbitol y manitol . Las formulaciones de NESP preferidas contempladas para su uso en la presente invención contendrán 1-5000 µg/ml de NESP, 10 mM a 30 mM de amortiguador de fosfato, 100 mM hasta 200 mM de NaCl, 0.001% hasta 0.1% (p/v) de polisorbato 80, y 0.5 mM hasta 50 mm de L-metionina, pH 5.0-7.0; y más preferentemente, 10-500 µg/ml de NESP, 20 mM de amortiguador de fosfato, 140 mM de NaCl, 0.005 % (p/v) de polisorbato 80, y 1 mM de L-metionina, pH 6.2._ Las formulaciones de EPO preferidas contempladas para su uso en la presente invención contendrán 50-500,000 IU/ml de EPO, 0.01 mM hasta 5 mM de amortiguador de fosfato, 0.01 mM hasta 150mM de NaCl, 5 mM hasta 50 mM de L-arginina o L-histidina o una sal de la misma, 0.001% hasta 0.1% (p/v) de polisorbato 80, y 0.5 mM hasta 50 mM de L-metionina, pH 5.0-7.0; y más preferentemente, 750-48,000 IU/ml de EPO, 2 mM de amortiguador de fosfato, 110 mM de NaCl, 43.1 mM de L-arginina HC1, 0.005 % (p/v) de polisorbato 80, y 0.5, 1, 2, 3 ó 5 mM de L-metionina, H 6.0; ó 2 mM de amortiguador de fosfato, 142 mM de NaCl, 9.54 mM de L-histidina HC1, 0.006% (p/v) de polisorbato 80, y 0.5, 1, 2, 3 ó 5 mM de L-rn.etion.ina, pH 6.0. También está contemplado para su uso en la inhibición de la oxidación de la metionina la colocación de una capa de nitrógeno. La capa de nitrógeno puede ser introducida al espacio superior de un vial o jeringa prellenada por purgado con nitrógeno durante el proceso de llenado . Los siguientes ejemplos son ofrecidos para ilustrar más completamente la invención, pero no van a ser interpretados como limitativos del alcance de la misma. Ej emplo 1 Este ejemplo describe la preparación de formulaciones de dosis múltiples y . de un solo uso, que contienen HSA y libres de HSA, de EPO y NESP. Las preparaciones de proteínas de EPO y NESP fueron preparadas como se describe en la sección de Materiales y Métodos posterior . Las formulaciones que contienen HSA de NESP y/o EPO fueron preparadas entonces agr.egando 0.1-1% de albúmina, los agentes de amortiguación apropiados (por ejemplo, fosfato de sodio), y un modificador de la tonicidad (por ejemplo, cloruro de sodio) a la preparación de proteina para obtener formulaciones que tienen las concentraciones deseadas de proteina y excipientes. Las formulaciones libres de HSA de NESP y/o EPO fueron preparadas reemplazando la albúmina con otras proteínas recombinantes o agentes tensioactivos aceptables farmacéuticamente (por ejemplo polisorbato 20 u 80) . Las formulaciones de dosis múltiples fueron preparadas introduciendo conservador (es ) (por ejemplo alcohol bencílico) a las formulaciones que contienen HSA o libres de HSA. Ejemplo 2 Este ejemplo describe experimentos en donde el efecto de la L-metionina libre durante la adición (introducida por la luz) de NESP fue evaluada. Aunque el mecanismo fundamental no está' claro, bajo condiciones extremas, la luz introduce una adición significativa a las formulaciones de NESP. Las- formulaciones libres de HSA, de un solo uso, de NESP,. preparadas . como se describió en el ejemplo 1 fueron utilizadas en el experimento. Los viales de vidrio que contienen la proteína fueron colocados en una caja de iluminación de rayos UV y fueron incubados toda la noche (16 horas) con exposición a la luz UV continua. Las muestras fueron analizadas con SEC-CLAR. Como se muestra en la figura 1, la adición de metionina libre 10 mM redujo significativamente la velocidad de adición.
Ejemplo 3 Este ejemplo describe experimentos en donde el efecto de la L-metionina libre durante la adición de NESP en la presencia de alcohol bencílico fue evaluado. Aunque el mecanismo fundamental no es claro, el alcohol bencílico introduce una adición muy pequeña a las formulaciones de NESP aún durante el almacenamiento a 2-8 °C. Las formulaciones libres de HSA, de dosis múltiples, de NES, preparadas como se describió en el Ejemplo 1 fueron utilizadas en el experimento . Las formulaciones de dosis múltiples que contienen 1% de alcohol bencílico fueron incubadas durante 13 meses a 2-8 °C y se analizaron con el método de SEC-CLAR. Como se muestra en la figura 2, la adición de metionina libre 1 mM-20 mM redujo significativamente la velocidad de adición. ¦Ejemplo 4 Este ejemplo describe experimentos en donde- varios aditivos y tratamientos fueron probados para verificar su capacidad para inhibir la oxidación de metionina en las formulaciones de un solo uso libres de HSA de NESP. Las formulaciones de un solo uso libres de ESA de NESP preparadas como se describe en el ejemplo 1 fueron utilizadas en los experimentos . En primer lugar, el efecto protector de varios anti-oxidantes sobre NESP fue examinado por el experimento de adición conocida de peróxido de hidrógeno (descrito en la sección de Materiales y Métodos posterior) . Los aminoácidos libres de L-lisina, glicina y L-metionina fueron probados y el % de oxidación fue determinado por mapeo tríptico como se describe en la sección de Materiales y Métodos posterior. Se demostró convincentemente que la L-metionina libre previene la oxidación del residuo Met-54 de NESP en la presencia de peróxido de hidrógeno en exceso (véase la Tabla 1) . Tabla 1 A ti-O idante Oxidación de Met-54 de NESP (%) Glicina 100 Lisina 100 Metionina 37.3 Glicina + Lisina 100 Glicina + Metionina 35.3 Lisina + Glicina + Metionina 32.9
A continuación, se examinó el efecto protector de varios aditivos y tratamientos de NESP. Una formulación libre de HSA de NESP fue utilizada como un control. Los aditivos probados fueron 20mM de L-metionina, 10 inM de histidina y 0.1 mM de EDTA. La colocación de la capa de nitrógeno en el espacio superior también fue evaluada. Se determinó que la L-metionina libre, EDTA, histidina, y/o colocación de la capa de nitrógeno puede inhibir efectivamente la oxidación del residuo de met-54 de las formulaciones libres de HSA de NESP contra varios agentes oxidantes tales como los iones de peróxido, superóxido (véase la figura 3) . La combinación de L-Metionina libre ya sea con EDTA o histidina fue más efectiva en la inhibición de la oxidación que los aditivos individuales (véase la Figura 3) . La combinación de L-Metionina libre y la colocación de la capa de nitrógeno en el espacio superior también fueron más efectivas en el tratamiento individual (véase la Figura 3) . E emplo 5 Este ejemplo describe experimentos en donde varios aditivos y tratamientos fueron probados para verificar su capacidad para inhibir la oxidación de la metionina en las formulaciones de dosis múltiples libres de HSA de EPO y/o NESP. Las formulaciones de. dosis múltiples libres de HSA de EPO y/o NESP preparadas como se describió en el Ejemplo 1 fueron utilizadas en los experimentos. En primer lugar, el efecto protector de varias concentraciones de las formulaciones de dosis múltiples libres de HSA de EPO y/o NESP fue examinado por experimentos de adición conocida de peróxido de hidrógeno como se describe en el Ejemplo 2. Las formulaciones que contuvieron 1% de alcohol bencílico y concentraciones de metionina libre que varían desde 0-20 mM fueron probadas. Las muestras fueron incubadas durante 56 días ya sea a 4 °C o 29 °C. La adición de L-metionina libre se encontró que va a ser efectiva en la inhibición de la oxidación inducida por la impureza de alcohol bencílico en la formulación de dosis múltiples (véanse las Figuras 4 y 5) . A continuación, se evaluó el efecto de la metionina sobre las formulaciones de EPO libres de HSA + alcohol bencílico. La Figura 6 compara los mapas trípticos de EPO en soluciones con y sin alcohol bencílico, y es claro que la adición de este conjunto particular de alcohol bencílico puede conducir a la oxidación casi completa de EPO en solución a pH '7.0. Sin embargo, la adición de L-Metionina libre puede prevenir completamente la oxidación . de EPO en una solución que contiene el mismo alcohol bencílico. Además, se determinó que. purgar la solución amortiguadora con nitrógeno también podría reducir significativamente la velocidad de oxidación de Met-54 de NESP por el benzaldehído (véase la Figura 7) . Esto indica que la L-Metionina libre puede inhibir el efecto oxidante del oxígeno molecular disuelto sobre Met-54 de NESP. Ejemplo 6 Este ejemplo describe experimentos en donde el efecto de la oxidación de la metionina 54 sobre la actividad biológica de NESP fue evaluada. En primer lugar, las formulaciones de NESP fueron oxidadas con 0.01% de peróxido de hidrógeno en una duración diferente de tal modo que las muestras de NESP que contienen diferentes cantidades del residuo de metionina 54 oxidada pudieron ser obtenidas. Se determinó que la oxidación de metionina 54 no afectó adversamente la actividad biológica de NESP o EPO (véase la Tabla 2) . Tabla 2 Oxidación (' Actividad (%) In Vitro in vivo Control 121 121 15 92 133 39 95 125 57 90 109 76 102 100 100 95 106
A continuación, una concentración suficiente de peróxido de hidrógeno fue agregada y las muestras incubadas durante varios días de tal modo que la totalidad del residuo de metionina 54 en la solución de NESP es oxidada aún en la presencia de la L-metionina libre agregada. Se determinó que bajo tensión oxidante extrema, el NESP pierde actividad biológica, en aquellas muestras que no contuvieron metionina 28
libre se pierde una actividad biológica significativa (véase la Tabla 3) . Tabla 3 Oxidación de Muestra Metionina (%) Actividad (%)
OmM Met, 0.25% H202, 6 días 100 37
5p?? Met, 0.25% H202, 6 días 100 85 lOmM Met, 0.25% H202, 6 días 100 91
20mM Met, 0.25% H202/ .6 días 100 85 40niM Met, 0.25% ¾02, 6 días 100 77
La inactivación de NESP fue atribuida a la oxidación de otros residuos diferentes que la metionina. El triptófano, cisteína, e histidina fueron identificados como sitios de oxidación adicionales (véase la Figura 8) . La adición de metionina libre previene la inactivación oxidante de NESP protegiendo estos aminoácidos críticos de la oxidación (Tabla 3) . Materiales y Métodos La EPO utilizada en la presente invención puede ser preparada de acuerdo con la patente U.S. No. 4,703,008 (Lin) incorporada para referencia, anterior. La NESP utilizada en la presente invención puede ser preparado de acuerdo con la Publicación PCT No. 94/09257 incorporada para referencia, anterior.
El mapeo tríptico de ESP o EPO fue llevada a cabo digiriendo las proteínas con tripsina disponible comercialmente seguido por la separación de los péptidos con CLAR de fase inversa. Un experimento típico podría ser llevado a cabo como sigue: una alícuota de 20 µ? del amortiguador de digestión de tripsina, que contiene 20 mM. de Metionina, 500 mM de Tris (Base), y 5M de urea a pH 8.2, será agregada a 180 µ? de la muestra seguido por la adición de 4 µ? de 1 mg/ml de solución de tripsina. Después de 18 horas de digestión a temperatura ambiente, las muestras digeridas fueron analizadas por CIAR de fase inversa utilizando una columna Phenomenex Júpiter C18 (250 x 4.6, 300 A). Los experimentos de adición conocida de peróxido de hidrógeno fueron llevados a cabo agregando alícuotas pequeñas de peróxido de hidrógeno a la muestra que va a ser probada. Después de la incubación durante un tiempo predeterminado a temperatura ambiente, la reacción fue detenida por reducción de la temperatura del peróxido libre con la adición de L-metionina libre en exceso de 100 mM. La presente invención ha sido descrita en términos de las modalidades particulares encontradas o propuestas para comprendér los modos preferidos para la práctica de la invención. Se apreciará por aquellos con experiencia ordinaria en el arte, a la luz de la presente descripción, que se pueden hacer numerosos cambios y modificaciones en las modalidades particulares ejemplificadas sin apartarse del alcance propuesto de la invención. Se hace constar que con relación a este fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.