KR0140218B1

KR0140218B1 - Ab-o21 항생제 및 그의 제조방법

Info

Publication number: KR0140218B1
Application number: KR1019890017773A
Authority: KR
Inventors: 시다리아 단테; 안드리올로 눈지오; 그레스타니 엔리코; 스페라 실비아; 가라바글리아 카를로; 피랄리 기오르기오; 콘팔로니에리 지오반니; 카싸니 기오르기오
Original assignee: 루이기 코티
Priority date: 1988-12-01
Filing date: 1989-12-01
Publication date: 1998-07-01
Also published as: ES2067520T3; CA2004197C; IL92452A0; IT1227657B; CA2004197A1; DE68920973D1; KR900009992A; IL92452A; ATE118011T1; EP0371509A2; US5126265A; JPH02288889A; AU4571989A; EP0371509B1; AU636317B2; IT8822808A0; BR8906050A; ZA899034B; DE68920973T2; EP0371509A3

Abstract

내용없음

Description

AB-021 항생제 및 그의 제조방법

제1도는 AB-021a 항생제의 U.V. 흡수 스펙트럼을 나타낸다.

제2도는 AB-021a 항생제의 I.R. 흡수 스펙트럼을 나타낸다.

제3도는 AB-021a 항생제의¹H N.M.R. 스펙트럼을 나타낸다.

제4도는 AB-021a 항생제의¹³C N.M.R. 스펙트럼을 나타낸다.

제5도는 AB-021a 항생제의 열 무게 분석을 나타낸다.

제6도는 AB-021b 항생제의 U.V. 흡수 스펙트럼을 나타낸다.

제7도는 AB-021b 항생제의 I.R. 흡수 스펙트럼을 나타낸다.

제8도는 AB-021b 항생제의¹H N. M. R. 스펙트럼을 나타낸다.

제9도는 AB-021b 항생제의¹³C N.M.R. 스펙트럼을 나타낸다.

제10도는 AB-021b 항생제의 열 무게 분석을 나타낸다.

본 발명은 AB-021 항생제로 약칭한 항생물질 및 그의 주성분인 AB-021a 항생제 및 AB-021b 항생제에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 스트렙토미세스 에스피. (Streptomyces sp.) NCIB 40068 의 발효에 의한 AB-021 항생제의 제조 방법 및 그에 민감한 미생물로 인한 감염성 질환의 치료에 있어서의 그 용도에 관한 것이다.

AB-021 항생제뿐만 아니라 그의 성분, 즉 AB-021a 항생제 및 AB-021b 항생제는 종래 공지된 다른 항생제와는 다르다.

본 발명에서 사용되는 용어 AB-021 항생제 는 하기의 특정 조건하에서 스트랩토미세스 에스피. NCIB 40068 의 발효에 의해 제조되고, 예를 들면, 항진균 및 / 또는 항세균형과 같은 생물학적 활성이 부여된 모든 성분의 혼합물을 나타낸다.

상기 생물학적 활성 성분은 여기에 국한되는 것이 아니지만 혼합물로부터 단리될 수 있는, AB-021a 항생제 및 AB-021b 항생제 로 제시되는 것을 포함한다.

발효분야에서 통상적인 지식을 가진 사람들에게는 AB-021 항생제를 형성하는 성분의 수 및 상호 비율은 발효조건 (예를들면, 배양배지, 발효온도, 발효기간, 통기성과 같은 것) 및 사용된 세균주의 함수로서 다양할 수 있다는 사실이 잘 알려져 있다.

또한, 본 발명은 스트랩토미세스 에스피. NCIB 40068 의 사용에 국한되지 않으며, AB-021 항생제를 생산하는 조건에서 상기 미생물의 천연 또는 인공 변종 및 / 또는 변이체의 사용 또한 포함한다는 점을 이해해야 한다.

그러므로, 본 발명의 목적은 호기조건하, 탄소, 질소 및 무기염원 및 미량의 금속을 함유하는 수성 영양배양 배지에서 스트렙토미세스 에스피. NCIB 40068, 또는 그의 자연 또는 인공 변종 또는 변이체 중 어느 하나를 조절 배양한 후, 상기 항생제 / 및 그의 주성분인 AB-021a 및 AB-021b 항생제를 분리함으로써 수득 할 수 있는 AB-021 항생제이다.

AB-021a 항생제의 물리 - 화학적 특성

AB-021 항생제의 한 성분인 AB-021a 항생제는 하기특징을 갖는 연황색 분말이다 :

(a) 디메틸술폭시드 및 ( 1:1 V/V ) 에탄올 / 물 또는 ( 1:1 V/V ) 메탄올 / 물 혼합물 ( V/V = 부피/부피 )에 잘 용해되고, 물에는 잘 용해되지 않으며, 에탄올 및 메탄올에는 다소 잘 용해된다 :

(b) 진공, 40℃에서 2 시간 동안 방치한 시료를 결정한 대략의 원소분석을 % 값으로 나타내면

탄소 : 64.3

수소 : 9.15

질소 : 1.04 ;

로서 황 및 인을 함유하지 않는다 ;

(c) 하기 조건하 (M-H)^-에 대해 1138에서 피크를 나타내는 FAB - MS 스펙트럼으로 계산하여 분자량은 약 1139 이다 :

- 9.5 kV에서 음이온, FAB, Xe

- 매트릭스 : 글리세롤

- 핀니간 매트 (Finnigan Mat) 8428 ;

(d) U.V. 흡수 스펙트럼은 첨부된 도면 중 제 1 도에 제시한다. 최대 흡수피크는 0.025mg/ml 농도의 1:1 (V/V)아세토니트릴 : 물에서, 232.8nm에서 0.193 ; 318.4nm에서 2.064 ; 332.6nm에서 2.44 ; 349.6nm에서 2.113 이다 ;

(e) KBr 펠렛에서의 적외선 (I.R.) 흡수 스펙트럼은 첨부된 도면중 제 2 도에 제시하며, 최대흡수 (cm^-1)는 하기와 같다 :

3365; 3015; 2923; 2851; 1700; 1634; 1594; 1541; 1431; 1380; 1329; 1262; 1128; 1095; 1056; 1004; 968; 919; 878; 843; 804; 754;

(f)¹H. N. M. R. 스펙트럼은 제 3 도에 제시하며, 소량의 사중 수소 아세트산이 첨가된 육중수소 - 디메틸 술폭시드 (DMSOd6)에서 부룩커 에이엠 (BRUKER AM) 300 MHz 분광계를 사용하여 기록된 신호를 나타낸다.

화학적 이동은 δTMS=2.56ppm에서 육중수소-디메틸 술폭시드의 중심 피크를 내부표준으로 사용하여 TMS = 0.00ppm (δ TMS)에 대해 간접적으로 나타낸다.

δ TMS(ppm) : 7.18(d, 1H); 6.69(dd, 1H); 6.59(dd, 1H); 6.52∼6.09(m, 9H); 5,96∼5.70(m, 3H); 5.70∼5.31(m, 8H); 4.27∼4.02(m, 4H); 4.02∼3.82(m, 4H); 3.82∼3.58(m, 4H); 3.30(t, 1H); 2.82(t, 2H); 2.73∼2.45 (*)(m,3H);2.41∼1.98(m,13H);1.91(s,3H);1.79∼1.12(m,24-25H);1.00(d,3H); 0.95(d, 3H); 0.89(d, 3H); 0.85(d3H);

범위내 (*)는 DMSOd6 피크도 포함하는 것이다.

(g)¹³C N.M.R. 스펙트럼은 제 4 도에 제시하며, 소량의 사중수소 아세트산이 첨가된 육중수소 - 디메틸술폭시드 (DMSOd6)에서 브룩커 에이엠 300 MHz 분광개를 사용하여 기록된 신호를 나타낸다.

화학적 이동은 δTMS = 39.85ppm에서 육중수소 - 디메틸술폭시드의 중심피크를 내부표준으로 사용하여 TMS = 0.00 ppm (δ TMS)에 대해 간접적으로 나타낸다.

다중 기호에 대한 자료는 45°, 90° 및 135°에서 DEPT 시험을 사용하여 얻는다.

δ TMS (ppm) : 212.1 (S); 169.9 (S); 138.8 (d); 138.5 (d); 137.0 (d); 136.9 (d);136.7 (d); 136.1 (d); 135.9 (d); 135.9 (d); 134.0 (d); 133.3 (d); 133.0 (d); 132.9 (d); 132.5 (d); 132.4 (d); 132.0 (d); 131.5 (d); 131.0 (d); 131.0 (d); 129.3 (d); 128.9 (d); 128.0 (d); 126.7 (d); 126.4 (d); 125.3 (d); 75.3 (d); 72.3 (d); 71.2 (d); 70.6 (d); 69.7 (d); 68.9 (d); 68.4 (d); 68.0 (d); 67.1 (d); 67.1 (d); 65.7 (d); 64.2 (d); 64.2 (d); 52.1 (d); 41.5 (d); 39.9 (d); 49.2 (t); 46.2 (t); 46.0 (t); 45.2 (t); 45.2 (t); 44.9 (t); 43.9 (t); 41.2 (t); 40.8 (t); 40.7 (t); 39.2 (t); 38.8 (t); 34.1 (t); 32.8 (t); 32.1 (t); 29.3 (t); 24.1 (t); 22.8 (q); 18.4 (q); 13.2 (q); 10.5 (q); 9.1 (q)

(h) 하기 용리계에서 키에셀겔 (Kieselgel) 60F 254 (Merck Schuchardt) 슬랩 및 역상 실리카슬랩 RP - 18F 254 (Merck Schuchardt) 상에서 15cm 의 용리액으로 전개시키는 박막크로마토그래피에서의 머무름 상수를 AB-021b 항생제와 비교, 제시한다 :

A 용리액 : 메탄올 : 아세토니트릴 : 물에 용해시킨 25mM 인산일수소나트륨 (4 : 4 : 2) ;

B 용리액 : 메탄올 : 아세토니트릴 : 물에 용해시킨 25mM 인산이수소칼륨 + 7 mM 테트라메틸 - 암모늄 클로라이드 (4 : 4 : 2) ;

C 용리액 : 메탄올 : 물에 용해시키고, 인산을 사용하여 pH 7.5로 조정한 10mM 인산일수소암모늄 (8 : 2) ;

D 용리액 : 메탄올 : 아세토니트릴 : 물에 용해시키고, 인산을 사용하여 pH 7.5로 조정한 10mM 인산일수소암모늄 (4 : 4 : 2) ;

E 용리액 : 에탄올 : 디옥산 : 30 % 암모니아수용액 : 물 (8 : 1 : 1 : 1) ;

F 용리액 : 메틸렌 클로라이드 : 메탄올 (17 : 3)

A. U.V. 광에서 형광 (366 nm)

B. 아니스알데히드 (T - 27 반응물)(Justus. G. Kirchner, Thin Layer Chromatography, 2nd Ed, John Wiley Sons 출판, p 205)

C. o - 아미노페놀 (T - 11 반응물)(상등, p 201)

(i) 하기조건하 역상 HPLC 칼럼상에서 분석 했을 때 머무름 시간 (Rt)은 약 8분이다 :

칼럼 : 하이바리크로카트트 리 - 크로소르브 RP - 18 (Hibar Lichro CART Li-Chrosorb RP - 18.7 미크론) 250 × 4.0mm ( Merck, Darmstadt, F. R. 독일)

전 칼럼 (Forecolumn) : 가드 백 (Guard Pak) RCSS C 18 (Millipore Waters)

용리액 : 메탄올 : 아세토니트릴 : 물에 용해시킨 10mM 인산일수소암모늄 (1:1:1) 유량 : 0.8ml/ 분

검출기 : U.V. 333nm

온도 : 40℃

동일한 조건하에서 약 11.8 분 후에 AB-021b 항생제가 용출된다.

(1) 페트킨 - 엘머 7 시리즈 ( PERKIN - ELMER 7 SERIES )

열분석계에서 30∼700℃의 온도범위내에서 20℃/분의 온도 증가율로, 질소하에서 열무게 분석을 수행하여, 제 5 도에 제시하는데, 가로축은 온도 (℃)이고, 세로축은 퍼센트 중량손실을 나타낸다.

제 5 도는 또한 곡선의 첫 번째 변화율을 나타낸다.

AB-021b 항생제의 물리 - 화학적 특성

AB-021 항생제의 한성분인 AB-021b 항생제는 하기특징을 갖는 진황색 분말이다 :

(a) U.V. 흡수 스펙트럼은 첨부된 도면중 제 6 도에 제시한다.

최대흡수는 0.02 mg/ml 농도의 1 : 1 (V/V)아세토니트릴 / 물에서, 369.0nm에서 0.90 ; 350.0nm에서 2.01 ; 332.6nm에서 2.21 ; 318.0nm에서 1.49 이다 ;

(b) 진공, 40℃에서 2 시간동안 방치한 시료를 결정한 대략의 원소분석을 % 값으로 나타낸다면 :

탄소 : 65.12

수소 : 8.65

질소 : 1.18

로서 황 및 인을 함유하지 않는다 :

(c) KBr 펠렛에서의 적외선 (I.R.)흡수 스펙트럼은 첨부된 도면 중 제 7 도에 제시하며, 최대흡수 (cm^-1)는 하기와 같다 :

3902, 3853, 3747, 3375, 3013, 2921, 2853, 2757, 1895, 1699, 1669, 1645, 1576, 1540, 1430, 1378, 1324, 1261, 1160, 1094, 1059, 1004, 969, 919, 878, 843, 803, 779, 697:

(d) 하기조건하 (M-H)^-에 대해 1164에서 프크를 나타내는 FAB-MS 스펙트럼으로 계산하여 분자량은 약 1165 이다 :

- 9.5 kV에서 음이온, FAB, Xe

- 매트릭스 : 글리세롤

- 핀니간 매트 8424 ;

(e)¹H N. M. R. 스펙트럼은 첨부된 도면중 제 8 도에 제시하며, 소량의 사중수소 아세트산이 첨가된 육중수소 - 디메틸술폭시드 (DMSOd6)에서 브룩커 에이엠 300 MHz 분광계를 사용하여 기록된 신호를 나타낸다.

화학적 이동은 δTMS=2.56ppm 에서 육중수소-디메틸술폭시드의 중심피크를 내부표준으로 사용하여 TMS=0.00ppm 에 대해 간접적으로 나타낸다.

δTMS (ppm) : 7.21 (d, 1H); 6.75 (dd, 1H); 6.63 (dd, 1H); 6.57∼6.07 (m, 11H); 5.93∼5.70 (m, 3H); 5.70∼5.33 (m, 8H); 4.25∼4.02 (m, 4H); 4.02∼3.83 (m, 4H); 3.83∼3.59 (m, 4H); 3.29 (t, 1H); 2.82 (t, 2H); 2.72∼2.44 (*) (m, 6-7H); 2.41∼2.00 (m, 14H); 1.92 (s, 3H); 1.80∼1.14 (m, 21H); 1.00 (d, 3H); 0.95 (d, 3H); 0.84 (d, 3H). 범위내 (*)는 DMSOd6 피크도 포함하는 것이다.

(f)¹³C N. M. R. 스펙트럼은 여기에 첨부된 도면중 제 9 도에 제시하며, 육중수소 - 디미틸술폭시드 (DMSOd6)에서 브룩커에 이엠 300 MHz 분광계를 사용하여 기록된 신호를 나타낸다.

화학적 이동은 δ TMS=39,85 ppm에서 육중수소 - 디메틸술폭시드의 중심피크를 내부표준으로 사용하여 TMS=0.00ppm (δ TMS)에 대해 간접적으로 나타낸다. 다중 기호에 대한 자료는 45°, 90° 및 135°에서 DEPT 시험을 사용하여 얻는다.

δ TMS (ppm) : 212.0 (s); 169.2 (s); 139.1 (d); 138.1 (d); 137.1 (d); 136.7 (d); 136.2 (d); 135.8 (d); 135.8 (d); 135.1 (d); 133.8 (d); 133.1 (d);132.8 (d); 132.8 (d); 132.6 (d); 132.3 (d); 132.2 (d); 132.1 (d); 131.8 (d); 131.2 (d); 130.9 (d); 130.8 (d); 129.2 (d); 128.7 (d); 127.9 (d); 126.4 (d); 126.2 (d); 125.2 (d); 75.4 (d); 72.6 (d); 71.0 (d); 70.6 (d); 69.6 (d); 68.9 (d); 68.4 (d); 68.0 (d); 67.3 (d); 67.2 (d); 65.6 (d); 64.4 (d); 64.4 (d); 51.9 (d); 41.3 (d); 39.6 (d); 49.2 (t); 45.8 (t); 45.7 (t); 45.0 (t); 44.9 (t); 44.7 (t); 43.6 (t); 41.1 (t); 40.7 (t); 40.5 (t); 39.0 (t); 38.7 (t); 33.9 (t); 32,5 (t); 31,9 (t); 29.0 (t); 23.9 (t); 18.1 (q); 12.8 (q); 10.4 (q); 8.7 (q).

(g) 페르킨 - 엘머 7 시리즈 열 분석 계에서 30∼700℃ 의 온도 범위내에서 20℃/ 분의 온도 증가율로, 질소하에서 열무게 분석을 수행하여, 제 10 도에 제시하는데, 가로축은 온도 (℃) 이고, 세로축은 퍼센트 중량손실을 나타낸다.

제 10 도는 또한 곡선의 첫 번째 변화율을 나타낸다.

(h) 박막 크로마토그래피에서의 머무름 상수 (Rf) 및 역상 HPLC 칼럼에서의 머무름 시간 (Rt) 은 AB - 021a 항생제의 물리 - 화학적 특성이 기술된 (h)및(i)난에 각각 기술되어 있다.

[특성]

미생물 스트렙토미세스 에스피. NCIB 40068 은 통상명 SD - 505W 로 카펠라 디 테르자 (Cappella di Terza, Novara)에서 수집된 토양시료로부터 단리한다.

본 미생물의 배양액은 부다페스트 조약하에 1988년 9월 29일, 내서날 콜렉션 오브 인더스트리알 박테리아 ( The National Collection of Industrial and Marine Bacteria Ltd., 영국 스코틀랜드 Aberdeen AB 98 DG, 135 Abbey Road, P. O. Box 31, Torry Research Station ) 에 기탁하여, 수탁번호 NICB 40068을 받았다.

균주의 형태학적 특성은 표 A 에 제시한다(배양배지명은 인터내셔날 스트렙토미세스 프로그램에 기록된 것에 따른다).

표 B 및 C 에 이균주의 몇몇 특성을 기재한다.

문헌(M. P. Starr, H. Stolp, H. G. Truper, A. Ballows, H. G. Shegel, The Prokaryotes vol. II Streptomycetacee, Springer Verlag Ed., 1981)에 기술된 방법에 따라 스트렙토미세스 에스피. NCIB 40068의 세포벽을 분석한다.

이러한 분석으로 당에 관한 특성이 없다고 밝혀져서, SD - 505W 균주는 스트렙토미세스 속에 속하는 것을 확인하였다.

다른 미생물과 마찬가지로, 스트렙토미세스 에스피. NCIB 40068은 자연적 또는 인공적 변동 및/ 또는 변이가 일어날 수 있다.

예를들면, 인공변종 또는 변이체는 아질산, 니트로소 - 구아니딘, 할로겐화알킬아민 등과 같은 화학적 변이 유발제 또는 X 선 또는 U.V. 광, 고주파와 같은 물리적 변이 유발제로 미생물을 처리하여 수득할 수 있다.

자연 발생적 변종 또는 변이체는 또한 스트렙토미세스 에스피. NCIB 40068에서 얻은 다른 콜로니를 단리 및 선별하여 수득할 수 있다.

스트렙토미세스 종에 속하고, AB - 021 항생제를 생산하는 천연원 또는 인공의 모든 변종 및/ 또는 변이체는 스트렙토미세스 에스피. NCIB 40068 미생물과 동등한 것으로 간주하며, 본 발명의 범주에 속한다.

[AB-021 항생제의 제조방법]

AB-021 항생제의 제조방법은 조절된 호기성 발효 조건화, 수성 영양 배지에서 스트렙토미세스 에스피. NCIB 40068 또는 그에 해당하는 자연 발생의 또는 인공 변종 또는 변이체를 배양한 후, 본질적으로 공지된 방법에 의해 상기 AB-021 항생제를 분리함을 특징으로 한다.

항생제 제조에서 통상적으로 사용되는 영양 배양 배지 또는 발효 브로쓰를 사용할 수 있지만, 몇몇 배양 배지가 바람직하다.

상기 배양 배지는 스트렙토미세스 속의 미생물에 의해 동화될 수 있는 탄소 및 질소 원을 함유해야만 하며, 또한 저수준의 무기염을 함유해야만 한다.

그것은 또한 미생물의 성장 및 발달에, 및 항생제 제조에 필요한 미량의 금속을 함유해야 한다.

상기 미량의 금속은 세균 성장을 위해 배양 배지에 공급된 탄소 및 유기질소원에 불순물로 이미 존재할 수 있거나, 필요할때에는 배양 배지에 가할 수 있다.

탄소원으로서, 일반적으로 탄수화물을 사용할 수 있는데, 특히, 예를들면 덱스트로스 또는 말토스, 또는 둘중하나, 또는 보족물과 같은 다당류, 전분 및 예를들면, 덱스트린, 가용성 전분과 같은 상업적 견지에서 전분으로 동화될 수 있는 산물 또는 예를들면, 글리세롤과 같은 폴리 알콜일 수 있다.

상기 화합물을 개별적으로 또는 서로 조합하여 사용할 수 있다.

상기 화합물은 각각, 또는 다양한 비율로 조합하여 사용할 수 있다.

배양 배지내 탄소원의 농도 및 형태는 일반적으로 상기 배지내에 함유된 다른 성분의 형태 및 양에 따라 좌우되지만, 어쨌든 일반적으로 0.5∼5 중량 % 범위의 농도가 바람직하다.

유기질소원으로는 예를들면, 효모 추출액, 육즙 또는 카제인 가수분해물과 같은 단백질성 추출액 및 예를들면, 콩가루와 같은 곡류 또는 프로플로, 옥수수 침지액 또는 증류 용해물(Distiller's Solubles) 과 같은 시판물을 사용할 수 있다.

이 화합물을 각각, 또는 서로 다양한 비율로 조합하여 사용할 수 있다. 배양 배지내 농도는 0.2∼6 중량 %의 범위내에 포함될 수 있다.

무기염으로는, 예를들면 인산염, 황산염, 염산염, 탄산염 및 질산염과 같은 나트륨염, 칼륨염, 마그네슘염, 암모늄염, 칼슘염을 사용할 수 있다.

배양 배지에 함유된 미량 금속, 예를들면 코발트, 철, 망간 등을 사용할 수 있다.

스트렙토미세스 에스피. NCIB 40068 에 의한 AB-021 항생제의 제조를 자극할 수 있는 특별한 능력을 보이는 몇가지 배양 배지중에서, 예를들면 하기 수성 제제를 언급할 수 있는데, 이것을 하기 제조예에서 사용한다.

스트렙토미세스 에스피. NCIB 40068 균주는 20∼35℃, 바람직하게는 25∼30℃의 온도범위에서 배양 및 발효 시킬 수 있다.

값은 일반적으로 약 5∼약 9의 범위일 수 있다.

배양 배지에 주입된 멸균 공기는 일반적으로 배지내 산소 농도를 20% 포화 값 보다 높게 유지할 수 있는 양으로 사용한다.

발효 동안의 AB-021 항생제 제조는 이 항생제에 민감한 미생물 및 진균 종을 사용하여 브로쓰 시료에 대한 항생제 활성의 시험으로, 또는 HPLC 분석으로 기록할 수 있다.

발효는 실질적인 항생제 활성을 수득할 수 있는 정도의 시간 동안 수행하는데, 일반적으로 24∼150 시간이면 충분하다.

[항생제의 분리 및 정제]

상기 기재된 발효 조건하에서 배양한 후, AB-021 항생제 및 그의 주성분인 AB-021a 항생제 및 AB-021b 항생제를 배양 브로쓰로부터 분리하고, 발효 분야에서 공지된 통상의 방법에 의해 정제한다.

이러한 방법으로는, 예를들면 용매추출, 비용매 침전, 한외여과, 칼럼크로마토그래피, 실리카겔크로마토그래피, 셀룰로스크로마토그래피, 역상크로마토그래피, 비이온성, 대공극 수지등에서의 크로마토그래피 등이 포함된다.

발효동안에 제조된 항생제는 배양브로쓰 및/또는 균사체 덩어리에서 발견될 수 있다.

AB-021 항생제의 바람직한 회수 방법은 배양 브로쓰로부터 균사체를 여거하고, 분리를 아세톤 또는 메탄올로 추출 하고, 용매가 완전히 사라질때까지 추출액을 진공에서 농축하여, 수성 현탁액을 수득한다.

이렇게 수득된 AB-021 항생제 - 함유 배양 브로쓰를 유리섬유 필터에 여과한 후, 예를들면 XAD - 2수지 (Rohm Haas Co.) 와 같은 비이온성 폴리스티렌 수지 칼럼에 투시시켜 AB-021 항생제를 흡착시킨다.

그런후 수지를 그 베드에 대해 2 배 부피의 물로 세척하고, 베드에 대해 3 배 부피의 아세톤 : 물의 8 : 2 (V/V) 혼합물로 용출시킨다.

보트리티스 (Borytis) 에 대한 생물학적 활성 시험으로 확인된 AB-021 항생제 - 함유분획을 서로 합한후 용매가 사라질 때까지 진공에서 농축시키고 수득된 수성 현탁액을 이전에 균사체로부터 수득한 분획과 합하여 AB-021 항생제를 함유하는 원 (raw) 산물을 수득한다.

그런후, 순수한 AB-021a 항생제 및 순수한 AB-021b 항생제 두 성분을 10mM 인산 일수소암모늄을 함유하는 물로 이루어진 A용리액, 및 메탄올로 이루어진 B용리액으로 형성된 용리계에서, A 용리액에서 30%로부터 70%까지의 B용리액의 직선구배를 사용하고, 매트렉스 (MATREX) 실리카 C18 형 ( 스위스 Lausanne, Amicon Europe 재품)의 실리카로 채워진 칼럼을 이용하고 역상 크로마토그래피에 의해 원산물로부터 단리한다.

순수한 상태의 AB-021a 항생제 및 순수한 상태의 AB-021b 항생제를 함유하는 분획들을 메탄올이 완전히 사라질때까지 진공에서 별도로 농축하고, 잔류 수용액을 2℃로 냉각하고 원심분리하여 AB-021a 항생제 및 AB-021b 항생제의 침전을 각각 수득한다.

각 용액으로부터 분리된 AB-021a 항생제 및 AB-021b 항생제를 물에 현탁시키고 다시 원심분리한 후, 상층액을 제거하고, 40℃, 진공에서 2 시간동안 건조시켜, 순수한 AB-021a 항생제 및 순수한 AB-021b 항생제를 각각 수득한다.

[생물학적 활성]

AB-021 항생제 및 그의 성분, 즉 AB-021a 항생제 및 AB-021b 항생제는 항진균 및 항세균 활성을 갖는다.

항진균활성은 곡초, 과쇼　수 및 원예작물의 농지 경작을 감염시키는 식물 병원성 진균 뿐만 아니라, 인간의 병원성 진균에 대해 특히 높다.

AB-021 항생제의 시험관내 및 생체내 항진균 활성은 하기 방법으로 결정한다.

시험관내 항진균 및 항세균 활성에 대한 시험

AB-021 항생제의 항미생물 활성은 항생제의 농도를 증가시켜 민감성 미생물종의 성장을 지지할 수 있는 한천화 배양배지에 가함으로써 통상적인 방법으로 결정한다.

식물 병원성 진균에 대해 또한, 이 조건하에서 대조에 대해 균사체의 성장을 적어도 50% 감소시키는 AB-021 항생제의 최소 농도 (ED50)를 결정한다.

효모(Candida albicans) 및 세균(Sarcina lutea)에 대해 성장을 완전히 억제시키는 최소 농도(MIC)를 결정한다.

표3 및 4에 기술된 방법에 의해 시험관내에서 얻어진 생물학적 활성자료를 기재한다.

[생체내 살진균 활성]

생체내 살진균 활성은 하기 방법으로 측정한다.

20% 아세톤 V/V 농도의 물 - 아세톤 용액내 AB-021 항생제를 조정룸 (Conditioned room) 내 화분에서 성장한 식물의 잎중 하부에 살포한다.

하루후, 시험진균의 접종물을 식물의 잎중 상부에 살포하고, 조정룸 내 보온 조건하에서 약 8일동안 방치한다.

그런후, 감염의 심각성 정도를 100 (건강한 물)에서 0 (완전히 감염된 식물)까지의 평가 범위로 점수를 매겨 평가한다.

기술한 방법에 의해 얻은 생체내 예방 활성에 대한 자료를 표 4에 기록한다.

각 항생제, 즉 AB-021a 항생제 및 AB-021b 항생제를 사용하여 매우 유사한 항진균 활성결과를 얻는다.

실용화를 목적으로, 농업 및 다른분야에서 모두, 본 발명의 항생제를 적당한 조성물로 적당히 사용해야한다.

이 조성물은 유효성분으로서 본 발명의 항생제 뿐만 아니라, 불활성 고체 담체 (예. 고령토, 실리카, 활석, 애타펄자이트, 규조토 등), 또는 불활성 액체 담체 (예. 유기용매, 식물 또는 천연오일, 물 및 그의 혼합물), 및 조제분야에서 일반적으로 사용되는 계면활성제, 현탁제, 분산제 및 습윤제와 같은 가능한 다른 부가제를 함유한다.

특별한 시용목적으로, 또는 조성물의 작용범위를 넓히기 위해, 다른 살충제, 살비제, 살진균제와 같은 다른 유효성분을 상기 조성물에 가할 수 있다.

사용량은 감연 형태 및 정도, 사용되는 조성물의 형태, 기후 및 환경인자와 같은 다른 요인에 따라 다양하다.

농업용으로는, AB-021 항생제 투여량이 10∼500g/ha 범위일 때 만족스러운 결과가 얻어진다.

하기 실시에는 본 발명의 범위를 제한하지 않고 설명할 목적으로 제시되는 것이다.

[실시예 1]

한천을 두껍게 입힌 상기 A(PM8)배지의 사면에서 성장한 스트렙토미세스 에스피. NCIB 40068 배양액을 5ml 의 멸균증류수에 현탁시킨다.

이러한 현탁액을 사용하여 100ml 의 A(PM8) 배지를 함유하는 삼각 플라스크에 접종시킨후, 180rpm, 28℃에서 55시간 동안 계속 교반한다.

이러한 배양액을 사용하여 1000ml의 A(PM8) 배지를 함유하는 삼각 플라스크를 접종시킨후, 150rpm, 28℃에서 40시간 동안 계속 교반한다.

이 배양액을 사용하여, 28ℓ의 B(PGC)배지를 함유하는 약 40ℓ용량의 발효기를 접종시킨다.

온도를 28℃로 조절 유지하고, 용존 산소 농도를 20% 포화값보다 높게 유지하면서 74시간 동안 발효시킨다.

AB-021 항생제의 분리

상기 기재된대로 수득된 28ℓ의 발효 브로쓰를 원심분리하고, 분리된 균사체를 7ℓ의 아세톤으로 추출한다.

아세톤성 추출액을 용매가 완전히 사라질때까지 진공하에서 농축하고 AB-021 항생제를 함유하는 잔류 수용액 (약 1ℓ)을 400ml의 메탄올을 사용하여 수집하고, 10mM 인산일수소암모늄을 함유하는 물로 이루어진 A 용리액 및 메탄올로 이루어진 B 용리액으로 형성된 용리계에서, 하기 표에 따른 구배를 사용하고, 매트렉스 실리카 C18형 (스위스 Lausanne, Amicon Europe 제품)의 실리카 1.0kg을 함유하는 칼럼 (내부직경 90mm × 길이 360mm)에서, 동일한 정지상으로 채워진 전컬럼 (50mm × 50mm)을 사용하여 크로마토그래피시킨다 :

순수한 AB-021a 항생제가 15000∼17550ml의 용출 범위내에서 2550ml로 수집되는 반면에, AB-021b 항생제는 21450∼24450ml의 용출범위내에서 3000ml로 수집된다.

수집된 분획을 메탄올이 완전히 제거될 때가지 진공하에서 증발시킨후, 4℃에서 24시간 동안 방치한다.

이 용액에서 AB-021a 항생제 및 AB-021b 항생제를 각각 침전시키고, 원심분리로 수집한다.

그런후, 원심분리 케이크를 물에 다시 현탁시켜 미량의 다른 잔류염을 제거하고, 다시 원심분리한다.

건조후, 연황색 분말의 AB-021a 항생제 198mg 및 연황색 분말의 AB-021b 항생제 210mg을 수득한다.

산물의 물리 - 화학적 특성은 상술되어 있다.

[실시예 2]

한천화 A(PM8) 배지의 사면에서 성장한 스트렙토미세스 에스피. NCIB 40068 의 배양액을 6ml의 멸균 증류수에 다시 현탁시킨다.

이 현탁액을 사용하여 각각 100ml의 A(PM8) 배지를 함유하는 3개의 삼각플라스크에 접종시킨다.

접종시킨 삼각플라스크를 180rpm, 28℃에서 48시간 동안 계속 교반한다.

수득된 배양액을 사용하여 각각 100ml의 B(PGC) 배지를 함유하는 50개의 삼각플라스크에 5부피 %의 접종물로 접종시킨다.

삼각플라스크를 180rpm, 28℃에서 72시간 동안 계속 교반한다.

그런후, 수득된 브로쓰를 6000rpm에서 20분동안 원심분리하여 균사체로부터 수집 및 분리한다.

[실시예 3]

한천화 A(PM8) 배지의 사면에서 성장한 스트렙토미세스 에스피. NCIB 40068의 배양액을 5ml의 멸균 증류수에 다시 현탁시킨다.

이 현탁액을 사용하여 100ml의 A(PM8) 배지를 함유하는 삼각플라스크를 접종시킨다.

그런후 접종된 삼각플라스크를 180rpm, 28℃에서 48시간 동안 교반한다.

수득된 배양액을 사용하여 각각 100ml의 C(SCM) 배지를 함유하는 3개의 삼각플라스크를 5부피 %의 접종물로 접종시킨다.

삼각플라스크를 180rpm, 30℃에서 24∼72시간 동안 교반한다.

발효후, 수득된 브로쓰를 실시예 2에서와 동일한 방법의 원심분리에 의해 균사체로부터 분리한다.

Claims

디메틸술폭시드 및 (1 : 1 V / V) 에탄올 / 물 또는 (1 : 1 V / V) 메탄올 / 물 혼합물 [V / V = 부피 / 부피]에 잘 용해되고, 물에는 잘 용해되지 않으며, 에탄올 및 메탄옥에는 다소 잘 용해됨;

(b) %값으로 나타낸 대략의 원소분석 :

탄소 : 64.3

수소 : 9.15

질소 : 1.04 ;

(c) 분자량 : 1139;

(d) U. V. 광에서의 최대 흡수 피크 (0.025mg / ml 의 1 : 1 (V / V) 아세토니트릴 / 물):

232.8 nm에서 0.193 ; 318.4 nm에서 2.064 ;

332.6 nm에서 2.44 ; 349.6 nm에서 2.113 ;

(e) 적외선광에서의 최대흡수 피크 (cm^-1) :

3365; 3015; 2923; 2851; 1700; 1634; 1594; 1541; 1431; 1380; 1329; 1262; 1128; 1095; 1056; 1004; 968; 919; 878; 843; 804; 754

(f)¹H-N. M. R. 스펙트럼의 주요 피크:

δTMS (ppm) : 7.18 (d, 1H) ; 6.69 (dd, 1H) ; 6.59 (dd, 1H) ; 6.52∼6.09 (m, 9H) ; 5.96∼5.70 (m, 3H) ; 5.70∼5.31 (m, 8H) ; 4.27∼4.02 (m, 4H) ; 4.02∼3.82 (m, 4H) ; 3.82∼3.58 (m, 4H) ; 3.30 (t, 1H) ; 2.82 (t, 2H) ; 2.73∼2.45 (*)(m, 3H) ; 2.41∼1.98 (m, 13H) ; 1.91 (s, 3H) ; 1.79∼1.12 (m, 24-25H) ; 1.00 (d, 3H) ; 0.95 (d,3H) ; 0.89 (d, 3H) ; 0.85 (d, 3H) ;

범위내 (*)는 DMSOd6 피크도 포함하는 것이다.

(g)¹³C-N. M. R. 스펙트럼의 주요 피크 :

δ TMS (ppm) : 212.1 (s) ; 169.9 (s) ; 138.8 (d) ; 138.5 (d) ; 137.0 (d) ; 136.9 (d) ; 136.7 (d) ; 136.1 (d) ; 135.9 (d) ; 135.9 (d) ; 134.0 (d) ; 133.3 (d) ; 133.0 (d) ; 132.9 (d) ; 132.5 (d) ; 132.4 (d) ; 132.0 (d) ; 131.5 (d) ; 131.0 (d) ; 131.0 (d) ; 129.3 (d) ; 128.9 (d) ; 128.0 (d) ; 126.7 (d) ; 126.4 (d) 125.3 (d) ; 75.3 (d) ; 72.3 (d) ; 71.2 (d) ; 70.6 (d) ; 69.7 (d) ; 68.9 (d) ; 68.4 (d) ; 68.0 (d) ; 67.1 (d) ; 67.1 (d) ; 65.7 (d) ; 64.2 (d) 64.2 (d) ; 52.1 (d) ; 41.5 (d) ; 39.9 (d) ; 49.2 (t) ; 46.2 (t) ; 46.0 (t) ; 45.2 (t) 45.2 (t) ; 44.9 (t) ; 43.9 (t) ; 41.2 (t) ; 40.8 (t) ; 40.7 (t) ; 39.2 (t) ; 38.8 (t) ; 34.1 (t) ; 32.8 (t) ; 32.1 (t) ; 29.3 (t) ; 24.1 (t) ; 22.8 (q) ; 18.4 (q) ; 13.2 (q) ; 10.5 (q) ; 9.1 (q).

(h) 60 F 254 슬랩 (Merck-Schuchardt)에서의 박막크로마토그래피 (TLC)에 의한 Rf 값 :

에타올 : 디옥산 : 30% 암모니아 수용액 : 물 (8 : 1 : 1 : 1)에서 0.47∼0.57 ;

메틸렌클로라이드 : 메탄올 (17 : 3)에서 0.0 ;

머크 - 스쿠챠르트 RP-18F 254 슬랩에서의 역상 크로마토그래피에 의한 Rf 값 :

메탄올 : 아세토니트릴 : 물에 용해시킨 25mM 인산일수소칼륨(4 : 4 : 2)에서 0.29 ;

메탄올 : 아세토니트릴 : 물에 용해시킨 25mM 인산이수소 칼륨 + 7mM 테트라메틸 - 암모늄클로라이드 (4 : 4 : 2)에서 0.39 ;

메탄올 : 물에 용해시키고, 인산을 사용하여 pH 7.5로 조정한 10mM 인산일수소암모늄용액 (8 : 2)에서 0.21 ;

메탄올 : 아세토니트릴 : 물에 용해시키고, 인산을 사용하여 pH 7.5로 조정한 10mM 인산 일수소암모늄 용액 (4 : 4 : 2)에서 0.25.

(i) 메탄올 : 아세토니트릴 : 10mM 인산일소수암모늄 수용액 (1 : 1 : 1)을 사용하여 0.8ml / 분의 유량으로 40℃에서 용출시키는 하이바리 - 크로카르트 리 - 크로소르브 (Hiber Li-ChroCART Li-Chrosorb)RP-18 칼럼,

전컬럼 : 가드팩 (Guard Pak) RCSS C18상에서의 역상 HPLC에 의한 머무름시간 (Rt) : 8분 ;
(a) U. V. 광에서의 최대흡수 피크 (0.02mg / ml 의 1 : 1 ( V / V) 아세토니트릴 / 물) :

369.0nm에서 0.90 ; 350.0nm에서 2.01 ; 332.6nm에서 2.21 ; 318.0nm에서 1.49 ;

(b) 적외선광에서의 최대흡수 피크 (cm^-1)

3902, 3853, 3747, 3375, 3013, 2921, 2853, 2757, 1895, 1699, 1669, 1645, 1576, 1540, 1430, 1378, 1324, 1261, 1160, 1094, 1095, 1004, 969, 919, 878, 843, 803, 779, 697 ; (c) 분자량 : 1165 ;

(d)¹H-N. M. R. 스펙트럼의 주요피크 :

δ TMS (ppm) : 7.21 (d, 1H) ; 6.75 (dd, 1H) ; 6.63 (dd, 1H) ; 6.57∼6.07 (m, 11H) ; 5.93∼5.70 (m, 3H) ; 5.70 ∼5.33 (m, 8H) ; 4.25∼4.20 (m, 4H) ; 4.02∼3.83 (m, 4H) ; 3.83∼3.59 (m, 4H) ; 3.29 (t, 1H) ; 2.82 (t, 2H) ; 2.72∼2.44 (*)(m,6-7H) ; 2.41∼2.00 (m, 14H) ; 1.92 (s, 3H) ; 1.80∼1.14 (m, 21H) ; 1.00 (d, 3H) ; 0.95 (d, 3H) ; 0.84(d, 3H)

범위내 (*)는 DMSOd6 피크도 포함하는 것이다.

(e)¹³C-N.M.R. 스펙트럼의 주요 피크 :

δ TMS (ppM) : 212.0 (s) ; 169.2 (s) ; 139.1 (d) ; 138.1 (d) ; 137.1 (d) ; 136.7 (d) ; 136.2 (d) ; 135.8 (d) ; 135.8 (d) ; 135.1 (d) ; 133.8 (d) ; 133.1 (d) ; 132.8 (d) 132.8 (d) ; 132.6 (d) ; 132.3 (d) ; 132.2 (d); 132.1 (d) ; 131.8 (d) ; 131.2 (d) ; 130.9 (d) ; 130.8 (d) ; 129.2 (d) ; 128.7 (d) ; 127.9 (d) ; 126.4 (d) ; 126.2 (d) ; 125.2 (d) ; 75.4 (d) ; 72.6 (d) ; 71.0 (d) ; 70.6 (d) ; 69.6 (d) ; 68.9 (d) ; 68.4 (d) ; 68.0 (d) ; 67.3 (d) ; 67.2 (d) ; 65.6 (d) ; 64.4 (d) ; 64.4 (d) ; 51.9 (d) ; 41.3 (d) ; 39.6 (d) ; 49.2 (t) ; 45.8 (t) ; 45.7 (t) ; 45.0 (t) ; 44.9 (t) ; 44.7 (t) ; 43.6 (t) ; 41.1 (t) ; 40.7 (t) ; 40.5 (t) ; 39.0 (t) ; 38.7 (t) ; 33.9 (t) ; 32.5 (t) ; 31.9 (t) ; 29.0 (t) ; 23.9 (t) ; 18.1 (q) ; 12.8 (q) ; 10.4 (q) ; 8.7 (q).

(f) 60 F 254 슬랩 (Merck-Schuchardt) 에서의 박말크로마토그래피 (TLC) 에 의한 Rf 값 :

에탄올 : 디옥산 : 30 % 암모니아 수용액 : 물 (8 : 1 : 1 : 1)에서 0.54 ;

메틸렌클로라이드 : 메탄올 (17 : 3)에서 0.00 ;

머크 - 스쿠챠르트 RP-18F 254 슬랩에서의 역상크로마트그래피에 의한 Rf 값 :

메탄올 : 아세토니트릴 : 물에 용해시킨 25 mM 인산일수소나트륨 (4 : 4 : 2)에서 0.27 ;

메탄올 : 아세토니트릴 : 물에 용해시킨 25mM 인산이수소칼륨 + 물에 용해시킨 7mM 테트라메틸 - 암모늄클로라이드 (4 : 4 : 2)에서 0.35 ;

메탄올 : 물에 용해시키고, 인산을 사용하여 pH 7.5로 조정한 10mM 인산일수소아모늄용액 (8 : 2)에서 0.12 ;

메탄올 : 아세토니트릴 : 인산을 사용하여 pH 7.5로 조정한 10mM 인산일수소암모늄 용액 (4 : 4 : 2)에서 0.24.

(g) 메탄올 : 아세토니트릴 : 10mM 인산일소수암모늄 수용액 (1 : 1 : 1)을 사용하여 0.8ml / 분의 유량으로 40℃에서 용출시키는 하이바 리 - 크로카르트 리 - 크로소르브 RP-18 칼럼, 전컬럼 : 가드팩 RCSS C18 상에서의 역상 HPLC에 의한 머무름시간 (Rt) : 11.8 분 ;을 특징으로 하는 고체 물질인 AB-021b 항생제.
호기조건하, 탄소, 질소 및 무기염 원을 함유하는 수성영양 배양 배지에서 스트렙토미세스 에스피. (Streptomyces sp.) NCIB 40068 또는 그의 해당 변이체를 조절 배양시켜 수득할 수 있고, 청구범위 제 1 및 2 항에서 정의된 AB-021a 항생제 및 AB-021b 항생제로 구성된 AB-021 항생제.
조절 호기성 발효 조건하, 동화될 수 있는 탄소, 질소 및 무기염 원을 함유하는 수성 영양 배지에서 스트렙토미세스 에스피. NCIB 40068 또는 그의 해당 변이체를 실질적인 항생제 활성이 얻어질 때까지 배양한후, 본질적으로 공지된 방법으로 상기 항생제를 회수하고, AB-021a 항생제 및 AB-021b 항생제로 명명된 주성분을 단리시킬 수 있음을 특징으로 하는 AB-021 항생제의 제조방법.
제 4 항에 있어서, 발효를 20℃∼35℃의 온도 범위에서 수행하는 방법.
제 4 항에 있어서, 발효를 5∼9의 pH 범위에서 수행하는 방법.
제 4 항에 있어서, AB-021 항생제를 여과후 크로마토그래피 기술에 의해 발효 브로쓰로부터 단리하는 방법.
제 4 항에 있어서, AB-021a 항생제 및 AB-021b 항생제를 10mM / 1의 인산일수소암모늄을 함유하는 물로 구성된 혼합물에서 메탄올 30%부터 70%까지의 직선 구배로 용출시키는 실리카겔 칼럼에서의 역상 크로마토그래피로 단리하는 방법.
스트렙토미세스 에스피. NCIB 40068 미생물.
유효성분으로 AB-021 항생제, AB-021a 항생제 및 AB-021b 항생제 중에서 선택된 화합물을 불활성 고체 또는 액체 담체 및 임의로 다른 부가제와 함께 함유하는 살진균 및 살균 조성물.