MXPA01008569A

MXPA01008569A - Metodo para producir aminoacido basico.

Info

Publication number: MXPA01008569A
Application number: MXPA01008569A
Authority: MX
Inventors: Kobayashi Masaki
Original assignee: Ajinomoto Kk
Priority date: 2000-08-24
Filing date: 2001-08-23
Publication date: 2003-05-19
Also published as: CN1982465A; US20020025564A1; EP2065471A1; KR20020016544A; CA2355492A1; DE60144083D1; JP2002065287A; CN1348009A; KR100858828B1; AU6358901A; JP4362959B2; TWI311587B; ZA200106984B; EP1182261B1; EP1182261A1; DK2065471T3; HU0103445D0; CN1982465B; DK1182261T3; CA2355492C

Abstract

Cuando se produce un aminoacido basico al cultivar un microorganismo que tiene capacidad para producir el aminoacido basico en un medio liquido bajo condicion aerobica para producir y acumular el aminoacido basico en el medio, el pH del medio se controla para que sea de 6.5-9.0 durante el cultivo, y 7.2-9.0 al termino del cultivo, y un periodo de cultivo donde se asegura que 2g/L o mas de iones de hidrogencarbonato y/o iones de carbonato existen en el medio durante el cultivo al controlar la presion en un tanque de fermentacion para que sea una presion positiva durante la fermentacion, o abasteciendo gas dioxido de carbono o un gas mezclado que contiene gas dioxido de carbono al medio, de manera que los iones de hidrogencarbonato y/o iones de carbonato deban servir como contra iones de cationes que principalmente consisten del aminoacido basico.

Description

MÉTODO PARA PRODUCIR AMINOÁCIDO BÁSICO ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiera a un método para producir un aminoácido básico mediante la fermentación y un producto de fermentación de aminoácido básico. Los aminoácidos básicos son útiles, por ejemplo, L-lisina es útil como un aditivo para el alimento animal y L-argínina y L-histídina son útiles para reparaciones farmacéuticas tales como infusiones.

TÉCNICA ANTCEDENTE RELACIONADA En los métodos para producir aminoácidos básicos mediante fermentación, los microorganismos que tienen capacidad para producir un aminoácido básico se cultivan para producir y acumular el aminoácido básico en caldo de cultivo, y el aminoácido básico se recolecta a partir del caldo de cultivo. En dichos métodos, el cultivo se lleva a cabo como un cultivo en lote, cultivo de alimentación o cultivo continuo. En dicha producción de aminoácidos básicos mediante fermentación, los ¡ones sulfato o iones cloruro se han añadido convencionalmente a un medio como contra aniones con el objeto de mantener la neutralidad eléctrica. Como una fuente de iones de sulfato, estos se administran principalmente como sulfato de amonio (publicación de patente japonesa abierta al publico Kokai Nos.5-30985 y 5-244969). En la mayoría de los casos, la recolección de aminoácidos básicos a partir del caldo de cultivo se lleva a cabo mediante un método de intercambio iónico, cuando se requiere purificación. Por ejemplo, en el caso de Lisina después de que el caldo de fermentación se ha hecho ligeramente ácido, la L-lisina se absorbe sobre una resina de intercambio iónico y luego se desorbe a partir de la resina con iones de amonio. La L-lisina desorbida se utiliza como una base de lisina o se cataliza como un hidrocloruro de L-lisina con ácido clorhídrico. Por otra parte, cuando no se purifican, el caldo de fermentación se concentra tal como esta, o después de que este se ha hecho ligeramente ácido con ácido clorhídrico o ácido sulfúrico y luego se somete a granulación por aspersión. En este caso, puesto que el contenido del aminoácido básico en el producto de fermentación obtenido está restringido por los componentes residuales contenidos en el medio, los contra aniones añadidos al medio no pueden ignorarse. Por lo tanto, la reducción de la cantidad de los contra aniones a ser usados tiene un significado importante en vista no solamente del costo de producción sino también de la calidad del producto. Por cierto, los microorganismos descargan una gran cantidad de gas dióxido de carbono durante la fermentación a través del metabolismo fisiológico tal como la respiración. La publicación de patente japonesa abierta al público No. 11-243985 describe un método para recolectar el gas dióxido de carbono en la fermentación de ácido L-glutámico caracterizado porque se permite el uso de un hidrogencarbonato de sodio y/o carbonato de sodio para que actúe sobre el ácido L-glutámico separado y obtenido a partir de caldo de fermentación de ácido L-glutámico en un medio acuoso para producir monosodio de L-glutamato y, al mismo tiempo, recolectar el gas dióxido de carbono no se utiliza efectivamente durante la fermentación BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Un objetivo de la presente invención es proveer una técnica para reducir una cantidad de fuente de contra anión a ser añadido a un medio durante la producción de aminoácidos básicos medíante fermentación. Los inventores de la presente invención encontraron que la cantidad de la fuente de contra anión debe reducirse y que el gas dióxido de carbono producido durante la fermentación puede utilizarse efectivamente al emplear gas dióxido de carbono en lugar de contra aniones tale como iones de sulfato, y por lo tanto logrando la presente invención. Es decir, la presente invención provee los siguientes. (1 ) Un método para producir un aminoácido básico, o caldo de fermentación o producto de fermentación que contiene el aminoácido básico mediante la fermentación que comprende el paso de cultivar un microorganismo que tiene capacidad para producir el aminoácido básico en un medio líquido bajo condición aeróbica para producir y acumular el aminoácido básico en el medio, donde: el pH del medio se controla para que sea de 6.5-9.0 durante el cultivo, y 7.2-9.0 al termino del cultivo, y un período de cultivo donde se aseguran que existen en el medio 2 g/L o más de iones de hidrogencarbonato y/o ¡ones de carbonato durante el cultivo al controlar la presión en un tanque de fermentación para que sea una presión positiva durante la fermentación, o abasteciendo el gas o bióxido de carbono o un gas mezclado que contiene gas bióxido de carbono al medio, de manera que los ¡ones de hídrogencarbonato y/o ¡ones de carbonato deben servir como contra ¡ones de los cationes principalmente consistiendo de aminoácidos básicos. (2) El método para producir un aminoácido básico, o caldo de fermentación o producto de fermentación que contiene el aminoácido básico de conformidad con (1 ), en donde la presión en el tanque de fermentación es 0.03-0.2 MPa. (3) El método para producir un aminoácido básico, o caldo de fermentación o producto de fermentación que contiene el aminoácido básico de conformidad con (1 ) ó (2), donde el aminoácido básico consiste de uno o más tipos de aminoácidos seleccionados a partir de L-lisina, L-arginina y L-histidina. (4) Un caldo de fermentación que contiene un aminoácido básico obtenido por el cultivo de un microorganismo que tiene capacidad para producir el aminoácido básico en un medio líquido bajo condición aeróbica o un producto de fermentación producido por el caldo de fermentación, el cual contiene iones hidrogencarbonato y/o iones carbonato como contra iones de cationes principalmente consistiendo de los aminoácidos básicos en una relación de normalidad de 5-80%, cuya relación se calcula de acuerdo con la siguiente ecuación: Relación de normalidad = [Normalidad de los iones hidrogencarbonato y/o iones carbonatoj/fNormalidad de los cationes que consiste principalmente de los aminoácidos básicos] x 100 (5) El caldo de fermentación que contiene un aminoácido básico o producto de fermentación de conformidad con (4), donde el aminoácido básico consiste de uno o más tipos de aminoácidos seleccionados a partir de L-lisina, L-arginina y L-histidina. (6) Un caldo de fermentación o producto de fermentación que contiene un aminoácido básico, el cual se obtiene al permitir al caldo de fermentación que contiene un aminoácido básico o al producto de fermentación de acuerdo con (4) que descargue gas bióxido de carbono. De acuerdo con la presente invención, pueden reducirse las cantidades de materiales industriales tales como sulfato de amino, y por lo tanto los aminoácidos básicos pueden producirse a un costo bajo. Además, aunque el caldo de fermentación obtenido contiene iones carbonato y/o hidrogencarbonato, estos pueden descargarse fácilmente hacia la atmósfera mediante calentamiento. Por lo tanto, puede obtenerse un caldo de fermentación o producto de fermentación que tiene una concentración alta de aminoácido en contenido sólido.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra un curso de tiempo de las relaciones de normalidad de los iones sulfato así como los iones carbonato y iones hidrogencarbonato con respecto a los cationes principalmente que consisten de lisina en el caldo de cultivo y la presión en el tanque de fermentación obtenido en el ejemplo 1 y comparativo con el ejemplo 1. La figura 2 muestra un curso de tiempo de la relación de la normalidad de los iones sulfato así como los ¡ones carbonato y iones hidrogencarbonato con respecto a los cationes que consisten principalmente de lisina en caldo de cultivo y la presión en el tanque de fermentación obtenido en el ejemplo 2 y comparativo al ejemplo 2.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se explicará en detalle a continuación el método de la presente invención se caracteriza por utilizar ya sea uno o ambos iones carbonato y iones hidrogencarbonato como contra iones principales del aminoácido básico en un método para producir un aminoácido básico mediante la fermentación que comprende cultivar un microorganismo que tiene capacidad para producir el aminoácido básico en un medio líquido bajo condición aeróbica para producir y acumular el aminoácido básico en el medio. El aminoácido básico producido por el método de la presente invención puede consistir de, por ejemplo, uno o más tipos de aminoácidos seleccionados a partir de L-lísina, L-arginina y L-histidina. El microorganismo que tiene capacidad para producir un aminoácido básico que se utiliza en el método de la presente invención no se limita particularmente, y cualesquiera microorganismos pueden utilizarse siempre y cuando estos puedan producir un aminoácido básico medíante fermentación. Los ejemplos de dichos microorganismos incluyen, por ejemplo, bacteria corineforme, bacteria que pertenece al género Escherichia, Serratia, Bacillus y otras. Aunque la bacteria corineforme y la bacteria Escherichia se explicarán a continuación, el microorganismo usado para el método de la presente invención no se limita estas bacterias. La bacteria corineforme incluye aquellas que han sido clasificadas dentro del género Brevibacterium, pero que se han unido en el género Corynebacterium actualmente (Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1981 )), e incluye bacteria que pertenece al género Brevibacterium cercanamente relacionada al género Corynebacterium. Los ejemplos de dichas bacterias corineformes son como se mencionan a continuación. Corynebacterium acetoacidophilum Corynebacterium acetoglutamicum Corynebacterium alkanolyticum Corynebacterium callunae Corynebacterium glutamicum Corynebacterium lilium (Corynebacterium glutamicum) Corynebacterium melassecola Corynebacterium thermoaminogenes Corynebacterium herculis Brevibacterium divaricatum (Corynebacterium glutamicum) Brevibacterium flavum (Corynebacterium glutamicum) Brevibacterium immariophilum Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum) Brevibacterium roseum Brevibacterium saccharolyticum Brevibacterium thiogenitalis Brevibacterium álbum Brevibacterium cerinum Microbacterium ammoniaphilum Como un ejemplo de la bacteria que pertenece al género Escherichia, puede mencionarse Escherichia coli. Los ejemplos de la bacteria corineforme que tiene capacidad para producir L-lisina incluye cepas mutantes resistentes a S-(2-aminoetil)-cisteina (abreviada como "AEC" de aquí en adelante), cepas mutantes que requieren aminoácidos tales como L-homoserina para su crecimiento (publicación de patente japonesa (kokoku) Nos. 48-28078 y 56-54999), cepas mutantes resistentes a AEC y aminoácidos que se requieren adicionalmente tales como L-leucina, L-homoserina, L-prolina, L-serina, L-arginina, L-alanina y L-valina (patente de E.U.A. Nos. 3,706,395 y 3,825,472), cepas mutantes productoras de L-lísina resistentes a DL-á-amino-á-caprolactamo, a-amino- laurilactamo, análogo de ácido aspártico, fármaco sulfa, quinoide y N-lauroilleucina, cepas mutantes productoras de L-lisina resistentes a oxaloacetato de carboxilasa o a un inhibidor de la enzima del sistema respiratorio (patente japonesa abierta al público Nos. 50-53588, 50-31093, 52-102498, 53-9394, 53-86089, 55-9783, 55-9759, 56-32995, 56-39778, publicación de patente japonesa Nos. 53-43591 y 53-1833), cepas mutantes productoras de L-lísina que requieren inosítol o acetato (patente japonesa abierta al público Nos. 55-9784 y 56-8692), cepas mutantes productoras de L-lisina que son sensibles a ácido fluoropirúvico o a una temperatura de 34°C o superior (patente japonesa abierta al público Nos. 55-9783 y 53-86090), cepas mutantes reproductoras de L-lísina de bacteria Brevibacterium o Corynebacterium resistente a etilenglicol (solicitud de patente de E.U.A. No. 333, 455) y otras. Los ejemplos específicos son Brevibacterium lactofermentum ATCC31269, Brevibacterium flavum ATCC21475 y Corynebacterium acetoglutamicum A TCC21491.

Como la bacteria que produce L-lisina que pertenece al género Escherichia, las cepas mutantes resistentes al análogo de L- lisina pueden ejemplificarse. Este análogo de L-lísina es una sustancia que inhibe el crecimiento de la bacteria que pertenece al género de bacteria Escherichia, pero esta inhibición se desensibiliza completamente o parcialmente si la L- lisina existe en el medio. Por ejemplo, pueden mencionarse la oxalisina, hidroxamato de lisina, (S)-2-aminoetil-L-cisteína (AEC), ?-metillisína, a-clorocaprolactamo y otras. Una cepa mutante resistente a estos análogos de lisina puede obtenerse a partir de microorganismos del género Escherichia mediante una técnica de mutación artificial usual. Los ejemplos específicos de las cepas bacterianas usadas para la producción de L-lísina ¡ncluyen AJ11442 de Escherichia coli (FERM BP-1543, NRRL B-12185; ver publicación de patente japonesa abierta al público No. 56-18596 y patente de E.U.A. No. 4,346,170) y Escherichia coli VL611. La cepa AJ11442 se depositó en el National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (actualmente, una corporación independiente administrativa, National Instítute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary) (Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japón, código postal: 305-5466) el 1° de mayo de 1981 , y recibió un número de acceso de FERM P-5084. Luego, ésta se transfirió a partir del depósito original anteriormente mencionado, a un depósito internacional según las provisiones del tratado de Budapest del 29 de octubre de 1987 y recibió un número de acceso de FERM BP-1543. En los microorganismos anteriormente mencionados, la inhibición por retroalimentación de la aspartocinasa se desensibiliza mediante L-lisina. Los ejemplos específicos de cepas Escherichia coli que tienen capacidad para producir L-lisina ¡ncluyen W3110 (tyrA)/pCABD2 de Escherichia coli (publicación de patente internacional W095/16042) y otras. La W3110 (tyrA)/pCABD2 de Escherichia coli es una cepa obtenida al introducir un plásmido pCABD2 que contiene genes del sistema enzimático para biosíntesis de L-lisina dentro de W3110 (tyrA), el cual es una cepa deficiente en TyrA de Escherichia coli. La cepa W3110 (tyrA), la cual se designa como AJ 12604, se depositó en el National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (actualmente, la corporación independiente administrativa, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary) (Chuo Da¡-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibarakí-ken, Japón, código postal: 305-5466) el 28 de enero de 1991 bajo el número de acceso de FERM P-11975, y luego se transfirió a un depósito internacional según las provisiones del tratado de Budapest del 29 de octubre de 1987 bajo un número de acceso de FERM BP-3579). El plásmído pCABD2 contiene un gen que codifica para un mutante tipo dihidrodipicolinato sintasa en la cual el residuo de histidina número 118 está reemplazado con un residuo de tirosina y la inhibición por retroalimentación por L-lisina está desensibilizada, el gen codifica para un mutante tipo aspartocinasa lll cuyo residuo de treonina número 352 está reemplazado con un residuo de isoleucina y la inhibición por retroalimentación por L-lisina está desensibilizada, y genes que codifican para dihidrodipicolinato reductasa y díaminopimelato dehidrogenasa. Además, la cepa W3110 (tyrA) de E. coli puede obtenerse como se describe a continuación. Esto es, muchas cepas se obtienen al introducir un plásmido dentro de la cepa W3110 (tyrA) y ésta se describen en la publicación de patente europea abierta al público No. 488424/1992. Por ejemplo, una cepa obtenida a partir de la introducción de un plásmido pHATerm se designa como cepa W3110 (tyrA)/pHATerm de E. coli, y se deposita en the National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (actualmente, la corporación independíente administrativa, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary) según un número de acceso de FERM BP-3653. La cepa W3110 (tyrA) puede obtenerse por, por ejemplo, eliminar el plásmido pHATerm a partir de esta cepa W3110 (tyrA)/pHATerm E. coli. La eliminación del plásmido puede llevarse a cabo en una manera convencional. Los ejemplos de las bacterias productoras de L-lisina que pertenecen al género Serratia ¡ncluyen bacteria Serratia transformada mediante la introducción de un ADN que codifica para un dihídrodipícolinato sintasa que tiene una mutación que desensibiliza la inhibición por retroalimentación por L-lisina dentro de sus células, y la bacteria Serratia que contiene una aspartocinasa cuya inhibición se desensibiliza mediante retroalimentación por L-lisina (WO96/41871 ). Los ejemplos de bacteria corineforme que tiene capacidad para producir L-arginina incluye las cepas de tipo silvestre de bacteria corineforme; bacteria corineforme resistente a ciertos agentes incluyendo fármacos sulfa, 2-tíazolealanína, ácido a-amino-ß-hidroxivalérico y otros; la bacteria corineforme exhibe auxotrofía para L-histídina, L-prolina, L-treonina, L-isoleucína, L-metionina o L-triptofano además de la resistencia a 2-tiazolalanina (patente Japonesa abierta al público No. 54-44096); la bacteria corineforme resistente a ácido cetomalónico, ácido fluromalónico o ácido monofluoroacético (patente Japonesa abierta al público No. 57-18989); bacteria corineforme resistente a arginínol (patente Japonesa abierta al público No. 62-24075); bacteria corineforme resistente a X-guanidína (X representa un derivado de ácidos grasos o una cadena linfática, patente Japonesa abierta al público No. 2- 186995) y otros. Específicamente, se pueden mencionar Brevibacteríum flavum AJ11169 (FERM BP-6892), Corynebacterium glutammicum AJ 12092 (FERM BP-6906), Brevibacterium flavum AJ11336 (FERM BP-6893), Brevibacterium flavum AJ11345 (FERM BP-6894) y Brevibacterium lactofermentum AJ 12430 (FERM BP-2228).

La cepa AJ11169 y la cepa AJ 12092 son las cepas resistentes a 2-tiazolalanina mencionadas en la patente Japonesa abierta al público No. 54-44096, la cepa AJ 11336 es la cepa que tiene resistencia a argininol y resistencia a sulfadiazina mencionada en la publicación en la patente Japonesa No. 62-24075, la cepa AJ11345 es la cepa que tiene resistencia a argininol, resistencia a 2-tiazolalanina, resistencia a sulfaguanidina, y que exhibe auxotrofía para histidina mencionada en la publicación de patente Japonesa No. 62-24075, y la cepa AJ 12430 es la cepa que tiene resistencia a octilguanidina y resistencia a 2-tiazolalanina mencionada en la patente Japonesa abierta al público No. 2-186995. Los ejemplos de la bacteria Escherichia que tiene capacidad para producir L-arginina incluye Escherichia coli introducida con el gen argA (ver patente Japonesa abierta al público No. 57-5693), y ejemplos de bacterias que pertenecen al genero Serratia que tiene capacidad para producir L-arginina incluyendo Serratia marcescens deficiente en la capacidad para metabolizar arginina y que exhibe resistencia a los antagonistas de arginína y canavanina y auxotrofía para lisina (ver patente Japonesa abierta al público No. 52-8729) Los ejemplos de bacteria corineforme que tiene capacidad para producción de L-histidina ¡ncluyen microorganismos que pertenecen al genero Brevibacterium y que tienen resistencia a un antagonista tiamína, específicamente, Brevibacterium lactofermentum FERM P-2170, FERM P-2316, FERM P-6478, FERM P-6479, FERM P-6480 y FERM P-6481 (publicación de patente Japonesa abierta al público No. 59-63194). Además, se pueden mencionar las cepas mutantes que pertenecen al genero Brevibacterium o Corynebacterium y que tiene resistencia a policétidos y capacidad para producir L-histidina, específicamente, FERM P-4161 , FERM P-7273, FERM P- 8371 , FERM P-8372 y ATCC14067. Los ejemplos de la bacteria que pertenece al genero Escherichia que tiene capacidad para producir L-histidina incluye las cepas mutantes que pertenecen al genero Escherichia y que tienen resistencia a un análogo de histidina, por ejemplo, cepa R-344 de Escherichia coli, y una bacteria que pertenece al genero Escherichia introducida con un gen de un sistema enzimátíco para la síntesis de L-histidina extraído a partir de una cepa antecedente. Específicamente, se pueden mencionar Escherichia coli NRRL-12116, NRRL-12118, NRRL-12119, NRRL-12120 y NRRL-12121 (publicación de patente Japonesa abierta al público No. 56-5099). Los ejemplos de la bacteria que pertenece al genero Bacillus que tiene capacidad para producir L-histidina ¡ncluye las cepas mutantes que pertenecen al genero Bacillus y que tienen resistencia para un análogo de histidina, y las bacterias que pertenecen al genero Bacillus introducidas con un gen obtenido a partir de una cepa mutante antecedente e implicadas en la resistencia a los antagonistas de histidina. Específicamente, se pueden mencionar FERM BP-218, FERM BP-224 y FERM BP-219 (publicación de patente Japonesa abierta al público No. 58-107192).

En la presente invención, un microorganismo que tiene la capacidad para producir un aminoácido básico puede cultivarse en un medio líquido bajo condición aeróbica, por ejemplo y específicamente, en la manera descrita a continuación, con el objeto de utilizar ya sea uno o ambos iones carbonato y iones hidrogencarbonato como contra iones principales del aminoácido básico. El pH del medio está controlado para que sea de 6.5-9.0, preferiblemente 6.5-8.0, durante el cultivo, y 7.2-9.0 al término del cultivo. Además, un período de cultivo donde se asegura que 2 g/L o más de iones de hidrogencarbonato y/o iones de carbonato existen en el medio durante el cultivo al controlar la presión en un tanque de fermentación para que sea una presión positiva durante la fermentación, o abasteciendo gas dióxido de carbono o un gas mezclado que contenía gas dióxido de carbono al medio. La expresión de "un período de cultivo en donde se asegura que 2 g/L o más de iones de hidrogencarbonato y/o iones de carbonato existen en el medio durante el cultivo" se usa aquí de manera que no necesariamente significa que los iones deben existir en una cantidad de 2 g/L o más por el período completo del cultivo, sino que significa que es suficiente que los iones existan en una cantidad de 2 g/L o más para cualquier período parcial del cultivo. Preferiblemente, el período en donde el ¡on existe en una cantidad de 2 g/L o más es un período de una fase logarítmica a una fase estacionaria.

En la presente invención, el incremento del pH controlado cambia el equilibrio a partir de uno donde el anión monovalente HC03- es dominante a uno donde el anión bivalente CO32", el cual es más efectivo como el contra ion, es dominante. Además, cuando pH se controla con amonio, el incremento de pH abastece amonio, y éste puede volverse una fuente de nitrógeno del aminoácido básico. Puesto que los cationes diferentes al aminoácido básico, K, Na, Mg, Ca y otros derivados a partir de los componentes del medio pueden mencionarse. Estos cationes cuentan para 50% o menos de los cationes locales. Con el objeto de obtener una presión positiva en un tanque de fermentación, por ejemplo, puede utilizarse una presión de alimentación de gas superior que la presión de gas agotado. Al usar una presión positiva en un tanque de fermentación, el gas dióxido de carbono producido por la fermentación se disuelve en el caldo de cultivo para formar iones de hidrogencarbonato o ¡ones de carbonato, y estos pueden servir como contra iones del aminoácido básico. Específicamente, la presión en el tanque de fermentación puede ser de 0.03-0.2 Mpa, preferiblemente 0.05-0.15 MPa. Además, el gas dióxido de carbono puede disolverse en el caldo de cultivo al abastecer gas dióxido de carbono o una mezcla de gas que contiene gas dióxido de carbono dentro del caldo de cultivo. Además, la presión en un tanque de fermentación puede controlarse para que se vuelva positiva, mientras que se abastece gas de dióxido de carbono o un gas mezclado que contiene gas dióxido de carbono dentro del caldo de cultivo.

Con el objeto de obtener una presión positiva en un tanque de fermentación, por ejemplo, puede utilizarse una presión de alimentación de gas superior que la presión de gas agotado. Cuando el gas dióxido de carbono se abastece a un caldo de cultivo, el caldo de cultivo puede burbujearse con gas dióxido de carbono puro o un gas mezclado que contiene 5 volúmenes % o más de gas dióxido de carbono. El medio líquido usado para el cultivo no esta particularmente limitado, y cualquier medio conocido convencional que contiene fuentes de nutrientes orgánicas o inorgánicas tales como fuentes de carbono y fuentes de nitrógeno y otras cantidades de nutrientes traza pueden usarse dependiendo del microorganismo a ser usado. Cualquier fuente de carbón puede utilizarse siempre y cuando un microorganismo pueda utilizarla. Por ejemplo, se pueden mencionar azucares tales como sacarosa, glucosa, fructosa, molasas y almidón hidrolizado, ácidos orgánicos tales como ácido acético, alcoholes tales como etanol y otros. Como fuente de nitrógeno, se pueden mencionar sustancias inorgánicas tales como iones de amonio, hidrolizado de proteína, extracto de levadura y otros. Como las cantidades de nutrientes traza, se pueden mencionar aminoácidos, vitaminas, cantidades de elementos metálicos traza y otros. El esquema de fermentación no esta particularmente limitado, y se puede llevar a cabo como cualquier lote de cultivo en donde el medio no se renueva recientemente, cultivos de introducción donde el medio se introduce cuando el azúcar añadida inicialmente se consume, y cultivos continuos en donde el medio se extrae cuando el volumen de un medio excede un volumen aceptable para un tanque de fermentación. Aunque la temperatura de cultivo puede seleccionarse adecuadamente dependiendo del microorganismo a ser utilizado, usualmente es de 25-45°C, preferiblemente 30-40°C. Además, la agitación suficiente se lleva a cabo y oxígeno suficiente se abastece durante la fermentación. En métodos convencionales, una cantidad suficiente de sulfato de amonio, cloruro de amonio o producto de descomposición de proteína obtenido con ácido sulfúrico o ácido clorhídrico se añade al medio con el objeto de usarlos como una fuente de contra aniones para el aminoácido básico producido, y por lo tanto el medio contiene ¡ones sulfato y ¡ones cloruro derivados a partir de aquellos materiales. Por lo tanto, la concentración de iones de carbonato, los cuales muestran altíves débil, es extremadamente baja durante el cultivo, y estos existen a un nivel de ppm la presente invención se caracteriza por la reducción de estos iones sulfato y ¡ones cloruro, y la disolución de gas de dióxido de carbono descargado a partir de microorganismos durante la fermentación en el medio en el medio ambiente de fermentación para usarlo como un fuente de contra ¡ones. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, no es necesario añadir iones de sulfato o iones de cloruro que excedan sus cantidades necesarias para el crecimiento del microorganismo. Preferiblemente, una cantidad adecuada de sulfato de amonio o similar se alimenta al medio en una etapa temprana del cultivo, y la introducción se detiene durante el cultivo. Alternativamente, el sulfato de amonio o similares pueden introducirse al medio, siempre y cuando se mantenga un buen balance con respecto a los ¡ones de carbonato o iones de hidrogencarbonato en el medio. Además, el amonio puede introducirse dentro del medio como una fuente de nitrógeno de L-lisina. Usualmente, el sulfato de amonio se añade a un medio como una fuente de contra ion del aminoácido básico, el dióxido de carbono en el caldo de cultivo se descargará mediante ¡ones sulfato. De acuerdo con la presente invención, en contraste, puesto que no es necesario añadir una cantidad excesiva de sulfato de amonio al medio, el dióxido de carbono puede disolverse fácilmente en el caldo de fermentación. El caldo de fermentación que contiene una aminoácido básico obtenido por la presente invención contiene ¡ones de carbonato o iones de hidrogencarbonato a una concentración de 5 a 80% con respecto a la normalidad del aminoácido básico producido por la fermentación. Estos ¡ones de carbonato o iones de hidrogencarbonato se descargan como gas dióxido de carbono al calentar, por lo tanto, puede incrementarse el contenido del aminoácido básico en los componentes sólidos en el caldo de fermentación. Además, si un ácido más fuerte que el ácido carbónico se añade al caldo de fermentación, este puede sustituirse fácilmente por el ácido carbónico, por lo tanto se pueden seleccionar varios tipos de sales. En la presente invención, el "producto de fermentación" incluye un producto concentrado y secado obtenido a partir de el caldo de fermentación anteriormente mencionado, el caldo de fermentación mismo y el producto seco del mismo. El aminoácido básico puede recolectarse a partir del caldo de fermentación por una combinación de técnicas conocidas tales como técnica de intercambio iónico en resina, técnicas de precipitación y otras técnicas.

EJEMPLOS De aquí en adelante, la presente invención se explicará más específicamente con referencia a los siguientes ejemplo.

EJEMPLO 1 (I) Cultivo semilla de la bacteria productora de L-lisina Un medio que contiene 45 g/L de glucosa, 15 g/L de molasas, 2 g/L (como nitrógeno) de hidrolizado de proteína de soya, 2 g/L de KH2PO , 5.6 g/L de NaOH, 10 g/L de sulfato de amonio, 0.8 g/L de MgS04«4H2O, 20 mg/L de FeSO4*7H2O, 20 mg/L de MnSO4*4H2O, 0.8 mg/L de hidrocloruro de tiamina y 0.2 mg/L de biotína (pH 6.0) se introdujo dentro de un tanque de fermentación de vidrio de volumen pequeño 1-L en una cantidad de 300 ml, y se esterilizó al calentar a 120°C por 20 minutos. Después de la fermentación el tanque se enfrió a 31.5°C, 5 asas de platino de Brevibacterium lactofermentum ATCC31269 que preliminarmente se habían crecido sobre una caja de LB por 24 horas se inocularon al medio, y el cultivo a 31.5°C y pH 7.0 por 30 horas con suficiente aireación y agitación. (2) Cultivo principal Un medio que contenía 30 g/L de glucosa, 45 g/L de molasas, 2 g/L (como nitrógeno) de hidrolizado de proteína soya, 1.4 g/L de ácido fosfórico, 1.2 g/L de NaOH 30 g/L de sulfato de amonio, 1.5 g/L de MgSO H2O, 15 mg/L de FeSO4»7H2O, 15 mg/L de MnSO4«4H2, 5 mg/L de hidrocloruro de tiamina y 0.75 mg/L de bíotina (pH 5.0) se introdujo dentro de un tanque de fermentación de vidrio de volumen pequeño 1-L en una cantidad de 300 mL, y se esterilizó al calentar a 120°C por 20 minutos. Después de la fermentación el tanque se enfrió a 31.5°C, 45 ml de la semilla de cultivo anteriormente mencionada se inoculó al medio, se cultivo a 34°C con aireación de 1/2 wm y suficiente agitación. Cuando la concentración de sacárido en el caldo de cultivo se volvió de 5 g/L o menor, un medio que contenía los siguientes componente se introdujo por el método descrito en la publicación de patente Japonesa abierta al publico No. 5-30985. Específicamente, las concentraciones de pH y oxígeno disuelto se midieron para detectar el estado de agotamiento de la fuente de carbón basándose en cambios de los valores medidos, y el medio se introdujo de manera que se mantuviera la concentración de la fuente de carbono en el caldo de cultivo par que fuera de 5 g/L o menos.

Medio de introducción El medio contenía 530 g/L de glucosa, 1.4 g/L (como nitrógeno) de hidrolizado de proteína de soya, 1.0 g/L de KOH, 44 g/L de cloruro de amonio, 0.3 g/L de MgSO4»7H20, 0.35 mg/L de hidrocloruro de tiamina y 0.35 mg/L de biotina (pH 5.5). Después de que una cantidad predeterminada del medio semilla se introdujo, el cultivo se detuvo cuando el sacárido en el caldo de cultivo se consumió por completo. El cultivo se inició a pH 7.0 y el pH gradualmente cambió a 8.0. Simultáneamente, la presión en el tanque cambio de 0 a 0.12 MPa. Como ejemplo comparativo 1 , el sulfato de amonio se añadió en lugar de incrementar pH y la presión en el tanque. Las concentraciones principales de los aniones cambiaron durante el cultivo como se muestra en la figura. Aunque la concentración del ion sulfato incrementó durante el cultivo en el ejemplo comparativo 1 , esta concentración fue baja y la concentración del ion hidrogencarbonato se incrementó por otra parte en el ejemplo 1. Después de terminar el cultivo, la relación de normalidad de los ¡ones de carbonato y ¡ones de hidrogencarbonato fue de 33% con respecto a los cationes principalmente consistentes de lísína, el cual fue un aminoácido básico en el caldo de fermentación. Además, el contenido de L-lisina en el producto seco total del caldo de fermentación fue de 46%. Por otra parte, en el ejemplo comparativo 1 , la relación de normalidad de los iones de carbonato y de los iones de hidrogencarbonato fue de 0% con respecto a los cationes principalmente consistiendo de lisina, y por lo tanto los iones de sulfato y los iones de cloruro fueron excesivos. Así, el contenido de L-lisina en el producto seco total del caldo de fermentación fue de 43%.

EJEMPLO 2 (1 ) cultivo de semilla de la bacteria productora de L-lisina un medio que contenía 40 g/L de glucosa,0.6 g/L (como nitrógeno) de hidrolízado de proteína de soya, 1 g/L de KH2PO4, 5.6 g/L de NaOH, 8 g/L de sulfato de amonio, 1.0 g/L de MgSO4»7H2, 10 mg/L de FeSO4»7H2O, 10 mg/L de MnSO4«4H2 (pH 6.0) se introdujo dentro de un tanque de fermentación de vidrio de volumen pequeño 1-L en una cantidad de 300 mL, y se esterilizó al calentar a 120°C por 20 minutos. Después de la fermentación el tanque se enfrió a 37°C, 5 asas de platino de Escherichia coli W3110 (tyrA)/pCABD2 (WO95/16042) prelíminarmente crecida sobre una placa de LB por 24 horas se inocularon al medio, y se cultivaron a 37°C y pH 6.7 por 24 horas con aireación suficiente y agitación. (2) Cultivo principal Un medio que contenía 30 g/L de glucosa, 0.4 g/L (como nitrógeno) de hidrolizado de proteína de soya, 0.5 g/L de KH2PO4, 20 g/L de sulfato de amonio, 1.0 g/L de MgS04»7H2, 30 mg/L de FeS04-7H20 y 30 mg/L de MnS0 -4H20 (pH 5.0) se introdujo dentro de un tanque de fermentación de vidrio de volumen pequeño 1-L en una cantidad de 300 ml, y se esterilizó al calentar a 120°C por 20 minutos. Después de la fermentación el tanque se enfrió a 37°C, 50 ml del cultivo semilla anteriormente mencionado se inoculó al medio, y el cultivo 37°C con aireación de vvm y suficiente agitación. Cuando la concentración de sacárido en el caldo de cultivo se volvió de 5 g/L o menos, una solución que contenía 760 g/L de glucosa se introdujo por el método descrito en la publicación de patente Japonesa abierta al público No. 5-30985 de la misma manera como en el ejemplo 1. Después de que una cantidad predeterminada del medio de introducción se introdujo, el cultivo se detuvo cuando el sacárido en el caldo de cultivo se consumió completamente. El cultivo se inició a pH 6.7 y el pH gradualmente cambio a 8.0. Simultáneamente, la presión en el tanque cambió de 0 a 0.1 Mpa. Como en el ejemplo comparativo 2, el sulfato de amonio se añadió en lugar de ¡ncrementar pH y la presión en el tanque. Las concentraciones principales de aniones cambiaron durante el cultivo como se muestra en la figura 2. A pesar de que la concentración del ¡on de sulfato se incrementó durante el cultivo en el ejemplo comparativo 2, esta concentración fue baja y por otra parte la concentración de ion hidrogencarbonato se incrementó en el ejemplo 2. Después de terminar el cultivo, la relación de normalidad de iones de carbonato y iones de hidrogencarbonato fue de 25% con respecto a los cationes que principalmente consistían de usina, el cual fue un aminoácido básico en el caldo de fermentación. Además, el contenido de L-lisina en el producto seco total del caldo de fermentación fue de 64%. Por otra parte, en el ejemplo comparativo 2, la relación de normalidad de los iones de carbonato y ¡ones de hidrogencarbonato fue de 0% con respecto a los cationes principalmente que consistían de lisína, y por lo tanto los iones de sulfato y los iones de cloruro fueron excesivos. Además, el contenido de L-lisina es el producto seco total del caldo de fermentación fue de 61 %.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un método para producir un aminoácido básico, o caldo de fermentación o producto de fermentación que contiene el aminoácido básico mediante la fermentación que comprende el paso de cultivar un microorganismo que tiene capacidad para producir el aminoácido básico en un medio líquido bajo condición aeróbica para producir y acumular el aminoácido básico en el medio, donde: el pH del medio está controlado para que sea de 6.5-9.0 durante el cultivo y 7.2-9.0 al término del cultivo, y un periodo de cultivo donde se asegura que 2 g/L o más de iones hidrogencarbonato y/o iones de carbonato existen en el medio durante el cultivo al controlar la presión en un tanque de fermentación para que sea una presión positiva durante la fermentación, o administrando gas bióxido de carbono o un gas mezclado que contiene gas bióxido de carbono al medio, de manera que letones de hidrogencarbonato y/o iones de carbonato deben servir como contra ¡ones de los cationes principalmente que consisten del aminoácido básico.

2.- El método para producir un aminoácido básico, o caldo de fermentación o producto de fermentación que contiene el aminoácido básico de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la presión en el tanque de fermentación es 0.03-0.2 Mpa.

3.- El método para producir un aminoácido básico o caldo de fermentación o producto de fermentación que contiene el aminoácido básico de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado además porque el aminoácido básico consiste de uno o más tipos de aminoácidos seleccionados a partir de L-lisina, L-argínina y L-histidina.

4.- Un caldo de fermentación que contiene un aminoácido básico obtenido al cultivar un microorganismo que tiene capacidad para producir el aminoácido básico en un medio líquido bajo condición aeróbica o un producto de fermentación producido por el caldo de fermentación, el cual contiene iones de hidrogencarbonato y/o ¡ones de carbonato como contra iones de cationes principalmente que consisten del aminoácido básico en una relación de normalidad de 5-80%, cuya relación se calcula de acuerdo con la siguiente ecuación: Relación de normalidad = [Normalidad de los iones hidrogencarbonato y/o iones carbonato] / [Normalidad de los cationes que consiste principalmente de los aminoácidos básicos] x 100

5.- El caldo de fermentación que contiene un aminoácido básico o un producto de fermentación de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque el aminoácido básico consiste de uno o más tipos aminoácidos seleccionados a partir de L-lisína, L-arginina, L-hístidína.

6.- Un caldo de fermentación o producto de fermentación que contiene un aminoácido básico, el cual se obtiene al permitir que el caldo de fermentación que contiene un aminoácido básico o el producto de fermentación de conformidad con la reivindicación 4 descargue el gas dióxido de carbono.