KR970010955B1 - Ab-011 항생제 및 그의 제조방법 - Google Patents

Ab-011 항생제 및 그의 제조방법 Download PDF

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빈센티 마르코
스페라 실비아
미렌나 루이기
피랄리 기오르기오
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프레시덴자 델 콘시글리오 데이 미니스트리 우피시오 델 미니스트로 페르 일 코오르디나멘토 델레 이니지 아티베 페르 라 리세르카 사이엔티피카에 테크놀로지카
루이기 코티
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Abstract

내용없음.

Description

AB-011 항생제 및 그의 제조방법
제 1 도는 AB-011a 항생제의 U.V. 흡수 스펙트럼을 나타낸다.
제 2 도는 AB-011a 항생제의 I.R. 스펙트럼을 나타낸다.
제 3 도는 AB-011a 항생제의1H N.M.R. 스펙트럼을 나타낸다.
제 4 도는 AB-011a 항생제의13C N.M.R. 스펙트럼을 나타낸다.
제 5 도는 AB-011a 항생제의 열무게 분석을 나타낸다.
제 6 도는 AB-011b 항생제의 U.V. 흡수 스펙트럼을 나타낸다.
제 7 도는 AB-011b 항생제의 I.R. 흡수 스펙트럼을 나타낸다.
제 8 도는 AB-011b 항생제의1H N.M.R. 스펙트럼을 나타낸다.
제 9 도는 AB-011b 항생제의13C N.M.R. 스펙트럼을 나타낸다.
제 10 도는 AB-011b 항생제의 열무게 분석을 나타낸다.
본 발명은 "AB-011 항생제"로 약칭한 항생물질 및 그의 주성분인 AB-011a 항생제 및 AB-011b 항생제에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 스트렙토미세스 에스. 피.(Streptomyces S. P.) NCIB 12629의 발효에 의한 그의 제조방법 및 그에 민감한 미생물로 인해 감염성 질환의 치료에 있어서의 그 용도에 관한 것이다.
AB-011 항생제는 종래 공지된 다른 항생제와는 다르다.
본 발명에서 사용되는 용어 "AB-011 항생제"는 하기의 특정 조건하에서 스트렙토미세스 에스. 피. NCIB 12629의 발효에 의해 제조되고, 예를들면, 항진균형과 같은 생물학적 활성이 부여된 모든 성분의 혼합물을 나타낸다.
상기 활성 성분은 여기에 국한되는 것은 아니지만 혼합물로부터 단리될 수 있는, AB-011a 및 AB-011b 항생제로 제시되는 것을 포함한다.
발효 분야에서 통상적인 지식을 가진 사람들에게는 AB-011 항생제를 형성하는 성분의 수 및 상호 비율은 발효조건 및 사용된 세균주의 함수로서 다양할 수 있다는 사실이 잘 알려져 있다.
또한, 본 발명은 스트렙토미세스 에스. 피. NCIB 12629의 사용에 국한되지 않으며, AB-011 항생제를 생산하는 조건에서 상기 미생물의 천연 또는 인공 변이체 및 변종의 사용을 또한 포함한다는 점을 이해해야 한다.
그러므로, 본 발명의 목적은 호기조건하, 탄소, 질소 및 무기염의 원을 함유하는 수성 영양배양 배지에서 스트렙토미세스 에스. 피. NCIB 12629 또는 그의 해당 변이를 조절 배양한 후, AB-011 항생제 및 그의 주성분인 AB-011a 및 AB-011b 항생제를 분리함으로써 수득할 수 있는 AB-011 항생제이다.
AB-011a 항생제의 물리 -화학적 특성
AB-011 항생제의 한 성분인 AB-011a 항생제는 하기 특징을 갖는 연황색 분말이다 :
(a) 디메틸술폭시드 및 (1 : 1 V/V) 에탄올/물 또는 (1 : 1 V/V)메탄올/물 혼합물[V/V=부피/부피]에 잘 용해되고, 물에는 잘 용해되지 않으며, 에탄올 및 메탄올에는 다소 잘 용해된다 ;
(b) 진공, 40℃에서 2시간동안 방치한 시료를 결정한 대략의 원소분석을 % 값으로 나타내면
탄소 : 58.86
수소 : 7.64
질소 : 1.11
로서 황 및 인을 함유하지 않는다 ;
(c)하기 조건하 (M-H)-에 대해 1196.65에서 피그를 나타내는 FAB-MS 스펙트럼으로 계산하여 분자량은 약 1197.65이다 :
-9.5kV에서 음이온, FAB, Xe
-매트릭스 : 글리세롤
-핀니간 매트(Finnigan Mat)8424 ;
(b) U.V. 흡수 스펙트럼은 첨부된 도면중 제1도에서 제시한다. 최대흡수는 0.029mg/ml 농도의 메탄올에서, 350.4nm에서 2.269; 332.6nm에서 2.197; 317.3nm에서 1.403; 303.3nm에서 0.679; 381.1nm에서 0.118; 405.6nm에서 0.097이다;
(e) KBr 펠렉에서의 I.R. 흡수 스펙트럼은 첨부된 도면중 제2도에 제시하며, 최대흡수(cm-1)는 하기와 같다 :
3421, 2960, 2930, 2855, 2035, 1718, 1634, 1570, 1448, 1403, 1383, 1340, 1340, 1302, 1268, 1168, 1063, 1036, 1009, 989, 906, 848, 794, 575, 526, 473;
(f)1H N.M.R. 스펙트럼은 제 3 도에 제시하며, 헥사-듀테로-디메틸술폭시드(DMSOd6)에서 브룩커 에이엠(BRUKERAM) 300MHz 분광계를 사용하여 기록된 신호를 나타낸다.
화학적 이동은 δTMS=2.65ppm에서 헥사-듀테로-디메틸술폭시드의 중심 피크를 내부표준으로 사용하여 TMS=0.00ppm(δTMS)에 대해 간접적으로 나타낸다.
δTMS=2.56ppm :
δTMS(ppm) : 6.45~6.10*(m,8H); 5.92(m,1H); 5.69(m,1H); 5.41(m,2H); 5.15(m,1H); 4.92(m,1H); 4.77~4.22(m,6H); 4.22~3.45*(m,8~10H); 3.37~3.07*(m,6~7H); 3.02(t,1H); 2.93(t,1H); 2.88~2.72*(m,3H); 2.45~2.27*(m,3~4H); 2.27~2.05*(m,3H); 2.05~1.85*(m,3H); 1.85~1.66*(m,1H); 1.66~1.15*(m,30~33H); 1.10(d,3H); 0.99(d,3H); 0.90(m,6H).
*로 표시된 신호에 해당하는 수소원자의 수는 오직 제시하기 위한 것으로서 오차에 영향 받는다.
(g)13C N.M.R. 스펙트럼은 제 4 도에 제시하며, 헥사-듀테로-디메틸술폭시드(DMSOd6)에서 브룩커 에이엠 300MHz 분광계를 사용하여 기록된 신호를 나타낸다. 화학적 이동은 δTMS=39.85ppm에서 헥사-듀테로-디메틸술폭시드의 중심피크를 내부표준으로 사용하여 TMS=0.00ppm(δTMS)에 대해 간접적으로 나타낸다. 다중 기호에 대한 자료는 45, 90 및 135에서 DEPT 시험을 사용하여 얻는다.
δTMS(ppm) : 208.6(s); 176.3(s); 170.3(s); 135.8(d); 134.6(d); 133.5(d); 133.2(d); 132.9(d); 132.7(d); 131.7(d); 131.4(d); 130.0(d); 129.5(d); 100.3(d); 99.8(d); 97.4(s); 97.3(d); 87.1(d); 84.4(d); 79.9(d); 75.0(d); 73.5(d); 73.1(d); 72.1(d); 70.7(d); 70.0(d); 69.0(d); 67.1(d); 66.1(d); 65.9(d); 64.0(d); 58.1(d); 56.9(q); 56.3(d); 51.6(t); 50.5(t); 44.7(t); 43.0(t); 42.5(t); 39.7(d); 39.4(d); 39.0(t); 37.5(t); 36.3(t); 34.4(t); 32.1(t); 31.7(t); 29.3(t); 18.0(q); 17.9(q); 17.1(q); 16.0(q); 11.5(q).
또한, 제 4 도에서 *로 표시한 몇몇 피크는 분석 시료의 원에 따라 강도가 다양하여 AB-011a 항생제에 대한 그 계수가 불확실한데. 상기 피크는 동일한 생성물의 분해 산물로 인한 것으로서, 그 피크의 목록을 하기에 기술한다.
δTMS(ppm) : 70.9(d); 68.9(d); 31.5(t); 29.0(t); 28.8(t); 28.3(t); 24.7(t); 22.8(q); 22.3(t); 18.0(t); 14.2(q).
(h) 하기 용리계에서 실리카 슬랩 키에셀겔(Kieselgel) 60F 254(Merck-Schuchardt) 및 역상 실리카 슬랩 RP-18F 254(Merck-Schuchardt) 상에서 15cm의 용리액으로 전개시키는 박막 크로마토그래피에서의 머무름 상수를 AB-011b 항생제와 비교, 제시한다 :
A 용리액 : 물에 용해시킨 메탄올 : 25mM 일염기성 인산칼륨+7mM 테트라메틸-암모늄 클로라이드(8 : 2);
B 용리액 : 물에 용해시킨 메탄올 : 아세토니트릴 : 25mM 일염기성 인산칼륨+7mM 테트라메틸-암모늄 클로라이드(4 : 4 : 2);
C 용리액 : 물에 용해시킨 메탄올 : 인산을 사용하여 pH 7.5로 조정한 10mM 이염기성 인산 암모늄(8 : 2);
D 용리액 : 물에 용해시킨 메탄올 : 아세토니트릴 : 인산을 사용하여 pH 7.5로 조정한 10mM 이염기성 인산 암모늄(4 : 4 : 2);
E 용리액 : 에탄올 : 디옥산 : 30% 암모니아수용액 : 물(8 : 1 : 1 : 1);
F 용리액 : 메틸렌 클로라이드 : 메탄올(17 : 3)
Figure kpo00001
발색 :
A. U.V. 광에서 형광(366nm)
B. 아니스알데히드(T-27 반응물)[Justus. G. Kirchner, Thin Layer Chromatography, 2nd Ed, John Wiley & Sons 출판, p 205]
C. o-아미노페놀(T-11 반응물)[상동, p 201]
(i) 하기 조건하 역상 HPLC 컬럼 상에서 분석했을 때 머무름 시간(Rt)은 약 7분이다 :
컬럼 : 하이바 리크로카르트 리-크로소르브 알피-18(Hiber Lichro CART Li-Chrosorb RP-18, 7미크론) 250×4.0mm(Merck, Darmstadt, F. R. 독일)
전 컬럼(Forecolumn) : 가드 팩(Guard Pak) RCSS C 18(Millipore Waters)
용리액 : 물에 용해시킨 메탄올 : 아세토니트릴 : 25mM 일염기성 인산칼륨+7mM 테트라메틸-암모늄클로라이드(4 : 4 : 2)
유량 : 0.8ml/분
검출기 : U.V. 333nm
온도 : 40℃
동일한 조건하에서 약 9분후에 AB-011b 항생제가 용출된다.
(1) 페르킨-엘머 7 시리즈(PERKIN-ELMER 7 SERIES) 열 분석계에서 30~700℃의 온도범위내에서 20℃/분의 온도 증가율로, 질소 하에서 열무게 분석을 수행하여, 제 5 도에 제시하는데, 가로축은 온도(℃)이고, 세로축은 퍼센트 중량손실을 나타낸다. 제 5 도는 또한 곡선의 첫번째 변화율을 나타낸다.
AB-011b 항생제의 물리-화학적 특성
AB-011 항생제의 한 성분인 AB-011b 항생제는 하기 특징을 갖는 진황색 분말이다 :
(a) U.V. 흡수 스펙트럼은 첨부된 도면중 제 6 도에 제시한다. 최대흡수는 0.04mg/ml 농도의 메탄올에서 349.9nm에서 2.872; 332.4nm에서 2.747; 316.9nm에서 1.999; 303.3nm에서 0.987이다;
(b) 진공, 40℃에서 2시간동안 방치한 시료를 결정한 대략의 원소분석을 % 값으로 나타내면
탄소 : 58.51
수소 : 8.14
질소 : 1.03
로서 황 및 인을 함유하지 않는다;
(c) KBr 펠렛에서의 I.R. 흡수 스펙트럼은 첨부된 도면중 제 7 도에 제시하며, 최대흡수(cm-1)는 하기와 같다;
3415, 2926, 2855, 2060, 1721, 1634, 1568, 1450, 1406, 1383, 1302, 1264, 1190, 1168, 1063, 1036, 1007, 988, 906, 847, 804, 722, 664, 618, 576, 509, 471, 446;
(d) 하기 조건하(M-H)-에 대해 1180에서 피크를 나타내는 FAB-MS 스펙트럼으로 계산하여 분자량은 약 1181이다 :
-9.5kV에서 음이온, FAB, Xe
-매트릭스 : 글리세롤
-핀니간 매트 8424;
(e)1H N.M.R. 스펙트럼은 제 8 도에 제시하며, 헥사-듀테로-디메틸술폭시드(DMSOd6)에서 브룩커 에이엠 300MHz 분광계를 사용하여 기록된 신호를 나타낸다. 화학적 이동은 δTMS=2.56ppm에서 헥사-듀테로-디메틸술폭시트의 중심 피크를 내부표준으로 사용하여 TMS=0.00ppm(δTMS)에 대해 간접적으로 나타낸다.
δTMS(ppm) : 6.45~6.05*(m,8H); 5.93(m,1H); 5.70(m,1H); 5.40(m,2H); 5.13(m,1H); 4.73~4.30(m,6H); 4.27~3.45*(m,8~9H); 3.37~3.09*(m,6~7H); 3.02(t,1H); 2.94(t,1H); 2.75~2.60*(m,1H); 2.44~2.28*(m,3H); 2.28~1.81(m,7~8H); 1.81~1.47*(m,5H); 1.47~1.16*(m,30~33H); 1.11(d,3H); 0.99(d,3H); 0.91(m,6H).
*로 표시한 신호에 해당하는 수소원자의 수는 오직 제시하기 위한 것으로서 오차에 의해 영향받는다.
(f)13C N.M.R. 스펙트럼은 제 9 도에 제시하며, 헥사-듀테로-디메틸술폭시트(DMSOd6)에서 브룩커 에이엠 300MHz 분광계를 사용하여 기록된 신호를 나타낸다. 화학적 이동은 δTMS=39.85ppm에서 헥사-듀테로-디메틸술폭시드의 중심 피크를 내부표준으로 사용하여 TMS=0.00ppm(δTMS)에 대해 간접적으로 나타낸다. 다중 기호에 대한 자료는 45, 90 및 135에서 DEPT 시험을 사용하여 얻는다.
δTMS(ppm) : 208.7(s); 176.3(s); 174.9(s); 170.4(s); 135.7(d); 134.7(d); 133.5(d); 133.3(d); 132.9(d); 132.7(d); 131.7(d); 131.5(d); 130.0(d); 129.5(d); 100.3(d); 100.0(d); 97.4(s); 96.9(d); 87.2(d); 84.5(d); 80.0(d); 75.1(d); 74.9(d); 73.1(d); 72.2(d); 70.7(d); 70.0(d); 69.0(d); 68.5(d); 67.8(d); 67.1(d); 65.9(d); 65.7(d); 63.9(d); 58.1(d); 56.9(q); 56.2(d); 51.5(t); 50.7(t); 46.5(t); 44.7(t); 42.5(t); 39.1(t); 38.5(t); 38.0(t); 36.3(t); 34.1(t); 32.3(t); 31.8(t); 31.6(t); 29.3(t); 18.1(q); 18.0(q); 17.9(q); 17.4(q); 16.3(q); 11.6(q).
또한, 제 9 도에서 *로 표시한 몇몇 피크는 분석 시료의 원에 따라 강도가 다양하여 AB-011b 항생제에 대한 그 계수가 불확실한데, 상기 피크는 동일한 생성물의 분해 산물로 인한 것으로서 그 피크의 목록을 하기에 기술한다.
δTMS(ppm) : 74.9(d); 70.5(d); 31.4(t); 29.0(t); 28.9(t); 28.8(t); 28.6(t); 26.9(t); 24.8(t); 22.8(q); 22.4(t); 22.0(t); 14.3(q).
(g) 페르킨-엘머 7 시리즈 열 분석계에서 30~700℃의 온도범위내에서 20℃/분의 온도 증가율로, 질소하에서 열무게 분석을 수행하여, 제 10도에 제시하는데, 가로축은 온도(℃)이고, 세로축은 퍼센트 중량 손실을 나타낸다. 제 10 도는 또한 곡선의 첫번째 변화율을 나타낸다.
(h) 박막 크로마토그래피에서의 머무름 상수(Rf) 및 역상 HPLC 컬럼에서의 머무름 시간(Rf)은 AB-011a 항생제의 물리-화학적 특성이 기술된 (h) 및 (i)난에 각각 기술되어 있다.
미생물 스트렙토미세스 에스. 피. NCIB 12629의 형태학 및 배양 특성
미생물은 통상명 SD18의 바르조(Varzo, Novara)에서 수집된 토양시료로부터 단리한다.
본 미생물의 배양액은 부다페스트 조약하에 1988년 1월 22일, 내셔날 콜렉션 오브 인더스트리알 박테리아(The National Collection of Industrial and Marine Bacteria Ltd., 영국 스코틀랜드 Aberdeen AB 98 DG, 135 Abbey Road, P. O. Box 31, Torry Research Station)에 기탁하여, 수탁번호 NCIB 12629를 받았다.
균주의 형태학적 특성은 표 A에 제지한다(배양배지명은 인터내셔날 스트렙토미세스 프로그램에 기록된 것에 따른다).
표 A
Figure kpo00002
표 B에는 이 균주의 몇가지 특성을 기록한다.
표 B(2)
Figure kpo00003
(2) 시험은 문헌[S. T. Williams, M. Goodfellow, E. M. H. Wellington, J. C. Vickers, G. Alderson, P. H. A. Sneath, M. J. Sackin, A. M. Mortimer : Journal of General Microbiology 1983, 129, 1815~1830]에 기술된 방법에 따라 수행된다.
표 C에는, 오직 탄소원으로서 몇가지 유기 물질에서의 균주의 성장을 기재한다.
표 C
Figure kpo00004
문헌[M. P. Starr, H. Stolp, H. G. Truper, A. Ballows, H. G. Shegel, The Prokaryotes vol. II Strepto-mycetacee, Springer Verlag Ed,. 1981]에 기술된 방법에 따라 행한 SD 18 균주의 세포벽 분석으로, 당에 관한 특성이 없다고 밝혀져서, SD 18은 스트렙토미세스 속에 속하는 것을 확인하였다.
다른 미생물과 마찬가지로, 스트렙토미세스 에스. 피. NCIB 12629는 변이가 일어날 수 있다.
예를들면, 인공 변종 또는 변이체는 X선 또는 U.V. 광, 고주파 및 아질산, 할로겐화 알킬아민, 니트로소-구아니딘, 장 뇌등의 화학물질과 같은 각종 공지의 변이 유발인자로 처리함으로써 수득할 수 있다.
스트렙토미세스 종에 속하고, AB-011 항생제를 생산하는 천연 원 또는 인공의 모든 변종 또는 변이체는 스트렙토미세스 에스. 피. NCIB 12629 균주와 동등한 것으로 간주하며, 본 발명의 범위에 속한다.
[AB-011 항생제의 제조방법]
AB-011 항생제의 제조 방법은 조절된 호기성 발효 조건하, 수성 영양 배지에서 스트렙토미세스 에스. 피. NCIB 12629 또는 그의 해당변이체를 배양한 후, 본질적으로 공지된 방법에 의해 상기 항생제를 분리함을 특징으로 한다.
항생제 제조에서 통상적으로 사용되는 영양 배양 배지 또는 발효 브로쓰를 사용할 수 있지만, 몇몇 배양배지가 바람직하다.
상기 배양 배지는 스트렙토미세스 속의 미생물에 의해 동화될 수 있는 탄소 및 질소 원을 함유해야만 하며, 또한 저수준의 무기염을 함유해야만 한다. 그것은 또한 미생물의 성장 및 발달에 필요한 미량의 금속을 함유해야 하는데, 세균 성장을 위해 공급된 탄소 또는 단백질성 질소원에 불순물로 이미 존재할 수 있거나 필요할 때에는 배양 배지에 가할 수 있다.
탄소원으로서, 탄수화물을 사용할 수 있는데, 예를들면 글루코스 또는 프룩토스와 같은 다당류 형태, 및 전분형태 또는 예를들면, 덱스트린, 가용성 전분과 같은 상업적 견지에서 유사한 산물, 또는 예를들면, 글리세롤과 같은 폴리알콜일 수 있다. 상기 화합물을 개별적으로 또는 서로 조합하여 사용할 수 있다.
배양배지내 탄소원의 농도는 일반적으로 상기 배지내에 함유된 다른 성분의 형태 및 양에 따라 좌우되지만, 어째든 일반적으로 0.5~5중량% 범위의 농도가 바람직하다. 질소원으로는 예를들면, 효모 추출액, 카제인 가수분해물 또는 증류 용해물(distillers solubles)과 같은 시판물을 사용할 수 있다.
이 화합물은 배양 배지내 0.1~4중량%의 농도범위에서 개별적으로 서로 조합하여 사용할 수 있다. 무기염으로는, 예를들면 인산염, 황산염, 염산염, 탄산염 및 질산염과 같은 나트륨염, 칼륨염, 마그네슘염, 암모늄염, 칼슘염을 사용할 수 있다.
미량 금속, 예를들면 코발트, 망간, 철 등을 사용할 수 있다. 스트렙토미세스 에스. 피. NCIB 12629에 의한 AB-011 항생제의 제조를 자극할 수 있는 특별한 능력을 보이는 몇 가지 배양배지중에서, 예를들면 하기 수성 제제를 언급할 수 있는데, 이것은 하기 제조예에서 사용된다.
P 배양 배지
Figure kpo00005
V 배양배지
Figure kpo00006
S 배지
Figure kpo00007
스트렙토미세스 에스. 피. NCIB 12629 균주는 20~35℃, 바람직하게는 25~30℃의 온도범위에서 성장할 수 있다.
pH값은 일반적으로 약 5~9의 범위일 수 있다.
배양 배지에 주입된 멸균 공기는 일반적으로 배지내 산소 농도를 20% 포화 값 이상으로 유지할 수 있는 양으로 사용한다.
발효 동안의 항생제 제조는 브로쓰 시료에 대한 항생제 활성의 시험으로 기록할 수 있다.
발효는 실질적인 항생제 활성을 수득할 수 있는 정도의 시간동안 수행하는데, 일반적으로 72~120시간이면 충분하다.
[항생제의 분리 및 정제]
상기 발효 조건하에서 배양한 후, AB-011 항생제 및 그의 주성분인 AB-011a 및 AB-011b 항생제를 배양 브로쓰로부터 분리하고, 발효 분야에서 공지된 통상적인 방법에 의해 정제한다.
이러한 방법으로는, 발효 분야에서 공지된 통상적인 방법에 의해 정제한다.
이러한 방법으로는, 예를들면 용매 추출, 비용매 침전, 한외여과, 컬럼 크로마토그래피, 실리카겔 크로마토그래피, 셀룰로스 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 비이온성, 대공극 수지등에서의 크로마토그래피 등이 포함된다.
발효 동안에 제조된 항생제는 배양 브로쓰 및/또는 균사체에서 발견될 수 있다.
AB-011 항생제의 바람직한 회수 방법은 배양 브로쓰로부터 균사체를 여거하고, 분리된 균사체를 아세톤 또는 메탄올로 추출하고, 용매가 완전히 사라질 때까지 추출액을 진공에서 농축하여, 수성 현탁액을 수득하고, 배양 브로쓰와 합한다.
이렇게 수득된 AB-011 함유 용액을 유리섬유-페이퍼 필터에 여과한 후, 예를들면 XAD-2형(Rohm & Haas Co.)과 같은 비이온성 폴리스티렌수지 컬럼에 투수시켜 AB-011 항생제를 흡착시킨다.
그런후 수지를 그 밴드에 대해 2배 부피의 물로 세척하고, 밴드에 대해 3배 부피의 아세톤 : 물의 8 : 2(V/V) 혼합물로 용출시킨다.
보트리티스(Botrytis)에 대한 생물학적 활성 시험으로 확인된 AB-011 항생제 함유 분획을 서로 합한후 진공에서 농축 건조시켜, 실질적으로 AB-011a 항생제 및 AB-011b 항생제로 구성된 AB-011 항생제를 함유하는 원(raw) 생성물을 수득한다.
그런후, 순수한 AB-011a 항생제 및 AB-011b 항생제를 1ℓ당 KH2PO425밀리몰 및 1ℓ당 테트라메틸암모늄 클로라이드 7밀리몰을 함유하는 물로 이루어진 "A" 용리액에서 50%로부터 80%까지의 B 용리액의 직선, 구배를 사용하고, 매트렉스(MATREX) 실리카 C18형(스위스 Lausanne, Amicon Europe 제품)의 실리카로 채워진 컬럼을 이용하여 역상 크로마토그래피에 의해 원 생산물로부터 단리한다.
순수한 상태의 AB-011a 항생제 및 순수한 상태의 AB-011b 항생제를 함유하는 분액들을 메탄올이 완전히 사라질 때까지 진공에서 별도로 농축하고, 잔류 수용액을 2℃로 냉각하고 원심분리하여 AB-011a 및 AB-011b 항생제의 침전을 각각 수득한다.
각 용액으로부터 분리된 AB-011a 및 AB-011b 항생제를 물에 현탁시키고 다시 원심분리한 후, 상층액을 제거하고, 40℃, 진공에서 2시간동안 건조시켜, 순수한 AB-011a 항생제 및 순수한 AB-011b 항생제를 각각 수득한다.
[생물학적 활성]
AB-011 항생제 및 그의 성분, 즉 AB-011a 항생제 및 AB-011b 항생제는 항 미생물 활성, 특히 항진균 활성을 갖는다.
항진균 활성은 초본, 목본, 상업 및 원에 배양에서 출몰하는 식물 전염성 진균에 대해 특히 높다.
AB-011 항생제의 시험관내 및 생체내 항 미생물 활성은 하기 방법으로 결정한다.
시험관내 활성 시험
AB-011 항생제의 항미생물 활성을 통상적인 방법에 의해 액체 성장 배지에서 적당히 희석하여 결정한다.
표 D에 최소 억제 농도를 기록한다.
식물 병원성 진균에 대해, 조절 조건하, 한천 배지에서, 대조와 비교하여 90% 균사 성장의 감소를 일으키는 AB-011 항생제의 최소 농도를 결정한다.
표 D
Figure kpo00008
[생체내 살진균 활성]
생체내 살진균 활성은 하기 방법으로 측정한다. 20% V/V 물-아세톤 용액내 AB-011 항생제를 조정룸(Conditioned room)내 화분에서 성장한 식물의 입중 하부에 살포한다.
하루 후, 시험 진균의 접종물을 식물의 잎중 상부에 살포하고, 조정 룸 내 보온 조건하에서 약 8일동안 방치한다.
그런후, 검염의 심각성 정도를 100(건강한 식물)에서 0(완전히 감염된 식물)까지의 평가 범위로 점수를 매겨 평가한다.
생체내 예방 활성에 대한 자료를 표 E에 기록한다.
표 E
Figure kpo00009
각 항생제, 즉 AB-011a 및 AB-011b 를 사용하여 매우 유사한 항진균 활성 결과를 얻는다.
실용화를 목적으로, 농업 및 다른 분야에서 모두, 본 발명의 항생제를 적당한 조성물로 적당히 사용해야 한다.
이 조성물은 유효 성분으로서 본 발명의 항생제 뿐만 아니라, 불활성 고체 담체(예. 고령토, 실리카, 활석, 애타펄자이트, 규조토 등), 또는 불활성 액체 담체(유기용매, 식물 또는 천연 오일, 물 및 그의 혼합물), 및 조제분야에서 일반적으로 사용되는 계면활성제, 현탁제, 분산제 및 습윤제와 같은 가능한 다른 부가제를 함유한다.
특별한 사용 목적으로, 또는 조성물의 작용범위를 넓히기 위해, 다른 살충제, 살비제, 살진균제 또는 비료와 같은 다른 유효 성분을 동일한 조성물에 가할 수 있다.
사용량은 감염 형태 및 정도, 사용되는 조성물의 형태, 기후 및 환경인자와 같은 다른 요인에 따라 다양하다.
농업용으로는, 10~500g/ha 범위의 항생제 투여량일 때 만족스러운 결과가 얻어진다.
하기 실시예는 본 발명의 범위를 제한하지 않고 설명할 목적으로 제시되는 것이다.
[실시예 1]
스트렙토미세스 에스. 피. NCIB 12629 균주의 발효
싱기 "V" 배지 내지 5ml의 스트렙토미세스 에스. 피. NCIB 12629 배양액을 함유하는 하나의 앰플(-20℃, 10% 글리세롤에서 보관)을 사용하여 150ml의 "V" 배지를 접종하고 28℃, 회전 교반기 (150rpm)에서 72시간동안 보온한다.
이 배양액을 7ℓ의 "S" 배지를 함유하는 발효기(약 10ℓ 부피)에 접종시키고 , 온도 29℃, 공기 유량 120ℓ/시간, 회전율 320rpm, 발효시간 96시간의 조건하에서 0.01g/ℓ 의 트윈(Tween) 2000을 가하여 거품억제제로 작용시킨다.
이렇게 수득된 발효 브로쓰를 페이퍼에 여과시켜 균사체를 분리한다.
연속 정제 조작을 위해, 상기 조건하에서 4회 발효에서 수득된 총 부피 28ℓ를 사용한다.
AB-011 항생제의 분리
28ℓ의 발효 브로쓰를 왓트만 GF/D 유리섬유 필터에 여과시키고, 분리된 균사체를 아세톤으로 추출한다.
아세톤성 추출액을 용매가 완전히 사라질때까지 진공에서 농축하고, 잔류 수용액을 이전에 여과된 브로쓰와 합한다.
이렇게 수득된 용액을 잔류 분획에 3.2ℓ가 남을 때까지 GR-61 막(컷-오프 20,000)에서 한외 여과시킨다.
잔류 분획을 물을 사용하여 25ℓ로 희석하고, 동일한 조건하에서 다시 한외 여과시켜, 20.5ℓ의 투과액을 수득한다.
한천에서의 보트리티스 성장 억제를 측정함으로써 활성을 계산했을때, 활성 시험에서 활성이 거의 없는 4.0ℓ의 두번째 잔류 분획을 따라 버린다.
25ℓ의 첫번째 한외여액을 잔류 분획에 3.6ℓ가 남을때까지 GR-90 막(컷-오프 2000)에서 농축시키는 반면에, 보트리티스에서 활성이 거의 없는 한외여액(21.0ℓ)을 따라 버린다. 대조적으로 잔류 분획은 60%의 초기 활성을 함유한다.
두번째 한외여과 투과액(20.5ℓ)을 상기와 동일한 방법으로 GR-90 막(컷-오프 2000)에서 농축시키면서, 잔류물 3.0ℓ는 약 30%의 초기 활성을 함유한다.
상품명 디디에스-나크스코브(DDS-Nakskov, Danemark)에 속하는 GR-61 및 GR-90 막을 동일 회사의 랩(Lab)-20 모듈(module)에 사용한다.
두 잔류 분획(3.6ℓ+3.0ℓ)을 서로 합하고, 비이온성 폴리스티렌 수지 XAD-2(Rohm & Haas Co.)의 컬럼(직경 45mm, 수지베트의 높이 30cm)에서 투수시켜, AB-011 항생제를 흡착시킨다. 투수 동안에, 입구 유량을 100ml/시간으로 유지한다. 그런후, 수지를 그 베드에 대해 2배 부피의 물로 세척한 후, 그 베드에 대해 3배 부피의 8 : 2 V/V 아세톤/물 혼합물을 사용하여 용출시킨다.
보트리티스에 대한 생물학적 시험에 의해 확인된 AB-011 항생제 함유 분획을 합하고, 진공에서 농축건조시켜, 실질적으로는 AB-011a 항생제 및 AB-011b 항생제로 구성된 AB-011 항생제를 함유하는 원물질을 수득한다.
원 생성물을 300ml의 메탄올로 수집한 후, 300ml의 물을 가한다. 순수한 AB-011a 항생제 및 순수한 AB-011b 항생제를 25mM 일염기성 인산칼륨+7mM 테트라메틸-암모늄 클로라이드를 함유하는 물로 구성된 "A" 용리액 및 메탄올을 함유하는 "B" 용리액으로 형성된 용리계에서, 하기 표에 따른 구배를 사용하고, 메트렉스 실리카 C18형(스위스 Lausanne, Amicon Europe 제품)의 350g의 실리카로 채워진 컬럼을 사용하는 역상 크로마토그래피에 의하여 원 물질로부터 단리한다 :
Figure kpo00010
순수한 AB-011a 항생제는 3000~3320ml 용출 범위내에서 320ml 수집되는 반면에, AB-011b 항생제는 3700~4400ml 용출 범위내에서 700ml 수집된다.
수집된 분획을 메탄올이 완전히 사라질 때까지 진공에서 증발시킨 후, 4℃에서 24시간동안 방치한다. 이 용액으로부터, 원심분리에 의해 AB-011a 항생제 및 AB-011b 항생제 침전물을 각각 수집한 후, 물에 다시 현탁시키고, 원심분리한다.
건조후, 70mg의 연황색 분말 AB-011a 항생제 및 20mg의 진황색 분말 AB-011b 항생제를 수득한다.
생성물의 물리-화학적 특성은 상기에 기록되어 있다.
[실시예 2]
스트렙토미세스 에스. 피. NCIB 12629의 발효
스트렙토미세스 에스. 피. NCIB 12629 균주의 동결 건조된 앰풀을 무균 건조하에서 개봉하고, 멸균 증류수를 사용하여 다시 수화시킨다. 수득된 현탁액을 사용하여 상기 기재된 100ml의 "P" 배양 배지를 함유하는 500ml의 삼각 플라스크에 접종시킨 후, 28℃, 180rpm의 회전 교반기에서 90시간동안 보온한다.
그런후, 배양 브로쓰를 원심분리하여 균사체로부터 분리하고, 생물학적 시험을 한다.
[실시예 3]
스트렙토미세스 에스. 피. NCIB 12629의 발효
실시예 2에 기재된 대로 스트렙토미세스 에스. 피. NCIB 12629 균주의 동결-건조된 앰풀을 다시 수화 시키고, "P" 배양배지에 접종한다.
배양액을 28℃, 180rpm의 회전 교반기에서 72시간동안 보온한다.
수득된 배양액으로부터, 5ml를 사용하여 상술된 대로 100ml의 "S" 배양배지(SCM)를 함유하는 500ml 용량의 삼각 플라스크에 접종시킨 후, 28℃, 180rpm의 회전 교반기에서 120시간동안 보온한다.
그런후, 배양 브로쓰를 실시예 2에 따라 처리하고 생물학적 시험을 한다.
[실시예 4]
스트렙토미세스 에스. 피. NCIB 12629의 발효
상술된 대로, 25ml의 "P" 배양 배지(PMB)를 함유하는 100ml 용량의 삼각 플라스크에, 슬랩 또는 경사한천 "P" 배지로부터 무균 조건하에서 취한 스트렙토미세스 에스. 피. NCIB 12629 균주의 콜로니 일부를 접종시킨다.
그런후, 이 배양액을 28℃, 180rpm의 회전 교반기에서 72시간동안 보온한다. 보온된 배양액을 20ml의 동일한 "P" 배지를 함유하는 100ml 용량의 삼각 플라스크에 5% 농도로 접종시키고, 전체를 실시예 2와 동일한 조건하에서 120시간동안 보온한다.
그런후, 배양 브로쓰를 실시예 2와 동일한 방법으로 처리하고, 생물학적 시험을 한다.

Claims (10)

  1. (a) 디메틸술폭시드 및 (1 : 1 V/V) 에탄올/물 또는 (1 : 1 V/V) 메탄올/물 혼합물[V/V=부피/부피]에 잘 용해되고, 물에는 잘 용해되지 않으며, 에탄올과 메탄올에는 다소 잘 용해됨;
    (b) 근사 원소 분석(% 값으로 나타냄) :
    탄소 : 58.86
    수소 : 7.64
    질소 : 1.11;
    (c) 분자량 : 1,197.65;
    (d) 0.029mg/ml 농도의 메탄올에서의 U.V. 최대 흡수 피크 :
    350.4nm에서 2.269; 332.6nm에서 2.197; 317.3nm에서 1.403; 303.3nm에서 0.679; 381.1nm에서 0.118; 405.6nm에서 0.097;
    (e) 적외선 최대 흡수 피크(cm-1) :
    3421, 2960, 2930, 2855, 2035, 1718, 1634, 1570, 1448, 1403, 1383, 1340, 1302, 1268, 1168, 1063, 1036, 1009, 989, 906, 848, 794, 575, 526, 473;
    (f)1H-N.M.R. 스펙트럼, 주 피크 :
    δTMS(ppm) : 6.45~6.10*(m,8H); 5.92(m,1H); 5.69(m,1H); 5.41(m,2H); 5.15(m,1H); 4.92(m,1H); 4.77~4.22(m,6H); 4.22~3.45*(m,8~10H); 3.37~3.07*(m,6~7H); 3.02(t,1H); 2.93(t,1H); 2.88~2.72*(m,3H); 2.45~2.27*(m,3~4H); 2.27~2.05*(m,3H); 2.05~1.85*(m,3H); 1.85~1.66*(m,1H); 1.66~1.15*(m,30~33H); 1.10(d,3H); 0.99(d,3H); 0.90(m,6H).
    (g)13C-N.M.R. 스펙트럼, 주 피크 :
    δTMS(ppm) : 208.6(s); 176.3(s); 170.3(s); 135.8(d); 134.6(d); 133.5(d); 133.2(d); 132.9(d); 132.7(d); 131.7(d); 131.4(d); 130.0(d); 129.5(d); 100.3(d); 99.8(d); 97.4(s); 97.3(d); 87.1(d); 84.4(d); 79.9(d); 75.0(d); 73.5(d); 73.1(d); 72.1(d); 70.7(d); 70.0(d); 69.0(d); 67.1(d); 66.1(d); 65.9(d); 64.0(d); 58.1(d); 56.9(q); 56.3(d); 51.6(t); 50.5(t); 44.7(t); 43.0(t); 42.5(t); 39.7(d); 39.4(d); 39.0(t); 37.5(t); 36.3(t); 34.4(t); 32.1(t); 31.7(t); 29.3(t); 18.0(q); 17.9(q); 17.1(q); 16.0(q); 11.5(q).
    (h) 60F 254 슬랩[멀크-스쿠차르트(Merck-Schuchardt)] 상의 박막 크로마토그래피(TLC)에 의한 Rf값 :
    0.25[에탄올 : 디옥사 : 30% 암모니아 수용액 : 물(8 : 1 : 1 : 1)];
    0.0[메틸렌 클로라이드 : 메탄올(17 : 3)]
    멀크-스쿠차르트 RP-18F 254 슬랩에서 역상 크로마토그래피에 의한 Rf값 :
    0.29[메탄올 : 25Mm 일염기성 인산칼륨+7mM 테트라메틸-암모늄 클로라이드를 함유하는 수용액(8 : 2)]
    0.44[메탄올 : 아세토니트릴 : 25mM 일염기성 인산칼륨+7mM 테트라메틸-암모늄 클로라이드를 함유하는 수용액(4 : 4 : 2)]
    0.13[메탄올 : 인산을 사용하여 pH 7.5로 조정한 10mM 일염기성 인산암모늄 수용액(8 : 2)]
    0.44[메탄올 : 아세토니트릴 : 인산을 사용하여 pH 7.5로 조정한 10mM 일염기성 인산암모늄 수용액(4 : 4 : 2)]
    (i) 하기 조건하, 하이바 리-크로카르트 리-크로소르브 RP-18 컬럼상의 역상 HPLC에 의한 머무름 시간(Rt), 7분 :
    전컬럼 : 가드 팩 RCSS C 18
    용리액 : 물에 용해시킨 메탄올 : 아세토니트릴 : 25mM 일염기성 인산칼륨 수용액+7mM 테트라메틸-암모늄 클로라이드(4 : 4 : 2)
    유량 : 0.8ml/분
    온도 : 40℃
    임을 특징으로 하는 고체 물질인 AB-011a 항생제.
  2. (a) 0.04mg/ml 농도의 메탄올에서의 U.V. 최대 흡수 피크 :
    349.9nm에서 2.872; 332.4nm에서 2.747; 316.9nm에서 1.999; 303.3nm에서 0.987;
    (b) 진공하 40℃에서 2시간동안 방치한 시료에 대해 결정된, 근사 원소 분석(% 값으로 나타냄) :
    탄소 : 58.51
    수소 : 8.14
    질소 : 1.03;
    (c) 적외선 최대 흡수 피크(cm-1) :
    3415, 2926, 2855, 2060, 1721, 1634, 1568, 1450, 1406, 1383, 1302, 1264, 1190, 1168, 1063, 1036, 1007, 988, 906, 847, 804, 722, 664, 618, 576, 509, 471, 446;
    (d) 분자량 : 1,181;
    (e)1H N.M.R. 스펙트럼, 주 피크 :
    δTMS(ppm) : 6.45~6.05(m,8H); 5.93(m,1H); 5.70(m,1H); 5.40(m,2H); 5.13(m,1H); 4.73~4.30(m,6H); 4.27~3.45*(m,8~9H); 3.37~3.09*(m,6~7H); 3.02(t,1H); 2.94(t,1H); 2.75~2.60*(m,1H); 2.44~2.28*(m,3H); 2.28~1.81*(m,7~8H); 1.81~1.47*(m,5H); 1.47~1.16*(m,30~33H); 1.1(d,3H); 0.99(d,3H); 0.91(m,6H).
    (f)13C-N.M.R. 스펙트럼, 주 피크 :
    δTMS(ppm) : 208.7(s); 176.3(s); 174.9(s); 170.4(s); 135.7(d); 134.7(d); 133.5(d); 133.3(d); 132.9(d); 132.7(d); 131.7(d); 131.5(d); 130.0(d); 129.5(d); 103.3(d); 100.0(d); 97.4(s); 96.9(s); 87.2(d); 84.5(d); 80.0(d); 75.1(d); 74.9(d); 73.1(d); 72.2(d); 70.7(d); 70.0(d); 69.0(d); 68.5(d); 67.8(d); 67.1(d); 65.9(d); 65.7(d); 63.9(d); 58.1(d); 56.9(q); 56.2(d); 51.5(t); 50.7(t); 46.5(t); 44.7(t); 42.5(t); 39.1(t); 38.5(t); 38.0(t); 36.3(t); 34.1(t); 32.3(t); 31.8(t); 31.6(t); 29.3(t); 18.1(q); 18.0(q); 17.9(q); 17.4(q); 16.3(q); 11.6(q).
    (g) 60F 254 슬랩(멀크-스쿠차르트) 상의 박막 크로마토그래피에 의한 Rf 값 :
    0.32[에탄올 : 디옥산 : 30% 암모니아 수용액 : 물(8 : 1 : 1 : 1)];
    0.00[메틸렌 클로라이드 : 메탄올(17 : 3)]
    멀크-스쿠차르트 RP-18F 254 슬랩상의 역상 크로마토그래피에 의한 Rf 값 :
    0.22[메탄올 : 25mM 일염기성 인산칼륨+7mM 테트라메틸-암모늄 클로라이드를 함유하는 수용액(8 : 2)]
    0.35[메탄올 : 아세토니트릴 : 25mM 일염기성 인산칼륨+7mM 테트라메틸-암모늄 클로라이드를 함유하는 수용액(4 : 4 : 2)]
    0.08[메탄올 : 인산을 사용하여 pH 7.5로 조정된 10mM 일염기성 인산암모늄 수용액(8 : 2)]
    0.20[메탄올 : 아세토니트릴 : 인산을 사용하여 pH 7.5로 조정된 10mM 일염기성 인산암모늄 수용액(4 : 4 : 2)]
    (h) 하기 조건하, 하이바 리-크로카르트 리-크로소르브 RP-18 컬럼상의 역상 HPLC에 의한 머무름 시간(Rt), 9분;
    전컬럼 : 가드 팩 RCSS C 18
    용리액 : 메탄올 : 아세토니트릴 : 25mM 일염기성 인산칼륨 수용액+7mM 테트라메틸-암모늄 클로라이드(4 : 4 : 2)
    유량 : 0.8ml/분
    온도 : 40℃
    임을 특징으로 하는 고체 물질인 AB-011b 항생제.
  3. 탄소원, 질소원 및 무기염원을 함유하는 수성 영양 배지에서 스트렙토미세스 에스. 피.(Streptomyces s. p.) NCIB 12629, 또는 그의 해당 변이체를 호기적 조건하에서 한정 배양함으로써 얻을 수 있는, 청구범위 제1항 및 제2항에 정의된 바의 AB-011a 항생제 및 AB-011b 항생제로 구성된 AB-011 항생제.
  4. 동화될 수 있는 탄소원, 질소원 및 무기염원을 함유하는 수성 영양 배지에서 스트렙토미세스 에스. 피. NCIB 12629, 또는 그의 해당 변이체를 호기적인 한정 발효 조건하에서 항생 활성을 얻기에 충분한 72~120시간동안 배양하는 단계, 그리고 이후 공지의 방법에 의해 하기 항생제를 회수하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 AB-011 항생제의 제조방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 발효를 25~30℃의 범위내의 온도에서 수행함을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 4 항에 있어서, 발효를 5~9의 범위내의 pH에서 수행함을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 4 항에 있어서, AB-011 항생제를 발효 브로스로부터 여과하고 이후 크로마토그래피에 분리함을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 4 항에 있어서, AB-011a 항생제 및 AB-011b 항생제를 25mM/ℓ의 KH2PO4및 7mM/ℓ 의 (CH3)4NCl을 함유하는 물로 구성된 혼합물에서 메탄올 50%로부터 80%까지의 직선 구배의 용리계를 사용하는 실리카 겔 컬럼에서의 역상 크로마토그래피에 의해 분리함을 특징으로 하는 방법.
  9. 스트렙토미세스 에스. 피. NCIB 12629 미생물.
  10. 유효 성분으로서 AB-011 항생제, AB-011a 항생제 및 AB-011b 항생제에서 선택된 화합물을 불활성 고체 또는 액체 담체, 및 임의로 다른 부가제와 함께 함유하는 살진균 조성물.
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