BR112014015105B1 - Composição farmacêutica, kit e usos de um composto - Google Patents

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Freddy Radtke
Rajwinder Lehal
Viktoria REINMÜLLER
Jieping Zhu
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Ecole polytechnique fédérale de Lausanne (EPFL)
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Abstract

composto, composição farmacêutica, kit, uso de um composto e método de tratamento. a presente invenção refere-se à utilização de inibidores da via de sinalização notch selecionados a partir do grupo consistindo de 6-(4-terc-butilfenoxi)piridin-3-amina (i3), seus derivados, no tratamento e/ou prevenção de cânceres.

Description

Campo da invenção
[01] A presente invenção refere-se ao uso de inibidores da via de sinalização Notch, em particular 6-(4-terc- butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) (número CAS 218457-67-1) e seus derivados, no tratamento e/ou prevenção de cânceres. Antecedentes da invenção
[02] A via de sinalização Notch representa um componente crítico para os circuitos moleculares que controlam o destino da célula durante o desenvolvimento, a sobrevivência da célula e a proliferação da mesma (Shih IeM, Wang TL em Cancer Res 2007; 67 (5) : 1879-82) . A ativação aberrante dessa via contribui para a tumorigênese. Os membros da família Notch estão sendo reconhecidos como oncogenes em um crescente número de cânceres. O papel do Notch no câncer humano foi destacado recentemente pela presença de ativação de mutações e amplificação dos genes Notch no câncer humano e pela demonstração de que os genes na via de sinalização Notch poderiam ser potenciais alvos terapêuticos. Ficou claro que um dos principais alvos terapêuticos na via Notch são os receptores Notch, em que os inibidores da Y—secretase evitam a geração do domínio oncogênico (intracelular) das moléculas Notch e suprimem a atividade Notch.
[03] Embora tenha sido feito progresso significativo no estudo do funcionamento complexo dessa via de sinalização, há opções muito limitadas disponíveis para os inibidores Notch. No entanto, a classe pioneira de inibidores Notch já está na fase dos ensaios clínicos para alguns tipos de câncer, como os inibidores da Y-secretase MK0752, disponível junto à Merck Sharp & Dohme Corp. MK0752 e RO4929097 (Roche), uma pequena molécula sintética, inibem a via de sinalização Notch, que pode resultar na indução da interrupção do crescimento e a apoptose em células tumorais, nas quais a via de sinalização Notch é superativada.
[04] Uma das desvantagens do uso de inibidores da Y-secretase para bloquear a sinalização Notch, como os disponíveis no mercado ou sob investigação, é o seu vasto leque de alvos adicionais, como a proteína precursora amiloide, bem como a não seletividade no bloqueio da sinalização Notch através de todos os quatro ligantes (Notch 1, 2, 3 e 4). Devido à capacidade de bloquear a sinalização Notch através de todos os quatro receptores, os inibidores da Y-secretase são conhecidos por causar metaplasia das células caliciformes no intestino. Além disso, algumas das malignidades hematológicas e tumores sólidos abrigam mutações nos receptores Notch (tais como translocações cromossômicas), resultando na expressão constitutiva da forma ativa dominante de NICD, independente da clivagem pelo complexo da Y-secretase. Portanto, esses tumores não respondem ao tratamento com inibidores da Y-secretase.
[05] Portanto, ainda há uma necessidade de identificar e desenvolver outros inibidores específicos e seletivos da via de sinalização Notch úteis para o tratamento e/ou prevenção de cânceres.
Resumo da invenção
[06] A presente invenção refere-se a uma 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) de fórmula I
Figure img0001
Fórmula Iou um dos seus derivados, tendo propriedades de inibição da via de sinalização Notch, sais, solvatos, tautômeros e isômeros dos mesmos para uso no tratamento e/ou prevenção de um câncer.
[07] Outro objeto da presente invenção é fornecer uma composição farmacêutica que compreende 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) de fórmula I, ou um dos seus derivados, tendo propriedades de inibição da via de sinalização Notch, ou sais, solvatos, tautômeros, isômeros farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
[08] A invenção também contempla um kit que compreende uma ou mais doses de 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3), ou um dos seus derivados com propriedades de inibição da via de sinalização Notch, para uso em um método para o tratamento e/ou prevenção do câncer, opcionalmente com reagentes e/ou instruções de uso.
[09] É outro objeto da invenção fornecer o uso de 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) de fórmula I, ou um de seus derivados com propriedades de inibição da via de sinalização Notch, para inibição in vitro ou in vitro da via de sinalização Notch nas células.
[010] É outro objeto da invenção fornecer um método de tratamento de um indivíduo para câncer dependente de Notch. Descrição das figuras
[011] A figura 1 mostra a ativação da sinalização Notch NICD mediada por blocos de 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) (número CAS 218457-67-1). A) As células N1-HeLa foram cotransfectadas com plasmídeo de expressão pcDNA3.Notch1, pGL4.26-12xCSL luciferase e plasmídeos de renila SV40. As células DL4 e N1-HeLA foram cocultivadas em uma placa com 96 poços em uma razão de 1:1 (20.000:20.000 células/poço) e tratadas com DMSO (dimetilsulfóxido) ou com 2, 5 e 10 μM de I3 e DAPT durante 24 horas. A ativação da via Notch foi medida pela quantificação da sinalização Notch pelo ensaio repórter da luciferase. O tratamento do ensaio de cocultura de DL4:N1 com 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) e DAPT causa uma diminuição dependente da concentração na ativação da sinalização Notch. B) Células HeLa foram transfectadas com NICD e tratadas com DMSO ou com 2, 5, 10, 20 e 40 μM de 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3). Como controle, as células cocultivadas também foram tratadas com 5, 10, 20 e 40 μM de DAPT. A ativação da via foi medida utilizando o ensaio repórter da luciferase induzido por Notch. O tratamento com 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) das células expressando NICD levou a uma atenuação da sinalização, enquanto que o tratamento com DAPT não teve nenhum efeito sobre a ativação da sinalização Notch mediada por NICD. C) o ensaio de cocultura de DL4:N1 e DL4:N2 foi tratado com I3 e DAPT (10 μM cada) durante 24 horas. O efeito da 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) e da DAPT sobre a ativação da via induzida por DL4-N1 e DL4-N2 foi medido pela atividade da luciferase induzida por Notch. Tanto o tratamento com I3 como com DAPT bloqueou a ativação da via induzida por Notch1 e Notch2. D) 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) inibiu a ativação da via através dos domínios intracelulares de Notch1 (NICD) e Notch2 (N2-ICD).
[012] A figura 2 mostra que a inibição mediada por 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) da sinalização Notch pode ser resgatada com o aumento da concentração de MAML1. As células HeLa foram cotransfectadas com 800 ng de NICD + 3 μg de pCDNA3.1 ou 800 ng de NICD + 1 μg de MAML1-FLAG ou 800 ng de NICD + 3 μg dos vetores de expressão MAML1-FLAG. Para medir a ativação da via Notch, o plasmídeo da luciferase pGL4.26-12xCSL também foi introduzido nas células. A renila SV40 foi usada como um controle interno. As células transfectadas com diferentes combinações e quantidades de plasmídeo foram tratadas com DMSO ou concentração crescente de 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) (1, 2,5, 5 e 10 μM) durante 24 horas. A atividade luciferase induzida por 12xCSL foi medida usando o sistema de ensaio da luciferase duplo. Na ausência de MAML1, 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) poderia bloquear as ativações da sinalização Notch, mas o efeito inibidor Notch da 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) foi diminuído com o aumento da quantidade de MAML1.
[013] A figura 3 mostra que a 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) inibe a sinalização Notch e infrarregula os seus genes alvo em linhagens de células cancerosas humanas. A) As células RPMI 8402 foram tratadas com DMSO, 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) e DAPT (10 μM) durante 24 horas e foram analisadas quanto à expressão dos genes alvo do Notch, Hes1, cMyc e Dtx1 por qRT-PCR. Os dados foram normalizados para HPRT como um gene de controle. B) O lisado de células inteiras de células tratadas com 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) foi analisado por Western blot. Usando anticorpos contra NICD (Val1744), Hes1 e cMyc, os níveis de proteína de NICD e os genes alvo de Notch foram determinados. C e D) as linhagens celulares T-ALL humanas HPB ALL (figura 3C) e KOPTK1 (figura 3D) foram tratadas com DMSO ou 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) durante 24 horas. Análises de Western blot foram realizadas usando os anticorpos específicos NICD (Val1744) e Hes1. A tubulina serviu como um controle de carga. E) O lisado de células inteiras de células PANC1 (linhagem de célula cancerosas pancreáticas) tratadas com DMSO e 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) foi analisado por Western blot. Os níveis de proteína Hes1 foram determinados utilizando anticorpos específicos para Hes1. As análises estatísticas foram feitas utilizando o teste t de student bicaudal. * = valor de p < 0,05.
[014] A figura 4 mostra que a 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) induz um bloqueio nas células cancerosas humanas. As linhagens de células-T-ALL humanas RPMI 8402 e KOPTK1, e a linhagem de células cancerosas pancreáticas PANC1, bem como células de melanoma induzidas por nRas foram semeadas em uma placa de 96 poços e tratadas com concentração de 10 μM de 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) e DAPT durante vários dias. Seus efeitos inibitórios do crescimento foram comparados com as células tratadas com igual quantidade de DMSO. Usando o ensaio de Alamar blue, as cinéticas de crescimento de RPMI 8402 e KOPTK1 foram monitoradas por até 6 dias, enquanto que as células de melanoma PANC1 e nRas foram monitoradas durante 4 dias. O tratamento com 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) das células de melanoma RPMI 8402, KOPTK1. PANC1 e nRas causou uma redução significativa em seus potenciais de crescimento. As análises= valor de p < 0,05. ns = não significativo.
[015] A figura 5 mostra o crescimento dependente de blocosNICD de 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina das células cancerosas humanas. A) Células DND41-parentais e DND41-NICD foram tratadas com 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) e DAPT durante 24 horas. As análises de Western blot foram realizadas para a proteína Hes1 usando anticorpos específicos para Hes1. Tanto DAPT quanto6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) causaram uma infrarregulação das células de origem Hes1 e DND41. As células DND41-NICD mostraram uma infrarregulação de Hes1 somente quando foram tratadas com6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3). B) Cinco mil células parentais DND41 foram semeadas e tratadas com DMSO, 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) e DAPT em uma placa de 96 poços. A cinética de crescimento da linhagem celular parental foi monitorada durante 5 dias usando a leitura de Alamar blue. O tratamento da linhagem celular parental DND41 com 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) e DAPT causou uma interrupção na proliferação. C) Da mesma forma, as células DND41-NICD tratadas com DMSO, 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) e DAPT, e suas cinéticas de crescimento, foram monitorados usando a leitura de Alamar blue durante 5 dias. O tratamento de células DND41-NICD com DAPT não teve um impacto significativo na sua proliferação, enquanto que o tratamento com 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) induziu uma interrupção na proliferação. D) A linhagem celular de câncer de mama humano HCC1187 abriga uma translocação cromossômica SEC22B-Notch2, levando assim a uma expressão da forma constitutivamente ativa de NICD independente da clivagem pelo complexo da Y-secretase- Essa mutação torna essa linhagem celular insensível ao tratamento com inibidor da Y-secretase- E) Duas mil células HCC1187 foram semeadas por poço em uma placa de 96 poços- As células foram tratadas com DMSO, inibidor da Y-secretase DAPT e I3 durante 6 dias- A leitura de Alamar blue foi obtida nos dias 0, 2, 4 e 6- Oito replicatas foram usadas cada tratamento e ponto de tempo- O tratamento da linhagem celular de câncer de mama humano HCC1187 com o inibidor da Y-secretase DAPT não alterou a cinética de crescimento em comparação com as contrapartes tratadas com DMSO, enquanto que o tratamento com I3 causou inibição estatisticamente significativa da proliferação celular- Os valores de P foram calculados utilizando o teste t de Student- * = valor de p < 0,05- ns = não significativo-
[016] A figura 6 mostra que a 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) induz a interrupção do ciclo celular em G0/G1 e a apoptose em linhagens celulares de leucemia linfoblástica aguda de células-T humanas e na linhagem celular de câncer de mama humano HCC1187- A) As linhagens celulares de leucemia humana (RPMI8402, CUTL1, KOPTK1, TALL1 e HPBALL) foram tratadas com I3 (10 μM) - A porcentagem da população de células positivas para anexina V (apoptóticas) foi medida utilizando citometria de fluxo- B) Análises do ciclo celular: as linhagens celulares RPMI8402, KOPTK1 e TALL1 foram tratadas com I3 (10 μM) e coradas com corante Ki67 e Hoechst para determinar o status do ciclo celular- As análises do ciclo celular sugerem que o tratamento com I3 causa um aumento de 20 a 30% em células retidas na fase G0/G1 do ciclo celular- C) As células HCC1187 foram tratadas com DMSO ou 10 μM de I3 e a porcentagem da população apoptótica foi medida usando o corante anexina V. D) Células HCC1187 tratadas com I3 foram analisadas quanto ao status do ciclo celular. A marcação com Ki67 e Hoechst revelou que I3 induz a parada das células HCC1187 em G0/G1.
[017] A figura 7 mostra que 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) mimetiza a perda genética do fenótipo de sinalização Notch2 no baço. A perda de sinalização Notch no baço leva a uma redução nas células B da zona marginal (MZB) no baço. A) Representação esquemática do plano experimental. B) Camundongos (n = 2) foram tratados com óleo (figura 7D à esquerda) ou 25 mg/Kg de 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) (figura durante 7D à direita) dias consecutivos. Os baços foram analisados no dia 8. Usando anticorpos específicos para B220, as células B no baço foram identificadas. As células MZB no compartimento de células B foram detectadas usando os anticorpos contra os marcadores de superfície celular CD23 e CD21. O tratamento de camundongos com 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) causa uma redução significativa na porcentagem de células MZB no baço. C) O tratamento com 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) causa uma redução dos números absolutos de células MZB no baço em comparação com os animais tratados com veículo.
[018] A figura 8 mostra que o tratamento com 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) aumenta a latência do desenvolvimento de leucemia em camundongos. A) Os camundongos NOD/SCID yc-/- foram injetados com 1 x 106 células HPB ALL (expressando luciferase). No dia 5, as células leucêmicas foram estabelecidas na medula óssea. Os camundongos 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) (figura 8A à direita) em todos os dias. Os camundongos foram visualizados no dia 27 usando o sistema de processamento de imagens de organismos vivos Caliper IVIS (Xenogen). As cores vermelho e azul indicam a intensidade do sinal de luciferase e são correlacionados com o número de células leucêmicas. B) O tratamento com 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) bloqueia o crescimento de células leucêmicas RPMI 8402 no ensaio de xenotransplante. Os camundongos NOD/SCID yc-/-foram transplantados com 5 x 105células RPMI 8402 (expressando luciferase). O desenvolvimento da leucemia foi monitorado usando o sistema de processamento de imagens de organismos vivos Caliper IVIS (Xenogen). No dia 13, um tratamento diário foi iniciado usando óleo (n = 3) ou 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) (n = 4). Os animais foram tratados durante 27 dias (ponto final do experimento).
[019] A figura 9 mostra que o tratamento com 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) bloqueia os tumores de mama em camundongos MMTV-ErbB2. A) Hes1 níveis de expressão de proteínas em tumores mamários MMTV-ErbB2 e idade normal correspondentes glândulas mamárias (M. G) foram comparadas usando anticorpo Anti-Hes1. A análise de Western blot mostrou uma expressão muito elevada da proteína Hes1 em tumores de mama MMTV-ErbB2. A tubulina serviu como um controle de carga. B) Uma única suspensão de células do tumor de mama MMTV-ErbB2 foi preparada e 1 x 106células foram injetadas na gordura infrapatelar limpa de camundongos FVB receptores. A formação de tumor foi monitorada em uma base regular. Uma vez que o tumor se desenvolveu até um volume de 100 a 300 mm3, os camundongos foram tratados com óleo (n = 2) ou 25 mg/Kg de 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) (n = 2). O volume do tumor foi medido a cada 6 a 7 dias. Os camundongos tratados com 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) exibiram uma progressão tumoral lenta em comparação com os camundongos tratados com óleo.
[020] A figura 10 mostra a atividade inibitória do Notch dos derivados químicos de6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3). Os diferentes derivados químicos de 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) foram testados no ensaio de cocultura DL4-N1 e os níveis de atividade Notch foram medidos usando o gene repórter da luciferase induzido por Notch. Os derivados I3-A, I3-B, I3-C, I3-E, I3-G, I3-H, I3-M e I3-N exibem atividade anti-Notch comparável à 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3), enquanto que os derivados I3-F e I3-I parecem ter atividade aumentada (DAPT = éster t-butílico de N-[N-(3,5-difluorfenacetil)-L-alanil]-S-fenilglicina). Descrição detalhada da invenção
[021] Embora os métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos neste documento podem ser usados na prática ou teste da presente invenção, materiais e métodos adequados são descritos abaixo. Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes e outras referências aqui mencionadas são incorporadas por referência nas suas totalidades. As publicações e pedidos discutidos neste documento são fornecidos unicamente para sua divulgação antes da data de depósito do presente pedido. Nada neste documento deve ser interpretado como uma admissão de que a presente invenção não é intitulada a antedatar tal publicação em virtude da invenção anterior. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não se destinam a ser limitantes.
[022] No caso de conflito, o presente relatório descritivo, incluindo as definições, prevalecerá. A menos que seja definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado que o comumente compreendido por uma pessoa versada na técnica a que o assunto neste documento pertence. Conforme usado neste documento, as seguintes definições são fornecidas para facilitar o entendimento da presente invenção.
[023] Conforme utilizado na presente invenção, o termo "compreende/compreendendo"é geralmente usado no sentido de incluir/incluindo, ou seja, permitir a presença de uma ou mais características ou componentes. Os termos "compreende" e "compreendendo"também abrangem os termos mais restritos "consiste" e "consistindo".
[024] Conforme usado no relatório descritivo e nas reivindicações, as formas no singular "um", "uma" e "o/a" incluem referências no plural, a menos que o contexto claramente especifique de outra forma.
[025] Por facilidade de leitura, os termos "composto(s) da invenção"ou "composto(s) de acordo com a invenção", usados em toda a descrição referem-se ao composto 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) (número CAS 218457-67-1), derivados da dita I3, sais ou solvatos do composto I3 ou dos derivativos, e aos isômeros, incluindo enantiômeros, estereoisômeros, rotâmeros, tautômeros e racematos do composto I3, compostos I3 quimicamente modificados e derivados dos ditos compostos I3.
[026] Conforme utilizado na presente invenção, o termo “indivíduo” é bem reconhecido na técnica e refere-se a um mamífero, incluindo cão, gato, rato, camundongo, macaco, vaca, cavalo, cabra, ovelha, porco, camelo e, mais preferencialmente, um ser humano. Em algumas modalidades, o indivíduo é um indivíduo que necessita de tratamento ou um indivíduo com uma doença ou distúrbio, como câncer. No entanto, em outras modalidades, o indivíduo pode ser um indivíduo normal ou um indivíduo que já tenha sido submetido a um tratamento contra o câncer. O termo não denota uma idade ou sexo particular. Dessa forma, indivíduos adultos, crianças e recém-nascidos, do sexo masculino o feminino, são destinados a serem englobados.
[027] Os termos "câncer", "células cancerosas", "doenças proliferativas celulares" e "transtornos proliferativos celulares", conforme utilizados na presente invenção, referem-se a ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada pelo crescimento de células desregulado. De acordo com a presente invenção, câncer refere-se, preferencialmente, aos tumores sólidos, tais como tumores do cérebro, mama, próstata, colorretal, de rim, pulmão, sarcoma ou melanoma, e tumores líquidos que afetam o sangue, como leucemia. Mais preferencialmente de acordo com a presente invenção, os cânceres são cânceres dependentes de Notch selecionados do grupo que compreende por leucemia linfoblástica aguda de células-T (T-ALL), leucemia mieloide crônica (CML), leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma de células do manto, câncer de mama, câncer de pâncreas, câncer de próstata, melanoma, tumores cerebrais, angiogênese tumoral e câncer colorretal. Alternativamente, o câncer dependente de Notch é resistente ao tratamento com inibidor de Y-secretase- Exemplos de tratamento com inibidor da Y-secretasecompreendem 1) inibidor da gama-secretase RO4929097 (RO) e maleato de cediranibe no tratamento de pacientes com tumores sólidos avançados (NCT01131234), 2) inibidor da gama-secretase RO4929097 no tratamento de pacientes jovens com tumores sólidos refratários ou reincidentes, tumores do SNC, linfoma ou leucemia de células-T (NCT01088763), 3) estudo da MK-0752 em combinação com tamoxifeno ou letrozol para tratar o câncer de mama em estágio inicial (NCT00756717), 4) GDC-0449 e RO4929097 no tratamento de pacientes com progressos ou sarcoma metastático (NCT01154452) 5) RO4929097 e cloridrato de erlotinibe no tratamento de pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas em estágio IV ou recorrente (NCT01193881), 6) bicalutamida e RO4929097 no tratamento de pacientes com câncer de próstata previamente tratado (NCT01200810), 7) RO4929097 no tratamento de pacientes com gliomas invasivos recorrentes (NCT01269411), 8) um inibidor da via de sinalização Notch para pacientes com leucemia/linfoma linfoblástico agudo de células-T (ALL) (NCT00100152) e 9) RO4929097 no tratamento de pacientes com câncer colorretal metastático (NCT01116687).
[028] A via de sinalização Notch é evolutivamente conservada e os participantes moleculares básicos nesta via são ligantes (Delta e Jagged), receptores Notch e os fatores de transcrição (Shih IeM, Wang TL em Cancer Res 2007; 67 (5) :1879- 82). Notch é um receptor heterodimérico transmembranar e há quatro membros distintos (Notch1, Notch2, Notch3 e Notch4) em seres humanos e roedores. Em uma condição fisiológica, a ligação do ligante Notch ao seu receptor inicia a sinalização Notch pela liberação do domínio intracelular do receptor Notch (Notch-ICD) através de uma cascata de clivagens proteolíticas pela α-secretase (também chamada de enzima conversora do fator de necrose tumoral α) e Y-secretasθ- O Notch-ICD intracelular liberado em seguida transloca para dentro do núcleo, onde ele modula a expressão gênica principalmente pela ligação a um fator de transcrição onipresente, CBF1, supressor do Hairless, Lag-1 (CSL). Essa ligação recruta os ativadores de transcrição para o complexo CSL e os convertem de um repressor de transcrição em um ativador, que se transforma em vários efetores a jusante. As funções fisiológicas da sinalização Notch são multifacetadas, incluindo a manutenção de células tronco, a especificação do destino da célula e a regulação da diferenciação no desenvolvimento, bem como na oncogênese.
[029] Nos cânceres, as alterações genéticas moleculares, tais como a translocação cromossômica, mutações pontuais e amplificação cromossômica nos loci do receptor Notch são os mecanismos conhecidos para a ativação constitutiva da via Notch. Apesar dos diferentes mecanismos, todos eles resultam em aumento dos níveis de Notch-IC intracelular. O potencial oncogênico do Notch foi primeiramente descoberto na leucemia linfoblástica aguda de células-T humana (T-ALL). Embora a sinalização Notch1 seja essencial para o desenvolvimento normal dos progenitores das células-T, a ativação constitutiva da sinalização Notch1 devido a alterações genéticas moleculares é associada com T-ALL. Por exemplo, deleções intersticiais da porção extracelular de Notch1 humano devido à translocação cromossômica (7;9) estão associadas com ~1% dos casos de T-ALL, e a ativação de mutações pontuais do Notch1 ocorrem em cerca de 50% dos casos de T-ALL. A formação de leucemia/linfoma de células-T foi observada em um modelo de camundongo transgênico Notch-ICD, que indica um papel causal da ativação Notch no desenvolvimento da T-ALL. No câncer de pulmão de células não pequenas, a translocação cromossômica (15;19) foi identificada em um subconjunto de tumores, e considera-se que a translocação eleva a transcrição Notch3 em tumores. No câncer de ovário, verificou-se que a amplificação do gene Notch3 ocorre em cerca de 19% dos tumores, e a superexpressão do Notch3 foi encontrada em mais da metade dos carcinomas ovarianos serosos. Da mesma forma, a ativação da sinalização Notch foi demonstrada no desenvolvimento do câncer de mama. Em modelos animais, a expressão de Notch4 constitutivamente ativa causa tumores de mama em camundongos e as mutações ativadoras de Notch1 contribuem para o desenvolvimento de T-ALL. Um estudo recente mostra que a superexpressão de Notch1 e Notch3 ativados em camundongos transgênicos bloqueia o desenvolvimento da glândula mamária e induz os tumores de mama em camundongo. A ativação da sinalização Notch também foi implicada na metástase pulmonar e óssea de células de câncer de mama. A superexpressão do Notch3 é suficiente para induzir a formação de tumor do plexo coroide em um modelo de camundongo, sugerindo um papel do Notch3 no desenvolvimento de certos tipos de tumores cerebrais.
[030] Com o objetivo de realizar uma varredura de alta produtividade (HTS) para identificar novos moduladores (inibidores) da sinalização Notch, os depositantes estabeleceram um ensaio de cocultura para induzir uma ativação mediada pelo receptor do ligante da via. O ensaio de cocultura foi estabelecido usando o ligante Notch DL4 e o receptor de Notch1, especificamente, porque a atividade da via mediada pelo receptor do ligante DL4-N1 desempenha um papel importante nas condições fisiopatológicas, como a angiogênese tumoral e a função do receptor Notch1 na indução de leucemia de células-T. Uma vez que esse ensaio depende da expressão e interação entre o ligante DL4 e o receptor Notch1, ele fornece uma oportunidade para interrogar a sinalização Notch induzida por interações ligante-receptor de forma controlada. A miniaturização desse ensaio em um formato de placa de 96 poços e em um formato de placa de 384 poços ajudou os depositantes a adaptar esse ensaio para realizar a HTS. O uso desse ensaio de cocultura para testar siRNA ou bibliotecas de moléculas pequenas pode levar à identificação das proteínas ou compostos químicos que são capazes de modular a sinalização Notch em diferentes etapas ao longo da via. Por exemplo, um HTS usando siRNA ou bibliotecas de moléculas pequenas pode produzir moduladores da via capazes de agir sobre as células que enviam sinal ou nas células receptoras de sinal. Alterações mediadas por moléculas pequenas ou proteínas na reciclagem ou tráfego de ligantes e receptores para a membrana plasmática podem potencialmente bloquear a via Notch e poderiam ser estudadas usando esse ensaio. Além disso, esse ensaio também pode ajudar a identificar proteínas ou entidades químicas capazes de bloquear as interações entre ligante e receptor, a clivagem S2 mediada por ADAM10/17 ou a clivagem S3 catalisada pela Y-secretase do receptor Notch, a translocação nuclear da forma ativa do Notch ou entidades capazes de bloquear o complexo de ativação de transcrição.
[031] Os depositantes também foram capazes de testar três diferentes bibliotecas de compostos químicos (Microsource NIMDS, Prestwick e Maybridge Hit finder) que levaram à identificação de vários produtos químicos que são capazes de bloquear a sinalização Notch em níveis diferentes ao longo da via.
[032] O uso do sistema renila independente do Notch como um controle interno permitiu aos depositantes eliminar os compostos químicos citotóxicos, limitando assim a taxa de respostas positivas. Além disso, esse ensaio baseado em células também ajudou a contornar os problemas relacionados com a permeabilidade celular dos compostos químicos para a adicional validação dos acertos.
[033] O desenvolvimento do sistema de ensaio de cocultura DL4:N1 lançou as bases para uma campanha de HTS. Esse ensaio forneceu um sistema de leitura robusto e sensível para identificar novos moduladores (inibidores) da via Notch.
[034] Os depositantes identificaram vários compostos químicos quanto à sua capacidade de bloquear a ativação da via Notch. Entre esses, foram identificados os compostos 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) (número CAS 218457-67-1) pela sua capacidade de bloquear a ativação da via Notch.
[035] Dessa forma, a presente invenção refere-se à6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) de fórmula I
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para uso no tratamento e/ou prevenção de câncer.
[036] A presente invenção também engloba modificações químicas da 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) (número CAS: 218457-67-1) para prolongar o tempo de circulação. Exemplos não limitantes dos métodos para peguilar fármacos, de forma transitória ou reversível, incluindo fármacos à base de polipeptídeo, são fornecidos nas Patentes Norte-Americanas Nos. 4.935.465 (depositada em 19 de junho de 1990) e 6.342.244 (depositada em 29 de janeiro de 2002); e nos pedidos norte-americanos publicados de número US2006/0074024. Uma pessoa versada na técnica tipicamente encontraria detalhes sobre os reagentes à base de PEG, por exemplo, nos pedidos publicados WO2005047366, US2005171328 e em aqueles listados no NEKTAR PEG Reagent Catalog® 2005-2006 (Nektar Therapeutics, San Carlos, Calif.).
[037] A presente invenção engloba adicionalmente derivados químicos do dito I3 com propriedades de inibição da via de sinalização Notch. Os depositantes demonstraram que a 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) e seus derivados almejam a sinalização Notch no complexo de ativação de transcrição no núcleo, e espera-se que tumores humanos resistentes aos inibidores da Y-secretase devido às mutações acima mencionadas respondam ao tratamento com 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3). Além disso, a 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) parece alvejar seletivamente a sinalização Notch, limitando dessa forma os seus efeitos tóxicos fora do alvo.
[038] Todos esses derivados compartilham a estrutura comum a seguir:
Figure img0003
[039] Preferencialmente, em dito derivado X é O e a posição 3 (ou para) é NH2.
[040] Mais preferencialmente, o derivado com propriedades de inibição da via de sinalização Notch é selecionado do grupo não limitante que compreende
Figure img0004
em que m é um número inteiro selecionado de 1 a 4;W é selecionado de H e halogênios; o halogênio é selecionado de F-, Cl-, Br- ou I-;Cada um de R1, R2, R3, R4é independentemente selecionado do grupo consistindo em H, fenila, fenila 2-, 3- ou 4-substituída, 2- ou 3-naftila, pirrolila, furanila, tiofuranila, pirimidinila, imidazolila, benzila, isopropila, terc-butila, (CH2)nCH3 alquenila, alquinila; o subscrito n é um número inteiro independentemente selecionado de 1 a 15;X é O, S, CR5R6, NR7, NHCOR8 ou NHSO2R9; onde cada um de R5, R6, R7, R8, R9 é selecionado do grupo consistindo na forma selecionada do grupo consistindo em H, fenila, fenila 2-, 3- ou 4-substituída, 2- ou 3-naftila, pirrolila, furanila, tiofuranila, pirimidinila, imidazolila, benzila, isopropila, terc-butila ou (CH2)nCH3, o subscrito n é um número inteiro independentemente selecionado de 1 a 15;Y é N ou CH;Z é H, NO2, OH ou NR10R11, onde cada um de R10 e R11 é independentemente selecionado do grupo que consiste em H e (CH2)nCH3 e NHCOR12, onde R12 é selecionado do grupo consistindo em (CH2)nCH3, aromáticos e heteroaromáticos como fenila, naftila, pirrolila, furanila, tiofuranila, pirimidinila, imidazolila, COOR13, onde R13 é selecionado do grupo consistindo em H, (CH2)nCH3, aromáticos e heteroaromáticos como fenila, naftila, pirrolila, furanila, tiofuranila, pirimidinila, imidazolila, NHSO2R14 onde R14 é selecionado do grupo consistindo em fenila, fenila 2-, 3- ou 4-substituída, naftila, heteroaromáticos como pirrolila, furanila, tiofuranila, pirimidinila, imidazolila, benzila e (CH2)nCH3; o subscrito n sendo um número inteiro selecionado independentemente de 1 a 15;
Figure img0005
em que m é um número inteiro selecionado de 1 a 4;W é selecionado de H e halogênios; o halogênio é selecionado de F-, Cl-, Br- ou I-;Cada um de R4e R15é independentemente selecionado do grupo consistindo em H, fenila, fenila 2-, 3- ou 4-substituída, 2- ou 3-naftila, pirrolila, furanila, tiofuranila, pirimidinila, imidazolila, benzila, isopropila, terc-butila, (CH2)nCH3 alquenila, alquinila; o subscrito n é um número inteiro independentemente selecionado de 1 a 15;X é o O, S, CR5R6, NR7, NHCOR8 ou NHSO2R9; cada um de R5, R6 e R7 é independentemente selecionado do grupo consistindo em H, fenila 2-, 3- ou 4-substituída, 2- ou 3-naftila, pirrolila, furanila, tiofuranila, pirimidinila, imidazolila, benzila, isopropila, terc-butila, (CH2)nCH3; cada um de R8 e R9 é independentemente selecionado do grupo consistindo em fenila, fenila 2-, 3- ou 4-substituída, 2- ou 3-naftila ou heteroaromáticos selecionados do grupo compreendendo pirrolila, furanila, tiofuranila, pirimidinila, imidazolila, benzila, (CH2)nCH3; o subscrito n é um número inteiro selecionado independentemente de 1 a 15;Y é N ou CH;Z é H, NO2, OH ou NR10R11, onde cada um de R10e R11é independentemente selecionado do grupo consistindo em H, (CH2)nCH3, NHCOR12, onde R12 é (CH2)nCH3, aromáticos e heteroaromáticos selecionados do grupo consistindo em fenila, naftila, pirrolila, furanila, tiofuranila, pirimidinila, imidazolila, COOR13 onde R13 é H, (CH2)nCH3, aromáticos e heteroaromáticos selecionados do grupo compreendendo fenila, naftila, pirrolila, furanila, tiofuranila, pirimidinila, imidazolila, NHSO2R14, onde R14 é fenila, fenila 2-, 3- ou 4-substituída, naftila, heteroaromáticos selecionados do grupo consistindo em pirrolila, furanila, tiofuranila, pirimidinila, imidazolila, benzila e (CH2)nCH3, o subscrito n sendo um inteiroselecionado independentemente de 1 a 15;
Figure img0006
em que m é um número inteiro selecionado de 1 a 4;W é selecionado de H e halogênios; o halogênio é selecionado de F-, Cl-, Br- ou I-;R4é H, fenila, fenila 2-, 3- ou 4-substituída, 2- ou 3-naftila, pirrolila, furanila, tiofuranila, pirimidinila, imidazolila, benzila, isopropila, terc-butila, (CH2)nCH3 alquenila, alquinila; o subscrito n é um número inteiro selecionado independentemente de 1 a 15;X é o O, S, CR5R6, NR7, NHCOR8 ou NHSO2R9; cada um de R5, R6 e R7 é independentemente selecionado do grupo consistindo em H,fenila, fenila 2-, 3- ou 4-substituída, 2- ou 3-naftila, pirrolila, furanila, tiofuranila, pirimidinila, imidazolila, benzila, isopropila, terc-butila, (CH2)nCH3; cada um de R8 e R9 é independentemente selecionado do grupo consistindo em fenila, fenila 2-, 3- ou 4-substituída, 2- ou 3-naftila ouheteroaromáticos selecionados do grupo compreendendo pirrolila, furanila, tiofuranila, pirimidinila, imidazolila, benzila, (CH2)nCH3; o subscrito n é um número inteiro selecionado independentemente de 1 a 15;Y é N ou CH;Z é H, NO2, OH ou NR10R11, onde cada um de R10e R11é independentemente selecionado do grupo consistindo em H, (CH2)nCH3, NHCOR12, onde R12é (CH2)nCH3, aromáticos e heteroaromáticos selecionados do grupo consistindo em fenila, naftila, pirrolila, furanila, tiofuranila, pirimidinila, imidazolila, COOR13 onde R13 é H, (CH2)nCH3, aromáticos e heteroaromáticos selecionados do grupo compreendendo fenila, naftila, pirrolila, furanila, tiofuranila, pirimidinila, imidazolila, NHSO2R14, onde R14 é fenila, fenila 2-, 3- ou 4-substituída, naftila, heteroaromáticos selecionados do grupo consistindo em pirrolila, furanila, tiofuranila, pirimidinila, imidazolila, benzila e (CH2)nCH3, o subscrito n sendo um inteiro selecionado independentemente de 1 a 15;
Figure img0007
em que m é um número inteiro selecionado de 1 a 4; W é selecionado de H e halogênios; o halogênio é selecionado de F-, Cl-, Br- ou I-;Cada um de R1, R2, R3, R4é independentemente selecionado do grupo consistindo em H, fenila, fenila 2-, 3- ou 4-substituída, 2- ou 3-naftila, pirrolila, furanila, tiofuranila, pirimidinila, imidazolila, benzila, isopropila, terc-butila, (CH2)nCH3 alquenila, alquinila; o subscrito n é um número inteiro independentemente selecionado de 1 a 15;X é o O, S, CR5R6, NR7, NHCOR8 ou NHSO2R9; cada um de R5, R6 e R7 é independentemente selecionado do grupo consistindo em H, fenila, fenila 2-, 3- ou 4-substituída, 2- ou 3-naftila, pirrolila, furanila, tiofuranila, pirimidinila, imidazolila, benzila, isopropila, terc-butila, (CH2)nCH3; cada um de R8 e R9 é independentemente selecionado do grupo consistindo em fenila, fenila 2-, 3- ou 4-substituída, 2- ou 3-naftila ou heteroaromáticos selecionados do grupo compreendendo pirrolila, furanila, tiofuranila, pirimidinila, imidazolila, benzila, (CH2)nCH3; o subscrito n é um número inteiro selecionado independentemente de 1 a 15; Z é H, NO2, OH ou NR10R11, onde cada R10 e R11 é independentemente selecionado do grupo consistindo em H, (CH2)nCH3, NHCOR12, onde R12 é (CH2)nCH3, aromáticos e heteroaromáticos selecionados do grupo consistindo em fenila, naftila, pirrolila, furanila, tiofuranila, pirimidinila, imidazolila e COOR13, onde R13 é H, (CH2)nCH3, aromáticos e heteroaromáticos selecionados do grupo compreendendo fenila, naftila, pirrolila, furanila, tiofuranila, pirimidinila, imidazolila, NHSO2R14, com R14 sendo fenila, fenila 2-, 3- ou 4-substituída, naftila, heteroaromáticos selecionados do grupo consistindo em pirrolila, furanila, tiofuranila, pirimidinila, imidazolila, benzila e (CH2)nCH3; o subscrito n sendo um inteiro selecionado independentemente de 1 a 15;
Figure img0008
em que m é um número inteiro selecionado de 1 a 4;W é selecionado de H e halogênios; o halogênio é selecionado de F-, Cl-, Br- ou I-;Cada um de R4e R15é independentemente selecionado do grupo consistindo em H, fenila, fenila 2-, 3- ou 4-substituída, 2- ou 3-naftila, pirrolila, furanila, tiofuranila, pirimidinila, imidazolila, benzila, isopropila, terc-butila, (CH2)nCH3 alquenila, alquinila; o subscrito n é um número inteiro independentemente selecionado de 0 a 15;X é o O, S, CR5R6, NR7, NHCOR8 ou NHSO2R9; cada um de R5, R6 e R7 é independentemente selecionado do grupo consistindo em H, fenila, fenila 2-, 3- ou 4-substituída, 2- ou 3-naftila, pirrolila, furanila, tiofuranila, pirimidinila, imidazolila, benzila, isopropila, terc-butila, (CH2)nCH3; cada um de R8 e R9 é independentemente selecionado do grupo consistindo em fenila, fenila 2-, 3- ou 4-substituída, 2- ou 3-naftila ouheteroaromáticos selecionados do grupo compreendendo pirrolila, furanila, tiofuranila, pirimidinila, imidazolila, benzila, (CH2)nCH3; o subscrito n é um número inteiro selecionado independentemente de 0 a 15;Z é H, NO2, OH ou NR10R11, onde cada R10 e R11 é independentemente selecionado do grupo consistindo em H, (CH2)nCH3, NHCOR12, onde R12 é (CH2)nCH3, aromáticos e heteroaromáticos selecionados do grupo consistindo em fenila, naftila, pirrolila, furanila, tiofuranila, pirimidinila, imidazolila e COOR13, onde R13 é H, (CH2)nCH3, aromáticos e heteroaromáticos selecionados do grupo compreendendo fenila, naftila, pirrolila, furanila, tiofuranila, pirimidinila, imidazolila, NHSO2R14, com R14 sendo fenila, fenila 2-, 3- ou 4-substituída, naftila, heteroaromáticos selecionados do grupo consistindo em pirrolila, furanila, tiofuranila, pirimidinila, imidazolila, benzila e (CH2)nCH3; o subscrito n sendo um inteiro selecionado independentemente de 0 a 15;
Figure img0009
em que m é um número inteiro selecionado de 1 a 3;W é selecionado de H e halogênios; o halogênio é selecionado de F-, Cl-, Br- ou I-;R4 é H, fenila, fenila 2-, 3- ou 4-substituída, 2- ou 3-naftila, pirrolila, furanila, tiofuranila, pirimidinila, imidazolila, benzila, isopropila, terc-butila, (CH2)nCH3 alquenila, alquinila; o subscrito n é um número inteiro selecionado independentemente de 0 a 15;
Figure img0010
X é o O, S, CR5R6, NR7, NHCOR8 ou NHSO2R9; cada um de R5, R6 e R7 é independentemente selecionado do grupo consistindo em H, fenila 2-, 3- ou 4-substituída, 2- ou 3-naftila, pirrolila, furanila, tiofuranila, pirimidinila, imidazolila, benzila, isopropila, terc-butila, (CH2)nCH3; cada um de R8 e R9 é independentemente selecionado do grupo consistindo em fenila, fenila 2-, 3- ou 4-substituída, 2- ou 3-naftila ou heteroaromáticos selecionados do grupo compreendendo pirrolila, furanila, tiofuranila, pirimidinila, imidazolila, benzila, (CH2)nCH3; o subscrito n é um número inteiro selecionado independentemente de 0 a 15;Z é H, NO2, OH ou NR10R11, onde cada R10 e R11 é independentemente selecionado do grupo consistindo em H, (CH2)nCH3, NHCOR12, onde R12 é (CH2)nCH3, aromáticos e heteroaromáticos selecionados do grupo consistindo em fenila, naftila, pirrolila, furanila, tiofuranila, pirimidinila, imidazolila e COOR13, onde R13 é H, (CH2)nCH3, aromáticos e heteroaromáticos selecionados do grupo compreendendo fenila, naftila, pirrolila, furanila, tiofuranila, pirimidinila, imidazolila, NHSO2R14, com R14 sendo fenila, fenila 2-, 3- ou 4-substituída, naftila, heteroaromáticos selecionados do grupo consistindo em pirrolila, furanila, tiofuranila, pirimidinila, imidazolila, benzila e (CH2)nCH3; o subscrito n sendo um inteiro selecionado independentemente de 0 a 15;
Figure img0011
em que o heteroaromático é um aminopirrol, aminofurano, aminotiofurano ou uma pirimidina;Cada um de R1, R2, R3, R4é independentemente selecionado do grupo consistindo em H, fenila, fenila 2-, 3- ou 4-substituída, 2- ou 3-naftila, pirrolila, furanila, tiofuranila, pirimidinila, imidazolila, benzila, isopropila, terc-butila, (CH2)nCH3 alquenila, alquinila; o subscrito n é um número inteiro independentemente selecionado de 0 a 15; X é O, S, CR5R6, NR7, NHCOR8 ou NHSO2R9; onde cada um de R5, R6, R7, R8 e R9 é independentemente selecionado do grupo consistindo em H, fenila, fenila 2-, 3- ou 4-substituída, 2- ou 3-naftila, pirrolila, furanila, tiofuranila, pirimidinila, imidazolila, benzila, isopropila, terc-butila ou (CH2)nCH3, o subscrito n é um número inteiro independentemente selecionado de 0 a 15;Z é H, NO2, OH ou NR10R11, onde cada R10 e R11 é independentemente selecionado do grupo consistindo em H, (CH2)nCH3, NHCOR12, onde R12 é (CH2)nCH3, aromáticos e heteroaromáticos selecionados do grupo consistindo em fenila, naftila, pirrolila, furanila, tiofuranila, pirimidinila, imidazolila e COOR13, onde R13 é H, (CH2)nCH3, aromáticos e heteroaromáticos selecionados do grupo compreendendo fenila, naftila, pirrolila, furanila, tiofuranila, pirimidinila, imidazolila, NHSO2R14, com R14 sendo fenila, fenila 2-, 3- ou 4-substituída, naftila, heteroaromáticos selecionados do grupo consistindo em pirrolila, furanila, tiofuranila, pirimidinila, imidazolila, benzila e (CH2)nCH3; o subscrito n sendo um inteiro selecionado independentemente de 0 a 15;
Figure img0012
em que o subscrito n é um número inteiro independentemente selecionado de 1 a 15;o heteroaromático é um aminopirrol, aminofurano, aminotiofurano ou uma pirimidina;Cada um de R4e R15é independentemente selecionado do grupo consistindo em H, fenila, fenila 2-, 3- ou 4-substituída, 2- ou 3-naftila, pirrolila, furanila, tiofuranila, pirimidinila, imidazolila, benzila, isopropila, terc-butila, (CH2)nCH3 alquenila ou alquinila; o subscrito n é um número inteiro independentemente selecionado de 0 a 15;X é o O, S, CR5R6, NR7, NHCOR8 ou NHSO2R9; cada um de R5, R6 e R7 é independentemente selecionado do grupo consistindo em H, fenila 2-, 3- ou 4-substituída, 2- ou 3-naftila, pirrolila, furanila, tiofuranila, pirimidinila, imidazolila, benzila, isopropila, terc-butila, (CH2)nCH3; cada um de R8 e R9 é independentemente selecionado do grupo consistindo em fenila, fenila 2-, 3- ou 4-substituída, 2- ou 3-naftila ou heteroaromáticos selecionados do grupo compreendendo pirrolila, furanila, tiofuranila, pirimidinila, imidazolila, benzila, (CH2)nCH3; o subscrito n é um número inteiro selecionado independentemente de 0 a 15;Z é H, NO2, OH ou NR10R11, onde cada R10 e R11 é independentemente selecionado do grupo consistindo em H, (CH2)nCH3, NHCOR12, onde R12 é (CH2)nCH3, aromáticos e heteroaromáticos selecionados do grupo consistindo em fenila, naftila, pirrolila, furanila, tiofuranila, pirimidinila, imidazolila e COOR13, onde R13 é H, (CH2)nCH3, aromáticos e heteroaromáticos selecionados do grupo compreendendo fenila, naftila, pirrolila, furanila, tiofuranila, pirimidinila, imidazolila, NHSO2R14, com R14 sendo fenila, fenila 2-, 3- ou 4-substituída, naftila, heteroaromáticos selecionados do grupo consistindo em pirrolila, furanila, tiofuranila, pirimidinila, imidazolila, benzila e (CH2)nCH3; o subscrito n sendo um inteiro selecionado independentemente de 0 a 15;
Figure img0013
formula xem que o heteroaromático é um aminopirrol, aminofurano, aminotiofurano ou uma pirimidina;R4é H, fenila, fenila 2-, 3- ou 4-substituída, 2- ou 3-naftila, pirrolila, furanila, tiofuranila, pirimidinila, imidazolila, benzila, isopropila, terc-butila, (CH2)nCH3 alquenila, alquinila; o subscrito n é um número inteiro selecionado independentemente de 0 a 15;X é o O, S, CR5R6, NR7, NHCOR8 ou NHSO2R9; cada um de R5, R6 e R7 é independentemente selecionado do grupo consistindo em H, fenila 2-, 3- ou 4-substituída, 2- ou 3-naftila, pirrolila, furanila, tiofuranila, pirimidinila, imidazolila, benzila, isopropila, terc-butila, (CH2)nCH3; cada um de R8 e R9 é independentemente selecionado do grupo consistindo em fenila, fenila 2-, 3- ou 4-substituída, 2- ou 3-naftila ou heteroaromáticos selecionados do grupo compreendendo pirrolila, furanila, tiofuranila, pirimidinila, imidazolila, benzila, (CH2)nCH3; o subscrito n é um número inteiro selecionado independentemente de 0 a 15;Z é H, NO2, OH ou NR10R11, onde cada R10 e R11 é independentemente selecionado do grupo consistindo em H, (CH2)nCH3, NHCOR12, onde R12 é (CH2)nCH3, aromáticos e heteroaromáticos selecionados do grupo consistindo em fenila, naftila, pirrolila, furanila, tiofuranila, pirimidinila, imidazolila e COOR13, onde R13 é H, (CH2)nCH3, aromáticos e heteroaromáticos selecionados do grupo compreendendo fenila, naftila, pirrolila, furanila, tiofuranila, pirimidinila, imidazolila, NHSO2R14, com R14 sendo fenila, fenila 2-, 3- ou 4-substituída, naftila, pirrolila, furanila, tiofuranila, pirimidinila, imidazolila, benzila e (CH2)nCH3; o subscrito n sendo um inteiro selecionado independentemente de 0 a 15;
[041] Ainda mais preferencialmente, o derivado com propriedades de inibição da via de sinalização Notch éselecionado do grupo que consiste em
Figure img0014
4-(4-(terc-pentil)fenóxi)anilina,
Figure img0015
4-(4-ciclo-hexilfenóxi)anilina,
Figure img0016
6-(4-((3r,5r,7r-adamantan-1-il)fenóxi)piridin-3-amina,
Figure img0017
6-(3-(terc-butil)fenóxi)piridin-3-amina,
Figure img0018
4-(4-(terc-butil)fenóxi)-3-fluoranilina,
Figure img0019
6-(4-(terc-pentil)fenóxi)piridin-3-amina,
Figure img0020
6-(4-butilfenóxi)piridin-3-amina,
Figure img0021
4-(4-ciclo-hexilfenóxi)-3-fluoranilina,
Figure img0022
3-flúor-4-(4-(terc-pentil)fenóxi)anilina,
Figure img0023
6-(4-(2-metilpentan-2-il)fenóxi)piridin-3-amina,
Figure img0024
4-(4-((3r,5r,7r)-adamantan-1-il)fenóxi)anilina,
Figure img0025
4-(4-((3r,5r,7r)-adamantan-1-il)fenóxi)-3-fluoranilina
Figure img0026
6-(4-ciclo-hexilfenóxi)piridin-3-amina,
Figure img0027
4-(4-(terc-butil)fenóxi)anilina,
Figure img0028
4-(4-isopropilfenóxi)anilina, e
Figure img0029
6-(4-(2,4,4-trimetilpentan-2-il)fenóxi)piridin-3-amina.
[042] A invenção também se refere aos sais ou solvatos do composto I3, compostos I3 quimicamente modificados e derivados dos ditos compostos I3 da invenção. Preferencialmente, esses sais e/ou solvatos são farmaceuticamente aceitáveis. De acordo com a presente invenção, os sais farmaceuticamente aceitáveis são produzidos a partir dos compostos inorgânicos ou orgânicos ácidos, ou compostos inorgânicos ou orgânicos alcalinos. Conforme utilizado na presente invenção, a frase “sal farmaceuticamente aceitável” refere-se a um sal que retém a eficácia biológica dos ácidos e bases livres de um composto especificado e que não é indesejável sob um aspecto biológico ou de outra natureza.
[043] A menos que seja especificado de outra forma, entende-se ainda que todos os isômeros, incluindo enantiômeros, estereoisômeros, rotâmeros, tautômeros e racematos do composto I3, compostos I3 quimicamente modificados e derivados dos ditos compostos I3 da invenção são contemplados como sendo parte dessa invenção. A invenção inclui estereoisômeros na forma opticamente pura e misturados, incluindo misturas racêmicas. Os isômeros podem ser preparados utilizando técnicas convencionais, por reação com materiais de partida opticamente puros ou opticamente enriquecidos, ou por separação de isômeros dos compostos da presente invenção.
[044] "Racematos" refere-se a uma mistura de enantiômeros.
[045] "Estereoisômero"ou "estereoisômeros"referem-se aos compostos que diferem na quiralidade de um ou mais estereocentros. Estereoisômeros incluem enantiômeros e diastereoisômeros. O composto I3, compostos I3 quimicamente modificados e os derivados dos ditos compostos I3 dessa invenção podem existir na forma estereoisomérica caso possuam um ou mais centros assimétricos ou uma ligação dupla com substituição assimétrica e, portanto, podem ser produzidos como estereoisômeros individuais ou como misturas. A menos que seja definido de outra forma, a descrição destina-se a incluir estereoisômeros individuais e misturas. Os métodos para a determinação da estereoquímica e a separação dos estereoisômeros são conhecidos na técnica (consulte a discussão no capítulo 4 de Advanced Organic Chemistry, 4aed., J. March, John Wiley and Sons, New York, 1992).
[046] "Tautômero"refere-se às formas alternativas de um composto que difere em termos da posição de um próton, tais como tautômeros cetoenólicos e iminoenamina, ou as formas tautoméricas dos grupos heteroarila contendo um átomo do anel ligado a uma porção -NH- do anel e uma porção =N do anel, como pirazóis, imidazóis, benzimidazóis, triazóis e tetrazóis.
[047] Uma pessoa versada na técnica saberá que, se o composto I3, os compostos I3 modificados e os derivados dos ditos compostos I3 da invenção contêm um grupo carregado, um contraíon adequado será derivado de um ácido orgânico ou inorgânico. Tais contraíons incluem haleto (tal como cloreto, brometo, fluoreto ou iodeto) sulfato, fosfato, acetato, succinato, citrato, lactato, maleato, fumarato, palmitato, colato, glutamato, glutarato, tartarato, estearato, salicilato, metanossulfonato, benzenossulfonato, sorbato, picrato, benzoato, cinamato e similares. Se a porção polar é um grupo negativamente carregado, um contraíon adequado será selecionado dentre sódio, amônio, bário, cálcio, cobre, ferro, lítio, potássio e zinco, e similares.
[048] Surpreendentemente, o composto químico 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) foi identificado como um potencial inibidor Notch. Curiosamente, verificou-se que a 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) bloqueia a ativação da via mediada por NICD (figura 1). Devido à sua capacidade de atenuar a ativação do Notch mediada por NICD, 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina é capaz de bloquear a proliferação de NICD superexpressando as linhagens celulares leucêmicas, que são resistentes ao DAPT (inibidor da a-Y-secretase, éster t-butílico de N-[N-(3,5-difluorfenacetil-lalanil)]-(S)-fenilglicina t-butílico) (figura 5). O potencial de inibição de Notch da 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) foi adicionalmente confirmado pela infrarregulação dos genes alvo do Notch em linhagens celulares T-ALL humanas (figura 3) e na matriz geneChip da Affymetrix (dados não mostrados). O fato de que a 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) pode induzir a diferenciação das células C2C12 em MHC expressando miotubos multinucleados validou adicionalmente a função anti-Notch da 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) (dados não mostrados). A inibição da via Notch causada pela 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) pode ser recuperada pela superexpressão de MAML1 acima de certos níveis. Por exemplo, 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) foi capaz de bloquear a sinalização com 800 ng de NICD e 1 μg de MAML1 foi transitoriamente introduzido nas células, no entanto, quando a quantidade de MAML1 aumentou até 3 μg, 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) não foi mais capaz de bloquear a ativação da via (figura 2). Esses dados sugerem que a 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) pode interferir com o complexo de ativação de transcrição do Notch, dessa forma inibindo a ativação da sinalização. Estudos de microscopia pela introdução de MAML em níveis onde a 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) ainda pode bloquear a ativação da via mostraram que o tratamento com 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) não impede a colocalização do NICD, MAML1 e CSL/RBP-jk em compartimentos subnucleares (dados não mostrados). Sem se ater à teoria, um dos possíveis mecanismos de ação da 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) poderia ser a interrupção do recrutamento de coativadores de transcrição para o complexo nuclear CSL/RBP-jk-NICD-MAML1. Portanto, o status de coativadores adicionais envolvido na formação do complexo de ativação de transcrição funcional ainda precisa ser determinado. Sob condições fisiológicas, após a formação do complexo CSL/RBP-jk-NICD-MAML1, a histona acetiltransferase CBP/p300 (HAT) é recrutada para o complexo, levando à sua autoacetilação e acetilação da histona 3 e 4.
[049] 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3), bem como os derivados da mesma, foram adicionalmente investigados em um contexto in vivo para determinar seus efeitos inibitórios sobre o Notch, bem como efeitos colaterais em camundongos. A sinalização Notch é essencial para a manutenção da homeostase normal no intestino. A remoção genética ou inibição farmacológica da sinalização de Notch1 e Notch2 no intestino causa metaplasia das células caliciformes no intestino. Dessa forma, observou-se que a 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) bloqueia a sinalização mediada por Notch1 e Notch2, esperou-se que os camundongos tratados com 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina desenvolvessem metaplasia das células caliciformes. Surpreendentemente, o tratamento de camundongos com 25 mg/Kg de 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) durante 7 dias (mais de um mês, no caso de xenotransplantes) não perturbou a homeostasia intestinal e nem apresentou qualquer indicação de acúmulo de células caliciformes (dados não mostrados). Esse resultado inesperado pode ser devido a duas razões. Uma possível explicação poderia ser que a concentração de 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) (25 mg/Kg) usada não é suficiente para bloquear a ativação da via Notch no intestino. No entanto, uma segunda explicação mais plausível poderia ser as diferenças na composição dos complexos de ativação de transcrição a jusante da sinalização de Notch1 e Notch2. Devido a essas possíveis diferenças, a sinalização mediada por Notch1 e Notch2 pode ter diferentes sensibilidades contra o tratamento com 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3).
[050] A sinalização Notch desempenha um papel importante na regulação do sistema hematopoiético. Por exemplo, a sinalização DL4-Notch1 é essencial para o desenvolvimento de células-T no timo. A ativação da via mediada por Notch2 e MAML1 é crítica para o desenvolvimento de células B da zona marginal (MZB) no baço. Para verificar se a 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) pode prejudicar o desenvolvimento da célula MZB dependente de Notch no baço, camundongos C57Bl6 foram tratados com 25 mg/Kg de 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) durante 7 dias e analisados no dia 8. As análises de citometria de fluxo utilizando anticorpos contra B220, CD21 e CD23 revelaram que o tratamento com 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) causa uma redução da porcentagem e números absolutos das células MZB no baço (figura 7).
[051] A atividade anticâncer da 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) foi investigada em modelos de transplante para doenças humanas, nomeadamente, a leucemia de células-T e o câncer de mama. Nesses estudos, a 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) demonstrou uma notável capacidade de retardar a progressão e a metástase da forma muito agressiva da linhagens celulares leucêmicas (figura 8). Além disso, em um estudo preliminar usando o câncer de mama como modelo de tumores sólidos, o tratamento com 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) causou um bloqueio na progressão do tumor em camundongos (figura 9).
[052] O composto químico 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) demonstrou capacidade de bloquear a sinalização mediada por NICD. Portanto, esse composto é útil em cânceres onde tumores induzidos por Notch são resistentes ao tratamento com inibidor da Y-secretase-
[053] A presente invenção também fornece uma composição farmacêutica compreendendo a 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) de fórmula I, ou um de seus derivados com propriedades de inibição da via de sinalização Notch, conforme descrito na presente invenção, ou sais, solvatos, tautômeros, isômeros dos mesmos e um veículo farmaceuticamente aceitável. Quanto aos veículos apropriados, referência pode ser feita à literatura padrão que os descreve, por exemplo, ao Capítulo β5.β do volume 5 de “Comprehensive Medicinal Chemistry”, Pergamon Press 1990, e ao “Lexikon der Hilfsstoffe für Pharmazie, Kosmetik und angrenzende Gebiete”, por H.P. Fiedler, Editio Cantor, β00β. O termo “veículo farmaceuticamente aceitável” significa um veículo ou excipiente que é útil na preparação de uma composição farmacêutica que é geralmente seguro e possui toxicidade aceitável. Veículos aceitáveis incluem aqueles que são aceitáveis para uso veterinário, bem como para uso farmacêutico humano. Um "veículo farmaceuticamente aceitável", conforme usado no presente relatório descritivo e reivindicações, inclui tanto um quanto mais de um tal veículo.
[054] Opcionalmente, a composição farmacêutica da presente invenção compreende ainda um ou mais agentes ativos adicionais selecionados do grupo não limitante formado por agentes quimioterapêuticos para tratamento de câncer. Tais agentes quimioterapêuticos podem ser selecionados do grupo que compreende, por exemplo, altretamina, bleomicina, bussulfano, capecitabina, carboplatina, carmustina, clorambucil, cisplatina, cladribina, crisantaspase, ciclofosfamida, citarabina, dacarbazina, daunorrubicina, doxorrubicina, epirrubicina, etoposídeo, fludarabina, fluoruracila, gencitabina, idarrubicina, ifosfamida, irinotecano, lomustina, melfalana, mercaptopurina, metotrexato, mitomicina, mitoxantrona, oxaliplatina, pentostatina, procarbazina, estreptozocina, taco, temozolomida, tioguanina/tioguanina, tiotepa, topotecano, treossulfano, vimblastina, vincristina, vindesina e vinorrelbina.
[055] Os compostos da invenção, ou seja, a 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) e seus derivados que são usados no tratamento e/ou prevenção de cânceres, podem ser incorporados em uma variedade de formulações e medicamentos para administração terapêutica. Mais particularmente, um ou mais composto(s), como fornecidos nesse documento, podem ser formulados em composições farmacêuticas por combinação com veículos farmaceuticamente aceitáveis adequados, e pode(m) ser formulado(s) em preparações sob as formas sólida, semissólida, líquida ou gasosa, como comprimidos, cápsulas, pílulas, pós, grânulos, drágeas, géis, pastas fluidas, unguentos, soluções, supositórios, injeções, inalantes e aerossóis. Como tal, a administração dos compostos pode ser realizada de várias maneiras, incluindo administração oral, bucal, retal, parenteral, intraperitoneal, intradérmica, transdérmica, intracraniana e/ou intratraqueal. Além disso, o composto pode ser administrado de forma local, ao invés de por via sistêmica, em um depósito ou em uma formulação de liberação sustentada. Os compostos podem ser formulados com excipientes, diluentes ou veículos comuns, e compactados em comprimidos ou formulados como elixires ou soluções para administração oral conveniente, ou administrados pelas vias intramuscular ou intravenosa. Os compostos podem ser administrados pela via transdérmica e podem ser formulados como formas de dosagem de liberação sustentada e similares. Os compostos podem ser administrados sozinhos, em combinação uns com os outros ou podem ser usados em combinação com outros compostos conhecidos. Formulações adequadas para a presente invenção são encontradas em Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company (1985) Philadelphia, PA, 17aedição), que é incorporado por referência neste documento. Além disso, para uma breve revisão dos métodos de liberação de fármaco, consulte Langer, Science (1990) 249:1527-1533, que é incorporado na presente invenção por referência.
[056] A quantidade de um composto conforme indicado na presente invenção, que pode ser combinada com um material portador para produzir uma forma de dosagem única irá variar dependendo da doença tratada, do indivíduo que necessita disso e do modo particular de administração. No entanto, de maneira geral, as doses de unidade adequadas para os compostos da presente invenção podem, por exemplo, conter preferencialmente entre 0,1 mg a cerca de 1000 mg, entre 1 mg a cerca de 500 mg e entre 1 mg a cerca de 300 mg do composto ativo. Em outro exemplo, a dose unitária é entre 1 mg a cerca de 100 mg. Tais doses unitárias podem ser administradas mais de uma vez por dia, por exemplo, 2, 3, 4, 5 ou 6 vezes por dia, porémpreferencialmente 1 ou 2 vezes por dia, de modo que a dosagem total para um adulto humano pesando 70 Kg esteja na faixa de 0,001 a cerca de 15 mg por Kg de peso do indivíduo por administração. Uma dosagem preferencial é de 0,01 a cerca de 1,5 mg por Kg de peso do indivíduo por administração, e tal terapia pode durar várias semanas ou meses e, em alguns casos, anos. Será compreendido, no entanto, que o nível de dose específica para qualquer paciente particular dependerá de uma variedade de fatores, incluindo a atividade do composto específico utilizado; a idade, peso corporal, estado de saúde geral, sexo e dieta do indivíduo a ser tratado; o tempo e a via de administração; a taxa de excreção; outros fármacos que foram anteriormente administrados; e a gravidade da doença específica sendo tratada, tal como é bem compreendido pelas pessoas versadas na técnica. Uma dosagem típica pode ser de um 1 mg a cerca de 100 mg por comprimido, ou 1 mg a cerca de 300 mg uma vez por dia, ou várias vezes por dia, ou uma cápsula ou comprimido de liberação com o tempo administrado uma vez por dia e contendo um teor proporcionalmente maior de ingrediente ativo. O efeito de liberação com o tempo pode ser obtido por materiais de que se dissolvem a diferentes valores de pH, por cápsulas que liberam lentamente por pressão osmótica, ou por qualquer outro meio conhecido de liberação controlada. Pode ser necessário utilizar dosagens fora dessas faixas em alguns casos, como será evidente pelas pessoas versadas na técnica.
[057] A presente invenção fornece ainda um composto da invenção para uso no tratamento e/ou prevenção de cânceres.
[058] Conforme utilizado na presente invenção, os cânceres são preferencialmente cânceres dependentes de Notch e são selecionados do grupo não limitante, compreendendo leucemia linfoblástica aguda de células-T (T-ALL), leucemia mieloide crônica (CML), leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma de células do manto, câncer de mama, câncer de pâncreas, câncer de próstata, melanoma, tumores cerebrais, angiogênese tumoral e câncer colorretal.
[059] Preferencialmente, os compostos da presente invenção (6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3), seus derivados) também podem ser usados no tratamento de cânceres onde os cânceres dependentes de Notch são resistentes ao tratamento com inibidor da Y-secretase- Os tumores humanos dependentes da sinalização Notch resistentes ao tratamento com inibidor da Y-secretase podem ser determinados pelos níveis de NICD, genes alvo de Notch, bem como o status de mutação do receptor Notch e outros componentes da via Notch.
[060] A presente invenção também fornece um método para tratar e/ou prevenir cânceres, o dito método compreendendo administrar a 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3), seus derivados ou a composição farmacêutica da invenção a um indivíduo necessitado disso.
[061] Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método de tratamento de uma doença associada a uma atividade da via de sinalização Notch, o dito método compreendendo administrar a 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3), um derivado do mesmo ou a composição farmacêutica da invenção a um indivíduo necessitado disso.
[062] A dose diária dos compostos da presente invenção irá necessariamente variar dependendo do hospedeiro tratado, da rota particular de administração, da severidade da doença e do tipo da doença a ser tratada. Dessa forma, a dosagem ideal pode ser determinada pelo médico que está tratando qualquer paciente particular. Além disso, observa-se que o clínico ou o médico do tratamento saberá como e quando iniciar, interromper, ajustar ou encerrar a terapia em conjunto com a resposta individual do paciente.
[063] Para qualquer composto usado no método da presente invenção, uma dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente a partir dos ensaios de cultura de células, modelos animais ou microdosagem de indivíduos humanos.
[064] "Tratamento", como usado na presente invenção, refere-se ao tratamento terapêutico e às medidas profiláticas ou preventivas. Indivíduos que necessitam de tratamento incluem aqueles que já estão doentes, como com câncer, bem como aqueles em que o distúrbio, como o câncer, será evitado. Portanto, o mamífero, preferencialmente o ser humano a ser tratado na presente invenção, pode ter sido diagnosticado como tendo o distúrbio, como câncer, ou pode ser predisposto ou suscetível ao distúrbio, como câncer.
[065] O termo "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a uma quantidade de um fármaco eficaz para tratar uma doença ou distúrbio em um mamífero. No caso do câncer, a quantidade terapeuticamente eficaz do fármaco pode reduzir o número de tumores ou células cancerosas, reduzir o tamanho do tumor; inibir (ou seja, tornar mais lento até certo ponto e, de preferência, interromper) a infiltração de células cancerosas em órgãos periféricos; inibir (ou seja, tornar mais lento até certo ponto e preferencialmente interromper) metástases tumorais; inibir, até certo ponto, o crescimento tumoral; e/ou aliviar, até certo ponto, um ou mais dos sintomas associados com o câncer. Até a medida que os compostos da presente invenção podem evitar o crescimento e/ou matar as células cancerosas existentes, ele pode ser citostático ou citotóxico. A frase "quantidade terapeuticamente eficaz"é usada aqui para significar uma quantidade suficiente para evitar, ou preferencialmente reduzir em pelo menos cerca de 30 por cento, preferencialmente em pelo menos 50%, preferencialmente em pelo menos 70 por cento, preferencialmente em pelo menos 80% ou preferencialmente em pelo menos 90% uma alteração clinicamente significativa no crescimento, progressão ou atividade mitótica de uma massa celular alvo, grupo de células cancerosas, ou outro aspecto da patologia.
[066] Opcionalmente, os compostos da presente invenção podem ser usados contra doenças de proliferação celular em combinação (por exemplo, ao mesmo tempo ou um após o outro) com tratamentos convencionais, tais como radioterapia padrão e/ou quimioterapia padrão. A radioterapia e quimioterapia padrão também podem compreender quimiorradioterapia concomitante.
[067] Portanto, opcionalmente, a radioterapia e/ou quimioterapia padrão pode(m) ser realizada(s) antes, simultaneamente ou após a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto da presente invenção, ou composições farmacêuticas contendo o mesmo.
[068] O termo “quimiorradioterapia concomitante” é usado quando esses dois tratamentos (quimioterapia e radioterapia) são administrados ao mesmo tempo ou quase ao mesmo tempo, por exemplo, um após o outro, ou no mesmo dia, etc.
[069] O termo "radioterapia padrão"refere-se ao uso de radiação ionizante como parte do tratamento contra o câncer para controlar células malignas. Preferencialmente, a radiação ionizante é radiação y. Também é comum combinar radioterapia com cirurgia, quimioterapia, terapia hormonal ou combinações das mesmas. Os tipos de câncer mais comuns podem ser geralmente tratados com radioterapia. A intenção do tratamento preciso (curativo, adjuvante, neoadjuvante ou paliativo) dependerá do tipo de tumor, localização e estágio, bem como do estado geral de saúde do indivíduo que necessita disso.
[070] O termo "quimioterapia padrão" geralmente refere-se a um tratamento de um câncer utilizando agentes quimioterapêuticos/químicos específicos. Um agente quimioterapêutico refere-se a um agente farmacêutico geralmente usado no tratamento de câncer. Os agentes quimioterapêuticos para tratar câncer incluem, por exemplo, altretamina, bleomicina, bussulfano, capecitabina, carboplatina, carmustina, clorambucil, cisplatina, cladribina, crisantaspase, ciclofosfamida, citarabina, dacarbazina, daunorrubicina, doxorrubicina, epirrubicina, etoposídeo, fludarabina, fluoruracila, gencitabina, idarrubicina, ifosfamida, irinotecano, lomustina, melfalana, mercaptopurina, metotrexato, mitomicina, mitoxantrona, oxaliplatina, pentostatina, procarbazina, estreptozocina, taco, temozolomida, tioguanina/tioguanina, tiotepa, topotecano, treossulfano, vimblastina, vincristina, vindesina ou vinorrelbina.
[071] Quando um agente quimioterapêutico é usado em combinação com um composto de acordo com a presente invenção, então ele pode ser usado sob a forma de um medicamento que contém uma combinação desses dois agentes, para administração simultânea, ou podem ser utilizados sob a forma de formas de dosagem separadas, cada um contendo um dos agentes e, em último caso, as formas de dosagem individuais podem ser utilizadas, por exemplo, sequencialmente, ou seja, uma forma de dosagem com o composto da invenção, seguido por uma forma de dosagem contendo o agente quimioterapêutico (ou vice-versa). Essa modalidade de duas formas de dosagem separadas pode ser concebida e fornecida sob a forma de um kit.
[072] Também de maneira opcional, os compostos da presente invenção podem ser usados contra doenças de proliferação de células, como cânceres, em combinação com a remoção convencional de uma massa tumoral, por exemplo, por ressecção segmentar (biópsia ou ressecção bruta).
[073] O termo "remoção de uma massa tumoral" refere-se à remoção, ablação ou ressecção de uma massa tumoral de um indivíduo. A remoção pode ser química, por radiação ou cirúrgica. Preferencialmente, a dita remoção é cirúrgica, tal como remoção ou ressecção. A ressecção pode ser "ressecção segmentar" (ou segmentectomia), um procedimento cirúrgico para remover parte de um órgão ou glândula de um indivíduo. Ela também pode ser usada para remover um tumor e o tecido normal ao seu redor. O agente de diminuição de volume também ser usado para remover a massa tumoral. O termo "agente de diminuição de volume" inclui qualquer molécula (por exemplo, química, biológica) ou qualquer agente externo/ambiental (por exemplo, irradiação gama) ou cirurgia tradicional, que permitiria matar as células cancerosas da massa tumoral (por exemplo, as células FL10e FL1-, como mencionado acima).
[074] Outro objeto da presente invenção é um kit que compreende uma ou mais doses de 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3), ou um dos seus derivados tendo propriedades de inibição da via de sinalização Notch, ou a composição farmacêutica da presente invenção para uso em um método para tratamento e/ou prevenção de cânceres. O kit pode abranger adicionalmente uma ou mais doses de um agente quimioterapêutico. Opcionalmente, o kit também pode compreender reagentes e/ou instruções de uso.
[075] Geralmente, o kit compreende um recipiente e um rótulo ou bula em ou associado com o recipiente. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, etc. Os recipientes podem ser formados a partir de uma variedade de materiais, como vidro ou plástico. O recipiente retém a composição farmacêutica que é eficaz para o tratamento da condição e pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frasco com uma tampa perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). O rótulo ou bula indica que a composição é usada para tratar a condição de escolha, como o câncer.
[076] A presente invenção também se refere ao uso dos compostos da invenção para inibir a via de sinalização Notch in vitro ou in vivo nas células. Em geral, as ditas células são células cancerosas.
[077] É também previsto um método de tratamento de um indivíduo para o câncer dependente de Notch, que compreende i) determinar nas células cancerosas obtidas a partir de uma amostra biológica do dito indivíduo se o câncer é dependente da via de sinalização Notch e ii) tratar o dito indivíduo com base em se o câncer é câncer dependente de Notch através da administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) de fórmula I, ou um de seus derivados, tendo propriedades de inibição da via de sinalização Notch, ou uma composição farmacêutica da invenção.
[078] Geralmente, a dependência da via de sinalização Notch em células cancerosas é determinada por qualquer método conhecido na técnica. Como exemplo, esse método pode consistir em ensaios de atividade do complexo da Y-secretase in vitro, como descrito na presente invenção.
[079] Esse método de tratamento pode compreender ainda a administração de pelo menos um tratamento de câncer convencional. O tratamento de câncer convencional é administrado antes, simultaneamente ou após a administração da quantidade terapeuticamente eficaz de 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) de fórmula I, ou um de seus derivados possuindo propriedades de inibição da via de sinalização Notch, ou a composição farmacêutica da invenção.
[080] Geralmente, o tratamento de câncer convencional consiste em radioterapia e/ou quimioterapia.
[081] A presente invenção refere-se também ao uso dos compostos da invenção em um método para induzir a apoptose em uma célula, in vitro ou in vivo, por indução da parada do ciclo celular G0/G1.
[082] As pessoas versadas na técnica perceberão que a invenção descrita neste documento é suscetível a variações e modificações diferentes daquelas especificamente descritas. É para ser compreendido que a invenção inclui todas as tais variações e modificações sem se afastar do espírito ou das suas características essenciais. A invenção também inclui todas as etapas, características, composições e compostos referidos ou indicados neste relatório descritivo, individualmente ou coletivamente, e quaisquer e todas as combinações ou quaisquer duas ou mais das ditas etapas ou características. A presente divulgação é, portanto, para ser considerada em todos os aspectos ilustrados e não de modo restritivo, o escopo da invenção sendo indicado pelas reivindicações em anexo, e todas as alterações que vêm dentro do significado e faixa de equivalência se destinam a ser aqui englobadas.
[083] Várias referências são citadas ao longo desse relatório descritivo, cada uma das quais é incorporada na presente invenção por referência em sua totalidade.
[084] A descrição acima será mais plenamente compreendida com referência aos exemplos a seguir. Tais exemplos são, no entanto, exemplares dos métodos da prática da presente invenção e não se destinam a limitar o escopo da invenção. EXEMPLOS Exemplo 1 Constructos e ensaios do gene repórter:
[085] DNAc do camundongo DL4-IRES dsRED foi clonado em um vetor pENTR1 (Invitrogen®) e foi então transportado em um vetor de destino lentiviral usando a estratégia de clonagem Gateway (Invitrogen). Um promotor da fosfoglicerato quinase (PGK) direcionou a expressão da proteína DL4. As partículas de lentivírus DL4 foram produzidas em células 293T pela cotransfecção do vetor de lentivírus DL4, o plasmídeo de expressão Gag/pol e o plasmídeo que codifica as proteínas do envelope viral. Para superexpressar a proteína Notch1, o DNAc do Notch1 completo de camundongo foi um clonado em um vetor de puromicina pCDNA3.1-IRES. O DNAc Notch1 foi clonado à montante da puromicina IRES entre os sítios de restrição HindIII e XbaI. Um promotor CMV controlou a expressão da proteína Notch1.
[086] Para medir a ativação da sinalização Notch, as sequências de ligação ao DNA de consenso CSL/RBP-jk foram clonadas em uma conformação de cabeça a cauda no vetor da pGL4 luciferase (Promega), desse modo denominado vetor 12xCSL/RBP-jjk luciferase. A fim de determinar a ativação da via Notch no ensaio de varredura de composto químico, as sequências de ligação ao DNA de consenso 12x CSL/RBP-jk foram clonadas no vetor pGL4.26.luciferase (Promega). Como um controle interno para a eficiência de transfecção, o vetor renila SV40 foi usado (Promega).
[087] Os estudos da superexpressão de NICD-GFP foram realizados usando o plasmídeo de expressão pEGFP-C1-NICD. O plasmídeo FLAG-CMV2 expressando MAML1-FLAG foi um presente do Dr. Lizi Wu, da Escola de Medicina de Harvard, em Boston. Geração de células HeLa estáveis DL4 e N1:
[088] A fim de gerar as linhagens celulares estáveis DL4 e N1, as células HeLa foram comprados da ATCC (n° de catálogo CCL-2). Para gerar as linhagens estáveis DL4, as células foram transduzidas com partículas de lentivírus DL4. Os clones estáveis de DL4 foram selecionados usando puromicina. Clones de alta expressão de DL4 foram separados usando anticorpos contra DL4 com a separação de células ativada por fluorescência (FACS). Para gerar a linhagem estável N1, as células foram transfectadas com um plasmídeo pCDNA3.1+ (Invitrogen) contendo Notch1 completo de camundongo sob o controle do promotor CMV. Para selecionar os clones que expressam Notch1, um cassete de puromicina IRES foi clonado a jusante do DNAc do Notch1. As células HeLa expressando altos níveis de Notch1 foram enriquecidas por FACS usando anticorpos anti-Notch1. As Células HeLa DL4 e N1 foram cultivadas em DMEM (GIBCO, Invitrogen), FCS a 10% e puromicina 10 ug/mL (Sigma).
Varredura de Alta Produtividade e Análises de Dados:
[089] Para a varredura da biblioteca química, o ensaio de cocultura foi realizado da seguinte forma. As células HeLa N1 foram cotransfectadas em placas de cultura de tecido de 10 cm com 16 μg do vetor pGL4.26.12xCSL.luciferase/placa, 4 μg de plasmídeo de expressão Notch1/placa e 200 ng de vetor renila SV40/placa. As células HeLa DL4 e N1 foram soltas da placa usando EDTA 0,5 mM (1XPBS). Ambas as populações de células foram contadas e misturadas em uma razão 1:1 (5.000:5.000células/poço em uma placa de 384 poços) e dispensadas em placas de 384 poços (brancas de fundo claro, da Corning) usando um dispensador de placas multidrop Combi. As placas de ensaio foram pré-dispensadas (usando o manipulador de líquido Biomek 3000 automatizado) com bibliotecas de compostos químicos (Microsource NIMDS, Maybridge Hitfinder e Prestwick) para fornecer uma concentração final de 10 μM. O volume final do ensaio foi 22 μLs. Vinte e quatro horas depois, o meio de crescimento foi aspirado e as células foram lisadas com 1x tampão de lise passiva durante 10 minutos em temperatura ambiente. A atividade da luciferase foi medida utilizando o reagente de ensaio luciferase II e os valores de renila foram determinados utilizando o reagente Stop and Glow (sistema de ensaio da luciferase duplo, n° Cat. E1980, Promega). As leituras de luciferase e renila foram feitas usando o leitor multiplacas Tecan® F500 (Tecan). Todas as etapas de manipulação de líquidos (aspiração do meio, dosagem do tampão de lise passiva, reagente do ensaio da luciferase II e reagentes Stop and Glow) foram realizadas usando o manipulador de líquidos ELF406.
[090] As análises de dados foram realizadas utilizando o software de análises elaborado internamente na Instalação de Triagem Biomolecular (Biomolecular Screening Facility) da Ecole Polytechnique Fédérale De Lausanne (EPFL).
Extração de RNA
[091] O RNA total foi extraído das células usando o kit de extração TRIzol® (Invitrogen). Em resumo, 1 x 106células foram lavadas com 1x PBS gelado e foram lisadas em 1 mL de solução de TRIzol® durante 5 minutos em temperatura ambiente para dissociar os complexos de nucleoproteína. As células lisadas foram, então, tratadas com 200 μL de clorofórmio e agitadas vigorosamente durante 15 a 30 segundos, e incubadas em temperatura ambiente durante 2 a 3 minutos. As amostras foram centrifugadas a 14000 rpm utilizando a centrífuga de bancada durante 10 minutos a 4 °C. Após a centrifugação, fase aquosa superior foi transferida para novos tubos eppendorf. Para precipitar o RNA total, 500 μL de álcool isoamílico foi adicionado à fase aquosa separada e incubado em temperatura ambiente durante 10 minutos. Um pélete de RNA foi obtido por centrifugação das amostras a 4 °C durante 10 minutos. O pélete de RNA obtido foi lavado com 1 mL de etanol 75% gelado e foi centrifugado a 14000 rpm a 4 °C. O pélete de RNA foi seco do excesso de etanol e ressuspenso em 40 μL de água DPEC.
Síntese de cDNA:
[092] O RNA total extraído da célula foi usado para sintetizar o DNAc por reação de transcrição reversa. A transcrição reversa foi realizada usando SuperScript™ RT (Invitrogen). A concentração de RNA foi medida utilizando o espectrofotômetro NanoDrop®ND-1000 (Witec AG) e 500 ng do RNA total foi misturado com uma mistura de 10 mM de dNTPs e 100 ng de iniciadores aleatórios. A mistura reacional foi incubada a 65 °C durante 5 minutos e foi rapidamente incubada em gelo durante 1 minuto. Após incubação em gelo, 5x do tampão da primeira fita e TDT 0,1 M foram adicionados, e a mistura foi incubada durante 2 minutos a 25 °C. Para iniciar a reação de transcrição reversa, β00 U de SuperScrip™ II RT foi adicionado à mistura reacional e incubado a 42 °C durante 50 minutos. A reação foi interrompida por incubação da mistura reacional a 75 °C durante 15 minutos.
Análise de Western blot:
[093] As células foram lisadas em tampão RIPA (Tris.Cl 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, nonidet P-40 1%, desoxicolato de sódio 0,5% e SDS 0,1%) durante 30 minutos a 4 °C. As células lisadas foram centrifugadas para remover os fragmentos a 14000 rpm a 4 °C. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo eppendorf. A concentração da proteína foi determinada pelo ensaio de Bradford utilizando o espectrofotômetro (Ultrospec 3000 pro) . 40 μg da proteína foram desnaturados em 1x tampão de carregamento de gel SDS (Tris.Cl 100 mM, pH 6,8, DTT 200 mM, SDS 4%, bromofenol 0,2% e glicerol 20%) por aquecimento a 99 °C durante 5 minutos. As amostras de proteína desnaturada foram armazenadas em gelo até o carregamento no gel de acrilamida. As amostras foram feitas em um gel de acrilamida de 8% a 10% em tampão de eletroforese de Tris-glicina (Tris 25 mM, glicina 250 mM, SDS 0,1%). Após a separação no gel de acrilamida, as amostras de proteína foram transferidas para sobre a membrana PVDF (laboratório PEQ, número de catálogo 39-3010) usando o tampão de transferência (glicina 39 mM, base Tris 48 mM, SDS 0,037% e metanol 20%).
[094] Para o immunoblot, as membranas foram bloqueadas com 5% de leite e incubadas de um dia para o outro com anticorpos primários a 4 °C. As membranas foram lavadas com 1x TBST (1x TBS + tween 20 0,5%) durante 5 minutos (3 vezes) e incubadas com anticorpos secundários conjugados com HRP durante uma hora em temperatura ambiente. O sinal foi detectado com substrato quimiluminescente Super Signal West (Thermo Scientific, número de catálogo 34077).
Marcação por Imunofluorescência:
[095] Para efetuar a marcação por imunofluorescência, as células HeLa ou células C2C12 foram cultivadas sobre lamínulas. As células foram lavadas com 1X PBS gelado, fixas com PFA 4% durante 5 minutos em temperatura ambiente e permeabilizadas usando Triton X-100 0,3%. As células subsequentemente permeabilizadas foram bloqueadas durante 20 minutos com BSA 1% durante 20 minutos em temperatura ambiente. As células foram incubadas com anticorpos primários adequados em temperatura ambiente. Os anticorpos secundários conjugados com Alexa Fluor-488 foram usados para detectar os anticorpos primários. As células foram contracoradas com DAPI e montadas em meios de montagem para fluorescência. As imagens fluorescentes foram visualizadas e capturadas usando o microscópio Zeiss Axioplan na instalação central de bioimagem e óptica na EPFL. Tabela 1: Lista dos anticorpos e diluições de trabalho.
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Ensaio de diferenciação do mioblasto C2C12:
[096] As células C2C12 foram cultivadas sobre lamínulas revestidas com colágeno na presença de meio de crescimento (soro 10%). Para induzir a diferenciação do mioblasto, as células foram cultivadas até 100% de confluência durante 3 dias na presença dos meios de diferenciação (soro de cavalo 2%) ou na presença de meio de crescimento + inibidores Notch. Após 3 dias, as células foram lavadas com 1X PBS gelado e fixas com PFA 4%. A marcação por imunofluorescência foi realizada usando o anticorpo anti-MHC, conforme explicado na secção 2.2.6 (Marcação por imunofluorescência).
Análises de citometria de fluxo:
[097] As análises de separação de células ativada por fluorescência (FACS) foram realizadas na plataforma instrumental de ADP CyAn™ para citometria de fluxo na instalação central de citometria de fluxo da EPFL. A expressão de DL4 e Notch1 nas células HeLa DL4 e N1 foi determinada utilizando os anticorpos anti-DL4 e anti-N1, respectivamente. O desenvolvimento de células-T no timo foi investigado usando os anticorpos contra CD4, CD8 e TCRβ. O desenvolvimento da célula MZB foi monitorado usando os anticorpos contra B220, CD21 e CD23. Em suma, uma única suspensão de células foi preparada a partir do timo e do baço. 1 x 106células foram suspensas em 50 μL de meio de coloração (HBSS suplementado com NCS 2% e HEPES 25 mM) e coradas com combinações de anticorpo adequadas por incubação em gelo durante 30 minutos.
[098] Para quantificar a porcentagem de células apoptóticas, a coloração com AnexinaV e 7AAD foi realizada. As células do Timo foram suspensas em 300 μL de 1x tampão de ligação AnexinaV (BD Biosciences, San Diego, EUA) e incubadas com 10 μL de anticorpo AnexinaV-Cy5 e 10 μL de 7AAD (BD Biosciences, San Diego, EUA). As amostras foram incubadas durante 15 minutos em temperatura ambiente. FACS foram realizados em uma hora de coloração dos anticorpos.
[099] As análises de citometria de fluxo foram feitas em células vivas pela passagem da difusão para a frente (FSC) e dispersão lateral (SSC). Os dados foram analisados com o software FlowJo (Tree Star, Ashland, OR).
Ensaio de proliferação de Alamar blue:
[0100] Os ensaios de proliferação de Alamarblue® foram realizados para determinar a cinética de crescimento das células tratadas com inibidor Notch. Alamar blue® consiste em um substrato de resazurina permeável a células. Em células metabolicamente ativas e em proliferação, a resazurina é convertida em resorufina devido a um potencial de redução intrínseco das células vivas e produz uma fluorescência vermelha. Desse modo, a produção de resorufina serve como um indicador da viabilidade da população de células.
[0101] Os ensaios de proliferação foram realizados por semeadura de 5000 células/poço em uma placa de 96 poços. As células foram tratadas com DMSO ou inibidores Notch para intervalos de tempo diferentes. Cada tratamento para cada intervalo de tempo foi realizado em 8 replicatas. Para determinar a cinética de crescimento, 10 mL de Alamar blue® (Invitrogen) foi adicionado a cada poço e incubado durante 4 horas. A leitura de Alamarblue foi realizada usando o leitor multiplacas Tecan F500 (Tecan).
Coloração com Hematoxilina e Eosina:
[0102] Os órgãos foram coletados, fixados em paraformaldeído a 4% (PFA) de um dia para o outro a 4 °C e incorporados em parafina. Os cortes de tecido tiveram a gordura removida e foram hidratados usando concentração decrescente de etanol (100% a 70%) e, finalmente, em água destilada. As seções foram coradas com hematoxilina durante 5 minutos, lavadas com álcool ácido durante cerca de 20 segundos e, em seguida, lavadas em água corrente durante 10 minutos. As seções foram, em seguida, coradas com eosina durante 5 minutos, lavadas em água e desidratadas usando concentração crescente de etanol (70% a 100%) e limpas em solução de xileno. As seções foram montadas usando solução de montagem. As seções coradas com hematoxilina e eosina foram visualizadas e as imagens foram capturadas utilizando microscópio Leica DMI4000. Coloração com Alcian blue:
[0103] O tecido intestinal foi esguichado com 1x PBS gelado, fixado em PFA 4%. Os tecidos foram imersos em parafina e cortados até uma espessura de 4 mícrons. As seções intestinais foram desparafinizadas a 60 °C e hidratadas com concentração decrescente de álcool (100% a70%) e, finalmente, elas foram lavadas em água destilada. A coloração com Alcian blue foi realizada durante 30 minutos em temperatura ambiente, lavada em água corrente e, finalmente, contramarcada em solução vermelho rápida nuclear durante 5 minutos. As secções de tecido foram, em seguida, lavadas em água corrente, desidratadas em álcool a 100% e lavadas em solução de xileno. As seções montadas foram, em seguida, visualizadas e as imagens foram capturadas utilizando o microscópio Leica DMI4000.
Camundongos experimentais:
[0104] Os camundongos foram mantidos e criados nas instalações para animais da EPFL, em Lausane. Os camundongos C57Bl6 foram usados para avaliar a toxicidade intestinal dos compostos químicos. Os camundongos MMTV-ErbB2/Neu-IRES Cre (fundo de FVB) foram obtidos do Dr. William J Muller, da Universidade McGill, Montreal, e genotipados utilizando os iniciadores específicos MMTV-ErbB2/Neu (Ursini-Siegel et al., β008) . Os camundongos NOD/SCIDYC-/-foram comprados do The Jackson Laboratory (EUA) e foram mantidos e criados em instalações animais da EPFL de Lausane.
Toxicidade intestinal e efeito no desenvolvimento das células B da zona marginal:
[0105] Os camundongos C57Bl6 foram injetados intraperitonealmente (ip) com óleo ou 25 mg/Kg de I3 ou 10 mg/Kg de CPA, uma vez por dia durante 5 a 7 dias. Os camundongos foram pesados usando uma escala de pesagem no dia 0, dia 3 e dia 5. No dia 8, o tecido intestinal, o baço e o timo foram coletados para análise.
Ensaio de transplante de tumor:
[0106] As linhagens celulares leucêmicas humanas RPMI 8402 e HPB ALL foram transduzidas com um lentivírus contendo o gene da luciferase constitutivamente expresso a jusante de um promotor CMV. As linhagens celulares leucêmicas humanas RPMI 8204 (0,5 a 1 x 106células) e HPB ALL (1 x 106) foram suspensas em 100 μL de 1x PBS gelado e mantidas em gelo até o transplante. Os camundongos NOD/SCIDYC-/-foram transplantados com as linhagens celulares leucêmicas humanas por injeção intravenosa (iv). Os camundongos foram monitorados quanto ao desenvolvimento do tumor utilizando o sistema de processamento de imagens de organismos vivos Caliper IVIS (Xenogen). Em resumo, a luciferina do substrato da luciferase (Biosynth, L-8820) foi dissolvida em 1x PBS e foi injetada (intraperitonealmente) nos camundongos a uma concentração de 150 mg/Kg de peso corporal. Os camundongos foram visualizados 5 minutos após a injeção de luciferina usando o sistema de processamento de imagens de organismos vivos Caliper IVIS.
[0107] Nos dias 13 a 15, os camundongos foram tratados com óleo ou 25 mg/Kg de I3 diariamente. As imagens foram captadas ao término dos experimentos.
[0108] Os tumores de mama primários MMTV-ErbB2/Neu foram coletados dos camundongos e uma única suspensão de células foi preparada. 1 x 106células tumorais primárias foram suspensas em 50 μL de 1X PBS e foram mantidas em gelo. Camundongos receptores FVB de três semanas de idade tiveram o epitélio endógeno limpo e as células tumorais foram injetadas na gordura infrapatelar vazia. O desenvolvimento do tumor nos camundongos receptores foi monitorado e os volumes de tumor foram medidos utilizando um paquímetro digital. Os volumes de tumor foram calculados utilizando a fórmula a seguir: 2 x comprimento x (largura)2. Após o tumor alcançar um volume de cerca de 100 mm3, os camundongos receptores foram tratados com óleo ou 25 mg/Kg de I3 em dias alternados. Desenvolvimento do ensaio
[0109] A fim de identificar novos moduladores da via Notch, os depositantes estabeleceram um ensaio de cocultura no qual as células HeLa expressando o ligante DL4 foram cultivadas com células HeLa N1, ativando dessa forma a via Notch. O uso de um sistema de cocultura de células HeLA DL4 e N1 imita as condições fisiológicas da comunicação entre células, entre o ligante e as células que expressam o receptor. A geração in vitro de um sistema de ensaio receptor-ligante controlado permitiu que os depositantes modificassem e monitorassem a intensidade do sinal Notch pelos inibidores da Y-secretase- O cocultura de célula HeLa DL4:N1 ativa a sinalização Notch
[0110] Para configurar um ensaio de cocultura, os depositantes estabeleceram linhagens celulares HeLa estáveis expressando DL4 e N1. Em resumo, as células HeLa foram transduzidas com um lentivírus contendo DNAc de DL4 a jusante do promotor PGK. A população de células expressando D4 foi enriquecida por separação de células ativada por fluorescência. Da mesma forma, a linhagem de células HeLa N1 estável foi estabelecida usando um plasmídeo contendo o DNAc de N1 de camundongo, seguido por um cassete de seleção de puromicina IRES. Esse sistema permitiu que os depositantes selecionassem apenas clones expressando Notch1 quando foram selecionados usando puromicina. Os níveis de expressão das proteínas DL4 e N1 nas respectivas linhagens celulares foram detectados usando anticorpos anti-DL4 e anti-N1. A quantificação dos níveis de proteína por citometria de fluxo mostrou um alto nível de expressão de DL4 e N1 em comparação com as células HeLa parentais (dados não mostrados).
[0111] Para avaliar o potencial de ativação da via Notch das linhagens celulares estáveis, células HeLa DL4 e N1 estáveis (DL4-HeLa e N1-HeLa, respectivamente) foram cocultivadas na razão 1:1 em uma placa de 6 poços e se multiplicaram até a confluência. As células cocultivadas foram tratadas com DMSO ou DAPT (10 μM) durante 24 horas. Para fins de comparação, as células HeLa parentais também foram cocultivadas com células DL4-HeLa e foram cultivadas na presença ou ausência de DAPT durante 24 horas. As análises de Western blot para a forma ativa de Notch1 (NICD) utilizando anticorpos VAL1744 foram realizadas e revelou apenas níveis modestos de NICD quando as células HeLA parentais foram cocultivadas com células HeLa DL4 (dados não mostrados), representando um nível baixo de Notch1 endógeno nas células HeLa. Por outro lado, na ausência do ligante (células DL4-HeLa) ou na presença de GSI (DAPT), os níveis de NICD não foram detectados, indicando uma perda de sinalização Notch (dados não mostrados). No entanto, as coculturas de células DL4- e N1-HeLa revelaram níveis significativamente mais elevados de NICD, que pode ser bloqueado por tratamento com DAPT (dados não mostrados). A introdução transitória do DNAc de Notch1 completo nas células HeLa N1 aumentaram ainda mais a robustez do ensaio de cocultura, tal como é indicado pelo aumento dos níveis de proteína NICD (dados não mostrados). A inibição da clivagem de N1 com DAPT pode anular o aumento na atividade de sinalização Notch (dados não mostrados). Esses resultados confirmaram que altos níveis de ativação da via Notch poderiam ser alcançados no ensaio de cocultura de DL4:N1, que responde à inibição do GSI.
[0112] O estabelecimento do ensaio de cocultura DL4:N1 em um formato de placa de 6 poços permitiu que os depositantes avaliassem se a interação receptor-ligante mediou a ativação de sinalização Notch. O tratamento de GSI (DAPT) do sistema de cocultura pode bloquear a sinalização Notch desencadeada por interação receptor-ligante.
Ensaio de compatibilidade de varredura de alta produtividade (HTS)
[0113] Inicialmente, o ensaio de cocultura de DL4:N1foi feito em uma placa de 6 poços. Para configurar uma varredura de alta produtividade (HTS), o sistema de ensaio foi adicionalmente otimizado para funcionar robustamente em um formato de placa de 384 poços.
[0114] O ensaio teve a escala reduzida para um formato de placa de 384 poços para efetuar a varredura das bibliotecas de compostos químicos. Para fazer isso, as células HeLa-N1 foram transfectadas com plasmídeos repórteres e o vetor de expressão N1. Doze horas mais tarde, os compostos químicos foram colocados em uma prato de 384 poços, juntamente com DMSO e DAPT como controles negativo e positivo. As células HeLa DL4 e N1 foram misturadas na razão de 1:1 (5000:5000 células/poço) e adicionadas a placas de 384 poços usando o dispensador de placas multidropCombi. A leitura da luciferase foi medida usando o sistema de ensaio da luciferase duplo. Para otimizar e determinar a reprodutibilidade do ensaio, metade da placa foi tratada com DMSO (192 poços) e a segunda metade foi tratada com DAPT 10 μM (192 poços) . O tratamento com DAPT causou uma infrarregulação de 10 vezes da ativação de sinalização Notch. O valor Z' para esse ensaiofoi maior que 0,5. Um valor Z'> 0,5 confirma a confiabilidade e a reprodutibilidade dos ensaios para uma campanha HTS. Exemplo 26-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) como um novo inibidor da sinalização NotchI3 inibe a ativação mediada por NICD da sinalização Notch:
[0115] Para validar a atividade inibitória do Notch e determinar o valor IC50 do composto I3, utilizou-se o sistema de ensaio de cocultura DL4:N1. As células no ensaio de cocultura foram tratadas durante 24 horas, com uma concentração crescente de I3 (2 a 10 μM). A ativação da via Notch foi medida usando um ensaio repórter da luciferase induzido por Notch. Como mostrado na figura 1A, I3 bloqueia a sinalização Notch de forma dependente da concentração com um valor IC50 na faixa de μM inferior.
[0116] Para determinar se a superexpressão de NICD pode recuperar a inibição mediada por I3 da sinalização Notch, as células HeLa foram cotransfectadas com um plasmídeo de expressão NICD e o constructo de luciferase 12xCSL. As células transfectadas foram tratadas com uma concentração crescente de I3 e DAPT. Surpreendentemente, o tratamento das células expressando NICD com I3 poderia bloquear a ativação da via de forma dependente da dose, enquanto que DAPT não teve efeito sobre a ativação de sinalização (figura 1B). Esses dados sugerem que a inibição mediada por I3 da via Notch é devido à sua atividade a jusante do evento de clivagem S3.
[0117] Em seguida, os depositantes investigaram se I3 poderia bloquear a ativação da via por meio de outros receptores Notch ou se ele é específico para a sinalização de Notch1. Para abordar esse ponto, um ensaio de cocultura foi aqui usado, onde a sinalização Notch foi ativada através de pares de ligante-receptor DL4:N1 ou DL4:N2. O tratamento de células nesses dois ensaios de cocultura com I3 causou uma inibição da sinalização Notch por meio dos pares de ligante-receptor DL4:N1 e DL4:N2 (figura 1C). Da mesma forma, I3 também poderia bloquear a ativação da via pelo domínio intracelular de Notch1 (NICD) e pelo domínio intracelular de Notch2 (ICD-N2), sugerindo que o I3 não é específico para a ativação mediada por NICD (figura 1D).A 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina não bloqueia localização nuclear do NICD:
[0118] Dados in vitro de células HeLa transfectadas com NICD sugeriram que a 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) bloqueia a sinalização Notch atuando a jusante do evento de clivagem S3. Isto levanta várias possibilidades sobre o mecanismo de ação da 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3). Por exemplo, o tratamento com 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) poderia comprometer a localização nuclear do NICD. Um segundo mecanismo possível de inibição poderia ser alvo de um ou mais componentes individuais do complexo de ativação de transcrição no núcleo. Para testar se a 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) tem um impacto no transporte nuclear de NICD, células HeLa foram transfectadas com um constructo de fusão NICD-GFP e tratadas com DMSO e 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3). Isso permitiu que os depositantes acompanhassem o transporte da proteína de fusão dentro da célula. Em paralelo, a inibição da via mediada por 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) foi determinada pela medição da luciferase induzida por Notch (dados não mostrados). Estudos de microscopia mostraram que, em células tratadas com DMSO, a proteína de fusão NICD-GFP é translocada para o núcleo, o que não foi perturbado após o tratamento com 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (dados não mostrados). Estes dados eliminam a exclusão nuclear do NICD como um mecanismo de ação da I6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3). A superexpressão de MAML1 acima de um determinado limiar pode recuperar a inibição da sinalização Notch induzida por 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3):
[0119] Uma vez que o bloqueio mediado pela 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) da sinalização Notch não implica na exclusão nuclear de NICD, os depositantes abordaram se a 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) bloqueia a interação e, dessa forma, a localização subnuclear de NICD, MAML1 e CSL-RBP-jk (todas as partes do complexo de ativação de transcrição nuclear). Para resolver esse problema, as células HeLa foram cotransfectadas com 800 ng do plasmídeo NICD-GFP, 1 μg do vetor de expressão MAML1-FLAG e cultivadas sobre lamínulas. As células HeLa transfectadas foram tratadas com DMSO ou 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) (10 μM) durante 24 horas. A capacidade da 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina para bloquear a ativação do Notch nessa concentração de NICD e MAML1 foi verificada pela medição da luciferase induzida pelo Notch (dados não mostrados). Após o tratamento, as células foram fixadas com PFA 4%, bloqueadas com BSA 1% e marcadas com anticorpos contra FLAG marcado com MAML1 e CSL-RBP-jk. A proteína de fusão NICD-GFP foi visualizada pelo rastreamento da proteína GFP. Quando expressa sozinha, a proteína NICD-GFP foi localizada no núcleo de forma difusa e o tratamento com 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina não alterou sua localização nuclear. No entanto, a superexpressão de NICD-GFP e MAML1 levou à colocalização de ambas as proteínas em compartimentos subnucleares (possivelmente corpos nucleares). O tratamento de 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) das células não perturba a translocação e colocalização de NICD-GFP e MAML1 no compartimento subnuclear (dados nãomostrades)
[0120] Da mesma forma, a localização de CSL/RBP-jk foi investigada utilizando anticorpos específicos contra essa proteína. Como mostrado na figura 22C, MAML1-FLAG e CSL/RBP-jk colocalizados em compartimentos subnucleares e o tratamento com 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) não perturbou a distribuição dos mesmos no núcleo (dados não mostrados). Esses dados sugerem que o tratamento com 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) não perturbou a colocalização dos componentes do complexo de ativação de transcrição do Notch no núcleo. No entanto, ainda é necessário verificar se ele bloqueia a interação entre os vários componentes do complexo.
[0121] Para adicionalmente investigar o mecanismo de ação da 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3), os depositantes especularam que a 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) pode estar alvejando um dos componentes do complexo de ativação de transcrição. A superexpressão desta proteína alvo pode titular o composto 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) e, portanto, recuperar a inibição da via induzida por 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3). Para abordar essa questão, as células HeLa foram cotransfectadas com 800 ng do plasmídeo NICD-GFP e com uma quantidade crescente (0, 1 e 3 μg) do vetor de expressão MAML1-FLAG. A ativação da via Notch foi mensurada através da introdução do plasmídeo da luciferase 12xCSL. Conforme é mostrado na figura 2, em células HeLa transfectadas apenas com NICD ou NICD + 1 μg de MAML1, o tratamento com 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) pode bloquear a sinalização Notch de modo dependente da concentração. No entanto, quando a quantidade de plasmídeo MAML1 aumentou para 3 μg, o tratamento com 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) já não foi capaz de inibir a ativação da sinalização Notch (figura 2). Portanto, a superexpressão de MAML1 acima de um determinado limiar poderia resgatar a inibição mediada por 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) da via Notch. Esses dados sugerem que o MAML1 em si pode ser o alvo do composto 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3). Um aumento na concentração de MAML1 pode ser capaz de titular o inibidor e, assim, torná-lo incapaz de bloquear a sinalização em cascata. O tratamento com 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) diminui a sinalização Notch em linhagens celulares de câncer humano:
[0122] A ativação aberrante da sinalização Notch desempenha um papel importante no início do tumor e/ou manutenção dos cânceres humanos. Para determinar se o tratamento com 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) pode bloquear a sinalização Notch em células cancerosas humanas, várias linhagens celulares de células cancerosas (linhagens celulares T-ALL RPMI 8402, HPBALL, KOPTK1 e a linhagem de células cancerosas pancreáticas PANC1) foram tratadas com 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) durante 24 horas. O efeito sobre a sinalização Notch foi determinado através da medição dos níveis de expressão dos genes alvo do Notch. O tratamento com 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) das linhagens celulares cancerosas humanas (RPMI 8402, HPBALL, KOPTK1 e PANC1) durante 24 horas e análises subsequentes dos genes alvo do Notch por qRT-PCR ou análise de Western blot mostrou que a 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) induziu uma infrarregulação estatisticamente significativa dos genes alvo do Notch como Hes1, cMyc e Dtx1 no mRNA, bem como nos níveis de proteína (figura 3). A infrarregulação dos genes alvo do Notch correlaciona-se com níveis reduzidos de NICD (figuras 3B, C e D).
[0123] Como o tratamento das linhagens celulares T-ALL humanas e da linhagem de células cancerosas pancreáticas com 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) induziu uma infrarregulação da sinalização Notch, os depositantes questionaram se essa inibição da via traduz-se em interrupção do crescimento nas células cancerosas. Para esse fim, as linhagens celulares induzidas por nRas, RPMI 8402, KOPTK1 e PANC1 foram cultivadas na presença ou ausência de 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) durante vários dias e o índice de proliferação das mesmas foi medido usando o ensaio de Alamar blue. Além disso, as linhagens celulares RAJI de linfócitos B, sem mutações Notch conhecidas, foram usadas como um controle (dados não mostrados). Como mostrado na figura 4, o tratamento com 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) e DAPT induziu um bloqueio de proliferação significativo nas linhagens celulares T-ALL RPMI 8402, KOPTK1 e na linhagem do câncer pancreático PANC1. Da mesma forma, a6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) inibiu significativamente o crescimento de linhagens celulares de melanoma induzidas por nRas (figura 4). No entanto nem DAPT e nem 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) apresentaram qualquer efeito sobre a proliferação das células RAJI independente do Notch (dados não mostrados). 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3), mas não o DAPT, bloqueia a sinalização Notch em T-ALL humana superexpressando NICD e na linhagem celular de câncer de mama.
[0124] 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3)pode bloquear a ativação mediada por NICD da via Notch (Figura 1). Para determinar se a 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) também pode induzir um bloqueio de proliferação em células superexpressando NICD, a linhagem celular T-ALL humana DND41 (DND41 parental) foi transduzida com um lentivírus expressando NICD para gerar a linhagem celular DND41-NICD. Essas duas linhagens celulares foram tratadas com DMSO, 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) e DAPT. O tratamento da linhagem celular DND41 parental com DAPT e 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) levou a uma infrarregulação de Hes1, em comparação com as células tratadas com DMSO. No entanto, quando as células DND41-NICD foram tratadas com DMSO, 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) e DAPT, apenas o tratamento com 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3), e não o com DAPT causou uma infrarregulação de Hes1 (figura 5A). Além disso, essas duas linhagens celulares também foram monitoradas ao longo de vários dias para os efeitos antiproliferativos da 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) e DAPT. Observou-se que, enquanto tanto o tratamento com 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) como com DAPT causou um bloqueio proliferativo significativo na linhagem celular DND41 parental (figura 5B), apenas 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) foi capaz de induzir uma interrupção do crescimento em células DND41-NICD (figura 5C). Esses dados reforçam ainda mais a noção de que o composto 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) pode bloquear a ativação da via mediada por NICD e a proliferação nas células cancerosas humanas.
[0125] Para reforçar ainda mais a noção de que a 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) pode bloquear a ativação da via mediada por NICD e a proliferação das células cancerosas humanas, as linhagens celulares do câncer de mama humano HCC1187 foram tratadas com esse composto. A linhagem celular HCC1187 abriga uma translocação cromossômica SECC22B-Notch2, gerando assim a forma constitutivamente ativa de N2-ICD (figura 5D). Devido a essa mutação, as linhagens celulares HCC1187 não respondem aos inibidores da Y-secretase, como DAPT. Conforme mostrado na figura 5E, enquanto o tratamento com DAPT não inibiu a proliferação das linhagens celulares HCC1187, o tratamento com6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) induziu significativamente um bloqueio da proliferação nessas linhagens celulares. 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) induz a interrupção do ciclo celular em G0/G1 e a apoptose em linhagens celulares de leucemia linfoblástica aguda de células-T humanas:
[0126] Conforme mostrado nas figuras 4 e 5, o tratamento com 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) das linhagens celulares leucêmicas humanas e das linhagens celulares do câncer de mama humano regula negativamente a proliferação. Esse interrupção da proliferação mediada pela 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) poderia ser devido à indução da apoptose ou interrupção do ciclo celular durante as diferentes fases do ciclo celular. Além disso, a inibição da sinalização Notch usando os inibidores da Y-secretase demonstrou induzir a interrupção do ciclo celular em G0/G1 nas linhagens celulares TALL humanas. Portanto, para elucidar ainda mais os mecanismos responsáveis pela interrupção da proliferação mediada por 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3), análises do ciclo celular e da apoptose foram realizadas. As linhagens celulares TALL humanas (RPMI8402, KOPTK1, TALL1, CUTL1 e HPB ALL) e a linhagem celular de câncer de mama humano HCC1187 foram tratadas com 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) ou DMSO durante 2 dias ou 7 dias. Para investigar a morte celular, a coloração com anexina V foi realizada e a proporção da população de células apoptóticas (positivas para AnexinaV) foi determinada por análises de citometria de fluxo após 7 dias de tratamento. Como mostrado na figura 6A, o tratamento com 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) induz a apoptose significativa em RPMI8402, CUTL1, KOPTK1, TALL1 e HPB ALL. Da mesma forma, a 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina induz a apoptose na linhagem celular de câncer de mama humano HCC1187 (figura 6C).
[0127] Além da indução da apoptose, a interrupção proliferativa observada nas linhagens celulares leucêmicas humanas tratadas com 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) e a linhagem celular de câncer de mama também parece ser devido à interrupção do ciclo celular na fase G0/G1 do ciclo celular. As linhagens celulares leucêmicas (RPMI8402, KOPTK1 e TALL1) e as linhagens celulares de câncer de mama foram tratadas com 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) durante 48 horas e o status do ciclo celular foi determinado usando coloração com Ki67 e Hoechst. Conforme mostrado nas figuras 6B e 6D, a 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) induz uma interrupção na fase G0/G1 do ciclo celular, um fenótipo normalmente observado devido à inibição da sinalização Notch.A inibição da sinalização Notch mediada por 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina inibição induzida do mioblasto C2C12:
[0128] Para confirmar adicionalmente o potencial inibitório do Notch da 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) em diferentes sistemas, a diferenciação do mioblasto C2C12 foi usada como um ensaio funcional. A ativação da via Notch em mioblastos C2C12 retém os mesmos em um estado não diferenciado, enquanto que a anulação da sinalização Notch induz a diferenciação deles. Os mioblastos C2C12 foram tratados com DMSO, 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) e DAPT e foram cultivados até 100% de confluência durante 3 dias. Depois de três dias, as células foram fixadas e marcadas com anticorpos contra a proteína da cadeia pesada da miosina (MHC). Os núcleos das células foram contramarcados com DAPI. Os mioblastos C2C12 cultivados na presença de 10% de soro (meio de crescimento) mantém seus estados não diferenciados, enquanto que as células tratadas com DAPT e 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) começaram a se diferenciar em miotubos MHC positivos multinucleados (dados não mostrados).6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) não inibe as cascatas de sinalização Wnt e Hedgehog
[0129] Uma das preocupações sobre a atividade do composto químico 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) é a sua especificidade para a via de sinalização Notch. Para testar se a 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) também poderia bloquear outras vias de desenvolvimento, os depositantes testaram a sua capacidade de bloquear as vias de sinalização Wnt e Hedgehog. Em resumo, para medir a sinalização Wnt, células HeLa foram transfectadas com um plasmídeo contendo um promotor consistindo em sítios de ligação de TCF/LEF e, dessa forma, induziram a expressão de um gene da luciferase (TOP-luciferase). Para ativar a via Wnt, um plasmídeo que codifica a β-catenina foi cotransfectado nas células HeLa. As células cotransfectadas foram incubadas na presença ou ausência do composto químico 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3). A introdução transitória da β-catenina leva a uma suprarregulação da sinalização Wnt, conforme medido pela atividade da luciferase induzida por β-catenina-TCF/LEF. De modo importante, o tratamento com 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) das células com a sinalização Wnt ativada não bloqueia a ativação da via Wnt (dados não mostrados).
[0130] Usando uma estratégia semelhante, a sinalização Hedgehog foi ativada em células HeLa pela introdução do fator de transcrição Gli1 e a ativação da via foi monitorada usando uma sequência promotora contendo os sítios de ligação Gli1 que induzem a expressão da luciferase. O tratamento dessas células com 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) não inibiu a cascata de sinalização Hedgehog (dados não mostrados). Analisados em conjunto, esses dados sugerem que o composto químico 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) não pode prejudicar outras vias de desenvolvimento e pode ser específico para a inibição da sinalização Notch. No entanto, ainda é necessário determinar se a resistência da sinalização Wnt e Hedgehog para a 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) é específica para o tipo de célula ou se ela é um fenômeno geral.
Efeitos in vivo da 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) em camundongos C57BL6:
[0131] A sinalização Notch regula a homeostase de vários órgãos durante o desenvolvimento. Por exemplo, a ativação da via mediada por Notch1 é essencial para o desenvolvimento das células-T no timo (Radtke et al., 1999). No entanto, o desenvolvimento das células-T dirigida por Notch1 não parece ser dependente de MAML1, porque a perda de MAML1 não alterou o desenvolvimento das células-T no camundongo. Isso pode ter ocorrido devido a um mecanismo compensatório pelos membros das famílias MAML2 e MAML3 para a perda de MAML1. No baço, a sinalização induzida por Notch2 exclusivamente por MAML1 é necessária para o desenvolvimento da célula MZB. A perda da remoção genética do Notch2 e MAML1 causa um bloqueio no desenvolvimento das células MZB (Wu et al., 2007, Saito et al., 2003, ).Além disso, a sinalização Notch via Notch1 e Notch2 é essencial para a manutenção do compartimento da cripta. Uma remoção genética do composto de Notch1 e Notch2 no intestino leva à metaplasia das células caliciformes. Os depositantes, dessa forma, investigaram se a 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) poderia prejudicar os processos de desenvolvimento dependentes de Notch mencionados acima.
[0132] Nos ensaios de cultura in vitro, o composto químico 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) foi capaz de bloquear a ativação da via mediada por Notch1 e Notch2. Portanto, os depositantes levantaram a hipótese de que o tratamento de camundongos com 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) pode causar a metaplasia das células caliciformes do intestino. Para testar essa hipótese, camundongos receberam injeção por via intraperitoneal (ip) de 25 mg/Kg de 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) durante 7 dias consecutivos. No dia 8, os animais foram sacrificados e os tecidos intestinais foram fixados e embebidos em parafina. Análises histológicas foram realizadas usando Alcian blue para corar as células caliciformes. Surpreendentemente, apesar de sua capacidade de bloquear a ativação da via mediada por Notch1 e por Notch2 em culturas in vitro, o tecido intestinal de camundongos tratados com 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) era completamente normal com arquitetura intacta e não havia indicação de metaplasia das células caliciformes (dados não mostrados). Da mesma forma, o efeito da 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) sobre alterações do peso corporal também foi monitorado. Os camundongos foram injetados durante 5 dias consecutivos com 25 mg/Kg de 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) e as alterações na massa corporal foram registradas. O tratamento de camundongos com 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) não causou uma perda no peso corporal.O tratamento com 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) induz um bloqueio no desenvolvimento das células MZB:
[0133] Os depositantes levantaram a hipótese de que a inibição mediada por 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) da sinalização Notch2 deveria causar um bloqueio no desenvolvimento das célula MZB no baço. O desenvolvimento das células MZB foi avaliado por marcação por citometria de fluxo dos esplenócitos com anticorpos direcionados contra B220, CD21 e CD23. Conforme mostrado na figura 7B, o tratamento de camundongos com 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) causa uma redução na porcentagem da população de célula MZB no baço. Além disso, a perda da população de células MZB no baço também reflete o número absoluto de células MZB (figura 7C).
[0134] Portanto, o bloqueio mediado por 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) no desenvolvimento das células MZB imita a perda do fenótipo Notch2 e MAML1. No entanto, ainda precisa de ser analisado se 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) exerce seu efeito inibidor de Notch apenas através do MAML1 ou se ele poderia bloquear também a sinalização Notch através de outros membros da família MAML.O tratamento com 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) torna o crescimento do tumor mais lento da leucemia de células-T humanas em um modelo de xenotransplante:
[0135] Sabe-se que a ativação da sinalização Notch devido a mutações de ativação em diferentes componentes da via causa mais de 50% das leucemias linfoblásticas agudas de células-T humanas. Portanto, os depositantes decidiram investigar a atividade anticâncer do composto químico 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) na leucemia de células-T humanas induzida por Notch in vivo. Para atingir esse objetivo, modelos de xenotransplante de leucemia humana foram estabelecidos usando camundongos NOD/SCID yc"/". As linhagens celulares T-ALL humanas HPB ALL e RPMI 8402 foram usadas para essa finalidade. A linhagem celular HPB ALL abriga uma mutação L1575P no domínio de heterodimerização e uma inserção no domínio PEST do receptor Notch1, ativando assim constitutivamente a sinalização Notch1. Da mesma forma, as células RPMI 8402 exibem ativação da sinalização Notch independente de ligante devido a uma inserção no resíduo 1584 a.a no domínio de heterodimerização e também uma mutação inativadora (R465H) na E3 ligase FBW7. Verificou-se que essas duas linhagens celulares respondem ao tratamento com 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) em ensaios de cultura in vitro em termos de proliferação e/ou infrarregulação dos genes alvo do Notch. Para determinar se essas linhagens celulares estabelecem a leucemia em um cenário de xenotransplante, 1 milhão de células de cada linhagem foram injetadas por via intravenosa (iv) em camundongos NOD/SCIDYC-/-. Os animais desenvolveram leucemia com 100% de penetrância e morreram dentro de 4 semanas após o transplante.
[0136] Uma vez que as linhagens celulares RPMI 8402 e HPB ALL demonstraram desenvolver leucemia em um ensaio de xenotransplante, elas foram transduzidas com um lentivírus expressando constitutivamente o gene da luciferase. Isso permitiu que os depositantes visualizassem e monitorassem a progressão da leucemia em camundongos usando o sistema de detecção de imagens de organismos vivos Caliper IVIS (Xenogen). A fim de determinar a eficácia anticâncer de 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) em tumores estabelecidos, foi realizado um experimento de manutenção. Um milhão de células HPB ALL foram injetadas (iv) em camundongos NOD/SCID Ye—/—- Os camundongos foram monitorados quanto ao desenvolvimento de leucemia através da detecção de células leucêmicas expressando luciferase. Após o estabelecimento da doença por volta do dia 15, os camundongos foram divididos em dois grupos. Um grupo foi tratado com óleo, como controle, e o segundo grupo foi tratado com 25 mg/Kg de 6—(4—terc—butilfenóxi)piridin—3—amina (I3) diariamente. Como mostrado na figura 8A, os camundongos tratados com óleo desenvolveram leucemia com penetrância de 100%, enquanto que a leucemia nos camundongos tratados com 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) não progrediu no mesmo ritmo do grupo tratado com óleo (figura 8A).
[0137] Da mesma forma, em um experimento semelhante, os camundongos NOD/SCID yc-/-foram transplantados com 5 x 105 células RPMI 8402 e tratados com óleo ou 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) após o estabelecimento da doença. Conforme mostrado na figura 8B, os animais tratados com óleo desenvolveram leucemia, enquanto que os camundongos tratados com 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) estavam livres da doença. Além disso, análises histológicas revelaram que, em camundongos tratados com óleo, as células leucêmicas progrediram para se infiltrar no fígado, mas os camundongos tratados com 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) não desenvolveram quaisquer lesões metastáticas no fígado (dados não mostrados). Uma vez que esses animais foram tratados com o composto químico 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) durante 27 dias, o tecido intestinal foi analisado para detectar qualquer toxicidade no intestino. A coloração com Alcian blue do tecido intestinal não revelou qualquer anormalidade no número de células caliciformes e na arquitetura intestinal (dados não mostrados).
[0138] Analisando em conjunto os dados dos depositantes obtidos pelo modelo de xenotransplante para leucemia humana, sugere-se que a 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) tem a capacidade de retardar a progressão da doença de uma leucemia já estabelecida. Por causa de sua capacidade de impactar na progressão tumoral, I3 pode ser um candidato adequado para desenvolvimento adicional como um agente anticâncer.Tumores de mama em camundongos MMTV-ErbB2 exibem a ativação da sinalização Notch e o efeito da 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) sobre a progressão do tumor de mama.
[0139] No câncer de mama humano, altos níveis das proteínas Notch1 e Jagged1 correlacionaram com uma sobrevida insatisfatória de pacientes com câncer de mama. Além disso, a ativação da sinalização Notch no câncer de mama humano também facilita a metástase óssea e de pulmão. Portanto, a fim de determinar o potencial anticâncer do composto químico 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) no câncer de mama, um modelo de camundongo do câncer de mama foi investigado. Sabe-se que a superexpressão induzida pelo vírus do tumor de mama em camundongo (MMTV) de ErbB2 causa tumores de mama em camundongo. Camundongos transgênicos MMTV-ErbB2 desenvolveram tumores de mama com uma latência de cerca de 5 a 6 meses, juntamente com o desenvolvimento de metástases pulmonares. Uma das características dos tumores de mama de camundongo MMTV-ErbB2 é a presença predominante dos tipos de célula do epitélio do lúmen. Sabe-se que a sinalização Notch induz a diferenciação das células do lúmen das células tronco mamárias de camundongo. Portanto, os depositantes levantaram a hipótese de que a ativação da via Notch em tumores de mama MMTV-ErbB2 pode parcialmente contribuir para a tumorigênese, favorecendo a diferenciação das células epiteliais do lúmen. Para este efeito, os depositantes investigaram os níveis de ativação da sinalização Notch em tumores de mama MMTV-ErbB2-IRES-Cre pela medição dos níveis de Hes1 por Western blotting. Como mostrado na figura 9A, os tumores de mama induzidos por MMTV-ErbB2 expressam níveis muito elevados da proteína Hes1 em comparação com as glândulas mamárias normais compatíveis com a idade. Para investigar o efeito da 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) sobre o desenvolvimento do câncer de mama, tumores de mama MMTV-ErbB2 foram coletados de camundongos FVB contendo o transgene MMTV-ErbB2. Uma única suspensão de células foi preparada e 5 x 105células tumorais foram injetadas em uma gordura infrapatelar vazia de um camundongo FVB receptor. Após o desenvolvimento de tumores palpáveis, os camundongos receptores foram tratados com óleo ou 25 mg/Kg de 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) em dias alternados, até o final do experimento. O volume do tumor foi mensurado e registrado em intervalos regulares. Os resultados preliminares mostraram que o tratamento de camundongos receptores com tumor com 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) causou significativo retardo do crescimento tumoral em comparação com camundongos tratados apenas com óleo (figura 9B). Esses dados mostraram que 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) tem a capacidade de desacelerar o crescimento do câncer de mama estabelecido.6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) bloqueia a sinalização Notch em leucemias linfoblásticas agudas de células-T humanas primárias:
[0140] Para investigar adicionalmente o efeito inibidor Notch de 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) em uma condição patológica relevante, amostras de TALL humana primárias foram perfiladas para ativação da sinalização Notch. Um acúmulo da forma ativa de Notch (NICD) foi usado como um biomarcador para a ativação da via. Várias TALL humanas primárias exibiram um acúmulo de NICD oncogênico e o tratamento desses tumores com 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) leva a uma infrarregulação dessa proteína. Além disso, a infrarregulação de NICD nessas amostras de TALL humana primárias correlaciona-se com uma interrupção da proliferação (dados não mostrados). Pelo contrário, as amostras de TALL humanas primárias que não apresentam níveis detectáveis de NICD não responderam ao tratamento com 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) (dados não mostrados).
[0141] Esses dados indicam que um acúmulo de NICD pode ser usado como um biomarcador para a ativação da via Notch e prevê o resultado do tratamento usando o inibidor Notch 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3).Diferentes derivados de 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) apresentam uma habilidade de bloquear a ativação da sinalização Notch no ensaio de cocultura de DL4-N1:
[0142] A fim de melhorar a atividade inibitória do Notch, assim como a eficácia do composto 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) parental, diferentes derivados químicos de I3 foram testados no ensaio de cocultura de DL4-N1. A varredura de mais de 40 diferentes derivados químicos de 6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina (I3) forneceu os seguintes compostos quanto à sua capacidade de bloquear a ativação da via Notch no ensaio de cocultura (figura 10). I3-A). 6-(4-ciclo-hexilfenóxi)piridin-3-amina I3-B) 6-(4-(terc-pentil)fenóxi)piridin-3-amina (No. CAS 1036533-91-1) I3-C) 4-(4-(terc-butil)fenóxi)anilina (No. CAS 56705-89-6) I3-D). 6-(4-butilfenóxi)piridin-3-amina I3-E). 4-(4-(terc-pentil)fenóxi)anilina (No. CAS 328032-81-1) I3-F). 4-(4-ciclo-hexilfenóxi)anilina (No. CAS 70682-64-3) I3-G) 6-(4-((3r,5r,7r)-adamantan-1-il)fenóxi)piridin-3-amina I3-H). 6-(3-(terc-butil)fenóxi)piridin-3-amina (No. CAS 1098366-43-8) I3-I). 4-(4-(terc-butil)fenóxi)-3-fluoranilina (No. CAS 946785-77-9) I3-J). 4-(4-isopropilfenóxi)anilina I3-K). 6-(4-(2,4,4-trimetilpentan-2-il)fenóxi)piridin-3-amina I3-L). 4-(4-ciclo-hexilfenóxi)-3-fluoranilina I3-M). 3-flúor-4-(4-(terc-pentil)fenóxi)anilina I3-N). 6-(4-(2-metilpentan-2-il)fenóxi)piridin-3-amina I3-O). 4-(4-((3r,5r,7r)-adamantan-1-il)fenóxi)anilina I3-P). 4-(4-((3r,5r,7r)-adamantan-1-il)fenóxi)-3-fluoranilina Conforme demonstrado na figura 10, alguns desses derivados (I3-A, I3-B, I3-C, I3-E, I3-G, I3-H, I3-M e I3-N) bloqueiam a sinalização Notch até níveis comparáveis ao composto original I3, enquanto que os derivados I3-F e I3-I parecem ter atividade aprimorada.Exemplo 3Síntese Química de Derivados e Precursores do Mesmo 4-(2-metilpentan-2-il)fenol
Figure img0033
4-butirilfenol (1000 mg, 6,09 mmol, 1,00 eq.) foi suspenso em tolueno (25 mL) e DCM (5mL) e refrigerado até 0 °C. Uma solução de Me3Al 2M em tolueno (7 mL, 14,01 mmol, 2,30 eq.) foi adicionada gota a gota, pelo qual o material de partida foi dissolvido. Após agitar em temperatura ambiente durante 15 h, a mistura reacional foi novamente refrigerada até 0 °C e TMSOSO2CF3 (1,1 mL, 6,09 mmol, 1,00 eq.) foi adicionado gota a gota. Após agitar em temperatura ambiente durante 3 dias, a reação foi suprimida vertendo a mistura em água gelada. Após a acidificação com H3PO4 40%, o produto foi extraído com acetato de etila (3x) e as camadas orgânicas foram lavadas com H3PO4 - solução de NaCl aquosa saturada acidificada. O solvente foi removido sob pressão reduzida a 30 °C. O produto bruto resultante foi purificado por cromatografia em coluna flash (SiO2; DCM/éter de petróleo, 1:1 a 2:1) para produzir o composto título como um óleo incolor (188 mg, com uma pureza de cerca de 90% (determinada por RMN), 0,95 mmol, 15% de rendimento). Rf = 0,60 (DCM/MeOH 4%). HRMS (ESI) calcd. para C12H17O-[M-H]- 177,1279, encontrado: 177,1284. RMN1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,β4 - 7,18 (m, 2H, Haromático), 6, 82 - 6, 76 (m, 2H, Haromático), 5,12 (s, 1H, O H), 1, 60 — 1,52 (m, 2H, C(CH3)2C H2CH2CH3), 1,27 (s, 6H, C(CH3)2CH2CH2CH3), 1,16 - 1,01 (m, 2H, C(CH3)2CH2CH2CH3), 0,83 (t, J = 7,3 Hz, 3H, C(CH3)2CH2CH2CH3). RMN 13C (101 MHz, CDCI3) δ 153, 03, 142,29, 127,11, 114,85, 47,Y5, Y7,25, β9,βY, 18,09, 14,90.
Procedimento Geral A:
[0143] As respectivas nitropiridinas ou nitrobenzenos e os fenóis particulares foram dissolvidos em DMF ou DMSO. K2CO3 anidro foi adicionado e a mistura reacional foi agitada em temperatura ambiente, salvo indicação em contrário, até a completa conversão. A reação foi, em seguida, extinta pela adição de H2O e o produto foi extraído com EtOAc ou Et2O. As camadas orgânicas foram lavadas com solução de NaOH 1M aquosa (1x) e depois com solução de NaCl aquosa saturada (1x). O solvente foi removido até a secura sob pressão reduzida a 30 °C. O resíduo foi separado em DCM e filtrado através de algodão para remover os sais inorgânicos. O produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna flash para produzir os compostos títulos correspondentes (I3-n e I3-nA até I3-nP). 2-(4-(terc-butil)fenóxi)-5-nitropiridina, I3-n
Figure img0034
[0144] Após o procedimento, A,2-cloro-5-nitropiridina (501 mg, 3,16 mmol, 1,00 eq.) e 4-terc-butilfenol (611 mg, 4,07 mmol, 1,29 eq) foram dissolvidos em DMF (6,0 mL). K2CO3 anidro (654 mg, 4,73 mmol, 1,50 eq) foi adicionado e a mistura reacional foi agitada em temperatura ambiente durante 14 h. Após extração com Et2O, o produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna flash (SiO2; EtOAc/éter de petróleo, de 1:100 a 1:50) para produzir o composto título como um sólido incolor (820 mg, 3,01 mmol, 95% de rendimento). Rf = 0,40 (EtOAc/PE 1:20). HRMS (ESI) calcd. para C15H17N2O3+[M+H]+273,1234, encontrado: 273,1229. RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ 9,06 (d, J = 2,8 Hz, 1H, Haromático), 8,46 (dd, J = 9,1, 2,8 Hz, 1H, Haromático), 7,53 -7,42 (m, 2H, H aromático) , 7,17 - 7, 05 (m, 2H, H aromático) , 7, 01 (d, J = 9,1 Hz, 1H, H aromático), 1,35 (s, 9H, C(CH3)3). RMN 13C (101 MHz, CDCI3) δ 167,20, 150,49, 148,98, 145,26, 140,29, 134,95, 126,99, 120,84, 111,38, 34,72, 31,57.2-(4-ciclo-hexilfenóxi)-5-nitropiridina, I3-nA
Figure img0035
[0145] Após o procedimento, A,2-cloro-5-nitropiridina (300 mg, 1,89 mmol, 1,00 eq.) e 4-ciclo-hexilfenol (417 mg, 2,37 mmol, 1,25 eq) foram dissolvidos em DMSO (6 mL). K2CO3 anidro (397 mg, 2,87 mmol, 1,52 eq.) foi adicionado e a mistura reacional foi agitada em temperatura ambiente durante 27 h. Após extração com Et2O, o produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna flash (SiO2; EtOAc/éter de petróleo, de 1:100 a 1:75) para produzir o composto título como um sólido incolor (600 mg, 2,01 mmol, rendimento quantitativo). Rf = 0,35 (EtOAc/PE 1:20). HRMS (ESI) calcd. para C17H19N2O3+[M+H]+299,1390, encontrado: 299,1392. RMN1H (400 MHz, CDCl3) δ 9,06 (d, J = 2,9 Hz, 1H, Haromático), 8,46 (dd, J = 9,1, 2,9 Hz, 1H, Haromático), 7,31 - 7,22 (m, 2H, Haromático), 7,07 (dd, J = 8,7, 2,3 Hz, 2H, Haromático), 7,00 (d, J = 9,1 Hz, 1H, Haromático), 2,58 - 2,51(m, 1H, H de ciclo-hexila), 2,01 - 1,64 (m, 5H, H de ciclo-hexila), 1,56 - 1,10 (m, 5H, H de ciclo-hexila). RMN13C (101 MHz, CDCl3) δ 167,18, 150,71, 145,88, 145,17, 140,22, 134,89, 128,30, 121,12 111,30, 44,08, 34,59, 26,95, 26,19.5-nitro-2-(4-(terc-pentil)fenóxi)piridina, I3-n
Figure img0036
[0146] Após o procedimento A, 2-cloro-5-nitropiridina (303 mg, 1,91 mmol, 1,00 eq.) e 4-terc-pentilfenol (397 mg, 2,42 mmol, 1,27 eq) foram dissolvidos em DMSO (6 mL). K2CO3 anidro (403 mg, 2,92 mmol, 1,53 eq) foi adicionado e a mistura reacional foi agitada em temperatura ambiente durante 7 h. Após extração com Et2O, o produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna flash (SiO2; EtOAc/éter de petróleo, 1:100) para produzir o composto título como um sólido incolor (530 mg, 1,85 mmol, 97% de rendimento). Rf = 0,31 (EtOAc/PE 1:20). HRMS (ESI) calcd. para C16H19N2O3+[M+H]+287,1390, encontrado: 287,1381. RMN 1H (400 MHz, CDClY) δ 9,07 — 9,05 (m,1H, Haromático), 8,45 (dd, J = 9,4, 2,4 Hz, 1H, Haromático), 7,40 (d, J = 8,6 Hz, 2H, Haromático), 7,09 (d, J = 8,6 Hz, 2H, Haromático), 6,99 (d, J = 9,2 Hz, 1H, Haromático), 1,67 (q, J = 7,4 Hz, 2H, Ar-C(CH3)2CH2CH3), 1,31 (s, 6H, Ar-C(CH3)2CH2CH3), 0,73 (t, J = 7,4 Hz, 3H, Ar-C(CH3)2CH2CH3). RMN 13C (101 MHz, CDCla) δ 167, 17, 150,46, 147,34, 145,20, 140,27, 134,90, 127,56, 120,72, 111,28, 37,89, 37,06, 28,55, 9,26. 1-(terc-butil)-4-(4-nitrofenóxi)benzeno, I3-nC
Figure img0037
[0147] Após o procedimento A, 4-fluornitrobenzeno (500 mg, 3,54 mmol, 1,00 eq) e 4-terc-butilfenol (671 mg, 4,46 mmol, 1,26 eq) foram dissolvidos em DMF (6,0 mL). K2CO3 anidro (857 mg, 6,20 mmol, 1,75 eq) foi adicionado e a mistura reacional foi agitada em temperatura ambiente durante 52 h. Após extração com EtOAc, o produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna flash (SiO2; EtOAc/éter de petróleo, 1:100) para produzir o composto título como um sólido amarelo pálido (860 mg, 3,17 mmol, 89% de rendimento). Rf = 0,72 (EtOAc/PE 1:9). HRMS (ESI) calcd. para C16H18NO3+ [M+H]+272,1281, encontrado: 272,1272. RMN1H (400 MHz, CDCl3) δ 8,β4 - 8,16 (m, 2H, Haromático) , 7,49 - 7,39 (m, 2H, Haromático) , 7, 06 - 6, 97 (m, 4H, Haromático), 1,35 (s, 9H, C(CH3)3). RMN 13C (101 MHz, CDCl3) δ 163, 82, 152,29, 148,59, 142,54, 127,27, 126,03, 120,15, 116,98, 34,67, 31,58.2-(4-butilfenóxi)-5-nitropiridina, I3-nD
Figure img0038
[0148] Após o procedimento A, 2-cloro-5-nitropiridina (103 mg, 0,65 mmol, 1,00 eq.) e 4-butilfenol (126 mg, 0,84 mmol, 1,29 eq.) foram dissolvidos em DMF (2,5 mL). K2CO3 anidro (143 mg, 1,04 mmol, 1,59 eq) foi adicionado e a mistura reacional foi agitada em temperatura ambiente durante 6 h. Após extração com Et2O, o produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna flash (SiO2; EtOAc/éter de petróleo, 1:100) para produzir o composto título como um sólido incolor (190 mg, 0,70 mmol, rendimento quantitativo). Rf = 0,33 (EtOAc/PE 1:20). HRMS (ESI) calcd. para C15H17N2O3+ [M+H]+273,1234, encontrado:273,1226. RMN1H (400 MHz, CDCl3) δ 9,05 (dd, J = 2,9, 0,6 Hz, 1H, Haromático), 8,46 (dd, J = 9,1, 2,8 Hz, 1H, Haromático), 7,32 - 7,21 (m, 2H, Haromático), 7,11 - 7,02 (m, 2H, H aromático), 7,00 (dd, J = 9,0, 0,6 Hz, 1H, Haromático), 2,69 - 2,60 (m, 2H, Ar-C H2CH2CH2CH3), 1,70 — 1,57 (m, 2H,Ar-CH2CH2CH2CH3), 1,39 (dq, J = 14,6, 7,3 Hz, 2H, Ar-CH2CH2CH2CH3), 0,95 (t, J = 7,3 Hz, 3H, Ar-CH2CH2CH2CH3). RMN 13C (101 MHz, CDCl3) δ 167,27, 150,75, 145,22, 140,86, 140,30, 134,92, 129,91, 121,22, 111,32, 35,21, 33,67, 22,51, 14,08. 1-nitro-4-(4-(terc-pentil)fenóxi)benzeno, I3-nE
Figure img0039
[0149] Após o procedimento A, 4-fluornitrobenzeno (318 mg, 2,25 mmol, 1,00 eq.) e 4-terc-pentilfenol (460 mg, 2,28 mmol, 1,24 eq.) foram dissolvidos em DMSO (6 mL). K2CO3 anidro (465 mg, 3,37 mmol, 1,49 eq. foi adicionado e a mistura reacional foi agitada em temperatura ambiente durante 2 h. Após extração com Et2O, o produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna flash (SiO2; EtOAc/éter de petróleo, 1:100) para produzir o composto título como um sólido incolor (533 mg, 1,87 mmol, 83% de rendimento). Rf = 0,70 (EtOAc/PE 1:20). HRMS (ESI) calcd. para C17H20NO3+[M+H]+285,1365, encontrado: 285,1359. RMN1H (400 MHz, CDCl3) δ 8,β5 - 8,14 (m, 2H, Haromático), 7,44 - 7,32 (m, 2H, Haromático), 7,06 - 6,96 (m, 4H, Haromático), 1,66 (q, J = 7,4 Hz, 2H, Ar-C(CH3)2CH2CH3), 1,31 (s, 6H, Ar-C(CH3)2CH2CH3)), 0,71 (t, J = 7,4 Hz, 3H, Ar-C(CH3)2CH2C H3)). RMN13C (101 MHz, CDC13) δ 163, 81, 152,24, 146,94, 142,56, 127,91, 126,01, 120,06, 116,99, 37,89, 37,06, 28,63, 9,27.1-ciclo-hexil-4-(4-nitrofenóxi)benzeno, I3-nF
Figure img0040
[0150] Após o procedimento A, 4-fluornitrobenzeno (325 mg, 2,30 mmol, 1,00 eq) e 4-ciclo-hexilfenol (519 mg, 2,94 mmol, 1,28 eq.) foram dissolvidos em DMSO (6 mL). K2CO3 anidro (513 mg, 3,72 mmol, 1,61 eq) foi adicionado e a mistura reacional foi agitada em temperatura ambiente durante 48 h. Após extração com Et2O, o produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna flash (SiO2; EtOAc/éter de petróleo, de 1:100 a 1:50) para produzir o composto título como um sólido amarelo pálido (640 mg, 2,15 mmol, 93% de rendimento). Rf = 0,55 (EtOAc/PE 1:20). HRMS (ESI) calcd. para C18H20NO3+[M+H]+ 298,1438, encontrado: 298,1442. RMN 1H (400 MHz, CDCI3) δ 8,31 - 8,11 (m, 2H, H aromático), 7,26 (d, J = 2,3 Hz, 2H, H aromático), 7,13 - 6,92 (m, 4H, H aromático), 2,57 - 2,50 (m, 1H, H de ciclo-hexila), 2,09 - 1,67 (m, 5H, H de ciclo-hexila), 1,59 - 1,18 (m, 5H, H de ciclo-hexila). RMN13C (101 MHz, CDCl3) δ 163,89, 152,61, 145,58, 142,57, 128,66, 126,04, 120,49, 116,99, 44,14, 34,72, 26,99, 26,23.2-(4-((3r,5r,7r)-adamantan-1-il)fenóxi)-5-nitropiridina, I3-nG
Figure img0041
[0151] Após o procedimento A, 2-cloro-5-nitropiridina (300 mg, 1,89 mmol, 1,00 eq.) e 4-adamantilfenol (546 mg, 2,39 mmol, 1,26 eq.) foram dissolvidos em DMSO (6 mL). K2CO3 anidro (662 mg, 4,79 mmol, 2,53 eq) foi adicionado e a mistura reacional foi agitada em temperatura ambiente durante 42 h. Após extração com Et2O, o produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna flash (SiO2; EtOAc/éter de petróleo, de 1:100 a 1:50) para produzir o composto título como um sólido incolor (664 mg, 1,89 mmol, rendimento quantitativo). Rf = 0,36 (EtOAc/PE 1:20). HRMS (ESI) calcd. para C21H23N2O3+[M+H]+ 351,1703, encontrado: 351,1701. RMN1H (400 MHz, CDCl3) δ 9,06 (d, J = 2,8 Hz, 1H, Haromático), 8,45 (dd, J = 9,1, 2,8 Hz, 1H, H aromático) , 7,52 - 7,39 (m, 2H, H aromático) , 7,16 - 7,06 (m, 2H, H aromático), 7,00 (d, J = 9,1 Hz, 1H, H aromático), 2,13 - 2,10 (m, 3H, H de adamantila), 1,94 (d, J = 3,0 Hz, 5H, H de adamantila), 1,87 - 1,70 (m, 5H, H de adamantila). RMN13C (101 MHz, CDCl3)δ 167,19, 150,51, 149,18, 145,β0, 140,β6, 134,89, 126,53, 120,83, 111,32, 43,35, 36,82, 36,18, 29,02. 2-(3-(terc-butil)fenóxi)-5-nitropiridina, I3-nH
Figure img0042
[0152] Após o procedimento A, 2-cloro-5-nitropiridina (300 mg, 1,89 mmol, 1,00 eq) e 3-terc-butilfenol (358 mg, 2,38 mmol, 1,26 eq.) foram dissolvidos em DMSO (6 mL). K2CO3 anidro (420 mg, 3,04 mmol, 1,60 eq) foi adicionado e a mistura reacional foi agitada em temperatura ambiente durante 70 h. Após extração com Et2O, o produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna flash (SiO2; EtOAc/éter de petróleo, 1:100) para produzir o composto título como um sólido incolor (512 mg, 1,88 mmol, 99% de rendimento). Rf = 0,37 (EtOAc/PE 1:20). HRMS (ESI) calcd. para C15H17N2O3+[M+H]+ 273,1234, encontrado: 273,1232. RMN1H (400 MHz, CDCl3)δ 9,08 - 9,04 (m, 2H, Haromático), 8,47 (dd, J = 9,1, 2,8 Hz, 1H, Haromático), 7,39 (t, J = 7,9 Hz, 1H, Haromático), 7,33 (ddd, J = 7,9, 1,8, 1,2 Hz, 1H, Haromático), 7,17 (t, J = 2,1 Hz, 1H, Haromático), 7,01 (dd, J = 9,1, 0,5 Hz, 1H, Haromático), 6,98 (ddd, J = 7,9, 2,4, 1,2 Hz, 1H, v aromático), 1,34 (s, 9H, C(CH3)3). RMN 13C (101 MHz, CDCI3) δ 167,21, 153, 88, 152,76, 145,26, 140,31, 134,93, 129,50, 123,17, 118,62, 118,47, 111,28, 35,02, 31,36. 1-(4-(terc-butil)fenóxi)-2-flúor-4-nitrobenzeno, I3-nI
Figure img0043
[0153] Após o procedimento A, 3,4-difluornitrobenzeno (401 mg, 2,52 mmol, 1,00 eq.) e 4-terc-butilfenol (477 mg, 3,18 mmol, 1,26 eq.) foram dissolvidos em DMSO (6 mL). K2CO3 anidro (522 mg, 3,78 mmol, 1,50 eq) foi adicionado e a mistura reacional foi agitada em temperatura ambiente durante 19 h. Após extração com Et2O, o produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna flash (SiO2; EtOAc/éter de petróleo, 1:50) para produzir o composto título como um óleo incolor (722 mg, 2,52 mmol, 99% de rendimento). Rf = 0,54 (EtOAc/PE 1:20). HRMS (ESI) calcd. para C16H17FNO3+[M+H]+290,1187, encontrado: 290,1194. RMN1H (400 MHz, CDCl3) δ 8,07 (dd, J = 10,3, 2,7 Hz, 1H, Haromático), 7,96 (ddd, J = 9,1, 2,7, 1,5 Hz, 1H, H aromático), 7,49 - 7,38 (m, 2H, Haromático), 7,09 - 6, 99 (m, 2H, Haromático), 6,96 (dd, J = 9,1, 8,0 Hz, 1H, Haromático), 1,35 (s, 9H, C(CH3)3). RMN13C (101 MHz, CDCl3) δ 153,35, 152,23, 151,93, 151,82, 150,84, 148,70, 142,40, 142,33, 127,29,120,68, 120,64, 119,38, 117,73, 117,71, 113,28, 113,05, 34,65, 31,54. 1-(4-ciclo-hexilfenóxi)-2-flúor-4-nitrobenzeno, I3-nJ
Figure img0044
[0154] Após o procedimento A, 3,4-difluornitrobenzeno (509 mg, 3,20 mmol, 1,00 eq) e 4-ciclo-hexilfenol (691 mg, 3,93 mmol, 1,23 eq.) foram dissolvidos em DMSO (6 mL). K2CO3 anidro (664 mg, 4,81 mmol, 1,50 eq) foi adicionado e a mistura reacional foi agitada em temperatura ambiente durante 23 h. Após extração com Et2O, o produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna flash (SiO2; EtOAc/éter de petróleo, 1:50) para produzir o composto título como um sólido amarelo pálido (1002 mg, 3,18 mmol, 99% de rendimento). Rf = 0,51 (EtOAc/PE 1:20). HRMS (ESI) calcd. para C18H19FNO3+[M+H]+ 316,1343, encontrado: 316,1348. RMN1H (400 MHz, CDCl3) δ 8,09 (dd, J = 10,3, 2,7 Hz, 1H, Haromático), 7,97 (ddd, J = 9,1, 2,7, 1,4 Hz, 1H, Haromático), 7,33 - 7,22 (m, 2H, Haromático) , 7, 08 - 6, 99 (m, 2H, Haromático), 6,96 (dd, J = 9,1, 8,0 Hz, 1H, Haromático), 2,58 - 251 (m, 1H, H de ciclo-hexila), 1,98 - 1,73 (m, 5H, H de ciclo-hexila), 1,52 - 1,20 (m, 5H, H de ciclo-hexila). RMN 13C (101 MHz, CDCla) δ 153,35, 152,51, 152,01, 151,90, 150,84, 145,68, 142,39, 142,32, 128,67,120,70, 120,66, 119,73, 117,70, 117,68, 113,30, 113,08, 44,09, 34,69, 26,97, 26,21 2-flúor-4-nitro-1-(4-(terc-pentil)fenóxi)benzeno, I3-nK
Figure img0045
[0155]Após o procedimento A, 3,4-difluornitrobenzeno (502 mg, 3,16 mmol, 1,00 eq.) e 4-terc-pentilfenol (693 mg, 4,22 mmol, 1,34 eq.) foram dissolvidos em DMSO (6 mL). K2CO3 anidro (656 mg, 4,75 mmol, 1,50 eq) foi adicionado e a mistura reacional foi agitada em temperatura ambiente durante 22 h. Após extração com Et2O, o produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna flash (SiO2; EtOAc/éter de petróleo, 1:50) para produzir o composto título como um óleo amarelo pálido (943 mg, 3,11 mmol, 99% de rendimento). Rf = 0,61 (EtOAc/PE 1:20). HRMS (ESI) calcd. para C17H19NO3+[M+H]+ 304,1343, encontrado: 304,1332. RMN1H (400 MHz, CDCl3) δ 8,08 (dd, J = 10,3, 2,7 Hz, 1H, Haromático), 7,96 (ddd, J = 9,1, 2,7, 1,5 Hz, 1H, Haromático) , 7,42 - 7,35 (m, 2H, H aromático) , 7, 07 - 6, 99 (m, 2H, Haromático), 6,95 (dd, J = 9,1, 8,0 Hz, 1H, Haromático), 1,66 (q, J = 7,4 Hz, 2H, Ar-C(CH3)2CH2CH3), 1,31 (s, 6H, Ar-C(CH3)2CH2CH3), 0,71 (t, J = 7,4 Hz, 3H, Ar-C(CH3)2CH2C H3). RMN 13C (101 MHz, CDCl3) δ 153, 40, 152,19, 151,98, 151,87, 150,88, 147,11, 127,97, 120,71, 120,68,119,34, 117,73, 117,71, 113,11, 37,92, 37,08, 28,64. 2-(4-(2-metilpentan-2-il)fenóxi)-5-nitropiridina, I3-nL
Figure img0046
[0156] Após o procedimento A,4-(2-metilpentan-2il)fenol (52 mmol, 0,29 mmol, 1,00 eq.) e 2-cloro-5-nitropiridina (57 mg, 0,36 mmol, 1,23 eq.) foram dissolvidos em DMSO (6 mL). K2CO3 anidro (66 mg, 0,48 mmol, 1,65 eq) foi adicionado e a mistura reacional foi agitada em temperatura ambiente durante 27 h. Após extração com Et2O, o produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna flash (SiO2; EtOAc/éter de petróleo, 1:50) para produzir o composto título como um sólido incolor (86 mg, 0,29 mmol, 98% de rendimento). Rf = 0,50 (EtOAc/PE 1:10). HRMS (ESI) calcd. para C17H21N2O3+ [M+H]+ 301,1547, encontrado: 301,1545. RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ 9,07 (d, J = 2,7 Hz, 1H, Haromático), 8,46 (dd, J = 9,1, 2,8 Hz, 1H, Haromático), 7,45 - 7,35 (m, 2H, H aromático) , 7,14 - 7, 05 (m, 2H, Haromático) , 6, 99 (dd, J = 9,0, 0,6 Hz, 1H, Haromático), 1,65 - 1,54 (m, 2H, C(CH3)2CH2CH2CH3), 1,32 (s, 6H, C(CH3)2CH2CH2CH3), 1,19 - 1,05 (m, 2H, C(CH3)2CH2CH2CH3), 0,84 (t, J = 7,3 Hz, 3H, C(CH3)2CH2CH2CH3). RMN 13C (101 MHz, CDCl3) δ 167, 17, 150, 43, 147, 69, 145,21, 140,26, 134,90, 127,44, 120,72, 111,29, 47,27, 37,74, 29,07, 18,08, 14,87.(3r,5r,7r)-1-(4-(4-nitrofenóxi)fenil)adamantano, I3-nM
Figure img0047
[0157] Após o procedimento A, 4-fluornitrobenzeno (303 mg, 2,15 mmol, 1,00 eq.) e 4-adamantilfenol (600 mg, 2,63 mmol, 1,22 eq.) foram dissolvidos em DMSO (6 mL). K2CO3 anidro (450 mg, 3,26 mmol, 1,52 eq) foi adicionado e a mistura reacional foi agitada em temperatura ambiente durante 20 h. Após extração com Et2O, o produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna flash (SiO2; EtOAc/éter de petróleo, de 1:100 a 1:50) para produzir o composto título como um sólido amarelo pálido (736 mg, 2,11 mmol, 98% de rendimento). Rf = 0,73 (EtOAc/PE 1:10). HRMS (ESI) calcd. para C22H24NO3+[M+H]+ 350,1751, encontrado: 350,1760. RMN1H (400 MHz, CDCl3) δ 8,27 8,10 (m, 2H, Haromático), 7,46 - 7,35 (m, 2H, Haromático), 7,08 - 6,95 (m, 4H, Haromático), 2,13 - 2,10 (m, 3H, H de adamantil), 1,93 (d, J = 2,9 Hz, 6H, H de adamantil), 1,88 - 1,70 (m, 6H, H de adamantil). RMN 13C (101 MHz, CDC13) δ 163, 85, 152,30, 148,86, 142,53, 126,86, 126,85, 126,03, 120,18, 117,00, 43,40, 36,82, 36,17, 29,03.(3r,5r,7r)-1-(4-(2-flúor-4-nitrofenóxi)fenil)adamantano,13 nN
Figure img0048
[0158] Após o procedimento A, 3,4-difluornitrobenzeno (303 mg, 1,90 mmol, 1,00 eq.) e 4-adamantilfenol (533 mg, 2,34 mmol, 1,23 eq.) foram dissolvidos em DMSO (6 mL). K2CO3 anidro (395 mg, 2,86 mmol, 1,50 eq) foi adicionado e a mistura reacional foi agitada em temperatura ambiente durante 4 h. Após extração com Et2O, o produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna flash (SiO2; EtOAc/éter de petróleo, 1:100) para produzir o composto título como um sólido incolor (703 mg, 1,91 mmol, rendimento quantitativo). Rf = 0,69 (EtOAc/PE 1:10). HRMS (APPI) calcd. para C22H22FNO+ [M]+367,1584, encontrado: 367,1581. RMN1H (400 MHz, CDCl3) δ 8,08 (dd, J = 10,3, 2,7 Hz, 1H, Haromático), 7,96 (ddd, J = 9,1, 2,7, 1,5 Hz, 1H, Haromático) , 7,46 - 7,36 (m, 2H, Haromático) , 7,06 - 7,00 (m, 2H, Haromático), 6,95 (dd, J = 9,1, 8,0 Hz, 1H, Haromático), 2,17 - 2,07 (m, 3H, H de adamantil), 1,92 (d, J = 2,9 Hz, 5H, H de adamantil), 1,87 - 1,71 (m, 5H, H de adamantil). RMN C (101 MHz, CDCl3) δ 153,36, 153,35, 152,24, 152,21, 151,99, 151,88, 150,85, 150,83, 148,98, 126,89,120,70, 120,66, 119,44, 119,42, 117,72, 117,70, 113,30,113,07, 43,38, 36,81, 36,17, 29,02. 2-(4-isopropilfenóxi)-5-nitropiridina, I3-nO
Figure img0049
[0159] Após o procedimento A, 2-cloro-5-nitropiridina (303 mg, 1,91 mmol, 1,00 eq.) e 4-isopropifenol (331 mg, 2,43 mmol, 1,27 eq.) foram dissolvidos em DMF (6,0 mL). K2CO3 anidro (398 mg, 2,88 mmol, 1,51 eq) foi adicionado e a mistura reacional foi agitada em temperatura ambiente durante 24 h. Após extração com Et2O, o produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna flash (SiO2; EtOAc/éter de petróleo, 1:100) para produzir o composto título como um sólido amarelo pálido (490 mg, 1,90 mmol, 99% de rendimento). Rf = 0,40 (EtOAc/PE 1:20). HRMS (ESI) calcd. para C14H15N2O3+[M+H]+ 259,1077, encontrado: 259,1072. RMN1H (400 MHz, CDCl3) δ 9,04 (d, J = 3,4 Hz, 1H, Haromático), 8,44 (dd, J = 9,1, 2,8 Hz, 1H, Haromático), 7,37 - 7,28 (m, 2H, Haromático), 7,12 - 7,06 (m, 2H, Haromático), 7,03 - 6,97 (m, 1H, Haromático), 2,96 (hept, J = 6,9 Hz, 1H, CH(CH3)2), 1,30 (d, J = 7,0 Hz, 6H, CH(CH3)2). RMN13C (101 MHz, CDCl3)δ 167,08, 150,67, 146,49, 145,02, 140,18, 134,81, 127,84, 121,11, 111,24, 33,62, 24,03. 5-nitro-2-(4-(2,4,4-trimetilpentan-2-il)fenóxi)piridina,I3-nP
Figure img0050
[0160] Após o procedimento A, 2-cloro-5-nitropiridina (303 mg, 1,91 mmol, 1,00 eq.) e 4-terc-octilfenol (495 mg, 2,40 mmol, 1,25 eq) foram dissolvidos em DMSO (5 mL). K2CO3 anidro (426 mg, 3,08 mmol, 1,61 eq) foi adicionado e a mistura reacional foi agitada a 40 °C durante 28 h. Após extração com Et2O, o produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna flash (SiO2; EtOAc/éter de petróleo, 1:50) para produzir o composto título como um sólido incolor (598 mg, 1,82 mmol, 95% de rendimento). Rf = 0,65 (EtOAc/PE 1:10). HRMS (ESI) calcd. para C19H25N2O3+[M+H]+329,1860, encontrado: 329,1854. RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ 9,07 (d, J = 2,8 Hz, 1H, Haromático), 8,45 (dd, J = 9,1, 2,8 Hz, 1H, Haromático), 7,52 - 7,40 (m, 2H, H aromático) , 7,14 - 7, 03 (m, 2H, Haromático) , 6, 97 (d, J = 9,1 Hz, 1H, Haromático), 1,76 (s, 2H, Ar-C(CH3)2CH2C(CH3)3), 1,40 (s, 6H, Ar-C(CH3)2CH2C(CH3)3), 0,75 (s, 9H,Ar-C(CH3)2CH2C(CH3)3). RMN13C (101 MHz, CDCl3) δ 167,β4, 150,49, 148,12, 145,30, 140,29, 134,92, 127,78, 120,57, 111,15, 57,28, 38,63, 32,55, 31,93, 31,62.
Procedimento Geral B:
[0161] Os respectivos derivados nitro (I3-n, I3-nA a I3-nP) foram primeiramente dissolvidos em MeOH ou tolueno, ou adicionados diretamente a uma suspensão de quantidades catalíticas de Pd (10%) no pó de carvão ativado em MeOH. O frasco foi purgado com H2 (6x) e a mistura reacional foi agitada em temperatura ambiente até a completa conversão. A mistura reacional foi, em seguida, filtrada através de Celite. O solvente foi removido sob pressão reduzida a 30 °C e o produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna de flash para produzir os compostos títulos correspondentes (I3, I3-A a I3-P).6-(4-(terc-butil)fenóxi)piridin-3-amina, I3
Figure img0051
[0162]Após o procedimento B, I3-n (300 mg, 1,10 mmol 1,00 eq.) foi adicionado a uma suspensão de Pd (10%) em carvão ativado em pó (82 mg, Pd 0,08 mmol, 0,07 eq.) em MeOH (15 mL). O frasco foi purgado com H2 (6x) e a mistura reacional foi agitada em temperatura ambiente durante 2 h. O produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna flash (SiO2; DCM/MeOH 1%) para produzir o composto título como um sólido bege pálido (250 mg, 1,03 mmol, 94% de rendimento). Rf = 0,40 (DCM/MeOH 4%). HRMS (ESI) calcd. para C15H19N2O+[M+H]+243,1492, encontrado: 243,1487. RMN1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,69 (d, J = 3, 0 Hz, 1H, Haromático) , 7,39 - 7,31 (m, 2H, Haromático) , 7,03 (dd, J = 8,6, 3,0 Hz, 1H, Haromático), 7,00 - 6,93 (m, 2H, H aromático), 6,72 (d, J = 8,6 Hz, 1H, Haromático), 3,48 (s, 1H, NH2), 1,31 (s, 9H, C(CH3)3). RMN13C (101 MHz, CDCl3) δ 156,6β, 153,28, 146,33, 138,82, 134,06, 126,86, 126,47, 119,24,112,36, 34,33, 31,52.6-(4-ciclo-hexilfenóxi)piridin-3-amina, I3-A
Figure img0052
[0163] Após o procedimento B, I3-nA (201 mg, 0,67 mmol, 1,00 eq.) foi adicionado a uma suspensão de Pd (10%) em carvão ativado em pó (47 mg, Pd 0,04 mmol, 0,07 eq.) em MeOH (15 mL). O frasco foi purgado com H2 (6x) e a mistura reacional foi agitada em temperatura ambiente durante 5 h. O produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna flash (SiO2; DCM/MeOH 1%) para produzir o composto título como um sólido bege (190 mg, 0,71 mmol, rendimento quantitativo). Rf = 0,36 (DCM/MeOH 4%). HRMS (ESI) calcd. para C17H21N2O+[M+H]+269,1648, encontrado: 269,1643. RMN1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,70 (d, J = 2,9 Hz, 1H, Haromático), 7,22 - 7,13 (m, 2H, Haromático), 7,04 (dd, J = 8,6, 3,0 Hz, 1H, Haromático), 7,01 - 6,92 (m, 2H, H aromático), 6,73 (dd, J = 8,8, 0,7 Hz, 1H, Haromático), 3,36 (s, 2H, NH2) , 2,51 -2,44 (m, 1H, H de ciclo-hexila) , 1,97 - 1,67 (m, 5H, H de ciclo-hexila), 1,49 - 1,15 (m, 5H, H deciclo-hexila). RMN13C (101 MHz, CDCl3) δ 156,88, 153,61, 143,47, 138,67, 134,21, 127,92, 126,96, 119,68, 112,38, 43,99, 34,68, 27,01, 26,25. 6-(4-(terc-pentil)fenóxi)piridin-3-amina, I3-B
Figure img0053
[0164] Após o procedimento B, I3-nB (200 mg, 0,70 mmol, 1,00 eq.) foi adicionado a uma suspensão de Pd (10%) em carvão ativado em pó (52 mg, Pd 0,05 mmol, 0,07 eq.) em MeOH (15 mL). O frasco foi purgado com H2 (6x) e a mistura reacional foi agitada em temperatura ambiente durante 3 h. O produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna flash (SiO2; DCM/MeOH 0,5%) para fornecer o composto título como um sólido bege (107 mg, 0,42 mmol, 60% de rendimento). Rf = 0,41 (DCM/MeOH 4%). HRMS (ESI) calcd. para C16H21N2O+ [M+H]+257,1648,encontrado: 257,1648. RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,7Y (d, J = 2,9 Hz, 1H, Haromático), 7,34 - 7,23 (m, 2H, Haromático), 7,06 (dd, J = 8,6, 3,0 Hz, 1H, Haromático), 7,02 - 6,94 (m, 2H, H aromático), 6,73 (d, J = 8,6 Hz, 1H, Haromático), 3,35 (s, 2H, NH2), 1,62 (q, J = 7,4 Hz, 2H, Ar-C(CH3)2CH2CH3), 1,27 (s, 6H, Ar-C(CH3)2CH2CH3), 0,70 (t, J = 7,4 Hz, 3H, Ar-C(CH3)2CH2CH3). RMN 13C (101 MHz, CDCl3) δ 156, 80, 153, 36, 144,75, 138,72, 134,30, 127,19, 126,97, 119,13, 112,51, 37,63, 37,04, 28,64, 9,26.4-(4-(terc-butil)fenóxi)anilina, I3-C
Figure img0054
[0165] Após o procedimento B, I3-nC (300 mg, 1,11 mmol, 1,00 eq.) foi adicionado a uma suspensão de Pd (10%) em carvão ativado em pó (59 mg, 0,06 mmol de Pd, 0,05 eq.) em MeOH (15 mL). O frasco foi purgado com H2 (6x) e a mistura reacional foi agitada em temperatura ambiente durante 3,5 h. O produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna flash (SiO2; acetato de etila/éter de petróleo, de 1:100 a 1:10) para fornecer o composto título como um óleo amarelo escuro (244 mg, 1,01 mmol, 91% de rendimento). Rf = 0,78 (DCM/MeOH 4%). HRMS (ESI) calcd. para C16H20NO+[M+H]+242,1539, encontrado: 242,1530. RMN 1H (400 MHz, CDC13) δ 7,YY - 7,27 (m, 2H, Haromático), 6,91 - 6,84 (m, 4H, Haromático), 6,72 - 6,66 (m, 2H, Haromático), 3,49 (s, 2H, NH2), 1,31 (s, 9H, C(CH3)3). RMN13C (101 MHz, CDCl3) δ 156,55, 149,24, 145,05, 142,30, 126,45, 121,08, 116,90, 116,49, 34,33, 31,66.6-(4-butilfenóxi)piridin-3-amina, I3-D
Figure img0055
[0166] Após o procedimento B, I3-nD (170 mg, 0,62 mmol, 1,00 eq.) foi adicionado a uma suspensão de Pd (10%) em carvão ativado em pó (53 mg, 0,05 mmol de Pd, 0,08 eq) em MeOH (15 mL). O frasco foi purgado com H2 (6x) e a mistura reacional foi agitada em temperatura ambiente durante 1,5 h. O produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna flash (SiO2; DCM/MeOH 1%) para produzir o composto título como um óleo marrom (133 mg, 0,55 mmol, 88% de rendimento). Rf = 0,38 (DCM/MeOH 4%). HRMS (ESI) calcd. para C15H19N2O+[M+H]+243,1492, encontrado: 243,1485. RMN1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,69 (d, J = 3,1 Hz, 1H, Haromático), 7,20 - 7,09 (m, 2H, Haromático), 7,03 (dd, J = 8, 6, 3, 0 Hz, 1H, Haromático) , 7,00 - 6, 91 (m, 2H, Haromático) , 6,72 (d, J = 8,6 Hz, 1H, H aromático), 3,36 (s, 2H, NH2), 2,67 - 2,51 (m, 2H, Ar-CH2CH2CH2CH3), 1,66 - 1,52 (m, 2H,Ar-CH2CH2CH2CH3), 1,41 - 1,31 (m, 2H, Ar- Ar-CH2CH2CH2CH3), 0,93 (t, J = 7,3 Hz, 3H, Ar-CH2CH2CH2CH3). RMN 13C (101 MHz, CDCl3) δ 156,83, 153,55, 138,75, 138,26, 134,12, 129,48, 126,90, 119,74, 112,28, 35,02, 33,74, 22,40, 14,02.4-(4-(terc-pentil)fenóxi)anilina, I3-E
Figure img0056
[0167] Após o procedimento B, I3-nE (313 mg, 1,10 mmol, 1,00 eq.) foi dissolvido em MeOH (10 mL) e adicionado a uma suspensão de Pd (10%) em carvão ativado em pó (52 mg, 0,05 mmol de Pd, 0,04 eq) em MeOH (5 mL). O frasco foi purgado com H2 (6x) e a mistura reacional foi agitada em temperatura ambiente durante 3 h. O produto bruto foi purificado por filtração através de uma fina camada de SiO2 (DCM/MeOH 4%) para produzir o composto título como um óleo bege (293 mg, 1,15 mmol, rendimento quantitativo). Rf = 0,09 (EtOAc/PE 1:20). HRMS (ESI) calcd. para C17H22N2O+[M+H]+256,1696, encontrado: 256,1692. v (400 MHz, CDCl3) δ 7,29 - 7,19 (m, 2H, Haromático), 6,98 - 6,81 (m, 4H, Haromático), 6,76 - 6,61 (m, 2H, Haromático), 3,47 (s, 2H, NH2), 1,63 (q, J = 7,4 Hz, 2H, Ar-C(CH3)2CH2CH3), 1,28 (s, 6H, Ar-C(CH3)2CH2CH3), 0,71 (t, J = 7,4 Hz, 3H, Ar-C(CH3)2CH2CH3). RMN13C (101 MHz, CDCl3) δ 156,45, 149,08, 143,29, 142,55, 127,08, 121,04, 116,79, 116,33, 37,50, 37,06, 28,69, 9,27. 4-(4-ciclo-hexilfenóxi)anilina, I3-F
Figure img0057
[0168] Após o procedimento B, I3-nF (352 mg, 1,18 mmol, 1,00 eq.) foi dissolvido em tolueno (5 mL) e adicionado a uma suspensão de Pd (10%) em carvão ativado em pó (38 mg, 0,04 mmol de Pd, 0,03 eq.) em MeOH (10 mL). O frasco foi purgado com H2 (6x) e a mistura reacional foi agitada em temperatura ambiente durante 2 h. O produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna flash (SiO2; DCM) para produzir o composto título como um sólido bege (315 mg, 1,18 mmol, rendimento quantitativo. Rf = 0,86 (DCM/MeOH 4%). HRMS (ESI) calcd. para C18H22NO+[M+H]+ 268,1696, encontrado: 268,1692. RMN1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,17 - 7,07 (m, 2H, Haromático), 6, 94 - 6, 82 (m, 4H, Haromático), 6, 72 - 6, 62 (m, 2H, Haromático) , 3,49 (s, 2H, NH2) , 2,51 — 2,44 (m, 1H, H de ciclo-hexila), 1,98 - 1,68 (m, 5H, H de ciclo-hexila), 1,46 - 1,21 (m, 5H, H de ciclo-hexila). RMN13C (101 MHz, CDCla) δ 156,87, 149,13, 142,53, 142,05, 127,81, 121,02, 117,22, 116,33, 43,90, 34,79, 27,05, 26,27.6-(4-((3r,5r,7r)-adamantan-1-il)fenóxi)piridin-3-amina, I3-G
Figure img0058
[0169] Após o procedimento B, I3-nG (278 mg, 0,79 mmol, 1,00 eq.) foi dissolvido em tolueno (10 mL) e adicionado a uma suspensão de Pd (10%) sobre carvão ativado em pó (56 mg, 0,05 mmol de Pd, 0,07 eq.) em MeOH (10 mL). O frasco foi purgado com H2 (3x) e a mistura reacional foi agitada em temperatura ambiente durante 3 h. O produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna flash (SiO2; DCM/MeOH de 0 a 1%) para fornecer o composto título como um sólido incolor (176 mg, 0,55 mmol, 69% de rendimento). Rf = 0,43 (DCM/MeOH 4%). HRMS (ESI) calcd. para C21H25N2O+[M+H]+321,1961, encontrado: 321,1959. RMN1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,71 (d, J = 3,0 Hz, 1H, Haromático), 7,37 - 7,29 (m, 2H, Haromático), 7, 08 - 6, 96 (m, 3H, H aromático), 6,74 (d, J = 8,6 Hz, 1H, Haromático), 3,40 (s, 2H, NH2), 2,12 - 2,09 (m, 3H, H de adamantil), 1,93 (dd, J = 9,7, 3,0 Hz, 5H, H de adamantil), 1,86 - 1,70 (m, 5H, H de adamantil). RMN 13C (101 MHz, CDCI3) δ 156, 73, 153, 37, 151,35, 146, 65, 138,76, 134,15, 128,14, 126,86, 126,06, 125,54, 124,88, 119,29, 112,40, 43,36, 43,22, 36,87, 36,84, 35,87, 29,02.6-(3-(terc-butil)fenóxi)piridin-3-amina, I3-H
Figure img0059
[0170] Após o procedimento B, I3-nH (362 mg, 1,33 mmol, 1,00 eq.) foi dissolvido em MeOH (10 mL) e adicionado a uma suspensão de Pd (10%) em carvão ativado em pó (44 mg, 0,04 mmol de Pd, 0,03 eq) em MeOH (5 mL). O frasco foi purgado com H2 (5x) e a mistura reacional foi agitada em temperatura ambiente durante 2 h. O produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna flash (SiO2; DCM/MeOH de 0 a 1%) para fornecer o composto título como um óleo marrom pálido (303 mg, 1,25 mmol, 94% de rendimento). Rf = 0,44 (DCM/MeOH 4%). HRMS (ESI) calcd. para C15H19N2O+[M+H]+243,1492, encontrado: 243,1493. RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,9β (d, J = 3,0 Hz, 1H, Haromático), 7,48 - 7,40 (m, 1H, Haromático), 7,32 (ddd, J = 7,8, 1,9, 1,0 Hz, 1H, Haromático), 7,29 - 7,27 (m, 1H, Haromático), 7,24 (d, J = 3,0 Hz, 1H, Haromático), 7,01 (ddd, J = 8,0, 2,4, 1,0 Hz, 1H, Haromático), 6,92 (dd, J = 8,6, 0,7 Hz, 1H, Haromático), 3,40 (s, 2H, NH2) 1,48 (s, 9H, C(CH3)3). RMN 13C (101 MHz, CDCl3) δ 156, 81, 155, 65, 153, 31, 138, 69, 134,40, 129, 10, 126, 99, 120,85, 117,23, 116,69, 112,54, 34,89, 31,41.4-(4-(terc-butil)fenóxi)-3-fluoranilina, I3-I F
Figure img0060
[0171] Após o procedimento B, I3-nI (501 mg, 1,73 mmol, 1,00 eq.) foi dissolvido em MeOH (13 mL) e adicionado a uma suspensão de Pd (10%) sobre carvão ativado em pó (56 mg, 0,05 mmol de Pd, 0,03 eq.) em MeOH (2 mL). O frasco foi purgado com H2 (5x) e a mistura reacional foi agitada em temperatura ambiente durante 1,5 h. O produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna flash (SiO2; DCM) para produzir o composto título como um sólido incolor (455 mg, 1,75 mmol, rendimento quantitativo). Rf = 0,76 (DCM/MeOH 1%). HRMS (ESI) calcd. para C16H19FNO+[M+H]+260,1445, encontrado: 260,1442. RMN 1H (4 00 MHz, CDC13) δ 7,Y7 - 7,2 9 (m, 2H, Haromático) , 6,94 (t, J = 8,8 Hz, 1H, Haromático), 6,91 - 6,85 (m, 2H, H aromático), 6,52 (dd, J = 12,0, 2,7 Hz, 1H, Haromático), 6,42 (ddd, J = 8,6, 2,7, 1,3 Hz, 1H, Haromático), 3,61 (s, 2H, NH2), 1,33 (s, 9H, C(CH3)3). RMN13C (101 MHz, CDCl3) δ 156,58, 156,44, 154,12, 145,02, 144,42, 144,33, 134,83, 134,71, 126,41,123,92, 123,90, 115,43, 110,97, 110,93, 103,93, 103,72, 34,25, 31,59. 4-(4-ciclo-hexilfenóxi)-3-fluoranilina, I3-J
Figure img0061
[0172] Após o procedimento B, I3-nJ (550 mg, 1,74 mmol, 1,00 eq.) foi dissolvido em MeOH (12 mL) e adicionado a uma suspensão de Pd (10%) sobre carvão ativado em pó (46 mg, 0,04 mmol de Pd,, 0,03 eq.) em MeOH (3 mL). O frasco foi purgado com H2 (6x) e a mistura reacional foi agitada em temperatura ambiente durante 2 h. O produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna flash (SiO2; DCM/éter de petróleo, de 1:1 a 2:1) para fornecer o composto título como um sólido rosa pálido (489 mg, 1,71 mmol, 98% de rendimento). Rf = 0,81(DCM/MeOH 4%). HRMS (ESI) calcd. para C18H21FNO+[M+H]+286,1602, encontrado: 286,1613. RMN1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,19 - 7,10 (m, 2H, H aromático), 6,93 (t, J = 8,8 Hz, 1H, H aromático), 6,90 - 6,83 (m, 2H, H aromático), 6,51 (dd, J = 12,1, 2,7 Hz, 1H, Haromático), 6,41 (ddd, J = 8,6, 2,7, 1,2 Hz, 1H, Haromático), 3,66 (s, 2H, NH2), 2,52 - 2,45 (m, 1H, H de ciclo-hexila), 1,96 - 1,72 (m, 5H, H de ciclo-hexila), 1,53 - 1,18 (m, 5H, H de ciclo-hexila) RMN13C (101 MHz, CDCl3) δ 156,74, 156,55, 154,09, 144,39, 144,30, 142,04, 134,86, 134,74, 127,79, 123,89,115,76, 110,93, 110,90, 103,90, 103,69, 43,80, 34,72, 26,99, 26,22.3-flúor-4-(4-(terc-pentil)fenóxi)anilina, I3-k
Figure img0062
[0173] Após o procedimento B, I3-nK (497 mg, 1,64 mmol, 1,00 eq.) foi dissolvido em MeOH (13 mL) e adicionado a uma suspensão de Pd (10%) sobre carvão ativado em pó (28 mg, 0,03 mmol de Pd, 0,02 eq.) em MeOH (2 mL). O frasco foi purgado com H2 (6x) e a mistura reacional foi agitada em temperatura ambiente durante 1,5 h. O produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna flash (SiO2; acetato de etila/éter de petróleo, de 1:10 a 1:7,5) para fornecer o composto título como um óleo de cor laranja (463 mg, 1,69 mmol, rendimento quantitativo). Rf = 0,28 (EtOAc/éter de petróleo 1:5). HRMS (ESI) calcd. para C17H21FNO+[M+H]+274,1602, encontrado: 274,1599. RMN 1H (400 MHz, CDC13) δ 7,β6 — 7,17 (m, 2H, H aromático) , 6, 92 (t, J = 8,8 Hz, 1H, Haromático) , 6,89 - 6, 80 (m, 2H, H aromático), 6,51 (dd, J = 12,0, 2,7 Hz, 1H, H aromático), 6,42 (ddd, J = 8,7, 2,7, 1,2 Hz, 1H, H aromático), 3,65 (s, 2H, NH2), 1,61 (q, J = 7,4 Hz, 2H, Ar-C(CH3)2CH2CH3), 1,26 (s, 6H, Ar-C(CH3)2CH2CH3), 0,69 (t, J = 7,4 Hz, 3H, Ar-C(CH3)2CH2CH3). RMN13C (101 MHz, CDCl3)δ 156,61, 156,37, 154,15, 144,34, 144,25, 143,34, 134,98, 134,86, 123,95,123,92, 115,41, 110,98, 110,95, 104,00, 103,78, 37,07, 28,68, 9,26.6-(4-(2-metilpentan-2-il))fenóxi)piridin-3-amina, I3-L
Figure img0063
[0174] Após o procedimento B, I3-nL (50 mg, 0,17 mmol, 1,00 eq.) foi dissolvido em MeOH (12 mL) e adicionado a uma suspensão de Pd (10%) sobre carvão ativado em pó (31 mg, 0,03 mmol de Pd, 0,17 eq.) em MeOH (3 mL). O frasco foi purgado com H2 (6x) e a mistura reacional foi agitada em temperatura ambiente durante 1,5 h. O produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna flash (SiO2; DCM/MeOH 1%) para produzir o composto título como um óleo de cor laranja pálido (39 mg, 0,14 mmol, 87% de rendimento). Rf = 0,41 (DCM/MeOH 4%). HRMS (ESI) calcd. para C17H23N2O+ [M+H]+271,1805, encontrado:271,1796. RMN 1H (400 MHz, CDCI3) δ 7,7Y (d, J = 2,9 Hz, 1H, Haromático), 7,32 - 7,26 (m, 2H, Haromático), 7,07 (dd, J = 8, 6, 3, 0 Hz, 1H, Haromático) , 7,01 - 6, 94 (m, 2H, Haromático) , 6,74 (d, J = 8,6 Hz, 1H, H aromático), 3,35 (s, 2H, NH2), 1,61 - 1,51 (m, 2H, C(CH3)2CH2CH2CH3), 1,27 (s, 6H, C(CH3)2CH2CH2CH3),1,16 - 1,01 (m, 2H, C(CH3)2CH2CH2CH3), 0,82 (t, J = 7,3 Hz, 3H, C(CH3)2CH2CH2C H3). RMN 13C (101 MHz, CDCl3) δ 156, 82, 153, 32, 145,10, 138,67, 134,32, 128,12, 127,09, 126,99, 119,62,119,13, 112,53, 47,31, 37,49, 29,17, 18,08, 14,90.4-(4-((3r,5r,7r)-adamantan-1-il)fenóxi)anilina, I3-M
Figure img0064
[0175] Após o procedimento B, I3-nM (615 mg, 1,76 mmol, 1,00 eq.) foi dissolvido em tolueno (15 mL) e adicionado a uma suspensão de Pd (10%) sobre carvão ativado em pó (126 mg, 0,12 mmol de Pd, 0,07 eq.) em MeOH (10 mL). O frasco foi purgado com H2 (6x) e a mistura reacional foi agitada em temperatura ambiente durante 19 h. O produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna flash (SiO2; DCM) para produzir o composto título como um sólido bege (538 mg, 1,68 mmol, 96% de rendimento). Rf = 0,39 (DCM/MeOH 1%). HRMS (ESI) calcd. para C22H26NO+[M+H]+320,2009, encontrado: 320,2006. RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,Y2 - 7,25 (m, 2H, Haromático), 6, 93 - 6, 86 (m, 4H, Haromático), 6,72 - 6,65 (m, 2H, Haromático), 3,56 (s, 2H, NH2), 2,14 - 2,06 (m, 3H, H de adamantil), 1,90 (d, J = 2,9 Hz, 5H, H de adamantil), 1,84 - 1,71 (m, 5H, H de adamantil). RMN 13C (101 MHz, CDCl3) δ 156, 59, 149, 02, 145, 32, 142,51, 125, 98, 121,10, 116,84, 116,34, 43,45, 36,88, 35,78, 29,07. 4-(4-((3r,5r,7r)-adamantan-1-il)fenóxi)-3-fluoranilina,I3-N
Figure img0065
[0176] Após o procedimento B, I3-nN (570 mg, 1,55 mmol, 1,00 eq.) foi dissolvido em tolueno (10 mL) e adicionado a uma suspensão de Pd (10%) sobre carvão ativado em pó (143 mg, 0,13 mmol de Pd, 0,09 eq.) em MeOH (10 mL). O frasco foi purgado com H2 (6x) e a mistura reacional foi agitada em temperatura ambiente durante 7 h. O produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna flash (SiO2; DCM) para produzir o composto título como um sólido incolor (510 mg, 1,51 mmol, 97% de rendimento). Rf = 0,67 (DCM/MeOH 1%). HRMS (ESI) calcd. para C22H25FNO+[M+H]+338,1915, encontrado: 338,1916. RMN 1H (400 MHz, CDC13) δ 7,Y2 - 7,23 (m, 2H, Haromático), 6,92 (t, J = 8, 8 Hz, 1H, Haromático) , 6,89 - 6, 81 (m, 2H, Haromático) , 6, 51 (dd, J = 12,0, 2,7 Hz, 1H, H aromático), 6,41 (ddd, J = 8,7, 2,7, 1,2 Hz, 1H, H aromático), 3,64 (s, 2H, NH2), 2,11 - 2,07 (m, 3H, H de adamantil), 1,89 (d, J = 2,9 Hz, 5H, H de adamantil), 1,83 - 1,70 (m, 5H, H de adamantil). RMN13C (101 MHz, CDCl3) δ 156,60, 156,47, 154,15, 145,37, 144,33, 144,24, 134,91, 134,79, 125,98, 123,97, 123,95, 115,47, 110,98, 110,95,103,98, 103,76, 43,43, 36,86, 35,76, 29,06. 6-(4-isopropilfenóxi)piridin-3-amina, I3-O
Figure img0066
[0177] Após o procedimento B, I3-nO (202 mg, 0,78 mmol,1,00 eq.) foi adicionado a uma suspensão de Pd (10%) sobre carvão ativado em pó (76 mg, 0,07 mmol de Pd, 0,09 eq.) em MeOH (15 mL). O frasco foi purgado com H2 (6x) e a mistura reacional foi agitada em temperatura ambiente durante 1 h. O produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna flash (SiO2; DCM/MeOH 1%) para fornecer o composto título como um sólido bege (150 mg, 0,66 mmol, 84% de rendimento). Rf = 0,42 (DCM/MeOH 4%). HRMS (ESI) calcd. para C14H17N2O+[M+H]+229,1335, encontrado: 229,1326. RMN1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,70 (d, J = 2,9 Hz, 1H, Haromático), 7,24 - 7,14 (m, 2H, Haromático), 7,05 (dd, J = 8, 6, 3, 0 Hz, 1H, Haromático) , 7,01 - 6, 93 (m, 2H, Haromático) , 6,73 (d, J = 8,6 Hz, 1H, H aromático), 3,33 (s, 2H, NH2), 2,89 (hept, J = 6,9 Hz, 1H, CH(CH3)2), 1,24 (d, J = 7,0 Hz, 6H, CH(C H3)2). RMN 13C (101 MHz, CDCl3) δ 156, 88, 153, 59, 144,19, 138,68, 134,19, 127,55, 126,97, 119,76, 112,35, 77,48, 77,16, 76,84, 33,57, 24,20.6-(4-(2,4,4-trimetilpentan-2-il)fenóxi)piridin-3-amina,I3-P
Figure img0067
[0178] Após o procedimento B, I3-nP (283 mg, 0,86 mmol, 1,00 eq.) foi dissolvido em tolueno (4 mL) e adicionado a uma suspensão de Pd (10%) sobre carvão ativado em pó (78 mg, 0,07 mmol de Pd, 0,09 eq.) em MeOH (15 mL). O frasco foi purgado com H2 (5x) e a mistura reacional foi agitada em temperatura ambiente durante 2 h. O produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna flash (SiO2; DCM/MeOH 2%) para fornecer o composto título como um sólido incolor (235 mg, 0,79 mmol, 91% de rendimento). Rf = 0,49 (DCM/MeOH 4%). HRMS (ESI) calcd. para C19H27N2O+[M+H]+299,2118, encontrado: 299,2112. RMN 1H (400 MHz, CDC13) δ 7,7Y (dd, J = 3,0, 0,7 Hz, 1H, Haromático) , 7,37 - 7,29 (m, 2H, Haromático), 7,06 (dd, J = 8,6, 3,0 Hz, 1H, Haromático), 6,99 - 6,93 (m, 2H, Haromático), 6,71 (dd, J = 8,6, 0,7 Hz, 1H, Haromático), 3,10 (s, 2H, NH2), 1,72 (s, 2H, Ar-C(CH3)2CH2C(CH3)3), 1,36 (s, 6H, Ar-C(CH3)2CH2C(CH3)3), 0,73 (s, 9H, Ar-C(CH3)2CH2C(CH3)3). RMN13C (101 MHz, CDCl3) δ 156,87, 153,39, 145,48, 138,70, 134,39, 127,37, 126,94,118,96, 112,41, 57,20, 38,36, 32,50, 31,93, 31,68.

Claims (12)

1. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizadapelo fato de compreender (i) um composto selecionado do grupo que consiste em:6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina de fórmula I
Figure img0068
6-(4-(terc-pentil)fenóxi)piridin-3-amina de fórmula IIg
Figure img0069
6-(4-(2-metilpentan-2-il)fenóxi)piridin-3-amina de fórmula IIj
Figure img0070
6-(3-(terc-butil)fenóxi)piridin-3-amina de fórmula IIe
Figure img0071
6-(4-(2,4,4-trimetilpentan-2-il)fenóxi)piridin-3-amina de fórmulaIIm
Figure img0072
6-(4-butilfenóxi)piridin-3-amina de fórmula IIh
Figure img0073
4-(4-ciclo-hexilfenóxi)-3-fluoranilina de fórmula IIIb
Figure img0074
6-(4-ciclo-hexilfenóxi)piridin-3-amina de fórmula IIIc Fórmula IIIc
Figure img0075
6-(4-((3r,5r,7r)-adamantan-1-il)fenóxi)piridin-3-amina de fórmula IVa.
Figure img0076
Fórmula IVa em que o composto que está em uma dose unitária está em uma quantidade que varia entre 0,1 mg a cerca de 1000 mg; e (ii) um veículo farmaceuticamente aceitável
2. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que o composto é selecionado do grupo que consiste em:6-(4-terc-butilfenóxi)piridin-3-amina de fórmula I
Figure img0077
6-(4-(terc-pentil)fenóxi)piridin-3-amina de fórmula IIg,
Figure img0078
Fórmula IIg 6-(3-(terc-butil)fenóxi)piridin-3-amina de fórmula IIe
Figure img0079
3. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que o composto está em uma quantidade que varia entre 1 mg e 500 mg.
4. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 3, caracterizadapelo fato de que o composto está em uma quantidade que varia entre 1 mg e 100 mg.
5. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato do veículo farmaceuticamente aceitável ser um excipiente.
6. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, caracterizadapelo fato de compreender ainda um agente quimioterapêutico.
7. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 6, caracterizadapelo fato do agente quimioterapêutico ser selecionado do grupo que consiste em altretamina, bleomicina, bussulfano, capecitabina, carboplatina, carmustina, clorambucil, cisplatina, cladribina, crisantaspase, ciclofosfamida, citarabina, dacarbazina, daunorrubicina, doxorrubicina, epirrubicina, etoposídeo, fludarabina, fluoruracila, gencitabina, idarrubicina, ifosfamida, irinotecano, lomustina, melfalana, mercaptopurina, metotrexato, mitomicina, mitoxantrona, oxaliplatina, pentostatina, procarbazina, estreptozocina, taco, temozolomida, tioguanina/tioguanina, tiotepa, topotecano, treossulfano, vimblastina, vincristina, vindesina e vinorrelbina
8. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de ser formulada na forma de comprimido ou cápsula.
9. KIT, caracterizado pelo fato de compreender uma ou mais doses de um composto ou uma composição farmacêutica conforme definidos em uma das reivindicações 1 a 8.
10. KIT, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de compreender ainda uma ou mais doses de um agente quimioterapêutico.
11. USO DE UM COMPOSTO, ou de uma composição farmacêutica conforme definidos em uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de ser para inibir a via de sinalização Notch in vitro nas células.
12. USO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que as células são células cancerosas.
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