MXPA02005377A - Proceso de multiples etapas para la preparacion de una sal de mesilato de deferoxamina altamente puro. - Google Patents

Abstract

La presente invencion proporciona un proceso de purificacion mediante el cual la d eferoxamina B producida por un microorganismo y mezclada con otros polihidroxamatos producidos por el microorganismo pueden convertirse en su sal de mesilato sustancialmente libre de los demas polihidroxamatos y sustancialmente libre de ion cloruro. El proceso incluye al adsorcion y desorcion de la deferoxamina B sobre una resina de adsorcion, la precipitacion directa de la base libre deferoxamina B fuera del eluyente de la resina de adsorcion, el contacto de la base libre deferoxamina B con acido metanosul fonico y la aislacion de la sal de mesilato de deferoxamina B mediante precipitacion. Este proceso minimiza la descomposicion de deferoxamina B.

Description

PROCESO DE MÚLTIPLES ETAPAS PARA LA PREPARACIÓN DE UNA SAL DE MESILATO DE DEFEROXAMINA ALTAMENTE PURO SOLICITUD RELACIONADA Esta solicitud reivindica los beneficios de acuerdo con el Título 35, artículo 119 del Código de Estados Unidos de la Solicitud de Patente Húngara P 99 04454, presentada el 1 de diciembre de 1999.

CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se relaciona con un proceso para preparar mesilato de deferoxamina B altamente puro.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La deferoxamina B, representada p or la fórmula I, es un quelante de hierro de polihidroxamato que es útil para reducir la concentración del hierro en el plasma sanguíneo humano.

El nombre químico sistemático de la deferoxamina B (también denominada deferriferrioxamina B) es N' - [5- [ [4~ [ [5- (acetilhidroxiamino) pen il] amino] -1,4-dioxobutil] hidroxiamino] pentil] -N- (5-aminopentil) -N-hidroxibutanodiamida. La deferoxamina B tiene una propiedad deseable de alta afinidad con el hierro férrico (Ka= 10 31) acoplada con una muy baja afinidad con el c alcio (Ka= 10 2) . Goodman y Gilman, The Phar acologica.1 Basis of Therapeutics 1668 (9a edición, 1996) .

La deferoxamina B se indica para el tratamiento de intoxicación aguda con hierro y sobrecarga de hierro crónica debido a anemias dependientes de la trans fusión. Promueve la excreción de hierro en pacientes con sobre carga secundaria de hierro producida por múltiples transfusiones, como puede ocurrir con el tratamiento de algunas anemias crónicas tales como talasemia. La terapia a largo plazo hace más lenta la acumulación de hierro hepático y retarda o elimina el progreso de la fibrosis hepática. Physicians Desk Reference 2010 (54a Edición 1999) . La deferoxamina B no se absorbe bien por vía oral; debe administrarse por vía parenteral.

Los procesos de ferme ntación en escala industrial para producir deferoxamina B usan la cepa de la bacteria Streptomyces pilosus, que produce una variedad de compuestos de polihidroxamato, pero predominantemente deferoxamina B, en un medio de cultivo pobre en hierro. Patente Be lga N° 619.532. La deferoxamina B generalmente se aisla del caldo de fermentación como su sal de clorhidrato. La sal de clorhidrato no es farmacéuticamente aceptable para la administración parenteral a humanos. En consecuencia, se la debe convertir en una sal farmacéuticamente aceptable. La sal de mesilato es la sal de deferoxamina aprobada por la Administración de Alimentos y Drogas. La Farmacopea Estadounidense y Formulario Nacional establece que el mesilato de deferoxamina B a nivel farmacéutico deberá c ontener no más de 120 ppm de cloruro. USP/NF 24/19, páginas 499 -500 (1999) . Ésto ha demostrado que es una norma desafiante para cumplir y subsiste la necesidad de un proceso mejorado para transformar la deferoxamina B producida mediante la fermentación en una sal de mesilato pura farmacéuticamente aceptable para su administración a pacientes .

La Patente Belga 619.532 revela la purificación de la deferoxamina B obtenida mediante la fermentación usando cromatografía de adsorción. Carbono activado, tierra diatomácea activada (ej . tierra de batán) o resina de intercambio de iones (Asmit) son adsorbentes recomendados. Se dice que adsorbentes alternativos incluyen óxido de aluminio, silicatos de magnesio, gel de sílice, yeso y resinas de intercambio de iones. De acuerdo con la Patente Belga 619.532, la deferoxamina B puede eluirse usando una fase móvil de metanol-agua, piridina-agua o ácido acético -metanol .

La Publicación Internacional N° WO 93/09088 y la Patente Europea 347.163 describen la cromatografía sobre gel de sílice como un método para purificar la deferoxamina B producida por medios sintéticos, no por medios microbiológicos.

La Publicación Internacional N° WO 93/03045 describe la purificación de complejos quelados de hierro de deferoxamina B y compue stos relacionados estructuralmente usando una resina de adsorción de poliestireno.

Las Patentes Estadounidenses Nos. 3.153.621 y 3.118.823 revelan la purificación parcial de deferoxamina B usando resinas de intercambio de iones. Se cree que las enseñanza s de estas patentes derivan en una mezcla de deferoxamina B con otros polihidroxamatos producidos por la cepa Streptomyces pilosus .

La Patente Belga 616.139 revela que la sal de mesilato de deferoxamina B se puede obtener de la sal de clorhidrato de deferoxamina B pasando una solución acuosa de clorhidrato de deferoxamina B sobre Dowex -1, resina de intercambio de aniones X-16 (en la forma de OH), agregando ácido metanosulfónico en una cantidad equivalente a la base de deferoxamina en solución acuosa resul tante, luego evaporando el agua y finalmente, purificando la sal de mesilato de deferoxamina mediante la recristalización desde alcohol acuoso o una mezcla de agua metanol -acetona.

La Patente Estadounidense N° 5.374.71 describe la purificación de clorhidrato de deferoxamina B crudo mediante cromatografía de intercambio de iones y recristalización múltiple. La sal de mesilato se prepara directamente desde el clorhidrato de deferoxamina B purificado poniéndolo en contacto con una resina de intercambio de an iones que tiene un contra ion d mesilato. El mesilato de deferoxamina B se obtiene desde la solución acuosa mediante liofilización.

Bic el, H. et al. Helvética Chimica Acta, 1385-1389 (1963), describe la purificación de la base deferoxamina B mediante 1 a recristalización múltiple desde una mezcla de agua -alcohol. La base deferoxamina B se prepara mediante intercambio de aniones, evaporación hasta su secado, y múltiples recristalizaciones. La base deferoxamina B luego se suspende en una mezcla de agua -metanol y se prepara una sal acida mineral. Posteriormente la solución de deferoxamina B se evapora y el residuo se recristaliza desde una mezcla de agua -metanol .

La remoción del ion de cloruro desde una solución acuosa de deferoxamina B es uno de los pasos en cada uno de los métodos descriptos anteriormente para purificar la deferoxamina B desde un caldo de fermentación. En cada caso, el ion de cloruro se remueve usando una resina de intercambio de aniones. Sin embargo, las resinas de intercambio de iones solas no son eficaces para aislar el mesilato de deferoxamina B libre de ion de cloruro como se exige para lograr un estado de pureza farmacéuticamente aceptable.

Los métodos de purificación mencionados anteriormente que usan gel de sílice u óxido de alum inio como adsorbentes son ineficientes, insumen tiempo y son costosos. Los demás sustitutos, carbón activado, tierra diatomácea, silicatos de magnesio, y yeso, son adsorbentes de deferoxamina pobres. Por estos motivos, aún subsiste una necesidad en el arte de un método rápido, eficiente y no costoso para obtener el mesilato de deferoxamina B desde un caldo de fermentación libre de ion de cloruro, o por lo menos libre de anión de cloruro en una cantidad superior a 120 ppm.

Más aún, los métodos descriptos a nteriormente no remueven eficientemente los productos de la fermentación que están estructuralmente relacionados con la deferoxamina B, que deben removerse antes de usar la deferoxamina B en un producto farmacéutico. Generalmente, un extracto de un caldo d e fermentación que produce deferoxamina B contiene, en relación con el contenido de deferoxamina B, aproximadamente del 6% al 20% en moles de compuestos polihidroxamato que están estructuralmente relacionados con la deferoxamina B. Tales compuestos incluye n otras deferoxaminas , tales como deferoxamina A, C, D 1# D2, E, F y G. Como la deferoxamina B y otras deferoxaminas tienen propiedades químicas similares, ninguno de los proceso de purificación conocidos o combinaciones de ellos han podido reducir la canti dad de las impurezas por debajo del 2,5%.

Además de su efecto terapéutico incierto, y posiblemente tóxico, es importante remover estas impurezas para determinar con precisión la concentración de la deferoxamina B en una solución, tal como una solución es téril para inyección. La USP/NF especifica que una solución para inyección de deferoxamina B contiene entre el 90,0% y el 110% de la concentración rotulada. USP/NF 24/19, página 500 (1999) . El ensayo para determinar la concentración especificada por la USP/NF es una medición de la intensidad de absorbencia fotométrica del complejo de hierro a 485 nm. Id. Las impurezas relacionadas estructuralmente también forman complejos que absorben en la gama de 485 nm, lo cual deriva en una sobreestimación del contenido de deferoxamina B. Hemos descubierto que un ensayo fotométrico de una solución de mesilato de deferoxamina B obtenida mediante la fermentación de acuerdo con métodos conocidos en el arte sobreestima la concentración de deferoxamina B un 3%. Por lo tanto, subsiste la necesidad en el arte de un método rápido, eficiente y no costoso para obtener mesilato de deferoxamina B desde un caldo de fermentación libre de otros polihidroxamatos formados mediante los procesos metabólicos de Streptomyces (ej . pilosus o 101/87) así como libre de ion de cloruro.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN La necesidad de alta pureza en drogas para prevenir efectos indeseables causados por impurezas y la necesidad de precisión en la determinación de la potencia de la droga mesilato de deferoxamina B son satisfechas ambas por la presente invención. En el transcurso de nuestros experimentos con deferoxamina B, hallamos que los subproductos de la fermentación que no están químicamente relacionados con la deferoxamina B y sustancias relacionadas c on una polaridad significativamente diferente se pueden remover mediante cromatografía de adsorción, pero que otros polihidroxamatos no podrían. Hemos hallado que el medio más eficaz para reducir la cantidad de otros polihidroxamatos es la precipitación de la base libre deferoxamina B después de la limpieza preliminar mediante cromatografía de adsorción. También hemos hallado que se forman productos de la descomposición si la deferoxamina B se evapora hasta secarse. La deferoxamina B es un sólido razonablemente estable, pero está propenso a la descomposición en solución concentrada. Cuando una solución diluida de deferoxamina B se evapora, la concentración de la solución se eleva, lo cual causa la descomposición y un producto solidificado de baja pureza. Hal lamos que esta descomposición se puede minimizar mediante la concentración y el ajuste del pH del eluyente de la resina de adsorción dentro de ciertos parámetros y luego la precipitación directa de la base libre deferoxamina B del eluyente .

Por lo tanto, hemos descubierto que para remover eficientemente las impurezas de cloruro y polihidroxamato, para minimizar la formación de productos de descomposición, y para separarlos en la medida en que su formación es inevitale, se debe aplicar, en sucesión, cromat ografía sobre la resina de adsorción, precipitación de la base libre deferoxamina B desde una mezcla de agua y un solvente orgánico soluble en agua, foramción de la sal de mesilato de deferoxamina y cristalización de la sal desde una mezcla de agua y un antisolvente de sal de mesilato o desde una mezcla de metanol y un antisolvente de sal de mesilato. Este proceso produce mesilato de deferoxamina B que contiene menos del 2,5% en moles de otras impurezas de polihidroxamato y menos de 90 ppm de iones de cloruro.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un proceso de purificación para la producción de mesilato de deferoxamina B altamente puro desde un material fuente que contiene deferoxamina B producida mediante un proceso mic robiológico. El proceso de purificación es viable en una escala industrial y es altamente económico para otros procesos de purificación conocidos.

Los procesos microbiológicos para producir deferoxamina B son conocidos en el arte, por ejemplo el método d escripto en la Patente Estadounidense N° 3.158.552, que se incorpora en la presente invención como referencia en su totalidad. Como se describe en la patente ? 552, Streptomyces pilosus se cultiva en un medio de inmersión con un bajo contenido de hierro par a estimular la producción de deferoxaminas que el microorganismo usa para extraer hierro de su medio. Al final de la fermentación, la deferoxamina B se libera de su complejo con iones Fe3" en el medio de cultivo mediante el agregado de un agente quelante d e hierro competitivo, 8 -hidroxiquinolina. El ca]_do luego se filtra para remover la masa celular y se obtiene una solución acuosa que contiene deferoxamina B. Después de procesar nuevamente, clorhidrato de deferoxamina B, mezclado con otras deferoxaminas, s e precipita desde la solución acuosa.

El proceso de la presente invención se puede aplicar a un material fuente obtenido de un caldo de fermentación después de un procesamiento tal como concentración o extracción descripto en la patente 552 o después de 1 procesamiento descripto en la Patente Estadounidense N° 5.374.771. En forna similar, un extracto de caldo de fermentación evaporado que contiene deferoxamina B se puede recoger en un solvente acuoso u orgánico y usar como material fuente para deferoxamin a B. Preferentemente, el material fuente de deferoxamina B es una solución acuosa con una concentración de deferoxamina B de 5 a 70 g L '1 , más preferentemente de 10 a 30 g L _1. El proceso de purificación se describe además aplicado a tal solución acuosa de deferoxamina B (en adelante "la solución de deferoxamina B cruda") .

El proceso de purificación de la presente invención comprende tres etapas. Primero, las impurezas químicamente no relacionadas con deferoxamina B y sustancias relacionadas con polaridad significativamente diferente se remueven pro cromatografía sobre una resina de adsorción. En la segunda etapa, la deferoxamina B se separa del anión cloruro y otros polihidroxamatos mediante la precipitación de deferoxamina B como su base libre. En la ter cera etapa, la deferoxamina B, en la forma de base libre, se suspende en un solvente mezclado, se trata con ácido metanosulfónico para disolver la base libre y se cristaliza como su sal de mesilato.

Separación Croma tográfica de Impurezas En la primera e tapa de la invención, los compuestos que sen químicamente disímiles de la deferoxamina B y sustancias relacionadas con polaridad significativamente diferente se separan sustancialmente mediante el contacto del material fuente de deferoxamina B con un lecho de resina de adsorción y recogiendo la deferoxamina B en solución como un eluyente del lecho. Las resinas de adsorción preferidas son resinas de tipo aromático no sustituidas y sustituidas, resinas aromáticas con grupos hidrófobos, resina acrílicas y meta crílicas. Resina de adsorción especialmente preferidas incluyen resinas Diaion ® de las series FP, HP, SP y HPMG (Mitsubishi Chemical Corp.) y resinas Amberlite ® de la serie XAD (Rohm & Haas) , las más preferidas son Diaion ® SP 207 y Amberlite ® XAD 1180. La deferoxamina B se puede eluir desde estas resinas con una mezcla de agua y un solvente orgánico soluble en agua tal como metanol, etanol, acetonitrilo y tetrahidrofurano.

Un procedimiento cromatográfico preferido usa una pre -columna y una columna princip al que contiene lechos separados de resina de adsorción. De acuerdo con este procedimiento preferido, la solución de deferoxamina B cruda primero se eluye a través de una pre -columna que contiene una pequeña cantidad de resina de adsorción, es decir de 2 a 6 centesimos del volumen de la solución de deferoxamina B cruda. La pre columna se puede montar sobre la columna principal y la solución de deferoxamina B cruda se puede dejar pasar a través de la pre -columna sin eluir con solvente porque solamente una porción menor de la deferoxamina B es adsorbida sobre la pre columna. Alternativamente, la pre -columna se puede eluir con solvente. El eluyente puede ser una mezcla de agua y un solvente orgánico soluble en agua descripto anteriormente, pero preferentemente, para la retención mejorada de deferoxamina B sobre la columna principal, el solvente de elución, si se usa, es el agua salada descripta anteriormente. Una pre -columna puede derivar en una pequeña reducción en el rendimiento del mesilato de deferoxamina B al final del proceso pero su uso tiene la ventaja de una más alta pureza final y la ventaja económica de una mayor facilidad de regeneración de la resina de adsorción de la columna principal .

Después de pasar optativamente la solución de deferoxamina B cruda a través de una pre -columna, la solución preferentemente se trata con una sal inorgánica para mejorar la adsorción de deferoxamina B sobre la columna principal. Las sales de cloruro y sales de sulfato son sales inorgánicas preferidas, la más preferida es cloruro de amonio y sulfato de amonio. La sal inorgánica debe agregarse en una cantidad de 2 a 15 g L x de solución, más preferentemente de 5 -10 g L"1. La solución de deferoxamina B cruda luego se carga sobre una columna principal que contiene un lecho de resina de adsorción cuyo volumen es de 1 vigésimo del volumen de la solución de deferoxamina B cruda hasta el mismo volumen que el de la solución de deferoxamina B cruda. Preferentemente, el volumen del lecho de resina de adsorción es de 1/14 a % del v olumen de la solución de deferoxamina B cruda. Una solución de deferoxamina B cruda más altamente concentrada generalmente requiere menos resina que una solución más diluida. La deferoxamina B se adsorbe en la resina y la solución acuosa agotada de deferox amina B se deja drenar desde el lecho o se echa desde el lecho con una solución de sal inorgánica. La deferoxamina B parcialmente purificada luego se recupera de la resina de adsorción eluyendo con una mezcla de agua y un solvente orgánico soluble en agua tal como metanol, etanol, acetonitrilo o tetrahidrofurano, más preferentemente acetonitrilo. Generalmente, la proporción del solvente orgánico en la mezcla debe ser del 1% al 70% (v/v) , preferentemente del 1% al 50% (v/v) según la resina. En particular, una mezcla de agua : acetonitrilo : metanol de 88:12:3 es una mezcla de solventes muy buena para eluir deferoxamina B desde la resina Amberlite® XAD 1180.

El gradiente de elución también se puede usar ventajosamente para eluir deferoxamina B desde cualquiera de las resinas adecuadas. Uno de tales métodos de gradiente aplicables generalmente consiste en eluir primero con agua salada, luego con agua que contiene un solvente de elución orgánico. Eluir primero con agua, luego con una mezcla de agua -acetonitrilo o agua-metanol, optativamente seguida por la elución con una mezcla de agua -etanol o agua -acetona da buenos resultados. Un método de gradiente particularmente preferido para eluir deferoxamina B desde resina Amberlite ® XAD 1180 es eluir primero con agua salada , luego con una mezcla de 90:10 de agua-acetonitrilo, y luego aumentar gradualmente el contenido de acetonitrilo a una mezcla de agua -acetonitrilo de 80:20.

Sea que se use la elución con gradiente o sin gradiente, la deferoxamina B se recoge de la columna principal disuelta en un eluyente orgánico acuoso contenido en una o más fracciones cortadas de la corriente de eluyente. El eluyente que contiene deferoxamina B puede optativamente decolorarse por ejemplo mediante el tratamiento con carbono activado o un a resina de intercambio catiónico como Amberlite ® IRC 50, Duolite ® C467 y Lewatit® CNP 80 de acuerdo con métodos conocidos en el arte. Si la deferoxamina B se recoge en tres o más fracciones, una fracción de elución temprana, uno más fracciones de elución media y una fracción de elución tardía, luego la fracción (es) media que contiene deferoxamina B generalmente es incolora. Solamente las fracciones de elución temprana y tardía posiblemente tengan coloración. Por consiguiente, la deseabilidad de un tratamie nto de decoloración dependerá de cómo se corten las fracciones. Si se recogen tanto fracciones de elución temprana como tardía y se combinan con fracción (es) medias, es deseable usar tanto carbono activado como resina de intercambio de cationes para decolo rar ya que las fracciones de elución temprana y de elución tardía responden en forma diferente a métodos de decoloración diferentes.

Precipitación de Base Libre Deferoxamina B En la segunda etapa del proceso de la invención, la base libre deferoxamina B se precipita fuera del eluyente desde la resina de adsorción. Aunque la concentración de la deferoxamina B en el eluyente puede variar mucho según la mezcla (s) de solventes usada para eluir deferoxamina B desde la resina, no es necesario evaporar el eluye nte hasta secarlo para establecer una concentración apropiada y la composición del solvente para precipitar la base. La evaporación del eluyente hasta secarse es, de hecho, desventajosa debido a la inestabilidad de los grupos hidroxamato de deferoxamina B a la concentración alt¿ de la solución y el calor aplicado. En cambio, el eluyente se puede preparar para la precipitación de la base libre con un alto rendimiento y alta pureza mediante el siguiente procedimiento .

Si la concentración de deferoxamina B d el eluyente es inferior a 50 g L _1, el eluyente debe evaporarse en condiciones leves a una concentración de deferoxamina B de 50 g L _1 a 150 g L _1, preferentemente de 80 g L"1 a 100 g L"1 y más preferentemente de 90 g L -1. Los solventes de elución orgánico s preferidos enumerados anteriormente tienen punto de ebullición más bajo que el agua y en algunos casos son azeótropos con una cantidad menor de agua, de manera que la proporción del agua en la mezcla de solvente aumenta con la concentración. El eluyente concentrado luego se diluye con acetonitrilo en una cantidad de 0,5 a 1,5 veces el volumen del eluyente concentrado. Se halló que el agregado de acetonitrilo en esta etapa impide la precipitación de clorhidrato de deferoxamina B (o sulfato, según sea el caso según la sal orgánica usada) .

Luego se ajusta el pH del eluyente con concentración ajustada que contiene deferoxamina B en agua y acetonitrilo (y optativamente otro solvente de elución orgánico) a entre 8,6 y 10,5, más preferentemente entre 9,4 y 10,0 . El pH se puede ajustar usando una resina de intercambio de iones básica o agregando una solución alcalina acuosa o ambas. Las resinas de intercambio de iones básicas icnluyen resinas Amberlite ® de la serie IRA y resinas Diaion ® de la serie WK, la más pre ferida es Amberlite® IRA 67 en forma de OH ". Las soluciones alcalinas adecuadas son soluciones de NaOH, KOH, amoníaco o una amina, la más preferida es amoníaco acuoso concentrado.

En una técnica de ajuste de pH especialmente preferida, primero se ensaya el pH del eluyente con concentración ajustada. Éste es inferior a pH 8,0, el pH se ajusta a entre 8,0 y 9,3 con una resina de intercambio de iones básica tal como Amberlite® IRA 67 en forma de OH ". La resina luego se separa y se agrega amoníaco acuoso hast a que el eluyente de concentración ajustada alcanza un pH de entre 9,4 y 10,0.

Después del ajuste del pH, la cristalización de la base libre deferoxamina B se induce agregando un anti -solvente de base libre deferoxamina B tal como acetonitrilo, etanol, met anol, o acetona. Los anti -solventes de base libre deferoxamina B son acetonitrilo y mezclas de acetonitrilo -acetona. Como se usa en la presente invención, el término "anti -solvente" significa un líquido en el cual un compuesto es pobremente soluble. Por lo tanto el término anti -solvente se relaciona con la solubilidad de un compuesto particular en ese líquido. La presente invención usa dos clases de anti -solvente: anti -solventes de base libre deferoxamina B y anti -solventes de mesilato de deferoxamina B .

La velocidad de agregado del anti -solvente de base libre deferoxamina B al eluyente con pH ajustado no es crítica, pero una velocidad de agregado más lenta tiende a producir cristales de mayor tamaño y una base libre deferoxamina B cristalina más pura. En una escala de producción, una velocidad de agregado práctica es de 0,5 a 2 veces el volumen del eluyente de pH ajustado por hora, aunque se puede lograr un tamaño de cristal aumentado y una pureza más alta con una velocidad de agregado más lenta. La canti dad total del anti solvente de base libre deferoxamina B agregado es preferentemente de 1,5 a 10 veces, más preferentemente de 2 a 8 veces y más preferentemente de 2,5 a 5 veces el volumen del eluyente de pH ajustado. La temperatura de la solución se puede mantener en cualquier punto de -20°C a 40°C durante la cristalización, aunque preferentemente la temperatura se mantiene entre 0°C y 20°C.

Después de completar la cristalización, los cristales de base libre deferoxamina B se pueden aislar por cualquier medio convencional, tal como filtración o decantación. Optativamente, los cristales de la base libre se pueden purificar más mediante recristalización. Las mezclas de acetonitrilo-agua también son buenos sistemas de solventes para la recrístalización .

Cristalización de Mesila to de Deferoxamina B En la tercera etapa del proceso de la invención, la base libre cristalizada se supende en un solvente mezclado. Luego se agrega ácido metanosulfónico a la suspensión que hace que la base libre deferoxamina B entr e en solución. Después de completar la disolución de la base libre deferoxamina B, se continúa agregando ácido metanosulfónico hasta que la solución alcanza un pH de 3 a 6, más preferentemente de 3,4 -4,5. Luego se deja precipitar el mesilato de deferoxamina B.

Los solventes mezclados adecuados para suspender la base libre deferoxamina B son mezclas de un solvente de mesilato de deferoxamina B, agua o metanol, y un anti -solvente de mesilato de deferoxamina B. Los anti -solventes de mesilato de deferoxamina B incluyen alcoholes alifáticos de C ?-C7, acetona, formato de metilo, acetato de metilo, acetato de etilo, hexano, tolueno, tetrahidrofurano y acetonitrilo. El componente de solvente polar del solvente mezclado, es decir el metanol o el agua, preferentemen te se mezcla a una razón de 1:1 a 1:10 con el componente de anti -solvente, más preferentemente en una razón de 1:5. Los solventes mezclados preferidos son mezclas de agua -etanol, mezclas de agua acetonitrilo, mezclas de metanol -etanol y mezclas de metanol -acetonitrilo, las más preferidas son las mezclas de agua: etanol de 1:5 y las mezclas de metanol -etanol de 1:3. El volumen del solvente mezclado que debe usarse para suspender la base libre es de 5 a 20 L por kilogramo de la base libre deferoxamina B, más preferentemente de 7 a 15 L por kilogramo.

Después de formar la suspensión, se agrega ácido metanosulfónico a la suspensión. La cantidad del ácido metanosulfónico que se requiere es puede aproximar calculando la cantidad requerida para proveer un equivale nte del ácido a la base. Alternativamente, la cantidad del ácido metanosulfónico necesaria para proveer un equivalente se puede medir con precisión observando la cantidad de la base libre sin disolver que queda suspendida durante el agregado del ácido. El ácido metanosulfónico debe agregarse lentamente con este propósito ya que la velocidad a la cual la base suspendida puede reaccionar con el ácido es la velocidad limitada por el área superficial de los cristales. Después de que toda la base libre deferoxam ina B se ha disuelto, el pH de la solución debe monitorearse, mientras se agrega ácido metanosulfónico adicional para llevar el pH de la solución a entre 3 y 6, preferentemente 3,5 -4,5. Después de que se alcanza el pH deseado, se dejan precipitar los crist ales de mesilato de deferoxamina B.

Para acelerar la precipitación, la solución se puede enfriar de -20°C a 10°C. Además, la precipitación se puede acelerar agregando más anti -solvente de mesilato de deferoxamina B a la mezcla, es decir agregando un ale ohol alifático de C ?-C7, acetona, formato de metilo, acetato de metilo, acetato de etilo, hexano, tolueno, tetrahidrofurano o acetonitrilo. Después de que la precipitación es completa, se aisla mesilato de deferoxamina B por medios convencionales tales com o filtración o decantación.

Habiendo así descripto el proceso de la invención con referencia a sus realizaciones preferidas, la invención se ilustrará a continuación con los ejemplos siguientes.

EJEMPLOS GENERAL Condiciones de HPLC (Fase Inversa) : col umna: C 10, tamaño de partícula 10 µ, longitud 250 mm, diámetro 4,6 mm; fase móvil: 5,5% THF/agua, 0,13% (NH 4) H2P04 (p/v), 0,04% de edetato de sodio (p/v); velocidad de flujo: 2 ml min. "1; detección: UV ?-220 nm.

EJEMPLO 1 Clorhidrato de deferoxamina B c rudo (7,88 kg) que contiene 5,30 kg de deferoxamina B se disolvió en agua (362 L) . La solución acuosa luego se pasó a través de un volumen igual de la resina de adsorción Diaion ® SP 207 (Mitsubishi Chemical Corpl) en una columna cromatográfica de 10 litros a una velocidad de flujo de 14 L h"1. El eluyente contenía 5,04 kg de deferoxamina,. Luego se agregó cloruro de amonio en una cantidad de 5 g L _1 a un eluyente con agitación hasta que el cloruro de amonio se disolvió completamente. La solución luego se car gó en una columna que contenía resina de adsorción Amberlite® XAD 1180 (132 L) (Rohm & Haas) y se la llevó al lecho con agua salada. La columna se eluyó con 10% de acetonitrilo-agua y luego 20% de acetonitrilo -agua a una velocidad de flujo de 14 L h "1. El eluyente se recogió en fracciones. La fracción principal dio una solución de clorhidrato de deferoxamina que contenía 4,53 kg de deferoxamina B. La fracción principal luego se decoloró sobre carbono activado (45 g) y resina de intercambio de iones Duolite® C467 (Rohm & Haas) en forma de H" que dio una solución de clorhidrato de deferoxamina que contenía 4,03 kg de deferoxamina B.

El eluyente decolorado se evaporó a una concentración de deferoxamina B de 90 g L "1. Luego se agregó un volumen de acetonitrilo igual al del eluyente de concentración y se ajustó la basicidad mediante el agregado de Amberlite ® IRA 67 (Rohm y Haas) en forma de OH a un pH de 8 , 0 -9, 3. Después del ajuste del pH con la resina de intercambio de aniones, el pH se elevó a entre 9,4 y 10, 0 con amoníaco acuoso. Luego precipitó base libre deferoxamina agregando dos volúmenes de acetonitrilo a la solución y enfriando a -5°C. La cristalización fue completa después de varias horas . Los cristales de base libre deferoxamina se aislaron mediante filtración y luego se suspendieron en acetonitrilo -agua a 1:1, se filtraron nuevamente, se lavaron con acetonitrilo y se secaron para dar 3,81 kg de base libre deferoxamina. La cromatografía por HPLC indicó que la base libre era 97% pura. Después del ensayo químico de USP <221> para determinar el contenido de cloruro, se halló que la base libre deferoxamina B precipitada tenía un contenido de cloruro inferior a 60 ppm. USP/NF 24/19, páginas 1867-1858 (1999).

La base libre deferoxamina se suspendió en una m ezcla de 14:3 de etanol y agua (42,5 L) . Se agregó lentamente ácido metanosulfónico diluido a la suspensión hasta que la base libre se disolvió y la solución alcanzó un pH de 3,7 a 5. Se agregó etanol (200 L) a la solución para precipitar la sal de mesilato y la supensión resultante se enfrió a -10°C y se mantuvo a -10°C durante varias horas. Los cristales resultantes se aislaron mediante filtración, se lavaron con etanol (50 L) y se secaron bajo vacío para dar 3,4 kg de mesilato de deferoxamina. La cromato grafía de HPLC indicó que el mesilato contenía 1,84% en peso de impurezas. El contenido de humedad determinado mediante el Análisis de Karl -Fischer fue -del 0,2% en moles. USP/NF 24/19, páginas 2003-2004 (1999) . La coloración fue mejor que Y5 medida de acue rdo con los criterios de Farmacopea Europea para calificar la coloración.

EJEMPLO 2 Clorhidrato de deferoxamina B crudo (707 g) que contiene 587 g de deferoxamina B se disolvió en agua (10 L) . La solución acuosa luego se pasó a través de una columna de cromatografía que contenía resina de adsorción Diaion ® SP 207 (1 L) a una velocidad de flujo de 0,35 L h ~1. Se halló que el eluyente de la columna contenía 562 g de deferoxamina B. Luego se cargó el eluyente sobre un lecho de resina de adsorción Amberlite ® XAD 1180. (7,2 L) en una columna de cromatografía. El lecho se eluyó a una velocidad de flujo de 0,7 L h _1, primero con 5,6 L de una solución de cloruro de amonio en agua a 10 g L "1 y luego con una mezcla de metanol -agua de 1:4. La deferoxamina B (432 g) se recogió en una sola fracción. Esta fracción se decoloró agitando sobre carbón activado (40 g) y se filtró. El eluyente decolorado se evaporó a una concentración de deferoxamina B de 60 g L"1.

Luego se agregó un volumen igual de acetonitrilo. Luego se agregó amoníaco acuoso concentrado hasta que la solución alcanzó un pH 9,8. Luego se agregaron cuatro volúmenes de acetonitrilo para precipitar la base libre deferoxamina B. La suspensión resultante se enfrió a -4°C y se mantuvo a temperatura reducida dura nte 24 h, después de cuyo tiempo los cristales se aislaron mediante filtración. Los cristales aislados luego se lavaron mediante tres repeticiones de suspensión de agua -acetonitrilo de 1:1 y filtración. Los cristales luego se secaron a 40°C a presión ambie nte para dar la base libre deferoxamina B (341 g) en 95,2% de pureza (p/p) determinada mediante HPLC y con un contenido de cloruro inferior a 60 ppm.

La base deferoxamina B luego se suspendió en una mezcla de etanol (3,1 L) y agua (0,46 L) . Se agregó len tamente ácido metanosulfónico hasta que la base deferoxamina B se disolvió y la solución alcanzó un pH de 3,5. Se agregaron otros 30 L de etanol a la solución para precipitar mesilato de deferoxamina B precipitado. La supensión resultante luego se enfrió d e -5°C a 0°C y se mantuvo a temperatura reducida durante 24 horas.

Los cristales se aislaron mediante filtración, se lavaron con etanol y se secaron bajo vacío para dar mesilato de deferoxamina B (299 g) con una pureza del 98% (p/p) determinada mediante análisis de HPLC.

EJEMPLO 3 Clorhidrato de deferoxamina B crudo (760 g) que contiene 530 g de deferoxamina B se disolvió en acetonitrilo : agua 1:1 (14 L) a 40°C. La solución resultante luego se filtró y el pH se ajustó a 9, 9 agregando una concentración de amoníaco acuoso. Luego se agregó acetonitrilo (49 L) para precipitar la base libre deferoxamina B. La suspensión resultante se enfrió a 17°C y se mantuvo a temperatura reducida durante cuatro horas. El precipitado se aisló mediante filtración, se lavó con acetonitrilo y se secó bajo presión reducida para dar base libre deferoxamina B (403 g) . La base luego se suspendió en agua (20 L) y se agregó lentamente ácido clorhídrico hasta que la base se disolvió y la solución resultante alcanzó un pH de entre 5,0 y 5,5.

La solución se cargó sobre un lecho de resina de adsorción Amberlite® XAD 1180 (7,2 L) en una columna de cromatografía y se eluyó con 25% de acetonitrilo -agua. La deferoxamina B (320 g) se obtuvo en una sola fracción. El eluyente que contiene deferoxamina B se decoloró sobre carbón activado (10 g) . Después de la filtración, el eluyente decolorado que contenía 305 g de deferoxamina B se concentró a 110 g L "x. Luego se agregó un volumen igual de acetonitrilo a la solución. El pH de la solución luego se ajustó a entre 8,6 y 9,0 agregando resina de intercambio de aniones Amberlite ® IRA 167 en forma de OH" . Se agregó amoníaco acuoso a la solución para precipitar base libre deferoxamina B. Se continuó agregando hasta que la suspensión alcanzó pH 9,8. La susp ensión luego se enfrió a 4°C y se mantuvo a presión reducida durante varias horas. Los cristales luego se aislaron mediante filtración y se suspendieron en una mezcla 1:1 de acetonitrilo -agua, se filtraron nuevamente y luego se secaron bajo presión reduci da. La base libre deferoxamina B secada luego se pulverizó antes de ser usada para preparar la sal de mesilato descripta en el Ejemplo 1, último párrafo. Se halló que base libre pulverizada era 97,8% (p/p) pura mediante el análisis de HPLC. La sal de mesilato obtenida usando este material contenía un 0,96% de impurezas (p/p) mediante análisis de HPLC y tenía un contenido de cloruro inferior a 60 ppm.

EJEMPLO 4 Se aisló mesilato de deferoxamina B desde deferoxamina B cruda de acuerdo con el proceso del Ej emplo 2 , excepto que el clorhidrato de deferoxamina B se eluyó desde el lecho de resina de adsorción /Amberlite ® XAD 1180 usando 15% de etanol -agua seguida por 25% de THF -agua. Se halló que el mesilato de deferoxamina (238 g) así obtenido tenía un contenido de impurezas del 1,73% (p/p) mediante el análisis de HPLC.

EJEMPLO 5 Se cromatografió clorhidrato de deferoxamina B cruda de acuerdo con el procedimiento descripto en el Ejemplo 1. Después de que el eluyente que contenía deferoxamina B se concentró a 9 0 g L _1 y se decoloró como se describió en el Ejemplo 1, el eluyente decolorado se dividió en tres porciones iguales que contenían 40 g de deferoxamina B cada una. Cada porción se diluyó con un anti -solvente. Una porción se diluyó con un volumen igual de m etanol, otra con un volumen igual de etano y otra con un volumen igual de acetona. El pH de cada una de las porciones luego se ajustó a entre 8,6 y 10,1 con amoníaco acuoso que hace que la base libre deferoxamina B salga de la solución. La precipitación se completó agregando el triple del volumen de la porción de una mezcla de 1:1 de acetonitrilo-anti-solvente a cada porción, es decir acetonitrilo-metanol, acetonitrilo -etanol o acetonitrilo acetona. Las suspensiones luego se enfriaron de -20°C a -5°C y la b ase libre deferoxamina B se aisló de cada suspensión mediante filtración. Los cristales luego se lavaron como se describió en el Ejemplo 1. Siguiendo el procedimiento para convertir la base libre en el mesilato en el Ejemplo 1, el mesilato de deferoxamina B se obtiene en cantidades de 24g 28g, partiendo de 40 g de deferoxamina B cruda. El contenido de impurezas del mesilato de deferoxamina B así obtenido fue entre el 1,1% y el 1,5% (p/p) .

EJEMPLO 6 Se siguió el proceso del Ejemplo 2, salvo que la deferox amina B cruda contenía anión sulfato y la resina Amberlite ® XAD 1180 se lavó con sulfato de amonio acuoso en lugar de cloruro de amonio acuoso y luego se eluyó con 10% de acetonitrilo -agua en lugar de una mezcla de 1:4 de metanol -agua. La sal de mesilato de deferoxamina B (261 g) así obtenida tenía un contenido de impurezas del 1,4% (p/p) medido mediante HPLC.

EJEMPLO 7 Una suspensión de base libre deferoxamina B se preparó de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 2 y se enfrió como se describió a 4°C . Una porción de un décimo de la suspensión que contenía 34,1 g de base libre deferoxamina B se calentó a 36°C y se agitó a temperatura elevada durante 1 hora y luego se filtró para recuperar la base libre. Los cristales recuperados luego se secaron y se c onvirtieron en el mesilato de deferoxamina B como se describió en el Ejemplo 2. El producto (27 g) tenía un contenido de impurezas del 1,4% (p/p) determinado mediante el análisis de HPLC.

EJEMPLO 8 Se siguió el proceso del Ejemplo 2, párrafos 1 y 2, ex cepto que una porción del eluyente que contenía 43,2 g de deferoxamina B no se decoloró. La base libre se precipitó dos veces desde esta porción del eluyente. La deferoxamina B primero se precipitó como se describió en Ejemplo 2, párrafo 2. Luego la base deferoxamina B ya precipitada se suspendió en una mezcla de acetonitrilo -agua 1:1 a una concentración de 40 -50 g L _1. Luego se agregó lentamente un molar de ácido clorhídrico a la suspensión hasta que la deferoxamina B se disolvió. La base libre deferoxamin a B luego se re -precipitó desde la solución siguiendo el procedimiento del Ejemplo 2, párrafo 2, y se transformó en la sal de mesilato como se describió en el Ejemplo 2, párrafo 3, para dar 27 g de mesilato de deferoxamina B. La coloración del producto no podía distinguirse de la del producto del Ejemplo 2. El contenido de impurezas medido mediante HPLC es 1,4% (p/p) .

EJEMPLO 9 Siguiendo el procedimiento del Ejemplo 1, se crcmatografió deferoxamina B cruda y el eluyente que contenía deferoxamina B (45,3 g) se decoloró. La solución decolorada se concentró a 90 g L "1 y se pasó a través de un lecho de resina de adsorción Diaion® SP 207. Continuando con el procedimento para precipitar la base libre y convertirla en la sal de mesilato como se describió en el s egundo y tercer párrafos del Ejemplo 1, se pueden obtener 31,5 g del mesilato y con solamente 1,46% (p/p) de impureza de acuerdo con el análisis de HPLC.

EJEMPLO 10 Se siguió el procedimiento del Ejemplo 1, excepto que los 200 L de acetonitrilo fueron s ustituidos por 200 L de etanol para inducir la precipitación de mesilato de deferoxamina. El mesilato de deferoxamina se obtuvo se obtuvo con un 94,7% de rendimiento .

Siguiendo el procedimiento del Ejemplo 1, pero sustituyendo propanol, butanol, alcohol amílico, hexanol y heptanol por etanol para inducir la precipitación del mesilato de deferoxamina B, el mesilato se obtuvo con rendimientos en la gama del 83,1% al 89,1%.

Sustituyendo formato de etilo, acetato de etilo, acetato de butilo, hexano y THF po r etanol en el procedimiento del Ejemplo 1, se obtiene mesilato de deferoxamina B con rendimientos en la gama del 88,1% al 93,1%.

En cada una de estas variaciones del procedimiento del Ejemplo 1, la impureza estaba presente en menos del 2,5% (p/p) determinada por HPLC.

EJEMPLO 11 El mesilato de deferoxamina preparado de acuerdo con el Ejemplo 1 se recristalizó desde metanol y mezclas de metanol y otros solventes con rendimientos en la gama del 81,3% al 93,7%. La recristalización se realizó disolviendo m esilato de deferoxamina en 8,5 volúmenes de metanol a 35°C y luego agregando uno de los siguientes solventes a temperatura ambiente: metanol, etanol, propanol, butanol, formato de etilo, acetato de etilo, acetato de butilo, hexano, tolueno, THF o acetonitr ilo. El mesilato de deferoxamina B recristalizado típico tenía 1,2% -1,6% (p/p) de impureza, menor que el nivel de 1,84% (p/p) de impureza del material antes de la recristalización.

Habiendo descripto la invención con referencia a sus realizaciones preferidas y habiendo ilustrado la invención con ejemplos específicos, los expertos en el arte pueden, al leer esta invención, comprenden modificaciones que pueden hacerse sin apartarse del espíritu y el alcance de la invención. En consecuencia se debe comprend er que la descripción y los ejemplos presentados anteriormente tienen propósitos ilustrativos solamente y no deben interpretarse como limitantes del alcance de lainvención expuestos en las reivindicaciones siguientes.

Claims (26)

REIVINDICACIONES

1. Un proceso par a aislar mesilato de deferoxamina B de un material fuente que contiene deferoxamina B producida mediante un proceso microbiológico que comprende los pasos de: a) adsorber deferoxamina B en una resina de adsorción mediante el contacto del material fuente con la resina de adsorción, b) obtener un eluyente que contiene deferoxamina B eluyendo la resina de adsorción que tiene deferoxamina B adsorbida sobre ella con una mezcla de agua y un solvente de elución organice soluble en agua, c) ajustar el pH del elu yente entre 8,6 y 10,5 con una resina de intercambio de iones básica o una solución alcalina, o ambas , d) cristalizar base libre deferoxamina B desde el eluyente de pH ajustado agregando un anti -solvente de base deferoxamina B, optativamente después de la concentración parcial del eluyente en una concentración de deferoxamina B de no más de 150 g L_1, e) suspender la base libre deferoxamina B en un solvente mezclado que comprende un anti -solvente de mesilato de deferoxamina B y un solvente de mesilato de d eferoxamina B seleccionado del grupo formado por agua y metanol, f) disolver la base libre deferoxamina B en el solvente mezclado mediante el contacto de la suspensión con ácido metanosulfónico, y g) precipitar mesilato de deferoxamina B.

2. El proceso de la reivindicación 1, que además comprende el paso preliminar de pasar el material fuente a través de un lecho de pre-columna de resina de adsorción.

3. El proceso de la reivindicación 1, que además comprende el paso preliminar de agregar una sal inorg ánica al material fuente .

4. El proceso de la reivindicación 3, en donde la sal inorgánica es cloruro de amonio o sulfato de amonio.

5. El proceso de la reivindicación 1, en donde la resina de adsorción se eluye con una mezcla de agua y un solvente soluble en agua seleccionado del grupo formado por metanol, etanol, acetonitrilo y tetrahidrofurano.

6. El proceso de la reivindicación 5, en donde el solvente orgánico soluble en agua es acetonitrilo.

7. El proceso de la reivindicación 1, que además comp rende el paso intermedio de decolorar el eluyente antes de ajustar el pH del eluyente.

8. El proceso de la reivindicación 1, que además comprende ajustar la concentración de deferoxamina B del eluyente antes de ajustar el pH del elúyente.

9. El proceso de la reivindicación 8, en donde la concentración de deferoxamina B en el eluyente se ajusta de 50 g L"1 a 150 g L"1 mediante evaporación.

10. El proceso de la reivindicación 9, en donde la concentración de deferoxamina B se ajusta de 80 g L _1 a 100 g L.-1.

11. El proceso de la reivindicación 10, en donde la concentración de deferoxamina B se ajusta a 90 g L"1.

12. El proceso de la reivindicación 8, que además comprende agregar acetonitrilo al eluyente después del ajuste de la concentración y antes del ajuste del pH.

13. El proceso de la reivindicación 1, en donde el pH del eluyente se ajusta entre 9,4 y 10.

14. El proceso de la reivindicación 1, en donde el pH del eluyente se ajusta agregando una solución alcalina.

15. El proceso de la reivindic ación 14, en donde la solución alcalina es una solución de NaOH, KOH, amoníaco o una amina.

16. El proceso de la reivindicación 15, en donde la solución alcalina es amoníaco acuoso.

17. El proceso de la reivindicación 1, en donde el pH del eluyente se ajusta usando una resina de intercambio iónico básica .

18. El proceso de la reivindicación 13, en donde el pH del eluyente se ajusta entre 9,4 y 10 agregando una resina de intercambio iónico básico al eluyente hasta que se alcanza un pH de entre 8,0 y 9, 3, separando la resina de intercambio iónico básica y agregando amoníaco acuoso hasta que se alcanza un pH de entre 9,4 y 10.

19. El proceso de la reivindicación 1, en donde el solvente mezcldo en el cual se suspende la base libre deferoxamina B comprende agua y un anti -solvente de mesilato de deferoxamina B seleccionado del grupo formado por alcoholes alifáticos de C?-C7, acetona, formato de metilo, acetato de metilo, hexano, tolueno, tetrahidrofurano y acetonitrilo.

20. El proceso de la reivindicación 19, en donde el anti solvente de mesilato de deferoxamina B se selecciona del grupo formado por etanol, acetona y acetonitrilo.

21. El proceso de la reivindicación 1, en donde el solvente mezclado en el cual se suspende la base libre deferoxamina B comprende metanol y un anti -solvente de mesilato de deferoxamina B seleccionado del grupo formado por alcoholes alifáticos de C ?-C7, acetona, formato de metilo, acetato de metilo, hexano, tolueno, tetrahidrofurano y acetonitrilo.

22. El proceso de la reivindi cación 21, en donde el anti solvente de mesilato de deferoxamina B se selecciona del grupo formado por etanol, acetona y acetonitrilo.

23. El proceso de la reivindicación 1, en donde la precipitación de mesilato de deferoxamina B se acelera mediante enfriamiento.

24. El proceso de la reivindicación 1, en donde la precipitación de mesilato de deferoxamina B se acelera agregando un anti -solvente de mesilato de deferoxamina B seleccionado del grupo formado por alcoholes alifáticos de C x-C , acetona, format o de metilo, acetato de metilo, hexano, tolueno, tetrahidrofurano y acetonitrilo.

25. El proceso de la reivindicación 1, en donde el mesilato de deferoxamina B tiene un contenido de iones cloruro de 90 ppm o menos

26. El proceso de la reivindicación 1, en donde el mesilato de deferoxamina B precipitado contiene menos del 2,5% en moles salvo polihidroxamatos basados en los moles de deferoxamina B.