MX2012014083A - Vacuna oral que comprende un antigeno y un agonista de receptor de tipo toll. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona una composición inmunogénica que comprende uno o más antígenos y un agonista de receptor de tipo Toll (TLR) en una composición oralmente (por ejemplo, sublingualmente) administrada.

Description

VACUNA ORAL QUE COMPRENDE UN ANTIGENO Y UN AGONISTA DE RECEPTOR DE TIPO TOLL CAMPO DE LA INVENCION La presente invención proporciona composiciones inmunogénicas adecuadas para administración oral.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION En general existe una necesidad de incrementar la comodidad del paciente con respecto a la vacunación así como de mejorar la facilidad de fabricación y transporte de vacunas. La inmunización oral puede dirigir algunas de estas necesidades y se puede utilizar para administrar antígenos en combinación con auxiliares para inducir respuestas inmunes específicas de antígeno, ver, por ejemplo, W099/21579.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención proporciona una composición inmunogénica que comprende uno o más antígenos y un agonista receptor de tipo Toll (TLR) en una composición oralmente administrada y su uso en medicina.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS Figura 1: respuestas de Ab de virus específico A/Solomon Island inducidas en suero después de administración s.l. de detergente A/SI/3/2006 dividido con o sin agonista de TLR2 y/o TLR4 como adyuvante. Se anestesiaron ratones y se vacunaron s.l. con A/SI/3/2006 inactivado (7 ó 14 pg) ± SFOMP (5 µ?), Pam3Cysl_ip (10 g) o CT (5 pg) como adyuvante en los días 0 y 14. Dos semanas después de la segunda inmunización, los sueros se recolectaron y se determinaron los niveles de Ab de virus específico A/SI/3/2006 a través de ELISA y se evaluó la funcionalidad de IgG en suero a través del ensayo Hl. Las concentraciones de IgG específicas se muestran como ng/ml, y el número de ratones por grupo teniendo una titulación Hl protectora (>40) se indica en la gráfica de barras. NS = ninguna diferencia importante en los niveles específicos de IgG contra niveles de IgG en ratones intramuscularmente inmunizados. Cada grupo tuvo diez ratones.

Figura 2: respuestas de Ab de virus específico A/Solomon Island inducidas en suero después de administración s.l. de detergente A/SI/3/2006 dividido con o sin agonista de TLR2 y/o TLR4 como adyuvante. Se anestesiaron ratones y se vacunaron s.l. con A/SI/3/2006 inactivado (7 ó 14 pg) adyuvado con CRX527 (1 µ) + Pam3CysLip (5 \ig) o CT (1 g) en los días 0 y 14. Dos semanas después de la segunda inmunización, los sueros se recolectaron y se determinaron los niveles de Ab de virus específico A/SI/3/2006 a través de ELISA. La funcionalidad de IgG en suero se evaluó a través del ensayo Hl. Las concentraciones de IgG específicas se muestran como concentraciones medias geométricas expresadas como ng/ml, y se indican límites de confidencia de 95%. El número de ratones por grupo, teniendo una titulación Hl protectora (>40) se indica en la gráfica de barras. NS= ninguna diferencia importante en los niveles específicos de IgG contra niveles de IgG en ratones intramuscularmente inmunizados. Cada grupo tuvo de 5 a 10 ratones.

Figura 3: respuestas de Ab de virus específico A/Solomon Island inducidas en suero después de administración s.l. de detergente A/SI/3/2006 dividido con agonistas de TLR. Se anestesiaron ratones y se vacunaron s.l. con A/SI/3/2006 inactivado (7.5 pg) adyuvado con SFOMP (1 pg), Pam3CysLip (1 pg), CRX527 (1 pg), CRX642 (1 pg), MPL (1 pg), Flagelina (1 pg), CpG (1 pg) o CT (1 pg) en los días 0 y 14. Dos semanas después de la segunda inmunización, los sueros se recolectaron y se determinaron los niveles de Ab de virus específico A/SI/3/2006 a través de ELISA. La funcionalidad de IgG en suero se evaluó a través del ensayo Hl. Las concentraciones de IgG específicas se muestran como concentraciones medias geométricas expresadas como ng/ml, y se indican límites de confidencia de 95%. El número de ratones por grupo, teniendo una titulación Hl protectora (>40) se indica en la gráfica de barras. NS= ninguna diferencia importante en los niveles específicos de IgG contra niveles de IgG en ratones intramuscularmente inmunizados ( 11 M ) . Cada grupo tuvo un total de 20 ratones que fueron procesados en 5 experimentos de 4 animales/gripo. Debido a dificultadles técnicas, se excluyeron 2 combinaciones de 4 ratones cada una del análisis del grupo inmunizado con CRX527.

DESCRIPCION DETALLADA La presente invención proporciona una composición inmunogénica que comprende uno o más antígenos y un agonista de receptor de tipo Toll (TLR) en una composición oralmente administrada.

La presente invención proporciona una composición inmunogénica que comprende uno o más antígenos y un agonista de receptor de tipo Toll (TLR) en una forma de dispersión sólida oralmente administrada diseñada para desintegrarse rápidamente en la cavidad oral.

En una modalidad más de la invención, se proporciona una composición inmunogénica como aquí se define para usarse en un método para inmunización, el cual comprende el paso de administrar dicha composición oralmente, en particular sublingualmente. En una modalidad más de la invención, se proporciona una composición inmunogénica como aquí se define adecuada para administración oral (en particular sublingual) que comprende uno o más antígenos y un agonista de receptor de tipo Toll (TLR). En otra modalidad adicional de la invención, se proporciona una composición inmunogénica oralmente (en particular, sublingualmente) administrada como aquí se define, que comprende uno o más antígenos y un agonista de receptor de tipo Toll (TLR).

En un aspecto adicional de la invención, se proporciona una composición inmunogénica como aquí se define para usarse en medicina.

En otro aspecto de la invención, se proporciona una composición inmunogénica como aquí se define para usarse en el tratamiento y/o prevención de enfermedades.

Los términos "administración oral", "oralmente administrado", "vacunación oral", "inmunización oral", "suministro oral", como se utilizan aquí, pretenden referirse a la aplicación de antígenos en la cavidad oral, en donde la composición inmunogénica que comprende un antígeno es adsorbida en una forma que promueve una respuesta inmune en el tejido de la mucosa de la región bucofaríngea. Para evitar dudas, estos térmicos no abarcan la administración de un antígeno a través de ingestión, es decir, en donde el antígeno es tragado o de cualquier otra forma entra al estómago. En una modalidad particular, las composiciones inmunogénicas de la invención se administran sublingualmente, es decir, por abajo de la lengua.

Una "composición oralmente (por ejemplo, sublingualmente) administrada", como aquí se utiliza, se refiere a una composición que es administrada a la cavidad oral, en donde la composición inmunogénica o al menos componentes antigénicos de la composición que comprenden un antígeno son adsorbidos en una forma que promueve una respuesta inmune en el tejido de la mucosa de la región bucofaríngea. Para evitar duda, estos términos no abarcan composiciones administradas por ingestión, es decir, en donde el antígeno es tragado o de cualquier otra forma entra al estómago o cualquier otro medio de administración como composición inmunogénica conocida por aquellos expertos en la técnica (por ejemplo, administración intramuscular, intradérmica, intranasal, o transcutánea). En una modalidad particular, las composiciones inmunogénicas de la invención se administran sublingualmente, es decir, por abajo de la lengua.

La composición inmunogénica oralmente administrada puede ser un líquido o una forma de dosis sólida. En una modalidad particular de la invención, la composición inmunogénica está en una forma de dosis sólida, la cual se desintegra rápidamente en la cavidad oral. La composición inmunogénica está en una forma de dispersión sólida, la cual se desintegra rápidamente en la cavidad oral. Después de la desintegración, los componentes de la forma de dosis rápidamente cubren y quedan en contacto con los tejidos de la mucosa de la región bucofaríngea, para incluir el ejido linfoide asociado con la mucosa. Esto lleva a los componentes antigénicos a contacto con tejidos capaces de absorción del antígeno. En una modalidad particular de la invención, se proporciona una composición inmunogénica en formas de dosis sólidas que se desintegra en aproximadamente 1 a aproximadamente 60 segundos, en particular de aproximadamente 1 a aproximadamente 30 segundos, de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 segundos o de aproximadamente 2 a 8 segundos, de colocarse en la cavidad oral. Normalmente, el tiempo de desintegración será menor que 60 segundos que puede ser probado siguiendo el método de desintegración especificado en United States Pharmacopoeia No. 23, 1995, en agua a 37°C.

En particular, las composiciones inmunogénicas oralmente administradas comprenden una substancia muco-adhesiva. Las formas de dosis sólidas adecuadas se describen en W01999/021579 (EP1024824B1).

En una modalidad, particular de la invención, se proporciona una formulación que comprende una substancia muco-adhesiva, en donde la substancia muco-adhesiva se selecciona del grupo de: polímeros poliacrílicos, celulosa y sus derivados o polímeros naturales (por ejemplo, gelatina, alginato de sodio y pectina). En una modalidad particular, el muco-adhesivo se selecciona del grupo que comprende quitosano o sus derivados, almidón y sus derivados, ácido hialurónico y sus derivados, alginato de sodio, gelatina, poligalacturonato de sodio, dextrana, mañano, película de celulosa, polímeros sintéticos no degradables, polímeros a base de ácido poliacrílico, carbopoles o combinaciones de los mismos.

En una modalidad adicional de la invención, las composiciones inmunogénicas comprenden además del antígeno(s) y adyuvante, agentes formadores de matriz y componentes secundarios. Los agentes formadores de matriz adecuados para usarse en la presente invención incluyen materiales derivados de proteínas animal y vegetal, tales como las gelatinas, dextrinas y soya, proteínas de semilla de trigo y de psyllium; gomas tales como acacia, guar, agar, y xantana; polisacáridos; alginatos; carboximetilcelulosa; carragenano; dextranas; pectinas; polímeros sintéticos, tales como polivinilpirrolidona; y polipéptido/proteína o complejos de polisacárido tales como complejos de gelatina-acacia. Otros agentes formadores de matriz adecuados para usarse en la presente invención incluyen azúcares tales como manitol, dextrosa, lactosa, galactosa y trehalosa; azúcares cíclicos tales como ciclodextrina; sales inorgánicas tales como fosfato de sodio, cloruro de sodio y silicatos de aluminio; y aminoácidos teniendo de 2 a 12 átomos de carbono tales como glicina, L-alanina, ácido L-aspártico, ácido L-glutámico, L-hidroxiprolina, L-isoleucina, L-leucina y L-fenílalanina. Uno o más agentes formadores de matriz pueden incorporarse a la solución o suspensión antes de la solidificación. El agente formador de matriz puede estar presente además de un agente tensoactivo o la exclusión de un agente tensoactivo. Además de la formación de matriz, el agente formador de matriz puede ayudar a mantener la dispersión de cualquier ingrediente activo dentro de la solución o suspensión. Esto es especialmente de ayuda en el caso de antígenos que no son suficientemente solubles en agua y, por lo tanto, deben suspenderse más que disolverse.

En una modalidad adicional, las composiciones inmunogénicas además comprenden componentes secundarios tales como conservadores, antioxidantes, agentes tensoactivos, mejoradores de viscosidad, agentes colorantes, agentes saborizantes, modificadores de pH, edulcorantes o agentes enmascadores del sabor, los cuales también pueden ser incorporados a la composición. Los agentes colorantes adecuados incluyen óxidos de hierro rojo, negro y amarillo y colorantes FD & C tales como FD &C azul No. 2 y FD & C rojo No. 40 disponibles de Ellis & Everard. Los agentes saborizantes adecuados incluyen sabores a menta, frambuesa, regaliz, naranja, limón, toronja, caramelo, vainilla, cereza, y uva y combinaciones de éstos. Los modificadores de pH adecuados incluyen ácido cítrico, ácido tartárico, ácido fosfórico, ácido clorhídrico y ácido maleico. Los edulcorantes adecuados incluyen aspartamo, acelsulfamo K y taumático. Los agentes enmascadores de sabor incluyen bicarbonato de sodio, resinas de intercambio iónico, compuestos de inclusión de ciclodextrina, adsorbatos o activos microencapsulados.

Las composiciones inmunogénicas de la invención comprenderán un antigeno, el cual es capaz de producir una respuesta inmune contra un patógeno de ser humano o animal o una substancia que ocasiona patogénesis en seres humanos o animales.

El término "antígeno" es bien conocido por los expertos en la técnica. Un antígeno puede ser una proteína, polísacárido, péptido, ácido nucleico, conjugados de proteína-polisacárido, molécula o hapteno que sea capaz de elevar una respuesta inmune en un ser humano o animal. Los antígenos pueden derivarse, se homólogos o sintetizarse a moléculas mímicas a partir de virus, bacterias, parásitos, protozoarios y hongos. Las composiciones ¡nmunogénicas pueden incluir uno o más antígenos, en dicha modalidad, los antígenos pueden ser tomados del mismo organismo o de organismos diferentes. En una modalidad particular de la invención, el antígeno se deriva de influenza.

Las composiciones inmunogénicas de la invención comprenden un agonista de receptor de tipo T o 11. Por "agonista de TLR" se quiere dar a entender un compuesto que sea capaz de ocasionar una respuesta de señalización a través de una trayectoria de señalización de TLR, ya sea como un ligando directo o indirectamente a través de un ligando endógeno o exógeno (Sabroe et al, Jl 2003 p1630-5).

Los receptores de tipo Toll (TLRs) son receptores de transmembrana de tipo I, evolucionalmente conservados entre insectos y seres humanos. Se han establecido diez TLRs (TLRS 1-10) (Sabroe et al, Jl 2003 p1630-5). Los miembros de la familia de TLR tienen dominios extracelulares e intraceluíares; se ha mostrado que sus dominios extracelulares tienen secuencias de repetición ricas en leucina, y sus dominios intraceluíares son similares a la región intracelular del receptor de interleucina-1 (IL-1R). Las células de TLR se expresan diferencialmente entre células inmunes y otras células (incluyendo células epiteliales vasculares, adipocitos, miocitos cardiacos y células epiteliales intestinales). El dominio intracelular de los TLRs puede ¡nteractuar con la proteína de adaptador Myd88, la cual también posee el dominio IL-1R en su región citoplásmica, conduciendo a la activación de NF-KB de citocinas; esta trayectoria de Myd88 es una a través de la cual la liberación de citocina es efectuada por al activación de TLR. La expresión principal de TLRs es en los tipos de células tales como células de presentación de antigeno (por ejemplo, células dendríticas, macrófagos, etc.).

La activación de células dendríticas mediante estimulación a través de los TLRs conduce a la maduración de células dendríticas, y producción e citocinas inflamatorias tales como IL-12. La investigación realizada ha encontrado que TLRs reconocen diferentes tipos de agonistas, aunque algunos agonistas son comunes a varios TLRs. Los agonistas de TLR predominantemente se derivan de bacterias o virus, e incluyen moléculas tales como flagelina o lipopolisacárido bacteriano (LPS).

En una modalidad, el agonista de receptor de tipo toll es un agonista de receptor 4 de tipo Toll (TLR), preferiblemente un agonista tal como un derivado de lípido A particularmente lípido monofosforilo A o más particularmente lípido A de monofosforilo 3-diacetilado (3D - MPL). 3D-MPL está disponible bajo la marca comercial de MPL® por GlaxoSmithKIine Biologicals North America y principalmente promueve respuesta de célula CD4+ T con un fenotipo de IFN-g (Th1). Puede ser producido de acuerdo con los métodos descritos en GB 2 220 211 A. Químicamente es una mezcla de lípido A de monofosforilo 3-desacetilado con 3, 4, 5, ó 6 cadenas acetiladas. De preferencia en las composiciones de la presente invención se utiliza una pequeña partícula de 3 D-MPL. La pequeña partícula, 3 D-MPL, tiene un tamaño de partícula de manera que puede ser filtrada en forma estéril a través de un filtro de 0.22 µ?t?. Dichas preparaciones se describen en la Solicitud de Patente Internacional No. WO 94/21292. Los derivados sintéticos de lípido A son conocidos y se piensan que son agonistas de TLR 4 incluyendo, pero no limitándose a: OM174 (2-desoxi-6-o-[2-desoxi-2-[(R)-3-dodecanoiloxitetra-decanoilamino]-4-o-fosfono- -D-glucopiranosil]-2-[(R)-3-hidroxitetradecanoilamino]-a-D-glucopiranosil fosfato diácido), (WO 95/14026).

OM 294 DP 1 ,10-bis(fosfato diácido) (3S, 9 R) -3--[(R)-dodecanoilox¡tetradecanoilaminoJ-4-oxo-5-aza-9(R)-[(R)-3-hidroxitetradecanoilamino]decan-1 ,10-diol, (W099 /64301 y WO 00/0462).

OM 197 MP-Ac DP 1-fosfato diácido 10-(6-aminohexanoato) de (3S-, 9R) -3-[(R)-dodecanoiloxitetradecanoilamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hidroxitetradecanoilamino]decan-1 , 10-diol, (WO 01/46127).

Otros ligandos TLR4 que pueden ser utilizados son fosfatos de glucosaminida (AGPs) tales como aquellos descritos en WO9850399 o US6303347 (también se describen procedimientos para la preparación de AGPs), o sales farmacéuticamente aceptables de AGPs como se describe en US6764840. Algunos AGPs son agonistas de TLR4, y algunos son antagonistas de TLR4. Ambos se cree que son útiles como adyuvantes. En una modalidad particular de la invención, el adyuvante es un agonista de TLR-4 que es un AGP. En una modalidad particular, el agonista de TLR4 es CRX524 ó CRX527. CRX527 y CRX524 han sido descritos previamente (ver, Patente de E.U.A. No. 6,113,918; Ejemplos 15 y 16, y WO 2006/12425 y WO 2006/16997).

Otros ligandos de TLR-4 adecuados, capaces de ocasionar una respuesta de señalización a través de TLR-4 (Sabroe et al, Jl 2003 p1630-5) son, por ejemplo, lipopolisacárido de bacterias gram-negativas y sus derivados o fragmentos de las mismas, en particular un derivado no tóxico de LPS (tal como 3D-MPL). Otro agonista de TLR son: proteína de choque térmico (HSP) 10, 60, 65, 70, 75 ó 90; Proteína A de agente tensoactivo, olígosacáridos de híaluronato, fragmentos de sulfato de heparán, fragmentos de fibronectina, péptidos de fibrinógeno y b-defensina-2, muramil dipéptido (MDP) o proteína F del virus sincitial respiratorio. En una modalidad, el agonista de TLR es HSP 60, 70 ó 90.

En una modalidad adicional de la invención, el agonista de TLR es un agonista de TLR2 (Sabroe et al, Jl 2003 p1630-5). Convenientemente, el agonista de TLR capaz de ocasionar una respuesta de señalización a través de TLR-2 es uno o más de una lipoproteína, una peptidoglucano, un lipopéptído bacteriano de M. tuberculosis, B. burgdorferi T pallidum; peptidoglucanos de especies que incluyen Staphylococcus aureus; ácidos lipoteicoicos, ácidos manurónicos, porinas Neisseria, fimbria bacteriana, factores de virulencia de Yersenia, viriones de CMV, hemaglutinina de sarampión, y zimosán de levadura. En una modalidad particular de la invención, el agonista de TLR2. En una modalidad particular de la invención, el agonista de TLR2 es el lipopéptido sintético Pam3Cys-Lip (ver, por ejemplo, Fisette et al., Journal of Biological Chemistry 278(47) 46252).

En una modalidad adicional de la invención, las composiciones inmunogénicas de la invención comprenden un TLR4 y un agonista de TLR2. Én una modalidad particular, las composiciones inmunogénicas de la invención comprenden preparaciones de proteína de membrana externa de Shigella flexineri (SFOMP). En una modalidad particular, las composiciones inmunogénicas comprenden agonista de TLR4, tal como un AGP (por ejemplo, CRX-527 y el agonista de TLR2, Pam3CysLip.

Las composiciones inmunogénicas de la invención pueden comprender un agonista de TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8 o TLR9 o una combinación de los mismos.

En una modalidad de la presente invención, se utiliza un agonista de TLR que sea capaz de ocasionar una respuesta de señalización a través de TLR-1 (Sabroe et al, Jl 2003 p1630-5). Convenientemente, el agonista de TLR capaz de ocasionar una respuesta de señalización a través de TLR-1 se selecciona de: lipopéptidos tri-acilados (LPs); modulina soluble en fenol; Mycobacterium tuberculosis LP; S-(2,3-bis(palmitoiloxi)-(2-RS)- prop¡l)-N-palmitoil-(R)-Cys-(S)-Ser-(S)-Lys(4)-OH, triclorhidrato (Pam3Cys) LP, que ¡mita el término amino acetilado de una lipoproteína bacteriana y OspA LP de Borrelia burgdorfei.

En una modalidad alternativa, se utiliza un agonista de TLR que es capaz de ocasionar una respuesta de señalización a través de TLR3 (Sabroe et al, Jl 2003 p1630-5). Convenientemente, el agonista de TLR capaz de ocasionar una respuesta de señalización a través de TLR-3 es ARN de estructura de cadena doble (dsARN), o ácido poliinosínico-policitidilico (Poli IC), un patrón e ácido nucleico molecular asociado con infección viral.

En una modalidad alternativa, se utiliza un agonista de TLR que es capaz de ocasionar una respuesta de señalización a través de TLR-5 (Sabroe et al, Jl 2003 p1630-5). Convenientemente, el agonista de TLR capaz de ocasionar una respuesta de señalización a través de TLR-5 es una flagelina bacteriana o una variante de la misma.

Dicho agonista de TLR-5 puede ser flagelina o puede ser un fragmento de flagelina, la cual retiene la actividad agonista de TLR-5. La flagelina puede incluir un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de H. pylori, S. typhimurium, V. cholera, S. márceseos, S. flexneri, T. pallidum, L. pneumophilia, B. burgdorferei; C. difficile, R. meliloti, A. tumefaciens; R. lupine; B. clarridgeiae , P. mirabilis, B. subtilus, L. moncytogenes, P. aeruginosa y E. coli.

En una modalidad particular, la flagelina se selecciona del grupo que consiste de flagelina B de S. typhimurium (Genbank Número de acceso AF045151), un fragmento de flagelina B FliC de S. typhimurium, E. coli. (Genbank Número de acceso AB028476); fragmento FliC de E. coli; flagelina FliC de S. typhimurium (ATCC14028) y un fragmento de flagelina FliC de S. typhimurium.

En una modalidad particular, dicho agonista de TLR-5 es una flagelina truncada como se describe en WO2009/156405, es decir, uno en donde el dominio hipervariable ha sido eliminado. En un aspecto de esta modalidad, dicho agonista de TLR-5 se selecciona del grupo que consiste de: FliC^ 74.4oo; FliCAi 6i -405 y FliC 38-4os- En una modalidad más, dicho agonista de TLR-5 es una flagelina como se describe en WO2009/128950.

Si el agonista de TLR-5 es un fragmento de flagelina, se entenderá que dicho fragmento retendrá la actividad de agonista de TLR5, y, por lo tanto, debe retener la porción de esta secuencia responsable de la activación de TLR-5. Un experto en la técnica sabe que los dominios terminales NH2 y COOH de flagelina son importantes para la interacción y activación de TLR-5, en particular, por ejemplo, aminoácidos 86-92 en Salmonella. ^ En una modalidad alternativa, se utiliza un agonista de TLR que es capaz de ocasionar una respuesta de señalización a través de TLR-6 (Sabroe eí al, Jl 2003 p1630-5). Convenientemente, el agonista de TLR capaz de ocasionar una respuesta de señalización a través de TLR-6 es una lipoproteína micobacteriana, LP di-acilado, y modulina soluble en fenol. Además, los agonistas de TLR6 se describen en WO2003043572.

En una modalidad alternativa, se utiliza un agonista de TLR que es capaz de ocasionar una respuesta de señalización a través de TLR-7 (Sabroe et al, Jl 2003 p1630-5). Convenientemente, el agonista de TLR capaz de ocasionar una respuesta de señalización a través de TLR-7 es un ARN de estructura de cadena individual (ssARN), loxoribina, un análogo de guanosina en las posiciones N7 y C8, o un compuesto imidazoquinolina, o derivado de los mismos. En una modalidad, el agonista de TLR es imiquimod. Además, los agonistas de TLR7 se describen en WO02085905.

En una modalidad alternativa, se utiliza un agonista de TLR que es capaz de ocasionar una respuesta de señalización a través de TLR-8 (Sabroe et al, Jl 2003 p1630-5). Convenientemente, el agonista de TLR capaz de ocasionar una respuesta de señalización a través de TLR-8 es un ARN de estructura de cadena individual (ssARN), una molécula de imidazoquinolina con actividad anti-viral, por ejemplo, resiquimod (R848); resiquimod también es capaz de reconocimiento por TLR-7. Otros agonistas de TLR-8 que pueden ser utilizados incluyen aquellos descritos en WO2004071459.

En una modalidad, se proporciona una composición inmunogénica de la invención, en donde el agonista de TLR7/8 es una molécula de imidazoquinolina, en particular, una imidazoquinolina covalentemente enlazada a un grupo fósforo o fosfonolípido. En una modalidad particular, las composiciones inmunogénicas de la invención comprenden CRX642 (ver, WO2010/ 048520).

También se utilizan oligonucleótidos inmunoestimulantes o cualquier otro agonista de receptor 9 de tipo Toll. Los oligonucleótidos preferidos para usarse en adyuvantes o vacunas o composiciones de la presente invención son oligonucleótidos que contienen CpG, de preferencia conteniendo dos o más motivos de CpG de dinucleótido por al menos tres, muy preferiblemente al menos seis o más nucleótidos. N motivo de CpG es un nucleótido de citosina seguido por un nucleótido de guanina. Los oligonucleótidos de CpG de la presente invención son típicamente desoxinucleótidos. En una modalidad preferida, el inter-nucleótido en el oligonucleótido es fosforoditioato, o muy preferiblemente un enlace fosforotioato, aunque un fosfodiéster u otros enlaces de inter-nucleótido están dentro del alcance de la invención. También incluidos dentro del alcance de la invención están los oligonucleótidos con enlaces de inter-nucleótido mixtos. Los métodos para producir oligonucleótidos de fosforotioato o fosforoditioato se describen en US5,666,153, US5,278,302 y WO95/26204.

Loa oligonucleótidos de CpG utilizados en la presente invención pueden ser sintetizados a través de cualquier método conocido en la técnica (por ejemplo, ver, EP 468520). Convenientemente, dichos oligonucleótidos pueden ser sintetizados utilizando un sintetizador automático.

Por consiguiente, en otra modalidad, la composición adyuvante además comprende un inmunoestimulante adicional, el cual se selecciona del grupo que consiste de; un agonista de TLR-1, un agonista de TLR-2, un agonista de TLR-3, un agonista de TLR-4, un agonista de TLR-5, un agonista de TLR-6, un agonista de TLR-7, un agonista de TLR-8, un agonista de TLR-9, o una combinación de los mismos.

En una modalidad particular, se proporciona una composición inmunogénica de la invención, en donde el agonista de TLR o al menos uno de los agonistas de TLR en una combinación de agonistas de TLR es sintético. Por "sintético(a)" se quiere dar a entender que el agonista de TLR no es de existencia natural.

Las composiciones inmunogénicas de la invención pueden comprender un inmunoestimulante adicional, por ejemplo, una saponina tal como Quil A y sus derivados. Quil A es una preparación de saponina aislada del árbol Quilaja Saponaria Molina de América del Sur y fue el primero descrito por tener actividad adyuvante por Dalsgaard ef al. en 1974 ("Saponin adjuvants", Archiv. für die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, Berlín, p243-254). Se h an aislado fragmentos purificados de Quil A a través de HPLC que retiene la actividad adyuvante sin la toxicidad asociada con Quil A (EP 0 362 278), por ejemplo, QS7 y QS21 (también conocido como QA7 y QA21). QS-21 es una saponina derivada de la corteza de Quilaja Saponaria Molina que induce células T citotóxicas CD8 + (CTLs), células Th1 y una respuesta de anticuerpo de lgG2a predominante y es una saponina preferida en el contexto de la presente invención.

Las composiciones inmunogénicas de la invención son adecuadas para usarse en medicina, por consiguiente, se proporciona una composición inmunogénica como se describe aquí para usarse en medicina.

En una modalidad adicional, se proporciona una composición inmunogénica como aquí se describe para usarse en un método para inmunización, que comprende el paso de administrar dicha composición oralmente (en particular, sublingualmente), en particular, a un ser humano.

En una modalidad más, se proporciona una composición inmunogénica como aquí se describe para usarse en la prevención y/o tratamiento de enfermedades, en particular, en seres humanos.

En otra modalidad, se proporciona el uso de una composición inmunogénica como aquí se describe en la fabricación de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de enfermedad, en particular, seres humanos.

Las modalidades de la presente que se refieren a "composiciones de vacuna" de la invención también son aplicables a modalidades que se refieren a "composiciones inmunogénicas" de la invención, y viceversa.

Los términos "comprendiendo", "comprender" y "comprende" de la invención también son aplicables a modalidades que se refieren a "composiciones inmunogénicas" de la invención, y viceversa.

Los términos "comprendiendo", "comprender" y "comprende" de la presente pretenden, por parte de los inventores, ser opcionalmente substituibles con los términos "consistiendo de", "que consiste de" y "consiste de", respectivamente, y en cada caso.

EJEMPLOS Materiales y Métodos Modelo de Animal y Administración de Vacuna Se obtuvieron de seis a ocho ratones BALB/c hembra, de 8 semanas de edad de Charles Rivers Canadá. Para la administración sublingual, los ratones fueron anestesiados a través de inyección Lp. de cetamina y xilazina. Las vacunas fueron administradas a través de una micro pipeta. El volumen total de Ag más adyuvante se mantuvo a 8 µ? para evitar efectos de deglución. Se realizaron inyecciones i.m. en los músculos de los muslos en un volumen de 50 µ?. Los ratones fueron inmunizados en los días 0 y 14 y fueron sacrificados para el día 28.

IgG en Suero Mediante ELISA Se realizó un sangrado final 2 semanas después de la última inmunización (día 28). Se recolectó suero para la determinación específica de IgG y la presencia de anticuerpos funcionales en suero. La determinación de anticuerpos de IgG anti-A/Solomon/lsland/3/2006 en ratones se realizó a través de ELISA utilizando una división de detergente A/SI/3/2006 como antígeno de recubrimiento. Se diluyó antígeno Flu de división a una primera concentración de 0.5 g/ml (25 ng/50 µ?) en Regulador de pH de Recubrimiento (0.05M Carbonato/Bicarbonato, pH 9.6) y fragmento específico IgG Fc-? anti-ratón de cabra AffiniPure (Jackson Immuno Research) a una concentración final de 1.0 µg/ml (50 ng/50 µ?) en Regulador de pH de Recubrimiento. El antígeno de recubrimiento y el anticuerpo de captura fueron adsorbidos durante 4 horas a 20°C sobre placas de poliestireno de 96 cavidades de fondo plano (Maxisorp, Nunc). Después de la incubación, las placas se lavaron cuatro veces con DPBS (salina regulada en su pH con fosfato de Dulbecco sin Ca2+ o Mg2 + ; Gibco) /0.05% Tween 20 (Sigma). Después las placas se incubaron durante 1 hora a 20°C con DPBS conteniendo albúmina sérica de bovino al 1% (BSA, Sigma). Los sueros se diluyeron en regulador de pH conteniendo PBS, 0.05% Tween 20 y BSA al 1% (regulador de pH de dilución de muestra), después se agregó a placas cubiertas con Flu divididas en diluciones en serie y se incubaron durante 16 horas a 18 horas a 4°C. Después de la incubación, las placas se lavaron cuatro veces con PBS/0.05% Tween 20. El anticuerpo secundario, una IgG de anti-ratón de cabra AffiniPure conjugada con peroxidasa (fragmento Fc-? específico) diluido a 1/10000 en regulador de pH de dilución de muestra, después se agregó a cada cavidad y se incubó durante 30 minutos a 37°C. Después del paso de lavado (PBS/0.05% Tween 20), las placas se incubaron durante 30 minutos a 20°C con substrato de dTMB peroxidasa (BD Biosciences). La reacción se detuvo con 1 M H2S0 y se leyó a 450 nm. Se calculó la concentración especifica de IgG en suero a partir de un estándar mediante SoftMaxPro utilizando una ecuación de cuatro parámetros y expresado como ng/ml.

Preparación de Muestra de Mucosa Dos semanas después de la segunda inmunización, se recolectaron lavado bronco-alveolar (BAL), lavado nasal, saliva, lavado vaginal y heces para la determinación de anticuerpo IgA de antígeno específico. Las muestras de BAL y lavado nasal se probaron directamente para cuantificación de IgA. Las muestras de saliva fueron extraídas de la torunda agregando 300 µ? del regulador de pH de dilución de muestra conteniendo coctel de inhibidor de proteasa (PIC), mini tabletas completas (Roche) y las muestras de arremolinaron dos veces 15 segundos antes de ser probadas. Las muestras de lavado vaginal se diluyeron en 200 µ? del regulador de pH de dilución de muestra conteniendo PIC y bromelina (250 ug/ml) (Sigma), se incubaron 1 hora a 37°C, y se arremolinaron durante 15 segundos antes de ser determinadas. Las pellas fecales se mantuvieron sobre hielo seco hasta la adición del regulador de pH de muestra de dilución conteniendo PIC. Las heces se pesaron y se volvieron a suspender en un volumen en µ? representando 5 veces su peso en mg. Las muestras se homogeneizaron (homogeneizador Kontes) y se centrifugaron a 4°C 7300 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante se recolectó y se analizó mediante ELISA.

ELISA de IgA Se realizó la cuantificación de anticuerpos IgG anti-A/SI/3/2006 en ratones a través de ELISA similar a la descrita para la determinación de IgG en suero. Más específicamente, se realizó el recubrimiento con antígeno Flu de división diluido a una concentración final de 2 g/ml (100 ng/50 µ?) en Regulador e pH de Recubrimiento (0.05M Carbonato/Bicarbonato, pH 9.6) e IgA antiratón de cabra (cadena a específica) (Sígma) a una concentración final de 1.0 pg/ml (50 ng/50 µ?) en Regulador e pH de Recubrimiento. Después de la noche y el paso de bloqueo, se agregaron muestras de mucosa a las placas recubiertas con Flu de división en diluciones en serie y se incubaron durante 16 horas a 18 horas a 4°C. Después de la incubación, el anticuerpo secundario, una IgA anti-ratón de cabra AffiniPure conjugado con peroxidasa (cadena a específica) diluido a 1/6000 en regulador de pH de dilución de muestra, después se agregó a cada cavidad y se incubó durante 30 minutos a 37°C. Después de la incubación con substrato de peroxidasa TMB (BD Biosciences), la reacción se detuvo con 1 M H2S0 y se leyó a 450 nm. Se calculó la concentración de IgA a partir de un estándar mediante SoftMaxPro utilizando una ecuación de cuatro parámetros y expresada como ng/ml.

Ensayo de Inhibición de Hemaglutinación (Hl) El ensayo Hl se llevó a cabo en sueros individuales tomados dos semanas después de la segunda inmunización. Se removieron inhibidores no específicos del suero mediante un tratamiento nocturno con un receptor de destrucción de enzima (Sigma). Después se agregó una solución salina de calcio para lograr una dilución de 1:10, seguido por incubación con 50% (v/v) de una solución de glóbulos rojos de pollo o gallo-cerdo a 4°C durante 60 minutos para remover aglutininas no específicas. El suero tratado se diluyó en serie en 25 µ? de PBS y después se incubó con un volumen igual de PBS conteniendo antígeno de influenza de cepa específica (virus entero, conteniendo 8 unidades de hemaglutinina) durante 45 minutos a temperatura ambiente. Se agregó una suspensión, v/v, al 0.5% de glóbulos rojos obtenidos de pollo o gallo adulto y la mezcla se incubó durante otros 45 minutos. Las reacciones se siguieron a través de inspección visual: una formación de coágulo indica una reacción positiva (inhibición) y un parche difuso de células indica una reacción negativa (hemaglutinación). Como un control negativo y con el fin de determinar los valores de antecedente del ensayo, se probaron en paralelo muestras de suero de ratones inmunizados con regulador de pH. Todos los sueros fueron corridos por duplicado. La titulación HAI se registró como el punto recíproco de la última dilución que inhibió hemaglutinina.

Análisis Estadístico Se realizaron análisis estadísticos como sigue. Los valores se transformaron en registro (log) y se analizaron para su distribución Gausiana con la prueba de normalidad de Shapiro. Wilk. Cuando la mayoría del grupo tuvo una distribución normal o un valor de asimetría estadística (-1<1) y curtosis (-1<2) dentro de límites aceptables, ANOVA de una dirección y se realizó la prueba de Comparación Múltiple de Dunnet. De otra manera, se realizó ANOVA de Kruskal-Wallis y prueba de Comparación Múltiple de Dunn.

Resultados y Discusión Para determinar la efectividad de vacunación sublingual, se probaron nuevas formulaciones de vacuna utilizando antígenos de influenza como antigeno modelo adyuvado con agonistas de TLR2 y 4 para su potencia para producir respuestas sistémicas e inmunes de mucosa. Primero se evaluaron preparaciones de proteína de membrana externa de Shigella flexineri SFOMP), un agonista de TLR2/4 derivado de bacteria y el lipopéptido sintético Pam3CysLip, un agonista de TLR2. Se inmunizaron ratones BALB/c dos veces a intervalos de 2 semanas a través de la ruta sublingual con virus A/SI/3/2006 de división de detergente adyuvado ya sea con SFOMP (5 pg), Pam3Cysl_ip (10 pg), o con toxina (CT). Dos semanas después de la inmunización final, se midieron los niveles de anticuerpos de virus específico a través de ELISA y ensayos Hl. Se detectaron anticuerpos de IgG en suero específicos de A/Solomon Islands en los animales anestesiados que fueron inmunizados con antigeno dividido adyuvado con SFOMP o Pam3CysLip. Todos los ratones sublingualmente inmunizados con las formulaciones adyuvadas mostraron niveles de IgG estadísticamente similares al grupo intramuscularmente vacunado (Figura 1). La adyuvación de 7 pg de antigeno con Pam3CysLip ó 14 pg de antigeno con SFOMP significativamente incrementó los niveles de IgG cuando se comparó con la vacuna no adyuvada. La funcionalidad de IgG en suero se demostró a través del ensayo Hl y como se muestra en la Figura 1, la adyuvación de la vacuna sublingual condujo a titulaciones de ensayo Hl que teóricamente están asociadas a un mínimo de 60% de protección. Estos datos sugirieron un uso potencial de agonistas de TLR2/4 en inmunización sublingual.

Para confirmar el potencial de agonistas de TLR2 y/o TLR4 en vacunación sublingual, se utilizó un agonista de TLR4 sintético puro (CRX527) solo o en combinación con un agonista de TLR2 puro (Pam3Cysl_ip). CRX527 se investigó a una dosis de 1 pg en un régimen de inmunización estándar. Los análisis de ELISA de IgG en suero revelaron que las formulaciones de vacuna comprendiendo el agonista de TLR4 CRX-527 (1 pg) ± el agonista de TLR2, Pam3CysLip (5 pg) y antígeno de influenza de división son potentes para producir respuestas de IgG en suero de antígeno específico después de inmunización sublingual (Figura 2). En este estudio, el efecto de adyuvación de la vacuna sublingual se observó con cada adyuvante. El ensayo Hl confirmó la presencia de anticuerpos funcionales en suero después de administración sublingual de la vacuna. A pesar de la alta variabilidad de la respuesta dentro de ratones del mismo grupo, se vio una buena asociación entre el nivel de IgG en suero y las titulaciones de Hl.

Con el fin de evaluar la respuesta de anticuerpo de mucosa en compartimentos relevantes contra BAL probado de antígeno de modelo, se recolectaron lavado nasal y saliva para la determinación de anticuerpo IgA de antígeno específico. Además, se recolectaron lavado vaginal y heces para investigar el grado de la respuesta inmune de la mucosa inducida por la ruta sublingual. Los análisis de ELISA de IgA mostraron que las formulaciones de vacuna A/SI/3/2006 basándose en el agonista de TLR4 ± TLR2 son potentes para producir respuesta inmune de mucosa cuando se administraron sublingualmente. Como se muestra en el Cuadro 1, se detectaron IgAs de antígeno específicos en todos los compartimentos de mucosa, los niveles más altos encontrándose en las muestras de lavado vaginal y pellas fecales. Cualquier vacuna sublingualmente suministrada, incluyendo la formulación no adyuvada, indujo una respuesta específica de antígeno en las heces. La adyuvación del antígeno de detergente dividió de Solomon Islands ofreció al menos un doble incremento en los niveles de IgAs de antígeno específico.

Cuadro 1: respuestas de Ab de mucosa de virus específico A/Solomon Island después de administración s.l. de A/SI/3/2006 de división de detergente con o sin agonista de TLR4 ± TLR2 como adyuvante. Los ratones fueron anestesiados y vacunados s.l. con A/SI/3/2006 inactivado (7 ó 14 pg) adyuvado con CRX527 (1 pg) ± Pam3CysLip (5 pg) o CT (1 pg) en los días 0 y 14. Dos semanas después de la segunda inmunización, se recolectaron muestras de mucosa y se determinaron los niveles de IgA de virus específico A/SI/3/2006 a través de ELISA. Los niveles específicos de IgG se muestran como concentraciones medias geométricas expresadas en ng/ml, y se indican límites de confidencia del 95%. Se realizó la Prueba de Comparación Múltiple de Dunnett. Diferencias importantes se indican como sigue: * = P>0.05, * = P>0.01 y * = P=0.001 contra ratones intramuscularmente inmunizados. Cada grupo tuvo de 5 a 10 ratones. NA = Debido a dificultades técnicas, muestra no disponible.

Para identificar una formulación de vacunación potente de antígeno/adyuvante, se realizaron estudios de inmunogenicidad sublinguales con antígeno de división de detergente A/SI/3/2006 con 7 adyuvantes candidato (dosis 1 pg). Se realizó inmunización intramuscular (IM) como un punto importante para determinar el éxito de la inmunización sublingual. Ya que la vacuna de Flu vendida se da como una vacuna de un disparo, la inmunización intramuscular solo se dio una vez, ya sea en el día de la primera inmunización, o en el día de la segunda inmunización.

El análisis de EISA de IgG en suero reveló que 2 instilaciones de vacuna Flu no adyuvada sublingualmente administradas pueden producir una respuesta de IgG en suero específica (GMC = 5267 ng/ml) (Figura 3). La adyuvación de la vacuna flu con SFOMP (GMC = 28771 ng/ml), Pam3Cysüp (GMC = 40731 ng/ml), o CT (GMC = 42343 ng/ml) indujo niveles de IgG específicos similares a la inmunización intramuscular dada una vez ya sea en el día 0 ó en el día 4. Además de la adyuvación con SFOMP o Pam3CysLip, la cual induce 5.5X y 7.7X la producción de IgG incrementada en suero comparado con vacuna flu sublingual no adyuvada, CRX642 (GMC = 23966 ng/ml) también mostró un efecto adyuvante y puede inducir un nivel de IgG significativamente más alto (4.6X). Se pueden inducir anticuerpos en suero funcionales (titulaciones de Hl >40) después de inmunización sublingual. Cuando los animales fueron inmunizados con vacuna no adyuvada, 1/40 animal mostró una titulación de Hl de >40. Se observó un número incrementado de ratones teniendo anticuerpos funcionales en la formulación de vacuna adyuvada con SFOMP (4/20), con Pam3CysLip (4/20), con CRX642 (4/20) o con CT (7/20). La discrepancia de estas titulaciones Hl comparada con las observadas en el primer estudio sublingual con SFOMP ± Pam3CysLip con antígeno flu probablemente se debe a la ruta de administración. Como se mencionó previamente, siempre se observa un alto coeficiente de variación dentro de los animales del mismo grupo. Para superar esta limitación se planea formular el antígeno con compuestos muco-adhesivos.

La respuesta inmune de mucosa después de inmunización sublingual se investigó a través de ELISA de IgA en varios fluidos de mucosa. En contraste a la inmunización IM, la inmunización sublingual con antígeno de influenza de división adyuvado induce IGA de antígeno específico en BAL, lavado nasal, saliva, lavado vaginal y heces. Al utilizar Flu como un antígeno modelo, los criterios de éxito para inmunización sublingual de la respuesta de anticuerpo de mucosa en compartimentos relevantes contra el antígeno modelo probado, podría requerir la respuesta de IgA en fluido pulmonar, lavado nasal, y saliva.

Los análisis de BAL indicaron que se encontraron bajos niveles de IgAs específicos en fluido pulmonar después de vacunación sublingual (Cuadro 2). Se observó una respuesta de IgA más alta en el animal inmunizado con CT adyuvado con vacuna flu (GMC = 9.75 mg/ml). Además de CT, las vacunas adyuvadas de Pam3CysLip (GMC = 3.95 ng/ml), Flagelina (G C-4.04 ng/ml) y CpG (GMC=4.10 ng/my) inducen niveles de BAL IgA significativamente más altos que la inmunización IM basándose en la prueba de comparación múltiple de Kruskal Wallis y Dunn. Los análisis de lavado nasal revelaron que se encontraron bajos niveles de IgAs específicos en fluido pulmonar después de vacunación sublingual. Como en BALs, se observó una respuesta de IgA más alta en el animal inmunizado con CT adyuvado con la vacuna flu (GMC = 12.91 ng/ml). Además de CT, solo las vacunas adyuvadas con CpG (GMC = 4.33 ng/ml) indujeron IgA significativamente más alto. Niveles más altos que la inmunización IM basado en pruebas de comparación múltiple de Kruskal Wallis y Dunn fue el único adyuvante probado induciendo niveles de IgA significativamente más altos en lavado nasal comparado con la vacuna flu sublingual no adyuvada. Los análisis de saliva revelaron que se encontraron niveles bajos de IgAs específicos en saliva después de vacunación sublingual. Como en BAL y en el lavado nasal, se observó una respuesta de IgA más alta en el animal inmunizado con CT adyuvado con vacuna flu (GMC = 6.00 ng/ml). Además de CT, las vacunas adyuvadas de Pam3CysLip (GMC = 4.13/ml) inducen niveles de IgA en saliva significativamente más altos que la inmunización IM basándose en pruebas ANOVA de una dirección y de comparación múltiple de Dunnett. Con base en los criterios de inmunización sublingual de la respuesta de anticuerpo de mucosa en compartimentos relevantes contra antígeno modelo probado, CpG, Pam3CysLip y Flagelina, representan candidatos potenciales.

Cuadro 2: respuestas de Ab de mucosa de virus específico A/Solomon Island después de administración s i. de A/SI/3/2006 de división de detergente con o sin agonista de TLR como adyuvante. Los ratones fueron anestesiados y vacunados s.l. con A/SI/3/2006 inactivado (7.5 g) adyuvado con SFO P (1 pg), Pam3CysLip (1 pg), CRX527 (1 pg), CRX642 (1 pg), MPL (1 pg), Flagelina (1 pg), CpG (1 pg) o CT (1 pg) en los días 0 y 14. Dos semanas después de la segunda inmunización, se recolectaron muestras de mucosa y se determinaron los niveles de IgA de virus específico A/SI/3/2006 a través de ELISA. Los niveles específicos de IgG se muestran como concentraciones medias geométricas expresadas en ng/ml, y se indican límites de confidencia del 95%. A: Se realizó la Prueba de Comparación Múltiple de Dunn, B: Se realizó prueba de comparación Múltiple de Dunnett. Diferencias importantes se indican como sigue: * = P>0.05, * = P>0.01 y * = P>0.001 contra ratones intramuscularmente inmunizados. Cada grupo tuvo de 5 a 10 ratones.

Los análisis de lavado vaginal revelaron que niveles más altos de IgAs específicos pueden ser detectados en secreciones vaginales después de vacunación sublingual. Como se observó previamente, IgA es indetectable después de la inmunización I y el nivel de fondo se fijó a GMC= 3.54 ng/ml. la vacuna flu no adyuvada sublingual puede inducir 2.2 veces niveles más altos de IgA (GMC = 7.76 ng/ml) comparado con inmunización IM. La adyuvación de SFOMP, Pam3Cysl_ip, CRX642 o Flagelina altamente incrementó la respuesta de IgA y, p or lo tanto, representa candidatos adyuvantes potenciales para antígenos q ue requieren IgA en secreción vaginal. Sin embargo, se necesitan más estudios con el antígeno apropiado. IgAs también pueden ser detectados en heces fecales después de vacunación sublingual. La vacuna sublingual no adyuvada indujo niveles de IgA fecales a la inmunización IM. Como se indicó en el Cuadro 2, solo la adyuvación con CT significativamente redujo la respuesta IgA comparado con inmunización IM.

Conclusión: Se han probado varios adyuvantes para inmunización sublingual de ratones con Flu A/Solomon Island de División como un antígeno modelo. Se mostró que candidatos potenciales adyuvantes son SFOMP y Pam3CysLip. Sin embargo, es posible que la concentración de antígeno siga siendo demasiada alta y CRX642 puede, en una dosis más baja de antígeno, representar un adyuvante más prometedor. Con base en el ensayo funcional, los candidatos de adyuvante potenciales para inmunización sublingual son SFOMP, Pam3CysLip y CRX642. Con base en los criterios de éxito para inmunización sublingual de respuesta de anticuerpo de mucosa en compartimentos relevantes contra antígeno modelo probado, CpG, Pam3CysLip, Flagelina y CRX642 representan candidatos potenciales. Los análisis CMI no permitieron distinguir entre los adyuvantes probados en términos de su producción de citosina Th1 y patrón de citosina. De todos los criterios combinados, los adyuvantes más prometedores para inmunización sublingual son Pam3Cysl_ip, CRX642 y Flagelina.

Claims (21)

REIVINDICACIONES

1. Una composición inmunogénica que comprende uno o más antígenos y un agonista de receptor de tipo Toll (TLR) en una composición oralmente (por ejemplo, sublingualmente) administrada.

2. Una composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la composición oralmente administrada es una forma de dispersión sólida diseñada para desintegrarse rápidamente en la cavidad oral.

3. Una composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 1 ó reivindicación 2, en donde el adyuvante se selecciona del grupo de agonista de TLR1, agonista de TLR2, agonista de TLR3, agonista de TLR4, agonista de TLR5, agonista de TLR7, agonista de TLR8, agonista de TLR9 o cualquier combinación de los mismos.

4. Una composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el agonista de TLR o al menos uno de los agonistas de TLR, en una combinación de agonistas de TLR, es sintético.

5. Una composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el adyuvante es una combinación de un agonista de TLR4 y TLR2, en particular, preparaciones de proteína de membrana externa de Shigella flexineri o agonista de TLR4, tal como un AGP (por ejemplo) CRX-527 y el agonista de TLR2, Pam3CysLip.

6. Una composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el adyuvante es un agonista de TLR2, en particular, Pam3CysLip.

7. Una composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el adyuvante es un agonista de TLR9, en particular un oligonucleótido ¡nmunoestimulante, en particular un oligonucleótido inmunoestimulante que comprende uno o más motivos de CpG.

8. Una composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el adyuvante es un agonista de TLR6, en particular flagelina o un fragmento de la misma.

9. Una composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el adyuvante es un agonista de TLR4, el cual es un AGP, en particular, CRX527.

10. Una composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el adyuvante es un agonista de TLR7/8.

11. Una composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 10, en donde e I agonista de TLR7/8 es una molécula de imidazoquinolina, en particular una imidazoquinolina covalentemente unida a un grupo fósforo o fosfonol ípido.

12. Una composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 10 u 11, en donde el agonista de TLR7/8 es CRX642.

13. Una composición inmunogénica de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, que comprende un inmunoestimulante adicional, por ejemplo, QS21.

14. Una composición inmunogénica de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en donde la forma de dispersión sólida se desintegra en aproximadamente 1 a aproximadamente 60 segundos, en particular, aproximadamente 1 a aproximadamente 30 segundos, aproximadamente 1 a aproximadamente 10 segundos, o aproximadamente 2 a aproximadamente 8 segundos, de ser colocada en la cavidad oral.

15. Una composición inmunogénica de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, que además comprende una substancia muco-adhesiva.

16. Una composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 15, en donde la substancia muco-adhesiva se selecciona del grupo de: polímeros poliacrílicos, derivados de celulosa o polímeros naturales (por ejemplo, gelatina, alginato de sodio y pectina).

17. Una composición inmunogénica de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en donde el antígeno se deriva de influenza.

18. Una composición inmunogénica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 para usarse en medicina.

19. Una composición inmunogénica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 para usarse en el tratamiento y/o prevención de enfermedades.

20. Una composición inmunogénica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 para usarse en un método para inmunización, el cual comprende el paso de administrar dicha composición oralmente.

21. Una composición inmunogenica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 para usarse en un método para inmunización, que comprende el paso de administrar dicha composición sublingualmente.