MXPA00009174A

MXPA00009174A - Metodo para producir l-aminoacidos por fermentacion.

Info

Publication number: MXPA00009174A
Application number: MXPA00009174A
Authority: MX
Inventors: Kuniki Kino
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Kk
Priority date: 1999-09-20
Filing date: 2000-09-19
Publication date: 2003-02-24
Also published as: CA2319283A1; US6344347B1; DE60038345D1; US6706517B2; DE60038345T2; EP1085086A3; ATE389717T1; US20020102665A1; EP1085086B1; EP1085086A2

Abstract

La presente invencion proporciona un metodo industrialmente eficiente para producir un L-aminoacido util como un medicamento, agente quimico, material alimenticio y aditivo de alimentacion, y el metodo comprende cultivar en un medio un microorganismo que tiene la capacidad para producir el L-aminoacido y que tiene resistencia a un inhibidor de ADN girasa o un microorganismo que tiene la capacidad de producir el L-aminoacido y que tiene tanto resistencia al inhibidor de ADN girasa como resistencia a un derivado de aminoquinolina, producir y acumular el L-aminoacido en el mismo y recuperar el L-aminoacido del mismo.

Description

MÉTODO PARA PRODUCIR L-AMINOÁCIDOS POR FERMENTACIÓN ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con un método para producir aminoácidos por fermentación co eficiencia industrial alta. Como un método de fermentación directo para producir y acumular L-aminoácidos directamente a partir de sacáridos, se conocen métodos en los cuales las cepas mutantes derivadas de cepas de tipo silvestre de microorganismos que pertenecen a los géneros Corynebacterium . Brevibacterium - Escherichia, Serratia o Arthrobacter . Por ejemplo, lo siguiente se conoce como mutantes productores de L-aminoácidos : mutantes auxotróficos los cuales requieren aminoácidos, etc. (Solicitud de Patente Examinada Putrlicada Japonesa No. 10037/1981), mutantes los cuales tienen resistencia a análogos de aminoácidos y vitaminas (Solicitudes de Patentes no Examinadas Publicadas Japonesas Nos. 134993/1981 y 44193/1987), mutantes los cuales tienen tanto mutación auxotrófica como mutación de resistencia a análogos de aminoácidos (Solicitudes de Patentes no Examinadas Publicadas Japonesas Nos. 31093/1975 y 134993/1981) , mutantes los cuales tienen degradabilidad disminuida (Solicitud de Patente no Examinada Publicada Japonesa No. 273487/1988 y Solicitud de Patente Examinada REF: 123284 Publicada Japonesa No. 48195/1977) , y mutantes cuyas enzimas aminoacilo -ARN-sintetizantes tienen una afinidad disminuida por sustrato (Solicitud de Patente no Examinada Publicada Japonesa No. 330275/1992) . También se sabe que la producción de un aminoácido se puede mejorar mediante la utilización de transformantes obtenidos por transformación con ADN recombinantes que presenten genes involucrados en la biosíntesis de aminoácidos (Publicaciones de Patentes no Examinadas Publicadas Japonesas Nos. 893/1983, 12995/1985, 210994/1985, 30693/1985, 195695/1986, 271981/1986, 458/1990 y 42988/1990; Solicitudes de Patentes Examinadas Publicadas Japonesas Nos. 42676/1989, 11960/1993 y 26467/1993) . Para producir L-triptofano, ha habido un informe de que la productividad del aminoácido se mejora al proporcionar resistencia a derivados de aminoquinolina o a derivados de fenotiasina (Solicitud de Patente no Examinada Publicada Japonesa No. 112795/1992) . Se ha informado que la expresión de un operón involucrado en la síntesis de histidina se incrementa en una cepa deficiente de ADN girasa [Proc. Nati . Acad. Sci . USA, 84, 517 (1987) ] y un informe de que las concentraciones de ciertas especies de ARNt de aminoácido, que incluyen ARNt para His están disminuidas en una cepa mutante de ADN girasa [J. Mol . Biol . , 66., 131 (1972)], sin embargo, no se ha hecho aún algún inf orme acerca de la relación entre la resi stencia a inhibidores ADN girasa y la productividad de aminoácidos .

DESCRIPCIÓN BREVE DE LA INVENCIÓN Un objetivo de la presente invención es proporcionar un método industrialmente eficiente para producir un L-aminoácido útil como un medicamento, agente químico, material alimenticio y aditivos de alimentación. La presente invención se relaciona con los siguientes aspectos (1) a (14) . (1) Un método para producir un L-aminoácido, el cual comprende : (a) cultivar en un medio un microorganismo que tiene capacidad para producir un L-aminoácido y que tiene resistencia a un inhibidor- e ADN girasa. (b) producir y acumular los aminoácidos en el cultivo; (c) recuperar el L-aminoácido del cultivo. (2) El método para producir un aminoácido como se describe en el inciso (1) , en donde inhibidor de ADN girasa se selecciona del grupo que consiste de ácido nalidíxico, ácido oxolínico, coumermicina, noboviocina y las sales de metal alcalino de estas sustancias. (3) El método para producir un L-aminoácido como se describe antes en el inciso (1) , en donde el microorganismo tiene resistencia a un derivado de aminoquinolina. (4) El método para producir un L-aminoácido como se describe antes en el inciso (3) , en donde el derivado de aminoquinolina se selecciona del grupo que consiste de cloroquina, amodiaquina, pentaquina, primaquina y las sales de metal alcalino de estas sustancias. (5) El método para producir un aminoácido como se describe antes en cualquiera de (1) a (4) , en donde el L-aminoácido es L-histidina. (6) El método para producir un L-aminoácido como se describe antes en (1) o (3) , en donde el microorganismo se selecciona del grupo que consiste de los géneros Serratia, Corynebacterium, Arthrobacter , Microbacterium, Bacillus y Escherichia. (7) El método para producir un aminoácido como se describe antes en el inciso (6) , en donde el microorganismo se selecciona del grupo que consiste de Escherichia coli H-9342 (FERM BP-6675) y Escherichia coli H-9343 (FERM BP-6676) . (8) Un microorganismo que tiene la capacidad de producir un L-aminoácido y que tiene resistencia a un inhibidor de ADN girasa. (9) El microorganismo como se describe antes en el inciso (8) , en donde el inhibidor de ADN girasa se selecciona del grupo que consiste de ácido nalidíxico, ácido oxolínico, coumermicina, novobiocina y las sales de metal alcalino de estas sustancias . (10) El microorganismo como se describe antes en los incisos ( 8 ) o ( 9 ) , en donde el mi croorgani smo t iene resistencia a un derivado de aminoquinolina. (11) El microorganismo como se describe antes en el inciso (10) , en el que el derivado de aminoquinolina se selecciona del grupo que consiste de cloroquina, amodiaquina, pentaquina, primaquina y las sales de metal alcalino de estas sustancias. (12) El microorganismo descrito antes en el inciso (8) , en donde el L-aminoácido es L-his idina. (13) El microorganismo descrito antes en cualquiera de los incisos (8) a (12) , en donde el microorganismo se selecciona del grupo que consiste de los géneros Serratia, Corynejbacter?um, Arthrobacter, Microbacterium, Bacillus, y Es cheri chia. (14) Un microorganismo, caracterizado porque se selecciona de ya sea Escherichia coli H-9342 (FERM BP-6675) o Escherichia coli H-9343 (FERM BP-6676) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Como el microorganismo de la presente invención, se puede utilizar cualquier microorganismo en la medida en que tenga capacidad para producir un L-aminoácido y tienen resistencia al inhibidor de ADN girasa. Adicionalmente, es preferible que el microorganismo tenga una resistencia adicional a un derivado de aminoquinolina. Los ejemplos de microorganismos incluyen microorganismos que pertenecen a los géneros Serra t i a , Coryn eba c t eri um , Ar t hroba c t er , Microbacterium, Bacillus y Escherichia . tales como Serratia ficaria, Serratia fonticola, Serratia liquiefaciens , Serratia marcescens , Corynebacteri um gl utami cum, Corynebacterium mycetoides , Corynebacterium variabilis , Corynebacterium ammoniagenes , Arthrobacter crystallopoietes , Arthrobacter duodecadis, Arthrobacter ramosus, Arthrobacter sulfureus, Arthrobacter aurescens, Arthrobacter citreus, Arthrobacter globiformis, Microbacterium ammoniaphilum, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefacines y Escherichia coli . Como el inhibidor de ADN girasa para uso en la presente invención, se puede utilizar cualquier sustancia en la medida en que inhiba a ADN girasa, una del tipo II de topoisomerasa las cuales están presentes en bacterias . Por ejemplo, se pueden utilizar como inhibidores de ADN girasa ácido nalidíxico, ácido oxolínico, coumermicina y novobiocina. Adicionalmente, las sales de metal alcalino de estas sustancias se pueden utilizar como el inhibidor de ADN girasa. En la presente, cualquier metal alcalino tal como sodio y potasio se puede utilizar como los metales alcalinos.

Como el derivado de aminoquinolina para uso en la presente invención, se puede utilizar cualquier sustancia, en la medida en que tenga una estructura principal de aminoquinolina. Por ejemplo, se pueden utilizar como los derivados de aminoquinolina a los derivados de 4-aminoquinolina tales como cloroquina y amodiaquina, y los derivados de 8 -aminoquinolina tales como pentaquina y primaquina. Adicionalmente, las sales de metal alcalino de estas sustancias se pueden utilizar como el derivado de aminoquinolina. Todas estas sustancias se conocen como medicamentos contra el paludismo. En la presente, cualquier metal alcalino tal como sodio y potasio se pueden utilizar como los metales alcalinos. El microorganismo de la presente invención se puede obtener al someter a un microorganismo que tiene capacidad para producir un aminoácido a un tratamiento de mutación convencional que incluye radiación ultravioleta y tratamiento con un mutágeno tal como N-metil-N1 -nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) , cultivar las cepas mutantes resultantes bajo condiciones generales sobre un medio en placa de agar que contiene un inhibidor de ADN girasa a una concentración a la cual la presente cepa no puede crecer o crece escasamente, y seleccionar colonias de la cepa las cuales son más grandes que la cepa parental entre las colonias resultantes. Además, el microorganismo que tiene tanto resistencia al inhibidor de ADN girasa como resistencia a un derivado de aminoquinolina se pueden obtener al someter la cepa resistente al inhibidor de ADN girasa a un tratamiento de mutación, cultivar las cepas mutantes resultantes sobre un medio en placa en agar que contiene un derivado de aminoquinolina a una concentración a la cual la cepa parental no puede crecer o crece escasamente, y seleccionar colonias las cuales son más grandes que la cepa parental entre las colonias resultantes . Dado que un microorganismo tiene la capacidad de producir el aminoácido, un microorganismo de manera inherente tiene capacidad para producir el aminoácido que se va a utilizar; alternativamente, un microorganismo el cual se acaba de obtener a someter a un tipo de silvestre de microorganismo para producir un aminoácido por métodos conocidos también se puede utilizar. Los métodos conocidos incluyen el método de fusión-celular, método de transducción u otras técnicas recombinantes de genes [en general véase Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Segunda Edición Cold Spring Harbor Laboratory Press, después de (1989) (abreviado como Molecular Cloning, 2nd ed. en lo siguiente) ] , además del tratamiento de mutación anterior. El microorganismo de la presente invención también se puede obtener al preparar un microorganismo mutante que tiene resistencia a un inhibidor de ADN girasa o un microorganismo que tiene tanto resistencia al inhibidor ADN girasa como resistencia a un derivado de aminoquinolina por tratamiento de mutación convencional y después al someter al microorganismo mutante preparado al método descrito antes para conferir al microorganismo la capacidad de producir un L-aminoácido . Los ejemplos específicos de los microorganismos de la presente invención incluyen Escherichia coli H-9342 (FERM BP-6675) y Escherichia coli H-9343 (FERM BP-6676) . La producción del aminoácido mediante la utilización del microorganismo de la presente invención se puede llevar a cabo sobre un método convencional para cultivar bacterias. Como el medio utilizado para la producción del aminoácido, se puede utilizar cualquier medio sintético o medio natural, en la medida en que contenga apropiadamente una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, una sustancia inorgánica y cantidades en trazas de nutrientes los cuales requiera la cepa. Como la fuente de carbono, se pueden utilizar carbohidratos tales como glucosa, fructosa, lactosa, melasas, hidrolizados de celulosa, hidrolizados de sacáridos crudos e hidrolizados de almidón; ácidos orgánicos tales como ácido pirúvico, ácido acético, ácido fumárico, ácido málico y ácido lático; y alcoholes tales como glicerina y etanol.

Como la fuente de nitrógeno, se pueden utilizar amoníaco y diversas sales inorgánicas tales como cloruro de amonio, sulfato de amonio, acetato de amonio y fosfato de amonio; sales de amonio de ácidos orgánicos; aminas; peptona, extracto de carne, licor de macerado de maíz, hidrolizado de caseína, hidrolizado de torta de frijol de soya, diversas células fermentadas y materiales digeridos de los mismos . Como la sustancia inorgánica, se puede utilizar fosfato dihidrógeno de potasio, fosfato ácido dipotásico, fosfato de magnesio, sulfato de magnesio, cloruro de magnesio, cloruro de sodio, sulfato ferroso, sulfato de manganeso, sulfato de cobre, cloruro de calcio y carbonato de calcio. El microorganismo se cultiva bajo condiciones aeróbicas tales como cultivo en agitación y cultivo en agitación aireado, a una temperatura dentro del intervalo de 20 a 40 °C, preferiblemente dentro de un intervalo de 28 a 37 °C. El pH del medio está dentro del intervalo de 5 a 9, preferiblemente alrededor de la neutralidad. El pH del medio se ajusta mediante la utilización de carbonato de calcio, ácidos inorgánicos u orgánicos, soluciones alcalinas, amoníaco y amortiguadores de pH. Generalmente, el aminoácido se produce y acumula en el medio, por cultivo durante 1 a 7 días. Después de completar el cultivo, se remueven del medio precipitados tales como células, y el L-aminoácido se puede recuperar del medio mediante el método de tratamiento de intercambio iónico, el método de concentración, etcétera, en combinación. De acuerdo con la presente invención, cualquier L-aminoácido se puede producir sin limitación específica, sino que incluye también, por ejemplo a L-histidina. La presente invención se ilustra adicionalmente por los siguientes ejemplos, los cuales no se construyen para limitar el alcance de la presente invención.

Ejemplo 1: Preparación de una cepa mutante productora de L-histidina que tiene resistencia a un inhibidor de ADN girasa o una cepa mutante productora de L-histidina que tiene tanto resistencia a inhibidor ADN girasa como resistencia a un derivado de aminoquinolina". La cepa mutante productora de L-histidina, H-9340 que tiene resistencia a l, 2, 4-triazol alanina, la cual se deriva de Escherichia coli ATCC 21318 que requiere metionina se somete a un tratamiento de mutación con N-metil-N1 -nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) (0.2 mg/ml, 30 °C, 30 minutos) de acuerdo con un método convencional y se dispersa en un medio en placa en agar que contiene 1 g/litro de sal monosódica de noboviocina [glucosa 0.2%, fosfato diácido de potasio 0.3%, fosfato ácido disódico 0.6%, sulfato de magnesio 0.01%, cloruro de sodio 0.05%, cloruro de amonio 0.1%, 50 mg/litro del nutriente requerido (DL-metionina y agar 1.5%, pH 7.2] . La cepa mutante se cultiva en medio de placa de agar y se cultivan a 30 °C durante 2 a 6 días, y se toman las colonias de crecimiento grande y se separan para obtener la cepa H-9342. Además, la colonia que se obtiene se somete a un tratamiento de mutación con NTG (0.2 mg/ml, 30 °C, 30 minutos) , seguido por dispersión en un medio de cultivo en placa en agar que contiene 150 mg/litro de sal disódica de primaquina. El cultivo se lleva a cabo en el mismo a 30 °C durante 2 a 6 días, y las colonias con crecimiento grande se toman y se separan para obtener la cepa H-9343. Las cepas H-9340, H-9342 y H-9343 se depositaron el 9 de marzo de 1999 ante el National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japón) bajo el Tratado de Budapest con números de acceso FERM BP-6673, FERM BP-6675 y FERM BP-6676, respectivamente.

Ejemplo 2: Prueba comparativa de crecimiento del medio de cul t ivo de pl aca de agar que c ont i ene primaquina o novobiocina .

El crecimiento de las cepas mutantes H-9342 y H-9343 obtenido en el ejemplo 1 se compara con el crecimiento de la cepa parental H-9340 en un medio de placa de agar que contiene primaquina o noviobiocina. Cada una de las cepas mutantes, la cual se ha cultivado en un medio natural durante 24 horas y se ha suspendido en su solución salina fisiológica, se dispersa hasta una densidad celular de 1 a 10 células/cm2 en un medio de placa de agar que contiene sal disódica de primaquina o sal monosódica de novobiocina a la misma concentración y por el tiempo de adquisición de cada una de las cepas mutantes, y se cultiva a 33 °C durante 4 días. En la tabla 1 se muestra el crecimiento o carencia de crecimiento de las cepas en el medio anterior. La cepa H-9340 parental no crece dentro del medio de cultivo de placa de agar que contiene cualquiera de los agentes químicos. Adicionalmente, H-9342 no crece en el medio de cultivo que contiene primaquina.

Tabla 1 Ejemplo 3 Producción de L-histidina Se lleva a cabo de la siguiente manera la producción de L-histidina utilizando las cepas mutantes H-9342 y H-9343 obtenida en el ejemplo 1 y la cepa parental H-9340. Cada una de las cepas, H-9340, H-9342 y H-9343 se inoculan 6 ml de un medio de siembra (glucosa 2%, melasas 0.5%, licor de macerado de maíz 1%, sulfato de amonio 1.2%, fosfato diácido de potasio 0.3%, sulfato de magnesio 0.015%, 600 mg/litro DL-metionina, 100 mg/litro de adenina, carbonato de calcio 3% pH 6.2) en un tubo de ensayo grande, y se cultiva con agitación a 30 °C durante 12 horas. Cada uno de los cultivos de siembra obtenidos (0.1 ml) se inocula en 5 ml de un medio de producción (glucosa 6%, licor de macerado de maíz 1%, sulfato de amonio 2.4%, fosfato diácido de potasio 0.4%, sulfato de magnesio 0.015%, 10 mg/litro de sal de cloruro de tiamina, 10 mg/litro de pantotenato de calcio, carbonato de calcio 3%, pH 6.5) en un tubo de ensayo grande y se cultiva posteriormente en el mismo con agitación a 30°C durante 48 horas. Después del cultivo, la cantidad de L-histidina acumulada en el medio se ensaya por cromatografía líquida de alta resolución. Los resultados se muestran en la tabla 2. En comparación con la productividad de L-histidina de la cepa parental H-9340, se mejora la productividad de L-histidina de la cepa mutante H-9342; y en comparación con la productividad de L-histidina de la cepa mutante H-9342, se mejora la productividad de L-histidina de la cepa mutante H-9343.

Tabla 2 Además, se inoculan 100 ml de cultivo de semilla de H-9343 en 600 ml de medio de cultivo de fermentación (glucosa 6%, licor de macerado de maíz 1%, sulfato de amonio 0.5%, fosfato diácido de potasio 0.4%, sulfato de magnesio 0.05%, 100 mg/litro de cloruro de calcio, pH 6.5) en un fermentador pequeño de 2 litros y el cultivo se lleva a cabo a 30 °C, a una velocidad de 800 rpm y un volumen de aireación de 1 litro/min.

El ajuste de pH y el suministro de la fuente de nitrógeno durante el cultivo se llevan a cabo mediante la utilización de amoníaco acuoso, para mantener el pH a 6.5 + 0.2. Bajo el suministro apropiado de glucosa, sulfato de amonio y fosfato diácido de potasio, el cultivo se lleva a cabo durante 70 horas. Consecuentemente , la cantidad de L - hi stidina acumulada en cultivos de 46.5 g/litro . Por otra parte , la cantidad de L-histidina acumulada durante el cultivo de H-9340 de la misma manera es de 27.7 g/litro. De acuerdo con la presente invención, se puede obtener y cultivar en un medio un microorganismo que tenga la capacidad de producir un L-aminoácido y que tenga resistencia a un inhibidor de ADN girasa o un microorganismo que tenga la capacidad de producir un L-aminoácido y que tenga tanto resistencia a un inhibidor de ADN-girasa como resistencia a un derivado de aminoquinolina, por lo que se puede mejorar la productividad del L-aminoácido de manera que el L-aminoácido se puede producir de manera industrialmente eficiente a bajo costo. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES
Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un método para producir un L-aminoácido, caracterizado porque comprende: (a) cultivar en un medio un microorganismo que tiene capacidad para producir un L-aminoácido y que tiene resistencia a un inhibidor de ADN girasa; (b) producir y acumular el L-aminoácido en el cultivo; y (c) recuperar el L-aminoácido del cultivo. 2. El método para producir un L-aminoácido, de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el inhibidor de ADN girasa se selecciona del grupo que consiste de ácido nalidíxico, ácido oxolínico, coumermicina , novobiocina y las sales de metal alcalino de estas sustancias.
3. El método para producir un L-aminoácido, de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el microorganismo tiene resistencia a un derivado de aminoquinolina.
4. El método para producir un L-aminoácido, de conformidad con la reivindicación 3 , caracterizado porque el derivado de aminoquinolina se selecciona del grupo que consiste de cloroquina, amodiaquina, pentaquina, primaquina y las sales de metal alcalino de estas sustancias.
5. El método para producir un L-aminoácido, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el L-aminoácido es L-histidina.
6. El método para producir un L-aminoácido, de conformidad con la reivindicación 1 ó 3 , caracterizado porque el microorganismo se selecciona del grupo que consiste de los géneros Serra t i a , Coryn eba c t eri um , Ar throba c t er , Microbacterium, Bacillus y Escherichia .
7. El método para producir un L-aminoácido, de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el microorganismo se selecciona del grupo que consiste de Escherichia coli H-9342 (FERM BP-6675) y Escherichia coli H-9343 (FERM BP-6676) .
8. Un microorganismo que tiene la capacidad de producir un L-aminoácido y que tiene resistencia a un inhibidor de ADN girasa.
9. El microorganismo de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el inhibidor de ADN girasa se selecciona del grupo que consiste de ácido nalidíxico, ácido oxolínico, coumermicina, novobiocina y las sales de metal alcalino de estas sustancias.
10. El microorganismo de conformidad con la reivindicación 8 ó 9, caracterizado porque el microorganismo tiene resistencia a un derivado de aminoquinolina.
11. El microorganismo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el derivado de aminoquinolina se selecciona del grupo que consiste de cloroquina, amodiaquina, pentaquina, primaquina y las sales de metal alcalino de estas sustancias.
12. El microorganismo de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el L-aminoácido es L-histidina.
13. El microorganismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, caracterizado porque el microorganismo se selecciona del grupo que consiste de los géneros Serra t i a , Coryn eba c t eri um , Ar throba c er , Microbacterium, Bacillus y Escherichia .
14. Un microorganismo, caracterizado porque se selecciona de cualquiera ds Escherichia coli H-9342 (FERM BP-6675) o Escherichia coli H-9343 (FERM BP-6676) .