ME02245B - Anti-cd38 humana antitjela i njihove upotrebe - Google Patents

Anti-cd38 humana antitjela i njihove upotrebe

Info

Publication number
ME02245B
ME02245B MEP-2015-350A MEP2015350A ME02245B ME 02245 B ME02245 B ME 02245B ME P2015350 A MEP2015350 A ME P2015350A ME 02245 B ME02245 B ME 02245B
Authority
ME
Montenegro
Prior art keywords
antibody
seq
amino acid
epitope
fragment
Prior art date
Application number
MEP-2015-350A
Other languages
English (en)
Inventor
Michael Tesar
Ute Jäger
Original Assignee
Morphosys Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=37054659&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ME02245(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Publication of ME02245B publication Critical patent/ME02245B/me
Application filed by Morphosys Ag filed Critical Morphosys Ag

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/005—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies constructed by phage libraries
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/74—Inducing cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Mycology (AREA)

Description

Anti-CD38 humana antitela i njihove upotrebe
 
Opis
 
OSNOVA PRONALASKA
 
[0001] CD38 je membranski glikoprotein tipa-II i pripada familiji ektoenzima, zbog njegove enzimske aktivnosti kao ADP ribozil-ciklaze i cADP-hidrolaze. U toku ontogenije, CD38 se javlja na CD34+ opredeljenim matičnim ćelijama i linijski-opredeljenim progenitorima limfoidnih, eritroidnih i mijeloidnih ćelija. Razume se da ekspresija CD38 opstaje samo u limfoidnoj liniji, preko ranih stadijuma T- i B-ćelijskog razvoja.
[0002] Ushodna regulacija CD38 služi kao marker za aktivaciju limfocita-naročito diferencijaciju B-ćelija duž plazmacitoidnog puta. (Ko-)receptorne funkcije CD38 koje dovode do intracelularnog prenosa signala ili intercelularne komunikacije preko njegovog liganda, CD31, su postulirane, kao i njegova uloga kao intracelularnog regulatora drugog mesindžera, cikličnog ADPr, u različitim kaskadama prenosa signala. Međutim, njegov fiziološki značaj ostaje da se rasvetli, s obzirom na to da „knock out“ mišjeg analoga ili anti-CD38 auto-antitela kod ljudi izgleda da nisu štetni.
[0003] Pored zapažanja njegove ekspresije u hematopoetskom sistemu, istraživači su zabeležili ushodnu regulaciju CD38 na različitim ćelijskim linijama poreklom od B-, T-, i mijeloidnih/monocitnih tumora, uključujući B- ili T-ćelijsku akutnu limfoblastičnu leukemiju (ALL), akutnu mijeloidnu leukemiju (AML), ne-Hodgkin-ov limfom (NHL) i multipli mijelom (MM). Kod MM, na primer, snažna ekspresija CD38 je potvrđena kod većine od svih uzoraka pacijenata.
[0004] Stoga, prekomerna ekspresija CD38 na malignim ćelijama daje privlačno terapeutsko ciljno mesto za imunoterapiju. Posebno je privlačna činjenica da su najprimitivnije pluripotentne matične ćelije hematopoetskog sistema CD38-negativne i da je veličina citotoksičnih efekata od strane ADCC ili CDC u korelaciji sa ekspresionim nivoima odgovarajućeg ciljnog mesta.
[0005] Trenutni pristupi anti-CD38 terapija mogu biti podeljeni u dve grupe: in vivo i ex vivo pristupe. U in vivo pristupima, anti-CD38 antitela se primenjuju na subjekta kod koga postoji potreba za terapijom kako bi se izazvala antitelom posredovana deplecija malignih ćelija koje prekomerno eksprimiraju CD38. Deplecija može biti postignuta pomoću ADCC i/ili CDC posredovanim preko antitela pomoću efektorih ćelija, ili upotrebom anti-CD38 antitela kao ciljnih grupa za transport citotoksičnih supstanci, npr. saporina, do ciljnih ćelija, i kasnijom internalizacijom. U ex vivo pristupu, ćelijska populacija, npr. ćelije koštane srži, koja sadrži maligne ćelije koje prekomerno eksprimiraju CD38 su uklonjene iz individue kod koje postoji potrebna za tretmanom i dovedene su u kontakt sa anti-CD38 antitelima. Ciljne ćelije su ili uništene citotoksičnim supstancama, npr. saporinom, kao što je opisano za in vivo pristup, ili su uklonjene dovođenjem u kontakt ćelijske populacije sa imobilizovanim anti-CD38 antitelima, na taj način uklanjajući ciljne ćelije koje prekomerno eksprimiraju CD38 iz smeše. Zatim, depletirana ćelijska populacija je ponovo umetnuta u pacijenta.
[0006] Antitela specifična za CD38 mogu biti podeljena u različite grupe, u zavisnosti od različitih osobina. Vezivanje nekih antitela za CD38 molekul (pretežno aa 220-300) može da pokrene aktivnosti unutar ciljne ćelije, kao što je oslobađanje Ca2+, oslobađanje citokina, fosforilacioni događaji i stimulacija rasta na bazi specifičnosti odgovarajućeg antitela (Konopleva et al., 1998; Ausiello et al., 2000), ali ne može se videti jasna korelacija između vezujućeg mesta različitih poznatih antitela i njihovih (ne-)agonističkih osobina (Funaro et al., 1990).
[0007] Relativno malo je poznato o efikasnosti objavljenih anti-CD38 antitela. Ono što je poznato je da sva poznata antitela izgleda da isključivo prepoznaju epitope (aminokiselinske ostatke 220 do 300) koji se nalaze u C-terminalnom delu CD38. Nisu poznata antitela koja bi bila specifična za epitope u N-terminalnom delu CD38 udaljenom od aktivnog mesta u primarnoj proteinskoj sekvenci. Međutim, našli smo da OKT10, koji je klinički ispitivan, ima relativno nizak afinitet i efikasnost kada se analizira kao himerni konstrukt koji sadrži humani Fc deo. Pored toga, OKT10 je mišje antitelo koje ga čini nepogodnim za humanu primenu. scFv fragment humanog anti-CD38 antitela je nedavno opisan (WO 02/06347). Međutim, to antitelo je specifično za selektivno eksprimiran CD38 epitop.
[0008] U skladu sa tim, u svetlu velikog potencijala za terapiju anti-CD38 antitelom, postoji velika potreba za humanim anti-CD38 antitelima sa visokim afinitetom i sa visokom efikasnošću u posredovanju ubijanja malignih ćelija koje prekomerno eksprimiraju CD38 pomoću ADCC i/ili CDC.
[0009] Predstavljeni pronalazak zadovoljava ove i druge potrebe obezbeđivanjem potpuno humanih i visoko efikasnih anti-CD38 antitela, koja su opisana u daljem tekstu.
 
 
 
 
REZIME PRONALASKA
 
[0010] Cilj pronalaska je obezbediti humana i humanizovana antitela kao što su definisana u priloženim patentnim zahtevima.
[0011] Sledeći cilj pronalaska je obezbediti antitela kao što su opisana u priloženim patentnim zahtevima koja su bezbedna za humanu primenu.
[0012] Cilj predstavljenog pronalaska je takođe obezbediti upotrebe za tretman bolesti i/ili stanja povezanih sa ushodnom regulacijom CD38 sa jednim ili više antitela prema pronalasku. Ovi i drugi ciljevi pronalaska su potpunije opisani ovde.
[0013] Pronalazak se uopšteno odnosi na izolovano antitelo ili funkcionalni fragment antitela koji sadrži antigen-vezujući region koji je specifičan za epitop CD38, gde je antitelo ili njegov funkcionalni fragment sposoban da posreduje u ubijanju CD38+ ciljne ćelije (LP-1 (DSMZ: ACC41) i RPMI-8226 (ATCC: CCL-155)) pomoću ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela ("ADCC") sa najmanje dva do pet puta boljom efikasnošću od himernog OKT10 antitela koje ima SEQ ID NOS: 23 i 24 (pod istim ili značajno istim uslovima), kada se humana PBMC ćelija koristi kao efektorna ćelija, i kada je odnos efektornih ćelija prema ciljnim ćelijama između oko 30:1 i oko 50:1. Takvo antitelo ili njegov funkcionalni fragment mogu da sadrže antigen-vezujući region koji sadrži H-CDR3 region prikazan u SEQ ID NO: 5, 6, 7 ili 8; antigen-vezujući region može dalje da obuhvata H-CDR2 region prikazan u SEQ ID NO: 5, 6, 7, ili 8; i antigen-vezujući region takođe može da sadrži H-CDR1 region prikazan u SEQ ID NO: 5, 6, 7, ili 8. Takvo CD38-specifično antitelo prema pronalasku može da sadrži antigen-vezujući region koji sadrži L-CDR3 region prikazan u SEQ ID NO: 13, 14, 15, ili 16; antigen-vezujući region može dalje da obuhvata L-CDR1 region prikazan u SEQ ID NO: 13, 14, 15, ili 16; i antigen-vezujući region takođe može da sadrži L-CDR2 region prikazan u SEQ ID NO: 13, 14, 15, ili 16.
[0014] Pronalazak se generalno odnosi na izolovano antitelo ili funkcioanlni fragment antitela koji sadrži antigen-vezujući region koji je specifičan za epitop CD38, gde je antitelo ili njegov funkcionalni fragment sposoban da posreduje u ubijanju CD38-tranficirane CHO ćelije pomoću CDC sa najmanje dva puta boljom efikasnošću od himernog OKT10 (SEQ ID NOS: 23 i 24) pod istim ili značajno istim uslovima kao u prethodnom pasusu. Antitelo koje zadovoljava ove kriterijume može da sadrži antigen-vezujući region koji sadrži H-CDR3 region prikazan u SEQ ID NO: 5, 6, ili 7; antigen-vezujući region može dalje da obuhvata H-CDR2 region prikazan u SEQ ID NO: 5, 6 ili 7; i antigen-vezujući region takođe može da sadrži H-CDR1 region prikazan u SEQ ID NO: 5, 6 ili 7. Takvo CD38-specifično antitelo prema pronalasku može da sadrži antigen-vezujući region koji sadrži L-CDR3 region prikazan u SEQ ID NO: 13, 14, ili 15; antigen-vezujući region može dalje da obuhvata L-CDR1 region prikazan u SEQ ID NO: 13, 14, ili 15; i antigen-vezujući region može takođe da sadrži L-CDR2 region prikazan u SEQ ID NO: 13, 14, ili 15.
[0015] U jednom aspektu, pronalazak daje antitela i njihove funkcionalne fragmente) koji sadrže antigen-vezujući region koji je specifičan za epitop CD38, pri čemu taj epitop sadrži jedan ili više aminokiselinskih ostataka od aminokiselinskih ostataka 43 do 215 CD38, kao što je prikazano u SEQ ID NO: 22. Specifičnije, epitop za koji se vezuje antigen-vezujući region sadrži jedan ili više aminokiselinskih ostataka koji se nalaze u jednom ili više aminokiselinskih nizova uzetih sa spiska aminokiselinskih nizova 44-66, 82-94, 142-154, 148-164, 158-170, i 192-206. Za određena antitela, epitop može biti linearni, dok za druga, on može biti konformacioni (tj., diskontinuiran). Antitelo ili njegov funkcionalni fragment koje/koji ima jedno ili više od ovih osobina može da sadrži antigen-vezujući region koji sadrži HCDR3 region prikazan u SEQ ID NO: 5, 6, 7, ili 8; antigen-vezujući region može dalje da obuhvata H-CDR2 region prikazan u SEQ ID NO: 5, 6, 7 ili 8; i antigen-vezujući region takođe može da sadrži H-CDR1 region prikazan u SEQ ID NO: 5, 6, 7 ili 8. Takvo CD38-specifično antitelo prema pronalasku može da sadrži antigen-vezujući region koji sadrži L-CDR3 region prikazan u SEQ ID NO: 13, 14, 15 ili 16; antigen-vezujući region može dalje da obuhvata L-CDR1 region prikazan u SEQ ID NO: 13, 14, 15 ili 16; i antigen-vezujući region takođe može da sadrži LCDR2 region prikazan u SEQ ID NO: 13, 14, 15 ili 16. Antitelo ili njegov funkcionalni fragment koje/koji ima jednu ili više od ovih osobina može da ima aminokiselinsku sekvencu teškog lanca sa: najmanje 60 procenta identičnosti sekvenci u CDR regionima sa CDR regionima prikazanim u SEQ ID NO: 5, 6, 7 ili 8; i/ili najmanje 80 procenta homologije sekvenci u CDR regionima sa CDR regionima prikazanim u SEQ ID NO: 5, 6, 7 ili 8. Dalje su uključena anti-CD38 antitela koja imaju aminokiselinsku sekvencu lakog lanca sa: najmanje 60 procenta identičnosti sekvenci u CDR regionima sa CDR regionima prikazanim u SEQ ID NO: 13, 14, 15 ili 16; i/ili najmanje 80 procenata homologije sekvenci u CDR regionima sa CDR regionima prikazanim u SEQ ID NO: 13, 14, 15 ili 16.
[0016] Antitelo prema pronalasku može biti IgG (npr., IgG1), dok fragment antitela može biti Fab ili scFv, na primer. Fragment antitela prema pronalasku, prema tome, može biti, ili može da sadrži, antigen-vezujući region koji se ponaša na jedan ili više načina kao što je ovde opisano.
[0017] Pronalazak se takođe odnosi na sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju antitelo prema pronalasku ili njegov fragment. Takva nukleinska kiselina će obuhvatati sekvencu koja kodira antigen-vezujući region humanog antitela ili njegov funkcionalni fragment koji je specifičan za epitop CD38. Takva sekvenca nukleinske kiseline može da kodira varijabilni težak lanac antitela i obuhvata sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NOS: 1, 2, 3 ili 4, ili sekvencu nukleinske kiseline koja hibridizuje pod uslovima visoke stringentnosti za komplementarni lanac SEQ ID NO: 1, 2, 3 ili 4. Nukleinska kiselina može da kodira varijabilni laki lanac izolovanog antitela ili njegovog funkcionalnog fragmenta, i može da sadrži sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NOS: 9, 10, 11, ili 12, ili sekvencu nukleinske kiseline koja hibridizuje pod uslovima visoke stringentnosti za komplementarni lanac SEQ ID NO: 9, 10, 11, ili 12.
[0018] Nukleinske kiseline prema pronalasku su pogodne za rekombinantnu proizvodnju. Na taj način, pronalazak se takođe odnosi na vektore i ćelije domaćine koji sadrže sekvencu nukleinske kiseline prema pronalasku.
[0019] Kompozicije prema pronalasku se mogu koristiti za terapeutske ili profilaktičke primene. Pronalazak, prema tome, obuhvata farmaceutsku kompoziciju koja sadrži inventivno antitelo (ili funkcionalni fragment antitela) i farmaceutski prihvatljiv nosač ili ekscipijent. U srodnim aspektima, pronalazak daje antitelo prema pronalasku ili njegov fragment za upotrebu u postupku za tretman poremećaja ili stanja povezanog sa neželjenim prisustvom CD38 ili ćelije koja eksprimira CD38, odnosno hematološke bolesti. Takav postupak sadrži korake primene na subjekta kod koga postoji potreba za tim efikasne količine farmaceutske kompozicije koja sadrži inventivno antitelo kao što je opisano ili razmatrano ovde.
[0020] Pronalazak se takođe odnosi na izolovane epitope CD38, bilo u linearnom ili konformacionom obliku, i njihovu upotrebu za izolaciju antitela ili njegovog funkcionalnog fragmenta, pri čemu to antitelo ili fragment antitela sadrži antigen-vezujući region koji je specifičan za navedeni epitop. U tom smislu, linearni epitop može da sadrži aminokiselinske ostatke 192-206, dok konformacioni epitop može da sadrži jedan ili više aminokiselinskih ostataka izabranih iz grupe koju čine aminokiseline 44-66, 82-94, 142-154, 148-164, 158-170 i 202-224 CD38. Epitop CD38 se može koristiti, na primer, za izolaciju antitela ili njihovih funkcionalnih fragmenata (pri čemu svako od antitela ili fragmenata antitela sadrži antigen-vezujući region koji je specifičan za takav epitop), koja sadrži korake dovođenja u kontakt navedenog epitopa CD38 sa bibliotekom antitela i izolaciju antitela (jednog ili više) ili njegovog/njihovog funkcionalnog fragmenta (fragmenata).
[0021] Pronalazak se dalje odnosi na izolovani epitop CD38, koji se sastoji uglavnom od aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe koju čine aminokiseline 44-66, 82-94, 142-154, 148-164, 158-170, 192-206 i 202-224 CD38. Kao što je ovde korišćen, takav epitop "uglavnom se sastoji od" jedne od neposredno prethodnih aminokiselinskih sekvenci plus dodatni elementi, uz uslov da dodatni elementi materijalno ne utiču na osnovne i nove karakteristike epitopa.
[0022] Izolovani epitop CD38 može da se sastoji od aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe koju čine aminokiseline 44-66, 82-94, 142-154, 148-164, 158-170, 192-206 i 202-224 CD38.
[0023] Pronalazak se takođe odnosi na komplet koji sadrži (i) izolovani epitop CD38 koji sadrži jedan ili više aminokiselinskih nizova uzetih sa spiska od 44-66, 82-94, 142-154, 148-164, 158-170, 192-206 i 202-224; (ii) biblioteku antitela; i (iii) uputstva za upotrebu biblioteke antitela za izolaciju jednog ili više članova takve biblioteke koji se specifično vezuje za takav epitop.
 
KRATAK OPIS SLIKA
 
[0024]
 
Slika 1a daje sekvence nukleinskih kiselina različitih varijabilnih teških regiona novog antitela.
Slika 1b daje aminokiselinske sekvence varijabilnih teških regiona novog antitela. CDR regioni HCDR1, HCDR2 i HCDR3 su označeni od N- do C-terminusa u boldu.
Slika 2a daje sekvence nukleinskih kiselina različitih varijabilnih lakih regiona novog antitela.
Slika 2b daje aminokiselinske sekvence različitih varijabilnih lakih regiona novog antitela. CDR regioni LCDR1, LCDR2 i LCDR3 su označeni od N- do C-terminusa u boldu.
Slika 3 daje aminokiselinske sekvence varijabilnih teških regiona različitih sekvenci master gena HuCAL antitela na bazi konsenzusa. CDR regioni HCDR1, HCDR2 i HCDR3 su označeni od N- do C-terminusa u boldu.
Slika 4 daje aminokiselinske sekvence varijabilnih lakih regiona različitih sekvenci master gena HuCAL antitela na bazi konsenzusa. CDR regioni LCDR1, LCDR2 i LCDR3 su ozmačeni od N- do C-terminusa u boldu.
Slika 5 daje aminokiselinsku sekvencu CD38 (SWISS-PROT primarni pristupni broj P28907).
Slika 6 daje nukleotidne sekvence teških i lakih lanaca himernog OKT10.
Slika 7 daje šematski prikaz epitopa reprezentativnih antitela predstavljenog pronalaska.
Slika 8 daje DNK sekvencu pMORPH® h_I_gG1_1 (bp 601-2100) (SEQ ID NO: 32): Vektor je zasnovan na pcDNA3.1+ vektorima (Invitrogen). Aminokiselinska sekvenca VH-„stuffer“ sekvence je prikazana u boldu; dok su finalni okviri čitanja VH-lider sekvence i gena konstantnog regiona štampani u ne-boldu. Rekstrikciona mesta su naznačena iznad sekvcence. Prajming mesta sekvencirajućih prajmera su podvučena.
Slika 9 daje DNK sekvencu ekspresionog vektora pMORFH®_h_Igκ_1 Ig kapa lakog lanca (bp 601-1400) (SEQ ID NO: 33): Vektor je baziran na pcDNA3.1+ vektorima (Invitrogen). Aminokiselinske sekvence Vκ-„stuffer“ sekvence naznačene su u boldu, dok su konačni okviri čitanja Vκ-lider sekvence i gena konstantnog regiona štampani u ne-boldu. Restrikciona mesta su naznačena iznad sekvence. Prajming mesta sekvencirajućih prajmera su podvučena.
Slika 10 daje DNK sekvencu vektora pMORPHO-h_Igλ_1 HuCAL Ig lambda lakog lanca (bp 601-1400) (SEQ ID NO: 34): Aminokiselinska sekvenca Vλ-„stuffer“ sekvence je naznačena u boldu, dok su krajnji okviri čitanja Vλ-lider sekvence i gena konstantnog regiona štampani u ne-boldu. Restrikciona mesta su naznačena iznad sekvence. Prajming mesta sekvencirajućih prajmera su podvučena.
Slika 11 daje rezultate proliferacionog testa: PBMCs iz 6 različitih zdravih davaoca (kao što su naznačeni pojedinačnim tačkama) kultivisane su u trajanju od 3 dana u prisustvu HuCAL® antitela Mab#1 (=MOR03077), Mab#2 (=MOR03079), i Mab#3 (=MOR03080), referentnog antitela chOKT10, agonističke (ag.) kontrole IB4, beznačajne HuCAL® negativne kontrole IgG1 (NC) i mišjeg IgG2a (Iso) kao uparene izotipske kontrole za IB4. Standardno obeležavanje sa BrdU je korišćeno za merenje proliferacione aktivnosti i njegove inkorportacije (kao RLU = relativne jedinice svetlosti) analizirane preko ELISA na bazi hemiluminescencije.
Slika 12 daje rezultate testa oslobađanja IL-6: PBMCs iz 4-8 različitih zdravih davaoca (kao što su naznačeni pojedinačnim tačkama) su kultivisane u trajanju od 24 časa u prisustvu HuCAL® antitela Mab#1 (=MOR03077), Mab#2 (=MOR03079), i Mab#3 (=MOR03080), referentnog antitela chOKT10, agonističke (ag.) kontrole IB4, beznačajne HuCAL® negativne kontrole (NC) i samo medijuma (Medium). Sadržaj IL-6 u relativnim jedinicama svetlosti (RLU) analiziran je iz supernatanata kulture preko ELISA na bazi hemiluminescencije.
Slika 13 daje podatke o citotoksičnosti prema CD34+/CD38+ progenitorskim ćelijama: PBMCs iz zdravih davaoca sa autolognim CD34+/CD38+ progenitorskim ćelijama su inkubirane sa HuCAL® Mab#1 (=MOR03077), Mab#2 (=MOR03079), i Mab#3 (=MOR03080), pozitivnom kontrolom (PC = chOKT10) i beznačajnom HuCAL® negativnom kontrolom u trajanju od 4 časa, respektivno. Nakon toga, ćelijska suspenzija je mešana sa kondicioniranim metil-celuloznim medijumom i inkubirana 2 nedelje. Jedinice koje fomiraju kolonije (CFU) izvedene iz ranih prethodnika eritropoeze „erythroid burst forming units“ (BFU-E; panel B) i matičnih ćelija granulocita/eritroidnih/makrofaga/megakariocita (CFU-GEMM; paneli B) i matičnih ćelija granulocita/makrofaga (CFU-GM; panel C) brojane su i normalizovane prema kontroli koja je predstavljena medijumom ("nijedan" = medijum). Panel A predstavlja ukupan broj CFU (ukupan CFUc) za sve progenitore. Date su srednje vrednosti od najmanje 10 različitih davaoca PBMC. Linije koje predstavljaju grešku su standardne greške srednje vrednosti.
Slika 14 daje podatke o ADCC sa različitim ćelijskim linijama:
 
a: Pojedinačna merenja (osim za RPMI8226: prosek iz 4 pojedinačna testa); E:T –odnos: 30:1
b: Namba et al., 1989
c: 5 µg/ml korišćeno za koncentraciju antitela (osim za Raji sa 0.1 µg/ml)
d: dodavanje retinoeve kiseline za stimulaciju ubijanja specifičnog za CD38 [%] = [(ubijanje ekpresijom-ubijanje medijumom) / (1-ubijanje medijumom)]*100
PC: Pozitivna kontrola (=chOKT10)
MM: Multipli mijelom
CLL: Hronična B-ćelijska leukemija
ALL: Akutna limfoblastična leukemija
AML: Akutna mijeloidna leukemija
DSMZ: Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH
ATCC: Američka kolekcija tipova kultura
ECACC: Evropska kolekcija ćelijskih kultura
MFI: Srednji intenziteti fluorescencije
 
Slika 15 daje podatke o ADCC sa MM-uzorcima:
a: 2-4 pojedinačnih analiza
 
Slika 16 daje eksperimentalne rezultate srednjih zapremina tumora posle tretmana ksenografta humanog mijeloma sa MOR03080: grupa 1: nosač; grupa 2: MOR03080 kao hIgG1 1mg/kg 32-68 dana svaki drugi dan; grupa 3: MOR03080 kao hIgG1 5 mg/kg 32-68 dana svaki drugi dan; grupa 4: MOR03080 kao chIgG2a 5 mg/kg 32-68 dana svaki drugi dan; grupa 5: MOR03080 kao hIgG1 mg/kg, 14-36 dana svaki drugi dan; grupa 6: netretirana
 
DETALJAN OPIS PRONALASKA
 
[0025] Predstavljeni pronalazak je zasnovan na otkriću novih antitela koja su specifična za ili imaju visok afinitet za CD38 i mogu da pružaju terapeutsku korist subjektu. Antitela prema pronalasku, koja mogu biti humana ili humanizovana, mogu biti korišćena u mnogim kontekstima, koji su potpunije ovde opisani.
[0026] "Humano" antitelo ili funkcionalni fragment humanog antitela je ovde definisano/definisan kao ono koje nije himerno (npr., nije "humanizovano") i nije od (bilo u celini ili delimično) ne-humane vrste. Humano antitelo ili funkcionalni fragment antitela može biti izvedeno/izveden iz čoveka ili može biti sintetičko humano antitelo. "Sintetičko humano antitelo" je ovde definisano kao antitelo koje ima sekvencu poreklom, u celini ili delimično, in silico iz sintetičkih sekvenci koje su bazirane na analizi poznatih sekvenci humanog antitela. In silico dizajn sekvence humanog antitela ili njenog fragmenta može se postići, na primer, analizom baze podataka sekvenci humanog antitela ili fragmenta antitela i osmišljavanjem polipeptidne sekvence upotrebom podataka dobijenih od nje. Drugi primer humanog antitela ili funkcionalnog fragmenta antitela, je onaj koji je kodiran nukleinskom kiselinom izolovanom iz biblioteke sekvenci antitela humanog porekla (tj., takva biblioteka je bazirana na antitelima uzetim iz humanog prirodnog izvora).
[0027] "Humanizovano antitelo" ili funkcionalni fragment humanizovanog antitela je ovde definisano/definisan kao ono koje je (i) poreklom od ne-humanog izvora (npr., transgenog miša koji nosi heterologni imuni sistem), pri čemu je to antitelo bazirano na sekvenci humane klicine linije; ili (ii) himerno, gde je varijabilni domen ne-humanog porekla i konstantni domen je humanog porekla ili (iii) CDR-graftovan, gde su CDRs varijabilnog domena ne-humanog porekla, dok su jedan ili više okvira varijabilnog domena humanog porekla i konstantni domen (ukoliko postoji) je humanog porekla.
[0028] Kao što je ovde korišćeno, antitelo "se vezuje specifično za," je "specifično za" ili "specifično prepoznaje" antigen (ovde, CD38) ako je takvo antitelo sposobno da pravi razliku između takvog antigena i jednog ili više referentnih antigena, s obzirom na to da specifičnost vezivanja nije apsolutna, već relativna osobina. U njegovom najopštijem obliku (i kada nije navedena definisana referenca), "specifično vezivanje" označava sposobnost antitela da pravi razliku između antigena od interesa i nesrodnog antigena, kao što je određeno, na primer, u skladu sa jednim od sledećih postupaka. Takvi postupci sadrže, ali bez ograničenja na Western blotove, ELISA-, RIA-, ECL-, IRMA-testove i skeniranja peptida. Na primer, može se izvesti standardni ELISA test. Bodovanje se može izvesti pomoću razvoja standardne boje (npr. sekundarno antitelo sa renovim peroksidom i tetrametil benzidin sa vodonik peroksidom). Reakcija u određenim komoricama je bodovana pomoću optičke gustine, na primer, na 450 nm. Tipična osnova (=negativna reakcija) može biti 0.1 OD; tipična pozitivna reakcija može biti 1 OD. Ovo znači da razlika pozitivna/negativna može biti veća od 10-puta. Tipično, određivanje specifičnosti vezivanja je izvedeno upotrebom ne pojedinačnog referentnog antigena, već grupe od oko tri do pet nesrodnih antigena, kao što su mleko u prahu, BSA, transferin ili slično.
[0029] Međutim, "specifično vezivanje" takođe može da označava sposobnost antitela da pravi razliku između ciljnog antigena i jednog ili više blisko srodnih antigena, koji se koriste kao referentne tačke, npr. između CD38 i CD157. Pored toga, "specifično vezivanje" može da se odnosi na sposobnost antitela da pravi razliku između različitih delova njegovog ciljnog antigena, npr. različitih domena ili regiona CD38, kao što su epitopi u N-terminalnom ili u C-terminalnom regionu CD38, ili između jednog ili više ključnih aminokiselinskih ostataka ili nizova aminokiselinskih ostataka CD38.
[0030] Takođe, kao što je ovde korišćen, "imunoglobulin" (Ig) je ovde definisan kao protein koji pripada klasi IgG, IgM, IgE, IgA ili IgD (ili bilo kojoj njihovoj podklasi), i obuhvata sva konvencionalno poznata antitela i njihove funkcionalne fragmente. "Funkcionalni fragment" antitela/imunoglobulina ovde je definisan kao fragment antitela/imunoglobulina (npr., varijabilni region IgG) koji zadržava antigen-vezujući region. "Antigen-vezujući region" antitela tipično se nalazi u jednom ili više hipervarijabilnih regiona antitela, tj., CDR-1, -2, i/ili -3 regionima; međutim, varijabilni "okvirni" regioni takođe mogu da imaju važnu ulogu u vezivanju antigena, kao što je obezbeđivanjem osnove za CDR regione. Poželjno, "antigen-vezujući region" sadrži najmanje aminokiselinske ostatke 4 do 103 varijabilnog lakog (VL) lanca i 5 do 109 varijabilnog teškog (VH) lanca, poželjnije aminokiselinske ostatke 3 do 107 VL i 4 do 111 VH, i naročito poželjni su kompletni VL i VH lanci (aminokiselinski položaji 1 do 109 VL i 1 do 113 VH; numeracija prema WO 97/08320). Poželjna klasa imunoglobulina za upotrebu u predstavljenom pronalasku je IgG. "funkcionalni fragmenti" prema pronalasku obuhvataju domen F(ab’)2 fragment, Fab fragment i scFv. F(ab’)2 ili Fab mogu biti konstruisani tako da se minimizuju ili potpuno uklone intermolekularne disulfidne interakcije koje se javljaju između CH1 i CL domena.
[0031] Antitelo prema pronalasku može biti poreklom od biblioteke rekombinantnog antitela koja je zasnovana na aminokiselinskim sekvencama koje su dizajnirane in silico i kodirane nukleinskim kiselinama koje su stvorene sintetički. Postignut je in silico dizajn sekvence antitela, na primer, analizom baze podataka humanih sekvenci i osmišljavanjem polipeptidne sekvence upotrebom podataka dobijenih iz nje. Postupci za dizajniranje i dobijanje in silico-stvorenih sekvenci su opisani, na primer, u Knappik et al., J. Mol. Biol. (2000) 296:57; Krebs et al., J. Immunol. Methods. (2001) 254:67; i U.S. Patentu br. 6,300,064 objavljenom za Knappik et al., koji su ovde obuhvaćeni referencom u njihovoj celini.
 
Antitela prema pronalasku
 
[0032] U ovom dokumentu, pozivamo se na sledeća reprezentativna antitela prema pronalasku: "antitelo br." ili "LACS" ili "MOR" 3077, 3079, 3080 i 3100. LAC 3077 predstavlja antitelo koje ima varijabilni teški region koji odgovara SEQ ID NO: 1 (DNK)/SEQ ID NO: 5 (protein) i varijabilni laki region koji odgovara SEQ ID NO: 9 (DNK)/SEQ ID NO: 13 (protein). LAC 3079 predstavlja antitelo koje ima varijabilni teški region koji odgovara SEQ ID NO: 2 (DNK)/SEQ ID NO: 6 (protein) i varijabilni laki region koji odgovara SEQ ID NO: 10 (DNK)/SEQ ID NO: 14 (protein). LAC 3080 predstavlja antitelo koje ima varijabilni teški region koji odgovara SEQ ID NO: 3 (DNK)/SEQ ID NO: 7 (protein) i varijabilni laki region koji odgovara SEQ ID NO: 11 (DNK)/SEQ ID NO: 15 (protein). LAC 3100 predstavlja antitelo koje ima varijabilni teški region koji odgovara SEQ ID NO: 4 (DNK)/SEQ ID NO: 8 (protein) i varijabilni laki region koji odgovara SEQ ID NO: 12 (DNK)/SEQ ID NO: 16 (protein).
[0033] Pronalazak se generalno odnosi na antitela koja imaju antigen-vezujući region koji se specifično vezuje za ili ima visok afinitet za jedan ili više regiona CD38, čija je aminokiselinska sekvenca prikazana sa SEQ ID NO: 22. Navedeno je da antitelo ima "visok afinitet" za antigen ako je mera afiniteta najmanje 100 nM (monovalentni afinitet Fab fragmenta). Inventivno antitelo ili antigen-vezujući region poželjno mogu da se vežu za CD38 sa afinitetom od oko manjim od 100 nM, poželjnije manjim od oko 60 nM, i poželjnije manje od oko 30 nM. Dalje su poželjna antitela koja se vezuju za CD38 sa afinitetom od manje od oko 10 nM, i poželjnije manjim od oko 3 nM. Na primer, afinitet antitela prema pronalasku protiv CD38 može biti oko 10.0 nM ili 2.4 nM (monovalentni afinitet Fab fragmenta).
[0034] Tabela 1 daje rezime afiniteta reprezentativnih antitela prema pronalasku, kao što je određeno pomoću površinske plazmon rezonance (Biacore) i FACS Scatchard analize:
 
Tabela 1: Afiniteti antitela
Antitelo (Fab ili IgG1)
BIACORE (Fab) KD [nM]a
FACS Scatchard (IgG1)b KD [nM]a
MOR03077
56.0
0.89
MOR03079
2.4
0.60
MOR03080
27.5
0.47
MOR03100
10.0
6.31
Himerno OKT10
Nije određen
8.28
a: srednja vrednost od najmanje 2 različita određivanja afiniteta
b: RPMI8226 MM ćelijska linija korišćena za FACS-Scatchards
 
[0035] U vezi sa Tabelom 1, afinitet LACs 3077, 3079, 3080 i 3100 je meren pomoću površinske plazmon rezonance (Biacore) na imobilizovanom rekombinantnom CD38 i pomoću postupka protočne citometrije upotrebom humane RPMI8226 ćelijske linije koja eksprimira CD38. Biacore studije su izvedene na direktno imobilizovanom antigenu (CD38-Fc fuzioni protein). Fab format LACs 3077, 3079, 3080 i 3100 ispoljava opseg monovalentnog afiniteta između oko 2.4 i 56 nM na imobilizovanom CD38-Fc fuzionom proteinu sa LAC 3079 koji pokazuje najveći afinitet, nakon koga slede Fab 3100, 3080 i 3077.
[0036] IgG1 format je korišćen za određivanja afiniteta na bazi ćelija (FACS Scatchard). Desna kolona Tabele 1 označava snagu vezivanja LACS u ovom formatu. LAC 3080 je pokazao najjače vezivanje, što je malo jače od LACS 3079 i 3077.
[0037] Antitela prema pronalasku su specifična za oblast unutar N-terminalnog regiona CD38. Na primer, LACs 3077, 3079, 3080, i 3100 prema pronalasku mogu specifično da se vezuju za N-terminalni region CD38.
[0038] Tip epitopa za koji se vezuje antitelo prema pronalasku može biti linearan (tj. jedan uzastopni niz aminokiselina) ili konformacioni (tj. višestruki nizovi aminokiselina). U cilju određivanja da li je epitop određenog antitela linearan ili konformacioni, stručnjak iz date oblasti može da analizira vezivanje antitela za preklapajuće peptide (npr., 13-merne peptide sa preklapanjem od 11 aminokiselina) koji pokrivaju različite domene CD38. Upotrebom ove analize, pronalazači su otkrili da LACS 3077, 3080, i 3100 prepoznaju diskontinuirane epitope u N-terminalnom regionu CD38, dok epitop LAC 3079 može biti opisan kao linearan (videti Sliku 7). Kombinovano sa znanjem koje je ovde dato, stručnjak iz date oblasti tehnike će znati da upotrebljava jedan ili više izolovanih epitopa CD38 za generisanje antitela koja imaju antigen-vezujući region koji je specifičan za navedene epitope (npr. upotrebom sintetičkih peptida epitopa CD38 ili ćelija koje eksprimiraju epitope CD38).
[0039] Antitelo prema pronalasku poželjno je species unakrsno-reaktivno sa ljudima i najmanje jednom drugom vrstom, koja može biti vrsta glodara ili ne-humanog primata. Ne-humani primat može biti rezus majmun, pavijan i/ili makaki majmun. Vrsta glodara može biti miš, pacov i/ili hrčak. Antitelo koje je unakrsno reaktivno sa najmanje jednom vrstom glodara, na primer, može da obezbedi veću fleksibilnost i koristi u odnosu na poznata anti-CD38 antitela, za svrhe izvođenja in vivo studija kod višestrukih vrsta sa istim antitelom.
[0040] Poželjno, antitelo prema pronalasku ne samo da je sposobno da se veže za CD38, već takođe je sposobno da posreduje u ubijanju ćelije koja eksprimira CD38. Specifičnije, anmtitelo prema pronalasku može da posreduje njegov terapeutski efekat deplecijom CD38-pozitivnih (npr., malignih) ćelija preko efektornih funkcija antitela. Ove funkcije obuhvataju ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC) i citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC).
[0041] Tabela 2 daje rezime određivanja EC50 vrednosti reprezentativnih antitela prema pronalasku kod ADCC i CDC:
 
Tabela 2: EC50 vrednosti antitela
Antitelo (IgG1)
ADCC
EC50 [nM]
CDC
EC50 [nM]
 
LP-1
RPMI8226
CHO-transfektanti
MOR03077
0.60a
0.08a
0.8c; 0.94d
MOR03079
0.09a
0.04a
0.41c
MOR03080
0.17b
0.05a
3.2c; 2.93d
MOR03100
1.00b
0.28a
10.9c; 13.61e
himerno OKT10
5.23a
4.10a
9.30c
a: srednja vrednost od najmanje 2 određivanja EC50
b: jedno određivanje
c: srednja vrednost od 2 određivanja EC50
d: srednja vrednost od 3 određivanja EC50
e: srednja vrednost od 4 određivanja EC50
 
[0042] Ekspresija CD38, međutim, nije samo nađena na imunim ćelijama unutar mijeloida (npr. monocite, granulocite) i limfoidnoj liniji (npr. aktivirane B i T-ćelije; plazma ćelije), već takođe na odgovarajućim prekursorskim ćelijama. S obzirom da je važno da te ćelije nisu pogođene ubijanjem malignih ćelija posredovanim preko antitela, antitela prema predstavljenom pronalasku poželjno nisu citotoksična za prekursorske ćelije.
[0043] Pored njegovih katalitičkih aktivnosti kao ciklična ADP-riboza ciklaza i hidrolaza, CD38 ispoljava sposobnost da prenosi signale od biološkog značaja (Hoshino et al., 1997; Ausiello et al., 2000). Te funkcije mogu biti indukovane in vivo pomoću, npr. interakcija receptor-ligand ili unakrsnim vezivanjem sa agonističkim anti-CD38 antitelima, što dovodi, npr. do mobilizacije kalcijuma, proliferacije limfocita i oslobađanja citokina. Poželjno, antitela prema predstavljenom pronalasku su ne-agonistička antitela.
 
Peptidne varijante
 
[0044] Antitela prema pronalasku nisu ograničena na specifične peptidne sekvence koje su ovde date. U vezi sa ovim otkrićem i konvencionalno dostupnim tehnologijama i referencama, stručnjak iz date oblasti tehnike će biti sposoban da pripremi, testira i koristi funkcionalne varijante antitela koje su ovde otkrivene, uz razumevanje da varijante koje imaju karakteristike vezivanja opisane u prethodnom tekstu i sposobnost da posreduju ubijanje CD38+ ciljne ćelije spadaju unutar obima predstavljenog pronalaska. Kao što je korišćeno u ovom kontekstu, "sposobnost da posreduje ubijanje CD38+ ciljne ćelije" označava funkcionalnu karakteristiku pripisanu anti-CD38 antitelu prema pronalasku. Sposobnost da posreduje ubijanje CD38+ ciljne ćelije, na taj način, obuhvata sposobnost da posreduje ubijanje CD38+ ciljne ćelije, npr. pomoću ADCC i/ili CDC, ili pomoću konstrukata toksina konjugovanih za antitelo prema pronalasku.
[0045] Varijanta antitela može da obuhvata, na primer, antitelo koje ima najmanje jedan promenjeni region koji određuje komplementarnost (CDR) (hiper-varijabilni) i/ili okvirni (FR) (varijabilni) domen/položaj, naspram peptidne sekvence koja je ovde otkrivena. Da bi se bolje ilustrovao ovaj koncept, kratak opis strukure antitela sledi.
[0046] Antitelo je sastavljeno od dva peptidna lanca, od kojih svaki sadrži jedan (laki lanac) ili tri (težak lanac) konstanta domena i varijabilni region (VL, VH), pri čemu je poslednji naveden od njih u svakom slučaju sačinjen od četiri FR regiona i tri CDR regiona postavljena između njih. Antigen-vezujuće mesto je formirano pomoću jednog ili više CDR regiona, dok FR regioni obezbeđuju strukturni okvir za CDR regione i, stoga, imaju važnu ulogu u vezivanju antigena. Promenom jednog ili više aminokiselinskih ostataka u CDR ili FR regionu, stručnjak iz date oblasti tehnike rutinski može da generiše mutirane ili raznovrsne sekvence antitela, čiji se skrining može izvršiti naspram antigena, za nove ili poboljšane osobine, na primer.
[0047] Tabele 3a (VH) i 3b (VL) opisuju CDR i FR regione za određena antitela prema pronalasku i porede aminokiseline na datom položaju međusobno i sa odgovarajućim konsenzus sekvencama ili sekvencama "master gena" (kao što je opisano u U.S. Patentu br. 6,300,064):
 
 
 
 
 
[0048] Stručnjak iz date oblasti tehnike može da koristi podatke u Tabelama 3a i 3b da bi dizajnirao peptidne varijante koje su unutar obima predstavljenog pronalaska. Poželjno da su varijante konstruisane promenom aminokiselina unutar jednog ili više CDR regiona; varijanta bi takođe mogla da ima jedan ili više promenjenih okvirnih regiona. U vezi sa poređenjem novih antitela međusobno, ostaci kandidati koji se mogu menjati obuhvataju npr. ostatke 4 ili 37 varijabilnog lakog i npr. ostatke 13 ili 43 varijabilnih teških lanaca LACs 3080 i 3077, s obzirom na to da su ovo položaji koji variraju međusobno. Promene takođe mogu biti napravljene u okvirnim regionima. Na primer, peptidni FR domen bi mogao biti promenjen gde postoji devijacija u ostatku u poređenju sa sekvencom klicine linije.
[0049] U vezi sa poređenjem novih antitela sa odgovarajućim konsenzus sekvencama ili sekvencama "master gena", ostaci kandidati koji se mogu menjati obuhvataju npr. ostatke 27, 50 ili 90 varijabilnog lakog lanca LAC 3080 u poređenju sa VLλ3 i npr. ostatke 33, 52 i 97 varijabilnog teškog lanca LAC 3080 u poređenju sa VH3. Alternativno, stručnjak iz date oblasti tehnike bi mogao da napravi istu analizu poređenjem aminokiselinskih sekvenci koje su ovde otkrivene sa poznatim sekvencama iste klase takvih antitela, upotrebom, na primer, postupka koji su opisali Knappik et al., 2000 i U.S. Patent br. 6,300,064 objavljen za Knappik et al.
[0050] Pored toga, varijante mogu biti dobijene upotrebom jednog LAC kao početne tačke za optimizaciju diverzifikacijom jednog ili više aminokiselinskih ostataka u LAC, poželjno aminokiselinskih ostataka u jednom ili više CDR regiona, i skriningom dobijene kolekcije varijanti antitela za varijante sa poboljšanim osobinama. Naročito je poželjna diverzifikacija jednog ili više aminokiselinskih ostataka u CDR-3 VL, CDR-3 VH, CDR-1 VL i/ili CDR-2 VH. Diverzifikacija može biti izvedena sintetisanjem kolekcije DNK molekula upotrebom tehnologije trinukleotidne mutageneze (TRIM) (Virnekäs, B., Ge, L., Plückthun, A., Schneider, K.C., Wellnhofer, G., and Moroney S.E. (1994) Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis. Nucl. Acids Res. 22, 5600.).
 
Konzervativne aminokiselinske varijante
 
[0051] Mogu biti napravljene polipeptidne varijante koje čuvaju ukupnu molekularnu strukturu peptidne sekvence antitela koja je ovde opisana. Imajući u vidu osobine pojedinačnih aminokiselina, neke racionalne supstitucije će biti prepoznate od strane stručnjaka iz date oblasti tehnike. Aminokiselinske supstitucije, tj., "konzervativne supstitucije," mogu biti napravljene, na primer, na osnovu sličnosti u polarnosti, naelektrisanju, rastvorljivosti, hidrofobnosti, hidrofilnosti i/ili amfipatičnoj prirodi uključenih ostataka.
[0052] Na primer, (a) nepolarne (hidrofobne) aminokiseline obuhvataju alanin, leucin, izoleucin, valin, prolin, fenilalanin, triptofan, i metionin; (b) polarne neutralne aminokiseline obuhvataju licin, serin, treonin, cistein, tirozin, asparagin i glutamin; (c) pozitivno naleketrisane (bazne) aminokiseline obuhvataju arginin, lizin, i histidin; i (d) negativno naelektrisane (kisele) aminokiseline obuhvataju asparaginsku kiselinu i glutaminsku kiselinu. Supstitucije tipično mogu biti napravljene unutar grupa (a)-(d). Pored toga, glicin i prolin mogu biti supstituisani međusobno na bazi njihove sposobnosti da prekinu α-helikse. Slično, određene aminokiseline, kao što su alanin, cistein, leucin, metionin, glutaminska kiselina, glutamin, histidin i lizin se najčešće nalaze u α-heliksima, dok se valin, izoleucin, fenilalanin, tirozin, triptofan i treonin češće nalaze u β-nabranim pločama. Glicin, serin, asparaginska kiselina, asparagin i prolin se obično nalaze u zavojnicama. Neke poželjne supstitucije mogu biti napravljene među sledećim grupama: (i) S i T; (ii) P i G; i (iii) A, V, L i I. Imajući u vidu poznati genetički kod, i tehnike rekombinantne i sintetičke DNK, stručnjak iz date oblasti može lako da konstruiše DNK kiseline koje kodiraju konzervativne aminokiselinske varijante. U jednom posebnom primeru, aminokiselinski položaj 3 u SEQ ID NOS: 5, 6, 7 i/ili 8 može biti promenjen od Q u E.
[0053] Kao što je ovde korišćena, "identičnost sekvenci" između dve polipeptidne sekvence ukazuje na procenat aminokiselina koje su identične između sekvenci. "Sličnost sekvenci" ukazuje na procenat aminokiselina koje su ili identične ili koje predstavljaju konzervativne aminokiselinske supstitucije. Poželjne polipeotidne sekvence prema pronalasku imaju identičnost sekvenci u CDR regionima od najmanje 60%, poželjnije, najmanje 70% ili 80%, još poželjnije najmanje 90% i najpoželjnije najmanje 95%. Poželjna antitela takođe imaju sličnost sekvenci u CDR regionima od najmanje 80%, poželjnije 90% i najpoželjnije 95%.
 
DNK molekuli prema pronalasku
 
[0054] Predstavljeni pronalazak se takođe odnosi na DNK molekule koji kodiraju antitelo prema pronalasku. Ove sekvence obuhvataju, ali bez ograničenja na, one DNK molekule navedene na Slikama 1a i 2a.
[0055] DNK molekuli prema pronalasku nisu ograničeni na sekvence otkrivene ovde, već takođe obuhvataju njihove varijante. DNK varijante unutar pronalaska mogu biti opisane u vezi sa njihovim fizičkim osobinama u hibridizaciji. Stručnjak iz date oblasti tehnike će prepoznati da se DNK može koristiti za identifikaciju njenog komplementa i, s obzirom na to da je DNK dvolančana, njenog ekvivalenta ili homologa, upotrebom tehnika hibridizacije nukleinskih kiselina. Takođe će biti jasno da se hibridizacija može javiti sa manje od 100% komplementarnosti. Međutim, imajući odgovarajući izbor uslova, tehnike hibridizacije se mogu koristiti za diferencijaciju među DNK sekvencama na bazi njihove strukturne srodnosti sa određenom probom. Za vodič u vezi sa ovim uslovima videti, Sambrook et al., 1989 (Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, USA) i Ausubel et al., 1995 (Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Sedman, J. G., Smith, J. A., & Struhl, K. eds. (1995). Current Protocols in Molecular Biology. New York: John Wiley and Sons).
[0056] Strukturna sličnost između dve polinukleotidne sekvence može biti izražena kao funkcija "stringentnosti" uslova pod kojim će dve sekvence da hibridizuju međusobno. Kao što je ovde korišćen, termin "stringentnost" označava veličinu u kojoj uslovi nisu naklonjeni hibridizaciji. Stringentni uslovi snažno su nefavorizujući za hibridizaciju, i samo strukturalno najsrodniji molekuli će se hibridizovati međusobno pod takvim uslovima. Suprotno, ne-stringentni uslovi favorizuju hibridizaciju molekula koji ispoljavaju manji stepen strukturne srodnosti. Stringentnost hibridizacije, prema tome, je u direktnoj korelaciji sa strukturnim vezama dve sekvence nukleinskih kiselina. Sledeće veze su korisne u korelaciji hibridizacije i srodnosti (gde Tm je temperatura topljenja dupleksa nukleinskih kiselina):
 
a.
Tm = 69.3 + 0.41(G+C)%
 
b. Tm dupleksa DNK smanjuje se za 1°C sa svakim povećanjem od 1% u broju nesparenih baznih parova.
 
C.
(Tm)μ2 - (Tm)μ1 = 18.5 log10μ2/μ1
 
gde su μ1 i μ 2 jonske snage dva rastvora.
 
[0057] Stringentnost hibridizacije je funkcija mnogih faktora, uključujući ukupnu koncentraciju DNK, jonsku snagu, temperaturu, veličinu probe i prisustvo sredstava koji prekidaju vodoničnu vezu. Faktori koji stimulišu hibridizaciju obuhvataju visoke koncentracije DNK, visoke jonske snage, niske temperature, duži veličinu probe i odsustvo sredstava koji prekidaju vodoničnu vezu. Hibridizacija se tipično izvodi u dve faze: "vezujuća" faza i faza "ispiranja".
[0058] Prvo, u vezujućoj fazi, proba je vezana za ciljno mesto pod uslovima koji favorizuju hibridizaciju. Stringentnost se obično kontroliše u ovoj fazi promenom temperature. Za visoku stringentnost, temperatura je obično između 65°C i 70°C, osim ukoliko se ne koriste kratke (< 20 nt) oligonukleotidne probe. Reprezentativan hibridizacioni rastvor sadrži 6X SSC, 0.5% SDS, 5X Denhardt-ov rastvor i 100 μg nespecifične nosačke DNK. Videti Ausubel et al., section 2.9, supplement 27 (1994). Naravno, poznati su mnogi različiti, ali funkcionalno ekvivalentni, puferski uslovi. Tamo gde je stepen srodnosti niži, može biti izabrana niža temperatura. Vezujuće temperature na niskoj stringentnosti su između oko 25°C i 40°C. Srednja stringentnost je između najmanje oko 40°C do manje od oko 65°C. Visoka stringentnost je najmanje oko 65°C.
[0059] Drugo, višak probe se uklanja ispiranjem. U ovoj fazi se obično primenjuju stringentniji uslovi. Stoga, ovaj stadijum "ispiranja" je najvažniji u određivanju srodnosti preko hibridizacije. Rastvori za ispiranje tipično sadrže niske koncentracije soli. Jedan primer rastvora srednje stringentnosti sadrži 2X SSC i 0.1% SDS. Rastvor visoke stringentnosti za ispiranje sadrži ekvivalent (u jonskoj snazi) od manje od oko 0.2X SSC, sa poželjnim stringentnim rastvorom koji sadrži oko O.1X SSC. Temperature povezane sa različitim stringentnostima su iste kao što su razmatrane u prethodnom tekstu za "vezivanje." Rastvor za ispiranje takođe je tipično zamenjen određeni broj puta u toku ispiranja. Na primer, tipični uslovi visoke stringentnosti ispiranja sadrže dva puta ispiranje od 30 minuta na 55°C i tri puta u trajanju od 15 minuta na 60°C.
[0060] Prema tome, predstavljeni pronalazak sadrži molekule nukleinske kiseline koji hibridizuju sa molekulima navedenim na Slikama 1a i 2a pod uslovima visoke stringentnosti vezivanja i ispiranja, gde takvi nukleinski molekuli kodiraju antitelo ili njegov funkcionalni fragment koji imaju osobine kao što su ovde opisane. Poželjni molekuli (iz perspektive iRNK) su oni koji imaju najmanje 75% ili 80% (poželjno najmanje 85%, poželjnije najmanje 90% i najpoželjnije najmanje 95%) homologije ili identičnosti sekvenci sa jednim od DNK molekula koji su ovde opisani. U jednom posebnom primeru varijante pronalaska, nukleinsko kiselinski položaj 7 u SEQ ID NOS: 1, 2, 3 i/ili 4 može biti supstituisan iz C u G, na taj način menjajući kodon iz CAA u GAA.
 
 
 
Funkcionalno ekvivalentne varijante
 
[0061] Sledeća klasa DNK varijanti unutar obima pronalaska može biti opisana u vezi sa proizvodom koji kodiraju (videti peptide navedene na slikama 1b i 2b). Ovi funkcionalno ekvivalentni geni su okarakterisani činjenicom da oni kodiraju iste peptidne sekvence koje se nalaze na slikama 1b i 2b zbog degeneracije genetičkog koda. SEQ ID NOS: 1 i 31 su primer funkcionalno ekvivalentnih varijanti, jer su njihove nukleinsko kiselinske sekvence različite, ali ipak one kodiraju isti polipeptid, tj. SEQ ID NO: 5.
[0062] Razume se da varijante DNK molekula koje su ovde date mogu biti konstruisane na nekoliko različitih načina. Na primer, one mogu biti konstruisane kao kompletno sintetičke DNK. Postupci efikasnog sintetisanja oligonukleotida u opsegu od 20 do oko 150 nukleotida su široko dostupni. Videti Ausubel et al., section 2.11, Supplement 21 (1993). Preklapajući oligonukleotidi mogu biti sintetisani i sklopljeni na način koji su prvi put objavili Khorana et al., J. Mol. Biol. 72:209-217 (1971); videti takođe Ausubel et al., supra, Section 8.2. Sintetičke DNK poželjno su dizajnirane sa pogodnim restrikcionim mestima konstruisanim na 5’ i 3’ krajevima gena da bi se olakšalo kloniranje u odgovarajući vektor.
[0063] Kao što je naznačeno, postupak za generisanje varijanti predstavljen je započinjanjem sa jednom od DNK koje su ovde navedene i zatim izvođenjem mutageneze usmerene na mesto. Videti Ausubel et al., supra, chapter 8, Supplement 37 (1997). U tipičnom postupku, ciljna DNK je klonirana u jednolančani DNK nosač bakteriofaga. Jednolančana DNK je izolovana i hibridizovana sa oligonukleotidom koji sadrži željenu/željene nukleotidnu/nukleotidne promenu/promene. Komplementarni lanac je sintetisan i dvolančani fag je uveden u domaćina. Nešto rezultirajućeg potomstva će sadržati željenog mutanta, koji može biti potvrđen upotrebom DNK sekvenciranja. Pored toga, dostupni su različiti postupci koji povećavaju verovatnoću da će fag potomstva biti željeni mutant. Ovi postupci su dobro poznati stručnjacima iz date oblasti tehnike i kompleti su komercijalno dostupni za generisanje takvih mutanata.
 
Rekombinantni DNK konstrukti i ekspresija
 
[0064] Predstavljeni pronalazak dalje obezbeđuje rekombinantne DNK konstrukte koji sadrže jednu ili više nukleotidnih sekvenci prema predstavljenom pronalasku. Rekombinantni konstrukti prema predstavljenom pronalasku se koriste u vezi sa vektorom, kao što je plazmidni ili virusni vektor, u koji je inseriran DNK molekul koji kodira antitelo prema pronalasku.
[0065] Kodirani gen može biti proizveden pomoću tehnika opisanih u Sambrook et al., 1989, and Ausubel et al., 1989. Alternativno, DNK sekvence mogu biti hemijski sintetisane upotrebom, na primer, sintisajzera. Videti, na primer, tehnike opisane u OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (1984, Gait, ed., IRL Press, Oxford), koja je ovde obuhvaćena referencom u celini. Rekombinantni konstrukti prema pronalasku su sadržani sa ekspresionim vektorima koji su sposobni da eksprimiraju RNK i/ili proteinske proizvode kodirane/kodiranih DNK (jedne ili više). Vektor može dalje da sadrži regulatorne sekvence, uključujući promotor funkcionalno vezan za otvoreni okvir čitanja (ORF). Vektor može dalje da sadrži selektabilnu marker sekvencu. Specifični inicijacioni bakterijski sekretorni signali takođe mogu biti potrebni za efikasnu translaciju kodirajućih sekvenci inseriranog ciljnog gena.
[0066] Predstavljeni pronalazak dalje daje ćelije domaćine koje sadrže najmanje jednu od DNK prema predstavljenom pronalasku. Ćelija domaćin može praktično biti bilo koja ćelija za koju su dostupni ekspresioni vektori. To može biti, na primer, viša eukariotska ćelija domaćin, kao što je sisarska ćelija, niža eukariotska ćelija domaćin, kao što je ćelija kvasca, ali poželjno je prokariotska ćelija, kao što je bakterijska ćelija. Uvođenje rekombinantnog konstrukta u ćeliju domaćina može biti postignuto kalcijum fosfatnom transfekcijom, DEAE, dekstranom posredovanom transfekcijom, elektroporacijom ili fagnom infekcijom.
 
Bakterijska ekspresija
 
[0067] Korisni ekspresioni vektori za bakterijsku upotrebu su konstruisani insercijom strukturne DNK sekvence koja kodira željeni protein zajedno sa pogodnim translacionim inicijacionim i terminacionim signalima u funkcionalnoj fazi čitanja sa funkcionalnim promotorom. Vektor će sadržati jedan ili više fenotipskih selektabilnih markera i oridžin replikacije da bi se osiguralo održavanje vektora i, ako je poželjno, da bi se obezbedila amplifikacija unutar domaćina. Pogodni prokariotski domaćini za transformaciju obuhvataju E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium i razliučite vrste unutar roda Pseudomonas, Streptomyces i Staphylococcus.
[0068] Bakterijski vektori mogu biti, na primer, na bazi bakteriofaga, plazmida ili fagemida. Ovi vektori mogu da sadrže selektabilni marker i bakterijski oridžin replikacije poreklom od komercijalno dostupnih plazmida koji tipično sadrže elemente dobro poznatog klonirajućeg vektora pBR322 (ATCC 37017). Posle transformacije pogodnog soja domaćina i rasta soja domaćina do odgovarajuće ćelijske gustine, izabrani promotor je de-represovan/indukovan odgovarajućim sredstvima (npr., temperaturnim pomeranjem ili hemijskom indukcijom) i ćelije su kultivisane tokom dodatnog perioda. Ćelije su tipično sakupljene centrifugiranjem, raskinute fizičkim ili hemijskim sredstvima, i dobijeni sirovi ekstrakt je ostao za dodatno prečišćavanje.
[0069] U bakterijskim sistemima, određeni broj ekspresionih vektora može biti povoljno izabran u zavisnosti od upotrebe nameravane za protein koji se eksprimira. Na primer, kada se proizvodi velika količina takvog proteina, za generisanje antitela ili za skrining peptidnih biblioteka, na primer, mogu biti poželjni vektori koji usmeravaju ekspresiju visokih nivoa proizvoda fuzionog proteina se lako prečišćavaju.
 
Terapeutski postupci
 
[0070] Terapeutski postupci obuhvataju primenu na subjekta kod koga postoji potreba za tretmanom terapeutski efikasne količine antitela razmatranog u ovom pronalasku. "Terapeutski efikasna" količina je ovde definisana kao količina antitela koja je dovoljnog kvantiteta da depletira CD38-pozitivne ćelije u tretiranoj oblasti subjekta – bilo kao pojedinačna doza ili prema višestrukom doznom režimu, pojedinačno ili u kombinaciji sa drugim sredstvima, što dovodi do ublažavanja štetnog stanja, a koja količina je takođe toksikološki tolerabilna. Subjekat može biti humana ili ne-humana životinja (npr., zec, pacov, miš, majmun ili drugi primat nižeg reda).
[0071] Antitelo prema pronalasku može biti ko-primenjivano sa poznatim lekovima, i u nekim slučajevima antitelo bi moglo samo da bude modifikovano. Na primer, antitelo bi moglo biti konjugovano za imunotoksin ili radioizotop da bi se potencijalno dalje povećala efikasnost.
[0072] Inventivna antitela se mogu koristiti kao terapeutsko ili dijagnostičko sredstvo u različitim situacijama gde je CD38 nepoželjno eksprimiran ili nađen. Poremećaji i stanja naročito pogodna za tretman antitelom prema pronalasku su multipli mijelom (MM) i druge hematološke bolesti, kao što su hronična limfocitna leukemija (CLL), hronična mijelogena leukemija (CML), akutna mijelogena leukemija (AML), i akutna limfocitna leukemija (ALL). Antitelo prema pronalasku bi se takođe moglo koristiti za tretman inflamatorne bolesti kao što je reumatoidni artritis (RA) ili sistemski lupus eritematodes (SLE).
[0073] Za tretman bilo kog od prethodno navedenih poremećaja, farmaceutske kompozicije za upotrebu u skladu sa predstavljenim pronalaskom mogu biti formulisane na konvencionalan način upotrebom jednog ili više fiziološki prihvatljivih nosača ili inertnih punilaca. Antitelo prema pronalasku može biti primenjivano pomoću bilo kojih pogodnih sredstava, koja mogu da variraju, u zavisnosti od tipa poremećaja koji se tretira. Mogući putevi primene obuhvataju parenteralnu (npr., intramuskularnu, intravensku, intraarterijsku, intraperitonealnu ili subkutanu), intrapulmonarnu i intranazalnu, i, ako je poželjna za lokalni imunosupresivni tretman, intralezionu primenu. Pored toga, antitelo prema pronalasku moglo bi se primenjivati pulsnom infuzijom, sa, npr., smanjujućim dozama antitela. Poželjno, doza se daje injekcijama, najpoželjnije intravenskim ili subkutanim injekcijama, u zavisnosti delimično od toga da li je primena kratka ili hronična. Količina koja će se primenjivati zavisiće od različitih faktora kao što su klinički simptomi, težina individue, od toga da li se primenjuju drugi lekovi. Stručnjak iz date oblasti tehnike će znati da će put primene varirati u zavisnosti od poremećaja ili stanja koje se tretira.
[0074] Određivanje terapeutski efikasne količine novog polipeptida, prema ovom pronalasku, u velikoj meri će zavisiti od karakteristika određenog pacijenta, puta primene, i prirode poremećaja koji se tretira. Opšti vodič se može naći, na primer, u publikacijama Međunarodne konferencije o harmonizaciji i u REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES, chapters 27 and 28, pp. 484-528 (18th ed., Alfonso R. Gennaro, Ed., Easton, Pa.: Mack Pub. Co., 1990). Preciznije, određivanje terapeutski efikasne količine zavisiće od takvih faktora kao što su toksičnost i efikasnost leka. Toksičnost može biti određena upotrebom postupaka koji su dobro poznati u tehnici i koji se nalaze u prethodno navedenim referencama. Efikasnost može biti određena korišćenjem istog vodiča zajedno sa postupcima opisanim u daljem tekstu u Primerima.
 
Dijagnostički postupci
 
[0075] CD38 je visoko eksprimiran na hematološkim ćelijama kod određenih maligniteta; na taj način, anti-CD38 antitelo prema pronalasku se može koristiti u cilju prikaza ili vizuelizacije mesta moguće akumulacije malignih ćelija u pacijentu. U vezi s tim, antitelo može biti detektabilno obeleženo, preko upotrebe radioizotopa, afinitetnih obeleživača (kao što je biotin, avidin, itd.) fluorescentnih obeleživača, paramagnetnih atoma, itd. Postupci za postizanje takvog obeležavanja su dobro poznati u tehnici. Klinička primena antitela u dijagnostičkom imadžingu prikazana je u Grossman, H. B., Urol. Clin. North Amer. 13:465-474 (1986)), Unger, E. C. et al., Invest. Radiol. 20:693-700 (1985)), i Khaw, B. A. et al., Science 209:295-297 (1980)).
[0076] Detekcija fokusa takvih detektabilno obeleženih antitela bi mogla biti indikativna za mesto razvoja tumora, na primer. Ispitivanje se može izvesti uklanjanjem uzoraka tkiva ili krvi i inkubacijom takvih uzoraka u prisustvu detektabilno obeleženih antitela. Poželjno se ova tehnika izvodi na ne-invazivan način preko upotrebe magnetnog imadžinga, fluorografije, itd. Takav dijagnostički test se može koristiti u praćenju uspeha tretmana bolesti, gde je prisustvo ili odsustvo CD38-pozitivnih ćelija relevantan indikator. Pronalazak takođe razmatra upotrebu anti-CD38 antitela, kao što je ovde opisan za dijagnostiku u ex vivo postavci.
 
Terapeutske i dijagnostičke kompozicije
 
[0077] Antitela prema predstavljenom pronalasku mogu biti formulisana prema poznatim postupcima za pripremu farmaceutski korisnih kompozicija, gde se antitelo prema pronalasku (uključujući bilo koji njegov funkcionalni fragment) kombinuje u smeši sa farmaceutski prihvatljivim nosačem. Pogodni nosači i njihova formulacija opisani su, na primer, u REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES (18th ed., Alfonso R. Gennaro, Ed., Easton, Pa.: Mack Pub. Co., 1990). U cilju formiranja farmaceutski prihvatljive kompozicije pogodne za efikasnu primenu, takve kompozicije će sadržati efikasnu količinu jednog ili više antitela prema predstavljenom pronalasku, zajedno sa pogodnom količinom nosača.
[0078] Preparati mogu biti pogodno formulisani tako da daju kontrolisano oslobađanje aktivnog jedinjenja. Preparati sa kontrolisanim oslobađanjem mogu biti postignuti preko upotrebe polimera za formiranje kompleksa ili apsorbovanje anti-CD38 antitela. Kontrolisano oslobađanje može biti ispoljeno izborom odgovarajućih makromolekula (na primer poliestara, poliamino kiselina, polivinila, pirolidona, etilenvinil-acetata, metilceluloze, karboksimetilceluloze, ili protamina, sulfata) i koncentracije makromolekula kao i postupaka ugradnje u cilju kontrole oslobađanja. Sledeći mogući postupak za kontrolu trajanja delovanja pomoću preparata sa kontrolisanim oslobađanjem je ugradnja anti-CD38 antitela u čestice polimernog materijala kao što su poliestri, poliaminokiseline, hidrogelovi, poli(mlečna kiselina) ili etilen vinilacetatni kopolimeri. Alternativno, umesto ugradnje ovih sredstava u polimerne čestice, moguće je zatvoriti ove materijale u mikrokapsule pripremljene, na primer, pomoću tehnika koacervacije ili pomoću interfacijalne polimerizacije, na primer, hidroksimetilceluloznih ili želatinskih-mikrokapsula i poli(metilmetakrilatnih) mikrokapsula, respektivno, ili u koloidnim sistemima za primenu leka, na primer, lipozomima, albuminskim mikrosferama, mikroemulzijama, nanočesticama i nanokapsulama ili u makroemulzijama. Takve tehnike su navedene u Remington’s Pharmaceutical Sciences (1980).
[0079] Jedinjenja mogu biti formulisana za parenteralnu primenu injekcijom, npr., pomoću bolus injekcije ili kontinuirane infuzije. Formulacije za injekciju mogu biti predstavljene u jediničnom obliku doze, npr., u ampulama, ili u više-doznim kontejnerima, sa dodatim konzervansom. Kompozicije mogu imati takve oblike kao suspenzije, rastvori ili emulzije u uljanim ili vodenim nosačima, i mogu da sadrže formulaciona sredstva kao što su suspendujuća, stabilizujuća i/ili dispergujuća sredstva. Alternativno, aktivni sastojak može biti u obliku praha za konstituciju sa pogodnim nosačem, npr., sterilnom vodom bez pirogena, pre upotrebe.
[0080] Kompozicije mogu, ako je poželjno, biti predstavljene u pakovanju ili uređaju dispenzeru, koji može da sadrži jedan ili više jediničnih oblika doze koji sadrže aktivni sastojak. Pakovanje može na primer da sadrži metalnu ili plastičnu foliju, kao što je blister pakovanje. Pakovanje ili uređaj dispenzer mogu biti praćeni uputstvima za primenu.
[0081] Pronalazak se dalje razume u vezi sa sledeći radnim primerima, čiji je cilj da ilustruju i stoga da ne ograničavaju pronalazak.
 
PRIMERI
 
Ćelijske linije
 
[0082] Sledeće ćelijske linije su dobijene iz Evropske kolekcije ćelijskih kultura (ECACC), Nemačke kolekcije mikroorganizama (DSMZ) ili Američke kolekcije tipa kultura (ATCC): hibridoma ćelijska linija koja proizvodi CD38 mišje IgG1 monoklonsko antitelo OKT10 (ECACC, #87021903), Jurkat ćelije (DSMZ, ACC282), LP-1 (DSMZ, ACC41), RPMI8226 (ATCC, CCL-155), HEK293 (ATCC, CRL-1573), CHO-K1 (ATCC, CRL-61) i Raji (ATCC, CCL-86)
 
Ćelije i uslovi kulture
 
[0083] Sve ćelije su kultivisane pod standardizovanim uslovima na 37°C i 5% CO2 u humidifikovanom inkubatoru. Ćelijske linije LP-1, RPMI8226, Jurkat i Raji su kultivisane u RPMI1640 (Pan biotech GmbH, #P04-16500) dopunjenom sa 10 % FCS (PAN biotech GmbH, #P30-3302), 50 U/ml penicilina, 50 μg/ml streptomicina (Gibco, #15140-122) i 2 mM glutamina (Gibco, #25030-024) i, u slučaju Jurkat- i Raji-ćelija, mora se dodati dodatno 10 mM Hepes (Pan biotech GmbH, #P05-01100) i 1 mM natrijum piruvat (Pan biotech GmbH, # P04-43100).
[0084] CHO-K1 i HEK293 su uzgajane u DMEM (Gibco, #10938-025) dopunjenim sa 2 mM glutaminom i 10% FCS. Stabilni CD38 CHO-K1 transfektanti su održavani u prisustvu G418 (PAA GmbH, P11-012) dok je za HEK293 esencijalno bilo dodavanje 1mM natrijum-piruvata. Posle prolazne transfekcije HEK293 10% FCS je zamenjen sa Ultra low IgG FCS (Invitrogen, #16250-078). Ćelijska linija OKT10 je kultivisana u IDMEM (Gibco, #31980-022), dopunjenim sa 2 mM glutaminom i 20 % FCS.
 
Priprema suspenzija pojedinačne ćelije od periferne krvi
 
[0085] Svi uzorci krvi su uzeti posle informisanog pristanka. Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) su izolovane pomoću Histopaque®-1077 (Sigma) prema uputstvima proizvođača iz zdravih davaoca. Eritrociti su depletirani iz ovih ćelijskih suspenzija inkubacijom u ACK puferu za lizu (0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 M EDTA) u trajanju od 5 min na RT ili komercijalnom derivatu (Bioscience, #00-4333). Ćelije su isprane dva puta sa PBS i zatim dalje obrađene za protočnu citometriju ili ADCC (videti u daljem tekstu).
 
Protočna citometrija ("FACS")
 
[0086] Sva bojenja su izvedena u 96-komornim pločama za kulturu sa okruglim dnom (Nalge Nunc) sa 2 x 105 ćelija po komorici. Ćelije su inkubirane sa Fab ili IgG antitelima na naznačenim koncentracijama u 50 μl FACS puferu (PBS, 3% FCS, 0.02% NaN3) u trajanju od 40 min na 4°C. Ćelije su isprane dva puta i zatim inkubirane sa R-fikoeritrinom (PE) konjugovanim kozjim-anti-humanim ili kozjim-anti-mišjim IgG (H+L) F(ab’)2 (Jackson Immuno Research), razblaženim 1:200 u FACS puferu, u trajanju od 30 min na 4°C. Ćelije su ponovo isprane, resuspendovane u 0.3 ml FACS pufera i zatim analizirane pomoću protočne citometrije u FACSCalibur (Becton Dickinson, San Diego, CA).
[0087] Za FACS bazirane Scatchard analize RPMI8226 ćelije su bojene na 12 različitih razblaženja (1:2n) počevši na 12.5 μg/ml (IgG) krajnje koncentracije. Najmanje dva nezavisna merenja su korišćena za svaku koncentraciju i KD vrednosti su ekstrapolirane iz medijane intenziteta fluorescencije prema Chamow et al. (1994).
Površinska plazmon rezonanca
 
[0088] Kinetičke konstante kon i koff su određene sa serijskim razblaženjima odgovarajućeg Fab koji se kovalentno vezuje za imobilizovani CD38-Fc fuzioni protein upotrebom BIAcore 3000 instrumenta (Biacore, Uppsala, Sweden). Za kovalentnu imobilizaciju antigena korišćen je standard hemije kuplovanja EDC-NHS. Za direktno kuplovanje CD38 Fc-fuzionog proteina, CM5 senzorni čipovi (Biacore) su obloženi sa ∼600-700 RU u 10 mM acetatnom puferu, pH 4.5. Za referentnu protočnu ćeliju, korišćena je odgovarajuća količina HSA (humanog serum albumina). Kinetička merenja su izvedena u PBS (136 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.76 mM KH2PO4 pH 7.4) na stopi protoka od 20 μl/min upotrebom opsega koncentraciaj Fab od 1.5-500 nM. Vreme injekcije za svaku koncentraciju bilo je 1 min, nakon koga sledi 2 min faze disocijacije. Za regeneraciju je korišćeno 5 μl 10mM HCl. Svi senzogrami su fitovani lokalno upotrebom BIA softvera za evaluaciju 3.1 (Biacore).
 
PRIMER 1: Generisanje antitela iz HuCAL biblioteka
 
[0089] Za generisanje terapeutskih antitela protiv CD38, izvedene su selekcije sa bibliotekom MorphoSys HuCAL GOLD fagnog prikaza. HuCAL GOLD® je biblioteka Fab bazirana na HuCAL® konceptu (Knappik et al., 2000; Krebs et al., 2001), u kojoj su svih šest CDR regiona diverzifikovani, i koja koristi CysDisplay™ tehnologiju za vezivanje Fab fragmenata za površinu faga (Löhning, 2001).
 
A. Spašavanje fagemida, amplifikacija faga i prečišćavanje
 
[0090] HuCAL GOLD® biblioteka fagemida je amplifikovana u 2 x TY medijumu koji sadrži 34 μg/ml hloramfenikola i 1 % glukoze (2 x TY-CG). Posle infekcije pomoćnim fagom (VCSM13) na OD600 od 0.5 (30 min na 37°C bez mućkanja; 30 min na 37°C mućkanje na 250 rpm), ćelije su centrifugirane (4120 g; 5 min; 4°C), resuspendovane u 2 x TY / 34 μg/ml hloramfenikola/ 50 μg/ml kanamicina i uzgajane preko noći na 22°C. Fagi su PEG-istaloženi iz supernatanta, resuspendovani u PBS / 20 % glicerolu i čuvani na -80°C. Amplifikacija faga između dva ciklusa paninga je izvedena kao što sledi: TG1 ćelije mid-log faze su inficirane sa eluiranim fagima i postavljene na LB-agar dopunjen sa 1 % glukoze i 34 μg/ml hloramfenikola (LB-CG). Posle prekonoćne inkubacije na 30°C, kolonije su sastrugane, podešene do OD600 od 0.5 i dodat je pomoćni fag kao što je opisano u prethodnom tekstu.
B. Paning sa HuCAL GOLD®
 
[0091] Za selekcije fagi HuCAL GOLD® antitela su podeljeni u tri grupe koje odgovaraju različitim VH master genima (grupa 1: VH1/5λκ, grupa 2: VH3 λκ, grupa 3: VH2/4/6 λκ). Ove grupe su pojedinačno podvrgnute 3 ciklusa paninga celih ćelija na CHO-K1 ćelijama koje eksprimiraju CD38, nakon čega sledi pH-eluiranje i korak post-adsorpcije na CD38-negativnim CHO-K1-ćelijama za depleciju irelevantnih antitelo-faga. Konačno, preostali fagi antitela su korišćeni za inficiranje E. coli TG1 ćelija. Posle centrifugiranja bakterijski pelet je resuspendovan u 2 x TY medijumu, postavljenom na agar ploče i inkubiran preko noći na 30°C. Izabrani klonovi su zatim sastrugani sa ploča, fagi su izolovani i amplifikovani. Drugi i treći ciklus selekcija su izvedeni kao početni.
[0092] Inserti koji kodiraju Fab izabranih HuCAL GOLD® faga su subklonirani u ekspresioni vektor pMORPH®x9_Fab_FS (Rauchenberger et al., 2003) da bi se olakšala brza ekspresija rastvorljivog Fab. DNK izabranih klonova je razložena sa XbaI i EcoRI na taj način isecajući insert koji kodira Fab (ompA-VLCL i phoA-Fd), i klonirana u XbaI / EcoRI isečeni vektor pMORPH®x9_Fab_FS. Fab eksprimiran u ovom vektoru nosi dva C-terminalna obeleživača (FLAG™ i Strep-tag® II) za detekciju i prečišćavanje.
 
PRIMER 2: Biološki testovi
 
[0093] Ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC) i citotoksičnost zavisna od komplementa je merena prema objavljenom protokolu na bazi analize protočne citometrije (Naundorf et al., 2002) kao što sledi:
 
ADCC:
 
[0094] Za merenja ADCC, ciljne ćelije (T) su podešene do 2.0E+05 ćelija/ml i obeležene sa 100 ng/ml kalceina AM (Molecular Probes, C-3099) u RPMI1640 medijumu (Pan biotech GmbH) u trajanju od 2 minuta na sobnoj temperaturi. Rezidualni kalcein je uklonjen sa 3 koraka ispiranja u RPMI1640 medijumu. Paralelno, PBMC su pripremljene kao izvor za (prirodne ubice) efektorne ćelije (E), podešene do 1.0E+07 i mešane sa obeleženim ciljnim ćelijama da bi se proizveo konačni E:T-odnos od 50:1 ili manje, u zavisnosti od uslova testa. Ćelije su isprane jednom i ćelijska mešavina je resuspendovana u 200 μl RPMI1640 medijuma koji sadrži odgovarajuće antitelo u različitim razblaženjima. Ploča je inkubirana 4 časa pod standardizovanim uslovima na 37°C i 5% CO2 u humidifikovanom inkubatoru. Pre FACS analize ćelije su obeležene sa propidijumjodidom (PI) i analizirane pomoću protočne citometrije (Becton-Dickinson). Između 50.000 i 150.000 događaja je izbrojano za svaki test.
[0095] Sledeća jednačina je dala aktivnost ubijanja [u %]:
 
sa EDA = događaji mrtvih ćelija (kalcein + PI obojene ćelije), i
ELA = događaji živih ćelija (kalceinom obojene ćelije)
 
CDC:
 
[0096] Za merenja CDC, 5.0E+04 CD38 CHO-K1 transfektanti su dodati u mikrotitarsku komornu ploču (Nunc) zajedno sa 1:4 razblaženjem humanog seruma (Sigma, #S-1764) i odgovarajućeg antitela. Svi reagensi i ćelije su razblaženi u RPMI1640 medijumu (Pan biotech GmbH) dopunjenom sa 10% FCS. Reakciona mešavina je inkubirana u trajanju od 2 časa pod standardizovanim uslovima na 37°C i 5% CO2 u humidifikovanom inkubatoru. Kao negativne kontrole služio je toplotom-inaktivirani komplement ili CD38-transfektanti bez antitela. Ćelije su obeležene sa PI i podvrgnute FACS-analizi.
[0097] Ukupno je izbrojano 5000 događaja i broj mrtvih ćelija na različitim koncentracijama antitela korišćen je za određivanje EC50 vrednosti. Sledeća jednačina daje aktivnost ubijanja [u %]:
 
sa EDC = događaji mrtvih ćelija (PI obojene ćelije), i
ELC = događaji živih ćelija (neobojeni)
 
[0098] Vrednosti citotoksičnosti od ukupno 12 različitih razblaženja antitela (1 :2n) u tri kopije su korišćene u ADCC i dve kopije u CDC za svako antitelo u cilju dobijanja EC-50 vrednosti sa standardnim softverom za analizu (PRISM®, Graph Pad Software).
 
 
PRIMER 3: Generisanje stabilnih CD38-transfektanata i CD38 Fc-fuzionih proteina
 
[0099] U cilju generisanja CD38 proteina za paning i skrining moraju biti ustanovljena dva različita ekspresiona sistema. Prva strategija je obuhvatala generisanje CD38-Fc-fuzionog proteina, koji je prečišćen iz supernatanata posle prolazne transfekcije HEK293 ćelija. Druga strategija je obuhvatala generisanje stabilne CHO-K1 –ćelijske linije za visoku površinsku ekspresiju CD38 za upotrebu za selekciju antitela-faga preko paninga cele ćelije.
[0100] Kao početni korak Jurkat ćelije (DSMZ ACC282) su korišćene za generisanje cDNK (Invitrogen) nakon čega sledi amplifikacija cele CD38-kodirajuće sekvence upotrebom prajmera komplementarnih sa prvih 7 i poslednjih 9 kodona CD38, respektivno (prajmer MTE001 & MTE002rev; Tabela 4). Analiza sekvenci CD38-inserta potvrdila je aminokiselinsku sekvencu koju su objavili Jackson et al. (1990) osim položaja 49 koji je otkrio glutamin umesto tirozina kao što su opisali Nata et al. (1997). Za uvođenje restrikcionih mesta endonukleaze i kloniranje u različite derivate ekspresionog vektora pcDNA3.1 (Stratagene), prečišćeni PCR-proizvod je služio kao obrazac za reamplifikaciju celog gena (prajmeri MTE006 & MTE007rev, Tabela 4) ili njegovog dela (prajmeri MTE004 & MTE009rev, Tabela 4). U poslednjem navedenom slučaju fragment koji kodira ekstracelularni domen (aa 45 do 300) je amplifikovan i kloniran u okviru između humane Vkapa lider sekvence i humane Fc-gama 1 sekvence. Ovaj vektor je služio kao ekspresioni vektor za generisanje rastvorljivog CD38-Fc fuzionog-proteina. Sledeći pcDNA3.1-derivat bez lider sekvence je korišćen za inserciju celog gena CD38. U ovom slučaju stop kodon ispred Fc-kodirajućeg regiona i nedostajuća lider-sekvenca je dala CD38-površinsku ekspresiju. HEK293 ćelije su prolazno transficirane sa vektorom Fc-fuzionog proteina za generisanje rastvorljivog CD38 Fc-fuzionog proteina i, u slučaju celog derivata, CHO-KL1-ćelije su transficirane za generisanje stabilne ćelijske linije koja eksprimira CD38.
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Tabela 4:
Prajmer #
Sekvenca (5’-> 3’)
MTE001
ATG GCC AAC TGC GAG TTC AGC (SEQ ID NO: 25)
MTE002rev
TCA GAT CTC AGA TGT GCA AGA TGA ATC (SEQ ID NO: 26)
MTE004
TT GGT ACC AGG TGG CGC CAG CAG TG (SEQ ID NO: 27)
MTE006
TT GGT ACC ATG GCC AAC TGC GAG (SEQ ID NO: 28)
MTE007rev
CCG ATA TCA* GAT CTC AGA TGT GCA AGA TG (SEQ ID NO: 29)
MTE009rev
CCG ATA TC GAT CTC AGA TGT GCA AGA TG (SEQ ID NO: 30)
* dovodi do stop kodona (TGA) u smislu orijentacije.
 
PRIMER 4: Kloniranje, ekspresija i prečišćavanje HuCAL® IgG1:
 
[0101] U cilju eksprimiranja celog IgG, fragmenti varijabilnog domena teških (VH) i lakih lanaca (VL) su subklonirani iz Fab ekspresionih vektora u odgovarajuće pMORPH®_hIg vektore (videti slike 8 do 10). Restrikcioni endonukleazni parovi BlpI/MfeI (insert-preparat) i BlpI/EcoRI (vektor-preparat) su korišćeni za subkloniranje fragmenta VH domena u pMORPH®_hIgG1. Enzimski parovi EcoRV/HpaI (lambda-insert) i EcoRV/BsiWI (kapa-insert) su korišćeni za subkloniranje fragmenta VL domena u odgovarajuće pMORPH®_hIgk_1 ili pMORPH®_h_Igλ_1 vektore. Rezultirajući IgG konstrukti su eksprimirani u HEK293 ćelijama (ATCC CRL-1573) prolaznom transfekcijom upotrebom standardne tehnike istovremene ko-precipitacije kalcijum fosfata -DNK. IgGs su prečišćeni iz supernatanata ćelijske kulture pomoću afinitetne hromatografije preko kolone Protein A sefaroza. Obrada dalje u nizu obuhvatala je pufersku izmenu pomoću gel filtracije i sterilne filtracije prečišćenog IgG. Kontrola kvaliteta je otkrila čistoću od >90 % smanjenjem SDS-PAGE i >90 % monomernog IgG kao što je određeno pomoću analitičke ekskluzione hromatografije. Sadržaj endotoksina u materijalu je određen pomoću kinetičkog testa na bazi LAL (Cambrex European Endotoxin Testing Service, Belgium).
 
 
 
 
PRIMER 5: Generisanje i proizvodnja himernog OKT10 (chOKT10; SEQ ID NOS: 23 i 24)
 
[0102] Za konstrukciju chOKT10 mišji VH i VL regioni su amplifikovani pomoću PCR-a upotrebom cDNK pripremljene od mišje OKT10 hibridoma ćelijske linije (ECACC #87021903). Grupa prajmera je korišćena kao što je objavljeno (Dattamajumdar et al., 1996; Zhou et al., 1994). PCR proizvodi su korišćeni za Topo-kloniranje (Invitrogen; pCRII-vektor) i pojedinačne kolonije su podvrgnute analizi sekvenci (M13 reverzni prajmer) koja je otkrila dve različite sekvence kapa lakog lanca i jednu sekvencu teškog lanca. Prema poravnanju sekvenci (EMBL baza podataka nukleotidnih sekvenci) i literaturi (Krebber et al, 1997) jedna od kapa-sekvenci pripada unutrašnjem repertoaru fuzionog partnera ćelije tumora X63Ag8.653 i stoga ne pripada OKT10 antitelu. Prema tome, samo nova kapa sekvenca i pojedinačan VH-fragment je korišćen za dalje kloniranje. Oba fragmenta su reamplifikovana za dodavanje restrikcionih mesta endonukleaze nakon čega sledi kloniranje u odgovarajuće pMORPH® IgG1-ekspresione vektore. Sekvence za težak lanac (SEQ ID NO: 23) i lak lanac (SEQ ID NO: 24) date su na Sl. 6. HEK293 ćelije su transficirane prolazno i supernatant je analiziran u FACS za himerno OKT10 antitelo koje se vezuje za Raji ćelijsku liniju koja prekomerno eksprimira CD38 (ATCC).
 
PRIMER 6: Mapiranje epitopa
 
1. Materijal i metode:
 
Antitela:
 
[0103] Sledeći anti-CD38 IgG su poslati za mapiranja epitopa:
 
 
 
 
 
 
 
MOR#
Serija#
Format
konc. [mg/ml]/zapr.[μl]
MOR03077
2CHE106_030602
humani IgG1
0.44/1500
MOR03079
2APO31
humani IgG1
0.38/500
MOR03080
030116_4CUE16
humani IgG1
2.28/200
MOR0100
030612_6SBA6
humani IgG1
0.39/500
him. OKT10*
030603_2CHE111
humani IgG1
0.83/500
* himerno OKT10 koje se sastoji od humanog Fc i mišjih varijabilnih regiona.
 
CD38-sekvenca:
 
[0104] Aminokiselinska (aa) sekvenca (položaj 44 - 300) je bazirana na humanom CD38 uzetim iz objavljene sekvence pod SWISS-PROT primarnim pristupnim brojem P28907. Na položaju 49 aa Q (umesto T) je korišćena za peptidni-dizajn.
 
PepSpot-analiza:
 
[0105] Antigeni peptidi su sintetisani na celuloznoj membrani na postepeni način rezultirajući u definisanom rasporedu (peptidni niz) i kovalentno su vezani za celuloznu membranu. Testovi vezivanja su izvedeni direktno na peptidnom nizu.
[0106] Uopšteno antigeni peptidni niz je inkubiran sa blokirajućim puferom u trajanju od nekoliko časova da bi se smanjilo ne-specifično vezivanje antitela. Izvodi se inkubacija sa primarnim antitelom (koje se vezuje za antigeni peptid) u blokirajućem puferu, nakon čega sledi inkubacija sa peroksidazom (POD)-obeleženim sekundarnim antitelom, koje se selektivno vezuje za primarno antitelo. Kratko ispiranje T (Tween)-TBS-puferom direktno posle inkubacije niza antigenog peptida sa drugim antitelom nakon čega sledi prvi hemiluminescentni eksperiment je napravljeno da bi se dobio prvi pregled koji se antigeni peptidi vezuju za primarno antitelo. Sledi nekoliko koraka ispiranja puferom (T-TBS- i TBS-pufer) da bi se smanjilo lažno pozitivno vezivanje (nespecifično vezivanje antitela za samu celuloznu membranu). Posle ovih koraka ispiranja izvedena je krajnja hemiluminescentna analiza. Podaci su analizirani sa imadžing sistemom koji pokazuje intenzitet signala (Boehringer Light units, BLU) kao pojedinačna merenja za svaki peptid. U cilju procene ne-specifičnog vezivanja sekundarnih antitela (anti-humani IgG), ova antitela su inkubirana sa peptidnim nizom u odsustvu primarnih antitela kao prvi korak. Ako primarno antitelo ne pokazuje nikakvo vezivanje za peptide ono može biti direktno obeleženo sa POD, koji povećava osetljivost sistema (kao što je izvedeno za MOR3077). U ovom slučaju izvedena je konvencionalna hemija kuplovanja preko slobodnih amino-grupa.
[0107] Antigen je skeniran sa 13-mernim peptidima (preklapanje od 11 aminokiselina). Ovo je rezultiralo u nizovima od 123 peptida. Testovi vezivanja su izvedeni direktno na nizu. Peptidom-vezana antitela MOR03077, MOR03079, MOR03080, MOR03100 i himerno OKT10 su detektovani upotrebom peroksidazom-obeleženog sekundarnog antitela (peroksifaza konjugat –kozje-anti-humano IgG, gama lanac specifično, afinitetno izolovano antitelo; Sigma-Aldrich, A6029). Mapiranja su izvedena sa hemiluminescentnim supstratom u kombinaciji sa imadžing sistemom. Pored toga, direktno POD-obeležavanje MOR03077 je izvedeno u cilju povećanja osetljivosti sistema.
 
2. Rezime i zaključci:
 
[0108] Svih pet antitela pokazalo je različite profile u PepSpot analizi. Šematski rezime je dat na Sl. 7, koji ilustruje različite aa sekvence CD38 koje su prepoznate. Epitop za MOR03079 i himerno OKT10 mogu se jasno smatrati linearnim. Epitop za MOR03079 može biti postuliran unutar aa 192 - 206 (VSRRFAEAACDVVHV) CD38, dok za himerno OKT10 pretežno je prepoznata sekvenca između aa 284 i 298 (FLQCVKNPEDSSCTS. Poslednji navedeni rezultati potvrđuju objavljene podatke za roditeljski mišji OKT10 (Hoshino et al., 1997), koji zahteva svoj epitop između aa 280-298. Ipak, za precizniju definiciju epitopa i određivanje ključnih aminokiselina (glavna mesta interakcije antigen-antitelo) trebalo bi da budu predviđeni skraćenje peptida VSRRFAEAACDVVHV i FLQCVKNPEDSSCTS i alanin-skeniranje oba.
[0109] Epitopi za MOR03080 i MOR03100 mogu se jasno smatrati diskontinuiranim s obzirom na to da je prepoznato nekoliko peptida koji pokrivaju različita proteinska mesta. Ti peptidi sadrže aa 82-94 i aa 158-170 za MOR03080 i aa 82-94, 142-154, 158-170, 188-200 i 280-296 za MOR03100. Međutim, izvesno preklapanje između oba epitopa može biti pretpostavljeno s obzirom na to da su dva različita mesta koja se nalaze unutar aa položaja 82-94 (CQSVWDAFKGAFI; peptid #20) i 158-170 (TWCGEFNTSKINY; peptid #58) prepoznata od strane oba antitela.
[0110] Epitop za MOR03077 može se smatrati jasno različitim od poslednja dva i može se opisati kao multisegmentirani diskontinuirani epitop. Epitop obuhvata aa 44-66, 110-122, 148-164, 186-200 i 202-224.
 
PRIMER 7: test oslobađanja IL-6/proliferacije
 
1. Materijal i metode:
 
[0111] Testovi proliferacije- i oslobađanja IL-6 izvedeni su prema Ausiello et al. (2000) sa sledećim modifikacijama: PBMC iz različitih zdravih davaoca (posle dobijanja informisanog pristanka) su prečišćene pomoću centrifugiranja prema gradijentu gustine upotrebom Histopaque sistema za odvajanje ćelija prema uputstvima dobavljača (Sigma) i kultivisane pod standardnim uslovima (5% CO2, 37°C) u RPMI1640 medijumu, dopunjenom sa 10% FCS i glutaminom ("kompletni RPMI1640"). Za oba testa korišćena su sledeća antitela: HuCAL® anti-CD38 IgG1s monoklonska antitela MOR03077, MOR03079, i MOR03080, agonističko mišje IgG2a monoklonsko antitelo (IB4; Malavasi et al., 1984), beznačajno HuCAL® IgG1 antitelo, sparena izotipska kontrola (mišji IgG2a: anti-trinitrofenol, hapten-specifično antitelo; kat.#: 555571, klon G155-178; Becton Dickinson) ili kontrola sa medijumom. Za test oslobađanja IL-6, 1.0 E+06 PBMC u 0.5 ml kompletnog RPMI1640 medijuma inkubirano je 24 časa u epruveti za kulturu od 15 ml (Falcon) u prisustvu 20 μg/ml antitela. Supernatanti ćelijske kulture su sakupljeni i analizirani za oslobađanje IL-6 upotrebom Quantikine kompleta prema protokolu proizvođača (R&D systems). Za test proliferacije 2.0E+05 PBMCs je inkubirano u trajanju od 3 dana u 96-komornoj ploči sa ravnim dnom (Nunc) u prisustvu 20 μg/ml antitela. Svaki test je izveden u dve kopije. Posle 4 dana BrdU je dodat u svaku komoricu i ćelije su inkubirane dodatnih 24 časa na 37°C pre fiksacije ćelija i denaturacije DNK prema protokolu nabavljača (Roche). Ugradnja BrdU je merena preko anti-BrdU peroksidazom-spojenog antitela u postavci na bazi hemiluminescencije.
 
2. Rezime i zaključci:
 
Test proliferacije:
 
[0112] Pored njegovih katalitičkih aktivnosti kao ciklični ADP-riboza ciklaza i hidrolaza, CD38 ispoljava sposobnost da prenosi signale biološkog značaja (Hoshino et al., 1997; Ausiello et al., 2000). Te funkcije bi mogle biti indukovane in vivo pomoću npr. receptor-ligand interakcija ili pomoću unakrsnog vezivanja sa anti-CD38 antitelima. Ti događaji prenosa signala dovode npr. do mobilizacije kalcijuma, proliferacije limfocita i oslobađanja citokina. Međutim, ovo prenošenje signala nije samo zavisno od antigenog epitopa, već bi takođe moglo da varira od davaoca do davaoca (Ausiello et al., 2000). U pogledu imunoterapije ne-agonistička antitela su poželjna u odnosu na agonistička antitela. Prema tome, HuCAL® anti-CD38 antitela (monoklonska antitela MOR03077; MOR03079, MOR03080) su dalje okarakterisana u testu proliferacije i testu oslobađanja IL-6 (važan MM faktor rasta) u poređenju sa referentnim antitelom chOKT10 i agonističkim anti-CD38 monoklonskim antitelom IB4.
[0113] Kao što je pokazano na Sl. 11 i Sl.. 12 HuCAL anti-CD38 antitela Mab#1, 2 i 3 kao i referentno antitelo chOKT10 i odgovarajuće negativne kontrole pokazali su da nema ili samo slabu indukciju proliferacije i da nema oslobađanja IL-6 u poređenju sa agonističkim antitelom IB4.
 
PRIMER 8: Klonogeni test
 
1. Materijal i metode:
 
[0114] PBMC koje sadrže autologne CD34+/CD38+ prekursorske ćelije su izolovane iz zdravih individua (posle dobijanja informisanog pristanka) pomoću centrifugiranja prema gradijentu gustine upotrebom Histopaque sistema za odvajanje ćelija prema uputstvima dobavljača (Sigma) i inkubirane sa različitim HuCAL® IgG1anti-CD38 antitelima (monoklonska antitela MOR03077, MOR03079, i MOR03080) i pozitivnom kontrolom (PC) chOKT10 na 10 μg/ml. Medijum i irelevantan HuCAL® IgG1 služili su kao kontrola pozadine. Svaki ADCC-test se sastojao od 4.0E+05 PBMCs koje su inkubirane u trajanju od 4 časa na 37°C u RPMI1640 medijumu dopunjenim sa 10% FCS. Za klonogeni test 2.50 ml "kompletne" metilceluloze (CellSystems) je inokulisano sa 2.5 E+05 ćelija iz ADCC-testa i inkubirano za razvoj kolonije najmanje 14 dana u kontrolisanoj sredini (37°C; 5% CO2). Kolonije su analizirane od strane dva nezavisna operatora i grupisane u BFU-E + CFU-GEMM (rani prethodnici eritropoeze „erythroid burst forming units“ i matične ćelije granulocita/ eritroidne/ makrofaga/ megakariocita) i CFU-GM (matične ćelije granulocita / makrofaga).
 
2. Rezime i zaključci:
 
[0115] S obzirom na to da se ekspresija CD38 ne nalazi samo na imunim ćelijama unutar mijeloida (npr. monocita, granulocita) i limfoidne linije (npr. aktivirane B i T-ćelije; plazma ćelije), već takođe na odgovarajućim prekursorskim ćelijama (CD34+/CD38+), važno je da te ćelije nisu pogođene antitelom-posredovanim ubijanjem. Prema tome, klonogeni test je primenjen u cilju analize tih efekata na CD34+/CD38+ progenitorima.
[0116] PBMCs iz zdravih davaoca su inkubirane sa HuCAL® anti-CD38 antitelima (Mab#1, Mab#2 i Mab#3) ili nekoliko kontrola (beznačajno HuCAL® antitelo, medijum i referentno antitelo chOKT10 kao pozitvna kontrola) prema standardnom ADCC-protokolu nakon koga sledi dalja inkubacija u kondicioniranoj metilcelulozi za razvoj kolonija. Kao što je prikazano na Sl. 13 nikakva značajna redukcija jedinica koje fomiraju kolonije nije prikazana za sva HuCAL® anti-CD38 antitela u poređenju sa beznačajanim antitelom ili referentnim antitelom.
 
PRIMER 9: ADCC testovi sa različitim ćelijskim linijama i primarnim ćelijama multiplog mijeloma
 
1. Materijal i metode:
 
[0117] Izolacija i ADCC uzoraka MM-pacijenta: Aspirati koštane srži su dobijeni od pacijenata sa multiplim mijelomom (posle dobijanja informisanog pristanka). Maligne ćelije su prečišćene preko standardnog protokola upotrebom anti-CD138 magnetnih kuglica (Milteny Biotec) posle centrifugiranja prema gradijentu gustine (Sigma). ADCC-test je izveden kao što je opisan pre.
 
2. Rezime i zaključci:
 
[0118] Nekoliko ćelijskih linija poreklom od različitih maligniteta je korišćeno u ADCC da bi se pokazao citotoksični efekat HuCAL® anti-CD38 antitela na širi spektar ćelijskih linija uključujući različita porekla i nivoe ekspresije CD38. Kao što je prikazano na Slici 14, sve ćelije su ubijene u ADCC na konstantnim koncentracijama antitela (5 μg/ml) i E:T odnosima na 30:1. Citotoksičnost preko ADCC je takođe pokazana za nekoliko uzoraka multiplog mijeloma od pacijenata. Sva HuCAL® anti-CD38 antitela su bila sposobna da izvedu ubijanje MM ćelija zavisno od doze i EC50-vrednosti su varirale između 0.006 i 0.249 nM (Slika 15).
 
PRIMER 10: Analiza unakrsne-reaktivnosti pomoću FACS i imunohisto-hemije (IHC)
 
1. Materijal i metode:
 
[0119] IHC sa krajnicima: Za IHC HuCAL® anti-CD38 monoklonska antitela i beznačajna negativna kontrolna antitela su prevedena u bivalentni dHLX-format (Plückthun & Pack, 1997). 5 μm krio-isečci iz limfnih čvorova poreklom iz makaki majmuna, rezus majmuna i ljudi (dobijeni iz arhiva Instituta za patologiju Univerziteta u Gracu/Austrija) isečeni su sa Leica CM3050 kriostatom. Isečci su sušeni na vazduhu u trajanju od 30 minuta do 1 časa i fiksirani u ledeno hladnom etanolu u trajanju od 10 minuta ispirani sa PBS. Za detekciju dHLX-formata korišćeno je mišje anti-His antitelo (Dianova) u kombinaciji sa Envision kompletom (DAKO). Za detekciju anti-CD38 mišjih antitela (npr. referentno mišje monoklonsko OKT10) korišćen je samo Envison komplet.
[0120] FACS-analiza limfocita: EDTA-tretirani uzorci krvi su dobijeni od zdravih ljudi (posle dobijanja informisanog pristanka), od rezus i makaki majmuna i podvrgnuti centrifugiranjuu prema gradijentu gustine upotrebom Histopaque sistema za odvajanje ćelija prema uputstvima proizvođača (Sigma). Za FACS-analizu ćelije iz interfaze su inkubirane sa primarnim antitelima (HuCAL® anti-CD38 i negativna kontrolna monoklonska antitela kao mišji IgG2a ili Fab-format, pozitivno kontrolno mišje antitelo OKT10 i sparena izotipska kontrola) nakon čega sledi inkubacija sa anti-M2 Flag (Sigma; samo Fab-format) i fikoeritrinom (PE)-obeleženim anti-mišjim konjugatom (Jackson Research). FACS analiza je izvedena na kontrolisanoj populaciji limfocita.
 
2. Rezime i zaključci:
 
[0121] HuCAL® anti-CD38 su analizirana za inter-species CD38 unakrsnu-reaktivnost. Dok su sva anti-CD38 monoklonska antitela bila sposobna da detektuju humani CD38 na limfocitima u FACS i IHC, samo MOR03080 zajedno sa pozitivnom kontrolom OKT10 je pokazao dodatnu reaktivnost sa CD38 makaki i rezus majmuna (videti Tabelu 5: analiza unakrsne-reaktivnosti).
Tabela 5:
 
Limfociti (FACS) i limfni čvorovi (IHC) od:
Antitelo
Čoveka
Makaki majmuna
Rezus majmuna
Mab#1
++
-
-
Mab#2
++
-
-
Mab#3
++
++
++
PC
++
++
++
NC
-
-
-
++: snažno pozitivno bojenje; -: bez bojenja; NC: negativna kontrola; PC: pozitivna kontrola (=referentno cMAb)
 
PRIMER 11: Tretman ksenograftova humanog mijeloma kod miševa (upotrebom RPMI8226 ćelijske linije) sa MOR03080
 
1. Uspostavljanje subkutanog mišjeg modela:
 
[0122] Subkutani mišji model za tumorsku ćelijsku liniju RPMI8226 poreklom od humanog mijeloma u ženkama C.B-17-SCID miševa je ustanovljen na sledeći način od strane Aurigon Life Science GmbH (Tutzing, Germany): na dan -1, 0 i 1, anti-asialo GM1 poliklonska antitela (ASGM) (WAKO-Chemicals), koja depletiraju ksenoreaktivne NK-ćelije u SCID miševima su primenjena intravenski u cilju deaktiviranja bilo koje rezidualne specifične imune reaktivnosti u C.B-17-SCID miševima. Na dan 0, ili je 5x106 ili 1x107 RPMI8226 tumorskih ćelija u 50 μl PBS inokulisano istovremeno u desni kuk miševa tretiranih sa ASGM (kao što je opisano u prethodnom tekstu) ili netretiranih (svaka grupa se sastoji od pet miševa). Razvoj tumora je bio sličan u sve 4 inokulisane grupe bez nađene značajne razlike za tretman sa ili bez anti-asialo GM1 antitela ili inokulacijom različitih ćelijskih brojeva. Izgleda da tumori sporo rastu sa tendencijom stagnacije ili oscilacije u veličini tokom nekih dana. Dva tumora su oscilirala u veličini u toku celog perioda ispitivanja, i jedan tumor se čak smatra da je potpuno nestao od maksimalne zapremine od 321 mm3. Strudija tretmana sa ovim modelom tumora bi trebalo da obuhvata visok broj tumorom-inokulisanih životinja po grupi.
 
2. Tretman sa MOR03080:
 
2.1 Cilj studije
 
[0123] Ova studija je izvedena od strane Aurigon Life Science GmbH (Tutzing, Germany) da bi se poredila anti-tumorska efikasnost intraperitonealno primenjenih antitela (HuCAL® anti-CD38) u poređenju sa tretmanom nosačem (PBS). Humano antitelo hMOR03080 (izotip IgG1) je testirano u različitim količinama i režimima tretmana. Pored toga, himerno antitelo chMOR03080 (izotip IgG2a: testirano je himerno antitelo koje sadrži varijabilne regione MOR03080 i mišje konstantne regione konstruisane na sličan način kao što je opisano u Primeru 5 za himerno OKT10 (mišji VH/VL i humani konstantni regioni)). RPMI8226 ćelijska linija kancera je izabrana kao model i inokulisana je subkutano u ženke SCID miševa kao što je opisano u prethodnom tekstu. Krajnje tačke u studiji su bile telesna težina (b.w.), zapremina tumora i klinički znaci.
 
2.2 Antitela i nosač
 
[0124] Obezbeđena su antitela spremna za upotrebu za Aurigon u koncentracijama od 2.13 mg/ml (MOR03080 hIgG1) i 1.73 mg/ml (MOR03080 chIgG2a, i čuvana na -80°C do primene. Antitela su otopljena i razblažena sa PBS do odgovarajuće krajnje koncentracije. Obezbeđen je nosač (PBS) spreman za upotrebu za Aurigon i čuvan na 4°C do primene.
 
2.3 Specifikacija životinja
[0125]
Vrsta: miš
Soj: Fox chase C.B-17-scid (C.B-Igh-1b/IcrTac)
Broj i pol: 75 ženki
Dobavljač: Taconic M&B, Bomholtvej 10, DK-8680 Ry
Zdravstveni status: SPF
Naručena težina: približno 18 g
Aklimatizacija: 9 dana
 
2.4 Tumorska ćelijska linija
 
[0126] Tumorske ćelije (RPMI8226 ćelijska linija) su uzgajane i prebačene u Aurigon Life Science GmbH, gde su ćelije razdvojene i uzgajane još jedan ciklus. Aurigon je pripremio ćelije za injekciju na dan inokulacije. Medijum za kulturu korišćen za ćelijsko razmnožavanje bio je RPMI 1640 dopunjen sa 5% FCS, 2 mM L-Glutamin i PenStrep. Ćelije nisu pokazale neočekivanu stopu rasta ili ponašanje.
[0127] Za inokulaciju, tumorske ćelije su suspendovane u PBS i podešene do krajnje koncentracije od 1x107 ćelija/ 50 μl u PBS. Suspenzija tumorskih ćelija je mešana temeljno pre injektiranja.
 
2.5 Eksperimentalni postupak
 
[0128] Na dan 0, 1x107 RPMI8226 tumorskih ćelija je inokulisano subkutano u desni kuk, dorzalno, 75 SCID miševa. Prva grupa je napravljena sa 15 slučajno izabranih životinja (grupa 5) direktno posle inokulacije. Ova grupa je tretirana sa 1 mg/kg b.w. hIgG1-MOR03080 svaki drugi dan između dana 14 i 36. Od svih drugih 60 životinja napravljeno je 4 grupe sa deset životinja u svakoj grupi na dan 31 (zapremina tumora od oko 92 mm3). Grupe 1-4 su napravljene sa sličnim srednjim vrednostima zapremine tumora i srandardnim devijacijama. Dodatna grupa od 5 životinja (grupa 6) je izabrana koja pokazuje relativno male zapremine tumora (zapremina tumora od oko 50 mm3) za poređenje sa pre-tretiranom grupom 5 (svi osim tri miša su pokazali zapremine tumora od manje od 10 mm3, jedan sa oko 22 mm3, jedan sa oko 44 mm3 i jedan sa oko 119 mm3). Grupe 1 do 4 su tretirane svaki drugi dan od dana 32 do dana 68 sa ili PBS (nosač; grupa 1), 1 mg/kg b.w. hIgG1-MOR03080 (grupa 2) ili 5 mg/kg b.w.hIgG1-MOR03080 (grupa 3), ili sa 5 mg/kg b.w. chIgG2a-MOR03080 (grupa 4). Grupa 6 nije primila nikakav tretman (videti Tabelu 6). Zapremine tumora, telesna težina i klinički znaci su mereni dva puta nedeljno do kraja studije.
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Tabela 6:
Grupa
br. životinja
Tip primene
Supstanca
Režim
Doza tretmana [mg/kg]
Zapremina primene [μl/kg]
1
10
i.p.
nosač (PBS)
Svaki drugi dan između dana 32 i dana 68
--
10
2
10
i.p.
MOR03080 humano
Svaki drugi dan između dana 32 i dana 68
1
10
3
10
i.p.
MOR03080 humano IgG
Svaki drugi dan između dana 32 i dana 68
5
10
4
10
i.p.
MOR03080
himerno
IgG2a
Svaki drugi dan između dana 32 i dana 68
5
10
5
15
i.p.
MOR03080 humano IgG1
Svaki drugi dan između dana 14 i dana 36
1
10
6
5
--
--
--
--
--
 
2.6 Rezultati
 
Klinička zapažanja i mortalitet
 
[0129] Nisu zabeleženi nikakvi specifični klinički nalazi ili mortalitet vezani za tumor ili supstancu. U grupi 3 (hIgG1 5 mg/kg) četiri životinje su uginule u toku uzimanja uzorka krvi (jedna na dan 3, jedna na dan 34; dve na dan 52). U grupi 4 (muIgG2a 1 mg/kg) jedna životinja je uginula u toku uzimanja uzorka krvi (dan 34). Sve druge životinje, koje su uginule u toku studije su eutanazirane zbog veličine tumora.
 
Razvoj telesne težine
 
[0130] Nije zabeležen uticaj leka na razvoj težine u poređenju sa grupom 1 (nosač). Na telesnu težinu primetno je uticalo uzimanje uzorka krvi u grupama 3 (hIgG1 5 mg/kg) i 4 (muIgG2a 5 mg/kg). Uprkos takvim prekidima srednji dobitak na telesnoj težini svih grupa je bio kontinuiran.
 
Razvoj tumora (videti Sliku 16)
 
[0131] U grupi 1 (nosač) rast tumora je nađen u očekivanoj stopi sa sporim napredovanjem. Kako ova ćelijska linija ima izražene vrednosti standardne devijacije za najveći i najmanji tumor ona je isključena iz dalje statističke analize. Rast tumora životinja u grupi 1 je sličan sa rastom tumora u grupi 6 (netretirana), iako je ova grupa počela sa nižom srednjom zapreminom tumora na dan 31. Tretman bi mogao prema tome da ima mali uticaj na stopu rasta tumora. U grupi 1, dva miša su morala biti eutanazirana pre dana 83 zbog veličine tumora, i još jedan pre dana 87, tako da srednja vrednost zapremine tumora nije više reprezentativna posle dana 80. U grupi 6, jedan miš je morao biti eutanaziran pre dana 80 zbog veličine tumora, dva miša pre dana 83, i još jedan pre dana 87, tako da srednja vrednost zapremine tumora nije više reprezentativna posle dana 76.
[0132] U grupi 2, tretiranoj sa 1 mg/kg b.w. hIgG1, jedna životinja je isključena iz dalje analize, zbog toga što je tumor rastao u mišićno tkivo i ovo obično povećava brzinu rasta tumora. U poređenju sa kontrolnom grupom 1 (nosač) srednja veličina tumora je počela da se značajno razlikuje počevši sa danom 45 do kraja studije. Posle kraja tretmana (dan 68) nije zabeležen povećani rast tumora.
[0133] Životinje iz grupe 3 (5 mg/kg b.w. hIgG1) otkrile su izraženo smanjenje u rastu tumora u poređenju sa grupom 1 (nosač), koje postaje statistički značajno sa danom 38 do dana 83. Srednja vrednost zapremine tumora počela je snažno da izrasta oko dve nedelje posle kraja tretmana. Jedan od ukupno deset tumora nestao je na dan 45 i nije izrastao do 19 dana posle kraja tretmana.
[0134] Najbolji učinak svih grupa za tretman počevši sa zapreminom tumora od 92 mm3 nađen je u grupi 4 (5 mg/kg b.w. muIgG2a), gde je srenja vrednost zapremine tumora pokazala jasnu regresiju i tumori su čak nestali kod 4 životinje do kraja perioda obzervacije. Razlika prema srednjoj vrednosti zapremine tumora grupe 1 (nosač) bila je visoko značajna počevši od dana 38 do kraja studije.
[0135] Rani tretman sa 1 mg/kg b.w. hIgG1 između dana 14 i 36 (grupa 5) otkrio je rani kao i dugotrajan efekat na razvoj tumora. Jedna životinja je isključena iz dalje analize jer je tumor prerastao u mišićno tkivo. Na dan 31, samo pet životinja je imalo merljivi tumor na mestu inokulacije, u poređenju sa ostatkom inokulisanih životinja, gde samo 2 od ukupno 60 nije imalo odgovor na inokulaciju tumora. Napredovanje tumora je odloženo od oko 31 dana (poređenje dana 52 kontrolne grupe 1 sa danom 83 grupe 5). Oko 50% životinja nije pokazalo tumore na mestu inokulacije na kraju studije.
 
 
2.7 Zaključak
 
[0136] Nisu zabeleženi klinički nalazi ili mortalitet povezani sa tumorom ili supstancom u poređenju sa grupom 1 (kontrola).
[0137] Nije zabeležen uticaj leka na razvoj težine.
[0138] Rast tumora RPMI8226 tumorskih ćelija posle tretmana je smanjen u cilju efikasnosti: hIgG1 mg/kg, 14-36 dana svaki drugi dan (grupa 5) > muIgG2a 5 mg/kg 32-68 dana svaki drugi dan (grupa 4) > hIgG1 5 mg/kg 32-68 dana svaki drugi dan (grupa 3) > hIgG1 mg/kg 32-68 dana svaki drugi dan (grupa 2). U grupama 2 do 4, srednje vrednosti zapremine tumora su ponovo povećane posle kraja tretmana u različitoj meri.
 
Reference:
[0139]
Ausiello C.M., Urbani F., Lande R., 1a Sala A., Di Carlo B., Baj G., Surico N., Hilgers J., Deaglio S., Funaro A., Malavasi F. (2000) Functional topography of discrete domains of human CD38. Tissue Antigens. 2000 Dec;56(6):539-47.
 
Chamow, S.M., Zhang, D.Z., Tan, X.Y, Mathre, S.M., Marsters, S.A., Peers, D.H., Byrn, RA., Ashknazi, A., Junghans, R.P (1994). humanized, bispecific immunoadhesin-antibody that retargets CD3+ effectors to kill HIV-1-infected cells. J Immunol. 1994 Nov 1;153(9):4268-80
 
Dattamajumdar, A.K., Jacobsen, D.P., Hood, L.E., Osman, G.E. (1996). Rapid cloning of rearranged mouse immunoglobulin variable genes. Immunogentetics 43, 141-151
 
Funaro, A., Spagnoli, G.C., Ausiello, C.M., Alessio, M., Roggero, S., Delia, D., Zaccolo, M., and Malavasi, F. (1990) Involvement of the multilineage CD38 molecule in a unique pathway of cell activation and proliferation. J. Immunol. 145, 2390-2396.
 
Hoshino S., Kukimoto I., Kontani K., Inoue S., Kanda Y., Malavasi F., Katada T. (1997) Mapping of the catalytic and epitopic sites of human CD38/NAD+ glycohydrolase to a functional domain in the carboxyl terminus. J Immunol. 158(2):741-7.
 
Jackson D.G., Bell J.I. (1990) Isolation of a cDNA encoding the human CD38 (T10) molecule, a cell surface glycoprotein with an unusual discontinuous pattern of expression during lymphocyte differentiation. J Immunol. 144(7):2811-5.
 
Knappik,A., Ge,L., Honegger,A., Pack,P., Fischer,M., Wellnhofer,G., Hoess,A., Wolle,J., Pluckthun,A., and Virnekas,B. (2000). Fully synthetic human combinatorial antibody libraries (HuCAL) based on modular consensus frameworks and CDRs randomized with trinucleotides. J Mol Biol 296, 57-86.
 
Konopleva M., Estrov Z., Zhao S., Andreeff M., Mehta K. (1998) Ligation of cell surface CD38 protein with agonistic monoclonal antibody induces a cell growth signal in myeloid leukemia cells. J Immunol. 161(9):4702-8.
 
Krebber, A., Bornhauser, S., Burmester, J., Honegger, A., Willuda, J., Bossard, H.R., Plückthun, A. (1997). Reliable cloning of functional antibody variable domains from hybridomas and spleen cell repertoires employing a reengineered phage display system. J. Imm. Meth. 201, 35-55.
 
Krebs,B., Rauchenberger,R., Reiffert,S., Rothe,C., Tesar,M., Thomassen,E., Cao,M., Dreier,T., Fischer,D., Hoss,A., Inge,L., Knappik,A., Marget,M., Pack,P., Meng,X.Q., Schier,R., Sohlemann,P., Winter,J., Wolle,J., and Kretzschmar,T. (2001). High-throughput generation and engineering of recombinant human antibodies. J Immunol Methods 254, 67-84.
 
Löhning, C. (2001). Novel methods for displaying (poly)peptides/proteins on bacteriophage particles via disulfide bonds. WO 01/05950.
 
Malavasi, F., Caligaris-Cappio, F., Milanese, C., Dellabona, P., Richiardi, P., Carbonara, A. O. (1984). Characterization of a murine monoclonal antibody specific for human early lymphohemopoietic cells. Hum. Immunol. 9: 9-20
 
Namba, M., Otsuki, T., Mori, M., Togawa, A., Wada, H., Sugihara, T., Yawata, Y., Kimoto, T. (1989). Establishment of five human myeloma cell lines. In Vitro Cell Dev. Biol. 25: 723.
 
Nata K., Takamura T., Karasawa T., Kumagai T., Hashioka W., Tohgo A., Yonekura H., Takasawa S., Nakamura S., Okamoto H. (1997). Human gene encoding CD38 (ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase): organization, nucleotide sequence and alternative splicing. Gene 186(2):285-92.
 
Naundorf, S., Preithner, S., Mayer, P., Lippold, S., Wolf, A., Hanakam, F., Fichtner, I., Kufer, P., Raum, T., Riethmüller, G., Baeuerle, P.A., Dreier, T. (2002). Int. J. Cancer 100, 101-110.
 
Plückthun A, and Pack P. (1997) New protein engineering approaches to multivalent and bispecific antibody fragments. Immunotechnology 3(2):83-105.
 
Rauchenberger R., Borges E., Thomassen-Wolf E., Rom E., Adar R., Yaniv Y., Malka M., Chumakov L, Kotzer S., Resnitzky D., Knappik A., Reiffert S., Prassler J., Jury K., Waldherr D., Bauer S., Kretzschmar T., Yayon A., Rothe C. (2003). Human combinatorial Fab library yielding specific and functional antibodies against the human fibroblast growth factor receptor 3. J Biol Chem. 278(40):38194-205.
 
Zhou, H., Fisher, R.J., Papas, T.S. (1994). Optimization of primer sequences for mouse scFv repertoire display library construction. Nucleic Acids Res. 22: 888-889.
 
[0140] Predstavljeni pronalazak se takođe odnosi na sledeće stavke:
 
1. Izolovano humano ili humanizovano antitelo ili njegov funkcionalni fragment koje/koji sadrži antigen-vezujući region koji je specifičan za epitop CD38 (SEQ ID NO: 22), pri čemu je antitelo ili njegov funkcionalan fragment sposobno/sposoban da posreduje ubijanje CD38+ ciljne ćelije pomoću ADCC sa najmanje pet puta boljom efikasnošću od himernog OKT10 (SEQ ID NOS: 23 i 24) pod istim ili značajno istim uslovima kada se humana PBMC ćelija koristi kao efektorna ćelija, pri čemu je navedena CD38+ ciljna ćelija izabrana iz grupe koju čine LP-1 (DSMZ: ACC41) i RPMI-8226 (ATCC: CCL-155), i pri čemu je odnos efektornih ćelija prema ciljnim ćelijama između oko 30:1 i oko 50:1.
 
2. Izolovani antigen-vezujući region antitela ili njegovog funkcionalnog fragmenta prema stavki 1.
 
3. Izolovani antigen-vezujući region prema stavki 2, koji sadrži H-CDR3 region prikazan u SEQ ID NO: 5, 6, 7 ili 8.
 
4. Izolovani antigen-vezujući region prema stavki 3, koji dalje sadrži H-CDR2 region prikazan u SEQ ID NO: 5, 6, 7 ili 8.
 
5. Izolovani antigen-vezujući region prema stavki 4, koji dalje sadrži H-CDR1 region prikazan u SEQ ID NO: 5, 6, 7 ili 8.
 
6. Izolovani antigen-vezujući region prema stavki 5, koji sadrži varijabilni trežak lanac prikazan u SEQ ID NO: 5, 6, 7 ili 8.
 
7. Izolovan antigen-vezujući region prema stavki 2, koji sadrži L-CDR3 region prikazan u SEQ ID NO: 13, 14, 15 ili 16.
 
8. Izolovani antigen-vezujući region prema stavki 7, koji dalje sadrži L-CDR1 region prikazan u SEQ ID NO: 13, 14, 15 ili 16.
 
9. Izolovani antigen-vezujući region prema stavki 8, koji dalje sadrži L-CDR2 region prikazan u SEQ ID NO: 13, 14, 15 ili 16.
 
10. Izolovani antigen-vezujući region prema stavki 9, koji sadrži varijabilni laki lanac prikazan u SEQ ID NO: 13, 14, 15 ili 16.
 
11. Izolovani antigen-vezujući region prema stavki 2, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu teškog lanca izabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO: 5, 6, 7 ili 8; i (ii) sekvenca koja ima najmanje 60 procenata identičnosti sekvenci u CDR regionima sa CDR regionima prikazanim u SEQ ID NO: 5, 6, 7 ili 8.
 
12. Izolovani antigen-vezujući region prema stavki 2, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu lakog lanca izabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO: 13, 14, 15 ili 16; i (ii) sekvenca koja ima najmanje 60 procenata identičnosti sekvenci u CDR regionima sa CDR regionima prikazanim u SEQ ID NO: 13, 14, 15 ili 16.
 
13. Izolovano antitelo prema stavki 1, koje je IgG.
 
14. Izolovano antitelo prema stavki 13, koje je IgG1.
 
15. Izolovano humano ili humanizovano antitelo ili njegov funkcionalni fragment, koje sadrži antigen-vezujući region koji je specifičan za epitop CD38 (SEQ ID NO: 22), pri čemu je navedeno antitelo ili njegov funkcionalni fragment sposobno/sposoban da posreduje ubijanje CD38-transficirane CHO ćelije pomoću CDC sa najmanje dva puta većom efikasnošću od himernog OKT10 (SEQ ID NOS: 23 i 24) pod istim ili značajno istim uslovima.
 
16. Izolovani antigen-vezujući region antitela ili njegovog funkcionalnog fragmenta prema stavki 15.
 
17. Izolovani antigen-vezujući region prema stavki 16, koji sadrži H-CDR3 region prikazan u SEQ ID NO: 5, 6 ili 7.
 
18. Izolovani antigen-vezujući region prema stavki 17, koji dalje sadrži H-CDR2 region prikazan u SEQ ID NO: 5, 6 ili 7.
 
19. Izolovani antigen-vezujući region prema stavki 18, koji dalje sadrži H-CDR1 region prikazan u SEQ ID NO: 5, 6 ili 7.
 
20. Izolovani antigen-vezujući region prema stavki 19, koji sadrži varijabilni težak lanac prikazan u SEQ ID NO: 5, 6 ili 7.
 
21. Izolovani antigen-vezujući region prema stavki 16, koji sadrži L-CDR3 region prikazan u SEQ ID NO: 13, 14 ili 15.
 
22. Izolovani antigen-vezujući region prema stavki 21, koji dalje sadrži L-CDR1 region prikazan u SEQ ID NO: 13, 14 ili 15.
 
23. Izolovani antigen-vezujući region prema stavki 22, koji dalje sadrži L-CDR2 region prikazan u SEQ ID NO: 13, 14 ili 15.
 
24. Izolovani antigen-vezujući region prema stavki 23, koji sadrži varijabilni laki lanac prikazan u SEQ ID NO: 13, 14 ili 15.
 
25. Izolovani antigen-vezujući region prema stavki 16, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu teškog lanca izabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO: 5, 6 ili 7; i (ii) sekvenca koja ima najmanje 60 procenata identičnosti sekvenci u CDR regionima sa CDR regionima prikazanim u SEQ ID NO: 5, 6 ili 7.
 
26. Izolovani antigen-vezujući region prema stavki 16, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu lakog lanca izabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO: 13, 14 ili 15; i (ii) sekvenca koja ima najmanje 60 procenata identičnost sekvenci u CDR regionima sa CDR regionima prikazanim u SEQ ID NO: 13, 14 ili 15.
 
27. Izolovano antitelo prema stavki 15, koje je IgG.
 
28. Izolovano antitelo prema stavki 27, koje je IgG1.
 
29. Izolovano humano ili humanizovano antitelo ili njegov funkcionalni fragment koje sadrži/koji sadrži antigen-vezujući region koji je specifičan za epitop CD38, pri čemu epitop sadrži jedan ili više aminokiselinskih ostataka od aminokiselinskih ostataka 1 do 215 CD38 (SEQ ID NO: 22).
 
30. Izolovano antitelo ili njegov funkcionalni fragment prema stavki 29, pri čemu epitop sadrži jedan ili više aminokiselinskih ostataka sadržanih u jednom ili više aminokiselinskih nizova uzetih sa spiska aminokiselinskih nizova 44-66, 82-94, 142-154, 148-164, 158-170, i 192-206 CD38.
 
31. Izolovano antitelo ili njegov funkcionalni fragment prema stavki 29, pri čemu je navedeni epitop linearni epitop.
 
32. Izolovano antitelo ili njegov funkcionalni fragment prema stavki 31, pri čemu navedeni antigen-vezujući region sadrži H-CDR3 region prikazan u SEQ ID NO: 6.
 
33. Izolovano antitelo ili njegov funkcionalni fragment prema stavki 32, pri čemu navedeni antigen-vezujući region sadrži H-CDR2 region prikazan u SEQ ID NO: 6.
 
34. Izolovano antitelo ili njegov funkcionalni fragment prema stavki 33, pri čemu navedeni antigen-vezujući region sadrži H-CDR1 region prikazan u SEQ ID NO: 6.
 
35. Izolovano antitelo ili njegov funkcionalni fragment prema stavki 31, koje/koji sadrži varijabilni težak lanac prikazan u SEQ ID NO: 6.
 
36. Izolovano antitelo ili njegov funkcionalni fragment prema stavki 31, pri čemu navedeni antigen-vezujući region sadrži L-CDR3 region prikazan u SEQ ID NO: 14.
 
37. Izolovano antitelo ili njegov funkcionalni fragment prema stavki 36, pri čemu navedeni antigen-vezujući region dalje sadrži L-CDR1 region prikazan u SEQ ID NO: 14.
 
38. Izolovano antitelo ili njegov funkcionalni fragment prema stavki 37, pri čemu navedeni antigen-vezujući region dalje sadrži L-CDR2 region prikazan u SEQ ID NO: 14.
 
39. Izolovano antitelo ili njegov funkcionalni fragment prema stavki 31, koje/koji sadrži varijabilni laki lanac prikazan u SEQ ID NO: 14.
 
40. Izolovano antitelo ili njegov funkcionalni fragment prema stavki 31, koje/koji sadrži aminokiselinsku sekvencu teškog lanca izabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO: 6; i (ii) sekvenca koja ima najmanje 60 procenata identičnosti sekvenci u CDR regionima sa CDR regionima prikazanim u SEQ ID NO: 6.
 
41. Izolovano antitelo ili njegov funkcionalni fragment prema stavki 31, koje/koji sadrži aminokiselinsku sekvencu lakog lanca izabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO: 14; i (ii) sekvenca koja ima najmanje 60 procenata identičnosti sekvenci u CDR regionima sa CDR regionima prikazanim u SEQ ID NO: 14.
 
42. Izolovani funkcionalni fragment prema stavki 31, koji je Fab ili scFv fragment antitela.
 
43. Izolovano antitelo prema stavki 31, koje je IgG.
 
44. Izolovano antitelo prema stavki 43, koje je IgG1.
 
45. Izolovano antitelo ili njegov funkcionalni fragment prema stavki 29, pri čemu je navedeni epitop konformacioni epitop.
 
46. Izolovano antitelo ili njegov funkcionalni fragment prema stavki 45, pri čemu navedeni antigen-vezujući region sadrži H-CDR3 region prikazan u SEQ ID NO: 5, 7, ili 8.
 
47. Izolovano antitelo ili njegov funkcionalni fragment prema stavki 46, pri čemu navedeni antigen-vezujući region dalje sadrži H-CDR2 region prikazan u SEQ ID NO: 5, 7, ili 8.
 
48. Izolovano antitelo ili njegov funkcionalni fragment prema stavki 47, pri čemu navedeni antigen-vezujući region dalje sadrži H-CDR1 region prikazan u SEQ ID NO: 5, 7 ili 8.
 
49. Izolovano antitelo ili njegov funkcionalni fragment prema stavki 45, koje sadrži varijabilni težak lanac prikazan u SEQ ID NO: 5, 7 ili 8.
 
50. Izolovano antitelo ili njegov funkcionalni fragment prema stavki 45, pri čemu navedeni antigen-vezujući region sadrži L-CDR3 region prikazan u SEQ ID NO: 13, 15 ili 16.
 
51. Izolovano antitelo ili njegov funkcionalni fragment prema stavki 50, pri čemu navedeni antigen-vezujući region dalje sadrži L-CDR1 region prikazan u SEQ ID NO: 13, 15 ili 16.
 
52. Izolovano antitelo ili njegov funkcionalni fragment prema stavki 51, pri čemu navedeni antigen-vezujući region dalje sadrži L-CDR2 region prikazan u SEQ ID NO: 13, 15 ili 16.
 
53. Izolovano antitelo ili njegov funkcionalni fragment prema stavki 45, koje/koji sadrži varijabilni laki lanac prikazan u SEQ ID NO: 13, 15 ili 16.
 
54. Izolovano antitelo ili njegov funkcionalni fragment prema stavki 45, koje/koji sadrži aminokiselinsku sekvencu teškog lanca izabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO: 5, 7 ili 8; i (ii) sekvenca koja ima najmanje 60 procenata identičnosti sekvenci u CDR regionima sa CDR regionima prikazanim u SEQ ID NO: 5, 7 ili 8.
 
55. Izolovano antitelo ili njegov funkcionalni fragment prema stavki 45, koje/koji sadrži aminokiselinsku sekvencu lakog lanca izabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO: 13, 15 ili 16; i (ii) sekvenca koja ima najmanje 60 procenata identičnosti sekvenci u CDR regionima sa CDR regionima prikazanim u SEQ ID NO: 13, 15 ili 16.
 
56. Izolovani funkcionalni fragment prema stavki 45, koji je Fab ili scFv fragment antitela.
 
57. Izolovano antitelo prema stavki 45, koje je IgG.
 
58. Izolovano antitelo prema stavki 57, koje je IgG1.
 
59. Varijabilni težak lanac izolovanog antitela ili njegovog funkcionalnog fragmenta koji je kodiran sa (i) sekvencom nukleinske kiseline koja sadrži SEQ ID NO: 1, 2, 3 ili 4, ili (ii) sekvencama nukleinske kiseline koje hibridizuju pod uslovima visoke stringentnosti za komplementarni lanac od SEQ ID NO: 1, 2, 3 ili 4, pri čemu je navedeno antitelo ili njegov funkcionalni fragment specifično/specifičan za epitop CD38.
 
60. Varijabilni laki lanac izolovanog antitela ili njegovog funkcionalnog fragmenta koji je kodiran sa (i) sekvencom nukleinske kiseline koja sadrži SEQ ID NO: 9, 10, 11, ili 12, ili (ii) sekvencama nukleinske kiseline koje hibridizuju pod uslovima visoke stringentnosti za komplementarni lanac od SEQ ID NO: 9, 10, 11, ili 12, pri čemu je navedeno antitelo ili njegov funkcionalni fragment specifično/specifičan za epitop CD38.
 
61. Izolovana nukleinsko kiselinska sekvenca koja kodira antigen-vezujući region humanog antitela ili njegovog funkcionalnog fragmenta koji je specifičan za epitop CD38.
 
62. Nukleinsko kiselinska sekvenca koja kodira varijabilni teški lanac izolovanog antitela ili njegov funkcionalni fragment, koja sadrži (i) sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NOS: 1, 2, 3 i 4 ili (ii) nukleinsko kiselinsku sekvencu koja hibridizuje pod uslovima visoke stringentnosti za komplementaran lanac SEQ ID NO: 1, 2, 3 ili 4, pri čemu je navedeno antitelo ili njegov funkcionalni fragment specifično/specifičan za epitop CD38.
 
63. Nukleinsko kiselinska sekvenca koja kodira varijabilni laki lanac izolovanog antitela ili njegovog funkcionalnog fragmenta, koja sadrži (i) sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NOS: 9, 10, 11 i 12 ili (ii) nukleinsko kiselinsku sekvencu koja hibridizuje pod uslovima visoke stringentnosti sa komplementarnim lancem SEQ ID NO: 9, 10, 11 ili 12, pri čemu je navedeno antitelo ili njegov funkcionalni fragment specifično/specifičan za epitop CD38.
 
64. Vektor koji sadrži nukleinsko kiselinsku sekvencu prema bilo kojoj od stavki 61-63.
 
65. Izolovana ćelija koja sadrži vektor prema stavki 64.
 
66. Izolovana ćelija prema stavki 65, pri čemu je navedena ćelija bakterijska.
 
67. Izolovana ćelija prema stavki 65, pri čemu je navedena ćelija sisarska.
 
68. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo ili njegov funkcionalni fragment prema bilo kojoj od stavki 1, 15 i 29 i farmaceutski prihatljiv nosač ili ekscipijent.
 
69. Postupak za tretman poremećaja ili stanja povezanog sa neželjenim prisustvom CD38+ ćelija, koji sadrži primenu na subjekta kod koga postoji potreba za tim efikasne količine farmaceutske kompozicije prema stavki 68.
 
70. Postupak prema stavki 69, pri čemu je navedeni poremećaj ili stanje hematološka bolest,
 
71. Postupak prema stavki 70 uzet sa spiska multiplog mijeloma, hronične limfocitne leukemije, hronične mijelogene leukemije, akutne mijelogene leukemije i akutne limfocitne leukemije.
 
72. Postupak prema stavki 69, pri čemu je navedeni poremećaj ili stanje inflamatorna bolest
 
73. Postupak prema stavki 72 uzet sa spiska reumatoidnog artritisa i sistemskog lupus eritomatodesa.
 
74. Postupak za ciljno delovanje na CD38+ ćelije u subjektu ili uzorku ćelija, koji sadrži korak omogućavanja da navedene CD38+ ćelije dođu u kontakt sa antitelom ili njegovim funkcionalnim fragmentom prema bilo kojoj od stavki 1, 15 i 29.
 
75. Postupak za upotrebu epitopa CD38 za izolaciju humanog ili humanizovanog antitela ili njegovog funkcionalnog fragmenta, pri čemu navedeno antitelo ili njegov funkcionalni fragment sadrži antigen-vezujući region koji je specifičan za navedeni epitop, i pri čemu navedeni postupak sadrži korake:
 
a) dovođenja u kontakt navedenog epitopa CD38 sa bibliotekom antitela; i
b) izolacije navedenog antitela ili njegovog funkcionalnog fragmenta,
 
pri čemu navedeni epitop je linearni epitop.
 
76. Postupak prema stavki 75, pri čemu navedeni linearni epitop sadrži aminokiselinske ostatke 192-206.
 
77. Postupak za upotrebu epitopa CD38 za izolaciju humanog ili humanizovanog antitela ili njegovog funkcionalnog fragmenta, pri čemu navedeno antitelo ili njegov funkcionalni fragment sadrži antigen-vezujući region koji je specifičan za navedeni epitop, i gde navedeni postupak sadrži korake:
a) dovođenja u dodir navedenog epitopa CD38 sa bibliotekom antitela; i
b) izolacije navedenog antitela ili njegovog funkcionalnog fragmenta,
pri čemu je navedeni epitop konformacioni epitop.
 
78. Postupak prema stavki 77, pri čemu navedeni konformacioni epitop sadrži jednu ili više aminokiselinskih sekvenci izabranih iz grupe koju čine aminokiseline 44-66, 82-94, 142-154, 148-164, 158-170 i 202-224 CD38.
 
79. Izolovani epitop CD38 koji se uglavnom sastoji od aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe koju čine aminokiseline 44-66, 82-94, 142-154, 148-164, 158-170, 192-206 i 202-224 CD38.
 
80. Izolovani epitop CD38 koji se uglavnnom sastoji od aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe koju čine aminokiseline 44-66, 82-94, 142-154, 148-164, 158-170, 192-206 i 202-224 CD38.
 
81. Komplet koji sadrži izolovani epitop CD38 koji sadrži jedan ili više aminokiselinskih nizova uzetih sa spiska od 44-66, 82-94, 142-154, 148-164, 158-170, 192-206 i 202-224 i biblioteku antitela i uputstva za upotrebu.
 
82. Humano antitelo prema prema bilo kojoj od stavki 1, 15 i 29, gde je humano antitelo sintetičko humano antitelo.
 
83. Izolovani antigen-vezujući region prema bilo kojoj od stavki 11, 12, 25 i 26, gde je navedena identičnost sekvenci najmanje 80%.
 
84. Izolovano antitelo ili njegov funkcionalni fragment prema bilo kojoj od stavki 40, 41, 54 i 55, gde je navedena identičnost sekvenci najmanje 80%.
 
 
Patentni zahtevi
 
1. Humano ili humanizovano antitelo ili njegov fragment koje/koji sadrži antigen-vezujući region koji se specifično vezuje za epitop CD38, pri čemu epitop sadrži jednu ili više aminokiselinskih ostataka sadržanih u jednom ili više od aminokiselinskih nizova uzetih sa spiska aminokiselinskih nizova 44-66, 82-94, 142-154, 148-164, 158-170, ili 192-206 CD38 (SEQ ID NO: 22).
 
2. Antitelo ili njegov fragment prema patentnom zahtevu 1, pri čemu epitop sadrži jedan ili više aminokiselinskih ostataka sadržanih u aminokiselinskim nizovima 44-66 ili 148-164 CD38 (SEQ ID NO: 22).
 
3. Antitelo ili njegov fragment prema patentnom zahtevu 1, pri čemu epitop sadrži jedan ili više aminokiselinskih ostataka sadržanih u aminokiselinskom nizu 192-206 CD38 (SEQ ID NO: 22).
 
4. Antitelo ili njegov fragment prema patentnom zahtevu 1, pri čemu epitop sadrži jedan ili više aminokiselinskih ostataka sadržanih u aminokiselinskim nizovima 82-94, ili 158-170 CD38 (SEQ ID NO: 22).
 
5. Antitelo ili njegov fragment prema patentnom zahtevu 1, pri čemu epitop sadrži jedan ili više aminokiselinskih ostataka sadržanih u aminokiselinskim nizovima 82-94 ili 142-154 CD38 (SEQ ID NO: 22).
 
6. Antitelo ili njegov fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, pri čemu je epitop linearni epitop.
 
7. Antitelo ili njegov fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, pri čemu je epitop konformacioni epitop.
 
8. Antitelo ili njegov fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7, pri čemu je antitelo IgG.
 
9. Antitelo ili njegov fragment prema patentnom zahtevu 8, pri čemu je antitelo IgG1.
 
10. Antitelo ili njegov fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9, pri čemu je antitelo sintetičko humano antitelo.
 
11. Nukleinska kiselina koja kodira antitelo ili njegov fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 10.
 
12. Vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu prema patentnom zahtevu 11.
 
13. Ćelija koja sadrži vektor prema patentnom zahtevu 12.
 
14. Ćelija prema patentnom zahtevu 13, pri čemu je navedena ćelija bakterijska ćelija ili sisarska ćelija.
 
15. Farmaceutska kompozicija koja sadrži humano antitelo ili njegov funkcionalni fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 10 i farmaceutski prihvatljiv nosač ili ekscipijent.
 
16. Upotreba humanog antitela ili njegovog funkcionalnog fragmenta prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 10 za pripremu farmaceutske kompozicije za tretman hematološke bolesti.
 
17. Humano antitelo ili njegov funkcionalni fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 10 za upotrebu u postupku za tretman hematološke bolesti.
 
18. Upotreba prema patentnom zahtevu 16 ili humano antitelo ili njegov funkcionalni fragment za upotrebu prema patentnom zahtevu 17, pri čemu je hematološka bolest multipli mijelom, hronična limfocitna leukemija, hronična mijelogena leukemija, akutna mijelogena leukemija ili akutna limfocitna leukemija.
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Claims (18)

1. Humano ili humanizovano antitelo ili njegov fragment koje/koji sadrži antigen-vezujući region koji se specifično vezuje za epitop CD38, pri čemu epitop sadrži jednu ili više aminokiselinskih ostataka sadržanih u jednom ili više od aminokiselinskih nizova uzetih sa spiska aminokiselinskih nizova 44-66, 82-94, 142-154, 148-164, 158-170, ili 192-206 CD38 (SEQ ID NO: 22).
2. Antitelo ili njegov fragment prema patentnom zahtevu 1, pri čemu epitop sadrži jedan ili više aminokiselinskih ostataka sadržanih u aminokiselinskim nizovima 44-66 ili 148-164 CD38 (SEQ ID NO: 22).
3. Antitelo ili njegov fragment prema patentnom zahtevu 1, pri čemu epitop sadrži jedan ili više aminokiselinskih ostataka sadržanih u aminokiselinskom nizu 192-206 CD38 (SEQ ID NO: 22).
4. Antitelo ili njegov fragment prema patentnom zahtevu 1, pri čemu epitop sadrži jedan ili više aminokiselinskih ostataka sadržanih u aminokiselinskim nizovima 82-94, ili 158-170 CD38 (SEQ ID NO: 22).
5. Antitelo ili njegov fragment prema patentnom zahtevu 1, pri čemu epitop sadrži jedan ili više aminokiselinskih ostataka sadržanih u aminokiselinskim nizovima 82-94 ili 142-154 CD38 (SEQ ID NO: 22).
6. Antitelo ili njegov fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, pri čemu je epitop linearni epitop.
7. Antitelo ili njegov fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, pri čemu je epitop konformacioni epitop.
8. Antitelo ili njegov fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7, pri čemu je antitelo IgG.
9. Antitelo ili njegov fragment prema patentnom zahtevu 8, pri čemu je antitelo IgG1.
10. Antitelo ili njegov fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9, pri čemu je antitelo sintetičko humano antitelo.
11. Nukleinska kiselina koja kodira antitelo ili njegov fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 10.
12. Vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu prema patentnom zahtevu 11.
13. Ćelija koja sadrži vektor prema patentnom zahtevu 12.
14. Ćelija prema patentnom zahtevu 13, pri čemu je navedena ćelija bakterijska ćelija ili sisarska ćelija.
15. Farmaceutska kompozicija koja sadrži humano antitelo ili njegov funkcionalni fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 10 i farmaceutski prihvatljiv nosač ili ekscipijent.
16. Upotreba humanog antitela ili njegovog funkcionalnog fragmenta prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 10 za pripremu farmaceutske kompozicije za tretman hematološke bolesti.
17. Humano antitelo ili njegov funkcionalni fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 10 za upotrebu u postupku za tretman hematološke bolesti.
18. Upotreba prema patentnom zahtevu 16 ili humano antitelo ili njegov funkcionalni fragment za upotrebu prema patentnom zahtevu 17, pri čemu je hematološka bolest multipli mijelom, hronična limfocitna leukemija, hronična mijelogena leukemija, akutna mijelogena leukemija ili akutna limfocitna leukemija.
MEP-2015-350A 2004-02-06 2016-05-17 Anti-cd38 humana antitjela i njihove upotrebe ME02245B (me)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US54191104P 2004-02-06 2004-02-06
US54758404P 2004-02-26 2004-02-26
US55394804P 2004-03-18 2004-03-18
US59901404P 2004-08-06 2004-08-06
US61447104P 2004-10-01 2004-10-01
EP11196172.8A EP2511297B1 (en) 2004-02-06 2005-02-07 Anti-CD38 human antibodies and uses therefor

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ME02245B true ME02245B (me) 2015-10-30

Family

ID=37054659

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MEP-2015-350A ME02245B (me) 2004-02-06 2016-05-17 Anti-cd38 humana antitjela i njihove upotrebe

Country Status (18)

Country Link
EP (3) EP2915820A1 (me)
JP (4) JP2008504013A (me)
KR (2) KR20130126747A (me)
BR (1) BRPI0507489A (me)
CY (1) CY1116458T1 (me)
DK (2) DK1720907T3 (me)
ES (2) ES2541436T3 (me)
HR (1) HRP20150641T1 (me)
HU (1) HUE025369T2 (me)
IL (1) IL177242A (me)
ME (1) ME02245B (me)
NO (1) NO20063986L (me)
NZ (1) NZ548990A (me)
PL (1) PL2511297T3 (me)
PT (1) PT2511297E (me)
RS (1) RS54056B1 (me)
SG (1) SG142330A1 (me)
WO (1) WO2005103083A2 (me)

Families Citing this family (116)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7658924B2 (en) 2001-10-11 2010-02-09 Amgen Inc. Angiopoietin-2 specific binding agents
US9200061B2 (en) 2004-02-06 2015-12-01 Morpho Sys AG Generation and profiling of fully human HuCAL gold®-derived therapeutic antibodies specific for human CD3i
ES2541436T3 (es) 2004-02-06 2015-07-20 Morphosys Ag Anticuerpos humanos anti-CD38 y usos para ellos
AU2005235811B2 (en) 2004-02-06 2011-11-03 Morphosys Ag Anti-CD38 human antibodies and uses therefor
EP3312196B1 (en) 2005-03-23 2019-07-17 Genmab A/S Antibodies against cd38 for treatment of multiple myeloma
PL2860192T3 (pl) 2005-10-12 2018-03-30 Morphosys Ag Wytwarzanie i profilowanie w pełni ludzkich, uzyskanych z HuCAL GOLD terapeutycznych przeciwciał swoistych wobec ludzkiego CD38
RS55963B1 (sr) 2005-12-29 2017-09-29 Janssen Biotech Inc Humana anti-il-23 antitela, kompozicije, metode i upotrebe
JP5328018B2 (ja) * 2006-06-05 2013-10-30 国立大学法人広島大学 抗ｃｄ３８抗体を細胞表面に有する免疫担当細胞
AU2007302448C1 (en) 2006-09-26 2019-02-14 Genmab A/S Combination treatment of CD38-expressing tumors
AU2013209322A1 (en) * 2006-10-19 2013-08-15 Sanofi-Aventis Novel anti-cd38 antibodies for the treatment of cancer
EP1914242A1 (en) * 2006-10-19 2008-04-23 Sanofi-Aventis Novel anti-CD38 antibodies for the treatment of cancer
JO2913B1 (en) 2008-02-20 2015-09-15 امجين إنك, Antibodies directed towards angiopoietin-1 and angiopoietin-2 proteins and their uses
EP2191841A1 (en) * 2008-11-28 2010-06-02 Sanofi-Aventis Antitumor combinations containing antibodies recognizing specifically CD38 and vincristine
EP2191840A1 (en) 2008-11-28 2010-06-02 Sanofi-Aventis Antitumor combinations containing antibodies recognizing specifically CD38 and melphalan
WO2010079189A1 (en) 2009-01-09 2010-07-15 Morphosys Ag Display vectors and methods and uses thereof
EP2580243B1 (en) 2010-06-09 2019-10-16 Genmab A/S Antibodies against human cd38
NZ607473A (en) 2010-09-27 2014-11-28 Morphosys Ag Anti-cd38 antibody and lenalidomide or bortezomib for the treatment of multiple myeloma and nhl
CA2813314A1 (en) * 2010-10-05 2012-04-12 Daiichi Sankyo Company, Limited Antibody targeting osteoclast-related protein siglec-15
UA112170C2 (uk) 2010-12-10 2016-08-10 Санофі Протипухлинна комбінація, що містить антитіло, яке специфічно розпізнає cd38, і бортезоміб
US12466897B2 (en) 2011-10-10 2025-11-11 Xencor, Inc. Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications
WO2013059885A2 (en) 2011-10-28 2013-05-02 Cephalon Australia Pty Ltd Polypeptide constructs and uses thereof
ES2658953T3 (es) 2012-09-25 2018-03-13 Morphosys Ag Combinaciones y usos de los mismos
DK2914302T3 (en) 2012-11-05 2017-04-10 Morphosys Ag RADIOACTIVALLY MARKED ANTIBODY AND USES OF IT
JP2014117191A (ja) * 2012-12-13 2014-06-30 Fisheries Research Agency リン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ１、抗リン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ１抗体、中性スフィンゴミエリナーゼ１変異体、及びそれらの用途
CA2898100C (en) 2013-01-14 2023-10-10 Xencor, Inc. Novel heterodimeric proteins
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US11117975B2 (en) 2013-04-29 2021-09-14 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Anti-CD38 antibodies and fusions to attenuated interferon alpha-2B
CA2909952C (en) * 2013-04-29 2021-10-12 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd. Anti-cd38 antibodies and fusions to attenuated interferon alpha-2b
WO2015063339A1 (en) 2013-11-04 2015-05-07 Glenmark Pharmaceuticals S.A. Production of t cell retargeting hetero-dimeric immunoglobulins
US9732154B2 (en) 2014-02-28 2017-08-15 Janssen Biotech, Inc. Anti-CD38 antibodies for treatment of acute lymphoblastic leukemia
US9603927B2 (en) 2014-02-28 2017-03-28 Janssen Biotech, Inc. Combination therapies with anti-CD38 antibodies
JP6775422B2 (ja) * 2014-03-28 2020-10-28 ゼンコー・インコーポレイテッドＸｅｎｃｏｒ、 Ｉｎｃ． Ｃｄ３８及びｃｄ３に結合する二重特異性抗体
UA119352C2 (uk) 2014-05-01 2019-06-10 Тева Фармасьютикалз Острейліа Пті Лтд Комбінація леналідоміду або помалідоміду і конструкції анти-cd38 антитіло-атенуйований інтерферон альфа-2b та спосіб лікування суб'єкта, який має cd38-експресуючу пухлину
WO2015195555A1 (en) 2014-06-16 2015-12-23 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Blocking cd38 using anti-cd38 antibody conjugated to protein g to protect nk cells
US10106620B2 (en) 2014-06-16 2018-10-23 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Blocking CD38 using anti-CD38 F(ab′)2 to protect NK cells
PE20170676A1 (es) 2014-09-09 2017-05-22 Janssen Biotech Inc Terapias de combinacion con anticuerpos anti-cd38
KR102754019B1 (ko) 2014-10-29 2025-01-14 바이시클러드 리미티드 Mt1-mmp에 특이적인 바이사이클릭 펩타이드 리간드
UA125637C2 (uk) 2014-10-29 2022-05-11 Тева Фармасьютікалз Острейліа Пті Лтд ЗЛИТИЙ ПОЛІПЕПТИД ІНТЕРФЕРОНУ <font face="Symbol">a2</font>b
US11773166B2 (en) 2014-11-04 2023-10-03 Ichnos Sciences SA CD3/CD38 T cell retargeting hetero-dimeric immunoglobulins and methods of their production
MA40894A (fr) * 2014-11-04 2017-09-12 Glenmark Pharmaceuticals Sa Immunoglobulines hétéro-dimères reciblant des lymphocytes t cd3/cd38 et leurs procédés de production
US10259887B2 (en) 2014-11-26 2019-04-16 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
JP2017536830A (ja) 2014-11-26 2017-12-14 ゼンコー・インコーポレイテッドＸｅｎｃｏｒ、 Ｉｎｃ． Ｃｄ３及びｃｄ３８に結合するヘテロ二量体抗体
SG11201704283PA (en) 2014-11-26 2017-06-29 Xencor Inc Heterodimeric antibodies that bind cd3 and tumor antigens
EA202092609A1 (ru) 2014-12-04 2021-10-29 Янссен Байотек, Инк. Антитела к cd38 для лечения острого миелолейкоза
CN113527495A (zh) * 2015-04-08 2021-10-22 索伦托药业有限公司 与cd38结合的抗体治疗剂
JP7160533B2 (ja) 2015-05-13 2022-10-25 モルフォシス・アーゲー 多発性骨髄腫（ｍｍ）の処置
CA2986594C (en) 2015-05-20 2025-06-10 Tufts Medical Center, Inc. Anti-CD38 antibodies for the treatment of light chain amyloidosis and other CD38-positive hematological malignancies
HUE051246T2 (hu) 2015-05-30 2021-03-01 Molecular Templates Inc Deimmunizált shigatoxin alegység vázak és azokat tartalmazó, sejthez irányító molekulák
CN107708734B (zh) 2015-06-22 2022-01-11 詹森生物科技公司 用抗cd38抗体和生存素抑制剂联合治疗血红素恶性肿瘤
HRP20240338T1 (hr) 2015-06-24 2024-05-24 Janssen Biotech, Inc. Imunomodulacija i liječenje solidnih tumora s protutijelima koja se specifično vežu na cd38
US20170044265A1 (en) 2015-06-24 2017-02-16 Janssen Biotech, Inc. Immune Modulation and Treatment of Solid Tumors with Antibodies that Specifically Bind CD38
US10781261B2 (en) 2015-11-03 2020-09-22 Janssen Biotech, Inc. Subcutaneous formulations of anti-CD38 antibodies and their uses
HUE053366T2 (hu) 2015-11-03 2021-06-28 Janssen Biotech Inc Szubkután anti-CD38-ellenanyag-készítmények és alkalmazásuk
CN108699161B (zh) 2016-03-04 2022-06-03 莫佛塞斯公司 多发性骨髓瘤中m-蛋白应答的临床评估
KR20190020341A (ko) 2016-06-28 2019-02-28 젠코어 인코포레이티드 소마토스타틴 수용체 2에 결합하는 이종이량체 항체
US20190233533A1 (en) 2016-06-28 2019-08-01 Umc Utrecht Holding B.V. Treatment Of IgE-Mediated Diseases With Antibodies That Specifically Bind CD38
EP3487506A1 (en) 2016-07-20 2019-05-29 Hybrigenics SA Combinations of inecalcitol with an anti-cd38 agent and their uses for treating cancer
EP3635001A1 (en) * 2017-06-08 2020-04-15 Black Belt Therapeutics Limited Cd38 modulating antibody
AU2018280871B2 (en) 2017-06-08 2024-09-26 Black Belt Therapeutics Ltd CD38 modulating antibody
EP4509143A3 (en) 2017-06-20 2025-04-23 Sorrento Therapeutics, Inc. Cd38 antibody drug conjugate
CN111032678A (zh) 2017-06-26 2020-04-17 拜西克尔德有限公司 具有可检测部分的双环肽配体和其用途
ES2926195T3 (es) 2017-08-04 2022-10-24 Bicycletx Ltd Ligandos peptídicos bicíclicos específicos de CD137
EP3668543A1 (en) 2017-08-16 2020-06-24 Black Belt Therapeutics Limited Cd38 antibody
US11542338B2 (en) 2017-08-16 2023-01-03 Black Belt Therapeutics Limited CD38 modulating antibody
WO2019034752A1 (en) 2017-08-16 2019-02-21 Tusk Therapeutics Ltd Cd38 modulating antibody
AU2018348093A1 (en) * 2017-10-10 2020-05-28 Sanofi Anti-CD38 antibodies and combinations with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies
CN111565751A (zh) 2017-10-31 2020-08-21 詹森生物科技公司 治疗高危多发性骨髓瘤的方法
AU2018366199A1 (en) 2017-11-08 2020-05-28 Xencor, Inc. Bispecific and monospecific antibodies using novel anti-PD-1 sequences
GB201721265D0 (en) 2017-12-19 2018-01-31 Bicyclerd Ltd Bicyclic peptide ligands specific for EphA2
TWI825046B (zh) 2017-12-19 2023-12-11 英商拜西可泰克斯有限公司 Epha2特用之雙環胜肽配位基
EP3740198A4 (en) 2018-01-18 2023-08-09 Fred Hutchinson Cancer Center MODIFICATION OF INFLAMMATORY STATES OF IMMUNE CELLS IN VIVO BY MODULATION OF CELL ACTIVATION STATES
WO2019149743A1 (en) 2018-01-30 2019-08-08 Cellectis Combination comprising allogeneic immune cells deficient for an antigen present on both t-cells and pathological cells and therapeutic antibody against said antigen
CN110144008B (zh) * 2018-02-12 2021-03-19 杭州尚健生物技术有限公司 Cd38蛋白抗体及其应用
AU2019224659A1 (en) 2018-02-23 2020-10-15 Bicycletx Limited Multimeric bicyclic peptide ligands
AU2019247415A1 (en) 2018-04-04 2020-10-22 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind fibroblast activation protein
KR20210022684A (ko) 2018-06-20 2021-03-03 소렌토 쎄라퓨틱스, 인코포레이티드 Cd38에 결합하는 변이 항체
US11180531B2 (en) 2018-06-22 2021-11-23 Bicycletx Limited Bicyclic peptide ligands specific for Nectin-4
GB201810320D0 (en) 2018-06-22 2018-08-08 Bicycletx Ltd Peptide ligands for binding to CD38
GB201810316D0 (en) 2018-06-22 2018-08-08 Bicyclerd Ltd Peptide ligands for binding to EphA2
BR112021007227A2 (pt) 2018-10-17 2021-08-10 Janssen Biotech, Inc. método para fornecer administração subcutânea de anticorpos anti-cd38
MX2021005905A (es) 2018-11-20 2021-06-23 Janssen Biotech Inc Metodo seguro y eficaz para tratar la psoriasis con el anticuerpo especifico anti-il-23.
GB201820288D0 (en) 2018-12-13 2019-01-30 Bicycle Tx Ltd Bicycle peptide ligaands specific for MT1-MMP
GB201820325D0 (en) 2018-12-13 2019-01-30 Bicyclerd Ltd Bicyclic peptide ligands specific for psma
GB201820295D0 (en) 2018-12-13 2019-01-30 Bicyclerd Ltd Bicyclic peptide ligands specific for MT1-MMP
IL317328A (en) 2018-12-14 2025-01-01 Morphosys Ag Antibody formulations
CN113474045A (zh) 2018-12-21 2021-10-01 拜斯科技术开发有限公司 Pd-l1特异性的双环肽配体
US12551567B2 (en) 2018-12-21 2026-02-17 Bicyclerd Limited Bicyclic peptide ligands specific for PD-L1
GB201900530D0 (en) 2019-01-15 2019-03-06 Bicyclerd Ltd Bicyclic peptide ligands specific for CD38
GB201900529D0 (en) 2019-01-15 2019-03-06 Bicycletx Ltd Bicyclic peptide ligands specific for CD38
JP7687956B2 (ja) 2019-03-15 2025-06-03 モルフォシス・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング 自己抗体介在性自己免疫疾患の処置のための、抗ｃｄ３８抗体及びその医薬組成物
US11780911B2 (en) 2019-05-23 2023-10-10 Janssen Biotech, Inc. Method of treating inflammatory bowel disease with a combination therapy of antibodies to IL-23 and TNF alpha
KR20220026586A (ko) 2019-06-27 2022-03-04 크리스퍼 테라퓨틱스 아게 암 치료를 위한 키메라 항원 수용체 t세포 및 nk세포 억제제의 용도
JP2022539248A (ja) 2019-07-02 2022-09-07 フレッド ハッチンソン キャンサー リサーチ センター 組換えａｄ３５ベクター及び関連遺伝子治療改善
TWI860386B (zh) 2019-07-30 2024-11-01 英商拜西可泰克斯有限公司 異質雙環肽複合物
EP4130035A4 (en) * 2020-03-31 2024-06-26 Bio-Thera Solutions, Ltd. Antibody and fusion protein for treating coronaviruses and use thereof
WO2021231976A1 (en) 2020-05-14 2021-11-18 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (psma) and cd3
MX2022014430A (es) 2020-05-21 2023-02-22 Janssen Biotech Inc Método para tratar la enfermedad inflamatoria del intestino con una terapia de combinación de anticuerpos para il-23 y tnf alfa.
US20220023344A1 (en) 2020-06-26 2022-01-27 Crispr Therapeutics Ag Allogeneic cell therapy of acute lymphoblastic leukemia using genetically engineered t cells targeting cd19
CA3189761A1 (en) 2020-08-03 2022-02-10 Gemma Mudd Peptide-based linkers
CN114075283A (zh) 2020-08-12 2022-02-22 三生国健药业（上海）股份有限公司 结合人cd38的抗体、其制备方法和用途
CN114195893A (zh) * 2020-09-17 2022-03-18 百奥泰生物制药股份有限公司 抗整联蛋白抗体或抗原结合片段及其应用
GB202016331D0 (en) 2020-10-15 2020-12-02 Bicyclerd Ltd Bicyclic peptide ligand drug conjugates
US20220202859A1 (en) 2020-12-23 2022-06-30 Crispr Therapeutics Ag Cancer treatment using cd38 inhibitor and/or lenalidomide and t-cells expressing a chimeric antigen receptor
CA3204187A1 (en) 2021-01-14 2022-07-21 Stefan Steidl Anti-cd38 antibodies and their uses
US20220275090A1 (en) 2021-02-22 2022-09-01 Janssen Biotech, Inc. Combination Therapies with Anti-CD38 Antibodies and PARP or Adenosine Receptor Inhibitors
TW202302642A (zh) 2021-03-01 2023-01-16 德商莫菲西斯公司 用於治療抗體介導移植物排斥用途之抗ｃｄ３８抗體
KR20230156079A (ko) 2021-03-09 2023-11-13 젠코어 인코포레이티드 Cd3과 cldn6에 결합하는 이종이량체 항체
US11859012B2 (en) 2021-03-10 2024-01-02 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and GPC3
AR125851A1 (es) 2021-05-12 2023-08-16 Crispr Therapeutics Ag Células inmunes modificadas genéticamente que se focalizan en cd70 para su uso en el tratamiento de neoplasias malignas hematopoyéticas
WO2022238963A2 (en) 2021-05-12 2022-11-17 Crispr Therapeutics Ag Genetically engineered immune cells targeting cd70 for use in treating solid tumors
TW202321303A (zh) 2021-07-19 2023-06-01 德商莫菲西斯公司 抗pla2r自體抗體媒介膜性腎病變之治療
US20230134748A1 (en) 2021-11-03 2023-05-04 Janssen Biotech, Inc. Corticosteriod Reduction in Treatment with Anti-CD38 Antibody
WO2023098813A1 (en) * 2021-12-03 2023-06-08 Nanjing Leads Biolabs Co., Ltd. Antibodies binding cd38 and uses thereof
EP4472740A1 (en) 2022-01-31 2024-12-11 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Cd38 as a biomarker and biotarget in t-cell lymphomas
TW202423970A (zh) 2022-10-10 2024-06-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 Ｇｐｒｃ５ｄ ｔｃｂ及ｃｄ３８抗體之組合療法
WO2026059919A1 (en) 2024-09-10 2026-03-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating multiple myeloma with bcma inhibitors in combination with cd38 inhibitors

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9424449D0 (en) * 1994-12-02 1995-01-18 Wellcome Found Antibodies
US20020164788A1 (en) 1994-12-02 2002-11-07 The Wellcome Foundation Limited Humanized antibodies to CD38
ATE219517T1 (de) 1995-08-18 2002-07-15 Morphosys Ag Protein-/(poly)peptidbibliotheken
JP2000316578A (ja) * 1999-05-12 2000-11-21 Bml Inc 糖尿病発症危険因子の検出方法
EP1990409A3 (en) 1999-07-20 2011-05-18 MorphoSys AG Bacteriophage
EP1174440A1 (en) 2000-07-19 2002-01-23 U-BISys B.V. A selectively-expressed epitope on the human CD38 molecule detected by a phage display library-derived human scFv antibody fragment
US7091323B2 (en) * 2001-04-24 2006-08-15 Bayer Corporation Human TIMP-1 antibodies
AR038568A1 (es) * 2002-02-20 2005-01-19 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-a beta y su uso
ES2541436T3 (es) * 2004-02-06 2015-07-20 Morphosys Ag Anticuerpos humanos anti-CD38 y usos para ellos
EP1888647A2 (en) * 2005-05-24 2008-02-20 MorphoSys AG Generation and profiling of fully human hucal gold®-derived therapeutic antibodies specific for human cd38
EP2511298B1 (en) 2005-10-31 2019-01-16 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Compositions and Methods for Treating Cancer based on human FZD receptors
JP2012022417A (ja) * 2010-07-12 2012-02-02 Humony Co Ltd 電子請求処理サービスシステム及び該電子請求処理サービスシステム用のアプリケーション
JP6257929B2 (ja) * 2013-06-13 2018-01-10 東芝メディカルシステムズ株式会社 Ｘ線コンピュータ断層撮影装置

Also Published As

Publication number Publication date
JP2015110597A (ja) 2015-06-18
NZ548990A (en) 2009-06-26
JP2016164198A (ja) 2016-09-08
EP1720907A2 (en) 2006-11-15
SG142330A1 (en) 2008-05-28
HK1097859A1 (en) 2007-07-06
RS54056B1 (sr) 2015-10-30
IL177242A0 (en) 2006-12-10
JP2012116856A (ja) 2012-06-21
EP1720907B1 (en) 2015-04-08
WO2005103083A3 (en) 2006-11-16
DK2511297T3 (en) 2015-06-15
KR20140066259A (ko) 2014-05-30
EP2511297B1 (en) 2015-04-08
ES2541489T3 (es) 2015-07-21
EP2915820A1 (en) 2015-09-09
WO2005103083A2 (en) 2005-11-03
HUE025369T2 (en) 2016-02-29
HRP20150641T1 (hr) 2015-07-17
KR20130126747A (ko) 2013-11-20
WO2005103083A8 (en) 2006-10-05
JP2008504013A (ja) 2008-02-14
DK1720907T3 (en) 2015-06-15
ES2541436T3 (es) 2015-07-20
IL177242A (en) 2011-09-27
BRPI0507489A (pt) 2007-07-10
EP2511297A1 (en) 2012-10-17
PT2511297E (pt) 2015-08-24
NO20063986L (no) 2006-11-06
JP5926568B2 (ja) 2016-05-25
CY1116458T1 (el) 2017-03-15
PL2511297T3 (pl) 2015-08-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2511297B1 (en) Anti-CD38 human antibodies and uses therefor
US9758590B2 (en) Anti-CD38 human antibodies and uses thereof
EP2860192B1 (en) Generation and profiling of fully human HuCAL GOLD-derived therapeutic antibodies specific for human CD38
US9200061B2 (en) Generation and profiling of fully human HuCAL gold®-derived therapeutic antibodies specific for human CD3i
US20090123950A1 (en) Generation And Profiling Of Fully Human Hucal Gold®-Derived Therapeutic Antibodies Specific For Human CD38
CN1976950B (zh) 抗cd38人抗体及其用途
RU2402568C2 (ru) Человеческие анти-cd38-антитела и их применение
HK1097859B (en) Anti-cd38 human antibodies and uses therefor