MX2014007544A - Inhibidores de la trayectoria de señalizacion notch y uso de los mismos en el tratamiento de canceres. - Google Patents

Inhibidores de la trayectoria de señalizacion notch y uso de los mismos en el tratamiento de canceres.

Info

Publication number
MX2014007544A
MX2014007544A MX2014007544A MX2014007544A MX2014007544A MX 2014007544 A MX2014007544 A MX 2014007544A MX 2014007544 A MX2014007544 A MX 2014007544A MX 2014007544 A MX2014007544 A MX 2014007544A MX 2014007544 A MX2014007544 A MX 2014007544A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
tert
amine
formula
notch
butylphenoxy
Prior art date
Application number
MX2014007544A
Other languages
English (en)
Other versions
MX355632B (es
Inventor
Radtke Freddy
Lehal Rajwinder
Reinmüller Viktoria
Zhu Jieping
Original Assignee
Ecole Polytechnique Fédérale De Lausanne Epfl
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ecole Polytechnique Fédérale De Lausanne Epfl filed Critical Ecole Polytechnique Fédérale De Lausanne Epfl
Publication of MX2014007544A publication Critical patent/MX2014007544A/es
Publication of MX355632B publication Critical patent/MX355632B/es

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4412—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
    • A61K31/351—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom not condensed with another ring
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D213/60—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D213/72—Nitrogen atoms
    • C07D213/73—Unsubstituted amino or imino radicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/075—Ethers or acetals
    • A61K31/085—Ethers or acetals having an ether linkage to aromatic ring nuclear carbon
    • A61K31/09—Ethers or acetals having an ether linkage to aromatic ring nuclear carbon having two or more such linkages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/135—Amines having aromatic rings, e.g. ketamine, nortriptyline
    • A61K31/136—Amines having aromatic rings, e.g. ketamine, nortriptyline having the amino group directly attached to the aromatic ring, e.g. benzeneamine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/407—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil condensed with other heterocyclic ring systems, e.g. ketorolac, physostigmine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61N—ELECTROTHERAPY; MAGNETOTHERAPY; RADIATION THERAPY; ULTRASOUND THERAPY
    • A61N5/00—Radiation therapy
    • A61N5/10—X-ray therapy; Gamma-ray therapy; Particle-irradiation therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C205/00—Compounds containing nitro groups bound to a carbon skeleton
    • C07C205/27—Compounds containing nitro groups bound to a carbon skeleton the carbon skeleton being further substituted by etherified hydroxy groups
    • C07C205/35—Compounds containing nitro groups bound to a carbon skeleton the carbon skeleton being further substituted by etherified hydroxy groups having nitro groups and etherified hydroxy groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of the carbon skeleton
    • C07C205/36—Compounds containing nitro groups bound to a carbon skeleton the carbon skeleton being further substituted by etherified hydroxy groups having nitro groups and etherified hydroxy groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of the carbon skeleton to carbon atoms of the same non-condensed six-membered aromatic ring or to carbon atoms of six-membered aromatic rings being part of the same condensed ring system
    • C07C205/38—Compounds containing nitro groups bound to a carbon skeleton the carbon skeleton being further substituted by etherified hydroxy groups having nitro groups and etherified hydroxy groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of the carbon skeleton to carbon atoms of the same non-condensed six-membered aromatic ring or to carbon atoms of six-membered aromatic rings being part of the same condensed ring system the oxygen atom of at least one of the etherified hydroxy groups being further bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring, e.g. nitrodiphenyl ethers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C217/00—Compounds containing amino and etherified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C217/78—Compounds containing amino and etherified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having amino groups and etherified hydroxy groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of the same carbon skeleton
    • C07C217/80—Compounds containing amino and etherified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having amino groups and etherified hydroxy groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of the same carbon skeleton having amino groups and etherified hydroxy groups bound to carbon atoms of non-condensed six-membered aromatic rings
    • C07C217/82—Compounds containing amino and etherified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having amino groups and etherified hydroxy groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of the same carbon skeleton having amino groups and etherified hydroxy groups bound to carbon atoms of non-condensed six-membered aromatic rings of the same non-condensed six-membered aromatic ring
    • C07C217/90—Compounds containing amino and etherified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having amino groups and etherified hydroxy groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of the same carbon skeleton having amino groups and etherified hydroxy groups bound to carbon atoms of non-condensed six-membered aromatic rings of the same non-condensed six-membered aromatic ring the oxygen atom of at least one of the etherified hydroxy groups being further bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring, e.g. amino-diphenylethers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D213/60—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D213/62—Oxygen or sulfur atoms
    • C07D213/63—One oxygen atom
    • C07D213/64—One oxygen atom attached in position 2 or 6
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D213/60—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D213/62—Oxygen or sulfur atoms
    • C07D213/63—One oxygen atom
    • C07D213/64—One oxygen atom attached in position 2 or 6
    • C07D213/643—2-Phenoxypyridines; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57496—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving intracellular compounds
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/08—Solutions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/42—Notch; Delta; Jagged; Serrate
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4703—Regulators; Modulating activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/745—Assays involving non-enzymic blood coagulation factors
    • G01N2333/75—Fibrin; Fibrinogen

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Radiology & Medical Imaging (AREA)

Abstract

La presente invención se refiere al uso de inhibidores de la trayectoria de señalización Notch seleccionados del grupo que consiste de 6-(4-tert-butilfenoxi)piridin-3-amina (I3), sus derivados, en el tratamiento y/o prevención de cánceres.

Description

INHIBIDORES DE LA TRAYECTORIA DE SEÑALIZACIÓN NOTCH Y USO DE LOS MISMOS EN EL TRATAMIENTO DE CÁNCERES CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al uso de inhibidores de la trayectoria de señalización Notch en particular la 6- (4-Tert-Butilfenoxi) Piridin-3-Amina (13) (número CAS 218457-67-1) y sus derivados, en el tratamiento y/o prevención de cánceres .
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La trayectoria de ' señalización Notch representa un componente critico en los circuí tos moleculares que controlan los destinos celulares durante el desarrollo, supervivencia celular y proliferación celular (Shih IeM, Wang TL in Cáncer Res 2007; 67(5) : 1879-82) . La activación aberrante de esta trayectoria contribuye a tumorigénesis . Los miembros de la familia Notch se están revelando como oncogenes en un número cada vez mayor de cánceres. El papel de Notch en cáncer humano se ha destacado recientemente por la presencia de mutaciones de activación y amplificación de genes Notch en cáncer humano y por la demostración de que los genes en la trayectoria de señalización Notch podrían ser objetivos terapéuticos potenciales. Se ha hecho evidente que uno de los objetivos terapéuticos principales en la trayectoria Noten son los receptores Notch, en cuyos inhibidores ?-secretasa evitan la generación del dominio oncogénico (intracelular) de moléculas Notch y suprime la actividad Notch.
Aunque se han hecho progresos significativos en la disección del funcionamiento complejo de esta trayectoria de señalización, hay opciones muy limitadas disponibles para inhibidores Notch. Sin embargo, la clase pionera de inhibidores Notch ya está en ensayos clínicos para algunos tipos de cánceres, tal como inhibidores ?-secretasa MK0752 de Merck Sharp & Dohme Corp. MK0752, y RO4929097 (Roche), una molécula pequeña sintética, inhibe la trayectoria de señalización Notch, que puede resultar en inducción de detención del crecimiento y apoptosis en células tumorales en las cuales la trayectoria de señalización Notch está sobre activada.
Uno de los inconvenientes del uso de inhibidores ?-secretasa para bloquear la señalización Notch, como actualmente en el mercado o bajo investigación, es su amplia gama de objetivos adicionales tal como proteina de precursor amiloide asi como sin selectividad en señalización Notch de bloqueo por medio de todos los cuatro ligandos (Notch 1, 2, 3 y 4). Debido a su capacidad para bloquear la señalización Notch por medio de todos cuatro inhibidores de ?-secretasa receptores se conocen que · causan metaplasia de células caliciformes en el intestino. Además, algunas de las malignidades hematológicas y mutaciones que albergan tumores sólidos en los . receptores Note (tal como translocaciones cromosómicas ) que resultan en expresión constitutiva de forma activa dominante de NICD independiente de escisión por complejo ?-secretasa. Por lo tanto estos tumores no responden a tratamiento de inhibidores ?-secretasa.
Por lo tanto, todavía hay una necesidad para identificar y desarrollar además inhibidores específicos y selectivos de trayectoria de señalización Notch útil para tratar y/o prevenir cánceres.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a 6-(4-Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) de la Fórmula I Fórmula I o uno de sus derivados que tienen propiedades de inhibición de trayectoria de señalización Notch, sales, solvatos, tautómeros, isómeros de los mismos para usar en el tratamiento y/o prevención de un cáncer.
Un objetivo adicional de la presente invención es proporcionar una composición farmacéutica que comprende composición farmacéutica que comprende 6-(4-Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) . de la Fórmula I, o uno de sus derivados que tienen propiedades de inhibición de trayectoria de señalización Notch, o sales farmacéuticamente aceptables, solvatos, tautómeros, isómeros de los mismos, y un portador farmacéuticamente aceptable.
La invención también contempla un kit que comprende una o más dosis de 6- (4-Tert-Butilfenoxi) Piridin-3-Amina (13), o uno de sus derivados que tienen propiedades de inhibición de trayectoria de señalización Notch, para usar en un método para el tratamiento y/o prevención de cáncer, opcionalmente con reactivos y/o instrucciones para el uso.
Un objetivo adicional de la invención es proporcionar el uso de 6- ( -Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) de la Fórmula I o uno de sus derivados que tienen propiedades de inhibición de trayectoria de señalización Notch, para inhibir in vitro o in vitro la trayectoria de señalización Notch en células.
Otro objetivo de la invención es proporcionar un método de tratamiento de un sujeto para cáncer dependiente de Notch.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las Figuras 1A, IB, 1C y ID muestran bloques de 6-(4-Tert-Butilfenoxi) Piridin-3-Amina (13) (número CAS 218457-67-1) NICD mediada por activación de señalización Notch. Figura 1A) Las células Nl-HeLa se co-transfectaron con plásmido de expresión pcDNA3. Notchl , luciferasa pGL .26-12xCSL y plásmidos renilla SV40. Las células DL4- y Nl-HeLa se co-cultivaron en una placa de 96 pozos en relación 1:1 (20,000: 20, 000 células/pozo) y trataron con DMSO o con 2, 5 y 10 µ? de 13 y DAPT por 24 horas. La activación de trayectoria Notch se midió al cuantificar la señaLización Notch conducida por ensayo reportero de luciferasa. El tratamiento de ensayo de co-cultivo DL4:N1 con 6- (4-Tert-Butilfenoxi) Piridin-3-Amina (13) y DAPT causa una disminución dependiente de la concentración en la activación de señalización Notch. Figura IB) Las células HeLa se transíectaron con NICD y trataron con DMSO o con 2, 5, 10, 20 y 40 µ? de 6-(4-Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13). Como un control las células co-cultivadas también se trataron con 5, 10, 20 y 40 µ? de DAPT. La activación de trayectoria se midió usando Notch conducido por ensayo reportero de luciferasa. El tratamiento de 6- ( -Tert-Butilfenoxi) Piridin-3-Amina (13) de las células que expresan NICD lleva a una atenuación de la señalización, mientras que el tratamiento DAPT no tiene efecto sobre la activación de señalización Notch mediada por NICD. Figura 1C) El ensayo de co-cultivo DL4:N1 y DL4:N2 se trató con 13 y DAPT (cada 10 µ?.) por 24 horas. El efecto de 6-(4-Tert-Butilfenoxi) Piridin-3-Amina (13) y DAPT en DL4-N1 y DL4-N2 conducido por la activación de trayectoria se midió por Notch conducido por actividad de luciferasas. Ambos tratamientos 13 y DAPT bloquean 1.a activación de trayectoria inducida por Notchl y Notch2. Figura ID) La 6- ( 4 -Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) inhibe la activación de trayectoria por medio de dominios intracelulares de Notchl (NICD) y Notch2 (N2-ICD) .
La Figura 2 muestra que la inhibición mediada por 6- (4-Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) de señalización Notch se puede rescatar. con concentración cada vez mayor de MAMLl. Las células HeLa se co-transfectaron 800ng de NICD + 3µg de pCDNA3.1 o 800ng de NICD + 1 µg de MAMLl-FLAG o 800ng de NICD + 3µg de vectores de expresión MAMLl-FLAG. Para medir la activación de trayectoria Notch, el plásmido de luciferasa pGL4.26-12xCSL también se% introdujo en las células. La renilla SV40 se usó como un control interno. Las células transíectadas con diferentes combinaciones y cantidades de plásmido se trataron con DMSO o una concentración cada vez mayor de 6- ( 4-Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) (1, 2.5, 5 y 10. µ?) por 24 horas.. El 12xC L conducido por actividad de luciferasas se midió usando sistema de ensayo de luciferasa dual. En la ausencia de MAML1, 6- ( 4 -Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) podría bloquear las activaciones de señalización Notch, pero el efecto inhibidor de Notch de 6-(4-Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) se disminuyo con cantidad incrementada de MAML1. · Las Figuras 3A,. 3B, 3C, 3D y 3E muestran que la 6- (4-Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) inhibe la señalización Notch y subregula sus genes objetivo en líneas celulares de cáncer humano. Figura 3A) Las células RPMI 8402 se trataron con D SO, 6- ( 4 -Tert-Butil fenoxi ) Piridin-3-Amina (13) y DAPT (10 µ?) por 24 horas y analizaron por la expresión de genes objetivo Notch, Hesl, cMyc y Dtxl por qRT-PCR. Los datos se normalizaron a HPRT como un gen de mantenimiento. Figura 3B) El lisado celular completo de 6- ( -Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) tratado con células se analizó por Western blot. Usando anticuerpos contra NICD (Vall744), Hesl y cMyc, los niveles de proteína de NICD y genes objetivo Notch se determinaron. Figura 3C) y Figura 3D) Las líneas celulares T-ALL humanas HPB ALL y KOPTK1 se trataron con DMSO o 6-(4-Tert-Butilfenoxi ) iridin-3-Amina (13) por 24 horas. Los análisis de Western blot se realizaron usando NICD (Vail 744) y anticuerpos específicos Hesl. La tubulina sirve como un control de carga. Figura 3E) El lisado celular completo de DMSO, la 6- ( 4-Tert-Butilfenoxi ) Pi ridin-3-Amina (13) tratada con células PANC1 (línea celular de cáncer pancreático) se analizaron por Western blot. Los niveles de proteína Hesl se determinaron usando anticuerpos específicos Hesl. Los análisis estadísticos se hicieron usando prueba t de student de dos colas. * = valor p < 0.05.
La Figura 4 muestra que la 6-(4-Tert-Butilfenoxi) Piridin-3-Amina (13) induce un bloque proliferativo en células de cáncer humano. Las líneas celulares T-ALL humanas RPMI 8402 y KOPTK1, y línea celular de cáncer pancreático PANC1 así como nRas conducido por células de melanoma se sembraron en una placa de 96 pozos y trataron con 10 µ? concentración de 6-(4-Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) y DAPT por varios días. Sus efectos inhibidores de crecimiento se compararon con células tratadas con igual cantidad de DMSO. Usando ensayo de azul Alamar, la cinética de crecimiento de RPMI 8402 y KOPTK1 fueron seguidos por hasta 6 días, mientras que PANC1 y células de melanoma nRas se monitorearon por 4 días. El tratamiento de 6- ( 4-Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) de RPMI 8402, KOPTK1, PANC1 y células de melanoma nRas causa una reducción significativa en su potencial de crecimiento. Los análisis estadísticos se hicieron usando prueba t de student. * = valor p < 0.05. ns~ no significativo.
Las Figuras 5A, 5B, 5C, 5D y 5E muestran que la 6- (4- Tert-Butilfenoxi) Piridin-3-Amina (13) bloquea el crecimiento dependiente NICD de células de cáncer humano. Figura 5A) Las células DND41-Parental y DND41-NICD se trataron con 6-(4-Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) y DAPT por 24 horas. Los análisis de Western blot se llevaron a cabo por proteina Hesl usando anticuerpos específicos Hesl. Tanto DAPT como 6- (4-Tert-Butilfenoxi) Piridin-3-Amina (13) causan una sub-regulación de Hesl en células DND 1-Parental . Las células DND41—NICD muestran una sub-regulación de Hesl únicamente cuando se tratan con 6- ( 4 -Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13). Figura 5B) Cinco mil células DND41-Parental se sembraron y trataron con DMSG, 6- (4-Tert-Butilfenoxi) Piridin-3-Amina (13) y DAPT en una placa de 96 pozos. La cinética de crecimiento de la línea celular parental fue seguido durante 5 días usando lectura de salida de azul Alamar. El tratamiento de línea celular DND41-parental con tanto 6- (4-Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) como DAPT causa una detención de proliferación. Figura 5C) De forma similar, Las células DND41-NICD tratadas con DMSO, 6-(4-Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) y DAPT y su cinética de crecimiento se monitorearon usando lectura de salida de azul Alamar durante 5 días. El tratamiento de células DND41-NICD con DAPT no tenía un impacto significativo en su proliferación, mientras que el tratamiento de 6-(4-Tert- Butilfenoxi) Piridin-3-Amina (13) induce una detención de proliferación. Figura 5D) La linea celular de cáncer de mama humano HCC1187 alberga una transubicación cromosómica SEC22B-Notch2, lo que conduce a una expresión de forma constitutivamente activa de NICD independiente de escisión por el complejo ?-secretasa. Esta mutación hace que esta linea celular insensible a tratamiento de inhibidor de ?-secretasa. Figura 5E) Dos mil células HCC1187 se sembraron por pozo en una placa de 96 pozos. Las células se trataron con DIVISO, inhibidor de^ ?-secret sa DAPT y 13 por 6 días. La lectura de salida de azul Alamar fue tomada en el dia 0, día 2, dia 4 y dia 6. Ocho repeticiones se usaron para cada tratamiento y punto de tiempo. El tratamiento de linea celular de cáncer de mama humano HCC 1187 con inhibidor de ?-secretasa DAPT no alteró la cinética de crecimiento cuando se compara con Homólogos tratados con DMSO, mientras que tratamiento 13 causa inhibición estadísticamente significativa de proliferación celular. Los valores P se calcularon usando la prueba t de student. * = valor p < 0.05. ns= no significativo .
Las Figuras 6A, 6B, 6C y 6D muestran que la 6-(4-Tert-Butilfenoxi) Piridin-3-Amina (13) induce la detención de ciclo de célula G0/G1 y apoptosis en líneas celulares de leucemia linfoblástica aguda de célula T humana y línea celular de cáncer de mama humano HCC 1187. Figura 6A) las líneas celulares leucémicas humanas (RI-MI8402, CUTL1, K0PTK1, TALL1 y HPBALL) se trataron con 13 (10 µ?) . El porcentaje de población celular positiva (apoptótica) Anexina V se midió usando citometría de flujo. Figura 6B) Análisis de ciclo celular: Las líneas celulares RP I8402, K0PTK1 y TALL1 se trataron con 13 (10 µ?) y manchado con Ki67 y tinción Hoechst para determinar el estado de ciclo celular. El análisis de ciclo celular sugiere que el tratamiento 13 causa incrementar 20-30% en células detenidas en fase G0/G1 del ciclo celular. Figura 6C) Las células HCC1187 se trataron con DMSO o 10 µ? de 13 y el porcentaje de población apoptótica se midió usando tinción Anexina V. Figura 6D) Las células HCC1187 tratadas con 13 se analizaron para el estado de ciclo celular. La tinción Ki67 y Hoechst revela que 13 induce detención G0/G1 en células HCC1187.
Las Figuras 7A, 7B y 7C muestran que la 6-(4-Tert-Butilfenoxi) Piridin-3-Amin.a (13) imita la pérdida genética de fenotipo de señalización Notch2 en el bazo. La pérdida de señalización Notch en el bazo lleva a una reducción en células de Zona B . Marginales (MZB) en el bazo. Figura 7A) Esquemas del plan experimental. Figura 7B) Los ratones (n=2) se trataron con aceite o 25 mg/kg de 6-(4-Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) por 7 días consecutivos. Los bazos se analizaron en el día 8. Usando anticuerpos específicos B220, las células B en el bazo se identificaron. Las células MZB dentro del compartimiento de célula B se detectaron usando anticuerpos contra marcadores de superficie celular CD23 y CD21. El tratamiento de ratones con 6-(4-Tert-Butilfenoxi) Piridin-3-Amina (13) causa una reducción significativa en el. porcentaje de células MZB en el bazo. Figura 7C) El tratamiento de 6- ( 4 -Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) causa una reducción en los números absolutos de células MZB en el bazo; cuando se compara con animales tratados con vehículo.
Las Figuras 8A y 8B muestran que el tratamiento de 6-(4-Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) incrementa la latencia de desarrollo de leucemia en ratones. Figura 8A) Los ratones NOD/SCID YC_ " se inyectaron con células 1 x 106 HPB ALL (expresión de luciferasa) . En el día 15, las células leucémicas se establecieron en la médula ósea. Los ratones se trataron con aceite o 6- (4-Tert-Butilfenoxi) Piridin-3-Amina (13) para cada día. Los ratones' se formaron imágenes en el día 27 usando sistema de' formación de imágenes en directo Caliper IVIS (Xenogen) . El color rojo y azul indica la intensidad de señal de luciferasa y se correlaciona con el número de células leucémicas. Figura 8B) El tratamiento de 6-(4-Tert-Butilfenoxi) Piridin-3-Amina (13) bloquea el crecimiento de células leucémicas RPMI 8402 en ensayo de xenotransplantes. Los ratones NOD/SCID ??~ _ se trasplantaron con células 5 x 105 RPMI 8402 (expresión de luciferasa) . El desarrollo de leucemia fue seguido usando sistema de formación de imágenes en directo Caliper IVIS (Xenogen) . En el día 13, un tratamiento diario se inició usando aceite (n=3) o 6- (4-Tert-Butilfenoxi) Piridin-3-Amina (13) (n=4). Los animales se trataron por 27 días (punto final del experimento) .
Las Figuras 9A y 9B muestran que el tratamiento de 6-(4- Tert-Butilfenoxi) Piridin-3-Amina (13) bloquea los MMTV-ErbB2 tumores mamarios de ratón. Figura 9A) Los niveles de expresión de proteína Hesl en los tumores mamarios MMTV-ErbB2 y glándulas mamarias emparejadas de edad normal (M.G) se compararon usando anticuerpo Anti-Hesl. El análisis de Western blot mostró una expresión muy alta de proteína Hesl en tumores mamarios MMTV-ErbB2. La tubulina sirve como un control de carga. Figura 9B) Una suspensión celular simple de tumor mamario MMTV-ErbB2 se preparó y células 1 x 106 se inyectaron en la almohadilla de grasa limpiada de ratones FVB de recipiente. La formación de tumor se monitoreó en una base regular. Una vez que el tumor se desarrolla a un volumen de 100-300 mm3, los ratones se trataron con aceite (n=2) o 25 mg/kg de 6- ( 4-Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) (n=2). El volumen de tumor se midió cada 6-7 días. Los ratones tratados con 6- ( 4-Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) exhibieron una progresión de tumor lenta comparada con ratones tratados con aceite.
La Figura 10 mostró actividad inhibidora Notch de derivados químicos de 6- (4-Tert-Butilfenoxi) Piridin-3-Amina (13). Diferentes derivados químicos de 6-(4-Tert-Butilfenoxi) Piridin-3-Amina (13) se probaron en ensayo de co-cultivo DL4-N1 y los niveles de actividad Notch se midieron usando Notch conducido por gen reportero de luciferasa. Los derivados I3-A, I3-B, I3-C, ¦ I3-E, I3-G, I3-H, I3-M y I3-N exhiben actividad anti-Notch comparable a 6-(4-Tert-Butilfenoxi) Piridin-3-Amina (13), mientras que los derivados I3-F y I3-I parecen tener una actividad mejorada.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Aunque métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente se pueden usar en la práctica o ensayo de la presente invención, los métodos y materiales adecuados se describen abajo. Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes, y otras referencias mencionadas en la presente se incorporan como referencia en su totalidad. Las publicaciones y solicitudes discutidas en la presente se proporcionan únicamente para su descripción antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada en la presente se debe interpretar como una admisión de que la presente invención no tiene derecho a anteceder tal publicación en virtud de la invención anterior. Además, los materiales, métodos, y ejemplos son ilustrativos únicamente y no se pretende que sean limitantes.
En el caso de conflicto, la presente especificación, que incluye definiciones, se controlará. A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por uno de experiencia en la técnica a la cual la materia objeto de la presente pertenece. Como se usa en la presente, las siguientes definiciones se suministran con objeto de facilitar la comprensión de la presente invención.
Como se usa en la presente, el término "comprende/que comprende" se usa generalmente en el sentido de incluye/que incluye, es decir que permite la presencia de uno o más rasgos o componentes. Los términos "comprende" y "que comprende" también abarca los más restrictivos "consiste" y "que consiste".
Como se usa en la especificación y reivindicaciones, la forma singular "un/una", y "el/la" incluye referencias en plural a menos que el contexto claramente dicto lo contrario.
Para facilitar la lectura, el término "compuesto ( s ) de la invención" o "compuesto ( s ) de acuerdo a la invención" usados a lo largo de la descripción se refiere al compuesto 6- (4-Tert-Butilfenoxi) Piridin-3-Amina (13) (número CAS 218457-67-1) , derivados de tal 13, sales o solvatos del compuesto 13 o de los derivados, y a isómeros, que incluyen enantiómeros , estereoisómeros , rotámeros, tautómeros y racematos del compuesto 13, compuestos 13 modificados químicos y derivados de tales compuestos 13.
Como se usa en la presente los términos "sujeto" son bien reconocidos en la técnica, y, se refiere a un mamífero, que incluye perro, gato, rata, ratón, mono, vaca, caballo, cabra, oveja, cerdo, camello, y, más preferiblemente, un humano. En algunas modalidades, el sujeto es un. sujeto que necesita de tratamiento o un sujeto con una enfermedad o trastorno, tal como cáncer. Sin embargo, en otras modalidades, el sujeto puede ser un sujeto normal o un sujeto que ya ha experimentado un tratamiento contra cáncer. El término no denota una edad o sexo particular. Por lo tanto, los sujetos adultos, niños y recién nacidos, sea hombre o mujer, se pretende que estén cubiertos.
Los términos "cáncer", "células de cáncer", "enfermedades proliferativas celulares" y "trastornos proliferativos celulares" como se usa en la presente se refiere a o describe la condición fisiológica en mamíferos que se caracteriza típicamente por crecimiento celular no regulado. De acuerdo a la presente invención, cáncer se refiere preferiblemente a tumores sólidos, tal como de cerebro, pecho, próstata, colon y recto, riñon, pulmón, sarcoma, o melanoma y tumores líquidos, que afectan a la sangre, tal como leucemia. Más preferiblemente de acuerdo a la presente invención, los cánceres son cánceres dependientes de Notch seleccionados del grupo que comprende Leucemia linfoblástica Aguda de célula T (T-ALL, por sus siglas en inglés), leucemia miel'oide crónica (CML, por sus siglas en inglés), leucemia linfocítica crónica (CLL, por sus siglas en inglés), Linfoma de célula de manto, cáncer de pecho, cáncer pancreático, cáncer ele próstata, melanoma, tumores de cerebro, angiogénesis tumoral, cáncer colorrectal. Alternativamente, el cáncer dependiente de Notch es resistente al tratamiento de inhibidor de ?-secretasa. Los ejemplos de tratamiento de inhibidor de ?-secretasa comprenden 1) inhibidor de secretasa Gamma RO4929097 y Maleato Cediranib en el tratamiento de pacientes con tumores sólidos avanzados (NCTO 1131234), 2) Inhibidor de Secretasa Gamma RO4929097 en Tratamiento de Pacientes Jóvenes Con Tumores Sólidos en Recaída o Ref actarios, Tumores CNS, Linfoma, o Leucemia de .Célula T (NCTO 1088763), 3) Estudio de MK-0752 en combinación con Tamoxifen o Letrozol para tratar etapa temprana de cáncer de pecho (NCT00756717) , 4) GDC-0449 y RO4929097 en el tratamiento de pacientes con Avances o sarcoma metastásico (NCTO 1154452) 5) RO4929097 y Clorhidrato de Erlotinib en el tratamiento de pacientes con etapa IV o Cáncer de Pulmón de Célula No Pequeña recurrente (NCT01193881) , 6) Bicalutamida y RO4929097 en el tratamiento de pacientes con cáncer de próstata previamente tratado (NCTO 1200810), 7) RQ4929097 'en el tratamiento de pacientes con los Gliomas invasivos recurrentes (NCTO 1269411), 8) Un inhibidor de trayectoria de señalización Notch para pacientes con Leucemia Linfoblástica Aguda de célula T/Linfoma (ALL) (NCT00100152) y 9) RO4929097 en el tratamiento de pacientes con cáncer colorrectal metastásico (NCTO 1116687).
La trayectoria de señalización Notch se conserva evolutivamente y los jugadores moleculares básicos en esta trayectoria son ligandos (Delta and Jagged) , receptores Notch, y los factores de transcripción (Shih IeM, Wang TL in Cáncer Res 2007; 67 ('5): 1879-82). Notch es un receptor heterodimérico de transmembrana y hay cuatro miembros distintos (Notchl, Notch2, Notch3 y Notch4) en humanos y roedores. En una condición fisiológica, el enlace del ligando Notch a su receptor inicia la señalización Notch al liberar el dominio intracelular del receptor Notch (Notch-ICD) a través de una cascada de escisiones proteolíticas por ambas oí-secretasa (también llamadas enzima que convierte el factor a de necrosis de tumor) y ?-secretasa. El Notch-ICD intracelular liberado luego se transubica en el núcleo donde modula la expresión de gen ante todo al enlazar a un factor de transcripción ubicuo, CBF1, supresor de sin pelo, Lag-1 (CSL) . Este enlace engancha activadores de transcripción al complejo CSL y la convierte de un represor transcripcional en un activador, que activa diversos efectores de 3' . Las funciones fisiológicas de señalización Notch son multifacéticas, que incluyen mantenimiento de células madre, especificación de destinos celulares, y regulación de diferenciación en desarrollo asi como en oncogénesis.
En cánceres, alteraciones genéticas moleculares, tal como transubicación cromosómica, mutaciones puntuales, y amplificación cromosomal en los loci de receptor Notch, son los mecanismos conocidos por .activación constitutiva de trayectoria Notch. A pesar de los mecanismos diferentes, todos ellos dan como resultado niveles incrementados de Notch-IC intracelular. El potencial oncogénico de Notch se descubrió primero en leucemia linfoblástica aguda de célula T humana (T-ALL) . Mientras que la señalización de Notch 1 es esencial para el desarrollo normal de progenitores de célula T, la activación constitutiva de señalización Notchl debido a alteraciones genéticas moleculares se asocia con T-ALL. Por ejemplo, las eliminaciones intersticiales de la porción extracelular de Notchl humano debido a (7; 9) transubicación cromosómica se asocian con ~ 1% de casos T-ALL y mutaciones puntuales de activación de Notchl se presentan en alrededor de 50% de casos T-ALL. La formación de leucemia de célula T/linfoma se observó en un modelo de ratón transgénico Notch-ICD, que indica un papel causal de activación Notch en desarrollo T-ALL. En cáncer .de pulmón de célula no pequeña, la transubicación cromosómica (15; 19) se ha identificado en un subconjunto de tumores, y la transubicación se cree que eleva la transcripción Notch3 en tumores. En cáncer de ovario, la amplificación de gen Notch3 se encontró que se produce en alrededor de 19% de tumores, y la sobreexpresión de Notch3 se encontró en más di- la mitad de los carcinomas serosos de ovario. De forma similar, la activación de señalización Notch se ha mostrado en el desarrollo de cáncer de pecho. En modelos animales, constitutivamente la expresión Notch4 activa causa tumores mamarios en ratones y mutaciones de activación Notchl contribuyen al desarrollo de T-ALL. Un estudio reciente además muestra que la sobreexpresión de Notchl y Notch3 activados en ratones transgénicos bloquea el desarrollo de glándula mamaria e induce tumores de pecho de ratón. La activación de señalización Notch también se ha implicado en pulmón y metástasis óseas de células de cáncer de pecho. LA sobreexpresión de Notch3 es suficiente para inducir formación de tumores de plexo coroideo en un modelo de ratón, que sugiere un papel de Notch3 en el desarrollo de ciertos tipos de tumores de cerebro.
Con el objetivo de llevar a cabo una Separación por Exclusión de alto rendimiento (HTS) para identificar moduladores novedosos (inhibidores) de señalización Notch, Los solicitantes han establecido un ensayo de co-cultivo para inducir una activación mediada por receptor de ligando de la trayectoria. El ensayo de co-cultivo se estableció usando ligando Notch DL4 y receptor Notchl específicamente, ya que la activación de trayectoria mediada por receptor de ligando DL4-N1 juega un papel importante en las afecciones patofisiológicas tal como ' angiogénesis tumoral y el papel de receptor Notchl en inducir leucemia de célula T. Ya que este ensayo depende de la expresión e interacción entre ligando DL4 y receptor Notchl, esto proporciona una oportunidad para interrogar señalización Notch inducida por interacción de ligando-receptor de una manera controlada. La miniaturización de este ensayo en una placa de 96 pozos y formato de placa de 384 pozos ayudó a los Solicitantes para adaptar este ensayo para llevar a cabo HTS. El uso de este ensayo de co-cultivo para separar por exclusión siARN o colecciones de molécula pequeña puede llevar a la identificación de proteínas o compuestos químicos que son capaces de modular la señalización Notch en diferentes etapas a lo largo de la trayectoria. Por ejemplo, un HTS usando siARN o colecciones de molécula pequeña puede proporcionar moduladores de la trayectoria capaces de actuar en la señal que envía o señal que recibe células. Las alteraciones mediadas por proteína o molécula pequeña en el reciclaje o tráfico de los ligandos y receptores a la membrana de plasma pueden potencialmente bloquear la trayectoria Notch y se podrían estudiar usando este ensayo. Además, este ensayo también puede ayudar a identificar proteínas o entidades químicas capaces de bloquear interacciones ligando-receptor, desdoblamiento S2 mediado por ADAM 10/17 o desdoblamiento S3 catalizado por ?-secretasa del receptor Notch, transubicación nuclear de la forma activa de Notch o entidades capaces de bloquear complejo de activación transcripcional.
Los solicitantes han podido separar por exclusión tres diferentes colecciones de compuesto químico ( icrosource NIMDS, descubridores clave Prestwick and Maybridge) que han llevado a la identificación de diversos químicos, que son capaces de bloquear la señalización Notch en diferentes niveles a lo largo de la trayectoria.
El uso del sistema de renilla independiente, de Notch como un control interno permite a Solicitantes eliminar compuestos químicos citotóxicos, que limitan de este modo la velocidad de impactos positivos falsos. Además, este ensayo basado en célula también ayuda a eludir cuestiones relacionadas con la permeabilidad celular de los compuestos químicos para validación de golpe; adicional.
El desarrollo de sistema de ensayo de co-cultivo DL4:N1 sienta las bases para una campaña HTS . Este ensayo proporciona un sistema de lectura robusto y sensible para identificar moduladores novedosos (inhibidores) de la trayectoria Notch.
Los solicitantes identifican diversos compuestos químicos por su capacidad para bloquear la activación de trayectoria Notch. Entre ellos, se identificaron el compuesto 6- (4-Tert-Butilfenóxi) Piridin-3-Amina (13) (número CAS 218457-67-1) por su capacidad para bloquear la activación de trayectoria Notch.
Así, la presente invención se refiere a 6-(4-Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) de la Fórmula I Fórmula I para usar en el tratamiento y/o prevención de un cáncer.
La presente invención también abarca modificaciones químicas de la 6- (4-Tert-Butilfenoxi) Piridin-3-Amina (13) (CAS número: 218457-67-1) para prolongar sus tiempos de vida de circulación. Los ejemplos sin limitación de métodos para transitoriamente, o reversiblemente, pegilar los fármacos, que incluyen fármacos basados en polipéptido, se proporcionan en las Patentes de E.U.A. Nos. 4, 935, 465 (emitida el 19 de junio 1990) y 6, 342, 244 (emitida el 29 enero 2002); y en solicitudes publicadas, de E.U.A. número US2006/007402 . Un experto en la técnica típicamente encontraría más detalles alrededor de reactivos basados en PEG en, por ejemplo, solicitudes publicadas O2005047366, US2005171328, y aquellas enlistadas en el catálogo de reactivos NEKTAR PEG® 2005-2006 (Nektar Therapeutics , San Carlos, California) .
La presente invención además abarca derivados químicos de tal 13 que tienen propiedades de innibición de trayectoria de señalización Notch. Los solicitantes han demostrado que 6-(4-Tert-Butilfenoxi) Piridi ?-3-Amina (13) y su señalización Notch objetivo de der.ivados en el complejo de activación transcripcional en el núcleo, tumores humanos resistentes a inhibidores de ?-secretasa debido a mutaciones mencionadas arriba se espera que respondan a tratamiento de 6-(4-Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amína (13). Además, la 6-(4-Tert-Butilfénoxi ) Piridin-3-Amina (13) parece dirigir selectivamente la señalización Notch, limitando así sus efectos tóxicos fuera de objetivo.
Estos derivados todos comparten ia estructura siguiente: Preferiblemente, en tales derivados X es 0 y posición 3 (o para) es N.H2.
Más preferiblemente, el derivado que tiene propiedades de inhibición de trayectoria de señalización Notch se selecciona del grupo sin limitación que comprende Fórmula II en donde m es un entero seleccionado de 1 hasta 4 ; W se selecciona de H y halógenos; el halógeno se selecciona de F-, Cl-, Br- o I- ; Rl, R2 , R3, R4 son cada uno independientemente seleccionados del grupo que consiste en H, fenilo, 2-, 3- o 4-fenilo substituido, 2- o 3-naftilo, pirrolilo, furanilo, tiofuranilo, pirimidinilo, imidazolilo, bencilo, isoPropilo, tertButilo, alquenilo (CH2)nCH3, alquinilo; el subíndice n es un entero independientemente seleccionado de 1 hasta 15; X es 0, S, CR5R6, NR7 , NHC0R8, o NHS02R9; donde R5, R6, R7, R8, R9 son cada uno independientemente seleccionados del grupo que consiste en seleccionados del grupo que consiste en H, fenilo, 2-, 3- o 4- fenilo substituido, 2- o 3-naftilo, pirrolilo, furanilo, tiofuranilo, pirimidinilo, imidazolilo, benciio, isoPropilo, tertButilo, o (CH2)nCH3, el subíndice n es un entero independientemente seleccionado de 1 hasta 15; Y es N o CH; Z es H, N02, OH, NR10R11 donde RIO y Rll son cada uno independientemente seleccionados del grupo que consiste en H y (CH2)nCH3, NHC0R12 donde R12 es seleccionado del grupo que consiste de (CH2)nCH3, aromático y heteroaromáticos tal como fenilo, naftilo, pirrolilo, furanilo, tiofuranilo, pirimidinilo, imidazolilo, C00R13 donde R13 es seleccionado del grupo que consiste de H, (CH2)nCH3, aromático y heteroaromáticos tal como fenilo, naftilo, pirrolilo, furanilo, tiofuranilo, pirimidinilo, imidazolilo, NHS02R14 donde R14 es seleccionado del grupo que consiste de fenilo, 2-, 3- o 4, fenilo substituido, naftilo, heteroaromáticos tal como pirrolilo, furanilo, tiofuranilo, pirimidinilo, imidazolilo, benciio, (CH2)nCH3; el subíndice n es un entero independientemente seleccionado de 1 hasta 15, Fórmula III en donde m es un entero seleccionado de 1 hasta 4; W se selecciona de H y halógenos; el halógeno se selecciona de F-, Cl-, 'Br- o I-; R4 , R15 son cada uno independientemente seleccionados del grupo que consiste en H, fenilo, 2-, 3- o 4- fenilo substituido, 2- o 3-naftilo, pirrolilo, furanilo, tiofuranilo, pirimidinilo, imidazolilo, bencilo, isoPropilo, tertButilo, alquenilo (CH2)nCH3, alquinilo; el subíndice n es un entero independientemente seleccionado de 1 hasta 15; X es 0, S, CR5R6, NR7 , NHC0R8 o NHS02R9; R5, R6 y R7 son cada uno independientemente seleccionados del grupo que consiste en H, fenilo, 2-, 3- o 4- fenilo substituido, 2- o 3- naftilo, pirrolilo,' furanilo, tiofuranilo, pirimidinilo, imidazolilo, bencilo, isoPropilo, tertButil, (CH2)nCH3; R8 y R9 son cada uno independientemente seleccionados del grupo que consiste en fenilo, 2-, 3- o 4- fenilo substituido, 2- o 3-naftilo, o heteroaromáticos seleccionados del grupo que comprende pirrolilo, furanilo, tiofuranilo, pirimidinilo, imidazolilo, bencilo, (CK2)nCH3,- el . subíndice n es un entero independientemente seleccionado de 1 hasta 15; Y es N o CH; Z es H, N02, OH, NR10R11 donde R10 y R11 son cada uno independientemente seleccionados del grupo que consiste en H, (CH2)nCH3, NHCOR12 donde R12 es (CH2)nCH3, aromático y heteroaromáticos seleccionados del grupo que comprende fenilo, naftilo, pirrolilo, furanilo, tiofuranilo, pirimidinilo, imidazolilo, C00R13 donde RI3 es H, (CH2)nCH3, aromático y heteroaromáticos seleccionados del grupo que comprende fenilo, naftilo, pirrolilo, furanilo, tiofuranilo, pirimidinilo, imidazolilo, NHS0-R14 donde R14 es fenilo, 2-, 3- o 4, fenilo substituido, naftilo, heteroaromáticos seleccionados del grupo que comprende pirrolilo, furanilo, tiofuranilo, pirimidinilo, imidazolilo, bencilo, (CH2)nCH3, el subíndice n es un entero independientemente seleccionado de 1 hasta 15; Fórmula IV en donde m es un entero seleccionado de 1 hasta 4 ; W se selecciona de H y halógenos; el halógeno se selecciona de F-, CL-, Br- o I-; R4 es H, fenilo, 2-, 3- o - fenilo substituido, 2- o 3-naftilo, pirrolilo, furanilo, tiofuranilo, pirimidinilo, imidazolilo, bencilo, isoPropilo, tertButilo, (CH2)nCH3 alquenilo, alquinilo; el subíndice n es un entero independientemente seleccionado de 1 hasta 15; X es O, S, CR5R6, MR'7, NHCOR3 o NHS02R9; R5, R6 y R7 son cada uno independientemente seleccionados del grupo que consiste en H, fenilo, 2-, 3- o 4- fenilo substituido, 2- o 3- naftilo, pirrolilo, furanilo, tiofuranilo, pirimidinilo, imidazolilo, bencilo, isoPropilo, tertButilo, (CH2)nCH3; R8 y R9 son cada uno independientemente seleccionados del grupo que consiste en fenilo, 2-, 3- o 4- fenilo substituido, 2- o 3-naftilo, o heteroaromáticos seleccionados del grupo que comprende pirrolilo, furanilo, tiofuranilo, pirimidinilo, imidazolilo, bencilo, (CH2)nC'H3; el subíndice n es un entero independientemente seleccionado de 1 hasta 15; Y es N o CH; Z es H, N02, OH, ¦ NR10R11 donde R10 y R11 son cada uno independientemente seleccionados del grupo que consiste en H, (CH2)nCH3, NHCOR12 donde R12 es (CH2)nCH3, aromático y heteroaromáticos seleccionados del grupo que comprende fenilo, naftilo, pirrolilo, furanilo, tiofuranilo, pirimidinilo, imidazolilo, COOR13 donde R13 es H, (CH2)nCH3, aromático y heteroaromáticos seleccionados del grupo que comprende fenilo, naftilo, pirrolilo, furanilo, tiofuranilo, pirimidinilo, imidazolilo, NHS02R14 donde R14 es fenilo, 2-, 3- o 4, fenilo substituido, naftilo, heteroaromáticos seleccionados del grupo que comprende pirrolilo, furanilo, tiofuranilo, pirimidinilo, imidazolilo, bencilo, (CH2)nCH3, el subíndice n es un entero independientemente seleccionado de 1 hasta 15 Fórmula V en donde m es un entero seleccionado de 1 hasta 4; W se selecciona de H y halógenos; el halógeno se selecciona de F-, Cl-, Br- o I-; Rl, R2, R3, R4 son cada uno independientemente seleccionados del grupo que consiste en H, fenilo, 2-, 3- o 4- fenilo substituido, 2- o 3-naftilo, pirrolilo, furanilo, tiofuranilo, pirimidinilo, imidazolilo, bencilo, isoPropilo, tertButilo, alquenilo (CH2)nCH3, alquinilo; el subíndice n es un entero independientemente seleccionado de 1 hasta 15; X es 0, S, CR5R6, NR7, NHC0R8 p NHS02R9; R5, R6 y R7 son cada uno independientemente seleccionados del grupo que consiste en H, fenilo, 2-, 3- o 4- fenilo substituido, 2- o 3- naftilo, pirrolilo, furanilo, tiofuranilo, pirimidinilo, imidazolilo, bencilo, isoPropilo, tertButilo, (CH2)nCH3; R8 y R9 son cada uno independientemente seleccionados del grupo que consiste en fenilo, 2-, 3- o 4- fenilo substituido, 2- o 3-naftilo, o heteróaromáticos seleccionados del grupo que comprende pirrolilo, furanilo, tiofuranilo, pirimidinilo, imidazolilo, bencilo, (CH2)nCH3; el subíndice n es un entero independientemente seleccionado de 1 hasta 15; Z es H, N02, OH, NR10R11 donde RIO y Rll son cada uno independientemente seleccionados del grupo que consiste en H, (CH2)nCH3, NHC0R12 donde R12 es (CH2)nCH3, aromático y heteroaromáticos seleccionados del grupo que comprende fenilo, naftilo, pirrolilo, furanilo, tiofuranilo, pirimidinilo, imidazolilo., C00R13 donde R13 es H, (CH2)nCH3, aromático y heteroaromáticos seleccionados del grupo que comprende fenilo, naftilo, pirrolilo, furanilo, tiofuranilo, pirimidinilo, imidazolilo, NHS02R14 con R14 es fenilo, 2-, 3-o 4, fenilo substituido, naftilo, heteroaromáticos seleccionados del grupo que comprende pirrolilo, furanilo, tiofuranilo, pirimidinilo, imidazolilo, bencilo, (CH2)nCH3; el subíndice n es un entero independientemente seleccionado de 1 hasta 15; Fórmula VI en donde m es un entero seleccionado de 1 hasta 4 ; W se selecciona de H y halógenos; el halógeno se selecciona de F-, Cl-, Br- o I-; R4 , R15 son cada uno independientemente seleccionados del grupo que consiste en H, fenilo, 2-, 3- o 4- fenilo substituido, 2- o 3-naftilo, pirrolilo, furanilo, tiofuranilo, pirimidinilo, imidazolilo, bencilo, isoPropilo, tertButilo, alquenilo (CH2)nCH3, alquinilo; el subíndice n es un entero independientemente seleccionado de 0 hasta 15; X es 0, S, CR5R6, NR7, NHC0R8 o NHS02R9; R5, R6 y R7 son cada uno independientemente seleccionados del grupo que consiste en H, fenilo, 2-, 3- o 4- fenilo substituido, 2- o 3- naftilo, pirrolilo, fúranilo, tiofuranilo, pirimidinilo, imidazolilo, bencilo, isoPropilo, tertButilo, (CH2)nCH3; R8 y R9 son cada uno independientemente seleccionados del grupo que consiste en fenilo, 2-, 3- o 4- fenilo substituido, 2- o 3-naftilo, o hetéroaromáticos seleccionados del grupo que comprende pirrolilo, furanilo, tiofuranilo, pirimidinilo, imidazolilo, bencilo, (CH2)nCH3; el subíndice n es un entero independientemente seleccionado de 0 hasta 15; Z es H, N02, OH, NR10R11 donde RIO y Rll son cada uno independientemente seleccionados del grupo que consiste en H, (CH2)nCH3, NHCOR12 donde' R12 es (CH2)nCH3, aromático y hetéroaromáticos seleccionados del grupo que comprende fenilo, naftilo, pirrolilo, furanilo, tiofuranilo, pirimidinilo, imidazolilo, C00R13 donde R13 es H, (CH2)nCH3, aromático y hetéroaromáticos seleccionados del grupo que comprende fenilo, naftilo, pirrolilo, furanilo, tiofuranilo, pirimidinilo, imidazolilo, NHS02R14 con R14 es fenilo, 2-, 3-o 4, fenilo substituido, naftilo, hetéroaromáticos seleccionados del grupo que comprende pirrolilo, furanilo, tiofuranilo, pirimidinilo, imidazolilo, bencilo, (CH2)nCH3; el subíndice n es un entero independientemente seleccionado de 0 hasta 15; Fórmula VII en donde m es un entero seleccionado de 1 hasta 3; W se selecciona de H y halógenos; el halógeno se selecciona de F-, Cl-, Br- o I-; R4 es H, fenilo, 2-, 3- o 4- fenilo substituido, 2- o 3-naftilo, pirrolilo, furanilo, tiofuranilo, pirimidinilo, imidazolilo, bencilo, isoPropilo, tertButilo, (CH2)nCH3 alquenilo, alquinilo; el subíndice n es un entero independientemente seleccionado de 0 hasta 15; X es 0, S, CR5R6, NR7 , NHC0R8 o NHS02R9; R5, R6 y R7 son cada uno independientemente seleccionados del grupo que consiste en H, fenilo, 2-, 3- o 4- fenilo substituido, 2- o 3- naftilo, pirrolilo, furanilo, tiofuranilo, pirimidinilo, imidazolilo, bencilo, isoPropilo, tertButilo, (CH2)nCH3; R8 y R9 son cada uno independientemente seleccionados del grupo que consiste en fenilo, 2-, 3- o 4- fenilo substituido, 2- o 3-naftilo, o heteroaromáticos seleccionados del grupo que comprende pirrolilo, furanilo, tiofuranilo, pirimidinilo, imidazolilo, bencilo, (CH2)nCH3; el subíndice n es un entero independientemente seleccionado de 0 hasta 15; Z es H, N02, OH, NR10R11 donde RIO y Rll son cada uno independientemente seleccionados del grupo que consiste en H, (CH2)nCH3, NHC0R12 donde' R12 es. (CH2)nCH3, aromático y heteroaromáticos seleccionados del grupo que comprende fenilo, naftilo, pirrolilo, furanilo, tiofuranilo, pirimidinilo, imidazolilo, C00R13 donde R13 es H, (CH2)nCH3, aromático y heteroaromáticos seleccionados del grupo que comprende fenilo, naftilo, pirrolilo, furanilo, tiofuranilo, pirimidinilo, imidazolilo, NHS02R14 con R14 es fenilo, 2-, 3-o 4, fenilo substituido, naftilo, heteroaromáticos seleccionados del grupo que comprende pirrolilo, furanilo, tiofuranilo, pirimidinilo, imidazolilo, bencilo, (CH2)nCH3; el subíndice n es un entero independientemente seleccionado de 0 hasta 15; Fórmula VIII en donde el heteroaromático es un aminopirrol, aminofurano, aminotiofurano, o una pirimidina; Rl, R2, R3, R4 son cada uno independientemente seleccionados del grupo que consiste en H, fenilo, 2-, 3- o 4- fenilo substituido, 2- o 3-naftilo, pirrolilo, furanilo, tiofuranilo, pirimidinilo, imidazolilo, bencilo, isoPropilo, tertButilo, alquenilo (CH2)nCH3, alquinilo; el subíndice n es un entero independientemente seleccionado de 0 hasta 15; X es 0, S, CR5R6, NR7, NHC0R8, o NHS02R9; donde R5, R6, R7, R8, R9 son cada uno independientemente seleccionados del grupo que consiste en H, fenilo, 2-, 3- o 4- fenilo substituido, 2- o 3-naftilo, pirrolilo, furanilo, tiofuranilo, pirimidinilo, imidazolilo, bencilo, isoPropilo, tertButilo, o (CH2)nCH3, el subíndice n es un entero independientemente seleccionado de 0 hasta 15; Z es H, N02, OH, •NRlORll donde RIO y Rll son cada uno independientemente seleccionados del grupo que consiste en H, (CH2)nCH3, NHC0R12 donde R12 es (CH2)nCH3, aromático y heteroaromáticos seleccionados del grupo que comprende fenilo, naftilo, pirrolilo, furanilo, tiofuranilo, pirimidinilo, imidazolilo, C00R13 donde R13 es H, (CH2)nCH3, aromático y heteroaromáticos seleccionados del grupo que comprende fenilo, naftilo, pirrolilo, furanilo, tiofuranilo, pirimidinilo, imidazolilo, NHS02R14 con R14 es fenilo, 2-, 3-o 4, fenilo substituido, naftilo, heteroaromáticos seleccionados del grupo que comprende pirrolilo, furanilo, tiofuranilo, pirimidinilo, imidazolilo, bencilo, (CH2)nCH3; el subíndice n es un entero independientemente seleccionado de 0 hasta 15; Fórmula IX en donde el subíndice n es un entero independientemente seleccionado de 1 hasta 15; el heteroaromático es un aminopirrol, aminofurano, aminotiofurano, o una pirimidina; R4, R15 son cada uno independientemente seleccionados del grupo que consiste .en H, fenilo, 2-, 3- o 4- fenilo substituido, 2- o 3-naftilo, pirrolilo, furanilo, tiofuranilo, pirimidinilo, imidazolilo, bencilo, isoPropilo, tertButilo, alquenilo (CH2)nCH3, alquinilo; el subíndice n es un entero independientemente seleccionado de 0 hasta 15; X es O, S, CR5R6, NR7 , NHCOR8 o NHS02R9 ; R5, R6 y R7 son cada uno independientemente seleccionados del grupo que consiste en H, fenilo, 2-, 3- o 4- fenilo substituido, 2- o 3- naftilo, pirrolilo, furanilo, tiofuranilo, pirimidinilo, imidazolilo, bencilo, isoPropilo, tertButilo, (CH2)nCH3; R8 y R9 son cada uno independientemente seleccionados del grupo que consiste en fenilo, 2-, 3- o 4- fenilo substituido, 2- o 3-naftilo, o heteroarómáticos seleccionados del grupo que comprende pirrolilo, furanilo, tiofuranilo, pirimidinilo, imidazolilo, bencilo, (CH2)nCH3; el subíndice n es un entero independientemente seleccionado ié 0 hasta 15; Z es H, N02, OH, NRlORll donde RIO y Rll son cada uno independientemente seleccionados del grupo que consiste en H, (CH2)nCH3, NHCOR12 donde R12 es (CH2)nCH3, aromático y heteroaromáticos seleccionados del grupo que comprende fenilo, naftilo, pirrolilo, furanilo, tiofuranilo, pirimidinilo, imidazolilo, C00R13 donde R13 es H, (CH2)nCH3, aromático y heteroaromáticos seleccionados del grupo que comprende fenilo, naftilo, pirrolilo, furanilo, tiofuranilo, pirimidinilo, imidazolilo,' NHS02R14 con R14 es fenilo, 2-, 3-o 4, fenilo substituido, naftilo, heteroaromáticos seleccionados del grupo que comprende pirrolilo, furanilo, tiofuranilo, pirimidinilo, imidazolilo, bencilo, (CH2)nCH3; el subíndice n es un entero independientemente seleccionado de 0 hasta 15; p , ? Formula X R* en donde el heteroaromático es un aminopirrol, aminofurano, aminotiofurano, o una pirimidina; R4 es H, fenilo, 2-, 3- o 4- fenilo substituido, 2- o 3- naftilo, pirrolilo, furanilo, tiofuranilo, pirimidinilo, imidazolilo, bencilo, isoPropilo, tertButilo, alquenilo (CH2)nCH3, alquinilo; ' el subíndice n es un entero independientemente seleccionado de 0 hasta 15; X es O, S, CR5R6, NR7-, NHCOR8 o NHS02R9; R5, R6 y R7 son cada uno independientemente seleccionados del grupo que consiste en H, fenilo, 2-, 3- o 4- fenilo substituido, 2- o 3- naftilo, pirrolilo, furanilo, tiofuranilo, pirimidinilo, imidazolilo, bencilo, isoPropilo, tertButilo, (CH2)nCH3; R8 y R9 son cada uno independientemente seleccionados del grupo que consiste en fenilo, 2-, 3- o 4- fenilo substituido, 2- o 3-naftilo, o heteroaromáticos seleccionados del grupo que comprende pirrolilo, furanilo, tiofuranilo, pirimidinilo, imidazolilo, bencilo, (CH2)nCH3; el subíndice n es un entero independientemente seleccionado de 0 hasta 15; Z es H, N02, OH, NR10R11 donde RIO y Rll son cada uno independientemente seleccionados del grupo que consiste en H, (CH2)nCH3, NHCOR12 donde. R12 es (CH2)nCH3, aromático y heteroaromáticos seleccionados del grupo que comprende fenilo, naftilo, pirrolilo, furanilo, tiofuranilo, pirimidinilo, imidazolilo, COOR13 donde R13 es H, (CH2)nCH3, aromático y heteroaromáticos seleccionados del grupo que comprende fenilo, naftilo, pirrolilo, furanilo, tiofuranilo, pirimidinilo, imidazolilo, NHS02R14 con R14 es fenilo, 2-, 3-o 4, fenilo substituido, naftilo, heteroaromáticos seleccionados del grupo que comprende pirrolilo, furanilo, tiofuranilo, pirimidinilo, imidazolilo, bencilo, (CH2)nCH3; el subíndice n es un entero independientemente seleccionado de 0 hasta 15; Aún más preferiblemente, el derivado que tiene propiedades de inhibición de trayectoria de señalización Notch es seleccionado del grupo que consiste en Fórmula II d 4 (4- ( tert-pentil ) feno Fórmula III a 4- ( 4-ciclohexilfenoxi ) Fórmula IV a 6- (4- ( (3r, 5r, 7r) -adamantan-l-il ) fenoxi) piridin-3-amina , XX Fórmula li e 6- (3- (tert-butil) fenoxi) piridin-3-amina, Fórmula II f 4- (4- (tert-butil) fenoxi) -3-fluoroanilina, Fórmula II g 6- (4- (tert-Pentil) fenoxi) piridin-3-amina, Fórmula II h 6- ( 4-Butilfenoxi ) piridin-3-amina , Fórmula III b 4- (4-Ciclohexilfenoxi) -3-fluoroanilina , Fórmula II i 3-Fluoro-4- (4- (tert-pentil) fenoxi-) anilina, Fórmula II j 6- (4- ( 2-Metilpentan-2-il ) fenoxi) piridin-3-amina, Fórmula IV b 4- (4- ( (3r, 5r, 7r) -Adamantan-l-il ) fenoxi) anilina, r Fórmula IV c 4-(4-((3r,5r,7r) -Adamantan-l-il ) fenoxi ) -3-fluoroanilina, Fórmula III c 6- ( 4-ciclohexilfenoxi ) piridin-3-amina, Fórmula II k 4- ( - ( tert-butil ) feno Fórmula II 1 4- (4-isopropilfenoxi) anilina, y Fórmula li ra 6- (4- (2, 4, 4-trimetilpentan-2-il ) fenoxi) piridin-3 -amina .
La invención también se refiere a sales o solvatos del compuesto 13, compuestos 13 modificados químicos y derivados de tales compuestos 13 de la invención. Preferiblemente, estas sales y/o solvatos son farmacéuticamente aceptables. De acuerdo a la presente invención, las sales farmacéuticamente aceptables se producen de compuestos orgánicos o inorgánicos ácidos, o compuestos orgánicos o inorgánicos alcalinos. Como se usa en la presente, la frase "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a' una sal que retiene la eficacia biológica de los ácidos libres y bases de un compuesto especificado y que no es biológicamente o de otra manera indeseable.
A menos que se especifique de otra manera, se entiende además que todos los isómeros, que incluyen enant iómeros , estereoisómeros , rotámeros, tautómeros y racematos del compuesto 13, compuestos 13 modificados químicos y derivados de tales compuestos 13 de la invención se contemplan como que son parte de esta invención. La invención incluye estereoisómeros en forma ópticamente pura y en mezcla, que incluye mezclas racémicas. Los isómeros se pueden preparar usando técnicas convencionales, ya sea al reaccionar materiales de partida ópticamente puros u ópticamente enriquecidos o al separar isómeros de compuestos de la presente invención.
Los "racematos" se refiere a una mezcla de enantiómeros .
El "estereoisómero" o "estereoisómeros" se refiere a compuestos que difieren en la quiralidad de uno o más estereocentros. Los estereoisómeros incluyen enantiómeros y diastereómeros . El compuesto 13, compuestos 13 modificados quimicos y derivados de tales compuestos 13 de esta invención pueden existir en forma estereoisomérica si poseen uno o más centros asimétricos o un enlace doble con substitución asimétrica y, por lo tanto, ' se puede producir como estereoisómeros individuales o como mezclas. A menos que se indique de otra manera, la descripción se pretende para incluir estereoisómeros individuales asi como mezclas. Los métodos para la determinación de estereoquímica y la separación de estereoisómeros son bien conocidos en la técnica (ver discusión en Capitulo 4 de Advanced Organic Chemistry, 4a ed., J. March, John Wiley and Sons, Nueva York, 1992) .
"Tautómero" se refiere a formas alternativas de un compuesto que difiere en la posición de un protón, tal como tautómeros enol-ceto y imina-enamina, o las formas tautoméricas de grupos heteroarilo que contiene un átomo de anillo enlazado a tanto una porción -NH- de anillo y una porción =N- de anillo tal como pirazoles, imidazoles, benzimidazoles, triazoles, y tetrazoles.
Una persona experta conocerá que, si el compuesto 13, compuestos 13 modificados químicos y derivados de tales compuestos 13 de la invención contienen grupo cargado, un contraión adecuado se derivará de un ácido orgánico o inorgánico. Tales contraiones incluyen haluro (tal como cloruro, bromuro, fluoruro, yoduro) , sulfato, fosfato, acetato, succinato, citrato, Lactato, maleato, fumarato, palmitato, colato, glutamato, glutarato, tartrato, estearato, saiicilato, metanosulfonato, bencenosulfonato, sorbato, picrato, benzoato, cinnamato, y similares. Si la porción polar es un grupo negativamente cargado, un contraión adecuado se seleccionará de sodio, amonio, bario, calcio, cobre, hierro, litio, potasio y zinc, y similares.
Asombrosamente, el compuesto químico 6-(4-Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) se identificó como un inhibidor Notch potencial. Curiosamente, 6-(4-Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Araina (13) se encontró para bloquear Activación de trayectoria mediada por NICD (figura 1) . Debido a su capacidad para atenuar la activación Notch mediada por NICD, 6- (4-Tert-Butilfenoxi) Piridin-3-Amina (13) es capaz de bloquear la proliferación de Líneas celulares leucémicas que sobre expresan NICD que son resistentes a DAPT (inhibidor de a-v-secretasa, N- G - (3.5-dif luorofenacetil-Lalanil) ] - (S) -feniiglici.na -butil ster) (figura 5) . El potencial inhibidor Notch de 6- (4-Tert-Rutilfenoxi) Piridin-3-Amina (13) se confirmó además por la sub-reguiación de genes objetivo Nctch en líneas celulares T-AI.L humanas (figura 3) y matriz Affymetrix geneChip (datos no mostrados) . El hecho ae que 6- (4-Tert-Butilfenoxi) Piriain-3-Amina (13) puede inducir diferenciación de células C2CI2 en miotubos multinucleados que expresan MHC además -/aiidan el papel anti- otch de 6- (4-Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Ami na (13.) (datos no mostrados) . La inhibición de trayectoria Notch causada por 6- (4-Tert-Rutilfencxí ) Piridin-3-Am.ina (13) se puede rescatar por la sobreexpresión de MAML3 por arriba de ciertos niveles. Por ejemplo, 6- ( -Tert-Rutilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) fue capaz de bloquear la señalización con 300 ra de NICD y 1 yg de MAMLl se introdujo transitoriamente en las células, sin embargo cuando io cantidad de iMA Ll se incrementó a 3 yg, 6-( 4-Tert-Butilfenoxi Piridin 3---Amina (13) ya no fue capaz de bloquear ia activación de trayectoria (Figura 2) . Estos datos sugieren que, 6- (4-Tert-But ilfenoxi) Piridin-3-Amina (13) Duede interferir con el complejo de activación transcripcional Notch inhibi ndo ce este modo la activación de señalización. Los estudios de microscopio por la introducción de MAML en niveles donde 6-(4-Tert-Butilfenoxi) Piridin-3-Amina (13) .todavía podrían bloquear la activación de trayectoria muestran que el tratamiento 6- (4-Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) no impide la colocalización de NICD, MAML1 y CSL/RBP-j k en los compartimientos sub—nucleares (datos no mostrados) . Sin estar liqado a la teoría, uno de los mecanismos posibles de acción de 6- (4-Tert-Butilfenoxi) Piridin-3-Amina (13) se podría interrumpir el enganche de co-activadores transcripcionales al complejo CSL/RBP-j k-NICD-MAMLl de núcleo. Por lo tanto, el estado de co-activadores adicionales involucrados en la formación de complejo de activación transcripcional funcional aún necesita determinarse. Bajo condiciones fisiológicas, después de la formación de complejo CSL/RBP-j k-NICD-MAMLl , Acetiltransferasa de histona CBP/p300 (HAT) se engancha al complejo que lleva a su autoacetilación y acetilación de histona 3 y 4.
La 6- (4-Tert-Butilfenoxi) Piridin-3-Amina (13), así como derivados de los mismos, se investigaron además en un contexto in vivo para determinar su inhibidor Notch así como efectos secundarios tóxicos en los ratones. La señalización Notch es esencial para el mantenimiento de homeostasis normales en el intestino.. La ablación genética o inhibición farmacológica de señalización Notchl y Notch2 en el intestino lleva a metaplasia de células caliciformes en el intestino. Ya que, 6- ( 4-Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) se ha observado para bloquear la señalización mediada por Notchl y Notch2, los ratones tratados con 6-(4-Tert- Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) se esperaron para desarrollar metaplasia de células caliciformes. Asombrosamente, el tratamiento de ratones con 25 mg/kg de 6- (4-Tert-Butilfenoxi) Piridin-3-Amina (13) por 7 días (más de un mes en el caso de xenotransplantes ) no perturbó la homeostasis intestinal y sin ninguna indicación de acumulación de células¦ calciformes (datos no mostrados). Este resultado inesperado podría ser debido a dos razones. Una explicación posible podría ser que la concentración de 6- (4-Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) (25mg/kg) usada no es suficiente para bloquear la activación de trayectoria Notch en el intestino. Sin embargo, una segunda explicación más plausible podría ser las 'diferencias en la composición de complejos de activación transcripcional dirección descendente de señalización Notchl Notch2. Debido a estas diferencias posibles, la señalización mediada por Notchl y Notch2 puede tener diferentes sensibilidades contra tratamiento de 6-(4-Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) .
La señalización Notch juega un papel importante en la regulación de sistema hematopoyético . Por ejemplo, la señalización DL4-Notchl es esencial para desarrollo de célula T en el timo. La activación de trayectoria mediada por Notch2 y MAML1 es critico para desarrollo de células de Zona B Marginales (MZB) en el bazo. Para dirigir si 6-(4-Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) puede empeorar el desarrollo de célula MZB dependiente de Noten en el bazo, los ratones C57B16 se trataro con 25 mg/kg de 6-(4-Tert-Butilfenoxi) Piridin-3-Amina (13) por 7 dias y analizaron en el día 8. Los análisis de citometria de flujo usando anticuerpos contra B220, CD21 y CD23 revela que el tratamiento de 6- (4-Tert-Butilfenoxi) Piridin-3-Amina (13) causa una reducción del porcentaje y números absolutos de células MZB en el bazo (figura 7) .
La actividad anti-cáncer de 6-(4-Tert- Butilfenoxi) Piridin-3-Amina (13) se investigó en modelos de trasplante para enfermedades humanas, es decir leucemia de célula T y cáncer de pecho. En estos estudios, la 6-(4-Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Arnina (13) ha demostrado una capacidad notable para retrasar la progresión y metástasis de cada forma agresiva de lineas' celulares de leucemia (figura 8) . Además, en un estudio preliminar usando cáncer de pecho como un modelo de tumeres sólidos, el tratamiento de 6-(4-Tert-Butilfenoxi ) Pi ridin-3-Amina (13) ha llevado a un bloque en la progresión de tumor en ios ra ov.es (figura 9) .
El compuesto químico 6- ( 4 -Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) ha mostrado capacidad para bloquear señalización mediada por ICD. Por lo tanto este compuesto es útil en cánceres donde Notch conducido por tumores son resistentes a tratamiento de inhibidor de ?-secretasa.
La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende 6- (4-Tert-Butilfenoxi Piridin-3-Amina (13) de la fórmula I, o uno de sus derivados que tienen propiedades de inhibición de trayectoria de señali ación Notch como se describe en la presente, o sales farmacéuticamente aceptables, solvatos, tau orneros, i.someros del mismo, y un portador farmacéuticamente aceptable. En cuanto a los portadores apropiados, se puede hacer referencia a la literatura estándar que describe estos, por ejemplo el capitule 25.2 de Vol. 5 de "Comprehensiva Medicinal Chemistry", Pergaraon Press 1990, y de "Lexikon der Hilfsstoffe fur Pharmazie, Kosmetik und angren zeride Cebiete", by H.P. Fiedler, Edición Cantor, 20C2. El término "portador farmacéuticamente aceptable" significa un pertader o excipiente que es útil en preparar una composición f rmacéutica que es generalmente seguro, y posee toxicidades aceptables. Los portadores aceptables incluyen aquellos que son aceptables para uso veterinario así como uso farmacéutico humano. Un "portador farmacéuticamente aceptable" como se usa en la especificación y reivindicaciones incluyen tanto uno' como más de un portador. Opcionalmente, la composición farmacéutica de la presente invención además comprende uno o más agentes activos adicionales seleccionados entre el grupo sin limitación que comprende agentes quimioterapéuticos para tratar cáncer. Tales agentes quimioterapéuticos pueden ser seleccionados entre el grupo que comprende, por ejemplo, Altretamina, Bleomicina, Busulfán, Capecitabina, Carboplatin, Carmustina, Clorambucil, Cisplatino, Cladribina, Crisantaspasa, Ciclofosfamida, Citarabina, Dacarbazina, Daunorubicina , Doxorubicina, Epirubicina, Etopósido, Fludarabina, F'luorouracilo, Gemcitabina, Idarubicina, Ifosfamida, Irinotecan, Lomustina, elfalán, Mercaptopurina, Metotrexato, Mitomicina, Mitoxantrona, ¦ Oxaliplatino, ' Pentostatina, Procarbazina, Estreptozocina , Taco, Temozolomida, Tioguanina/Tioguanina, Tiotepa, Topotecán, Treosulfán, Vinblastina, Vincristina, Vindesina y Vinorelbina.
Los compuestos de la invención, es decir la 6-(4-Tert- Butilfenoxi) Piridin—3-Amina (13) y derivados de los mismos, que se usan en el tratamiento y/o prevención de cánceres se pueden incorporar en. una variedad de formulaciones y medicamentos por administración terapéutica. Más particularmente, uno o más compuesto (s) como se proporciona en la presente se puede formular en las composiciones farmacéuticas por combinación con portadores farmacéuticamente aceptables, apropiados, y se puede formular en preparaciones en formas sólida, semi-sólida, liquida o gaseosa, tal como comprimidos, cápsulas, pildoras, polvos, gránulos, grageas, geles, compuesto acuoso, ungüentos, soluciones, supositorios, inyecciones, inhalantes y aerosoles. Como tal, la administración de los compuestos se puede alcanzar de diversas formas, que incluyen administración oral, bucal, rectal, parenteral, intraperitoneal, intradérmico, transdérmico, intracraneal y/o intratraqueal . Por otra parte, el compuesto se puede administrar de una manera local en lugar de sistémica, en un depósito o formulación de liberación sostenida. Los compuestos se pueden formular con excipientes comunes, diiuyentes o portadores, y comprimidos en comprimidos, o formulados como elixires o soluciones para administración oral conveniente, o administrados por las vías intramuscular c intravenosa. Los compuestos se pueden administrar a través de la piel, y se pueden formular como formas de dosificación de liberación sostenida y similar. Los compuestos se pueden administrar solos, en combinación uno con el otro, o se pueden usar en combinación con otros compuestos conocidos.
Las formulaciones adecuadas para usar en la presente invención se encuentran en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company (1985) Filadelfia, PA, 17th ed. ) , que se incorpora en la presente como referencia. Por otra parte, para una breve revisión de métodos para suministro de fármaco, ver, Lsnger, Science (1990) 249: 1527-1533, que se incorpora en la presente como referencia.
La cantidad de un compuesto como se proporciona en la presente que se puede combinar con un material portador para producir una forma de dosificación simple variará dependiendo de la enfermedad tratada, el sujeto que necesita del mismo, y ei modo particular de administración. Sin embargo, como una guia general, las dosis unitarias adecuadas para los compuestos de la presente .invención pueden, por ejemplo, preferiblemente contener entre 0.1 mg hasta alrededor de 1000 mg, entre 1 mq hasta alrededor de 500 mg, y entre 1 mg hasta alrededor de 300 mg del compuesto activo. En otro ejemplo, la dosis unitaria es entre 1 mg hasta alrededor de 100 mg . Tales dosis unitarias se pueden administrar más de una vez al dia, por ejemplo, 2, 3, 4, 5 c 6 veces al dia, pero preferiblemente 1 o 2 veces al dia, de manera que la dosificación total para un adulto humano de 70 kg está en el intervalo de 0.001 hasta alrededor de 1 mg por kg de peso de sujeto por administración. Una dosificación preferida es 0.01 hasta alrededor de 1..5 mg por kg de peso de sujeto por administración, y tal terapia se puede extender por un número de semanas o meses, y en algunos casos, años. Se entenderá, sin embargo, que el nivel de dosis especifico para cualquier paciente particular dependerá de una variedad de ractores que incluye la actividad del compuesto especifico empleado; la edad, peso corporal, salud <ieneral, sexo y dieta del individuo que está siendo tratado; el tiempo y ruta de administración; la velocidad de excreción; otros fármacos que se han administrado previamente; y la severidad de la enfermedad particular que se somete a terapia, como es bien entendido por aquellos de experiencia en el área. Una dosificación típica puede ser un comprimido de 1 mg hasta alrededor de 100 mg o 1 mg hasta alrededor de 300 mg tomado una vez por día, o, múltiples veces al día, o un :ompriir>icio o cápsula de liberación retardada tomada una vez per día y que contiene un contenido proporcionalmente mayor de ingrediente activo. El efecto de liberación retardada se puede obtener por materiales de cápsula que se disuelven en diferentes valores de pH, por cápsulas que liberan lentamente por presión osmótica, o por cualquier otro medio conocido de liberación controlada. Puede ser necesario usar dosificaciones fuera de estos intervalos en algunos casos como será evidente para aquellos expertos en la técnica.
La presente invención además proporciona un compuesto de la invención para usar en tratar y/o prevenir cánceres.
Como se usa en la presente, los cánceres son preferiblemente cánceres dependientes de Notch y son seleccionados del grupo sin limitación que comprende leucemia linfoblástica Aguda de célula T (T-ALL) , leucemia mieloide crónica (CML) , leucemia linf ocí t Lea cr nica (CLL) . linfoma de célula de manto, cáncer de pe'dx , cán er pancreático, cáncer de próstata, melanoma, tumores de cerebro, angiogénesis tumoral, y cáncer colorrectal.
Preferiblemente, los compuestos de la presente invención ( 6- (4-Tert-Butilfenoxi) Piridin-3-Amina (13), sus derivados) también se pueden usar en el tratamiento de cánceres donde los cánceres dependientes de Notch son resistentes a tratamiento de inhibidor de ?-secretasa. La señalización Notch dependiente de tumores humanos resistentes a tratamiento de inhibidor de y-secreta:;a se puede determinar por lo niveles de NICD, genes ol eti.vo Notch asi como por el estado de mutación de receptor Notch y otros componentes de la trayectoria Notch.
La presente invención también proporciona un método para tratar y/o prevenir cánceres, tal método comprende administrar la 6- (4-Tert-Butilfenoxi) Piridin-3-Amina (13), sus derivados, o la composición farmacéutica de la invención 5-1 a un sujeto que necesita del mismo.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un método de tratamiento de una enfermedad asociada con una actividad de trayectoria de señalización Notch sobre-regulada, tal método comprende administrar la 6-(4-Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13), un derivado del mismo, o la composición farmacéutica de la invención a un sujeto que necesita del mismo.
La dosis diaria de compuestos de la pr se^ni e invención variará necesari mente dependien lo del hospedero tratado, la ruta particular de administración, y la severidad y clase de la enfermedad que se está tratando. En consecuencia la dosificación óptima se puede determinar por el médico que esté tratando cualquier paciente particular. Además, se observa que el clínico o médico que trata sabrá cómo y cuándo comenzar, interrumpir, ajusfar, o terminar la terapia en conjunto con la respuesta individual del paciente.
Para cualquier compuesto usado en el método de la presente invención, una dosificación t -:ai) ut Lcam nte efectiva se puedo estimar inici.límente de ensayos de cultivo celular, modelos animales, o mi crodosificaciones de sujetos humanos .
El "tratamiento" como se usa en la presente, se refiere a tanto tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas. Los sujetos que necesitan de tratamiento incluyen aquellos ya con el tra itorno, tal como cáncer, asi como aquellos en los que el trastorno, tal como cáncer, se ha de evitar. Por lo tanto, el mamífero, preferiblemente humano, a tratarse en la presente puede haber sido diagnosticado como que tiene el trastorno, tal como cáncer, o se puede predisponer o ser susceptible al trastorno, tal como cáncer.
El término "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad de un fármaco efectivo para tratar una enfermedad o trastorno en un' mamífero. En el case» de cáncer, la cantidad terapéuticamente efectiva del rá rmaco puede reducir el número de tumor o c> 'lulas de cáncer, reducir el tamaño de tumor; inhibir (es decir, disminuir en cierto grado y preferiblemente detener) la infiltración de células de cáncer en los órganos periféricos; inhibir (es decir, disminuir en cierto grado y preferiblemente stop) la metástasis tumor; inhibir, hasta cierto grado, crecimiento de tumor; y/o aliviar hasta cierto grado uno o más de los síntomas asociados con el cáncer. En la medida en que los compuestos de la presenté invención pueden ev tar el crecimiento y/o matar las células de cáncer existentes, pueden ser citostático y/o cit tóxico. La frase "cantidad terapéuticamente efectiva" se usa en la presente para significar una cantidad suficiente para prevenir, o preferiblemente reducir por al menos alrededor de 30 por ciento, preferiblemente por ai menos 50 por ciento, preferiblemente por al menos 'O por ciento, preferiblemente por al menos 30 por ciento, preferiblemente por al menos 90%, un cambio clínicamente significativo en el crecimiento o progresión o actividad mitótica de una masa celular objetivo, grupo de células . de cáncer, u otro rasgo de patología.
Opcionalmente los compuestos de la presente invención se pueden usar contra enfermedades proliferativas celulares en combinación (por ejemplo ya sea al mismo tiempo, o casi al mismo tiempo, o uno después del otro) con tratamientos convencionales tal como " radioterapia estándar y/o quimioterapia estándar. La quimioterapia y radioterapia estándar también pueden s> r la quimio-radioterapia concomitante.
Por lo tanto, opcionalmente, la radioterapia y/o quimioterapia estándar se puede realizar antes de, simultáneamente o después de la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto de la presente invención, o composiciones farmacéuticas que contienen el mismo.
El término "quimio-radioterapia concomitan e" se usa cuando estos dos tratamientos (quimioterapia y r idioterapia ) se dan ya sea al mismo tiempo, o casi al mismo tiempo, por ejemplo uno después del otro, o en el mismo día, etc.
El término "radioterapia estándar" se refiere al uso de radiación ionizante como parte de tratamiento de cáncer para controlar células malignas. Preferiblemente 1 radiación ionizante es y- irradiación . Es ' también común combinar la radioterapia con cirugía, ¦ quimil terapia, terapia de hormona, o combinaciones de los mismos. Tipos más comunes de cánceres se pueden tratar usualmente con radioterapia. La intención de tratamiento preciso (curativo, adyuvante, neoadyuvante o paliativa) dependerá del tipo de tumor, ubicación, y etapa, así como la salud general del sujeto que necesita del mismo.
El término "quimioterapia estándar" generalmente se refiere a un tratamiento de un cáncer usando agentes quimioterapéuticos/químicos específicos. U:i agente quimioterapéutico se refiere a un agente farmacéutico generalmente usado para tr.itar cáncer. Los agentes quimioterapéuticos para tratar cáncer incluyen, por ejemplo, Altretamina, Bleomicina, Busulfán, Capecitabina, Carboplatin, Carmustina, Clorambucil, Cisplatino, Cladribina, Crisantaspasa, Ciclofosfamida, Citarabina, Dacarbazina, Daunorubicina, Doxorubicina , Epirubicina, Etopósido, Fludarabina, Fluorouracilo, Gemcitabina, Idarubicina, Ifosfamida, Irinotecan, Lomusv. ina , Melfalán, Mercaptopurina, Metotrexato, Mitomicina, M i. to anl roña , 0 <aliplat i no, Pentostatin, Procarbazina, Estreptozocina , Taco, Temozolomide, , Tioguanin/Tioguanina, Tiotepa, Topotecán, Treosulfán, Vinblastina, Vincristina, Vindesina o Vinorelbina.
Cuando un agente quimioterapéutico se usa en combinación con un compuesto de acuerdo a la presente invención, entonces esto se puede usar en la foima de un mcidicamenti > jue contiene una combinación de estos dos .igenteí-, para administración simultánea, o se pueden usar en la forma de formas de dosificación separada, cada uno contiene uno de los agentes, y en el último caso las formas de dosificación individual se pueden usar por ejemplo, secuencialmente, es decir, una forma de dosificación con el compuesto de la invención, seguido por una forma de dosificación que contiene el agente quimioterapéutico (o vice versa) . Esta modalidad de dos formas de dosificación separada se puede concebir y proporcionar en la forma de un kit.
También opcionalmente Jos compuestos de la presente invención se pueden usar contra enfermedades proliferativas celulares, tal co o cánceres, en combinación con eliminación convencional de un volumen de tumor, por, por ejemplo resección segmentaria (biopsia o resección macroscópica) .
El término "eliminación de un volumen de tumor" se refiere a cualquier eliminación, ablación o resección de un volumen de tumor de un sujeto. La eliminación puede ser química, radiación o quirúrgica. Preferiblemente tal eliminación es quirúrgica, tal como ablación o resección. La resección puede ser "resección segmentaria" (o segmentectomía) , un procedimiento quirúrgico para eliminar parte de un órgano o glándula de un sujeto. También se puede usar para eliminar un tumor y tejido normal alrededor de él. El agente de citoreducción también se puede usar para eliminar el volumen de tumor. El término "agente de citoreducción" incluye cualquier molécula (por ejemplo, química, biológica) o cualquier agente externo/ambiental (por ejemplo, ?-irradiación) o cirugía tradicional que permitiría la matanza de células de cáncer del volumen de tumor (por ejemplo, células FL1° y FL1 como se mencionó anteriormente) .
Otro objeto de la presente invención es un kit que comprende una o más dosis de 6- (4-Tert-Butilfenoxi) Piridin-3-Amina (13), o de uno de sus derivados que tienen propiedades de inhibición de trayectoria de señalización Noten, o la composición farmacéutica de la presente invención para usar en un método para tratamiento y/o prevención de cánceres. El kit puede además comprender una o más dosis de un agente quimioterapéutico . Opcionalmente , el kit también puede comprender reactivos y/o instrucciones para el uso.
Generalmente, el kit comprende un recipiente y una etiqueta o prospecto en o asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringas, etc. Los recipientes se pueden formar de una variedad de materiales tal como vidrio o plástico. El recipiente mantiene la composición farmacéutica que es efectiva para tratar la afección y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón que se puede perforar por una aguja de inyección hipodérmica) . La etiqueta o prospecto indica que la composición se usa para tratar la afección de elección, t al corr.'o cánce .
La presente invención también se refiere al uso de los compuestos de la invención para inhibir in vitro o in vivo la trayectoria de señalización Notch en células. Usualmente, tales células son células de cáncer.
También previsto es un método de tratamiento de un sujeto para cáncer dependiente de Notch, que comprende i) determinar en células de cáncer obtenidas de una muestra biológica de tal sujeto si el cáncer es la trayectoria de señalización Notch dependiente, i i) y tratar tal sujeto en base a si el cáncer es cáncer dependiente de Notch al administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de 6- ( 4-Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) de la Fórmula I o uno de sus derivados que tienen propiedades de inhibición de trayectoria de señalización Noten, o una composición farmacéutica de la invención.
Usualmente, la dependencia de trayectoria de señalización Noten en células de cáncer se determina por cualquier método conocido en Li técnica. Como un ejemplo, este método puede consistir en unos ensayos de actividad de complejo de ?-secretasa in vi tro como se describe en la presente.
Este método de tratar puede además comprender administrar al menos un tratamiento de cáncer convencional. El tratamiento de cáncer convencional se administra antes de, simultáneamente o después de la administración de la cantidad terapéuticamente efectiva de 6- { -Terr-Butilfenoxi ) Pindm-3-Amina (13) de la Fórmula 1 o no de sus derivados que tiene propiedades de inhibición de trayectoria de señalización Notch, c la composición farmacéut ica de :1a invención.
Usualmente, el tratamiento de cáncer convencional consiste en radioterapia y/o quimioterapia.
La presente invención también se refiere al uso de los compuestos de la invención en un método para provocar apoptosis en una célula, ya sea in vitro o in vivo, al inducir ia detención de ciclo de célula G0/G1.
Aquellos expertos en la técnica apreciarán que la invención descrita en la presente es susceptible variaciones y modificaciones diferentes de aquellas específicamente descritas. Es de entenderse que la invención incluye todas de tales variaciones y modificaciones sin apartarse del espíritu o características esenciales del mismo. La invención también incluye todas de las etapas, rasgos, composiciones y compuestos referidos o indicados en esta especificación, individualmente o colectivamente, y cualquiera y todas las combinaciones o cualqine; a de dos o más de tales etapas o rasgos. L.i presente descripción es por lo tanto para considerarse como en todos los aspectos ilustrados y no restrictivos, el alcance de la invención que se indica por las reivindicaciones adjuntas, y todos los cambios que vienen dentro del significado e intervalo de equivalencia se pretende que estén abarcados en esto.
Diversas referencias se citan a lo largo de esta Especificación, cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad.
La descripción anterior se entenderá mas completamente con referencia a los siguientes Ejemplos. Tales Ejemplos, son, sin embargo, ejemplares de métodos de practicar la presente invención y no se pretende que limiten el alcance de la invención.
EJEMPLOS EjempLi 1 Constructos y ensayos de gen reportero: El cADN DL4-IRES dsRED de ratón se clonó en un vector pENTRl ( Invitrogen®) y finalmente transportó en un vector de lentivirus de destino usando estrategia de clonación Gateway (Invitrogen) . Un Promotor de fosfoglicerato quinasa (PGK) maneja la expresión de proteina DL4. Las partículas lentivirales DL4 se produjeron en células 293T por co-transfección de vector de lentivirus DL4, plásmido de expresión Gag/pol y codificación de pLásmido paja proteínas de envoltura viral. Para sobreexpr esai proteina Noten 1, el cADN Noten 1 de longitud completa de ratón fue uno clonado en un vector de puromicina pCDNA3.1-IRES . El cADN Notchl se clonó dirección ascendente de IRES-puromicina entre sitios de restricción HindIII y Xbal . Un promotor CMV controla la expresión de proteina Notchl.
Para medir la activación de señalización Notch, las secuencias de enlace ADN de consenso CSL/RBP-jk se clonaron en una cabeza a la conformación de la cola en el vector de luciferasa pGL4 (Promega), así llamado vector de luciferasa 12xCSL/RBP-j j k. Con objeto de iet.ermi.nar la activación de trayectoria Notch en ensayo de separación por exclusión de compuesto químico, secuencias de enlace ADN de consenso 12x CSL/RBP-jk se clonaron en vector de luciferasa pGL4.26. (Promega) . Como un control interno para eficiencia de transfección, Vector de renilla SV40 se usó (Promega) .
Los estudios de sobreexpresión NICD-GFP se realizaron usando plásmido de expresión .pEGFP-Cl-NICD. El plásmido FLAG-CMV2 que expresa MAML1-FLAG fue una especie de re jalo del Dr. Lizi Wu, Harvard Medical Schooi, Boston.
Generación de DL4 y NI células HeLa estables : Con objeto de generar lineas celulares estables DL4 y NI, célula HeLa se compraron de ATCC (# de catálogo CCL-2) . Para generar lineas estables DL4, las células se transducieron con partículas lentivirales DL4. Los clones estables DL4 se seleccionaron usando puromicina. Los Clones de expresión DL4 superiores se clasificaron usando anticuerpos contra DL4 con clasificación celular activada de Fluorescencia (FACS) . Para generar la línea estable NI, la célula se transfectaron con un plásmido pCDNA3.1+ (Invitrogen) que contiene Notchl de longitud completa de ratón bajo el control de promotor CMV. Para seleccionar Notchl que expresa clones, un Cásete de puromicina IRES se clonó dirección descendente de cADN Notchl. Las células HeLa que expresan niveles altos de Notchl se enriquecieron por FACS usando anticuerpos anti- otchl . Las células DL4- y NI- HeLa se cultivaron en DMEM (GIBCO, Invitrogen) , 10% FCS y 10ug/ml de aromicina (Sigma) .
Separación por exclusión de alta producción y análisis de datos : Para separar por exclusión la colección química, el ensayo de co-cultivo se realizó como sigue. Las células Nl-HeLa se co-trans feotaron en pLacas de cultivo do. '.ejido 10 cm con 16 µ? de vector/placa de LucLferasa pGL4.26.12xCSL . , 4 de placa/plásmido de expresión Notchl, y 200 ng de placa/vector de renilia SV40. Las células DL4- y Nl-HeLa se desprendieron de la placa al usar 0.5m EDTA (IXPBS) . Las ambas poblaciones celulares se contaron y mezclaron en relación 1:1 (5,000:5,000 células/pozo en una placa de 384 pozos) y dispensaron en placas de 384 pozos (blanco, fondo claro, Corning) usando dispensador de placa Combi multipunto. Las placas de ensayo se pr ^-dispensaron (usando manipulador de liquido Biomek. 3000 automatizado) con colecciones de compuesto químico (Microsource NIMDS, Maybridge Hitfmder and Prestwick) para dar una final concentración de 10 µ?. El volumen de ensayo final fue 22 µ1=. Veinticuatro horas más tarde, el medio de crecimiento se aspiró y las células se lisaron con solución amortiguadora de lisis Pasiva lx por 10 minutos a temperatura ambiente. La actividad de luciferasa se midió usando Reactivo II de Knsayo de Luciferasa y los valores de Renilla se determinaron al usar reactivo de Detención y Brillo (Sistema de ensayo de luciferasa doble, Cat # E1980, Promega) . Las lecturas de luciferasa y renilla se tomaron usando lector multiplaca Tecan® F500 (Tecan) . Todas las etapas de manipulación de liquido (aspiración del medio, dispensación de solución amortiguadora de lisis Pasiva, Reactivo II de Ensayo de Luciferasa y reactivos de Detención y Brillo) se rea] izaron usando ELF406 manipulador de liquido.
Los análisis de datos se realizaron usando software de análisis construido interno en Instalación de Separación por Exclusión Biomolecular (BSF) en Ecole Polytechnique Fedérale de Lausanne (EPFL) .
Extracción de ARN El ARN total se extrajo de las células usando TRIzol® el kit de extracción (Invitrogen) . Brevemente, las células lxlO6 se lavaron con lxPBS enfriado en hielo y Usaron en 1 mi de solución TRIzol® por 5 minutos a temperatura an.biente para disociar complejos de nucleoproieina. Las células Usadas se trataron luego con 200 µ? de cloroformo y agitaron vigorosamente por 15-30 segundes e incubaron a temperatura ambiente por 2-3 minutos. Las muestras se centrifugaron a 14000 rpm usando centrifugadora de mesa Eppendorf por 10 minutos a 4C'C. Después de ]a centrifugación, la fase acuosa superior se transfirió a nuevos tubos eppendorf. Para precipitar A.RN total 5Q0 µ? de alcohol de isomilo se agregó a la fase acuosa separada e incubo a temperatura ambiente por 10 minutos. Un peletizado de ARN se obtuvo por centrifugación de las muestras a 4°C por 10 minutos. El peletizado de ARN obtenido se lavó con etanol al 75% enfriado en hielo 1 mi y centrifugaron a 14000 rpm a 4°C. El peletizado de AR se secó completamente de exceso de etanol y re-suspendió en 40 µ? de agua DPEC.
Síntesis de cADN: El ARN total extraído de la célula se usó para sintetizar cADN por reacción de transcripción inversa. La transcripción inversa se realizó asando Superscript™ RT ( In.vitr.ogen ) . La concentración de ARN se midió usando NanoDrop©ND-1000 espectrofotómetro (Witec AG) y 500 ng de ARN total se mezcló con una mezcla de lOmM de dNTPs y 100 ng de cebadores aleatorios. La mezcla de reacción se incubó a 65 °C por 5 minutos y rápidamente incubó sobre hielo por 1 minuto. Después de la incubación en hielo, la primera solución amortiguadora de hebra 5x y D T ?.?? se agregaron y la mezcla se incubó por 2 minutos a 25°C. Para iniciar la reacción de transcripción inversa, 200U de SuperScrip™ II RT se agregó a la mezcla de reacción e incubó a 42°C por 50 minutos. La reacción se detuvo al incubar Ja mezcla de reacción a 75°C por 15 minutos.
Análisis de Western blot: Las células se Usaron en solución amortiguadora RIPA (50mM Tris.Cl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% nonidet P-40, 0.5% deoxicolato de sodio y 0.1% SDS) por 30 minutos a 4°C. Las células lisadas se centrifugaron para eliminar los residuos a 14000 rpm a 4°C. El sobrenadante se transfirió a un tubo eppendorf nuevo. La concentración de proteina se determinó por ensayo Bradford usando espectrofotómetro (UH rospec 3000 pro) . 40 xg de proteína se desnaturalizaron en lx SDS solución amortiguadora de cargd de gel (lOOmM Tris.Cl, pH 6.8, 200 mM DT , 4% SDS, 0.2% bromofenol, 20% glicerol) al calentar a 99°C por 5 minutos. Las muestras de proteína desnaturalizadas se almacenaron sobre hielo hasta la carga en el gel de acrilamida . Las muestras se ejecutaron en 8% o 10% gel de acrilamida en solución amortiguadora de electroforesis de Tris-glicina (Tris 25m , glicina 250 mM, 0.1% SDS) . Después de la separación en el gel de acrilamida, las muestras de proteína se transfirieron membrana .ie PVDF ( PEQ lab, catálogo número 39-3010) usando solución amortiguadora de transferencia (glicina 39 mM, base Tris 48 mM, 0.037% SDS y 20% metanol ) .
Para la inmunotransferencia , las membranas se bloquearon con 5% leche e incubaron durante la noche con anticuerpos primarios a 4°C. LÍAS membranas so lavaron con lx TBST (lx TBS + 0.5% tween 20) por 5 minuto:; (3 veces) e incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con HRP por una hora a temperatura ambiente. La señal se detectó con substrato quimioluminiscente Super Signal West (Thermo Scientific, catálogo número 34077).
Tinción de inmunofluorescencia : Para realizar la tinción de inmunofluorescencia, las células HeLa o células C2C12 se cultivaron en cubre objetos. Las células se lavaron con PBS enfriado en hiel lx, fijado con 4% PFA por 5 minutos a temperatura ambiente y permeabilizaron usando 0.31 Tritón X-100. Las Células permeabilizadas posteriormente se bloquearon por 20 minutos con 1% BSA por 20 minutos, a temperatura ambiente. Las células se incubaron con anticuerpos primarios apropiados para uno a temperatura ambiente. Los anticuerpos secundarios conjugados con Alexa Fluor-488 se usaron para detectar anticuerpos primarios. Las células fueron contra-manchadas con DAPI y montadas en medios de montaje; fluorescentes. Las Imágenes fluorescentes se visualizaron y capturaron usando microscopio Zeiss Axioplan en Bioimaging e instalación de núcleo de ópticos en EPFL .
Tabla 1: Lista de los anticuerpos y diluciones de trabajo.
Ensayo de diferenciación de mioblastos C2C12 : Las células C2C12 se culi ivaron en hoja de cubierta revestida de colágeno en la presencia de medio de crecimiento (10% suero) . Para inducir diferenciación de mioblastos, las células se cultivaron a 100% confluencia por 3 días en la presencia de medios de diferenciación (2% suero de caballo) o en la presencia de medio de crecimiento + inhibidores Notch. Después de 3 días, las células se lavaron con PBS enfriado en hielo lx y fijaron con 4% PFA. La tinción de inmunofluorescencia se reaLizó usando anticuerpo anti-MHC como se explica en la sección 2.2.6 (Tinción de inmunofluorescencia) . .
Análisis de citometria de flujo: Los análisis de clasificación celular activada de fluorescencia (FACS) se realizaron en plataforma de instrumento CyAn™ ADP para citometria cié flujo en Instalación principal de citometria de flujo, EPFL. DL4 y expresión Notch 1 en células DL4- y Nl-HeLa se determinó usando anticuerpos anti-DL4 y anti-Nl respectivamente. El desarrollo de célula T en el timo se investigó usando anticuerpos contra CD4, CD8 y el desarrollo de célula TCRp. ZB se monitoreó usando anticuerpos contra B220, CD21 y CD23. En breve, una suspensión celular simple se preparó del timo y bazo. Las células IxlO6 se suspendieron en 50 µ? de medios de tinción (HBSS complementados con 2% NCS y 25mM HEPES) y mancharon con combinaciones de anticuerpo apropiadas al incubar sobre hielo por 30 minutos.
Para cuantificar el porcentaje de células apoptóticas, la tinción de AnnexinV y 7AAD se realizó. Las células de timo se suspendieron en 300 µ? de solución amortiguadora de enlace lx AnnexinV (BD Biosciences, San Diego, USA) e incubó con 10 µ? de anticuerpo Annex.inV-Cy5 y 10 µ? de 7AAD (BD Biosciences, San Diego, USA) . Las muestras se incubaron por 15 minutos a temperatura ambiente. FACS se realizó con una hora de tinción de anticuerpo.
Los análisis de citometría de flujo se hicieron en células vivas al sincronizar en dispersión frontal (FSC) y dispersión lateral (SSC) . Los datos se analizaron por software FlowJo (Tree Star, Ashland, OR) .
Ensayo de proliferación de azul Alamar: Los ensayos de proliferación Alamarblue® se realizaron para determinar la cinética de crecimiento de Células tratadas con inhibidor Notch. El Alamar blue® consiste de una resazurina de substrato permeable a la célula. En células metabólicamente activas y proliferativas, la resazurina se convierte en resorufina debido a un poder de reducción intrínseco de células vivas y produce una fluorescencia roja. Por lo tanto la producción de resorufina sirve como un indicador de la viabilidad de la población celular.
Los ensayos de proliferación se realizaron al sembrar 5000 células/pozo en una placa de 96 pozos. Las células se trataron con DIVISO o los. inhibidores Notch por diferentes intervalos de tiempo. Cada tratamiento por cada intervalo de tiempo se llevó a cabo en 8 repeticiones. Para determinar la cinética de crecimiento, 10 µ? de Alamar blue® (Invitrogen) se agregó a cada pozo e incubó por 4 horas. La lectura de Alamarblue se tomó usando lector multiplac:a Tecan F500 (Tecan) .
Hematoxilina y Tinción de eosina : Los órganos se cosecharon, fijaron en 4% paraformaldehído (PFA) durante la noche a 4°C e incrustaron en parafina. Las secciones de tejido se desparafinaron e hidrataron usando concentración de etanol decreciente (100%-70%) y finalmente en agua destilada. Las secciones se mancharon con Hemotoxilina ' por 5 minutos, enjuagaron en alcohol ácido por alrededor de 20 segundos y luego se enjuagaron en agua corriente por 10 minutos. Las secciones se mancharon luego con Eosina por 5 minutos, se lavaron en agua y deshidrataron usando concentración cada vez mayor de etanol (70%-100%) y aclararon en solución de xileno. Las secciones se montaron luego usando solución de montaje. Las secciones teñidas hematoxilina y Eosina se visualizaron y las imágenes se capturaron usando microscopio Leica DMI4000.
Tinción de azul Alcian: El tejido intestinal se limpió con chorro de agua con lxPBS enfriado en hielo, se fijó en 4% PFA. Los tejidos se incrustaron en paraf i-na y seccionaron a un espesor de 4 mieras. Las secciones intestinales se desparafini zaron a 60°C e hidrataron con concentración de alcohol disminuida (100% -70%) y finalmente lavaron en agua destilada. La tinción de azul Alcian se realizó por 30 minutos a temperatura ambiente se lavó en agua corriente y finalmente se contratiño en solución roja rápida nuclear por 5 minutos. Las secciones de tejido se lavaron luego en agua corriente deshidratada en 100% alcohol y aclararon en solución de xileno . Las secciones montadas luego se visualizaron y las imágenes se capturaron usando microscopio Leica DMI4000.
Ratones experimentales : Los ratones se mantuvieron' y criaron en instalaciones de Animales, EPFL, Lausana . Les ratones C57B16 se usaron para evaluar la toxicidad intestinal de los compuestos químicos. Los ratones MMTV-ErbB2 /Neu-IRES Cre (respaldo FVB) se obtuvieron de Dr. William J Muller, cGill University, Montreal y obtuvo el genotipo usando cebadores específicos MMTV-ErbB2 /Neu ( Ur sini-Siegel et al, 2008). Los ratones NOD/SCIDvc ~'~ se compraron de The Jackson Laboratory (EUA) y se mantuvieron y criaron en instalaciones de Animales, EPFL, Lausana.
Toxicidad Intestinal y efecto en desarrollo celular de Zona B Marginal : Los ratones C57B16 se inyectaron por intraperitoneal (i.p) con aceite o 25 mg/kg de 13 o 10 mg/kg de PA, una vez al día por 5-7 días. Los ríitones se pesaron usando una balanza en el día 0, día 3 y di a 5. En el día 8, el tejido intestinal, bazo y timo se cosecharon para análisis.
Ensayo de trasplante de tumor: Las líneas celulares leucémicas humanas RPMI 8402 y HPB ALL se transducieron con un lentivirus que contiene gen de luciferasa constitutivamente expresado dirección descendente de un promotor CMV. Las líneas celulares leucémicas humanas RPMI 8204 (células 0.5-1 xlO6) y HPB ALL (1 x 10,;) se suspendieron en 100 µ? de lxPBS enfriado en hielo y mantuvieron sobre hielo hasta el trasplante. Los ratones NOD/SCIDYC _ ~ se trasplantaron con las líneas celulares leucémicas humanas por inyección intravenosa (i.v). Los ratones se monitorearon por desarrollo de tumor usando sistema de formación 'de imágenes en directo Caliper IVIS (Xenogen) . Brevemente, el substrato de luciferasa luciferina (Biosynth, L-8820) se disolvió en lxPBS y se inyectó (intra peritoneal) en los ratones en una concentración de 150mg/kg de peso corporal. A les ratones se les forma cor, imágenes 5 minutos después de la inyección de luciferina usando sistema de formación de imágenes en directo Caliper IVIS.
En el dia 13-15, los ratones se trataron con aceite o 25 mg/kg de 13 sobre una base diaria. Las imágenes se capturaron al final de los experimentos.
Los tumores mamarios M TV- Ert B2 /Neu primarios se cosecharon de los ratones y una suspensión celular simple se preparó. Las células tümoral s primarias 1 x 106 se suspendieron en 50 µ? de lx PBS y mantuvieron en hielo. Los ratones FVB receptores de tres semanas de edad se limpiaron de su epitelio endógeno y las células tumorales se inyectaron en la almohadilla de grasa vacia. El desarrollo de tumor en los ratones receptores se monitoreó y los volúmenes de tumor se midieron usando calibrador digital. Los volúmenes de tumor se calcularon usando la siguiente fórmula: 2 x longitud x (ancho) 2. Una vez que el tumor alcanzó un volumen de alrededor de 100 mm3, los ratones receptores se trataron con aceite o 25 mg/kg de 13 en días alternos.
Desarrollo de ensayo Con objeto de identificar moduladores novedosos de la trayectoria Notch, los ' solicitantes han establecido un ensayo de co-cultivo en el cual el ligando DL4 que expresa células HeLa se cultivaron con células NI HeLa, de este modo activando la trayectoria Notch. El uso de un sistema de cocultivo celular DL4 y NI HeLa imita las condiciones fisiológicas de comunicación célula-célula entre ligando y receptor que expresa células. La generación in vitro de un sistema de ensayo de receptor-ligando controlado permite a los Solicitantes modificar y monitorear la intensidad de señal Notch por inhibidores de ?-secretasa.
Cocultivo celular DL4:N1 HeLa activa la señalización Notch Para configurar un ensayo de co-cultivo, los solicitantes han establecido DL4 y NI que expresa lineas celulares HeLa estables; En breve, las células HeLa se transducieron con un lentivirus que contiene cADN dirección descendente DL4 del promotor PGK. El D4 que expresa la población celular se enriqueció por clasificación celular activada de fluorescencia. De forma similar, la linea celular HeLa estable NI se estableció usando un plásmido que contiene el. cADN de ratón NI seguido por u cásete de selección de Puromicina IRES. Este sistema permite a los Solicitantes seleccionar por únicamente Notchl que expresa clones cuando se selecciona usando puromicina. Los niveles de expresión de proteínas DL4 y NI en las líneas celulares respectivas se detectaron usando anticuerpos an.ti-DL4 y anti-Nl. La cuantificación de los niveles de proteína por citometría de flujo muestran expresión de nivel alto de DL4 y NI comparado con células HeLa párenteles (datos no mostrados) .
Para evaluar el potencial de activación de trayectoria Noten de las líneas celulares estables, las células HeLa estables DL4 y NI ( DL4 -HeLa y NI -HeLa , respectivamente), se co-cultivaron en relación 1:1 en una placa de 6 pozos y crecieron hasta confluencia. Las células cocultivadas se trataron con DIVISO o DAPT (10 µ?) por 24 horas. Para comparción, las células . HeLa parentales también se cocultivaron con células DL4-HeLa y se cultivaron en la presencia o ausencia de DAPT por 24 horas. El análisis de Western blot por la forma activa de Notchl (NICD) usando anticuerpos VAL1744 se realizó y reveló únicamente niveles modestos de NICD cuando las células HeLa parentales se co-cultivaron con células HeLa DL4 (datos no mostrados), representando un nivel bajo de Notchl endógeno en células HeLa. Por otra parte, en la ausencia de ligando (células DL4-HeLa) o en la presencia de niveles NICD GSI (DAPT) no se detectaron, indicando una .pérdida de señalización Notch (datos no mostrados). Sin embargo, los cocultivo de células HeLa DL4- y NI- revelan niveles significativamente superiores de NICD, que se pueden bloquear por tratamiento DAPT (datos no mostrados) . La introducción transitoria de cADN Notch 1 de longitud completa en células Nl-HeLa además mejoran la robustez del ensayo de co-cultivo como se indica por los niveles incrementados de proteina NICD (datos no mostrados). Inhibir el desdoblamiento NI con DAPT puede revocar el incremento en actividad de señalización Notch (datos no mostrados). Estos resultados confirman que los niveles altos de la activación de trayectoria Notch podrían alcanzarse en el ensayo de co-cultivo DL4:N1 que responde a inhibición GSI.
El establecimiento del ensayo de co-cultivo DL4:N1 en un formato de placa de 6 pozos permite a los Solicitantes evaluar activación de señalización Notch mediada por interacción receptor-ligando. EJ tratamiento GSI (DAPT) del sistema de cocultivo puede bloquear la señalización Notch conducida por interacción receptor-ligando.
Establecimiento de ensayo compatible de Separación por Exclusión de alto rendimiento (HTS) Inicialmente, el ensayo de co-cultivo DL4:N1 se estableció en una placa de 6 pozos. Con objeto de configurar una separación por exclusión de alto rendimiento (HTS), el sistema de ensayo se optimizó además para trabajar con firmeza en un formato de placa de 384 pozos.
El ensayo se redujo proporcionalmente a un formato de placa de 384 pozos para separación por exclusión de colecciones de compuesto químico. Con objeto de lograr esto, las células Nl-HeLa se transfectaron con plásmidos de un reportero y vector de expresión NI. Doce horas más tarde, los compuestos químicos se dispensaron en una placa de 384 pozos junto con DMSO y DAPT como controles negativo y positivo. Las células HeLa DL4- y NI- se mezclaron en una relación 1:1 (5000:5000 células /pozo ) y agregan a placas de 384 pozos usando dispensador de placa multidropCombi . La lectura de luciferasa se midió usando sistema de ensayo de luciferasa dual. Para optimizar y determinar la reproducibilidad del ensayo, la mitad de la placa se trató con DMSO (192 pozos) y la segunda mitad se trató con 10 µ? DAPT (192 pozos) . El tratamiento de DAPT lleva a una sub-regulación de 10 veces de activación de señalización Notch. El valor Z' para este ensayo fue mayor que 0.5. Un v lor Z' de >0.5 confirma la conflabilidad y reproducibilidad de los ensayos para una campaña HTS.
Ejemplo 2 6-(4-Tert-Butilfezioxi)Piridin-3-Amina (13) como un inhibidor de señalización Notch novedoso 13 inhibe la activación mediada por NICD de señalización Notch : Para validar la actividad inhibidora Notch y determinar el valor IC50 del compuesto 13, el sistema de ensayo de co- cultivo DL4:N1 se usó. 'Las células en el ensayo de co-cultivo se trataron por 24 horas con una concentración cada vez mayor de 13 (2-10µ?) . La activación de la trayectoria Notch se midió usando un Notch conducido por ensayo reportero de luciferasa. Como se muestra en la figura 1A, E3 bloquea la señalización Notch en una manera dependiente de la concentración con un valor IC50 en el intervalo µ? inferior.
Para determinar si la sobreexpresión de NICD puede rescatar la inhibición mediada por 13 de señalización Notch, las células HeLa se co-transfectaron con un plásmido de expresión NICD y constructo de luciferasa 12xCSL. Las células transíectadas se trataron con una concentración cada vez mayor de 13 y DAPT. Asombrosamente, el tratamiento de células que expresan NICD con 13 podría bloquear la activación de trayectoria de una mañera dependiente de dosis, mientras que DAPT no tiene efecto sobre la activación de señalización (Figura IB) . Estos datos sugieren que la inhibición mediada por 13 de la trayectoria Notch es debido a su actividad dirección descendente del evento de desdoblamiento S3.
Los Solicitantes siguientes investigaron si 13 podría bloquear la activación de trayectoria por medio de otros receptores Notch o es específica para señalización Notchl. Para dirigir esto, un ensayo de co-cultivo se usó donde la señalización Notch se activó por medio de DL4:N1 o DL4:N2 pares de receptor de ligando. El tratamiento de las células en estos dos ensayos de co-cultivo con ?3 causa una inhibición de la señalización Notch por medio de ambos pares DL4:N1 y DL4:N2 ligando-receptor (Figura 1C). De forma similar, 13 también bloquearía la activación de trayectoria por dominio intracelular Notchl (NICD) y dominio intracelular Notch2 (N2-ICD) , que sugiere que 13 no es específico para activación mediada por NICD (Figura ID) . 6- (4-Tert-Butilfenoxi) Piridin-3-Amina no bloquea la localización nuclear de NICD: Los datos in vitro de células HeLa transfectadas con NICD sugieren que 6- (4-Tert-Butilfenoxi) Piridin-3-Amina (13) bloquea la señalización Notch por actuación dirección descendente de evento de desdoblamiento S3. Esto plantea diversas posibilidades alrededor del mecanismo de acción de 6- ( 4-Tert-Butilfenoxi) Piridin-3-Amina (13). Pea: ejemplo, el tratamiento de 6- ( 4-Tert-Buti I fenoxi ) Piridin-3-Amina (13) perjudicaría la localización nuclear del NICD. Un segundo mecanismo posible de inhibición podría ser la orientación de uno o más componentes individuales del complejo de activación transcripcional en el núcleo. Para probar si 6- (4-Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) tiene un impacto en el transporte nuclear de NICD, células HeLa se transfectaron con un constructo de fusión NICD-GFP y trataron con DMSO y 6-(4-Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13). Esto permite a los Solicitantes seguir el transporte de proteina de fusión dentro de la célula. En paralelo, la inhibición de trayectoria mediada por 6- ( -Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) se determinó por Notch conducido por medición de luciferasa (datos no mostrados) . Los estudios de microscopio muestran que en la proteína de fusión NICD-GFP de células tratadas con DMSO transubica al · núcleo, que no se perturbó sobre tratamiento 6- (4-Tert-But i lfenoxi) Piridin-3-Amina (13) (datos no mostrados) . Estos datos eliminan la exclusión nuclear de NICD como un mecanismo de acción de I6-(4-Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) .
Sobreexpresión de MAMLl por arriba de un cierto umbral puede rescatar la inhibición de señalización Notch inducida por 6-( -Tert-Butilfenoxi) Piridin-3-Amina (13) : Como 6- ( 4-Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) mediada por bloqueo de señalización Notch no implica la exclusión nuclear de NICD, los Solicitantes dirigen si 6- (4-Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) bloquea la interacción y de este modo la sub-localización nuclear de NICD, MAMLl y CSL-RBP-jk (todas las partes del complejo de activación transcripcional de núcleo) . Para resolver esto, las células HeLa se co-transfectaron con 800 ng de plásmido NICD-GFP, 1 g de vector de expresión MAML1-FLAG y crecieron en cubre objetos. Las células HeLa transíectadas se trataron con DMSO o 6- (4-Tert-Butilfenoxi) Piridin- 3-Amina (13) (??µ?) por 24 horas. La capacidad de 6- (4-Tert-Butilfenoxi) Piridin-3-Amina (13) para bloquear activación Noten en esta concentración de NICD y MAMLl se verificó por Notch conducido por medición de luciferasa (datos no mostrados). Después del tratamiento, las células se fijaron con 4% PFA, bloquearon con 1% BSA y mancharon con anticuerpos contra MAMLl etiquetada FLAG y CSL-RBP-jk. La proteina de fusión NICD-GFP se visualizó al rastrear la proteina GFP. Cuando se expresa sola, la proteina NICD-GFP se localizó en el núcleo de una manera difusa y tratamiento de 6- (4-Tert-Bu ilí:enoxi) P iridin-3-Amina (13) no alteró su localización nuclear. Sin embargo la sobreexpresión de NICD-GFP y MAMLl; lleva a co-localización de ambas proteínas en compartimientos sub-nucleares (posiblemente cuerpos nucleares). El tratamiento de . G-^-Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) de las células no perturbó la transubicación y co-localización de NICD-GFP y MAMLl en compartimiento sub-nuclear (datos no mostrados) .
De forma similar, la ubicación de CSL/RBP-j k se investigó usando anticuerpos específicos contra esta proteína. Como se muestra en la figura 22C, MAMLl-FLAG y CSL/RBP-jk se co-localizan en compartimientos sub-nucleares y el tratamiento 6- (4-Tert-Butilfenoxi) Piridin-3-Amina (13) no perturbó su distribución en el núcleo (datos no mostrados). Estos datos sugiere que el tratamiento de 6-(4-Tert-Butilfenoxi) Piridin-3-Amina (13) no perturba la colocalización de componentes del complejo de activación transcripcional Notch en el núcLeo. Sin embargo, si bloquea la interacción entre diversos componentes del complejo todavía tendrá que investigarse.
Para investigar además el mecanismo de acción de 6-(4- Tert-Butilfenoxi ) Piridín-3-Amina (13), los Solicitantes especulan que la 6- (4-Tert-Butilfenoxi) Piridin-3-Amina (13) podría dirigirse a uno de los componentes del complejo de activación transcripcional. La sobre expresión de esta proteína objetivo puede titular hacia fuera el compuesto 6-(4-Tert-Butilfenoxi) Piridin- 3-Ami a (13) y así rescatar la 6-(4-Tert-Butilfenoxi) Piridin-3-Am i na (13) inducida por inhibición de trayectoria. Para dirigir esta cuestión, las células HeLa se co-transfectaron con 800 ng de plásmido NICD-GFP y con una cantidad incrementada (0.,. 1 y 3 µ?) de vector de expresión MAMLl-FLAG . La activación de trayectoria Notch se midió al introducir plásmido de luciferasa 12xCSL. Como se muestra en la figura 2, en células HeLa transfectadas con NICD solo o NICD + ?µ? de MAML1, el tratamiento de 6-(4-Tert- Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) puede bloquear la señalización Noten de una manera dependiente de la concentración. Sin embargo, cuando la cantidad de plásmido MAML1 se incrementó a 3 g, el tratamiento de 6-(4-Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) ya no fue capaz de inhibir la activación de la señalización Noten (Figura 2). Por lo tanto, la sobre expresión de MAML1 por arriba de un cierto umbral podría rescatar la 6- ( -Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) mediada por inhibición de la trayectoria Notch. Estos datos sugieren que MAML1 por si misma pueda ser el objetivo del compuesto 6— ( -Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13). Un incremento en la concentración de MAML1 puede ser capaz de titular fuera el inhibidor y así haciéndolo incapaz de bloquear la cascada de señalización.
Tratamiento de 6- (4-Tert-Butilfenoxi) Piridin-3-Amina (13) disminuye la señalización Notch en las lineas celulares de cáncer humano : La activación aberrante de señalización Notch juega un papel important en inicio de tumor y/o mantenimiento de cánceres humanos. Para determinar si el tratamiento de 6-(4-Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) puede bloquear la señalización Notch en las células de cáncer humano, diversas líneas celulares de cáncer (líneas celulares T-ALL RPMI 8402, HPBALL, K0PTK1 y linea celular de cáncer pancreático PANC1) se trataron con 6- ( 4-Tert-Butilfenoxi) Piridin-3-Amina (13) por 24 horas. El efecto sobre la señalización Noten se determinó al medir los niveles de expresión de genes objetivo Noten. El tratamiento de 6- ( -Tert-Butilfenoxi) Piridin-3-Amina (13) de lineas celulares de cáncer humano (RPMI 8402, HPBALL, KOPTK1 y PANC1) por 24 horas y análisis posteriores de genes objetivo Notch por qRT-PCR o análisis de Western blot muestra que la 6- (4-Tert-Butiifenoxi) P L idin-3-Amina (13) induce una sub-regulación estadísticamente importante de genes objetivo Notch tal como Hesl, cMyc y Dtxl en el mARN así como en los niveles de proteína (Figura 3) . La sub-regulación de genes objetivo Notch se correlaciona con niveles reducidos de NICD (Figuras 3B, 3C y 3D) .
Como tratamiento de las líneas celulares T-ALL humanas y línea celular de cáncer pancreático PANC 1 con 6- (4-Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) induce una sub-regulación de señalización Notch, los Solicitantes cuestionan si esta inhibición de la trayectoria se traduce en detención del crecimiento en células de cáncer. Con este fin, RPMI 8402, K0PTK1, PANC1 y nRas . conducidos por líneas celulares de melanoma se cultivaron en la presencia o ausencia de 6-(4-Tert-Butilfenoxi) Piridin-3-Amina (13) por varios días y su índice de proliferación se midió usando el ensayo de azul Alamar. Además, líneas celulares RAJI de linfooitos B sin mutaciones Notch conocidas se u aron como un control (datos no mostrados) . Como se muestra en la figura 4, el tratamiento de 6- (4-Tert-Butilfenoxi) Piridin -3-Amina (13) y DAPT induce un bloque de proliferación significativo en líneas celulares T-ALL RPMI 8402, KOPTK1 y línea de cáncer pancreático PANCí . De forma similar, la 6- ( 4 -Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) significativamente inhibe el crecimiento de nRas conducido por líneas celulares de melanoma (Fig 4) . Sin embargo ni DAPT ni 6- ( -Tert -But i 1 enoxi ) Piridin-3-Amina (13) tuvieron ningún efecto en La pr.oli fei ación de células RAJI independientes de Notch (datos n<> mostrados) . 6- (4-Tert-Butilfenoxi) Piridin-3-Amina (13) pero no bloquea DAPT señalización Notch en linea celular de cáncer de pecho y T-ALL humano que sobreexpresa NICD .
La 6- ( 4-Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) puede bloquear la activación mediada por NICD de la trayectoria Notch (figura 1). Para determinar si 6-(4-Tert-Butilfenoxi) Piridin-3-Amina (13) también puede inducir un bloque de proliferación en células que sobreexpresan NICD, la línea celular T-ALL humana DND41 ( DND41-Parental) fue transducida con un lentivirus que expresa NICD para generar línea celular DND41- ICD . Estas dos líneas celulares se trataron con DMSO, 6- ( -Tert-But ilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) y DAPT. El tratamiento de linea celular parental D D41 con DAPT y 6- (4-Tert-Butilfenoxi) Piri:din-3-Amina (13) lleva a una sub-regulación de Hesl cuando se compara con células tratadas con DMSO. Sin embargo, cuando las células DND 1-NICD se trataron con DMSO, la 6- ( 4-Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) y DAPT, únicamente 6- (4-Tert-Butilfenoxi) Piridin-3-Amina (13), pero no tratamiento DAPT causa una sub-regulación de Hesl (Figura 5A) . Además, estas dos lineas celulares también se monitorearon durante diversos días para efectos anti-proliferativos de 6- ( -Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) y DAPT. Se observe que mientras que ambos tratamientos 6-(4-Tert-Butilfenoxi ) Piridin -3-Amina ' (13) y DAPT causan un bloqueo proliferativo importante en la linea celular parental DND41 (Figura 5B) , únicamente 6- (4-Tert-Butilfenoxi) Piridin-3-Amina (13) fue capaz de inducir una detención del crecimiento en células D D41-NICD (Figura 5C) . Estos datos además, fortalecen la noción de que el compuesto 6- (4-Tert-Butilfenoxi ) Pirid.in-3-Amina (13) puede bloquear la activación de trayectoria mediada por NICD y la proliferación en células de cáncer humane.
Para además fortalecer la noción de que la 6- (4-Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) puede bloquear la activación de trayectoria mediada por NICD y la proliferación de células d.e cáncer humano, las líneas celulares de cáncer de mama humano HCC1187 se trataron con este compuesto. La linea celular HCC 1187 alberga una transubicación cromosómica SECC22B-Notch2 , generando asi la forma constitutivamente activa de N2-ICD (figura 5D) . Debido a esta mutación, las líneas celulares HCC 1187 no responden a inhibidores de y-secretasa tal como DAPT. Como se muestra en la figura 5E, mientras que el tratamiento DAPT no inhibió la proliferación de líneas celulares HCC 1187, el tratamiento de 6-(4-Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) significativamente induce un bloque de proliferación en esta línea celular. 6- (4-Tert-Butilfenoxi) Piridin-3-Amina (13) induce detención de ciclo celular G0/G1 y apoptosis en lineas celulares de leucemia linfoblástica aguda de célula T humana: Como se muestra en la figura 4 y 5, el tratamiento de 6-(4-Tert-Butilfenoxi) iridin-3-Araina (13) de líneas celulares leucémicas humanas y líneas celulares de cáncer de mama humano negativamente regula la proliferación. Esta 6-(4-Tert-Butilfenoxi) Piridin-3~Amina (13) mediada por detención proliferativa podría ser debido a la inducción de apoptosis o detención de ciclo celular durante diferentes fases de ciclo celular. Además, la inhibición de la señalización Notch usando inhibidores de ?-secretasa se li mostrado para inducir detenerón de ciclo celular G0/G1 en lineas celulares TALL humanas. Por lo tanto para elucidar además los mecanismos responsables por 6- (4-Tert-Buti lfenoxi) Piridin-3-Amina (13) mediada por ciclo celular de detención proliferativa y análisis de apoptosis se llevaron a cabo. Las lineas celulares TALL humanas (RPMI8402, K0PTK1, TALL1, CUTL1 y HPB ALL) y linea celular de cáncer de mama humano HCC 1187 se trataron con 6- ( 4-Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) o D SO por 2 días o 7 días. Para investigar la muerte celular, la tinción de Anexina V se realizó y la proporción de población celular apoptótica (Anexina V positiva) se determinó por análisis de citometría de flujo después de 7 días de tratamiento. Como se muestra en la figura 6A, el tratamiento de 6- ( 4-Tert-Buti] fenoxi ) Piridin-3-Amina (13) induce la apoptosis significativa en RPMI8402, CUTL1, K0PTK1, TALL1 y HPB ALL. De forma similar, la 6-(4-Tert-Butilfenoxi) Pir.idin-3-Amina induce la apoptosis en línea celular de cáncer de mama humano HCC 1187 (figura 6C) .
Además de la inducción de apoptosis, la detención proliferativa observada en líneas celulares leucémicas humanas y línea celular de cáncer de pecho tratadas con 6-(4-Tert-Butilfencxi) Piridin-3-Amina (13) también parece que es debido a la detención de ciclo celular en fase del ciclo celular G0/G1. Las líneas celulares de leucemia (RP I8402, K0PTK1 y TALL1) y líneas celulares de cáncer de pecho se trataron con 6- ( 4 -Tert-Buti lfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) por 48 horas y el estado de ciclo celular se determinó usando mancha Ki67 y Hoechst. Como se muestra en la figura 6B y 6D, la 6- (4-Tert-Butilfenoxi) Piridin-3-Amina (13) induce una detención en la fase del ciclo celular G0/G1, un fenotipo normalmente observado debido¦ a la inhibición de señalización Notch. 6- (4-Tert-Butilfenoxi) Piridin-3-Amina (13) mediada por inhibición de señalización Notch induce la diferenciación de mioblastos C2C12 : Para confirmar además el potencial inhibidor Notch de la 6- (4-Tert-Butilfenoxi) Piridin-3-Amina (13) en diferentes sistemas, la diferenciación de mioblastos C2C12 se usó como un ensayo funcional . La activación de trayectoria Notch en mioblastos C2C12 los mantiene en un estado indiferenciado, mientras que la abrogación de señalización Notch induce su diferenciación. Los mioblastos C!C12 se trataron con DMSO, la 6- (4-Tert-Butiifenoxi) Piridin-3-Amina (13) y DAPT y crecieron a 100% de confluencia por 3 días. Después de tres días, las células se fijaro y mancharon con anticuerpos contra proteína de Cadena Pesada de Miosina (MHC) . Los núcleos celulares se contrarnancharon con DAPT . Los mioblastos C2C12 crecieron en la presencia de 101 suero (medio de crecimiento) manteniendo su estado indiferenciado, mientras que las células tratadas con DAPT y 6- ( 4-Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) comienzan a diferenciarse en miotubos positivos MHC multinucleados (datos no mostrados). 6- (4-Tert-Butilfenoxi) Piridin-3-Amina (13) no impide a cascadas de señalización de Wnt y Erizo Una de las preocupaciones alrededor de la actividad del compuesto químico 6- (4-Tert-Butilfenoxi ) Pii idin-3-Amina (13) es su especi icidad hacia la trayectoria de señalización Noten. Con objeto de probar ' si 6-(4-Tert-Butilfenoxi) Piridin-3-Airnna (13) también bloquearía otras rayectorias de desarrollo, los Solicitantes han probado su capacidad para bloquear las trayectorias de señalización de Wnt y Erizo. En resumen, para medir la señalización Wnt, las células HeLa se transíectaron con un plásmido que contiene un promotor que consiste de sitios de enlace TCF/LEF y de este modo conducen la expresión de un gen de' iuciferasa {TOP-iuciferasa ) . Para activar la trayectoria Wnt, una codi f icición de plásmido para ß-catenina se co-transfectó en células HeLa. Las co-células transfectadas se incubaron en la presencia o ausencia del compuesto químico 6- ( 4-Tert-Butilfenoxi) Piridin-3-Amina (13) . La introducción transitoria de ß-catenina lleva a una sobreregulación de señalización nt según lo medido por ß-catenina-TCF/LEF conducido por la actividad de luciferasas. De forma importante, el tratamiento de 6- (4-Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) de células con señalización Wnt activada no bloquea la activación de trayectoria Wnt (datos, no mostrados) .
Usando una estrategia similar, la señalización de Erizo se activó en células HeLa al introducir el factor de transcripción Glil y la activación de trayectoria se monitoreó usando una secuencia de promotor que contiene sitios de enlace Glil que conducen la expresión de luciferasa. El tratamiento de estas células con 6-(4-Tert-Eutilfenoxi) Piridin-3-Amina (13) no inhibió la cascada de señalización de Erizo (datos no mostrados) . Tomados juntos estos datos sugiere que el compuesto químico 6-(4-Tert-Butilfenoxi) Piridin-3-.Amina (13) no puede empeorar otras trayectorias de desarrollo y podría ser específico para la inhibición de señalización Noten. Sin embargo aún necesita determinarse si la. resistencia de Wnt y señalización de Erizo hacia 6 - (4-Tert-ButilfenoxÍ) Pi ridin-3-Amina (13) es el tipo de célula específico o si es un fenómeno general.
Efectos in vivo de 6- (4-Tert-Butilfenoxi) Piridin-3-Amina (13) en ratones C57BL6 : La señalización Notch regula la homeostasis de diversos órganos durante el desarrollo. Por ejemplo, activación de trayectoria mediada por Notchl es esencial para el desarrollo de célula T en el timo (Radtke ot al, 1999). Sin embargo, el Notchl conducido por el desarrollo de célula T no parece ser dependiente de MAMLl, como la pérdida de MAMLl no perturbó el desarrollo de célula T e los ratones. Esto podría ser debido a un mecanismo compensatorio por miembros de la familia MAML2 y MAML3 por la pérdida de MAMLl. En el bazo, Notch2 conducido por la señalización exclusivamente por medio de MAMLl se requiere para desarrollo celular MZB. La pérdida de ablación genética de Notch2 y MAMLl causa un bloque en el desarrollo de células MZE (Wu .et al, 2007, Saito et al, 2005,). Además, la señalización Notch por medio de ambos Notchl y Notch2 es esencial para el mantenimiento del compartimiento crypt. Una ablación genética de compuesto de Notchl y Notch2 en el intestino lleva a metaplasia de células caliciformes. Los Solicitantes por lo tanto, investigan si la 6-(4-Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) perjudicaría los procesos de desarrollo dependientes de Notch mencionados anteriormente.
En los ensayos de cultivo in vit.ro, el compuesto químico 6- (4-Tert-Butilfenoxi) Piridin-3-A.mina (13) fue capaz de bloquear activación de trayectoria mediada por Notchl y Notch2. Por lo tanto, los Solicitantes presumen que el tratamiento de ratones con 6- ( 4-Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) puede llevar a una metaplasia de células caliciformes del intestino. Para probar esta hipótesis, los ratones se inyectaron intraperitonealmente (i.p) con 25 mg/kg de 6- ( -Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) por 7 días consecutivos. En el dia 8, los animales se sacrificaron y los tejidos intestinales se fijaron, e incrustaron en parafina. Los análisis histológicos se 1 levaron a cabo usando azul Alelan para teñir las células caliciformes. Asombrosamente, a pesar de su capacidad para bloquear tanto activación de trayectoria mediada por Noten 1 como Notch2 en cultivos in vitro, el tejido intestinal de ratones tratados con 6- (4-Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) fue completamente normal con arquitectura intacta y ninguna indicación de metaplasia de células caliciformes (datos no mostrados) . De forma similar, el efecto de ' 6- ( 4 -Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) en cambios de peso corporal también se monitoreó. Los ratones se inyectaron per 5 días consecutivos con 25 mg/kg de 6- ( 4 -Tert-Bu ilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) y los cambios en la masa corporal se registraron. El tratamiento de ratones con 6- ( 4-Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) no causó una pérdida en el peso corporal.
Tratamiento de 6- (4-Tert-Butilfenoxi) Piridin-3-Amina (13) induce un bloque en desarrollo celular MZB: Los Solicitantes presumen que inhibición mediada por 6- ( 4~Tert-Butil fenox ) Pi ridin-3-Am i na (13) de señalización otch2 podría llevar a un bloque en desarrollo celular MZB en el bazo. El desarrollo celular MZB se evaluó por tinción de citometría de flujo de esplenocitos con anticuerpos dirigidos contra B220, CD21 y CD23. Como se muestra en la figura 7B el tratamiento de ratones con 6- ( 4-Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) lleva a una reducción en el porcentaje de población celular MZB en el bazo. Además, la pérdida de población celular MZB en el bazo también refleja en el número absoluto de células MZB (figura 7C).
Por lo tanto, la 6- ( -Ter -Butilfencxi ) Piridin-3-Amina (13) mediada por bloque en desarrollo celular MZB imita la pérdida de fenotipo Notch2 y MAML1. Sin embargo, todavía se necesita para ser vivo, si 6- ( 4 -Tert-Buti lfenoxi ) Piridin-3-Am.ina (13) ejerce su efecto inhibidor Noten únicamente por medio de MAML1 o podría bloquear la señalización Notch por medio de otros miembros de la familia MAML también.
Tratamiento de 6- (4-Tert-Butilfenoxi) Piridin-3-Amina (13) muestra el crecimiento de tumor de leucemia de célula T humana en un modelo de xenotransplante : La activación de señalización Notch debido a mutaciones de activación en diferentes componentes de la trayectoria se conocen que causan más de 50% de .las leucemias Linfoblásticas agudas de célula T humana. Por lo tanto, los Solicitantes decidieron investigar la actividad anti-cáncer del compuesto químico 6- (4-Tert-Butilfenoxi) Pi ridin-3-Amina (13) en Notch conducido por leucemia de célula T humana in vivo. Para lograr este objetivo, los modelos de xenotransplante de leucemia humana se establecieron usando ratones NOD/SCID YC_/" . Las líneas celulares T-ALL humanas HPB ALL y RPMI 8402 se usaron para este propósito. La línea celular HPB ALL alberga una mutación L1575P en el dominio de heterodimeri ación y una inserción en el dominio PEST del receptor Notchl, de este modo constitutivamente activando la señalización Notchl. De forma similar, las células RPMI 8402 exhiben activación de señalización Notch independiente de ligando debido a una inserción en residuo 1584 a. a en el dominio de heterodimerización y también una mutación inactivante (R465H) en la ligasa E3 FBW7. Ambas de estas línea de células se encontraron para responder a tratamiento de 6- (4-Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) en ensayos de cultivo in vitro en términos de proliferación y/o sub-regulación de los genes objetivo Noten.. Para determinar si estas lineas celulares establecer . leucemia en un ajuste de xenotransplante , un millón de células de cada linea se inyectaron intravenosamente (i.v) en ratones NOD/SCIDYC_/~ . Los animales desarrollaron leucemia con 100% de penetrancia y muere dentro de 4 semanas después de trasplante.
Una vez que las lineas celulares RPMI 8402 y HPB ALL se mostraron para desarrollar leucemia en un ensayo de xenotransplantes , ellas se t ransducie ron con un lentivirus constitutivamente que expresa gen de luciferasa. Esto permite a los solicitantes visualizar y monitorear la progresión de leucemia en los ratones . usando el sistema de detección de imágenes en directo Caliper IVIS (Xenogen) . Con objeto de determinar la eficacia anti-cáncer de 6-(4-Tert-Butilfenoxi ) Piridiri-3-Amina (13) en tumores establecidos, un experimento de mantenimiento se realizó. Un millón de células HPB ALL se inyectaron (i.v) en ratones NOD/SCID yc~f~ . Los ratones se monitorearon por el desarrollo de leucemia al detectar las células leucémicas que expresan luciferasa. Una vez que la enfermedad se estableció alrededor del día 15, los ratones se dividieron en dos grupos. Un grupo se trató con aceite como un control y el segundo grupo se trató con 25 mg/kg de 6- (4-Tert-Butilfenoxi ) Pir idin-3-Amina (13) sobre una base diaria. Como se muestra en la figura 8?, los ratones tratados con aceite desarro laron leucemia con 100% de penetrancia mientras que la leucemia en los rallones tratados con 6- (4-Tert-Butilfenoxi).Piridin-3-Amina (13) no progresó en la misma velocidad como en el. grupo tratado con aceite (Figura 8A) .
De forma similar en un experimento preliminar, los ratones NOD/SCID yc_/" se trasplantaron con células 5 x 105 RPMI 8402 y trataron con aceite o 6-(4-Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) después del establecimiento de la enfermedad. Como se muestra en la figura 8B, los animales tratados con aceite, desarrollaron leucemia mientras que los ratones tratados con 6- ( -Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) fueron libres de la enfermedad. Además, los análisis histológicos revelan que en ratones tratados con aceite, las células leucémicas progresan para infiltrar el hígado, pero los ratones tratados con 6-(4-Tert-Butilfenoxi) Piridi.n-3-Amina (13) no desarrollaron ninguna de las lesiones metastásicas en el hígado (datos no mostrados) . Ya que estos animales se trataron con el compuesto químico 6-(4-Tert-Butilfenoxi) Piridin-3-Amina (13) por 27 días, el tejido intestinal se analizó para detectar cualquier toxicidad en el intestino. La tinción de azul Alcian de tejido intestinal no revela ninguna de las anormalidades en los números de células cálciformes y arquitectura intestinal (datos no mostrados) .
Tomados juntos les datos de ios Solicitantes de modelo de xenotransplante para leucemia humana sugiere que la 6- (4-Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) tiene la capacidad para retrasar la progresión de la enfermedad de una leucemia ya establecida. Debido a su capacidad para impactar la progresión de tumor, 13 puede ser un candidato adecuado para un mayor desarrolle como un agente anti-cáncer.
Tumores mamarios de ratón MMTV-ErbB2 exhiben activación de señalización Notch y efecto de 6- (4-Tert-Butilfenoxi) Piridin-3- Amina (13) en progresión de tumor mamario.
En cáncer . de pecho humano, los niveles altos de proteínas Notch 1 y Jagged 1 correlacionadas con una supervivencia pobre de pacientes con cáncer de pecho. Además, la activación de señalización Notch en cáncer de pecho humano también facilita la metástasis de hueso y pulmón. Por lo tanto con objeto ele determinar el potencial anticáncer del compuesto químico 6- (4-Tert-Butilfenoxi) Piridin-3-Amina (13) en cáncer de pecho, un modelo de ratón de cáncer de pecho se investigó. El virus de tumor mamario de ratón (MMTV) conducido por sobreexpresión de ErbB2 se conoce que causa tumores mamarios de ratón. Los ratones transgénicos MMTV- ErbB2 desarrollan tumores mamarios con una latencia de alrededor de 5-6 meses junto con el desarrollo de metástasis de pulmón. Una de las características de tumores mamarios de ratón M TV-ErbB2 es la presencia de tipos de célula epitelial predominantemente luminal. La señalización Notch se conoce para conducir diferenciación de célula luminal de células madre mamarias de ratón. Por lo tanto los Solicitantes presumen que la activación de la trayectoria Notch en tumores mamarios MMTV-ErbB2 puede contribuir hacia la tumorigénesis en parte al favorecer la diferenciación de célula epitelial luminal. Con este fin, los Solicitantes han investigado los niveles de activación de señalización Notch en tumores mamarios MMTV-ErbB2-IRES-Cre al medir los niveles de Hesl por Western blot. Como se muestra en la figura 9A, MMTV-ErbB2 conducido por tumores mamarios expresa niveles muy altos de proteina Hesl comparados con la edad de glándulas mamarias normales igualadas. Para investigar el efecto de 6-(4-Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) en desarrollo de cáncer de pecho, los tumores mamarios MMTV-ErbB2 se cosecharon de ratones FVB que llevan el tiansg n MMTV-ErbB2. Una suspensión celular simple se preparó y las células tumorales 5xl05 se inyectaron en una almohadilla de grasa vacia de un ratón FVB receptor. Una vez que' los tumores palpables se han desarrollado, los ratones receptores se trataron con ya sea aceite o 25 mg/kg de 6- ( 4-Tert-Butilfenoxi ) P Lr Ídin-3-Amina (13) en los días alternos hasta el final del experimento. El volumen de tumor se midió y registró en intervalos regulares. Los resultados preliminares mostraron que el tratamiento de tumor que portan los ratones receptores con 6-(4-Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) causa retardo de crecimiento de tumor significativo cuando se compara con ratones tratados con solo aceite (Figura 9B) . Estos datos muestran que 6-(4-Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) tiene la capacidad para retrasar el crecimiento de cáncer de pecho establecido. 6- (4-Tert-Butilfenoxi) Piridin-3-Amina (13) bloquea la señalización Noten en leucemias linfoblásticas agudas de célula T humana primaria: Para investigar además el efecto inhibidor Notch de 6-( 4-Tert-Butilfenoxi) Piridin-3-Amina (13) en una afección patológica relevante, las muestras TALL humanas primarias se perfilaron para la activación de señalización Notch. Una acumulación de forma activa de Notch (NICD) se usó como un biomarcador para la activación de trayectoria. Diversas TALL humana primaria exhiben una acumulación de NICD oncogénico y tratamiento de estos t.umores con 6- (4-Tert- Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) lleva a una sub-regulación de esta proteina. Por otra parte, la sub-regulación de NICD en estas muestras TALL humanas primarias se correlaciona con una detención proliferativa- (datos no mostrados) . De lo contrario, las muestras TALL humanas primarias que no muestran niveles detectables de NICD, no respondieron a tratamiento de 6- ( 4-Tert-Buti fenoxi ) Piridin-3-Amina (13) (datos no mostrados) .
Estos datos indican que una acumulación de NICD se pueden usar como un biomarcador para activación de trayectoria Notch y predecir el resultado del tratamiento usando inhibidor Notch 6- ( 4-Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13).
Diferentes derivados de 6- (4-Tert-Butilfenoxi) Piridin-3-Amina (13) exhiben una capacidad para bloquear la activación de señalización Notch en ensayo de co-cultivo DL4-N1: Con objeto de aumentar la actividad inhibidora Notch asi como la eficacia de compuesto de 6- (4-Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) parental, diferentes derivados químicos de 13 se probaron en ensayo de co-cultivo DL4-N1. La separación por exclusión de más de 40 diferentes derivados químicos de 6- ( -Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) proporcionó los siguientes compuestos por su capacidad para bloquear activación de trayectoria Notch en ensayo de co-cultivo (figura 10) .
I3-A) . 6- ( 4-ciclohexilfenoxi ) iridin-3-amina I3-B) 6- (4- (tert-pentil) fenoxi) piridin-3-amina (CAS # 1036533-91-1) I3-C) 4- (4- (tert-butil) fenoxi) anilina (CAS # 56705-89-6) 13-D) . 6- ( 4-Butilfenoxi ) piridin-3-amina I3-E) . 4- (4- (tert-pentil) fenoxi) nilina (CAS # 328032-81-1) I3-F) . 4- (4-ciclohexilfenoxi) anilina (CAS # 70682-64-3) 13-G) 6-(4-((3r,5r,7r) -adamantan-l-il) fenoxi) piridi -3-amina I3-H) . 6- (3- (tert-butil) fenoxi ) piridin-3-amina (CAS # 1098366-43-8) I3-I) . 4- (4- (tert-butil) fenoxi) -3-fiuoroanilina (CAS # 946785-77-9) 13-J) . 4- ( 4-isopropilfenoxi) anilina I3-K) . 6- (4- (2, 4 , 4-trimetilpentan-2-il) fenoxi) iridin-3-amina 13-L) . 4- ( -ciclohexilfenoxi ) -3-fIuoroanilina I3- ) . 3-fluoro-4- ( 4- (teri -pentil ) fenoxi ) anilina 13-N) . 6- ( 4- ( 2-metilpentan-2-il ) enoxi ) pi idin-3-amina 13-0) . 4- (4- ( (3r, 5r, 7r) -adamantan-l-il) fenoxi) anilina I3-P). 4-(4-((3r,5r,7r) -adamantan-l-il) fenoxi) -3-fIuoroanilina Como se muestra en la figura 10, algunos de estos derivados (I3-A, I3-B, I3-C, I3-E, 13-G, I3-H, I3-M y 13-N) bloquean la señalización Noten a niveles comparables con compuesto parental 13, mientras que derivados I3-F y .13-1 parecen tener actividad mejorada Ejemplo 3 Síntesis química del derivado y Precursores Del mismo 4- (2-metilpentan-2-ll) fenol El 4-Butirilfenol (1000 mg, 6.09 mmol, 1.00 eq) se suspendió en tolueno (25 mL) y DCM (5rnL) y enfrió a 0°C. LA solución 2M Me3Al en tolueno (7 mL, 14.01 mmol, 2.30 eq) se agregó gota a gota por lo cual el material de partida se disolvió. Después de agitar a temperatura ambiente por 15 h, la mezcla de reacción se enfrió nuevamente a 0°C y TMSOS02CF3 (1.1 mL, 6.09 mmol, 1.00 eq) se agregó gota a gota. Después de agitar a temperatura ambiente por 3 d, la reacción se apagó al vaciar la mezcla en agua con hielo. Después de la acidificación con 40% H3PO4, el producto se extrajo con acetato de etilo (3.x) y las capas orgánicas se lavaron con Solución NaCl acuosa saturada ácida H3PO4. El solvente se removió bajo presión reducida a 30°C. El producto crudo resultante se purificó' por cromatografía de columna instantánea (Si02; DCM/éter de petróleo 1:1 hasta 2:1) para dar el compuesto del título como aceite incoloro (188 mg, con una pureza de alrededor de 90% (por RMN) , 0.95 mmol, 15% de 10G rendimiento) . Rf = 0.60 ( DC /MeOH 4 % ) . HRMS (EIST) calculado para Ci2H170- [M-H ] ~ 177.1279, encontrado: 177.1284. XH · RMN (400 MHz , CDC13) d 7.24 - 7.18 (m, 2H, aromático H) , 6.82 -6.76 (m, 2H, aromático H) , 5.12 (s, 1H, OH) , 1.60 - 1.52 (m, 2H, C (CH3) 2CH2CH2CH3) , 1.27 (s, 6H, C (CH3) 2CH2CH2CH3) , 1.16 -1.01 (m, 2H, C (CH3) 2CH2CH2CH3) , 0.83 (t, J = 7.3 Hz, 3H, C (CH3) 2CH2CH2CH3) . 13C RMN (101 MHz, CDC13) d 153.03, 142.29, 127.11, 114.85, 47.35, 37.25, 29.23, 18.09, 14.90.
Procedimiento General A: Las nitropiridinas o nitrobencenos respectivos y los fenoles particulares se disolvieron en DMF o D SO. El. K2C03 anhidro se agregó y la' mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente, a menos que se establezca de otra manera, hasta la conversión completa. La reacción se apagó luego por la adición de ¾0 y el producto se extrajo con EtOAc o Et20. Las capas orgánicas se lavaron con solución NaOH acuosa 1M (lx) y después con solución NaCl acuosa saturada (lx) . El solvente se removió hasta secarse bajo presión reducida a 30 °C. El residuo se removió en DC y filtró a través de algodón para eliminar sales inorgánicas. El producto crudo se purificó por cromatografía de columna instantánea para proporcionar los compuestos de título correspondiente (13-n, 13-nA hasta 13-nP) . 2- (4- (tert-butll) fenoxl) -5-nitroplrldlna, I3-n Siguiendo el procedimiento A, 2-cloro-5-nitropiridina (501 mg, 3.16 mmol, 1.00 eg) y 4 -tert-butilfenol (611 mg, 4.07 mmol, 1.29 eq) se disolvieron en DMF (6.0 mL) . El K2C03 anhidro (654 mg, 4.73 mmol, 1.50 eq) se agregó y la mezcla de reacción se agitó. a temperatura ambiente por 14 h. Después de la extracción con Et2<0, el producto crudo se purificó por cromatografía de columna instantánea (S1O2; EtOAc/éter de petróleo 1:100 hasta 1:50) para proporcionar el compuesto del título como sólido incoloro (820 mg, 3.01 mmol, 95% de rendimiento). Rf = 0.40 (EtOAc/PH 1:20). HRMS (ESI) calculado para Ci5Hi7N203+ [M+H]+ 273.1234, encontrado: 273.1229. rH RMN (400 MHz, CDCI3) d 9.06 (d, J= 2.8 Hz, 1H, aromático H) , 8.46 (dd, J = 9.1, 2.8 Hz, 1?, aromático H) , 7.53-7.42 (m, 2H, aromático H) , 7.17 - 7.05 (m, 2H, aromático H) , 7.01 (d, J = 9.1 Hz, 1H, aromático H) , 1.35 (s, 9H, C(CH3)3). 13C RMN (101 MHz, CDCI3) d 167.20, 150.49, 148.98, 145.26, 140.29, 134.95, 126.99, 120.84, 111.38, 34.72, 31.57. (4-ciclohexilfenox±) -5-nltroplrldina, Siguiendo el procedimiento A, l!-cloro- -? Ltropiridina (300 mg, 1.89 mmol, 1.00 eq) y 4 -ciclohexilfenol (417 mg, 2.37 mmol, 1.25 eq) se disolvieron en DMSO (6 mL) . El anhidro K2CO3 (397 mg, 2.87 mmol, 1.52 eq) se agregó y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente por 27 h. Después de la extracción con Et20, el producto crudo se purificó por cromatografía de columna instantánea (Si02; EtOAc/éter de petróleo 1:100 hasta 1:75) para proporcionar el compuesto del título como sólido incoloro (600 mg, 2.01 mmol, rendimiento cuantitativo). Rf = 0.35 (EtOAc/PE 1:20). HR S (ESI) calculado para C1 H19 2O3+ [Mi-H]+ 299.1390, encontrado: 299.1392. XH R N (400 MHz, CDC1,) d 9.06 (d, J= 2.9 Hz, 1H, aromático H) , 8.46 (dd, J = 9.1 , 2.9 Hz, 1H, aromático H) , 7.31 - 7.22 (m, 2H, aromático H) , 7.07 (dd, J= 8.7 , 2.3 Hz, 2H, aromático H) , 7.00 (d, J= 9.1 Hz, 1H, aromático H) , 2.58 - 2.51 (m, 1H, ciclohexilo H) , 2.01 - 1.64 (m, 5H, ciclohexilo H) , 1.56 - 1.10 (m, 5H, ciclohexilo H) . 13C RMN (101 MHz, CDCI3) d 167.18, 150.71, 145.88, 145.17, 140.22, 134.89, 128.30, 121.12, 111.30, 44.08, 34.59, 26.95, 26.19. 5-nltro-2- (4- (tert-pentil) fenoxi)piridina, 13-nB Siguiendo el procedimiento A, 2-cloro-5-nitropiridina (303 mg, 1.91 mmol, 1.00 eq) y 4-tert- entilfenol (397 mg, 2.42 mmol, 1.27 eq) . se disolvieron en D SO (G itiL) . El K2C03 anhidro (403 mg, 2.92 mmol, 1.53 eq) se agregó y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente por 7 h. Después de la extracción con Et20, el producto crudo se purificó por cromatografía de columna instantánea (Si02; EtOAc/éter de petróleo 1:100) para proporcionar el compuesto del título como sólido incoloro (530 mg, 1.85 mmol, 97% de rendimiento) . Rf = 0.31 (EtOAc/PE 1:20). HRMS (ESI) calculado para ClsHi9N203+ [M+H]+ 287.1390, encontrado: 287.1381. XH RMN (400 MHz, CDC13) d 9.07 - 9.05 (m, 1H, aromático H) , 8.45 (dd, J = 9.4, 2.4 Hz, 1H, aromático H) , 7.40 (d, J= 8.6 Hz, 2H, aromático H) , 7.09 (d, J= 8.6 Hz, 2H, aromático H) , 6.99 (d, J = 9.2 Hz, 1H, aromático H) , 1.67 (q, J= 7.4 Hz, 2H, Ar-C (CH3) 2CH2CH3) , 1.31 (s, 6H, Ar-C (CH3) 2CH2CH3) , 0.73 (t, J= 7.4 Hz, 3H, Ar-C (CH3) 2CH2CH3) . 13C RMN (101 MHz, CDC13) d 167.17, 150.46, 147.34, 145.20, 140.27, 134.90, 127.56, 120.72, 111.28, 37.89, 37.06, 28.55, 9.26.
L12 1- (tert-butil) -4- (4-nitrofenoxl)benceno, J3-nC Siguiendo el procedimiento A, 4 -fluoronitrobenceno (500 mg, 3.54 mmol, 1.00 eq) y 4-tert-butilfenol (671 mg, 4.46 mmol, 1.26 eq) se disolvieron en DMF (6.0 mL) . El K2C03 anhidro (857 mg, 6.20- mmol, 1.75 eq) se agregó y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente por 52 h. Después de extracción con KtOAc, el producto crudo se purificó por cromatografía de columna instantánea (S1O2; EtOAc/éter de petróleo 1:100) para proporcionar el compuesto del título como sólido amarillo pálido (860 mg, 3.17 mmol, 89% de rendimiento) . Rf = 0.72 (EtOAc/PE 1:9) . HRMS (ESI) calculado para Ci6HiñN03+ [M+H]+ 272.1281, encontrado: 272.1272. XH R N (400 MHz, CDC13) d 8.24 -8.16 (m, 2H, aromático H), 7.49 - 7.39 (m, 2H, aromático H), 7.06 - 6.97 (m, 4H, aromático H) , 1.35 (s, 9H, C(CH3)3) . 13C RMN (101 MHz, CDC13) d 163.82, 152.29, 148.59, 142.54, 127.27, 126.03, 120.15, 1 16.98, 34.67, 31.58. 1] 3 2- (4-b tilfenoxi) -5-nitropirid±n&, I3-nD Siguiendo el procedimiento A, 2-cloro-5-nitropiridina (103 mg, 0.65 mmol, 1.00 eq) y 4-butilfenol (126 mg, 0.84 mmol, 1.29 eq) se disolvieron en DMF (2.5 mL) . El K2CO3 anhidro (143 mg, 1.04 mmol, 1.59 eq) se agregó y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente por 6 h . Después de extracción con Et¿0, el producto crudo se purificó por cromatografía de columna instantánea (Si02; EtOAc/éter de petróleo 1:100) para proporcionar el compuesto del título como sólido incoloro (.190 mg, 0.70 mmol, rendimiento cuantitativo). Rf = 0.33 (EtOAc/PE 1:20). HRMS (ESI) calculado para C15H17N2C [M+H]1" 273.1234, encontrado: 273.1226. XH RMN (400 MHz, CDC13) d 9.05 (dd, J= 2.9, 0.6 Hz, 1H, aromático H) , 8.46 (dd, J = 9.1, 2.8 Hz, 1H, aromático H) , 7.32-7.21 (m, 2H, aromático H) , 7.11 - 7.02 (m, 2H, aromático H) , 7.00 (dd, J = 9.0, 0.6 Hz, 1H, aromático H) , 2.69 - 2.60 (m, 2H, Ar-CH2CH2CH2CH3 ) , 1.70 - 1.57 (m, 2H, Ar-CH2CH2CH2CH3 ) , 1.39 (dq, J= 14.6, 7.3 H;:, 2H, Ar-CH2CHrCH2CH3 ) , 0.95 (t, J = 7.3 Hz, 3H, Ar-CH. CH CH2CH3 ) . 13C RMN (101 MHz, CDCI3) 5 167.27, 150.75,. 145.22, 140.86, 140.30, 134.92, 129.91, 121.22, 111.32, 35.21, 3S.67, 22.51, 14.08.
I-nitro-4- (4- (tert-pentil) fenoxi)benceno, I3-nE Siguiendo el procedimiento A, 4-fluoronitrobenceno (318 mg, 2.25 mmol, 1.00 eq) y 4-tert-pentilfenol (460 mg, 2.28 mmol, 1.24 eq) se disolvieron en DMSO (6 mL) . El K2C03 anhidro (465 mg, 3.37 mmol, .1.49 eq) se agregó y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente por 2 h. Después de la extracción con Et20, el producto crudo se purificó por cromatografía de columna instantánea (Si02; EtOAc/éter de petróleo 1:100) para proporcionar el compuesto del título como sólido incoloro (533 mg, 1.87 mmol, 83% de rendimiento) . Rf = 0.70 (EtOAc/PE 1:20) . HRMS (ESI) calculado para Ci7H2oN03+ [M+H]+ 285.1365, encontrado: 285.1359. XH RMN (400 Hz, CDC13) d 8.25 - 8.14 (m, 2H, aromático H) , 7.44 - 7.32 (m, 2H, aromático H) , 7.06 - 6.96 (m, 4H, aromático H) , 1.66 (q, J= 7.4 Hz, 2H, Ar-G (CH3) 2GH2CH3) , 1.31 (s, 6H, Ar-C (CH3) 2CH2CH3) , 0.71 (t, J= 7.4 Hz, 3H, Ar-C ( CH3 ) 2CH2CH3 ) . 13C RMN (101 MHz, CDC13) d 163.81, 152.24, 146.94, 142.56, 127.91, 126.01, 120.06, 116.99, 37.89, 37.06, 28.63, 9.27. l-ciclohexil-4- (4-nitrofenoxi)benceno, I3-nF Siguiendo el procedimiento A, el 4-fluoronitrobenceno (325 mg, 2.30 mmol, 1.00 eq) y el 4 -ciclohexilfenol (519 mg, 2.94 mmol, 1.28 eq) se disolvieron en DMSO (6 mL) .
El K2CO3 anhidro (513. mg, 3.72 mmol, 1.61 eq) se agregó y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente por .48 h. Después de la extracción con Et20, el producto crudo se purificó por cromatografía de columna instantánea (Si02; EtOAc/éter de petróleo 1:100 hasta 1:50) para proporcionar el compuesto del título como sólido amarillo pálido (640 mg, 2.15 mmol, 93% de rendimiento). Rf = 0.55 (EtOAc/PE 1:20). HRMS (ESI) calculado para CIHH2O 03+ [M+H]+ 298.1438, encontrado: 298.1442. XH RMN (400 MHz, CDC13) d 8.31 - 8.1 1 (m, 2H, aromático H) , 7.26 (d, J = 2.3 Hz, 2H, aromático H) , 7.13 - 6.92 (m, 4H, aromático H) , 2.57 - 2.50 (m, 1H, ciclohexilo H) , 2.09 - 1.67 (m, 5H, ciclohexilo H) , 1.59 -1.18 (m, 5H, ciclohexilo H) . 13C RMN (101 MHz, CDC13) d 163.89, 152.61, 145.58, 142.57, 128.66, 126.04, 120.49, 116.99, 44.14, 34.72, 26.99, 26.23. 2- (4- ( (3r,5r, 7r) -a.damantan-1-il) fenoxi) -5-nitropiridina, I3-nG Siguiendo el procedimiento A, 2-cloro-5-nitropiridina (300 mg, 1.89 mmol, 1.00 eq) y 4 -adamantilfenol (546 mg, 2.39 mmol, 1.26 eq) se disolvieron en DMSO (6 mL). El K2C03 anhidro (662 mg, 4.79 mmol, 2.53 eq) se agregó y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente por 42 h. Después de la extracción con Et2<0, el producto crudo se purificó por cromatografía de columna instantánea (Si02; EtOAc/éter de petróleo 1:100 hasta 1:50) para proporcionar el compuesto del título como sólido incoloro (664 mg, 1.89 mmol, rendimiento cuantitativo). Rf = 0.36 (EtOAc/PE 1:20). HRMS (ESI) calculado para C21H23N2C . [ +H]+ 351.1703, encontrado: 351.1701. ¾ RMN (400 MHz, CDC1.) d 9.06 (d, J= 2.8 Hz, 1H, aromático H) , 8.45 (dd, J = 9.1 , 2.8 Hz, 1H, aromático H) , 7.52 - 7.39 (m, 2H, aromático H) , 7.16 - 7.06 (m, 2H, aromático H) , 7.00 (d, J = 9.1 Hz, 1H, aromático H) , 2.13 -2.10 (m, 3H, adamantilo H) , 1.94 (d, J = 3.0 Hz, 5H, adamantilo H) , 1.87 -1.70 (m, 5H, adamantilo H) . 13C RMN (101 MHz, CDCI3) d 167.19, 150.51, 149.18, 145.20, 140.26, 134.89, 126.53, 120.83, 111.32, 43.35, 36.82, 36.18, 29.02.. 2- (3- (tert-butil) fenoxi) -5-nitropiridina, I3-nH Siguiendo el procedimiento A, 2-cloro-5-nitropíridina (300 mg, 1.89 mmol, 1.00 eq) y 3-tert-butilfenol (358 mg, 2.38 mmol, 1.26 eq) se disolvieron en DMSO (6 mL) . El K2C03 anhidro (420 mg, 3.04 mmol, 1.60 eq) se agregó y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente por 70 h. Después de la extracción con Et2G, el producto crudo se purificó por cromatografía de columna instantánea (Si02; EtOAc/éter de petróleo 1:100) para proporcionar el compuesto del título como sólido incoloro (512 mg, 1.88 mmol, 99% de rendimiento). Rf = 0.37 (EtOAc/PE 1:20). HRMS (ESI) calculado para Ci5H17N203+ [M+H]+ 273.1234, encontrado: 273.1232. XH RMN (400 MHz, CDC13) d 9.08 - 9.04 (m, 2H, aromático H) , 8.47 (dd, J = 9.1, 2.8 Hz, 1H, aromático H) , 7.39 (t, J= .7.9 Hz, 1H, aromático H) , 7.33 (ddd, J= 7.9, 1.8, 1.2 Hz, 1H, aromático H) , 7.17 (t, J = 2.1 Hz, 1H, aromático H) , 7.01 (dd, J= 9.1 , 0.5 Hz, 1H, aromático H) , 6.98 (ddd, J = 7.9, 2.4, 1.2 Hz, 1H, aromático H) , 1.34 (s, 9H, C(CH3)3). 13 RMN (101 MHz, CDC13) d 167.21, 153.88, 152.76, 145.26, 140.31, 134.93, 129.50, 123.17, 118.62, 118.47, 111.28,¦ 35.02, 31.36. 1- (4- (tert-butil) fenoxi) -2-£luoro-4-nxtrobenceno, I3-nI F Siguiendo el procedimiento A, 3 , -difluoronitrobenceno (401 mg, 2.52 mmol, 1.00 eq) y 4 -tert-butilfenol (477 mg, 3.18 mmol, 1.26 eq) se disolvieron en DMSO (6 mL) . El K2C03 anhidro (522 mg, 3.78 mmol, 1.50 eq) se agregó y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambi.ent.e por 19 h. Después de la extracción con Et20, el producto crudo se purificó por cromatografía de columna, instantánea (Si02; EtOAc/éter de petróleo 1:50) para proporcionar el compuesto del titulo como aceite incoloro (722 mg, 2.52 mmol, 99% de rendimiento) . Rf = 0.54 (EtOAc/PE 1:20) . HRMS (ESI) calculado para C16H17FN03+ [M+H]+ 290.1187, encontrado: 290.1194. XH RMN (400 MHz , CDC13) d 8.07 (dd, J= 10.3, 2.7 Hz, 1H, aromático H) , 7.96 (ddd, J = 9.1, 2.7, 1.5 Hz, 1H, aromático H), 7.49 - 7.38 (m, 2H, aromático H) , 7.09 - 6.99 (m, 2H, aromático H) , 6.96 (dd, J = 9.1, 8.0 Hz, 1H, aromático H) , 1.35 (s, 9H, C(C )3) . 13C RMN (101 MHz, CDC13) d 153.35, 152.23, 151.93, 151.82, 150.84, 148.70, 142.40, 142.33, 127.29, 120.68, 120.64, 119.38, 117.73, 117.71, 113.28, 113.05, 34.65, 31.54. 1- (4-ciclohexilfenoxi) -2-fluoro-4-nltrobenceno, I3-nJ Siguiendo el procedimiento A, 3 , 4 -difluoronitrobenceno (509 mg, 3.20 mmol, 1.00 eq) y -ciclohexilfenol (691 mg, 3.93 mmol, 1.23 eq) se disolvieron en DIVISO (6 mL) . El K2C03 anhidro (664 mg, 4.81 mmol, 1.50 eq) se agregó y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente por 23 h. Después de la extracción con Et20, el producto crudo se purificó por cromatografía de columna instantánea (Si02; EtOAc/éter de petróleo 1:50) para proporcionar el compuesto del título como sólido amarillo pálido · (1002 mg, 3.18 mmol, 99% de rendimiento). Rf = 0.51 (EtOAc/PE 1 : 20) . HRMS (ESI) calculado para Ci8H19FN03+ [M+H]+ 316.1343, encontrado: 316.1348. xti RMN (400 MHz , CDC13) d 8.09 (dd, J= 10.3, 2.7 Hz, 1H, aromático H), 7.97 (ddd, J = 9.1, 2.7, 1.4 Hz, 1H, aromático ), 7.33 -7.22 (m, 2H, aromático), 7.08 - 6.99 (m, 2H, aromático H) , 6.96 (dd, J= 9.1, 8.0 Hz, 1H, aromático H) , 2.58 - 251 (m, 1H, ciclohexilo H), .1.98 - 1.73 (m, 5H, ciclohexilo H) , 1.52 - 1.20 (m, 5H, ciclohexilo H) . 13C RMN (101 MHz, CDCI3) d 153.35, 152.51, 152.01, 151.90, 150.84, 145.68, 142.39, 142.32, 128.67, 120.70, ¦ 120.66, 119.73, 117.70, 117.68, 113.30, 113.08, 44.09, 34.69, 26.97, 26.21. 2-fluoro-4-nitro-l- (4- (tert-pentll) fenoxl)benceno, I3-nK Siguiendo el procedimiento A, 3, 4-difluoronitrobenceno (502 mg, 3.16 mmol, 1.00 eq) y 4 -tert-pentilfenol (693 mg, 4.22 mmol, 1.34 eq) se disolvieron en DMSO (6 mL) . El K2C03 anhidro (656 mg, 4.75 mmol, 1.50 eq) se agregó y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente por 22 h. Después de la extracción con Et20, el producto crudo se purificó por cromatografía de columna instantánea (Si02; EtOAc/éter de petróleo 1:50) para proporcionar el compuesto del título como aceite amarillo pálido (943 mg, 3.11 mmol, 99-°s de rendimiento) . Rf = 0.61 (EtOAc/PE 1:20) . HRMS (ESI) calculado para ' Ci7Hi9N03+ [M+H]+ 304.1343, encontrado: 304.1332. XH RMN (400 MHz, CDCI3) d 8.08 (dd, J= 10.3, 2.7 Hz, 1H, aromático H) , 7.96 (ddd, J = 9.1, 2.7, 1.5 Hz, 1H, aromático H) , 7.42 -7.35 (m, 2H, aromático H) , 7.07 - 6.99 (m, 2H, aromático H) , 6.95 (dd, J = 9.1, 8.0· Hz, 1H, aromático H) , 1.66 (q, J= 7.4 Hz, 2H, Ar-C(CH3)2CH2CH3) , 1.31 (s, 6H, Ar-C (CH3) 2CH2CH3) , 0.71 (t, J= 7.4 Hz, 3H, Ar-C (CH3) 2CH2CH3) . 13C RMN (101 MHz, CDC13) d 153.40, 152.19, 151.98, 151.87, 150.88, 147.11, 127.97, 120.71, 120.68, 119.34, .117.73, 117.71, 113.11, 37.92 , 37.08 , 28.64. 2- (4- (2-met±lpentan-2-±l) fenoxi) -5-nitropiridina, 13-nL Siguiendo el procedimiento A, ni 4- (2-metilpentan-2-il) fenol (52 mg, 0.29 mmol, 1.00 eq) y la 2-cloro-5-nitropiridina (57 mg, 0.36 mmol, 1.23 eq) se disolvieron en DMSO (6 mL) . El K2C03 anhidro (66 mg, 0.48 mmol, 1.65 eq) se agregó y la mezcla de. reacción se agitó a temperatura ambiente por 27 h. Después de la extracción con Et20, el producto crudo se purificó por cromatografía de columna instantánea (Si02; EtOAc/éter de petróleo 1:50) para proporcionar el compuesto del título como sólido incoloro (86 mg, 0.29 mmol, 98% de rendimiento). Rf = 0.50 (EtOAc/PE 1:10). HPvMS (ESI) calculado para Ci7H2i 203+ [M)-H]+ 301.1547, encontrado: 301.1545. XH RMN (400 MHz, CDC13) d 9.07 (d, J= 2.7 Hz, 1H, aromático H) , 8.46 (dd, J = 9.1, 2.8 Hz, 1H, aromático H) , 7.45 - 7.35 (m, 2H, aromático H) , 7.14 - 7.05 (m, 2H, aromático H) , 6.99 (dd, J= 9.0, 0.6 Hz, 1H, aromático H) , 1.65 - 1.54 (m, 2H, C (CH3) 2CH2CH2CH3) , 1.32 (s, 6H, C (CH3) 2CH2CH2CH3) , 1.19 '- 1.05 (m, 2H, C (CH3) 2CH2CH2CH3) , 0.84 (t, J= 7.3 Hz, 3H, C (CH3)2CH2CH2CH3) . 13C RMN (101 MHz, CDC13) d 167.17, 150.43, 147.69, 145.21, 140.26, 134.90, 127.44, 120.72, 111.29, 47.27, 37.74, 29.07, 18.08, 14.87. (3r,5r, 7r) -1- (4- (4-nitrofenoxi) fenil) adamantano, 13-nM Siguiendo el procedimiento A, 4 -fluoronitrobenceno (303 mg, 2.15 mmol, 1.00 eq) y .4 -adamant ilfenol (600 mg, 2.63 mmol, 1.22 eq) se disolvieron en DMSO (6 mL) . El K2C03 anhidro (450 mg, 3.26 mmol, 1.52 eq) se agregó y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente por 20 h. Después de la extracción con Et20, el producto crudo se purificó por cromatografía de columna instantánea (Si02; EtOAc/éter de petróleo 1:100 hasta 1:50) para proporcionar el compuesto del título como sólido amarillo pálido (736 mg, 2.11 mmol, 98% de rendimiento). Rr- - 0.73 (EtOAc/PE 1:10). HRMS (ESI) calculado para C22H24 03+ [M+H]+ 350.1751, encontrado: 350.1760. ¾ RMN (400 MHz, CDC13) d 8.27 8.10· (m, 2H, aromático), 7.46 - 7.35 (m, 2H, aromático H) , 7.08 - 6.95 (m, 4H, aromático H) , 2.13 - 2.10 (m, 3H, adamantilo H) , 1.93 (d, J = 2.9 Hz, 6H, adamantilo H) , 1.88 - 1.70 (m, 6H, adamantilo H) . 13C RMN (101 MHz, CDCI3) d 163.85, 152.30, 148.86, 142.53, 126.86, 126.85, 126.03, 120.18, 1 17.00, 43.40, 36.82, 36.17, 29.03. (3r,5r, 7r) -1- (4- (2-fluoro-4-nitrofenoxi) fenll) adamantano, 13-nN Siguiendo el procedimiento A, 3, 4-difluoronitrobenceno (303 mg, 1.90 mmol, 1.00 eq) y -adamantilfenol (533 mg, 2.34 mmol, 1.23 eq) se disolvieron en DMSO (6 mL) . El K2C03 anhidro (395 rao, 2.86 mmol, 1.50 eq) se agregó y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente por 4 h. Después de la extracción con Et20, el producto crudo se purificó por cromatografía de columna instantánea (SÍO2; EtOAc/éter de petróleo 1:100) para proporcionar el compuesto del título como sólido incoloro (703 mg, 1.91 mmol, rendimiento cuantitativo). Rf = 0.69 (EtOAc/PE 1:10). HRMS (APPI) calculado para C22H22FN0+ [M]+ 367.1584, encontrado: 367.1581. 2H RMN (400 Hz, CDC13) d 8.08 (dd, J = 10.3, 2.7 Hz, 1H, aromático H) , 7.96 (ddd, J = 9.1, 2.7, 1.5 Hz, 1H, aromático H) , 7.46 - 7.36 (m, 2H, aromático H) , 7.06 - 7.00 (m, 2H, aromático H) , 6.95 (dd, J = 9.1, 8.0 Hz, 1H, aromático H) , 2.17 - 2.07 (m, 3H, adamantilo H), 1.92 (d, J = 2.9 Hz, 5H, adamantilo H) , 1.87 - 1.71 (m, 5H, adamantilo H) . 13C RMN (1C1 MHz, CDC13) d 153.36, 153.35, 152.24, 152.21, 1.51.99, 151.88, 150.85, 150.83, 148.98, 126.89, 120.70, 120.66, 119.44, 119,42, 117.72, 117.70, 113.30, 113.07, 43.38, 36.81, 36.17, 29.02. 2- (4-isopropllfezioxi) -5-nitzopiridina, I3-nO Siguiendo el procedimiento ?, la 2-cloro-5-nitropiridina (303 mg, 1.91 mmol, 1.00 eq) y el 4-iso-propilfenol (331 mg, 2.43 mmol, 1.27 eq) se disolvieron en DMF (6.0 mL) . El K2C03 anhidro (398 mg, 2.88 mmol, 1.51 eq) se agregó y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente por 24 h. Después de la extracción con Et20, el producto crudo se purificó por cromatografía de columna instantánea (S1O2; EtOAc/éter de petróleo 1:100) para proporcionar el compuesto del título como sólido amarillo pálido (490 mg, 1.90 mmol, 99% de rendimiento). Rf = 0.40 (EtOAc/PE 1:20). HRMS (ESI) calculado para C14H15 203+ [M+H]+ 259.1077, encontrado: 259.1072. ?? RMN (400 Hz, CDCI3) d 9.04. (d, J= 3.4 Hz, 1H, aromático H), 8.44 (dd, J = 9.1 , 2.8 Hz, 1H, aromático H) , 7.37 - 7.28 (m, 2H, aromático H) , 7.12 - 7.06 (m, 2H, aromático H) , 7.03 - 6.97 (m, 1H, aromático H) , 2.96 (hept, J= 6.9 Hz, 1H, CH(CH3)2), 1.30 (d, J = 7.0 Hz, 6H, CH(C3h). L3C RMN (101 MHz, CDC13) d 167.08, 150.67, 146.49, 145.02, 140.18, 134.81, 127.84, 121.11, 111.24, 33.62, 24.03. 5-nitro-2- (4- (2,4, 4-trimetilpentan-2-il) fenoxx)piridina, Siguiendo el procedimiento A, 2-Cloro-5-nitropiridina (303 mg, 1.91 mmol, 1.00 eq) y 4 -tert-octilfenol (495 mg, 2.40 mmol, 1.25 eq) se disolvieron en DMSO (5 mL) . El K2C03 anhidro (426 mg, 3.08 mmol, 1.61 eq) se agregó y la mezcla de reacción se agitó a 40°C por 28 h. Después de la extracción con Et20, el producto crudo se purificó por cromatografía de columna instantánea. (Si02; EtOAc/éter de petróleo 1:50) para proporcionar el compuesto del título como sólido incoloro (598 mg, 1.82 mmol, 95% de rendimiento). Rf = 0.65 (EtOAc/PE 1:10). HRMS (ESI) calculado para CLC,H25N203+ [M+H]+ 329.1860, encontrado: 329.1854.. ¾ RMN (400 MHz , CDC13) d 9.07 (d, J = 2.8 Hz, 1H, aromático H) , 8.45 (dd, J= 9.1 , 2.8 Hz, 1H, aromático H) , 7.52"- 7.40 (m, 2H, aromático H) , 7.14 - 7.03 (m, 2H, aromático H) , 6.97 (d, J = 9.1 Hz, 1H, aromático H) , 1.76 (s, 2H, Ar-C (CH3) 2CH2C (CH3) 3) , 1.40 (s, 6H, Ar-C(CH3)2CH2C(CH3)3) , 0.75 (s, 9H, Ar-C (CH3) 2CH2C (CH3) 3) . 13C RMN (101 MHz, CDC13) d .167.24, 150.49, 148.12, 145.30, 140.29, 134.92, 127.78, 120.57, 111.15, 57.28, 38.63, 32.55, 31.93, 31.62.
Procedimiento General B: Los respectivos derivados nitro (I3-n, I3-nA hasta 13-nP) se disolvieron primero en MeOH o tolueno, o directamente agregados a una suspensión de cantidades catalíticas de Pd (10%) en polvo de carbono activado en MeOH. El matraz se purgó con H2 (6x) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente hasta la conversión completa. La mezcla de reacción se filtró luego a través de Celite. El solvente se removió bajo presión reducida a 30 °C y el producto crudo se purificó por cromatógrafía de columna instantánea para dar los compuestos del título correspondiente (13, I3-A hasta 13-P) - 6- (4- (tert-butil) fenoxi)p±rid±n-3-am±na, 13 Siguiendo el procedimiento B, I3-n (300 mg, 1.10 mmol, 1.00 eq) se agregó a una suspensión de Pd (10%) en polvo de carbono activado (82 mg, 0.08 mmol. Pd, 0.07 eg) en MeOH (15 mL) . El matraz se purgó con H2 (6x) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente por 2 h. El producto crudo se purificó por cromatografía de columna instantánea (SÍO2; DCM/MeOH 1%) para dar el compuesto del título como sólido beige pálido (250 mg, 1.03 mmol, 94% de rendimiento). Rf = 0.40 (DCM/MeOH 4%). HRMS (ESI) calculado para C15H19N20+ [M+H] + 243.1492, encontrado: 243.1487. ? RMN (400 MHz , CDC13) d 7.69 (d, J= 3.0 Hz, 1H, aromático H) , 7.39 - 7.31 (m, 2?, aromático H) , 7.03 (dd, J= 8.6, 3.0 Hz, 1H, aromático H) , 7.00 - 6.93 (m, 2H, aromático H), 6.72 (d, J= 8.6 Hz, 1H, aromático H) , 3.48 (s, 1H, NH2), 1.31 (s, 9H, C(C3)3). 13C RMN (101 MHz, CDC13) d 156.62, 153.28, 146.33, 138.82, 134.06, 126.86, 126.47, 119.24, 112.36, 34.33, 31.52. 6- (4-c±clohex±lfenoxi)p±r±din~3-éaa±na I3-A Siguiendo el procedimiento B, I3-nA (201 mg, 0.67 mmol, 1.00 eq) se agregó a una suspensión de Pd (10%) en polvo de carbono activado (47 mg, 0.04 mmol Pd, 0.07 eq) en MeOH (15 mL) . El matraz se purgó con ¦ H2 (6x) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente por 5 h. El producto crudo se purificó por cromatografía de columna instantánea (SÍO2; DCM/MeOH 1%) para dar. el compuesto del título como sólido beige (190 mg, 0.71 mmol, rendimiento cuantitativo). Rf 0.36 (DCM/MeOH 4%). HRMS (ESI) calculado para Ci7H2iN20+ [M+H] + 269.1648, encontrado: 269.1643. ? RMN (400 MHz, CDC13) d 7.70 (d, J= 2.9 Hz, 1H, aromático. H ) , 7.22 - 7.13 (m, 2H, aromático H) , 7.04 (dd, J= 8.6, 3.0 Hz, 1H, aromático H) , 7.01 - 6.92 (m, 2H, aromático H ) , 6.73 (dd, J= 8.8, 0.7 Hz, 1H, aromático H ) , 3.36 (s, 2H, NH2), 2.51-2.44 (m, 1H, ciclo exilo H) , 1.97 - 1.67 (m, 5H, ciclohexilo H) , 1.49 -1.15 (m, 5H, ciclohexilo H) . 13C RMN (101 MHz, CDC13) d 156.88, 153.61, 143.47, 138.67, 134.21, 127.92, 126.96, 119.68, 112.38, 43.99, 34.68, 27.01, 26.25. 6- (4- (tert-pentxl) fenox±)pir±dln-3-amlna, I3-B Siguiendo el procedimiento B, 13-nB (200 mg, 0.70 mmol, 1.00 eq) se agregó a una suspensión de Pd (10%) en polvo de carbono activado (52 mg, 0.05 mmol Pd, 0.07 eq) en MeOH (15 mL) . El matraz se purgó con H2 (6x) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente por 3 h. El producto crudo se purificó por cromatografía de columna instantánea (Si02; DCM/MeOH 0.5%)) para dar el compuesto del título como sólido beige (107 mg, 0.42 mmol, 60% de rendimiento). Rf = 0.41 (DCM/MeOH 4%). HRMS (ESI) calculado para Ci6H2iN20+ [M+H] + 257.1648, encontrado: 257.1648. ? RMN (400 MHz, CDC13) d 7.73 (d, J= 2.9 Hz, 1H, ¦ aromático H) , 7.34 - 7.23 (m, 2H, aromático H) , 7.06 (dd, J= 8.6, 3.0 Hz, 1H, aromático H) , 7.02 - 6.94 (m, 2H, aromático H) , 6.73 (d, J- 8.6 Hz, 1H, aromático H) , 3.35 (s, 2H, NH2) , 1.62 (q, J= 7.4 Hz, 2H, Ar- C (CH3) 2CH2CH3) , 1.27 (s, 6H, Ar-C ( CH3 ) 2CH2CH3 ) , 0.70 (t, J = 7.4 Hz, 3H, Ar-C (CH3) 2CH2CH3) . 13C RMN (101 Hz, CDC13) d 156.80, 153.36, 144.75, 138.72, 134.30, 127.19, 126.97, 119.13, 112.51, 37.63, 37.04, 28.64, 9.26. 4- (4- (tert-butil) fenoxi) anilina, I3-C Siguiendo el procedimiento B, I3-nC (300 mg, 1.11 mmol, 1.00 eq) se agregó a una suspensión de Pd (10%) en polvo de carbono activado (59 mg, 0.06 mmol Pd, 0.05 eq) en MeOH (15 mL) . El matraz se purgó con H2 (6x) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente por 3.5 h. El producto crudo se purificó por cromatografía de columna instantánea (Si02; acetato de etilo/éter de petróleo 1:100 hasta 1:10) para dar el compuesto del título como aceite amarillo oscuro (244 mg, 1.01 mmol, 91% de rendimiento) . Rf 0.78 (DCM/MeOH 4%) . HRMS (ESI) calculado para. Ci6H20NO+ [M+H]+ 242.1539, encontrado: 242.1530. XH RMN (400 MHz, CDC13) ó 7.33 - 7.27 (m, 2H, aromático H) , 6.91 - 6.8 (m, 4H, aromático H) , 6.72 - 6.66 (m, 2H, aromático H) , 3.49 (s, 2H, NH2) , 1.31 (s, 9H, C(CH3)3) . 13C RMN (101 Hz , CDC1,) d 156.55, 149.24, 145.05, 142.30, 126.45, 121.08, 116.90, 116.49, 34.33, 31.66. 6- (4-b tilfenox±)piridin-3-axaina/ I3-D Siguiendo el procedimiento B, I3-nD (170 mg, 0.62 mmol, 1.00 eq) se agregó a una suspensión de Pd (10%)) en polvo de carbono activado (53. mg, 0.05 mmol Pd, 0.08 eq) en MeOH (15 mL) . El matraz se purgó con H2 (6x) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente por 1.5 h. El producto crudo se purificó por cromatografía de columna instantánea (Si02; DCM/MeOH 1%) para dar el compuesto del título como aceite marrón (133 mg, 0.55 mmol, 88% de rendimiento) . Rf = 0.38 (DCM/MeOH 4%) . HRMS (ESI) calculado para Ci5Hi9N20+ [M+H] + 243.1492, encontrado: 243.1485. ? RMN (400 MHz, CDC13) d 7.69 (d, J= 3.1 Hz, 1H, aromático H) , 7.20 - 7.09 (m, 2H, aromático H) , 7.03 (dd, J= 8.6, 3.0 Hz, 1H, aromático H) , 7.00 - 6.91 (m, 2H, aromático H) , 6.72 (d, J= 8.6 Hz, 1H, aromático H) , 3.36 (s, 2H, NH2 ) , 2.67 - 2.51 (m, 2H, Ar-CH2CH2CH2CH3 ) , 1.66 - 1.52 (m, 2H, Ar-CH2CH2CH2CH3) , 1.41 - 1.31 (m, 2H, Ar-CH2CH2CH2CH3) , 0.93 (t, J= 7.3 Hz, 3H, Ar- CH2CH2CH2CH3 ) . 1JC R N (101 MHz , CDC13) d 156.83, 153.55, 138.75, 138.26, 134.12, 129.48, 126.90, 119.74, 112.28, 35.02, 33.74, 22.40, 14.02. 4- (4- (tert-pentil) fenoxi) anilina, I3-E Siguiendo el procedimiento B, I3-nE (313 mg, 1.10 mmol, 1.00 eq) se disolvió en MeOH (10 mL) y agregó a una suspensión de Pd (10%) en polvo de carbono activado (52 mg, 0.05 mmol Pd, 0.0 eq) 'en MeOH (5 mL) . El matraz se purgó con H2 (6x) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente por 3 h. El producto crudo se purificó por filtración a través- de una capa Si02 delgada (DCM/MeOH 4%) para dar el compuesto del titulo como aceite beige (293 mg, 1.15 mmol, rendimiento cuantitativo) . Rf 0.09 (EtOAc/PE 1:20) . HRMS (ESI ) calculado para 7?22 20+ [M+H]+ 256.1696, encontrado: 256.1692. ¾ RMN (400 MHz, CDC13) d 7.29 - 7.19 (m, 2H, aromático H) , 6.98 - 6.81 (m, 4H, aromático H) , 6.76 - 6.61 (m, 2H, aromático H) , 3.47 (s, 2H, NH2), 1.63 (q, J= 7.4 Hz, 2H, Ar-C (CH3) 2CH2CH3) , 1.28 (s, 6H, Ar-C (CH3) 2CH2CH3) , 0.71 (t, J= 7.4 Hz, 3H, Ar-C (CH3) 2CH2CH3) . 13C RMN (101 MHz, CDCI3) d 156.45, 149.08, 143.29, 142.55, 127.08, 121.04, 116.79, 116.33, 37.50, 37.06, 28.69, 9.27. 4- (4-cíclohexilfenoxi) anilina, I3-F Siguiendo el procedimiento B, I3-nF (352 mg, 1.18 mmol, 1.00 eq) se disolvió en tolueno (5 mL) y agregó a una suspensión de Pd (10%) en polvo de carbono activado (38 mg, 0.04 mmol Pd, 0.03 eq) en eOH (10 mL) . El matraz se purgó con H2 (6x) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente por 2 h. El. producto crudo se purificó por cromatografía de columna instantánea (Si02; DCM) para dar el compuesto del título como sólido beige (315 mg, 1.18 mmol, rendimiento cuantitativo). Rf = 0.86 (DCM/MeOH 4%). HRMS (ESI) calculado para Ci8H22NO+ [M+H]+ 268.1696, encontrado: 268.1692. 2? RMN (400 MHz, CDC13) d 7.17 - 7.07 (m, 2H, aromático H) , 6.94 - 6.82 (m, 4H, aromático H) , 6.72 - 6.62 (m, 2H, aromático H) , 3.49 (s, 2H, NH2) , 2.51 -2.44 (m, 1H, ciclohexilo H) , 1.98 - 1.68 (m, 5H, ciclohexilo H) , 1.46 -1.21 (m, 5H, ciclohexilo H) . 13C RMN (101 MHz, CDC13) d 156.87, 149.13, 142.53,. 142.05, 127.81, 121.02, 117.22, 116.33, 43.90, 34.79, 27.05, 26.27. 6- (4- ( (3r,5r, 7r) -adamantazi-l-il) fenoxi)piridin-3-amina, I3-G Siguiendo el procedimiento B, I3-nG (278 mg, 0.79 mmol, 1.00 eq) se disolvió en tolueno (10 mL) y agregó a una suspensión de Pd (10%) en polvo de carbono activado (56 mg, 0.05 mmol Pd, 0.07 eq) en MeOH (10 mL) . El matraz se purgó con H2 (3x) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente por 3 h. El producto crudo se purificó por cromatografía de columna instantánea (Si02; DCM/MeOH 0% hasta 1%) para dar el compuesto del título como sólido incoloro (176 mg, 0.55 mmol, 69% de rendimiento). Rf = 0.43 ( DCM/MeOH 4%). HRMS (ESI) calculado para C2iH25 20+ [M+H]+ 321.1961, encontrado: 321.1959. lti RMN (400 MHz, CDC13) d 7.71 (d, J = 3.0 Hz, 1H, aromático H) , 7.37 - 7.29 (m, 2H, aromático H) , 7.08 - 6.96 (m, 3H, aromático H) , 6.74 (d, J= 8.6 Hz, 1H, aromático H) , 3.40 (s, 2H, NH2), 2.12 - 2.09 (m, 3H, adamantilo H) , 1.93 (dd, J= .9.7, 3.0 Hz, 5H, adamantilo H) , 1.86 - 1.70 (m, 5H, adamantilo H) . 13C RMN (101 MHz, CDC13) d 156.73, 153.37, 151.35, 146.65, 138.76, 134.15, 128.14, 126.86, 126.06, 125.54, 124.88, 119.29, 112.40, 43.36, 43.22, 36.87, 36.84, 35.87, 29.02. 6- (3- (tert-butil) fenoxl)plridln-3-amina, I3-H Siguiendo el procedimiento B, I3-nH (362 mg, 1.33 mmol, 1.00 eq) se disolvió en MeOH (10 mL) y agregó a una suspensión de Pd (10%) en polvo de carbono activado (44 mg, 0.04 mmol Pd, 0.03 eq) en MeOH (5 mL) . El matraz se purgó con H2 (5x) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente por 2 h. El producto crudo se purificó por cromatografía de columna instantánea (S1O2; DCM/MeOH 0% hasta 1%) para dar el compuesto del título como aceite marrón pálido (303 mg, 1.25 mmol, 94% de rendimiento). Rf = 0.44 (DCM/MeOH 4%). HRMS (ESI) calculado para Ci5Hi9N20+ [M+H] + 243.1492, encontrado: 243.1493. ? RMN (400 MHz, CDC13) d 7.92 (d, J = 3.0 Hz, 1H, aromático H) , 7.48 - 7.40 (m, 1H, aromático H) , 7.32 (ddd, J = 7.8, 1.9, 1.0 Hz, 1H, aromático H), 7.29 - 7.27 (m, 1H, aromático H) , 7.24 (d, J = 3.0 Hz, 1H, aromático H) , 7.01 (ddd, J= 8.0, 2.4, 1.0 Hz, 1H, aromático H) , 6.92 (dd, J = 8.6, 0.7 Hz, 1H, aromático H) , 3.40 (s, 2H, NH2) 1.48 (s, 9H, C(CH3)3). 13C RMN (101 MHz, CDC13) d 156.81, 155.65, 153.3.1, 138.69, 134.40, 129.10, 126.99, 120.85, 117.23, 116.69, 112.54, 34.89, 31.41. 4- (4- (tert-butll) fenoxl) -3-fluo?oanlllna, I3-I F Siguiendo el procedimiento B, I3-nI (501 mg, 1.73 mmol, 1.00 eq) se disolvió' en MeOil (13 mL) y agregó a una suspensión de Pd (10%) en polvo de carbono activado (56 mg, 0.05 rnnol Pd, 0.03 eq) en MeOH (2 mL) . El matraz se purgó con ¾ (5x) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente por 1.5 h. El producto crudo se purificó por cromatografía de columna instantánea (SÍO2; DCM) para dar el compuesto del título como sólido incoloro (455 mg, 1.75 mmol, rendimiento cuantitativo). Rf - 0.76 (DCM/MeOH 1%). HRMS (ESI) calculado para C16Hi9FNO' [M+H]+ 260.1445, encontrado: 260.1442. 1ti R N (400 MHz, CDC13) d 7.37 - 7.29 (m, 2H, aromático H) , 6.94 (t, J= 8.8 Hz, 1H, aromático H) , 6.91 -6.85 (m, 2H, aromático H) , 6.52 (dd, J = 12.0, 2.7 Hz, 1H, aromático H) , 6.42 (ddd, J = 8.6, 2.7, 1.3 Hz, 1H, aromático H) , 3.61 (s, 2H, N.H2), .1.33 (s, 9H, C(CH3)3). 13C RMN (101 MHz, CDCI3) d 156.58, 156.44, 154.12, 145.02, 144.42, 144.33, 134.83, 134.71, 126.41, 123.92, 123.90, 115.43, 110.97, 110.93, 103.93, 103.72, 34.25, 31.59. 4- (4-ciclohexllfenoxi) ->3-£lvLoroa.nlllna, 13-J Siguiendo el procedimiento B, I3-nJ (550 mg, 1.74 mmol, 1.00 eq) se disolvió en MeOH (12 mL) y agregó a una suspensión de Pd (10%) en' polvo de carbono activado (46 mg, 0.04 mmol Pd, 0.03 eq) en MeOH (3 mL). El matraz se purgó con H2 (6x) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente por 2 h. El producto crudo se purificó por cromatografía de columna instantánea (Si02; DCM/éter de petróleo 1:1 hasta 2:1) para dar el compuesto del título como sólido color rosa pálido (489 mg, 1.71 mmol, 98% de rendimiento). Rf = 0.81 (DCM/MeOH 4%). HRMS (ESI ) calculado para C18H2iFNO+ [M+H]+ 286.1602, encontrado: 286.1613. XH RMN (400 MHz, CDC13) d 7.19 ? 7.10 (m, 2H, aromático H) , 6.93 (t, J= 8.8 Hz, 1H, aromático H) , 6.90 - 6.83 (m, 2H, aromático H) , 6.51 (dd, J= 12.1 , 2.7 Hz, 1?, aromático H) , 6.41 (ddd, J = 8.6, 2.7, 1.2 Hz, 1H, aromático H) , 3.66 (s, 2H, NH2), 2.52 - 2.45 (m, 1H, ciclohexilo H) , 1.96 - 1.72 (m, 5H, ciclohexilo H) , 1.53 -· 1.18 (m, 5H, ciclohexilo H) . 13C RMN (101 MHz, CDCI3) d 156.74, 156.55, 154.09, 144.39, 144.30, 142.04, 134.86, 134.74, 127.79, 123.89, 115.76, 110.93, 110.90, 103.90, 103.-69, 43.80, 34.72, 26.99, 26.22. 3-flvLoro-4- (4- (tert-pentil) fenoxi) anilina., F Siguiendo el procedimiento B, I3-nK (497 mg, 1.64 mmol, 1.00 eq) se disolvió en MeOH (13 mL) y agregó a una suspensión de Pd (10%) en polvo de carbono activado (28 mg, 0.03 mmol Pd, 0.02 eq) en MeOH (2 mL) . El matraz se purgó con H2 (6x) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente por 1.5 h. El producto crudo se purificó por cromatografía de columna instantánea (Si02; acetato de etilo/éter de petróleo 1:10 hasta 1:7.5) para dar el compuesto del título como aceite naranja (463 mg, 1.69 mmol, rendimiento cuantitativo). Rf = 0.28 (EtOAc/éter de petróleo 1:5). HRMS (ESI) calculado para Ci7H2iF 0+ [M+H]+ 274.1602, encontrado: 274.1599. XH RMN. (400 MHz, CDC13) d 7.26 - 7.17 (m, 2H, aromático H) , 6.92 (t, J= 8.8 Hz, 1H, aromático H) , 6.89 - 6.80 (m, 2H, aromático H) , 6.51 (dd, J= 12.0, 2.7 Hz, 1H, aromático H) , 6.42 (ddd, J= 8.7, 2.7, 1.2 Hz, 1H, aromático H) , 3.65 (s, 2H, N3) , 1.61 (q. J = 7.4 Hz, 2H, Ar-C (CH3) 2C3CH3 ) , 1.26 (s, 6H, Ar-C (CH3) 2CH2CH3) , 0.69 (t, J= 7.4 Hz, 3H, Ar-C (CH3) 2CH2CH3 ) . 13C RMN (101 MHz, CDC13) d 156.61, 156.37, 154.15, 144.34, 144.25, 143.34, 134.98, 134.86, 123.95, 123.92, 115.41, 110.98, 110.95, 104.00, 103.78, 37.07, 28.68, 9.26. 6- (4- (2-metxlpentan-2-±l) fenox±)piridin-3-am±na/ I3-L Siguiendo el procedimiento B, I3-nL (50 mg, 0.17 mmol, 1.00 eq) se disolvió en MeOH (12 mL) y agregó a una suspensión de Pd (10%) en polvo de carbono activado (31 mg, 0.03 mmol Pd, 0.17 eq) en MeOH (3 mL) . El matraz se purgó con H2 (6x) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente por 1.5 h. El producto crudo se purificó por cromatografía de columna instantánea (S1O2; DCM/MeOH 1%) para dar el compuesto del título como aceite naranja pálido (39 mg, 0.14 mmol, 87% de rendimiento) . Rf = 0.41 (DCM/MeOH 4%). HRMS (ESI ) calculado para C17H23 20+ [M+H]+ 271.1805, encontrado: 271.1796. XH RMN (400 MHz, CDC13) d 7.73 (d, J = 2.9 Hz, 1H, aromático H) , 7.32 - 7.26 (m, 2H, aromático H) , 7.07 (dd, J= 8.6, 3.0 Hz, 1H, aromático H) , 7.01 - 6.94 (m, 2H, aromático H) , 6.74 (d, J= 8.6 Hz, 1H, aromático H) , 3.35 (s, 2H, N3), 1.61 - 1.51 (m, 211, C (CH3 ) 2CH2CH2CH3) , 1.27 (s, 6H, C (03)2CH2CH9CH3) , 1.16 - 1.01 (m, 2H, C (CH3) 2CH2CH2CH3 ) , 0.82 (t, J= 7.3 Hz, 3H, C (CH,) ,.CH2CH2CH3) . 13C RMN (101 MHz, CDCI3) d 156.82, 153.32, 145.10, 138.67, 134.32, 128.12, 127.09, 126.99, 119.62, 119.13, 112.53, 47.31, 37.49, 29.17, 18.08, 14.90. 4- (4- ( (3r, 5r, 7r) -adiamantan-1-11) fenoxl) anilina, I3-M Siguiendo el procediraiento B, 13-nM (615 mg, 1.76 mmol, 1.00 eq) se disolvió en tolueno (15 mL) y agregó a una suspensión de Pd (10%) en polvo de carbono activado (126 mg, 0.12 mmol Pd, 0.07 eq) en MeOH (10 mL) . El matraz se purgó con H2 (6x) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente por 19 h. El producto crudo se purificó por cromatograf a de columna instantánea (S1O2; DCM) para dar el compuesto del título como sólido beige (538 mg, 1.68 mmol, 96% de rendimiento) . Rf ' = 0.39 (DCM/MeOH 1%) . -HRMS (ESI) calculado para C22H26 O+ [M+H]+ 320.2009, encontrado: 320.2006. XH RMN (400 MHz, CDCI3) d 7.32 - 7.25 (m, 2H, aromático H) , 6.93 - 6.86 (m, 4H, aromático H) , 6.72 - 6.65 (m, 2H, aromático H) , 3.56 (s, 2H, NH2), 2.14-2.06 (m, 3H, adamantilo H), 1.90 (d, J= 2.9 Hz, 5H, adamantilo H) , 1.84 - 1.71 (m, 5H, adamantilo H) . 13C RM (101 MHz, CDC13) d 156.59, 149.02, 145.32, 142.51, 125.98/ 121.10, 116.84 , 116.34 , 43.45, 36.88, 35.78, 29.07. 4- (4- ( (3r,5r, 7r) -adamantan-1-il) fenoxi) -3-fluoxoanllina, I3-N Siguiendo el procedimiento B, I3-nN (570 mg, 1.55 mmol, 1.00 eq) se disolvió en tolueno (10 mL) y agregó a una suspensión de Pd (10%) en polvo de carbono activado (143 mg, 0.13 mmol Pd, 0.09 eq) en MeOH (10 mL) . El matraz se purgó con ¾ (6x) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente por 7 h. El producto crudo se purificó por cromatografía de columna instantánea (Si02; DCM) para dar el compuesto del título como sólido incoloro (510 mg, 1.51 mmol, 97% de rendimiento). Rf = 0.67- (DCM/MeOH 1%). HRMS (ESI) calculado para C22H25FNO+ [M+H] 338.1915, encontrado: 338.1916. 1'H RMN (400 MHz, CDC13) d 7.32 - 7.23 (m, 2H, aromático H) , 6.92 (t, J= 8.8 Hz, 1H, aromático H) , 6.89 -6.81 (m, 2H, aromático H) , 6.51 (dd, J= 12.0, 2.7 Hz, 1H, aromático H) , 6.41 (ddd, J= 8.7, 2.7, 1.2 Hz, 1H, aromático H) , 3.64 (s, 2H, NH2), 2.11 - 2.07 (m, 3H, adamantilo H) , 1.89 (d, J= 2.9 Hz, 5H, adamantilo H) , 1.83 - 1.70 (m, 5H, adamantilo H) . 13C RMN (101 MHz, CDC13) d 156.60, 156.47, 154.15, 145.37, 144.33, 144.24, 134.91, 134.79, 125.98, 123.97, 123.95, 115.47, 110.98, 110.95, 103.98, 103.76, 43.43, 36.86, 35.76, 29.06·. 6- (4-isopropilfenoxi)p±rid±n-3-amina/ 13-0 Siguiendo el procedimiento B, I3-nO (202 mg, 0.78 mmol, 1.00 eq) se agregó a una suspensión de Pd (10%) en polvo de carbono activado (76 mg, 0.07 mmol Pd, 0.09 eq) en MeOH (15 mL) . El matraz se purgó con H2 (6x) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente por 1 h. El producto crudo se purificó por cromatografía de columna instantánea (Si02; DCM/MeOH 1%) para dar el compuesto del título como sólido beige (150 mg, 0.66 mmol, 84% de rendimiento). Rf = 0.42 (DCM/MeOH 4%). HRMS (ESI) calculado para C14Hi7N20+ [M+H] + 229.1335, encontrado: 229.1326. ? RMN (400 MHz , CDC13) d 7.70 (d, J= 2.9 Hz, 1H, aromático H), 7.24 - 7.14 (m, 2H, aromático H) , 7.05 (dd, J= 8.6, 3.0 Hz, 1H, aromático H) , 7.01 - 6.93 (m, 2H, aromático II), 6.73 (d, J= 8.6 Hz, 1H, aromático H) , 3.33 (s, 2H, NH2) , 2.89 (hept, J = 6.9 Hz, 1H, CH(CH3)2), 1.24 (d, J= 7.0 Hz, 6H, CH(CH3)2). 13C RMN (101 MHz, CDC13) d 156.88, 153:59, 144.19, 138.68, 134.19, 127.55, 126.97, 119.76, 112.35, 77.48, 77.16, 76.84, 33.57, 24.20. 6- (4- (2, 4, 4-trimetilpentan-2-ll) fenoxi)piridin-3-amina, ?3-? Siguiendo el procédimiento B, 13-nP (283 mg, 0.86 mmol, 1.00 eq) se disolvió en tolueno (4 mL) y agregó a una suspensión de Pd (10%) en polvo de carbono activado (78 mg, 0.07 mmol Pd, 0.09 eq) en MeOH (15 mL) . El matraz se purgó con H2 (5x) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente por 2 h. El producto crudo se purificó por cromatografía de columna instantánea (S1O2; DCM/MeOH 2%) para dar el compuesto del título como sólido incoloro (235 mg, 0.79 mmol, 91% de rendimiento). Rf = 0.49 (DCM/MeOH 4%). HRMS (ESI) calculado para Ci9H27 20+ [M+H]+ 299.2118, encontrado: 299.2112. XH RMN (400 MHz, CDC13) d 7.73 (dd, J = 3.0, 0.7 Hz, 1H, aromático H), 7.37 - 7.29 (m, 2H, aromático H) , 7.06 (dd, J= 8.6, 3.0 Hz, 1H, aromático H) , 6.99 - 6.93 (m, 2H, aromático H) , 6.71 (dd, J= 8.6, 0.7 Hz, 1H, aromático H) , 3.10 (s, 2H, NH2), 1.72 (s, 2H, Ar-C (CH3) 2CH2C (CH3) 3) , 1.36 (s, 6H, Ar-C (CH3) 2CH2C (CH3) 3) , 0.73 (s, 9H, Ar-C (CH3) 2CH2C (CH3) 3) . 13C RMN (101 MHz, CDCI3) d 156.87 , 153.39 , 145.48, 138.70, 134.3.9, 127.37, 126.94, 118.96, 112.41, 57.20, 38.36, 32.50, 31.93, 31.68. · *

Claims (17)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES
1. Un compuesto para usar en el tratamiento y/o prevención de un cáncer dependiente de Notch, caracterizado porque el compuesto que tiene propiedades de inhibición de trayectoria de señalización Notch es de la fórmula: RZ- L I I I Formula II en donde m es un enteró seleccionado de 1 hasta 4; W se selecciona de H y halógenos; el halógeno se selecciona de F-, Cl-, Br- o -; R1, R2, R3, ' R4 son cada uno independientemente seleccionados del grupo que consiste de K, isopropilo, tertbutilo, (CH2)nCH3; el subíndice n es un entero independientemente seleccionado de 1 hasta 15; X es O, NR7 donde es R7 es H; Y es N o CH; Z es NR10MRn donde R10 y R11 es H, o Fórmula III donde m es un entero seleccionado de 1 hasta 4 ; W se selecciona de H y halógenos; el halógeno se selecciona de F-, C1-, Br~ o I-; R4 y R±s son cada uno independientemente seleccionados del grupo que consiste de H, tertbutilo, (CH2)nCH3; el subíndice n es un entero independientemente seleccionado de 1 hasta 15; X es 0, NR7 donde es R7 es H; Y es N o CH; Z es NR10NR11 donde R10 y R11 es H, Fórmula IV donde m es un entero seleccionado de 1 hasta 4; se selecciona de H y halógenos; el halógeno se selecciona de F-, Cl-, Br- o I-; R4 es independientemente seleccionado del grupo que consiste de H, isopropilo, tertbutilo, (CH2)nCH3; el subíndice n es un entero independientemente seleccionado de 1 hasta 15; X es O, NR7 donde es R7 es H; Y es N o CH Z es NR10NR donde R10 y R11 es H,
2. El compuesto de conformidad con la reivindicación caracterizado porque el compuesto se selecciona del grupo consiste de: '6- ( 4-Tert-Butilfenoxi ) Piridin-3-Amina (13) de la Fórmula I Fórmul I iciohexilfenoxi ) aailina de la Fórmula Illa Fórmula Illa 6- (4 - { { 3r , 5r , 7r ) -adamantan - 1 -il ) fenoxi ) piridin-3 -amina de la Fórmula iVa, Fórmula IVa 6- (3- (tert-butil) fenoxi) iridin-3-amina de la Fórmula líe Fórmula II e 4- ( - (tert-butil) fenoxi) -3-fluoroanilina de la Fórmula Ilf Fórmula II f 6- ( - (tert-Pentil ) fenoxi ) piridin-3-amina de la Fórmula Fórmula II g 6- ( 4-Butilfenoxi ) piridin-3-amina de la Fórmula Ilh, Fórmula I I . h 3-Fluoro-4 - (4 - ( tert-pen il ) í .enoxi ) anilina, •t ?·.? ·. Fórmula II i 4- (4-Ciclohexilfenoxi) -3-fluoroanilina de la Fórmula III b i Fórmula G.?? b 4- (4- ( (3r, 5r, 7r) -Adamantan- 1 -il ) fenoxi) anilina Fórmula IVb Fórmula IV b ( 4-ciclohexilfenoxi ) piridin-3-amina de la fórmula Fórmula [II c o uno de sus sales, solvatos, tautómeros , o isómeros de los mismos.
3. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el cáncer dependiente de Notch es seleccionado del grupo que comprende leucemia linfoblástica Aguda de célula T (T-ALL) , leucemia mieloide crónica (CML) , leucemia linfocitica crónica (CLL) , Linfoma de célula de manto (MCL) , cáncer dé pecho, cáncer pancreático, cáncer de próstata, meianoma, tumores de cerebro, angiogénesis de tumor, y cáncer colorrectal.
4. El compuesto de conformidad con una de cualesquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque el cáncer dependiente de Notch es resistente a tratamiento de inhibidor de ?-secretasa.
5. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un compuesto de conformidad con una de cualesquiera de las reivindicaciones 1-4 o sales farmacéuticamente aceptables, solvatos, tautómeros, isómeros de los mismos, y un portador farmacéuticamente aceptable.
6. Un kit, caracterizado porque comprende una o más dosis de un compuesto de conformidad con una de cualesquiera de las reivindicaciones 1-4, opcionalmente con reactivos y/o instrucciones para el uso.
7. El kit de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque además comprende una o más dosis de un agente quimioterapéutico .
8. Un uso de un: compuesto de conformidad con una de cualesquiera de las reivindicaciones 1-4, para inhibir in vitro la trayectoria de señalización Notch en células.
9. El uso de conformidad con la reivindicación 8, en donde las células son células de cáncer.
10. El uso de un compuesto de conformidad con una de cualesquiera de las reivindicaciones 1-4, para inhibir in vivo la trayectoria de señalización Notch en células.
11. El uso de conformidad con la reivindicación 10, en donde las células son células de cáncer.
12. Un método de tratamiento de un sujeto para cáncer dependiente de Notch, caracterizado porque comprende i) determinar en células de cáncer obtenidas de una muestra biológica del sujeto si el cáncer es dependiente de la trayectoria de señalización Notch, ii) y tratar al sujeto en base a si el cáncer es cáncer dependiente de Notch al administrar una cantidad terapéuticamente efectiva' de un compuesto de conformidad con una de cualesquiera de las reivindicaciones 1-4, o una composición farmacéutica de la reivindicación 5.
13. El método de tratamiento de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la dependencia de trayectoria de señalización Notch en células de cáncer se determina por un ensayo de actividad de complejo de ?-secretasa in vitro.
14. El método de tratamiento de conformidad con la reivindicación 12 o 13, caracterizado porque además comprende administrar al menos un tratamiento convencional de cáncer.
15. El método de tratamiento de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el tratamiento de cáncer convencional se administra antes de, simultáneamente o después de la administración de la cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de conformidad con una de cualesquiera de las reivindicaciones 1-4, o la composición farmacéutica de la reivindicación 5.
16. El método de tratamiento de conformidad con la reivindicación 1 o 15, caracterizado porque el tratamiento de cáncer convencional consiste en radioterapia y/o quimioterapia .
17. Un método de tratamiento de una enfermedad asociada con una actividad de trayectoria de señalización Noten sobre-regulada, caracterizado porque comprende administrar un compuesto de conformidad con una de cualesquiera de las reivindicaciones 1-4, o la composición farmacéutica de la reivindicación 5 a un sujeto que necesita del mismo.
MX2014007544A 2011-12-21 2012-12-21 Inhibidores de la trayectoria de señalización notch y uso de los mismos en el tratamiento de cánceres. MX355632B (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP11010130.0A EP2606884A1 (en) 2011-12-21 2011-12-21 Inhibitors of notch signaling pathway and use thereof in treatment of cancers
PCT/IB2012/057622 WO2013093885A1 (en) 2011-12-21 2012-12-21 Inhibitors of notch signalling pathway and use thereof in treatment of cancers

Publications (2)

Publication Number Publication Date
MX2014007544A true MX2014007544A (es) 2014-11-10
MX355632B MX355632B (es) 2018-04-25

Family

ID=47722321

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MX2014007544A MX355632B (es) 2011-12-21 2012-12-21 Inhibidores de la trayectoria de señalización notch y uso de los mismos en el tratamiento de cánceres.

Country Status (26)

Country Link
US (5) US9296682B2 (es)
EP (3) EP2606884A1 (es)
JP (4) JP6373760B2 (es)
CN (3) CN107434779B (es)
AU (1) AU2012356033B2 (es)
BR (1) BR112014015105B1 (es)
CA (1) CA2859740C (es)
CY (1) CY1119964T1 (es)
DK (1) DK2793884T3 (es)
ES (1) ES2660782T3 (es)
HK (1) HK1203396A1 (es)
HR (1) HRP20180348T1 (es)
HU (1) HUE036583T2 (es)
IL (1) IL233285A0 (es)
LT (1) LT2793884T (es)
MX (1) MX355632B (es)
NO (1) NO2793884T3 (es)
PL (1) PL2793884T3 (es)
PT (1) PT2793884T (es)
RS (1) RS56907B1 (es)
RU (1) RU2631611C2 (es)
SG (2) SG11201403418VA (es)
SI (1) SI2793884T1 (es)
TR (1) TR201802117T4 (es)
WO (1) WO2013093885A1 (es)
ZA (1) ZA201404965B (es)

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2606884A1 (en) 2011-12-21 2013-06-26 Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL) Inhibitors of notch signaling pathway and use thereof in treatment of cancers
US10626372B1 (en) 2015-01-26 2020-04-21 Fate Therapeutics, Inc. Methods and compositions for inducing hematopoietic cell differentiation
US10501413B2 (en) 2015-03-23 2019-12-10 University Of Miami Inhibitors of the Notch transcriptional activation complex and methods for use of the same
US10858628B2 (en) 2015-11-04 2020-12-08 Fate Therapeutics, Inc. Methods and compositions for inducing hematopoietic cell differentiation
CN108368520B (zh) 2015-11-04 2023-01-17 菲特治疗公司 多能细胞的基因组工程改造
US11318167B2 (en) 2015-12-11 2022-05-03 The Johns Hopkins University Isolation of fusion-competent myoblasts and therapeutic applications thereof related to muscular dystrophy
CN105541703A (zh) * 2016-01-27 2016-05-04 吉林大学 一种含吡啶结构的三胺单体及其制备方法
EP3429576A1 (en) 2016-03-17 2019-01-23 Xeniopro GmbH Enhancers of notch signaling and their use in the treatment of cancers and malignancies medicable by upregulation of notch
KR101833672B1 (ko) 2016-04-12 2018-03-02 주식회사 엘지화학 화합물 및 이를 포함하는 유기 전자 소자
IT201600132360A1 (it) 2016-12-29 2018-06-29 Univ Degli Studi Roma La Sapienza Inibitori di notch per uso nel trattamento della leucemia linfoblastica acuta a cellule t
US11591289B2 (en) 2017-02-24 2023-02-28 Xeniopro GmbH Aromatic compounds
WO2018154118A2 (en) * 2017-02-24 2018-08-30 Reinmueller Viktoria Novel aromatic compounds
EP3462349A1 (en) * 2017-10-02 2019-04-03 Koninklijke Philips N.V. Assessment of notch cellular signaling pathway activity using mathematical modelling of target gene expression
AU2019289917A1 (en) * 2018-06-21 2021-01-07 Cellestia Biotech Ag Process for making amino diaryl ethers and amino diaryl ethers hydrochloride salts
TW202034900A (zh) 2018-10-02 2020-10-01 美商頻率醫療公司 有關耳用治療劑之醫藥組成物及方法
MA55611A (fr) 2019-04-08 2022-02-16 Frequency Therapeutics Inc Association de chir99021 et d'acide valproïque pour traiter une perte auditive
US20220169642A1 (en) 2019-04-10 2022-06-02 Cellestia Biotech Ag Compounds for the treatment of oncovirus induced cancer and methods of use thereof
SG11202110547YA (en) 2019-04-10 2021-10-28 Cellestia Biotech Ag Compounds for the treatment of oncovirus induced cancer and methods of use thereof
CN111153817B (zh) * 2020-01-20 2021-02-02 四川大学 苯氧基-n-苯基苯胺衍生物及其应用
WO2021197333A1 (zh) * 2020-03-31 2021-10-07 浙江养生堂天然药物研究所有限公司 药物组合及其用途
US20230338347A1 (en) 2020-09-16 2023-10-26 Cellestia Biotech Ag New Use of Inhibitors of the Notch Signalling Pathway
EP4008324A1 (en) 2020-12-07 2022-06-08 Cellestia Biotech AG Combinations comprising an inhibitor of an anti-apoptotic protein, such as bcl-2, bcl-xl, bclw or mcl-1, and a notch signaling pathway inhibitor for treating cancer
WO2022122667A1 (en) 2020-12-07 2022-06-16 Cellestia Biotech Ag Pharmaceutical combinations for treating cancer
TW202313020A (zh) 2021-06-02 2023-04-01 瑞士商西萊絲蒂亞生物科技股份有限公司 自體免疫及發炎性疾病的治療方法
WO2023079132A1 (en) 2021-11-08 2023-05-11 Cellestia Biotech Ag Pharmaceutical combinations for treating cancer
EP4223292A1 (en) 2022-02-07 2023-08-09 Cellestia Biotech AG Pharmaceutical combinations for treating cancer
WO2024012414A1 (en) * 2022-07-11 2024-01-18 Westlake University Use of a fbxo42 specific inhibitor in treating notch signaling-dependent disease

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8430252D0 (en) 1984-11-30 1985-01-09 Beecham Group Plc Compounds
US4816373A (en) * 1986-01-31 1989-03-28 Mitsubishi Paper Mills, Ltd. Method of producing images
US4959377A (en) * 1989-06-29 1990-09-25 Hoechst-Roussel Pharmaceuticals Inc. Phenoxypyridinamine compounds which are use as a dermatological composition
AU4633893A (en) * 1992-06-17 1994-01-04 University Of Massachusetts Medical Center Liposomal formulations for administering to cancer patients
US5935924A (en) 1994-04-15 1999-08-10 Genentech, Inc. Treatment of congestive heart failure
US6214966B1 (en) 1996-09-26 2001-04-10 Shearwater Corporation Soluble, degradable poly(ethylene glycol) derivatives for controllable release of bound molecules into solution
US6692919B1 (en) * 1997-07-23 2004-02-17 Yale University Activated forms of notch and methods based thereon
EP1140840B1 (en) 1999-01-13 2006-03-22 Bayer Pharmaceuticals Corp. -g(v)-carboxyaryl substituted diphenyl ureas as raf kinase inhibitors
RU2319693C9 (ru) * 1999-01-13 2008-08-20 Байер Копэрейшн Производные мочевины (варианты), фармацевтическая композиция (варианты) и способ лечения заболевания, связанного с ростом раковых клеток (варианты)
AU769425B2 (en) 1999-04-23 2004-01-29 Alza Corporation Conjugate having a cleavable linkage for use in a liposome
JP2001089412A (ja) * 1999-09-22 2001-04-03 Otsuka Pharmaceut Co Ltd ベンゼン誘導体またはその医薬的に許容される塩
JP4427328B2 (ja) * 2001-12-14 2010-03-03 エクセリクシス， インク． ヒト−ａｄａｍ−１０インヒビター
WO2003095448A1 (en) * 2002-05-06 2003-11-20 Bayer Pharmaceuticals Corporation Pyridinyl amino pyrimidine derivatives useful for treating hyper-proliferative disorders
WO2004013179A1 (en) * 2002-08-03 2004-02-12 Lorantis Limited Conjugate of notch signalling pathway modulators and their use in medical treatment
WO2005014524A2 (en) * 2003-08-07 2005-02-17 Wisconsin Alumni Research Foundation Amino thiol compounds and compositions for use in conjunction with cancer therapy
US20050214250A1 (en) 2003-11-06 2005-09-29 Harris J M Method of preparing carboxylic acid functionalized polymers
RU2392961C2 (ru) * 2004-11-10 2010-06-27 Хубрехт Лабораториум Лечение аденомы и/или аденокарциномы кишечника с помощью ингибирования активации пути notch
GB0518232D0 (en) * 2005-09-07 2005-10-19 Merck Sharp & Dohme New methods
PE20090321A1 (es) * 2007-06-04 2009-04-20 Genentech Inc Anticuerpos anti-notch1 nrr, metodo de preparacion y composicion farmaceutica
JP2011523655A (ja) 2008-06-03 2011-08-18 フレセニウス メディカル ケア ドイッチュランド ゲーエムベーハー ガンマセクレターゼモジュレータを含む医薬組成物
US8436025B2 (en) * 2008-09-19 2013-05-07 CompleGen Partners, Inc. Compounds and methods for PKC theta inhibition
US20100292193A1 (en) * 2009-04-10 2010-11-18 The Regents Of The University Of California Radioprotective drugs
EP2606884A1 (en) 2011-12-21 2013-06-26 Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL) Inhibitors of notch signaling pathway and use thereof in treatment of cancers

Also Published As

Publication number Publication date
DK2793884T3 (en) 2018-03-05
HUE036583T2 (hu) 2018-07-30
CN104136027B (zh) 2017-05-24
AU2012356033B2 (en) 2017-08-03
SI2793884T1 (en) 2018-03-30
CN113616648A (zh) 2021-11-09
US9296682B2 (en) 2016-03-29
NO2793884T3 (es) 2018-04-28
MX355632B (es) 2018-04-25
TR201802117T4 (tr) 2018-03-21
CN107434779B (zh) 2021-07-13
US10274481B2 (en) 2019-04-30
RU2631611C2 (ru) 2017-09-25
JP2018172433A (ja) 2018-11-08
CN107434779A (zh) 2017-12-05
CA2859740A1 (en) 2013-06-27
BR112014015105A8 (pt) 2017-06-27
HRP20180348T1 (hr) 2018-04-06
HK1203396A1 (en) 2015-10-30
CA2859740C (en) 2023-07-25
CY1119964T1 (el) 2018-12-12
IL233285A0 (en) 2014-08-31
ES2660782T3 (es) 2018-03-26
US20180224429A1 (en) 2018-08-09
EP2793884B1 (en) 2017-11-29
JP2020125314A (ja) 2020-08-20
US10054581B1 (en) 2018-08-21
EP2606884A1 (en) 2013-06-26
US20190219566A1 (en) 2019-07-18
EP2793884A1 (en) 2014-10-29
US20140329867A1 (en) 2014-11-06
ZA201404965B (en) 2017-04-26
SG10201605984RA (en) 2016-09-29
RU2014127753A (ru) 2016-02-10
PT2793884T (pt) 2018-02-26
JP2021120399A (ja) 2021-08-19
SG11201403418VA (en) 2014-07-30
US11085918B2 (en) 2021-08-10
AU2012356033A1 (en) 2014-08-07
LT2793884T (lt) 2018-02-26
JP6887701B2 (ja) 2021-06-16
JP6373760B2 (ja) 2018-08-15
RS56907B1 (sr) 2018-05-31
US20160266095A1 (en) 2016-09-15
NZ627559A (en) 2016-06-24
PL2793884T3 (pl) 2018-05-30
US20210382038A1 (en) 2021-12-09
EP3332783A1 (en) 2018-06-13
JP2015506345A (ja) 2015-03-02
BR112014015105B1 (pt) 2021-11-16
CN104136027A (zh) 2014-11-05
BR112014015105A2 (pt) 2017-06-13
WO2013093885A1 (en) 2013-06-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11085918B2 (en) Method for identifying modulators of notch signaling
JP6510485B2 (ja) Ｐｒｍｔ５インヒビターおよびそれらの使用方法
KR20220021462A (ko) Notch 신호 전달 경로의 억제제 및 암의 치료에서 이의 용도
NZ627559B2 (en) Inhibitors of notch signalling pathway and use thereof in treatment of cancers
EP4106871A1 (en) Biphenyl compounds as soce modulators, compositions and uses thereof
WO2023220558A1 (en) Combination of curaxins and immune checkpoint inhibitors for treating cancer
KR102058886B1 (ko) 항안드로겐 특성을 갖는 신규한 헤테로아릴아미드 유도체

Legal Events

Date Code Title Description
FG Grant or registration