KR20230101931A - Cd80 변이체 면역조절 단백질 및 그의 용도 - Google Patents

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KR20230101931A
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라이언 스완슨
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알파인 이뮨 사이언시즈, 인코포레이티드
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Abstract

변이체 CD80 폴리펩타이드, 상기 변이체 CD80 폴리펩타이드를 포함하는 면역조절 단백질, 및 이러한 단백질을 인코딩하는 핵산이 제공된다. 본 발명의 면역조절 단백질은 다양한 면역학적 및 종양학적 병태에 대한 치료적 유용성을 제공한다. 이러한 단백질의 제조 및 사용을 위한 조성물 및 방법도 제공된다.

Description

CD80 변이체 면역조절 단백질 및 그의 용도{CD80 VARIANT IMMUNOMODULATORY PROTEINS AND USES THEREOF}
관련 출원의 상호-참조
[1] 이 출원은 "CD80 리간드 변이체 면역조절 단백질 및 그의 용도"라는 제하의 2016년 4월 15일자 미국 가특허출원 No. 62/323,595, "CD80 리간드 변이체 면역조절 단백질 및 그의 용도"라는 제하의 2016년 9월 14일자 미국 가특허출원 No. 62/394,743, "ICOS 리간드 변이체 면역조절 단백질 및 그의 용도"라는 제하의 2016년 10월 20일자 미국 가특허출원 No. 62/410,844, "CD80 리간드 변이체 면역조절 단백질 및 그의 용도"라는 제하의 2017년 3월 16일자 미국 가특허출원 No. 62/472,570, 및 "CD80 리간드 변이체 면역조절 단백질 및 그의 용도"라는 제하의 2017년 3월 22일자 및 미국 가특허출원 No. 62/475,201에 기초한 우선권 주장 출원으로서 상기 각 출원의 내용은 그 전체가 참조 병합되었다.
서열목록의 참조 병합
[2] 본원은 전자형태의 서열목록과 함께 출원된다. 이 서열목록은 파일명이 761612000440SeqList.txt이고 크기가 815,991 바이트이며 2017년 4월 13일에 생성되었다. 이 전자형태의 서열목록에 담긴 정보는 그 전체가 참조 병합되었다.
분야
[3] 본 발명은 암 및 면역학적 질환의 치료에 있어 면역 반응을 조절하기 위한 치료 조성물에 관한 것이다. 일부 측면에서, 본 발명은 동족 결합 파트너에 대해 변경된 친화성을 나타내는 CD80의 특정 변이체에 관한 것이다.
배경
[4] 항원-제시 세포 (APC) 또는 표적 세포와 림프구에 의해 또는 이들 간에 형성된 면역학적 시냅스(IS)에서 일어나는 프로세스에 개입함으로써 면역 반응을 조절하는 것은 의학적으로 점점 큰 관심의 대상이 되고 있다. 기계학적으로, IS 내 세포 표면 단백질은 이들이 결합하는 단일 단백질과 복수의 단백질 표적의 조화롭고도 종종 동시적인 상호반응과 연관될 수 있다.
IS 상호반응은 두 세포들 간의 정션과 밀접하게 연관되어 일어나며 이 구조 내 단일 단백질은 관련 세포(트랜스) 상의 단백질 뿐만 아니라 동일 세포(시스) 상의 단백질 양자 모두와 아마도 동시에 반응할 수 있다. 비록 IS를 조절하는 치료방법이 공지이긴 하지만, 개선된 치료법이 요구되고 있다. 본 발명에 따라 이러한 요구사항을 만족하며, 세포 상에서 발현될 수 있는 가용성 단백질 또는 막관통 면역조절 단백질을 비롯한 면역조절 단백질이 제공된다.
발명의 개요
[5] 일부 구체예에서, 본 발명에 따라 IgV 도메인 또는 그의 특이적 결합 단편, IgC 도메인 또는 그의 특이적 결합 단편, 또는 양자 모두를 함유하는 변이체 CD80 폴리펩타이드가 제공되며 여기서 상기 변이체 CD80 폴리펩타이드는 비변형 CD80 또는 그의 특이적 결합 단편 내, SEQ ID NO:　28의 넘버링을 참조로 대응하는 위치(들) 4, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 21, 22, 24, 25, 27, 28, 29, 30,31, 33, 36, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 47, 48, 50, 52, 53, 54, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65,66, 67, 68, 69, 70, 72, 74, 76, 77, 80, 81, 83, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 99, 102, 103, 104, 108, 107,109, 110, 114, 115, 116, 117, 118, 120, 121, 122, 126, 127, 128, 129, 130, 133, 137, 140, 142, 143, 144, 148, 149, 152, 154, 160, 162, 164, 168, 169, 174, 175, 177, 178, 183, 178, 185, 188, 190, 192, 193, 또는 199에서 하나 이상의 아미노산 변형을 함유하는 것이다. 일부 구체예에서, 상기 하나 이상의 아미노산 변형은 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 포함한다. 일부 구체예에서, 비변형 CD80은 포유동물 CD80 또는 그의 특이적 결합 단편이다. 일부 구체예에서, 비변형 CD80은 인간 CD80 또는 그의 특이적 결합 단편이다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는: IgV 도메인 또는 그의 특이적 결합 단편; 및 IgC 도메인 또는 그의 특이적 결합 단편을 포함한다. 일부 구체예에서, 비변형 CD80은 (i) SEQ ID NO:28에 제시된 아미노산 서열, (ii) SEQ ID NO:28에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 (iii) IgV 도메인 또는 IgC 도메인을 포함하는 그의 일부 또는 그의 특이적 결합 단편이다.
[6] 변이체 CD80 폴리펩타이드들 중 임의의 구체예에서, IgV 도메인 또는 IgC 도메인의 특이적 결합 단편은 길이가 적어도 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 이상의 아미노산이고; IgV 도메인의 특이적 결합 단편은 SEQ ID NO:1의 아미노산 35-135에 제시된 IgV 도메인의 길이의 적어도 80%인 길이를 포함하거나; 또는 IgC 도메인의 특이적 결합 단편은 SEQ ID NO:1의 아미노산 145-230에 제시된 IgC 도메인의 길이의 적어도 80%인 길이를 포함한다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 최대1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 아미노산 변형, 선택적으로 아미노산 치환을 갖는다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 28, 또는 그의 특이적 결합 단편에 대해적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 나타낸다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80은 비변형 CD80과 비교시 CD28, PD-L1, 또는 CTLA-4의 엑토도메인에 대해 변경된 결합 특이성을 나타낸다. 일부 사례에서, 변경된 결합은 변경된 결합 친화성 및/또는 변경된 결합 선택성이다.
[7] 변이체 CD80 폴리펩타이드들 중 임의의 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 V4M, K9E, E10R, V11S, A12G, A12T, A12V, T13N, L14A, S15V, S15F, C16S, C16G, C16L, G17W, H18L, H18R, H18Y, V20L, S21P, V22A, E24G, L25P, Q27R, T28A, T28S, R29C, R29D, R29H, R29V, I30V, Y31F, Y31H, Y31L, Q33H, K36E, K36G, K37E, K37Q, M38I, M38L, M38T, M38V, L40M, T41A, T41G, T41D, T41I, M42T, M43I, M43Q, M43R,M43V, S44P, M47T, N48I, N48D, W50G, E52G, Y53C, K54M, F59L, F59S, D60V, I61N, T62S, N63S, N64S, L65H, S66H, I67F, I67T, V68A, V68M, I69T, L70Q, L70P, L70R, L72P, P74L, D76G, E77G, E77K, Y80N, E81A, E81R, E81V, V83A, V83I, L85I, L85R, K86E, Y87N, E88D, E88G, K89E, K89N, K89R, D90K, D90L, D90N, A91E, A91G, A91S, A91T, F92L, F92N, F92P, F92Y, K93I, K93E, K93Q, K93R, K93V, R94G, R94L, R94F, E95K, H96R, L97R, E99G, E99D, L102S, S103L, S103P, V104A, V104L, D107N, F108L, P109S, P109H, T110A, S114T, D115G, F116S, F116L, E117V, E117G, I118V, I118A, I118T, T120S, S121P, N122S, I126L, I126V,I127T, C128Y, C128R, S129L, S129P, T130A, G133D, P137L, S140T, L142S, E143G, N144S, N144D, L148S, N149D, N149S, N152T, T154I, T154A, E160G, E162G, Y164H, S168G, K169E, K169I, K169S, M174T, M174V, T175A,N177S, H178R, L183H, K185E, H188D, H188Q, R190S, N192D, Q193L, T199S, 또는 그의 보존적 아미노산 치환이다.
[8] 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 비변형 CD80 또는 그의 특이적 결합 단편에서 하나 이상의 아미노산 결실을 포함하는 IgV 도메인 또는 IgC 도메인 또는 이의 특이 적 결합 단편을 함유한다. 일부 구체예에서, 결실은 SEQ ID NO:　28의 위치 43에 대응한다.
[9] 일부 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 V4M/L70Q/A91G/T120S/T130A, A12T/H18L/M43V/F59L/E77K/P109S/I118T,A12V/S15F/Y31H/T41G/T130A/P137L/N152T, V20L/L70Q/A91S/T120S/T130A, V22A/L70Q/S121P, E24G/L25P/L70Q/T120S, T28S/L70Q/A91G/E95K/T120S/T130A, E24G/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/F59L/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/H96R,R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M42T/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/L148S/N149S,R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/N149S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118T/N149S,R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/N144S/N149S,R29H/Y31H/T41G/Y87N/E88G/K89E/D90N/A91G/P109S, R29H/E52G/L70R/E88G/A91G/T130A, R29H/E52G/T120S/T130A,R29V/Y31F/K36G/M38L/M43Q/E81R/V83I/L85I/K89R/D90L/A91E/F92N/K93Q/R94G,R29V/M43Q/E81R/L85I/K89R/D90L/A91E/F92N/K93Q/R94G,Y31H/T41G/L70Q/A91G/T120S/T130A,K36G, K36G/K37Q/M38I/L40M, K36G/K37Q/M38I/F59L/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/E99G/T130A/N149S, K36E/I67T/L70Q/A91G/T120S/T130A/N152T, K37E/F59S/L70Q/A91G/T120S/T130A,M38T/L70Q/E77G/A91G/T120S/T130A/N152T,M38V/T41D/M43I/W50G/D76G/V83A/K89E/T120S/T130A,T41I/A91G,S44P/L70Q/A91G/T130A,E52G/L70Q/A91G/T120S/T130A, K54M/A91G/T120S, D60V/A91G/T120S/T130A, N63S/L70Q/A91G/T120S/T130A, S66H/D90G/T110A/F116L, I67F/L70R/E88G/A91G/T120S/T130A, I67T/L70Q/A91G/T120S, V68A/T110A, V68M/L70P/L72P/K86E,L70Q/A91G/T110A/T120S/T130A,L70Q/E81A/A91G/T120S/I127T/T130A,L70Q/Y87N/A91G/T130A, L70Q/A91G, L70Q/A91G/E117G/T120S/T130A, L70Q/A91G/T120S/T130A, L70Q/A91G/T130A, L70Q/A91G/I118A/T20S/T130A, L70R/A91G/T120S/T130A, E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R, K89E/T130A,K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R, E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R/N122S/N177S,K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R/N122S/N177S, A91G, A91G/F92L/F108L/T120S, A91G/L102S, A91G/S103P, A91G/T120S/T130A, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T120S/I127T/T130A/K169E, 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R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/L70Q/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/I127T/T130A/E143G/K169E/M174V/H188D, R29D/I30V/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/I127T/T130A/H188D, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/I127T/T130A/H188D, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/L70Q/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/I127T/T130A/K169E, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/L70Q/E81V/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/I127T/T130A, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/I127T/T130A/K169E/H188D, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/F108L/I118V/T120S/T130A/K169E/H188D, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/L70Q/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/T130A/N149D/K169E/H188D, H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/L70Q/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/T130A/K169E/H188D, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/I127T/C128Y/T130A/H188D, H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/E99D/T130A, H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/L70Q/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/T130A/K169E, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/I61N/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94F/V104A/I118V/T120S/I126V/T130A, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94F/I118V/T120S/T130A, H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/I127T/T130A/L142S/H188D, C16S/H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T110A/I118V/H188D, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/A91G/I118V/T120S/I127T/T130A/H188D, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/L70Q/D76G/A91G/S103L/I118V/T120S/I127T/T130A,Y53C/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/I127T/T130A/K169E, T62S/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/T130A/K169E, Y53C/L70Q/D90G/T130A/N149D/N152T/H188D, H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/I127T/T130A/H188D, 또는 H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T130A/N149S이다.
[10] 변이체 CD80 폴리펩타이드들 중 임의의 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 IgV 도메인 또는 그의 특이적 단편 및/또는 IgC 도메인 또는 그의 특이적 단편을 함유한다. 변이체 CD80 폴리펩타이드들 중 임의의 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 IgV 도메인 또는 그의 특이적 결합 단편을 함유한다. 일부 구체예에서, IgV 도메인 또는 그의 특이적 결합 단편은 변이체 CD80 폴리펩타이드의 유일한 CD80 부분이다. 일부 구체예에서, IgC 도메인 또는 그의 특이적 결합 단편은 변이체 CD80 폴리펩타이드의 유일한 CD80 부분이다.
[11] 변이체 CD80 폴리펩타이드들 중 임의의 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 includes SEQ ID NOS: 55-108, 280-346, 414-475 또는 그의 특이적 결합 단편 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열, SEQ ID NOS: 55-108, 280-346, 414-475 또는 그의 특이적 결합 단편 중 어느 하나에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 나타내고 하나 이상의 아미노산 치환을 함유하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 IgV 도메인 또는 그의 특이적 결합 단편을 포함한다. 일부 구체예에서, IgV 도메인 또는 그의 특이적 단편은 변이체 CD80 폴리펩타이드의 유일한 CD80 부분이다. 일부 구체예에서, IgC 도메인 또는 그의 특이적 단편은 변이체 CD80 폴리펩타이드의 유일한 CD80 부분이다. 변이체 CD80 폴리펩타이드들 중 임의의 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 SEQ ID NOS: 153-195, 347, 373-386, 476-477 또는 그의 특이적 결합 단편 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열, SEQ ID NOS: 153-195, 347, 373-386, 476-477 또는 그의 특이적 결합 단편에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 나타내고 하나 이상의 아미노산 치환을 함유하는 아미노산 서열을 포함한다.
[12] 변이체 CD80 폴리펩타이드들 중 임의의 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 증가된 친화성으로 CD28, PD-L1, 또는 CTLA-4의 엑토도메인에 특이적으로 결합한다. 임의의 이러한 구체예들 중 일부에서, 변이체 폴리펩타이드는 엑토도메인에 대한 비변형 CD80의 결합에 비해 증가된 선택성으로 CD28, PD-L1 또는 CTLA-4의 엑토도메인에 특이적으로 결합한다. 일부 측면에서, 증가된 선택성은 하나의 동족 결합 파트너 대 또 다른 동족 결합 파트너에 대한 비변형 CD80 폴리펩타이드의 결합 비율과 비교하여, CD28, PD-L1 및 CTLA-4로부터 선택된 하나의 동족 결합 파트너 대 또 다른 동족 결합 파트너의 비율이 더 큰 것을 포함한다.
[13] 일부 구체예에서, 변이체 폴리펩타이드는 CD28의 엑토도메인에 대한 비변형 CD80의 결합에 비해, CD28의 엑토도메인에 대해 증가된 선택성을 가지면서 특이적으로 결합한다. 일부 측면에서, 증가된 선택성은 비변형 CD80 폴리펩타이드의 CD28 대 PD-L1 또는 CTLA-4에 대한 결합 비율에 비해, CD28 대 PD-L1 또는 CTLA-4에 대해 더 큰 비율로 결합하는 것을 포함한다. 일부 경우에서, 상기 비율은 적어도 또는 적어도 약 1.5배, 2.0배, 3.0배, 4.0배. 5배, 10배, 15배, 20배, 30배, 40배, 50배 이상 더 크다.
[14] 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 증가된 친화성으로 CD28의 엑토도메인에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 엑토도메인에 대한 증가된 친화성은 엑토도메인에 대한 비변형 CD80의 결합 친화성에 비해 1.2배, 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배 또는 60배 이상 증가된 것이다.
[15] 변이체 CD80 폴리펩타이드들 중 임의의 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 SEQ ID NO:　28의 넘버링을 참조로 12, 18, 20, 29, 31, 36, 40, 41, 43, 52, 59, 60, 63, 67, 70, 77, 81, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 107, 109, 114, 117, 118, 120, 122, 127, 130, 144, 169,177 또는 199 위치(들)에 대응한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 A12T, H18L, V20L, R29H, Y31H, K36G, L40M, T41G, T41I, M43V, E52G, F59L, D60V, N63S, I67T, L70Q, L70R, E77K, E81A, Y87N, E88D, E88G, K89E, K89R, D90K, D90N, A91G, A91S, F92Y, K93R, D107N, P109S, S114T, E117G, I118A, I118T, I118V, T120S, I127T, T130A, N144D, K169E, N177S 및 T199S 및 이의 보존적 아미노산 치환으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 A12T/H18L/M43V/F59L/E77K/P109S/I118T, V20L/L70Q/A91S/T120S/T130A, V20L/L70Q/A91S/I118V/T120S/T130A,R29H/Y31H/T41G/Y87N/E88G/K89E/D90N/A91G/P109S, K36G, K36G/L40M, T41I/A91G, E52G/L70/A91G/T120S/T130A, E52G/L70Q/A91G/D107N/I118V/T120S/T130A/K169E,D60V/A91G/T120S/T130A, D60V/A91G/I118V/T120S/T130A/K169E,N63S/L70Q/A91G/T120S/T130A, N63S/L70Q/A91G/S114T/I118V/T120S/T130A, I67T/L70Q/A91G/T120S, I67T/L70Q/A91G/I118V/T120S, L70Q/E81A/A91G/T120S/I127T/T130A, L70Q/E81A/A91G/I118V/T120S/I127T/T130A, L70Q/Y87N/A91G/T130A, L70Q/A91G, L70Q/A91G/N144D, L70Q/A91G/E117G/T120S/T130A, L70Q/A91G/E117G/I118V/T120S/T130A,L70Q/A91G/I118A/T120S/T130A, L70Q/A91G/I118A/T120S/T130A/K169E,L70Q/A91G/T120S/T130A, L70Q/A91G/I118V/T120S/T130A/K169E,L70R/A91G/T120S/T130A, L70R/A91G/I118V/T120S/T130A/T199S,E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R, K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R, 또는 K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R/N122S/N177S이다.
[16] 변이체 CD80 폴리펩타이드들 중 어느 하나의 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 증가된 친화성으로 PD-L1의 엑토도메인에 특이적으로 결합한다. 일부 경우에서, 엑토도메인에 대한 증가된 친화성은 비변형 CD80의 엑토도메인에 대한 결합 친화성에 비해 1.2배, 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배 또는 60배 이상 증가된 것이다. 임의의 이러한 구체예들 중 일부에서, 변이체 폴리펩타이드는 비변형 CD80의 엑토도메인에 대한 결합에 비해 증가된 선택성으로 PD-L1의 엑토도메인에 특이적으로 결합한다. 일부 경우에서, 증가된 선택성은 비변형 CD80 폴리펩타이드의 PD-L1에 대한 결합 대 CD28 또는 CTLA-4에 대한 결합 비율에 비해, PD-L1에 대한 결합 대 CD28 또는 CTLA-4에 대한 결합 비율이 더 크다는 것을 포함한다. 일부 사례에서, 이 비율은 적어도 또는 적어도 약 1.5배, 2.0배, 3.0배, 4.0배. 5배, 10배, 15배, 20배, 30배, 40배, 50배 이상 더 크다.
[17] 일부 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 SEQ ID NO:　28의 넘버링을 참조로 12, 18, 29, 31, 33, 36, 38, 40, 41, 42, 43, 47, 59, 67, 70, 77, 81, 85, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 109, 118, 120, 122, 144, 148, 149, 또는 177 위치(들)에 대응한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 A12T, H18L, R29D, R29H, Y31H, Y31L, Q33H, K36G, M38I, L40M, T41A, T41G, M42T, M43R, M43V, M47T, F59L, I67T, L70Q, E77K, E81V, L85R, Y87N, E88D, E88G, K89E, K89N, K89R, D90K, D90N, A91G, A91T, F92P, F92Y, K93R, K93V, R94L, P109S, I118T, I118V, T120S, N122S, N144S, L148S, N149S, 및 N177S, 및 그의 보존적 아미노산 치환으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 A12T/H18L/M43V/F59L/E77K/P109S/I118T, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118T/N149S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/N144S/N149S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M42T/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/L148S/N149S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/N149S, R29H/Y31H/T41G/Y87N/E88G/K89E/D90N/A91G/P109S, K36G, K36G/L40M,I67T/L70Q/A91G/T120S, I67T/L70Q/A91G/I118V/T120S,E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R, K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R, 또는 A91G이다.
[18] 변이체 CD80 폴리펩타이드들 중 어느 하나의 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 증가된 친화성으로 CD28의 엑토도메인 및 PD-L1의 엑토도메인과 결합한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 SEQ ID NO:　28의 넘버링을 참조로 12, 18, 36, 40, 43, 59, 77, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 109, 118, 122, 177 위치(들)에 대응한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 A12T, H18L, K36G, L40M, M43V, F59L, E77K, E88D, K89R, D90K, A91G, F92Y, K93R, P109S, I118T, N112S, N177S, 및 그의 보존적 아미노산 치환으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 A12T/H18L/M43V/F59L/E77K/P109S/I118T, K36G, K36G/L40M,E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R, K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R, 또는 K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R/N122S/N177S이다.
[19] 변이체 CD80 폴리펩타이드들 중 어느 하나의 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 증가된 친화성으로 CTLA-4의 엑토도메인에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 엑토도메인에 대한 증가된 친화성은 비변형 CD80의 엑토도메인에 대한 결합 친화성에 비해 1.2배, 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배 또는 60배 증가된 것이다. 임의의 이러한 구체예들 중 일부에서, 변이체 폴리펩타이드는 비변형 CD80의 엑토도메인에 대한 결합에 비해 증가된 선택성으로 CTLA-4의 엑토도메인에 특이적으로 결합한다. 일부 경우에서, 증가된 선택성은 the 비변형 CD80 폴리펩타이드의 CTLA-4에 대한 결합 대 CD28 또는 PD-L1에 대한 결합 비율에 비해 CTLA-4에 대한 결합 대 CD28 또는 PD-L1에 대한 결합 비율이 더 큰 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 비율은 적어도 또는 적어도 약 1.5배, 2.0배, 3.0배, 4.0배. 5배, 10배, 15배, 20배, 30배, 40배, 50배 이상 더 큰 것이다.
[20] 일부 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 SEQ ID NO:　28의 넘버링을 참조로 4, 29, 31, 36, 40, 41, 52, 67, 68, 70, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 107, 109, 110, 118, 120, 130, 144, 또는 169 위치(들)에 대응한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 V4M, R29H, Y31H, K36G, L40M, T41G, E52G, I67T, V68A, L70Q, Y87N, E88D, E88G, K89E, K89R, D90K, D90N, A91G, F92Y, K93R, D107N, P109S, T110A, I118V, T120S, T130A,N144D, 및 K169E 및 그의 보존적 아미노산 치환으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 V4M/L70Q/A91G/T120S/T130A, V4M/L70Q/A91G/I118V/T120S/T130A/K169E, R29H/Y31H/T41G/Y87N/E88G/K89E/D90N/A91G/P109S, K36G, K36G/L40M,E52G/L70Q/A91G/T120S/T130A, E52G/L70Q/A91G/D107N/I118V/T120S/T130A/K169E,I67T/L70Q/A91G/T120S, I67T/L70Q/A91G/I118V/T120S,V68A/T110A, L70Q/A91G, L70Q/A91G/N144D,L70Q/A91G/T120S/T130A,L70Q/A91G/I118V/T120S/T130A/K169E, L70Q/A91G/T130A, K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R, E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R, A91G/I118V/T120S/T130A,or A91G/T120S/T130A이다.
[21] 변이체 CD80 폴리펩타이드들 중 어느 하나의 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 증가된 친화성으로, CD28의 엑토도메인 및 CTLA-4의 엑토도메인에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 SEQ ID NO:　28의 36, 40, 52, 70, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 107, 118, 120, 130, 144, 또는 169 위치(들)에 대응한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 K36G, L40M, E52G, L70Q, E88D, K89R, D90K, A91G, F92Y, K93R, D107N, I118V, T120S, T130A, N144D, 및 K169E, 및 그의 보존적 아미노산 치환으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 K36G, K36G/L40M, E52G/L70Q/A91G/T120S/T130A, E52G/L70Q/A91G/D107N/I118V/T120S/T130A/K169E, L70Q/A91G, L70Q/A91G/N144D,L70Q/A91G/T120S/T130A, L70Q/A91G/I118V/T120S/T130A/K169E, E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R, 또는 K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R이다.
[22] 변이체 CD80 폴리펩타이드들 중 어느 하나의 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 증가된 친화성으로 PD-L1의 엑토도메인 및 CTLA-4의 엑토도메인에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 SEQ ID NO:　28의 29, 31, 36, 40, 41, 67, 70, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 109, 118, 120, 122, 또는 178 위치(들)에 대응한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 R29H, Y31H, K36G, L40M, T41G, I67T, L70Q, Y87N, E88D, E88G, K89E, K89R, D90N, D90K, A91G, F92Y, K93R, P109S, I118V, T120S, 및 그의 보존적 아미노산 치환으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은R29H/Y31H/T41G/Y87N/E88G/K89E/D90N/A91G/P109S, K36G, K36G/L40M, I67T/L70Q/A91G/T120S, I67T/L70Q/A91G/I118V/T120S, E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R, 또는 K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R이다.
[23] 변이체 CD80 폴리펩타이드들 중 어느 하나의 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 증가된 친화성으로, CD28의 엑토도메인, PD-L1의 엑토도메인, 및 CTLA-4의 엑토도메인에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 SEQ ID NO:　28의 36, 40, 88, 89, 90, 91, 92, 또는 93 위치(들)에 대응한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 K36G, L40M, E88D, K89R, D90K, A91G, F92Y, K93R, 및 그의 보존적 아미노산 치환으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 K36G, K36G/L40M, E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R, 또는 K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R이다.
[24] 변이체 CD80 폴리펩타이드들 중 어느 하나의 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 증가된 친화성으로 CD28의 엑토도메인 또는 PD-L1의 엑토도메인에 특이적으로 결합하고, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 감소된 친화성으로 CTLA-4의 엑토도메인에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 SEQ ID NO:　28의 29, 31, 33, 36, 38, 41, 42, 43, 47, 63, 67, 70, 81, 85, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 109, 114, 118, 120, 127, 130, 144, 148, 또는 149 위치(들)에 대응한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 R29D, R29H, Y31H, Y31L, Q33H, K36G, M38I, T41A, T41G, M42T, M43R, M47T, N63S, I67T, L70Q, E81A, E81V, L85R, Y87N, E88G, K89E, K89N, D90N, A91G, A91T, F92P, K93V, R94L, P109S, S114T, I118T, I118V, T120S, I127T, T130A, N144S, L148S, 및 N149S, 및 그의 보존적 아미노산 치환으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 N63S/L70Q/A91G/T120S/T130A,N63S/L70Q/A91G/S114T/I118V/T120S/T130A, 또는 L70Q/Y87N/A91G/T120S/I127T/T130A이다.
[25] 변이체 CD80 폴리펩타이드들 중 어느 하나의 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 증가된 친화성으로 CD28의 엑토도메인에 특이적으로 결합하고, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 감소된 친화성으로 CTLA-4의 엑토도메인에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 SEQ ID NO:　28의 63, 70, 81, 87, 91, 114, 118, 120, 127, 또는 130 위치(들)에 대응한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 N63S, L70Q, E81A, Y87N, A91G,S114T, I118V, T120S, I127T, 및 T130A, 및 그의 보존적 아미노산 치환으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M42T/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/L148S/N149S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118T/N149S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/N144S/N149S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/N149S, R29H/Y31H/T41G/Y87N/E88G/K89E/D90N/A91G/P109S, N63S/L70Q/A91G/T120S/T130A, N63S/L70Q/A91G/S114T/I118V/T120S/T130A,I67T/L70Q/A91G/T120S,I67T/L70Q/A91G/I118V/T120S, 또는 L70Q/Y87N/A91G/T120S/I127T/T130A이다.
[26] 변이체 CD80 폴리펩타이드들 중 어느 하나의 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 증가된 친화성으로 PD-L1의 엑토도메인에 특이적으로 결합하고, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 감소된 친화성으로, CTLA-4의 엑토도메인에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 SEQ ID NO:　28의 29, 31, 33, 36, 38, 41, 42, 43, 47, 67, 70, 81, 85, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 109, 118, 120, 144, 148, 149 위치(들)에 대응한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 R29D, R29H, Y31H, Y31L, Q33H, K36G, M38I, T41A, T41G, M42T, M43R, M47T, I67T, L70Q, E81V, L85R, Y87N, E88G, K89E, K89N, D90N, A91G, A91T, F92P, K93V, R94L, P109S, I118T, I118V, T120S, N144S, L148S, 및 N149S, 및 그의 보존적 아미노산 치환으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M42T/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/L148S/N149S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118T/N149S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/N144S/N149S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/N149S, R29H/Y31H/T41G/Y87N/E88G/K89E/D90N/A91G/P109S,I67T/L70Q/A91G/I118V/T120S, 또는 I67T/L70Q/A91G/T120S이다.
[27] 변이체 CD80 폴리펩타이드들 중 어느 하나의 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해, 증가된 친화성으로 CD28의 엑토도메인 및 PD-L1의 엑토도메인에 특이적으로 결합하고, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해, 감소된 친화성으로 CTLA-4의 엑토도메인에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 SEQ ID NO:　28의 70, 81, 87, 91, 또는 120 위치(들)에 대응한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 L70Q, Y87N, A91G, 및 T120S, 및 그의 보존적 아미노산 치환으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
[28] 변이체 CD80 폴리펩타이드들 중 어느 하나의 일부 구체예에서, CD28은 인간 CD28이다. 일부 구체예에서, PD-L1은 인간 PD-L1이다. 일부 구체예에서, CTLA-4는 인간 CTLA-4이다.
[29] 변이체 CD80 폴리펩타이드들 중 어느 하나의 일부 구체예에서, 결합 활성은 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 1.2배, 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 20배, 30배 40배 또는 50배 이상 변경(증가 또는 감소)된 것이다.
[30] 변이체 CD80 폴리펩타이드들 중 어느 하나의 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 가용성 단백질이다.
[31] 변이체 CD80 폴리펩타이드들 중 어느 하나의 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 멀티머화 도메인에 연결된다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 멀티머화 도메인에 연결된 제1 변이체 CD80 폴리펩타이드 및 멀티머화 도메인에 연결된 제2 변이체 CD80 폴리펩타이드를 포함하는, 멀티머 폴리펩타이드, 선택적으로 다이머 폴리펩타이드이다. 일부 구체예에서, 제1 변이체 CD80 폴리펩타이드 및 제2 변이체 CD80 폴리펩타이드는 같거나 다르다. 일부 구체예에서, 멀티머화 도메인은 이펙터 기능이 감소된 Fc 도메인 또는 그의 변이체이다.
[32] 변이체 CD80 폴리펩타이드들 중 어느 하나의 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 폴리펩타이드의 생물학적 반감기를 증가시키는 모이어티에 연결된다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 이펙터 기능이 감소된 Fc 도메인 또는 그의 변이체에 연결된다. 일부 구체예에서, Fc 도메인은 포유동물, 선택적으로 인간이거나; 또는 변이체 Fc 도메인은 포유동물, 선택적으로 인간인, 비변형 Fc 도메인에 비해 하나 이상의 아미노산 변형을 함유한다. 일부 구체예에서, Fc 도메인 또는 그의 변이체는 SEQ ID NO:226 또는 SEQ ID NO:227에 제시된 서열 또는 SEQ ID NO:226 또는 SEQ ID NO:227에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 함유한다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 링커를 통해 간접적으로 연결된다.
[33] 막관통 면역조절 단백질인 변이체 CD80 폴리펩타이드들 중 어느 하나의 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 변이체 CD80 폴리펩타이드의 세포외 도메인 (ECD) 또는 그의 특이적 결합 단편에 연결된 막관통 도메인을 더 함유한다. 일부 구체예에서, 막관통 도메인은 SEQ ID NO: 1의 잔기 243-263에 제시된 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 1의 잔기 243-263에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 그의 변이체를 함유한다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 막관통 도메인에 연결된 세포질 시그널링 도메인을 더 함유한다. 일부 구체예에서, 세포질 시그널링 도메인은 SEQ ID NO: 1의 잔기 264-288에 제시된 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 1의 잔기 264-288에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 나타내는 그의 기능성 변이체를 함유한다.
[34] 변이체 CD80 폴리펩타이드들 중 어느 하나의 일부 구체예에서, 변이체 CD80은 시험관내 일차 T-세포 분석(in vitro primary T-cell assay)에서 비변형 CD80에 비해 IFN-감마 (인터페론-감마) 발현을 증가시킨다. 변이체 CD80 폴리펩타이드들 중 어느 하나의 일부 구체예에서, 변이체 CD80은 시험관내 일차 T-세포 분석에서 비변형 CD80에 비해 IFN-감마 (인터페론-감마) 발현을 감소시킨다. 변이체 CD80 폴리펩타이드들 중 어느 하나의 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 탈글리코실화된다.
[35] 일부 구체예에서, 본 발명에 따라 면역글로불린 수퍼패밀리 (IgSF) 도메인을 포함하는 제2 폴리펩타이드에 연결된 본 발명의 임의의 구체예에 따른 변이체 CD80을 포함하는 면역조절 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 구체예에서, IgSF 도메인은 친화성 변형되어, 비변형 또는 야생형 IgSF 도메인에 비해 하나 이상의 그의 동족 결합 파트너(들)에 대해 변경된 결합을 나타낸다. 일부 구체예에서, IgSF 도메인은 비변형 또는 야생형 IgSF 도메인에 비해 하나 이상의 그의 동족 결합 파트너(들)에 대해 증가된 결합을 나타낸다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80은 제1 변이체 CD80이고 제2 폴리펩타이드의 IgSF 도메인은 본 발명의 어느 하나의 구체예에 따른 제2 변이체 CD80으로부터의 IgSF 도메인으로서, 여기서 제1 및 제2 변이체 CD80은 같거나 다른 것이다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 CD28, PD-L1, 또는 CTLA-4에 특이적으로 결합할 수 있고, 제2 폴리펩타이드의 IgSF 도메인은 변이체 CD80 폴리펩타이드에 의해 특이적으로 결합된 것 이외의 다른 동족 결합 파트너에 결합할 수 있다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 CD28 또는 PD-L1에 특이적으로 결합할 수 있고, IgSF 도메인은 변이체 CD80 폴리펩타이드에 의해 특이적으로 결합된 것 이외의 다른 동족 결합 파트너에 결합할 수 있다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 CD28 또는 CTLA-4에 특이적으로 결합할 수 있고, IgSF 도메인은 변이체 CD80 폴리펩타이드에 의해 특이적으로 결합된 것 이외의 다른 동족 결합 파트너에 결합할 수 있다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 CTLA-4 또는 PD-L1에 특이적으로 결합할 수 있고 IgSF 도메인은 변이체 CD80 폴리펩타이드에 의해 특이적으로 결합된 것 이외의 다른 동족 결합 파트너에 결합할 수 있다. 일부 구체예에서, IgSF 도메인은 B7 패밀리의 멤버로부터 유래한다. 일부 구체예에서, IgSF 도메인은 종양에서 발현된 리간드에 결합하는 종양-위치화 모이어티이다. 일부 구체예에서, 리간드는 B7H6이다. 일부 구체예에서, IgSF 도메인은 NKp30으로부터 유래한다. 일부 구체예에서, IgSF 도메인은 친화성 변형되어 비변형 또는 야생형 IgSF 도메인에 비해, 하나 이상의 그의 동족 결합 파트너(들)에 대해 증가된 결합을 나타낸다. 일부 구체예에서, IgSF 도메인은 IgV 도메인이거나 또는 이를 함유한다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 IgV 도메인이거나 또는 이를 함유한다.
[36] 임의의 어느 하나의 면역조절 단백질의 일부 구체예에서, 면역조절 단백질은 IgSF 도메인을 포함하는 제2 폴리펩타이드 및 변이체 CD80 폴리펩타이드 중 어느 하나 또는 두 가지 모두에 연결된 멀티머화 도메인을 함유한다. 일부 구체예에서, 멀티머화 도메인은 이펙터 기능이 감소된 Fc 도메인 또는 그의 변이체이다. 일부 구체예에서, 면역조절 단백질은 다이머이다. 일부 구체예에서, 면역조절 단백질은 호모다이머이다. 일부 경우에서, 면역조절 단백질은 헤테로다이머이다.
[37] 일부 구체예에서, 본 발명에 따라 본원에 설명된 어느 하나의 구체예에 따른 변이체 CD80 또는 모이어티에 연결된 본원에 설명된 어느 하나의 구체예 따른 면역조절 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 구체예에서, 상기 모이어티는 세포 표면 상의 분자에 특이적으로 결합하는 표적화 모이어티이다. 일부 구체예에서, 표적화 모이어티는 면역 세포의 표면 상의 분자에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 면역 세포는 항원 제시 세포 또는 림프구이다. 일부 구체예에서, 표적화 모이어티는 종양 표면 상에 분자에 결합하는 종양-위치화 모이어티이다. 일부 구체예에서, 모이어티는 단백질, 펩타이드, 핵산, 소분자 또는 나노입자이다. 일부 구체예에서, 모이어티는 항체 또는 항원-결합 단편이다. 임의의 이러한 구체예들 중 일부에서, 컨쥬게이트는 2가, 4가, 6가 또는 8가이다.
[38] 일부 구체예에서, 본 발명에 따라 본원에 설명된 어느 하나의 구체예에 따른 변이체 CD80을 인코딩하는 핵산 분자 또는 본원에 설명된 어느 하나의 구체예에 따른 면역조절 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 합성 핵산이다. 일부 구체예에서, 핵산은 cDNA이다.
[39] 일부 구체예에서, 본 발명에 따라 본원에 설명된 어느 하나의 구체예의 핵산을 포함하는 벡터가 제공된다. 일부 구체예에서, 벡터는 발현 벡터이다.
[40] 일부 구체예에서, 벡터는 포유동물 벡터 또는 바이러스 벡터이다.
[41] 일부 구체예에서, 본 발명에 따라 본원에 설명된 어느 하나의 구체예에 따fms 벡터를 포함하는 세포가 제공된다. 일부 구체예에서, 세포는 포유동물 세포이다. 일부 구체예에서, 세포는 인간 세포이다.
[42] 일부 구체예에서, 본 발명에 따라 본원에 설명된 어느 하나의 구체예에 따른 핵산 분자 또는 본원에 설명된 어느 하나의 구체예에 따른 벡터를, 세포에서 단백질을 발현하기 위한 조건 하에 숙주 세포 내로 도입하는 것을 포함하는, 변이체 CD80 폴리펩타이드 또는 면역조절 단백질의 제조방법이 제공된다. 일부 구체예에서, 이 방법은 변이체 CD80 폴리펩타이드 또는 면역조절 단백질을 세포로부터 단리 또는 정제하는 것도 포함한다.
[43] 일부 구체예에서, 본 발명에 따라 본 발명에 설명된 임의의 구체예에 따른 변이체 CD80 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 분자를 숙주 세포 내로 폴리펩타이드가 상기 세포에서 발현되는 조건 하에 도입하는 것을 포함하는, 변이체 CD80 폴리펩타이드를 발현하는 세포의 조작 방법이 제공된다.
[44] 일부 구체예에서, 본 발명에 따라 본원에 설명된 어느 하나의 구체예에 따른 변이체 CD80 폴리펩타이드를 발현하는 조작된 세포, 본원에 설명된 어느 하나의 구체예에 따른 면역조절 단백질, 본원에 설명된 어느 하나의 구체예에 따른 핵산 분자, 또는 본원에 설명된 어느 하나의 구체예에 따른 벡터가 제공된다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드 또는 면역조절 폴리펩타이드는 시그널 펩타이드를 함유한다. 일부 측면에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드 또는 면역조절 폴리펩타이드는 막관통 도메인을 함유하지 않으며 및/또는 세포 표면에서 발현되지 않는다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드 또는 면역조절 폴리펩타이드는 조작된 세포로부터 분비된다.
[45] 일부 구체예에서, 조작된 세포는 막관통 도메인을 함유하는 변이체 CD80 폴리펩타이드를 함유하며 및/또는 본원에 설명된 어느 하나의 구체예에 따른 막관통 면역조절 단백질이다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 세포 표면에서 발현된다.
[46] 일부 구체예에서, 조작된 세포는 면역 세포이다. 일부 구체예에서, 면역 세포는 항원 제시 세포 (APC) 또는 림프구이다. 일부 구체예에서, 조작된 세포는 일차 세포(primary cell)이다. 일부 구체예에서, 조작된 세포는 포유동물 세포이다. 일부 구체예에서, 조작된 세포는 인간 세포이다. 일부 구체예에서, 림프구는 T 세포이다. 일부 구체예에서, APC는 인공 APC이다.
[47] 임의의 이러한 구체예들 중 일부에서, 조작된 세포는 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 조작된(engineered) T-세포 수용체를 함유한다.
[48] 또한 본원에 설명된 임의의 구체예에 따른 변이체CD80 폴리펩타이드 또는 본원에 설명된 임의의 구체예에 따른 면역조절 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 감염 물질(infectious agent)도 제공된다. 일부 사레에서, 인코딩된 변이체 CD80 폴리펩타이드 또는 면역조절 폴리펩타이드는 막관통 도메인을 함유하지 않거나 및/또는 이들이 그 내부에서 발현되는 세포의 표면에서 발현되지 않는다. 일부 구체예에서, 인코딩된 변이체 CD80 폴리펩타이드 또는 면역조절 폴리펩타이드는 이들이 그 내부에서 발현되는 세포로부터 분비된다. 일부 측면에서, 인코딩된 변이체 CD80 폴리펩타이드는 막관통 도메인을 함유한다. 일부 측면에서, 인코딩된 변이체 CD80 폴리펩타이드는 이들이 그 내부에서 발현되는 세포의 표면에서 발현된다.
[49] 임의의 이러한 구체예들 중 일부에서, 감염 물질은 세균 또는 바이러스이다. 일부 경우에서, 바이러스는 항암 바이러스(oncolytic virus)이다. 일부 구체예에서, 항암 바이러스는 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 바이러스, 대상포진 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 레오바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 파보바이러스, 홍역 바이러스, 수포성 구내염 바이러스 (VSV), 콕사키 바이러스 또는 백시니아 바이러스이다. 일부 구체예에서, 바이러스는 구체적으로 수지상 세포 (DC)를 표적으로 삼거나 및/또는 수지상 세포-지향성(dendritic cell-tropic)이다. 경우에 따라 바이러스는 변형된 신드비스 바이러스 엔벨로프 산물로 슈도타이프된 렌티바이러스 벡터이다.
[50] 임의의 이러한 구체예들 중 일부에서, 감염 물질은 표적 세포의 사멸을 야기하거나 또는 면역 반응을 개시 또는 부스트할 수 있는 또 다른 유전자 산물을 인코딩하는 핵산 분자를 더 함유한다. 일부 구체예에서, 이러한 추가의 유전자 산물은 항암제, 항대사제, 항혈관형성제, 면역조절 분자, 면역 체크포인트 억제제, 항체, 사이토카인, 성장 인자, 항원, 세포독성 유전자 산물, 프로-아폽토시스 유전폽토시스 유전자 산물, 항-아폽토시스 유전자 산물, 세포 매트릭스 분해 유전자, 조직 재생을 위한 유전자 또는 인간의 체세포를 다분화능으로 재프로그램하는 유전자로부터 선택된다.
[51] 일부 구체예에서, 본 발명에 따라 본원에 설명된 임의의 구체예에 따른 변이체 CD80 폴리펩타이드, 본원에 설명된 임의의 구체예에 따른 면역조절 단백질, 본원에 설명된 어느 하나의 구체예에 따른 컨쥬게이트, 또는 본원에 설명된 어느 하나의 구체예에 따른 조작된 세포를 포함하는, 의약 조성물이 제공된다. 일부 구체예에서, 의약 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 의약 조성물은 멸균성이다.
[52] 일부 구체예에서, 본 발명에 따라 본원에 설명된 임의의 구체예에 따른 의약 조성물을 바이알에 포함하는 제조 물품이 제공된다. 일부 구체예에서, 바이알은 밀봉된 것이다
[53] 일부 구체예에서, 본 발명에 따라 본원에 설명된 어느 하나의 구체예에 따른 의약 조성물을 사용 지침을 포함하는 키트가 제공된다. 일부 구체예에서, 본 발명에 따라 본원에 설명된 어느 하나의 구체예에 따른 제조 물품 및 사용 지침을 포함하는 키트가 제공된다.
[54] 일부 구체예에서, 본 발명에 따라 본원에 설명된 임의의 구체예에 따른 의약 조성물을 대상자에게 투여하는 것을 포함하는, 대상자에 있어서 면역 반응을 조절하는 방법이 제공된다. 일부 구체예에서, 이러한 방법은 본원에 설명된 임의의 구체예에 따른 조작된 세포를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 조작된 세포는 대상자에게 자가(autologous)이다. 일부 구체예에서, 조작된 세포는 대상자에게 동종(allogenic)이다.
[55] 일부 구체예에서, 면역 반응의 조절은 대상자에 있어서 질병 또는 병태(condition)을 치료한다. 일부 구체예에서, 면역 반응은 증가된다. 일부 구체예에서, 종양-위치화(tumor-localizing) 모이어티에 연결된 변이체 CD80 폴리펩타이드를 포함하는 면역조절 단백질 또는 컨쥬게이트가 대상자에게 투여된다. 일부 경우에서, 종양-위치화 모이어티는 종양 항원을 인식하는 결합 분자이거나 또는 종양 항원을 인식하는 결합 분자를 함유한다. 일부 사례에서 상기 결합 분자는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 함유하거나 또는 야생형 IgSF 도메인 또는 그의 변이체를 함유한다.
[56] 일부 구체예에서, 본원에 설명된 어느 하나의 구체예에 따른 면역조절 단백질 또는 본원에 설명된 어느 하나의 구체예에 따른 컨쥬게이트를 포함하는 의약 조성물이 대상자에게 투여된다. 일부 구체예에서, 막관통 면역조절 단백질인 변이체 CD80 폴리펩타이드를 포함하는 조작된 세포가 대상자에게 투여되거나 및/또는 본원에 설명된 어느 하나의 구체예에 따른 조작된 세포가 대상자에게 투여된다.
[57] 일부 구체예에서, 막관통 면역조절 단백질인 변이체 CD80 폴리펩타이드를 인코딩하는 감염 물질이, 선택적으로, 상기 감염 물질이 종양 세포 또는 면역 세포를 감염시켜 막관통 면역조절 단백질이 상기 감염된 세포의 표면에서 발현되는 조건 하에서, 대상자에게 투여된다. 일부 측면에서, 막관통 면역조절 단백질은 본원에 설명된 어느 하나의 구체예에 따른 막관통 면역조절 단백질이다.
[58] 일부 구체예에서, 질병 또는 병태는 종양 또는 암이다. 일부 구체예에서, 질병 또는 병태는 흑색종, 폐암, 방광암, 혈액학적 악성종양, 간암, 뇌암, 신장암, 유방암, 췌장암, 대장암, 비장암, 전립선암, 고환암, 난소암, 자궁암, 위암, 근골격계암, 두경부암, 위장관암, 생식세포 암, 또는 내분비 및 신경 내분비 세포 암으로부터 선택된다.
[59] 일부 구체예에서, 면역 반응은 면역 반응을 조절하는 본 발명의 방법에 의해 감소된다.
[60] 일부 구체예에서, 가용성인 변이체 CD80 폴리펩타이드 또는 면역조절 단백질이 대상자에게 투여된다. 일부 경우에서, 가용성 폴리펩타이드 또는 면역조절 단백질은 Fc 융합 단백질이다. 임의의 이러한 구체예들 중 일부에서, 본원에 설명된 어느 하나의 구체예에 따른 변이체 CD80 폴리펩타이드, 또는 본원에 설명된 어느 하나의 구체예에 따른 면역조절 단백질을 포함하는 의약 조성물이 대상자에게 투여된다. 일부 구체예에서, 분비가능한 변이체 CD80 폴리펩타이드를 포함하는 조작된 세포가 대상자에게 투여된다. 일부 구체예에서, 본원에 설명된 어느 하나의 구체예에 따른 조작된 세포가 대상자에게 투여된다.
[61] 일부 구체예에서, 분비가능한 면역조절 단백질인 변이체 CD80 폴리펩타이드를 인코딩하는 감염 물질이, 선택적으로 상기 감염 물질이 종양 세포 또는 면역 세포를 감염시켜 분비가능한 면역조절 단백질이 감염된 세포로부터 분비되도록 하는 조건 하에서, 대상자에게 투여된다.
[62] 임의의 이러한 구체예들 중 일부에서, 질병 또는 병태는 염증성 또는 자가면역 질병 또는 병태이다. 일부 구체예에서, 질병 또는 병태는 항호중구 세포질 항체 (ANCA)-관련 혈관염, 혈관염, 자가면역 피부 질환, 이식, 류마티스성 질환, 염증상 위장관 질환, 염증상 안질환, 염증상 신경 질환, 염증상 폐질환, 염증성 내분비 질환, 또는 자가면역 혈액학적 질환이다. 일부 구체예에서, 질병 또는 병태는 염증성 장질환, 골이식, 크론씨병, 궤양성 대장염, 다발성 경화증, 천식, 류마티스성 관절염 또는 건선으로부터 선택된다.
[63] 도 1A-1C는 제공된 변이체 IgSF 도메인 분자의 다양한 포맷을 도시한 도면이다. 도 1A는: (1) Fc 사슬에 융합된, 변이체 IgSF 도메인 (vIgD), 예컨대 변이체 CD80; (2) 제1 변이체 IgSF 도메인 (제1 vIgD), 예컨대 변이체 CD80, 및 제2 IgSF 도메인, 예컨대 제2 변이체 IgSF 도메인 (제2 vIgD)를 함유하는 적층 분자; (3) 제1 변이체 IgSF 도메인 (vIgD), 예컨대 변이체 CD80, 및 종양 항원을 표적화하는 IgSF 도메인, 예컨대 NkP30 IgSF 도메인을 함유하는 종양 표적화 IgSF 분자; 및 (4) 항체 (V-Mab)에 연결된, 변이체 IgSF 도메인 (vIgD), 예컨대 변이체 CD80를 비롯한 가용성 분자를 도시한 도면이다. 도 1B는 세포 표면에서 발현된 변이체 IgSF 도메인 (vIgD)을 함유하는 막관통 면역조절 단백질 (TIP)을 나타낸 도면이다. 예시적인 일 구체예에서, 막관통 결합 vIgD의 동족 결합 파트너는 공동자극 수용체이고 vIgD을 함유하는 TIP(예컨대 CD80 vIgD)는 공동자극 수용체를 자극하여 TIP가 공동자극 수용체를 발현하는 세포에서 양성 시그널을 유도한다. 도 1C는 변이체 IgSF 도메인 (vIgD)이 세포, 예컨대 제1 T 세포 (예컨대 CAR T 세포)로부터 분비되는, 분비된 면역조절 단백질 (SIP)을 나타낸다. 예시적인 일 구체예에서, 분비된, vIgD의 동족 결합 파트너는 제1 세포 (예컨대 T 세포) 및/또는 제2 세포 (예컨대 T 세포; 내인성 또는 조작된, 예컨대 CAR T 세포) 상에서 발현될 수 있는, 예컨대 CD28과 같은 활성화 수용체이다. SIP가 그의 동족 결합 파트너와 결합되면, 활성화 수용체를 통한 시그널링이 차단된다. 모든 경우, vIgD는 V-도메인 (IgV) 단독, 조합 전체 세포외 도메인(ECD)을 비롯하여, V-도메인 (IgV)과 C-도메인 (IgC)의 조합, 또는 IgSF 수퍼패밀리 멤버의 Ig 도메인들의 임의 조합일 수 있다.
[64] 도 2는 vIgD가 CD80의 IgSF 도메인의 변이체인 Fc (vIgD-Fc)에 융합된 변이체 IgSF 도메인 (vIgD)의 활성화를 나타내는 예시적인 개략도이다. 도시된 바와 같이, CD80의 가용성 vIgD는 그의 동족 결합 파트너와 상호작용하여 CD28의 상호 작용을 각각 차단함으로써 CD28 공동자극 수용체에 의한 공동자극을 차단한다.
[65] 도 3은 변이체 IgSF 도메인 (vIgD)을 종양 세포에 위치시키기 위한 적층 분자의 예시적인 개략도이다. 이 포맷에서 적층 분자는 제1 변이체 IgSF 도메인 (first vIgD) 및 제2 IgSF 도메인 (예컨대 제2 vIgD)를 포함하는데 여기서 상기 제2 IgSF 도메인 (예컨대 제2 vIgD)은 종양 항원에 결합하는 종양-표적화된 IgSF 도메인이다. 예시적인 종양-표적화된 IgSF 도메인은 종양 항원 B7-H6에 결합하는 NkP30의 IgSF 도메인이다. 이 그림에서 vIgD는 CD80의 IgSF 도메인의 변이체이다. 도시된 바와 같이, 종양-표적화된 IgSF 도메인의 종양 세포 표면에 대한 결합은 종양 세포 표면에서 제1 vIgD를 국소화하는데 여기서 이것은 인접 면역 세포(예컨대 T 세포) 표면에서 발현되는 그의 동족 결합 파트너 (예컨대 CD28)들 중 하나 이상과 상호작용하여 공동자극 수용체를 자극시킬 수 있다.
[66] 도 4는 제1 변이체 IgSF 도메인 (제1 vIgD) 및 제2 IgSF 도메인, 예컨대 제2 변이체 IgSF 도메인 (제2 vIgD)을 함유하는 적층 분자의 예시적인 다양한 배열을 나타낸 도면이다. 도시된 바와 같이, 제1 vIgD 및 제2 IgSF 도메인은 Fc 서브유닛의 N-또는 C-말단에 직접 또는 간접적으로 독립적으로 연결된다. 호모다이머 Fc 분자 생성에 있어, Fc 서브유닛은 세포 내 개별적인 Fc 서브유닛의 공동-발현에 의해 맷칭된 Fc 서브유닛과 호모다이머를 형성할 수 있는 것이다. 헤테로다이머 Fc 분자 생성에 있어, 개별적인 Fc 서브유닛들은 돌연변이(에컨대 CH3 도메인에 있어 "구멍에 손잡이(knob-into-hole)" 돌연변이)를 함유하여, 상기 개별적인 Fc 서브유닛들이 세포에서 공동발현될 경우 호모다이머에 비해 헤테로다이머 형성이 선호된다.
[67] 도 5는 항체 (V-Mab)에 컨쥬게이트된 변이체 IgSF 도메인 (vIgD)의 활성화를 예시적으로 도시한 도면으로서 여기서 상기 항체 (예컨대 항-HER2 항체)는 종양 세포의 표면 상의 항원과 결합하는 것이다. 이 도면에서, vIgD는 CD80의 IgSF 도메인의 변이체이다. 도시된 바와 같이, 종양 세포 표면에 대한 항체 결합은 종양 세포 표면에서 vID를 국소화하는데 여기서 이것은 인접 면역 세포(예컨대 T 세포) 표면에서 발현되는 그의 동족 결합 파트너들 중 하나 이상과 상호작용하여 수용체 시그널링을 자극시킬 수 있다. 도시된 예시적인 일 구체예에서, 변이체 IgSF 도메인 (vIgD)은 CD80의 IgSF 도메인의 변이체이다. CD80 vIgD의 CD28 공동자극 수용체에 대한 결합은 아고니스트 또는 공동자극 시그널을 제공한다.
[68] 도 6A-6C는 항체 (V-Mab)에 컨쥬게이트된 변이체 IgSF 도메인 (vIgD)의 예시적인 다양한 배열을 나타낸 도면이다. 도 6A는 vIgD가 항체의 경쇄의 N-및/또는 C-말단에 직접 또는 간접적으로 연결되어 있는 다양한 배치를 나타낸다. 도 6B는 vIgD가 항체의 중쇄의 N-및/또는 C-말단에 직접 또는 간접적으로 연결되어 있는 다양한 배치를 나타낸다. 도 6C는 도 6A의 경쇄 및 도 6B의 중쇄가 세포에서 공동-발현되는 경우의 결과적인 V-Mab의 배열을 나타낸 도면이다.
[69] 도 7A는 표지되지 않은 재조합 인간 PD-L1-his, 인간 CTLA-4-his 또는 인간-PD-L2-Fc 융합 단백질의 존재 하에 변이체 CD80 A91G ECD-Fc 융합 분자에 대한 바이오티닐화된 재조합 CD28 Fc 융합 단백질 (rCD28.Fc)의 결합에 있어서의 경쟁적 결합 분석 결과를 나타낸 도면이다.
[70] 도 7B는 표지되지 않은 재조합 인간 rCD28.Fc, 인간 CTLA-4.Fc 또는 인간 PD-L2.Fc의 존재 하에 고정된 변이체 CD80 A91G ECD-Fc 융합 분자에 대한 바이오티닐화된 재조합 인간 PD-L1-his 모노머 단백질의 결합에 대한 경쟁 결합 분석 결과를 나타낸 도면이다.
[71] 도 8은 표적 항원-발현 세포와 공동-배양 후, 항-CD19 키메라 항원 수용체 (CAR) 단독 또는 예시적인 막관통 면역조절 TIP (CD80-TIP 또는 ICOSL-TIP) 또는 상응하는 CD80 또는 ICOSL 야생형 막관통 단백질에 의해 조작된 세포의 세포독성 사멸 활성을 반영하는 임피던스 결과를 나타낸 도면이다. 임피던스는 AceaReal-Time Cell Analyzer (RTCA)를 사용하여 평가되었으며, 96-웰 마이크로전자 플레이트(E-plate)의 배지에서 임피던스 변화를 측정한다.
상세한 설명
[72] 본원에 따라 적어도 하나의 표적 리간드 동족 결합 파트너(카운터-구조물 리간드 단백질이라고도 칭함)에 대해 변경된 결합 활성 또는 친화성을 나타내는 CD80의 변이체 또는 돌연변이체 및 그의 특이적 결합 단편인 또는 이들을 포함하는 면역조절 단백질이 제공된다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 비변형 또는 야생형 CD80 폴리펩타이드에 비해 하나 이상의 아미노산 변형(예컨대 아미노산 치환, 결실 또는 부가)을 함유한다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 비변형 또는 야생형 CD80 폴리펩타이드에 비해 하나 이상의 아미노산 변형(예컨대 아미노산 치환)을 함유한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 변형(예컨대 아미노산 치환)은 비변형 또는 야생형 CD80 폴리펩타이드의 IgSF 도메인(예컨대 IgV)에서 일어난다. 일부 구체예에서, 변경된 결합 활성 또는 친화성, 예컨대 증가 또는 감소된 활성 또는 친화성은, 동족 결합 파트너 단백질인 CD28, PD-L1, 또는 CTLA-4 중 적어도 하나에 대한 것이다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 하나 이상의 변형을 함유하지 않는 비변형 또는 야생형 CD80에 비해, CD28, PD-L1, 또는 CTLA-4 중 하나 이상에 대해 변경된, 예컨대 증가 또는 감소된 결합 활성 또는 친화성을 나타낸다. 일부 구체예에서, 면역조절 단백질은 가용성이다. 일부 구체예에서, 면역조절 단백질은 세포 표면에서 발현될 수 있는 막관통 면역조절 단백질이다. 일부 구체예에서, 본원에 따라 본원에서 제공된 변이체 CD80 폴리펩타이드 및 하나 이상의 다른 모이어티 또는 폴리펩타이드를 함유하는 컨쥬게이트 또는 융합체인 하나 이상의 다른 면역조절 단백질도 제공된다.
[73] 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 하나 이상의 변형을 포함하지 않는 비변형 또는 야생형 CD80에 비해, CD28, PD-L1, 또는 CTLA-4 중 하나 이상에 대해 증가된 결합 친화성을 나타낸다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 하나 이상의 변형을 포함하지 않는 비변형 또는 야생형 CD80에 비해, CD28, PD-L1, 또는 CTLA-4 중 하나 이상에 대해 감소된 결합 친화성을 나타낸다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 하나 이상의 변형을 포함하지 않는 비변형 또는 야생형 CD80에 비해, CD28, PD-L1, 또는 CTLA-4 중 하나 이상에 대해 증가된 결합 친화성과, CD28, PD-L1, 또는 CTLA-4 중 또 다른 하나 이상에 대해 감소된 결합 친화성을 나타낸다.
[74] 일부 구체예에서, 본 발명에서 제공된 변이체 CD80 폴리펩타이드 및 하나 이상의 다른 모이어티 또는 폴리펩타이드를 함유하는 컨쥬게이트 또는 융합체인 하나 이상의 다른 면역조절 단백질도 제공된다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드 및 면역조절 단백질은 면역학적 면역 반응을 조절, 예컨대 면역 반응을 증가 또는 감소시킨다. 일부 구체예에서, 본원에서 제공된 변이체 CD80 폴리펩타이드 및 면역조절 단백질은 조절 능력이 상실된(dysregulated) 면역 반응과 관련된 질병 또는 병태의 치료에 이용될 수 있다.
[75] 일부 구체예에서, 제공된 변이체 CD80 폴리펩타이드는 공동자극 시그널링 분자들과의 상호작용을 통해 T 세포 활성화를 조절한다. 일반적으로, 항원 특이적 T-세포 활성화는 대체로 2 가지 구별되는 시그널을 필요로 한다. 제1 시그널은 항원 제시 세포 (APC) 상에 존재하는 주요 조직적합 복합체(MHC) 관련 항원과 T-세포 수용체 (TCR)와의 상호작용에 의해 제공된다. 제2 시그널은 TCR 개입에 대해 공동자극성이고 T-세포 아폽토시스 또는 아네르기 (anergy)를 피하는데 필요하다.
[76] 일부 구체예에서, 정상적인 생리 조건 하에서, T 세포-매개된 면역 반응은 T 세포 수용체 (TCR)에 의한 항원 인식에 의해 개시되며 공동-자극과 억제 시그널 (예컨대, 면역 체크포인트 단백질)의 밸런스에 의해 조절된다. 면역계는 자가면역성(즉, 자가-관용성)을 방지하고 면역 반응 동안, 예를 들어 병원체 감염에 대한 공격 동안 조직을 과도한 손상으로부터 보호하기 위해 면역 체크포인트에 의존한다. 그러나 일부 경우에서, 이들 면역조절 단백질은 면역계를 공격하는 메카니즘으로서, 종양을 비롯한 질병 및 병태에서 조절불능될 수 있다.
[77] 일부 구체예에서, T-세포 공동자극 수용체로서, 리간드 B7-1 (CD80) 및 B7-2 (CD86) (이들 두 가지 모두 APC 상에 존재함)에 대한 T-세포 공동자극 수용체인, CD28이 알려져 있다. 이들 동일한 리간드들은 또한 CD28에 대해서보다 더 큰 친화성으로 억제 T-세포 수용체 CTLA-4 (세포독성 T-림프구-관련 단백질 4)에 결합할 수도 있다; CTLA-4에 대한 결합은 면역 반응을 하향-조절하는 작용을 한다. 마찬가지로, CD80은 프로그램된 사멸(death) 리간드 1 (PD-L1)에 결합할 수 있다. PD-L1은 또한 면역 활성화의 음성 조절자이기도 하고 프로그램된 사멸 1 (PD-1) 수용체와의 상호작용을 통해 면역 반응을 하향-조절할 수 있다. PD-L1에 대한 CD80의 결합은 PD-L1과 PD-1 간의 상호작용을 차단함으로 해서 면역 반응을 증강시키거나 개선시킬 수 있다. 그러므로, 일부 사례에서,CD80의 CD28 및 PD-L1과의 상호작용은 중복 및 상보적인 효과를 낼 수 있다.
[78] 일부 구체예에서, CD28 및 PD-L1은 면역 반응을 조절하는데 있어서 상보적인 역할을 할 수 있다. 이들 수용체 활성의 증강 또는 억압은 염증성 및 자가면역 질환, 암, 및 바이러스 감염의 치료에 있어 임상적 의미를 갖는다. 그러나, 일부 경우에서, 이들 두 가지 수용체의 공동자극 효과에 개입 및 변경하는 치료법은 면역학적 시냅스의 경계에 의해 부과된 크기 제한뿐만 아니라 공간 배향 요구에 의해 제약을 받는다. 일부 측면에서, 항체 약물을 비롯한 기존 치료 약물은 이들 상호작용의 조절과 관련된 복수개의 표적 단백질과 동시에 상호작용하지 못할 수 있다. 또한, 일부 사례에서,기존의 치료 약물은 면역 반응을 길항하는 능력만 있을 뿐 자극하는 능력은 없을 수 있다. 또한, 이들 두 수용체 중 하나 또는 다른 하나를 독자적으로 표적으로 하는 약물들 간의 약물동력학적 차이는 치료 과정 전반에 걸쳐 그러한 약물 조합의 원하는 혈액 농도를 적절히 유지하는데 어려움을 야기할 수 있다.
[79] 일부 구체예에서, 제공된 변이체 CD80 폴리펩타이드 또는 면역조절 단백질은 공동자극 수용체 CD28 또는 PD-L1, 일부 경우 CTLA-4와 연관되거나 또는 유도된 면역학적 활성을 조절(예컨대 증가 또는 감소)한다. 그러므로 일부 구체예에서, 제공된 폴리펩타이드는 제공된 CD28 및 PD-L1, 및 몇몇 경우 CTLA-4 모두에 독립적인 결합 친화성을 갖는 변이체 CD80을 제공함으로써 수용체에 의한 공동 자극의 상보적인 효과를 자극 또는 길항시킴으로써 이러한 제한을 극복한다. CD80의 이러한 변이체를 만들고 사용하는 방법도 제공된다.
[80] 특허, 특허 출원, 과학기사 및 데이터베이스를 비롯한 본 명세서에 언급된 모든 간행물은 마치 이들 특허, 특허 출원, 과학기사 및 데이터베이스가 개별적으로 그리고 구체적으로 참조 병합되는 것으로 표시된 것처럼, 그 내용 전체가 본 발명에 참조 병합된다. 만일 본 명세서에 제시된 정의가 본 명세서에 참조 병합된 특허, 특허 출원, 공개된 출원 및 기타 간행물에 제시된 정의와 상반되거나 일치하지 않을 경우, 본 명세서 상의 자체 정의가 이들 참조 병합된 문헌의 정의에 우선한다.
[81] 본 명세서에서 사용된 섹션 제목은 정리 목적을 위한 것일 뿐 설명된 주제를 한정하려는 의도로 제공된 것이 아니다.
I. 정의
[82] 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술용어, 각주, 및 기타 기술 및 과학용어들은 본 발명이 속한 기술분야의 통상의 기술자에 의해 공통적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는 것으로 의도된다. 몇몇 경우, 그 의미가 널리 이해되는 용어들도 명확성 및/또는 용이한 참조를 위해 본 명세서에 정의하였고, 본 명세서에 이들 정의가 포함되었다 해서 기술 분야에서 일반적으로 이해되는 것과 실질적인 차이를 나타내는 것으로 추정되어서는 아니된다.
[83] 본 명세서 전반에 걸쳐 사용되는 용어들은 특수한 경우 달리 언급되지 않는 한 하기 정의된 의미를 갖는다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위에서, 단수 형태 "a," "an," 및 "the"는 문맥상 명백히 달리 지시하지 않는 한 복수 의미를 아울러 포함한다. 달리 정의하지 않는 한, 본 명세서에 언급된 모든 기술 및 과학 용어들, 두문자어 및 약어들은 본 발명이 속한 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 흔히 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 달리 명시되지 않는 한, 화학 및 생화학명의 약칭 및 심볼은 IUPAC-IUB 명명법에 따른다. 달리 지시되지 않는 한, 모든 수치 범위는 범위를 한정하는 값들은 물론 그 사이의 정수 값들을 아울러 포함한다.
[84] 면역글로불린 수퍼패밀리 도메인의 문맥상 사용된 "변형된 친화성(affinity modified)"이라는 용어는, 포유동물 면역글로불린 수퍼패밀리(IgSF) 도메인이 변경된 아미노산 서열(대응하는 야생형의 모(母) IgSF 도메인 또는 비변형 IgSF 도메인에 비해)을 가짐으로 해서, 모(母) IgSF 도메인 또는 비변형 (즉, 비-친화성 변형된) IgSF 대조군 도메인에 비해, 그의 동족 결합 파트너들(달리, "카운터-구조물들") 중 적어도 하나에 대해 증가 또는 감소된 결합 친화성 또는 결합능(avidity)을 갖는 것을 의미한다. 문맥 상, 친화성 변형된 CD80 IgSF 도메인도 포함된다. 일부 구체예에서, 친화성-변형된 IgSF 도메인은 야생형 또는 변형되지 않은 IgSF 도메인에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개 또는 그 이상의 아미노산 차이, 예컨대 아미노산 치환을 함유할 수 있다. 결합 친화성 또는 결합능의 증가 또는 감소는 유세포 분석법과 같은 공지의 결합 분석법을 이용하여 알아낼 수 있다. Larsen 외, American Journal of Transplantation, Vol 5: 443-453 (2005). Linsley 외, Immunity, 1: 7930801 (1994) 참조. 어떤 단백질의 그의 동족 결합 파트너(들)에 대한 결합 친화성 또는 결합능의 증가는 야생형 IgSF 도메인 대조군의 값보다 적어도 10% 더 큰 값을 의미하며 일부 구체예에서, 야생형 IgSF 도메인 대조군 값에 비해 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 100%, 200%, 300%, 500%, 1000%, 5000%, 또는 10000% 더 큰 것을 의미한다. 어떤 단백질의 그의 동족 결합 파트너(들)에 대한 결합 친화성 또는 결합능의 감소는 대조군의 90% 이하 그러나 야생형 IgSF 도메인 대조군 값의 10% 이상의 값을 의미하고, 일부 구체예에서, 야생형 IgSF 도메인 대조군 값의 80% 이하, 70% 이하, 60% 이하, 50% 이하, 40% 이하, 30% 이하, 또는 20% 이하, 그러나 10% 이상의 값을 의미한다. 친화성 변형된 단백질은 아미노산 잔기의 치환, 부가 또는 결실에 의해 주요 아미노산 서열이 변경된 것이다. 용어 "친화성 변형된 IgSF 도메인"은 그 친화성 변형된 IgSF 도메인이 형성된 특정한 방법 또는 출발 조성물에 대해 어떠한 조건을 부과하는 것으로 상정되어서는 아니된다. 따라서, 본 발명의 친화성 변형된 IgSF 도메인들은 친화성 변형의 어떤 특정한 프로세스에 의해 친화성 변형된 IgSF 도메인으로 형질전환될 야생형 IgSF 도메인들로 한정되지 않는다. 친화성 변형된 IgSF 도메인 폴리펩타이드는, 예컨대, 야생형의 포유동물 IgSF 도메인 서열 정보로부터 출발하여 생성된 다음, 그의 동족 결합 파트너에 대한 결합에 관하여 가상적으로(in silico) 모델링된 다음 마지막으로, 친화성 변형된 IgSF 도메인 조성물의 생성을 위해 재조합적으로 또는 화학적으로 합성된다. 한 가지 별법 구체예에서, 친화성 변형된 IgSF 도메인은 야생형 IgSF 도메인의 위치-지향된(site-directed) 돌연변이에 의해 만들어질 수 있다. 따라서, 친화성 변형된 IgSF 도메인은 생성물을 가리키는 것이지, 반드시 주어진 프로세스에 의해 만들어진 생성물을 가리키는 것은 아니다. 재조합 방법, 화학적 합성법 또는 이들의 조합을 비롯한 다양한 기술을 이용할 수 있다.
[85] 본 명세서에서 용어 "동종이계(allogeneic)"이라 함은 하나의 생물체에서 제거된 다음 동일한 종의 유전적으로 다른 생물체로 주입되거나 입양적으로 전달된 세포 또는 조직을 의미한다. 본 발명의 일부 구체예에서, 종은 쥐 또는 인간이다.
[86] 본 명세서에서 용어 "자가 (autologous)"는 나중에 주입되거나 입양적으로 전달된 동일한 생물체로부터 제거된 세포 또는 조직을 의미한다. 자가 세포 또는 조직은 예를 들어, 재조합 DNA 방법론에 의해 변형될 수 있어, 생물체로부터 제거된 천연 세포 또는 천연 조직과 유전적으로 동일하지 않게 된다. 예를 들어, 천연의 자가 T 세포는 재조합 DNA 기술에 의해 유전적으로 조작되어 막관통 면역조절 단백질 및/또는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 자가 조작된 세포가 될 수 있는데, 이것은 몇몇 경우 T-세포 또는 TIL(종양 침윤 림프구)을 조작하는 것을 포함한다. 조작된 세포는 이어서 천연 T-세포가 분리된 환자에게 주입될 수 있다. 일부 구체예에서, 생물체는 인간 또는 쥐이다.
[87] 본 명세서에서 "결합 친화성(binding affinity)," 및 "결합능(binding avidity)"이라는 용어는 특수한 결합 조건 하에서, 어떤 단백질의 그의 카운터-구조물에 대한 특이적인 결합 친화성 및 특이적인 결합능을 각각 의미한다. 생화학적 동력학에서 결합능이라 함은 CD80과 그의 카운터-구조물인 PD-L1, CD28, 및/또는 CTLA-4 사이와 같이 개별적인 비공유 결합 상호 작용의 다중 친화력의 축적된 강도를 지칭한다. 따라서, 결합능은 단일 상호 작용의 강도를 나타내는 친화성과 구별된다. 친화성 변형된 CD80 IgSF 도메인을 함유하는 변이체 CD80의 그의 카운터-구조물에 대한 결합 친화성의 증가 또는 약화는 IgV 도메인과 같은 천연 또는 야생형 IgSF 도메인을 함유하는 비변형 CD80과 같은 비변형 CD80의 결합 친화성에 상대적으로 결정된다. 결합 친화성 또는 결합능을 결정하는 방법은 기술 분야에 알려져 있다. 예컨대, 문헌 [Larsen 외, American Journal of Transplantation, Vol 5: 443-453 (2005)] 참조. 일부 구체예에서, 예컨대 친화성 변형된 IgSF 도메인을 함유하는 변이체 CD80은 예컨대 실시예 6에 설명된 바와 같은 결합 분석에서 비변형 CD80 대조군에 비해 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 더 큰 평균 형광 강도(Mean Fluorescence Intensity: MFI) 값을 나타내는 결합 친화성을 갖는 것으로 유세포 분석법으로 측정되는 바와 같이 CD28, PD-L1 및/또는 CTLA-4에 특이적으로 결합한다.
[88] "생물학적 반감기(biological half-life)"라는 용어는 본 발명의 변이체 CD80 폴리펩타이드를 포함하는 면역 조절 폴리펩타이드와 같은 물질이 그의 약리학적 또는 생리학적 활성 또는 농도의 절반을 잃어버리는데 걸리는 시간을 가리킨다. 생물학적 반감기는 해당 물질의 제거, 배출, 분해(예컨대 효소 분해), 또는 신체 장기 또는 조직에서의 흡수 및 농축에 의해 영향받을 수 있다. 일부 구체예에서, 생물학적 반감기는 어떤 물질의 혈장 농도가 그의 정상 상태 수준의 절반에 도달하는데 걸리는 시간("혈장 반감기")을 측정함으로써 평가될 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드의 생물학적 반감기를 유도 및 증가시키는데 이용될 수 있는 컨쥬게이트는 기술분야에 공지이며 이의 비제한적인 예로는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 히드록시에틸 전분(HES), XTEN (연장된 재조합 펩타이드; WO2013130683 참조), 인간 혈청 알부민(HSA), 소 혈청 알부민(BSA), 지질(아실화), 및 폴리-Pro-Ala-Ser (PAS), 폴리글루탐산(글루타밀화)을 들 수 있다.
[89] 본 명세서에서 용어 "키메라 항원 수용체" 또는 "CAR"은 적어도 엑토도메인, 막관통, 및 엔도도메인을 포함하는 포유동물 세포 상에서 발현된 인공적인(즉, 사람이 만든) 막관통 단백질을 가리킨다. 선택적으로, CAR 단백질은 엑토도메인을 막관통 도메인에 공유적으로 링크시키는 "스페이서"를 포함한다. 스페이서는 종종 펩타이드 결합을 통해 엑토도메인을 막관통 도메인에 링크하는 폴리펩타이드이다. CAR은 일반적으로 포유동물 림프구 상에서 발현된다. 일부 구체예에서, CAR은 T-세포 또는 종양 침윤 림프구 (TIL)와 같은 포유동물 세포 상에서 발현된다. T-세포 상에서 발현된 CAR은 본 명세서에서 CAR T-세포 또는 "CAR-T"라 칭한다. 일부 구체예에서, CAR-T는 T 헬퍼 세포, 세포독성 T-세포, 내츄럴 킬러 T-세포, 메모리 T-세포, 조절 T-세포, 또는 감마 델타 T-세포이다. 예컨대 입양 세포 전달 등에서 임상적으로 사용될 경우, 환자의 종양에 대한 항원 결합 특이성이 있는 CAR-T는 일반적으로 그 환자로부터 수득된 천연 T-세포 상에서 발현되도록 조작된다. 그 다음 CAR을 발현하는 조작된 T-세포는 환자에게 다시 주입된다. 따라서 비록 동종이계 CAR-T가 본 발명의 범위 내에 포함되지만 CAR-T는 종종 자가 CAR-T이다. CAR의 엑토도메인은 생리학적 조건하에 종양 특이 항원과 같은 표적 항원과 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편 (예컨대 scFv)과 같은 항원 결합 영역을 포함한다. 특이적 결합시, 생화학적 연쇄 사건(즉, 시그널 형질도입: 시그널 transduction)은 CAR-T의 면역학적 활성의 조절을 초래한다. 따라서, 예를 들어, CAR-T의 항원 결합 영역에 의한 그의 표적 항원에 대한 특이적 결합시 세포 독성, 증식 또는 사이토카인 생성의 변화에 의해 반영되는 T-세포 활성의 면역학적 활성의 변화가 야기될 수 있다. CAR-T 활성화시 시그널 형질도입은 일부 구체예에서 천연 포유동물 T-세포에서 시그널 형질도입에 관여하는 CD3-제타 사슬 ("CD3-z")에 의해 달성된다. CAR-T는 T-세포의 면역조절 반응을 추가로 조절하기 위해, CD28, 41BB 또는 OX40과 같은 복수개의 시그널링 도메인들을 추가로 포함할 수 있다. CD3-z은 T-세포 수용체 시그널 형질도입에 관여하는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)로서 알려진 보존적 모티프를 포함한다.
[90] 시험관내 분석시 2 이상의 변이체 CD80 폴리펩타이드의 존재 하에 유도되는 사이토카인 생산과 관련하여 사용될 경우 "집합적으로" 또는 "집합적"이라는 용어는, 개별적인 변이체 CD80 폴리펩타이드에 의해 유도되는 사이토카인 생산과 무관하게 전체적인 사이토카인 발현 수준을 의미한다. 일부 구체예에서, 분석되는 사이토카인은 실시예 7에 설명된 바와 같은 시험관내 일차 T-세포 분석에서 IFN-감마이다.
[91] 변이체 CD80의 IgSF 도메인 관련에서와 같이, 폴리펩타이드와 관련된 "동족 결합 파트너" ("카운터-구조물")이라는 용어는 특정 결합 조건 하에서 문제의 폴리펩타이드가 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 분자(일반적으로 천연 포유동물 단백질)을 가리킨다. 일부 측면에서, 친화성 변형된 IgSF 도메인을 함유하는 변이체 CD80은 증가 또는 약화된 친화성으로 대응하는 천연 또는 야생형 CD80의 카운터-구조물에 특이적으로 결합한다. 특이적 결합 조건 하에서 그의 동족 수용체를 인식하여 특이적으로 결합하는 리간드 종은 그 수용체의 카운터-구조물 또는 동족 결합 파트너의 일례이다. "동족 세포 표면 결팝 파트너"는 포유동물 세포 표면에서 발현된 동족 결합 파트너이다. "세포 표면 분자종"은 면역학적 시냅스를 형성하는 포유동물 세포 등의 세포에 의해 그리고 세포 상에 발현되는 면역학적 시냅스(IS)의 리간드의 동족 결합 파트너이다.
[92] 본 명세서에서 "컨쥬게이트", "컨쥬게이션" 또는 이의 문법적 파생어는 2 이상의 화합물들이 기술분야에 알려진 임의의 결합 또는 연결 방법에 의해 한데 결합 또는 연결되어 다른 화합물이 형성되는 것을 가리킨다. 이것은 2 이상의 화합물의 결합 또는 연결에 의해 생성되는 화합물을 가리키는 것일 수도 있다. 예를 들어, 1 이상의 화학적 모이어티 또는 폴리펩타이드에 직접 또는 간접적으로 연결된 변이체 CD80 폴리펩타이드는 예시적인 컨쥬게이트이다. 이러한 컨쥬게이트들에는 융합 단백질, 화학적 컨쥬게이트에 의해 생성된 것들 및 다른 방법에 의해 생성된 것들이 포함된다.
[93] 본 명세서에서 "경쟁적 결합(competitive binding)"이라는 용어는 어떤 단백질이 적어도 2개의 동족 결합 파트너들과 특이적으로 결합할 수 있으나 하나의 동족 결합 파트너의 그 특이적인 결합이 제2 동족 결합 파트너의 동시적인 결합을 방지 또는 배제하는 것과 같이 저해하는 것을 의미한다. 그러므로, 몇몇 경우에서, 단백질이 2개의 동족 결합 파트너에 동시에 결합할 수는 없다. 일반적으로, 경쟁적 바인더는 특이적인 결합에 대하여 동일하거나 중복적인 결합 부위를 함유하지만, 반드시 요구되는 것은 아니다. 일부 구체예에서, 경쟁적 결합은 제2 동족 결합 파트너의 특이적인 결합으로 인해, 그의 동족 결합 파트너 중 하나에 대한 단백질의 특이적 결합을 측정가능하게 억제한다(부분적 억제 또는 완전한 억제). ELISA(효소결합면역흡수 분석법)와 같이, 경쟁적 결합을 정량하는 다양한 방법이 알려져 있다.
[94] 본 명세서에서 "보존적 아미노산 치환"이라는 용어는 어떤 아미노산 잔기가, 화학적 특성(예컨대 전하 또는 소수성)이 유사한 측쇄 R기를 갖는 다른 아미노산 잔기에 의해 치환되는 아미노산 치환을 의미한다. 화학적 특성이 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 그룹의 예로는: 1) 지방족 측쇄: 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신; 2) 지방족-히드록시 측쇄: 세린 및 트레오닌; 3) 아미드-함유 측쇄: 아스파라긴 및 글루타민; 4) 방향족 측쇄: 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판; 5) 염기성 측쇄: 리신, 아르기닌 및 히스티딘; 6) 산성 측쇄: 아스파트산 및 글루탐산; 및 7) 함황 측쇄: 시스테인 및 메티오닌을 들 수 있다. 보존적 아미노산 치환 그룹으로는 다음을 들 수 있다: 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린, 글루타메이트-아스파테이트 및 아스파라긴-글루타민.
[95] 단백질 위치와 관련하여 "대응하는(corresponding to)"이라는 용어, 예컨대, 개시된 서열, 예컨대 서열 목록 내의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 위치에 "대응하는" 뉴클레오타이드 또는 아미노산 위치라 함은 구조적인 서열 정렬 또는 GAP 알고리듬과 같은 표준 정렬 알고리듬에 기초하여, 개시된 서열과의 정렬에 의해 동정된 뉴클레오타이드 또는 아미노산 위치를 가리킨다. 예를 들어, 대응하는 잔기들은 레퍼런스 서열을 본 명세서에 설명된 구조 정렬 방법에 의해 SEQ ID NO:28 (ECD 도메인) 또는 SEQ ID NO:152 또는 372 (IgV 도메인)에 제시된 야생형 CD80의 서열과 정렬시킴으로써 결정될 수 있다. 서열들을 정렬함으로써, 통상의 기술자는 예컨대 보존된 그리고 동일한 아미노산 잔기들을 가이드로 사용하여, 대응하는 잔기들을 동정할 수 있다.
[96] 본 명세서에서 "감소하다(decrease)" 또는 "약화되다/감쇠하다(attenuate)" 또는 "억제하다(suppress)" 등의 용어는 통계적으로 유의한 양으로 감소한다는 의미이다. 감소는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%일 수 있다.
[97] "유도체" 또는 "유도되다"라는 용어는 단백질을 직접 도는 간접적으로 조성물에 공유적으로 연결시켜 변형시킴으로써 생물학적 반감기, 생체이용성, 면역원성, 가용성, 독성, 강도 또는 효능을 그의 치료학적 이점을 유지 또는 증강시키면서 변경시키는 것을 의미한다. 본 발명의 면역조절 폴리펩타이드의 유도체는 본 발명의 범위에 속하며 예를 들어 글리코실화, 페길화, 지질화 또는 Fc-융합체에 의해 만들어질 수 있다.
[98] 본 본 명세서에서, 도메인 (일반적으로 3개 이상, 일반적으로 5개 또는 7개 또는 그 이상의 아미노산, 예컨대 10 내지 200개의 아미노산 잔기)은 단백질 또는 인코딩 핵산과 같은 어떤 분자의 다른 부분들과 구조적 및/또는 기능적으로 구별되는, 그 분자의 어떤 부분을 가리키는 것으로 동정가능한 부분을 의미한다. 예를 들어, 도메인들에는 하나 이상의 구조적 모티프로 만들어진 단백질 내에서 독립적으로 폴딩된 구조를 형성할 수 있는, 및/또는 결합 활성과 같은 기능적 활성에 의해 인식되는, 폴리펩타이드 사슬의 일부가 포함된다. 하나의 단백질은 하나 또는 복수개의 구별되는 도메인들을 가질 수 있다. 예를 들어, 주요(primary) 서열 상동성 또는 관련된 패밀리 멤버들에 대한 구조 상동성, 예컨대 모티프에 대한 상동성에 의해, 도메인을 동정, 정의 또는 구별할 수 있다. 또 다른 예에서, 도메인은 동족 결합 파트너와 같은, 바이오분자와 상호반응하는 능력과 같은, 그의 기능에 의해 구별될 수 있다. 도메인은 생물학적 기능 또는 활성을 독립적으로 나타낼 수 있으므로, 도메인은 독립적으로 또는 다른 분자에 융합되어 예컨대 결합과 같은 활동을 수행할 수 있다. 도메인은 아미노산의 선형 서열이거나 또는 아미노산의 비-선형 서열일 수 있다. 많은 폴리펩타이드들이 도메인을 복수개 함유한다. 이러한 도메인들은 공지이고, 통상의 기술자에 의해 동정될 수 있다. 예시를 위해, 도메인에 대한 정의가 제시되었지만, 통상의 기술자들에게는 특정 명칭의 도메인들이 잘 인식되어 있다. 필요한 경우, 적절한 소프트웨어를 이용하여 도메인들을 동정할 수 있다.
[99] 본 명세서에서 "엑토도메인(ectodomain)"이라는 용어는 소포성 막(vesicular membrane)의 외부에 위치한, 막통과 단백질과 같은 막 단백질 영역을 가리키는 것이다. 엑토도메인들은 예를 들어 리간드 또는 세포 표면 수용체에 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 통해, 리간드 또는 세포 표면 수용체에 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 종종 포함한다. 세포의 막통과 단백질의 엑토도메인은 달리 세포외 도메인이라고도 칭해진다.
[100] 용어 "유효량" 또는 "치료적 유효량"이라 함은 단백질 조성물 또는 세포 조성물과 같은 본 발명의 치료용 조성물이 단독으로 (즉, 단독요법) 또는 부가적인 치료제와 조합적으로, 생체외(ex vivo) 투여되거나 (환자로부터의 세포와의 접촉에 의해) 또는 생체내 투여될 경우(환자 체내로의 투여에 의해), 예컨대 질병의 증상 및/또는 원인을 완화 또는 제거함으로써, 질병 진행을 통계적으로 유의하게 저감시키는 치료 조성물의 양 및/또는 농도를 의미한다. 유효량은 그 질환 또는 장애와 연관된 생물학적 반응 또는 효과 또는 적어도 하나의 증상을 감소, 경감 또는 완화시키거나, 또는 환자의 신체 기능을 향상시키는 양이다. 세포 치료법 사례에서, 유효량은 입양세포 치료에 의해 환자에게 투여된 세포의 유효한 투여량 또는 개수이다. 일부 구체예에서 환자는 비인간 영장류 또는 인간 환자와 같은 포유동물이다.
[101] 본 명세서에서 용어 "엔도도메인(endodomanin)"은 세포 표면막에 의해 정의된 내부 공간으로 연장되는, 막관통 단백질과 같은 일부 막 단백질에서 발견되는 영역을 가리킨다. 포유동물 세포에서, 엔도도메인은 막 단백질의 세포직 영역이다. 세포에서, 엔도도메인은 세포내 구성성분들과 상호반응하여 시그널 형질도입에서 일정 역할을 할 수 있고, 그에 따라 몇몇 경우 세포내 시그널링 도메인일 수 있다. 세포성 막관통 단백질의 엔도도메인은 달리 세포질 도메인이라고도 칭해지며, 몇몇 경우, 세포질 시그널링 도메인일 수도 있다.
[102] 본 명세서에서 포유동물 림프구의 면역학적 활성을 증가시킨다는 맥락상 용어 "증강된(enhanced)" 또는 "증가된(increased)"은 문맥상, 림프구의 하나 이상의 활성을 증가시킨다는 것을 의미한다. 증가된 활성은 예컨대 통계적 유의량만큼 세포 생존능, 세포 증식, 사이토카인 생산량 또는 T-세포 세포독성 중 하나 이상일 수 있다. 일부 구체예에서, 증가된 면역학적 활성에 대한 레퍼런스는 예컨대, 통계적으로 유의한 양으로, 인터페론 감마(IFN-감마) 생산이 증가되는 것을 의미한다. 일부 구체예에서, 면역학적 활성은 림프구 혼합 배양반응 (MLR) 분석법에 의해 평가될 수 있다. MLR 분석법의 실시 방법은 기술분야에 공지이다. Wang 외, Cancer Immunol Res. 2014 Sep: 2(9):846-56. 림프구의 활성을 평가하는 그 밖의 방법은 본 명세서에 설명된 임의의 분석법을 비롯하여 기술분야에 알려져 있다. 몇몇 구체예에서, 증강은 비-제로 대조군 값보다 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 75%,100%, 200%, 300%, 400%, 또는 500% 더 큰 증가일 수 있다.
[103] 본 명세서에서 용어 "조작된 세포(engineered cell)"라 함은 재조합 DNA 방법 또는 바이러스 형질도입에 의한 것과 같은 인간 개재에 의해 유전적으로 변형된 포유동물 세포를 가리킨다. 일부 구체예에서, 세포는 면역 세포, 예컨대 림프구 (예컨대 T 세포, B 세포, NK 세포) 또는 항원 제시 세포 (예컨대 수지상 세포)를 가리킨다. 세포는 환자로부터의 일차 세포(primary cell)일 수도 있고 세포주일 수도 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조작된 세포는 변이체 CD80 폴리펩타이드가 그에 특이적으로 결합하는, CD28, PD-L1 및/또는 CTLA-4을 발현하는 T-세포, 또는 PD-L1을 발현하는 APC의 면역학적 활성을 조절하도록 조작된 본 발명의 변이체 CD80을 포함한다. 일부 구체예에서, 변이체 80은 세포외 도메인을 함유하는 막관통 면역조절 단백질 (이하 "TIP"라 칭함) 또는 막관통 도메인 (예컨대 CD80 막관통 도메인)에 연결된 IgV 도메인, 및 선택적으로 세포내 시그널링 도메인을 함유하는 그의 일부분이다. 일부 경우에서, TIP는 이종 세포질 시그널링 도메인 또는 엔도도메인을 함유하는 키메라 수용체로서 포맷된다. 일부 구체예에서, 조작된 세포는 본 발명에 설명된 바와 같은 면역조절 단백질을 발현 및 분비할 수 있다. 제공된 조작된 세포들 중에는 조작된 T-세포 수용체 (TCR) 또는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 더 함유하는 세포도 포함된다.
[104] 본 명세서에서 "조작된 T-세포"라 함은 재조합 DNA 방법 또는 바이러스 형질도입 방법 등 인간의 개입에 의해 유전학적으로 변형된, T 헬퍼 세포, 세포독성 T-세포 (또는, 세포독성 T 림프구 또는 CTL), 내츄럴 킬러 T-세포, 조절 T-세포, 메모리 T-세포, 또는 감마 델타 T-세포와 같은 T-세포를 가리킨다. 조작된 T-세포는 T-세포 상에서 발현되어 조작된 T-세포 자신, 또는 T-세포 상에서 발현된 변이체 CD 80이 특이적으로 결합하는 포유동물 세포의 면역학적 활성을 조절하도록 조작되는 본 발명의 변이체 CD80 막관통 면역조절 단백질 (TIP)를 포함한다.
[105] 용어 "조작된 T-세포 수용체" 또는 "조작된 TCR"이라 함은 입양 면역치료법에서 종종 사용되는, T-세포 집단 내로 선택, 클로닝 및/또는 후속적으로 도입되는 주요조직적합 복합체 (MHC)/펩타이드 표적 항원에 대해 원하는 친화성으로 특이적으로 결합하도록 조작된 T-세포 수용체 (TCR)를 가리킨다. 조작된 TCR과 대조적으로, CAR은 MHC 비의존 방식으로 표적 항원에 결합하도록 조작된다.
[106] 본 발명에서 용어 "발현되다(expressed on)"라 함은 포유동물 세포와 같은 세포 표면에서 발현되는 단백질과 관련하여 사용된다. 그러므로, 단백질은 막 단백질로서 발현된다. 일부 구체예에서, 발현된 단백질은 막관통 단백질이다. 일부 구체예에서, 단백질은 약물 또는 검출가능한 표지 등의 소형 분자 모이어티에 컨쥬게이트된다. 세포 표면에서 발현된 단백질에는 세포-표면 단백질 예컨대 포유동물 세포에서 발현되는 세포 표면 수용체가 포함된다.
[107] 용어 "반감기 연장 모이어티"라 함은 그 모이어티에 컨쥬게이트되지 안은 단백질의 반감기에 비해, 포유동물 혈청에서 순환하는 단백질의 반감기를 연장시키는 폴리펩타이드 융합 또는 화학적 컨쥬게이트의 모이어티를 가리킨다.　 일부 구체예에서, 반감기는 1.2배, 1.5배, 2.0배, 3.0배, 4.0배, 5.0배, 또는 6.0배 이상, 또는 약 1.2배, 1.5배, 2.0배, 3.0배, 4.0배, 5.0배, 또는 6.0배 이상 연장된다. 일부 구체예에서, 반감기는 반감기 연장 모이어티가 없는 단백질에 비해 생체내 투여 후 6시간 이상, 12시간 이상, 24시간 이상, 48시간 이상, 72시간 이상, 96시간 이상 또는 1주일 이상 연장된다. 반감기는 단백질이 그의 농도, 양 또는 활성의 절반을 상실하는데 걸리는 시간을 가리킨다. 반감기는 예를 들어, ELISA 분석 또는 활성 분석을 이용함으로써 구할 수 있다. 예시적인 반감기 연장 모이어티에는 Fc 도메인, 멀티머화 도메인, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 히드록시에틸 전분 (HES), XTEN (연장된 재조합 펩타이드; WO2013130683 참조), 인간 혈청 알부민 (HSA), 소혈청 알부민 (BSA), 지질 (아실화), 및 폴리-Pro-Ala-Ser (PAS), 및 폴리글루탐산 (글루타밀화)가 포함된다.
[108] 본 명세서에서 "면역학적 시냅스(immunological synapse)" 또는 "면역 시냅스(immune synapse)"라는 용어는 항원-제시 세포 또는 종양세포와 같이 MHC I (주조직적합 복합체) 또는 MHC II을 발현하는 포유동물 세포와 이펙터 T 세포 또는 내츄럴 킬러(NK) 세포와 같은 포유동물 림프구 간의 인터페이스를 의미한다.
[109] 면역글로불린 분자의 Fc (결정화가능한 단편: fragment crystallizable) 영역 또는 도메인 (Fc 폴리펩타이드라고도 칭함)은 대체로 면역글로불린 중쇄의 불변 영역에 대응하고, 항체의 이펙터 기능(들)을 비롯한, 다양한 기능에 책임이 있다. Fc 도메인은 CH2 및 CH3 도메인 플러스 면역글로불린 분자의 힌지 도메인의 일부 또는 전부를 함유한다. Fc 도메인은 하나 이상의 다이설파이드 결합에 의해 결합된 2개의 폴리펩타이드 사슬의 다이머를 형성할 수 있다. 일부 구체예에서, Fc는 이펙터 기능을 용이하게 하기 위해 감소된(예컨대 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상 감소된) 활성을 나타내는 변이체 Fc이다. 일부 구체예에서, Fc 영역에서의 아미노산 치환은 특정한 SEQ ID NO.를 참조로 설명되지 않는 한 EU 넘버링 시스템에 따른다. EU 넘버링은 공지이며 가장 최근에 업데이트된 IMGT Scientific Chart (IMGT®, the international ImMunoGeneTics information system®, http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html (생성일: 2001년 5월 17일, 마지막 업데이트일: 2013년 6월 10일) 및 Kabat, E.A. 등에서 보고된 바와 같은 EU 인덱스에 따른다 [Sequences of Proteins of Immunological interest. 제5판, US Department of Health and Human Services, NIH publication No. 91-3242 (1991)].
[110] 면역조절 Fc 융합 단백질과 같은 면역글로불린 Fc 융합체 ("Fc-융합체")는, 면역글로불린의 Fc 영역에 작동적으로 연결된 하나 이상의 폴리펩타이드(또는 하나 이상의 소분자)를 포함하는 분자이다. Fc-융합체는, 예를 들어, 항체의 Fc 영역 (약물동력학을 용이하게 함) 및 변이체 CD80 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 면역글로불린 Fc 영역은 하나 이상의 변이체 CD80 폴리펩타이드 또는 소분자 (융합 파트너)에 직접 도는 간접적으로 연결될 수 있다. 다양한 링커들이 기술분야에 알려져있으며 Fc-융합체를 생성하도록, 융합 파트너에 Fc를 연결하는데 이용될 수 있다. 동일 종의 Fc-융합체들은 다이머화(이량화)되어 Fc-융합체 호모다이머를 형성하거나, 또는 비-동일 종을 이용함으로써, Fc-융합체 헤테로다이머를 형성할 수도 있다. 일부 구체예에서, Fc는 쥐 또는 인간 Fc와 같은 포유동물 Fc이다.
[111] 용어 "숙주 세포"는 재조합 발현 벡터에 의해 인코딩된 단백질을 발현하는데 사용될 수 있는 세포를 가리킨다. 숙주 세포는 예컨대 대장균과 같은 원핵생물일 수 있고 또는 진핵생물, 예컨대 단세포 진핵생물(예컨대 효모 또는 기타 진균류), 식물 세포 (예컨대, 담배 또는 토마토 식물 세포), 동물 세포 (예컨대, 인간 세포, 원숭이 세포, 햄스터 세포, 래트 세포, 마우스 세포, 또는 곤충 세포) 또는 하이브리도마일 수도 있다. 숙주 세포의 예로는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 이의 유도체 예컨대 Veggie CHO 및 무혈청 배지에서 성장하는 관련 세포주 또는 DHFR 결핍된 CHO 균주 DX-B11을 들 수 있다. 일부 구체예에서, 숙주 세포는 포유동물 세포 (예컨대, 인간 세포, 원숭이 세포, 햄스터 세포, 래트 세포, 마우스 세포, 또는 곤충 세포)일 수 있다.
[112] 본 명세서에서 용어 "면역글로불린" ("Ig"라 약칭됨)은 5가지 임의의 인간 항체 클래스, 즉: IgA (서브클래스 IgA1 및 IgA2를 포함한다), IgD, IgE, IgG (서브클래스 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4를 포함한다), 및 IgM를 비롯한 포유동물 면역글로불린 단백질을 가리키는 것이다. 이 용어는 또한 항원 결합 단편 (Fab), 가변 단편 (Fv)을 함유하는 VH 및 VL, 한 사슬 내에 한데 연결된 단일 사슬 가변 단편 (scFv)을 함유하는 VH 및 VL, 및 그 밖의 항체 V 영역 단편, 예컨대 Fab′, F(ab)2, F(ab′)2, dsFv 다이아바디, Fc, 및 Fd 폴리펩타이드 단편 등, 전적으로 또는 부분적으로 합성적이거나(예컨대, 재조합 또는 화학 합성) 또는 자연적으로 생산된, 전장 길이 미만의 면역글로불린도 포함한다. 호모이중특이 항체 및 헤테로이중특이 항체와 같은 이중특이 상체도 이 용어에 포함된다.
[113] 본 명세서에서 용어 "면역글로불린 수퍼패밀리" 또는 "IgSF"는 세포의 인식, 결합 또는 부착 프로세스에 관여하는 일군의 세포 표면 및 가용성 단백질을 의미한다. 분자들은 면역글로불린들(즉 항체들)과 공유된 구조적 속성에 기반하여 이 수퍼패밀리의 멤버로서 분류된다; 이들 모두는 면역글로불린 도메인 또는 폴드라 알려진 도메인을 갖는다. IgSF의 멤버들에는 면역계의 세포 표면 항원 수용체들, 공동-수용체들 및 공동-자극 분자들, 림프구에 대한 항원 제시와 관련된 분자, 세포 부착 분자, 특정한 사이토카인 수용체들 및 세포내 근육 단백질들이 포함된다. 이들은 면역계 내에서의 역할에 공통적으로 연관되어 있다. 면역학적 시냅스 내의 단백질들은 종종 IgSF의 멤버이다. IgSF는 기능과 같은 공유 속성에 따라 "서브패밀리"로 세분될 수 있다. 이러한 서브패밀리들은 대개 4 내지 30개의 IgSF 멤버들로 이루어진다.
[114] 본 명세서에서 "IgSF 도메인" 또는 "면역글로불린 도메인" 또는 "Ig 도메인"이라는 용어는 IgSF 단백질들의 구조 도메인을 가리킨다. Ig 도메인들은 면역글로불린 분자들의 이름을 따서 명명된다. 이들은 약 70-110개의 아미노산을 함유하며 이들의 크기와 기능에 따라 분류된다. Ig-도메인들은 역평행 베타 스트랜드들 2개 시트에 의해 형성되는 샌드위치-유사 구조를 갖는 특징적인 Ig-폴드를 갖는다. 샌드위치의 내측의 소수성 아미노산들과 B 스트랜드와 F 스트랜드의 시스테인 잔기들 간에 형성된 고도로 보존된 디설파이드 결합 간의 상호반응은, Ig-폴드를 안정화시킨다. Ig 도메인의 한쪽 말단은 이들의 리간드들에 대한 항체 특이성에 중요한 보체 결정 영역이라 칭해지는 섹션을 갖는다. Ig 유사 도메인들은: IgV, IgC1, IgC2, 또는 IgI로 분류될 수 있다. 대부분의 Ig 도메인들은 가변성(IgV)이거나 불변성(IgC)이다. 9개의 베타 스트랜드를 갖는 IgV 도메인들은 7개의 베타 스트랜드를 갖는 IgC 도메인들 보다 일반적으로 더 길다. IgSF의 몇몇 멤버들의 Ig 도메인들은 아미노산 서열 내 IgV 도메인들과 유사하면서도, 그 크기는 IgC 도메인들과 유사하다. 이들은 IgC2 도메인들이라 칭해지며, 표준 IgC 도메인들은 IgC1 도메인이라 칭해진다. T-세포 수용체 (TCR: T-cell receptor) 사슬은 세포외 부분에 2개의 Ig 도메인을 갖는데 구체적으로: 하나의 IgV 도메인은 N-말단에, 하나의 IgC1 도메인은 세포막 근처에 위치한다. CD80은 두 개의 Ig 도메인, 즉: IgV 및 IgC을 포함한다.
[115] 본 명세서에서 "IgSF 종"이라는 용어는 동일 또는 실제로 동일한 주요 아미노산 서열을 갖는 IgSF 멤버 단백질들의 앙상블을 의미한다. 각각의 포유동물 면역글로불린 수퍼패밀리 (IgSF) 멤버는 그 IgSF 멤버에 속하는 모든 IgSF 종들의 독특한 아이덴티티를 정의한다. 그러므로, 각각의 IgSF 패밀리 멤버는 다른 IgSF 패밀리 멤버들과는 구별되며, 그에 따라, 특정한 IgSF 패밀리 멤버의 각각의 종들은 다른 IgSF 패밀리 멤버의 종들과 구별된다. 그럼에도 불구하고, 글리코실화, 인산화, 유비퀴틴화, 니트로실화, 메틸화, 아세틸화 및 지질화와 같은 번역후 변형의 차이로 인하여, 동일한 IgSF 종들의 분자들 간에도 다양성이 존재할 수 있다. 이에 더해, 유전자 다형성에 기인하는 단일 IgSF 종들 내의 마이너한 서열 차이로 인해, 예컨대 단백질 가수분해 절단에 기인하는 IgSF 종들의 야생형 트렁케이트 형태가 그러하듯 단일 IgSF 종들 내에서도 또 다른 다양성 형태가 일어난다. "세포 표면 IgSF 종들"은 세포, 일반적으로 포유동물 세포 표면에서 발현되는 IgSF 종들이다.
[116] 본 명세서에서 T-세포와 같은 포유동물 림프구 관점에서 "면역학적 활성"이라는 용어가 사용될 경우 이는 하나 이상의 세포 생존, 세포 증식, 사이토카인 생산 (예컨대 인터페론-감마), 또는 T-세포 세포독성 활성을 가리킨다. 일부 경우에서, 면역학적 활성은 케모카인 또는 인터류킨과 같은 사이토카인의 그의 발현을 의미할 수 있다. 면역학적 활성의 증강 또는 억제를 알아내기 위한 분석법에는 배양 상등액에서 인터페론-감마 사이토카인 수준을 측정하는 MLR (림프구 혼합 배양반응) 분석법 (Wang 외, Cancer Immunol Res. 2014 Sep: 2(9):846-56), SEB (스타필로코커스 내독소 B) T 세포 자극 분석법 (Wang 외, Cancer Immunol Res. 2014 Sep: 2(9):846-56), 및 항-CD3 T 세포 자극 분석법 (Li 및 Kurlander, J Transl Med. 2010: 8: 104)이 포함된다. T 세포 활성화는 IFN-감마 사이토카인의 분비와 연관되어 있으므로, 이들 시험관내 인간 T 세포 분석에 의해 배양 상등액 내 IFN-감마 수준을 측정하는 것은 시판되는 ELISA 키트를 이용하여 분석될 수 있다 (Wu et al, Immunol Lett 2008 Apr 15; 117(1): 57-62). 면역 반응의 유도는 정지(quiescent) 림프구에 비해 면역학적 활성의 증가를 야기한다. 본 발명에 제시된 바와 같은, 친화성 변형된 IgSF 도메인을 함유하는 변이체 CD80 폴리펩타이드 등의 면역조절 단백질은 야생형 IgSF 멤버 또는 IgSF 도메인 대조군에 대한 주요 T-세포 분석에 있어 어떤 구체예에서는 IFN-감마 (인터페론-감마)의 발현을 증가시키고, 다른 구체예에서는 그 발현을 감소시킬 수 있다. 통상의 기술자라면 IFN-감마 발현의 증가를 알아내는데 사용되는 주요 T-세포 분석법이 IFN-감마 발현의 감소를 알아내기 위한 분석법에 사용되는 것과 다르다는 것을 인식할 것이다. 본 발명의 면역조절 단백질 또는 친화성 변형된 IgSF 도메인의, 주요 T-세포 분석법에서 IFN-감마 발현을 감소시키는 능력을 분석하는데 있어서, 실시예 6에 설명된 바와 같이, 림프구 혼합 배양반응(MLR) 분석법을 이용하라 수 있다. 간편하게, 본 발명의 친화성 변형된 IgSF 도메인의 가용성 형태를 사용하여 실시예 6에 설명된 바와 같이, MLR에서 IFN-감마 발현을 길항하여 그에 따라 감소시키는 그의 능력을 알아낼 수 있다. 별법으로, 본 발명의 면역조절 단백질 또는 친화성 변형된 IgSF 도메인의, 주요 T-세포 분석법에서의 IFN-감마 발현을 증가시키는 능력을 분석함에 있어서, 공동-고정화(co-immobilization) 분석법을 이용하라 수 있다. 공동-고정화 분석법에서는, 일부 구체예에서 항-CD3 항체에 의해 제공되는 T-세포 수용체 시그널을 공동-고정화된 친화성 변형된 IgSF 도메인, 예컨대 변이체 CD80과 연계 사용하여, 야생형 IgSF 도메인 대조군에 비해 IFN-감마 발현을 증가시키는 능력을 탐지한다. 변이체 CD80 막관통 면역조절 단백질의 활성을 평가하는 것을 포함하여, 조작된 세포의 면역학적 활성 분석법은 기술 분야에 알려져 있으며, 이의 예로는 항원 자극 후 T 세포 팽창 능력, 재-자극 부재시 T 세포 팽창 유지 능력, 및 적절한 동물 모델에서의 항암 활성 등을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 이러한 분석법에는 표준 51Cr-방출 분석법(참조: 예컨대 Milone 외, (2009) Molecular Therapy 17: 1453-1464) 또는 흐름(flow) 기반 세포독성 분석법, 또는 임피던스 기반 세포독성 분석법 (Peper 외 (2014) Journal of Immunological Methods, 405:192-198)이 포함된다.
[117] "면역조절 폴리펩타이드"는 면역학적 활성을 조절하는 폴리펩타이드이다. 면역 반응을 "조절" 또는 "조절하다"라 함은 면역학적 활성이 증가되거나 감소된다는 것이다. 면역조절 폴리펩타이드는 단일 폴리펩타이드 사슬이거나 또는 예를 들어 사슬간 다이설파이드 결합에 의해, 서로 공유결합된 적어도 두 개의 폴리펩타이드 사슬의 멀티머(다이머 또는 고차수의 멀티머)일 수 있다. 따라서, 모노머, 다이머 및 고차수 멀티머 폴리펩타이드는 상기 정의된 용어 범위 내에 포괄된다. 멀티머 폴리펩타이드는 호모멀티머(동일한 폴리펩타이드 사슬들의) 또는 헤테로멀티머(비-동일 폴리펩타이드 사슬들의)일 수 있다. 면역조절 폴리펩타이드는 변이체 CD80을 포함할 수 있다.
[118] 본 명세서에어 용어 "증가하다"라 함은 통계적으로 유의한 양으로 증가하는 것을 의미한다. 증가는 비-제로 대조군 값보다 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 75%, 100%, 또는 그 이상 클 수 있다.
[119] CD80의 "이소폼(isoform)"은 아미노산 서열을 달리하는, 복수개의 자연발생적인 CD80 폴리펩타이드들 중 하나이다. 이소폼은 단일 유전자에 의해 발현된 RNA 전사체의 스플라이스 변이체의 산물이거나 또는 유전자 복제로부터 일어날 수 있는 것과 같은 기능적으로 유사한 단백질을 생성하는 고도로 유사하지만 상이한 유전자들의 발현 산물일 수 있다. 본 명세서에서 CD80의 "이소폼"이라는 용어는 CD80 유전자의 상이한 대립유전자(alleles)의 산물을 가리키기도 한다.
[120] 본 명세서에서 "림프구"라는 용어는 포유동물 면역계에서 백혈구 세포의 3가지 서브타입 중 어느 하나를 의미한다. 이들은 내츄럴 킬러 세포(NK 세포) (세포-매개된, 선천성 세포독성 면역에서 기능한다), T 세포(세포 매개된, 후천성 세포독성 면역용), 및 B 세포(체액성의, 항체-구동된 후천성 면역용)를 포함한다. T 세포에는:T 헬퍼 세포, 세포독성 T-세포, 내츄럴 킬러 T-세포, 메모리 T-세포, 조절 T-세포, 또는 감마 델타 T-세포가 포함된다. 선천성 림프구 세포(ILC) 역시도 림프구 정의에 포함된다.
[121] "포유동물", 또는 "환자"라는 용어는; 인간, 침팬지, 레수스 원숭이, 시노몰구스 원숭이, 개, 고양이, 마우스 또는 래트 중 적어도 하나를 특별히 포함한다.
[122] 본 명세서에서 용어 "막 단백질"은 생리적 조건 하에서, 지질 이중층에 직접 또는 간접적으로 부착되는 단백질을 의미한다. 막을 형성하는 지질 이중층은 진핵세포(에컨대 포유동물) 세포막 또는 인공(즉, 사람이-만든) 막 예컨대 리포좀에서 발견되는 막과 같은 생물학적 막일 수 있다. 지질 이중충에 대한 막 단백질의 부착은 공유 결합, 또는 비-공유적 상호반응 예컨대 소수성 또는 정전기 상호반응에 의한 것일 수 있다. 막 단백질은 내재성(integral) 막 단백질 또는 외재성(peripheral) 막 단백질일 수 있다. 외재성 막 단백질인 막 단백질은 내재성 막 단백질에 비공유적으로 부착되거나 지질 이중충에 비공유적으로 부착된다. 외재성 막 단백질은 지질 이중층에 일시적으로 부착되어 포유동물의 생리적 조건 범위 하에서, 외재성 막 단백질은 지질 이중층과 회합 및/또는 해리될 수 있다. 외재성 막 단백질과 대조적으로, 내재성 막 단백질은 막의 지질 이중층에 실제로 영구적인 결합을 형성하여 포유동물의 생리적 조건 범위에서, 내재성 막 단백질은 지질 이중층에 대한 그의 결합으로부터 해리되지 않는다. 막 단백질은 지질 이중층의 한 개층(모노토픽)을 통해 막에 부착되거나, 또는 막의 두 개층 모두(폴리토픽)에 부착될 수 있다. 오직 하나의 지질 이중층과 상호반응하는 내재성 막 단백질은 "내재성 모노토픽 단백질"이다. 지질 이중층 두 개 모두와 상호반응하는 내재성 막 단백질은 "내재성 폴리토픽 단백질"이며 달리 본 명세서에서 "막관통 단백질"이라고도 칭해진다.
[123] 본 명세서에서 포유동물의 면역 반응과 같은 면역 반응 맥락에서 "조절하는" 또는 "조절하다"라는 용어는 본 발명의 변이체 CD80을 포함하는 면역조절 폴리펩타이드의 투여 결과로 또는 본 발명의 변이체 CD80 막관통 면역조절 단백질과 같은 면역조절 단백질을 발현하는 조작된 세포의 투여 결과로 일어나는, 존재하거나 또는 잠재적인 면역 반응의 증가 또는 감소와 같은 임의의 변경을 가리킨다. 따라서, 이 용어는 변이체 CD80을 포함하는 면역조절 단백질이 투여된 경우 또는 투여되지 않은 경우 일어나거나 존재하는 면역 반응에 비해, 면역 반응의 증가 또는 감소와 같은 변경을 의미한다. 이러한 조절은 면역 세포의 면역학적 활성의 면역학적 활성의 정도나 범위의 유도, 활성화, 억제 또는 변경을 모두 포함한다. 면역 세포에는 B 세포, T 세포, NK (내츄럴 킬러) 세포, NK T 세포, 프로페셔널 항원-제시 세포(APCs), 및 비-프로페셔널 항원-제시 세포, 및 염증 세포(호중구, 대식세포, 단핵구, 호염기구)가 포함된다. 조절은 기존의 면역 반응, 발달중인 면역 반응, 잠재적인 면역 반응, 또는 면역 반응을 유도, 조절하거나 면역반응에 영향을 주거나 또는 면역반응에 응답하는 능력에 대한 여하한 변화를 모두 포함한다. 조절은 면역 반응의 일부로서 면역 세포 내 유전자, 단백질 및/또는 기타 분자들의 발현 및/또는 기능에서의 여하한 변경을 모두 포함한다. 면역학적 활성의 조절 또는 면역 반응의 조절에는 예컨대 다음이 포함된다: 면역 세포의 제거, 결실 또는 격리(sequestration); 자가반응성 림프구, 항원 제시 세포 또는 염증 세포와 같은 기타 세포들의 기능성 성능을 조절할 수 있는 면역 세포의 유도 또는 생성; 면역 세포에서의 비반응성 상태의 유도(즉, 무감작(anergy)); 비제한적인 예로서, 이들 세포에 의해 발현되는 단백질의 패턴을 변형시키는 것을 비롯한, 면역 세포의 활성 또는 기능을 증강 또는 억압하는 것. 이의 예로는 사이토카인, 케모카인, 성장 인자, 전사 인자, 키나아제, 공동자극 분자 또는 기타 세포 표면 수용체들과 같은 특정 부류의 분자들의 변경된 생성 및/또는 분비, 또는 이들 조절 이벤트들의 여하한 조합을 들 수 있다. 조절은 예컨대 일차 T 세포 분석법에서 야생형 또는 변형되지 않은 CD80 대조군과 비교한 IFN-감마 (인터페론 감마)의 변경에 의해 평가될 수 있다 [참조: Zhao 및 Ji, Exp Cell Res. 2016 Jan1; 340(1) 132-138). 조절은 예를 들어, 야생형 CD80 막관통 단백질에 의해 조작된 세포와 비교시 조작된 세포의 사이토카인 분비의 변경 또는 조작된 세포의 세포독성 활성의 변경과 같이, 조작된 세포의 면역학적 활성의 변경에 의해 평가할 수 있다.
[124] "멀티머화 도메인"이라는 용어는 어떤 폴리펩타이드 분자와 하나 이상의 부가적인 폴리펩타이드 분자와의 안정한 상호작용을 촉진시키는 아미노산 서열을 가리키는 것으로 상기 부가적인 폴리펩타이드들 각각은 첫 번째 도메인과 안정한 멀티머를 형성하는 동일 또는 상이할 수 있는 멀티머화 도메인을 함유하는 것들이다. 일반적으로, 폴리펩타이드는 멀티머화 도메인에 직접 또는 간접적으로 결합된다. 예시적인 멀티머화 도메인에는 면역글로불린 서열 또는 그의 일부, 류신 지퍼, 소수성 영역, 친수성 영역 및 호환가능한(compatible) 단백질-단백질 상호작용 도메인들이 포함된다. 멀티머화 도메인은, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 서브타입을 비롯한 IgG, IgA, IgE, IgD 및 IgM 및 이들의 변형된 형태로부터의 면역글로불린 불변 영역 또는 도메인, 예컨대 Fc 도메인 또는 그의 일부일 수 있다.
[125] 용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 단일가닥 또는 이중가닥 형태의 핵산 잔기 (예컨대, 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드)의 폴리머를 가리키는 용어로 호환적으로 사용된다. 달리 특별히 한정하지 않는 한 이 용어들은 천연 뉴클레오타이드들의 공지 유사체를 함유하는 핵산 및 그에 대한 유사한 결합 특성을 갖고 자연발생적인 뉴클레오타이드들과 유사한 방식으로 대사되는 것들을 포괄한다. 달리 언급되지 않는 한, 특정한 핵산 서열은 명시적으로 지목된 서열("레퍼런스 서열") 뿐만 아니라 그의 보존적으로 변형된 변이체(예컨대, 축퇴 코돈 치환) 및 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 구체적으로, 축퇴 코돈 치환은 혼합-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기들에 의해 치환된 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈들의 세 번째 위치가 혼합-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기들에 의해 치환된 서열을 생성함으로써 얻을수 있다. 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드라는 용어는 어떤 유전자에 의해 인코딩된 cDNA 또는 mRNA도 포괄한다.
[126] 본 명세서에서 "분자종들"이라는 용어는 1차 아미노산과 동일 또는 실질적으로 동일한 단백질들의 앙상블을 의미하는데 이용된다. 각각의 포유동물 면역글로불린 수퍼패밀리 (IgSF) 멤버는 동일 또는 실제로 동일한 분자종들의 집합을 정의한다. 그러므로, 예컨대 인간 CD80은 IgSF 멤버이고 각각의 인간 CD80 분자는 CD80의 분자종이다. 동일한 분자종들의 분자들 간에도, 글리코실화, 인산화, 유키퀴틴화, 니트로실화, 메틸화, 아세틸화 및 지질화와 같은 번역후 변형에서의 차이로 인해, 변이가 일어날 수 있다. 이에 더해, 예컨대, 단백질분해 절단으로 인한 단일 분자종들의 야생형 트렁케이트 형태가 그러하듯, 유전자 다형성으로 인해 단일 분자종들 간에도 마이너한 서열 차이가 있을 수 있어 단일 분자종들 사이에 또 다른 형태의 변이 형태가 나타날 수 있다. "세포 표면 분자종들"은 포유동물 세포의 표면에서 발현되는 분자종들이다. IS를 형성하는 2개의 포유동물 세포들 중 어느 한쪽에만 (두 개 모두에는 아님) 배타적으로 존재하는, 2 이상의 상이한 단백질 종들은 서로 "시스" 또는 "시스 배열" 상태에 있다고 칭해진다. 2가지 상이한 단백질 종들로서, 첫 번째 종은 IS를 형성하는 2개의 포유동물 세포들 중 하나에만 배타적으로 존재하고 두 번째 종은 IS를 형성하는 2개의 포유동물 세포들 중 다른 하나에만 배타적으로 존재하는 경우, 이들 2 가지 상이한 단백질 종들은 "트랜스" 또는 "트랜스 배열" 상태에 있다고 칭해진다. 각 단백질이 IS를 형성하는 2개의 포유동물 세포 모두에 존재하는 2개의 상이한 단백질 종들은 이들 세포에서 시스 배열과 트랜스 배열 모두로 존재하는 것이다.
[127] 본 명세서에서 용어 "비-경쟁적 결합(비-competitive binding)"이라 함은 어떤 단백질이 적어도 2개의 동족 결합 파트너들과 동시에 특이적으로 결합하는 능력을 의미한다. 따라서, 비록 결합 반응이 동일 기간 동안 존재할 할 필요는 없으나, 적어도 2개의 상이한 동족 결합 파트너들에 대해 당해 단백질에 동시에 결합할 수 있으므로, 몇몇 경우, 당해 단백질은 동족 결합 파트너들 중 오직 하나에만 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 결합은 특이적인 결합 조건 하에 일어난다. 일부 구체예에서, 동시 결합은 하나의 동족 결합 파트너의 결합이 제2 동족 결합 파트너의 동시적인 결합을 실질적으로 저해하지 않도록 한다. 일부 구체예에서, 비-경쟁적 결합은 비-경쟁적 결합은 제2 동족 결합 파트너를 단백질 상의 그의 결합 부위에 결합시키는 것이 제1 동족체 결합 파트너의 단백질상 의 그의 결합 부위에 대한 결합을 대체하지 않는다는 것을 의미한다. 비-경쟁적 결합의 평가 방법은 예를 들어 문헌 [Perez de La Lastra et al., Immunology, 1999 Apr: 96(4): 663-670]에 설명된 바와 같이 기술분야에 잘 알려져 있다. 몇몇 경우, 비-경쟁적 상호반응에서, 제2 동족 결합 파트너가 제1 동족 결합 파트너의 결합을 직접적으로 간섭하지 않게끔, 제1 동족 결합 파트너는 제2 동족 결합 파트너의 상호반응 부위와 중복되지 않는 상호반응 부위에서 특이적으로 결합한다. 따라서, 제2 동족 결합 파트너의 결합에 의한 동족 결합 파트너의 결합에 미치는 효과는 어느 것이든 제1 동족 결합 파트너의 결합을 직접적으로 간섭하는 것을 제외한 메카니즘을 통한 것이다. 예를 들어, 효소-기질 상호반응 맥락에서, 비-경쟁적 억제제는 효소의 활성 부위 이외의 부위에 결합한다. 비-경쟁적 결합은, 제2 동족 결합 파트너가 제1 동족 결합 파트너의 결합과 중복되지 않는 상호반응 부위에 특이적으로 결합하지만 제1 상호반응 부위가 제1 동족 결합 파트너에 의해 점령된 경우에 한해 제2 상호반응 부위에 결합하는, 비경쟁적(uncompetitive) 결합 상호반응을 포괄한다.
[128] "의약 조성물"이라는 용어는 포유동물 대상자, 종종 인간에 있어서 의약 요도로 적합한 조성물을 가리킨다. 의약 조성물은 일반적으로 유효량의 활성물질 (예컨대, 변이체 CD80 막관통 면역조절 단백질을 발현하는 조작된 세포 또는 변이체 CD80을 포함하는 면역조절 폴리펩타이드) 및 담체, 부형제 또는 희석제를 포함한다. 담체, 부형제, 또는 희석제는 일반적으로 각각 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 말한다.
[129] "폴리펩타이드" 및 "단백질"라는 용어는 본 명세서에서 호환적으로 사용되며 펩타이드 결합을 통해 2 이상의 아미노산들이 연결되어 있는 분자쇄를 가리킨다. 이 용어는 생성물의 특정 길이를 지칭하는 것이 아니다. 그러므로, "펩타이드" 및 "올리고펩타이드"는 폴리펩타이드 정의에 포함된다. 이 용어는 예컨대 글리코실화, 아세틸화, 인산화 등과 같은 폴리펩타이드의 번역후 변형을 포함한다. 이 용어는 또한 하나 이상의 아미노산 유사체 또는 비정규적인 또는 비천연 아미노산들이 공지의 단백질 조작 기술을 이용하여 합성되거나 재조합적으로 발현되는 분자들도 포괄한다. 이에 더해, 단백질은 유도화될 수 있다.
[130] 본 명세서에서 "일차 T-세포 분석(primary T-cell assay)"이라 함은 인터페론 감마("IFN-감마") 발현을 측정하기 위한 시험관내 분석법을 가리킨다. 이러한 다양한 일차 T-세포 분석법은 실시예 6에 설명된 바와 같이 기술분야에 공지이다. 바람직한 구체에에서, 사용된 분석법은 항-CD3 공동고정화 분석법이다. 이 분석법에서, 일차 T 세포는 부가적인 재조합 단백질 존재 또는 부재 하에 고정된 항-CD3에 의해 자극된다. 배양 상등액을 대개 24-72시간 경화 시점에서 수확한다. 또 다른 구체예에서, 사용된 분석법은 혼합 림프구 반응(MLR)이다. 이 분석법에서 일차 T 세포들은 동종이형(allogenic) APC에 의해 자극된다. 배양 상등액은 대개 24-72 시간 경과 시점에서 수확된다. 배양 상등액 중 인간의 IFN-감마 수준을 표준 ELISA 기술로 측정한다. 납품업자들로부터 상업용 키트를 구입할 수 있으며 제조업자의 권장 지침에 따라 분석을 수행하면 된다.
[131] 본 발명의 면역조절 단백질을 인코딩하는 것과 같은 핵산에 적용되는 바와 같은 "정제된(purified)"이라는 용어는 일반적으로 기술 분야에 잘 알려진 분석 기술에 의해 탐지되는 다른 성분들이 실제로 없는 핵산 또는 폴리펩타이드를 의미한다 (예컨대, 정제된 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 전기영동 겔, 크로마토그래피 유출물, 및/또는 밀도구배 원심분리 처리되는 매질에서 불연속 밴드를 형성한다). 예컨대, 전기영동 겔에서 기본적으로 하나의 밴드로 나타나는 핵산 또는 폴리펩타이드는 "정제"된 것이다. 본 발명의 정제된 핵산 또는 단백질은 적어도 약 50% 순수하고, 대체로 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 99% 또는 그 이상 순수한 것이다 (예컨대 중량 백분율 또는 몰 기준임).
[132] "재조합(recombinant)"이라는 용어는 물질(예컨대 핵산 또는 폴리펩타이드)이 인간의 개재로 인해 인공적으로(즉, 비-자연적으로) 변경되었음을 가리킨다. 이러한 변경은 그의 자연 환경 또는 상태 내의 물질에 대해 수행되거나 또는 자연 환경 또는 상태로부터 제거될 수 있다. 예를 들어, "재조합 핵산"은 예컨대 클로닝, 친화성 변형, DNA 셔플링 또는 기타 공지의 분자생물학적 과정이 일어나는 동안 핵산을 재조합적으로 조작함으로써 만들어지는 것이다. "재조합 DNA 분자"는 이러한 분자생물학적 기술 수단에 의해 함께 연결된 DNA의 세그먼트들로 이루어진다. 본 명세서에서 "재조합 단백질" 또는 "재조합 폴리펩타이드"라 함은 재조합 DNA 분자를 이용하여 발현되는 단백질 분자이다. "재조합 숙주 세포"는 재조합 핵산을 함유 및/또는 발현하는 세포이거나 또는 예컨대 세포 내로 본원에서 제공된 막관통 면역조절 단백질과 같은 재조합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 도입하는 것과 같은 유전자 조작에 의해 달리 변경된 세포이다. 진핵생물 중의 전사 조절 시그널은 "프로모터"와 "인핸서" 요소를 포함한다. 프로모터 및 인핸서는 전사에 관여하는 세포상 단백질과 특이적으로 상호반응하는 DNA 서열들의 짧은 어레이로 구성된다. 프로모터 및 인핸서 요소들은 효모, 곤충 및 포유동물 세포를 비롯한 다양한 진핵생물 소스 및 바이러스로부터 분리된 바 있다(유사 조절 요소, 즉 프로모터들은 원핵세포에서도 발견된다). 특정한 프로모터 및 인핸서의 선택은 목적하는 단백질을 발현시키기 위해 어떤 세포 유형을 이용할 것인지에 의해 좌우된다. 본 명세서에서 "작동가능한 조합으로(in operable combination)," "작동가능한 순서로(in operable order)" 및 "작동가능하게 연결된(operably linked)"이라는 용어들은 목적하는 단백질 분자의 합성 및/또는 주어진 유전자의 전사를 지시할 수 있는 핵산 분자가 생산되는 방식으로 또는 그러한 배열로 이루어진 핵산 서열의 결합(linkage)을 가리킨다.
[133] 본 명세서에서 용어 "재조합 발현 벡터"라 함은 목적하는 특정 숙주 세포에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 적절한 핵산 서열 및 코딩 서열을 함유하는 DNA 분자를 가리킨다. 원핵세포에서의 발현에 필요한 핵산 서열들에는 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위 및 가능하게는 기타 서열들이 포함된다. 진핵 세포들은 프로모터, 인핸서 그리고 종결 및 폴리아데닐화 시그널을 이용하는 것으로 알려져 있다. 소망될 경우, 세포로부터의 보다 용이한 융합 단백질의 분리를 위해, 분비 시그널 펩타이드 서열은 또한, 임의로 재조합 융합 단백질과 같은 재조합 단백질에 대한 코딩 서열에 작동적으로 연결된 재조합 발현 벡터에 의해 인코딩되어, 발현된 융합 단백질이 재조합 숙주 세포에 의해 분비될 수 있다. 이 용어는 이것이 도입된 숙주 세포의 게놈 내로 병합된 벡터 뿐만 아니라 자가-복제 핵산 구조물로서의 벡터도 포함한다. 벡터에는 렌티바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 들 수 있다.
[134] 용어 "선택성"은 다른 동족 결합 결합 파트너와 같은 다른 기질에 대한 특이적 결합과 비교하여 하나의 동족 결합 결합 파트너와 같은 하나의 기질의 특이적 결합에 대한 대상 단백질 또는 폴리펩타이드의 선호를 지칭한다. 선택성은 제1 동족 결합 파트너 (예컨대, Kd1)와 같은 제1 기질과 대상 단백질의 결합 활성 (예컨대 결합 친화성)과, 제2 동족 결합 파트너 (예컨대, Kd2)와 동일한 대상 단백질의 결합 활성 (예컨대 결합 친화성)과의 비율로서 반영될 수 있다.
[135] 본 명세서에서 "서열 동일성(sequence identity)"이라는 용어는 각각 뉴클레오타이드 또는 아미노산 수준에서 유전자들 또는 단백질들 간의 서열 동일성을 가리킨다. "서열 동일성"은 뉴클레오타이드 수준에서 핵산들 간의 동일성의 척도이자 아미노산 수준에서의 단백질들 간의 동일성의 척도이다. 단백질 서열 동일성은 아미노산 서열들이 정렬된 경우 각 서열들에 있어서의 주어진 위치에서 아미노산 서열을 비교함으로써 알아낼 수 있다. 마찬가지로, 핵산 서열 동일성은 뉴클레오타이드 서열들이 정렬된 경우 각 서열에서의 주어진 위치에서 뉴클레오타이드 서열을 비교함으로써 알아낼 수 있다. 비교를 위한 서열의 정렬 방법은 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 이러한 방법으로는 GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA 및 TFASTA를 들 수 있다. BLAST 알고리듬은 퍼센트 서열 동일성을 산출하는데 2개의 서열들 간의 유사성을 통계적으로 분석한다. BALST 분석법을 수행하는 소프트웨어는 National Center for Biotechnology Information (NCBI) 웹사이트를 통해 공공연히 입수가능하다.
[136] 명세서에서 단백질과 관련하여 "가용성(soluble)"이라 함은, 그 단백질이 막 단백질이 아님을 의미한다. 일반적으로, 가용성 단백질은 IgSF 패밀리 멤버 수용체의 세포외 도메인만을, 또는 IgSF 도메인 또는 도메인들을 함유하는 그의 일부 또는 그의 특이적-결합 단편만을 독점적으로 함유할 뿐 막관통 도메인은 함유하지 않는다. 일부 경우에서, 단백질의 가용성은 Fc 도메인에 대한 직접 또는 링커를 통한 간접적 연결 또는 결합에 의해 향상될 수 있고, 몇몇 경우에서는 이러한 연결 또는 결합은 단백질의 안정성 및/또는 반감기도 향상시킬 수 있다. 일부 측면에서, 가용성 단백질은 Fc 융합 단백질이다.
[137] 본 명세서에서 폴리펩타이드 또는 핵산과 관련하여 사용될 경우 용어 "종(species)"은 동일하거나 실제로 동일한 서열들을 갖는 분자들의 앙상블을 의미한다. 동일한 종의 폴리펩타이드들 사이에서 변이는 글리코실화, 포스포릴화, 유비퀴틴화, 니트로실화, 메틸화, 아세틸화 및 지질화와 같은 후-번역 변형의 차이로 인해 일어날 수 있다. 아미노-말단 또는 카르복실-말단의 전장 종이 1, 2, 또는 3 아미노산 미만만큼 다른(또는 이러한 차이를 인코딩하는) 폴리펩타이드의 약하게 트렁크화된 서열은 단일 종의 것으로 간주된다. 이러한 마이크로이질성은 제조된 단백질들의 공통적인 속성이다.
[138] 본 명세서에서 전장 야생형 포유동물 CD80 폴리펩타이드 또는 그의 IgV 또는 IgC 도메인과 관련하여 사용될 경우 용어 "특이적 결합 단편"은 IgV 및/또는 IgC 도메인의 서브서열을 갖고 시험관내 및/또는 생체내에서 포유동물 CD28, 포유동물 PD-L1 및/또는 포유동물 CTLA-4, 예컨대 인간 또는 쥐의 CD28, PD-L1, 및/또는 CTLA-4에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드를 의미한다. 일부 구체예에서, CD80 IgV 또는 CD80 IgC의 특이적 결합 단편은 전장 야생형 길이의 적어도 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 길이를 갖는다. 특이적 결합 단편은 서열 변경에 의해 변이체 CD80을 형성할 수 있다.
[139] 본 명세서에서 "특이적으로 결합하다"라는 표현은, 특이적인 결합 조건 하에서, 충분한 통계적 크기를 갖는 무작위적인 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 집합체에 대한 동일 단백질의 평균적인 친화성이나 결합능에 비해, 그의 친화성 또는 결합능이 적어도 5배, 그러나 임의로 10, 20, 30, 40, 50, 100, 250 또는 500배, 심지어 적어도 1000배 더 커지는, 표적 단백질에 대한 단백질의 결합 능력을 의미한다. 특이적으로 결합하는 단백질은 단일 표적 분자에만 결합할 필요는 없으며 표적과 비-표적 (예컨대 파라로그(유사체:paralogs) 또는 오솔로그(이종상동체: orthologs)) 사이의 구조적 배열의 유사성으로 인해, 비-표적 분자에도 특이적으로 결합할 수 있다. 통상의 기술자라면 상이한 동물종에서 동일한 기능을 갖는 분자에 대한 특이적 결합(즉 오솔로그) 또는 표적 분자와 실질적으로 유사한 에피토프를 갖는 비-표적 분자에 대한 특이적 결합 (예컨대, 파라로그)이 가능함과 독특한 비-표적(예컨대 무작위적인 폴리펩타이드)의 통계적으로 합당한 집합에 대해 상대적으로 구해지는 결합의 특이성과 상충하지 않는다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명의 폴리펩타이드는 교차-반응성으로 인해, 표적 분자의 두 개 이상의 상이한 종들과 특이적으로 결합할 수도 있다. 2개의 단백질들 간의 특이적 결합을 알아내기 위해 고체상 ELISA 면역분석법 또는 Biacore 측정을 이용할 수 있다. 일반적으로, 2개의 결합 단백질들 간의 상호반응들의 해리 상수(Kd)는 1x10-5 M 미만이고, 흔히 1 x 10-12 M 정도로 낮다. 본 발명의 특정 구체예에서, 2개의 결합 단백질들 간의 상호반응의 해리 상수는 1x10-6 M, 1x10-7 M, 1x10-8 M, 1x10-9 M, 1x10-10 M 또는 1x10-11 M이다.
[140] 폴리펩타이드를 발현하는 포유동물 세포와 관련하여 "표면 발현하다" 또는 "표면 발현"이라는 용어는 그 폴리펩타이드가 막 단백질로서 발현됨을 의미한다. 일부 구체예에서, 막 단백질은 막관통 단백질이다.
[141] 예컨대 합성 핵산 분자 또는 합성 유전자 또는 합성 펩이드와 관련한 "합성"이라는 용어는 재조합 방법 및/또는 화학적 합성 방법에 의해 생산된 핵산 분자 또는 폴리펩타이드 분자를 가리킨다.
[142] 본 명세서에서 "표적화 모이어티(targeting moiety)"라 함은 변이체 CD80을 포함하는 폴리펩타이드에 공유적 또는 비공유적으로 결합하거나 또는 이를 물리적으로 내포하는 조성물을 가리킨다. 표적화 모이어티는 목적하는 카운터-구조물 에컨대, 세포 표면 수용체 (예컨대, B7 패밀리 멤버 PD-L1), 또는 종양 특이 항원 (TSA)이나 종양 관련 항원 (TAA) 예컨대 B7-H6과 같은 종양 항원에 대해 특이적인 결합 친화성을 갖는다. 일반적으로, 목적하는 카운터 구조물은 특이적인 조직 또는 세포-유형 상에 위치한다. 표적화 모이어티에는: 항체, 항원 결합 단편(Fab), VH 및 VL를 함유하는 가변 단편(Fv), 하나의 사슬 내에 VH 및 VL을 함께 연결한 채로 함유하는 단일사슬 가변 단편(scFv) 및 그 밖의 항체 V 영역 단편들, 예컨대 Fab', F(ab)2, F(ab')2, dsFv 다이아바디, 나노바디, 가용성 수용체들, 수용체 리간드들, 성숙한 친화성 수용체들 또는 리간드들, 그리고 소형 분자 (<500 dalton) 조성물 (예컨대, 특이 결합 수용체 조성물)이 포함된다. 표적화 모이어티는 또한 본 발명의 폴리펩타이드를 내포하는 리포좀의 지질 막에 공유적으로 또는 비공유적으로 결합할 수도 있다.
[143] 본 명세서에서 용어 "막관통 단백질(transmembrane protein)"은 포유동물 세포와 같은 생물학적 막 또는 리포좀과 같은 인공 구조물에서 발견되는 지질 이중층과 같은 지질 이중층에 실질적으로 또는 완전히 걸쳐있는(span) 막 단백질을 의미한다. 막관통 단백질은 이를 통해 지질 이중층에 통합되고 생리학적 조건 하에서 열역학적으로 안정한 막관통 도메인(transmembrane domain) ("transmembrane domain")을 포함한다. 막관통 도메인은 일반적으로 수성 환경(예컨대 세포질, 세포외 유액)과 상호반응하는 단백질 영역에 비해 높은 그의 소수성에 기초하여, 임의의 수의 상업적으로 이용 가능한 생물정보학 소프트웨어 적용을 통해 그들의 아미노산 서열로부터 예측 가능하다. 막관통 도메인은 종종 흔히 막을 통해 뻗어있는 소수성 알파 나선이다. 막관통 단백질은 지질 이중층의 두 층을 한 번 또는 여러 번 통과할 수 있다. 막관통 단백질은 본 명세서에 기술된 본원에서 제공된 막관통 면역조절 단백질을 포함한다. 막관통 도메인에 더해, 본 발명의 막관통 면역조절 단백질은 엑토도메인 및 일부 구체예에서 엔도도메인을 추가로 포함한다.
[144] 본 명세서에서 질병 또는 장애와 관련하여 "치료하는", "치료" 또는 "치료법"이라는 용어는 치료 조성물(예컨대, 면역조절 단백질 또는 조작된 세포를 함유하는)을 단독으로 또는 본 명세서에 설명된 다른 화합물과 조합 투여함으로써 임상적 또는 진단적 증상의 감소, 중단 또는 제거에 의해 입증되는 바와 같이 질병 또는 장애의 진행을 둔화, 중단 또는 역전시키는 것을 의미한다. "치료하는", "치료" 또는 "치료법"은 또한 급성 또는 만성 질병 또는 장애에 있어서 증상의 위중도의 감소 또는 자가면역 질환의 염증 측면에서 염증의 감소 또는 자가면역 질환 경과의 재발 또는 감퇴(remitting)의 경우 재발율의 감소를 의미하기도 한다. 본 명세서에서 암과 관련하여 암을 "치료" 또는 "억제하다", "억제하는" 또는 "억제"라는 의미는: 종양 성장 속도의 통계적으로 유의한 감소, 종양 성장의 중단, 또는 Response Evaluation Criteria for Solid Tumors(RECIST)와 같은 표준 기준법(그러나 이에 한정되지 않음)에 의해 측정되는 바와 같은, 종양의 크기, 질량, 대사 활성 또는 볼륨의 감소, 또는 무진행 생존(PFS: progression free survival) 또는 전체적인 생존(OS: overall survival)의 통계적으로 유의적인 증가 중 적어도 하나를 가리킨다. 본 발명의 문맥 상 본 명세서에서 질병 또는 장애와 관련하여 "예방하다", "예방 (prophylaxis, 또는 prevention)"의 의미는 본 발명의 폴리펩타이드 또는 조작된 세포를 단독으로 또는 다른 화합물과 조합하여, 투여하는 것을 의미한다. 질병 또는 장애 또는 질병 또는 장애의 증상의 일부 또는 전부의 개시 또는 발생을 방지하거나 또는 질병 또는 장애의 개시 가능성을 경감시키는 것을 의미한다.
[145] 본 명세서에서 "종양 특이 항원(tumor specific antigen)" 또는 "TSA"라 함은 포유동물 대상자의 종양 세포에 주로 존재하지만 포유동물 대상자의 정상 세포에서는 일반적으로 발견되지 않는 카운터 구조물을 가리킨다. 종양 특이 항원은 종양 세포에 대해서만 배타적일 필요는 없으나 종양 특이 항원을 갖는 특정 포유동물 세포의 백분율은 충분히 높거나 또는 종양 표면에 대한 종양 특이 항원의 수준은 충분히 높아서 본 발명의 면역조절 폴리펩타이드와 같은 항-종양 요법에 의해 표적화될 수 있고, 종양의 효과로부터 포유동물의 예방 또는 치료가 제공된다. 일부 구체예에서, 종양이 있는 포유동물로부터의 세포의 무작위 통계 표본에서, TSA를 나타내는 세포들의 적어도 50%는 암세포이다. 또 다른 구체예에서, TSA를 나타내는 세포들의 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%는 암세포이다.
[146] 본 명세서에서 변이체 CD80과 관련하여 사용된 용어 "변이체" ("변형된" 또는 돌연변이"라는 용어도)는 인간의 개입에 의해 생성된 포유동물 (예컨대, 인간 또는 쥐) CD80과 같은 CD80을 의미한다. 변이체 CD80은 비변형 또는 야생형 CD80에 상대적으로 변경된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드이다. 변이체 CD80은 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 부가, 또는 이의 조합에 의해 야생형 CD80 이소폼 서열과 상이한 폴리펩타이드이다. 본 발명의 목적 상, 변이체 CD80은 적어도 하나의 친화성 변형된 도메인을 함유하여, 이에 의해 하나 이상의 아미노산 차이가 IgSF 도메인 (예컨대 IgV 도메인)에서 발생한다. 변이체 CD80은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 그 이상의 아미노산 차이, 에컨대 아미노산 치환을 포함한다. 변이체 CD80 폴리펩타이드는 일반적으로 대응하는 야생형 또는 비변형 CD80, 예컨대 SEQ ID NO:1의 서열, 그의 성숙한 서열 또는 그의 세포외 도메인 또는 IgSF 도메인을 함유하는 그의 일부에 대해 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타낸다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:28, SEQ ID NO: 152, 또는 SEQ ID NO:372에 제시된 서열을 포함하는 대응하는 야생형 또는 비변형 CD80에 대해 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타낸다. 자연발생적인 아미노산 뿐만 아니라 비-자연발생적인 아미노산도 허용가능한 치환 또는 부가 범위 내에 포함된다. 변이체 CD80은 예를 들어, 드 노보 화학 합성, 드 노보 재조합 DNA 기술, 또는 이의 조합과 같은 임의의 특정 제조방법으로 한정되지 않는다. 본 발명의 변이체 CD80은 포유동물 종의 CD28, PD-L1 및/또는 CTLA-4 중 적어도 하나 또는 그 이상에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 변경된 아미노산 서열은 비변형 또는 야생형 CD80 단백질에 비해 CD28, PD-L1 및/또는 CTLA-4에 대해 변경된(즉, 증가 또는 감소된) 결합 친화성 또는 결합능을 결과시킨다. 결합 친화성 또는 결합능의 증가 또는 감소는 유세포 분석법 등 잘 알려진 결합 분석법을 이용하여 알아낼 수 있다. Larsen 외, American Journal of Transplantation, Vol 5: 443-453 (2005). Linsley 외, Immunity, 1: 7930801 (1994)도 참조할 것. CD28, PD-L1 및/또는 CTLA-4에 대한 변이체 CD80 결합 친화성 또는 결합능의 증가는 CD28, PD-L1 및/또는 CTLA-4에 대한 비변형 또는 야생형 CD80의 그것에 대해 적어도 5% 더 큰 값일 수 있고 일부 구체예에서, 비변형 또는 야생형 CD80 대조군 값의 그것보다 적어도 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 100% 더 큰 것일 수 있다. CD28, PD-L1 및/또는 CTLA-4에 대한 CD80 결합 친화성 또는 결합능의 감소는 비변형 또는 야생형 CD80 대조군 값의 95% 이하의 값이고, 일부 구체예에서, 비변형 또는 야생형 CD80 대조군 값의 결합 친화성 또는 결합능의 80%, 70% 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% 이하 또는 검출 불가능한 것일 수 있다. 변이체 CD80 폴리펩타이드는 아미노산 잔기의 치환, 부가 또는 결실에 의해 일차 아미노산 서열이 변경된다. 변이체 CD80 폴리펩타이드와 관련하여 용어 "변이체"는 어떠한 특정 출발 조성물에 대한 조건이나 변이체 CD80을 생성하는 방법에 대한 어떠한 조건을 부과하는 것으로 여겨져서는 아니된다. 변이체 CD80은 야생형 포유동물 CD80 서열 정보로부터 출발하여 CD28, PD-L1 및/또는 CTLA-4에 결합하기 위해 인 실리코(in silico) 모델링된 다음 최종적으로 재조합 또는 화학적으로 합성에 의해 변이체 CD80을 수득할 수 있다. 한 가지 별법 사례에서, 변이체 CD80은 비변형 또는 야생형 CD80의 부위-지향된 돌연변이생성에 의해 생성될 수 있다. 그러므로, 변이체 CD80은 조성물(composition)일 수 있고 반드시 임의의 주어진 방법에 의해 생산되는 생성물이어야 할 필요는 없다. 재조합 방법, 화학적 합성 또는 이들의 조합을 포함하는 다양한 기술이 사용될 수 있다.
[147] 본 명세서에서 용어 "야생형" 또는 "천연 또는 자연 (natural 또는 native)"은 핵산 분자, 단백질 (예 : CD80), IgSF 구성원, 숙주 세포 등과 같은 생물학적 물질과 관련하여 사용되고, 자연에서 발견되고 인간의 개입에 의해 변형되지 않는 것들을 지칭한다.
II. 변이체 CD80 폴리펩타이드
[148] 본 발명에 따라 하나 이상의 CD80 동족 결합 파트너에 대해 변경된 (증가 또는 감소된) 결합 활성 또는 친화성을 나타내는 변이체 CD80 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 구체예에서, CD80 동족 결합 파트너는 CD28, PD-L1, 또는 CTLA-4이다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 야생형 또는 비변형 CD80 폴리펩타이드 또는 IgD 또는 그의 특이적 결합 단편를 함유하는 야생형 또는 비변형 CD80의 일부에 비해 면역글로불린 수퍼패밀리 (IgSF) 도메인 (IgD)에 하나 이상의 아미노산 변형, 예컨대 하나 이상의 치환 (또는 "돌연변이" 또는 "교체"), 결실 또는 부가를 포함한다.
[149] 따라서, 제공된 변이체 CD80 폴리펩타이드는 하나 이상의 아미노산 변형 (예컨대, 치환)이 IgD에 있는 것인 변이체 IgD (이하 "vIgD"라 칭함)이거나 또는 이를 포함한다.
[150] 일부 구체예에서, IgD는 IgV 도메인 또는 IgC (예컨대 IgC2) 도메인 또는 IgV 도메인 또는 IgC (예컨대 IgC2) 도메인의 특이적 결합 단편, 또는 이의 조합을 포함한다. 일부 구체예에서, IgD는 CD80의 Ig 도메인의 임의 조합 또는 전체적인 세포외 도메인(ECD)를 포함하여, IgV 및 IgC의 조합 또는 IgV 단독일 수 있다. 표 2는 CD80의 IgV 또는 IgC 영역에 대응하는 예시적인 잔기를 나타낸다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 IgV 도메인 또는 IgC 도메인 또는 그의 특이적 결합 단편에 적어도 하나의 아미노산 변형(예컨대 치환)이 존재하는 IgV 도메인, 또는 IgC 도메인, 또는 그의 특이적 결합 단편을 포함한다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 IgV 도메인 또는 그의 특이적 결합 단편에 적어도 하나의 아미노산 변형(예컨대 치환)이 존재하는 IgV 도메인 또는 그의 특이적 결합 단편을 포함한다. 일부 구체예에서 변경된 결합 활성 또는 친화성으로 인해, 변경된 IgV 도메인 또는 IgC 도메인은 친화성 변형된 IgSF 도메인이다.
[151] 일부 구체예에서, 변이체는 비변형 CD80 서열의 서열에 비해 하나 이상의 IgSF 도메인에서 변형된다. 일부 구체예에서, 비변형 CD80 서열은 야생형 CD80이다. 일부 구체예에서, 비변형 또는 야생형 CD80은 천연 CD80 또는 그의 오솔로그의 서열을 갖는다. 일부 구체예에서, 비변형 CD80은 CD80의 세포외 도메인 (ECD) 또는 하나 이상의 IgSF 도메인을 함유하는 그의 일부이거나 또는 이를 포함한다 (표 2 참조). 일부 구체예에서, 비변형 또는 야생형 CD80 폴리펩타이드의 세포외 도메인은 IgV 도메인 및 IgC 도메인 또는 도메인들을 포함한다. 그러나, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 IgV 도메인 및 IgC 도메인 또는 도메인들 두가지 모두를 반드시 포함할 필요는 없다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 IgV 도메인 또는 그의 특이적 결합 단편을 포함하거나 기본적으로 이들로 구성된다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 IgC 도메인 또는 그의 특이적 결합 단편을 포함하거나 기본적으로 이들로 구성된다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80은 가용성이고 막관통 도메인을 결여한다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80은 막관통 도메인을 더 포함하며 일부 사례에서 세포질 도메인도 포함한다.
[152] 일부 구체예에서, 야생형 또는 비변형 CD80 폴리펩타이드는 비제한적인 예로서 인간, 마우스, 시노몰구스 원숭이, 또는 래트 CD80 폴리펩타이드와 같은 포유동물 CD80 폴리펩타이드이다. 일부 구체예에서, 야생형 또는 비변형 CD80 서열은 인간이다.
[153] 일부 구체예에서, 야생형 또는 비변형 CD80 폴리펩타이드는 (i) SEQ ID NO: 1에 제시된 아미노산 서열 또는 시그널 서열이 결여된 그의 성숙 형태, (ii) SEQ ID NO: 1 또는 그의 성숙 형태에 대해 적어도 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열를 포함할 수 있거나, 또는 (iii) IgV 도메인 또는 IgC 도메인 또는 그의 특이적 결합 단편을 함유하는, (i) 또는 (ii)의 단편이다.
[154] 일부 구체예에서, 야생형 또는 비변형 CD80 폴리펩타이드는 CD80의 세포외 도메인 또는 그의 일부이거나 또는 이를 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 비변형 또는 야생형 CD80 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 28에 제시된 아미노산 서열, 또는 그의 오솔로그를 포함한다. 예를 들어, 비변형 또는 야생형 CD80 폴리펩타이드는 (i) SEQ ID NO:28에 제시된 아미노산 서열, (ii) SEQ ID NO: 28에 대해 적어도 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 또는 (iii) IgV 도메인 또는 IgC 도메인을 포함하는 (i) 또는 (ii)의 특이적 결합 단편이다. 일부 구체예에서, CD80의 야생형 또는 비변형 세포외 도메인은 CD28, PD-L1 또는 CTLA-4 중 하나 이상과 같이, 하나 이상의 CD80 동종 결합 단백질에 결합할 수 있다.
[155] 일부 구체예에서, 야생형 또는 비변형 CD80 폴리펩타이드는 IgV 도메인 또는 IgC 도메인, 또는 그의 특이적 결합 단편을 함유한다. 일부 구체예에서, 야생형 또는 비변형 CD80 폴리펩타이드의 IgV 도메인은 SEQ ID NO: 152 또는 372에 제시된 아미노산 서열, 또는 그의 오솔로그를 포함한다. 옐르 들어, 비변형 또는 야생형 CD80 폴리펩타이드의 IgV 도메인은 (i) SEQ ID NO: 152 또는 372에 제시된 아미노산 서열, (ii) SEQ ID NO: 152 또는 372에 대해 적어도 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 함유할 수 있거나, 또는 (iii) (i) 또는 (ii)의 특이적 결합 단편이다. 일부 구체예에서, 야생형 또는 비변형 IgV 도메인은 CD28, PD-L1 또는 CTLA-4 중 하나 이상과 같은, 하나 이상의 CD80 동종 결합 단백질에 결합할 수 있다.
[156] 일부 구체예에서, 야생형 또는 비변형 CD80 폴리펩타이드의 IgC 도메인은 SEQ ID NO: 1의 잔기 145-230 또는 154-232에 제시된 아미노산 서열, 또는 그의 오솔로그를 포함한다. 예를 들어, 비변형 또는 야생형 CD80 폴리펩타이드의 IgC 도메인은 (i) SEQ ID NO: 1의 잔기 145-230 또는 154-232에 제시된 아미노산 서열, (ii) SEQ ID NO: 1의 잔기 145-230 또는 154-232에 대해 적어도 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 함유할 수 있거나, 또는 (iii) (i) 또는 (ii)의 특이적 결합 단편이다. 일부 구체예에서, 야생형 또는 비변형 IgC 도메인은 하나 이상의 CD80 동종 결합 단백질에 결합할 수 있다.
[157] 일부 구체예에서, 야생형 또는 비변형 CD80 폴리펩타이드는 CD80의 특이적 결합 단편, 예컨대 IgV 도메인 또는 IgC 도메인의 특이적 결합 단편을 함유한다. 일부 구체예에서 특이적 결합 단편은 CD28, PD-L1, 및/또는 CTLA-4와 결합할 수 있다. 특이적 결합 단편은 적어도 50 아미노산, 예컨대 적어도 60, 70, 80, 90, 100, 또는 110 아미노산의 아미노산 길이를 가질 수 있다. 일부 구체예에서, IgV 도메인의 특이적 결합 단편은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 35-135 또는 37-138에 제시된 IgV 도메인의 길이의 적어도 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%인 아미노산 서열을 함유한다. 일부 구체예에서, IgC 도메인의 특이적 결합 단편은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 145-230 또는 154-232로서 제시된 IgC 도메인의 길이의 적어도 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%인 아미노산 서열을 포함한다.
[158] 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 하나 이상의 친화성 변형된 IgSF 도메인을 포함하는 ECD 도메인 또는 그의 일부를 포함한다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 IgV 도메인 또는 IgC 도메인, 또는 IgV 도메인의 특이적 결합 단편 또는 IgC 도메인의 특이적 결합 단편을 포함할 수 있고 여기서 IgV 또는 IgC 도메인의 적어도 하나는 하나 이상의 아미노산 변형 (예컨대, 치환)을 포함한다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 IgV 도메인 및 IgC 도메인, 또는 IgV 도메인의 특이적 결합 단편 및 IgC 도메인의 특이적 결합 단편을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 전장 IgV 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 전장 IgC 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 IgV 도메인의 특이적 결합 단편을 포함한다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 IgC 도메인의 특이적 결합 단편을 포함한다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 전장 IgV 도메인 및 전장 IgC 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 전장 IgV 도메인 및 IgC 도메인의 특이적 결합 단편을 포함한다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 IgV 도메인의 특이적 결합 단편인 및 전장 IgC 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 IgV 도메인의 특이적 결합 단편인 및 IgC 도메인의 특이적 결합 단편을 포함한다.
[159] 이러한 임의의 구체예에 있어서, 변이체 CD80 폴리펩타이드의 하나 이상의 아미노산 변형 (예컨대, 치환)은 CD80 폴리펩타이드 도메인들 중 임의의 어느 하나 이상에 위치할 수 있다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 변형 (예컨대, 치환)은 변이체 CD80 폴리펩타이드의 세포외 도메인에 위치한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 변형 (예컨대, 치환)은 IgV 도메인 또는 IgV 도메인의 특이적 결합 단편에 위치한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 변형 (예컨대, 치환)은 IgC 도메인 또는 IgC 도메인의 특이적 결합 단편에 위치한다.
[160] 일반적으로, 폴리펩타이드들의 다양한 각 속성들을 이하에 개별적으로 개시한다 (예컨대, 가용성 및 막 결합 폴리펩타이드, CD28, PD-L1, 및 CTLA-4에 대한 CD80의 친화성, 폴리펩타이드 사슬 당 변이 갯수, 연결된 폴리펩타이드 사슬 갯수, 변이체 CD80 당 아미노산 변경의 갯수 및 성질, 등). 그러나, 통상의 기술자에게는, 임의의 특정한 폴리펩타이드가 이들 독립적인 속성들의 조합을 포함할 수 있다는 것이 명확히 이해될 것이다. IgSF 도메인의 도메인 조직을 설명하는데 사용된 SEQ ID NO로서 제시된 특정 서열에 대한 것을 비롯하여 아미노산을 참조로 한 것은 어디까지나 설명 목적을 위한 것일 뿐 제공된 구체예 범위로 본 발명이 한정되는 것은 아닌 것으로 이해되어야 한다. 폴리펩타이드 및 그의 도메인 설명은 상동성 분석 및 유사 분자의 정렬에 기초하여 이론적으로 유도된 것이다. 그러므로, 정확한 위치는 달라질 수 있고, 각 단백질에 대해 반드시 동일할 필요는 없다. 따라서, 특이적 IgSF 도메인, 예컨대 특이적 IgV 도메인 또는 IgC 도메인은 수 개의 아미노산 (예컨대 1, 2, 3 또는 4개)만큼 짧거나 길 수 있다.
[161] 또한, 이하에 설명되는 바와 같은 본 발명의 다양한 구체예는 위에 개시된 바와 같이 정의된 용어의 의미 내에서 제공된다. 따라서, 특정 정의에 설명 된 구체예들은 정의된 용어가 본 명세서에서 설명된 다양한 양상 및 속성을 설명하는데 이용될 때 참조로서 포함되는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 표제, 다양한 양태 및 구체예의 제시 순서, 및 각각의 독립적인 속성의 개별적인 개시는 본 개시의 범위에 대한 제한을 의미하지 않는다.
예시적인 변형 (Exemplary Modifications)
[162] 야생형 또는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 함유된 IgSF 도메인에 비해 적어도 하나의 친화성-변형된 IgSF 도메인 (예컨대 IgV 또는 IgC) 또는 그의 특이적 결합 단편을 함유하는 변이체 CD80 폴리펩타이드가 제공되며 상기 변이체 CD80 폴리펩타이드는 야생형 또는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 리간드 CD28, PD-L1 또는 CTLA-4 중 하나 이상에 대해 변경된 (증가 또는 감소된) 결합 활성 또는 친화성을 나타낸다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 예를 들어, 고상 ELISA 면역분석법, 유세포 분석법 또는 Biacore 분석법에 의해 측정되는 바와 같이 야생형 또는 비변형 CD80 폴리펩타이드 대조군 서열의 그것과는 다른, CD28, PD-L1, 및/또는 CTLA-4에 대한 결합 친화성을 갖는다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 CD28, PD-L1, 및/또는 CTLA-4에 대해 증가된 결합 친화성을 갖는다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 야생형 또는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해, CD28, PD-L1, 및/또는 CTLA-4에 대해 감소된 결합 친화성을 갖는다. CD28, PD-L1 및/또는 CTLA-4는 인간 단백질 또는 쥐의 단백질과 같은 포유동물 단백질일 수 있다.
[163] 각각의 동족 결합 파트너에 대한 결합 친화성은 독립적이다; 즉, 일부 구체예에서, 야생형 또는 비변형 CD80 폴리펩타이드와 비교시, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 CD28, PD-L1, 및 CTLA-4 중 하나, 두개 또는 세개에 대해 증가된 결합 친화성을 갖고/갖거나 CD28, PD-L1, 및 CTLA-4 중 하나, 두개 또는 세개에 대해 감소된 결합 친화성을 갖는다.
[164] 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 야생형 또는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해, CD28에 대해 증가된 결합 친화성을 갖는다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 야생형 또는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해, PD-L1에 대해 증가된 결합 친화성을 갖는다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 야생형 또는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 CTLA-4에 대해 증가된 결합 친화성을 갖는다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 야생형 또는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 CD28에 대해 감소된 결합 친화성을 갖는다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 야생형 또는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 PD-L1에 대해 감소된 결합 친화성을 갖는다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 야생형 또는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 CTLA-4에 대해 감소된 결합 친화성을 갖는다.
[165] 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 야생형 또는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 CD28 및 PD-L1에 대해 증가된 결합 친화성을 갖는다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 야생형 또는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 CD28에 대해 증가된 결합 친화성 및 PD-L1에 대해 감소된 결합 친화성을 갖는다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 야생형 또는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 CD28 및 PD-L1에 대해 감소된 결합 친화성을 갖는다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 야생형 또는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 CD28에 대해 감소된 결합 친화성 및 PD-L1에 대해 증가된 결합 친화성을 갖는다.
[166] 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 야생형 또는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 CD28 및 CTLA-4에 대해 증가된 결합 친화성을 갖는다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 야생형 또는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 CD28에 대해 증가된 결합 친화성 및 CTLA-4에 대해 감소된 결합 친화성을 갖는다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 야생형 또는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 CD28 및 CTLA-4에 대해 감소된 결합 친화성을 갖는다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 야생형 또는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 CD28에 대해 감소된 결합 친화성 및 CTLA-4에 대해 증가된 결합 친화성을 갖는다.
[167] 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 야생형 또는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 PD-L1 및 CTLA-4에 대해 증가된 결합 친화성을 갖는다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 야생형 또는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 PD-L1에 대해 증가된 결합 친화성 및 CTLA-4에 대해 감소된 결합 친화성을 갖는다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 야생형 또는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 PD-L1 및 CTLA-4에 대해 감소된 결합 친화성을 갖는다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 야생형 또는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 PD-L1에 대해 감소된 결합 친화성 및 CTLA-4에 대해 증가된 결합 친화성을 갖는다.
[168] 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 야생형 또는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 CD28, PD-L1, 및 CTLA-4에 대해 증가된 결합 친화성을 갖는다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 야생형 또는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 CD28 및 PD-L1에 대해 증가된 결합 친화성 및 CTLA-4에 대해 감소된 결합 친화성을 갖는다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 야생형 또는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 CD28 및 CTLA-4에 대해 증가된 결합 친화성, 및 PD-L1에 대해 감소된 결합 친화성을 갖는다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 야생형 또는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 CD28 및 PD-L1에 대해 감소된 결합 친화성 및 CTLA-4에 대해 증가된 결합 친화성을 갖는다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 야생형 또는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 CD28에 대해 감소된 결합 친화성 및 PD-L1 및 CTLA-4에 대해 증가된 결합 친화성을 갖는다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 야생형 또는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 CD28에 대해 증가된 결합 친화성, 및 PD-L1 및 CTLA-4에 대해 감소된 결합 친화성을 갖는다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 야생형 또는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 CD28, CTLA-4, 및 PD-L1에 대해 감소된 결합 친화성을 갖는다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 야생형 또는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해, CD28에 대해 감소된 결합 친화성 및 PD-L1 및 CTLA-4에 대해 증가된 결합 친화성을 갖는다.
[169] 일부 구체예에서, CD28, PD-L1, 및/또는 CTLA-4에 대해 증가 또는 감소된 결합 친화성을 갖는 변이체 CD80 폴리펩타이드는 야생형 또는 비변형 CD80 폴리펩타이드 대조군에 비해 CD28, PD-L1, 및/또는 CTLA-4에 대해 적어도 약 5%, 예컨대 적어도 약 10%, 15%, 20%, 25%, 35%, 또는 50% 증가된 결합 친화성을 가질 것이다. 일부 구체예에서, 야생형 또는 비변형 CD80 폴리펩타이드과 비교시 결합 친화성 증가는 1.2배, 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 20배, 30배 40배 또는 50배 이상이다. 그러한 예에서, 야생형 또는 비변형 CD80 폴리펩타이드는 하나 이상의 아미노산 변형 (예컨대, 치환)을 포함하지 않는 것을 제외하고 변이체 CD80 폴리펩타이드와 동일한 서열을 갖는다.
[170] 일부 구체예에서, CD28, PD-L1, 및/또는 CTLA-4에 대해 감소 또는 저감된 결합 친화성을 갖는 변이체 CD80 폴리펩타이드는 야생형 또는 비변형 CD80 폴리펩타이드 대조군에 비해 CD28, PD-L1, 및/또는 CTLA-4에 대해 적어도 약 5%, 예컨대 적어도 약 10%, 15%, 20%, 25%, 35%, 또는 50% 감소된 결합 친화성을 가질 것이다. 일부 구체예에서, 야생형 또는 비변형 CD80 폴리펩타이드과 비교시 결합 친화성 감소는 1.2배, 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 20배, 30배 40배 또는 50배 이상이다. 그러한 예에서, 야생형 또는 비변형 CD80 폴리펩타이드는 하나 이상의 아미노산 변형 (예컨대, 치환)을 함유하지 않는 것을 제외하고 변이체 CD80 폴리펩타이드와 동일한 서열을 갖는다.
[171] 일부 구체예에서, CD28, PD-L1, 및/또는 CTLA-4에 대한 전술한 구체예들 중 어느 하나의 평형 해리 상수 (Kd)는 1x10-5 M 미만, 1x10-6 M 미만, 1x10-7 M 미만, 1x10-8 M 미만, 1x10-9 M 미만, 1x10-10 M 미만 또는 1x10-11　M 미만, 또는 1x10-12 M 미만일 수 있다.
[172] 야생형 또는 비변형 CD80 서열이 반드시 본 명세서에 개시된 변이체 CD80 폴리펩타이드 제조를 위한 출발 조성물로서 사용될 필요는 없다. 그러므로, "치환"이라는 용어의 사용은 제공된 구체에가 변이체 CD80 폴리펩타이드의 특정 제조방법으로 한정됨을 시사하는 것은 아니다. 변이체 CD80 폴리펩타이드는 예를 들어, 드 노보 펩타이드 합성에 의해 만들어질 수 있고 따라서 그 치환을 인코딩하기 위해 코던을 변경시키는 의미의 "치환"이 반드시 요구되지 않는다. 이 원리는 아미노산 잔기의 "부가" 및 "결실" 등의 용어에도 적용되며 마찬가지로 특정 제조 방법을 시사하는 것이 아니다. 변이체 CD80 폴리펩타이드가 설계 또는 생성되는 수단은 어떤 특정한 방법으로 한정되지 않는다. 그러나 일부 구체예에서, 야생형 또는 비변형 CD80 인코딩 핵산은 야생형 또는 비변형 CD80 유전자 물질로부터 돌연변이되어 본 명세서의 실시예에 개시된 방법 또는 통상의 기술자에게 알려지 기타 방법에 따라 소망되는 특이적 결합 친화성 및/또는 IFN-감마 발현 또는 기타 활성의 유도에 대해 스크리닝된다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 임의의 수의 공개적으로 이용 가능한 데이터베이스에서 이용 가능한 단백질 또는 핵산 서열을 이용하여 새롭게 합성된 다음 스크리닝된다. National Center for Biotechnology Information은 그러한 정보를 제공하며, 그의 웹 사이트는 이전에 논의된 UniProtKB 데이터베이스와 마찬가지로 인터넷을 통해 공개적으로 액세스할 수 있다.
[173] 달리 언급되지 않는 한, 본 명세서의 전 개시를 통해 나타난 바와 같이, 아미노산 치환(들)은 SEQ ID NO:28에 제시된 비변형 ECD 서열 또는, 적용가능한 경우, SEQ ID NO:152 또는 372 (어노테이션 규칙에 따라 SEQ ID NO:28의 잔기 1-101 또는 1-107을 각각 함유함)에 제시된 비변형 IgV 서열의 위치 넘버링에 상응하는 아미노산 위치 번호에 의해 다음과 같이지정된다:
VIHVTKEVKEVATLSCGHNVSVEELAQTRIYWQKEKKMVLTMMSGDMNIWPEYKNRTIFDITNNLSIVILALRPSDEGTYECVVLKYEKDAFKREHLAEVTLSVKADFPTPSISDFEIPTSNIRRIICSTSGGFPEPHLSWLENGEELNAINTTVSQDPETELYAVSSKLDFNMTTNHSFMCLIKYGHLRVNQTFNWNTTKQEHFPDN (SEQ ID NO:28)
VIHVTKEVKEVATLSCGHNVSVEELAQTRIYWQKEKKMVLTMMSGDMNIWPEYKNRTIFDITNNLSIVILALRPSDEGTYECVVLKYEKDAFKREHLAEVT (SEQ ID NO:152)
VIHVTKEVKEVATLSCGHNVSVEELAQTRIYWQKEKKMVLTMMSGDMNIWPEYKNRTIFDITNNLSIVIQALRPSDEGTYECVVLKYEKDGFKREHLAEVTLSVKAD (SEQ ID NO:372)
[174] 레퍼런스 서열을 SEQ ID NO:28 또는 SEQ ID NO:152 또는 SEQ ID NO:372과 정렬시키는 등에 의해, 그의 IgSF 도메인 (예컨대 IgV)을 함유하는 그의 단편을 비롯하여, CD80 폴리펩타이드에서의 예컨대 아미노산 치환과 같은 변형에 상응하는 위치를 동정하는 것은 통상의 기술자의 기술 수준 범위 내이다. 본 명세서 전반에 걸쳐 변형 목록에서, 아미노산 위치는 중간에, 대응하는 비변형(예컨대 야생형) 아미노산은 그 번호 앞에 그리고 동정된 변이체 아미노산 치환은 그 번호 뒤에 위치한다. 만일 변형이 해당 위치의 결실이면 "del"로 표시되고 변형이 그 위치에서의 삽입이면 "ins"로 표시된다.
[175] 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 야생형 또는 비변형 CD80 서열 내에 하나 이상의 아미노산 변형 (예컨대, 치환)을 갖는다. 하나 이상의 아미노산 변형 (예컨대, 치환)은 야생형 또는 비변형 CD80 서열의 엑토도메인 (세포외 도메인), 예컨대 세포외 도메인에서 일어날 수 있다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 변형 (예컨대, 치환)은 IgV 도메인 또는 그의 특이적 결합 단편에 존재한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 변형 (예컨대, 치환)은 IgC 도메인 또는 그의 특이적 결합 단편에 존재한다. 변이체 CD80 폴리펩타이드의 일부 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 변형 (예컨대, 치환)의 일부는 IgV 도메인 또는 그의 특이적 결합 단편에서, 그리고 하나 이상의 아미노산 변형 (예컨대, 치환)의 일부는 IgC 도메인 또는 그의 특이적 결합 단편에서 일어난다.
[176] 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 아미노산 변형 (예컨대, 치환)을 갖는다. 변형 (예컨대, 치환)은 IgV 도메인 또는 IgC 도메인에 존재할 수 있다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 아미노산 변형 (예컨대, 치환)을 IgV 도메인 또는 그의 특이적 결합 단편 내에 가질 수 있다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 아미노산 변형 (예컨대, 치환)을 IgC 도메인 또는 그의 특이적 결합 단편 내에 가질 수 있다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 28, 152, 또는 372의 아미노산 서열과 같은, 야생형 또는 비변형 CD80 폴리펩타이드 또는 그의 특이적 결합 단편에 대해 적어도 약 85%, 86%, 86%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는다.
[177] 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:　28의 넘버링을 참조로 4, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 21, 22, 24, 25, 27, 28, 29, 30,31, 33, 36, 37, 38,40, 41, 42, 43, 44, 47, 48, 50, 52, 53, 54, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 72, 74, 76, 77, 80, 81, 83, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 99, 102, 103, 104, 107, 108, 109, 110, 114, 115, 116, 117, 118, 120, 121, 122, 126, 127, 128, 129, 130, 133, 137, 140, 142, 143, 144, 148, 149, 152, 154, 160, 162, 164, 168, 169, 174, 175, 177, 178, 183, 178, 185, 188, 190, 192, 193, 또는 199에 대응하는 위치에서 비변형 CD80 또는 그의 특이적 결합 단편 중 하나 이상의 아미노산 변형 (예컨대, 치환)을 갖는다. 일부 구체예에서, 이러한 변이체 CD80 폴리펩타이드들은 야생형 또는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 CD28, PD-L1, 또는 CTLA-4 중 하나 이상에 대해 변경된 결합 친화성을 나타낸다. 예컨대, 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 야생형 또는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 CD28, PD-L1, 및/또는 CTLA-4에 대해 증가된 결합 친화성을 나타낸다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 야생형 또는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 CD28, PD-L1, 및/또는 CTLA-4에 대해 감소된 결합 친화성을 나타낸다.
[178] 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 V4M, K9E, E10R, V11S, A12G, A12T, A12V, T13N, L14A, S15V, S15F, C16S, C16G, C16L, G17W, H18L, H18R, H18Y, V20L, S21P, V22A, E24G, L25P, Q27R, T28A, T28S, R29C, R29D, R29H, R29V,I30V, Y31F, Y31H, Y31L, Q33H, K36E, K36G, K37E, K37Q, M38I, M38L, M38T, M38V, L40M, T41A, T41G, T41D, T41I, M42T, M43I, M43Q, M43R, M43V, S44P, M47T, N48D, N48I, W50G, E52G, Y53C, K54M, F59L, F59S, D60V, I61N, T62S, N63S, N64S, L65H, S66H, I67F, I67T, V68A, V68M, I69T, L70Q, L70P, L70R, L72P, P74L, D76G, E77G, E77K, Y80N, E81A, E81R, E81V, V83A, V83I, L85I, L85R, K86E, Y87N, E88D, E88G, K89E, K89N, K89R, D90K, D90L, D90N, A91E, A91G, A91S, A91T, F92L, F92N, F92P, F92Y, K93I, K93E, K93Q, K93R, K93V, R94G, R94L, R94F, E95K, H96R, L97R, E99D, E99G, L102S, S103L, S103P, V104A, V104L, D107N, F108L, P109S, P109H, T110A, S114T, D115G, F116S, F116L, E117V, E117G, I118V, I118A, I118T, T120S, S121P, N122S, I126L, I126V, I127T, C128Y, C128R, S129L, S129P, T130A, G133D, P137L, S140T, L142S, E143G, N144D, N144S, L148S, N149D, N149S, N152T, T154I, T154A, E160G, E162G, Y164H, S168G, K169E, K169I, K169S, M174T, M174V, T175A, N177S, H178R, L183H, K185E, H188D, H188Q, R190S, N192D, Q193L, 또는 T199S로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 V4M, K9E, E10R, V11S, A12G, A12T, A12V, T13N, L14A, S15V, S15F, C16S, C16G, C16L, G17W, H18L, H18R, H18Y, V20L, S21P, V22A, E24G, L25P, Q27R, T28A, T28S, R29C, R29D, R29H, R29V, I30V, Y31F, Y31H, Y31L, Q33H, K36E, K36G, K37E, K37Q, M38I, M38L, M38T, M38V, L40M, T41A, T41G, T41D, T41I, M42T, M43I, M43Q, M43R, M43V, S44P, M47T, N48D, N48I, W50G, E52G, Y53C, K54M, F59L, F59S, D60V, I61N, T62S, N63S, N64S, L65H, S66H, I67F, I67T, V68A, V68M, I69T, L70Q, L70P, L70R, L72P, P74L, D76G, E77G, E77K, Y80N, E81A, E81R, E81V, V83A, V83I, L85I, L85R, K86E, Y87N, E88D, E88G, K89E, K89N, K89R, D90K, D90L, D90N, A91E, A91G, A91S, A91T, F92L, F92N, F92P, F92Y, K93I, K93E, K93Q, K93R, K93V, R94G, R94L, R94F, E95K, H96R, L97R, E99D, E99G, L102S, S103L, S103P, V104A, V104L, D107N, F108L, P109S, P109H, T110A, S114T, D115G, F116S, F116L, E117V, E117G, I118V, I118A, I118T, T120S, S121P, N122S, I126L, I126V, I127T, C128Y, C128R, S129L, S129P, T130A, G133D, P137L, S140T, L142S, E143G, N144D, N144S, L148S, N149D, N149S, N152T, T154I, T154A, E160G, E162G, Y164H, S168G, K169E, K169I, K169S, M174T, M174V, T175A, N177S, H178R, L183H, K185E, H188D, H188Q, R190S, N192D, Q193L, T199S로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환 또는 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는다.
[179] 일부 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 변형, 예컨대 치환은, L70Q/A91G, L70Q/A91G/T130A, L70Q/A91G/I118A/T120S/T130A, V4M/L70Q/A91G/T120S/T130A, L70Q/A91G/T120S/T130A, V20L/L70Q/A91S/T120S/T130A, S44P/L70Q/A91G/T130A, L70Q/A91G/E117G/T120S/T130A, A91G/T120S/T130A, L70R/A91G/T120S/T130A, L70Q/E81A/A91G/T120S/I127T/T130A, L70Q/Y87N/A91G/T130A, T28S/L70Q/A91G/E95K/T120S/T130A, N63S/L70Q/A91G/T120S/T130A, K36E/I67T/L70Q/A91G/T120S/T130A/N152T, E52G/L70Q/A91G/T120S/T130A, K37E/F59S/L70Q/A91G/T120S/T130A, A91G/S103P, K89E/T130A, D60V/A91G/T120S/T130A, K54M/A91G/T120S, M38T/L70Q/E77G/A91G/T120S/T130A/N152T, R29H/E52G/L70R/E88G/A91G/T130A, Y31H/T41G/L70Q/A91G/T120S/T130A, V68A/T110A, S66H/D90G/T110A/F116L, R29H/E52G/T120S/T130A, A91G/L102S, I67T/L70Q/A91G/T120S, L70Q/A91G/T110A/T120S/T130A, M38V/T41D/M43I/W50G/D76G/V83A/K89E/T120S/T130A, V22A/L70Q/S121P, A12V/S15F/Y31H/T41G/T130A/P137L/N152T, I67F/L70R/E88G/A91G/T120S/T130A, E24G/L25P/L70Q/T120S, A91G/F92L/F108L/T120S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118T/N149S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/N144S/N149S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M42T/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/L148S/N149S, E24G/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/F59L/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/H96R/N149S/C182S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/N149S, R29V/M43Q/E81R/L85I/K89R/D90L/A91E/F92N/K93Q/R94G, T41I/A91G, K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R/N122S/N177S, K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R, K36G/K37Q/M38I/F59L/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/E99G/T130A/N149S, E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R, K36G/K37Q/M38I/L40M, R29H/Y31H/T41G/Y87N/E88G/K89E/D90N/A91G/P109S, A12T/H18L/M43V/F59L/E77K/P109S/I118T, R29V/Y31F/K36G/M38L/M43Q/E81R/V83I/L85I/K89R/D90L/A91E/F92N/K93Q/R94G, V68M/L70P/L72P/K86E, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T120S/I127T/T130A/K169E, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/L70Q/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T120S/I127T/T130A, H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T120S/I127T/T130A/K169E, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T120S/T130A/M174T, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/F59L/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T120S/I127T/T130A/H188D, H18R/R29D/Y31L/Q33H/K36G/K37E/M38I/T41A/M43R/M47T/L70Q/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T120S/T130A/K169E/H188D, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/L70Q/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T120S/I127T/T130A/E143G/K169E/M174V/H188D, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/L70Q/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T120S/I127T/T130A, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T120S/I127T/T130A/H188D, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/L70Q/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T120S/I127T/T130A/K169E, 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H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/L70Q/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/T130A/K169E/H188D, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/I127T/C128Y/T130A/H188D, H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/E99D/T130A, H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/L70Q/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/T130A/K169E, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/I61N/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94F/V104A/I118V/T120S/I126V/T130A, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94F/I118V/T120S/T130A, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/T62S/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/T130A/K169E/T175A, H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/I127T/T130A/L142S/H188D, C16S/H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T110A/I118V/H188D, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/A91G/I118V/T120S/I127T/T130A/H188D, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/L70Q/D76G/A91G/S103L/I118V/T120S/I127T/T130A, Y53C/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/I127T/T130A/K169E, T62S/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/T130A/K169E, Y53C/L70Q/D90G/T130A/N149D/N152T/H188D, H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/I127T/T130A/H188D, H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T130A/N149S 이다.
[180] 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:　28의 넘버링을 참조로 비변형 CD80 또는 그의 특이적 결합 단편 내 대응하는 위치(들) 4, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 21, 22, 24, 25, 27, 28, 29, 31, 33, 36, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 47, 48, 50, 52, 53, 54, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 66, 67, 68, 69, 70, 72, 74, 76, 77, 80, 81, 83, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 99, 102, 103, 104, 108, 109, 110, 115, 116, 117, 118, 120, 121, 122, 126, 127, 128, 129, 130, 133, 137, 140, 142, 143, 144, 148, 149, 152, 154, 160, 162, 168, 169, 174, 175, 177, 178, 183, 178, 188, 190, 192, 또는 193에서 하나 이상의 아미노산 변형 (예컨대, 치환)을 갖는다. 일부 구체예에서, 이러한 변이체 CD80 폴리펩타이드는 야생형 또는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 CD28, PD-L1, 또는 CTLA-4 중 하나 이상에 대해 변경된 결합 친화성을 나타낸다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 야생형 또는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 CD28, PD-L1, 및/또는 CTLA-4에 대해 증가된 결합 친화성을 나타낸다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 야생형 또는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 CD28, PD-L1, 및/또는 CTLA-4에 대해 감소된 결합 친화성을 나타낸다.
[181] 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 V4M, K9E, E10R, V11S, A12G, A12T, A12V, T13N, L14A, S15V, S15F, C16S, C16G, C16L, G17W, H18L, H18R, H18Y, V20L, S21P, V22A, E24G, L25P, Q27R, T28A, T28S, R29C, R29D, R29H, R29V, Y31F, Y31H, Y31L, Q33H, K36E, K36G, K37E, K37Q, M38I, M38L, M38T, M38V, L40M, T41A, T41G, T41D, T41I, M42T, M43I, M43Q, M43R, M43V, S44P, M47T, N48I, W50G, E52G, Y53C, K54M, F59L, F59S, D60V, I61N, T62S, N63S, N64S, S66H, I67F, I67T, V68A, V68M, I69T, L70Q, L70P, L70R, L72P, P74L, D76G, E77G, E77K, Y80N, E81A, E81R, E81V, V83A, V83I, L85I, L85R, K86E, Y87N, E88D, E88G, K89E, K89N, K89R, D90K, D90L, D90N, A91E, A91G, A91S, A91T, F92L, F92N, F92P, F92Y, K93I, K93E, K93Q, K93R, K93V, R94G, R94L, R94F, E95K, H96R, L97R, E99G, L102S, S103L, S103P, V104A, V104L, F108L, P109S, P109H, T110A, D115G, F116S, F116L, E117V, E117G, I118V, I118A, I118T, T120S, S121P, N122S, I126L, I127T, C128Y, C128R, S129L, S129P, T130A, G133D, P137L, S140T, L142S, E143G, N144S, L148S, N149D, N149S, N152T, T154I, T154A, E160G, E162G, S168G, K169E, K169I, K169S, M174T, M174V, T175A, N177S, H178R, L183H, H188D, H188Q, R190S, N192D, Q193L,로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 V4M, K9E, E10R, V11S, A12G, A12T, A12V, T13N, L14A, S15V, S15F, C16S, C16G, C16L, G17W, H18L, H18R, H18Y, V20L, S21P, V22A, E24G, L25P, Q27R, T28A, T28S, R29C, R29D, R29H, R29V, Y31F, Y31H, Y31L, Q33H, K36E, K36G, K37E, K37Q, M38I, M38L, M38T, M38V, L40M, T41A, T41G, T41D, T41I, M42T, M43I, M43Q, M43R,M43V, S44P, M47T, N48I, W50G, E52G, Y53C, K54M, F59L, F59S, D60V, I61N, T62S, N63S, N64S, S66H, I67F, I67T, V68A, V68M, I69T, L70Q, L70P, L70R, L72P, P74L, D76G, E77G, E77K, Y80N, E81A, E81R, E81V, V83A, V83I, L85I, L85R, K86E, Y87N, E88D, E88G, K89E, K89N, K89R, D90K, D90L, D90N, A91E, A91G, A91S, A91T, F92L, F92N, F92P, F92Y, K93I, K93E, K93Q, K93R, K93V, R94G, R94L, R94F, E95K, H96R, L97R, E99G, L102S, S103L, S103P, V104A, V104L, F108L, P109S, P109H, T110A, D115G, F116S, F116L, E117V, E117G, I118V, I118A, I118T, T120S, S121P, N122S, I126L, I127T, C128Y, C128R, S129L, S129P, T130A, G133D, P137L, S140T, L142S, E143G, N144S, L148S, N149D, N149S, N152T, T154I, T154A, E160G, E162G, S168G, K169E, K169I, K169S, M174T, M174V, T175A, H178R, H178R, L183H, H188D, H188Q, R190S, N192D, Q193L로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환, 또는 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는다.
[182] 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 비변형 CD80 또는 그의 특이적 결합 단편 내에서 SEQ ID NO:　28의 넘버링을 참조로 30, 65,107, 114, 164,185, 또는 199에 대응하는 위치(들)에서 하나 이상의 아미노산 변형 (예컨대, 치환)을 갖는다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 I30V, N48D, L65H, E99D, D107N, S114T, I126V, N144D, Y164H, 및 T199S로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 N48D, L65H, E99D, D107N, S114T, I126V, N144D, Y164H, K185E, T199S로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환, 또는 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는다.
[183] 보존적 아미노산 치환은 야생형 또는 비변형 아미노산 이외의 치환된 아미노산과 동일한 클래스의 아미노산에 속하는 임의의 아미노산이다. 아미노산 클래스로는 지방족 (글리신, 알라닌, 발린, 류신, 및 이소류신), 히드록실 또는 황-함유 (세린, 시스테인, 트레오닌, 및 메티오닌), 시클릭 (프롤린), 방향족 (페닐알라닌, 티로신, 트립토판), 염기성 (히스티딘, 리신, 및 아르기닌), 및 산성/아미드 (아스파테이트, 글루타메이트, 아스파라긴, 및 글루타민)을 들 수 있다. 그러므로, 예를 들어, V4M 치환의 보존적 아미노산 치환에는 V4S, V4C, 및 V4T 아미노산 치환이 포함된다.
[184] 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 표 1에 수록된 임의의 치환(돌연변이)을 포함한다. 표 1은 또한 야생형 CD80 또는 예시적인 변이체 CD80 폴리펩타이드의 세포외 도메인 (ECD) 또는 IgV 도메인에 대한 예시적인 서열을 SEQ ID NO를 참조로 제공한다. 나타난 바와 같이, 표시된 바와 같이, 주어진 도메인에 상응하는 정확한 위치 또는 잔기는 도메인 식별 또는 분류에 사용된 방법에 따라 달라질 수 있다. 또한, 일부 사례에서, 소정의 도메인 (예를 들어, IgV)의 인접한 N-및/또는 C-말단 아미노산은 또한 발현시 도메인의 적절한 폴딩을 보장하기 위해 변이체 IgSF 폴리펩티드의 서열에 포함될 수 있다. 따라서, 표 1의 SEQ ID NO의 예시는 제한적인 것으로 해석되어서는 아니된다. 예를 들어, 변이체 CD80 폴리펩타이드의 IgV 도메인과 같은 특정 도메인은 각 SEQ ID NO에 제시된 아미노산 서열에 비해, 수 개의 아미노산, 예컨대 1-10, 예컨대 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개 또는 7 개의 아미노산 길이만큼 길어나 짧을 수 있다.
[185] 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 표 1에 수록된 세포외 도메인 (ECD) 서열들 중 어느 하나 (즉, SEQ ID NOS: 55-108, 280-346, 414-475 중 어느 하나)를 포함한다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 표 1에 수록된 세포외 도메인 (ECD) 서열들 중 어느 하나 (즉, SEQ ID NOS: 55-108, 280-346, 414-475 중 어느 하나)에 대해 적어도 90% 동일성, 적어도 91% 동일성, 적어도 92% 동일성, 적어도 93% 동일성, 적어도 94% 동일성, 적어도 95% 동일성, 예컨대 적어도 96% 동일성, 97% 동일성, 98% 동일성, 또는 99% 동일성을 나타내고 야생형 또는 비변형 CD80에는 존재하지 않는 아미노산 변형(들), 예컨대 치환(들)을 함유하는 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 표 1에 수록된 세포외 도메인 (ECD) 서열 중 어느 하나 (즉, SEQ ID NOS: 55-108, 280-346, 414-475 중 어느 하나)의 특이적 결합 단편을 포함하고 야생형 또는 비변형 CD80에는 존재하지 않는 아미노산 변형(들), 예컨대 치환(들)을 함유한다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 표 1에 수록된 IgV 서열 중 어느 하나 (즉, SEQ ID NOS: 153-195, 347, 373-386, 476-477 중 어느 하나)를 포함한다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 표 1에 수록된 IgV 서열 중 어느 하나 (즉, SEQ ID NOS: 153-195, 347, 373-386, 476-477 중 어느 하나)에 대해 적어도 90% 동일성, 적어도 91% 동일성, 적어도 92% 동일성, 적어도 93% 동일성, 적어도 94% 동일성, 적어도 95% 동일성, 예컨대 적어도 96% 동일성, 97% 동일성, 98% 동일성, 또는 99% 동일성을 나타내고, 야생형 또는 비변형 CD80에는 존재하지 않는 아미노산 변형(들), 예컨대, 치환(들)을 함유하는 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 에 수록된 IgV 서열 중 어느 하나 (즉, SEQ ID NOS: 153-195, 347, 373-386, 476-477 중 어느 하나)의 특이적 결합 단편을 포함하고 야생형 또는 비변형 CD80에는 존재하지 않는 아미노산 변형(들), 예컨대, 치환(들)을 함유한다..
[186] 표 1은 또한 야생형 CD80 또는 예시적인 변이체 CD80 폴리펩타이드의 세포외 도메인 (ECD) 또는 IgV 도메인에 대한 예시적인 서열을 SEQ ID NO를 참조로 제공한다. 나타난 바와 같이, 표시된 바와 같이, 주어진 도메인에 상응하는 정확한 위치 또는 잔기는 도메인 식별 또는 분류에 사용된 방법에 따라 달라질 수 있다. 또한, 일부 사례에서, 소정의 도메인 (예를 들어, ECD)의 인접한 N-및/또는 C-말단 아미노산은 또한 발현시 도메인의 적절한 폴딩을 보장하기 위해 변이체 IgSF 폴리펩티드의 서열에 포함될 수 있다. 따라서, 표 1의 SEQ ID NO의 예시는 제한적인 것으로 해석되어서는 아니된다. 예를 들어, 변이체 CD80 폴리펩타이드의 IgV 도메인과 같은 특정 도메인은 각 SEQ ID NO에 제시된 아미노산 서열에 비해, 수 개의 아미노산, 예컨대 1-10, 예컨대 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개 또는 7 개의 아미노산 길이만큼 길어나 짧을 수 있다.
Figure pat00001
Figure pat00002
Figure pat00003
Figure pat00004
Figure pat00005
Figure pat00006
[187] 일부 구체예에서 변이체 CD80 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:　28의 대응하는 위치(들) 12, 18, 20, 29, 31, 36, 40, 41, 43, 52, 59, 60, 63, 67, 70, 77, 81, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 107, 109, 114, 117, 118, 120, 122, 127, 130, 144, 169, 178 또는 199에서 하나 이상의 아미노산 변형 (예컨대, 치환)을 갖는다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 A12T, H18L, V20L, R29H, Y31H, K36G, L40M, T41G, T41I, M43V, E52G, F59L, D60V, N63S, I67T, L70Q, L70R, E77K, E81A, Y87N, E88D, E88G, K89E, K89R, D90K, D90N, A91G, A91S, F92Y, K93R, D107N,P109S, S114T, E117G, I118A, I118T, I118V, T120S, I127T, T130A,N144D, K169E, H178R, 또는 T199S로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드 A12T, H18L, V20L, R29H, Y31H, K36G, L40M, T41G, T41I, M43V, E52G, F59L, D60V, N63S, I67T, L70Q, L70R, E77K, E81A, Y87N, E88D, E88G, K89E, K89R, D90K, D90N, A91G, A91S, F92Y, K93R, D107N, P109S, S114T, E117G, I118A, I118T, I118V, T120S, I127T, T130A, N144D, K169E, H178R, 또는 T199S로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환 또는 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 A12T/H18L/M43V/F59L/E77K/P109S/I118T, V20L/L70Q/A91S/T120S/T130A, V20L/L70Q/A91S/I118V/T120S/T130A,R29H/Y31H/T41G/Y87N/E88G/K89E/D90N/A91G/P109S, K36G, K36G/L40M, T41I/A91G, E52G/L70/A91G/T120S/T130A, E52G/L70Q/A91G/D107N/I118V/T120S/T130A/K169E,D60V/A91G/T120S/T130A, D60V/A91G/I118V/T120S/T130A/K169E,N63S/L70Q/A91G/T120S/T130A, N63S/L70Q/A91G/S114T/I118V/T120S/T130A, I67T/L70Q/A91G/T120S, I67T/L70Q/A91G/I118V/T120S, L70Q/E81A/A91G/T120S/I127T/T130A, L70Q/E81A/A91G/I118V/T120S/I127T/T130A,L70Q/Y87N/A91G/T130A, L70Q/A91G, L70Q/A91G/N144D,L70Q/A91G/E117G/T120S/T130A, L70Q/A91G/E117G/I118V/T120S/T130A,L70Q/A91G/I118A/T120S/T130A, L70Q/A91G/I118A/T120S/T130A/K169E,L70Q/A91G/T120S/T130A, L70Q/A91G/I118V/T120S/T130A/K169E,L70R/A91G/T120S/T130A, L70R/A91G/I118V/T120S/T130A/T199S,E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R, K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R, 또는 K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R/N122S/N177S, E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R/N122S/N177S 이다. 일부 구체예에서, CD80 폴리펩타이드는 예컨대 SEQ ID NO: 28, 152, 또는 372에 제시된 서열을 포함하는 것과 같은 야생형 또는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해, 증가된 친화성 for the CD28의 엑토도메인에 대해 증가된 친화성 및/또는 CD28에 대해 증가된 선택성을 나타낸다.
[188] 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:　28의 위치(들) 12, 18, 21, 22, 28, 29, 31, 33, 36, 38, 40, 41, 42, 43, 47, 48, 59, 64, 67, 68, 70, 77, 81, 85, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 97, 104, 109, 115,117, 118, 120, 122, 126, 130, 133, 140, 144, 148, 149, 168, 169, 177, 183, 188 또는 193에 대응하는 위치(들)에서 하나 이상의 아미노산 변형 (예컨대, 치환)을 갖는다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 A12G, A12T, H18L, S21P, V22A, T28A,R29D, R29H, Y31H, Y31L, Q33H, K36G, M38I, L40M, T41A, T41G, M42T, M43R, M43V, M47T, N48I, F59L, N64S, I67T, V68A, V68M, L70Q, E77K, E81V, L85R, Y87N, E88D, E88G, K89E, K89N, K89R, D90K, D90N, A91G, A91T, F92P, F92Y, K93R, K93V, R94F, R94L, L97R, V104L, P109H, P109S, D115G, E117V, I118T, I118V, T120S, N122S, I126L, T130A, G133D, S140T, N144S, L148S, N149S, S168G, K169I, K169S, N177S, L183H, H188Q, R190S 및 Q193L로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 A12T, H18L, R29D, R29H, Y31H, Y31L, Q33H, K36G, M38I, L40M, T41A, T41G, M42T, M43R, M43V, M47T, F59L, I67T, L70Q, E77K, E81V, L85R, Y87N, E88D, E88G, K89E, K89N, K89R, D90K, D90N, A91G, A91T, F92P, F92Y, K93R, K93V, R94L, P109S, I118T, I118V,T120S, N122S, N144S, L148S, N149S, 및 N178S로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환 , 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는다.
[189] 일부 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 A12T/H18L/M43V/F59L/E77K/P109S/I118T, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118T/N149S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/N144S/N149S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M42T/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/L148S/N149S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/N149S, R29H/Y31H/T41G/Y87N/E88G/K89E/D90N/A91G/P109S, K36G, K36G/L40M,I67T/L70Q/A91G/T120S, I67T/L70Q/A91G/I118V/T120S,E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R, K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R, A91G,H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/I127T/T130A/H188D, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/V68M/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T130A/N149S/R190S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94F/E117V/I118T/N149S/S168G/H188Q, V22A/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/V68M/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T130A, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/N64S/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94F/ I118T/T130A/N149S/K169I, V22A/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/V68M/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/D115G/I118T/T130A/G133D/N149S, T28A/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/ V104L/T130A/N149S, H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/L97R/N149S/H188Q, K89E/T130A, K89E/K93E/T130A, S21P/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/N48I/V68A/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/S21P/ N48I/V68A/P109H/I126L/K169I, H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/V68M/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T130A, H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T130A/N149S, A12G/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/V68A/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/ L97R/T130A/L183H, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118T/T130A/S140T/N149S/K169S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118T/T130A/N149S/K169I/Q193L, V22A/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/ I118T/T130A/N149S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118T/T130A/N149S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118T/T130A/N149S/K169I, 또는 R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94F/T130A/N149S/K169I 이다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 28, 152, 또는 372에 제시된 서열을 포함하는 것과 같은 야생형 또는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해, PD-L1에 대해 증가된 친화성 및/또는 PD-L1에 대해 증가된 선택성을 나타낸다.
[190] 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:　28의 12, 18, 36, 40, 43, 59, 77, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 109, 118, 122, 또는 177에 대응하는 위치(들)에서 하나 이상의 아미노산 변형 (예컨대, 치환)을 갖는다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 A12T, H18L, K36G, M43V, F59L, E77K, E88D, K89R, D90K, A91G, F92Y, K93R, P109S, I118T, N112S, 및 N177S로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 A12T, H18L, K36G, L40M, M43V, F59L, E77K, E88D, K89R, D90K, A91G, F92Y, K93R, P109S, I118T, N112S, 및 N177S로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환, 및 그의 보존적 돌연변이를 갖는다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 A12T/H18L/M43V/F59L/E77K/P109S/I118T, K36G, K36G/L40M,E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R, K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R, E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R/N122S/N177S, 또는 K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R/N122S/N177S 이다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 28, 152, 또는 372에 제시된 서열을 포함하는 것과 같은 야생형 또는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 CD28의 엑토도메인 및 PD-L1의 엑토도메인에 대해 증가된 친화성을 나타낸다.
[191] 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:　28의 4, 29, 31, 36, 40, 41, 52, 67, 68, 70, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 107, 109, 110, 118, 120, 130, 144, 또는 169에 대응하는 위치(들)에서 하나 이상의 아미노산 변형 (예컨대, 치환)을 갖는다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 V4M, R29H, Y31H, K36G, L40M, T41G, E52G, I67T, V68A, L70Q, Y87N, E88D, E88G, K89E, K89R, D90K, D90N, A91G, F92Y, K93R, D107N,P109S, T110A, I118V, T120S, T130A,N144D, 및 K169E로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 V4M, R29H, Y31H, K36G, L40M, T41I, T41G, E52G, I67T, I69T, V68A, L70Q, Y87N, E88D, E88G, K89E, K89R, D90K, D90N, A91G, F92Y, K93R, D107N, P109S, T110A, I118V, T120S, T130A,N144D, 및 K169E으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 V4M/L70Q/A91G/T120S/T130A, V4M/L70Q/A91G/I118V/T120S/T130A/K169E, R29H/Y31H/T41G/Y87N/E88G/K89E/D90N/A91G/P109S, K36G, K36G/L40M,T41I/A91G, E52G/L70Q/A91G/T120S/T130A, E52G/L70Q/A91G/D107N/I118V/T120S/T130A/K169E,I67T/L70Q/A91G/T120S, I67T/L70Q/A91G/I118V/T120S,V68A/T110A, L70Q/A91G,L70Q/A91G/N144D, L70Q/A91G/T120S/T130A, L70Q/A91G/I118V/T120S/T130A/K169E, L70Q/A91G/T130A, K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R, E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R, A91G/I118V/T120S/T130A,A91G/T120S/T130A 또는 I69T/L70Q/A91G/T120S이다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 28, 152, 또는 372에 제시된 서열을 포함하는 것과 같은 야생형 또는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해, CTLA-4의 엑토도메인에 대해 증가된 친화성 및/또는 증가된 선택성을 나타낸다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:　28의 36, 40, 52, 70, 88, 89, 90, 91, 92, 93,107, 118120, 130, 144, 또는 169에 대응하는 위치(들)에서 하나 이상의 아미노산 변형 (예컨대, 치환)을 갖는다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 K36G,L40M, E52G, L70Q, E88D,K89R, D90K, A91G, F92Y, K93R, D107N, I118V, T120S, T130A,N144D, 및 K169E로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 K36G, L40M, E52G, L70Q, E88D,K89R, D90K, A91G, F92Y, K93R, D107N, I118V, T120S, T130AN144D,and K169E로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 K36G, K36G/L40M, E52G/L70Q/A91G/T120S/T130A, E52G/L70Q/A91G/D107N/I118V/T120S/T130A/K169E, L70Q/A91G, L70Q/A91G/N144D,L70Q/A91G/T120S/T130A, L70Q/A91G/I118V/T120S/T130A/K169E,E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R, 또는 K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R이다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 28, 152, 또는 372에 제시된 서열을 포함하는 것과 같은 야생형 또는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 CD28의 엑토도메인 및 CTLA-4의 엑토도메인에 대해 증가된 친화성을 나타낸다.
[192] 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 28의 29, 31, 36, 40, 41, 67, 70, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 109, 118, 120, 122, 130, 또는 178에 대응하는 위치(들)에서 하나 이상의 아미노산 변형 (예컨대, 치환)을 갖는다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 R29H, Y31H, K36G, L40M, T41G, I67T, L70Q, Y87N, E88D, E88G, K89E, K89R, D90N, D90K, A91G, F92Y, K93R, P109S,I118V, T120S로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 R29H, Y31H, K36G, L40M, T41G, I67T, L70Q, Y87N, E88D, E88G, K89E, K89R, D90N, D90K, A91G, F92Y, K93R, P109S, I118V, T120S로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 R29H/Y31H/T41G/Y87N/E88G/K89E/D90N/A91G/P109S, K36G, K36G/L40M, I67T/L70Q/A91G/T120S, I67T/L70Q/A91G/I118V/T120S, E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R, 또는 K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R이다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 28, 152, 또는 372에 제시된 서열을 포함하는 것과 같은 야생형 또는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 PD-L1의 엑토도메인 및 CTLA-4의 엑토도메인에 대해 증가된 친화성을 나타낸다.
[193] 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:　28의 36, 40, 8889, 90, 91, 92, 또는 93에 대응하는 위치(들)에서 하나 이상의 아미노산 변형 (예컨대, 치환)을 갖는다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 K36G, L40M, E88D, K89R, D90K, A91G, F92Y, 및 K93R로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 K36G, L40M, E88D, K89R, D90K, A91G, F92Y, K93R로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 K36G, K36G/L40M, E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R, 또는 K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R이다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 28, 152, 또는 372에 제시된 서열을 포함하는 것과 같은 야생형 또는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 CD28의 엑토도메인, PD-L1의 엑토도메인 및 CTLA-4의 엑토도메인에 대해 증가된 친화성을 나타낸다..
[194] 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:　28의 12, 18, 29, 31, 33, 36, 38, 40, 41, 42, 43, 47, 48, 63, 59, 64, 67, 68, 70, 81, 85, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 97, 104, 109, 114, 115, 117,118, 120, 122, 126, 127, 130, 133, 140, 144, 148,149, 168, 169,177, 183, 188 또는 193에 대응하는 위치(들)에서 하나 이상의 아미노산 변형 (예컨대, 치환)을 갖는다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 A12G, A12T, H18L, S21P, V22A, T28A, R29D, R29H, Y31H, Y31L, Q33H, K36G, M38I, L0M, T41A, T41G, M42T, M43R, M43V, M47T, N48I, F59L, N63S, N64S, I67T, V68A, V68M, L70Q, E77K, E81A, E81V, L85R, Y87N, E88D, E88G, K89E, K89N, D90K, D90N, A91G, A91T, F92P, F92Y, K93R, K93V, R94F, R94L, L97R, S103L, S103P, V104L, P109H, P109S, D115G, E117V, I118T,S114T, I118V, T120S, N122S, I126L, I127T, T130A, G133D, S140T, N144S, L148S, N149S, S168G, K169I, K169S, N177S, L183H, H188Q, R190S 및 Q193L로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 R29D, R29H, Y31H, Y31L, Q33H, K36G, M38I, T41A, T41G, M42T, M43R, M47T, N63S, I67T, L70Q, E81A, E81V, L85R, Y87N, E88G, K89E, K89N, D90N, A91G, A91T, F92P, K93V, R94L, P109S,S114T,I118V, I118T, T120S, I127T, T130A, N144S, L148S, 및 N149S로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 N63S/L70Q/A91G/T120S/T130A, N63S/L70Q/A91G/S114T/I118V/T120S/T130A, L70Q/Y87N/A91G/T120S/I127T/T130A이다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 A12T/H18L/M43V/F59L/E77K/P109S/I118T, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118T/N149S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/N144S/N149S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M42T/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/L148S/N149S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/N149S, R29H/Y31H/T41G/Y87N/E88G/K89E/D90N/A91G/P109S, K36G, K36G/L40M,I67T/L70Q/A91G/T120S, I67T/L70Q/A91G/I118V/T120S,E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R, K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R, A91G, H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/I127T/T130A/H188D, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/V68M/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T130A/N149S/R190S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94F/E117V/I118T/N149S/S168G/H188Q, V22A/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/V68M/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T130A, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/N64S/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94F/ I118T/T130A/N149S/K169I, V22A/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/V68M/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/D115G/I118T/T130A/G133D/N149S, T28A/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/ V104L/T130A/N149S, H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/L97R/N149S/H188Q, K89E/T130A, K89E/K93E/T130A, S21P/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/N48I/V68A/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/S21P/ N48I/V68A/P109H/I126L/K169I, H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/V68M/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T130A, H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T130A/N149S, A12G/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/V68A/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/ L97R/T130A/L183H, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118T/T130A/S140T/N149S/K169S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118T/T130A/N149S/K169I/Q193L, V22A/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/ I118T/T130A/N149S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118T/T130A/N149S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118T/T130A/N149S/K169I, 또는 R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94F/T130A/N149S/K169I이다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 28, 152, 또는 372에 제시된 서열을 포함하는 것과 같은 야생형 또는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 CD28의 엑토도메인 또는 PD-L1의 엑토도메인에 대해 증가된 친화성, 및 CTLA-4의 엑토도메인에 대해 감소된 친화성을 나타낸다.
[195] 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:　28의 63, 70, 81, 87, 91, 114, 118, 120, 127, 또는 130에 대응하는 위치(들)에서 하나 이상의 아미노산 변형 (예컨대, 치환)을 갖는다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 N63S, L70Q, E81A, Y87N, A91G, S114T, I118V, T120S, I127T, 및 T130A로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 N63S, L70Q, E81A, Y87N, A91G, S114T, I118V, T120S, I127T, 및 T130A로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M42T/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/L148S/N149S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118T/N149S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/N144S/N149S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/N149S, R29H/Y31H/T41G/Y87N/E88G/K89E/D90N/A91G/P109S, N63S/L70Q/A91G/T120S/T130A, N63S/L70Q/A91G/S114T/I118V/T120S/T130A,I67T/L70Q/A91G/T120S,I67T/L70Q/A91G/I118V/T120S, 또는 L70Q/Y87N/A91G/T120S/I127T/T130A이다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 28, 152, 또는 372에 제시된 서열을 포함하는 것과 같은, 야생형 또는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해, CD28의 엑토도메인에 대해 증가된 친화성 및 CTLA-4의 엑토도메인에 대해 감소된 친화성을 나타낸다.
[196] 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:　28의 12, 18, 29, 31, 33, 36, 38, 40, 41, 42, 43, 47,48, 59, 64, 67, 68, 70, 77, 81, 85, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 97, 104, 109, 115, 117, 118, 120, 122, 126, 130, 133, 140,144, 148, 149, 168, 169, 177, 183, 188 또는 193에 대응하는 위치(들)에서 하나 이상의 아미노산 변형 (예컨대, 치환)을 갖는다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 A12G, A12T, H18L, S21P, V22A, T28A, R29D, R29H, Y31H, Y31L, Q33H, K36G, M38I, L40M, T41A, T41G, M42T, M43R, M47T, M43V, N48I, F59L, N64S, I67T, V68A, V68M, L70Q, E77K, E81V, L85R, Y87N, E88D, E88G, K89E, K89N, K89R, D90K, D90N, A91G, A91T, F92P, F92Y, K93V, R94F, R94L, L97R, S103L, S103P, V104L, P109H, P109S, D115G, E117V, I118T,I118V, T120S, N122S, I126L, T130A, G133D, S140T, N144S, L148S, N149S, S168G, K169I, K169S, N177S, L183H, H188Q, R190S 및 Q193L로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 R29D, R29H, Y31H, Y31L, Q33H, K36G, M38I, T41A, T41G, M42T, M43R, M47T, I67T, L70Q, E81V, L85R, Y87N, E88G, K89E, K89N, D90N, A91G, A91T, F92P, K93V, R94L, P109S, I118T,I118V, T120S, N144S, L148S, 및 N149S로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M42T/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/L148S/N149S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118T/N149S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/N144S/N149S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/N149S, R29H/Y31H/T41G/Y87N/E88G/K89E/D90N/A91G/P109S, I67T/L70Q/A91G/I118V/T120S, 또는 I67T/L70Q/A91G/T120S이다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 A12T/H18L/M43V/F59L/E77K/P109S/I118T, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118T/N149S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/N144S/N149S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M42T/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/L148S/N149S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/N149S, R29H/Y31H/T41G/Y87N/E88G/K89E/D90N/A91G/P109S, K36G, K36G/L40M,I67T/L70Q/A91G/T120S, I67T/L70Q/A91G/I118V/T120S,E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R, K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R, A91G, H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/I127T/T130A/H188D, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/V68M/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T130A/N149S/R190S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94F/E117V/I118T/N149S/S168G/H188Q, V22A/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/V68M/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T130A, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/N64S/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94F/ I118T/T130A/N149S/K169I, V22A/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/V68M/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/D115G/I118T/T130A/G133D/N149S, T28A/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/ V104L/T130A/N149S, H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/L97R/N149S/H188Q, K89E/T130A, K89E/K93E/T130A, S21P/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/N48I/V68A/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/S21P/ N48I/V68A/P109H/I126L/K169I, H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/V68M/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T130A, H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T130A/N149S, A12G/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/V68A/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/ L97R/T130A/L183H, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118T/T130A/S140T/N149S/K169S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118T/T130A/N149S/K169I/Q193L, V22A/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/ I118T/T130A/N149S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118T/T130A/N149S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118T/T130A/N149S/K169I, 또는 R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94F/T130A/N149S/K169I이다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 28, 152, 또는 372에 제시된 서열을 포함하는 것과 같은 야생형 또는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해, PD-L1의 엑토도메인에 대해 증가된 친화성, 및 CTLA-4의 엑토도메인에 대해 감소된 친화성을 나타낸다.
[197] 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:　28의 70, 81, 87, 91, 또는 120에 대응하는 위치(들)에서 하나 이상의 아미노산 변형 (예컨대, 치환). 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 L70Q, Y87N, A91G, 및 T120S로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 L70Q, Y87N, A91G, 및 T120S로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 28, 152, 또는 372에 제시된 서열을 포함하는 것과 같은 야생형 또는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해, CD28의 엑토도메인 및 PD-L1의 엑토도메인에 대해 증가된 친화성, 및 CTLA-4의 엑토도메인에 대해 감소된 친화성을 나타낸다.
III. 변이체 폴리펩타이드의 포맷
[198] vIgD가 함유된 본 발명의 변이체 CD80을 포함하는 면역조절 폴리펩타이드는 가용성 단백질, 융합 또는 컨쥬게이트, 막 결합 단백질, 분비된 단백질로서 또는 감염 물질 내에서의 전달을 위해 다양한 방식으로 포맷될 수 있다. 일부 구체예에서, 특정 포맷은 소망되는 치료 용도에 따라 선택될 수 있다. 일부 경우에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드를 포함하는 면역조절 폴리펩타이드는 그의 동족 결합 파트너, 예컨대 CD28, PD-L1 및/또는 CTLA-4의 활성을 길항 또는 차단하기 위한 포맷으로 제공된다. 일부 구체예에서, CTLA-4의 길항은 종양학에서 면역성을 증가시키는데 유용할 수 있다. 일부 구체예에서, CD28의 길항은 염증 또는 자가면역성을 치료하는데 유용할 수 있다. 일부 경우에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드를 포함하는 면역조절 폴리펩타이드는 그의 동족 결합 파트너, 예컨대 CD28, PD-L1 및/또는 CTLA-4의 활성을 작용화(agonize) 또는 자극하는 포맷으로 제공된다. 일부 구체예에서, CTLA-4의 작용화(agonism)는 염증 또는 자가면역성을 치료하는데 유용할 수 있다. 일부 구체예에서, CD28의 작용화는 종양을 치료하는데 효과적일 수 있다. 통상의 기술자는 하나 이상의 특이적 동족 결합 파트너를 길항 또는 작용화하기 위한 것과 같은, 특정 포맷의 활성을 용이하게 구할 수 있다. 이러한 활성들을 평가하기 위한 예시적인 방법은 실시예를 비롯하여 본 명세서에 제공되어 있다.
[199] 일부 측면에서, 예컨대 Fc 사슬에 융합된, 그러한 단백질이 가용성인 CD80의 vIgD를 포함하는 면역조절 단백질이 제공된다. 일부 측면에서, 하나 이상의 부가적인 IgSF 도메인, 예컨대 하나 이상의 부가적인 vIgD가 본 발명에 제공된 CD80의 vIgD에 연결될 수 있다 (이하 "적층" 또는 "적층된" 면역조절 단백질이라 칭함). 일부 구체예에서, 제공된 면역조절 단백질의 모듈형 포맷은 다중 카운터구조물(다중 동족 결합 파트너)의 활성을 조절하기 위해 면역조절 단백질을 조작 또는 생성하기 위한 유연성을 제공한다. 일부 구체예에서, 이러한 "적층" 분자들은 가용성 포맷에서 제공되거나 또는 몇몇 사례에서, 막 결합된 또는 분비된 단백질로서 제공될 수 있다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 면역조절 단백질은 CD80의 vIgD가, 예를 들어 대상자에게 투여되는 경우처럼 vIgD를 특이적인 환경 또는 세포에 표적화 또는 국소화쉬키기 위해 리간드 예컨대 항원에 특이적으로 결합하는 표적화 물질 또는 모이어티 예컨대 항체 또는 기타 결합 분자에 직접 또는 간접적으로 연결되어 있는, 컨쥬게이트로서 제공된다. 일부 구체예에서, 표적화 물질, 예컨대 항체 또는 기타 결합 분자는 종양 항원에 결합함으로써, vIgD를 함유하는 변이체 CD80 을 종양 미세환경에 국소화시켜, 예를 들어, 종양 미세환경에 특이적인 종양 침윤 림프구(TIL) 의 활성을 조절할 수 있다.
[200] 일부 구체예에서, 제공된 면역조절 단백질은 세포에서 발현되어 조작된 세포 치료법(ECT)의 일부로서 제공된다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 면역 세포 (예컨대 T 세포 또는 항원 제시 세포) 등의 세포에서 막-결합 형태로서 발현됨으로써, 막관통 면역조절 단백질 (이하 "TIP"라 칭함)이 제공된다. 일부 구체예에서, TIP에 의해 인식된는 동족 결합 파트너에 따라, TIP 를 발현하는 조작된 세포들은 다른 조작된 세포 및/또는 내인성 T 세포에 양성 또는 음성 공동자극 시그널을 제공함으로써 동족 결합 파트너를 인식할 수 있다. 일부 측면에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 세포, 예를 들어 면역 세포 (예컨대 T 세포 또는 항원 제시 세포)에서 분비가능한 형태로 발현됨으로써 예컨대 세포가 대상자에게 투여될 때, 변이체 CD80 폴리펩타이드의 분비된 또는 가용성 형태(이하, "SIP"라 칭함)를 생성한다. 일부 측면에서, SIP는 그것이 분비되는 환경(예컨대 종양 미세환경)에서 동족 결합 파트너를 길항할 수 있다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는, 세포에서 TIP 또는 SIP로서 변이체 폴리펩타이드의 전달 또는 발현을 위해, 대상자에게 투여시 생체내에서 면역 세포(예컨대 T 세포 또는 항원 제시 세포)와 같은 세포를 감염시킬 수 있는 감염 물질(예컨대 바이러스 또는 세균성 물질)에서 발현된다.
[201] 일부 구체예에서, vIgD를 함유하는 변이체 CD80와 같은 가용성 면역조절 폴리펩타이드는, 리포좀 내에 캡슐화되어 제공된 컨쥬게이트들(예컨대 표적화 모이어티)의 임의의 어느 하나 또는 임의 조합에 리포좀 그 자체가 컨쥬게이트될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 가용성 또는 막 결합 면역조절 폴리펩타이드는 탈글리코실화된다. 보다 특정한 구체예에서, 변이체 CD80 서열은 탈글리코실화된다. 보다 특정한 구체예에서, 변이체 CD80의 IgV 및/또는 IgC (예컨대 IgC2) 도메인 또는 도메인들이 탈글리코실화된다.
[202] 제공된 포맷의 비제한적인 예가 도 1A-1C 및 이하에 더욱 상세히 설명된다.
A. 가용성 단백질
[203] 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드를 함유하는 면역조절 단백질은 가용성 단백질이다. 통상의 기술자는 세포 표면 단백질이 전형적으로 세포내, 막관통, 및 세포외 도메인 (ECD)을 갖는다는 것 그리고 그러한 단백질의 가용성 형태가 세포외 도메인 또는 그의 면역학적 활성 서브서열을 이용하여 만들어질 수 있다는 것을 이해할 것이다. 그러므로, 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드를 함유하는 면역조절 단백질은 막관통 도메인 또는 막관통 도메인의 일부를 결여한다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80을 함유하는 면역조절 단백질은 세포내 (세포질) 도메인 또는 세포내 도메인의 일부를 결여한다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드를 함유하는 면역조절 단백질은 ECD 도메인 또는 IgV 도메인 및/또는 IgC (예컨대 IgC2) 도메인 또는 도메인들 또는 아미노산 변형(들)을 함유하는 그의 특이적 결합 단편을 함유하는 그의 일부를 함유하는 vIgD 부분만을 함유한다.
[204] 일부 구체예에서, 변이체 CD80을 함유하는 면역조절 폴리펩타이드는 본 발명의 하나 이상의 변이체 CD80 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서 본 발명의 폴리펩타이드는 정확히 1, 2, 3, 4, 5개의 변이체 CD80 서열을 포함할 것이다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 서열들 중 적어도 두 개는 동일한 변이체 CD80 서열이다.
[205] 일부 구체예에서, 제공된 면역조절 폴리펩타이드는 CD80의 2 이상의 vIgD 서열을 포함한다. 폴리펩타이드 사슬 내 복수개의 변이체 CD80 폴리펩타이드들은 서로 동일하거나(즉 동일 종) 또는 동일하지 않은(즉, 상이한 종) 변이체 CD80 서열일 수 있다. 단일 폴리펩타이드 사슬 구체예에 더해 일부 구체예에서, 본 발명의 폴리펩타이드 2, 3, 4개 이상이 서로 공유 또는 비공유적으로 부착될 수 있다. 그러므로, 본 발명에 따라 모노머, 다이머 및 더 고차수 (예컨대, 3, 4, 5 이상)의 멀티머 단백질이 제공된다. 예를 들어, 일부 구체예에서 본 발명의 폴리펩타이드 정확히 2개가 서로 공유 또는 비공유적으로 결합되어 다이머를 형성할 수 있다. 일부 구체예에서, 이러한 결합은 사슬간 시스테인 다이설파이드 결합을 통해 형성된다. 본 발명의 2 이상의 폴리펩타이드들을 포함하는 조성물은 동일 종 실질적으로 동일한 종의 폴리펩타이드(예컨대 호모다이머) 또는 상이한 종의 폴리펩타이드(예컨대 헤테로다이머)의 것일 수 있다. 본 발명의 연결된 폴리펩타이드들을 복수개 갖는 조성물은 전술한 바와 같이 각 폴리펩타이드 사슬 내에 본 발명의 동일 또는 상이한 변이체 CD80 폴리펩타이드를 하나 이상 가질 수 있다.
[206] 일부 구체예에서, 면역조절 단백질은 면역글로불린 Fc에 부착된 변이체 CD80 폴리펩타이드 ("CD80 vIgD-Fc 융합체"라고도 불리는 "변이체 CD80-Fc 융합체"와 같은 "면역조절 Fc 융합체"를 생성함)를 포함한다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드의 부착은 Fc의 N-말단에 존재한다. 일부 실시 양태에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드의 부착은 Fc의 C-말단에서 일어난다. 일부 구체예에서, 2개 이상의 CD80 변이체 폴리펩타이드 (동일하거나 상이함)는 N-말단 및 C-말단에 독립적으로 부착된다.
[207] 일부 구체예에서, Fc는 쥐 또는 인간 Fc이다. 일부 구체예에서, Fc는 포유동물 또는 인간 IgGl, lgG2, lgG3, 또는 lgG4 Fc 영역이다. 일부 구체예에서, Fc는 IgG1, 예컨대 인간 IgG1으로부터 유래된다. 일부 구체예에서, Fc는 SEQ ID NO: 226에 제시된 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 226에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다.
[208] 일부 구체예에서, Fc 영역은 그의 정상적인 기능 증 하나 이상을 변경(예컨대 감소)시키기 위해 하나 이상의 변형을 함유한다. 일반적으로, Fc 영역은 면역글로불린의 주요 기능인, 항원-결합능에 더해, 보체-의존성 세포독성 (CDC) 및 항체-의존성 세포 세포독성 (ADCC)과 같은 이펙터 기능에 책임이 있다. 또한, Fc 영역 내에 존재하는 FcRn 서열은 생체내에서 FcRn 수용체에 대한 결합에 의해 생체내 반감기를 증가시킴으로써 혈청 내 IgG 수준을 조절하는 역할을 한다. 일부 구체예에서, 이러한 기능들은 제공된 Fc 융합 단백질들과의 사용을 위해 Fc에서 감소 또는 변경될 수 있다.
[209] 일부 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 변형이 본 발명에서 제공된 CD80-Fc 변이체 융합체의 Fc 영역에 도입되어, Fc 영역 변이체가 생성될 수 있다. 일부 구체예에서, Fc 영역 변이체는 감소된 이펙터 기능을 갖는다. 이펙터 기능을 변경시킬 수 있는 Fc 서열에 대한 변화 또는 돌연변이에는 많은 예가 있다. 예를 들어, WO 00/42072, WO2006019447, WO2012125850, WO2015/107026, US2016/0017041 및 Shields 외 J Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)에는 FcR에 대해 증강 또는 저감된 결합을 나타내는 예시적인 Fc 변이체들이 설명되어 있다. 이들 문헌의 내용은 본 명세서에 상세히 참조 병합된다.
[210] 일부 구체예에서, 제공된 변이체 CD80-Fc 융합체는 감소된 이펙터 기능을 나타내는 Fc 영역을 포함하는데, 이로 인해, 생체내에서의 CD80-Fc 변이체 융합체의 반감기가 중요하면서도 특정 이펙터 기능(예컨대 CDC 및 ADCC)은 불필요하거나 해롭기까지 한 적용예에 있어서 바람직한 후보가 된다. CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인하기 위해 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 분석을 수행할 수 있다. CD80-Fc 변이체 융합체가 FcγR 결합능을 결여하지만(따라서 ADCC 활성을 결여할 가능성이 높음), FcRn 결합능은 보유한다는 것을 확인하기 위해 예컨대, Fc 수용체 (FcR) 결합 분석을 수행할 수 있다. ADCC를 매개하기 위한 일차 세포, NK 세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면, 단구(monocytes)는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현한다. 조혈세포 상에서의 FcR 발현이 문헌[Ravetch 및 Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)의 464 페이지 표 3]에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 분석법의 비제한적인 예가 미국특허 No. 5,500,362 (예컨대 Hellstrom, I. 외 Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986) 참조) 및 Hellstrom, I 외, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 미국특허 No. 5,821,337 (Bruggemann, M. 외, J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)참조)에 설명되어 있다. 별법으로 비방사능 분석법도 사용가능하다 (예를 들어, 유세포 분석을 위한 ACTITM 비방사능 세포독성 분석법 (CellTechnology, Inc. Mountain View, Calif.; 및 CytoTox 96TM 비방사능 세포독성 분석법 (Promega, Madison, Wis.). 이러한 분석을 위한 유용한 이펙터 세포들에는 말초혈액 단핵구 세포(PBMC) 및 내추럴 킬러(NK) 세포가 포함된다. 별법으로 또는 이에 더해, 관심 분자의 ADCC 활성은 예컨대 문헌 [Clynes 외Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)]에 설명된 바와 같은 동물 모델에서 생체내 평가될 수도 있다. CD80-Fc 변이체 융합체가 C1q에 결합하지 못함으로 해서 CDC 활성을 결여한다는 것을 확인하기 위해 C1q 결합 분석법 역시도 수행가능하다. 예컨대, WO 2006/029879 및 WO 2005/100402에서 C1q 및 C3c 결합 ELISA 부분 참조. 보체 활성화를 평가하기 위해, CDC 분석을 수행할 수도 있다 (예를 들어, Gazzano-Santoro 외, J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M. S. 외, Blood 101:1045-1052 (2003); 및 Cragg, M. S. 및 M. J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004) 참조). FcRn 결합 및 생체내 소거/반감기 산정 역시도 기술분야의 공지 방법에 의해 수행가능하다 (예컨대, Petkova, S. B. 외, Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006) 참조).
[211] 이펙터 기능이 감소된 CD80-Fc 변이체 융합체들에는 EU 넘버링에 의한 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329들 중 하나 이상이 치환되어 있는 것들이 포함된다 (미국특허 No. 6,737,056). 이러한 Fc 돌연변이체에는 잔기 265 및 297가 알라닌으로 치환된 소위 "DANA" Fc 돌연변이체를 비롯하여, EU 넘버링에 의한 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2 이상이 치환된 Fc 돌연변이체가 포함된다 (미국특허 No. 7,332,581).
[212] 일부 구체예에서, CD80-Fv 변이체 융합체의 Fc 영역은 위치 234, 235, 236, 237, 238, 239, 270, 297, 298, 325, 및 329 (EU 넘버링에 따름) 중 1 이상의 임의의 아미노산이 천연 Fc 영역에 비해 상이한 아미노산으로 치환되어 있는 Fc 영역을 갖는다. Fc 영역의 이러한 변경은 전술한 변경에 국한되지 않으며, 예를 들어 Current Opinion in Biotechnology (2009) 20 (6), 685-691에 설명된, 탈글리코실화된 사슬 (N297A 및 N297Q), IgG1-N297G, IgG1-L234A/L235A, IgG1-L234A/L235E/G237A, IgG1-A325A/A330S/P331S, IgG1-C226S/C229S, IgG1-C226S/C229S/E233P/L234V/L235A, IgG1-E233P/L234V/L235A/G236del/ S267K, IgG1-L234F/L235E/P331S, IgG1-S267E/L328F, IgG2-V234A/G237A, IgG2-H268Q/V309L/A330S/A331S, IgG4-L235A/G237A/E318A, 및 IgG4-L236E 등의 변경; WO 2008/092117에 설명되어 있는 G236R/L328R, L235G/G236R, N325A/L328R, 및 N325LL328R 등의 변경; 위치 233, 234, 235, 및 237 (EU 넘버링에 의함)에서의 아미노산 삽입; 및 WO 2000/042072에 설명된 위치에서의 변경 등이 포함된다.
[213] FcRs에 대해 증강 또는 저감된 결합능을 갖는 어떤 Fc 변이체들이 설명된다 (예컨대, 미국특허 No. 6,737,056; WO 2004/056312, WO2006019447 및 Shields 외, J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001) 참조.)
[214] 일부 구체예에서, 반감기를 증가시키거나 및/또는 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 결합을 향상시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 변이체 Fc 영역을 포함하는 CD80-Fc 변이체 융합체가 제공된다. 반감기가 증가되고 FcRndp 대해 개선된 결합을 나타내는 항체들이 US2005/0014934A1 (Hinton 외) 또는 WO2015107026에 설명되어 있다. 이 항체들은 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 향상시키는 치환이 Fc 영역에 하나 이상 포함되어 있다. 이러한 Fc 변이체에는 Fc 영역 잔기들: EU 넘버링에 의할 때 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434 중 하나 이상이 치환된, 예컨대 Fc 영역 잔기 434가 치환된 것들이 포함된다 (미국특허 No. 7,371,826).
[215] 일부 구체예에서, CD80-Fc 변이체 융합체의 Fc 영역은 하나 이상의 아미노산 치환 E356D 및 M358L을 포함한다. 일부 구체예에서, CD80-Fc 변이체 융합체의 Fc 영역은 하나 이상의 아미노산 치환 C220S, C226S, C229S을 포함한다. 일부 구체예에서, CD80 변이체 융합체의 Fc 영역은 하나 이상의 아미노산 치환 R292C 및 V302C을 포함한다. 그 밖의 Fc 영역 변이체에 대하여는 Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); 미국특허 No. 5,648,260; 미국특허 No. 5,624,821; 및 WO 94/29351을 참조할 것.
[216] 일부 구체예에서, 예컨대 미국특허 No. 6,194,551, WO 99/51642, 및 Idusogie 외, J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)에 설명된 바와 같이, 감소된 C1q 결합 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC)을 결과시키는 변경이 Fc 영역에서 만들어진다.
[217] 일부 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하되, IgG1, 예컨대 인간 IgG1으로부터 유래된 변이체 Fc 영역을 포함하는, CD80-Fc 변이체 융합체가 제공된다. 일부 구체예에서, 변이체 Fc 영역은 SEQ ID NO: 226에 제시된 아미노산 서열로부터 유래된다. 일부 구체예에서, Fc는 SEQ ID NO: 226의 넘버링에 의할 경우 N82G(EU 넘버링의 N297G에 대응)인 적어도 하나의 아미노산 치환을 함유한다. 일부 구체예에서, Fc는 SEQ ID NO: 226의 넘버링에 의할 경우 R77C 또는 V87C(EU 넘버링의 R292C 또는 V302C에 대응)인 적어도 하나의 아미노산 치환을 함유한다. 일부 구체예에서, 변이체 Fc 영역은 SEQ ID NO: 226의 넘버링에 의할 경우 C5S 아미노산 변형(EU 넘버링의 C220S에 대응)을 함유한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 변이체 Fc 영역은 다음의 아미노산 변형을 포함한다: SEQ ID NO:226를 참조로 N82G 및 다음 아미노산 변형 중 하나 이상 C5S, R77C 또는 V87C.
[218] 일부 구체예에서, SEQ ID NOS:389, 392-394 및 413 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NOS:389, 392-394 및 413 중 어느 하나에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 변이체 Fc를 포함하는 CD80-Fc 변이체 융합체가 제공된다.
[219] 일부 구체예에서, Fc는 IgG2, 예컨대 인간 IgG2로부터 유래한다. 일부 구체예에서, Fc는 SEQ ID NO: 227에 제시된 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 227에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다.
[220] 일부 구체예에서, Fc는 SEQ ID NO: 411에 제시된 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 411에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, IgG4 Fc는 인간 IgG4의 CH3 도메인이 인간 IgG1의 CH3 도메인으로 치환되고 억제된 응집체 형성을 나타내는 안정화된 Fc, 인간 IgG4의 CH3 및 CH2 도메인이 인간 IgG1의 CH3 및 CH2 도메인으로 각각 치환되어 있는 항체, 또는 Kabat 등에 의해 제안된 EU 인덱스로 표시할 경우 위치 409의 아르기닌이 리신으로 치환되고 억제된 응집체 형성을 나타내는 항체이다 (예컨대 미국특허 No. 8,911,726 참조). 일부 구체예에서, Fc는 Fab-아암(Fab-arm) 교환에 의해 내인성 IgG4와 치료용 항체 간의 재조합을 방지하는 것으로 나타난, S228P 돌연변이를 함유하는 IgG4이다(예컨대 Labrijin 외 (2009) Nat. Biotechnol., 27(8)767-71 참조). 일부 구체예에서, Fc는 SEQ ID NO: 412에 제시된 서열 또는 SEQ ID NO: 412에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다.
[221] 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 Fc 서열에 직접 연결된다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 링커를 경유하는 등에 의해 Fc 서열에 간접적으로 연결된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 "펩타이드 링커들"이 변이체 CD80 폴리펩타이드와 Fc 도메인을 연결한다. 일부 구체예에서, 펩타이드 링커는 단일 아미노산 잔기이거나 또는 더 긴 길이일 수 있다. 일부 구체예에서, 펩타이드 링커는 적어도 하나의 아미노산 잔기를 갖지만 그 길이는 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 아미노산 잔기 이하이다. 일부 구체예에서, 링커는 (1-문자 아미노산 코드로 표시할 경우): GGGGS ("4GS") 또는 4GS 링커의 멀티머, 예컨대 2, 3, 4, 또는 5 4GS 링커들이다.
[222] 일부 구체예에서, 변이체 CD80-Fc 융합 단백질은 Fc 도메인에 연결된 2개의 변이체 CD80 Fc 폴리펩타이드에 의해 형성된 다이머이다. 일부 특정 구체예에서, CD80-Fc 변이체 융합 폴리펩타이드의 동일하거나 실질적으로 동일한 종들(3개 미만의 N-말단 또는 C-말단 아미노산 서열 차이가 허용됨)이 다이머화되어 호모다이머를 형성한다. 일부 구체예에서, 다이머는 그의 2 변이체 CD80 Fc 폴리펩타이드가 동일한 호모다이머이다. 별법으로, 상이한 종들의 CD80-Fc 변이체 융합 폴리펩타이드가 다이머화되어 헤테로다이머를 형성할 수 있다. 따라서, 일부 구체예에서, 다이머는 그의 2 변이체 CD80 Fc 폴리펩타이드가 상이한 헤테로다이머이다.
[223] 변이체 CD80-Fc 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자도 제공된다. 일부 구체예에서, Fc 융합 단백질의 생산을 위해, 변이체 CD80-Fc 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자가 적절한 발현 벡터에 삽입된다. 결과적인 변이체 CD80-Fc 융합 단백질은, Fc 도메인들 간의 어셈블리가 Fc 모이어티들 간에 형성된 사슬간 다이설파이드 결합에 의해 일어나, 다이머, 예컨대 2가의 변이체 CD80-Fc 융합 단백질가 형성되는 발현에 의해 형질전환된 숙주 세포에서 발현될 수 있다.
[224] 결과적인 Fc 융합 단백질은 단백질 A 또는 단백질 G 컬럼에 대해 친화성 크로마토그래피에 의해 쉽게 정제가능하다. 헤테로다이머 생성을 위해서는 부가적인 정제 단계가 필요할 수 있다. 예를 들어, 상이한 변이체 CD80 폴리펩타이드들을 인코딩하는 2개의 핵산을 세포에 형질전환되는 경우, 헤테로다이머의 형성은 생화학적으로 달성되어야 하는데 이는 Fc-도메인을 갖는 변이체 CD80 분자가 다이설파이드-연결된 호모다이머로서도 발현될 것이기 때문이다. 그러므로, 호모다이머는 사슬간 다이설파이드의 파괴를 선호하지만 사슬내 다이설파이드에는 아무런 영향을 미치지 않는 조건 하에서 감소될 수 있다. 일부 경우에서, 상이한 변이체-CD80 Fc 모노머들을 동 몰량으로 혼합 및 산화시켜 호모다이머와 헤테로다이머의 혼합물을 형성한다. 이 혼합물의 성분들을 크로마토그래피 기술에 의해 분리한다. 별법으로, 이러한 유형의 헤테로다이머 형성은 유전자 조작 및 후술되는 놉-인투-홀(knob-into-hole) 방법을 이용하여, 변이체 CD80 폴리펩타이드를 함유하는 Fc 융합 분자를 유전자 조작 및 발현함으로써 우회될 수 있다.
B. 부가적인 IgSF 도메인을 갖는 적층 분자들
[225] 일부 구체예에서, 면역조절 단백질들은 하나 이상의 다른 면역글로불린 수퍼패밀리 (IgSF) 도메인에 직접 또는 간접적으로 연결된, 본 발명에서 제공된 임의의 변이체 CD80 폴리펩타이드를 함유할 수 있다 ("적층된(stacked)" 면역조절 단백질 구조물 및 "II형" 면역조절 단백질이라고도 칭함). 일부 측면에서, 이것은 2 이상, 예컨대 3 이상의 동족 결합 파트너와 결합함으로써 면역 시냅스의 멀티-표적화 조절을 제공하는 독특한 멀티-도메인 면역조절 단백질을 만들 수 있다.
[226] 일부 구체예에서, 면역조절 단백질은 야생형 IgSF 패밀리 멤버에서는 발견되지 않는 또 다른 IgSF 패밀리 멤버(예컨대 포유동물 IgSF 패밀리 멤버)의 하나 이상의 다른 친화성 변형된 및/또는 비-친화성 변형된 IgSF 도메인 서열의 조합("비-야생형 조합") 및/또는 배열 ("비-야생형 배열" 또는 "비-야생형 순열")을 포함한다. 일부 구체예에서, 면역조절 단백질은 2, 3, 4, 5 또는 6개의 면역글로불린 수퍼패밀리 (IgSF) 도메인을 포함하며, 여기서 IgSF 도메인 중 적어도 하나는 본 발명에 따른 변이체 CD80 IgSF 도메인 (CD80의 vIgD)이다.
[227] 일부 구체예에서, 부가적인 IgSF 도메인의 서열은 야생형 또는 비변형 IgSF 도메인에 비해, 하나 이상의 아미노산 변형, 예컨대 치환을 함유하는 변형된 IgSF 도메인일 수 있다. 일부 구체예에서, IgSF 도메인은 비-친화성 변형된 (예컨대, 야생형) 것이거나 또는 친화성 변형된 것일 수 있다. 일부 구체예에서, 비변형 또는 야생형 IgSF 도메인은 마우스, 래트, 시노몰구스 원숭이, 또는 인간 유래, 또는 이의 조합으로부터 유래할 수 있다. 일부 구체예에서, 부가적인 IgSF 도메인은 표 2에 제시된 IgSF 패밀리 멤버의 IgSF 도메인일 수 있다. 일부 구체예에서, 부가적인 IgSF 도메인은 표 2에 제시된 IgSF 패밀리 멤버에 함유된 IgSF 도메인에 비해, 하나 이상의 아미노산 변형, 예컨대 치환을 함유하는 친화성-변형된 IgSF 도메인일 수 있다.
[228] 일부 구체예에서, 부가적인 IgSF 도메인은 시그널-조절 단백질(SIRP) 패밀리, 골수세포 상에 발현된 촉발 수용체 유사(TREML) 패밀리, 암배아 항원-관련 세포 부착 분자(CEACAM) 패밀리, 시알산 결합 Ig-유사 렉틴(SIGLEC) 패밀리, 부티로필린 패밀리, B7 패밀리, CD28 패밀리, V-set 및 면역글로불린 도메인 함유(VSIG) 패밀리, V-set 막관통 도메인(VSTM) 패밀리, 주요조직적합 복합체 (MHC) 패밀리, 시그널링 림프구 활성화 분자 (SLAM) 패밀리, 백혈구 면역글로불린-유사 수용체 (LIR), 넥틴 (Nec) 패밀리, 넥틴-유사 (NECL) 패밀리, 폴리오바이러스 수용체 관련 (PVR) 패밀리, 내추럴 세포독성 촉발 수용체 (NCR) 패밀리, T 세포 면역글로불린 및 뮤신 (TIM) 패밀리 또는 킬러-세포 면역글로불린-유사 수용체 (KIR) 패밀리로부터 선택된 패밀리의 IgSF 패밀리 멤버에 함유된 친화성 또는 비-친화성 변형된 IgSF 도메인이다. 일부 구체예에서, 부가적인 IgSF 도메인은 CD80(B7-1), CD86(B7-2), CD274 (PD-L1, B7-H1), PDCD1LG2(PD-L2, CD273), ICOSLG(B7RP1, CD275, ICOSL, B7-H2), CD276(B7-H3), VTCN1(B7-H4), CD28, CTLA-4, PDCD1(PD-1), ICOS, BTLA(CD272), CD4, CD8A(CD8-알파), CD8B(CD8-베타), LAG3, HAVCR2(TIM-3), CEACAM1, TIGIT, PVR(CD155), PVRL2(CD112), CD226, CD2, CD160, CD200, CD200R1(CD200R), 및 NC R3 (NKp30)로 이루어진 군으로부터 선택된 IgSF 단백질로부터 독립적으로 유래한다.
[229] 표 2의 첫 번째 열은 명칭 및 선택적으로 그 특정 IgSF 멤버에 대한 가능한 어떤 동의어의 명칭을 나타낸다. 두 번째 열은 uniprot.org에서 인터넷을 통해 접근가능한 공개적으로 이용가능한 데이터베이스인 UniProtKB 데이터베이스의 단백질 동정자, 또는, 일부 경우 GenBank Number를 나타낸다. Universal Protein Resource (UniProt)는 단백질 서열 및 주석이 달린 데이터의 포괄적인 리소스이다. UniProt 데이터베이스는 UniProt Knowledgebase (UniProtKB)를 포함한다. UniProt은 UniProt은 유럽 생물 정보학 연구소 (EMBL-EBI), SIB 스위스 생물 정보학 연구소 및 PIR (Protein Information Resource) 간의 공동 작업으로 미국 국립 보건원 (NIH)의 보조금으로 주로 지원되고 있다. GenBank는 공개적으로 이용 가능한 모든 DNA 서열의 주석이 달린 컬렉션 인 NIH 유전자 서열 데이터베이스이다 (Nucleic Acids Research, 2013 Jan; 41 (D1):D36-42). 세 번째 열은 표시된 IgSF 도메인이있는 영역을 나타낸다. 이 영역은 도메인이 범위를 정의하는 잔기를 포함하는 범위로 지정된다. 3열은 지정된 IgSF 영역에 대한 IgSF 도메인 클래스를 나타내기도 한다. 4열은 표시된 추가 도메인이 있는 영역을 나타낸다. (신호 펩타이드, S; 세포외 도메인, E; 막관통 도메인, T; 세포질 도메인, C). 도메인의 설명은 도메인을 식별하거나 분류하는데 사용되는 방법에 따라 달라질 수 있으며, 서로 다른 출처와 다르게 식별될 수 있다. 표 2의 도메인에 상응하는 잔기에 대한 설명은 단지 예시를 위한 것이며 수 개의 아미노산 (예컨대, 1, 2, 3 또는 4개)만큼 길거나 짧을 수 있다. 5열은 나열된 IgSF 멤버 중 일부에 대해 그의 동종 세포 표면 결합 파트너 중 일부를 나타낸다.
Figure pat00007
Figure pat00008
Figure pat00009
[230] "적층된(stacked)" 면역조절 단백질 구조물 (비-야생형 조합이건 또는 비-야생형 배열이건)에 존재하는 이러한 비-친화성 변형된 또는 친화성 변형된 IgSF 도메인의 수는 적어도 2, 3, 4, 또는 5개이고 일부 구체예에서는 정확히 2, 3, 4, 또는 5개의 IgSF 도메인이다 (이로써 친화성 변형된 IgSF 도메인의 수의 측정은 그의 비특이적 결합 분획 서열 및/또는 그의 실질적으로 면역학적으로 불활성인 분획 서열을 무시한다).
[231] 본원에서 제공된 적층형 면역조절 단백질의 일부 구체예에서, 변형된 친화성의 수 및 비-친화성 변형된 IgSF 도메인의 수는 각각 독립적으로 적어도: 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이다. 따라서, 친화성 변형된 IgSF 도메인의 수 및 비-친화성 변형된 IgSF 도메인의 수 (친화성 변형된 IgSF 도메인: 비-친화성 변형된 IgSF 도메인)는 정확하게 또는 적어도 2 : 0 (친화성 변형된 것: 야생형), 0:2, 2:1, 1:2, 2:2, 2:3, 3:2, 2:4, 4:2, 1:1, 1:3, 3:1, 1:4, 4:1, 1:5, 또는 5:1이다.
[232] 적층된 면역조절 단백질의 일부 구체예에서, 비-친화성 변형된 및/또는 친화성 변형된 IgSF 도메인들 중 적어도 2개는 동일한 IgSF 도메인이다.
[233] 일부 구체예에서, 본원에서 제공되는 적층된 면역 조절 단백질은 단일 IgSF 멤버로부터 유래하지만 비-야생형 배열 (대안적으로, "순열")인 적어도 2개의 친화성 변형된 및/또는 비-친화성 변형된 IgSF 도메인을 포함한다. 비 야생형 배열 또는 순열의 하나의 예시는 그 IgSF 도메인 서열이 본원에서 제공된 바와 같은 변이체 IgSF 도메인의 공급원으로 사용된 것인 야생형 CD80에서 발견되는 것들에 상대적으로 친화성 변형된 및/또는 비-친화성 변형된 IgSF 도메인 서열의 비-야생형 차수를 포함하는 면역조절 단백질이다. 따라서, 일례에서, 면역조절 단백질은 비-친화성 변형된 및/또는 친화성 변형된 형태임에도 불구하고 막관통 도메인에 대해 근위(proximal)인 IgV 및 원위(distal)인 IgC를 포함할 수 있다. 본원에서 제공된 면역조절 단백질에서, 비친 화성 변형된 및/또는 친화성 변형된 IgSF 도메인의 비-야생형 조합 및 비-야생형 배열 두 가지 모두의 존재 역시도 본 발명의 보호범위 내이다.
[234] 적층된 면역조절 단백질의 일부 구체예에서, 비-친화성 변형된 및/또는 친화성 변형된 IgSF 도메인은 비-동일 (즉, 상이한) IgSF 도메인이다. 비-동일한 친화성 변형된 IgSF 도메인들은 특이적 결합 조건 하에서 상이한 동족 결합 파트너들과 결합하며 이들이 조작된 야생형 또는 비변형 IgSF 도메인이 동일하였던 것인지와 무관하게 "비-동일"하다. 그러므로, 예를 들어, 면역조절 단백질 내 적어도 두 개의 비-동일 IgSF 도메인의 비-야생형 조합은 그의 기원이 하나 이상의 CD80으로부터 유래하고 유일한 적어도 하나의 IgSF 도메인 서열 및 그 기원이 CD80이 아닌 다른 IgSF 패밀리 멤버로부터 유래하고 유일한 것인 적어도 하나의 제2 IgSF 도메인 서열을 포함하며, 여기서 면역조절 단백질의 IgSF 도메인은 비-친화성 변형된 및/또는 친화성 변형된 형태이다. 그러나, 대안적인 구체예에서, 2개의 비-동일 IgSF 도메인은 동일한 IgSF 도메인 서열로부터 유래하지만, 적어도 하나는 상이한 동족 결합 파트너에 특이적으로 결합하도록 친화성 변형된 것이다.
[235] 일부 구체예에서, 제공된 면역조절 단백질은, 변이체 CD80 폴리펩타이드를 함유하는 것에 더해, 적어도 2, 3, 4, 5 또는 6개의 부가적인 면역글로불린 수퍼패밀리 (IgSF) 도메인s, 예컨대 표 2에 제시된 IgSF 패밀리 멤버의 IgD 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 제공된 면역조절 단백질은 적어도 하나의 부가적인 IgSF 도메인 (예컨대 제2 IgSF 도메인)을 함유하되 여기서 적어도 하나의 부가적인 또는 제2 IgSF 도메인은 SEQ ID NOS: 1-27 및 348 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열에 함유된 야생형 또는 비변형 IgSF 도메인 또는 그의 특이적 결합 단편에 제시된 IgSF 도메인이다. 일부 구체예에서, 야생형 또는 비변형 IgSF 도메인은 IgV 도메인 또는 IgC 도메인, 예컨대 IgC1 또는 IgC2 도메인이다.
[236] 일부 구체예에서, 제공된 면역조절 단백질은, 변이체 CD80 폴리펩타이드에 더해, 표 2에 제시된 IgSF 패밀리 멤버의 IgSF 도메인과 같은, 야생형 또는 비변형 IgSF 도메인 내 IgSF에 비해, 하나 이상의 아미노산 변형 (예컨대 치환, 결실 또는 돌연변이)를 함유하는 vIgD인 부가적인 IgSF 도메인 (예컨대 제2 IgSF 도메인) 역시도 적어도 한 개 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 부가적인 또는 제2 친화성-변형된 IgSF 도메인은 SEQ ID NOS: 1-27 및 348 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열에 함유된 야생형 또는 비변형 IgSF 도메인 또는 그의 특이적 결합 단편에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 야생형 또는 비변형 IgSF 도메인은 IgV 도메인 또는 IgC 도메인, 예컨대 IgC1 또는 IgC2 도메인이다. 일부 구체예에서, 부가적인 또는 제2 IgSF 도메인은 친화성-변형된 IgV 도메인 또는 IgC 도메인이다.
[237] 일부 구체예에서, 하나 이상의 부가적인 IgSF 도메인 (예컨대 제2 IgSF) 도메인은 종양 항원에 결합 또는 이를 인식하는 또 다른 IgSF 패밀리 멤버의IgSF 도메인 (예컨대 IgV)이다. 이러한 구체예에서, IgSF 패밀리 멤버는 종양-위치화 모이어티로서 작용함으로써, CD80의 vIgD를 종양 미세환경 내 면역 세포에 근접하게 한다. 일부 구체예에서, 부가적인 IgSF 도메인 (예컨대 제2 IgSF) 도메인은 종양 세포에서 발현된 B7-H6와 결합하거나 이를 인식하는 NkP30의 IgSF 도메인이다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 부가적인 (예컨대 제2) IgSF 도메인, 예컨대 NkP30은, 하나 이상의 아미노산 변형 (예컨대 치환, 결실 또는 부가)를 함유하는 vIgD이다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 변형은 비변형 IgSF 도메인, 예컨대 NkP30에 비해 B7-H6에 대한 결합 친화성 및/또는 민감성을 예컨대 적어도 또는 적어도 약 1.2배, 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 20배, 30배 40배 또는 50배 증가시킨다. 예시적인 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:54에 제시된 위치에 대응하는 NKp30 세포외 도메인의 위치를 참조로 돌연변이 L30V/A60V/S64P/S86G를 함유하는 NKp30 변이체이다.
[238] 표 3-5는 본원에 제공된 적층 구조물에서 사용될 수 있는 친화성-변형된 IgSF 도메인을 하나 이상 함유하는 예시적인 폴리펩타이드들을 나타낸다.
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Figure pat00012
[239] 일부 구체예에서, 다른 IgSF 패밀리 멤버로부터의 하나 이상의 부가적인 IgSF 도메인 (예컨대 제2 변이체 IgSF 도메인) 및 CD80의 vIgD를 포함하는 2 이상의 IgSF 도메인은 공유적으로 또는 비공유적으로 연결된다. 적층된 면역조절 단백질 폴리펩타이드 내 복수의 비-친화성 변형된 및/또는 친화성 변형된 IgSF 도메인들은 서로 공유적으로 직접 연결될 필요는 없다. 일부 구체예에서, 2 이상의 IgSF 도메인들은 직접 또는 링커를 통한 것과 같이 간접적으로 연결된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 잔기의 개재 스팬(intervening span)은 IgSF 도메인들을 서로 간접적으로 공유결합시킨다. 이러한 연결은 N-말단 내지 C-말단 잔기들을 통해 이루어질 수 있다. 일부 구체예에서, 이러한 연결은 IgSF 도메인(들)의 N-말단 또는 C-말단에 위치하지 않는 아미노산 잔기의 측쇄를 통해 이루어질 수있다. 따라서, 결합은 말단 또는 내부 아미노산 잔기 또는 이들의 조합을 통해 이루어질 수 있다.
[240] 일부 구체예에서, 하나 이상의 "펩타이드 링커들"은 CD80의 vIgD 및 부가적인 IgSF 도메인 (예컨대 제2 변이체 IgSF 도메인)을 연결한다. 일부 구체예에서, 펩타이드 링커는 단일 아미노산 잔기이거나 또는 더 긴 길이일 수 있다. 일부 구체예에서, 펩타이드 링커는 아미노산 잔기를 적어도 한 개 그러나 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 아미노산 잔기 길이로 갖는다. 일부 구체예에서, 링커는 (1-문자 아미노산 코드로서): GGGGS ("4GS") 또는 4GS 링커의 멀티머, 예컨대 2, 3, 4, 또는 5 4GS 링커들의 반복체이다. 일부 구체예에서, 펩타이드 링커는 (GGGGS)2 또는 (GGGGS)3이다. 일부 구체예에서, 링커는 알라닌 잔기 단독 시리즈 또는 다른 펩타이드 링커를 더 포함할 수 있다 (예컨대 4GS 링커 또는 그의 멀티머). 일부 구체예에서, 각 시리즈 내의 알라닌 잔기의 수는 2, 3, 4, 5, 또는 6 알라닌이다.
[241] 일부 구체예에서, 비-친화성 변형된 및/또는 친화성 변형된 IgSF 도메인들은 제1 및/또는 제2 비-친화성 변형된 및/또는 친화성 변형된 IgSF 도메인들의 N-말단 및/또는 C-말단에 삽입된 "야생형 펩타이드 링커들"에 의해 연결된다. 이들 링커들은 또한 선행 서열(leading sequences) (비-친화성 변형된 또는 친화성 변형된 IgSF 도메인에 대해 N-말단) 또는 후행 서열(trailing sequences) (비-친화성 변형된 또는 친화성 변형된 IgSF 도메인에 대해 C-말단), 및 IgSF의 Ig 폴드의 구조적 예측 바로 바깥에 분포하는 야생형 단백질 내에 존재하는 서열이라 칭해진다. 일부 구체예에서, "야생형 링커"는 야생형 단백질의 아미노산 서열 내 규정된 IgV 도메인과 같이, 시그널 서열 후, 그러나 IgSF 도메인 앞에 존재하는 아미노산 서열이다. 일부 구체예에서, "야생형" 링커는 야생형 단백질의 아미노산 서열 내에서 IgSF 도메인 다음 예컨대 규정된 IgV 도메인 바로 다음 그러나 IgC 도메인 앞에 존재하는 아미노산 서열이다. 이들 링커 서열은 이웃하는 IgSF 도메인(들)의 적절한 폴딩 및 기능에 기여할 수 있다. 일부 구체예에서, 제1 IgSF 도메인의 N-말단에 삽입된 선행 펩타이드 링커 및/또는 제1 비-친화성 변형된 및/또는 친화성 변형된 IgSF 도메인의 C-말단에 삽입된 후행 서열이 존재한다. 일부 구체예에서, 제2 IgSF 도메인의 N-말단에 삽입된 제2 선행 펩타이드 링커 및/또는 제2 비-친화성 변형된 및/또는 친화성 변형된 IgSF 도메인의 C-말단에 삽입된 제2 후행 서열이 존재한다. 제1 및 제2 비-친화성 변형된 및/또는 친화성 변형된 IgSF 도메인들이 동일한 부모 단백질로부터 유래하고 동일한 방향으로 연결된 경우, 제1 및 제2 비-친화성 변형된 및/또는 친화성 변형된 IgSF 도메인 사이의 야생형 펩타이드 링커들은 중복되지 않는다. 예를 들어, 제1 선행 야생형 펩타이드 링커 및 제2 선행 야생형 펩타이드 링커가 동일한 경우, II형 면역조절 단백질은 제1 후행 야생형 펩타이드 링커 또는 제2 선행 야생형 펩타이드 링커를 포함하지 않는다.
[242] 일부 구체예에서, II형 면역조절 단백질은 제1 비-친화성 변형된 및/또는 친화성 변형된 IgSF 도메인의 N-말단에 삽입된 제1 선행 야생형 펩타이드 링커를 더 포함하는데, 여기서 제1 선행 야생형 펩타이드 링커는 제1 비-친화성 변형된 및/또는 친화성 변형된 IgSF 도메인이 유래된 야생형 단백질 내 개재 서열로부터 적어도 5개 (예컨대 적어도 약 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개 이상)의 연속 아미노산을 부모 IgSF 도메인과 바로 직전의 도메인 (예컨대 시그널 펩타이드 또는 IgSF 도메인) 사이에 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 선행 야생형 펩타이드 링커는 제1 비-친화성 변형된 및/또는 친화성 변형된 IgSF 도메인이 유래된 야생형 단백질 내 전체 개재 서열을 부모 IgSF 도메인과 바로 직전의 도메인 (예컨대 시그널 펩타이드 또는 IgSF 도메인) 사이에 포함한다.
[243] 일부 구체예에서, II형 면역조절 단백질은 제1 비-친화성 변형된 및/또는 친화성 변형된 IgSF 도메인의 C-말단에 삽입된 제1 후행 야생형 펩타이드 링커를 더 포함하며, 여기서 상기 제1 후행 야생형 펩타이드 링커는 제1 비-친화성 변형된 및/또는 친화성 변형된 IgSF 도메인이 유래된 야생형 단백질 내 개재 서열로부터 적어도 5개 (예컨대 적어도 약 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개 이상)의 연속 아미노산을 부모 IgSF 도메인과 바로 직후의 도메인 (예컨대 IgSF 도메인 또는 막관통 도메인) 사이에 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 후행 야생형 펩타이드 링커는 제1 비-친화성 변형된 및/또는 친화성 변형된 IgSF 도메인이 유래된 야생형 단백질 내 전체 개재 서열을 부모 IgSF 도메인과 바로 직후의 도메인 (예컨대 IgSF 도메인 또는 막관통 도메인) 사이에 포함한다.
[244] 일부 구체예에서, II형 면역조절 단백질은 제2 비-친화성 변형된 및/또는 친화성 변형된 IgSF 도메인의 N-말단에 삽입된 제2 선행 야생형 펩타이드 링커를 더 포함하며, 여기서 제2 선행 야생형 펩타이드 링커는 제2 비-친화성 변형된 및/또는 친화성 변형된 IgSF 도메인이 유래된 야생형 단백질 내 개재 서열로부터 적어도 5개 (예컨대 적어도 약 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개 이상)의 연속 아미노산을 부모 IgSF 도메인과 바로 직전의 도메인 (예컨대 시그널 펩타이드 또는 IgSF 도메인) 사이에 포함한다. 일부 구체예에서, 제2 선행 야생형 펩타이드 링커는 제2 비-친화성 변형된 및/또는 친화성 변형된 IgSF 도메인이 유래된 야생형 단백질 내 전체 개재 서열을 부모 IgSF 도메인과 바로 직전의 도메인 (예컨대 시그널 펩타이드 또는 IgSF 도메인) 사이에 포함한다.
[245] 일부 구체예에서, II형 면역조절 단백질은 제2 비-친화성 변형된 및/또는 친화성 변형된 IgSF 도메인의 C-말단에 삽입된 제2 후행 야생형 펩타이드 링커를 더 포함하며, 여기서 상기 제2 후행 야생형 펩타이드 링커는 제2 비-친화성 변형된 및/또는 친화성 변형된 IgSF 도메인이 유래된 야생형 단백질 내 개재 서열로부터 적어도 5개 (예컨대 적어도 약 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개 이상)의 연속 아미노산을 부모 IgSF 도메인과 바로 직후의 도메인 (예컨대 IgSF 도메인 또는 막관통 도메인) 사이에 포함한다. 일부 구체예에서, 제2 후행 야생형 펩타이드 링커는 제2 비-친화성 변형된 및/또는 친화성 변형된 IgSF 도메인이 유래된 야생형 단백질 내 전체 개재 서열을 부모 IgSF 도메인과 바로 직후의 도메인 (예컨대 IgSF 도메인 또는 막관통 도메인) 사이에 포함한다.
[246] CD80 IgSF 도메인을 함유하는 II 형 단백질에 대한 예시적인 후행 서열들은, SEQ ID NO: 232에 제시된 아미노산 서열을 함유할 수 있다. CD80 IgSF 도메인을 함유하는 II 형 단백질에 대한 예시적인 후행 서열들이 SEQ ID NOS:　231, 232 및 371에 제시된다. ICOSL IgSF 도메인을 함유하는 II 형 단백질에 대한 예시적인 후행 서열들은 SEQ ID NOS: 233 및 234에 제시되어 있다. CD80 IgSF 도메인을 함유하는 II 형 단백질에 대한 예시적인 선행 및 후행 서열들은 SEQ ID NOS: 236-238에 제시되어 있다. NKp30 IgSF 도메인을 함유하는 II형 단백질에 대한 예시적인 후행 서열은 SEQ ID NO:235에 제시되어 있다.
[247] 일부 구체예에서, CD80의 vIgD를 비롯한 2 이상의 IgSF 도메인 및 또 다른 IgSF 패밀리 멤버로부터의 1 이상의 부가적인 IgSF 도메인 (예컨대 제2 변이체 IgSF 도메인)은 Fc에 연결 또는 부착되어 다이머형 멀티-도메인 적층 면역조절 단백질을 형성한다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드 및 제2 IgSF 도메인은 Fc 서브유닛의 N-또는 C-말단에 직접 또는 간접적으로 독립적으로 연결된다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드 및 제2 IgSF 도메인은 직접 또는 간접적으로 연결되고, 변이체 CD80 또는 제2 IgSF 도메인 중 하나 역시도 Fc 서브유닛의 N-또는 C-말단에 직접 또는 간접적으로 연결된다. 일부 구체예에서, Fc에 대한 연결은 펩타이드 링커, 예컨대 전술한 바 있는 펩타이드 링커를 통해 이루어진다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80과 제2 IgSF 도메인 간의 연결은 펩타이드 링커, 예컨대 전술한 바 있는 펩타이드 링커를 통해 이루어진다. 일부 구체예에서, CD80의 vIgD, 1 이상의 부가적인 IgSF 도메인, 및 Fc 도메인은 도 4에 도시된 바와 같이 수많은 임의의 배열들 중 어느 하나의 배열로 한데 연결될 수 있다. 예시적인 배열들이 실시예를 통해 설명된다.
[248] 일부 구체예에서, 적층된 면역조절 단백질은 2개의 적층된 면역조절 Fc 융합 폴리펩타이드에 의해 형성된 다이머이다. 임의의 적층된 면역조절 단백질을 인코딩하는 핵산 분자도 제공된다. 일부 구체예에서, 다이머형 멀티-도메인 적층 면역조절 단백질은 세포에서 발현에 의해, 또는 일부 경우 다이머형 Fc 융합 단백질 생성과 관련하여 전술한 바와 같이, 적층 면역조절 Fc 융합 폴리펩타이드의 공동-발현에 의해 생성될 수 있다.
[249] 일부 구체예에서, 다이머형 멀티-도메인 적층 면역조절 단백질은 각 Fc 서브유닛에 대해 2가, 각 서브유닛에 대해 1가, 또는 하나의 서브유닛에 대해 2가 및 또 다른 하나에 대해 4가이다.
[250] 일부 구체예에서, 다이머형 멀티-도메인 적층 면역조절 단백질은 호모다이머형 멀티-도메인 적층 Fc 단백질이다. 일부 구체예에서, 다이머형 멀티-도메인 적층 면역조절 단백질은 제1 적층 면역조절 Fc 융합 폴리펩타이드 및 제2 적층 면역조절 Fc 융합 폴리펩타이드을 포함하되 여기서 제1 및 제2 폴리펩타이드는 동일한 것이다. 일부 구체예에서, 폴리펩타이드의 Fc 부분은 전술한 바와 같은 임의의 Fc일 수 있다.
[251] 일부 구체예에서, 멀티-도메인 적층 분자는 2개의 상이한 Fc 폴리펩타이드들을 포함하는 헤테로다이머로서 여기서 이들 폴리펩타이드들 중 적어도 하나는 적어도 하나의 변이체 CD80 폴리펩타이드 및/또는 적어도 하나의 제2 IgSF 도메인 (예컨대 제2 변이체 IgSF 도메인)을 함유하는 Fc 폴리펩타이드이다. 일부 구체예에서, 멀티-도메인 적층 분자는 변이체 CD80 및 제2 IgSF 도메인을 함유하는 제1 Fc 폴리펩타이드 및 변이체 CD80 및 제2 IgSF 도메인을 함유하는 제2 Fc 폴리펩타이드를 함유한다. 일부 구체예에서, 멀티-도메인 적층 분자는 변이체 CD80 폴리펩타이드 및 제2 IgSF 도메인을 함유하는 제1 Fc 폴리펩타이드 변이체 CD80 폴리펩타이드 또는 제2 IgSF 도메인에 연결되지 않은 제2 Fc 폴리펩타이드를 함유한다.
[252] 일부 구체예에서, 멀티-도메인 적층 분자는 1, 2, 3, 4개 또는 그 이상의 변이체 CD80 폴리펩타이드 및 1, 2, 3, 4개 또는 그 이상의 제2 IgSF 도메인을 함유하는 제1 Fc 폴리펩타이드을 함유하되, 여기서 제1 적층 Fc 폴리펩타이드 내 IgSF 도메인의 총 개수는 2, 3, 4, 5, 6개 이상 보다 많다. 이러한 구체예의 일례에서, 제2 적층 Fc 폴리펩타이드는 1, 2, 3, 4개 또는 그 이상의 변이체 CD80 폴리펩타이드 및 1, 2, 3, 4개 또는 그 이상의 제2 IgSF 도메인을 함유하되, 여기서 제1 적층 Fc 폴리펩타이드 내 IgSF 도메인의 총 개수는 2, 3, 4, 5, 6개 이상 보다 많다. 이러한 구체예들의 또 다른 예에서, 제2 Fc 폴리펩타이드는 변이체 CD80 폴리펩타이드 또는 제2 IgSF 도메인에 연결되지 않는다
[253] 일부 구체예에서, 헤테로다이머 적층 분자는 제1 적층 면역조절 Fc 융합 폴리펩타이드 및 제2 적층 면역조절 Fc 융합 폴리펩타이드를 함유하되 여기서 상기 제1 및 제2 폴리펩타이드는 상이한 것들이다. 일부 구체예에서, 헤테로다이머 적층 분자는 제1 변이체 CD80 폴리펩타이드 및/또는 제2 IgSF 도메인 (예컨대 제2 변이체 IgSF 도메인)을 함유하는 제1 Fc 서브유닛 및 또 다른 제1 변이체 CD80 폴리펩타이드 또는 제2 IgSF 도메인을 함유하는 제2 Fc 서브유닛을 함유한다. 일부 구체예에서, 헤테로다이머 적층 분자는 제1 적층 면역조절 Fc 융합 폴리펩타이드 및 제2 적층 면역조절 Fc 융합 폴리펩타이드를 함유하되 여기서 상기 제1 및 제2 폴리펩타이드는 상이한 것들이다. 일부 구체예에서, 헤테로다이머 적층 분자는 제1 변이체 CD80 폴리펩타이드 및/또는 제2 IgSF 도메인 (예컨대 제2 변이체 IgSF 도메인)을 함유하는 제1 Fc 서브유닛 및 제1 변이체 CD80 폴리펩타이드와 제2 IgSF 도메인 (예컨대 제2 변이체 IgSF 도메인) 두 가지를 모두 함유하되 제1 Fc 서브유닛과는 다른 배향 또는 배열로 함유하는 제2 Fc 서브유닛을 함유한다.
[254] 일부 구체예에서, 제1 및 제2 적층된 면역조절 Fc 융합 폴리펩타이드 중 하나 또는 두 가지 모두의 Fc 도메인은, Fc 분자의 인터페이스가 헤테로다이머화를 용이화 및/또는 촉진하도록 변형되는 변형(예컨대 치환)을 포함한다. 일부 구체예에서, 변형은 돌출부(손잡이: knob)의 제1 Fc 폴리펩타이드로의 도입 및 공동(구멍: hole) 의 제2 폴리펩타이드로의 도입을 포함함으로 해서 상기 돌출부가 공동 내에 위치가능하게 되어 제1 및 제2 Fc-함유 폴리펩타이드의 복합체 형성을 촉진시키는 것이다. 폴리펩티드에서 돌출부 또는 공동을 생성하기위한 치환 및/또는 변형을 목표로하는 아미노산은 전형적으로 제2 폴리펩타이드의 인터페이스에서 하나 이상의 아미노산과 상호작용하거나 접촉하는 인터페이스 아미노산이다.
[255] 일부 구체예에서, 돌출부(구멍) 아미노산을 함유하도록 변형된 제1 폴리펩타이드는 제1 폴리펩타이드의 인터페이스로부터 돌출된 적어도 하나의 측쇄를 갖는 아미노산으로 천연 또는 오리지날 아미노산이 치환됨으로 해서 제2 폴리펩타이드의 인접 인터페이스내 의 상보적인 공동(구멍)에 위치가능하다. 가장 흔하게는, 치환 아미노산은 오리지날 아미노산 잔기보다 더 큰 측쇄 부피를 갖는 것이다. 통상의 기술자라면 돌출부 형성을 위한 이상적인 치환 아미노산을 동정하기 위한 아미노산 잔기의 특성을 결정 및/또는 평가하는 방법을 알 것이다. 일부 구체예에서, 돌출부 형성을 위한 치환 잔기는 자연발생적인 아미노산 잔기이며 예컨대 아르기닌 (R), 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y), 또는 트립토판 (W)을 들 수 있다. 일부 사례에서, 치환을 위해 동정된 오리지날 잔기는 예를 들어, 알라닌, 아스파라긴s, 아스파트산, 글리신, 세린, 트레오닌, 또는 발린과 같이, 소형 측쇄를 갖는 아미노산 잔기이다.
[256] 일부 구체예에서, 공동(구멍)을 함유하도록 변형된 제2 폴리펩타이드는 그 제2 폴리펩타이드의 인터페이스로부터 리세스된 적어도 하나의 측쇄를 갖는 아미노산에 의해 천연 또는 오리지날 아미노산이 치환되어 제1 폴리펩타이드의 인터페이스로부터의 대응하는 돌출부를 수용할 수 있는 것이다. 가장 흔하게는, 이러한 치환 아미노산은 오리지날 아미노산 잔기보다 더 작은 측쇄 부피를 갖는 것이다. 통상의 기술자라면 공동 형성을 위한 이상적인 치환 잔기를 동정하기 위해 아미노산 잔기를 어떻게 결정 및/또는 평가하는지 알 것이다. 일반적으로, 공동 형성을 위한 치환 잔기는 자연발생적인 아미노산이고, 여기에는 예를 들어 알라닌 (A), 세린 (S), 트레오닌 (T) 및 발린 (V)이 포함된다. 일부 사례에서, 치환을 위해 동정된 오리지날 아미노산은 예를 들어, 티로신, 아르기닌, 페닐알라닌, 또는 트립토판과 같은 대형 측쇄를 갖는 아미노산이다.
[257] 인간 IgG1의 CH3 인터페이스는, 예를 들어, 각 표면으로부터 1090A2 묻힌 4개의 역평행 β-가닥 상에 위치한 각 도메인 상에 16 개의 잔기를 포함한다 (예컨대, 참조: Deisenhofer 외 (1981)　Biochemistry,　20:2361-2370; Miller 외, (1990)　J Mol. Biol.,　216, 965-973; Ridgway 외, (1996)　Prot. Engin.,　9: 617-621; 미국특허 No. 5,731,168). 돌출부 또는 공동을 생성하기 위한 CH3 도메인의 생성에 대해서는 예를 들어, 미국특허 No. 5,731,168; 국제특허출원 WO98/50431 및 WO 2005/063816; 및 Ridgway 외, (1996)　Prot. Engin.,　9: 617-621에 설명되어 있다. 일부 사례에서, 돌출부 또는 공동을 생성하기 위한 CH3 도메인의 변형은 2개의 중심 역평행 β-가닥 상에 위치한 잔기에 표적화된다. 그 목적은 생성된 돌출부가 파트너 CH3 도메인의 보상성 공동 (compensatory cavity)에 의해 수용되기보다는 주변 용매로 돌출됨으로써 수용될 수있는 위험을 최소화하는 것이다.
[258] 일부 구체예에서, 헤테로다이머 분자는 "손잡이 사슬(knobs chain)"의 CH3 도메인 내에 T366W 돌연변이를, 그리고 "구멍 사슬(hole chain)"의 CH3 도메인에는 T366S, L368A, Y407V 돌연변이를 함유한다. 일부 경우에서, 예컨대 Y349C 돌연변이를 "손잡이" 또는 "구멍" 사슬 내로 도입하거나 또는 E356C 돌연변이또는 S354C 돌연변이를 또 다른 사슬의 CH3 도메인 내로 도입함으로써 이들 CH3 도메인들 간의 부가적인 사슬간 다이설파이드 다리 역시도 사용될 수 있다 (Merchant, A. M., 외, Nature Biotech. 16 (1998) 677-681). 일부 구체예에서, 헤테로다이머 분자는 두 개의 CH3 도메인 중 하나에 S354C, T366W 돌연변이를, 그리고 두 개의 CH3 도메인 중 다른 하나에 Y349C, T366S, L368A, Y407V 돌연변이를 함유한다. 일부 구체예에서, 헤테로다이머 분자는 두 개의 CH3 도메인 중 하나에 E356C, T366W 돌연변이를, 그리고 두 개의 CH3 도메인 중 다른 하나에 Y349C, T366S, L368A, Y407V 돌연변이를 포함한다. 일부 구체예에서, 헤테로다이머 분자는 두 개의 CH3 도메인 중 하나에 Y349C, T366W 돌연변이를, 그리고 두 개의 CH3 도메인 중 다른 하나에 E356C, T366S, L368A, Y407V 돌연변이를 포함한다. 일부 구체예에서, 헤테로다이머 분자는 두 개의 CH3 도메인 중 하나에 Y349C, T366W 돌연변이를, 그리고 두 개의 CH3 도메인 중 다른 하나에 S354C, T366S, L368A, Y407V 돌연변이를 포함한다. 그 밖의른 손잡이에 구멍 (knobs-in-holes) 기술이 예컨대 EP 1 870 459 A1에 설명되어 있다.
[259] 일부 구체예에서, 헤테로다이머 분자의 Fc 서브유닛들은 전술한 것과 같은 하나 이상의 다른 Fc 돌연변이를 부가적으로 함유할 수 있다. 일부 구체예에서, 헤테로다이머 분자는 이펙터 기능을 감소시키는 돌연변이를 갖는 Fc 서브유닛을 함유한다.
[260] 일부 구체예에서, CH3 돌출부/공동 변형을 함유하는 Fc 변이체는 적층된 면역조절 폴리펩타이드의 어디에든, 그러나 일반적으로는 그의 N-또는 C-말단을 통해 제1 및/또는 제2 적층된 면역조절 폴리펩타이드의 N-또는 C-말단에 결합되어 예컨대 융합 폴리펩타이드를 형성할 수 있다. 이러한 연결은 직접적이거나 또는 링커를 경유한 간접적인 것일 수 있다. 일반적으로, 손잡이 및 구멍 분자는 CH3 돌출부 변형(들)을 함유하는 Fc 변이체에 연결된 제1 적층 면역조절 폴리펩티드와 CH3 공동 변형(들)을 함유하는 Fc 변이체에 연결된 제2 적층 면역 조절 폴리펩티드의 공동-발현에 의해 생성된다.
C. 변이체 폴리펩타이드 및 면역조절 단백질의 컨쥬게이트 및 융합체
[261] 일부 구체예에서, 본 발명에서 제공된 IgSF 패밀리의 Ig 도메인의 변이체 (vIgD)를 포함하는 면역조절 단백질인, 변이체 폴리펩타이드는 , 이펙터 모이어티와 같은 모이어티, 예컨대 또 다른 단백질과 직접 또는 간접적으로 컨쥬게이트 또는 융합되어 컨쥬게이트 ("IgSF 컨쥬게이트")를 형성할 수 있다. 일부 구체예에서, 이러한 부착은 공유적이거나 또는 바이오틴-스트렙트아비딘 비공유 상호작용을 통한 비공유적일 수 있다. CD80-Fc 변이체 융합의 일부 구체예에서 전술한 컨쥬게이트들 중 어느 하나 또는 2 이상의 조합이 Fc에 또는 변이체 CD80 폴리펩타이드에 또는 두 가지 모두에 부착될 수 있다.
[262] 일부 구체예에서, 상기 모이어티는 표적화 모이어티, 소분자 약물 (500 달톤 몰 질량 미만의 비-폴리펩타이드 약물), 독소, 세포증식 억제제, 세포독성 물질, 면역억제제, 진단 목적에 적합한 방사능 물질, 치료 목적의 방사능 금속 이온, 전구약물-활성화 효소, 생물학적 반감기를 증가시키는 물질, 또는 진단 물질 또는 검출가능한 물질일 수 있다.
[263] 일부 구체예에서 이펙터 모이어티는 치료제, 예컨대 세포독성, 세포증식억제 또는 그 밖에 어떤 치료적 이점을 제공하는 암 치료제이다. 일부 구체예에서, 이펙터 모이어티는 세포 표면 항원, 예컨대 종양 세포 표면의 항원을 표적화하는 물질과 같은 표적화 모이어티 또는 물질이다. 일부 구체예에서, 이펙터 모이어티는 검출가능한 시그널을 직접 또는 간접적으로 생성할 수 있는 표지이다. 일부 구체예에서, 이펙터 모이어티는 독소이다. 일부 구체예에서, 이펙터 모이어티는 단백질, 펩타이드, 핵산, 소분자 또는 나노입자이다.
[264] 일부 구체예에서, 동일하거나 상이할 수 있는 1, 2, 3, 4, 5개 또는 그 이상의 이펙터 모이어티들이 변이체 폴리펩타이드 또는 단백질에 컨쥬게이트, 연결 또는 융합되어 IgSF 컨쥬게이트를 형성한다. 일부 구체예에서, 이러한 이펙터 모이어티들은 공지기술 및 후술되는 다양한 분자생물학적 또는 화학적 컨쥬게이션 및 결합 방법을 이용함으로써 변이체 폴리펩타이드 또는 면역조절 단백질에 부착될 수 있다. 일부 구체예에서, 링커들 예컨대 펩타이드 링커들, 절단가능 링커들, 비-절단가능 링커들 또는 컨쥬게이션 반응에 도움이 되는 링커들을 이용하여 이펙터 모이어티들을 변이체 폴리펩타이드 또는 면역조절 단백질에 연결 또는 컨쥬게이트시킬 수 있다.
[265] 일부 구체예에서, IgSF 컨쥬게이트는 다음 성분들: (단백질 또는 폴리펩타이드), (L)q 및 (이펙터 모이어티)m을 포함하되 여기서, 상기 단백질 또는 폴리펩타이드는 설명된 바와 같은 하나 이상의 동족 카운터 구조 리간드와 결합할 수 있는 임의의 설명된 변이체 폴리펩타이드 또는 면역조절 단백질이고; L은 단백질 또는 폴리펩타이드를 모이어티에 연결하기 위한 링커; m은 적어도 1; q는 0 또는 그 이상이며; 결과적인 IgSF 컨쥬게이트는 하나 이상의 카운터 구조 리간드에 결합하는 것이다. 특정 구체예에서, m은 1 내지 4이고 q는 0 내지 8이다.
[266] 일부 구체예에서, 예를 들어 변이체 폴리 펩타이드 또는 면역조절 단백질을 특정 세포에 표적화 전달하기 위해, 세포 표면 분자에 결합하는 표적화 물질과 컨쥬게이션된, 본 발명에서 제공되는 변이체 폴리펩타이드 또는 면역조절 단백질을 포함하는 IgSF 컨쥬게이트가 제공된다. 일부 구체예에서, 표적화 물질은 대상자 내 정상 세포/조직 및/또는 종양 세포/종양 상에 존재하는 분자를 위치 결정하고 이에 결합하는 능력을 갖는 분자(들)이다. 달리 설명해서, 표적화 물질을 포함하는 IgSF 컨쥬게이트는 종양 세포와 같은 세포 상에 존재하는, 리간드에 (직접 또는 간접적으로) 결합할 수 있다. 사용이 고려되는 본 발명의 표적화 물질에는 표적 세포 또는 분자의 성분에 결합할 수 있는항체, 폴리펩타이드, 펩타이드, 압타머, 기타 리간드, 또는 이들의 조합이 포함된다.
[267] 일부 구체예에서, 표적화 물질은 대상자에게 투여된 후 종양 세포(들)에 결합하거나 종양 세포(들) 부근(예를 들어, 종양 혈관계 또는 종양 미세 환경)에 결합 할 수있다. 표적화 물질은 암세포 표면의 수용체 또는 리간드에 결합할 수 있다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 비암성 세포 또는 조직에 특이적인 표적화 물질이 선택된다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 예를 들어, 표적화 물질은 특정 세포 또는 조직에 보통 존재하는 분자에 특이적일 수 있다. 또한, 일부 구체예에서, 동일한 분자가 정상 세포 및 암 세포에 존재할 수 있다. 다양한 세포 성분 및 분자가 알려져 있다. 예를 들어, 만일 표적화 물질이 EGFR에 특이적일 경우, 결과적인 IgSF 컨쥬게이트는 EGFR을 발현하는 정상적인 피부 표피 세포뿐만 아니라, EGFR을 발현하는 발현하는 표적 암 세포도 표적할 수 있다. 그러므로, 일부 구체예에서, 본 발명의 IgSF 컨쥬게이트는 2 개의 별도 메카니즘(표적화 암세포 및 비-암세포)에 의해 작동가능하다.
[268] 본 발명의 다양한 측면에서, 본 발명의 IgSF 컨쥬게이트는 세포 성분, 예컨대 종양 항원, 세균 항원, 바이러스 항원, 미코플라즈마 항원, 진균 항원, 프리온 항원, 기생충으로부터의 항원에 결합/표적화할 수 있는 표적화 물질을 포함한다. 일부 측면에서, 세포 성분, 항원 또는 분자는 각각 표적화 물질에 대한 소망되는 표적을 의미하는 것으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 다양한 구체예에서, 표적화 물질은 비제한적인 예로서 하기에 예시된 성분들, 즉: 성장 인자 수용체 (EGFR, ErbB-1, HERl), ErbB-2 (HER2/neu), ErbB-3/HER3, ErbB-4/HER4, EGFR 리간드 패밀리; 인슐린-유사 성장 인자 수용체 (IGFR) 패밀리, IGF-결합 단백질s (IGFBPs), IGFR 리간드 패밀리; 혈소판 유도된 성장 인자 수용체 (PDGFR) 패밀리, PDGFR 리간드 패밀리; 섬유아세포 성장 인자 수용체 (FGFR) 패밀리, FGFR 리간드 패밀리, 혈관내피 성장 인자 수용체 (VEGFR) 패밀리, VEGF 패밀리; HGF 수용체 패밀리; TRK 수용체 패밀리; 에프린 (EPH) 수용체 패밀리; AXL 수용체 패밀리; 백혈구 티로신 키나아제 (LTK) 수용체 패밀리; TIE 수용체 패밀리, 안지오포이에틴 1,2; 수용체 티로신 키나아제-유사 오펀 수용체 (ROR) 수용체 패밀리, 예컨대 ROR1; CD171 (L1CAM); B7-H6 (NCR3LG1); PD-L1, 종양 글리코실화 항원, 예컨대 sTn 또는 Tn, 예컨대 MUC1의 sTn Ag; LHR (LHCGR); 포스파티딜세린, 디스코이딘 도메인 수용체 (DDR) 패밀리; RET 수용체 패밀리; KLG 수용체 패밀리; RYK 수용체 패밀리; MuSK 수용체 패밀리; 트랜스포닝 성장 인자-α (TGF-α) 수용체, TGF-β; 사이토카인 수용체, 클래스 I (헤마토포이에틴 패밀리) 및 Class II (인터페론/IL-10 패밀리) 수용체, 종양괴사인자 (TNF) 수용체 수퍼패밀리 (TNFRSF), 사멸 수용체 패밀리; 고환암 (CT) 항원, 계통-특이 항원, 분화 항원, 알파-액티닌-4, ARTCl, 브레이크포인 클러스터 영역-아벨손 (Bcr-abl) 융합 산물, B-RAF, 카스파제-5 (CASP-5), 카스파제-8 (CASP-8), β-카테닌 (CTNNBl), 세포 분열주기 27 (CDC27), 사이클린-의존성 키나아제 4 (CDK4), CDKN2A, COA-I, dek-can 융합 단백질, EFTUD-2, 연장 인자 2 (ELF2), Ets 변이체 유전자 6/급성 골수성 백혈병 1 유전자 ETS (ETC6-AML1) 융합 단백질, 피브로넥틴(FN), 예컨대 피브로넥틴의 엑스트라도메인 A (EDA), GPNMB, 저밀도 지질수용체/GDP-L 푸코스: β-D갈락토스 2-α-L푸코실트랜스퍼라제 (LDLR/FUT) 융합 단백질, HLA-A2. HLA-A2 유전자 내 α2-도메인의 α-헬릭스의 잔기 170에서의 아르기닌에서 이소류신으로의 교환 (HLA-A*201-R170I), HLA-Al 1, 열충격 단백질 70-2 돌연변이된 (HSP70-2M), K1AA0205, MART2, 유비퀴터스 돌연변이 흑색종 1, 2, 3 (MUM-I, 2, 3), 전립선 산 포스파타제(PAP), 네오-PAP, 미오신 클래스 I, NFYC, OGT, OS-9, pml-RAR알파 융합 단백질, PRDX5, PTPRK, K-ras (KRAS2), N-ras (NRAS), HRAS, RBAF600, SIRT2, SNRPDl, SYT-SSXl 또는-SSX2 융합 단백질, 트리오세포스페이트 이소머라제, BAGE, BAGK-1, BAGE-2,3,4,5, GAGE-1,2,3,4,5,6,7,8, GnT-V (이상 N-아세틸 글루코사미닐 트랜스퍼라제 V, MGAT5), HERV-K-MEL, KK-LC, KM-HN-I, LAGE, LAGE-I, 흑색종 상의 CTL-인식된 항원 (CAMEL), MAGE-Al (MAGE-I), MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-AlO, MAGE-AI l, MAGE-A12, MAGE-3, MAGE-Bl, MAGE-B2, MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-Cl, MAGE-C2, 뮤신 1 (MUCl), MART-1/Melan-A (MLANA), gplOO, gplOO/ Pmell7 (SILV), 티로시나제 (TYR), TRP-I, HAGE, NA-88, NY-ESO-I, NY-ESO-l/LAGE-2, SAGE, Spl7, SSX-1,2,3,4, TRP2-INT2, 배아 암종 항원 (CEA), 칼리크레인 4, 포유글로빈-A(mammaglobin-A), OAl, 전립선 특이 항원 (PSA), TRP-1/ gp75, TRP-2, 아디포필린, 흑색종 2에 부재하는 인터페론 유도성 단백질 (AIM-2), BING-4, CPSF, 사이클린 Dl, 상피 세포 부착 분자 (Ep-CAM), EphA3, 섬유아세포 성장 인자-5 (FGF-5), 당단백질 250 (gp250), EGFR (ERBBl), HER-2/neu (ERBB2), 인터류킨 13 수용체 α2 사슬 (IL13Rα2), IL-6 수용체, 장내 카르복실 에스테라제 (iCE), 알파-피토(feto) 단백질 (AFP), M-CSF, mdm-2, MUCl, p53 (TP53), PBF, PRAME, PSMA, RAGE-I, RNF43, RU2AS, SOXlO, STEAPl, 서바이빈 (BIRC5), 인간 텔로머라제 역전사효소(hTERT), 텔로머라제, 윌름 종양 유전자(WTl), SYCPl, BRDT, SPANX, XAGE, ADAM2, PAGE-5, LIPl, CTAGE-I, CSAGE, MMAl, CAGE, BORIS, HOM-TES-85, AF15ql4, HCA661, LDHC, MORC, SGY-I, SPOl 1, TPXl, NY-SAR-35, FTHL17, NXF2, TDRDl, TEX15, FATE, TPTE, 면역글로불린 이디오타입, Bence-Jones 단백질, 에스트로겐 수용체 (ER), 안드로겐 수용체 (AR), CD40, CD30, CD20, CD 19, CD33, 암 항원 72-4 (CA 72-4), 암 항원 15-3 (CA 15-3), 암 항원 27-29 (CA 27-29), 암 항원 125 (CA 125), 암 항원 19-9 (CA 19-9), β-인간 융모성 고나도트로핀, β-2 마이크로글로불린, 편평세포 암종항원, 뉴런-특이적 에놀라제, 열충격 단백질 gp96, GM2, 사르그라모스팀(sargramostim), CTLA-4, 707 알라닌 프롤린 (707-AP), T 세포 4에 의해 인식된 선암종 항원 (ART-4), 암배아 항원 펩타이드-1 (CAP-I), 칼슘-활성화된 클로라이드 채널-2 (CLCA2), 사이클로필린 B (Cyp-B), 인간 인장 고리 종양(signet ring tumor)-2 (HST-2), 인간 유두종 바이러스 (HPV) 단백질 (HPV-E6, HPV-E7, 메이저 또는 마이너 캡시드 항원, 기타), 엡스타인-바 바이러스 (EBV) 단백질 (EBV 잠재 막 단백질-LMPl, LMP2; 기타), B형 또는 C형 간염 바이러스 단백질, 및 HIV 단백질에 특이적이거나 또는 이들 성분들과 결합한다.
[269] 일부 구체예에서, IgSF 컨쥬게이트는 그의 표적화 물질을 통해, 종양 세포, 종양 혈관계 또는 종양 미세환경의 세포 성분과 결합함으로써, 면역반응의 조절(예컨대 (예컨대, 공동-자극 분자의 활성화 또는 면역 세포 활성화 네거티브 조절 분자의 억제에 의함), 생존 시그널 (예컨대, 성장 인자 또는 사이토카인 또는 호르몬 수용체 길항제)의 억제, 사멸 시그널 및/또는 예컨대 항체 의존성 세포성 세포독성을 통한 면역-매개된 세포독성의 활성화를 통해 표적화된 세포의 살해를 촉진한다. 이러한 IgSF 컨쥬게이트는 IgSF 컨쥬게이트의 수용체-매개 엔도시토시스 를 통해 종양 표적에 컨쥬게이트된 이펙터 모이어티의 전달을 용이하게하는 것과 같이 종양 세포를 예방, 감소 또는 제거하기 위한 몇 가지 메카니즘을 통해 기능하거나; 또는 이러한 컨쥬게이트는 면역 세포 (예를 들어, NK 세포, 단핵 세포/대식세포, 수지상 세포, T 세포, B 세포)를 모집하고, 결합시키고, 및/또는 활성화시킬 수 있다. 또한, 어떤 경우에는 상기 경로 중 하나 이상이 본 발명의 하나 이상의 IgSF 컨쥬게이트의 투여시 작용할 수 있다.
[270] 일부 구체예에서, IgSF 컨쥬게이트는, 그의 표적화 물질을 통해, 종양 세포, 종양 혈관계 또는 종양 미세환경의 세포 성분에 결합하는 등 국소화함으로써, 종양 근방에서 면역반응의 세포들을 조절한다. 일부 구체예에서, 표적화 물질은 종양 표적에 대한 컨쥬게이트된 IgSF (예컨대 vIgD)의 전달을 용이화시켜, 그의 동족 결합 파트너와 상호작용하여 동족 결합 파트너를 산생하는 면역 세포 (예를 들어, NK 세포, 단핵구/대식세포, 수지상 세포, T 세포)의 시그널링을 변경시킨다. 일부 구체예에서, 국소화된 전달은 CD28 또는 ICOS를 통한 공동자극 시그널링을 배개한다.
[271] 일부 구체예에서, 표적화 물질은 면역글로불린이다. 본 발명에서, 용어 "면역글로불린"은 천연 또는 인공의 일가 또는 다가 항체를 포함하며, 이의 비제한적인 예로는 폴리클로날, 모노클로날, 다중특이, 인간, 인간화 또는 키메라 항체, 단일 사슬 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생성된 단편, 단일 사슬 Fv (scFv); 항-이디오타입 (항-Id) 항체, (예컨대, 본 발명 항체에 대한 항-Id 항체를 포함한다), 및 전술한 임의의 것의 에피토프-결합 단편을 들 수 있다. 본 명세서에서 "항체"라 함은 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 부분, 예컨대, 항원에 면역특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 함유하는 분자를 가리킨다. 본 발명의 면역글로불린 분자는 면역글로불린 분자의 임의의 종류(예컨대, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 및 IgY), 클래스 (예컨대, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, 및 IgA2) 또는 서브클래스일 수 있다.
[272] 일부 구체예에서, 그의 항체 표적화 모이어티를 통한 IgSF 컨쥬게이트는 종양 세포, 종양 혈관계 또는 종양 미세환경의 세포 성분과 결합함으로써, 면역반응의 조절(예컨대 (예컨대, 공동-자극 분자의 활성화 또는 면역 세포 활성화 네거티브 조절 분자의 억제에 의함), 생존 시그널 (예컨대, 성장 인자 또는 사이토카인 또는 호르몬 수용체 길항제)의 억제, 사멸 시그널 및/또는 예컨대 항체 의존성 세포성 세포독성을 통한 면역-매개된 세포독성의 활성화를 통해 표적화된 세포의 세포자멸사를 촉진한다. 이러한 IgSF 컨쥬게이트는 예컨대 IgSF 컨쥬게이트의 수용체-매개 엔도시토시스를 통해 종양 표적에 컨쥬게이트된 이펙터 모이어티의 전달을 용이하게하는 것과 같이 종양 세포를 예방, 감소 또는 제거하기 위한 몇 가지 메카니즘을 통해 기능하거나; 또는 이러한 컨쥬게이트는 면역 세포 (예를 들어, NK 세포, 단핵 세포/대식세포, 수지상 세포, T 세포, B 세포)를 모집하고, 결합시키고, 및/또는 활성화시킬 수 있다.
[273] 일부 구체예에서, IgSF 컨쥬게이트는, 그의 항체 표적화 모이어티를 통해, 종양 세포, 종양 혈관계 또는 종양 미세환경의 세포 성분에 결합함으로서 면역 반응을 조절할 것이다(예컨대, 공동-자극 분자의 활성화 또는 면역 세포 활성화의 네거티브 조절 분자의 억제에 의함). 일부 구체예에서, 이러한 컨쥬게이트는 면역 세포 (예컨대 NK 세포, 단핵구/대식세포, 수지상 세포, T 세포, B 세포)를 인식, 결합 및/또는 조절(예컨대 억제 또는 활성화)할 수 있다.
[274] 본 발명의 항체 표적화 모이어티들은 비제한적인 예로서 Fab, Fab' 및 F(ab')2, Fd, 단일-사슬 Fvs (scFv), 단일-사슬 항체, 다이설파이드-연결된 Fvs (sdFv) 및 VL 또는 VH 도메인을 포함하는 단편을 포함한다. 단일-사슬 항체를 비롯한 항원-결합 항체 단편은, 가변 영역(들)을 단독으로 또는 다음의 것들 전체 또는 일부와의 조합으로서 포함할 수 있다: 힌지 영역, CH1, CH2, 및 CH3 도메인. 또한 본 발명에는 힌지 영역, CH1, CH2, 및 CH3 도메인과 가변 영역(들)과의 임의의 조합 역시도 포함하는 항원-결합 단편도 포함된다. 또한 본 발명에는 Fc 단편, 항원-Fc 융합 단백질, 및 Fc-표적화 모이어티 컨쥬게이트 또는 융합 산물 (Fc-펩타이드, Fc-압타머)도 제공된다. 본 발명의 항체 표적화 모이어티들은 조류 및 포유동물을 비롯한 임의의 동물로부터 기원할 수 있다. 일 측면에서, 항체 표적화 모이어티들은 인간, 쥐(예컨대, 마우스 및 래트), 당나귀, 양, 토끼, 염소, 기니피그, 낙타, 말 또는 닭의 것일 수 있다. 또한 이러한 항체들은 동물 항체의 인간화 버젼일 수 있다. 본 발명의 항체 표적화 모이어티들은 단일특이, 이중특이, 삼중특히 또는 그 보다 더 많은 멀티특이적일 수 있다.
[275] 다양한 구체예에서, 항체/표적화 모이어티는 Fc (항체 내)와 Fc 수용체 (면역 세포 상) 간의 상호작용을 통해 그리고 본 발명에서 제공된 면역조절 단백질 또는 컨쥬게이트된 변이체 폴리펩타이드를 통해 면역 세포 (예컨대 NK 세포, 단핵구/대식세포, 수지상 세포)를 모집, 결합 및/또는 활성화시킨다. 일부 구체예에서, 항체/표적화 모이어티는 종양 물질을 인식 또는 결합하여 본 발명에 제공된 컨쥬게이트된 변이체 폴리펩타이드 또는 면역조절 단백질을 종양 세포에 국소화하여 종양 근방의 면역 세포를 조절하는 것을 용이하게 한다.
[276] IgSF 컨쥬게이트에 통합될 수 있는 항체들의 비제한적인 예로는 세툭시맙 (IMC-C225; Erbitux®), 트라스투주맙(Herceptin®), 리툭시맙(Rituxan®; MabThera®), 베바시주맙(Avastin®), 알렘투주맙(Campath®; Campath-1H®; Mabcampath®), 파니투무맙(ABX-EGF; Vectibix®), 라니비주맙(Lucentis®), 이브리투모맙, 이브리투모맙 티욱세탄, (Zevalin ®), 토시투모맙, 요오드 I 131 토시투모맙 (BEXXAR®), 카투막소맙(Removab®), 겜투주맙, 겜투주맙 오조가미신(Mylotarg®), 아바타셉트(CTLA-4-Ig; Orencia®), 벨라타셉트(L104EA29YIg; LEA29Y; LEA), 이필리무맙(MDX-010; MDX-101), 트레멜리무맙 (티실리무맙; CP-675,206), PRS-010, PRS-050, 아플리베르셉트(VEGF Trap, AVE005), 벨로식시맙(M200), F200, MORAb-009, SS1P (CAT-5001), 시주투무맙 (IMC-A12), 마투주맙(EMD72000), 니모투주맙 (h-R3), 잘루투무맙(HuMax-EGFR), 네시투무맙 IMC-11F8, mAb806 / ch806, Sym004, mAb-425, 파노렉스로 이루어진 군으로부터 선택되는 (17-1A) (쥐의 모노클로날 항체); 파노렉스 로 이루어진 군으로부터 선택되는 (17-1A) (키메라 쥐 모노클로날 항체); IDEC-Y2B8 (쥐의, 항-CD2O MAb) ; BEC2 (항-이디오타입 MAb, GD 에피토프를 모방) (BCG와 함께);온콜림(Lym-1 모노클로날 항체); SMART MI95 Ab, 인간화 13' I LYM-I (Oncolym), 오바렉스 (B43.13, 항-이디오타입 마우스 MAb); MDX-210 (인간화 항-HER-2 이중특이 항체); 선암종 상의 EGP40 (17-1A) 전이암(pancarcinoma) 항원에 결합하는 3622W94 MAb; 항-VEGF, 제나팍스(SMART 항-Tac (IL-2 수용체); SMART MI95 Ab, 인간화 Ab, 인간화됨); MDX-210 (인간화 항-HER-2 이중특이 항체); MDX-447 (인간화 항-EGF 수용체 이중특이 항체); NovoMAb-G2 (전이암 특이 Ab); TNT (히스톤 항원에 대한 키메라 MAb); TNT (히스톤 항원에 대한 키메라 MAb); 글리오맙-H (모노클론 s-인간화 Abs); GNI-250 Mab; EMD-72000 (키메라-EGF 길항제); LymphoCide (인간화 LL2 항체); 및 MDX-260 이중특이, 표적 GD-2, ANA Ab, SMART IDlO Ab, SMART ABL 364 Ab 또는 ImmuRAIT-CEA를 들 수 있다. 전술한 목록에 의해 설명되는 바와 같이, 특정 표적 에피토프에 대한 항체를 만드는 것이 통상적이다.
[277] 일부 구체예에서, 항체 표적화 모이어티는 전장 항체, 또는 Fc 도메인을 함유하는 그의 항원-결합 단편이다. 일부 구체예에서, 변이체 폴리펩타이드 또는 면역조절 단백질은 항체의 Fc 부분의 N-말단에 대한 컨쥬게이션에 의한 것과 같이, 항체 표적화 모이어티의 Fc 부분에 대해 컨쥬게이트된다.
[278] 일부 구체예에서, vIgD는 항체의 경쇄 및/또는 중쇄의 N-또는 C-말단에 직접 또는 간접적으로 연결된다. 일부 구체예에서, 연결은 펩타이드 링커를 경유하여, 예컨대 전술한 임의 방법에 의해 수행가능하다. 도 6A-6C는 예시적인 배열을 나타낸다. 일부 구체예에서, 항체 컨쥬게이트는 세포 내 항체의 중쇄 및 경쇄의 공동-발현에 의해 생산될 수 있다.
[279] 본 발명의 일 측면에서, 표적화 물질은 압타머 분자이다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 압타머는 표적화 물질로서 기능하는 핵산을 포함한다. 다양한 구체예에서 본 발명의 IgSF 컨쥬게이트는 종양 세포, 종양 혈관계, 및/또는 종양 미세환경 상의 분자에 특이적인 압타머를 포함한다. 일부 구체예에서, 압타머 자체는 표적화 모듈(서열)에 더해, 생물학적 활성 서열을 포함할 수 있고, 여기서 상기 생물학적 활성 서열은 표적 세포에 면역 반응을 유도할 수 있다. 달리 설명하면, 이러한 압타머 분자는 이중 용도 물질이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 IgSF 컨쥬게이트는 항체에 대한 압타머의 컨쥬게이트를 포함하며 여기서 상기 압타머 및 항체는 종양 세포, 종양 혈관계, 종양 미세환경 상의 분리된 분자, 및/또는 면역 세포에 대한 결합에 특이적이다
[280] 용어 "압타머"는 특정 분자에 대한 특이적 결합 특성에 기초하여 선택된 DNA, RNA 또는 펩타이드를 포함한다. 예를 들어, 압타머(들)은 본 발명에 설명된 바와 같이, 종양 세포, 종양 혈관계, 종양 미세환경, 및/또는 면역 세포 내 특정 유전자 또는 유전자 산물의 결합에 대해 선택될 수 있고, 여기서 이러한 선택은 공지기술의 방법 및 통상의 기술자에게 잘 알려진 방법에 의해 수행된다.
[281] 본 발명의 일부 측면에서 표적화 물질은 펩타이드이다. 예를 들어, 본 발명에 제공된 변이체 폴리펩타이드 또는 면역조절 단백질은 암 또는 종양 세포의 성분과 결합가능한 펩타이드에 컨쥬게이트될 수 있다. 따라서, 본 발명의 이러한 IgSF 컨쥬게이트는 종양 세포, 종양 혈관계의 세포 성분, 및/또는 종양 미세환경의 성분에 결합하는 펩타이드 표적화 물질을 포함한다. 일부 구체예에서, 표적화 물질 펩타이드는 인테그린의 길항제 또는 작용제일 수 있다. 알파 및 베타 서브유닛을 포함하는 인테그린에는 통상의 기술자에게 잘 알려진 수 많은 종류가 있다.
[282] 일 구체예에서, 표적화 물질은 Vvbeta3이다. 인테그린 Vvbeta3은 다양한 세포에서 발현되며 파골 세포와 뼈 매트릭스의 접착, 혈관 평활근 세포의 이동 및 혈관 신생을 비롯하여 생물학적으로 관련된 여러 과정을 중재하는 것으로 나타났다. 인테그린을 위한 적절한 표적화 분자로는 RGD 펩타이드 또는 펩타이드 모방체(peptidomimetics) 및 비-RGD 펩타이드 또는 펩타이드 모방체 (예컨대 미국특허 Nos. 5,767,071 및 5,780,426 참조), 그 밖의 인테그린 예컨대 V4.betai (VLA-4), V4-P7 (예컨대, 미국특허 No. 6,365,619; Chang et al, Bioorganic & Medicinal Chem Lett, 12:159-163 (2002); Lin et al., Bioorganic & Medicinal Chem Lett, 12:133-136 (2002) 참조), 등을 들 수 있다.
[283] 일부 구체예에서, 본 발명에 따른 변이체 폴리펩타이드 또는 면역조절 단백질과 치료제를 포함하는 IgSF 컨쥬게이트가 제공된다. 일부 구체예에서, 치료제의 예로는, 다우노마이신, 독소루비신, 메토트렉세이트, 및 빈데신을 들 수 있다 (Rowland 외, Cancer Immunol. Immunother. 21:183-187, 1986). 일부 구체예에서, 치료제는 세포내 활성을 갖는다. 일부 구체예에서, IgSF 컨쥬게이트는 내면화되고 치료제는 세포의 단백질 합성을 차단하여, 세포 사멸을 유도하는 세포독소이다. 일부 구체예에서, 치료제는 리보좀-불활성화 활성을 갖는 폴리펩타이드 포함 세포독소, 예를 들어, 젤로닌, 부가닌, 사포린, 리신, 리신 A 사슬, 브리오딘, 디프테리아 독소, 레스트리노신, 슈도모나스 내독소 A 및 그의 변이체이다. 치료제가 리보좀-불활성화 활성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 세포독소인 일부 구체예에서, IgSF 컨쥬게이트는 그 단백질이 세포에 세포독성적이기 위해서 표적 세포에 대한 결합시 내면화되어야 한다.
[284] 일부 구체예에서, 독소와 컨쥬게이트된, 본 발명에 따른 변이체 폴리펩타이드 또는 면역조절 단백질을 포함하는 IgSF 컨쥬게이트가 제공된다. 일부 구체예에서, 독소는 예컨대 디프테리아 독소와 같은 세균성 독소, 리신과 같은 식물성 독소, 소분자 독소 예컨대 젤다나마이신(Mandler 외, J.Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581 (2000); Mandler 외, Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028 (2000); Mandler 외, Bioconjugate Chem. 13:786-791 (2002)), 메이탄시노이드 (EP 1391213; Liu 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996)), 및 칼리케아마이신 (Lode 외, Cancer Res. 58:2928 (1998); Hinman 외, Cancer Res. 53:3336-3342 (1993))이다. 독소는 튜불린 결합, DNA 결합 또는 토포이소머라제 억제를 비롯한 메카니즘에 의해 그의 세포독성 및 세포증식 억제 효과를 발휘한다.
[285] 일부 구체예에서, 검출가능한 시그널을 직접 또는 간접적으로 생성할 수 있는 표지와 컨쥬게이션된, 본 발명에서 제공된 변이체 폴리펩타이드 또는 면역조절 단백질을 포함하는 IgSF 컨쥬게이트가 제공된다. 이들 IgSF 컨쥬게이트는 예컨대 생체내에서 암을 검출하는 것과 같은 연고 또는 진단 용도로 사용될 수 있다. 표지는 좋기로는 검출가능한 시그널을 직접 또는 간접적으로 생성할 수 있는 것이 바람직하다. 예를 들어, 표지는 3H, 14C, 32P, 35S, 123I, 125I, 131I과 같은 방사능-불투과형 또는 방사능동위원소; 형광(플루오로포어) 또는 화학발광(크로모포어) 화합물, 예컨대 플루오레신 이소티오시아네이트, 로다민 또는 루시페린; 알칼린 포스파타제, beta-갈락토시다제 또는 호스래디쉬 퍼옥사이드와 같은 효소; 조영제; 또는 금속 이온일 수 있다. 일부 구체예에서, 표지는 신티그래프 연구를 위한 방사능 원자, 예컨대 99Tc 또는 123I, 또는 핵자기공명(NMR) 영상화(자기공명영상화, MRI라고도 알려짐)를 위한 스핀 표지, 예컨대 지르코늄-89, 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철일 수 있다. 지르코늄-89는 다양한 금속 킬레이트화제와 복합체를 형성하여 예컨대 PET 영상화를 위해 항체에 컨쥬게이트될 수 있다 (WO 2011/056983). 일부 구체예에서, IgSF 컨쥬게이트는 간접적으로 검출가능하다. 예를 들어, IgSF 컨쥬게이트에 특이적고 검출가능한 표지를 함유하는 이차 항체를 이용하여 IgSF 컨쥬게이트를 검출할 수 있다.
[286] IgSF 컨쥬게이트는 공지 기술 방법을 이용하여 만들 수 있다. 예컨대, 본 발명에 그 내용 전체가 참조 병합된 WO 2009/067800, WO 2011/133886, 및 미국특허 출원공개 No. 2014322129 참조.
[287] IgSF 컨쥬게이트의 변이체 폴리펩타이드 또는 면역조절 단백질은 변이체 폴리펩타이드 또는 면역조절 단백질을 이펙터 모이어티와 연계 또는 연결시킬 수 있는 임의의 수단에 의해 이펙터 모이어티에 "부착(attached to)"될 수 있다. 예를 들어, IgSF 컨쥬게이트의 변이체 폴리펩타이드 또는 면역조절 단백질은 화학 또는 재조합 수단에 의해 이펙터 모이어티에 부착될 수 있다. 융합체 또는 컨쥬게이트를 제조하기 위한 화학적 수단은 기술분야에 알려져 있으며 IgSF 컨쥬게이트를 제조하는데 이용될 수 있다. 변이체 폴리펩타이드 또는 면역조절 단백질과 이펙터 모이어티를 컨쥬게이트하는데 사용되는 방법은 변이체 폴리펩타이드 또는 면역조절 단백질이 그들의 하나 이상의 카운터 구조 리간드와 결합하는 능력을 간섭함이 없이, 변이체 폴리펩타이드 또는 면역조절 단백질을 이펙터 모이어티에 연결시킬 수 있어야 한다.
[288] IgSF 컨쥬게이트의 변이체 폴리펩타이드 또는 면역조절 단백질은 이펙터 모이어티에 간접적으로 연결될 수 있다. 예컨대, IgSF 컨쥬게이트의 변이체 폴리펩타이드 또는 면역조절 단백질은 여러가지 종류 중 한 종류의 이펙터 모이어티를 함유하는 리포좀에 직접 연결될 수 있다. 이펙터 모이어티(들) 및/또는 변이체 폴리펩타이드 또는 면역조절 단백질은 고체 표면에 결합될 수도 있다.
[289] 일부 구체예에서, IgSF 컨쥬게이트의 변이체 폴리펩타이드 또는 면역조절 단백질 및 이펙터 모이어티는 두 가지 모두 단백질이며 공지 기술을 이용하여 컨쥬게이션될 수 있다. 이들 두 단백질을 컨쥬게이트시킬 수 있는 크로스링커들이 수백여종이나 존재한다 (예를 들어 "Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking," 1991, Shans Wong, CRC Press, Ann Arbor 참조). 크로스링커는 일반적으로 변이체 폴리펩타이드 또는 면역조절 단백질 및/또는 이펙터 모이어티 상에 삽입되거나 도는 이용가능한 반응성 관능기에 기초해서 선택된다. 또한, 반응성 기가 없을 경우, 광활성화가능한 크로스링커를 사용할 수 있다. 특정 예에서, 변이체 폴리펩타이드 또는 면역조절 단백질과 이펙터 모이어티 사이에 스페이서를 포함시키는 것이 요망될 수 있다. 기술분야에 알려진 가교제로는 호모이기능성 물질; 글루타르알데히드, 디메틸아디피미데이트 및 비스(디아조벤지딘) 및 헤테로이기능성 물질; m 말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 및 설포-m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드를 들 수 있다.
[290] 일부 구체예에서, IgSF 컨쥬게이트의 변이체 폴리펩타이드 또는 면역조절 단백질은 이펙터 모이어티의 화학적 결합을 위한 특이적 잔기에 의해 조작될 수 있다. 기술분야에 공지인 분자의 화학적 부착에 사용되는 특이적 잔기의 예로는 리신 및 시스테인을 들 수 있다. 크로스링커는 변이체 폴리펩타이드 또는 면역조절 단백질 상에 삽입되고, 이펙터 모이어티 상에서 이용가능한 반응성 관능기에 기초하여 선택된다.
[291] IgSF 컨쥬게이트는 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조될 수도 있다. 이 경우 변이체 폴리펩타이드 또는 면역조절 단백질을 인코딩하는 DNA 서열을 이펙터 모이어티를 인코딩하는 DNA 서열에 융합시켜, 키메라 DNA 분자를 결과시킨다. 이 키메라 DNA 서열은 융합 단백질을 발현하는 숙주 세포 내로 형질감염된다. 융합 단백질은 공지기술에 따라 포 배양체로부터 회수되어 정제될 수 있다.
[292] 표지인 이펙터 모이어티를 변이체 폴리펩타이드 또는 면역조절 단백질에 결합시키는 예로는 다음 문헌에 설명된 방법들이 포함된다: Hunter, 외, Nature 144:945 (1962); David, 외, Biochemistry 13:1014 (1974); Pain, 외, J. Immunol. Meth. 40:219 (1981); Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30:407 (1982); Wensel 및 Meares, Radioimmunoimaging And Radioimmunotherapy, Elsevier, N.Y. (1983); 및 Colcher 외, "Use Of Monoclonal Antibodies As Radiopharmaceuticals For The Localization Of Human Carcinoma Xenografts In Athymic Mice", Meth. Enzymol., 121:802-16 (1986).
[293] 방사능-또는 그 밖의 표지들을 공지 방식으로 컨쥬게이트 내에 통합시킬 수 있다. 예를 들어, 상기 펩타이드는 예를 들어, 수소 대신 불소-19를 포함하는 적절한 아미노산 전구체를 이용하는 화학적 아미노삽성에 의해 합성되거나 또는 생물합성될 수 있다. 99Tc 또는 123I, 186Re, 188Re 및 111In 등의 표지를 펩타이드 내 시스테인 잔기를 통해 결합시킬 수 있다. 이트륨-90을 리신 잔기를 통해 부착시킬 수 있다. IODOGEN 방법 (Fraker 외, Biochem. Biophys. Res. Commun. 80:49-57 (1978))을 이용하여 요오드-123을 통합시킬 수 있다. 문헌 "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989)에는 그 밖의 방법들이 자세히 설명되어 있다.
[294] 변이체 폴리펩타이드 또는 면역조절 단백질과 세포독성 물질과의 컨쥬게이트는 다양한 이기능성 단백질 커플링 물질, 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC), 이미노티올란(IT), 이미도에스테르의 이기능성 유도체 (예컨대 디메틸 아디피미데이트 HCI), 활성 에스테르 (예컨대 디숙신이미딜 수베레이트), 알데하이드 (예컨대 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물 (예컨대 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대 비스(p-디아조늄벤조일)-데틸렌디아민), 디이소시아테이트 (예컨대 톨루엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 불소 화합물 (예컨대 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 이용하여 만들어질 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소는 Vitetta 외, Science 238:1098 (1987)에 설명된 방법으로 만들 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 tn아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 방사능 뉴클레오타이드를 항체에 컨쥬게이트시키기 위한 예시적인 킬레이트화제이다. 참조: 예컨대, WO94/11026. 링커는 세포에서 세포독성 약물의 방출을 용이하게 해주는 "절단가능한 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정 링커, 펩티다제-민감성 링커, 광불안정 링커, 디메틸 링커 또는 디설파이드-함유 링커 (Chari 외, Cancer Research 52:127-131 (1992); 미국특허 No. 5,208,020)를 이용할 수 있다.
[295] 본 발명의 IgSF 컨쥬게이트가 명백히 고려될 수 있으나 크로스-링커 시약을 이용하여 제조된 약물 컨쥬게이트에 한정되지 않는다: 상업적으로 구입가능한 BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 설포-EMCS, 설포-GMBS, 설포-KMUS, 설포-MBS, 설포-SIAB, 설포-SMCC, 및 설포-SMPB, 및 SVSB (숙신이미딜-(4-비닐설폰)벤조에이트)(예컨대, Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, U.S.A). 참조: 페이지 467-498, 2003-2004 Applications Handbook and Catalog.
D. 막관통 및 분비가능한 면역조절 단백질 및 조작된 세포
[296] 본 발명에 따라 면역조절 변이체 CD80 폴리펩타이드 (또는 "조작된 세포")를 발현하는 조작된 세포들이 제공된다. 일부 구체예에서, 발현된 면역조절 변이체 CD80 폴리펩타이드는 막관통 단백질이고 및 표면 발현된다. 일부 구체예에서, 발현된 면역조절 변이체 CD80 폴리펩타이드은 발현되어 세포로부터 분비된다.
1. 막관통 면역조절 단백질
[297] 일부 구체예에서, 변이체 CD80을 포함하는 면역조절 폴리펩타이드는 막 결합 단백질일 수 있다. 이하에서 더욱 자세히 설명되는 바와 같이, 면역조절 폴리펩타이드는 변이체 CD80을 포함하는 막관통 면역조절 폴리펩타이드일 수 있으며 여기에는: 적어도 하나의 친화성 변형된 IgSF 도메인 (IgV 또는 IgC)을 함유하는 엑토도메인, 막관통 도메인 및, 선택적으로 세포질 도메인이 포함된다. 일부 구체예에서, 막관통 면역조절 단백질은 림프구 (예컨대 T 세포 또는 NK 세포) 또는 항원 제시 세포의 표면을 비롯하여, 포유동물 세포와 같은 면역 세포의 표면에서 발현될 수 있다. 일부 구체예에서, 막관통 면역조절 단백질은, 예컨대: T 헬퍼 세포, 세포독성 T-세포 (또는 세포독성 T 림프구 또는 CTL), 내츄럴 킬러 T-세포, 조절 T-세포, 메모리 T-세포, 또는 감마 델타 T-세포와 같은, 포유동물 T-세포의 표면에서 발현된다. 일부 구체예에서, 포유동물 세포는 항원 제시 세포 (APC)이다. 일반적으로, 그러나 배타적이지는 않지만, 엑토도메인 (또는 "세포외 도메인")은 본 발명의 변이체 CD80의 하나 이상의 아미노산 변이(예컨대 아미노산 치환)을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 일부 구체예에서 막관통 단백질은 본 발명의 변이체 CD80의 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 엑토도메인을 포함할 것이다.
[298] 일부 구체예에서, 조작된 세포들은 막관통 단백질과 같은 막 단백질일 수 있는 막관통 면역조절 폴리펩타이드 (TIP)인 변이체 CD80 폴리펩타이드를 발현한다. 전형적인 구체에에서, 막 단백질의 엑토도메인은 본 발명에서 제공된 변이체 CD80의 세포외 도메인 또는 그의 IgSF 도메인을 포함하되 적어도 하나의 igSF 도메인에는 하나 이상의 아미노산 치환이 함유된 것이다. 본원에서 제공된 막관통 면역조절 단백질은 엑토도메인에 링크된 막관통 도메인을 추가로 함유한다. 일부 구체예에서, 막관통 도메인은 세포 상에서의 세포 표면 발현을 위해 인코딩된 단백질을 결과시킨다. 일부 구체예에서, 막관통 도메인은 엑토도메인에 직접 링크된다. 일부 구체예에서, 막관통 도메인은 하나 이상의 링커 또는 스페이서를 통해 엑토도메인에 간접 링크된다. 일부 구체예에서, 막관통 도메인은 류신 및 발린과 같은 소수성 아미노산 잔기들을 주로 함유한다.
[299] 일부 구체예에서, 조작된 T 세포와 같은 조작된 세포의 표면에서 TIPs가 발현되도록 하기 위해 전장 막관통 고정(anchor) 도메인이 사용될 수 있다. 간단하게, 이것은 천연 IgSF 단백질 (예컨대 CD80)과 유사한 방식으로 친화성 변형되어(예컨대 CD80 또는 다른 천연 IgSF 단백질), 제1 막 근위(proximal) 도메인 서열에 간단히 융합되어 있는 특정한 천연 단백질로부터 유래할 수 있다. 일부 구체예에서, 막관통 면역조절 단백질은 SEQ ID NO:1에 제시된 아미노산 서열들에 함유된 막관통 도메인과 같은, 대응하는 야생형 또는 변형되지 않은 IgSF 멤버의 막관통 도메인을 포함한다(표 2 참조). 일부 구체예에서, 막 결합 형태는 SEQ ID NO:1의 잔기 243-263에 대응하는 것과 같이, 대응하는 야생형 또는 비변형 폴리펩타이드의 막관통 도메인을 포함한다.
[300] 일부 구체예에서, 막관통 도메인은 천연 CD80의 막관통 도메인이 아닌 비-천연 막관통 도메인이다. 일부 구체예에서, 막관통 도메인은 막-결합되거나 또는 막관통 단백질인 또 다른 비-CD80 패밀리 멤버 폴리펩타이드로부터의 막관통 도메인으로부터 유래한다. 일부 구체예에서는, T 세포 상의 다른 단백질로부터의 막관통 고정 도메인이 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 막관통 도메인은 CD8로부터 유래한다. 일부 구체예에서, 막관통 도메인은 스페이서 도메인 역할을 하는 CD8의 세포외 부분을 추가로 함유할 수 있다. 예시적인 CD8 유래된 막관통 도메인이 SEQ ID NO: 246 또는 399 또는 CD8 막관통 도메인을 함유하는 그의 일부에 제시되어 있다. 일부 구체예에서, 막관통 도메인은 합성 막관통 도메인이다.
[301] 일부 구체예에서, 막관통 면역조절 단백질은 막관통 도메인에 링크된 세포질 시그널링 도메인과 같은 엔도도메인을 추가로 함유한다. 일부 구체예에서, 세포질 시그널링 도메인은 세포 시그널링을 유도한다. 일부 구체예에서, 막관통 면역조절 단백질의 엔도도메인은 SEQ ID NO:1에 제시된 아미노산 서열에 함유된 세포질 도메인과 같은, 대응하는 야생형 또는 변형되지 않은 폴리펩타이드의 세포질 도메인을 포함한다 (표 2 참조).
[302] 일부 구체예에서, 변이체 CD80이거나 이를 포함하는 제공된 막관통 면역조절 단백질은 SEQ ID NO: 253에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 나타내고 설명된 바와 같은 적어도 하나의 친화성-변형된 CD80 IgSF 도메인 및 막관통 도메인을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 막관통 면역조절 단백질은 표 1에 제시된 것들을 포함하여, 설명된 바와 같이 IgSF 도메인 (예컨대 IgV 도메인)에 하나 이상의 임의의 아미노산 치환을 함유한다. 일부 구체예에서, 막관통 면역조절 단백질은 설명된 바와 같이 세포질 도메인을 더 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 막관통 면역조절 단백질은 시그널 펩타이드를 더 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 시그널 펩타이드는 SEQ ID NO:1에 제시된 아미노산 서열에 함유된 것과 같은, 야생형 IgSF 멤버의 천연 시그널 펩타이드이다 (예컨대 표 2 참조).
[303] 이러한 막관통 면역조절 단백질들을 인코딩하는 핵산 분자도 제공된다. 일부 구체예에서, 막관통 면역조절 단백질을 인코딩하는 핵산 분자는 SEQ ID NOS: 253에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 나타내고, 설명된 바와 같은 적어도 하나의 친화성-변형된 IgSF 도메인, 및 선택적으로 세포질 도메인을 함유하는 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 시그널 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 더 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 시그널 펩타이드는 대응하는 야생형 IgSF 멤버의 천연 시그널 펩타이드이다 (예컨대 표 2 참조).
[304] 막관통 면역조절 단백질의 한 가지 예는: i) SEQ ID NO:241에 제시된 아미노산 서열 또는 ii) SEQ ID NO:241에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 나타내고 SEQ ID NO:243의 친화성-변형된 도메인 또는 아미노산 치환을 그 내부에 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 CD80 TIP이다. 또한 i) SEQ ID NO:242에 제시된 뉴클레오타이드 서열, ii) SEQ ID NO: 242에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 나타내고 SEQ ID NO:241의 친화성-변형된 도메인을 포함하는 TIP를 인코딩하는 서열, 또는 SEQ ID NO:241의 아미노산 치환을 함유하는 폴리펩타이드, 또는 iii) 축퇴 코돈을 갖는 i) 또는 ii)의 서열도 제공된다.
[305] 일부 구체예에서, 막관통 면역조절 단백질의 엔도도메인이 적어도 하나의 ITAM (면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프)-함유 시그널링 도메인을 함유하는 세포질 시그널링 도메인을 함유하는 것인 CAR-관련 막관통 면역조절 단백질이 제공된다. ITAM은 T-세포 수용체 시그널 형질도입에 관여하는 CD3-제타 사슬("CD3-z")에 포함된, 면역 세포의 시그널 형질도입에 관여하는 수 개의 단백질 시그널링 도메인에서 발견되는 보존적 모티프이다. 일부 구체예에서, 엔도도메인은 CD3-제타 시그널링 도메인에 포함된다. 일부 구체예에서, CD3-제타 시그널링 도메인은 SEQ ID NO: 333에 제시된 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 247에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 나타내고 T 세포 시그널링 활성을 유지하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, CAR-관련 막관통 면역조절 단백질의 엔도도메인은 T-세포의 면역조절 반응을 추가로 조절하기 위해 공동자극 시그널링 도메인을 더 함유한다. 일부 구체예에서, 공동자극 시그널링 도메인은 CD28, ICOS, 41BB 또는 OX40이다. 일부 구체예에서, 공동자극 시그널링 도메인은 CD28 또는 4-1BB로부터 유래되고 SEQ ID NOS: 400-403에 제시된 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO:400-403에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 나타내고 T 세포 공동자극 시그널링 활성을 보유하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, CAR-관련 막관통 면역조절 단백질은 친화성 변형된 IgSF 도메인이 동족 결합 파트너 또는 카운터 구조물에 결합시 T 세포 시그널링을 자극하는 CARs의 속성을 갖는다. 일부 구체예에서, 친화성-변형된 IgSF 도메인의 그의 카운터 구조물에 대한 특이적 결합에 의해, 세포독성, 증식 또는 사이토카인 생산의 변화에 의해 반영되느 바와 같은 T-세포 활성의 면역학적 활성의 변화가 일어날 수 있다.
[306] 일부 구체예에서, 막관통 면역조절 단백질은 세포질 시그널링을 매개할 수 있는 엔도도메인을 함유하지 않는다. 일부 구체예에서, 막관통 면역조절 단백질은 야생형 또는 변형되지 않은 폴리펩타이드의 시그널 형질도입 메카니즘을 결여하며 따라서 그 자체는 세포 시그널링을 유지하지 않는다. 일부 구체예에서, 막관통 면역조절 단백질은 SEQ ID NOS:1에 제시된 아미노산 서열에 함유된 세포질 시그널링 도메인과 같은, 대응하는 야생형 또는 변형되지 않은 폴리펩타이드의 세포내(세포질) 도메인 또는 세포내 도메인의 일부를 결여한다 (표 2 참조). 일부 구체예에서, 막관통 면역조절 단백질은 IgSF 패밀리 (예컨대 PD-1 또는 TIGIT)의 억제 수용체를 비롯한, 특정한 억제 수용체에 함유된 것과 같은 ITIM (면역수용체 티로신-기반 억제 모티프)을 함유하지 않는다. 따라서, 일부 구체예에서, 막관통 면역조절 단백질은 설명된 것과 같이 엑토도메인 및 막관통 도메인만을 함유한다.
2. 분비된 면역조절 단백질 및 조작된 세포들
[307] 일부 구체예에서, 설명된 바와 같은 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 함유하는 CD80 변이체 면역조절 폴리펩타이드는 예컨대 세포에서 발현되는 때, 분비가능하다. 이러한 변이체 CD80 면역조절 단백질은 막관통 도메인을 포함하지 않는다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 면역조절 단백질은 반감기 연장 모이어티 (예컨대 Fc 도메인 또는 멀티머화 도메인)에 컨쥬게이트되지 않는다. 일부 구체예에서, 변이체 CD80 면역조절 단백질은 시그널 펩타이드, 예컨대 항체 시그널 펩타이드 또는 세포 외부의 도메인을 획득하기 위한 다른 효과적인 시그널 서열을 포함한다. 면역조절 단백질이 시그널 펩타이드를 포함하고 조작된 세포에 의해 발현될 경우, 시그널 펩타이드는 면역조절 단백질로 하여금 조작된 세포에 의해 분비하게 한다. 일반적으로, 시그널 펩타이드 또는 시그널 펩타이드의 일부는 분비와 함께 면역조절 단백질로부터 절단된다. 면역조절 단백질은 핵산 (발현 벡터의 일부일 수 있음)에 의해 인코딩될 수 있다. 일부 구체예에서, 면역조절 단백질은 세포 (예컨대, 면역 세포, 예를 들어 일차 면역 세포)에 의해 발현 및 분비된다.
[308] 따라서, 일부 구체예에서, 시그널 펩타이드를 더 포함하는 변이체 CD80 면역조절 단백질이 제공된다. 일부 구체예에서, 본 발명에 따라 시그널 펩타이드를 인코딩하는 분비 서열에 작동적으로 연결된 변이체 CD80 면역조절 단백질을 인코딩하는 핵산 분자가 제공된다.
[309] 시그널 펩타이드는 세포로부터 면역조절 단백질의 분비를 시그널링하는 면역조절 단백질의 N-말단 상의 서열이다. 일부 구체예에서, 시그널 펩타이드는 약 5 내지 약 40 아미노산 길이 (예컨대 약 5 내지 약 7, 약 7 내지 약 10, 약 10 내지 약 15, 약 15 내지 약 20, 약 20 내지 약 25, 또는 약 25 내지 약 30, 약 30 내지 약 35, 또는 약 35 내지 약 40 아미노산 길이)이다.
[310] 일부 구체예에서, 시그널 펩타이드는 대응하는 야생형 CD80으로부터의 천연 시그널 펩타이드이다 (표 2 참조). 일부 구체예에서, 시그널 펩타이드는 비-천연 시그널 펩타이드이다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 비-천연 시그널 펩타이드는 대응하는 야생형 CD80으로부터의 돌연변이 천연 시그널 펩타이드이고, 하나 이상 (예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 이상)의 치환체 삽입 또는 결실을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 비-천연 시그널 펩타이드는 야생형 IgSF 패밀리 멤버와 동일한 IgSF 패밀리로부터의 패밀리 멤버의 시그널 펩타이드 또는 그의 돌연변이이다. 일부 구체예에서, 비-천연 시그널 펩타이드는 야생형 IgSF 패밀리 멤버와 상이한 IgSF 패밀리로부터의 패밀리 멤버의 시그널 펩타이드 또는 그의 돌연변이이다. 일부 구체예에서, 시그널 펩타이드는 비-IgSF 단백질 패밀리로부터의 시그널 펩타이드 또는 그의 돌연변이, 예컨대 면역글로불린 (예컨대 IgG 중쇄 또는 IgG-카파 경쇄)으로부터의 시그널 펩타이드, 사이토카인 (예컨대 인터류킨-2 (IL-2), 또는 CD33), 혈청 알부민 단백질 (예컨대 HSA 또는 알부민), 인간 아주로시딘 프리단백질 시그널 서열, 루시페라제, 트립시노겐 (예컨대 쿠모트립시노겐 또는 트립시노겐) 또는 세포로부터 단백질을 효과적으로 분비할 수 있는 기타 시그널 펩타이드이다. 예시적인 시그널 펩타이드가 표 6에 설명되어 있다.
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[311] 분비가능한 변이체 CD80 면역조절 단백질의 일부 구체예에서, 면역조절 단백질은 발현될 경우 시그널 펩타이드를 포함하고, 시그널 펩타이드 (또는 그의 일부)는 분비시 면역조절 단백질로부터 절단된다.
[312] 일부 구체예에서, 조작된 세포들은 세포로부터 분비된 변이체 CD80 폴리펩타이드를 발현한다. 일부 구체예에서, 이러한 변이체 CD80 폴리펩타이드는 분비를 위해 시그널 서열의 작동가능한 조절 하에서 면역조절 단백질을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된다. 일부 구체예에서, 인코딩된 면역조절 단백질은 세포로부터 발현될 때 분비된다. 일부 구체예에서, 핵산 분자에 의해 인코딩된 면역조절 단백질은 막관통 도메인을 포함하지 않는다. 일부 구체예에서, 핵산 분자에 의해 인코딩된 면역조절 단백질은 반감기 연장 모이어티 (예컨대 Fc 도메인 또는 멀티머화 도메인)을 포함하지 않는다. 일부 구체예에서, 핵산 분자에 의해 인코딩된 면역조절 단백질은 시그널 펩타이드를 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 핵산은 면역조절 단백질을 인코딩하는 핵산에 작동적으로 연결된 분비 또는 시그널 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 더 포함함으로 해서, 면역조절 단백질의 분비를 가능케 한다.
3. 세포 및 세포의 조작
[313] 본원에서 제공된 면역조절 폴리펩타이드 중 임의의 것을 발현하는 조작된 세포가 본원에 제공된다. 일부 구체예에서, 조작된 세포는 제공된 막관통 면역조절 폴리펩타이드 중 임의의 것을 그들의 표면에서 발현한다. 일부 구체예에서, 조작된 세포는 단백질의 분비에 적합한 조건 하에서 세포로부터 면역조절 단백질을 발현 및 분비할 수 있거나 또는 분비할 수 있다. 일부 구체예에서, 면역조절 단백질은 림프구 예컨대 종양 침윤 림프구 (TIL), T-세포 또는 NK 세포 또는 골수 세포에서 발현된다. 일부 구체예에서, 조작된 세포는 항원 제시 세포 (APC)이다. 일부 구체예에서, 조작된 세포는 조작된 포유동물 T-세포 또는 조작된 포유동물 항원 제시 세포 (APC)이다. 일부 구체예에서, 조작된 T 세포 또는 APC는 인간 또는 쥐 세포이다.
[314] 일부 구체예에서, 조작된 T-세포의 비제한적인 예로는, T 헬퍼 세포, 세포독성 T-세포 (또는 세포독성 T 림프구 또는 CTL), 내츄럴 킬러 T-세포, 조절 T-세포, 메모리 T-세포, 또는 감마 델타 T-세포를 들 수 있다. 일부 구체예에서, 조작된 T 세포는 CD4+ 또는 CD8+이다. MHC의 시그널에 더해, 조작된 T-세포 역시도 공동-자극 시그널을 필요로 하며, 이것은 일부 구체예에서, 이전에 논의된 바와 같은 막 결합 형태로 발현되는 변이체 CD80 막관통 면역조절 폴리펩타이드에 의해 제공된다.
[315] 일부 구체예에서, 조작된 APC에는, 예를 들어, 세포성 및 비세포성 (예컨대, 생물분해가능한 폴리머 미립자) aAPC를 모두 포함하는 인공 APC (aAPCs) 뿐만 아니라, MHC II 발현 APCs 예컨대 대식세포, B 세포, 및 수지상 세포가 포함된다. 인공 APCs (aAPCs)는 T 세포에 대해 항원을 제시하고 T 세포를 활성화시킨다는 점에서 APCs와 유사한 방식으로 작용가능한 APCs의 합성 버젼이다. 항원 제시는 MHC (클래스 I 또는 클래스 II)에 의해 수행된다. 일부 구체예에서, aAPC와 같은 조작된 APC에서, MHC 상에 로딩된 항원은, 일부 구체예에서, 종양 특이 항원 또는 종양 관련 항원이다. MHC 상에 로딩된 항원은 T 세포의 T-세포 수용체 (TCR)에 의해 인식되며, 몇몇 경우, CTLA-4 또는 CD80 또는 본 발명에 제공된 변이체 CD80 폴리펩타이드에 의해 인식되는 다른 분자들을 발현할 수 있다. aAPC를 조작하는데 사용가능한 물질로는 다음을 들 수 있다: 폴리(글리콜산), 폴리(락틱-코-글리콜산), 철-산화물, 리포좀, 지질 이중층, 세파로스 및 폴리스티렌.
[316] 일부 구체예에서, 막관통 면역조절 단백질 또는 분비가능한 면역조절 단백질과 같은 본 발명에서 제공된 면역조절 단백질은 항원-결합 수용체, 예컨대 재조합 수용체, 예컨대 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 T 세포 수용체 (TCR)를 발현하는 세포 내에서 공동발현되거나 또는 이들 세포 내로 조작된다. 일부 구체예에서, 조작된 세포, 예컨대 조작된 T 세포는 암, 염증성 및 자가면역 질환 또는 바이러스 감염과 관련된 목적 항원을 인식한다. 특정 구체예에서, 항원-결합 수용체는 종양 특이 항원 또는 종양 관련 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 모이어티를 함유한다. 일부 구체예에서, 조작된 T-세포는 항원, 예컨대 종양 특이 항원 또는 종양 관련 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 도메인 (예컨대 scFv)을 함유하는 CAR (키메라 항원 수용체) T-세포이다. 일부 구체예에서, 항원-결합 도메인 (예컨대 scFv)은 CD19에 특이적이다. 예시적인 CAR은 항-CD19 CAR, 예컨대 SEQ ID NO:245에 제시된 항-CD19 scFv을 함유하는 CAR이다. 일부 구체예에서, TIP 단백질은 조작된 T-세포 수용체 세포 또는 및 조작된 키메라 항원 수용체 세포에서 발현된다. 이러한 구체예에서, 조작된 세포는 TIP 및 CAR 또는 TCR을 공동-발현한다.
[317] 일부 구체예에서, CAR은 스페이서 또는 힌지, 막관통 도메인, 및 CD3제타 시그널링 도메인과 같은 ITAM 시그널링 도메인을 포함하는 세포내 시그널링 도메인 (엔도도메인)을 추가로 함유한다. 일부 구체예에서, CAR은 보조 자극 시그널링 도메인을 추가로 포함한다. 일부 구체 예에서, 일부 구체예에서, 스페이서 또는 힌지는 항원-결합 도메인과 막관통 도메인 사이, 예컨대 세포상에서 발현될 때항원-결합 도메인과 및 세포질 막 사이에 존재한다. 일부 구체예에서, 스페이서 또는 힌지는 IgG 서브클래스 (예컨대 IgG1 및 IgG4, IgD 또는 CD8 (예컨대, Qin 외 (2017) J. Hematol. Oncol., 10:68 참조)로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 스페이서 또는 힌지는 IgG1로부터 유래한다.
[318] 일부 구체예에서, 스페이서 및 막관통 도메인은 SEQ ID NO: 246 또는 399에 제시된 서열 또는 SEQ ID NO:332 또는 364에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열과 같이 CD8로부터 유래된 힌지 및 막관통 도메인이다. 일부 구체예에서, 엔도도메인은 at CD3-제타 시그널링 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, CD3-제타 시그널링 도메인은 SEQ ID NO: 247에 제시된 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO:247에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 나타내고 T 세포 시그널링 활성을 보유하는 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, CAR-관련 막관통 면역조절 단백질의 엔도도메인은 T 세포의 면역조절 반응을 더 조절하기 위해 공동자극 시그널링 도메인을 더 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 공동자극 시그널링 도메인은 CD28, ICOS, 41BB 또는 OX40이다. 일부 구체예에서, 공동자극 시그널링 도메인은 CD28 또는 4-1BB로부터 유래하고 SEQ ID NOS: 400-403에 제시된 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO:400-403에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 나타내고T 세포 공동자극 시그널링 활성을 보유하는 아미노산 서열을 포함한다..
[319] 또 다른 구체예에서, 조작된 T-세포는 재조합 또는 조작된 TCR을 비롯한 TCR을 갖는다. 일부 구체예에서, TCR은 천연 TCR일 수 있다. 통상의 기술자라면 일반적으로 천연 포유동물 T-세포 수용체가 항원 특이적 인식 및 결합과 연루된 알파 및 베타 사슬(또는 감마 및 델타 사슬)을 포함한다는 것을 인식할 것이다. 일부 구체예에서, TCR은 변형된 조작된 TCR이다. 일부 구체예에서, 조작된 T 세포의 TCR은 APC에 의해 제시된 종양 관련되거나 종양 특이적인 항원에 특이적으로 결합한다.
[320] 일부 구체예에서, 면역조절 폴리펩타이드, 예컨대 막관통 면역조절 폴리펩타이드 또는 분비가능한 면역조절 폴리펩타이드는, 재조합 숙주 세포의 경우 사용되는 것과 같은 다양한 전략에 의해, 조작된 세포, 예컨대 조작된 T 세포 또는 조작된 APC 내로 통합될 수 있다. DNA 작제물을 일차 T 세포 내로 도입하기 위한 다양한 방법이 기술분야에 알려져 있다. 일부 구체예에서, 바이러스 형질도입 또는 플라스미드 전기천공이 사용된다. 전형적인 구체예에서, 발현 벡터. 또는 면역조절 단백질을 인코딩하는 핵산 분자는 발현된 막관통 면역조절 단백질을 세포막에 국소화시키거나 또는 분비시키는 시그널 펩타이드를 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 막관통 면역조절 단백질을 인코딩하는 핵산을 레트로바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터 내로 서브-클로닝하여, 숙주 포유동물 세포에서 발현시킨다. 발현 벡터는 포유동물 숙주 세포 내로 삽입될 수 있고, 숙주 세포 배양 조건 하에서, 면역조절 단백질은 표면 상에서 발현되거나 또는 분비된다.
[321] 예시적인 한 가지 예에서, 일차 T-세포는 생체외에서 정제되어(CD4 세포 또는 CD8 세포 또는 양자 모두) 다양한 TCR/CD28 아고니스트, 예컨대 항-CD3/항-CD28 코팅된 비드로 구성된 활성화 프로토콜에 의해 자극될 수 있다. 2일 또는 3일 활성화 프로세스 후, 면역조절 폴리펩타이드를 함유하는 재조합 발현 벡터를 표준 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 형질도입 프로토콜 또는 플라스미드 전기천공 전략을 통해 일차 T 세포 내로 안정하게 도입시킬 수 있다. 세포들을 예컨대 변이체 CD80를 포함하는 천연 부모 분자 및 폴리펩타이드와 교차-반응하는 항체 또는 항-에피토프 태그를 이용하는 유세포 분석법에 의해, 면역조절 폴리펩타이드 발현에 대해 모니터링할 수 있다. 면역조절 폴리펩타이드를 발현하는 T-세포들은 항-에피토프 태그 항체를 이용한 소팅을 통해 농축되거나 또는 용도에 따라 고발현 또는 저발현을 위해 농축될 수 있다.
[322] 면역조절 폴리펩타이드 발현시, 조작된 T-세포를 다양한 수단에 의해 적절한 기능에 대해 분석할 수 있다. 조작된 CAR 또는 TCR 공동-발현을 검정하여 조작된 T 세포의 이 부분이 면역조절 단백질의 발현에 의해 유의적으로 영향을 받지 않았음을 입증할 수 있다. 일단 검정되면, 표준 시험관내 세포독성, 증식 또는 사이토카인 분석(예컨대, IFN-감마 발현)을 이용하여, 조작된 T-세포의 기능을 평가할 수 있다. 예시적인 표준 엔드포인트는 종양 세포주의 용해 백분율, 조작된 T-세포의 증식 또는 배양 상등액 중 IFN-감마 단백질 발현이다. 대조군 작제물에 비해 종양 세포주의 통계적으로 유의한 증가된 용해, 조작된 T-세포의 증가된 증식 또는 증가된 IFN-감마 발현을 야기하는 조작된 작제물을 선택할 수 있다. 또한, 조작되지 않은, 예컨대 천연 일차 또는 내인성 T-세포 역시도 동일한 시험관내 분석으로 처리하여, 조작된 T-세포와 같은 조작된 세포에서 발현되는 면역조절 폴리펩타이드 작제물의 활성을 조절하는 능력, 예컨대 일부 사례에서 바이스탠더, 천연 T-세포에서 이펙터 기능을 활성화 및 생성하는 능력을 측정할 수 있다. CD69, CD44, 또는 CD62L와 같은 활성화 마커의 증가된 발현이 내인성 T 세포에서 모니터링될 수 있고, 증가된 증식 및/또는 사이토카인 생산은 조작된 T 세포에서 발현된 면역조절 단백질의 목적하는 활성을 가리키는 것일 수 있다.
[323] 일부 구체예에서, 유사한 분석법을 이용하여 CAR 또는 TCR을 단독으로 함유하는 조작된 T 세포의 기능과 CAR 또는 TCR 및 TIP 작제물을 함유하는 것들의 기능을 비교할 수 있다. 전형적으로, 이러한 시험관내 분석법은 동족체 CAR 또는 TCR 항원을 함유하는 "종양" 세포주 및 조작된 T 세포를 배양체에 다양한 비율로 플레이팅함으로써 수행된다. 표준 종말점은 종양 세포의 용해 백분율, 조작된 T 세포의 증식 또는 배양 상등액 중의 IFN-감마 생산이다. 통계적으로 유의하게 증가된 종양 세포주의 용해, 조작된 T 세포의 증가된 증식, 또는 동일한 TCR 또는 CAR 작제물 단독으로 증가된 IFN-감마 생산을 위한 조작된 면역조절 단백질이 선택될 수 있다. 조작된 인간 T 세포는 마우스 T, NK 및 B 세포가 결핍된 NSG 균주와 같은 면역저하(immunocompromised) 마우스에서 분석될 수 있다. CAR 또는 TCR이 이종 이식물의 표적 카운터-구조에 결합하고 TIP 친화성 변형된 IgSF 도메인과 공동-발현되는 조작된 인간 T 세포는 이종 이식과 비교하여 상이한 세포 수 및 비율로 생체 내에서 입양전달될 수 있다. 예를 들어, 루시퍼라제/GFP 벡터를 포함하는 CD19+ 백혈병 종양 세포주의 생착(engraftment)은 생물발광 또는 유세포 측정법을 통해 모니터링될 수있다. 일반적인 구체예에서, 이종 이식편을 쥐 모델에 도입한 다음 며칠 후에 조작된 T 세포를 도입한다. 면역조절 단백질을 포함하는 조작된 T 세포를, CAR 또는 TCR만을 단독 함유 하는 조작된 T 세포와 비교하여 증가된 생존, 종양 제거 또는 확장된 조작된 T 세포 수에 대해 분석할 수 있다. 시험관내 분석에서와 같이, 내인성, 천연 (즉, 비-조작된) 인간 T 세포는 그 집단에서 성공적인 에피토프 확산을 찾아보기 위해 공동-입양전달되어, 보다 나은 생존 또는 종양 제거를 결과시킨다.
E. 다양한 폴리펩타이드 및 면역조절 단백질을 발현하는 감염 물질
[324] 또한, 본원에 기재된 분비성 또는 막관통 면역조절 단백질을 포함하는 CD80 vIgD 폴리펩티드와 같은 임의의 변이체 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 함유하는 감염 물질이 제공된다. 일부 구체예에서, 이러한 감염 물질은 CD80 vIgD 폴리펩티드와 같은 본원에 기술된 변이체 면역조절 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 대상자 내 표적 세포, 예컨대 대상자 내 면역 세포 및/또는 항원 제시 세포 (APC) 또는 종양 세포에 전달할 수 있다. 또한 이러한 감염 물질에 함유된 핵산, 및/또는 그러한 감염 물질의 생성 또는 변형을 위한 핵산, 예컨대 이러한 감염 물질을 함유하는 벡터 및/또는 플라스미드, 및 조성물도 제공된다.
[325] 일부 구체예에서, 감염 물질은 미생물이다. 일부 구체예에서, 감염 물질은 바이러스 또는 세균이다. 일부 구체예에서, 감염 물질은 바이러스이다. 일부 구체예에서, 감염 물질은 세균이다. 일부 구체예에서, 이러한 감염 물질은 본원에 기재된 분비성 또는 막관통 면역조절 단백질을 포함하는 CD80 vIgD 폴리펩타이드와 같은 임의의 변이체 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 전달할 수 있다. 따라서, 일부 구체예에서, 감염 물질에 의해 감염되거나 접촉된 대상자의 세포는 변이체 면역조절 폴리펩타이드를 세포 표면에 발현시키거나 분비할 수 있다. 일부 구체예에서, 감염 물질은 또한 세포 및/또는 대상자 내 환경에 다른 치료제 또는 다른 치료제를 인코딩하는 핵산을 전달할 수 있다. 일부 구체예에서, 감염 물질에 의해 전달가능한 다른 치료제는 사이토카인 또는 다른 면역조절 분자를 포함한다.
[326] 일부 구체예에서, 감염 물질, 예컨대, 바이러스 또는 세균은 본원에 설명된, 분비성 또는 막관통 면역조절 단백질을 비롯하여, CD80 vIgD 폴리펩타이드와 같은, 임의의 변이체 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하며, 대상자 내 세포와 접촉 및/또는 감염에 의해, 상기 세포는 감염 물질에 함유된 핵산 서열에 의해 인코딩된, 분비성 또는 막관통 면역조절 단백질을 비롯한, CD80 vIgD 폴리펩타이드와 같은, 변이체 폴리펩타이드를 발현한다. 일부 구체예에서, 감염 물질은 대상자에게 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 대상자로부터의 세포는 감염 물질에 의해 생체외 형질도입될 수 있다.
[327] 일부 구체예에서, 감염 물질에 의해 감염된 세포에 의해 발현되는, 막관통 면역조절 단백질을 비롯한 CD80 vIgD 폴리펩타이드와 같은 변이체 폴리펩타이드는 막관통 단백질이고 표면 발현된다. 일부 구체예에서, 변이체 폴리펩타이드, 예컨대감염 물질에 의해 감염된 세포에 의해 발현된 분비가능한 면역조절 단백질을 비롯하여 CD80 vIgD 폴리펩타이드는, 발현되어 세포로부터 분비된다. 막관통 면역조절 단백질 또는 분비된 면역조절 단백질은 설명된 임의의 것일 수 있다.
[328] 일부 구체예에서, 감염 물질에 의해 표적화된 대상자 내 세포에는 종양 세포, 면역 세포, 및/또는 항원-제시 세포 (APC)가 포함된다. 일부 구체예에서, 감염 물질은 종양 미세환경 (TME) 내 세포를 표적화한다. 일부 구체예에서, 감염 물질은 분비성 또는 막관통 면역조절 단백질을 비롯하여, CD80 vIgD 폴리펩타이드와 같은 변이체 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을, 목적하는 효과, 예컨대 면역조절 및/또는 특이적인 세포-매개된 면역 반응, 예컨대 CD4 및/또는 CD8 T 세포 반응 (여기서 상기 CD8 T 세포 반응은 세포독성 T 세포 (CTL) 반응을 포함할 수 있음)을 유도 및/또는 개시하는 적절한 세포(예를 들어, APC, 예컨대 수지상 세포와 같이, 그 세포 표면에서 펩타이드/MHC 복합체를 나타내는 세포) 또는 조직 (예컨대, 림프구 조직)으로 전달한다. 일부 구체예에서, 감염 물질은 APC, 예컨대 수지상 세포 (DC)를 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 본원에 설명된 감염 물질에 의해 전달되는 핵산 분자는 예컨대 프로모터와 같은 조절 요소, 특정 표적 세포에서, 변이체 면역조절 폴리펩타이드르르 인코딩하는 작동적으로 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 적절한 핵산 서열을 포함한다.
[329] 일부 구체예에서, 면역조절 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열을 함유하는 감염 물질은 예컨대, 사이토카인, 전구약물 전환 효소, 세포독소 및/또는 검출가능한 유전자 산물과 같이, 하나 이상의 부가적인 유전자 산물을 인코딩하는 핵산 서열도 함유할 수 있다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 감염 물질은 항암 바이러스이고 상기 바이러스는 부가적인 치료적 유전자 산물을 인코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있ekk (참조: 예컨대 Cancer 9:64-71; Garcia-Aragoncillo 외, (2010) Curr Opin Mol Ther 12:403-411; 미국특허 Nos. 7,588,767, 7,588,771, 7,662,398 및 7,754,221 및 미국특허 Publ. Nos. 2007/0202572, 2007/0212727, 2010/0062016, 2009/0098529, 2009/0053244, 2009/0155287, 2009/0117034, 2010/0233078, 2009/0162288, 2010/0196325, 2009/0136917 및 2011/0064650 참조). 일부 구체예에서, 부가적인 유전자 산물은 면역 반응을 개시 또는 촉진 또는 조절할 수 있는 유전자 산물 또는 표적 세포 (예컨대, 종양 세포)의 사멸을 결과시킬 수 있는 치료적 유전자 산물일 수 있다(예컨대, 사이토카인). 예시적인 유전자 산물은 또한 항암제, 항대사제, 항혈관형성 제, 면역조절 분자, 면역 체크포인트 억제제, 항체, 사이토 카인, 성장 인자, 항원, 세포독성 유전자 산물, 프로-아폽토시스 산물, 항-아폽토시스 유전자 산물, 세포 매트릭스 분해 유전자, 조직 재생 및 인간 체세포를 다능성으로 재 프로그램하기 위한 유전자, 및 본원에 기술되거나 당업자에게 공지된 다른 유전자를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 추가의 유전자 산물은 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF)이다.
1. 바이러스
[330] 일부 구체예에서, 감염 물질은 바이러스이다. 일부 구체예에서, 감염 물질은 항암 바이러스, 또는 면역 세포와 같은 특정 세포를 표적화하는 바이러스이다. 일부 구체예에서, 감염 물질은 대상자 내 종양 세포 및/또는 암 세포를 표적화한다. 일부 구체예에서, 감염 물질은 면역 세포 또는 항원-제시 세포 (APC)를 표적화한다.
[331] 일부 구체예에서, 감염 물질은 항암 바이러스이다. 종양용해성 바이러스는 종양 세포에 축적되어 종양 세포에서 복제되는 바이러스이다. 세포에서의 복제 및 본원에 기술된 변이체 면역조절 변이체 CD80 폴리펩타이드 또는 면역조절 단백질을 인코딩하는 핵산의 선택적 전달에 의해, 종양 세포가 용해되고 종양이 수축되어 제거될 수 있다. 종양 용해성 바이러스는 또한 광범위한 숙주 및 세포 유형 범위를 가질 수 있다. 예를 들어, 항암 바이러스는 종양 및/또는 전이를 포함하는 면역특발성 세포 또는 면역특발성 조직에 축적될 수 있고, 또한 상처 조직 및 세포를 포함하여, 본원에 기재된 변이체 면역조절 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 광범위한 세포 유형에서 전달 및 발현시킬 수 있다. 종양용해 바이러스는 도한 종양 세포 특이적 방식으로 복제되어, 종양세포 용해 및 효율적인 종양 퇴화를 야기할 수도 있다.
[332] 예시적인 항암 바이러스로는 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 바이러스, 대상포진 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 레오바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 파보바이러스, 홍역 바이러스, 수포성 구내염 바이러스 (VSV), 콕사키 바이러스 및 백시니아 바이러스를 들 수 있다. 일부 구체예에서, 항암 바이러스는 고형 종양은 특이적으로 콜로니화할 수 있지만, 다른 장기는 감염시키지 않아, 본원에 설명된 변이체 면역조절 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 그러한 고형 종양에 전달하기 위한 감염 물질로서 사용가능하다.
[333] 본원에 설명된 변이체 CD80 폴리펩타이드 또는 면역조절 단백질을 인코딩하는 핵산을 전달하는데 사용가능한 종양분해 바이러스는, 기술분야에 알려진 임의의 것일 수 있고 예컨대 수포성 구내염 바이러스가 이에 포함된다. 예컨대, 미국특허 Nos. 7,731,974, 7,153,510, 6,653,103 및 미국특허 Pub. Nos. 2010/0178684, 2010/0172877, 2010/0113567, 2007/0098743, 20050260601, 20050220818 및 EP Pat. Nos. 1385466, 1606411 및 1520175; 단순포진 바이러스, (예컨대, 미국특허 Nos. 7,897,146, 7,731,952, 7,550,296, 7,537,924, 6,723,316, 6,428,968 및 미국특허 Pub. Nos., 2014/0154216, 2011/0177032, 2011/0158948, 2010/0092515, 2009/0274728, 2009/0285860, 2009/0215147, 2009/0010889, 2007/0110720, 2006/0039894, 2004/0009604, 2004/0063094, 국제특허공개 Nos., WO 2007/052029, WO 1999/038955; 레트로바이러스, 참조: 예컨대, 미국특허 Nos. 6,689,871, 6,635,472, 5,851,529, 5,716,826, 5,716,613 및 미국특허 Pub. No. 20110212530; 백시니아 바이러스, 참조, 예컨대, 2016/0339066, 및 아데노-관련 바이러스, 예컨대, 미국특허 Nos. 8,007,780, 7,968,340, 7,943,374, 7,906,111, 7,927,585, 7,811,814, 7,662,627, 7,241,447, 7,238,526, 7,172,893, 7,033,826, 7,001,765, 6,897,045, 및 6,632,670 참조.
[334] 종양 용해성 바이러스는 또한 병독성을 약화시키고, 그의 안전성 프로파일을 향상시키며, 종양 특이성을 향상시키도록 유전적으로 변형된 바이러스를 포함하며, 이들은 또한 세포 독소, 사이토카인, 전구약물 전환 효소 등의 추가 유전자를 갖춤으로 해서 바이러스의 전반적인 효능이 증강된다(참조: 예컨대, Kirn 외, (2009) Nat Rev Cancer 9:64-71; Garcia-Aragoncillo 외, (2010) Curr Opin Mol Ther 12:403-411; 참조 미국특허 Nos. 7,588,767, 7,588,771, 7,662,398 및 7,754,221 및 미국특허 Publ. Nos. 2007/0202572, 2007/0212727, 2010/0062016, 2009/0098529, 2009/0053244, 2009/0155287, 2009/0117034, 2010/0233078, 2009/0162288, 2010/0196325, 2009/0136917 및 2011/0064650). 일부 구체예에서, 항암 바이러스는 암 세포에서 선택적으로 복제됨으로 해서 종양용해성이 되도록 변형된 것들일 수도 있다. 예를 들어, 종양용해성 바이러스는 종양 치료법 및 유전자 치료법으로 변형된 방향성을 갖도록 조작된 아데노바이러스이다. 이러한 예로는 ONYX-015, H101 및 Ad5ΔCR (Hallden and Portella (2012) Expert Opin Ther Targets, 16 : 945-58) 및 TNFerade (McLoughlin 외 (2005) Ann. Surg. Oncol., 12 : 825-30), 또는 조건부로 복제가능한 아데노 바이러스 Oncorine®를 들 수 있다.
[335] 일부 구체예에서, 감염 물질은 변형된 단순포진 바이러스이다. 일부 구체예에서, 감염 물질은 본원에 설명된 변이체 CD80 폴리펩타이드 또는 면역조절 단백질과 같이, 본원에 설명된 임의의 변이체 면역조절 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 함유하도록 변형된, Talimogene laherparepvec의 변형된 버젼이다. (T-Vec, Imlygic 또는 OncoVex GM-CSF로도 알려짐). 일부 구체예에서, 감염 물질은 예컨대, WO 2007/052029, WO 1999/038955, US 2004/0063094, US 2014/0154216에 설명되어 있는 변형된 단순포진 바이러스, 또는 그의 변이체이다.
[336] 일부 구체예에서, 감염 물질은 바이러스가 투여된 대상자에서 특정한 세포 유형을 표적화하는 바이러스, 예컨대 면역 세포 또는 항원-제시 세포 (APCs)를 표적화하는 바이러스이다. 수지상 세포 (DCs)는 면역 반응의 개시 및 제어에 필수적인 APC이다. DC는 항원을 포획 및 프로세싱할 수 있고, 말초에서 임파선 기관으로 이동하여 주요조직적합 복합체 (MHC)-제한된 방식으로 휴지 T 세포에 항원을 제시할 수 있다. 일부 구체예에서, 감염 물질은 DC에서 발현을 위한 변이체 CD80 폴리펩타이드 또는 면역조절 단백질을 인코딩하는 핵산을 전달하도록 DC를 특이으로 표적화할 수 있는 바이러스이다. 일부 구체예에서, 바이러스는 렌티바이러스 또는 그의 변이체이다. 일부 구체예에서, 바이러스는 DC와 같은 세포 표면 마커 수지상 세포-특이적 세포간 부착 분자-3 포획(grabbing) 비-인테그린 (DC-SIGN)을 발현하는 세포에 효과적으로 결합하여 생산적으로 감염시키기 위해 슈도타이프된 렌티바이러스이다. 일부 구체예에서, 바이러스는 WO 2013/149167에 설명된 것과 같은, 신드비스 바이러스 E2 당단백질에 의해 슈도타이프된 렌티바이러스이다. 일부 구체예에서, 바이러스는 DC에 관심 서열 (예를 들어, 본원에 기재된 변이체 CD80 폴리펩타이드 또는 면역조절 단백질을 인코딩하는 핵산)의 전달 및 발현을 허용한다. 일부 구체예에서, 바이러스는 WO 2008/011636 또는 US 2011/0064763에 기재된 것들, 또는 그의 변이체를 포함한다.
2. 세균(Bacteria)
[337] 일부 구체예에서, 감염 물질은 세균이다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 세균은 본 명세서에 설명된 변이체 면역조절 폴리펩타이드, 예컨대, 변이체 CD80 폴리펩타이드 또는 면역조절 단백질을 인코딩하는 핵산을 종양 세포, 면역 세포, 항원-제시 세포 및/또는 식세포 등 대상자 내 표적 세포에 전달할 수 있다. 일부 구체예에서, 세균은 변이체 면역조절 폴리펩타이드의 발현을 위한 환경에서 표적 특이 세포로의 표적화 및/또는 변이체 면역조절 폴리펩타이드의 발현 및/또는 분비를 위해, 종양 미세환경(TME)와 같은, 대상자 내 특이적 환경으로 바람직하게 표적화될 수 있다.
[338] 일부 구체예에서, 세균은 플라스미드 DNA의 세균-매개 전달을 통해 핵산을 포유동물 세포에 전달한다 (세균감염(bactofection)이라고도 함). 예를 들어, 일부 구체예에서, 유전자 물질의 전달은 표적 세포로의 세균 전체의 유입을 통해 달성된다. 일부 구체예에서, 자발적 또는 유도된 세균 용해(bacterial lysis)는 후속적인 진핵세포 발현을 위한 플라스미드 방출로 이어질 수 있다. 일부 구체예에서, 세균은 핵산을 비-식세포성 포유동물 세포(예컨대 종양 세포), 및/또는 식세포, 컨대 특정 면역 세포 및/또는 APC로 전달할 수 있다. 일부 구체예에서, 세균에 의해 전달된 핵산은 발현을 위한 대상자의 세포핵으로 전달될 수 있다. 일부 구체예에서, 핵산은 특정 숙주 세포에서, 변이체 면역조절 폴리펩타이드를 인코딩하는 작동가능하게 연결된 서열, 예컨대 프로모터 또는 인핸서와 같은 조절 요소의 발현에 필요한 적절한 핵산 서열도 포함한다. 일부 구체예에서, 세균인 감염 물질은 면역조절 단백질을 인코딩하는 핵산을, 예컨대, 표적 세포에 의한 번역을 위해 표적 세포의 세포질에 전달된 미리 만들어진 번역-능력 RNA와 같은 RNA의 형태로 전달할 수 있다.
[339] 일부 구체예에서, 세균은 예컨대 종양 세포와 같은 표적 세포를 복제 및 용해시킬 수 있다. 일부 구체예에서, 세균은 핵산 서열 및/또는 유전자 산물을 함유하거나 및/또는 표적 세포의 세포질에 방출할 수 있으므로, 종양 세포와 같은 표적 세포를 사멸시킬 수 있다. 일부 구체예에서, 감염 물질은 예컨대, 종양 미세환경 (TME)과 같은 대상자 내의 특정 환경에서 특이적으로 복제할 수 있다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 세균은 혐기성 또는 저산소 미세환경에서 특이적으로 복제가능하다. 일부 구체예에서, 특정 환경에 존재하는 조건 또는 인자들, 예컨대 TME 내의 세포에 의해 생산되는 아스파테이트, 세린, 시트레이트, 리보스 또는 갈락토스는 그 환경으로 세균을 유인하는 화학유인제로서 작용할 수 있다. 일부 구체예에서, 세균은 예컨대, TME와 같은 환경에서 본 발명의 면역조절 단백질을 발현 및/또는 분비할 수 있다.
[340] 일부 구체예에서, 감염 물질은 리스테리아 종, 비피도박테리움 종, 대장균 종, 클로스트리듐 종, 살모넬라 종, 시겔라 종, 비브리오 종 또는 예르시니아 종인 세균이다. 일부 구체에에서, 세균은 리스테리아 모노시토겐스, 살모넬라 타이피뮤리움, 살모넬라 콜레라스위스, 대장균, 비브리오 콜레라, 클로스트리듐 퍼프린겐스, 클로스트리듐 부티리쿰, 클로스트리듐 노비이, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰, 비피도박테리움 인판티스, 비피도박테리움 롱엄 및 비피도벡티리움 아돌레센티스 중 하나 이상으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 세균은 조작된 세균이다. 일부 구체예에서, 세균은 예컨대 문헌 [Seow 및 Wood (2009) Molecular Therapy 17(5):767-777; Baban 외 (2010) Bioengineered Bugs 1:6, 385-394; Patyar 외 (2010) J Biomed Sci 17:21; Tangney 외 (2010) Bioengineered Bugs 1:4, 284-287; van Pijkeren 외 (2010) Hum Gene Ther. 21(4):405-416; WO 2012/149364; WO 2014/198002; US 9103831; US 9453227; US 2014/0186401; US 2004/0146488; US 2011/0293705; US 2015/0359909 및 EP 3020816]에 설명된 것과 같은 조작된 세균이다. 세균은 본원에서 제공된 변이체 면역조절 폴리펩타이드, 컨쥬게이트 및/또는 융합체를 인코딩하는 핵산 서열을 대상자에 전달하도록, 및/또는 이러한 변이체 면역조절 폴리펩타이드를 대상자에서 발현하도록 변형될 수 있다.
F. 폴리펩타이드 또는 세포 생산을 위한 핵산, 벡터 및 방법
[341] 본 발명에 따라 본 발명에서 제공된 변이체 CD80 폴리펩타이드 또는 면역조절 폴리펩타이드의 다양한 임의의 구체예들을 인코딩하는, "핵산"이라 통칭되는 단리된 핵한 또는 재조합 핵산이 제공된다. 일부 구체예에서, 본 발명에서 제공된 핵산은 후술하는 것들을 비롯하여, 본 발명에서 제공된 변이체 CD80 폴리펩타이드 또는 면역조절 폴리펩타이드의 재조합적 생산(예컨대, 발현)에 유용하다. 일부 구체예에서, 본원에서 제공된 핵산은 후술하는 것들을 비롯하여, 본 발명에서 제공된 변이체 CD80 폴리펩타이드 또는 면역조절 폴리펩타이드를 세포, 예컨대 조작된 세포, 예컨대 면역 세포, 또는 감염 물질 세포에서 발현하는데 유용하다. 본 발명에 따라 제공되는 핵산은 RNA 형태 또는 DNA 형태일 수 있고, 여기에는 mRNA, cRNA, 재조합 또는 합성 RNA 및 DNA, 및 cDNA가 포함된다. 본원에서 제공된 핵산은 일반적으로 DNA 분자이고 대체로 이중-가닥 DNA 분자이다. 그러나, 단일-가닥 DNA, 단일-가닥 RNA, 이중-가닥 RNA 및 하이브리드 DNA/RNA 핵산 또는 본 발명의 임의의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 이의 조합 역시도 제공된다.
[342] 또한 본원에서 제공된 변이체 CD80 폴리펩타이드 또는 면역조절 폴리펩타이드를 생산하는데 유용한 재조합 발현 벡터 및 재조합 숙주 세포도 제공된다.
[343] 또한 제공된 핵산 분자 또는 인코딩된 변이체 CD80 폴리펩타이드 또는 면역조절 폴리펩타이드 중 어느 하나, 예컨대 막관통 면역조절 폴리펩타이드 또는 분비가능한 면역조절 폴리펩타이드 중 어느 하나를 함유하는 조작된 세포, 예컨대 조작된 면역 세포도 제공된다.
[344] 또한 제공된 핵산 분자 또는 인코딩된 변이체 CD80 폴리펩타이드 또는 면역조절 폴리펩타이드 중 어느 하나, 예컨대 막관통 면역조절 폴리펩타이드 또는 분비가능한 면역조절 폴리펩타이드 중 어느 하나를 함유하는 감염 물질, 예컨대 세균 또는 바이러스 세포도 제공된다.
[345] 전술한 임의의 구체예에서, 본 발명에 제공된 면역조절 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산은 재조합 DNA 및 클로닝 기술을 이용하여 세포 내로 도입될 수 있다. 이를 위해, 면역조절 폴리펩타이드를 인코딩하는 재조합 DNA 분자를 작제한다. 이러한 DNA 분자를 제조하는 방법은 기술분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 펩타이드를 코딩하는 서열을 적절한 제한 효소를 이용하여 DNA로부터 잘라낼 수 있다. 별법으로, DNA 분자는 포스포르아미다이트법과 같은 화학 합성 기술을 이용하여 합성될 수 있다. 또한, 이러한 기술들을 조합 사용할 수도 있다. 일부 사례에서, 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 통해 재조합 또는 합성 핵산을 생성할 수 있다. 일부 구체예에서, 제공된 설명에 따라 적어도 하나의 친화성-변형된 IgSF 도메인 및 일부 구체예에서, 시그널 펩타이드, 막관통 도메인 및/또는 엔도도메인을 함유하는 하나 이상의 변이체 CD80 폴리펩타이드를 인코딩하는 DNA 삽입물이 생성될 수 있다. 이 DNA 삽입물은 당업자에게 공지된 바와 같이 적절한 형질도입/형질감염 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 또한, 이들 핵산 분자를 함유하는 발현 벡터도 제공된다.
[346] 일부 구체예에서, 발현 벡터는 단백질의 발현에 적합한 조건 하에서 적절한 세포내에서 면역조절 단백질을 발현할 수 있다. 일부 측면에서, 핵산 분자 또는 발현 벡터는 적절한 발현 조저러 서열에 작동적으로 연결된 면역조절 단백질을 인코딩하는 DNA 분자를 포함한다. DNA 분자 벡터 내 삽입 전 또는 후에 이러한 작동 연결을 수행하는 방법은 잘 알려져 있다. 발현 조절 서열에는 프로모터, 액티베이터, 인핸서, 오퍼레이터, 리보좀 결합 부위, 개시 시그널, 종결 시그널, 캡(cap) 시그널, 폴리아데닐화 시그널 및 전사 또는 번역 제어와 관련된 시그널이 포함된다.
[347] 일부 구체예에서, 면역조절 단백질의 발현은 발현을 제어 도는 조절하기 위해 프로모터 또는 인핸서에 의해 조절된다. 프로모터는 변이체 폴리펩타이드 또는 면역조절 단백질을 인코딩하는 핵산 분자의 일부분에 작동적으로 연결된다. 일부 구체예에서, 프로모터는 구성적 활성 프로모터(constitutively active promotor)이다 (예컨대 조직-특이적인 구성적 활성 프로모터 도는 그 밖의 구성 프로모터). 일부 구체예에서, 프로모터는 유도 물질(예컨대 T 세포 활성화 시그널)에 대해 응답할 수 있는 유도성 프로모터이다.
[348] 일부 구체예에서, 구성 프로모터는 변이체 폴리펩타이드 또는 면역조절 단백질을 인코딩하는 핵산 분자에 작동적으로 연결된다. 대표적인 구성 프로모터에는 SV(Simian vacuolating) 바이러스 40 (SV40) 프로모터, CMV 프로모터, UbC 프로모터 및 EF-1 알파 프로모터가 포함된다. 일부 구체예에서, 구성 프로모터는 조직 특이적이다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 프로모터는 면역 세포, 림프구 또는 T 세포와 같은 특정 조직에서 면역조절 단백질의 구성적 발현을 허용한다. 예시적인 조직 특이 적 프로모터는 미국특허 No. 5,998,205에 설명되어 있고, 예를 들어, 태아(feto)단백질, DF3, 티로시나제, CEA, 계면활성제 단백질, 및 ErbB2 프로모터가 이에 포함된다.
[349] 일부 구체예에서, 유도가능한 프로모터는 변이체 폴리펩타이드 또는 면역조절 단백질을 인코딩하는 핵산 분자에 작동적으로 연결되어 적절한 전사 인듀서의 존재 또는 부재를 조절함으로써 핵산의 발현을 제어할 수 있다. 예를 들어, 프로모터는 예컨대 공개된 테트라사이클린-조절된 시스템 또는 기타 조절가능한 시스템 (예컨대 공개된 국제 PCT Appl. No. WO 01/30843)에서와 같은 조절된 프로모터 및 전사인자 발현 시스템일 수 있어, 인코딩된 폴리펩타이드의 발현을 제어하는 것이 가능하다. 예시적인 조절가능한 프로모터 시스템은 예를 들어, Clontech사 (Palo Alto, CA)로부터 입수가능한 Tet-On (및 Tet-Off) 시스템이다. 이 프로모터 시스템은 테트라사이클린 또는 테트라사이클린 유도체 예컨대 독시사이클린에 의해 조절되는 형질전환 유전자의 조절된 발현을 허용한다. 다른 조절 가능한 프로모터 시스템이 공지되어 있다 (예를 들어, 리간드 결합 도메인 및 전사 조절 도메인 (예컨대 호르몬 수용체의 도메인)을 함유하는 유전자 스위치에 대해 설명하고 있는, 공개된 미국특허출원 No. 2002-0168714, 명칭: "단일 사슬, 모노머, 리간드 의존성 폴리펩타이드 스위치를 이용한 유전자 발현의 조절" 참조).
[350] 일부 구체예에서, 프로모터는 T-세포 활성화 시그널링에 반응하는 요소에 반응성이다. 오로지 예시 목적의 일부 구체에에서, 조작된 T 세포는 면역조절 단백질 및 상기 면역조절 단백질의 발현을 제어하기 위해 작동적으로 연결된 프로모터를 인코딩하는 발현 벡터를 포함한다. 조작된 T　세포는 예컨대 조작된 T 세포 수용체 (TCR) 또는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 통한 시그널링에 의해 활성화되고, 그에 의해 반응성 프로모터를 통한 면역조절 단백질의 발현 및 분비가 촉발된다.
[351] 일부 구체예에서, 유도성 프로모터는 면역조절 단백질을 인코딩하는 핵산 분자에 작동적으로 연결되어 상기 면역조절 단백질이 활성화된 T-세포의 핵 인자(NFAT) 또는 활성화된 B 세포의 핵 인자 카파-경쇄 인핸서(NF-κB)에 응답하여 발현된다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 유도성 프로모터는 NFAT 또는 NF-κB에 대한 결합 부위를 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 프로모터는 NFAT 또는 NF-κB 프로모터 또는 그의 기능성 변이체이다. 그러므로, 일부 구체예에서, 핵산은 면역조절 단백질의 발현 조절을 가능하게 하면서 면역조절 단백질의 독성을 감소 또는 제거할 수도 있다. 특히, 본 발명의 핵산을 포함하는 조작된 면역 세포는 그 세포 (예컨대, 세포에 의해 발현된 T-세포 수용체 (TCR) 또는 키메라 항원 수용체 (CAR))가 항원에 의해 특이적으로 자극되거나 및/또는 그 세포(예컨대, 세포의 칼슘 시그널링 경로)가 예컨대 포볼 미리스테이트 아세테이트(PMA: phorbol myristate acetate)/이오노마이신에 의해 비-특이적으로 자극되는 경우에만 면역조절 단백질을 발현 및 분비한다. 따라서, 면역조절 단백질의 일부 사례에서의 발현 및 분비는 오로지 필요한 때와 장소 (예컨대, 감염 질환-유발 물질의 존재, 암, 또는 종양 부위)에서만 일어나도록 조절될 수 있으므로, 바람직하지 못한 면역조절 단백질 상호작용을 감소 또는 회피할 수 있다.
[352] 일부 구체예에서, 본 명세서에 설명된 면역조절 단백질을 인코딩하는 핵산은 NFAT　프로모터, NF-κB 프로모터, 또는 그의 기능성 변이체를 인코딩하는 적절한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 본 명세서에서 "NFAT　프로모터"라 함은 최소 프로모터에 연결된 하나 이상의　NFAT 응답 요소를 가리킨다. "NF-κB 프로모터"는 최소 프로모터에 연결된 하나 이상의　NF-κB 응답성 요소를 가리킨다. 일부 구체예에서, 어떤 유전자의 최소 프로모터는 최소 인간 IL-2　프로모터 또는 CMV 프로모터이다. NFAT 응답성 요소들(responsive elements)은, 예컨대, NFAT1, NFAT2, NFAT3, 및/또는 NFAT4 응답성 요소를 포함할 수 있다.　NFAT　프로모터,　NF-κB 프로모터, 그의 기능성 변이체들은 결합 모티프를 임의의 수, 예컨대 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개 또는 최대 12개까지 포함할 수 있다.
[353] DNA 분자를 갖는 결과적인 재조합 발현 벡터를 이용하여 적절한 숙주를 형질전환한다. 이 형질전환은 기술분야에 공지인 방법을 이용하여 수행가능하다. 일부 구체예에서, 본원에서 제공된 핵산은 면역조절 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산에 작동적으로 연결된 분비 또는 시그널 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하여, 결과적인 가용성 면역조절 폴리펩타이드를 배양 배지, 숙주 세포, 또는 숙주 세포 페리플라즘(periplasm)으로부터 회수할 수 있다. 또 다른 구체에에서, 적절한 발현 조절 시그널은 면역조절 폴리펩타이드의 막 발현을 허용한다. 또한, 상업적으로 입수가능한 키트 및 계약 제조사를 이용하여 본원에서 제공된 조작된 세포 또는 재조합 숙주 세포를 제조할 수 있다.
[354] 일부 구체예에서, DNA 분자를 갖는 결과적인 발현 벡터를 이용하여 적절한 세포를 형질전환, 예컨대 형질도입한다. 도입은 공지 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 예시적인 방법에는 레트로바이러스 또는 렌티바이러스와 같은 바이러스를 경유하거나, 형질도입, 트랜스포존 및 전기천공을 포함하여, 수용체들을 인코딩하는 핵산을 전달하기 위한 방법들이 포함된다. 일부 구체예에서, 발현 벡터는 바이러스 벡터이다. 일부 구체예에서, 핵산은 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 형질도입 방법에 의해 세포 내로 전달된다.
[355] 포유동물 T-세포 또는 APC를 포함하여, 공개적으로 입수 가능한 다수의 공지된 포유동물 숙주 세포 중 임의의 것을 폴리펩타이드 또는 조작된 세포의 제조에 사용할 수있다. 세포의 선택은 당해 기술 분야에서 인정되는 다수의 인자에 의존한다. 여기에는 예를 들어, 선택된 발현 벡터와의 호환성, DNA 분자에 의해 인코딩된 펩타이드의 독성, 형질전환 속도, 펩타이드 회수 용이성, 발현 특성, 생물-안전성 및 비용 등이 포함된다. 이러한 인자들의 균형은 모든 세포가 특정 DNA 서열의 발현에 동등하게 효과적일 수는 없다는 이해와 맞물려야 한다.
[356] 일부 구체예에서, 숙주 세포는 예컨대 효모 세포, 또는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 또는 HEK293 세포 등의 포유동물 세포와 같은 다양한 진핵 세포일 수 있다. 숙주 세포는 또한 예컨대 대장균(E. coli)과 같은 원핵세포일 수도 있다. 형질전환된 재조합 숙주를 폴리펩타이드 발현 조건에서 배양한 다음 정제하여 가용성 단백질을 얻는다. 재조합 숙주 세포는 바람직한 폴리펩타이드가 발현되도록 통상적인 발효 조건에서 배양할 수 있다. 이러한 발효 조건은 기술분야에 잘 알려져 있다. 마지막으로, 본원에서 제공된 폴리펩타이드는 황산 암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 친 화성 크로마토 그래피를 비롯한, 당업계에 널리 공지된 다수의 방법 중 임의의 방법에 의해 재조합 세포 배양물로부터 회수 및 정제될 수 있다, 단백질 재폴딩(refolding) 단계는 필요에 따라 성숙한 단백질의 구성을 완료하는 데 사용할 수 있다. 최종적으로, 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)가 최종 정제 단계에서 사용될 수있다.
[357] 일부 구체예에서, 세포는 면역 세포, 예컨대 조작된 세포를 제조하는 것과 관련된 전술한 임의의 것일 수 있다. 일부 구체예에서, 이러한 조작된 세포는 일차 세포이다. 일부 구체예에서, 조작된 세포는 대상자에 있어 자가(autologous)인 세포이다. 일부 구체예에서, 조작된 세포는 대상자에 대해 동종이계(allogeneic)인 세포이다. 일부 구체예에서, 조작된 세포는 예컨대 백혈구 치환에 의해 대상자로부터 수득되고, 면역조절 폴리펩타이드,예컨대 막관통 면역조절 폴리펩타이드 또는 분비가능한 면역조절 폴리펩타이드의 발현을 위해 생체외에서 형질전환된다.
[358] 또한 본 발명에 따라 본 발명에 설명된 감염 물질에 함유된 임의의 변이체 면역조절 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산도 제공된다. 일부 구체예에서, 감염 물질은 핵산을 대상자 내 세포에 전달하거나, 및/또는 인코딩된 변이체 폴리펩타이드를 세포에서 발현시킨다. 또한 이러한 감염 물질을 생성, 생산 또는 변형하는데 사용되는 핵산도 제공된다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 본 발명에 따라 감염 물질의 생성, 대상자 내 세포로의 전달 및/또는 대상자 내 세포에서의 변이체 면역조절 폴리펩타이드의 발현을 위해, 변이체 면역조절 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 함유하는 벡터 및/또는 플라스미드도 제공된다.
[359] 일부 구체예에서, 제공된 핵산은 변이체 면역조절 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열을 함유하는 재조합 바이러스 또는 세균성 벡터이다. 일부 구체예에서, 재조합 벡터는 표적 세포에 의한 발현을 위해 대상자 내 표적 세포에 전달될 핵산 서열 및/또는 변이체 면역조절 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열을 함유하는 감염 물질을 생산하는데 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 재조합 벡터는 발현 벡터이다. 일부 구체예에서, 재조합 벡터는 표적 세포에서 감염 물질의 생성 및/또는 생산 및 발현에 필요한 적절한 서열을 포함한다.
[360] 일부 구체예에서, 재조합 벡터는 플라스미드 또는 코스미드이다. 본 발명에 설명된 것과 같은 변이체 면역조절 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열을 함유하는 플라스미드 또는 코스미드는 공지기술에 따라 쉽게 작제할 수 있다 감염 물질의 생성을 위해, 벡터 또는 게놈을 플라스미드 형태로 작제한 다음 패키징 또는 프로듀서 세포주 또는 숙주 세균에 형질감염시킬 수 있다. 재조합 벡터는 임의의 공지 재조합 기술으르 이용하여 생성가능하다. 일부 구체예에서, 벡터는 원핵생물 복제 원점 및/또는 원핵생물 시스템에서의 증식 및/또는 선택에 대한 약물 내성과 같은 검출가능하거나 선택가능한 마커를 부여하는 유전자를 포함할 수 있다.
[361] 일부 구체예에서, 재조합 벡터는 바이러스 벡터이다. 예시적인 재조합 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터 게놈, 폭스바이러스 벡터 게놈, 백시니아 바이러스 벡터 게놈, 아데노바이러스 벡터 게놈, 아데노바이러스-관련 바이러스 벡터 게놈, 헤르페스 바이러스 벡터 게놈, 및 알파 바이러스 벡터 게놈을 포함한다. 바이러스 벡터는 살아있거나, 약독화되거나, 복제 조건적 또는 복제 결핍적, 비-병원성(결여), 복제 경쟁 바이러스 벡터일 수 있고 및/또는 예컨대 본 발명에서 제공된 변이체 면역조절 폴리펩타이드와 같은 이종 유전자 산물을 발현하도록 변형된다. 바이러스 생성을 n이한 벡터 역시도 바이러스의 약화를 변경하기 위해 변형될 수 있고 여기에는 전사 또는 번역 로드를 증가 또는 감소시키는 방법이 포함된다.
[362] 사용가능한 예시적인 바이러스 벡터로는 변형된 백시니아 바이러스 벡터 (예컨대, Guerra 외, J. Virol. 80:985-98 (2006); Tartaglia 외, AIDS Research and Human Retroviruses 8: 1445-47 (1992); Gheradi 외, J. Gen. Virol. 86:2925-36 (2005); Mayr 외, Infection 3:6-14 (1975); Hu 외, J. Virol. 75: 10300-308 (2001); 미국특허 Nos. 5,698,530, 6,998,252, 5,443,964, 7,247,615 및 7,368,116 참조); 아데노바이러스 벡터 또는 아데노바이러스-관련 바이러스 벡터 (예컨대, Molin 외, J. Virol. 72:8358-61 (1998); Narumi 외, Am J. Respir. Cell Mol. Biol. 19:936-41 (1998); Mercier 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:6188-93 (2004); 미국특허 Nos. 6,143,290; 6,596,535; 6,855,317; 6,936,257; 7,125,717; 7,378,087; 7,550,296 참조); 쥐의 백혈병 바이러스(MuLV)에 기초한 것, 기본 원숭이 백혈병 바이러스 (GaLV), 에코트로픽(ecotropic) 레트로바이러스es, 원숭이 면역결핍 바이러스 (SIV), 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 및 이의 조합을 비롯한 레트로바이러스 벡터 (예컨대, Buchscher 외, J. Virol. 66:2731-39 (1992); Johann 외, J. Virol. 66: 1635-40 (1992); Sommerfelt 외, Virology 176:58-59 (1990); Wilson 외, J. Virol. 63:2374-78 (1989) ; Miller 외, J. Virol. 65:2220-24 (1991); Miller 외, Mol. Cell Biol. 10:4239 (1990) ; Kolberg, NIH Res. 4:43 1992; Cornetta 외, Hum. Gene Ther. 2:215 (1991) 참조); 인간 면역결핍 바이러스(HIV-1), HIV-2, 고양이의 면역결핍 바이러스 (FIV), 말의 감염성 빈혈 바이러스, 원숭이 면역결핍 바이러스 (SIV), 및 마에디/비스나(maedi/visna) 바이러스에 기초한 것과 같은 렌티바이러스 벡터 (예컨대, Pfeifer 외, Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2: 177-211 (2001); Zufferey 외, J. Virol. 72: 9873, 1998; Miyoshi 외, J. Virol. 72:8150, 1998; Philpott 및 Thrasher, Human Gene Therapy 18:8, 2007; Engelman 외, J. Virol. 69: 2729, 1995; Nightingale 외, Mol. Therapy, 13: 1121, 2006; Brown 외, J. Virol. 73:9011 (1999); WO 2009/076524; WO 2012/141984; WO 2016/011083; McWilliams 외, J. Virol. 77: 11150, 2003; Powell 외, J. Virol. 70:5288, 1996 참조) 또는 이들의 임의의 변이체, 및/또는 전술한 임의의 바이러스를 생성하는데 사용가능한 벡터를 들 수 있다. 일부 구체예에서, 재조합 벡터는 패키징 세포주에서와 같이 RNA 바이러스에 대한 경우처럼, 바이러스 게놈의 발현을 조절할 수 있는 프로모터 또는 인핸서 서열과 같은 조절 사열을 포함할 수 있다 (예컨대, 미국특허 Nos.5,385,839 및 5,168,062 참조).
[363] 일부 구체예에서, 재조합 벡터는 발현 벡터, 예컨대, 표적 세포, 예컨대, 대상자 내 세포, 예컨대, 종양 세포, 면역 세포 및/또는 APC 내로 전달될 때 인코딩된 유전자 산물의 발현을 허용하는 발현 벡터이다. 일부 구체예에서, 감염 물질에 함유된 재조합 발현 벡터는 대상자 내 표적 세포에서 면역조절 단백질을, 상기 단백질의 발현에 적합한 조건 하에서 발현할 수 있다.
[364] 일부 측면에서, 핵산 또는 발현 벡터는 적절한 발현 조절 서열에 작동적으로 연결된 면역조절 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 면역조절 단백질을 인코딩하는 핵산 서열의 벡터 내로의 삽입 전 또는 후에, 이 작동가능한 연결에 영향을 미치는 방법은 잘 알려져 있다. 발현 조절 서열의 예로는 프로모터, 액티베이터, 인핸서, 오퍼레이터, 리보좀 결합 부위, 개시 시그널, 종결 시그널, 캡 시그널, 폴리아데닐화 시그널 및 전사와 번역의 조절과 관련된 기타 시그널을 들 수 있다. 프로모터는 면역조절 단백질을 인코딩하는 핵산 서열의 일부에 작동적으로 연결될 수 있다. 일부 구체예에서, 프로모터는 표적 세포 내의 구성적으로 활성적인 프로모터이다 (예컨대 조직-특이적인 구성적으로 활성인 프로모터 또는 그 밖의 구성 프로모터). 예를 들어, 재조합 발현 벡터는 또한 림프구 조직-특이적 전사 조절 요소 (TRE) 예컨대 B 림프구, T 림프구, 또는 수지상 세포 특이적 TRE이다. 림프구 조직 특이적 TRE는 기술분야에 알려져 있다 (예컨대, Thompson 외, Mol. Cell. Biol. 12:1043-53 (1992); Todd 외, J. Exp. Med. 177:1663-74 (1993); Penix 외, J. Exp. Med. 178:1483-96 (1993) 참조). 일부 구체예에서, 프로모터는 유도 물질(예컨대 T 세포 활성화 시그널)에 응답할 수 있는 유도성 프로모터이다. 일부 구체예에서, 대상자 내 표적 세포, 예컨대, 종양 세포, 면역 세포 및/또는 APC에 전달된 핵산은 전술한 임의의 조절 요소에 작동적으로 연결될 수 있다.
[365] 일부 구체예에서, 벡터 세균성 벡터, 예컨대 세균성 플라스미드 또는 코스미드이다. 일부 구체예에서, 세균성 벡터는 포유동물 세포에 대한 플라스미드 DNA의 세균-매개 전달을 통해 표적 세포, 예컨대, 종양 세포, 면역 세포 및/또는 APCs에 전달된다(세균감염(bactofection)이라고도 함). 일부 구체예에서, 전달된 세균성 벡터는 표적 세포 내에서의 발현을 위해 적절한 발현 조절 서열, 예컨대 전술한 바와 같은 프로모터 서열 및/또는 인핸서 서열, 또는 임의의 조절 서열도 함유한다. 일부 구체예에서, 세균성 벡터는 감염 물질, 예컨대, 세균에서, 인코딩된 변이체 폴리펩타이드의 발현 및/또는 분비를 위한 적절한 발현 조절 서열을 함유한다.
[366] 일부 구체예에서, 본원에서 제공된 폴리펩타이드는 합성법에 의해서도 만들어질 수 있다. 고상 합성법이 개별적인 펩타이드를 만드는 바람직한 기술인데 이는 이 기술이 소형 펩타이드 제조시 비용면에서 가장 효율적인 방법이기 때문이다. 예컨대, 잘 알려진 고상 합성 기술에는 보호기, 링커, 및 고상 지지체의 사용, 그리고 특이적인 보호 및 탈보호 반응 조건, 링커 절단 조건, 스캐빈져의 사용, 및 고상 펩타이드 합성의 기타 측면을 이용하는 것이 포함된다. 이어서 펩타이드를 본원에 제공된 바와 같은 폴리펩타이드 내로 조립할 수 있다.
IV. 변이체 CD80 폴리펩타이드 및 면역조절 단백질의 활성 면역 조절을 평가하는 방법
[367] 일부 구체예에서, 본원에서 제공된 변이체 CD80 폴리펩타이드 (예컨대 전장 및/또는 특이적 결합 단편 또는 그의 컨쥬게이트, 적층 작제물 또는 융합체)는 T 세포 활성화를 조절하는 면역조절 활성을 나타낸다. 일부 구체예에서, CD80 폴리펩타이드는 야생형 또는 비변형 CD80 대조군에 상대적으로 일차 T 세포 분석시 IFN-감마 발현을 조절한다. 일부 경우에서, IFN-감마 발현의 조절은 대조군에 상대적으로 IFN-감마 발현을 증가 또는 감소시킬 수 있다. 특이적인 결합 및 IFN-감마 발현을 알아내기 위한 분석법은 기술분야에 잘 알려져 있고 여기에는 배양 상등액에서 인터페론-감마 사이토카인 수준을 측정하는 MLR (림프구 혼합 배양반응) 분석법 (Wang 외, Cancer Immunol Res. 2014 Sep: 2(9):846-56), SEB (스타필로코커스 내독소 B) T 세포 자극 분석법(Wang 외, Cancer Immunol Res. 2014 Sep: 2(9):846-56), 및 항-CD3 T 세포 자극 분석법 (Li 및 Kurlander, J Transl Med. 2010: 8: 104) 등이 포함된다
[368] 일부 구체예에서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 일부 구체예에서, 야생형 CD80 대조군에 비해 일차 T-세포 분석에서 IFN-감마 (인터페론-감마) 발현을 증가시키거나 또는 별법 실시에에서 감소시킬 수 있다. 가용성 변이체 CD80 서열을 함유하는 본원에서 제공된 폴리펩타이드의 일부 구체예에서, 상기 폴리펩타이드는 IFN-감마 발현을 증가시킬 수 있고, 또 다른 구체예에서는 야생형 CD80 대조군과 비교하여 일차 T-세포 분석에서 IFN-감마 발현을 감소시킬 수 있다. 다중 변이체 CD80 서열을 함유하는 제공된 폴리 펩타이드의 일부 구체예에서, 상기 폴리펩타이드는 IFN-감마 발현을 증가시킬 수 있고, 별도 구체예에서는 야생형 CD80 대조군과 비교하여 일차 T-세포 분석에서 IFN-감마 발현을 감소시킬 수 있다.
[369] 통상의 기술자라면 IFN-감마 발현의 증가를 결정하는데 사용되는 일차 T-세포 분석의 포맷이 IFN-감마 발현의 감소를 분석하기 위해 사용된 것과 다를 수 있다는 것을 인식할 것이다. 일차 T-세포 분석에서 IFN-감마 발현을 감소시키는 변이체 CD80의 능력을 분석함에 있어서, 림프구 혼합 배양 반응 (MLR) 분석을 실시예 6에 기재된 바와 같이 사용할 수 있다. 어떤 경우에는, 변이체 CD80의 가용성 형태를 이용하여 변이체 CD80이 실시예 6에 설명된 것과 마찬가지로 MLR에서 IFN-감마 발현을 길항 및 그에 따라 감소시키는 능력을 알아볼 수 있다.
[370] 별법으로, 일차 T-세포 분석에서 IFN-감마 발현을 증가시키는 변이체 CD80의 능력을 분석할 때, 공동-고정화 분석을 실시예 6에 기재된 바와 같이 사용할 수 있다. 공동-고정화 분석에서, 항-CD3 항체에 의해 일부 구체예에서 제공되는, TCR 시그널은 공동-고정된 변이체 CD80과 함께 사용되어 CD80 대조군에 상대적으로 IFN-감마 발현을 증가시키는 능력을 결정한다. 일부 경우, 다가 결합을 제공하는 정도까지 멀티머화된 변이체 CD80의 가용성 형태를 이용하여 실시예 6에 설명된 바와 같이 MLR에서, 변이체 CD80이 IFN-감마 발현을 작용화 및 그에 따라 증가시키는 능력을 결정할 수 있다.
[371] 통상의 기술자에게는 적절한 대조군의 사용에 관하여 알려져 있지만, 전술한 구체예에서, 대조군은 전형적으로, 그 변이체 CD80이 유래 또는 발달된 동일한 포유동물 종으로부터의 천연 CD80 이소폼의 야생형과 같은, 비변형 CD80의 사용을 포함한다. ICOS 및 CD28 중 어느 일방 또는 양방 모두에 대한 결합 친화성이 증가 또는 감소되는지와 무관하게, 일부 구체예에서 변이체 CD80은 야생형 CD80 대조군에 비해 일차 T-세포에서 IFN-감마 발현을 증가시키고, 또 다른 구체예에서는 IFN-감마 발현을 감소시킨다.
[372] 일부 구체예에서, 변이체 CD80은 야생형 또는 비변형 CD80 대조군에 비해 IFN-감마 발현 (즉, 단백질 발현)을 적어도: 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 그 이상 증가시킨다. 또 다른 구체예에서, 변이체 CD80은 야생형 또는 비변형 CD80 대조군에 비해 IFN-감마 발현 (즉 단백질 발현)을 적어도: 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 그 이상 감소시킨다. 일부 구체예에서, 야생형 CD80 대조군은 야생형 쥐의 CD80 서열이 변경된 변이체 CD80에 대해 전형적으로 사용되는 쥐의 CD80이다. 일부 구체예에서, 야생형 CD80 대조군은 SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:152, 또는 SEQ ID NO:372의 아미노산 서열을 포함하는 CD80 서열과 같은 야생형 인간 CD80 서열과는 다른 변경된 서열을 갖는 변이체 CD80에 전형적으로 사용되는 것과 같은 인간 CD80이다.
V. 의약 제형(pharmaceutical formulations)
[373] 본원에 따라 본 명세서에 설명된 임의의 변이체 CD80 폴리펩타이드, 면역조절 단백질, 컨쥬게이트, 조작된 세포 또는 감염 물질을 함유하는 조성물이 제공된다. 의약 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 의약 조성물은 예컨대 조성물의 pH, 삼투압, 점도, 투명도, 색상, 등장성, 냄새, 멸균성, 안정성, 용해 속도 또는 방출 속도, 흡착성 또는 침투성을 변형, 유지 또는 보존하기 위한 부형제를 1종 이상 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 통상의 기술자는 세포를 함유하는 의약 조성물과 단백질을 함유하는 의약 조성물이 상이하다는 것을 이해할 것이다.
[374] 일부 구체예에서, 의약 조성물은 분말, 캡슐 또는 정제와 같은 고체이다. 예를 들어, 의약 조성물의 성분들은 동결건조될 수 있다. 일부 구체예에서, 고체 의약 조성물은 투여 전에 액체에 용해 또는 재조성된다.
[375] 일부 구체예에서, 의약 조성물은 액체, 예를 들어 수용액(예컨대 생리식염수 또는 링거액)에 용해된 변이체 CD80 폴리펩타이드이다. 일부 구체예에서, 의약 조성물의 pH는 약 4.0 내지 약 8.5 (예컨대 약 4.0 내지 약 5.0, 약 4.5 내지 약 5.5, 약 5.0 내지 약 6.0, 약 5.5 내지 약 6.5, 약 6.0 내지 약 7.0, 약 6.5 내지 약 7.5, 약 7.0 내지 약 8.0, 또는 약 7.5 내지 약 8.5)이다.
[376] 일부 구체예에서, 의약 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제, 예컨대 충전제, 바인더, 피복제, 보존제, 윤활제, 향료, 감미료, 색소, 용매, 완충제, 킬레이트화제 또는 안정화제를 포함한다. 약학적으로 허용가능한 충전제의 예로는 셀룰로스, 이염기성 인산칼슘, 탄산칼슘, 미정질 셀룰로스, 수크로스, 락토스, 글루코스, 만니톨, 소르비톨, 말톨, 예비호화 전분, 옥수수 전분 또는 감자 전분을 들 수 있다. 약학적으로 허용가능한 바인더의 예로는 폴리비닐피롤리돈, 전분, 락토스, 자일리톨, 소르비톨, 말티톨, 젤라틴, 수크로스, 폴리에틸렌 글리콜, 메틸 셀룰로스, 또는 셀룰로스를 들 수 있다. 약학적으로 허용가능한 피복제의 예로는 히드록시프로필 메틸셀룰로스(HPMC), 쉘락, 옥수수 단백질 제인 또는 젤라틴을 들 수 있다. 약학적으로 허용가능한 붕괴제의 예로는 폴리비닐피롤리돈, 카르복시메틸 셀룰로스, 또는 글리콜산나트륨 전분을 들 수 있다. 약학적으로 허용가능한 윤활제의 에로는 폴리에틸렌 글리콜, 스테아르산 마그네슘 또는 스테아르산을 들 수 있다. 약학적으로 허용가능한 보존제의 에로는 메틸 파라벤, 에틸 파라벤, 프로필 파라벤, 벤조산 또는 소르브산을 들 수 있다. 약학적으로 허용가능한 감미료의 예로는 수크로스, 사카린, 아스파탐, 또는 소르비톨을 들 수 있다. 약학적으로 허용가능한 완충제의 예로는 카보네이트, 시트레이트, 글루코네이트, 아세테이트, 포스페이트 또는 타르트레이트를 들 수 있다.
[377] 일부 구체예에서, 의약 조성물은 주사가능한 마이크로스피어, 생체-침식성 입자, 폴리머 화합물(폴리락트산, 폴리글리콜산), 비드 또는 리포좀과 같이, 제품의 지속 방출 또는 조절 방출을 위한 물질을 더 포함한다.
[378] 일부 구체예에서, 의약 조성물은 멸균된 것이다. 멸균은 멸균 여과막 또는 주사를 통해 여과에 의해 달성될 수 있다. 조성물이 동결건조되는 경우, 이 방법을 이용한 멸균은 동결건조 전 또는 후에 수행될 수 있다. 비경구 투여용 조성물은 동결건조 형태 또는 용액으로 보관될 수 있다. 이에 더해, 비경구용 조성물은 일반적으로 예컨대 피하주사용침에 의해 침투가능한 스토퍼를 구비한 정맥 용액 백 또는 바이알과 같이, 멸균 억세스 포트를 갖는 용기 내로 투입된다.
[379] 일부 구체예에서, 본 발명에 따라 막관통 면역조절 단백질을 발현하는 조작된 세포를 비롯한, 막관통 면역조절 단백질을 함유하는 의약 조성물이 제공된다. 일부 구체예에서, 의약 조성물s 및 제형은 1종 이상의 선택적인 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함한다. 이러한 조성물은 완충제 예컨대 중성 완충된 식염수, 포스페이트 완충 염수 등; 탄수화물 예컨대 글루코스, 만노스, 수크로스 또는 덱스트란, 만니톨; 단백질; 폴리펩타이드 또는 아미노산 예컨대 글리신; 항산화제; 킬레이트화제 에컨대 EDTA 또는 글루타치온; 아쥬반트 (예컨대, 수산화알루미늄); 및 보존제를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 좋기로는 정맥 투여용으로 조성되는 것이 바람직하다.
[380] 일부 구체예에서, 의약 조성물은 면역조절 변이체 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열을 함유하는 감염 물질을 함유한다. 일부 구체예에서, 의약 조성물은 치료에 적합하고 대상자에게 투여하는데 적합한 양으로 감염 물질을 함유한다. 일부 구체예에서, 의약 조성물은 바이러스인 감염 물질 약 1Х105 내지 약 1Х1012 플라크-형성 단위 (pfu), 1Х106 내지 1Х1010 pfu, 또는 1Х107 내지 1Х1010 pfu, 예컨대 적어도 또는 적어도 약 또는 약 1Х106, 1Х107, 1Х108, 1Х109, 2Х109, 3Х109, 4Х109, 5Х109 pfu 또는 약 1Х1010 pfu를 일회 또는 다회 투여량으로 함유한다. 일부 구체예에서, 의약 조성물은 바이러스를 약 105 내지 약 1010 pfu/mL, 예를 들어, 5Х106 내지 5Х109 또는 1Х107 내지 1Х109 pfu/mL, 예컨대 적어도 또는 적어도 약 또는 약 106 pfu/mL, 107 pfu/mL, 108 pfu/mL 또는 109 pfu/mL의 농도로 함유할 수 있다. 일부 구체예에서, 의약 조성물은 세균인 감염 물질을 일회 또는 다회 투여량으로 약 1Х103 내지 약 1Х109 콜로니-형성 단위(cfu), 1Х104 내지 1Х109 cfu, 또는 1Х105 내지 1Х107 cfu, 예컨대 적어도 또는 적어도 약 또는 약 1Х104, 1Х105, 1Х106, 1Х107, 1Х108 또는 1Х109 cfu의 범위로 함유한다. 일부 구체예에서, 의약 조성물은 세균을 약 103 내지 약 108 cfu/mL, 예를 들어, 5Х105 내지 5Х107 또는 1Х106 내지 1Х107 cfu/mL, 예컨대 적어도 또는 적어도 약 또는 약 105 cfu/mL, 106 cfu/mL, 107 cfu/mL 또는 108 cfu/mL의 농도로 함유할 수 있다.
[381] 이러한 제형은 예컨대 정맥 주입에 적합한 형태일 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 체내 어느 조직, 장기 또는 신체 부분으로부터의 관심 세포를 체내 다른 조직, 장기 또는 신체 부분으로 전달 또는 운반하는데 관련된 약학적으로 허용가능한 물질, 조성물, 또는 비히클일 수 있다. 예를 들어, 담체는 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 용매 또는 캡슐화 재료, 또는 이의 조합일 수 있다. 담체의 각 성분은 제형내 다른 성분들과 공용성(compatible)이어야 한다는 점에서 "약학적으로 허용가능"하여야 한다. 담체는 또한 그것과 마주치게 되는 체내의 어느 조직, 장기 또는 신체 일부와의 접촉에도 적합하여야 하며, 이는 담체가 그의 치료적 장점을 과도하게 상회하는 독성, 자극, 알레르기 반응, 면역원성과 같은 위험성 또는 이들의 임의의 조합을 지녀서는 아니됨을 의미한다.
[382] 일부 구체예에서, 의약 조성물은 대상자에게 투여된다. 일반적으로, 의약 조성물의 투여량 및 투여 경로는 표준 의약 실무에 따라 대상자의 크기와 상태에 따라 결정한다. 예를 들어, 치료적으로 유효한 투여량은 세포 배양 분석을 통해 또는 마우스, 래트, 토끼, 개, 돼지 또는 원숭이와 같은 동물 모델에서 초기에 평가될 수 있다. 동물 모델은 또한 적절한 농도 범위 및 투여 경로를 결정하는데도 이용될 수 있다. 이러한 정보는 다시 인간에 사용되기에 유용한 투여량과 투여 경로를 결정하는데 이용될 수 있다. 정확한 투여량은 치료를 요하는 대상자와 관련된 여러 인자들을 고려하여 결정된다. 투여량 및 투여의 제반사항은 활성 화합물을 충분한 수준으로 제공하고 목적하는 효과를 유지하도록 조정된다. 고려하여야 할 인자에는 대상자의 질병 상태의 위중도, 전반적인 건강 상태, 연령, 체중 및 성별, 투여 시기 및 투여 빈도, 약물 조합(들), 반응 민감도 및 치료법에 대한 응답성이 포함된다.
[383] 장기적으로 작용하는 의약 조성물을, 특정 제형의 반감기 및 소거율에 따라 3 내지 4일마다, 매주, 또는 2주마다 투여할 수 있다. 투여 빈도는 사용된 제형 내 분자들의 약력학적 파라미터에 따라 달라진다. 전형적으로, 조성물은 소망되는 효과가 투여량에 의해 달성될 때가지 투여된다. 조성물은 따라서 경시적으로 단회 투여 또는 다회 투여(동일 또는 상이한 농도/투여량으로)를 통해 투여되거나 또는 연속 주입에 의해 투여될 수 있다. 또한 적절한 투여량의 강화가 일상적으로 이루어진다. 적절한 투여량은 적절한 투여량-반응 데이터를 사용함으로써 확인할 수 있다. 예컨대 T 세포 활성화 또는 증식, 사이토카인 합성 또는 생산(예컨대, TNF-α, IFN-γ, IL-2의 생산), 다양한 활성화 마커(예컨대, CD25, IL-2 수용체)의 유도, 염증, 관절 부종 또는 압통, C-반응성 단백질의 혈청 수준, 항-콜라겐 항체 생산, 및/또는 T 세포-의존성 항체 응답성(들)을 비롯한, 치료 효과를 가늠하기 위한 몇몇 바이오마커 또는 생리 마커를 모니터링할 수 있다.
[384] 일부 구체예에서, 의약 조성물은 대상자에게 경구, 경피(transdermally), 흡입, 정맥내, 동맥내, 근육내, 상처부위로의 직접 적용, 외과수술 부위로의 적용, 복강내, 좌약, 피하, 피내, 경피(transcutaneously), 분무, 흉강내, 뇌실내(intraventricularly), 관절내, 안내 또는 척수강내(intraspinally)를 비롯한 임의 경로를 통해 대상자에게 투여된다.
[385] 일부 구체예에서, 의약 조성물의 투여량은 단일 투여량 또는 반복 투여량이다. 일부 구체예에서, 상기 투여량은 대상자에게 1일 1회, 1일 2회, 1일 3회 또는 1일 4회 또는 그 이상 주어진다. 일부 구체예에서는, 1주일에 약 1회 이상(예컨대 약 2 또는 more, 약 3회 이상, 약 4회 이상, 약 5회 이상, 약 6회 이상, 또는 약 7회 이상) 투여된다. 일부 구체예에서, 수일, 수주일, 수개월 또는 수년의 기간에 걸쳐 복수회로 투여된다. 일부 구체예에서, 치료 코스는 약 1회 이상의 투여 (예컨대 약 2회 이상의 투여, 약 3회 이상의 투여, 약 4회 이상의 투여, 약 5회 이상의 투여, 약 7회 이상의 투여, 약 10회 이상의 투여, 약 15회 이상의 투여, 약 25회 이상의 투여, 약 40회 이상의 투여, 약 50회 이상의 투여, 또는 약 100회 이상의 투여)이다.
[386] 일부 구체예에서, 의약 조성물의 투여량은 대상자 체중 1 kg 당 약 1 ㎍ 이상의 단백질(예컨대 대상자 체중 1 kg 당 약 2 ㎍ 이상의 단백질, 대상자 체중 1 kg 당 약 5 ㎍ 이상의 단백질, 대상자 체중 1 kg 당 약 10 ㎍ 이상의 단백질, 대상자 체중 1 kg 당 약 25 ㎍ 이상의 단백질, 대상자 체중 1 kg 당 약 50 ㎍ 이상의 단백질, 대상자 체중 1 kg 당 약 100 ㎍ 이상의 단백질, 대상자 체중 1 kg 당 약 250 ㎍ 이상의 단백질, 대상자 체중 1 kg 당 약 500 ㎍ 이상의 단백질, 대상자 체중 1 kg 당 약 1 mg 이상의 단백질, 대상자 체중 1 kg 당 약 2 mg 이상의 단백질, 또는 대상자 체중 1 kg 당 약 5 mg 이상의 단백질)이다.
[387] 일부 구체예에서, 치료량의 세포 조성물이 투여된다. 일반적으로, 본 발명의 조성물의 정확한 투여량은 연령, 체중, 종양 크기, 감염 종도 또는 전이, 및 환자(대상자)의 상태 등 개체 차이를 고려하여 의사가 결정할 수 있다. 일반적으로, 조작된 세포 예컨대 본 발명에 설명된 바와 같은 T 세포를 포함하는 의약 조성물은 104 내지 109 세포/kg 체중, 예컨대 105 내지 106 세포/kg 체중 (이들 범위 사이의 모든 정수값을 포함함)의 투여량으로 투여될 수 있다. 조작된 세포 조성물 예컨대 T 세포 조성물 역시도 이러한 투여량 범위로 다회 투여될 수 있다. 세포들은 면역요법에 일반적으로 알려져 있는 주입 기술을 사용함으로써 투여할 수 있다 (예컨대, Rosenberg et al, New Eng. J. of Med. 319: 1676, 1988 참조). 이 기술 분야의 통상의 기술자라면 질병의 징후에 대해 환자를 모니터링하고 그에 따라 치료 방법을 조정함으로써 특정 환자에 대한 최적 투여량 및 처치 방법을 쉽게 결정할 수 있다.
[388] 본 발명의 치료 조성물의 투여가, 바람직하지 못한 면역 반응을 매개하거나 또는 매개할 수 있는 면역 세포를 제거, 격리 또는 불활성화시키거나; 보호적 면역 반응을 매개하거나 또는 매개할 수 있는 면역 세포를 유도, 생성 또는 턴온시키거나; 면역 세포의 물리적 또는 기능적 특징을 변화시키거나; 또는 이러한 효과들의 조합에 의해 면역학적 활성을 충분히 조절할 수 있는지를 알아보기 위한 다양한 수단이 알려져 있다. 이러한 면역학적 활성 조절의 측정 사례에는 면역세포 집단의 존부 검사(유세포분석법, 면역조직화학법, 조직학, 전자현미경, 폴리머라제 연쇄반응(PCR)을 이용); 시그널에 반응하여 증식 또는 분열하는 능력 또는 이에 대한 내성을 비롯한 면역 세포의 기능적 능력의 측정 (예컨대 항-CD3 항체, 항-T 세포수용체 항체, 항-CD28 항체, 칼슘 이오노포어, PMA (포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트), 펩타이드 또는 단백질 항원이 로딩된 항원제시세포를 이용한 자극 후 T 세포 증식 분석법 및 3H-티미딘 인코포레이션에 기초한 펩스캔 분석; B 세포 증식 분석법); 다른 세포를 살해 또는 용해시키는 능력의 측정(예컨대 세포독성 T 세포 분석법); 사이토카인, 케모카인, 세포 표면 분자, 항체 및 세포의 기타 생성물의 측정(예컨대, 유세포 분석법, 효소-결합 면역흡착 분석법, 웨스턴 블롯 분석법, 단백질 마이크로어레이 분석법, 면역침전 분석법); 면역 세포 내 시그널링 경로 또는 면역 세포의 활성화의 생화학적 마커의 측정(예컨대, 티로신, 세린 또는 트레오닌 인산화의 면역침전 분석법 및 웨스턴 블롯, 폴리펩타이드 절단, 및 단백질 복합체의 형성 또는 해리; 단백질 어레이 분석법; DNA 전사, DNA 어레이 또는 분해성(subtractive) 혼성화); 아폽토시스, 괴사, 또는 기타 메카니즘에 의한 세포 사멸의 측정(예컨대, 어넥신 V 염색, TUNEL 분석법, DNA 래더링을 측정하기 위한 겔 전기영동법, 조직학; 형광발생 카스파제 분석법, 카스파제 기질의 웨스턴 블롯 분석법); 면역 세포에 의해 생산된 유전자, 단백질 및 기타 분자의 측정(예컨대 노던 블롯 분석법, 폴리머라제 연쇄반응, DNA 마이크로어레이, 단백질 마이크로어레이, 2-차원 겔 전기영동,웨스턴 블롯 분석법, 효소결합 면역흡착분석법, 유세포 분석법); 및 자가면역, 신경퇴행성 및 자가 단백질 또는 자가 폴리펩타이드와 연관된 기타 질환의 개선과 같은 임상적 증상 또는 결과의 측정(임상 점수, 부가적 치료의 사용에 대한 필요성, 기능 상태, 조영 연구), 예컨대 다발경화증의 경우 재발률 또는 질병 위중도의 측정(통상의 기술자에게 알려진 임상 점수를 이용), I형 당뇨병의 경우 혈당 측정 또는 류마티스성 관절염의 경우 관절 염증을 측정하는 것을 들 수 있다.
VI. 제조 물품 및 키트
[389] 또한 본 발명에서 설명된 의약 조성물이 적절히 포장된 제조 물품도 제공된다. 본 발명에 설명된 조성물(예컨대 안과용 조성물)에 적합한 포장의 예로는 바이알(예컨대 밀봉 바이알), 베셀, 앰풀, 보틀, 단지, 유연성 포장(예컨대 밀봉 마일러 또는 비닐백) 등을 들 수 있다. 이러한 제조 물품은 추가로 멸균 및/또는 밀봉될 수 있다.
[390] 또한 본원에 따라 본원에 설명된 의약 조성물 (또는 제조 물품)을 포함하는 키트 역시도 제공되며, 이것은 예컨대 본원에 설명된 용도와 같은, 조성물의 사용 방법에 대한 지침(들)을 추가로 포함할 수 있다. 본원에 설명된 키트는 또한 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 시린지 및 포장 삽입물을 비롯하여 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 그 밖의 물질을, 본원에 설명된 임의의 방법을 수행하기 위한 지침과 함께 포함할 수도 있다.
VII. 치료 적용(THERAPEUTIC APPLICATIONS)
[391] 본원에 설명된 의약 조성물(본원에 설명된 변이체 CD80 폴리펩타이드, 면역조절 단백질, 컨쥬게이트, 및 조작된 세포를 포함하는 의약 조성물을 포함한다)은 질병 치료와 같은 다양한 치료 용도에 이용될 수 있다. 예를 들어, 일부 구체예에서 의약 조성물은 포유동물에서의 염증 또는 자가면역 질환, 암, 장기이식, 바이러스 감염 및/또는 세균 감염을 치료하는데 이용된다. 의약 조성물은 질병 치료를 위해 면역 반응을 조절(예컨대 증가 또는 감소)할 수 있다. 일부 구체예에서, 제공된 방법은 본원에 설명된 변이체 CD80 폴리펩타이드, 면역조절 단백질, 컨쥬게이트, 조작된 세포 및 감염 물질의 치료적 투여에 적용가능하다. 소망되는 면역 반응의 조절 유형, 예컨대 증가 또는 감소 유형에 맞추어 적절한 포맷을 선택하는 것은 제공된 개시 내용에 비추어, 통상의 기술자의 기술 수준 범위 내이다.
[392] 일부 구체예에서, 면역 반응을 자극하는 본원에 제공된 의약 조성물이 투여되며, 이것은 예컨대 암, 바이러스 감염 또는 세균 감염 치료시 유용할 수 있다. 일부 구체예에서, 의약 조성물은 변이체 CD80 폴리펩타이드를, 그의 동족 결합 파트너 CD28의 아고니스트 활성을 나타내는 포맷 및/또는 CD28을 통해 공동자극 시그널링을 자극 또는 개시하는 포맷으로 함유한다. 이러한 치료적 용도와 관련되어 사용되기 위한 CD80 폴리펩타이드의 예시적인 포맷으로는, 예를 들어, 면역조절 단백질 또는 종양 항원 (예컨대 Nkp30 또는 친화성-변형된 변이체)에 결합하는 IgSF 도메인 또는 그의 변이체 ("종양-위치화 IgSF 도메인이라고도 칭함)과 변이체 CD80 폴리펩타이드의 "적층체(stakc)", 종양-표적화 모이어티 (종양-위치화 모이어티라고도 칭함)에 연결된 변이체 CD80 폴리펩타이드를 함유하는 컨쥬게이트, 막관통 면역조절 단백질을 발현하는 조작된 세포, 또는 에컨대 감염된 세포(예컨대 종양 세포 또는 APC, 예컨대 수지상 세포)에서의 막관통 면역조절 단백질의 발현을 위해서와 같이, 막관통 면역조절 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 감염 물질을 들 수 있다.
[393] 일부 구체예에서, 의약 조성물은 포유동물의 암 세포 (예컨대 인간 암 세포)를 억제하는데 사용될 수 있다. 암 치료방법은 암에 걸린 대상자에게 본원에 설명된 임의의 의약 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 의약 조성물의 유효량을 투여하여 암을 억제, 중단하거나 암의 진행을 역전시킬 수 있다.
[394] 본원에 설명된 의약 조성물 및 치료방법에 의해 치료가능한 암의 예로는 흑색종, 방광암, 혈액학적 종양(백혈벙, 림프종, 골수종), 간암, 뇌암, 신장암, 유방암, 췌장암(선암종), 대장암, 폐암(소세포 폐암 및 비소세포 폐암), 비장암, 흉선 또는 혈액 세포의 암(즉, 백혈병), 전립선암, 고환암, 난소암, 자궁암, 위암, 근골격계암, 두경부암, 위장관암, 생식 세포 암, 또는 내분비 및 신경분비 암을 들 수 있다. 일부 구체예에서, 암은 유잉 육종이다. 일부 구체예에서, 암은 흑색종, 폐암, 방광암, 및 혈액학적 종양으로부터 선택된다.일부 구체예에서, 암은 림프종, 림프성 백혈병, 골수성 백혈병, 자궁경부암, 신경아세포종, 다발성 골수종이다.
[395] 인간 암 세포는 생체내 또는 생체외 치료될 수 있다. 인간 환자의 생체외 치료시, 암 세포를 함유하는 조직 또는 체액을 체외에서 처리한 다음 그 조직 또는 체액을 환자에게 재도입한다. 일부 구체예에서, 암은 치료적 조성물을 환자에게 투여함으로써 인간 환자의 생체내에서 치료된다.
[396] 일부 구체예에서, 의약 조성물은 단일 요법 (즉, 단일 약제로서) 또는 조합 요법 (즉, 화학 요법 약물, 암 백신, 또는 면역 체크포인트 억제제와의 조합)으로서 투여된다. 일부 구체예에서, 의약 조성물은 방사선 요법으로 투여될 수도 있다.
[397] 일부 구체예에서, 의약 조성물은 면역 반응을 억제하는데, 이것은 염증 또는 자가면역 질환 또는 장기이식 치료시 유용할 수 있다. 일부 구체예에서, 의약 조성물은 변이체 CD80 폴리펩타이드를 그의 동족 결합 파트너 CD28의 길항 활성을 나타내는 포맷 및/또는 CD28을 통해 공동자극 시그널링을 차단 또는 억제하는 포맷으로 함유한다. 이러한 치료적 용도와 관련하여 사용되기 위한 CD80 폴리펩타이드의 예시적인 포맷은, 예를 들어, 가용성인 변이체 CD80 폴리펩타이드 (예컨대 변이체 CD80-Fc 융합 단백질), 면역조절 단백질 또는 변이체 CD80 폴리펩타이드 및 Fc 융합체인 그의 가용성 형태를 포함하여 또 다른 IgSF 도메인과의 "적층체", 분비가능한 면역조절 단백질을 발현하는 조작된 세포, 또는 감염된 세포(예컨대 종양 세포 또는 APC, 예컨대 수지상 세포)에서의 분비가능한 면역조절 단백질의 발현 및 분비를 위한 것과 같이, 분비가능한 면역조절 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 감염 물질을 함유한다.
[398] 일부 구체예에서, 염증 또는 자가면역 질환은 항호중구 세포질 항체 (ANCA)-관련 혈관염, 혈관염, 자가면역 피부 질환, 이식, 류마티스성 질환, 염증상 위장관 질환, 염증상 안질환, 염증상 신경 질환, 염증상 폐질환, 염증성 내분비 질환, 또는 자가면역 혈액학적 질환이다.
[399] 일부 구체예에서, 본원의 의약 조성물에 의해 치료될 수 있는 염증 또는 자가면역 질환은 애디슨병, 알레르기, 탈모증, 알츠하이머, 항-호중구 세포질 항체 (ANCA)-관련 혈관염, 강직성 척추염, 항인지질 증후군 (휴 증후군), 천식, 죽상동맥경화증, 류마티스성 관절염, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 자가면역 내이질환, 자가면역 림프구증식 증후군, 자가면역 심근염, 자가면역 난소염, 무정자증, 베체트병, 버거병, 수포성 천포창, 심근병증, 심혈관 질환, 셀리악 스프루/셀리악 병, 만성피로 면역부전 증후군(CFIDS), 만성특발성 다발신경염, 만성염증성 탈수초증, 다발성 신경병증(CIPD), 만성 재발 성 다발성 신경병증 (길랭-바레 증후군), 척크-스트라우스 증후군 (CSS), 간질성 천포창, 저온응집소병(CAD), COPD (만성폐쇄성 폐질환), CREST 증후군, 크론병, 피부염, 포진피부염, 피부근육염, 당뇨병, 원반 낭창, 습진, 증식물집표피박리증, 필수 혼합형 저온 글로블린혈증, 에반 증후군, 외전 발작, 섬유근통, 굿파스쳐 증후군, 그레이브병, 하시모토 갑상선염, 특발성 폐섬유증, 특발성 혈소판 감소증 자반병 ITP), IgA 신증, 면역증식성 질환 또는 장애, 염증성 장질환 (IBD), 간질성 폐질환, 청소년 관절염, 청소년 특발성 관절염 (JIA), 가와사키병, 램버트-이튼 근무력 증후군, 편평태선, 루푸스 신장염, 림프구성 리포피시티스, 메니에르병, 밀러 피쉬 증후군/급성 파종뇌척수염, 혼합 연결조직 질환, 다발경화증(MS), 근육 류마티즘, 근육통성 뇌척수염 (ME), 중증 근무력증, 눈의 염증, 낙엽천포창, 보통천포창, 악성빈혈, 결절다발동맥염, 다발연골염, 다분비성 증후군(휘태커 증후군), 류마티스성 다발근육통, 다발근육염, 프라이머리 아감마글루불린혈증, 일차담관경화증/자가면역 담도감염병증, 건선, 건선 관절염, 레이노 현상, 라이터 증후군/반응성 관절염, 재협착, 류마티스성 발열, 류마티스 질환, 사코이드증, 슈미트 증후군, 공피증, 쉐그렌 증후군, 강직증후군, 전신홍반루푸스(SLE), 전신 공피증, 타카야스 관절염, 일시적 관절염/자이언트 세포 동맥염, 갑상선염, I형 당뇨병, 궤양성 대장염, 포도막염, 혈관염, 백반증, 간질성 장질화나 또는 베게너 육아종증이다. 일부 구체예에서, 염증 또는 자가면역 질환은 간질성 장질환, 이식, 크론병, 궤양성 대장염, 다발경화증, 천식, 류마티스성 관절염 및 건선으로부터 선택된다.
[400] 일부 구체예에서, 의약 조성물은 자가면역 상태를 조절하기 위해 투여된다. 예를 들어, 공여자로부터의 조직, 세포 또는 장기이식을 수혜자가 거부하는 것을 억제하는 방법에 있어서 면역 반응을 억제하는 것이 이로울 수 있다. 그러므로, 일부 구체예에서, 본원에 설명된 의약 조성물은 이식편 대 숙주 질환(GVHD)와 같은 이식편-관련 또는 이식 관련 질병 또는 장애를 제한 또는 예방하는데 사용된다. 일부 구체예에서, 의약 조성물은 이식 또는 식립된(transplanted, grafted) 골수, 장기, 피부, 신경, 아일렛 또는 실질 세포(parenchymal cells)의 자가면역 거부를 억제하는데 이용된다.
[401] 본원에 설명된 조작된 세포를 포함하는 의약 조성물 및 방법은 입양 세포 전달 용도에 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 조작된 세포를 포함하는 세포 조성물은 예를 들어 포유동물의 암 치료 또는 다른 구체예에서 자가면역 질환의 치료에 대한 면역요법 접근에서 면역학적 활성을 조절하는 관련 방법에 사용될 수 있다. 사용된 방법은 일반적으로 친화성 변형된 IgSF 도메인의 특이적 결합 및 포유동물 세포의 면역학적 활성의 조절을 허용하는 조건 하에서 포유동물 세포와 본 발명의 TIP를 접촉시키는 방법을 포함한다. 일부 구체예에서, 면역 세포 (예컨대 종양 침윤 림프구 (TIL), T-세포 (CD8+ 또는 CD4+ T-세포 포함), 또는 APC)를 조작하여 본 발명에 설명된 가용성 변이체 CD80 폴리펩타이드, 면역조절 단백질, 또는 컨쥬게이트 및/또는 막 단백질로서 발현시킨다. 이어서 조작된 세포를 APC, 제2 림프구 또는 종양 세포와 같이, 면역활성 조절이 요망되는 포유동물 세포와, 친화성 변형된 IgSF 도메인을 상기 포유동물 세포에서 친화성 변형된 IgSF 도메인의 카운터-구조에 대한 특이적 결합을 허용하는 조건 하에서 접촉시킴으로써 면역학적 활성을 상기 포유동물 세포에서 조절할 수 있다. 세포는 생체내 똔느 생체외에서 접촉될 수 잇다.
[402] 일부 구체예에서, 조작된 세포는 자가(autologous) 세포이다. 또 다른 구쳉PDp서, 세포는 동종이계이다. 일부 구체예에서, 세포는 그것이 분리되었던 포유동물 내로 재주입되는 조작된 자가 세포이다. 일부 구체예에서, 세포는 포유동물 내로 주입되는 조작된 동종이계 세포이다. 일부 구체예에서, 세포는 환자의 혈액 또는 종양으로부터 수확되어, 폴리펩타이드를 발현하도록 조작되고(예컨대 본원에 설명된 변이체 CD80 폴리펩타이드, 면역조절 단백질, 또는 컨쥬게이트), 시험관내 배양 시스템에서 증식된 다음(예를 들어 세포 자극에 의해), 종양 파괴를 매개하도록 환자에게 재주입된다. 일부 구체예에서, 이러한 방법은 입양세포 전달에 의해 수행되는데 이 방법에서는 TIP를 발현하는 세포(예컨대 T-세포)를 환자에게 재주입한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 치료 조성물 및 방법은 림프종, 림프성 백혈병, 골수성 백혈병, 자궁내막암, 신경모세포종, 또는 다발성 골수종과 같은 암에 걸린 포유동물 환자를 치료하는데 사용된다.
VIII. 예시적인 구체예
[403] 본원에서 제공되는 구체예들은 다음과 같다:
1. IgV 도메인 또는 그의 특이적 결합 단편, IgC 도메인 또는 그의 특이적 결합 단편, 또는 양자 모두를 포함하는 변이체 CD80 폴리펩타이드로서, 여기서 상기 변이체 CD80 폴리펩타이드는 비변형 CD80 또는 그의 특이적 결합 단편 내에 하나 이상의 아미노산 변형을, SEQ ID NO:　28의 넘버링을 참조로 대응하는 위치(들) 4, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 21, 22, 24, 25, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 36, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 47, 48, 50, 52, 53, 54, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 72, 74, 76, 77, 80, 81, 83, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 99, 102, 103, 104, 107, 108, 109, 110, 114, 115, 116, 117, 118, 120, 121, 122, 126, 127, 128, 129, 130, 133, 137, 140, 142, 143, 144, 148, 149, 152, 154, 160, 162, 164, 168, 169, 174, 175, 177, 178, 183, 185, 188, 190, 192, 193, 또는 199에 포함하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
2. 구체예 1에서, 하나 이상의 아미노산 변형은 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 포함하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
3. 구체예 1 또는 구체예 2에서, 비변형 CD80은 포유동물 CD80인 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
4. 구체예 1-3 중 어느 하나의 구체예에 있어서, CD80은 인간 CD80인 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
5. 구체예 1-4 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는:
IgV 도메인 또는 그의 특이적 결합 단편; 및
IgC 도메인 또는 그의 특이적 결합 단편
을 포함한느 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
6. 구체예 1-5 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 비변형 CD80은 (i) SEQ ID NO:28에 제시된 아미노산 서열, (ii) SEQ ID NO:28에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하너가; 또는 (iii) IgV 도메인 또는 IgC 도메인 또는 그의 특이적 결합 단편을 포함하는 그의 일부를 포함하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
7. 구체예 1-6 중 어느 하나의 구체예에 있어서:
IgV 도메인 또는 IgC 도메인의 특이적 결합 단편은 적어도 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 또는 그 이상의 아미노산 길이를 갖고;
IgV 도메인의 특이적 결합 단편은 SEQ ID NO:1의 아미노산 35-135로서 제시된 IgV 도메인의 길이의 적어도 80%인 길이를 포함하거나; 또는
IgC 도메인의 특이적 결합 단편은 SEQ ID NO:1의 아미노산 145-230으로서 제시된 IgC 도메인의 길이의 적어도 80%인 길이를 포함하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
8. 구체예 1-7 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 아미노산 변형, 선택적으로 아미노산 치환을 포함하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
9. 구체예 1-8 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 28, 또는 그의 특이적 결합 단편에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
10. 구체예 1-9 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 변이체 CD80은 비변형 CD80에 비해 CD28의 엑토도메인, PD-L1, 또는 CTLA-4에 대해 변경된 특이성을 나타내는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
11. 구체예 9에 있어서, 변경된 결합은 변경된 결합 친화성 및/또는 변경된 결합 선택성인 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
12. 구체예 1-11 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환은 V4M, K9E, E10R, V11S, A12G, A12T, A12V, T13N, L14A, S15V, S15F, C16S, C16G, C16L, G17W, H18L, H18R, H18Y, V20L, S21P, V22A, E24G, L25P, Q27R, T28A, T28S, R29C, R29D, R29H, R29V, I30V, Y31F, Y31H, Y31L, Q33H, K36E, K36G, K37E, K37Q, M38I, M38L, M38T, M38V, L40M, T41A, T41G, T41D, T41I, M42T, M43I, M43Q, M43R,M43V, S44P, M47T, N48D, N48I, W50G, E52G, Y53C, K54M, F59L, F59S, D60V, I61N, T62S, N63S, N64S, L65H, S66H, I67F, I67T, V68A, V68M, I69T, L70Q, L70P, L70R, L72P, P74L, D76G, E77G, E77K, Y80N, E81A, E81R, E81V, V83A, V83I, L85I, L85R, K86E, Y87N, E88D, E88G, K89E, K89N, K89R, D90K, D90L, D90N, A91E, A91G, A91S, A91T, F92L, F92N, F92P, F92Y, K93I, K93E, K93Q, K93R, K93V, R94G, R94L, R94F, E95K, H96R, L97R, E99D, E99G, L102S, S103L, S103P, V104A, V104L, D107N, F108L, P109S, P109H, T110A, S114T, D115G, F116S, F116L, E117V, E117G, I118V, I118A, I118T, T120S, S121P, N122S, I126L, I126V, I127T, C128Y, C128R, S129L, S129P, T130A, G133D, P137L, S140T, L142S, E143G, N144D, N144S, L148S, N149D, N149S, N152T, T154I, T154A, E160G, E162G, Y164H, S168G, K169E, K169I, K169S, M174T, M174V, T175A, N177S, H178R, L183H, K185E, H188D, H188Q, R190S, N192D, Q193L, T199S, 또는 그의 보존적 아미노산 치환인 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
13. 구체예 1-12 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환은 V4M/L70Q/A91G/T120S/T130A, A12T/H18L/M43V/F59L/E77K/P109S/I118T,A12V/S15F/Y31H/T41G/T130A/P137L/N152T, V20L/L70Q/A91S/T120S/T130A, V22A/L70Q/S121P, E24G/L25P/L70Q/T120S, T28S/L70Q/A91G/E95K/T120S/T130A, E24G/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/F59L/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/H96R,R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M42T/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/L148S/N149S,R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/N149S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118T/N149S,R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/N144S/N149S,R29H/Y31H/T41G/Y87N/E88G/K89E/D90N/A91G/P109S, R29H/E52G/L70R/E88G/A91G/T130A, R29H/E52G/T120S/T130A,R29V/Y31F/K36G/M38L/M43Q/E81R/V83I/L85I/K89R/D90L/A91E/F92N/K93Q/R94G,R29V/M43Q/E81R/L85I/K89R/D90L/A91E/F92N/K93Q/R94G,Y31H/T41G/L70Q/A91G/T120S/T130A,K36G, K36G/K37Q/M38I/L40M, K36G/K37Q/M38I/F59L/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/E99G/T130A/N149S, K36E/I67T/L70Q/A91G/T120S/T130A/N152T, K37E/F59S/L70Q/A91G/T120S/T130A,M38T/L70Q/E77G/A91G/T120S/T130A/N152T,M38V/T41D/M43I/W50G/D76G/V83A/K89E/T120S/T130A,T41I/A91G,S44P/L70Q/A91G/T130A,E52G/L70Q/A91G/T120S/T130A, K54M/A91G/T120S, D60V/A91G/T120S/T130A, N63S/L70Q/A91G/T120S/T130A, S66H/D90G/T110A/F116L, I67F/L70R/E88G/A91G/T120S/T130A, I67T/L70Q/A91G/T120S, V68A/T110A, V68M/L70P/L72P/K86E,L70Q/A91G/T110A/T120S/T130A,L70Q/E81A/A91G/T120S/I127T/T130A,L70Q/Y87N/A91G/T130A, L70Q/A91G, L70Q/A91G/E117G/T120S/T130A, L70Q/A91G/T120S/T130A, L70Q/A91G/T130A, L70Q/A91G/I118A/T20S/T130A, L70R/A91G/T120S/T130A, E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R, K89E/T130A,K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R, K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R/N122S/N177S,E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R/N122S/N177S A91G, A91G/F92L/F108L/T120S, A91G/L102S, A91G/S103P, A91G/T120S/T130A, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T120S/I127T/T130A/K169E, 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M38V/T41D/M43I/W50G/D76G/V83A/K89E/I118V/T120S/I126V/T130A, A12V/S15F/Y31H/M38L/T41G/M43L/D90N/T130A/P137L/N149D/N152T, I67F/L70R/E88G/A91G/I118V/T120S/T130A, E24G/L25P/L70Q/A91G/I118V/T120S/N152T, E24G/L25P/L70Q/A91G/I118V/T120S/N152T, A91G/F92L/F108L/I118V/T120S, E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R/N122S/N177S, K36G/K37Q/M38I/L40M/F59L/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/E99G/T130A/N149S, K36G/L40M, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/I127T/T130A/K169E, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/L70Q/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/I127T/T130A, H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/I127T/T130A/K169E, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/T130A/K169E/M174T, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/N48D/F59L/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/I127T/T130A/H188D, H18R/R29D/Y31L/Q33H/K36G/K37E/M38I/T41A/M43R/M47T/L70Q/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/T130A/K169E/H188D, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/L70Q/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/I127T/T130A/E143G/K169E/M174V/H188D, R29D/I30V/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/I127T/T130A/H188D, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/I127T/T130A/H188D, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/L70Q/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/I127T/T130A/K169E, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/L70Q/E81V/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/I127T/T130A, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/L70Q/E81V/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/I127T/T130A, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/I127T/T130A/K169E/H188D, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/F108L/I118V/T120S/T130A/K169E/H188D, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/L70Q/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/T130A/N149D/K169E/H188D, H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/L70Q/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/T130A/K169E/H188D, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/I127T/C128Y/T130A/H188D, H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/E99D/T130A, H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/L70Q/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/T130A/K169E, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/I61N/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94F/V104A/I118V/T120S/I126V/T130A, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94F/I118V/T120S/T130A, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94F/I118V/T120S/T130A R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/T62S/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/T130A/K169E/T175A, H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/I127T/T130A/L142S/H188D, C16S/H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T110A/I118V/H188D, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/A91G/I118V/T120S/I127T/T130A/H188D, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/L70Q/D76G/A91G/S103L/I118V/T120S/I127T/T130A, Y53C/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/I127T/T130A/K169E, Y53C/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/I127T/T130A/K169E, T62S/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/T130A/K169E,Y53C/L70Q/D90G/T130A/N149D/N152T/H188D, Y53C/L70Q/D90G/T130A/N149D/N152T/H188D, H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/I127T/T130A/H188D, 또는 H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T130A/N149S인 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
14. 구체예 1-13 중 어느 하나의 구체예에 있어서, SEQ ID NOS: 55-108, 280-346, 414-475 또는 그의 특이적 결합 단편 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NOS:55-108, 280-346, 414-475 또는 그의 특이적 결합 단편 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 나타내고 하나 이상의 아미노산 치환을 함유하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
15. 구체예 1-14 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 IgV 도메인 또는 그의 특이적 결합 단편을 포함하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
16. 구체예 1-15 중 어느 하나의 구체예에 있어서, IgV 도메인 또는 그의 특이적 단편은 변이체 CD80 폴리펩타이드의 유일한 CD80 부분인 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
17. 구체예 1-14 중 어느 하나의 구체예에 있어서, IgC 도메인 또는 그의 특이적 단편은 변이체 CD80 폴리펩타이드의 유일한 CD80 부분인 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
18. 구체예 1-17 중 어느 하나의 구체예에 있어서, SEQ ID NOS: 153-195, 347, 373-386, 476-477 또는 그의 특이적 결합 단편 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열, SEQ ID NOS: 153-195, 347, 373-386, 476-477 또는 그의 특이적 결합 단편 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 나타내고 하나 이상의 아미노산 치환을 함유하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
19. 구체예 1-17 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 CD28의 엑토도메인, PD-L1, 또는 CTLA-4에 대해 증가된 친화성으로 특이적으로 결합하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
20. 구체예 1-19 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 변이체 폴리펩타이드는 엑토도메인에 대한 비변형 CD80의 결합에 비해 CD28의 엑토도메인, PD-L1 또는 CTLA-4에 대해 증가된 선택성으로 특이적으로 결합하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
21. 구체예 20에 있어서, 증가된 선택성은 하나의 동족 결합 파트너 대 또 다른 동족 결합 파트너에 대한 비변형 CD80 폴리펩타이드의 결합 비율과 비교하여, CD28, PD-L1 및 CTLA-4로부터 선택된 하나의 동족 결합 파트너 대 또 다른 동족 결합 파트너의 비율이 더 큰 것을 포함하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
22. 구체예 19 또는 구체예 20에 있어서, 변이체 폴리펩타이드는 CD28의 엑토도메인에 대한 비변형 CD80의 결합에 비해 증가된 선택성으로 CD28의 엑토도메인에 특이적으로 결합하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
23. 구체예 22, 증가된 선택성은 CD28 대PD-L1 또는 CTLA-4에 대한 비변형 CD80 폴리펩타이드의 결합 비율에 비해 CD28 대 PD-L1 또는 CTLA-4에 대해 더 큰 비율을 포함하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
24. 구체예 21 또는 구체예 23에 있어서, 상기 비율은 적어도 또는 적어도 약 1.5배, 2.0배, 3.0배, 4.0배. 5배, 10배, 15배, 20배, 30배, 40배, 50배 또는 그 이상 더 큰 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
25. 구체예 1-24 중 어느 하나에 있어서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 증가된 친화성으로 CD28의 엑토도메인에 특이적으로 결합하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
26. 구체예 19 또는 구체예 25에 있어서, 엑토도메인에 대한 증가된 친화성은 엑토도메인에 대한 비변형 CD80의 결합 친화성에 비해 1.2배, 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배 또는 60배 이상 증가된 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
27. 구체예 1-26 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환은 SEQ ID NO:　28의 넘버링을 참조로 12, 18, 20, 29, 31, 36, 40, 41, 43, 52, 59, 60, 63, 67, 70, 77, 81, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 107, 109, 114, 117, 118, 120, 122, 127, 130, 144, 169, 177 또는 199 위치(들)에 대응하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
28. 구체예 1-27 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환은 A12T, H18L, V20L, R29H, Y31H, K36G, T41G, T41I, M43V, E52G, F59L, D60V, N63S, I67T, L70Q, L70R, E77K, E81A, Y87N, E88D, E88G, K89E, K89R, D90K, D90N, L40M, A91G, A91S, F92Y, K93R, D107N, P109S, S114T, E117G, I118A, I118T, I118V, T120S, I127T, T130A, N144D, K169E,N177S, 및 T199S으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 및 그의 보존적 아미노산 치환인 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
29. 구체예 1-28 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환은 A12T/H18L/M43V/F59L/E77K/P109S/I118T, V20L/L70Q/A91S/T120S/T130A, V20L/L70Q/A91S/I118V/T120S/T130A,R29H/Y31H/T41G/Y87N/E88G/K89E/D90N/A91G/P109S, K36G, K36G/L40M,T41I/A91G, E52G/L70/A91G/T120S/T130A, E52G/L70Q/A91G/D107N/I118V/T120S/T130A/K169E,D60V/A91G/T120S/T130A, D60V/A91G/I118V/T120S/T130A/K169E,N63S/L70Q/A91G/T120S/T130A, N63S/L70Q/A91G/S114T/I118V/T120S/T130A, I67T/L70Q/A91G/T120S, I67T/L70Q/A91G/I118V/T120S,L70Q/E81A/A91G/T120S/I127T/T130A, L70Q/E81A/A91G/I118V/T120S/I127T/T130A,L70Q/Y87N/A91G/T130A, L70Q/A91G, L70Q/A91G/N144D, L70Q/A91G/E117G/T120S/T130A, L70Q/A91G/E117G/I118V/T120S/T130A,L70Q/A91G/I118A/T120S/T130A, L70Q/A91G/I118A/T120S/T130A/K169E,L70Q/A91G/T120S/T130A, L70R/A91G/T120S/T130A, L70R/A91G/I118V/T120S/T130A/T199S L70Q/A91G/I118V/T120S/T130A/K169E,E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R, K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R, E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R/N122S/N177S, 또는 K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R/N122S/N177S인 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
30. 구체예 1-29 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 증가된 친화성으로 PD-L1의 엑토도메인에 특이적으로 결합하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
31. 구체예 30에 있어서, 엑토도메인에 대한 증가된 친화성은 엑토도메인에 대한 비변형 CD80의 결합 친화성에 비해 1.2배, 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배 또는 60배 이상 증가된 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
32. 구체예 1-31 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 변이체 폴리펩타이드는 엑토도메인에 대한 비변형 CD80의 결합에 비해 증가된 선택성으로 PD-L1의 엑토도메인에 특이적으로 결합하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
33. 구체예 32에 있어서, 증가된 선택성은 PD-L1 대 CD28 또는 CTLA-4에 대한 비변형 CD80 폴리펩타이드의 결합 비율에 비해 PD-L1 대 CD28 또는 CTLA-4에 대한 결합 비율이 더 큰 것을 포함하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
34. 구체예 33에 있어서, 상기 비율은 적어도 또는 적어도 약 1.5배, 2.0배, 3.0배, 4.0배. 5배, 10배, 15배, 20배, 30배, 40배, 50배 또는 그 이상 더 큰 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
35. 구체예 1-34 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환은 SEQ ID NO:　28의 넘버링을 참조로 12, 18, 29, 31, 33, 36, 38, 40, 41, 42, 43, 47, 48, 59, 64, 67, 68, 70, 77, 81, 85, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 97, 104, 109, 115, 117, 118, 120, 122, 126, 130, 133, 140, 144, 148, 149, 168, 178, 183, 188 또는 193 위치(들)에 대응하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
36. 구체예 1-35 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환은 A12G, A12T, H18L, S21P, V22A, T28A, R29D, R29H, Y31H, Y31L, Q33H, K36G, M38I, M38L, L40M, T41A, T41G, M42T, M43R, M43V, M47T, N48I, F59L, N64S, I67T, V68A, V68M, L70Q, E77K, E81V, L85R, Y87N, E88D, E88G, K89E, K89N, K89R, D90K, D90N, A91G, A91T, F92P, F92Y, K93V, R94F, R94L, L97R, S103L, S103P, V104L, P109H, P109S, D115G, E117V, I118T,I118V, T120S, N122S, I126L, T130A, G133D, S140T, N144S, L148S, N149S, S168G, K169I, K169S, N177S, H178R, L183H, H188Q, R190S 및 Q193L, 및 그의 보존적 아미노산 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
37. 구체예 1-36 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환은A12T/H18L/M43V/F59L/E77K/P109S/I118T, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118T/N149S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/N144S/N149S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M42T/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/L148S/N149S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/N149S, R29H/Y31H/T41G/Y87N/E88G/K89E/D90N/A91G/P109S, K36G, K36G/L40M,I67T/L70Q/A91G/T120S, I67T/L70Q/A91G/I118V/T120S, E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R, K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R, A91G, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118T/N149S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/N144S/N149S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M42T/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/L148S/N149S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/N149S, R29H/Y31H/T41G/Y87N/E88G/K89E/D90N/A91G/P109S, K36G, K36G/L40M,I67T/L70Q/A91G/T120S, I67T/L70Q/A91G/I118V/T120S,E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R, K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R, A91G, H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/I127T/T130A/H188D, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/V68M/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T130A/N149S/R190S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94F/E117V/I118T/N149S/S168G/H188Q, V22A/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/V68M/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T130A, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/N64S/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94F/ I118T/T130A/N149S/K169I, V22A/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/V68M/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/D115G/I118T/T130A/G133D/N149S, T28A/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/ V104L/T130A/N149S, H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/L97R/N149S/H188Q, K89E/T130A, K89E/K93E/T130A, S21P/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/N48I/V68A/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/S21P/ N48I/V68A/P109H/I126L/K169I, H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/V68M/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T130A, H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T130A/N149S, A12G/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/V68A/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/ L97R/T130A/L183H, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118T/T130A/S140T/N149S/K169S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118T/T130A/N149S/K169I/Q193L, V22A/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/ I118T/T130A/N149S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118T/T130A/N149S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118T/T130A/N149S/K169I, 또는 R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94F/T130A/N149S/K169I인 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
38. 구체예 1-37 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 증가된 친화성으로 CD28의 엑토도메인 및 PD-L1의 엑토도메인에 특이적으로 결합하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
39. 구체예 1-38 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환은 SEQ ID NO:　28의 넘버링을 참조로 12, 18, 36, 40, 43, 59, 77, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 109, 118, 122, 또는 177 위치(들)에 대응하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
40. 구체예 1-39 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환은 A12T, H18L, K36G,L40M, M43V, F59L, E77K, E88D, K89R, D90K, A91G, F92Y, K93R, P109S, I118T, N112S, N177S, 및 그의 보존적 아미노산 치환으로 이루어진 군으로부터 선택된느 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
41. 구체예 1-40 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환은 A12T/H18L/M43V/F59L/E77K/P109S/I118T, K36G, K36G/L40M,E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R, K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R, E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R/N122S/N177S, 또는 K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R/N122S/N177S인 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
42. 구체예 1-41 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 증가된 친화성으로 CTLA-4의 엑토도메인에 특이적으로 결합하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
43. 구체예 42에 있어서, 엑토도메인에 대한 증가된 친화성은 엑토도메인에 대한 비변형 CD80의 결합 친화성에 비해 1.2배, 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배 또는 60배 증가된 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
44. 구체예 1-43 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 변이체 폴리펩타이드는 엑토도메인에 대한 비변형 CD80의 결합에 비해 증가된 선택성으로 CTLA-4의 엑토도메인에 특이적으로 결합하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
45. 구체예 44에 있어서, 증가된 선택성은 CTLA-4 대 CD28 또는 PD-L1에 대한 비변형 CD80 폴리펩타이드의 결합 비율에 비해 CTLA-4 대 CD28 또는 PD-L1에 대해 더 큰 결합 비율을 포함하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
46. 구체예 45에 있어서, 상기 비율은 적어도 또는 적어도 약 1.5배, 2.0배, 3.0배, 4.0배. 5배, 10배, 15배, 20배, 30배, 40배, 50배 또는 그 이상 더 큰 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
47. 구체예 1-46 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환은 SEQ ID NO:　28의 넘버링을 참조로 4, 29, 31, 36, 40, 41, 52, 67, 68, 70, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 107, 109, 110, 118, 120, 130, 144, 또는 169 위치(들)에 대응하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
48. 구체예 1-47 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환은 V4M, R29H, Y31H, K36G,L40M T41G, E52G, I67T, V68A, L70Q, Y87N, E88D, E88G, K89E, K89R, D90K, D90N, A91G, F92Y, K93R, D107N, P109S, T110A, I118V, T120S, T130A, N144D, 및 K169E 및 그의 보존적 아미노산 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
49. 구체예 1-48 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환은 V4M/L70Q/A91G/T120S/T130A,V4M/L70Q/A91G/I118V/T120S/T130A/K169E, R29H/Y31H/T41G/Y87N/E88G/K89E/D90N/A91G/P109S, K36G, K36G/L40M,E52G/L70Q/A91G/T120S/T130A, E52G/L70Q/A91G/D107N/I118V/T120S/T130A/K169E,I67T/L70Q/A91G/T120S, I67T/L70Q/A91G/I118V/T120S, V68A/T110A, L70Q/A91G, L70Q/A91G/N144D,L70Q/A91G/T120S/T130A, L70Q/A91G/I118V/T120S/T130A/K169E,L70Q/A91G/T130A, K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R, E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R, A91G/I118V/T120S/T130A, 또는 A91G/T120S/T130A인 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
50. 구체예 1-49 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 증가된 친화성으로 CD28의 엑토도메인 및 CTLA-4의 엑토도메인에 특이적으로 결합하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
51. 구체예 1-50 중 어느 하나의 구체예에 있어서 하나 이상의 아미노산 치환은 SEQ ID NO:　28의 36, 40, 52, 70, 88, 89, 90, 91, 92, 93,107, 118, 120, 130,144, 또는 169 위치(들)에 대응하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
52. 구체예 1-51 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환은 K36G, L40M, E52G, L70Q, E88D, K89R, D90K, A91G, F92Y, K93R, D107N, I118V, T120S, T130A, N144D, 및 K169E, 및 그의 보존적 아미노산 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
53. 구체예 1-52 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환은 K36G, K36G/L40M, K36G/L40M, K36G/L40M, E52G/L70Q/A91G/T120S/T130A, E52G/L70Q/A91G/D107N/I118V/T120S/T130A/K169E,L70Q/A91G, L70Q/A91G/N144D,L70Q/A91G/T120S/T130A, L70Q/A91G/I118V/T120S/T130A/K169E, E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R, 또는 K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R인 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
54. 구체예 1-53 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 증가된 친화성으로 PD-L1의 엑토도메인 및 CTLA-4의 엑토도메인에 특이적으로 결합하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
55. 구체예 1-54 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환은 SEQ ID NO:　28의 29, 31, 36, 40, 41, 67, 70, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 109, 118, 120, 122, 130, 또는 178 위치(들)에 대응하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
56. 구체예 1-55 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환은 R29H, Y31H, K36G, L40M, T41G, I67T, L70Q, Y87N, E88D, E88G, K89E, K89R, D90N, D90K, A91G, F92Y, K93R, P109S, I118V, T120S, 및 그의 보존적 아미노산 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
57. 구체예 1-56 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환은 R29H/Y31H/T41G/Y87N/E88G/K89E/D90N/A91G/P109S, K36G, K36G/L40M, I67T/L70Q/A91G/T120S, I67T/L70Q/A91G/I118V/T120S,E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R, 또는 K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R인 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
58. 구체예 1-57 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 증가된 친화성으로 CD28의 엑토도메인, PD-L1의 엑토도메인, 및 CTLA-4의 엑토도메인에 특이적으로 결합하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
59. 구체예 1-58 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환은 SEQ ID NO:　28의 36, 40, 88, 89, 90, 91, 92, 또는 93 위치(들)에 대응하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
60. 구체예 1-59 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환은 K36G, L40M, E88D, K89R, D90K, A91G, F92Y, K93R, 및 그의 보존적 아미노산 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
61. 구체예 1-60 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환은 K36G,K36G/L40ME88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R, 또는 K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R인 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
62. 구체예 1-41 중 어느 하나의 구체예에 있어서:
변이체 CD80 폴리펩타이드는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 증가된 친화성으로 CD28의 엑토도메인 또는 PD-L1의 엑토도메인에 특이적으로 결합하고, 및
변이체 CD80 폴리펩타이드는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 감소된 친화성으로 CTLA-4의 엑토도메인에 특이적으로 결합하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
63. 구체예 1-41 및 62 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환은 SEQ ID NO:　28의 넘버링을 참조로 29, 31, 33, 36, 38, 41, 42, 43, 47, 63, 67, 70, 81, 85, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 109, 114, 118, 120, 127, 130, 144, 148, 또는 149 위치(들)에 대응하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
64. 구체예 1-41, 62, 및 63 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환은 R29D, R29H, Y31H, Y31L, Q33H, K36G, M38I, T41A, T41G, M42T, M43R, M47T, N63S, I67T, L70Q, E81A, E81V, L85R, Y87N, E88G, K89E, K89N, D90N, A91G, A91T, F92P, K93V, R94L, P109S, S114T, I118T, I118V, T120S, I127T, T130A, N144S, L148S, 및 N149S, 및 그의 보존적 아미노산 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
65. 구체예 1-41 및 62-64 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환은N63S/L70Q/A91G/T120S/T130A, N63S/L70Q/A91G/S114T/I118V/T120S/T130A 또는 L70Q/Y87N/A91G/T120S/I127T/T130A인 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
66. 구체예 1-41 및 62-65 중 어느 하나의 구체예에 있어서:
변이체 CD80 폴리펩타이드는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 증가된 친화성으로 CD28의 엑토도메인에 특이적으로 결합하고, 및
변이체 CD80 폴리펩타이드는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 감소된 친화성으로 CTLA-4의 엑토도메인에 특이적으로 결합하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
67. 구체예 1-41 및 62-66 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환은 SEQ ID NO:　28의 63, 70, 81, 87, 91, 114, 118, 120, 127, 또는 130 위치(들)에 대응하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
l68. 구체예 1-41, 및 62-67 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환은 N63S, L70Q, E81A, Y87N, A91G, S114T, I118V, T120S, I127T, 및 T130A, 및 그의 보존적 아미노산 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
69. 구체예 1-41, 및 62-67 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환은 R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M42T/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/L148S/N149S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118T/N149S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/N144S/N149S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/N149S, R29H/Y31H/T41G/Y87N/E88G/K89E/D90N/A91G/P109S, N63S/L70Q/A91G/T120S/T130A, N63S/L70Q/A91G/S114T/I118V/T120S/T130A,I67T/L70Q/A91G/T120S, I67T/L70Q/A91G/I118V/T120S, 또는 L70Q/Y87N/A91G/T120S/I127T/T130A인 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드..
70. 구체예 1-41 및 62-69 중 어느 하나의 구체예에 있어서:
변이체 CD80 폴리펩타이드는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 증가된 친화성으로 PD-L1의 엑토도메인에 특이적으로 결합하고, 및
변이체 CD80 폴리펩타이드는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 감소된 친화성으로 CTLA-4의 엑토도메인에 특이적으로 결합하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
71. 구체예 1-41 및 62-70 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환은 SEQ ID NO:　28의 29, 31, 33, 36, 38, 41, 42, 43, 47, 67, 70, 81, 85, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 109, 118, 120, 144, 148, 또는 149 위치(들)에 대응하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
72. 구체예 1-41, 및 62-71 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환은 R29D, R29H, Y31H, Y31L, Q33H, K36G, M38I, T41A, T41G, M42T, M43R, M47T, I67T, L70Q, E81V, L85R, Y87N, E88G, K89E, K89N, D90N, A91G, A91T, F92P, K93V, R94L, P109S, I118T, I118V, T120S, N144S, L148S, 및 N149S, 및 그의 보존적 아미노산 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
73. 구체예 1-41, 및 62-72 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환은 R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M42T/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/L148S/N149S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118T/N149S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/N144S/N149S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/N149S, R29H/Y31H/T41G/Y87N/E88G/K89E/D90N/A91G/P109S, I67T/L70Q/A91G/I118V/T120S 또는 I67T/L70Q/A91G/T120S인 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
74. 구체예 1-41 및 62-73 중 어느 하나의 구체예에 있어서:
변이체 CD80 폴리펩타이드는, 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 증가된 친화성으로 CD28의 엑토도메인 및 PD-L1의 엑토도메인에 특이적으로 결합하고, 및
변이체 CD80 폴리펩타이드는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 감소된 친화성으로 CTLA-4의 엑토도메인에 특이적으로 결합하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
75. 구체예 1-41 및 62-74변이체 CD80 폴리펩타이드, 하나 이상의 아미노산 치환은 SEQ ID NO:　28의 위치(들) 70, 81, 87, 91, 또는 120에 대응하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
76. 구체예 1-41, 및 62-75 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환은 L70Q, Y87N, A91G, 및 T120S, 및 그의 보존적 아미노산 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
77. 구체예 10-76 중 어느 하나의 구체예에 있어서, CD28은 인간 CD28인 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
78. 구체예 10-77 중 어느 하나의 구체예에 있어서, PD-L1은 인간 PD-L1인 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
79. 구체예 10-78 중 어느 하나의 구체예에 있어서, CTLA-4는 인간 CTLA-4인 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
80. 구체예 1-79 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 결합 활성은 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 1.2배, 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 20배, 30배 40배 또는 50배 이상 변경된(증가 또는 감소된) 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
81. 구체예 1-80 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 가용성 단백질인 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
82. 구체예 1-81 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 멀티머화 도메인에 연결된 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
83. 구체예 1-81 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 멀티머 폴리펩타이드, 선택적으로, 멀티머화 도메인에 연결된제1 변이체 CD80 폴리펩타이드 및 멀티머화 도메인에 연결된 제2 변이체 CD80 폴리펩타이드를 포함하는, 다이머 폴리펩타이드인 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
84. 구체예 83에 있어서, 제1 변이체 CD80 폴리펩타이드 및 제2 변이체 CD80 폴리펩타이드는 동일 또는 상이한 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
85. 구체예 82-84 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 멀티머화 도메인은 이펙터 기능이 감소된 Fc 도메인 또는 그의 변이체인 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
86. 구체예 1-85 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 상기 폴리펩타이드의 생물학적 반감기를 증가시키는 모이어티에 연결된 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
87. 구체예 1-86 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 이펙터 기능이 감소된 Fc 도메인 또는 그의 변이체에 연결된 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
88. 구체예 85-87 중 어느 하나의 구체예에 있어서:
Fc 도메인은 포유동물, 선택적으로 인간이고; 또는
변이체 Fc 도메인은 포유동물, 선택적으로 인간인 비변형 Fc 도메인에 비해 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
89. 구체예 85-88 중 어느 하나의 구체예에 있어서, Fc 도메인 또는 그의 변이체는 SEQ ID NO:226 또는 SEQ ID NO:227에 제시된 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO:226 또는 SEQ ID NO:227에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
90. 구체예 82-89 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 링커를 통해 간접적으로 연결된 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
91. 구체예 1-90 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 변이체 CD80 폴리펩타이드의 세포외 도메인 (ECD) 또는 그의 특이적 결합 단편에 연결된 막관통 도메인을 더 포함하는 막관통 면역조절 단백질인 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
92. 구체예 91에 있어서, 막관통 도메인은 SEQ ID NO: 1의 잔기 243-263에 제시된 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 1의 잔기 243-263에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 그의 기능성 변이체를 포함하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
93. 구체예 91 또는 구체예 92에 있어서, 막관통 도메인에 연결된 세포질 도메인을 더 포함하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
94. 구체예 93에 있어서, 세포질 도메인은 SEQ ID NO: 1의 잔기 264-288에 제시된 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 1의 잔기 264-288에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 그의 기능성 변이체를 포함하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
95. 구체예 1-94 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 변이체 CD80은 시험관내 일차 T-세포 분석에서 비변형 CD80에 비해 IFN-감마 (인터페론-감마) 발현을 증가시키는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
96. 구체예 1-95 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 변이체 CD80은 시험관내 일차 T-세포 분석에서 비변형 CD80에 비해 IFN-감마 (인터페론-감마) 발현을 감소시키는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
97. 구체예 1-96 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 탈글리코실화된 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
98. 면역글로불린 수퍼패밀리 (IgSF) 도메인을 포함하는 제2 폴리펩타이드에 연결된 구체예 1-97 중 어느 하나의 구체예에 기재된 변이체 CD80을 포함하는 면역조절 폴리펩타이드.
99. 구체예 98에 있어서, IgSF 도메인은 친화성 변형된 것이고 비변형 또는 야생형 IgSF 도메인에 비해 하나 이상의 그의 동족 결합 파트너(들)에 대해 변경된 결합을 나타내는 것인 면역조절 폴리펩타이드.
100. 구체예 99에 있어서, IgSF 도메인은 비변형 또는 야생형 IgSF 도메인에 비해 하나 이상의 그의 동족 결합 파트너(들)에 대해 증가된 결합을 나타내는 것인 면역조절 폴리펩타이드.
101. 구체예 98-100 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 변이체 CD80은 제1 변이체 CD80이고 제2 폴리펩타이드의 IgSF 도메인은 구체예 1-97 중 어느 하나의 구체예에 기재된 제2 변이체 CD80로부터의 IgSF 도메인이며, 여기서 제1 및 제2 변이체 CD80은 동일 또는 상이한 것인 면역조절 폴리펩타이드.
102. 구체예 98-101 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 CD28, PD-L1, 또는 CTLA-4에 특이적으로 결합할 수 있고, 제2 폴리펩타이드의 IgSF 도메인은 변이체 CD80 폴리펩타이드에 의해 특이적으로 결합된 것 이외의 동족 결합 파트너에 결합할 수 있는 것인 면역조절 단백질.
103. 구체예 98-102 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 CD28 또는 PD-L1에 특이적으로 결합할 수 있고, IgSF 도메인은 변이체 CD80 폴리펩타이드에 의해 특이적으로 결합된 것 이외의 동족 결합 파트너에 결합할 수 있는 것인 면역조절 단백질.
104. 구체예 98-103 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 CD28 또는 CTLA-4에 특이적으로 결합할 수 있고, IgSF 도메인은 변이체 CD80 폴리펩타이드에 의해 특이적으로 결합된 것 이외의 동족 결합 파트너에 결합할 수 있는 것인 면역조절 단백질.
105. 구체예 98-103 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 CTLA-4 또는 PD-L1에 특이적으로 결합할 수 있고, IgSF 도메인은 변이체 CD80 폴리펩타이드에 의해 특이적으로 결합된 것 이외의 동족 결합 파트너에 결합할 수 있는 것인 면역조절 단백질.
106. 구체예 98-105 중 어느 하나의 구체예에 있어서, IgSF 도메인은 B7 패밀리의 멤버로부터 유래한 것인 면역조절 폴리펩타이드.
107. 구체예 82-90 중 어느 하나의 구체예에 있어서, IgSF 도메인은 종양에서 발현된 리간드에 결합하는 종양-위치화 모이어티인 것인 면역조절 폴리펩타이드.
108. 구체예 107에 있어서, 리간드는 B7H6인 것인 면역조절 폴리펩타이드.
109. 구체예 107 또는 구체예 108에 있어서, IgSF 도메인은 NKp30으로부터 유래한 것인 면역조절 폴리펩타이드.
110. 구체예 98-109 중 어느 하나의 구체예에 있어서, IgSF 도메인은 친화성 변형된 것이고 비변형 또는 야생형 IgSF 도메인에 비해 하나 이상의 그의 동족 결합 파트너(들)에 대해 증가된 결합을 나타내는 것인 면역조절 폴리펩타이드.
111. 구체예 98-110 중 어느 하나의 구체예에 있어서, IgSF 도메인은 IgV 도메인이거나 또는 IgV 도메인을 포함하는 것인 면역조절 폴리펩타이드.
112. 구체예 98-111 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 IgV 도메인이거나 또는 IgV 도메인을 포함하는 것인 면역조절 폴리펩타이드.
113. 구체예 98-112 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 면역조절 단백질은 변이체 CD80 폴리펩타이드 및 IgSF 도메인을 포함하는 제2 폴리펩타이드 중 일방 또는 양방에 연결된 멀티머화 도메인을 포함하는 것인 면역조절 단백질.
114. 구체예 113에 있어서, 멀티머화 도메인은 이펙터 기능이 감소된 Fc 도메인 또는 그의 변이체인 것인 면역조절 단백질.
115. 구체예 98-114 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 다이머인 것인 면역조절 단백질.
116. 구체예 115에 있어서 호모다이머인 것인 면역조절 단백질.
117. 구체예 115에 있어서 헤테로다이머인 것인 면역조절 단백질.
118. 어떤 모이어티에 연결된, 구체예 1-98 중 어느 하나의 구체예에 기재된 변이체 CD80, 또는 구체예 99-117 중 어느 하나의 구체예에 기재된 면역조절 폴리펩타이드를 포함하는 컨쥬게이트.
119. 구체예 118에 있어서, 모이어티는 세포 표면 상의 분자에 특이적으로 결합하는 표적화 모이어티인 것인 컨쥬게이트.
120. 구체예 119에 있어서, 표적화 모이어티는 면역 세포 표면 상의 분자에 특이적으로 결합하는 것인 컨쥬게이트.
121. 구체예 120에 있어서, 면역 세포는 항원 제시 세포 또는 림프구인 것인 컨쥬게이트.
122. 구체예 119에 있어서, 표적화 모이어티는 종양 표면 상의 분자에 결합하는 종양-위치화 모이어티인 것인 컨쥬게이트.
123. 구체예 118-122 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 모이어티는 단백질, 펩타이드, 핵산, 소분자 또는 나노입자인 것인 컨쥬게이트.
124. 구체예 118-123 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 모이어티는 항체 또는 항원-결합 단편인 것인 컨쥬게이트.
125. 구체예 118-124 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 컨쥬게이트는 2가, 4가, 6가 또는 8가인 것인 컨쥬게이트.
126. 구체예 1-98 중 어느 하나의 구체예에 기재된 변이체 CD80 폴리펩타이드 또는 구체예 99-117 중 어느 하나의 구체예에 기재된 면역조절 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자(들).
127. 구체예 126에 있어서, 합성 핵산인 것인 핵산 분자.
128. 구체예 126 또는 구체예 127에 있어서, cDNA인 것인 핵산 분자.
129. 구체예 125-128 중 어느 하나의 구체예에 기재된 핵산 분자를 포함하는 벡터.
130. 구체예 129에 있어서, 발현 벡터인 것인 벡터.
131. 구체예 129 또는 구체예 130에 있어서, 벡터는 포유동물 벡터 또는 바이러스 벡터인 것인 벡터.
132. 구체예 129-131 중 어느 하나의 구체예에 기재된 벡터를 포함하는 세포.
133. 구체예 132에 있어서, 포유동물 세포인 것인 세포.
134. 구체예 133에 있어서, 인간 세포인 것인 세포.
135. 구체예 125-128 중 어느 하나의 구체예에 기재된 핵산 분자 또는 구체예 129-131 중 어느 하나의 구체예에 기재된 벡터를, 세포에서 단백질이 발현되는 조건 하에 숙주 세포 내로 도입하는 것을 포함하는, 변이체 CD80 폴리펩타이드 또는 면역조절 단백질의 제조방법.
136. 구체예 135에 있어서, 세포로부터 변이체 CD80 폴리펩타이드 또는 면역조절 단백질를 단리 또는 정제하는 것을 더 포함하는 방법.
137. 구체예 1-98 중 어느 하나의 구체예에 기재된 변이체 CD80 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자를 상기 폴리펩타이드가 세포 내에서 발현되는 조건 하에 숙주 세포 내로 도입하는 것을 포함하는, 변이체 CD80 폴리펩타이드를 발현하는 세포의 조작 방법.
138. 구체예 1-98 중 어느 하나의 구체예에 기재된 변이체 CD80 폴리펩타이드, 구체예 99-117 중 어느 하나의 구체예에 기재된 면역조절 단백질, 구체예 125-128 중 어느 하나의 구체예에 기재된 핵산 분자 또는 구체예 129-131 중 어느 하나의 구체예에 기재된 벡터를 발현하는 조작된 세포.
139. 구체예 138에 있어서, 변이체 CD80 폴리펩타이드 또는 면역조절 폴리펩타이드는 시그널 펩타이드를 포함하는 것인 조작된 세포.
140. 구체예 138 또는 구체예 139에 있어서, 변이체 CD80 폴리펩타이드 또는 면역조절 폴리펩타이드는 막관통 도메인을 포함하지 않고 및/또는 세포 표면 상에서 발현되지 않는 것인 조작된 세포.
141. 구체예 138-140 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 변이체 CD80 폴리펩타이드 또는 면역조절 폴리펩타이드가 조작된 세포로부터 분비되는 것인 조작된 세포.
142. 구체예 138 또는 구체예 139에 있어서, 조작된 세포는 구체예 91-97 중 어느 하나의 구체예에 기재된 막관통 면역조절 단백질이거나 및/또는 막관통 도메인을 포함하는 변이체 CD80 폴리펩타이드를 포함하는 것인 조작된 세포.
143. 구체예 138, 구체예 139 또는 구체예 142에 있어서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 세포 표면 상에서 발현되는 것인 조작된 세포.
144. 구체예 138-143 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 세포는 면역 세포인 것인 조작된 세포.
145. 구체예 144에 있어서, 면역 세포는 항원 제시 세포 (APC) 또는 림프구인 것인 조작된 세포.
146. 구체예 138-145 중 어느 하나의 구체예에 있어서 일차 세포인 것인 조작된 세포.
147. 구체예 138-146 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 세포는 포유동물 세포인 것인 조작된 세포.
148. 구체예 138-147 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 세포는 인간 세포인 것인 조작된 세포.
149. 구체예 145-148 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 림프구는 T 세포인 것인 조작된 세포.
150. 구체예 145-149 중 어느 하나의 구체예에 있어서, APC는 인공 APC인 것인 조작된 세포.
151. 구체예 138-150 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 조작된 T-세포 수용체를 더 포함하는 것인 조작된 세포.
152. 구체예 1-97 중 어느 하나의 구체예에 기재된 변이체 CD80 폴리펩타이드 또는 구체예 98-117 중 어느 하나의 구체예에 기재된 면역조절 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는, 감염 물질.
153. 구체예 152에 있어서, 인코딩된 변이체 CD80 폴리펩타이드 또는 면역조절 폴리펩타이드는 막관통 도메인을 포함하지 않고 및/또는 그것이 내부에서 발현되는 세포의 표면에서 발현되지 않는 것인 감염 물질.
154. 구체예 152 또는 구체예 153에 있어서, 인코딩된 변이체 COD80 폴리펩타이드 또는 면역조절 폴리펩타이드는 그것이 발현되는 세포로부터 분비되는 것인 감염 물질.
155. 구체예 152에 있어서, 인코딩된 변이체 CD80 폴리펩타이드는 막관통 도메인을 포함하는 것인 감염 물질.
156. 구체예 152 또는 구체예 155에 있어서, 인코딩된 변이체 CD80 폴리펩타이드는 그것이 발현되는 세포의 표면에서 발현되는 것인 감염 물질.
157. 구체예 152-156 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 감염 물질은 세균 또는 바이러스인 것인 감염 물질.
158. 구체예 157에 있어서, 바이러스는 항암 바이러스인 것인 감염 물질.
159. 구체예 158에 있어서, 항암 바이러스는 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 바이러스, 대상포진 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 레오바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 파보바이러스, 홍역 바이러스, 수포성 구내염 바이러스 (VSV), 콕사키 바이러스 또는 백시니아 바이러스인 것인 감염 물질.
160. 구체예 159에 있어서, 바이러스는 수지상 세포 (DCs)를 특이적으로 표적화하거나 및/또는 수지상 세포-지향성(tropic)인 것인 감염 물질.
161. 구체예 160에 있어서, 바이러스는 변형된 신드비스 바이러스 엔벨로프 산물로 슈도타이프된 렌티바이러스 벡터인 것인 감염 물질.
162. 구체예 152-161 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 표적 세포의 사멸을 야기하거나 또는 면역 반응을 개시 또는 부스트할 수 있는 유전자 산물을 더 인코딩하는 핵산 분자를 더 포함하는 것인 감염 물질.
163. 구체예 162에 있어서, 상기 추가의 유전자 산물은 항암제, 항대사제, 항혈관형성제, 면역조절 분자, 면역 체크포인트 억제제, 항체, 사이토카인, 성장 인자, 항원, 세포독성 유전자 산물, 프로-아폽토시스 유전폽토시스 유전자 산물, 항-아폽토시스 유전자 산물, 세포 매트릭스 분해 유전자, 조직 재생을 위한 유전자 또는 인간의 체세포를 다분화능으로 재프로그램하는 유전자로부터 선택되는 것인 감염 물질.
164. 구체예 1-97 중 어느 하나의 구체예에 기재된 변이체 CD80 폴리펩타이드, 구체예 98-117 중 어느 하나의 구체예에 기재된 면역조절 단백질, 구체예 118-125 중 어느 하나의 구체예에 기재된 컨쥬게이트, 구체예 138-151 중 어느 하나의 구체예에 기재된 조작된 세포 또는 구체예 152-163 중 어느 하나의 구체예에 기재된 감염 물질을 포함하는 의약 조성물.
165. 구체예 164에 있어서, 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 의약 조성물.
166. 구체예 164 또는 165에 있어서, 의약 조성물은 멸균된 것인 의약 조성물.
167. 구체예 164-166 중 어느 하나의 구체예에 기재된 의약 조성물을 바이알 내에 포함하는 제조 물품.
168. 구체예 167에 있어서, 바이알은 밀봉된 것인 제조 물품.
169. 구체예 164-166 중 어느 하나의 구체예에 기재된 의약 조성물, 및 사용 지침을 포함하는 키트.
170. 구체예 167 및 168 중 어느 하나의 구체예에 기재된 제조 물품, 및 사용 지침을 포함하는 키트.
171. 구체예 164-166 중 어느 하나의 구체예에 기재된 의약 조성물을 대상자에게 투여하는 것을 포함하는, 대상자에 있어서 면역 반응을 조절하는 방법.
172. 구체예 138-151 중 어느 하나의 구체예에 기재된 조작된 세포를 투여하는 것을 포함하는, 대상자에 있어서 면역 반응을 조절하는 방법.
173. 구체예 172에 있어서, 조작된 세포는 대상자에 대해 자가인 것인 방법.
174. 구체예 172에 있어서, 조작된 세포는 대상자에 대해 동종이계인 것인 방법.
175. 구체예 171-174 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 면역 반응의 조절은 대상자에 있어서 질병 또는 병태를 치료하는 것인 방법.
176. 구체예 171-175 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 면역 반응이 증가되는 것인 방법.
177. 구체예 171, 175 및 176 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 종양-위치화 모이어티에 연결된 변이체 CD80 폴리펩타이드를 포함하는 면역조절 단백질 또는 컨쥬게이트가 대상자에게 투여되는 것인 방법.
178. 구체예 177에 있어서, 종양-위치화 모이어티는 종양 항원일 인식하는 결합 분자이거나 상기 결합 분자를 포함하는 것인 방법.
179. 구체예 1787에 있어서, 결합 분자는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하거나 또는 야생형 IgSF 도메인 또는 그의 변이체를 포함하는 것인 방법.
180. 구체예 171 및 175-179 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 구체예 107-117 중 어느 하나의 구체예에 기재된 면역조절 단백질 또는 구체예 118-125 중 어느 하나의 구체예에 기재된 컨쥬게이트를 포함하는 의약 조성물을 대상자에게 투여하는 방법.
181. 구체예 172-176 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 막관통 면역조절 단백질인 변이체 CD80 폴리펩타이드를 포함하는 조작된 세포를 대상자에게 투여하거나 및/또는 구체예 138, 139 및 142-151 중 어느 하나의 구체예에 기재된 조작된 세포를 대상자에게 투여하는 것인 방법.
182. 구체예 171, 175 및 176 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 막관통 면역조절 단백질인 변이체 CD80 폴리펩타이드를 인코딩하는 감염 물질을, 선택적으로, 상기 감염 물질이 종양 세포 또는 면역 세포를 감염시키고, 감염된 세포 표면 상에서 상기 막관통 면역조절 단백질이 발현되는 조건 하에, 대상자에게 투여하는 것인 방법.
183. 구체예 181 또는 구체예 182에 있어서, 막관통 면역조절 단백질은 구체예 91-97 중 어느 하나의 구체예에 기재된 것인 방법..
184. 구체예 171-183 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 질병 또는 병태는 종양 또는 암인 것인 방법.
185. 구체예 171-184 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 질병 또는 병태는 흑색종, 폐암, 방광암, 혈액학적 악성종양, 간암, 뇌암, 신장암, 유방암, 췌장암, 대장암, 비장암, 전립선암, 고환암, 난소암, 자궁암, 위암, 근골격계암, 두경부암, 위장관암, 생식세포 암, 또는 내분비 및 신경 내분비 세포 암으로부터 선택되는 것인 방법.
186. 구체예 171-175 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 면역 반응이 감소되는 것인 방법.
187. 구체예 171, 175 및 186 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 가용성인 변이체 CD80 폴리펩타이드 또는 면역조절 단백질을 대상자에게 투여하는 방법.
188. 구체예 187에 있어서, 가용성 폴리펩타이드 또는 면역조절 단백질은 Fc 융합 단백질인 방법.
189. 구체예 171, 175 및 186-188 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 구체예 1-90 및 95-97 중 어느 하나의 구체예에 기재된 변이체 CD80 폴리펩타이드, 또는 구체예 98-106 및 111-117 중 어느 하나의 구체예에 기재된 면역조절 단백질을 포함하는 의약 조성물을 대상자에게 투여하는 방법.
190. 구체예 172-175 및 186 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 분비가능한 변이체 CD80 폴리펩타이드를 포함하는 조작된 세포를 대상자에게 투여하는 방법.
191. 구체예 172-175 및 186-188 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 구체예 138-141 및 144-151 중 어느 하나의 구체예에 기재된 조작된 세포를 대상자에게 투여하는 방법.
192. 구체예 171, 175 및 186-188 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 분비가능한 면역조절 단백질인 변이체 CD80 폴리펩타이드를 인코딩하는 감염 물질을, 선택적으로, 상기 감염 물질이 종양 세포 또는 면역 세포를 감염시키고 상기 분비가능한 면역조절 단백질이 상기 감염된 세포로부터 분비되는 조건 하에, 대상자에게 투여하는 방법.
193. 구체예 171-175 및 186-192 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 질병 또는 병태는 염증 또는 자가면역 질환 또는 병태인 것인 방법.
194. 구체예 171-175 및 186-193 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 질병 또는 병태는 항호중구 세포질 항체 (ANCA)-관련 혈관염, 혈관염, 자가면역 피부 질환, 이식, 류마티스성 질환, 염증상 위장관 질환, 염증상 안질환, 염증상 신경 질환, 염증상 폐질환, 염증성 내분비 질환, 또는 자가면역 혈액학적 질환인 것인 방법.
195. 구체예 193 또는 구체예 194에 있어서, 질병 또는 병태는 염증성 장질환, 골이식, 크론씨병, 궤양성 대장염, 다발성 경화증, 천식, 류마티스성 관절염 또는 건선으로부터 선택되는 것인 방법.
IX. 실시예
[404] 하기 실시예들은 오로지 설명 목적을 위해 포함된 것으로 본원발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
IgSF 도메인들의 돌연변이 DNA 구조물의 생성
[405] 실시예 1은 효소 디스플레이 라이브러리로서 효모 표면에서의 번역 및 발현을 위한 인간 CD80 IgSF 도메인들의 돌연변이 DNA 구조물의 생성을 설명한 것이다.
A. 축퇴 라이브러리
[406] SEQ ID NO: 28에 제시된 세포외 도메인 (ECD)의 야생형 인간 CD80 아미노산 서열(UniProt 수탁번호 P33681에 제시된 잔기 35-242에 대응함)에 기초하여 다음과 같은 작제물을 만들었다:
VIHVTKEVKEVATLSCGHNVSVEELAQTRIYWQKEKKMVLTMMSGDMNIWPEYKNRTIFDITNNLSIVILALRPSDEGTYECVVLKYEKDAFKREHLAEVTLSVKADFPTPSISDFEIPTSNIRRIICSTSGGFPEPHLSWLENGEELNAINTTVSQDPETELYAVSSKLDFNMTTNHSFMCLIKYGHLRVNQTFNWNTTKQEHFPDN
[407] 축퇴 코돈의 완전한 또는 부분적 무작위화를 위해 특이적인 잔기를 표적화하는 라이브러리를 만들기 위해, SEQ ID NO: 28을 인코딩하는 DNA를 최대 80 염기쌍(bp) 길이의 중복 올리고뉴클레오타이드 세트로서 Integrated DNA Technologies (Coralville, IA)로부터 주문하였다. ECD의 다양한 변이체 라이브러리를 생성하기 위해, 이들 올리고뉴클레오타이드들은 원하는 아미노산 위치에서 원하는 축퇴 코돈을 함유하였다. URL: rosettadesign.med.unc.edu/SwiftLib/.에 제시된 알고리듬을 이용하여 축퇴 코돈들을 생성하였다.
[408] 일반적으로, 코돈의 돌연변이 및 축퇴를 위한 위치들은 단백질 상호작용 인터페이스에 존재하는 잔기 뿐만 아니라 리간드 접촉 잔기들을 동정하기 위해 관심대상인 표적-리간드 쌍의 결정 구조로부터 선택하였다. 이 분석은 URL:spdbv.vital-it.ch)에서 구할 수 있는 구조 뷰어를 이용하여 수행하였다. 예를 들어, CTLA-4에 결합된 CD80의 결정 구조는 URL:www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=1I8L)로부터 공개적으로 입수가능하고 표적화 라이브러리는 CTLA4에 대한 개선된 바인더의 선택을 위해 CD80::CTLA4 인터페이스에 기초해서 디자인하였다. 그러나, 리간드 CD28 및 PDL1의 경우 입수가능한 CD80 구조물은 없기 때문에, CD28의 바인더 (CTLA4와 동일한 영역에서 CD80에 결합함) 및 PDL1에 대한 바인더(PDL1이 CTLA4와 동일 부위에 하는지는 알려져 있지 않음)를 선택하는데 있어 역시 동일한 바인더를 이용하였다.
[409] 라이브러리 디자인의 다음 단계는 보존된 잔기들을 동정하기 위해 인간, 마우스, 래트 및 원숭이의 CD80 서열들을 정렬시키는 것이었다. 이 분석에 기초하여, 보존적 아미노산 변화 플러스 야생형 잔기만을 명시한 축퇴 코돈들을 이용하여 보존된 표적 잔기들을 돌연변이시켰다. 보존되지 않은 잔기들은 보다 공격적으로 돌연변이되었지만, 야생형 잔기들도 포함하였다. 표적 단백질의 과도한 돌연변이를 회피하기 위해 야생형 잔기들 역시도 인코딩하는 축퇴 코돈들을 배치하였다. 동일한 이유로, 한 번에 최대 20개의 위치만을 돌연변이 표적으로 삼았다. 이들 잔기들은 접촉 잔기와 비-접촉 인터페이스 잔기들의 조합이었다.
[410] 올리고뉴클레오타이드들을 멸균수에 용해시키고, 동몰 비율로 혼합하고, 95℃로 5분간 가열한 다음 어닐링을 위해 실온으로 서서히 냉각시켰다. 이어서, ECD의 개시 및 종결부에 각각 어닐링하는 ECD-특이적 올리고뉴클레오타이드 프라이머들을 이용하여 PCR 산물을 생성하였다. 이어서 BamH1 및 Kpn1 클로닝 부위를 너머 및 포함하는 pBYDS03 클로닝 벡터 (Life Technologies USA)의 변형된 버젼과 40-50 bp만큼 중복되는 ECD-특이적 올리고뉴클레오타이드들을 이용하여, 전 단계로부터의 PCR 산물 100 nm을 증폭시켜 총 5 ㎍의 DNA를 생성하였다. 두 가지 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 모두 OneTaq 2x PCR 마스터 믹스 (New England Biolabs, USA)를 이용한 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의한 것이었다. 제2의 PCR로부터의 산물을 PCR 정제 키트(Qiagen, 독일)를 이용하여 정제하고 멸균 탈이온수에 재현탁시켰다.
[411] 라이브러리 삽입 준비를 위해, 벡터 pBYDS03의 변형된 효모 디스플레이 버젼을 BamH1 및 Kpn1 제한 효소 (New England Biolabs, USA)로 절단하고 큰 벡터 단편을 겔-정제한 다음 멸균, 탈이온수에 용해시켰다. 다음 단계를 위해 50 ㎕ 부피의 멸균된 탈이온수에서 12 ㎍의 라이브러리 DNA와 4 ㎍의 선형 벡터를 혼합함으로써 전기영동-준비된 DNA를 생성하였다. 표적화 라이브러리를 생성하기 위한 한 가지 별법은 표적 ECD를 올리고뉴클레오타이드 함유 촉퇴 코돈들을 이용하여 부위-지향 돌연변이시키는 것이었다(Multisite kit, Agilent, USA). 이 접근법은 돌연변이를 위한 표적 단백질의 특이 스트레치만을 표적화하는 서브라이브러리를 생성하는데 이용되었다. 이 경우, 선택 단계로 진행하기 전에 서브라이브러리들을 혼합하였다. 일반적으로, 라이브러리 크기는 서브라이브러리가 10E4 내지 10E5의 범위 내인 경우를 제외하고, 10E7 내지 10E8 클론 범위였다. ICOSL에 대해 대형 라이브러리및 서브라이브러리를 만들었다.
B. 무작위 라이브러리
[412] SEQ ID NO: 28에 제시된 CD80의 ECD의 변이체들을 동정하기 위해 무작위 라이브러리들도 작제하였다 (UniProt Accession No. P33681에 제시된 잔기 35-135에 대응하는, IgV 도메인을 함유함, 야생형 서열의 인접 C-말단 잔기에 의해 플랭킹됨). 야생형 ECD를 인코딩하는 DNA를 변형된 효모 디스플레이 벡터 pBYDS03의 BamH1 및 Kpn1 부위 사이에 클로닝시킨 다음 동일한 제한 효소를 이용하여 방출시켰다. 이어서 방출된 DNA를 Genemorph II 키트 (Agilent, USA)를 이용하여 돌연변이시켜 라이브러리 변이체 1개 당 평균 3 내지 5개의 아미노산 변경을 생성하였다. 이어서 돌연변이된 DNA를 2단계 PCR에 의해 증폭시키고 표적화 라이브러리에 대해 전술한 바와 같이 추가 프로세싱하였다.
실시예 2
DNA 라이브러리의 효모 내로의 도입
[413] 실시예 2는 CD80, CD86, ICOSL, 및 NKp30 DNA 라이브러리를 효모 내로 도입하는 것을 설명한다. 축퇴 및 무작위 라이브러리 DNA를 효모에 도입하기 위해, 효모 균주 BJ5464 (ATCC.org; ATCC 번호 208288)의 전기영동-컴피턴트 세포를 준비하고, 기본적으로 문헌에 설명된 바와 같이(Colby, D.W. et al. 2004 Methods Enzymology 388, 348-358) 상기 단계로부터의 전기영동-준비된 DNA를 이용하여 Gene Pulser II (Biorad, USA)에서 전기영동 처리하였다. 유일한 예외는 변형된 플라스미드 pBYDS03가 보유하는 LEU2 선택 마커를 수용하기 위해, 형질전환된 세포들을 비-유도성 최소선택 SCD-Leu 매지에서 성장시켰다는 점이다.
[414] 라이브러리 크기는 갓 회수된 세포들의 희석물을 SCD-Leu 한천 플레이트 상에 플레이팅한 다음 플레이트 당 적어도 50개의 콜로니를 생성하는 플레이팅으로부터의 단일 콜로니 갯수로부터 라이브러리 크기를 외삽함으로써 결정하였다. 전기영동 처리된 배양체의 나머지를 포화상태까지 성장시키고 이 배양체로부터의 세포들을 한번 더 동일 배지에서 계대배양하여 형질전환되지 않은 세포의 분획을 최소화시켰다. 라이브러리의 다양성을 유지하기 위해, 계산된 라이브러리 크기보다 적어도 10배 세포를 더 많이 함유하는 접종(inoculum)을 이용하여 이 계대배양 단계를 수행하였다. 2차 포화 배양체로부터의 세포들을 멸균 25% (중량/부피) 글리세롤을 함유하는 신선한 배지에 10E10/ml의 밀도가 되도록 재현탁하고 냉동 및 -80℃에서 보관하였다 (냉동 라이브러리 스톡).
[415] 1 리터의 SCD-Leu 배지는 14.7 그램의 소듐 시트레이트, 4.29 그램의 시트르산 모노히드레이트, 20 그램의 덱스트로즈, 6.7 그램의 Difco 브랜드 효모 질소 베이스, 및 효모가 없는 1.6 그램의 효모 합성 드롭-아웃 배지 보충물로 구성된다. 배지를 사용하기 전에 0.2 μM 진공 필터 장치를 이용하여 멸균처리하였다.
[416] 라이브러리 크기는 갓 회수된 세포들의 희석물을 SCD-Leu 한천 플레이트 상에 플레이팅한 다음 플레이트 당 적어도 50개의 콜로니를 생성하는 플레이팅으로부터의 단일 콜로니 갯수로부터 라이브러리 크기를 외삽함으로써 결정하였다.
[417] 2개 이상의 상이한 라이브러리 클론을 함유하는 세포들로부터 플라스미드를 분리하기 위해, 라이브러리 크기의 10배에 해당하는 갯수의 세포들을 SCD-Leu 배양체로부터 밤새 취하여 신선한 SCD-Leu 배지로 1/100 계대배양하고 밤새 성장시켰다. 이 밤샘 배양체로부터 얻은 세포들을 멸균 25% (중량/부피) 글리세롤에 10E10/ml의 밀도가 되도록 재현탁하고 냉동 및 -80℃에서 보관하였다 (냉동 라이브러리 스톡).
실시예 3
효모 선택
[418] 실시예 3은 CD80의 친화성 변형된 변이체들을 발현하는 효모의 선택에 설명한 것이다. A 라이브러리 크기의 적어도 10배에 해당하는 갯수의 세포들을 개별 라이브러리 스톡으로부터 해동하여, 비-유도 SCD-Leu 배지에 0.1 x 10E6 세포/ml로 현탁하고 밤새 성장시켰다. 다음 날, 라이브러리 크기의 10배에 해당하는 갯수의 세포들을 2000 RPM에서 2분간 원심분리하고 유도 SCD-Leu 배지에 0.1 x 10E6 세포/ml로 재현탁하였다. SCDG-Leu 유도 배지 1 리터는 물에 5.4 그램 Na2HPO4, 8.56 그램의 NaH2PO4*H20, 20 그램의 갈락토스, 2.0 그램의 덱스트로스, 6.7 그램의 Difco 효모 질소 베이스, 및 류신이 없는 1.6 그램의 효소 합성 드롭 아웃 보충물이 용해되어 있는 것으로 구성되며 0.22 ㎛ 막 필터 장치를 통해 멸균되었다. 배양체를 20℃에서 2일간 성장시켜 효모 세포 표면상에 라이브러리 단백질의 발현을 유도하였다.
[419] 비-바인더를 감소시키고 그의 외인성 재조합 카운터-구조 단백질 결합능을 갖는 모든 CD80 폴리펩타이드들을 농축하기 위해 세포들을 자석 비드로 프로세싱하였다. 예를 들어, 효모 디스플레이 표적화되거나 또는 무작위 CD80 라이브러리들을 CD28, CTLA-4, 및 PD-L1 각각에 대해 별도로 선택하였다. 이어서 개선된 바인더 기능을 나타내는 효모 세포의 분획을 농축하기 위해 외인성 카운터-구조 단백질 염색을 이용하여 2 내지 3 라운드의 유세포분석 소팅을 실시하였다. 자석 비드 농축 및 유세포 분석에 의한 선택은 기본적으로 문헌 [Keith D. Miller,1 Noah B. Pefaur,2 및 Cheryl L. Baird1 Current Protocols in Cytometry 4.7.1-4.7.30, July 2008]에 설명되어 있다.
[420] CD80 라이브러리를 이용하여 표적 리간드 단백질들을 다음과 같이 R&D Systems (USA)로부터 공급하였다: 인간 rCD28.Fc (즉, 재조합 CD28-Fc 융합 단백질), rPDL1.Fc 및 rCTLA4.Fc. 자성 스트렙트아비딘 비드를 New England Biolabs, USA로부터 구득하였다. 카운터-구조 단백질의 바이오티닐화를 위해, 바이오티닐화 키트 cat# 21955, Life Technologies, USA를 이용하였다. 2-색 유세포분석 소팅을 위해, Becton Dickinson FACS Aria II 소터를 이용하였다. CD80 디스플레이 수준을 Alexafluor 488 (Life Technologies, USA)이 표지된 항-헤마글루티닌(항-HA) 항체를 이용하여 모니터링하였다. 리간드 결합 Fc 융합 단백질 rCD28.Fc 및 rCTLA4.Fc를 PE 컨쥬게이트된 인간 Ig 특이 염소 Fab (Jackson ImmunoResearch, USA)를 이용하여 검출하였다. 정면 스캐터 (FSC) / 측면 스캐터 (SSC) 파라미터를 이용하여 이중 효모를 배제하고(gated out), 소트 게이트들은 FL1에서 보다 제한된 태그 발현 결합을 지니는 FL4에서 검출된 더 놓은 리간드 결합에 기초하였다.
[421] 유세포 분석 소트로부터의 효모 아웃풋을 보다 높은 특이적 결합 친화성에 대해 분석하였다. 소트 효모 아웃풋을 증식 및 재-유도시켜 이들이 인코딩하는 특징 IgSF 친화성 변형된 도메인 변이체들을 발현시켰다. 이어서 이 집단을 모균주, 야생형 효모 균주 또는 비드 아웃풋 효모 집단과 같은 다른 선택된 아웃풋과, 유세포 분석법에 의해 비교할 수 있다.
[422] FL1 상에서 항-HA 태그 항체를 이용하여 측정시 상기 설명된 모든 F2 아웃풋의 MFI 값이 증가하지 않았고 종종 야생형 균주에 비해 감소하였다는 것은 중요한데, 이는 증가된 결합이 효모 표면 상의 선택된 변이체들의 증가된 발현의 함수가 아니라는 것과 높은 리간드 결합을 갖는 중간 내지 낮은 발현체들만을 선택하는 게이팅 전략이 타당함을 입증하는 것이다.
[423] 선택된 변이체 CD80 ECD 도메인들을 융합 단백질로서 더 포맷시키고 후술하는 바와 같이 결합 및 기능 활성에 대해 시험하였다.
실시예 4
Fc-융합체 및 다양한 면역조절 단백질 유형으로 선택 아웃풋 재구성
[424] 실시예 4는 선택 아웃풋을, CD80의 Fc 분자에 융합된, 친화성 변형된 (변이체) 세포외 도메인 (ECD)(변이체 ECD-Fc 융합 분자들)을 함유하는 면역조절 단백질로서 재포맷하는 것을 설명한다.
[425] 최종 유세포 분석 CD80 소트로부터의 아웃풋 세포들을 SCD-Leu 배지에서 최종 밀도로 성장시켰다. 각 아웃풋으로부터의 플라스미드 DNA를 효소 플라스미드 DNA 분리 키트 (Zymoresearch, USA)를 이용하여 분리하였다. Fc 융합을 위해, 선택된 Fc 융합 벡터 내로의 클로닝에 적합한 제한효소 부위가 부가된 PCR 프라이머들을 이용하여, 돌연변이 표적 ECD을 위한 코딩 DNA를 플라스미드 DNA 프렙으로부터 회분식-증폭시켰다. 제한효소 절단 후, PCR 산물을 적절한 Fc 융합 벡터 내로 접합시킨 다음 공급자 지침에 따라 균주 XL1 Blue E. Coli (Agilent, USA) 또는 NEB5알파 (New England Biolabs) 내로 화학적 형질전환시켰다. 예시적인 Fc 융합 벡터는 pFUSE-hIgG1-Fc2 (Invivogen, USA)이다.
[426] 형질전환 반응 희석물을 100 ㎍/ml 카르베니실린 (Teknova, USA)을 함유하는 LB-한천 상에 플레이팅하여 단일 콜로니를 생성하였다. 이어서 각 형질전환으로부터 최대 96 콜로니를 96 웰 플레이트 중 LB-브로쓰 (Teknova cat # L8112) 에서 37℃로 밤새 포화되도록 배양하고 모든 클론 내의 돌연변이(들)을 동정하기 위해 각 웰로부터 소량의 분주액을 취해 ECD 삽입물의 DNA 시퀀싱하였다. DNA 시퀀싱을 위한 샘플 준비는 서비스 제공자(Genewiz; South Plainfield, NJ)가 제공한 프로토콜을 이용하여 수행하였다. DNA 시퀀싱을 위해 샘플을 수거한 후 최종 글리세롤 함량이 25%가 되도록 나머지 배양액에 글리세롤을 첨가하고 마스터 플레이트로서 나중에 사용하기 위해 -20℃에서 플레이트를 보관하였다 (후술 내용 참조). 별법으로, 일회용 96 웰 레플리케이터(VWR, USA)를 이용하여 배양된 액체 배양액으로부터 고형 한천 플레이트로 복제함으로써 DNA 시퀀싱을 위한 샘플을 생상하였다. 이들 플레이트들을 밤새 인큐베이션하여 성장 팻치를 만들고 Genewiz에 의해 명시된 바와 같이 Genewiz에 플레이트들을 제출하였다. 일부 사례에서, 재시퀀싱을 수행하여 돌연변이를 검정하였다.
[427] Genewiz-생성된 DNA 시퀀싱 데이터를 분석하여 목적하는 클론을 동정한 후, 목적하는 클론들을 마스터 플레이트로부터 회수하고 100 ㎍/ml 카르베니실린 (Teknova, USA)를 함유하는 5 ml의 액체 LB-브로쓰에서 소정 밀도로 개별적으로 성장시킨 다음 이어서 각 배양체 2 ml씩을, Pureyield 키트 (Promega)와 같은 표준 키트를 이용하여 대략 10 ㎍의 각 클론의 미니프렙 플라스미드 DNA를 제조하는데 사용하였다. 목적하는 클론은 일반적으로 다음 단계에 따라 동정하였다. 먼저, DNA 서열 데이터 파일을 Genewiz 웹사이트로부터 다운로드하였다. 이어서 모든 서열들을 ECD 코딩 영역 시작 부위에서 개시되도록 수동으로 조작하였다. 이어서 조작된 서열들을 URL: www.ebi.ac.uk/Tools/st/emboss_transeq/로부터 입수가능한 적절한 프로그램을 이용하여 뱃치-번역하였다. 이어서 번역된 서열들을 URL: multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html에서 입수가능한 적절한 프로그램을 이용하여 정렬시켰다.
[428] 이어서 목적하는 클론들을 다음 기준에 따라 동정하였다: 1.) 동일한 클론은 정렬 중 적어도 2회 나타나고 및 2.) 돌연변이는 정렬 중 적어도 2회 나타나며 좋기로는 서로 다른 클론들에서 나타난다. 이들 기준 중 적어도 하나를 만족하는 클론들은 개선된 결합으로 인해, 소팅 프로세스에 의해 농축된 클론들이었다.
[429] 적어도 하나의 친화성-변형된 도메인을 갖는 CD80의 ECD를 함유하는 Fc 융합 단백질인 면역조절 단백질을 생성하기 위해, 인코딩 핵산 분자를 생성하여 다음과 같이 디자인된 단백질을 인코딩하였다: 변이체(돌연변이) ECD 다음에 3개 알라닌(AAA) 링커 다음에 SEQ ID NO: 226에 제시된 야생형 인간 IgG1 Fc에 대해 돌연변이 R77C, N82G 및 V87C를 함유하는 인간 IgG1 Fc. 상기 구조물은 시스테인과 공유 결합을 형성할 수 있는 항체 경쇄를 일절 포함하지 않으므로, 인간 IgG1 Fc는 SEQ ID NO: 226에 제시된 야생형 또는 변형되지 않은 Fc에 비해 5 위치의 시스테인 잔기가 세린 잔기로 치환된 (C5S) 것이다.
실시예 5
Fc-융합체의 발현 및 정제
[430] 실시예 5는 변이체 ECD CD80을 함유하는 Fc-융합 단백질들의 대량 발현 및 정제 처리를 설명한다.
[431] 재조합 변이체 Fc 융합 단백질들을 Expi293 발현 시스템 (Invitrogen, USA)을 이용하여 만들었다. 이전 단계로부터 얻은 4 ㎍의 각 플라스미드 DNA를 200㎕ Opti-MEM (Invitrogen, USA)에 첨가하고 이와 동시에 10.8㎕ ExpiFectamine을 또 다른 200㎕ Opti-MEM에 첨가하였다. 5분 후, 200㎕의 플라스미드 DNA를 200㎕의 ExpiFectamine과 혼합하고 이 혼합물을 세포에 첨가하기 전에 추가로 20분간 더 인큐베이션하였다. 천만개의 Expi293 세포들을 3.4ml 부피의 Expi293 배지 (Invitrogen, USA) 내, 멸균된 10 ml, 원뿔형 바닥을 갖는 깊은 24웰 배양 플레이트 (Thomson Instrument Company, USA)의 각각의 별도 웰에 분주하였다. 95% 습도 및 8% CO2로 설정된 포유동물 세포 배양 인큐베이터에서 플레이트들을 5일간 120 RPM으로 진탕시켰다. 5일의 인큐베이션 후, 세포들을 펠릿화하고 배양 상등액을 제거하였다.
[432] 제조업체 프로토콜(카탈로그 넘버 45202, Life Technologies, USA)을 이용하여 고처리량 96 웰 단백질 A 정제 키트를 이용함으로써 단백질을 정제하였다. 제조업체 프로토콜을 이용하여 96 웰 스핀 탈염 플레이트 (카탈로그 넘버 89807, Life Technologies, USA)를 이용하여 결과적인 용리 분획들의 완충액을 PBS로 교체하였다. 정제된 단백질을 Nanodrop 장치 (Thermo Fisher Scientific, USA)에 의해 측정되는 280 nm 흡광도를 이용하여 정량하고, 변성 및 환원 조건 하에 NUPAGE 프리-캐스트, 폴리아크릴아미드 겔 (Life Technologies, USA) 상에 5 ㎍의 단백질을 로딩한 다음 겔 전기영동함으로써 단백질의 순도를 평가하였다. 표준 쿠마씨 염색을 이용하여 겔에서 단백질을 가시화하였다.
실시예 6
친화성-성숙된(Affinity-Matured) IgSF 도메인-함유 분자들의 결합 및 활성 평가
A. 세포-발현된 카운터 구조에 대한 결합
[433] 이 실시예는 동족 결합 파트너들에 대한 CD80 도메인 변이체 면역조절 단백질들의 특이성 및 친화성을 보여주기 위한 Fc-융합 결합 연구를 설명한다.
[434] 동족 결합 파트너들을 발현하는 세포를 생산하기 위해, 인간 CD28, CTLA4, 및 PD-L1 각각에 대한 전장 포유동물 표면 발현 구조물을 pcDNA3.1 발현 벡터 (Life Technologies)에서 디자인하여 Genscript, USA로부터 공급받았다. Expi293F 단기 형질감염 시스템(Life Technologies, USA)을 이용하여 결합 연구를 수행하였다. 실험에 필요한 세포수를 결정하고 제조업체의 권장 프로토콜을 이용하여 약 30 ml 규모의 형질감염을 수행하였다. 각각의 CD28, CTLA-4, PD-L1, 또는 모형(mock) 30 ml 형질감염을 위해, 7천5백만개의 Expi293F 세포들을 30 ㎍ 발현 구조물 DNA 및 1.5ml의 희석된 ExpiFectamine 293 시약과 함께 48 시간 동안 인큐베이션하고, 이 동안 염색을 위해 세포들을 수확하였다.
[435] 유세포 측정에 의한 염색을 위해, 적절한 단기 형질감염 또는 음성 대조군의 200,000개 세포들을 96 웰 둥근바닥 플레이트에 플레이팅하였다. 세포들을 스핀 다운시키고 염색 완충액 (PBS (인산염 완충염수), 1% BSA (소혈청 알부민), 및 0.1% 소듐 아자이드)에 20분간 재현탁시켜 비-특이적인 결합을 차단하였다. 그 후, 세포들을 다시 원심분리하고, 각 후보 변이체 CD80 Fc 단백질의 실험에 따라, 50 ㎕ 중 100nM 내지 1nM 변이체 면역조절 단백질을 함유하는 염색 완충액에 재현탁하였다. 얼음에서 일차 염색을 45분간 수행하고, 그에 앞서, 염색 완충액에 세포들을 2회 세척하였다. PE-컨쥬게이트된 항-인간 Fc (Jackson ImmunoResearch, USA)를 50 ㎕ 염색 완충액에 1; 150으로 희석하고 세포에 첨가한 다음 다시 30분간 얼음 위에서 인큐베이션하였다. 2차 항체를 2회 세척하고 세포들을 4% 포름알데히드/PBS에 고정시킨 다음 샘플을 FACScan 유세포분석기 (Becton Dickinson, USA) 상에서 분석하였다.
[436] 평균 형광 강도(MFI)를 각 형질감염체 및 음성 모 세포주에 대해 Cell Quest Pro 소프트웨어 (Becton Dickinson, USA)를 이용하여 계산하였다.
B. 생체 활성 특징화
[437] 이 실시예는 인간 일차 T 세포 시험관내 분석을 이용한 Fc-융합 변이체 단백질 생체 활성 특징화에 관하여 설명한다.
1. 림프구 혼합 배양반응 (Mixed Lymphocyte Reaction: MLR)
[438] 가용성 rCD80.Fc 생체 활성을 인간 림프구 혼합 배양반응 (MLR)을 이용하여 검사하였다. PBMC (BenTech Bio, USA)로부터 분리된 단핵세포들을, 생체외에서 15 배지(Lonza, Switzerland) 중 500U/ml rIL-4 (R&D Systems, USA) 및 250U/ml rGM-CSF (R&D Systems, USA)와 함께 시험관내에서 7일간 배양함으로써 인간 일차 수지상 세포(DC)를 생성하였다. 10,000개의 성숙한 DC 및 100,000개의 정제된 동종이형(allogeneic) CD4+ T 세포들 (BenTech Bio, USA)을, 200㎕ 최종 부피의 Ex-Vivo 15 배지 중 96 웰 둥근바닥 플레이트에서 변이체 CD80 Fc 융합 단백질 및 대조군과 함께 공동-배양시켰다. 제 5일에, 배양 상등액 중 IFN-감마 분비를 Human IFN-감마 Duoset ELISA 키트 (R&D Systems, USA)를 이용하여 분석하였다. 광학 밀도를 VMax ELISA Microplate Reader (Molecular Devices, USA)로 측정하고 IFN-감마 Duo-세트 키트 (R&D Systems, USA)에 포함된, 적정된 rIFN-감마 스탠다드에 대해 정량하였다.
2. 항-CD3 공동고정화 분석
[439] CD80 융합 변이체들의 공동자극 생체 활성을 항-CD3 공동고정화(coimmobilization) 분석으로 탐지하였다. 1nM 또는 4nM 마우스 항-인간 CD3 (OKT3, Biolegends, USA)을 1nM 내지 80nM rCD80.Fc 변이체 단백질들와 함께 PBS에 희석하였다. 이 혼합물을 조직 배양체로 처리된 평평한 바닥 96 웰 플레이트(Corning, USA)에 밤새 첨가하여 플레이트의 웰에 대한 자극성 단백질이 부착을 용이하게 하였다. 다음 날, 미결합 단백질을 플레이트로부터 씻어내고 100,000개의 정제된 인간 범(pan) T 세포들 (BenTech Bio, US) 또는 인간 T 세포클론 BC3 (Astarte Biologics, USA)을 최종 부피 200㎕의 Ex-Vivo 15 배지 (Lonza, Switzerland) 내로 각 웰에 첨가하였다. 배양 상등액을 수확하기 전에 세포들을 3일간 배양하고 전술한 바와 같이 인간 IFN-감마 수준을 Duoset ELISA 키트 (R&D Systems, USA)를 이용하여 측정하였다.
C. 결과
[440] 예시적으로 시험된 변이체들에 대한 결합 및 활성 연구 결과를 표 7-8에 나타내었다. 특히, 표 7은 해당 동족 구조물 CD28에 대한 친화성-성숙체의 스크리닝 과정에서 선택된 CD80의 ECD에서의 예시적인 IgSF 도메인 아미노산 치환(대체)을 나타낸다. 표 8은 해당 동족 구조물 PD-L1에 대한 친화성-성숙체의 스크리닝 과정에서 선택된 CD80의 ECD에서의 예시적인 IgSF 도메인 아미노산 치환(대체)을 나타낸다. 표에서, 예시적인 아미노산 치환들은 각 비변형 레퍼런스 ECD 서열에 대응하는 아미노산 위치 번호로 나타낸다. 예를 들어, 표 7 및 표 8에서 비변형 레퍼런스 ECD 서열은 SEQ ID NO:28에 제시된 비변형 CD80 ECD 서열이다. 아미노산 위치는 중앙에 표시하였고, 대응하는 비변형(예컨대 야생형) 아미노산은 숫자 앞에, 동정된 변이체 아미노산 치환은 숫자 다음에 나타내었다. 컬럼 2에는 각각의 변이체 ECD-Fc 융합 분자에 대한 변이체 ECD의 SEQ ID NO 동정자(identifier)를 기재하였다.
[441] 동족 카운터 구조 리간드를 발현하도록 유전자 조작된 세포들에 대한 각 변이체 Fc-융합 분자의 결합에 대한 평균 형광 강도(MFI) 값 및 아미노산 치환(들)을 함유하지 않는 대응하는 비변형 ECD-Fc 융합 분자의 동일한 세포-발현된 카운터 구조 리간드에 대한 결합과 비교한 MFI의 비율(ratio)에 의해 측정되는 바와 같은 결합 활성 역시도 나타내었다. T 세포의 활성을 조절하는 변이체 Fc-융합 분자들의 기능 활성 역시도 i) 항-CD3과 함께 공동 고정된 표시된 변이체 ECD-Fc 융합 분자와 함께 또는 ii) MLR 분석에서 표시된 변이체 ECD-Fc 융합 분자와 함께 생성된 배양 상등액 중 IFN-감마의 계산된 수준 (pg/ml)에 기초하여 나타내었다. 표 7 및 8은 또한 두 가지 모두의 기능 분석에 있어서 대응하는 비변형 ECD-Fc와 비교되는 각 변이체 ECD-Fc에 의해 생산된 IFN-감마의 비율도 나타낸다.
[442] 나타난 바와 같이, 선택 결과 적어도 하나, 그리고 몇몇 경우 두 개 이상의 동족 카운터 구조 리간드에 대해 증가된 결합을 나타내는 친화성-변형된 CD80 IgSF 도메인 변이체들이 몇 개 동정되었다. 이에 더해, 이 결과는 변이체 분자들의 친화성 변형이 분자의 포맷에 따라 면역학적 활성을 증가시키기도 하고 감소시키기도 하는 두 가지 개선된 활성을 모두 나타냈다는 것을 보여주었다. 예를 들어, 리간드의 공동 고정화는 세포와의 다가 상호반응을 제공하여 아미노산 치환(들)을 함유하지 않는 비변형 (예컨대 야생형) ECD-Fc 분자에 비해 T 세포 활성의 증가 및 아고니스트 활성을 선호할 가능성이 높다. 그러나, 분자가 용액 중에 2가 Fc 분자로서 제공될 경우, 동일한 IgSF 도메인 변이체는 아미노산 치환(들)을 함유하지 않는 비변형 (예컨대 야생형) ECD-Fv 분자에 비해 T 세포 활성을 감소시키는 길항 활성을 나타내었다.
Figure pat00014
Figure pat00015
Figure pat00016
Figure pat00017
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실시예 7
리간드 결합 경쟁 분석
[443] 실시예 6에 제시된 바와 같이, 몇몇 변이체 CD80 분자는 CD28 및 PD-L1 중 일방 또는 양방 모두에 대해 향상된 결합을 나타내었다. 리간드 CD28 및 PD-L1에 대한 CD80의 결합 활성을 더 평가하기 위해 이 실시예는 CD28 및 PD-L1 양자 모두에 결합하는 예시적인 변이체 CD80 폴리펩타이드의 비-경쟁적 속성을 평가하는 리간드 경쟁 분석법을 설명한다.
[444] CD80이 CD28와 PD-L1에 동시에 결합하는 능력을 평가하기 위해 플레이트-결합된 변이체 CD80 A91G ECD-Fc가 통합된 ELISA 기반 결합 분석법을 구축하였다. Maxisorp 96 웰 ELISA 플레이트 (Nunc, USA)를 PBS 내 100nM 인간 재조합 변이체 CD80 A91G ECD-Fc 융합 단백질로 밤새 코팅하였다. 다음 날 미결합 단백질을 씻어내고, 실온에서 1 시간 동안 1% 소혈청 알부민 (Millipore, USA)/PBS를 이용하여 플레이트를 블로킹시켰다. 이 블로킹 시약을 PBS/ 0.05% Tween을 이용하여 3회 세척해냈고, 이것은 각 세척 당 플랫폼 진탕기 상에서의 2분간의 인큐베이션을 포함하였다.
[445] 경쟁 분석의 한 편에서는, CD80을 CD28과 인큐베이션한 다음 CD28-결합 CD80을 공지의 다른 CD80 리간드 카운터 구조물 PD-L1 또는 CTLA-4 또는 음성 대조군 리간드 PD-L2의 존재 하에서의 경쟁적 결합에 대해 평가하였다. 구체적으로, 바이오티닐화된 재조합 인간 CD28 Fc 융합 단백질 (rCD28.Fc; R&D Systems)을 10 nM으로부터 시작하여 웰 내로 적정하고 25 μl 부피로 1:2 희석하여 8 포인트 희석하였다. 바이오티닐화된 rCD28.Fc의 첨가 직후, 미표지 경쟁 바인더, 재조합 인간 PD-L1 모노머 his-태그된 단백질, 재조합 인간 CTLA-4 모노머 his-태그된 단백질, 또는 음성 대조군 인간 재조합 PD-L2 Fc 융합 단백질 (R&D Systems)을 25 μl 중에 각각 2000/1000/500　nM의 농도로 첨가하여 최종 부피를 50 μl로 하였다. 전술한 3회 세척 단계를 반복하기에 앞서 이들 단백질들을 1시간 동안 함께 인큐베이션하였다.
[446] 세척 후, 결합된 바이오티닐화 rCD28.Fc의 검출을 위해 웰 당 2.5　ng의 HRP-컨쥬게이트된 스트렙트아비딘(Jackson Immunoresearch, USA)을 1% BSA/PBS로 희석하고 웰에 첨가하였다. 1시간 인큐베이션한 후, 웰들을 전술한 바와 같이 다시 3회 세척하였다. 시그널 검출을 위해, 세척 후 50 μl의 TMB 기질(Pierce, USA)을 웰에 첨가하고 7분간 인큐베이션한 다음 50ul 2M 황산 종결 용액을 첨가하였다. Emax Plus 마이크로플레이트 판독기 (Molecular Devices, USA) 상에서 광학 밀도를 구하였다. 광학 밀도 값을 Prism (Graphpad, USA)을 이용하여 그래프화하였다.
[447] 결과를 도 7A에 나타내었다. 이 결과는 rCD28.Fc의 적정과 함께 변이체 CD80 A91G ECD-Fc 융합 단백질에 대한, 바이오티닐화된 rCD28.Fc의 결합이 감소되었음을 나타낸다. 비-경쟁적 대조군 단백질 rPDL2의 존재 하에 rCD28.Fc 결합이 수행된 경우, CD80에 대한 CD28 결합은 감소하지 않았다 (검은 삼각형). 이와 대조적으로, 경쟁적 대조군, rCTLA-4은 CD28.Fc와 함께 인큐베이션된 경우, 예상된 대로 CD80에 대한 CD28 결합을 감소시켰다 (x축). 재조합 PD-L1을 CD28.Fc와 함께 인큐베이션한 경우에는 CD80에 대한 CD28 결합의 감소가 관찰되지 않았는데, 이는 CD80에 대한 CD28 및 PD-L1의 에피토프가 비-경쟁적임을 입증하는 것이다. CD80에 대한 CD28 경쟁 분석에 사용된 재조합 PD-L1 단백질의 결합은 비-바이오티닐화된 rCD28.Fc의 존재 하에 바이오티닐화된 PD-L1을 인큐베이션함으로써 확인되었다 (사각형).
[448] CD80을 PD-L1과 함께 인큐베이션시킨 다음, PD-L1-결합된 CD80을, 공지의 다른 CD80 리간드 카운터 구조물 CD28 또는 CTLA-4 또는 음성 대조군 리간드 PD-L2의 존재 하에서의 경쟁적 결합에 대해 평가하는, 역 경쟁(reverse competition)도 셋업하였다. 구체적으로, 이 분석법은 바이오티닐화된 재조합 인간 PD-L1-His 모노머 단백질을, 재조합 변이체 CD80을 함유하는 웰 내로 적정함으로써 수행하였다. 이 리간드에 대한 결합은 더 약하기 때문에, 적정은 5000 nM으로 시작하되 마찬가지로 25 μL 부피로 8 포인트에 걸쳐 1:2 희석하였다. 결합을 검출하기 위해 rPD-L1-his가 사용된 경우, 경쟁적 리간드들인 인간 rCD28.Fc, 인간 rCTLA-4.Fc, 또는 인간 rPD-L2.Fc 대조군들을, 총 50 μl 부피가 되도록, 25 μl 내 2.5nM 최종 농도로 첨가하였다. 후속적인 세척, 검출 및 OD 측정은 전술한 바와 같다.
[449] 결과를 도 7B에 나타내었다. 적정된 PD-L1-his 결합 단독은 플레이트에 고정된 변이체 CD80 A91G ECD-Fc 융합 분자에 PD-L1이 결합되었음을 확인해주었다(사각형). 비-경쟁적 대조군 단백질, rPDL2의 존재 하에 PD-L1-His 결합이 수행된 경우 CD80에 대한 PD-L1 결합은 감소되지 않았다 (삼각형). CTLA-4가 CD28에 대해 경쟁적임에도 불구하고, CD28-경쟁적 대조군 단백질, rCTLA-4은, PD-L1-his와 함께 인큐베이션된 경우, CD80에 대한 PD-L1 결합을 감소시키지 않았다 (x축). 이 결과는 CD80 결합에 대한 CD28과 PD-L1 사이의 경쟁의 부재를 추가로 입증했다. 마지막으로, PD-L1-his를 CD28.Fc와 함께 인큐베이션한 경우, CD80에 대한 PD-L1 결합의 감소는 관찰되지 않았고, 이는 CD80에 대한 CD28 및 PD-L1의 에피토프가 비-경쟁적임을 입증하였다.
[450] 따라서, 이들 결과는 PD-L1 또는 음성 대조군 PD-L2가 아닌 CTLA-4가 CD80에 대한 CD28의 결합에 대해 경쟁적이었음과 (도 7A), CD28, CTLA-4 및 PD-L2는 CD80에 대한 CD28의 결합에 대해 경쟁하지 않았음을 보여준다 (도 7B). 따라서, 이들 결과는 CD28 및 PD-L1이 CD80의 비-경쟁적 결합체라는 것과, 이러한 비-경쟁적 결합이 ELISA에서 어느 리간드가 검출되는지와 무관하게 입증하는 것이다.
실시예 8
부가적인 친화성 변형된 IgSF 도메인
[451] 이 실시예는 면역 활성화 및 억제 두 가지 모두에서 이중 역할을 하는 것으로 입증된 바 있는, 부가적인 친화성 변형된 ICOSL, CD86 (B7-2) 및 NKp30 면역조절 단백질의 설계, 생성 및 스크리닝을 설명한다. 이들 실시예는 IgSF 도메인의 친화성 변형이 면역활적 활성을 증가 및 감소시키는 작용을 모두 할 수 있는 단백질을 생성함을 입증한다. 이 연구는 또한 변이체 친화성 변형된 CD80과 쌍으로 (즉, 적층된) 융합된 도메인의 다양한 조합이 면역조절 활성을 달성하기 위해 II형 면역조절 단백질을 형성하는 것을 기술한다.
[452] 효모 디스플레이 라이브러리로서의 번역 및 발현을 위한 인간 ICOSL, CD86 및 NKp30 IgSF 도메인의 돌연변이 DNA 작제물을 실시예 1에 설명된 바와 같이 생성하였다. 축퇴 코돈으로 완전 또는 부분적으로 무작위화하기 위한 표적 단백질의 특이적 잔기를 표적으로하는 라이브러리를 위해, 인간 ICOSL (SEQ ID NO:32) 및 NKp30 (SEQ ID NO:54)의 세포외 도메인 (ECD)에 대한 코딩 DNA 서열을 최대 80 염기쌍(bp) 길이의 중복 올리고뉴클레오타이드로서 Integrated DNA Technologies (Coralville, IA)로부터 주문하였다. 실제로 실시예 1에 설명된 바와 같은 표적화 돌연변이에 의해 잔기들을 돌연변이 시켰다. 별법으로, 실제로 실시예 1에 설명된 바와 같이 ICOSL (SEQ ID NO:32), CD86 (SEQ ID NO: 29) 및 NKp30 (SEQ ID NO:54)의 ECD의 변이체들을 동정하기 위해 무작위 라이브러리를 작제하였다.
[453] 축퇴 및 무작위 라이브러리 DNA를 실제로 실시예 2에 설명된 바와 같이 효모 내로 도입하여 효모 라이브러리를 생성하였다. 이 라이브러리를 이용하여 실제로 실시예 3에 설명된 바와 같이, ICOSL, CD86 및 NKp30의 친화성 변형된 변이체들을 발현하는 효모를 선별하였다. 실제로 실시예 3에 설명된 바와 같이 그의 외인성 재조합 카운터-구조물 단백질에 대한 결합능을 갖는 ICOSL, CD86 또는 NKp30 변이체를 농축시키고 비-바인더들을 감소시키기 위해 세포를 처리하였다. 이어서 개선된 바인더를 나타내는 효모 세포 분획을 농축하기 위해 외인성 카운터-구조물 단백질 염색을 이용한 유세포분석 소팅을 2 내지 3 라운드 수행하였다. 자성 비드 농축 및 유세포분석에 의한 선별에 대하여는 기본적으로 문헌 [Keith D. Miller,1 Noah B. Pefaur,2 및 Cheryl L. Baird1 Current Protocols in Cytometry 4.7.1-4.7.30, July 2008]에 설명되어 있다.
[454] ICOSL, CD86 및 NKp30 라이브러리를 이용하여, 다음과 같은 표적 리간드 단백질을 R&D Systems (USA)으로부터 공급받았다: 인간 rCD28.Fc (즉, 재조합 CD28-Fc 융합 단백질), rCTLA4.Fc, rICOS.Fc, 및 rB7H6.Fc. 2-색상 유세포분석법을 실제로 실시예 3에 설명된 바에 따라 수행하였다. 유세포분석 소트로부터의 효모 아웃풋을 보다 높은 특이적 결합 친화성에 대해 분석하였다. 소트 아웃풋 효모를 증식 및 재-유도하여 이들이 인코딩하는 특정 IgSF 친화성 변형된 도메인 변이체를 발현시켰다. 이어서 이 집단을 유세포분석에 의해, 모균주, 야생형 효모 균주 또는 다른 선택된 아웃풋, 예컨대 비드 아웃풋 효모 집단과 비교할 수 있다.
[455] ICOSL의 경우, 제2 소트 아웃풋(F2)을, 각 rICOS.Fc, rCD28.Fc 및 rCTLA4.Fc의 결합에 대한 모(parent) ICOSL 효모에 대한 것과 항-HA (헤마글루티닌) 태그 발현 및 2차 항-인간 Fc에 의해 각 집단을 이중으로 염색함으로써 비교하여 리간드 결합을 검출하였다.
[456] ICOS에 결합하기 위해 선택된 ICOSL 효모 변이체의 경우, 5.6 nM rICOS.Fc로 염색한 경우, F2 소트 아웃풋은 997의 평균 형광강도 (MFI) 값을 나타낸 반면, 모 ICOSL 균주 MFI는 동일한 농도의 rICOS.Fc로 염색된 경우 397로 측정되었다. 이것은 이 클론의 선택된 F2 풀에서의 평균 결합의 대략 3배 개선을 나타내며, 그 풀로부터의 개별 클론을 개별적으로 시험될 경우 훨씬 향상된 MFI/친화성을 가질 것으로 예측된다.
[457] CD28에 결합하기 위해 선택된 ICOSL 효모 변이체의 경우, 100　nM rCD28.Fc로 염색한 경우, F2 소트 아웃풋은 640의 평균 형광강도 (MFI) 값을 나타낸 반면, 모 ICOSL 균주 MFI는 동일한 농도의 rCD28.Fc로 염색된 경우 27로 측정되었다 (22배 향상). CTLA-4에 대한 결합을 위해 선택된 ICOSL 효모 변이체의 경우, F2 소트 아웃풋은 100nM rCTLA4.Fc로 염색한 경우, 949의 MFI 값을 나타낸 반면, 모 ICOSL 균주의 MFI 값은 동일한 농도의 rCTLA4.Fc로 측정시 29였다 (32배 향상).
[458] B7-H6에 결합하기 위해 선택된 NKp30 효모 변이체의 경우, 16.6nM rB7H6.Fc로 염색시 F2 소트 아웃풋은 533의 MFI 값을 나타낸 반면, 모 NKp30 균주의 MFI는 동일한 농도의 rB7H6.Fc로 염색시 90으로 측정되었다 (6배 향상).
[459] 동정된 NKp30 변이체 중, SEQ ID NO: 54에 제시된 위치에 상응하는 NKp30 세포외 도메인의 위치와 관련하여 돌연변이 L30V/A60V/S64P/S86G를 함유하는 변이체가 확인되었다. 동정된 CD86 변이체 중에는 SEQ ID NO:29에 제시된 위치에 상응하는 CD86 세포외 도메인의 위치와 관련하여 돌연변이 Q35H/H90L/Q102H가 확인되었다. 동정된 ICOSL 변이체 중에는 하기 표 9에 제시된, 그리고 더 나중에 설명되는 변이체가 있다.
[460] CD80의 경우처럼 FL1에서 항-HA 항체로 측정시 전술한 모든 F2 아웃풋의 MFI는 야생형 균주에 비해 증가하지 않았고 때로는 저하되었는데, 이는 증가된 결합이, 효모 표면에서의 선택된 변이체의 증가된 발현의 함수가 아님을 가리키며, 높은 리간드 결합을 나타내면서 중간 내지 낮은 발현체만을 선택하는 게이팅 전략이 검증되었다.
[461] 예시적인 선택 아웃풋을 실시예 4에 실제로 설명된 바와 같이, Fc 분자에 융합된 ICOSL의 친화성 변형된 (변이체) 세포외 도메인 (ECD)를 함유하는 면역조절 단백질(변이체 ECD-Fc 융합 분자)로서 재포맷하고 실시예 5에 실제로 설명된 바와 같이 Fc-융합 단백질을 발현 및 정제하였다.
[462] 이어서 세포-발현된 카운터 구조물에 대한 예시적인 ICOSL Fc 융합 변이체의 결합을 실질적으로 실시예 6에 기재된 바와 같이 평가하였다. 동족 결합 파트너를 발현하는 세포를 생성하기 위해, 인간 CD28 및 ICOS 각각에 대한 전장 포유동물 표면 발현 작제물들을 실제로 실시예 6에 기재된 바와 같이 수행하였다. 또한, Fc-융합 변이체 단백질의 생체 활성을 실제로 실시예 6에 설명된 바와 같이 항-CD3 공동고정 분석법 또는 림프구 혼합 배양반응 (MLR)에 의해 특징화하였다.
[463] 예시적인 시험된 변이체에 대한 결합 및 활성 연구의 결과를 표 9에 나타내었다. 특히, 표 9는 각각의 동족 구조물 ICOS 및 CD28에 대한 친화성-성숙을 위해 스크리닝된 ICOSL의 ECD에서의 예시적인 IgSF 도메인 아미노산 치환(대체)를 나타낸다. 예시적인 아미노산 치환은 다음과 같이 각각의 비변형 레퍼런스 ECD 서열에 상응하는 아미노산 위치 번호에 의해 표시된다. 예컨대, 표 9에서 비변형 레퍼런스 ECD 서열은 SEQ ID NO:32에 제시된 비변형 ICOSL ECD 서열이다. 아미노산 위치는 중간에 표시되고, 대응하는 비변형(예컨대 야생형) 아미노산은 상기 번호 앞에 그리고 동정된 변이체 아미노산 치환은 상기 번호 뒤에 표시한다. 칼럼 2는 각 변이체 ECD-Fc 융합 분자에 대한 변이체 ECD의 SEQ ID NO 식별자를 나타낸다.
[464] 또한 동족 카운터 구조물을 발현하도록 조작된 세포에 대한 각 변이체 Fc-융합 분자의 결합에 대한 평균 형광강도(MFI) 값 및 동일한 세포-발현 카운터 구조 리간드에 대한 아미노산 치환(들)을 함유하지 않는 상응하는 비변형 ECD-Fc 융합 분자의 결합과 비교한 MFI의 비율에 의해 측정된 결합 활성도 나타내었다. T 세포의 활성을 조절하기위한 변이체 Fc-융합 분자의 기능적 활성 역시도 i) 항-CD3과 공동고정된 지시된 변이체 ECD-Fc 융합 분자 또는 ii) MLR 분석에서 표시된 변이체 ECD-Fc 융합 분자에 의해 생성된 배양 상등액 중 IFN- 감마의 계산된 수준 (pg/ml)에 기초하여 나타내었다. 이들 표는 또한 두 가지 기능성 분석 모두에서 대응하는 비변형 ECD-Fc에 대한 각 변이체 ECD-Fc에 의해 생성된 IFN-감마의 비율도 나타낸다.
[465] 나타난 바와 같이, 이러한 선택에 의해, 친화성-변형된 적어도 하나, 일부 경우에 다수의 동족체 카운터 구조물 리간드에 대해 증가된 결합을 나타내는 친화성-변형된 ICOSL IgSF 도메인 변이체들이 여러개 동정되었다. 또한, 이러한 결과는 변이체 분자의 친화성 변형이 분자의 포맷에 따라 면역학적 활성을 증가 및 감소시키는 개선된 활성을 나타낸다는 것도 보여주었다. 예를 들어, 리간드의 공동고정은 아미노산 치환을 함유하지 않은 비변형(예, 야생형) ECD-Fc 분자와 비교하여 아고니스트 활성을 선호하고 T 세포 활성화를 증가시키기 위해 결합력을 증가 시키거나 클러스터링하는 세포와의 다가 상호작용을 제공할 가능성이다. 그러나, 분자가 용액 중에 2가 Fc 분자로서 제공될 경우, 동일한 IgSF 도메인 변이체들은 아미노산 치환(들)을 함유하지 않는 비변형(예, 야생형) ECD-Fc 분자에 비해 T 세포 활성화를 감소시키는 길항 활성을 나타내었다.
Figure pat00019
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실시예 9
상이한 친화성-변형된 도메인들을 함유하는 적층된 분자들의 생성 및 평가
[466] 이 실시예는 동정된 변이체 CD80 폴리펩타이드 및 하나 이상의 부가적인 변이체 CD80, CD86, ICOSL, 및 NKp30 분자이 한데 연결되어 Fc에 융합된, 적어도 2종의 상이한 친화성 변형된 도메인들을 함유하는 적층 작제물로서 생성된 추가적인 면역조절 단백질들을 설명한다.
[467] Selected 하나 이상의 카운터 구조 리간드에 대해 친화성-변형된 전술한, 선택된 변이체 분자들을 이용하여 친화성-변형된 IgSF 도메인들을 두 개 이상 함유하는 "적층(stack)" 분자(즉, II형 면역조절 단백질)을 생성하였다. 적층 구조물들은 Gibson 어셈블리 키트 (New England Biolabs)를 이용함으로서 표준 Gibson 어셈블리에 의해 Fc에 대한 그의 융합을 가능케 하는 포맷으로 적층체를 인코딩하는 유전자블록(geneblocks) (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA)으로서 수득되었다.
[468] 다음과 같이 디자인된 단백질을 인코딩하기 위해 모든 적층체의 인코딩 핵산 분자들을 생성하였다: 전술한 바와 같이 시그널 펩타이드, 이어서 목적하는 제1 변이체 IgV, 이어서 3개의 GGGGS(G4S) 모티프로 구성된 15개 아미노산 링커(SEQ ID NO:228), 이어서 목적하는 제2의 IgV, 이어서 2개의 GGGGS 링커 (SEQ ID NO: 229) 이어서 3개의 알라닌(AAA), 이어서 인간 IgG1 Fc. 각 적층체에 있어서 IgV 도메인들의 정확한 폴딩 기회를 최대화하기 위해, 제1 IgV에 앞서, 이 IgV와 시그널 펩타이드(선행 서열) 사이에 야생형 단백질에서 정상적으로 발생하는 모든 잔기들을 선행시켰다. 마찬가지로, 제1 IgV에 이어서 야생형 단백질에서 이것을 보통 다음 Ig 도메인 (일반적으로 IgC 도메인)에 연결시키는 모든 잔기 또는 만일 제2 IgV 도메인이 부재할 경우, 이것을 막통과 도메인(후행 서열)과 연결시키는 잔기가 후행하였다. 두 개의 IgV 도메인들 모두가 동일한 모 단백질 (예컨대 다른 CD80 IgV와 함께 적층된 CD80 IgV)로부터 유래된 경우, 이들 양자 사이에 링커가 중복되지 않는 경우를 제외하고, 동일한 디자인 원리가 제2의 IgV 도메인에도 적용되었다.
[469] 표 10에는 예시적인 적층된 구조물들에 대한 디자인이 기재되어 있다. 표 10에 나타나 있는 예시적인 적층 분자들은 표시된 바와 같은 IgV 도메인들 및 부가적으로 전술한 바와 같은 선행 서열 또는 후행 서열을 함유한다. 표에서, 다음의 성분들이 순서대로 제시된다: 시그널 펩타이드 (SP; SEQ ID NO:225), IgV 도메인 1 (IgV1), 후행 서열 1 (TS1), 링커 1 (LR1; SEQ ID NO:228), IgV 도메인 2(IgV2), 후행 서열 2 (TS2), 링커 2 (LR2; SEQ ID NO:230) 및 Fc 도메인 (C5S/R77C/N82G/V87C 아미노산 치환을 함유하는 SEQ ID NO:226). 몇 경우, 선행 서열 1(LS1)은 시그널 펩타이드와 IgV1 사이에 존재하고 몇몇 경우 선행 서열 2 (LS2)는 링커와 IgV2 사이에 존재한다
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[470] 적어도 하나의 친화성-변형된 IgV 도메인을 함유하는 CD80, CD86, ICOSL 또는 Nkp30으로부터의 변이체 IgV 도메인들의 다양한 조합을 함유하는 변이체 IgV-적층된-Fc 융합분자들의 대량 발현 및 정제를 실질적으로 실시예 5에 설명된 바와 같이 수행하였다. 대응하는 카운터 구조에 대한 변이체 IgV-적층된-Fc 융합 분자들의 결합 및 항-CD3 공동고정 분석에 의한 기능적 활성을 실질적으로 실시예 6에 설명된 바와 같이 평가하였다. 예를 들어, 전술한 바와 같이 유사한 공동고정된 항-CD3 분석법으로, 적층된 IgSF Fc 융합 단백질들의 공동자극 생체 활성을 알아보았다. 이 경우, 4nM의 항-CD3 (OKT3, Biolegend, USA)을 4nM 내지 120nM의 인간 rB7-H6.Fc (R&D Systems, USA) 또는 인간 rPD-L1.Fc (R&D Systems, USA)과 함께 조직-배양 처리된 96 웰 플레이트(Corning, USA) 상에서 밤새 공동고정시켰다. 다음 날 결합되지 않은 단백질을 PBS로 세척하고 100ul Ex-Vivo 15 배지 (Lonza, Switzerland) 내 100,000개의 정제된 범(pan) T 세포들을 각 웰에 첨가하였다. 이어서 적층된 IgSF 도메인들을 총 200ul 부피에 대해 100ul의 부피로 8nM 내지 40nM의 농도 범위로 첨가하였다. 배양 상등액 수확 전 3일 동안 세포들을 배양하고 전술한 바와 같이 Duoset ELISA 키트 (R&D Systems, USA)를 이용하여 인간 IFN-감마 수준을 측정하였다.
[471] 결과를 표 11-14에 나타내었다. 구체적으로, 표 11은 NKp30 IgV 도메인 및 CD80 또는 CD86 IgV 도메인을 함유하는 변이체 IgV-적층된-Fv 융합 분자들에 대한 결합 및 기능적 활성 결과를 기재하고 있다. 표 12는 변이체 CD80 IgV 도메인 및 CD80, CD86 또는 ICOSL IgV 도메인을 함유하는 변이체 IgV-적층된-Fc 융합 분자들에 대한 결합 및 기능적 활성 결과를 기재하고 있다. 표 13은 두 개의 변이체 CD80 IgV 도메인들을 함유하는 변이체 IgV-적층된-Fc 융합 분자들에 대한 결합 및 기능적 활성 결과를 기재하고 있다. 표 14는 변이체 CD80 IgV 도메인 및 변이체 ICOSL IgV 도메인을 함유하는 IgV-적층된 Fc 융합 분자들에 대한 결과를 기재한다.
[472] 표 11-14 각각에서, 컬럼 1은 아미노 말단 (N 말단) 도메인으로부터 시작하여, C 말단 인간 IgG1 Fc 도메인들에 앞서 위치하는 중간의 WT 또는 친화성 변형된 도메인으로 된 적층된, 친화성 변형된 또는 야생형 (WT) 도메인들의 구조 조직 및 배향을 나타낸다. 컬럼 2는 각각의 "적층" 분자들에 함유된 각 IgV 도메인의 서열에 대한 SEQ ID NO 동정자(identifier)를 나타낸다. 컬럼 3은 컬럼 1로부터의 표시된 친화성 변형된 적층된 도메인들에 대해 선택된 결합 파트너를 나타낸다.
[473] 다양한 카운터 구조 리간드들을 발현하도록 조작된 세포들에 대한 각 적층 분자의 결합에 대한 평균 형광 강도(MFI)값 및 동일한 세포-발현된 카운터 구조 리간드에 대한 아미노산 치환(들)을 함유하지 않는 비변형 IgV 도메인들을 함유하는 대응하는 적층 분자의 결합과 비교한 MFI의 비율(ratio)에 의해 측정되는 바와 같은 결합 활성 역시도 나타내었다. T 세포의 활성을 조절하는 변이체 적층 분자들의 기능적 활성 역시도 실시예 6에 설명된 바와 같이 항-CD3과 공동고정된 적절한 리간드 및 분자 중 표시된 변이체 적층 분자와 함께 생성된 배양 상등액(pg/ml)에서의 IFN-감마의 계산된 수준에 기초하여 나타내었다. 이 표는 또한 공동고정 분석에서 대응하는 비변형 적층 분자와 비교시 각 변이체 적층 분자에 의해 생산된 IFN-감마의 비율도 나타낸다.
[474] 나타난 바와 같이, 표시된 결과들은 상응하는 비변형(예컨대 야생형) IgV 도메인을 함유하는 대응하는 적층 분자에 비해, 적어도 하나의 동족 카운터 구조 리간드에 대한 결합이 증가된 친화성-변형된 활성을 나타내는 적어도 하나의 변이체 IgSF 도메인들을 함유하는 적층 분자들을 생성하는 것이 가능하였음을 보여준다. 몇몇 경우, 분자 내 두 개의 변이체 IgSF 도메인들 중 어느 하나 또는 두 개 모두의 조합으로부터의 적층 분자는 두 개 이상의 동족 카운터 구조 리간드에 대해 증가된 결합을 나타내었다. 이러한 결과는 또한 적층된 분자들 중의 IgV 도메인들의 순서가 증가된 결합 활성 정도를 변경시킬 수 있다는 것도 보여주었다. 몇몇 경우, 기능성 T 세포활성은 또한 표적화된 공동고정 분석에서 평가시 변경되었다.
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실시예 10
막관통 면역조절 단백질을 발현하는 조작된 세포의 생성 및 평가
[475] 전술한 변이체 CD80 또는 ICOSL 친화성-변형된 IgSF 도메인을 함유하는 세포외 도메인(ECD)을 함유하는 막관통 면역조절 단백질(TIP)이 키메라 항원 수용체(CAR)와 공동-발현된 조작된 T 세포를 생성하였다. TIP는 또한 상응하는 야생형 CD80 또는 ICOSL 막관통 단백질 서열의 막관통 도메인 및 세포질 도메인도 함유하였다. 조작된 세포들의 면역조절 활성을 CAR만을 발현하는 세포 또는 대응하는 야생형 CD80 또는 ICOSL 막관통 단백질과 CAR을 공동-발현하는 세포와 비교하였다.
[476] 예시적인 CD80-TIP는 SEQ ID NO: 1의 잔기 243-288에 상응하는 막관통 및 세포질 도메인과 SEQ ID NO: 28에 제시된 CD80 세포외 도메인 내의 위치를 참조로 I67T/L70Q/A91G/T120S에 상응하는 IgV 및 IgC 도메인에서 아미노산 치환을 함유하는 친화성-변형된 IgSF 도메인을 갖는 변이체 CD80이었다. 예시적인 CD80-TIP의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 241에 제시되어 있으며, SEQ ID NO: 242에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩된다. 상응하는 야생형 CD80 막관통 단백질은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 잔기 35-288에 제시된 아미노산 서열을 가지며 SEQ ID NO: 251에 제시된 아미노산 서열에 의해 인코딩된다.
[477] 예시적인 ICOSL-TIP는 SEQ ID NO: 5의 잔기 257-302에 상응하는 막관통 및 세포질 도메인과 SEQ ID NO: 32에 제시된 ICOSL 세포외 도메인 내의 위치를 참조로 N52H/I143T에 상응하는 IgV 및 IgC 도메인에서 아미노산 치환을 함유하는 친화성-변형된 IgSF 도메인을 갖는 변이체 ICOSL이었다. 예시적인 ICOSL-TIP의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 243에 제시되어 있으며, SEQ ID NO: 244에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩된다. 상응하는 야생형 ICOSL 막관통 단백질은 SEQ ID NO: 5의 아미노산 잔기 19-302에 제시된 아미노산 서열을 가지며 SEQ ID NO: 252에 제시된 아미노산 서열에 의해 인코딩된다.
[478] 대응하는 비-친화성 변형된 IgSF 도메인을 함유하는 야생형-막관통 단백질 또는 친화성-변형된 도메인을 함유하는 TIP를, CD3제타 세포내 시그널링을 포함하는 1세대 키메라 항원 수용체 (CAR)와 함께 T 세포에서 공동발현시켰다. 1 세대 CAR은 CAR은 CD19에 특이적인 ScFv (SEQ ID NO:245), 힌지 및 CD8로부터 유래된 막관통 도메인(SEQ ID NO:246) 및 CD3제타로부터 유래한 세포내 시그널링 도메인(SEQ ID NO:247에 제시됨)을 포함한다. CD19 scFv - CD3제타 CAR을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 SEQ ID NO:248에 기재되어 있고 CD19 scFv - CD3제타 CAR의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:479에 제시되어 있다.
[479] CAR을 단독으로 인코딩하거나 또는 자가 절단 T2A 서열(SEQ ID NO : 250 및 SEQ ID NO: 249에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는)에 의해 CAR로부터 분리된 야생형 막관통 단백질 또는 예시적인 TIP 중 하나 역시도 인코딩하는 핵산 분자들을 생성하였다. 예시적인 구조물들은 표 15에 제시된 핵산 서열들을 함유하였다. 대조군으로서, CD28 공동자극 도메인을 부가적으로 함유하는 2세대 CAR을 인코딩하는 핵산 구조물도 만들었다(CD19 scFv - CD28 - CD3제타).
Figure pat00040
[480] 3 명의 상이한 건강한 공여자로부터 수득한 인간 PBMC 샘플로부터 분리한 T 세포들을 형질도입하는데 이용되었던 렌티바이러스 벡터 내로 핵산 분자들을 개별적으로 클로닝하였다.　이들 벡터 및 렌티바이러스 패키징 구조물에 의한 HEK293 세포의 공동-형질도입 후 핵산 서열을 함유하는 렌티바이러스 입자들이 생산되었다. 렌티바이러스 입자들을 초원심분리에 의해 배양 배지로부터 수집하고 qRT-PCR에 의해 적정하였다. 밀도침강법을 이용하여 3명의 건강한 혈액 공여자로부터 인간 말초혈액 단핵구 세포들(peripheral blood mononuclear cells: PBMC)을 분리하였다. PBMC를 항-CD3 및 항-CD28 항체 및 IL-2와 함께 밤새 배양한 다음, 5:1의 감염 다중도로 렌티바이러스 제제로 형질도입하였다. 대조군인 2세대 CAR을 인코딩하는 렌티바이러스 벡터들는 한 명의 공여자로부터 세포를 형질도입하는데만 이용되었다.
[481] 배양 2주일(14일) 후, 96 웰 마이크로 전자 플레이트 (E- 플레이트)의 배양 배지에서 임피던스 변화를 측정하여, 실시간 플롯으로 세포수 및 형태학 변화를 나타내는 AceaReal-Time Cell Analyzer (RTCA)를 사용하여 표적 항원-발현 세포와 함께 배양한 다음 세포들을 세포독성에 대해 분석하였다. CD19-발현 HeLa 표적 세포 (HeLa-CD19)를 96-웰 E-플레이트에 접종하고 각 단층의 임피던스를 RTCA 시스템을 사용하여 24 시간 동안 모니터링 하였다. 조작된 T 세포를 이펙터: 표적 비율 10 : 1로 하여 웰에 첨가하고 웰을 48 시간 더 모니터링 하였다. 측정된 전기 임피던스의 변화로부터 유도된 세포 지수(CI: Cell Index) 값으로 결과를 표시 및 기록한 다음, 모든 웰의 CI 판독 값을 개별 웰의 CI 값에 대해 동시에 나누어 비율을 변환하여 기준-시간에서의 백분율 값을 나타내는 표준화된 세포 지수 값을 얻는다(참조: "Introduction to the Data Analysis of the Roche xCELLigence®System with RTCA Package." Bioconductor. May, 3, 2016, bioconductor.org/packages/devel/bioc/vignettes/RTCA/inst/doc/aboutRTCA.pdf. Accessed September 9, 2016). 이 분석법에서, 단층의 임피던스 감소는 형질도입된 세포들에 의한 표적 세포들의 살해를 반영한다.
[482] 이러한 결과는, 1 세대 CAR을 발현하는 세포의 임피던스 감소 정도가 2 세대 CAR을 발현하는 세포보다 작았음에도 불구하고, 비-형질도입된 T 세포에 비해 1 세대 CAR을 발현하는 세포에서 임피던스가 감소함을 나타낸 것이다. 1 세대 CAR을 발현하는 세포의 임피던스 감소는 일반적으로 분석의 최초 8 시간까지 지속되었으며, 2 세대 CAR- 발현 세포들만이 이후 임피던스를 감소시켰다.
[483] 도 8에 도시된 바와 같이, 한 공여자에서, TIP 또는 상응하는 야생형 막관통 단백질을 1 세대 CAR과 동시 발현시키는 각 세포들은 더 큰 임피던스 감소를 나타냈는데, 이는 1 세대 CAR 만을 발현하는 세포에 비해, 세포독성 활성이 더 크다는 것을 가리킨다. 또한, 이 결과는 비-친화성 변형된 IgSF 도메인을 함유하는 상응하는 야생형 CD80 또는 ICOSL 막관통 단백질을 공동 발현하는 CAR-발현 세포와 비교하여, CD80-TIP 또는 ICOSL-TIP를 공동 발현하는 CAR-발현 세포에서 세포 독성 활성이 더 컸음을 나타낸다. 이들 TIP-조작 세포의 관찰 결과는 CAR과 함께 CD80-TIP 또는 ICOSL-TIP를 공동 발현하는 세포에서의 세포 독성 활성이, CAR-발현 T 세포와 같은 항원-특이적 T 세포의 세포독성 면역 반응을 조절하는데 있어 증가된 활성을 나타낸다는 것을 보여주는 것이다.
[484] 다른 두 공여자에서, CD80-TIP를 발현하는 세포들은, 대응하는 야생형 CD80 막관통 단백질을 발현하는 세포에 비해 더 큰 임피던스 감소를 나타내지 않았다. 한 공여자에서, ICOS-L TIP가 시험된 다른 구조물과 비교하여 가장 좋은 세포 독성을 나타내긴 하였으나, 이 기증자에서는 야생형 막관통 단백질 구조물을 형질도입하는데 충분한 세포가 없었다. 또 다른 공여자에서는, ICOS-L-TIP를 발현하는 세포들이, 상응하는 야생형 ICOS-L-TIP 막관통 단백질을 발현하는 세포들에 비해 더 큰 임피던스 감소를 결과시키지 않았다. 시험된 세포에서, CD80-TIP, ICOSL-TIP 또는 상응하는 야생형 막관통 단백질을 CAR과 함께 발현하는 모든 세포들은 1 세대 CAR을 발현하는 세포보다 더 큰 세포 독성 활성을 나타냈다. 공여자 사이에서 관찰된 이들 상이한 결과는 공여자들 사이의 T 세포의 차이, 세포 표면의 다양한 조작된 단백질의 발현 수준의 차이, 세포 살해를 평가하기 위한 이 예시적인 분석법에 사용된 특정 조건 (예컨대, 제14일의 형질도입된 세포 평가, 단일 이펙터:표적 세포 비율 평가) 또는 다른 인자들과 관련된 것일 수 있다.
실시예 11
CD80 IgSF 도메인 변이체의 결합 및 활성 평가
[485] 추가의 ECD CD80 변이체를 동정하고, 실시예 5에 기술된 바와 같이 ECD-Fc 융합 단백질을 생성하는데 사용하였다. 실시예 6에 실질적으로 기재된 바와 같이 동족 결합 파트너에 대한 CD80 도메인 변이체 면역조절 단백질의 특이성 및 친 화성을 평가하기 위해 결합 연구를 수행하였다. 세포-발현 카운터 구조물에 대한 결합 및 항-CD3 공동고정 분석으로부터의 생체 활성에 대한 부가적인 CD80 IgSF 도메인 변이체의 예시적인 결과가 표 16에 제시되어있다.
[486] 표 16에 나타낸 예시적인 아미노산 치환은 SEQ ID NO:28에 제시된 각각의 비변형 레퍼런스 CD80 ECD 서열에 상응하는 아미노산 위치 번호로 표시한다. 아미노산 위치는 중간에 표시되고, 이 번호 앞에는 대응하는 비변형 (예컨대 야생형) 아미노산을, 상기 번호 다음에는 동정된 변이체 아미노산 치환을 나타낸다. 컬럼 2는 각 변이체 ECD-Fc 융합 분자에 대한 변이체 ECD에 대한 SEQ ID NO 식별자를 나타낸다. 또한 동종카운터 구조 리간드를 발현하도록 조작된 세포에 대한 각 변이체 Fc-융합 분자의 결합에 대한 평균 형광강도 (MFI) 값으로서 측정된 결합 활성 및 아미노산 치환(들)을 함유하지 않는 대응하는 비변형 ECD-Fc 융합 분자의 동일한 세포-발현된 카운터 구조 리간드에 대한 결합과 비교한 MFI 비율도 나타내었다. 또한 항-CD3과 공동고정된 표시된 변이체 ECD-Fc 융합 분자를 이용하여 생성된, 배양 상등액 중 대응하는 비변형(모) ECD-Fc와 비교한 IFN-감마의 비율 및 IFN-감마의 계산된 수준 (pg/ml)에 기초하여, T 세포 활성을 조절하기 위한 변이체 Fc-융합 분자의 기능적 활성도 나타내었다. 이러한 결과는, 적어도 하나의 동족 카운터 구조 리간드에 대한 친화성-변형된 CD80 IgSF 도메인 변이체의 변경, 예컨대 증가된 결합 친화성 및/또는 개선된 면역학적 활성을 보여준다.
Figure pat00041
Figure pat00042
Figure pat00043
Figure pat00044
Figure pat00045
Figure pat00046
[487] 본 발명은 예를 들어 본 발명의 다양한 측면을 설명하기 위해 제공된, 특정 개시된 구체예들로 그 범위가 한정되는 것으로 의도되지 않는다. 설명된 조성물과 방법에 대한 다양한 변형이 가능하다는 것은 본 명세서의 설명과 교시 내용으로부터 자명하다. 이러한 변형은 본 발명의 진정한 범위와 정신을 벗어나지 않고 실시될 수 있으며 본 명세서의 개시 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Alpine Immune Sciences, Inc. SWANSON, Ryan KORNACKER, Michael <120> CD80 Variant Immunomodulatory Proteins and Uses Thereof <130> 761612000440 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> 62/323,595 <151> 2016-04-15 <150> 62/394,743 <151> 2016-09-14 <150> 62/410,844 <151> 2016-10-20 <150> 62/472,570 <151> 2017-03-16 <150> 62/475,201 <151> 2017-03-22 <160> 478 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 288 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> CD80(B7-1) <400> 1 Met Gly His Thr Arg Arg Gln Gly Thr Ser Pro Ser Lys Cys Pro Tyr 1 5 10 15 Leu Asn Phe Phe Gln Leu Leu Val Leu Ala Gly Leu Ser His Phe Cys 20 25 30 Ser Gly Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu 35 40 45 Ser Cys Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile 50 55 60 Tyr Trp Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp 65 70 75 80 Met Asn Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr 85 90 95 Asn Asn Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly 100 105 110 Thr Tyr Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg 115 120 125 Glu His Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr 130 135 140 Pro Ser Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile 145 150 155 160 Ile Cys Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu 165 170 175 Glu Asn Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp 180 185 190 Pro Glu Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met 195 200 205 Thr Thr Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg 210 215 220 Val Asn Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro 225 230 235 240 Asp Asn Leu Leu Pro Ser Trp Ala Ile Thr Leu Ile Ser Val Asn Gly 245 250 255 Ile Phe Val Ile Cys Cys Leu Thr Tyr Cys Phe Ala Pro Arg Cys Arg 260 265 270 Glu Arg Arg Arg Asn Glu Arg Leu Arg Arg Glu Ser Val Arg Pro Val 275 280 285 <210> 2 <211> 329 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> CD86(B7-2) <400> 2 Met Asp Pro Gln Cys Thr Met Gly Leu Ser Asn Ile Leu Phe Val Met 1 5 10 15 Ala Phe Leu Leu Ser Gly Ala Ala Pro Leu Lys Ile Gln Ala Tyr Phe 20 25 30 Asn Glu Thr Ala Asp Leu Pro Cys Gln Phe Ala Asn Ser Gln Asn Gln 35 40 45 Ser Leu Ser Glu Leu Val Val Phe Trp Gln Asp Gln Glu Asn Leu Val 50 55 60 Leu Asn Glu Val Tyr Leu Gly Lys Glu Lys Phe Asp Ser Val His Ser 65 70 75 80 Lys Tyr Met Gly Arg Thr Ser Phe Asp Ser Asp Ser Trp Thr Leu Arg 85 90 95 Leu His Asn Leu Gln Ile Lys Asp Lys Gly Leu Tyr Gln Cys Ile Ile 100 105 110 His His Lys Lys Pro Thr Gly Met Ile Arg Ile His Gln Met Asn Ser 115 120 125 Glu Leu Ser Val Leu Ala Asn Phe Ser Gln Pro Glu Ile Val Pro Ile 130 135 140 Ser Asn Ile Thr Glu Asn Val Tyr Ile Asn Leu Thr Cys Ser Ser Ile 145 150 155 160 His Gly Tyr Pro Glu Pro Lys Lys Met Ser Val Leu Leu Arg Thr Lys 165 170 175 Asn Ser Thr Ile Glu Tyr Asp Gly Val Met Gln Lys Ser Gln Asp Asn 180 185 190 Val Thr Glu Leu Tyr Asp Val Ser Ile Ser Leu Ser Val Ser Phe Pro 195 200 205 Asp Val Thr Ser Asn Met Thr Ile Phe Cys Ile Leu Glu Thr Asp Lys 210 215 220 Thr Arg Leu Leu Ser Ser Pro Phe Ser Ile Glu Leu Glu Asp Pro Gln 225 230 235 240 Pro Pro Pro Asp His Ile Pro Trp Ile Thr Ala Val Leu Pro Thr Val 245 250 255 Ile Ile Cys Val Met Val Phe Cys Leu Ile Leu Trp Lys Trp Lys Lys 260 265 270 Lys Lys Arg Pro Arg Asn Ser Tyr Lys Cys Gly Thr Asn Thr Met Glu 275 280 285 Arg Glu Glu Ser Glu Gln Thr Lys Lys Arg Glu Lys Ile His Ile Pro 290 295 300 Glu Arg Ser Asp Glu Ala Gln Arg Val Phe Lys Ser Ser Lys Thr Ser 305 310 315 320 Ser Cys Asp Lys Ser Asp Thr Cys Phe 325 <210> 3 <211> 290 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> CD274 (PD-L1, B7-H1) <400> 3 Met Arg Ile Phe Ala Val Phe Ile Phe Met Thr Tyr Trp His Leu Leu 1 5 10 15 Asn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr 20 25 30 Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu 35 40 45 Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile 50 55 60 Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser 65 70 75 80 Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn 85 90 95 Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr 100 105 110 Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val 115 120 125 Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val 130 135 140 Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr 145 150 155 160 Pro Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser 165 170 175 Gly Lys Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn 180 185 190 Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr 195 200 205 Cys Thr Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu 210 215 220 Val Ile Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr His 225 230 235 240 Leu Val Ile Leu Gly Ala Ile Leu Leu Cys Leu Gly Val Ala Leu Thr 245 250 255 Phe Ile Phe Arg Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Val Lys Lys Cys 260 265 270 Gly Ile Gln Asp Thr Asn Ser Lys Lys Gln Ser Asp Thr His Leu Glu 275 280 285 Glu Thr 290 <210> 4 <211> 273 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> PDCD1LG2(PD-L2, CD273) <400> 4 Met Ile Phe Leu Leu Leu Met Leu Ser Leu Glu Leu Gln Leu His Gln 1 5 10 15 Ile Ala Ala Leu Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Glu Leu Tyr Ile Ile 20 25 30 Glu His Gly Ser Asn Val Thr Leu Glu Cys Asn Phe Asp Thr Gly Ser 35 40 45 His Val Asn Leu Gly Ala Ile Thr Ala Ser Leu Gln Lys Val Glu Asn 50 55 60 Asp Thr Ser Pro His Arg Glu Arg Ala Thr Leu Leu Glu Glu Gln Leu 65 70 75 80 Pro Leu Gly Lys Ala Ser Phe His Ile Pro Gln Val Gln Val Arg Asp 85 90 95 Glu Gly Gln Tyr Gln Cys Ile Ile Ile Tyr Gly Val Ala Trp Asp Tyr 100 105 110 Lys Tyr Leu Thr Leu Lys Val Lys Ala Ser Tyr Arg Lys Ile Asn Thr 115 120 125 His Ile Leu Lys Val Pro Glu Thr Asp Glu Val Glu Leu Thr Cys Gln 130 135 140 Ala Thr Gly Tyr Pro Leu Ala Glu Val Ser Trp Pro Asn Val Ser Val 145 150 155 160 Pro Ala Asn Thr Ser His Ser Arg Thr Pro Glu Gly Leu Tyr Gln Val 165 170 175 Thr Ser Val Leu Arg Leu Lys Pro Pro Pro Gly Arg Asn Phe Ser Cys 180 185 190 Val Phe Trp Asn Thr His Val Arg Glu Leu Thr Leu Ala Ser Ile Asp 195 200 205 Leu Gln Ser Gln Met Glu Pro Arg Thr His Pro Thr Trp Leu Leu His 210 215 220 Ile Phe Ile Pro Phe Cys Ile Ile Ala Phe Ile Phe Ile Ala Thr Val 225 230 235 240 Ile Ala Leu Arg Lys Gln Leu Cys Gln Lys Leu Tyr Ser Ser Lys Asp 245 250 255 Thr Thr Lys Arg Pro Val Thr Thr Thr Lys Arg Glu Val Asn Ser Ala 260 265 270 Ile <210> 5 <211> 302 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> ICOSLG(B7RP1, CD275, ICOSL, B7-H2) <400> 5 Met Arg Leu Gly Ser Pro Gly Leu Leu Phe Leu Leu Phe Ser Ser Leu 1 5 10 15 Arg Ala Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp 20 25 30 Val Glu Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn 35 40 45 Asp Val Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr 50 55 60 Tyr His Ile Pro Gln Asn Ser Ser Leu Glu Asn Val Asp Ser Arg Tyr 65 70 75 80 Arg Asn Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe 85 90 95 Ser Leu Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gln Asp Glu Gln Lys Phe His 100 105 110 Cys Leu Val Leu Ser Gln Ser Leu Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val 115 120 125 Glu Val Thr Leu His Val Ala Ala Asn Phe Ser Val Pro Val Val Ser 130 135 140 Ala Pro His Ser Pro Ser Gln Asp Glu Leu Thr Phe Thr Cys Thr Ser 145 150 155 160 Ile Asn Gly Tyr Pro Arg Pro Asn Val Tyr Trp Ile Asn Lys Thr Asp 165 170 175 Asn Ser Leu Leu Asp Gln Ala Leu Gln Asn Asp Thr Val Phe Leu Asn 180 185 190 Met Arg Gly Leu Tyr Asp Val Val Ser Val Leu Arg Ile Ala Arg Thr 195 200 205 Pro Ser Val Asn Ile Gly Cys Cys Ile Glu Asn Val Leu Leu Gln Gln 210 215 220 Asn Leu Thr Val Gly Ser Gln Thr Gly Asn Asp Ile Gly Glu Arg Asp 225 230 235 240 Lys Ile Thr Glu Asn Pro Val Ser Thr Gly Glu Lys Asn Ala Ala Thr 245 250 255 Trp Ser Ile Leu Ala Val Leu Cys Leu Leu Val Val Val Ala Val Ala 260 265 270 Ile Gly Trp Val Cys Arg Asp Arg Cys Leu Gln His Ser Tyr Ala Gly 275 280 285 Ala Trp Ala Val Ser Pro Glu Thr Glu Leu Thr Gly His Val 290 295 300 <210> 6 <211> 534 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> CD276(B7-H3) <400> 6 Met Leu Arg Arg Arg Gly Ser Pro Gly Met Gly Val His Val Gly Ala 1 5 10 15 Ala Leu Gly Ala Leu Trp Phe Cys Leu Thr Gly Ala Leu Glu Val Gln 20 25 30 Val Pro Glu Asp Pro Val Val Ala Leu Val Gly Thr Asp Ala Thr Leu 35 40 45 Cys Cys Ser Phe Ser Pro Glu Pro Gly Phe Ser Leu Ala Gln Leu Asn 50 55 60 Leu Ile Trp Gln Leu Thr Asp Thr Lys Gln Leu Val His Ser Phe Ala 65 70 75 80 Glu Gly Gln Asp Gln Gly Ser Ala Tyr Ala Asn Arg Thr Ala Leu Phe 85 90 95 Pro Asp Leu Leu Ala Gln Gly Asn Ala Ser Leu Arg Leu Gln Arg Val 100 105 110 Arg Val Ala Asp Glu Gly Ser Phe Thr Cys Phe Val Ser Ile Arg Asp 115 120 125 Phe Gly Ser Ala Ala Val Ser Leu Gln Val Ala Ala Pro Tyr Ser Lys 130 135 140 Pro Ser Met Thr Leu Glu Pro Asn Lys Asp Leu Arg Pro Gly Asp Thr 145 150 155 160 Val Thr Ile Thr Cys Ser Ser Tyr Gln Gly Tyr Pro Glu Ala Glu Val 165 170 175 Phe Trp Gln Asp Gly Gln Gly Val Pro Leu Thr Gly Asn Val Thr Thr 180 185 190 Ser Gln Met Ala Asn Glu Gln Gly Leu Phe Asp Val His Ser Ile Leu 195 200 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<212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> CD160 <400> 24 Met Leu Leu Glu Pro Gly Arg Gly Cys Cys Ala Leu Ala Ile Leu Leu 1 5 10 15 Ala Ile Val Asp Ile Gln Ser Gly Gly Cys Ile Asn Ile Thr Ser Ser 20 25 30 Ala Ser Gln Glu Gly Thr Arg Leu Asn Leu Ile Cys Thr Val Trp His 35 40 45 Lys Lys Glu Glu Ala Glu Gly Phe Val Val Phe Leu Cys Lys Asp Arg 50 55 60 Ser Gly Asp Cys Ser Pro Glu Thr Ser Leu Lys Gln Leu Arg Leu Lys 65 70 75 80 Arg Asp Pro Gly Ile Asp Gly Val Gly Glu Ile Ser Ser Gln Leu Met 85 90 95 Phe Thr Ile Ser Gln Val Thr Pro Leu His Ser Gly Thr Tyr Gln Cys 100 105 110 Cys Ala Arg Ser Gln Lys Ser Gly Ile Arg Leu Gln Gly His Phe Phe 115 120 125 Ser Ile Leu Phe Thr Glu Thr Gly Asn Tyr Thr Val Thr Gly Leu Lys 130 135 140 Gln Arg Gln His Leu Glu Phe Ser His Asn Glu Gly Thr Leu Ser Ser 145 150 155 160 Gly Phe Leu Gln Glu Lys Val Trp Val Met Leu Val Thr Ser Leu Val 165 170 175 Ala Leu Gln Ala 180 <210> 25 <211> 278 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> 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<211> 127 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> BTLA(CD272) ECD <400> 39 Lys Glu Ser Cys Asp Val Gln Leu Tyr Ile Lys Arg Gln Ser Glu His 1 5 10 15 Ser Ile Leu Ala Gly Asp Pro Phe Glu Leu Glu Cys Pro Val Lys Tyr 20 25 30 Cys Ala Asn Arg Pro His Val Thr Trp Cys Lys Leu Asn Gly Thr Thr 35 40 45 Cys Val Lys Leu Glu Asp Arg Gln Thr Ser Trp Lys Glu Glu Lys Asn 50 55 60 Ile Ser Phe Phe Ile Leu His Phe Glu Pro Val Leu Pro Asn Asp Asn 65 70 75 80 Gly Ser Tyr Arg Cys Ser Ala Asn Phe Gln Ser Asn Leu Ile Glu Ser 85 90 95 His Ser Thr Thr Leu Tyr Val Thr Asp Val Lys Ser Ala Ser Glu Arg 100 105 110 Pro Ser Lys Asp Glu Met Ala Ser Arg Pro Trp Leu Leu Tyr Arg 115 120 125 <210> 40 <211> 371 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> CD4 ECD <400> 40 Lys Lys Val Val Leu Gly Lys Lys Gly Asp Thr Val Glu Leu Thr Cys 1 5 10 15 Thr Ala Ser Gln Lys Lys Ser Ile Gln Phe His Trp Lys Asn Ser Asn 20 25 30 Gln Ile Lys Ile Leu Gly Asn Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro 35 40 45 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ggccattacc ttaatctcag taaatggaat ttttgtgata 780 tgctgcctga cctactgctt tgccccaaga tgcagagaga gaaggaggaa tgagagattg 840 agaagggaaa gtgtacgccc tgtataa 867 <210> 252 <211> 909 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> ICOSL <400> 252 atgcggctgg gcagtcctgg actgctcttc ctgctcttca gcagccttcg agctgatact 60 caggagaagg aagtcagagc gatggtaggc agcgacgtgg agctcagctg cgcttgccct 120 gaaggaagcc gttttgattt aaatgatgtt tacgtatatt ggcaaaccag tgagtcgaaa 180 accgtggtga cctaccacat cccacagaac agctccttgg aaaacgtgga cagccgctac 240 cggaaccgag ccctgatgtc accggccggc atgctgcggg gcgacttctc cctgcgcttg 300 ttcaacgtca ccccccagga cgagcagaag tttcactgcc tggtgttgag ccaatccctg 360 ggattccagg aggttttgag cgttgaggtt acactgcatg tggcagcaaa cttcagcgtg 420 cccgtcgtca gcgcccccca cagcccctcc caggatgagc tcaccttcac gtgtacatcc 480 ataaacggct accccaggcc caacgtgtac tggatcaata agacggacaa cagcctgctg 540 gaccaggctc tgcagaatga caccgtcttc ttgaacatgc ggggcttgta tgacgtggtc 600 agcgtgctga ggatcgcacg gacccccagc gtgaacattg 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50 55 60 Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr 65 70 75 80 Glu Cys Val Val Arg Lys Tyr Glu Asn Asp Thr Pro Val Leu Glu His 85 90 95 Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser 100 105 110 Ile Ser Asp Phe Glu Val Pro Ser Ser Asn Ile Arg Arg Ile Thr Cys 115 120 125 Ser Ala Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu Glu Asn 130 135 140 Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp Pro Glu 145 150 155 160 Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Glu Leu Asp Phe Asn Met Thr Thr 165 170 175 Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val Asn 180 185 190 Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn 195 200 205 <210> 472 <211> 208 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD80 v180 ECD <400> 472 Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys 1 5 10 15 Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp 20 25 30 Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn 35 40 45 Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Ser Asn Asn 50 55 60 Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr 65 70 75 80 Val Cys Val Val Arg Lys Tyr Glu Asn Asp Thr Pro Val Leu Glu His 85 90 95 Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser 100 105 110 Ile Ser Asp Phe Glu Val Pro Ser Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys 115 120 125 Ser Ala Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu Glu Asn 130 135 140 Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp Pro Glu 145 150 155 160 Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Glu Leu Asp Phe Asn Met Thr Thr 165 170 175 Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val Asn 180 185 190 Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn 195 200 205 <210> 473 <211> 208 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD80 v181 ECD <400> 473 Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys 1 5 10 15 Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp 20 25 30 Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn 35 40 45 Ile Trp Pro Glu Cys Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn 50 55 60 Leu Ser Ile Val Ile Gln Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr 65 70 75 80 Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Gly Ala Phe Lys Arg Glu His 85 90 95 Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser 100 105 110 Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys 115 120 125 Ser Ala Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu Glu Asn 130 135 140 Gly Glu Glu Leu Asp Ala Ile Thr Thr Thr Val Ser Gln Asp Pro Glu 145 150 155 160 Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met Thr Thr 165 170 175 Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly Asp Leu Arg Val Asn 180 185 190 Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn 195 200 205 <210> 474 <211> 208 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD80 v182 ECD <400> 474 Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys 1 5 10 15 Gly Leu Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Asp Ile Leu Trp 20 25 30 His Lys Glu Gly Lys Ile Val Leu Ala Met Arg Ser Gly Asp Thr Asn 35 40 45 Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn 50 55 60 Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr 65 70 75 80 Val Cys Val Val Arg Lys Tyr Glu Asn Asp Thr Pro Val Leu Glu His 85 90 95 Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser 100 105 110 Ile Ser Asp Phe Glu Val Pro Ser Ser Asn Ile Arg Arg Ile Thr Cys 115 120 125 Ser Ala Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu Glu Asn 130 135 140 Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp Pro Glu 145 150 155 160 Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met Thr Thr 165 170 175 Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly Asp Leu Arg Val Asn 180 185 190 Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn 195 200 205 <210> 475 <211> 208 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD80 v183 ECD <400> 475 Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys 1 5 10 15 Gly Leu Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Asp Ile Leu Trp 20 25 30 His Lys Glu Gly Lys Ile Val Leu Ala Met Arg Ser Gly Asp Thr Asn 35 40 45 Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn 50 55 60 Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr 65 70 75 80 Val Cys Val Val Arg Lys Tyr Glu Asn Asp Thr Pro Val Leu Glu His 85 90 95 Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser 100 105 110 Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys 115 120 125 Ser Ala Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu Glu Asn 130 135 140 Gly Glu Glu Leu Ser Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp Pro Glu 145 150 155 160 Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met Thr Thr 165 170 175 Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val Asn 180 185 190 Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn 195 200 205 <210> 476 <211> 101 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD80 v153 IgV <400> 476 Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys 1 5 10 15 Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp 20 25 30 Gln Lys Glu Gly Lys Met Val Met Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn 35 40 45 Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn 50 55 60 Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr 65 70 75 80 Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His 85 90 95 Leu Ala Glu Val Thr 100 <210> 477 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD80 v153 IgV <400> 477 Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys 1 5 10 15 Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp 20 25 30 Gln Lys Glu Gly Lys Met Val Met Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn 35 40 45 Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn 50 55 60 Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr 65 70 75 80 Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His 85 90 95 Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp 100 105 <210> 478 <211> 237 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ICOSL v36 ECD <400> 478 Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu 1 5 10 15 Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn Asp Val 20 25 30 Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr Tyr His 35 40 45 Ile Pro Gln His Ser Ser Leu Glu Asn Val Asp Ser Arg Tyr Arg Asn 50 55 60 Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe Ser Leu 65 70 75 80 Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gln Asp Glu Gln Lys Phe His Cys Leu 85 90 95 Val Leu Ser Gln Ser Leu Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val Glu Val 100 105 110 Thr Leu His Val Ala Ala Asn Phe Ser Val Pro Val Val Ser Ala Pro 115 120 125 His Ser Pro Ser Gln Asp Glu Leu Thr Phe Thr Thr Ser Ile Asn Gly 130 135 140 Tyr Pro Arg Pro Asn Val Tyr Trp Ile Asn Lys Thr Asp Asn Ser Leu 145 150 155 160 Leu Asp Gln Ala Leu Gln Asn Asp Thr Val Phe Leu Asn Met Arg Gly 165 170 175 Leu Tyr Asp Val Val Ser Val Leu Arg Ile Ala Arg Thr Pro Ser Val 180 185 190 Asn Ile Gly Cys Cys Ile Glu Asn Val Leu Leu Gln Gln Asn Leu Thr 195 200 205 Val Gly Ser Gln Thr Gly Asn Asp Ile Gly Glu Arg Asp Lys Ile Ala 210 215 220 Glu Asn Pro Val Ser Thr Gly Glu Lys Asn Ala Ala Thr 225 230 235

Claims (195)

  1. IgV 도메인 또는 그의 특이적 결합 단편, IgC 도메인 또는 그의 특이적 결합 단편, 또는 양자 모두를 포함하는 변이체 CD80 폴리펩타이드로서, 여기서 상기 변이체 CD80 폴리펩타이드는 비변형 CD80 또는 그의 특이적 결합 단편 내에 하나 이상의 아미노산 변형을, SEQ ID NO:　28의 넘버링을 참조로 대응하는 위치(들) 4, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 21, 22, 24, 25, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 36, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 47, 48, 50, 52, 53, 54, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 72, 74, 76, 77, 80, 81, 83, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 99, 102, 103, 104, 107, 108, 109, 110, 114, 115, 116, 117, 118, 120, 121, 122, 126, 127, 128, 129, 130, 133, 137, 140, 142, 143, 144, 148, 149, 152, 154, 160, 162, 164, 168, 169, 174, 175, 177, 178, 183, 185, 188, 190, 192, 193, 또는 199에 포함하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  2. 청구항 1에서, 하나 이상의 아미노산 변형은 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 포함하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에서, 비변형 CD80은 포유동물 CD80인 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  4. 청구항 1-3 중 어느 하나의 청구항에 있어서, CD80은 인간 CD80인 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  5. 청구항 1-4 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는:
    IgV 도메인 또는 그의 특이적 결합 단편; 및
    IgC 도메인 또는 그의 특이적 결합 단편
    을 포함하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  6. 청구항 1-5 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 비변형 CD80은 (i) SEQ ID NO:28에 제시된 아미노산 서열, (ii) SEQ ID NO:28에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 (iii) IgV 도메인 또는 IgC 도메인 또는 그의 특이적 결합 단편을 포함하는 그의 일부를 포함하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  7. 청구항 1-6 중 어느 하나의 청구항에 있어서:
    IgV 도메인 또는 IgC 도메인의 특이적 결합 단편은 적어도 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 또는 그 이상의 아미노산 길이를 갖고;
    IgV 도메인의 특이적 결합 단편은 SEQ ID NO:1의 아미노산 35-135로서 제시된 IgV 도메인의 길이의 적어도 80%인 길이를 포함하거나; 또는
    IgC 도메인의 특이적 결합 단편은 SEQ ID NO:1의 아미노산 145-230으로서 제시된 IgC 도메인의 길이의 적어도 80%인 길이를 포함하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  8. 청구항 1-7 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 아미노산 변형, 선택적으로 아미노산 치환을 포함하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  9. 청구항 1-8 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 28, 또는 그의 특이적 결합 단편에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  10. 청구항 1-9 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 변이체 CD80은 비변형 CD80에 비해 CD28의 엑토도메인, PD-L1, 또는 CTLA-4에 대해 변경된 특이성을 나타내는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  11. 청구항 9에 있어서, 변경된 결합은 변경된 결합 친화성 및/또는 변경된 결합 선택성인 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  12. 청구항 1-11 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환은 V4M, K9E, E10R, V11S, A12G, A12T, A12V, T13N, L14A, S15V, S15F, C16S, C16G, C16L, G17W, H18L, H18R, H18Y, V20L, S21P, V22A, E24G, L25P, Q27R, T28A, T28S, R29C, R29D, R29H, R29V, I30V, Y31F, Y31H, Y31L, Q33H, K36E, K36G, K37E, K37Q, M38I, M38L, M38T, M38V, L40M, T41A, T41G, T41D, T41I, M42T, M43I, M43Q, M43R,M43V, S44P, M47T, N48D, N48I, W50G, E52G, Y53C, K54M, F59L, F59S, D60V, I61N, T62S, N63S, N64S, L65H, S66H, I67F, I67T, V68A, V68M, I69T, L70Q, L70P, L70R, L72P, P74L, D76G, E77G, E77K, Y80N, E81A, E81R, E81V, V83A, V83I, L85I, L85R, K86E, Y87N, E88D, E88G, K89E, K89N, K89R, D90K, D90L, D90N, A91E, A91G, A91S, A91T, F92L, F92N, F92P, F92Y, K93I, K93E, K93Q, K93R, K93V, R94G, R94L, R94F, E95K, H96R, L97R, E99D, E99G, L102S, S103L, S103P, V104A, V104L, D107N, F108L, P109S, P109H, T110A, S114T, D115G, F116S, F116L, E117V, E117G, I118V, I118A, I118T, T120S, S121P, N122S, I126L, I126V, I127T, C128Y, C128R, S129L, S129P, T130A, G133D, P137L, S140T, L142S, E143G, N144D, N144S, L148S, N149D, N149S, N152T, T154I, T154A, E160G, E162G, Y164H, S168G, K169E, K169I, K169S, M174T, M174V, T175A, N177S, H178R, L183H, K185E, H188D, H188Q, R190S, N192D, Q193L, T199S, 또는 그의 보존적 아미노산 치환인 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  13. 청구항 1-12 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환은 V4M/L70Q/A91G/T120S/T130A, A12T/H18L/M43V/F59L/E77K/P109S/I118T,A12V/S15F/Y31H/T41G/T130A/P137L/N152T, V20L/L70Q/A91S/T120S/T130A, V22A/L70Q/S121P, E24G/L25P/L70Q/T120S, T28S/L70Q/A91G/E95K/T120S/T130A, E24G/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/F59L/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/H96R,R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M42T/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/L148S/N149S,R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/N149S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118T/N149S,R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/N144S/N149S,R29H/Y31H/T41G/Y87N/E88G/K89E/D90N/A91G/P109S, R29H/E52G/L70R/E88G/A91G/T130A, R29H/E52G/T120S/T130A,R29V/Y31F/K36G/M38L/M43Q/E81R/V83I/L85I/K89R/D90L/A91E/F92N/K93Q/R94G,R29V/M43Q/E81R/L85I/K89R/D90L/A91E/F92N/K93Q/R94G,Y31H/T41G/L70Q/A91G/T120S/T130A,K36G, K36G/K37Q/M38I/L40M, K36G/K37Q/M38I/F59L/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/E99G/T130A/N149S, K36E/I67T/L70Q/A91G/T120S/T130A/N152T, K37E/F59S/L70Q/A91G/T120S/T130A,M38T/L70Q/E77G/A91G/T120S/T130A/N152T,M38V/T41D/M43I/W50G/D76G/V83A/K89E/T120S/T130A,T41I/A91G,S44P/L70Q/A91G/T130A,E52G/L70Q/A91G/T120S/T130A, K54M/A91G/T120S, D60V/A91G/T120S/T130A, N63S/L70Q/A91G/T120S/T130A, S66H/D90G/T110A/F116L, I67F/L70R/E88G/A91G/T120S/T130A, I67T/L70Q/A91G/T120S, V68A/T110A, V68M/L70P/L72P/K86E,L70Q/A91G/T110A/T120S/T130A,L70Q/E81A/A91G/T120S/I127T/T130A,L70Q/Y87N/A91G/T130A, L70Q/A91G, L70Q/A91G/E117G/T120S/T130A, L70Q/A91G/T120S/T130A, L70Q/A91G/T130A, L70Q/A91G/I118A/T20S/T130A, L70R/A91G/T120S/T130A, E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R, K89E/T130A,K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R, E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R/N122S/N177S, K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R/N122S/N177S, A91G, A91G/F92L/F108L/T120S, A91G/L102S, A91G/S103P, A91G/T120S/T130A, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T120S/I127T/T130A/K169E, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/L70Q/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T120S/I127T/T130A, H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T120S/I127T/T130A/K169E, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T120S/T130A/M174T, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/F59L/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T120S/I127T/T130A/H188D, H18R/R29D/Y31L/Q33H/K36G/K37E/M38I/T41A/M43R/M47T/L70Q/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T120S/T130A/K169E/H188D, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/L70Q/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T120S/I127T/T130A/E143G/K169E/M174V/H188D, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/L70Q/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T120S/I127T/T130A, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T120S/I127T/T130A/H188D, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/L70Q/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T120S/I127T/T130A/K169E, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/L70Q/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T120S/I127T/T130A, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T120S/I127T/T130A/K169E/H188D, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/F108L/T120S/T130A/K169E/H188D, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/L70Q/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T130A/H188D,R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/L70Q/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T120S/I127T/T130A/K169E, H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/L70Q/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T120S/T130A/K169E/H188D, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T120S/I127T/C128Y/T130A/H188D, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94F/T130A/K169E, H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T130A, H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/L70Q/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T120S/T130A/K169E, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/L70Q/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93I/R94L/L97R/T130A, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/L70Q/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93I/R94L/L97R/T130A/L148S, H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/I127T/T130A/K169E, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/I61N/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94F/V104A/T120S/T130A, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/F92P/K93V/R94F/I118V/T130A, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/T62S/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/T130A/K169E/T175A, H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/F116S/T130A/H188D, H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T120S/I127T/T130A/L142S/H188D, C16S/H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T110A/H188D, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/A91G/T120S/I127T/T130A/H188D, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/L70Q/D76G/A91G/S103L/T120S/I127T/T130A, Q33 deleted/Y53C/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T120S/I127T/T130A/K169E, T62S/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T120S/T130A/K169E, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/S129L/H188D, K9E/E10R/V11S/A12G/T13N/K14A/S15V/C16L/G17W/H18Y/Y53C/L70Q/ D90G/T130A/N149D/N152T/H188D, H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/I127T/T130A/H188D, K89E/K93E/T130A, S21P/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/N48I/V68A/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/P109H/I126L/K169I, H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/ P74L/Y80N/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/L97R, S21P/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/P74L/Y80N/E81V/L85R/K89N/D90N/A91T/F92P/K93V/R94L/T130A/N149S/E162G, H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/V68M/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T130A, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/V68M/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T130A/N149S/R190S, H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/P74L/Y80N/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T130A/R190S, C16G/V22A/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/V68M/D76G/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118T/T130A/S140T/N149S/K169I/H178R/N192D, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94F/E117V/I118T/N149S/S168G/H188Q, V22A/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/V68M/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T130A, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/N64S/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94F/ I118T/T130A/N149S/K169I, V22A/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/V68M/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/D115G/I118T/T130A/G133D/N149S, S129P, A91G/S129P, I69T/L70Q/A91G/T120S, Y31H/S129P, T28A/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/ V104L/T130A/N149S, H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/L97R/N149S/H188Q, H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/L97R/N149S, H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/V68A/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/ T130A/N149S/T154I, A12G/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/V68A/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/ L97R/T130A/L183H, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118T/T130A/S140T/N149S/K169S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118T/T130A/N149S/K169I/Q193L, V22A/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/ I118T/T130A/N149S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118T/T130A/N149S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118T/T130A/N149S/K169I, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94F/T130A/N149S/K169I, I118T/C128R, Q27R/R29C/M42T/S129P/E160G, S129P/T154A, S21P/L70Q/D90G/T120S/T130A, L70Q/A91G/N144D, L70Q/A91G/I118A/T120S/T130A/K169E, V4M/L70Q/A91G/I118V/T120S/T130A/K169E, L70Q/A91G/I118V/T120S/T130A/K169E, L70Q/A91G/I118V/T120S/T130A, V20L/L70Q/A91S/I118V/T120S/T130A, L70Q/A91G/E117G/I118V/T120S/T130A, A91G/I118V/T120S/T130A, L70R/A91G/I118V/T120S/T130A/T199S, L70Q/E81A/A91G/I118V/T120S/I127T/T130A, T28S/L70Q/A91G/E95K/I118V/T120S/I126V/T130A/K169E, N63S/L70Q/A91G/S114T/I118V/T120S/T130A, K36E/I67T/L70Q/A91G/I118V/T120S/T130A/N152T, E52G/L70Q/A91G/D107N/I118V/T120S/T130A/K169E, K37E/F59S/L70Q/A91G/I118V/T120S/T130A/K185E, D60V/A91G/I118V/T120S/T130AK169E, K54M/L70Q/A91G/Y164H/T120S, M38T/L70Q/E77G/A91G/I118V/T120S/T130A/N152T, Y31H/T41G/M43L/L70Q/A91G/I118V/T120S/I126V/T130A, L65H/D90G/T110A/F116L, R29H/E52G/D90N/I118V/T120S/T130A, I67T/L70Q/A91G/I118V/T120S, L70Q/A91G/T110A/I118V/T120S/T130A, M38V/T41D/M43I/W50G/D76G/V83A/K89E/I118V/T120S/I126V/T130A, A12V/S15F/Y31H/M38L/T41G/M43L/D90N/T130A/P137L/N149D/N152T, I67F/L70R/E88G/A91G/I118V/T120S/T130A, E24G/L25P/L70Q/A91G/I118V/T120S/N152T, A91G/F92L/F108L/I118V/T120S, E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R/N122S/N177S, K36G/K37Q/M38I/L40M/F59L/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/E99G/T130A/N149S, K36G/L40M, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/I127T/T130A/K169E, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/L70Q/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/I127T/T130A, H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/I127T/T130A/K169E, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/T130A/K169E/M174T, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/N48D/F59L/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/I127T/T130A/H188D, H18R/R29D/Y31L/Q33H/K36G/K37E/M38I/T41A/M43R/M47T/L70Q/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/T130A/K169E/H188D, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/L70Q/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/I127T/T130A/E143G/K169E/M174V/H188D, R29D/I30V/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/I127T/T130A/H188D, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/I127T/T130A/H188D, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/L70Q/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/I127T/T130A/K169E, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/L70Q/E81V/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/I127T/T130A, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/I127T/T130A/K169E/H188D, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/F108L/I118V/T120S/T130A/K169E/H188D, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/L70Q/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/T130A/N149D/K169E/H188D, H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/L70Q/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/T130A/K169E/H188D, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/I127T/C128Y/T130A/H188D, H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/E99D/T130A, H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/L70Q/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/T130A/K169E, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/I61N/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94F/V104A/I118V/T120S/I126V/T130A, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94F/I118V/T120S/T130A, H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/I127T/T130A/L142S/H188D, C16S/H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T110A/I118V/H188D, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/A91G/I118V/T120S/I127T/T130A/H188D, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/L70Q/D76G/A91G/S103L/I118V/T120S/I127T/T130A,Y53C/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/I127T/T130A/K169E, T62S/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/T130A/K169E, Y53C/L70Q/D90G/T130A/N149D/N152T/H188D, H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/I127T/T130A/H188D, 또는 H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T130A/N149S.
    인 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  14. 청구항 1-13 중 어느 하나의 청구항에 있어서, SEQ ID NOS: 55-108, 280-346, 414-475 또는 그의 특이적 결합 단편 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NOS:55-108, 280-346, 414-475 또는 그의 특이적 결합 단편 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 나타내고 하나 이상의 아미노산 치환을 함유하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  15. 청구항 1-14 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 IgV 도메인 또는 그의 특이적 결합 단편을 포함하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  16. 청구항 1-15 중 어느 하나의 청구항에 있어서, IgV 도메인 또는 그의 특이적 단편은 변이체 CD80 폴리펩타이드의 유일한 CD80 부분인 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  17. 청구항 1-14 중 어느 하나의 청구항에 있어서, IgC 도메인 또는 그의 특이적 단편은 변이체 CD80 폴리펩타이드의 유일한 CD80 부분인 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  18. 청구항 1-17 중 어느 하나의 청구항에 있어서, SEQ ID NOS: 153-195, 347, 373-386, 476-477 또는 그의 특이적 결합 단편 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열, SEQ ID NOS: 153-195, 347, 373-386, 476-477 또는 그의 특이적 결합 단편 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 나타내고 하나 이상의 아미노산 치환을 함유하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  19. 청구항 1-17 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 CD28의 엑토도메인, PD-L1, 또는 CTLA-4에 대해 증가된 친화성으로 특이적으로 결합하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  20. 청구항 1-19 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 변이체 폴리펩타이드는 엑토도메인에 대한 비변형 CD80의 결합에 비해 CD28의 엑토도메인, PD-L1 또는 CTLA-4에 대해 증가된 선택성으로 특이적으로 결합하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  21. 청구항 20에 있어서, 증가된 선택성은 하나의 동족 결합 파트너 대 또 다른 동족 결합 파트너에 대한 비변형 CD80 폴리펩타이드의 결합 비율과 비교하여, CD28, PD-L1 및 CTLA-4로부터 선택된 하나의 동족 결합 파트너 대 또 다른 동족 결합 파트너의 비율이 더 큰 것을 포함하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  22. 청구항 19 또는 청구항 20에 있어서, 변이체 폴리펩타이드는 CD28의 엑토도메인에 대한 비변형 CD80의 결합에 비해 증가된 선택성으로 CD28의 엑토도메인에 특이적으로 결합하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  23. 청구항 22에 있어서, 증가된 선택성은 CD28 대PD-L1 또는 CTLA-4에 대한 비변형 CD80 폴리펩타이드의 결합 비율에 비해 CD28 대 PD-L1 또는 CTLA-4에 대해 더 큰 비율을 포함하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  24. 청구항 21 또는 청구항 23에 있어서, 상기 비율은 적어도 또는 적어도 약 1.5배, 2.0배, 3.0배, 4.0배. 5배, 10배, 15배, 20배, 30배, 40배, 50배 또는 그 이상 더 큰 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  25. 청구항 1-24 중 어느 하나에 있어서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 증가된 친화성으로 CD28의 엑토도메인에 특이적으로 결합하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  26. 청구항 19 또는 청구항 25에 있어서, 엑토도메인에 대한 증가된 친화성은 엑토도메인에 대한 비변형 CD80의 결합 친화성에 비해 1.2배, 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배 또는 60배 이상 증가된 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  27. 청구항 1-26 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환은 SEQ ID NO:　28의 넘버링을 참조로 12, 18, 20, 29, 31, 36, 40, 41, 43, 52, 59, 60, 63, 67, 70, 77, 81, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 107, 109, 114, 117, 118, 120, 122, 127, 130, 144, 169, 177 또는 199 위치(들)에 대응하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  28. 청구항 1-27 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환은 A12T, H18L, V20L, R29H, Y31H, K36G, T41G, T41I, M43V, E52G, F59L, D60V, N63S, I67T, L70Q, L70R, E77K, E81A, Y87N, E88D, E88G, K89E, K89R, D90K, D90N, L40M, A91G, A91S, F92Y, K93R, D107N, P109S, S114T, E117G, I118A, I118T, I118V, T120S, I127T, T130A, N144D, K169E,N177S, 및 T199S으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 및 그의 보존적 아미노산 치환인 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  29. 청구항 1-28 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환은 A12T/H18L/M43V/F59L/E77K/P109S/I118T, V20L/L70Q/A91S/T120S/T130A, V20L/L70Q/A91S/I118V/T120S/T130A,R29H/Y31H/T41G/Y87N/E88G/K89E/D90N/A91G/P109S, K36G, K36G/L40M,T41I/A91G, E52G/L70/A91G/T120S/T130A, E52G/L70Q/A91G/D107N/I118V/T120S/T130A/K169E,D60V/A91G/T120S/T130A, D60V/A91G/I118V/T120S/T130A/K169E,N63S/L70Q/A91G/T120S/T130A, N63S/L70Q/A91G/S114T/I118V/T120S/T130A, I67T/L70Q/A91G/T120S, I67T/L70Q/A91G/I118V/T120S,L70Q/E81A/A91G/T120S/I127T/T130A, L70Q/E81A/A91G/I118V/T120S/I127T/T130A,L70Q/Y87N/A91G/T130A, L70Q/A91G, L70Q/A91G/N144D, L70Q/A91G/E117G/T120S/T130A, L70Q/A91G/E117G/I118V/T120S/T130A,L70Q/A91G/I118A/T120S/T130A, L70Q/A91G/I118A/T120S/T130A/K169E,L70Q/A91G/T120S/T130A, L70R/A91G/T120S/T130A, L70R/A91G/I118V/T120S/T130A/T199S L70Q/A91G/I118V/T120S/T130A/K169E,E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R, K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R, E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R/N122S/N177S, 또는 K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R/N122S/N177S인 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  30. 청구항 1-29 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 증가된 친화성으로 PD-L1의 엑토도메인에 특이적으로 결합하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  31. 청구항 30에 있어서, 엑토도메인에 대한 증가된 친화성은 엑토도메인에 대한 비변형 CD80의 결합 친화성에 비해 1.2배, 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배 또는 60배 이상 증가된 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  32. 청구항 1-31 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 변이체 폴리펩타이드는 엑토도메인에 대한 비변형 CD80의 결합에 비해 증가된 선택성으로 PD-L1의 엑토도메인에 특이적으로 결합하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  33. 청구항 32에 있어서, 증가된 선택성은 PD-L1 대 CD28 또는 CTLA-4에 대한 비변형 CD80 폴리펩타이드의 결합 비율에 비해 PD-L1 대 CD28 또는 CTLA-4에 대한 결합 비율이 더 큰 것을 포함하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  34. 청구항 33에 있어서, 상기 비율은 적어도 또는 적어도 약 1.5배, 2.0배, 3.0배, 4.0배. 5배, 10배, 15배, 20배, 30배, 40배, 50배 또는 그 이상 더 큰 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  35. 청구항 1-34 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환은 SEQ ID NO:　28의 넘버링을 참조로 12, 18, 29, 31, 33, 36, 38, 40, 41, 42, 43, 47, 48, 59, 64, 67, 68, 70, 77, 81, 85, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 97, 104, 109, 115, 117, 118, 120, 122, 126, 130, 133, 140, 144, 148, 149, 168, 178, 183, 188 또는 193 위치(들)에 대응하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  36. 청구항 1-35 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환은 A12G, A12T, H18L, S21P, V22A, T28A, R29D, R29H, Y31H, Y31L, Q33H, K36G, M38I, M38L, L40M, T41A, T41G, M42T, M43R, M43V, M47T, N48I, F59L, N64S, I67T, V68A, V68M, L70Q, E77K, E81V, L85R, Y87N, E88D, E88G, K89E, K89N, K89R, D90K, D90N, A91G, A91T, F92P, F92Y, K93V, R94F, R94L, L97R, S103L, S103P, V104L, P109H, P109S, D115G, E117V, I118T,I118V, T120S, N122S, I126L, T130A, G133D, S140T, N144S, L148S, N149S, S168G, K169I, K169S, N177S, L183H, H188Q, R190S 및 Q193L, 및 그의 보존적 아미노산 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  37. 청구항 1-36 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환은A12T/H18L/M43V/F59L/E77K/P109S/I118T, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118T/N149S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/N144S/N149S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M42T/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/L148S/N149S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/N149S, R29H/Y31H/T41G/Y87N/E88G/K89E/D90N/A91G/P109S, K36G, K36G/L40M,I67T/L70Q/A91G/T120S, I67T/L70Q/A91G/I118V/T120S, E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R, K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R, A91G, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118T/N149S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/N144S/N149S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M42T/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/L148S/N149S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/N149S, R29H/Y31H/T41G/Y87N/E88G/K89E/D90N/A91G/P109S, K36G, K36G/L40M,I67T/L70Q/A91G/T120S, I67T/L70Q/A91G/I118V/T120S,E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R, K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R, A91G, H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/I127T/T130A/H188D, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/V68M/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T130A/N149S/R190S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94F/E117V/I118T/N149S/S168G/H188Q, V22A/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/V68M/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T130A, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/N64S/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94F/ I118T/T130A/N149S/K169I, V22A/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/V68M/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/D115G/I118T/T130A/G133D/N149S, T28A/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/ V104L/T130A/N149S, H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/L97R/N149S/H188Q, K89E/T130A, K89E/K93E/T130A, S21P/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/N48I/V68A/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/S21P/ N48I/V68A/P109H/I126L/K169I, H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/V68M/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T130A, H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T130A/N149S, A12G/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/V68A/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/ L97R/T130A/L183H, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118T/T130A/S140T/N149S/K169S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118T/T130A/N149S/K169I/Q193L, V22A/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/ I118T/T130A/N149S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118T/T130A/N149S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118T/T130A/N149S/K169I, 또는 R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94F/T130A/N149S/K169I인 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  38. 청구항 1-37 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 증가된 친화성으로 CD28의 엑토도메인 및 PD-L1의 엑토도메인에 특이적으로 결합하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  39. 청구항 1-38 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환은 SEQ ID NO:　28의 넘버링을 참조로 12, 18, 36, 40, 43, 59, 77, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 109, 118, 122, 또는 177 위치(들)에 대응하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  40. 청구항 1-39 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환은 A12T, H18L, K36G,L40M, M43V, F59L, E77K, E88D, K89R, D90K, A91G, F92Y, K93R, P109S, I118T, N112S, N177S, 및 그의 보존적 아미노산 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  41. 청구항 1-40 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환은 A12T/H18L/M43V/F59L/E77K/P109S/I118T, K36G, K36G/L40M,E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R, K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R, E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R/N122S/N177S, 또는 K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R/N122S/N177S인 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  42. 청구항 1-41 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 증가된 친화성으로 CTLA-4의 엑토도메인에 특이적으로 결합하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  43. 청구항 42에 있어서, 엑토도메인에 대한 증가된 친화성은 엑토도메인에 대한 비변형 CD80의 결합 친화성에 비해 1.2배, 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배 또는 60배 증가된 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  44. 청구항 1-43 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 변이체 폴리펩타이드는 엑토도메인에 대한 비변형 CD80의 결합에 비해 증가된 선택성으로 CTLA-4의 엑토도메인에 특이적으로 결합하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  45. 청구항 44에 있어서, 증가된 선택성은 CTLA-4 대 CD28 또는 PD-L1에 대한 비변형 CD80 폴리펩타이드의 결합 비율에 비해 CTLA-4 대 CD28 또는 PD-L1에 대해 더 큰 결합 비율을 포함하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  46. 청구항 45에 있어서, 상기 비율은 적어도 또는 적어도 약 1.5배, 2.0배, 3.0배, 4.0배. 5배, 10배, 15배, 20배, 30배, 40배, 50배 또는 그 이상 더 큰 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  47. 청구항 1-46 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환은 SEQ ID NO:　28의 넘버링을 참조로 4, 29, 31, 36, 40, 41, 52, 67, 68, 70, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 107, 109, 110, 118, 120, 130, 144, 또는 169 위치(들)에 대응하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  48. 청구항 1-47 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환은 V4M, R29H, Y31H, K36G,L40M T41G, E52G, I67T, V68A, L70Q, Y87N, E88D, E88G, K89E, K89R, D90K, D90N, A91G, F92Y, K93R, D107N, P109S, T110A, I118V, T120S, T130A, N144D, 및 K169E 및 그의 보존적 아미노산 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  49. 청구항 1-48 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환은 V4M/L70Q/A91G/T120S/T130A, V4M/L70Q/A91G/I118V/T120S/T130A/K169E, R29H/Y31H/T41G/Y87N/E88G/K89E/D90N/A91G/P109S, K36G, K36G/L40M,E52G/L70Q/A91G/T120S/T130A, E52G/L70Q/A91G/D107N/I118V/T120S/T130A/K169E,I67T/L70Q/A91G/T120S, I67T/L70Q/A91G/I118V/T120S,V68A/T110A, L70Q/A91G, L70Q/A91G/N144D,L70Q/A91G/T120S/T130A, L70Q/A91G/I118V/T120S/T130A/K169E,L70Q/A91G/T130A, K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R, E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R, A91G/I118V/T120S/T130A,A91G/T120S/T130A, 또는 I69T/L70Q/A91G/T120S인 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  50. 청구항 1-49 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 증가된 친화성으로 CD28의 엑토도메인 및 CTLA-4의 엑토도메인에 특이적으로 결합하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  51. 청구항 1-50 중 어느 하나의 청구항에 있어서 하나 이상의 아미노산 치환은 SEQ ID NO:　28의 36, 40, 52, 70, 88, 89, 90, 91, 92, 93,107, 118, 120, 130,144, 또는 169 위치(들)에 대응하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  52. 청구항 1-51 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환은 K36G, L40M, E52G, L70Q, E88D, K89R, D90K, A91G, F92Y, K93R, D107N, I118V, T120S, T130A, N144D, 및 K169E, 및 그의 보존적 아미노산 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  53. 청구항 1-52 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환은 K36G, K36G/L40M, E52G/L70Q/A91G/T120S/T130A, E52G/L70Q/A91G/D107N/I118V/T120S/T130A/K169E,L70Q/A91G, L70Q/A91G/N144D,L70Q/A91G/T120S/T130A,L70Q/A91G/I118V/T120S/T130A/K169E,E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R, 또는 K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R인 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  54. 청구항 1-53 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 증가된 친화성으로 PD-L1의 엑토도메인 및 CTLA-4의 엑토도메인에 특이적으로 결합하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  55. 청구항 1-54 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환은 SEQ ID NO:　28의 29, 31, 36, 40, 41, 67, 70, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 109, 118, 120, 122, 130, 또는 178 위치(들)에 대응하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  56. 청구항 1-55 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환은 R29H, Y31H, K36G, L40M, T41G, I67T, L70Q, Y87N, E88D, E88G, K89E, K89R, D90N, D90K, A91G, F92Y, K93R, P109S, I118V, T120S, 및 그의 보존적 아미노산 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  57. 청구항 1-56 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환은 R29H/Y31H/T41G/Y87N/E88G/K89E/D90N/A91G/P109S, K36G, K36G/L40M, I67T/L70Q/A91G/T120S, I67T/L70Q/A91G/I118V/T120S,E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R, 또는 K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R인 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  58. 청구항 1-57 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 증가된 친화성으로 CD28의 엑토도메인, PD-L1의 엑토도메인, 및 CTLA-4의 엑토도메인에 특이적으로 결합하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  59. 청구항 1-58 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환은 SEQ ID NO:　28의 36, 40, 88, 89, 90, 91, 92, 또는 93 위치(들)에 대응하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  60. 청구항 1-59 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환은 K36G, L40M, E88D, K89R, D90K, A91G, F92Y, K93R, 및 그의 보존적 아미노산 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  61. 청구항 1-60 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환은 K36G,K36G/L40ME88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R, 또는 K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R인 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  62. 청구항 1-41 중 어느 하나의 청구항에 있어서:
    변이체 CD80 폴리펩타이드는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 증가된 친화성으로 CD28의 엑토도메인 또는 PD-L1의 엑토도메인에 특이적으로 결합하고, 및
    변이체 CD80 폴리펩타이드는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 감소된 친화성으로 CTLA-4의 엑토도메인에 특이적으로 결합하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  63. 청구항 1-41 및 62 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환은 SEQ ID NO:　28의 넘버링을 참조로 29, 31, 33, 36, 38, 41, 42, 43, 47, 63, 67, 70, 81, 85, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 109, 114, 118, 120, 127, 130, 144, 148, 또는 149 위치(들)에 대응하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  64. 청구항 1-41, 62, 및 63 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환은 R29D, R29H, Y31H, Y31L, Q33H, K36G, M38I, T41A, T41G, M42T, M43R, M47T, N63S, I67T, L70Q, E81A, E81V, L85R, Y87N, E88G, K89E, K89N, D90N, A91G, A91T, F92P, K93V, R94L, P109S, S114T, I118T, I118V, T120S, I127T, T130A, N144S, L148S, 및 N149S, 및 그의 보존적 아미노산 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  65. 청구항 1-41 및 62-64 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환은N63S/L70Q/A91G/T120S/T130A, N63S/L70Q/A91G/S114T/I118V/T120S/T130A 또는 L70Q/Y87N/A91G/T120S/I127T/T130A인 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  66. 청구항 1-41 및 62-65 중 어느 하나의 청구항에 있어서:
    변이체 CD80 폴리펩타이드는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 증가된 친화성으로 CD28의 엑토도메인에 특이적으로 결합하고, 및
    변이체 CD80 폴리펩타이드는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 감소된 친화성으로 CTLA-4의 엑토도메인에 특이적으로 결합하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  67. 청구항 1-41 및 62-66 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환은 SEQ ID NO:　28의 63, 70, 81, 87, 91, 114, 118, 120, 127, 또는 130 위치(들)에 대응하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  68. 청구항 1-41, 및 62-67 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환은 N63S, L70Q, E81A, Y87N, A91G, S114T, I118V, T120S, I127T, 및 T130A, 및 그의 보존적 아미노산 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  69. 청구항 1-41, 및 62-67 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환은 R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M42T/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/L148S/N149S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118T/N149S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/N144S/N149S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/N149S, R29H/Y31H/T41G/Y87N/E88G/K89E/D90N/A91G/P109S, N63S/L70Q/A91G/T120S/T130A, N63S/L70Q/A91G/S114T/I118V/T120S/T130A,I67T/L70Q/A91G/T120S, I67T/L70Q/A91G/I118V/T120S, 또는 L70Q/Y87N/A91G/T120S/I127T/T130A인 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드..
  70. 청구항 1-41 및 62-69 중 어느 하나의 청구항에 있어서:
    변이체 CD80 폴리펩타이드는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 증가된 친화성으로 PD-L1의 엑토도메인에 특이적으로 결합하고, 및
    변이체 CD80 폴리펩타이드는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 감소된 친화성으로 CTLA-4의 엑토도메인에 특이적으로 결합하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  71. 청구항 1-41 및 62-70 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환은 SEQ ID NO:　28의 29, 31, 33, 36, 38, 41, 42, 43, 47, 67, 70, 81, 85, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 109, 118, 120, 144, 148, 또는 149 위치(들)에 대응하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  72. 청구항 1-41, 및 62-71 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환은 R29D, R29H, Y31H, Y31L, Q33H, K36G, M38I, T41A, T41G, M42T, M43R, M47T, I67T, L70Q, E81V, L85R, Y87N, E88G, K89E, K89N, D90N, A91G, A91T, F92P, K93V, R94L, P109S, I118T, I118V, T120S, N144S, L148S, 및 N149S, 및 그의 보존적 아미노산 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  73. 청구항 1-41, 및 62-72 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환은 R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M42T/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/L148S/N149S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118T/N149S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/N144S/N149S, R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/N149S, R29H/Y31H/T41G/Y87N/E88G/K89E/D90N/A91G/P109S, I67T/L70Q/A91G/I118V/T120S 또는 I67T/L70Q/A91G/T120S인 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  74. 청구항 1-41 및 62-73 중 어느 하나의 청구항에 있어서:
    변이체 CD80 폴리펩타이드는, 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 증가된 친화성으로 CD28의 엑토도메인 및 PD-L1의 엑토도메인에 특이적으로 결합하고, 및
    변이체 CD80 폴리펩타이드는 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 감소된 친화성으로 CTLA-4의 엑토도메인에 특이적으로 결합하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  75. 청구항 1-41 및 62-74변이체 CD80 폴리펩타이드, 하나 이상의 아미노산 치환은 SEQ ID NO:　28의 위치(들) 70, 81, 87, 91, 또는 120에 대응하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  76. 청구항 1-41, 및 62-75 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환은 L70Q, Y87N, A91G, 및 T120S, 및 그의 보존적 아미노산 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  77. 청구항 10-76 중 어느 하나의 청구항에 있어서, CD28은 인간 CD28인 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  78. 청구항 10-77 중 어느 하나의 청구항에 있어서, PD-L1은 인간 PD-L1인 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  79. 청구항 10-78 중 어느 하나의 청구항에 있어서, CTLA-4는 인간 CTLA-4인 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  80. 청구항 1-79 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 결합 활성은 비변형 CD80 폴리펩타이드에 비해 1.2배, 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 20배, 30배 40배 또는 50배 이상 변경된(증가 또는 감소된) 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  81. 청구항 1-80 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 가용성 단백질인 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  82. 청구항 1-81 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 멀티머화 도메인에 연결된 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  83. 청구항 1-82 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 멀티머 폴리펩타이드, 선택적으로, 멀티머화 도메인에 연결된제1 변이체 CD80 폴리펩타이드 및 멀티머화 도메인에 연결된 제2 변이체 CD80 폴리펩타이드를 포함하는, 다이머 폴리펩타이드인 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  84. 청구항 83에 있어서, 제1 변이체 CD80 폴리펩타이드 및 제2 변이체 CD80 폴리펩타이드는 동일 또는 상이한 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  85. 청구항 82-84 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 멀티머화 도메인은 이펙터 기능이 감소된 Fc 도메인 또는 그의 변이체인 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  86. 청구항 1-85 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 상기 폴리펩타이드의 생물학적 반감기를 증가시키는 모이어티에 연결된 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  87. 청구항 1-86 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 이펙터 기능이 감소된 Fc 도메인 또는 그의 변이체에 연결된 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  88. 청구항 85-87 중 어느 하나의 청구항에 있어서:
    Fc 도메인은 포유동물, 선택적으로 인간이고; 또는
    변이체 Fc 도메인은 포유동물, 선택적으로 인간인 비변형 Fc 도메인에 비해 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  89. 청구항 85-88 중 어느 하나의 청구항에 있어서, Fc 도메인 또는 그의 변이체는 SEQ ID NO:226 또는 SEQ ID NO:227에 제시된 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO:226 또는 SEQ ID NO:227에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  90. 청구항 82-89 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 링커를 통해 간접적으로 연결된 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  91. 청구항 1-90 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 변이체 CD80 폴리펩타이드의 세포외 도메인 (ECD) 또는 그의 특이적 결합 단편에 연결된 막관통 도메인을 더 포함하는 막관통 면역조절 단백질인 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  92. 청구항 91에 있어서, 막관통 도메인은 SEQ ID NO: 1의 잔기 243-263에 제시된 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 1의 잔기 243-263에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 그의 기능성 변이체를 포함하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  93. 청구항 91 또는 청구항 92에 있어서, 막관통 도메인에 연결된 세포질 도메인을 더 포함하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  94. 청구항 93에 있어서, 세포질 도메인은 SEQ ID NO: 1의 잔기 264-288에 제시된 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 1의 잔기 264-288에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 그의 기능성 변이체를 포함하는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  95. 청구항 1-94 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 변이체 CD80은 시험관내 일차 T-세포 분석에서 비변형 CD80에 비해 IFN-감마 (인터페론-감마) 발현을 증가시키는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  96. 청구항 1-95 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 변이체 CD80은 시험관내 일차 T-세포 분석에서 비변형 CD80에 비해 IFN-감마 (인터페론-감마) 발현을 감소시키는 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  97. 청구항 1-96 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 탈글리코실화된 것인 변이체 CD80 폴리펩타이드.
  98. 면역글로불린 수퍼패밀리 (IgSF) 도메인을 포함하는 제2 폴리펩타이드에 연결된 청구항 1-97 중 어느 하나의 청구항에 기재된 변이체 CD80을 포함하는 면역조절 폴리펩타이드.
  99. 청구항 98에 있어서, IgSF 도메인은 친화성 변형된 것이고 비변형 또는 야생형 IgSF 도메인에 비해 하나 이상의 그의 동족 결합 파트너(들)에 대해 변경된 결합을 나타내는 것인 면역조절 폴리펩타이드.
  100. 청구항 99에 있어서, IgSF 도메인은 비변형 또는 야생형 IgSF 도메인에 비해 하나 이상의 그의 동족 결합 파트너(들)에 대해 증가된 결합을 나타내는 것인 면역조절 폴리펩타이드.
  101. 청구항 98-100 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 변이체 CD80은 제1 변이체 CD80이고 제2 폴리펩타이드의 IgSF 도메인은 청구항 1-97 중 어느 하나의 청구항에 기재된 제2 변이체 CD80로부터의 IgSF 도메인이며, 여기서 제1 및 제2 변이체 CD80은 동일 또는 상이한 것인 면역조절 폴리펩타이드.
  102. 청구항 98-101 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 CD28, PD-L1, 또는 CTLA-4에 특이적으로 결합할 수 있고, 제2 폴리펩타이드의 IgSF 도메인은 변이체 CD80 폴리펩타이드에 의해 특이적으로 결합된 것 이외의 동족 결합 파트너에 결합할 수 있는 것인 면역조절 단백질.
  103. 청구항 98-102 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 CD28 또는 PD-L1에 특이적으로 결합할 수 있고, IgSF 도메인은 변이체 CD80 폴리펩타이드에 의해 특이적으로 결합된 것 이외의 동족 결합 파트너에 결합할 수 있는 것인 면역조절 단백질.
  104. 청구항 98-103 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 CD28 또는 CTLA-4에 특이적으로 결합할 수 있고, IgSF 도메인은 변이체 CD80 폴리펩타이드에 의해 특이적으로 결합된 것 이외의 동족 결합 파트너에 결합할 수 있는 것인 면역조절 단백질.
  105. 청구항 98-103 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 CTLA-4 또는 PD-L1에 특이적으로 결합할 수 있고, IgSF 도메인은 변이체 CD80 폴리펩타이드에 의해 특이적으로 결합된 것 이외의 동족 결합 파트너에 결합할 수 있는 것인 면역조절 단백질.
  106. 청구항 98-105 중 어느 하나의 청구항에 있어서, IgSF 도메인은 B7 패밀리의 멤버로부터 유래한 것인 면역조절 폴리펩타이드.
  107. 청구항 82-90 중 어느 하나의 청구항에 있어서, IgSF 도메인은 종양에서 발현된 리간드에 결합하는 종양-위치화 모이어티이거나 또는 염증 환경에서 세포 또는 조직에서 발현된 리간드에 결합하는 염증-위치화 모이어티인 것인 면역조절 폴리펩타이드.
  108. 청구항 107에 있어서, 리간드는 B7H6인 것인 면역조절 폴리펩타이드.
  109. 청구항 107 또는 청구항 108에 있어서, IgSF 도메인은 NKp30으로부터 유래한 것인 면역조절 폴리펩타이드.
  110. 청구항 98-109 중 어느 하나의 청구항에 있어서, IgSF 도메인은 친화성 변형된 것이고 비변형 또는 야생형 IgSF 도메인에 비해 하나 이상의 그의 동족 결합 파트너(들)에 대해 증가된 결합을 나타내는 것인 면역조절 폴리펩타이드.
  111. 청구항 98-110 중 어느 하나의 청구항에 있어서, IgSF 도메인은 IgV 도메인이거나 또는 IgV 도메인을 포함하는 것인 면역조절 폴리펩타이드.
  112. 청구항 98-111 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 IgV 도메인이거나 또는 IgV 도메인을 포함하는 것인 면역조절 폴리펩타이드.
  113. 청구항 98-112 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 면역조절 단백질은 변이체 CD80 폴리펩타이드 및 IgSF 도메인을 포함하는 제2 폴리펩타이드 중 일방 또는 양방에 연결된 멀티머화 도메인을 포함하는 것인 면역조절 단백질.
  114. 청구항 113에 있어서, 멀티머화 도메인은 이펙터 기능이 감소된 Fc 도메인 또는 그의 변이체인 것인 면역조절 단백질.
  115. 청구항 98-114 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 다이머인 것인 면역조절 단백질.
  116. 청구항 115에 있어서 호모다이머인 것인 면역조절 단백질.
  117. 청구항 115에 있어서 헤테로다이머인 것인 면역조절 단백질.
  118. 어떤 모이어티에 연결된, 청구항 1-98 중 어느 하나의 청구항에 기재된 변이체 CD80, 또는 청구항 99-117 중 어느 하나의 청구항에 기재된 면역조절 폴리펩타이드를 포함하는 컨쥬게이트.
  119. 청구항 118에 있어서, 모이어티는 세포 표면 상의 분자에 특이적으로 결합하는 표적화 모이어티인 것인 컨쥬게이트.
  120. 청구항 119에 있어서, 표적화 모이어티는 면역 세포 표면 상의 분자에 특이적으로 결합하는 것인 컨쥬게이트.
  121. 청구항 120에 있어서, 면역 세포는 항원 제시 세포 또는 림프구인 것인 컨쥬게이트.
  122. 청구항 119에 있어서, 표적화 모이어티는 종양 표면 상의 분자에 결합하는 종양-위치화 모이어티인 것인 컨쥬게이트.
  123. 청구항 118-122 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 모이어티는 단백질, 펩타이드, 핵산, 소분자 또는 나노입자인 것인 컨쥬게이트.
  124. 청구항 118-123 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 모이어티는 항체 또는 항원-결합 단편인 것인 컨쥬게이트.
  125. 청구항 118-124 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 컨쥬게이트는 2가, 4가, 6가 또는 8가인 것인 컨쥬게이트.
  126. 청구항 1-97 중 어느 하나의 청구항에 기재된 변이체 CD80 폴리펩타이드 또는 청구항 98-117 중 어느 하나의 청구항에 기재된 면역조절 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자(들).
  127. 청구항 126에 있어서, 합성 핵산인 것인 핵산 분자.
  128. 청구항 126 또는 청구항 127에 있어서, cDNA인 것인 핵산 분자.
  129. 청구항 125-128 중 어느 하나의 청구항에 기재된 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  130. 청구항 129에 있어서, 발현 벡터인 것인 벡터.
  131. 청구항 129 또는 청구항 130에 있어서, 벡터는 포유동물 벡터 또는 바이러스 벡터인 것인 벡터.
  132. 청구항 129-131 중 어느 하나의 청구항에 기재된 벡터를 포함하는 세포.
  133. 청구항 132에 있어서, 포유동물 세포인 것인 세포.
  134. 청구항 133에 있어서, 인간 세포인 것인 세포.
  135. 청구항 125-128 중 어느 하나의 청구항에 기재된 핵산 분자 또는 청구항 129-131 중 어느 하나의 청구항에 기재된 벡터를, 세포에서 단백질이 발현되는 조건 하에 숙주 세포 내로 도입하는 것을 포함하는, 변이체 CD80 폴리펩타이드 또는 면역조절 단백질의 제조방법.
  136. 청구항 135에 있어서, 세포로부터 변이체 CD80 폴리펩타이드 또는 면역조절 단백질를 단리 또는 정제하는 것을 더 포함하는 방법.
  137. 청구항 1-97 중 어느 하나의 청구항에 기재된 변이체 CD80 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자를 상기 폴리펩타이드가 세포 내에서 발현되는 조건 하에 숙주 세포 내로 도입하는 것을 포함하는, 변이체 CD80 폴리펩타이드를 발현하는 세포의 조작 방법.
  138. 청구항 1-97 중 어느 하나의 청구항에 기재된 변이체 CD80 폴리펩타이드, 청구항 98-117 중 어느 하나의 청구항에 기재된 면역조절 단백질, 청구항 126-128 중 어느 하나의 청구항에 기재된 핵산 분자 또는 청구항 129-131 중 어느 하나의 청구항에 기재된 벡터를 발현하는 조작된 세포.
  139. 청구항 138에 있어서, 변이체 CD80 폴리펩타이드 또는 면역조절 폴리펩타이드는 시그널 펩타이드를 포함하는 것인 조작된 세포.
  140. 청구항 138 또는 청구항 139에 있어서, 변이체 CD80 폴리펩타이드 또는 면역조절 폴리펩타이드는 막관통 도메인을 포함하지 않고 및/또는 세포 표면 상에서 발현되지 않는 것인 조작된 세포.
  141. 청구항 138-140 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 변이체 CD80 폴리펩타이드 또는 면역조절 폴리펩타이드가 조작된 세포로부터 분비되는 것인 조작된 세포.
  142. 청구항 138 또는 청구항 139에 있어서, 조작된 세포는 청구항 91-97 중 어느 하나의 청구항에 기재된 막관통 면역조절 단백질이거나 및/또는 막관통 도메인을 포함하는 변이체 CD80 폴리펩타이드를 포함하는 것인 조작된 세포.
  143. 청구항 138, 청구항 139 또는 청구항 142에 있어서, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 세포 표면 상에서 발현되는 것인 조작된 세포.
  144. 청구항 138-143 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 세포는 면역 세포인 것인 조작된 세포.
  145. 청구항 144에 있어서, 면역 세포는 항원 제시 세포 (APC) 또는 림프구인 것인 조작된 세포.
  146. 청구항 138-145 중 어느 하나의 청구항에 있어서 일차 세포인 것인 조작된 세포.
  147. 청구항 138-146 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 세포는 포유동물 세포인 것인 조작된 세포.
  148. 청구항 138-147 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 세포는 인간 세포인 것인 조작된 세포.
  149. 청구항 145-148 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 림프구는 T 세포인 것인 조작된 세포.
  150. 청구항 145-149 중 어느 하나의 청구항에 있어서, APC는 인공 APC인 것인 조작된 세포.
  151. 청구항 138-150 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 조작된 T-세포 수용체를 더 포함하는 것인 조작된 세포.
  152. 청구항 1-97 중 어느 하나의 청구항에 기재된 변이체 CD80 폴리펩타이드 또는 청구항 98-117 중 어느 하나의 청구항에 기재된 면역조절 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는, 감염 물질.
  153. 청구항 152에 있어서, 인코딩된 변이체 CD80 폴리펩타이드 또는 면역조절 폴리펩타이드는 막관통 도메인을 포함하지 않고 및/또는 그것이 내부에서 발현되는 세포의 표면에서 발현되지 않는 것인 감염 물질.
  154. 청구항 152 또는 청구항 153에 있어서, 인코딩된 변이체 CD80 폴리펩타이드 또는 면역조절 폴리펩타이드는 그것이 발현되는 세포로부터 분비되는 것인 감염 물질.
  155. 청구항 152에 있어서, 인코딩된 변이체 CD80 폴리펩타이드는 막관통 도메인을 포함하는 것인 감염 물질.
  156. 청구항 152 또는 청구항 155에 있어서, 인코딩된 변이체 CD80 폴리펩타이드는 그것이 발현되는 세포의 표면에서 발현되는 것인 감염 물질.
  157. 청구항 152-156 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 감염 물질은 세균 또는 바이러스인 것인 감염 물질.
  158. 청구항 157에 있어서, 바이러스는 항암 바이러스인 것인 감염 물질.
  159. 청구항 158에 있어서, 항암 바이러스는 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 바이러스, 대상포진 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 레오바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 파보바이러스, 홍역 바이러스, 수포성 구내염 바이러스 (VSV), 콕사키 바이러스 또는 백시니아 바이러스인 것인 감염 물질.
  160. 청구항 159에 있어서, 바이러스는 수지상 세포 (DCs)를 특이적으로 표적화하거나 및/또는 수지상 세포-지향성(tropic)인 것인 감염 물질.
  161. 청구항 160에 있어서, 바이러스는 변형된 신드비스 바이러스 엔벨로프 산물로 슈도타이프된 렌티바이러스 벡터인 것인 감염 물질.
  162. 청구항 152-161 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 표적 세포의 사멸을 야기하거나 또는 면역 반응을 개시 또는 부스트할 수 있는 유전자 산물을 더 인코딩하는 핵산 분자를 더 포함하는 것인 감염 물질.
  163. 청구항 162에 있어서, 상기 추가의 유전자 산물은 항암제, 항대사제, 항혈관형성제, 면역조절 분자, 면역 체크포인트 억제제, 항체, 사이토카인, 성장 인자, 항원, 세포독성 유전자 산물, 프로-아폽토시스 유전폽토시스 유전자 산물, 항-아폽토시스 유전자 산물, 세포 매트릭스 분해 유전자, 조직 재생을 위한 유전자 또는 인간의 체세포를 다분화능으로 재프로그램하는 유전자로부터 선택되는 것인 감염 물질.
  164. 청구항 1-97 중 어느 하나의 청구항에 기재된 변이체 CD80 폴리펩타이드, 청구항 98-117 중 어느 하나의 청구항에 기재된 면역조절 단백질, 청구항 118-125 중 어느 하나의 청구항에 기재된 컨쥬게이트, 청구항 138-151 중 어느 하나의 청구항에 기재된 조작된 세포 또는 청구항 152-163 중 어느 하나의 청구항에 기재된 감염 물질을 포함하는 의약 조성물.
  165. 청구항 164에 있어서, 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 의약 조성물.
  166. 청구항 164 또는 165에 있어서, 의약 조성물은 멸균된 것인 의약 조성물.
  167. 청구항 164-166 중 어느 하나의 청구항에 기재된 의약 조성물을 바이알 내에 포함하는 제조 물품.
  168. 청구항 167에 있어서, 바이알은 밀봉된 것인 제조 물품.
  169. 청구항 164-166 중 어느 하나의 청구항에 기재된 의약 조성물, 및 사용 지침을 포함하는 키트.
  170. 청구항 167 및 168 중 어느 하나의 청구항에 기재된 제조 물품, 및 사용 지침을 포함하는 키트.
  171. 청구항 164-166 중 어느 하나의 청구항에 기재된 의약 조성물을 대상자에게 투여하는 것을 포함하는, 대상자에 있어서 면역 반응을 조절하는 방법.
  172. 청구항 138-151 중 어느 하나의 청구항에 기재된 조작된 세포를 투여하는 것을 포함하는, 대상자에 있어서 면역 반응을 조절하는 방법.
  173. 청구항 172에 있어서, 조작된 세포는 대상자에 대해 자가인 것인 방법.
  174. 청구항 172에 있어서, 조작된 세포는 대상자에 대해 동종이계인 것인 방법.
  175. 청구항 171-174 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 면역 반응의 조절은 대상자에 있어서 질병 또는 병태를 치료하는 것인 방법.
  176. 청구항 171-175 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 면역 반응이 증가되는 것인 방법.
  177. 청구항 171, 175 및 176 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 종양-위치화 모이어티에 연결된 변이체 CD80 폴리펩타이드를 포함하는 면역조절 단백질 또는 컨쥬게이트가 대상자에게 투여되는 것인 방법.
  178. 청구항 177에 있어서, 종양-위치화 모이어티는 종양 항원일 인식하는 결합 분자이거나 상기 결합 분자를 포함하는 것인 방법.
  179. 청구항 1787에 있어서, 결합 분자는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하거나 또는 야생형 IgSF 도메인 또는 그의 변이체를 포함하는 것인 방법.
  180. 청구항 171 및 175-179 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 청구항 107-117 중 어느 하나의 청구항에 기재된 면역조절 단백질 또는 청구항 118-125 중 어느 하나의 청구항에 기재된 컨쥬게이트를 포함하는 의약 조성물을 대상자에게 투여하는 방법.
  181. 청구항 172-176 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 막관통 면역조절 단백질인 변이체 CD80 폴리펩타이드를 포함하는 조작된 세포를 대상자에게 투여하거나 및/또는 청구항 138, 139 및 142-151 중 어느 하나의 청구항에 기재된 조작된 세포를 대상자에게 투여하는 것인 방법.
  182. 청구항 171, 175 및 176 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 막관통 면역조절 단백질인 변이체 CD80 폴리펩타이드를 인코딩하는 감염 물질을, 선택적으로, 상기 감염 물질이 종양 세포 또는 면역 세포를 감염시키고, 감염된 세포 표면 상에서 상기 막관통 면역조절 단백질이 발현되는 조건 하에, 대상자에게 투여하는 것인 방법.
  183. 청구항 181 또는 청구항 182에 있어서, 막관통 면역조절 단백질은 청구항 91-97 중 어느 하나의 청구항에 기재된 것인 방법..
  184. 청구항 171-183 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 질병 또는 병태는 종양 또는 암인 것인 방법.
  185. 청구항 171-184 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 질병 또는 병태는 흑색종, 폐암, 방광암, 혈액학적 악성종양, 간암, 뇌암, 신장암, 유방암, 췌장암, 대장암, 비장암, 전립선암, 고환암, 난소암, 자궁암, 위암, 근골격계암, 두경부암, 위장관암, 생식세포 암, 또는 내분비 및 신경 내분비 세포 암으로부터 선택되는 것인 방법.
  186. 청구항 171-175 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 면역 반응이 감소되는 것인 방법.
  187. 청구항 171, 175 및 186 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 가용성인 변이체 CD80 폴리펩타이드 또는 면역조절 단백질을 대상자에게 투여하는 방법.
  188. 청구항 187에 있어서, 가용성 폴리펩타이드 또는 면역조절 단백질은 Fc 융합 단백질인 방법.
  189. 청구항 171, 175 및 186-188 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 청구항 1-90 및 95-97 중 어느 하나의 청구항에 기재된 변이체 CD80 폴리펩타이드, 또는 청구항 98-106 및 111-117 중 어느 하나의 청구항에 기재된 면역조절 단백질을 포함하는 의약 조성물을 대상자에게 투여하는 방법.
  190. 청구항 172-175 및 186 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 분비가능한 변이체 CD80 폴리펩타이드를 포함하는 조작된 세포를 대상자에게 투여하는 방법.
  191. 청구항 172-175 및 186-188 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 청구항 138-141 및 144-151 중 어느 하나의 청구항에 기재된 조작된 세포를 대상자에게 투여하는 방법.
  192. 청구항 171, 175 및 186-188 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 분비가능한 면역조절 단백질인 변이체 CD80 폴리펩타이드를 인코딩하는 감염 물질을, 선택적으로, 상기 감염 물질이 종양 세포 또는 면역 세포를 감염시키고 상기 분비가능한 면역조절 단백질이 상기 감염된 세포로부터 분비되는 조건 하에, 대상자에게 투여하는 방법.
  193. 청구항 171-175 및 186-192 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 질병 또는 병태는 염증 또는 자가면역 질환 또는 병태인 것인 방법.
  194. 청구항 171-175 및 186-193 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 질병 또는 병태는 항호중구 세포질 항체 (ANCA)-관련 혈관염, 혈관염, 자가면역 피부 질환, 이식, 류마티스성 질환, 염증상 위장관 질환, 염증상 안질환, 염증상 신경 질환, 염증상 폐질환, 염증성 내분비 질환, 또는 자가면역 혈액학적 질환인 것인 방법.
  195. 청구항 193 또는 청구항 194에 있어서, 질병 또는 병태는 염증성 장질환, 골이식, 크론씨병, 궤양성 대장염, 다발성 경화증, 천식, 류마티스성 관절염 또는 건선으로부터 선택되는 것인 방법.
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