KR20220100705A - 일부 신경 및 뇌 종양에 대한 개인화된 면역요법 - Google Patents

일부 신경 및 뇌 종양에 대한 개인화된 면역요법 Download PDF

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옌스 프리체
스테펜 발터
노르베르트 힐프
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하르프레트 싱
사브리나 쿠트루프-코퀴
콜레테 송
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Abstract

본 발명은 면역요법 방법에 사용하기 위한 펩티드, 핵산 및 세포에 관한 것이다. 특히 본 발명은 암의 면역요법에 관한 것이다. 본 발명은 더욱이 항종양 면역 반응을 촉진시키는 백신 조성물의 활성 약학적 성분으로 작용하는 종양-연관 세포독성 T 세포(CTL) 펩티드 항원결정부위 단독 또는 기타 종양-연관 펩티드와의 병용에 관한 것이다. 본 발명은 항종양 면역 반응을 이끌어내는 백신 조성물에 사용할 수 있는 인간 종양 세포의 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 분자로부터 유래하는 펩티드 서열들 및 이들의 변이체들에 관한 것이다.

Description

일부 신경 및 뇌 종양에 대한 개인화된 면역요법{PERSONALIZED IMMUNOTHERAPY AGAINST SEVERAL NEURONAL AND BRAIN TUMORS}
본 발명은 면역요법 방법에 사용하기 위한 펩티드, 핵산 및 세포에 관한 것이다. 특히 본 발명은 암의 면역요법에 관한 것이다. 본 발명은 더욱이 항종양 면역 반응을 촉진시키는 백신 조성물의 활성 약학적 성분으로 작용하는 종양-연관 세포독성 T 세포(CTL) 펩티드 항원결정부위 단독 또는 기타 종양-연관 펩티드와의 병용에 관한 것이다. 본 발명은 항종양 면역 반응을 이끌어내는 백신 조성물에 사용할 수 있는 인간 종양 세포의 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 분자로부터 유래하는 특이적 펩티드 서열들 및 이들의 변이체는 물론 최적의 백신을 필요로 하는 개인에게 제공하는 방법에 관한 것이다.
신경아교종은 신경계의 아교세포로부터 발생하는 뇌종양이다. 아교세포는 흔히 신경아교 또는 단순히 아교라고 불리는 비신경세포로서 세포 지원과 영양을 제공하고, 항상성을 유지하며, 미엘린을 생성하고, 신경계의 신호 전달에 참여한다. 신경아교종의 가장 중요한 두 개의 소집단은 종양이 발생하는 정상 아교세포의 종류에 따라 이름이 붙여진 성상아교세포에서 발생한 성상아교세포종과 핍지교종세포에서 발생한 핍지신경교종을 포함한다. 성상아교세포종의 소집단에 속하는 다형성 교모세포종(이하 교모세포종)은 성인에게서 가장 많이 발생하는 악성 뇌종양이며 모든 악성 뇌종양의 40%, 신경아교종의 50%를 차지한다. 이는 공격적으로 중추 신경계를 침략하고 모든 신경아교종 중에서 가장 높은 악성도(등급 4)로 분류되어 있다. 비록 신경 영상, 미세 수술법의 발전과 테모졸로마이드나 방사선과 같은 다양한 치료의 옵션이 꾸준히 개발되고 있음에도 불구하고, 교모세포종은 여전히 불치병으로 남아 있다. 첫 진단 후 평균 수명은 9에서 12개월로 뇌종양의 치사율은 아주 높다. 1986에서 1990년 사이의 5년 생존율은 8.0%였다. 현재까지, 총 종양 절제를 포함한 침습적 치료 후 5년 생존율은 아직도 10% 미만이다. 따라서, 이를 대체할 수 있는 효과적 치료 방법이 절실히 필요하다.
교모세포종의 종양 세포는 뇌종양 중에서 가장 미분화된 종양 세포로서, 이 종양 세포들은 이동 및 증식 가능성이 높고 매우 침투력이 높아 좋지 않은 예후에 기여한다. 교모세포종은 뇌에서의 빠르고 침략적이고 침윤적인 성장으로 인해 죽음을 초래한다. 침윤적인 성장 패턴으로 인해 이 종양들은 수술적 제거가 불가능하다. 교모세포종은 또한 상대적으로 방사선 및 화학 요법에 내성을 가지고 있으며, 따라서 치료 후 재발생율이 높다. 게다가, 수술적 제거와 방사선 요법 후 모든 종양 세포를 완전 박멸하는 데에 종양 세포에 대한 면역 반응은 효과가 거의 없다.
교모세포종은 미분화된 성상아교세포종 또는 아교 전구세포의 악성 변화 중의 유전자 메커니즘의 차이에 따라 1차 교모세포종(드 노보)과 2차 교모세포종으로 구분된다. 2차 교모세포종은 45세까지의 젊은 인구에서 발생한다. 평균적으로 4세에서 5세 사이에, 2차 교모세포종은 낮은 등급의 성상아교세포종에서 미분화된 성상아교세포종을 통해 생긴다. 이와 반대로, 1차 교모세포종은 대개 나이가 든 인구에서 발생하며 평균 연령은 55세이다. 대개, 1차 교모세포종은 임상 또는 병리학적으로 아무 이상이 없는 상태에서 3개월 이내에 종양의 진행이 나타나는 것으로 알려진 급성 전격성 교모세포종으로 발병한다(Pathology and Genetics of the Nervous Systems. 29-39(IARC Press, Lyon, France, 2000)).
교모세포종은 미엘린 신경 세포를 따라 이동하여 중추 신경계에 광범위하게 퍼진다. 대부분의 경우, 외과적 치료는 한정 지속적인 치료 효과를 보인다. 악성 아교 세포는 T 세포의 증식을 손상시키고 면역 자극 사이토카인 IL-2의 생산을 막는 면역 억제제를 생성하여 숙주의 면역 체계가 감지하지 못하도록 한다.
두개 내(intracranial)의 종양은 뇌, 뇌막, 뇌하수체, 두개골, 및 심지어는 잔여 배아 조직을 포함하는 중추 신경계의 모든 구조나 세포 유형에서부터 발생될 수 있다. 미국에서 전체 연간 1차 뇌종양 발생률은 100,000 건당 14건이다. 가장 흔한 뇌종양은 수막종으로서 전체 1차 뇌종양의 27%를 차지하며, 교모세포종은 전체 1차 뇌종양의 23%를 차지한다(교모세포종은 성인 악성 뇌종양의 40%를 차지한다). 이 종양의 많은 부분이 공격적이거나 높은 등급에 속한다. 1차 뇌종양은 소아 고형 종양 중 가장 흔하고 백혈병 다음으로 두 번째로 가장 흔한 소아 사망의 원인이다.
현재도 교모세포종의 효과적인 치료법에 대한 연구가 계속 진행되고 있다. 이 종양세포와 싸우기 위한 면역치료법, 또는 면역 체계를 이용하는 치료법은 이미 연구된 바 있다.
다중 펩티드 백신인 IMA950에 대한 임상 시험이 영국의 이매틱스 바이오테크놀로지스(immatics biotechnologies)(독일 튀빙겐)에서 진행 중에 있다. 이 백신의 펩티드는 전적으로 HLA-A*02 펩티드이다.
중증의 부작용을 초래할 수 있는 화학요법제나 기타 약물을 사용하지 않고 다른 HLA 대립형질들이나 대립형질들의 조합으로써 환자의 안녕을 강화시키며, 본 발명의 단백질들의 과발현을 보여주는 교모세포종과 수모세포종 및 기타 종양을 위한 효과적이며 안전한 치료 옵션이 여전히 필요하다.
본 발명의 제1 양태에서, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 49, 서열번호 71 및 서열번호 74 내지 서열번호 129의 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 및 서열번호 1 내지 서열번호 49, 서열번호 71 및 서열번호 74 내지 서열번호 129에 대해 적어도 90% 상동성인 이의 변이체 서열을 포함하는 펩티드 또는 약학적으로 허용가능한 염에 관한 것으로, 상기 변이체는 상기 펩티드와 교차 반응하는 T 세포를 유도하고, 상기 펩티드는 전장 폴리펩티드가 아니다.
본 발명은 더욱이 서열번호 1 내지 서열번호 49, 서열번호 71 및 서열번호 74 내지 서열번호 129로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열, 및 서열번호 1 내지 서열번호 49, 서열번호 71 및 서열번호 74 내지 서열번호 129와 적어도 90% 상동성인 이의 변이체 서열을 포함하는 펩티드에 관한 것으로, 상기 펩티드나 변이체는 아미노산 8에서 100개 사이, 바람직하게는 8에서 30개 사이, 가장 바람직하게는 8에서 14개 사이의 전체 길이를 갖는다.
다음 표에는 본 발명에 따른 펩티드들과 각각의 서열번호 및 이 펩티드들의 유망한 출처 단백질이 나와 있다. 표 1a, 1b 및 1c에 있는 모든 펩티드는 HLA A*02 대립형질과 결합하고, 표 1d 및 1e에 있는 펩티드는 HLA-DR 대립형질과 결합한다.
표 1d 및 1e의 클래스 II 펩티드는 BCAN, BIRC5 및/또는 PTPRZ1 폴리펩티드를 과발현 및/또는 과다제시하는 암의 치료에 특히 유용하다.
[표 1a]
본 발명의 펩티드
Figure pat00001
[표 1b]
본 발명의 추가 펩티드
Figure pat00002
[표 1c]
교모세포종에서 과발현되는 추가 펩티드
Figure pat00003
[표 1d]
본 발명의 MHC 클래스 II 펩티드
Figure pat00004
[표 1e]
추가 MHC 클래스 II 펩티드
Figure pat00005
표 2a 및 b에는 본 발명에 따른 펩티드들과 각각의 서열번호, 이 펩티드들이 발생할 수 있는 출처 단백질이 나와 있다. 표 2에 있는 모든 펩티드는 HLA A*24 대립형질과 결합한다.
[표 2a]
본 발명의 추가 펩티드
Figure pat00006
Figure pat00007
서열번호 101에 따른 펩티드는 다음 단백질로부터 유래할 수 있다: 다PCDHGA12, PCDHGC3, PCDHGC5, PCDHGC4, PCDHGB7, PCDHGB6, PCDHGB5, PCDHGB3, PCDHGB2, PCDHGB1, PCDHGA11, PCDHGA10, PCDHGA9, PCDHGA7, PCDHGA6, PCDHGA5, PCDHGA4, PCDHGA3, PCDHGA2, PCDHGA, PCDHGB4 또는 PCDHGA8. 서열번호 109에 따른 펩티드는 EVPSKQCVS의 프레임시프트이다(염색체 19, 2+ 프레임: 57954686-57954712. W+4: 키뉴레닌((S)-2-아미노-4-(2-아미노페닐)-4-옥소-부탄산)). 서열번호 99에 따른 펩티드는 TXN2의 제1 인트론의 일부이다(매칭 EST, BG169743.1에 의해 지지됨).
[표 2b]
교모세포종에서 과발현되는 추가 펩티드
Figure pat00008
[표 2c]
상기 적응증에서 과발현 및/또는 과다제시되는 발명에 따른 펩티드에 근거하는 추가 적응증(예를 들면 치료 대상 암들)
Figure pat00009
Figure pat00010
그리하여 본 발명의 다른 바람직한 양태는, 여기서 설명된 용도와 유사하게 위 표 2c에 따른 암 질환(예를 들면 교모세포종)에 대한 바람직한 - 가급적 병용 - 면역요법을 위한 본 발명에 따른 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따른 펩티드는 인간 주 조직적합 복합체(MHC) 클래스 I 또는 II의 분자에 결합하는 능력을 갖는다.
본 발명은 더욱이 본 발명에 따른 펩티드에 관한 것으로 상기 펩티드는 서열번호 1 내지 서열번호 49, 서열번호 71 및 서열번호 74 내지 서열번호 129에 따른 아미노산 서열로 구성되거나 필수적으로 구성된다.
본 발명은 더욱이 본 발명에 따른 펩티드에 관한 것으로 상기 펩티드는 변형되고/거나 비펩티드 결합을 포함한다.
본 발명은 더욱이 본 발명에 따른 펩티드에 관한 것으로 상기 펩티드는 융합 단백질의 일부이며 특히 HLA-DR 항원-연관된 불변쇄(Ii)의 N-말단 아미노산에 융합된다.
본 발명은 더욱이 본 발명에 따른 펩티드를 인코딩하는 핵산에 관한 것이다.
본 발명은 더욱이 DNA, cDNA, PNA, RNA 또는 이들의 조합인 본 발명에 따른 핵산에 관한 것이다.
본 발명은 더욱이 본 발명에 따른 핵산을 발현할 수 있는 발현 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 더욱이 의약에 사용하기 위한 본 발명에 따른 펩티드, 본 발명에 따른 핵산 또는 본 발명에 따른 발현 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 더욱이 본 발명에 따른 항체에 관한 것이다.
본 발명은 더욱이 본 발명에 따른 sTCR에 관한 것이다.
본 발명은 더욱이 본 발명에 따른 핵산을 또는 전에 설명한 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명은 더욱이 항원-제시 세포인 본 발명에 따른 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명은 더욱이 본 발명에 따른 숙주 세포에 관한 것이며 항원-제시 세포는 수지상 세포이다.
본 발명은 더욱이 본 발명에 따른 펩티드 제조 방법에 관한 것으로, 그 방법은 본 발명에 따른 숙주 세포의 배양과 숙주 세포 또는 그 배양 배지로부터 펩티드의 분리를 포함한다.
본 발명은 더욱이 시험관 내에서 세포독성 T 림프구(CTL)를 항원-특이적 방식으로 상기 CTL을 활성화시키기에 충분한 시간 동안 적합한 항원-제시 세포의 표면에 발현된 인간 클래스 I 또는 II MHC 분자가 로딩된 항원과 접촉시키는 것을 포함하는 활성화된 CTL의 시험관 내 제조 방법에 관한 것으로, 상기 항원은 본 발명에 따른 임의의 펩티드이다.
본 발명은 더욱이 본 발명에 따른 방법에 관한 것으로, 충분한 양의 항원을 항원-제시 세포와 접촉시킴으로써 항원이 적합한 항원-제시 세포의 표면에 발현된 클래스 I 또는 II MHC 분자 위에 로딩된다.
본 발명은 더욱이 본 발명에 따른 방법에 관한 것으로, 항원-제시 세포가, 서열번호 1 내지 서열번호 49, 서열번호 71 및 서열번호 74 내지 서열번호 129, 또는 서열번호 1 내지 서열번호 49, 서열번호 71 및 서열번호 74 내지 서열번호 129에 대해 적어도 90% 상동성인 이의 변이체 서열 또는 상기 변이체 아미노산 서열을 포함하는 상기 펩티드를 발현할 수 있는 발현 벡터를 포함한다.
본 발명은 더욱이 본 발명에 따른 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 이상 발현하는 세포를 선택적으로 인식하는 본 발명에 따른 방법에 의해 제조된 활성화된 세포독성 T 림프구(CTL)에 관한 것이다.
본 발명은 더욱이 표적 세포가 본 발명에 따른 임의의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 이상 발현하는 환자에서 그 표적 세포를 죽이는 방법에 관한 것으로, 그 방법은 본 발명에 따른 효과적인 숫자의 세포독성 T 림프구(CTL)를 상기 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
본 발명은 더욱이 설명한 임의의 펩티드, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 발현 벡터, 본 발명에 따른 세포, 본 발명에 따른 항체, 또는 본 발명에 따른 활성화된 세포독성 T 림프구를 약제로서 또는 약제의 제조에서의 사용에 관한 것이다.
본 발명은 더욱이 본 발명에 따른 사용에 관한 것으로 상기 약제가 백신이다. 본 발명은 더욱이 본 발명에 따른 사용에 관한 것으로 상기 약제가 암에 대해 활성을 갖는다.
본 발명은 더욱이 교모세포종의 진단 및/또는 예후에 사용할 수 있는 본 발명에 따른 펩티드에 근거한 특정 마커 단백질 및 바이오마커에 관한 것이다.
본 발명은 더욱이 암 치료를 위해 이러한 신규 표적들의 사용에 관한 것이다.
본 발명은 더욱이 특정한 대립형질 조합을 갖는 환자 집단 및/또는 환자 특이적 백신의 제공 및 제조 방법에 관한 것이다.
즉, 본 발명은 더욱이 의약에 사용하기 위한, 서열번호 1 내지 서열번호 49, 서열번호 71 및 서열번호 74 내지 서열번호 129에 따른 펩티드, 본 발명에 따른 핵산 또는 본 발명에 따른 발현 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 더욱이 서열번호 1 내지 서열번호 49, 서열번호 71 및 서열번호 74 내지 서열번호 129로부터 선택된 서열에 따른 펩티드에 특이적인 본 발명에 따라 여기에서 설명된 항체들, 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명은 더욱이 서열번호 1 내지 서열번호 49, 서열번호 71 및 서열번호 74 내지 서열번호 129로부터 선택된 서열에 따른 펩티드 및/또는 본 발명에 따른 상기 펩티드들과 MHC와의 복합체를 표적하는, 특히 특이적으로 표적하는 T 세포 수용체(TCR), 특히 가용성 TCR(sTCR), 및 이 TCR의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명은 더욱이 본 발명에 따른 핵산 또는 앞에서 설명한 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명은 더욱이 항원-제시 세포인 본 발명에 따른 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명은 더욱이 본 발명에 따른 숙주 세포에 관한 것이며 항원-제시 세포는 수지상 세포이다.
본 발명은 더욱이 본 발명에 따른 펩티드의 제조 방법에 관한 것으로, 그 방법은 본 발명에 따른 숙주 세포의 배양과 숙주 세포 또는 그 배양 배지로부터 펩티드의 단리를 포함한다.
본 발명은 더욱이 시험관 내에서 CTL을 세포독성 T 림프구(CTL)를 활성화시키기에 충분한 시간 동안 항원-특이적 방식으로 적합한 항원-제시 세포의 표면에 발현된 인간 클래스 I 또는 II MHC 분자가 로딩된 항원과 접촉시키는 것을 포함하는 활성화된 CTL의 시험관 내 제조 방법에 관한 것으로, 상기 항원은 본 발명에 따른 임의의 펩티드이다.
본 발명은 더욱이 본 발명에 따른 방법에 관한 것으로, 충분한 양의 항원을 항원-제시 세포와 접촉시킴으로써 항원이 적합한 항원-제시 세포의 표면에 발현된 클래스 I 또는 II MHC 분자 위에 로딩된다. 본 발명은 더욱이 본 발명에 따른 방법에 관한 것으로, 상기 항원-제시 세포는 서열번호 1 내지 서열번호 49, 서열번호 71 및 서열번호 74 내지 서열번호 129로부터 선택된 하나 이상의 서열 또는 이의 변형된 아미노산 서열을 포함하는 상기 펩티드를 발현할 수 있는 발현 벡터를 포함한다.
본 발명은 더욱이 본 발명에 따른 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 이상 발현하는 세포를 선택적으로 인식하는 본 발명에 따른 방법에 의해 제조된, 여기에서 설명하는 바와 같은 활성화된 세포독성 T 림프구(CTL)에 관한 것이다.
본 발명은 더욱이 표적 세포가 본 발명에 따른 임의의 아미노산 서열(즉, 서열번호 1 내지 서열번호 49, 서열번호 71 및 서열번호 74 내지 서열번호 129로부터 선택된 하나 이상의 서열)을 포함하는 폴리펩티드를 이상 발현하는 환자에서 표적 세포를 죽이는 방법에 관한 것으로, 그 방법은 본 발명에 따른 효과적인 수의 세포독성 T 림프구(CTL)를 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
본 발명은 더욱이 약제로서 또는 약제의 제조 시 본 발명에 따른 임의의 펩티드, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 발현 벡터, 본 발명에 따른 숙주 세포나 세포, 또는 본 발명에 따른 활성화된 세포독성 T 림프구의 사용에 관한 것이다. 본 발명은 더욱이 본 발명에 따른 사용에 관한 것으로 상기 약제는 백신이다.
본 발명은 더욱이 혈액암, 특히 만성 림프구성 백혈병(CLL) 세포의 진단 및/또는 예후에 사용할 수 있는, 본 발명에 따른 펩티드에 기반한 특정 마커 단백질 및 바이오마커에 관한 것이다.
본 발명은 더욱이 암 치료를 위해 이러한 신규 표적들을 사용하는 것과 관련된다.
본 발명은 더욱이 본 발명에 따른 하나 이상의 펩티드, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 발현 벡터, 본 발명에 따른 숙주 세포나 세포 또는 개별 환자의 사용을 위해 설계되고 배합된, 본 발명에 따른 활성화된 세포독성 T 림프구를 포함하는 개인화된 항암 백신을 제조하는 방법에 관한 것으로, 상기 설계는 환자 및/또는 환자군 및/또는 암 특이적 펩티드와 연관된, 사전 선택되고/되거나 사전 선별된 종양의 데이터베이스("창고")의 사용을 포함한다.
본 발명의 펩티드는 본 발명의 MHC/펩티드 복합체(즉, 서열번호 1 내지 서열번호 49, 서열번호 71 및 서열번호 74 내지 서열번호 129에서 선택된 하나 이상의 서열을 포함)에 대한 특정 항체의 생성, 제조 및 개발에 사용할 수 있다. 이 항체들은 병든 조직(예를 들면 종양)에 대한 치료, 독성 물질 또는 방사능 물질 표적화를 위해 사용될 수 있다. 이런 항체의 또 다른 사용은 PET 같은 영상 목적을 위해 병든 조직의 방사성 핵종을 표적화할 수도 있다.
그러므로 본 발명의 다른 양태는 HLA-제한 항원(즉, 서열번호 1 내지 서열번호 49, 서열번호 71 및 서열번호 74 내지 서열번호 129에서 선택된 하나 이상의 서열을 포함)과 결합하는 인간 주 조직적합 복합체(MHC) 클래스 I 또는 II와 특이적으로 결합하는 재조합 항체의 생산 방법을 제공하는 것으로, 이 방법에는 상기 HLA-제한 항원과 결합하는 용해성 형태의 MHC 클래스 I 또는 II 분자와 상기 인간 주 조직적합 복합체(MHC) 클래스 I 또는 II를 발현하는 세포를 포함하는 유전자 조작된 비인간 포유동물의 면역화; 상기 비인간 포유동물의 세포를 생산하는 항체로부터 mRNA 분자의 단리; 상기 mRNA 분자에 의해 인코딩된 단백질 분자를 표시하는 파지 디스플레이 라이브러리의 생산; 및 상기 파지 디스플레이 라이브러리로부터 하나 이상의 파지, 즉 상기 HLA-제한 항원과 결합하는 상기 인간 주 조직적합 복합체(MHC) 클래스 I 또는 클래스 II와 특이적으로 결합하는 상기 항체를 표시하는 하나 이상의 파지의 단리가 포함된다.
본 발명의 다른 양태는 HLA 제한 항원과 결합하는 인간 주 조직적합 복합체(MHC) 클래스 I 또는 II에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하는 것으로 이 항체는 바람직하게는 다클론 항체, 단클론 항체, 이중특이성 항체 및/또는 키메라 항체이다.
본 발명의 또 다른 양태는 HLA-제한 항원(즉, 서열번호 1 내지 서열번호 49, 서열번호 71 및 서열번호 74 내지 서열번호 129에서 선택된 하나 이상의 서열을 포함)과 결합하는 인간 주 조직적합 복합체(MHC) 클래스 I 또는 II에 특이적으로 결합하는 상기 항체를 생산하는 방법에 관한 것으로, 이 방법에는 상기 HLA-제한 항원과 결합하는 용해성 형태의 MHC 클래스 I 또는 II 분자와 상기 인간 주 조직적합 복합체(MHC) 클래스 I 또는 II를 발현하는 세포를 포함하는 유전자 조작된 비인간 포유동물의 면역화; 상기 비인간 포유동물의 세포를 생산하는 항체로부터 mRNA 분자의 단리; 상기 mRNA 분자에 의해 인코딩된 단백질 분자를 표시하는 파지 디스플레이 라이브러리의 생산; 및 상기 파지 디스플레이 라이브러리로부터 하나 이상의 파지, 즉, 상기 HLA-제한 항원과 복합되는 상기 주 조직적합 복합체(MHC) 클래스 I 또는 II와 특이적으로 결합 가능한 상기 항체를 표시하는 하나 이상의 파지의 단리가 포함된다. 이러한 항체와 단일쇄 클래스 I 주 조직적합 복합체는 물론 다른 도구들을 생성하는 각각의 제조 방법도 포함된다.
본 발명의 다른 양태는 본 발명에 따른 특이적 펩티드-MHC 복합체를 인지하는 용해성 T 세포 수용체의 생산 방법을 제공하는 것이다. 이러한 용해성 T 세포 수용체는 특이적 T 세포 클론으로부터 생성 가능하며, 그 친화력은 상보결정 부위를 표적하는 돌연변이 생성에 의해 증가시킬 수 있다.
면역 반응의 자극은 숙주 면역계에서 항원의 존재를 이질적인 것으로 인식하는 것에 의존한다. 종양-연관 항원의 존재의 발견은 종양 성장에 개입하는 숙주의 면역계의 사용 가능성을 증가시켰다. 면역계의 체액성 및 세포성 가지를 이용하는 다양한 기전이 현재 암 면역 치료에서 탐색되고 있다.
세포 면역 반응의 특정 요소는 종양 세포를 특정하게 인식하고 파괴하는 능력이 있다. 세포독성 T 세포(CTL)의 종양 침투 세포 집단에서의 또는 말초 혈액에서의 단리는 이런 세포들이 암에 대해 자연 면역 방어로써의 중요한 역할을 할 수 있다는 것을 시사한다. 단백질 또는 시토졸에 자리잡은 결점 리보솜 생성물(DRIPS)에서 유래된 보통 8 에서 10의 아미노산 잔기의 주 조직적합 복합체(MHC)를 가진 펩티드의 클래스 I 분자를 인식하는 CD8-양성 T 세포(TCD8+)는, 특히 이 반응에서 중요한 역할을 한다. 인간의 MHC-분자도 인간 백혈구-항원(HLA)으로 지정된다.
MHC 분자는 두 클래스로 나누어 진다. MHC 클래스 I 분자는 핵을 갖는 대부분의 세포에서 찾을 수 있다. MHC 분자는 α 중쇄와 β-2-저분자글로불린(MHC 클래스 I 수용체) 또는 α와 β 쇄(MHC 클래스 II 수용체)로 각각 구성되어 있다. 이들의 3차원 형태는 결합 홈을 형성하며, 이는 펩티드와의 비공유결합에 사용이 된다. MHC 클래스 I은 대부분 내인 단백질, DRIP와 큰 펩티드의 단백질분해 분할로 인해 생성된 펩티드를 제시한다. MHC 클래스 II 분자는 대부분 전문적인 항원-제시 세포(APC)에서 찾아 볼 수 있고, 이들은 주로 APC로부터 세포내 섭취 중 섭취된 외인 또는 막전 단백질의 펩티드를 제시하며, 이는 후에 처리된다. 펩티드와 MHC 클래스 I 분자의 복합물은 적당한 T 세포 수용체(TCR)를 갖는 CD8-양성 세포독성 T 림프구에 의해서 인식이 되는 반면, 펩티드와 MHC 클래스 II 분자의 복합물은 적당한 TCR을 갖는 CD4-양성 조력 T 세포에 의해 인식이 된다. TCR, 펩티드 및 MHC가 1:1:1의 화학양론적 반응량으로 존재한다는 사실은 잘 알려져 있다.
CD4-양성 조력 T 세포는 CD8-양성 세포독성 T 세포에 의한 효과적인 반응을 유도하고 지속하는데 중요한 역할을 한다(Wang and Livingstone, 2003; Sun and Bevan, 2003; Shedlock and Shen, 2003). 종양 특이적 항원(TAA)에서 유도된 CD4-양성 T 세포 항원결정부위의 동정은 항-종양 면역 반응을 일으키기 위한 의약품의 개발에 아주 중요하다(Kobayashi et al., 2002; Qin et al., 2003; Gnjatic et al., 2003). 종양 부위에서, 조력 T 세포는, CTL 친화적 사이토킨 주위 환경을 지원하고(Qin and Blankenstein, 2000; Mortara et al., 2006) 효과기 세포, 예를 들면 CTL, NK 세포들, 대식 세포를 유치한다(Marzo et al., 2000; Hwang et al., 2007).
염증이 없는 경우, MHC 클래스 II 분자의 발현은 주로 면역계의 세포, 특히 전문적 항원-제시 세포(APC), 예를 들면, 단핵 세포, 단핵 세포-유도된 세포, 대식 세포, 수지상 세포로 제한된다. 암 환자에서, 종양의 세포는 놀랍게도 MHC 클래스 II 분자를 발현하는 것으로 알려졌다(Dengjel et al., 2006).
예를 들면, 쥐 같은 포유류 동물 모델에서 CTL 효과기 세포(즉, CD8-양성 T 림프구) 없이도, CD4-양성 T 세포가 인터페론-γ(IFNγ)의 분비에 의한 혈관신생의 저해를 통한 종양의 억제 징후에 충분하다는 것이 보여졌다.
또한, HLA 클래스 II 분자에 의해 나타나는 종양 특이적 항원에서의 펩티드를 인식하는 CD4-양성 T 세포가 종양 진행을 항체 유도(Ab) 반응을 통해서 중화할 수 있다는 것이 밝혀졌다(Kennedy et al., 2003).
HLA 클래스 I 분자에 결합하는 종양-연관 펩티드와 달리, 종양 특이적 항원(TAA)의 클래스 II 리간드의 소수만이 이제까지 설명되었다.
HLA 클래스 II 분자의 구성 발현이 일반적으로 면역계의 세포로 제한되기 때문에, 클래스 II 펩티드를 기본 종양에서 단리하는 것은 가능하지 않다고 간주되었다. 그러나, 덴젤(Dengjel) 등은 최근에 다수의 MHC 클래스 II 항원결정부위를 종양에서 직접적으로 동정하는데 성공 했다(WO 2007/028574, EP 1 760 088 B1; (Dengjel et al., 2006)).
종양 특이적 세포독성 T 림프구에 의해 인식되는 항원, 즉 그들의 항원결정부위는, 발현되고, 같은 원조의 변형없는 세포들에 비해서, 각각의 종양의 규제된 세포인 효소, 수용체, 전사 인자 등의 모든 단백질 클래스에서 유도된 분자일 수 있다.
CD8 및 CD4에 의존하는 두 유형의 반응이 항-종양 효과에 같이 및 시너지 있게 기여하므로, CD8+ CTL(리간드: MHC 클래스 I 분자 + 펩티드 항원결정부위) 또는 CD4-양성 조력 T 세포(리간드: MHC 클래스 II 분자 + 펩티드 항원결정부위)에 의해 인식되는 종양 특이적 항원의 식별 및 특성화가 종양 백신의 개발에 중요하다.
본 발명은 또 매우 유용한 MHC 클래스 II 펩티드(서열번호 71 참고)에 관한 것이다. 이 펩티드는 BCAN을 과발현 및/또는 과다제시하는 교모세포종과 기타 암들에 대해 유용하다.
펩티드가 세포 면역 반응을 촉발(유도)하려면 MHC-분자에 결합해야 한다. 이 프로세스는 MHC-분자의 대립형질 및 그 펩티드의 아미노산 서열의 특정한 다형성에 의존한다. MHC-클래스 I 결합 펩티드는 대개 길이가 8 내지 12개의 아미노산 잔기이며 또한 대개 그 서열 내에 MHC-분자의 상응하는 결합 홈과 상호작용하는 두 개의 유지되는 잔기("고정")를 포함하고 있다. 이렇게 함으로써 각 MHC 대립형질은 어떤 펩티드가 결합 홈에 특이적으로 결합할 수 있는가를 결정하는 "결합 모티프"를 갖는다.
MHC 클래스 I 의존 면역 반응에서, 펩티드는 종양 세포에 의해 발현되는 어떤 MHC 클래스 I 분자와 결합할 수 있어야 하며 또한 특정한 T 세포 수용체(TCR)를 갖는 T 세포에 의해 인식될 수 있어야 한다.
종양 특이적 세포독성 T 림프구에 의해 인식되는 항원, 즉 그들의 항원결정부위는, 발현되고, 같은 원조의 변형없는 세포들에 비해서, 각각의 종양의 규제된 세포인 효소, 수용체, 전사 인자 등의 모든 단백질 클래스에서 유도된 분자일 수 있다.
종양 특이적 항원의 현재 분류는 다음과 같은 주요 군을 포함한다:
a) 암-고환 항원: 제일 처음으로 T 세포에 의해 인식된 TAA는 이 종류에 속하며, 이는 그 멤버들의 발현이 조직학적으로 인간 종양과 다르며, 정상 조직 중, 고환의 정모 세포/정원 세포에서만 있으며, 때로는 태반에서도 있기 때문에 암-고환(CT)라고 최초에 불려졌다. 고환의 세포들이 클래스 I 또는 II HLA 분자를 발현하지 않기 때문에, 이 항원들은 정상 세포에 있는 T 세포에 의해 인식될 수 없으며 면역학적으로 종양 특이적이라고 간주될 수 있다. CT 항원의 잘 알려진 예로는 MAGE 패밀리 멤버들 또는 NY-ESO-1이 있다.
b) 다른 항원들: 이 TAA는 종양과 종양이 생긴 정상 조직 사이에서 공유된다; 대부분은 흑색종과 정상 멜라닌세포에서 발견된다. 많은 멜라닌세포 혈통-관련 단백질은 멜라닌의 생합성에 관련되어 있으며 그러므로 종양 특이적이 아니지만 암 면역치료에 널리 사용된다. 예로는, 티로시나아제 및 흑색종을 위한 멜란-A/MART-1 또는 전립선암을 위한 PSA가 있고 이로 국한되지 않는다.
c) 과발현된 TAA: 일반적으로 낮은 발현 수준이 있는 많은 정상 조직뿐만 아니라 조직학적으로 다른 종양 종류들에서 유전자를 인코딩하는 널리 발현된 TAA가 발견된다. 정상 조직에서 처리되고 잠재적으로 표현되는 많은 항원결정부위가 T 세포 인식의 한계치 수준보다 낮을 수 있고, 그의 종양 세포에서의 과발현은 이전에 생성된 내성을 중단함으로써 항암 반응을 일으킬 수 있다. TAA의 이 종류의 유력한 예로는 Her-2/neu, 서바이빈, 텔로머라제 또는 WT1이 있다
d) 종양 특이적 항원: 이러한 독특한 TAA는 정상 유전자의 돌연변이로부터 발생한다(β-카테닌, CDK4 등 같은). 이러한 분자 변형의 일부는 종양 변환 및/또는 진행과 관련되어 있다. 종양 특이적 항원은 일반적으로 강한 면역 반응을 정상 조직에 대한 자기 면역 반응에 대한 위험성 없이 유도할 수 있다. 반면에, 대부분의 경우 TAA는 그들이 발견되고 일반적으로 많은 개별 종양에서 공유되지 않는 정확한 종양에만 적절하다.
e) 비정상 번역 후 변형에서 발생하는 TAA: 이러한 TAA는 특정하지도 않고 과발현되지도 않는 단백질에서 발생할 수 있지만 종양에서 주로 활동적인 번역 후 과정에 의해 종양과 관련된다. 이 클래스의 예는 종양 특이적일 수도 아닐 수도 있는 저하 동안의 단백질 접합과 같은 이벤트 또는 MUC1을 위한 종양의 새로운 항원결정부위로 이끄는 변경된 당화 패턴에서 발생한다.
f) 종양 바이러스 단백질: 이러한 TAA는 종양발생 과정에서 중요한 역할을 할 수 있는 바이러스 단백질이며, 그들이 이질적이기 때문에(인간 태생이 아닌), T 세포 반응을 일으킬 수 있다. 이런 단백질의 예로는 인간 유두종 종류 16 바이러스 단백질, 및 경부 암종에서 발현하는 E6와 E7이 있다.
종양 특이적 또는 관련된 항원과 같은 세포독성 T-림프구에 의해 단백질이 인식되고, 치료에 사용되려면, 특정한 전제 조건이 충족되어야 한다. 항원은 정상의 건강한 조직에 의해 비교적 작은 양이 아닌 주로 종양 세포에 의해 발현되어야 하거나, 다른 구현에서는 펩티드는 정상의 건강한 조직과 비교하여 과다제시되어야 한다. 더 바람직하게는, 각각의 항원이 하나의 유형의 종양에서뿐만 아니라 높은 농도로 나타나는 것이다(즉, 세포마다 펩티드 각각의 카피 수). 종양 특이적 및 종양-연관 항원은 종종 기능, 예를 들면 세포 주기 관리 또는 세포사멸의 억제 때문에 정상 세포를 종양 세포로 변환하는데 관련된 단백질에서 직접적으로 유도된다. 또한, 변환을 직접적으로 일으키는 단백질의 하류 표적은 상향조절될 수 있으며 따라서 간접적으로 종양 특이적일 수 있다. 그런 간접적 종양 특이적인 항원은 백신 접근법의 표적이 될 수도 있다. 두 경우 다 항원결정부위가 항원의 아미노산 서열에 나타나는 것이 필수이며, 이는 종양 특이적 항원에서 유도된 그런 펩티드("면역원성 펩티드")는 시험관 내 또는 생체 내 T 세포-반응을 유도해야 하기 때문이다.
기본적으로, MHC 분자에 결합할 수 있는 임의의 펩티드는 T 세포 항원결정부위로서 기능할 수 있다. 시험관 내 또는 생체 내 T 세포 반응의 유도의 전제 조건은 상응하는 TCR이 있는 T 세포의 존재와 이 특정 항원결정부위에 대한 면역적 내성의 부재이다.
따라서, TAA는 종양 백신의 개발을 위한 출발 점이다. TAA의 식별과 특성화의 방법은 환자 또는 건강한 대상에서 단리될 수 있는 CTL의 사용에 기반되거나, 다른 전사 프로파일 또는 종양과 정상 조직 사이에 다른 펩티드 발현 패턴의 생성에 기반된다.
그러나, 종양 조직 또는 인간 종양 세포주에서 과발현되거나 그런 조직 또는 세포주에서 선택적으로 발현되는 유전자의 식별은 면역 치료에서 이런 유전자에서 전사된 항원의 이용에 대한 정확한 정보를 제공하지 않는다. 이것은 상응하는 TCR이 있는 T 세포가 제시되어야 하고 이 특정 항원결정부위에 대한 면역원성 내성이 없거나 최소화되어야 하기 때문에 이러한 항원의 항원결정부위의 개별 소집단만이 상기 적용에 적당하다. 따라서 본 발명의 매우 바람직한 구현에서, 그에 대해 기능 및/또는 증식하는 T 세포가 있을 수 있는 과다 또는 선택적으로 제시된 펩티드만을 선택하는 것은 중요하다. 그런 기능성 T 세포는 특이적 항원에 의해 자극되었을 때 클론적으로 확대되고 효과기 기능("효과기 T 세포")을 실행할 수 있는 T 세포로 정의된다.
본 발명에 따른 TCR 및 항체의 경우 기저 펩티드의 면역원성은 이차적인 것이다. 본 발명에 따른 TCR과 항체에서 그 제시가 결정 요인이다.
조력 T 세포는 항-종양 면역에서 CTL 효과기 기능을 조절하는데 중요한 역할을 한다. CD8-양성 킬러 T 세포의 TH1 유형 지원 효과기 기능의 조력 T 세포 반응을 일으키는 조력 T 세포 항원결정부위는, 세포 표면에 종양-연관 펩티드/MHC 복합체를 보이는 종양 세포에 대한 세포독성 기능을 포함한다. 이런 식으로 종양-연관 조력 T 세포 펩티드 항원결정부위는, 단독으로 또는 다른 종양-연관 펩티드와 함께, 항-종양 면역 반응을 자극하는 백신 조성의 활성 약학 성분으로 사용될 수 있다.
추가 암들에 대한 사용은 본 발명에 따른 펩티드의 기저 폴리펩티드에 관한 다음 설명에서 공개된다.
시스테인 및 글리신-풍부 단백질 2(CSRP2)
CSRP2는 CSRP 군 유전자의 멤버로 LIM 도메인 단백질 군을 인코딩하며, 이는 발육과 세포 분화에 중요한 조절 과정에 관여할 수 있다. CSRP2는 다양한 종양 유형에서 결손이나 손상 이벤트에 의해 흔히 영향을 받는 영역인 염색체 하위 띠인 12q21.1에 매핑되었다(Weiskirchen et al., 1997). CSRP2의 발현은 간세포 암종(HCC)의 중간 정도 분화된 종양에서 상당히 상승한다. CSRP2는 HCC의 탈분화와 연관될 가능성이 있다(Midorikawa et al., 2002).
용질 운반자과 10(나트륨/담즙산 공동수종체과) 멤버 4(SLC10A4)
유전자 SLC10A4는 콜린성 및 모노아민성 신경세포의 시납스전 말단에 존재하는, 최근에 밝혀진 운반 단백질을 인코딩한다(Zelano et al., 2013). SLC10A4 mRNA는 인간 조직에서 흔히 발현되며, 뇌와 태반 및 간에서 mRNA 발현 수준이 가장 높다. SLC10A4-형질감염 CHO 세포에서, 면역탁본 분석 및 면역형광 염색 결과는 혈장 막과 세포내 구획에서 발현되는 49-kDa 단백질을 보여주었다(Splinter et al., 2006). SLC10A4는 신경전달물질이나 비만세포 매개체의 소포 저장이나 세포외 배출에 참여할 수 있다(Claro da et al., 2013).
ELOVL 지방산 연장 효소 2(ELOVL2)
ELOVL2는 포유동물의 마이크로솜 ELOVL 지방산 효소 패밀리의 멤버로, 산화성 스트레스 유도 및 지질 생합성에 관여하며, 포유동물에서 다양한 세포 기능에 요구되는 고도불포화된 지방산(PUFA) 등의 매우 긴 쇄의 지방산의 연장을 주도한다(Aslibekyan et al., 2012; Zadravec et al., 2011). 구체적으로 ELOVL2는 고환에서 매우 긴 PUFA의 형성을 위한 필수 효소이다(Casado et al., 2013). ELOVL2의 결핍은 정자발생의 완전한 정지와 연관 있는 것으로 나타난 바 있으며, 정세관은 전조세포와 일차 정모세포만을 보여주고 더 이상의 배아 세포는 없었다(Zadravec et al., 2011). ELOVL2는 생명의 맨 처음 단계부터 시작되며 노화에 대한 매우 고무적인 바이오마커로 보이는 메틸화의 점진적 증가를 보여준다(Garagnani et al., 2012). 이 효소의 상향조절은 간세포 암종으로부터 보고된 바 있다(Zekri et al., 2012).
전이 억제제 1-유사(MTSS1L)
방사 아교는 중추 신경계의 발육 과정에서 신경세포 이동, 축삭 유도 및 신경발생에서 중심 역할을 수행한다. 최근의 연구에서 MTSS1L(또는 ABBA)에 방사 아교 세포에서 액틴과 형질막 역학의 신규 조절인자로 파악되었다. 흥미롭게도 ABBA가 방사-아교-유사 C6-R 세포에서 형질막과 액틴 사이의 경계에 집중되며, 그 고갈은 형질막 역학과 돌기 연장에서 결함을 초래한다(Saarikangas et al., 2008). 생쥐 섬유모세포(NIH3T3 세포)에서 GFP 표지 Abba의 과발현은 막 파상과 라멜리포디아의 PDGF-매개 형성을 강화시켰다. 일부 데이터는 전장 Abba와 Rac1 사이의 상호작용이 막 변형에 관련이 있음을 나타낸다(Zheng et al., 2010).
단백질 티로신 인산분해효소, 수용체-유형, Z 폴리펩티드 1(PTPRZ1)
PTPRZ1(단백질 티로신 인산분해효소, 수용체-유형, Z 폴리펩티드 1)은 수용체 유형 단백질 티로신 인산분해효소 패밀리의 멤버로, 두 가지 세포질 티로신-단백질 인산분해효소 도메인, 즉, α-탄산 탈수효소 도메인과 섬유결합소 유형-III 도메인으로써 일회 통과 제 I형 막 단백질을 인코딩한다. PTPRZ1은 주로 신경계에서 발현되며 아교 전구세포와 성상아교세포에 의해 합성된다(Canoll et al., 1993; Milev et al., 1994; Engel et al., 1996; Meyer-Puttlitz et al., 1996; Sakurai et al., 1996). PTPRZ1은 GBM에서 과발현되며 GBM 세포 운동성에 관여하는 것으로 사료된다(Muller et al., 2003; Ulbricht et al., 2003; Lu et al., 2005; Wellstein, 2012). 더욱이, PTRPZ1은 교모세포종에서 유전체 DNA 수준으로 흔히 증폭된다(Mulholland et al., 2006). 성상아교세포종에서, PTPRZ1의 증가된 발현 수준은 불량한 임상적 예후와도 상관관계가 있다(Ulbricht et al., 2003). siRNA 형질감염에 의한 PTPRZ1 발현의 길항작용은 시험관 내 및 생체 내에서 교모종 성장을 억제한다(Ulbricht et al., 2006).
키네신과 멤버 1A(KIF1A)
KIF1A는 키네신 3과의 단량체 모터 단백질이다. 이는 뇌 특이적 단백질로 간주되며, 그 기본 기능은 신경세포에서 시냅스 수포의 신속한 선행 축삭 운반과 관련이 있다. KIF1A는 신경세포의 기능과 샘플에 필수적이다(Hirokawa & Noda, 2008). KIF1A의 이상 과메틸화는 두경부 편평세포 암종(Demokan et al., 2010; Kaur et al., 2010; Loyo et al., 2011; Pattani et al., 2010; Guerrero-Preston et al., 2011), 폐암(Loyo et al., 2011), 갑상선암 및 유방암(Brait et al., 2012; Ostrow et al., 2009)과 같은 다양한 유형의 암에서 흔히 발생한다. KIF1A는 미세 잔존 질환(MRD)의 8개의 마커 중 하나로 밝혀졌으며, IV기 신경모세포종 종양에서 풍부하게 발현되었고 정상 골수/혈액 시료에서 낮게 검출되거나 검출되지 않았다. IV기 환자의 경우, 골수에서 KIF1A의 발현 수준은 무진행 및 전체 생존에 대해 고도의 예후성을 보였다(Cheung et al., 2008). 신경모세포종에서 미세 잔존 질환에 대하여, KIF1A는 11개의 유전자 중 하나로서 종양 개시 세포에서의 과발현은 MRD와 상관 관계가 있다(Hartomo et al., 2013).
프로토캐드헤린 γ 서브패밀리 C, 5(PCDHGC5)
프로토캐드헤린 γ-C5(PCDHGC5)는 PCDHG 패밀리의 22 멤버 가운데 하나이다. 프로토캐드헤린(PCDH)은 캐드헤린의 서브그룹이며, 주로 중추 신경계에서 발현된다(Kallenbach et al., 2003; Hirayama and Yagi, 2006). γ 유전자 군집은 면역글로불린 군집과 유사하게 구성된다. 즉 엑토도메인(카데린 반복, 막횡단 및 근위 세포 내 도메인)을 인코딩하는 22가지 가변 엑손들, 및 세포질 도메인의 원위 작용 군을 인코딩하는 3가지 불변 엑손들은 RNA 스플라이싱에 의해 연결된다(Morishita and Yagi, 2007; Wang et al., 2002). PCDH는 발육 조직의 형태발생 및 시냅스 형성과 조정(Frank and Kemler, 2002) 및 출생 후 뇌에서 뇌척수액의 생산에 관여한다(Lobas et al., 2012). PCDHGC5과 같은 일부 PCDHG들은 세포내 어댑터 단백질 PDCD10(프로그램된 세포사 10)과 상호작용하며, 후자는 신경세포에서 세포사멸을 매개한다(Lin et al., 2010a).
글루탐산염 수용체, 수축력, 카이네이트 3(GRIK3)
글루탐산염 수용체들은 포유동물의 뇌에서 주된 흥분 신경전달물질 수용체이며 다양한 정상 신경 생리학적 과정에서 활성화된다. GRIK3(GluR7)은 글루탐산염 수용체의 카이네이트과에 속하며, 이는 네 개의 소단위로 구성되며 리간드 활성화 이온 채널로서 기능한다(Pinheiro et al., 2007). GluR5-7 소단위들은 인간 신경교종에서 발현된다(Aronica et al., 2001). 교모세포종에서는 GluR7이 인간 뇌보다 더 높은 수준으로 발현되었다(Brocke et al., 2010). GluR7은 또한 몇 가지 인간 종양 세포주에서 차등적으로 발현되는 것으로 나타났다(횡문근육종/수모세포종, 신경모세포종, 갑상선 암종, 폐암종, 성상아교세포종, 다발골수종, 교모종, 폐 암종, 대장 선암종, T 세포 백혈병 세포, 유방 선암종 및 대장 선암종)(Stepulak et al., 2009).
발작 관련 6 호모로그(생쥐)-유사(SEZ6L)
SEZ6L cDNA는 단백질-단백질 상호작용 및 신호 전달에 관여하는 복수 도메인을 갖는 1,024-아미노산 막횡단 단백질을 인코딩하는 3,072-bp 오픈 리딩 프레임을 포함한다. SEZ6L은 뇌에서 풍부하게 발현되었으며 또한 폐 상피세포 등 다양한 인간 조직에서도 발현되었다. 그러므로 SEZ6L 단백질은 다양한 인간 세포에서 단백질-단백질 상호작용을 통해 세포간 신호 변환기로 기능을 하는 막횡단 단백질로서 간주된다(Nishioka et al., 2000). SEZ6L 유전자에서 유전자 변이체는 여자 환자에서 제 I형 양극성 장애와 관련이 있다(Xu et al., 2013). SEZ6L의 다형태 변이체는 폐암의 위험 증가와 연관될 수 있다(Raji et al., 2010; Gorlov et al., 2007). SEZ6L 메틸화 상태 또한 위 암종의 마커일 수 있다(Kang et al., 2008). Suzuki 등(2002)이 수행한 연구는 SEZ6L 유전자가 결장직장 암종의 발전과 진행에 영향을 미칠 수도 있음을 시사한다. 이 저자들은 원발성 결장직장 암에서 SEZ6L이 고도로 과메틸화된 유전자의 하나였음을 찾아냈다(Suzuki et al., 2002).
앙키린 반복 도메인 40(ANKRD40)
ANKRD40은 앙키린 반복 단백질 패밀리의 멤버이다. ANKRD40은 염색체 17q21.33에 국지화된다. ANKRD40의 기능은 알려져 있지 않다. 하지만 앙키린 반복은 루프에 의해 분리된 두 개의 α 나선으로 구성된 단백질에서의 33-잔기 모티프이며, 효모 Cdc10 및 초파리 노치의 신호전달 단백질에서 최초로 발견되었다(Breeden and Nasmyth, 1987). 앙키린 반복으로 구성된 도메인들은 단백질-단백질 상호작용을 매개하며, 알려진 단백질에서 가장 흔한 구조적 모티프에 존재한다(Mosavi et al., 2004). 앙키린 반복 단백질은 다수의 인간 질병과 연관이 있어왔다. 이 단백질들은 암과 연관이 있는 세포주기 억제제 p16 및 반복 도메인이 돌연변이에 의해 방해를 받으면 신경계 질환인 CADASIL을 유발할 수 있는 노치 단백질(세포 신호전달 경로의 주요 성분)을 포함한다(Mosavi et al., 2004).
뉴로리긴 4, Y-연관(NLGN4Y)
NLGN4Y와 같은 뉴로리긴은 시냅스의 시냅스후 측에 존재하는 세포 부착 분자로서, 기능적 시냅스의 형성에 필수일 수 있다(Jamain et al., 2003). 스칼레츠키(Skaletsky) 등(2003)은 NLGN4Y의 Y-염색체 등록체인 NLGN4가 태아 및 성인의 뇌, 전립선 및 고환에서 발현되었음을 밝혔다(Skaletsky et al., 2003). 일부 데이터는 NLGN4Y의 서열 변이체가 자폐증이나 정신 지체와 연관이 있을 수 있음을 시사했다(Ylisaukko-oja et al., 2005; Yan et al., 2008).
칼륨 내부 정류 채널, 서브패밀리 J, 멤버 10(KCNJ10)
KCNJ10은 상동에 의해 7개 서브패밀리로 그룹화되는 16가지 칼륨 내부 정류(Kir) 채널 소단위들의 하나를 인코딩한다. KCNJ10은 신경아교 세포에서 주요 구멍 형성 소단위이며 대부분의 데이터는 동의유전자 채널을 시사한다. KCNJ10의 돌연변이는 공통 특발성 전신성 간질 증후군의 발작 감수성과 관련된 바 있다(Olsen and Sontheimer, 2008). 정상 뇌에서는, KCNJ10는 미세혈관 주위, 아교 경계/연질막 내부 및 때때로 신경세포 내부에서 IHC에 의해 검출되었다(Saadoun et al., 2003). 다양한 인간 뇌 종양(저급 및 고급 성상아교세포종과 핍지신경교종)에서 KCNJ10은 건강한 조직에 비해 잘못 제한되는데, 이는 신경아교 세포의 완충 능력을 손상시킴으로 물의 유입을 초래할 수 있다(세포독성 수종)(Warth et al., 2005). KCNJ10은 또한 손상된 뇌(암종, 핍지신경교종 및 교모세포종 세포)의 성상아교세포를 상향조절했다. 이는 아쿠아포린 4의 상향조절에 대한 반응이라고 가정했다(Saadoun et al., 2003). KCNJ10는 성상아교세포종의 새로운 바이오마커로서 또는 치료 표적으로서 사용될 수 있다(Tan et al., 2008).
브레비칸(BCAN)
브레비칸(BCAN)은 콘드로이틴 황산 프로테오글리칸의 렉티칸과에서 뇌 특이적 멤버이다. 두 가지의 BCAN 아이소형이 보고된 바 있다: 세포외 바탕으로 분비되는 전장 폼 아이소형 및 글리코포스파디닐이노시틀(GPI) 고정을 예측하는 서열을 갖는 짧은 아이소형(Gary et al., 2000). BCAN은 정상 수준에 비해 약 7배의 발현 증가의 검출이 가능한 교모종에서 극적인 상향조절을 보여준다(Gary et al., 2000; Gary et al., 1998). BCAN은 또한 생물학적으로 보다 공격적인 II 등급 핍지신경교종에서 상향조절되는 것으로 검증된 바 있다(Rostomily et al., 2010). 더욱이 BCAN은 가장 높은 생체 내 유도만능성 및 발종양성을 보여주는 GBM 암 줄기 세포 유형에서 선택적으로 과발현되는 것으로 묘사된 바 있다(Gunther et al., 2008). 임상적으로 BCAN 상향조절은 높은 등급의 교모종 환자의 불량한 생존과 상관관계가 있다(Liang et al., 2005).
막 연관 구아닐산 키나제, WW 및 PDZ 도메인 보유 2(MAGI2)
MAGI2는 자궁 편활근종, 전립선암 및 교모세포종에서 결손된 영역인 염색체 7q21로 제한된 바 있다(Cui et al., 1998; Cunningham et al., 1996; Ishwad et al., 1995; Kim et al., 1995). MAGI2는 뇌 특이적이며(Shoji et al., 2000; Wood et al., 1998; Yamada et al., 2003) 또한 흥분 시냅스에서 NMDA 수용체와 상호작용하는 것으로 나타난 바 있다(Hirao et al., 1998). MAGI2는 AMPA- 및 NMDA-유형 글루탐산 수용체와 같은 신경전달 물질 수용체의 동원에 관여한다(Koide et al., 2012). MAGI2는 PTEN 등 뇌에서 일부 리간드들과 상호작용한다(Deng et al., 2006). MAGI2로부터의 PDZ-2 도메인에 대한 종양 억제인자 PTEN의 결합은 PTEN 단백질 안정성을 증가시켰다(Valiente et al., 2005). MAGI2 과발현은 STS-유도 세포사멸에 대한 자궁외 PTEN을 은닉하는 암 세포의 감수성을 증진시킨다(Li et al., 2013b). MAGI2와 알쯔하이며병의 발병 위험의 상당한 연관이 있음이 밝혀진 바 있다(Kohannim et al., 2012).
스캐빈저 수용체 등급 A, 멤버 3(SCARA3)
염색체 8p21에 대한 코스미드(cosmid) 매핑으로부터 예측된 엑손 서열을 사용하여, 한(Han) 등(1998)은 태아 뇌 라이브러리를 선택하여 신규 거식세포 스캐빈저 수용체-유사 유전자 SCARA3(CSR1로 부름)을 단리했다(Han et al., 1998). CSR1은 전립선암, 두경부 편평 세포 암종 및 폐암 등 몇몇 인간 악성 종양에서 흔히 결손되는 유전자 자리인 8p21-22에 위치한다(Coon et al., 2004; Gallucci et al., 2006; Kurimoto et al., 2001). 원발성 난소 암종의 높은 SCARA3 수준 및 진단부터 재발까지 질병 진행에 따른 그 상향조절은 난소암 생물학에서의 역할을 시사했다(Bock et al., 2012). 한 연구에서 CSR1(SCARA3)은 그 대사의 증가를 통해 산화 자유 라디칼의 돌연변이 손상으로부터 세포를 보호하는 것을 제안했다(Han et al., 1998). 더욱이 CSR1은 새로 특성화된 종양 억압 유전자이며, 30%가 넘는 전립선암에서 과메틸화를 진행하여, 중대한 RNA 처리 효소를 납치하여 신규 기전을 통해 세포사를 유도한다(Zhu et al., 2009).
글루탐산 수용체, 수축촉진, AMPA 4(GRIA4)
GRIA4(또는 GLUR4)는 AMPA(α-아미노-3-하이드록시-5-메틸-4-이속사졸 프로티오네이트)-민감 글루탐산 수용체의 패밀리에 속하며 RNA 교정(AGA->GGA; R->G)의 대상이 된다. GluR4 소단위(GRIA4)는 성인의 뇌에서 채널 성질의 조절은 물론 AMPA 수용체의 교통에서 중심적인 역할을 수행할 수 있다(Kawahara et al., 2004). 출현하는 증거나 암의 생물학에서 글루탐산의 역할을 지지한다. GLUR4의 억제(knockdown)는 침입과 전이에 관여하는 유전자, 종양 억압 유전자, 종양 유전자 및 유착 유전자의 발현과 기능에 영향을 미쳤다(Luksch et al., 2011). GRIA4는 교모세포종의 성장에서 중대한 역할을 한다. GRIA4 소단위를 포함하는 Ca(2+)-투과 수용체의 차단은 교모세포종 침입의 예방을 위한 유용한 치료 전략일 수 있다(Ishiuchi et al., 2002). 교모세포종 세포는 GluR1 및/또는 GluR4 소단위로부터 조립된 Ca(2+)-투과 AMPAR을 발현한다. Ca(2+)-투과 AMPA 수용체의 과발현은 종양 세포의 이동 및 증식을 용이하게 했다(Ishiuchi, 2009).
클러스테린(CLU)
클러스테린은 거의 어디에나 있는 조직 분배를 갖는 불가사의한 헤테로다이머 당단백질이다. 이는 조직 개조, 생식, 지질 운반, 상보적 조절 및 세포사멸 등 다양한 병리생리학적 과정에서 중요한 역할을 수행한다(Li et al., 2010; Niu et al., 2012). CLU 유전자의 생성물은 문맥에 의존하는 방식으로 종양형성을 촉진 또는 억제한다. 다른 CLU 아이소형은 다르거나 심지어는 반대의 생물적 기능을 갖는다는 가설이 존재한다(Chaiwatanasirikul and Sala, 2011). 전사멸 CLU는 핵 아이소형(핵 클레스테인; nCLU)으로 보이며, 분비 CLU(sCLU)는 항사멸로 사료된다(Kim et al., 2012b). 클러스테린은 다면발현성 분자 새퍼론으로 생존 및 증식의 이점을 암 세포에 부여하며(Shiota et al., 2012) 또한 막 안정제 단백질로서 세포사멸 동안 상피 세포의 자가 탐식 분해를 제한하는데 관여하는 것으로 보인다(Bruchovsky et al., 1996). sCLU의 과발현은 원발성 위암(Bi et al., 2010), 난소암(Yang et al., 2009), 유방암(Niu et al., 2012), 폐암(Panico et al., 2013), 간세포 암종(Chen et al., 2012a)에서 검출되었으며, 불량한 생존과 전이와 연관이 있었다.
세라미드 합성효소 1(CERS1)
세라미드는 생물 활성의 스핑고리피드이며 현재 암 연구의 일선에 위치한다. 고전적으로 세라미드는 암 세포에서 사멸, 성장 억제 및 노화를 유도하는 것으로 사료된다(Saddoughi and Ogretmen, 2013). 세라미드 합성효소 1(CerS1)은 스핑가닌(디하이드로스핑고신)을 아실화하며 디하이드로세라미드를 형성하며 스핑고신을 아실화하여 세라미드를 형성한다(Futerman and Riezman, 2005). 지앙(Jiang) 등(1998)은 노던 블로팅으로 CerS1의 인간 조직 발현을 분석하여 뇌 골격 근육 및 고환에서 가장 높은 발현을 찾아냈다(Jiang et al., 1998). CerS1 발현에 의한 C(18)-피리디늄 세라미드 치료 또는 내인성 C(18)-세라미드 생성은 인간 암 세포에서 사멸과 무관하게 자가탐식 세포의 사멸을 매개한다(Sentelle et al., 2012). 몇 가지 증거는 암 화학요법제와 방사능에 대한 민감도 조절에 있어서 CerS1의 역할을 지적한다(Min et al., 2007; Separovic et al., 2012). 추가 실험은 HNSCC 세포에서 CerS1과발현 및 C18:0-세라미드 생산의 성장 억제와 전사멸 영향을 잘 보여주었다(Senkal et al., 2007).
G 단백질-연결 수용체 98(GPR98)
G 단백질-연결 수용체들(GPCRs)은 관련된 단백질의 가장 커다란 슈퍼패밀리다. GPR98 유전자는 G-단백질 연결 수용체 슈퍼패밀리의 멤버를 인코딩한다. 인코딩된 단백질은 7-막횡단 수용체 도메인을 포함하고 칼슘과 결합하며 중추 신경계에서 발현된다. YAC 클론의 연관 분석과 FISH 및 방사선조사 하이브리드 분석에 의해 니킬라(Nikkila) 등(2000)은 염색체 5q14.1에 대해 GPR98 유전자를 매핑했다(Nikkila et al., 2000). 맥밀란(McMillan) 등(2002)은 유전체 서열 분석에 의해 GPR98 유전자가 90개의 엑손을 포함하여 최소 600 kb의 범위임을 결정했다(McMillan et al., 2002). 대형 GPR98 유전자에서의 변이는 증후군 유형 2C(Ebermann et al., 2009) 및 가족성 열성 경련과 연관이 있다(Nakayama et al., 2000). 한 연구에서 GPR98은 다형 교모세포종 환자의 생존과 연관이 있었다(Sadeque et al., 2012).
글리코게닌 2(GYG2)
글리코게닌은 글리코겐 생합성의 개시 단계에 관여하는 자가 글리코실화 단백질이다. 이는 처음 몇 개의 포도당 분자들을 중합함으로써 프라이머로서 행동하며, 이후에는 다른 효소들이 떠맡는다. 인간 글리코게닌-2 유전자 GYG2의 복제는 11개 엑손 및 크기가 46 kb를 넘는 유전자 1개의 존재를 밝혀냈다(Zhai et al., 2000). 뮤(Mu) 및 로쉬(Roach)(1998)는 FISH에 의해 Xp22.3에 대한 GYG2 유전자 매핑을 실행했다. 글리코게닌-2의 수준은 글리코겐 축적을 결정할 수 있으므로 글리코겐 합성의 제어 가능성을 갖는다(Mu and Roach, 1998).
카르니틴 팔미토일 전환효소 1C(CPT1C)
CPT1C 유전자는 카르니틴/콜린 아세틸 전환효소 패밀리의 멤버를 인코딩한다(Jogl and Tong, 2003). 인코딩된 단백질은 장쇄 지방산의 β-산화와 미토콘드리아로의 수송을 조절하며, 섭식 행동과 전신 에너지 항상성의 조절에서 역할을 수행할 수 있다(Bonnefont et al., 2004; Wolfgang et al., 2006). CPT1C는 새로 동정되었으며 잘 알려지지 않은 뇌 특이적 CPT1 동종이다(Reamy and Wolfgang, 2011). 최근의 임상전 연구는, 대개 뇌에서만 발현되는 유전자인 CPT1C가 암세포 생존과 종양 성장을 촉진함을 시사한다. CPT1C는 정상적으로 뇌에 제한된 발현 및 대부분 약의 혈액뇌 장벽을 통과할 수 없는 능력으로 인해, 구체적인 저분자 억제에 대한 이상적인 후보일 수 있다(Reilly and Mak, 2012).
용질 운반자 패밀리 35, 멤버 E1(SLC35E1)
용질 운반자 패밀리 SLC35는 인간에서 적어도 17개의 분자 종으로 구성된다. 이제까지 특성화된 패밀리 멤버들은 골지 기관 및/또는 세포질 그물(ER)로 제한되는 뉴클레오티드 당 운반체를 인코딩한다(Ishida and Kawakita, 2004). SLC35E1은 염색체 19p13.11에 매핑되었다(Gerhard et al., 2004). 국소적으로 진행된 직장암 환자에서, 42개 유전자(SLC35E1 포함)의 유전자 발현 특징은 반응자를 비반응자로부터 구별할 수 있다. 그리하여 신보강 화학요법에 대한 직장 암종의 반응의 치료전 예측이 가능하므로 새로운 소중하고 실용적인 치료층화를 나타낼 수 있다(Rimkus et al., 2008).
산 민감성(양성자 관문) 이온 채널 패밀리 멤버 4(ASIC4)
ASIC4는 아밀로라이드 민감성 나트륨 채널의 슈퍼 유전자 패밀리에 속한다. 이제까지 다섯 가지의 다른 ASIC들이 포유동물 조직으로부터 복제되었다. ASIC4는 뇌 전체, 척수 및 내이에서 발현된다(Grunder et al., 2000). 이제까지 다섯 가지의 다른 ASIC들이 포유동물 조직으로부터 복제되었다. ASIC4는 중추 신경계 전반에 걸쳐 발현되며 뇌하수체에서 가장 크게 발현됨을 보여준다. ASIC4는 자체로는 비활성이며 그 기능은 알려져 있지 않다. ASIC에 상동성인 이온 채널 소단위에서의 돌연변이는 예쁜 꼬마 선충에서 신경 퇴행을 초래한다. 그러므로 ASIC에서의 유사한 돌연변이가 인간의 신경퇴행에 대한 책임이 있을 수 있다고 추측한 바 있다(Grunder et al., 2001). 더욱이 뼈에서의 ASIC4의 발현은 항상 매우 낮은 수준이다(Jahr et al., 2005).
콜라겐 유형 XX, α 1(COL12A1)
COL20A1은 콜라겐 유전자이다. COL20A1 유전자는 염색체 20q13.33에 매핑되었다(Deloukas et al., 2001). 이 유전자의 기능은 아직 알려진 바 없다. 최근 한 연구에서 유방암 재발, 전이 또는 생존 분석에서의 치사율과 연관된 공동 작용 유전자들의 하위집합들을 파악했다. 중국 한족 유방암 환자의 투병 생존에 대해 COL20A1을 포함하는 16-유전자 특징이 확립되었다(Huang et al., 2013a).
표피 성장 인자 수용체(EGFR)
EGFR은 erbB의 원종양유전자이다. EGFR은 전구 세포의 표현형을 조절하는 다수의 경로를 활성화하는데 관여한다. 활성화된 EGFR 티로신 키나아제의 활성은 신경 줄기 세포의 이동, 증식 및 생존을 증진시킨다. EGFR의 과발현은 활성 리간드:수용체 복합체 형성의 증가로 인해 세포 성장을 증강시킬 수 있다. 유전자 증폭은 GBM 종양에서 EGF 수용체의 기저 과발현에 대한 기전이다(Thompson and Gill, 1985). EGFR 신호전달은 교모세포종에서도 역할을 수행하는 것으로 알려져 있으므로, 교모세포종은 암 줄기 세포로부터 유래하며 EGFR 신호는 이러한 전구 세포에서 흔히 변형되는 것으로 결론내릴 수 있다(yuso-Sacido et al., 2006). 티로신 키나아제 억제제(TKI), 단클론성 항체, 백신 및 RNA-기반 제제 등 EGFR이나 그 변이체의 구성적으로 활성인 형태인 ΔEGFR을 대상으로 하는 넓은 범위의 가능한 요법들이 GBM 치료를 위해 현재 개발 중이거나 임상 시험 중에 있다. 이러한 요법을 평가한 실험 연구의 자료는 매우 고무적이지만, 클리닉에서의 효능은 선행 또는 획득된 약물 내성에 의해 지금까지 제한되고 있다. 다수의 연구에 의하면, GBM에서는 복수 대상 접근방법이 이러한 대상 요법 유형에 대하여 더 바람직한 미래를 제공할 것이다(Taylor et al., 2012).
야누스 키나아제 및 미세관 상호작용 단백질 2(JAKMIP2)/야누스 키나아제 및 미세관 상호작용 단백질 3(JAKMIP3)
JAKMIP2는 α-헬릭스 이중 나선 단백질 또는 골진 패밀리의 멤버로 2012년(Cruz-Garcia et al., 2012)에 파악된 바 있으며, 모터 단백질, 막 테더링 및 수포 수송 단백질로서 다양한 생물적 기능을 갖는다(Rose and Meier, 2004; Rose et al., 2005). JAKMIP2는 외재성 막 단백질로서 신경내분비 세포에서 골지 기관 및 후골지 운반체에 걸쳐 분배되며 또한 신경내분비 세포에서 분비 카고의 규제된 교통에 대한 부정적 조정자로서 행동할 수 있다(Cruz-Garcia et al., 2012). JAKMIP3은 JAKMIP2의 파라로그로서(Cruz-Garcia et al., 2012), 및 모터 단백질, 막 테더링 및 수포 수송 단백질로서 다양한 생물적 기능을 갖는 긴 α-헬릭스 이중 나선 단백질 또는 골진 패밀리 멤버로 파악되었다(Rose and Meier, 2004; Rose et al., 2005). JAKMIP3은 JAKMPI2의 긴 이중 나선 영역과 매우 유사한 영역 및 동일한 C-말단 막횡단 도메인을 표시한다. 이는 JAKMIP2와 같이 조절된 분비 경로를 갖는 세포가 포함된 조직, 즉, 내분비와 신경 조직에서 주로 발현된다. 두 가지 모두 외재성 막 단백질로서 골지 기관 및 후골지 운반체에 위치하며 또한 신경내분비 세포에서 분비 카고의 규제된 수송에 대한 부정적 조정자로서 행동할 수 있다(Cruz-Garcia et al., 2007; Cruz-Garcia et al., 2012; Malagon et al., 2009).
Wntless 호모로그(초파리)(WLS)/중배엽 유도 조기 반응 1 호모로그(제노푸스 래비스)(MIER1)
WLS는 막횡단 분류 수용체이며 트랜스 골지 그물과 세포 표면 사이를 이동한다. WLS는 Wnt 신호전달 단백질의 효율적인 분배에 요구된다(Gasnereau et al., 2011). 난포 상피에서 WLS의 손실은 심오한 모발 주기 정지를 초래했다(Myung et al., 2013). WLS는 WNT/β-카테인 신호전달의 활성화에 의해 흑색종 증식 및 자발적 전이의 부정적 조절인자로서 기능한다(Yang et al., 2012b). WLS는 성상아교세포종에서 과발현된다. 교종과 교종 유래 줄기유사 세포에서 WLS의 결손은 감소된 세포 증식과 세포사멸을 초래한다. 교모종 세포에서 WLS 침묵은 세포 이동과 생체 내 종양 생성 능력을 감소시켰다. WLS는 교종의 종양 생성에 대한 필수 조절 인자이다(Augustin et al., 2012). MIER1은 섬유모세포 성장 인자(FGF)-활성화 전사 조절 인자이다(Paterno et al., 1997). 또는 접합된 전사 변이체가 다수의 아이소형들을 인코딩하고, 이들의 일부에는 C-말단 핵 위치 신호가 결여되어 있다(Paterno et al., 2002). 에스트로겐 수용체-α(ER alpha)는 유방 발육과 종양형성에서 중심 역할을 수행하며, 그 활성의 억제가 ER α-양성 유방암의 치료에서 여전히 최상의 치료이다. 차등 스플라이싱은 유방암 세포에서 α의 세포화 위치는 변형시키지만 MIER1 전사 조절인자의 β 아이소형은 그러하지 못하다(Clements et al., 2012). 핵 MI-ER1 α의 손실이 침습성 유방암종의 발달에 기여할 수 있다고 제안되었다(McCarthy et al., 2008).
인슐린 수용체 기질 2(IRS2)
인슐린 유사 성장 인자(IGF)는 세포 이동의 자극으로서 종양 진행 및 부분적으로 전이를 촉진하는 것으로 사료된다. IRS 단백질은 종양 세포 대사를 제어하는 IR/IGF-1R로부터의 신호를 매개하는데 있어서 중심 역할을 한다(Shaw, 2011). 인슐린 수용체 기질-1(IRS-1) 및 IRS-2는 제1형 IGF 및 인슐린 수용체의 바로 하류에 위치하는 멀티사이트 도킹 단백질이다. IRS-2는 흔하게 발현되며 대부분의 세포 유형에서 인슐린 의존 세포분열 및 포도당 대사의 조절에서 일차 매개체이다(White, 2002). IRS-2는 또한 여러 유형의 암에서 흔하게 발현된다(Mardilovich et al., 2009). IRS-1은 아니지만 IRS-2는 유방암 세포의 IGF에 대한 이동 반응에 관여하는 것으로 보고된 바 있다(de Blaquiere et al., 2009). IRS-2는 흔히 종양 운동성 및 침입과 연관이 있다(Mardilovich et al., 2009). 일부 데이터는 IRS2가 신장 상피에서 발현됨을 보여준다. 당뇨병 신장병증(DN) 환자의 신장 세뇨관에서 구체적인 상향조절은 마커 및/또는 인간 DN 진행의 매개체로서의 IRS2의 신규 역할을 나타낸다(Hookham et al., 2013).
N-아세틸 전이효소 8-유사(GCN5-관련, 추정)(NAT8L)
NAT8L(N-아세틸 전환효소 8-유사)은 아스파라진산 N-아세틸전이효소, 즉, 포유동물 뇌에서 두 번째로 가장 풍부한 대사물인 N-아세틸아스파라진산염을 만드는 효소로서 최근에 파악되었다. NAT8L 단백질은 신경세포 특이적 단백질이며, L-아스파라진산염과 아세틸-CoA로부터 NAA 합성을 촉매하는 N-아세틸아스파라진산(NAA) 생합성 효소이다(Wiame et al., 2010; Ariyannur et al., 2010). NAT8L은 신경세포 특이적 단백질로서 원발성 NAA 결핍증(hypoacetylaspartia)에서 돌연변이된다(Wiame et al., 2010).
테라신 C(TNC)
테라신 C(TNC)는 태아 발육(Bartsch et al., 1992), 상처 치유(Mackie et al., 1988) 및 신생물 과정과 같은 상승된 이동 활성도와 밀접하게 연관된 과정에 고도로 상향조절되는 세포의 기질 단백질이다(Chiquet-Ehrismann, 1993; Chiquet-Ehrismann and Chiquet, 2003). 더욱이 TNC는 높은 증식 지수를 갖는 종양 혈관에서 과발현되는데, 이 지수는 TNC가 신생물 혈관형성에 관여함을 나타낸다(Kim et al., 2000). 정상 인간 뇌에서는 TNC의 발현은 거의 드물게 검출되는 반면, 악성 교모종에서는 높은 수준으로 발현된다(Bourdon et al., 1983). 최근에 TNC가 악성 교모종은 물론 GBM 세포주에서 노치 신호전달의 표적 유전자로서 파악되었다(Sivasankaran et al., 2009). TNC의 과발현은 더욱이 대장암(De et al., 2013), 최악의 예후와 연관된 바 있는 선낭 낭성 암종(Siu et al., 2012), 혈관형성을 촉진할 가능성이 있는 유년 비인두 혈관섬유종(Renkonen et al., 2012), 진행 흑색종(Fukunaga-Kalabis et al., 2010), 증식, 이동 및 전이에서 역할을 수행하는 췌장암(Paron et al., 2011)으로부터 보고된 바 있다.
미세관-연관 단백질 1B(MAP1B)
MAP1B 유전자는 미세관-연관 단백질 패밀리에 속하는 단백질을 인코딩한다. 이 패밀리의 단백질들은 미세관 조립에 관여하는 것으로 사료되며, 이는 신경발생에서 필수 단계이다. MAP1B는 신경세포 미세관에서 α-튜불린의 티로신화를 조절하며, 이는 축삭 유도와 신경세포 이동과 같은 신경계 발육에 관여하는 일반 과정에 대해 중요할 수 있다(Utreras et al., 2008). MAP1B는 신경모세포종에서 강력하게 및 널리 발현되며 또한 횡문근육종 및 윌름즈 종양의 기질에서 국소성으로 또는 다소성으로 발현되었다(Willoughby et al., 2008). 더욱이 미세관-연관 단백질 1B 경쇄(MAP1B-LC1)는 신경모세포종 세포에서 종양 억제 유전자 p53의 활성도를 음의 조절한다(Lee et al., 2008a).
뉴로칸(NCAN)
뉴로칸은 아그레칸/베르시칸 프로테오클리칸 패밀리에 속하는 신경계 특이적 CSPG이다. 이는 특히 뇌의 발육 시 그 세포의 기질에서 중요한 성분으로 뇌의 성숙화 동안 대부분의 영역에서 하향조절된다(Rauch, 2004; Zimmermann et al., 1994). NCAN은 몇 가지 결합 파트너를 가지며, ECM 성분 테라신 C(Grumet et al., 1994), 히알유로난(Melrose et al., 1996; Zhang et al., 2004) 및 막 단백질 L1CAM(Grumet et al., 1994) 및 헤파린 황산 프로테오글리칸(Akita et al., 2004)이 포함된다. 일부 연구에서는 NCAN과 종양 침입성의 상관관계를 고려한다. 국소적 침투성 교모세포종과 폐 선암종의 잘 구속된 뇌내 전이의 비교에서, NCAN은 교모세포종에서 mRNA 및 단백질(IHC) 수준에 대해 더 높은 발현을 나타냈다(Klekner et al., 2010; Varga et al., 2010). NCAN 및 3가지 다른 유전자들이 저등급 성상아교세포종의 침투성 표현형과 상관관계가 있는 것으로 나타났다(Varga et al., 2012).
아데노신 A3 수용체(ADORA3)
ADORA3은 아데노신 수용체 패밀리에 속하는 단백질을 인코딩하며, 이 수용체들은 G-단백질-연결 수용체로서 다양한 세포내 신호전달 경로와 생리적 기능에 관여한다. A3AR(ADORA3)은 암의 발전에서 중요한 역할을 보여주는 종양 세포에서 고도로 발현되는 것으로 받아들여진 바 있다(Fishman et al., 2002; Merighi et al., 2003; Gessi et al., 2008; Bar-Yehuda et al., 2008). 인간 A3AR의 경우, 효능이 있으며 선택적인 작용질는 물론 선택적인 A3AR 길항제가 파악된 바 있다. CI-IB-MECA는 A3AR(ADORA3)의 작용질이며 다양한 암 세포에서 세포 사멸을 유도한 것으로 보고된 바 있다. CI-IB-MECA는 인간 교모종 세포(Kim et al., 2012a) 및 인간 방광암 세포(Kim et al., 2010)에서 세포간 Ca(2+) 및 ROS 생성에 의해 매개되는 ERK 및 Akt의 억압을 통해 카스파아제-의존 세포 사멸을 유도한다. A3AR 작용질인 IB-MECA는 전립선암 세포의 생체외 세포 증식 및 침입의 억제 외에도, 생쥐에서 전립선암의 생체 내 종양 성장 및 전이를 억제한다(Jajoo et al., 2009).
신경세포 PAS 도메인 단백질 3(NPAS3)
NPAS3는 암 발전 및 신경행위 등 다양한 역할을 갖는 뇌에서 발현되는 전사 인자들의 기본 헬릭스-루프-헬릭스 PAS 도메인 등급의 멤버이다(Brunskill et al., 1999; Erbel-Sieler et al., 2004; Kamnasaran et al., 2003; Lavedan et al., 2009). 더욱이 NPAS3을 갖는 염색체 14의 결손은 정상 비신생물 조직과 비교하여, 핍지신경교종, 흑색종 및 유방, 전립선 및 비뇨생식기관 등 다수의 종양에서 보고된 바 있다(Schaefer et al., 2001; Kimchi et al., 2005; Turashvili et al., 2007; Harada et al., 2008). NPAS3는 세포 주기, 증식, 세포사멸 및 세포 이동/침입을 조정하여 성상아교세포종의 진행을 구동하며 내피 세포의 생존력에 대한 더 많은 영향을 주는 종양 억제제의 특징을 보여준다. 임상적 중요성에 관하여, 교모세포종에서 NPAS3 발현의 부재는 생존의 상당히 음성적 예후 마커였다. 악성 교모종 세포주에서 과발현된 NPAS3는 전환을 상당히 억제시킨 반면, 감소된 발현은 보다 공격적인 성장을 상당히 유도했다(Moreira et al., 2011). NPAS3은 종양 억제제로서 인간 악성 성상아교세포종의 진행을 구동하며 생존의 음성적 예후 마커이다(Moreira et al., 2011).
뉴로리긴 4, X-연관(NLGN4X)/뉴로리긴 4, Y-연관(NLGN4Y)/뉴로리긴 2(NLGN2)/뉴로리긴 3(NLGN3)
뉴로리긴 유전자 과는 5개 멤버로 구성된다: 3q26의 NLGN1, 17p13의 NLGN2, Xq13의 NLGN3, Xp22의 NLGN4 및 Yq11의 NLGN4Y(Ylisaukko-oja et al., 2005).
뉴로리긴 4, X-연관은 세포 유착 단백질 패밀리 멤버로 신경세포 시냅스의 성숙화 및 기능에서 역할을 수행하는 것으로 보인다. 한 논문에서는 건강한 성인의 뇌에서 RT-PCR에 의한 NLGN4X mRNA의 검출을 설명하고 있다(Jamain et al., 2003). 더욱이 NLGN4X의 상향조절은 인간 배아의 신경 줄기 세포 및 인간 후각 망울에서 유래된 신경 줄기 세포로부터 설명된 바 있다(Marei et al., 2012). X-연관 NLGN4 유전자에서의 돌연변이는 자폐성 장애의 가능한 원인이며, 일부 자폐증, 아스버거 증후군 및 정신 지체 환자들에서 보고된 바 있다(Jamain et al., 2003; Laumonnier et al., 2004; Lawson-Yuen et al., 2008). NLGN4X와 암과의 연관은 거의 설명된 바 없다. 위장관 기질 종양의 경우, NLGN4X의 과발현은 노년층 사례에 비해 소아 및 젊은 성인에서 발견된 바 있다(Prakash et al., 2005).
NLGN4Y와 같은 뉴로리긴은 시냅스의 시냅스후 측에 존재하는 세포 부착 분자로서, 기능적 시냅스의 형성에 필수일 수 있다(Jamain et al., 2003). 스칼레츠키 등(2003)은 NLGN4Y의 Y-염색체 등록체인 NLGN4가 태아 및 성인의 뇌, 전립선 및 고환에서 발현되었음을 밝혔다(Skaletsky et al., 2003). 일부 데이터는 NLGN4Y의 서열 변이체가 자폐증이나 정신 지체와 연관이 있을 수 있음을 시사했다(Ylisaukko-oja et al., 2005; Yan et al., 2008). NLGN2는 배양된 신경세포에서 고도로 발현된다(Chubykin et al., 2007). NLGN 패밀리 단백질 가운데, NLGN2는 억제 시냅스 전달에 중대하며(Chubykin et al., 2007), 억제 회로 기능의 결함은 정신분열증의 주요 임상적 특징을 나타내는 작업 기억력 장애에 기여한다(Lewis et al., 2005). 뉴로리긴-2 유전자(NLGN2)의 돌연변이는 정신분열증과 연관이 있었다(Sun et al., 2011).
배양된 해마 신경세포에서는, 내인성 NLGN3이 고도로 발현되었으며 글루타메이트성 및 GABA성 시냅스에 국한되었다(Budreck and Scheiffele, 2007). 최근에 뉴로리긴이라 부르는 신경 세포 유착 분자의 과에서 점 돌연변이를 자폐 스펙트럼 장애와 정신 지체와 연관시킨 바 있다. 해마 신경세포에서 야생형 NLGN3 단백질의 과발현은 시냅스전 말단의 형성을 자극하는 반면, 질병과 연관된 돌연변이는 이러한 시냅스 기능의 손실을 초래한다(Chih et al., 2004). 더욱이 NLGN3 유전자의 돌연변이는 시냅스에 국한된 세포-유착 분자에 영향을 미치며, 시냅스 형성의 결함이 자폐증에 대한 취약성을 초래할 수 있음을 시사한다(Jamain et al., 2003).
디펩티딘-펩티다아제 3(DPP3)/바르데-비들 증후군 1(BBS1)
DPP3 유전자는 세린 단백질 분해 효소의 클랜 SC에서 S9B 패밀리의 멤버인 단백질을 인코딩한다. DPP3는 염색체 11q12-q13.1에 매핑되었다(Fukasawa et al., 2000). DPP3는 진핵 세포의 세포 내 단백질 이화작용에 관여하는 세포질 아연-엑소펩티다아제이다(Abramic et al., 2004). 종양 세포질액 DPP3의 활성도는 원발성 난소 암종에서 증가하며(Simaga et al., 2003), DPP3의 단백질 분해 활성도는 자궁내막 또는 난소 악성종양의 생화학적 지표일 수 있다(Simaga et al., 2008; Simaga et al., 1998). DPP3의 변형된 발현은 원발성 난소암종, 산화 스트레스, 통증, 염증 및 백내장 발생의 관여를 시사한다(Prajapati and Chauhan, 2011). 바르데-비들 증후군(BBS)은 유전적 장애로서, 일차적 특징은 비만, 망막색소 변성증, 다지증, 정신 지체 및 성기발육부전증이다. BBS 환자는 또한 당뇨병, 고혈압 및 울혈성 심장 질환에 대한 위험이 높다. BBS는 6개 이상의 부위가 지도화된 것으로 알려져 있다: 11q13(BBS1), 16q21(BBS2), 3p13-p12(BBS3), 15q22.3-q23(BBS4), 2q31(BBS5), 및 20p12(BBS6)(Mykytyn et al., 2003). BBS1 단백질은 눈, 사지, 심장 및 생식계 발육에서 역할을 수행할 수 있다. 이 유전자의 돌연변이는 바르데-비들 증후군의 주요 형태(제1형) 환자에서 관찰된 바 있다(Harville et al., 2010). 실험 결과에 의하면, BBS1 발현은 망막에서 일차 섬모 세포인 광수용체 등 섬모 세포로 엄격히 제한됨을 잘 보여준다(Azari et al., 2006).
유비퀴틴 특이적 펩티다아제 11(USP11)
염색체 연관된 단백질의 유비퀴틴화는 DNA 수리와 전사 조절의 많은 양상에 있어서 중요하다(Vissers et al., 2008; Weake and Workman, 2008). USP11의 전장 cDNA는 저캇 세포 라이브러리로부터 복제되었다. USP11은 면역 형광 검사에 의해 비분열 세포의 핵에 일차적으로 국한되었다(Ideguchi et al., 2002). USP-11은 유비퀴틴 특이적 프로테아제 패밀리의 멤버이며 이중쇄 절단 복구의 필수 조절인자로 출현했다(Bayraktar et al., 2013; Wiltshire et al., 2010). USP11은 BRCA2 경로 내에서 DNA 손상 복구에 참여할 수 있지만(Schoenfeld et al., 2004), p53에 대한 뚜렷한 영향은 없었다(Li et al., 2002). 낮은 USP11 발현은 유방암을 가진 여성에서 더 나은 생존 결과와 상관관계가 있었다(Bayraktar et al., 2013). 췌장관 샘암종(PDA) 세포의 내인성 USP11 mRNA 농도 증가는 USP11 억제제인 미톡산트론에 대한 감수성의 증가와 관련이 있었다. 흥미롭게도 PDA 세포에서 USP11의 침묵은 젠시타빈에 대한 감수성 또한 강화시켰다(Burkhart et al., 2013).
진핵세포 번역 개시 인자 4E(EIF4E)
EIF4E는 리보솜을 mRNA의 캡 구조로 유도하는데 연관있는 진핵세포의 번역 개시 인자이다. EIF4E는 중요한 번역 조절인자로서, 다수의 인간 고형암에서 악성 변형, 진행 및 방사선 저항성에 대한 중대한 역할을 수행한다. eIF4E 과발현은 광범위한 인간 악성 종양에서 종양 형성과 연관되었다(Yang et al., 2012a; Nasr et al., 2013; Wheater et al., 2010). EIF4E의 농도 또한 불량한 예후 및 결과와 관련된 바 있다(Carroll and Borden, 2013). EIF4E는 세포의 생존, 증식, 전이 및 혈관형성을 제어하는 다수의 종양유전자 네트워크의 번역을 조절한다. EIF4E는 핵 전달과 특정 전사체의 번역을 촉진하는 강력한 종양유전자이다(Culjkovic-Kraljacic et al., 2012).
플렉스트린 상동 도메인 함유, 패밀리 A(포스포이노시티드 결합 특이적) 멤버 4(PLEKHA4)
잠정 포스파티딜이노시톨 3,4,5-트리포스페이트-결합 모티프(PPBM)를 함유하는 단백질의 EST 데이터베이스 검색과 인간 범용 cDNA 라이브러리 선별을 통해, 다울러(Dowler) 등(2000)은 이들이 PEPP1이라고 지정한 PLEKHA4를 인코딩하는 전장 cDNA를 획득했다. 노던 블롯 분석은 어떠한 정상 조직에서도 발현을 검출하지 못했지만, 흑색종 암세포주에서 3-kb 전사체가 높은 농도로 검출되었다. PLEKHA4 유전자는 염색체 19q13.33(Dowler et al., 2000)에 매핑되었다. 플렉스트린 상동 도메인(PH 도메인)은 약 120개 아미노산의 단백질 도메인이며, 세포내 신호전달에 관여하는 광범위한 단백질에서 또는 세포 환경의 성분으로 발생한다(Musacchio et al., 1993). PH 도메인은 단백질을 각종 막으로 동원하여, 적절한 세포 구획으로 표적을 만들거나 신호 전달 경로의 다른 구획과 상호작용을 가능하게 하는 역할을 수행한다(Ingley and Hemmings, 1994). PEPP1의 PH 도메인은 N-말단 영역에 위치하며, 다른 명백한 기능적 모티프는 없다(Dowler et al., 2000).
샤페론 함유 TCP1, 소단위 7(eta)(CCT7)
샤페론 함유 t-복합체 폴리펩티드 1(CCT)은 CCT1 내지 CCT8의 8개 소단위로 구성된 세포질 분자 샤페론으로 액틴, 튜불린 및 기타 세포질 단백질들의 접힘을 돕는다(Yokota et al., 2001). 에드워드(Edwards) 등(1997)은 FISH에 의해 CCT7 유전자를 염색체 2p13에 대해 매핑했다(Edwards et al., 1997). 일부 관찰 내용에서 CCT-에타의 증가된 발현은 뒤퓌트랑 구축 환자에서 잠복 및 활성 질환의 마커이며, 섬유모세포에 의해 나타나는 수축력 증가에 필수적일 수 있음을 시사한다(Satish et al., 2013). CCT7은 말기 대장암 대비 대조 사이에서 다르게 나타났다(Nibbe et al., 2009).
핵소체 복합체 연관 4 호몰로지(사카로마이세스 세레비지애)(NOC4L)
NOC4L은 염색체 12q24.33에 매핑되었다(Milkereit et al., 2003). NOC4L의 기능은 아직 알려진 바 없으며 그 단백질은 생물학적으로 특성화되지 않았다.
코일형-코일-헬릭스-코일형-코일-헬릭스 도메인 함유 2(CHCHD2)
CHCHD2는 신규 세포 이동 결정인자로서 파악되었다. 세포 내 국소화 및 추가적 기능 연구는 CHCHD2 및 HABP1이 상호 조절함으로써 세포 이동의 균형을 유지함을 시사했다(Seo et al., 2010). CHCHD2는 미토콘드리아의 기능에 및 PKIB는 단백질 키나아제 A-의존 경로 조절에 각각 관여한다(Feyeux et al., 2012). 헌팅턴병 환자에게서 CHCHD2 발현은 정상 세포와 다르다(Feyeux et al., 2012).
SRY(성별 결정 영역 Y)-상자 8(SOX8)/SRY(성별 결정 영역 Y)-상자 9(SOX9)/SRY(성별 결정 영역 Y)-상자 10(SOX10)
Sox8은 전사 인자이며 Sox9 및 Sox10 외에도 Sox 유전자 패밀리의 그룹 E에 속한다. 이는 배아 발육의 조절 및 세포 운영의 결정에 관여한다. 이 단백질은 뇌 발육 및 기능에 관여할 수 있다. Sox8은 배아 및 성인의 뇌, 발육하는 소뇌의 미성숙한 아교 세포에서 강력히 발현된다. 또한 수모세포종에서 발현되며 조기 아교세포 마커를 제공한다(Cheng et al., 2001). Sox8은 Sox10과 DNA-의존 헤테로다이머를 형성할 수 있는 것으로 나타났다(Stolt et al., 2004).
Sox9는 성인에서 멜라닌 생성에 연관되며 암 전환과 연관되어 있다(Harris et al., 2010; Flammiger et al., 2009; Rao et al., 2010). 더욱이 이 단백질은 연골 세포외 기질(ECM) 생산 및 세포 증식을 조절하는 것으로 묘사되었으며, 세포 증식을 조절하는 광범위한 암에서 발현된다(Pritchett et al., 2011). SOX9 mRNA의 과발현은 악성 교모종 환자의 불량한 임상적 결과와 밀접한 관련이 있다(Wang et al., 2012a). Sox10 단백질은 핵-세포질간 이동 단백질로서 행동하며, 신경 능선과 말초 신경계의 발달에 중요하다. Sox10은 핍지교종세포 발달의 후기로 제한되었으며(Kordes et al., 2005) 또한 핍지교종세포의 정렬 마커로서 묘사되었다(Rousseau et al., 2006). Sox10은 RIG(방사능 유도 교모세포종)에서 일관되게 발현되지만 소아 GBM에서는 거의 발현되지 않는다(Donson et al., 2007).
사이클린-의존 키나아제 4(CDK4)/사이클린-의존 키나아제 6(CDK6)
CDK4는 Ser/Thr 단백질 키나아제 패밀리의 멤버이다. 이는 단백질 키나아제 복합체의 촉매 소단위로서 세포 주기 G1기의 진행에 중요하다. 이 키나아제의 활성은 세포 주기에서 G1에서 S기로의 전이로 제한되며 그 발현은 일차적으로 전사 수준으로 제어된다(Xiao et al., 2007). CDK4 및 CDK6 효소 및 그 조절 인자, 즉, 사이클린은 배아형성, 항상성 및 발암에서 중대한 역할을 수행한다(Graf et al., 2010). 폐암 조직에서 CDK4 단백질의 발현 수준은 정상 조직에 비해 유의하게 증가했다(P < 0.001). CDK4 발현이 더 높은 환자들은 CDK4 발현이 낮은 환자보다 총 생존 기간이 더 뚜렷이 짧았다. 다변수 분석에 의하면 CDK4 발현의 수준은 폐암 환자의 생존율에 대한 독립적인 예후 지수임을 시사한다(P < 0.001). 더욱이 CDK4 발현의 억제는 세포 주기 조절인자인 p21의 발현을 유의하게 상승시킨다(Wu et al., 2011a). 내인성 K-Ras 종양유전자를 발현하는 폐 세포에서, Cdk2 또는 Cdk6이 아닌 Cdk4의 절제는 즉각적인 노화 반응을 유도한다. 단일 Cdk4 대립형질을 발현하는 폐나 다른 K-Ras-발현 조직에서는 이러한 반응이 발생하지 않는다. 전산화 단층촬영 스캔으로 검출이 가능한 진행성 종양에서의 Cdk4 대립형질의 표적화 또한 노화를 유도하고 종양 진행을 방지한다(Puyol et al., 2010).
흑색종 항원과 F, 1(MAGEF1)
MAGE(흑색종-연관 항원) 슈퍼패밀리의 대부분 멤버들은 종양, 고환 및 태아 조직에서 발현되며, 이는 암/고환 발현 패턴(MAGE 서브그룹 I)으로 묘사된 바 있다. MAGE 서브그룹 I의 펩티드는 펩티드와 DC 백신 접종에서 성공적으로 사용되어 왔다(Nestle et al., 1998; Marchand et al., 1999; Marchand et al., 1999; Marchand et al., 1995; Thurner et al., 1999). 이와는 반대로, MAGEF1과 같은 일부 MAGE 유전자들(MAGE 서브그룹 II)은 시험된 모든 성인과 태아의 조직에서 및 난소, 유방, 경부, 흑색종 및 백혈병 등의 다수의 종양 유형에서 흔히 발현된다(Nestle et al., 1998; Marchand et al., 1999; Marchand et al., 1999; Marchand et al., 1995; Thurner et al., 1999). 그렇지만 MAGEF1의 과발현은 NSCLC(Tsai et al., 2007) 및 대만인 결장직장 암 환자의 코호트의 79%(Chung et al., 2010)에서 검출되었다.
뉴로리긴 4, X 연관(NLGN4X)
뉴로리긴 4, X 연관은 세포 유착 단백질 패밀리의 멤버로 신경세포 시냅스의 성숙화 및 기능에서 역할을 수행하는 것으로 보인다. 한 논문에서는 건강한 성인의 뇌에서 RT-PCR에 의한 NLGN4X mRNA의 검출을 설명하고 있다(Jamain et al., 2003). 더욱이 NLGN4X의 상향조절은 인간 배아의 신경 줄기 세포 및 인간 후각 망울에서 유래된 신경 줄기 세포로부터 설명된 바 있다(Marei et al., 2012). X-연관 NLGN4 유전자에서의 돌연변이는 자폐성 장애의 잠재적 원인이며, 일부 자폐증, 아스버거 증후군 및 정신 지체 환자들에 대해 보고된 바 있다(Jamain et al., 2003; Laumonnier et al., 2004; Lawson-Yuen et al., 2008). NLGN4X와 암과의 연관은 거의 설명된 바 없다. 위장관 기질 종양의 경우, NLGN4X의 과발현은 노년층 사례에 비해 소아 및 청년층에서 발견된 바 있다(Prakash et al., 2005).
액포 단백질 분류 13 상동체 B(VPS13B)
VPS13B는 시스-골지 기질 단백질 GM130과 겹치는 골지 복합체에 국한된 표재성 막 단백질로서 동정되었다. 하위세포 국소화와 일관되는 것으로, RNAi를 사용하는 VPS13B 소실은 골지 리본의 미니스택으로의 분쇄를 유발한다(Seifert et al., 2011). 콜마이넨(Kolehmainen) 등(2003)은 VPS13B로도 알려진 COH1 유전자를 염색체 8q22의 코헨 증후군 결정적 부위 내에서 동정했다(Kolehmainen et al., 2003). 유전자 VPS13B에서 기능소실 돌연변이는 보통염색체 열성 코헨 증후군을 유도한다(Seifert et al., 2011). VPS13B 및 기타 유전자들의 돌연변이는 위암 및 결장직장 암에서 수체 불안정성으로 묘사되었다(An et al., 2012).
신경세포 유착 분자(NRCAM)
NRCAM(신경세포 유착 분자)은 복수의 면역글로불린-유사 C2-유형 및 섬유결합소 유형-III 도메인을 갖는 신경세포 막횡단 세포 유착 분자이다. 이는 신경 세포의 유도, 증식 및 다발형성에 관여하는데(Grumet et al., 1991; Morales et al., 1993; Stoeckli and Landmesser, 1995; Perrin et al., 2001; Sakurai et al., 2001), 이것은 기타 IgCAM과의 동종 친화성은 물론 이동친화성 상호작용의 형성에 의해 이루어진다(Volkmer et al., 1996; Sakurai et al., 1997; Zacharias et al., 1999). NRCAM은 정상 뇌와 비교해서 역형성 성상아교세포종 및 GBM 종양 조직에서 상향조절되며, 증가된 농도는 침습성 행위와 상관관계가 있다(Sehgal et al., 1998). NRCAM에 대한 안티센스 RNA는 인간 GBM 세포의 종양형성 용량을 감소시킨다(Sehgal et al., 1999). NRCAM은 또한 인간 유두 갑상선 암종에서 mRNA 및 단백질 수준의 측면에서 과발현된다(Gorka et al., 2007). 종양에서 NRCAM mRNA의 과발현은 높은 증식 지수와 연관이 있으며, 뇌실막 세포종에서 불량한 결과와 연관이 있었다(Zangen et al., 2007). 대장암에서도, NRCAM의 과발현은 진행된 환자에서 불량한 예후와 연관이 있는 반면(Chan et al., 2011), 전립선암에서는 높은 수준의 NRCAM 발현은 양호한 종양 표현형 및 PSA 재발의 감소된 위험과 연관이 있었다(Tsourlakis et al., 2013).
RAD54 호모로그 B(사카로마이세스 세레비지애)(RAD54B)
DNA 회복 및 재조합 단백질인 RAD54B는 인간에서 RAD54B 유전자에 의해 인코딩되는 단백질이다. RAD54는 두 가닥 DNA에 결합하여 DNA 과정에서 ATPase 활성도를 나타낸다. 인간 RAD54B 단백질은 RAD54 단백질의 파라로그이며, 상동 재조합에서 중요한 역할을 한다. 상동 재조합(HR)은 DNA 이중쇄 절단(DSB)의 정확한 회복에 필수적이다(Sarai et al., 2008). 암에서 체세포 변이가 되는 것으로 알려진 유전자인 RAD54B의 억제(knockdown)는 포유동물 세포에서 염색체 불안전성(CIN)을 유발한다(McManus et al., 2009). RAD54B 상승 유전자 발현은 보다 짧은 진행까지의 기간 및 GBM 환자에서 불량한 OS와 유의하게 연관이 있다(Grunda et al., 2010).
지방산 결합 단백질 7, 뇌(FABP7)
지방산 결합 단백질(FABP)은 세포액의 14-15 kDa 단백질이며, 이는 지방산(FA) 흡수, 운반 및 표적에 관여하는 것으로 생각된다. FABP7은 발육하는 뇌와 망막에서 고도로 발현되며, 그 발현은 성인 CNS에서 상당히 감소한다(Godbout et al., 1998). 시험관 내(in vitro) 결과에 근거하여, FABP7이 발육하는 뇌의 방사성 교모계의 확립에 요구되는 것으로 제안된 바 있다(Mita et al., 2007). 정상 뇌의 경우, FABP7 단백질은 거의 검출되지 않지만, 일부 GBM에서는 중간 내지 강력한 핵 및 세포질 발현을 나타낸다. FABP7형질 주입 세포는 대조 세포보다 5배 많은 이동을 보여준다. 그러므로 특히 교모세포종에서의 FABP7 과발현과 연관된 보다 짧은 전체 생존 기간은 주위의 뇌 실질 안으로의 종양 세포의 이동과 침입 증가에 기인할 수 있다(Liang et al., 2005). 성상아교세포종에서 FABP7의 분배에 대한 추가 분석은 종양의 침윤 영역에서 FABP7 농도의 상승을 나타내며, 악성 세포의 주위 뇌 세포로의 침윤을 구동하는데 있어서 FABP7의 중요한 역할을 제안한다(Mita et al., 2007; De et al., 2012). FABP7 프로모터는 GMB에서의 과발현과 일관성 있게 저메틸화된 것으로 나타났다(Etcheverry et al., 2010).
황산 콘드로이틴 프로테오글리칸 4(CSPG4)
CSPG4(황산 콘드로이틴 프로테오글리칸)는 신혈관형성의 기능적 역할을 갖는 신생 혈관주위세포에서 필수적인 막 황산 콘드로이틴 프로테오글리칸을 대표한다(Ozerdem, 2006). 시험관 내 데이터에는 CSPG4가 종양 혈관 생성에서 중요한 역할을 한다는 많은 증거가 있다. 그러므로 CSPG4-양성 종양은 신혈관형성과 혈관 부피를 상당히 증가시키는 것으로 밝혀진 바 있으며, CSPG4는 정상적으로 상피 세포의 증식 및 혈관 형성을 억제하는 안지오텐신을 단리시키는 것으로 나타났다(Chekenya et al., 2002). CSPG4는 악성 뇌 종양의 혈관에 있는 종양 세포와 혈관주위세포 모두에 의해 과발현된다(Chekenya and Pilkington, 2002). CSPG4는 인간 교모종에서 차등적으로 발현되며, 저급 교모종에 비해 고급 교모종에서 발현이 더 높다(Chekenya et al., 1999). 종양 세포와 연관된 혈관에서의 높은 CSPG4 농도는 GBM에서 유의하게 더 짧은 생존 기간과 관련이 있었다(Svendsen et al., 2011). 두 개의 이질성 GBM 이종이식에서 CSPG4에 대한 표적은 종양 성장과 부종 수준, 혈관 형성 및 정상화된 혈관 기능을 상당히 감소시켰다(Wang et al., 2011a). 최근에 CSPG4는 교모세포종에서 유래한 줄기-유사 세포주에서 상향조절된 것으로 보고된 바 있다(He et al., 2010). CSPG4의 높은 발현은 α3β1 인테그린/PI3K 신호전달 및 그 하류 표적들의 증가된 활성화에 의해 매개되는 복수 약물의 내성과 상관 관계가 있으며 이는 세포 생존을 촉진시킨다(Chekenya et al., 2008).
ORM1-유사 1(사카로마이세스 세레비지애)(ORMDL1)
인간 유전자들(ORMDL1, ORMDL2 및 ORMDL3)은 성인과 태아 조직에서 흔하게 발현되며, 세포질 그물에서 단백질 접힘에 관여할 수 있는 ER에 고정된 막횡단 단백질을 인코딩한다. 유전체 서열 분석에 의해, 헬크비스트(Hjelmqvist) 등(2002)은 염색체 2q32.2에 대해 ORMDL1 유전자를 매핑했다(Hjelmqvist et al., 2002). ORMDL 단백질은 포유동물 세포에서 세라마이드 생합성의 일차 조절인자이다(Siow and Wattenberg, 2012). ORMDL1은 프리세닐린 1(PS1) 돌연변이와 연합하여 특이적으로 하향조절된다(Araki et al., 2008).
형질변환 산성 코일형-코일 함유 단백질 3(TACC3)
TACC3는 ch-TOG(대장 및 간 종양 과발현된 유전자) 및 동원체 섬유에서 미세관을 교차연관시키는 클라트린과의 복합체에 존재한다. TACC3은 고환, 폐, 지라, 골수, 가슴샘 및 말초 혈액 백혈구 등의 특정 증식성 조직에서 발현된다. TACC3 발현은 일부 인간 종양 유형에서 변형된다. 세포 내에서 TACC3은 중심체와 방추 미세소관 모두에 위치하지만 성상 미세소관은 아니다(Hood and Royle, 2011). TACC3 발현은 p53 발현과 상관관계가 있었으며, 그 종양이 TACC3 및 p53을 고도로 발현한 환자의 경우 두 면역 염색에 대한 저수준 발현을 갖춘 환자보다 예후가 유의하게 더 불량했다(P = 0.006). 이는 TACC3의 증가가 증식적 이점을 NSCLC에 부여하고 종양 진행에 기여할 수 있으며 또한 TACC3 발현은 NSCLC에서 임상적 결과의 강력한 예후 지표임을 시사하는 것이다(Jung et al., 2006). TACC3은 노치 신호전달 경로의 부정적인 조절인자일 수 있다(Bargo et al., 2010).
더블코리틴-유사 키나아제 2(DCLK2)
미세소관(MT)-연관 DCX 단백질은 포유동물의 대뇌 피질의 발달에 있어서 필수 역할을 수행한다. DCX에 고도로 상동성인 도메인(DC)에 의한 단백질 키나아제인 더블코르틴 키나아제 2(DCAMKL2)의 동정이 보고되었다. DCAMKL2의 과발현은 저온 유도되는 탈중합화에 대해 MT 세포 골격을 안정제시킨다. DCAMKL2의 자가인산화는 MT에 대한 이의 친화력을 강력하게 감소시킨다(Edelman et al., 2005). DCLK2는 CaMK Ser/Thr 단백질 키나아제패밀리의 멤버로 칼슘- 또는 CaM-의존성이 아니며 오히려 CRE-의존 유전자 발현을 억제한다(Ohmae et al., 2006). DCLK2는 중추 신경계에서 고도로 발현되는데(Edelman et al., 2005) 신경세포 특이적 방식으로 발현된다(Ohmae et al., 2006). 이는 발달 과정에서 증식하는 신경세포에서 발현되며 성인기에서 유사분열 후 신경세포에서 지속된다. 시냅스성 신경세포에서, DCLK2는 세포 몸체와 엑손 및 수생돌기의 말단 분절에 국한된다(Tuy et al., 2008; Edelman et al., 2005).
페카넥스-유사 3(초파리)(PCNXL3)
페카넥스-유사 단백질 3(PCNXL3)은 멀티패스 막 단백질이고; 이는 페카넥스 패밀리에 속한다. PCNXL3 유전자는 염색체 영역 11q12.1-q13에 매핑되었다. 신규한 세 개의 인간 종양 특이적 변위 변곡점은 마커 D11S4933과 D11S546 사이의 염색체 11q13 영역에 위치했다. 그러므로 PCNXL3은 11q13-연관된 질병 유전자일 수 있다(van et al., 2000).
디하이드로피리미디나아제-유사 4(DPYSL4)
디하이드로피리미디나아제-유사 단백질 4(DPYSL4)는 해마 신경세포 발육의 알려진 조절인자이다. DPYSL4는 치배 형태 형성 동안 치아 상피 세포의 성장 조절, 분극 및 분화에 관여한다(Yasukawa et al., 2013). 일부 연구에서는, 미세관의 중합 억제를 통한 신경돌기의 외성장 가능성의 완화에 대한 DPYSL4의 역할을 보여주었으며, 또한 신경세포사 이전의 핵 농축 동안 비멘틴과의 신규한 연관 또한 밝혀냈다(Aylsworth et al., 2009). p53 종양 억제 유전자는 매우 다양한 종양에서 빈번히 변이되는데, 유전자 무결성의 유지에서 중요한 역할을 수행한다. DPYSL4의 mRNA 및 단백질 발현 모두 p53-숙련 세포에서 항암제에 의해 고유하게 유도되었다. DPYSL4는 DNA 손상에 반응하여 p53에 의해 제어되는 세포사멸-유도 인자이다(Kimura et al., 2011).
인슐린-유사 성장 인자 2 mRNA 결합 단백질 3(IGF2BP3)
IGF2BP3은 인슐린-유사 성장 인자 2 mRNA 결합 단백질 패밀리의 멤버이며, mRNA 국소화, 회전 및 번역 제어에 관련된다. 이 단백질은 몇몇 KH(K-상동성) 도메인을 포함하는데 이들은 RNA 결합에 중요하며 RNA 합성 및 대사에 관여하는 것으로 알려져 있다. 과발현은 주로 배아 발육 동안 발생하며 일부 종양에 대해 묘사된 바 있다. 그러므로 IGF2BP3은 종양태아성 단백질로 간주된다(Liao et al., 2005). IGF2BP3은 IGF-II 단백질 합성의 강화 및 CD44 mRNA의 안정제를 통한 세포 침입의 유도에 의해 종양 세포 증식을 촉진시킬 수 있다(Findeis-Hosey and Xu, 2012). 더욱이 IGF2BP3의 발현은 인간의 여러 신생물에 대해 연구되어 이동, 침입, 세포 생존 및 종양 전이를 매개한다는 증거가 늘고 있으며(Jeng et al., 2009; Kabbarah et al., 2010; Li et al., 2011; Liao et al., 2011; Lu et al., 2011; Hwang et al., 2012; Samanta et al., 2012) 또한 혈관형성에도 관여할 수 있다(Suvasini et al., 2011; Chen et al., 2012). 폐 선암종에서, IGF2BP3 발현은 중간이나 낮은 정도로 분화된 선암종에서 보다 높은 빈도로 검출될 수 있는데, 이는 공격적인 생물학적 거동과 연관이 있을 수 있다(Findeis-Hosey et al., 2010; Beljan et al., 2012; Findeis-Hosey and Xu, 2012).
드로셔, 리보뉴클레아제 제III형(드로셔)
드로셔는 microRNA(miRNA) 또는 RNAi 경로의 일환으로써 상보적 전령 RNA(mRNA)의 분할을 유도하기 위해 RNA-유도 침묵 복합체(RISC)와 상호작용으로써 광범위한 기타 유전자들을 조절하는 세포에 의해 자연적으로 발현되는 짧은 RNA 분자의 처리 개시에 책임이 있는 클래스 2 RNase III 효소이다. microRNA 분자는 pri-miRNA로 알려진 긴 RNA 초기 전사체로서 합성되며, 이는 드로셔에 의해 분할되어 pre-miRNA로 알려진 약 70개 길이의 염기쌍으로 된 특이적인 줄기-루프 구조를 생성한다(Lee et al., 2003). 드로셔는 마이크로프로세서 복합체로 불리는 단백질 복합체의 일부로 존재하며, 이중 가닥 RNA 결합 단백질 파셔(또는 DGCR8) 또한 포함하는데(Denli et al., 2004), 이는 드로셔 활성도에 필수적이며 적합한 처리에 요구되는 pri-miRNA의 단일가닥 단편들을 결합시킬 수 있다(Han et al., 2006). 인간 드로셔는 리보솜 RNA 전구체의 처리에 관여하는 핵 dsRNA 리보뉴클레아제로서 동정된 2000년에 복제되었다(Wu et al., 2000). 드로셔는 최초로 동정되어 복제된 인간 RNase III 효소이다. miRNA의 처리와 활성도에 참여하는 다른 두 가지 인간 효소는 다이서(Dicer) 및 아르고노트(Argonaute) 단백질이다. 드로셔와 파셔 모두 pre-miRNA에서 pre-miRNA로의 처리가 발생하는 세포 핵에 국지화된다. 이후 후자의 분자는 세포질에서 RNase 다이서에 의해 성숙한 miRNA로 추가 처리된다(Lee et al., 2003). 드로셔 및 다른 miRNA 처리 효소들은 암 예후에 중요할 수 있다(Slack 및 Weidhaas, 2008).
ATP-결합 카세트, 서브패밀리 A(ABC1), 멤버 13(ABCA13)
인간에서 막횡단 수송체의 ATP-결합 카세트(ABC) 과는 적어도 48개의 유전자와 7개의 유전자 서브패밀리를 갖는다. 예측하는 ABCA13 단백질은 5,058개의 아미노산 잔기로 구성되어 현재까지 설명된 가장 긴 ABC 단백질이다(Prades et al., 2002). 나이트(Knight) 등은 ABCA13 단백질이 생쥐와 인간의 태아 및 피질에 발현되며, 두 영역 모두 정신분열증과 양극성 장애와 연관되어 있다고 판단했다(Knight et al., 2009). ABCA13 유전자 염색체 7p12.3에 위치하는데, 이는 췌장에 영향을 미치는 유전적 질병(슈와크만-다이아몬드 증후군)을 포함하는 영역은 물론 T 세포 종양 침습 및 전이(INM7)에 연관된 위치이므로, 이러한 병리의 위치 후보이다(Prades et al., 2002).
사이클린 B1(CCNB1)
CCNB1은 유사분열에 관여하는 조절 단백질이다. 이 유전자 생성물은 p34(cdc2)와 복합체를 이루어 성숙화-촉진 인자(MPF)를 형성한다(Zhao et al., 2006; Gong and Ferrell, Jr., 2010). 사이클린 B1 및 G1은 p53과 협력함으로써, 활성 세포 주기에서 주요 체크포인트인 G2/M 전이를 조절한다(Li et al., 2003). 이후의 독립적 조사에 의해, 종양 진행 및/또는 불량한 임상적 예후의 경향과 관련 있는 CCNB1 (과)발현을 다양한 암에서 파악했으며, 그 예는 결장직장 암종(Li et al., 2003), RCC(Tsavachidou-Fenner et al., 2010), 유방암(Aaltonen et al., 2009; Agarwal et al., 2009; Suzuki et al., 2007; Chae et al., 2011), 수모 세포종(de et al., 2008), 편평 세포 폐암(Kettunen et al., 2004), 위장관 기질 종양(Koon et al., 2004), 식도 편평 세포 암종(Song et al., 2008), 후두 편평 세포 암종(Dong et al., 2002), 구강 설 편평 세포 암종(Harada et al., 2006), 부신피질 암종(Soon et al., 2009), 폐선암종(Wikman et al., 2002), 비소세포 폐암(Cooper et al., 2009), 경부암(Zhao et al., 2006), 프로락틴 뇌하수체 종양(Raverot et al., 2010) 및 신장 세포 암종(Ikuerowo et al., 2006)이다.
CCR4-NOT 전사 복합체, 소단위 1(CNOT1)
인간 CCR4-NOT 데아데닐라제 복합체는 적어도 9개의 효소 및 비효소 소단위들로 구성된다. CNOT1은 CCR4-NOT 복합체의 효소 활성도 표시에 있어서 중요한 역할을 하며, 따라서 mRNA 탈아데닐화 및 mRNA 붕괴의 제어에 중대하다. CNOT1 소실은 CCR4-NOT 복합체를 구조적으로 및 기능적으로 저하시키며 mRNA의 안정제를 유도하는데, 이는 ER 스트레스-매개된 세포사멸을 유발하는 번역의 증가를 초래한다. 이토(Ito) 등은 CNOT1이 CCR4-NOT 데아데닐라아제의 활성도를 확보하여 세포 생존력에 기대한다고 결론을 지었다(Ito et al., 2011). 유방암 세포에서 내인성 CNOT1 또는 기타 CCR4-NOT 소단위의 siRNA-매개 소실은 ERα 표적 유전자의 조절 해제(ERα 표적 유전자인 TTF1 및 c-Myc의 유도 증가)를 초래한다. 이러한 발견 내용은 암과 관계 있는 분자적 경로의 이해와 관련된 핵 수용체 신호전달의 전사 억제인자로서 인간 CCR4-NOT 복합체의 기능을 정의한다(Winkler et al., 2006).
배큘로바이러스성 IAP 반복-함유 5(서바이빈)(BIRC5)
BIRC5(서바이빈)은 세포사멸 단백질(IAP) 억제제 패밀리의 멤버이다. 서바이빈은 복수의 암 객체에서 과발현된다. 그러므로 일반적으로 서바이빈의 과발현은 더 짧은 전체 생존 기간 및 더 높은 악성 등급과 연관 있는 것으로 사료된다.
서바이빈의 농도 상승은 GBM 및 성상아교세포종으로부터 분리된 암 줄기 세포에서 보고된 바 있다(Jin et al., 2008). 뇌 교모종에서 서바이빈 과발현은 악성 증식, 항-세포사멸사 및 혈관형성에서 중요한 역할을 수행할 수 있음이 제시되었다(Zhen et al., 2005; Liu et al., 2006). 몇몇 분석을 통해 교모세포종에서 서바이빈의 발현과 생존에 대한 영향을 연구했다. 요약하면, 서바이빈 발현, 특히 성상 세포종의 경우 핵 및 세포질에서의 동시 발현은 서바이빈-음성 종양 환자와 비교할 때 악성 등급(교모세포종에서 가장 높은 서바이빈 발현) 및 더 짧은 전체 생존 시간과 유의하게 연관이 있었다(Kajiwara et al., 2003; Saito et al., 2007; Uematsu et al., 2005; Mellai et al., 2008; Grunda et al., 2006; Xie et al., 2006; Sasaki et al., 2002b; Chakravarti et al., 2002). 추가적으로 서바이빈 발현은 새로 진단된 종양과 비교할 때 재발 GBM에서 유의하게 증가했다(Guvenc et al., 2013). 서바이빈은 암 요법을 위한 유망한 표적이므로, 서바이빈에서 유래된 펩티드를 사용한 연구에서 서바이빈은 종양 환자에 있어서 CD8+ T 세포-매개 반응을 이끌어 냄으로써 면역원성임을 보여주었다. 그 밖에 서바이빈은 같은 환자에서 말초혈액 림프구의 CD4+ T 세포 반응성을 특이적으로 자극했다(Casati et al., 2003; Piesche et al., 2007).
막횡단 단백질 255A(TMEM255A)
TMEM255A 유전자(일명 FAM70A)는 염색체 Xq24에 위치한다(Ross et al., 2005). TMEM255A의 기능은 아직 알려진 바 없다. 그러나 TMEM255A가 매핑된 염색체 Xq24는 일부 암/고환(CT) 유전자의 위치이며, 이 유전자들은 일부 종양에서 발현된다(Chen et al., 2006). 더욱이 HER2-양성 유방암의 80%에서 Xq24에서의 결손이 관찰되었으며, 이는 암과 관련하여 과거에 알려진 유전자들은 물론 신규 유전자들을 담당한다(Tina et al., 2012).
ST8 α-N-아세틸-뉴라미나이드 α-2,8-시알산전이효소 5(ST8SIA5)
생쥐 Siat8e의 cDNA 식별로부터 생성된 DNA 프로브 및 인간 뇌 조직에서 모두 mRNA의 5-프라임 RACE를 사용하여 인간 뇌 cDNA 라이브러리를 선별하여, 킴(Kim) 등(1997)은 인간 SIAT8E(α-2,8-시안산전이효소 V, ST8SIA5)를 복제했다. 태아 및 성인 뇌에서 노던 블롯 분석을 통해 11- 및 2.5-kb 전사체 및 발현을 검출했다(Kim et al., 1997). ST8SIA5는 제 II형 막 단백질이며 골지 기관에 존재할 수 있다. 인코딩된 단백질은 당전이효소과 29의 멤버이며, GD1c, GT1a, GQ1b 및 GT3으로부터 강글리오시드 GD1a, GT1b, GM1b 및 GD3을 각각 합성하는데 관여할 수 있다(Kim et al., 1997). 강글리오시드는 신경세포 분화 과정에서 중요한 역할을 수행한다. 강글리오시드 수준의 조절은 신경 세포 분화의 유도와 관련있다. 일부 결과에 의하면, ST8Sia5 유전자는 강글리오시드 GQ1b를 증가시키며 ERK1/2 MAP 키나아제 경로를 통해 신경세포 분화를 향상시킨다(Kwak et al., 2011).
서열 유사성 120C패밀리(FAM120C)
서열 유사성 120C 패밀리는 FAM120C 유전자에 의해 인코딩되는 인간의 단백질이다. FAM120C는 가능한 막횡단 단백질을 인코딩하며, 돌연변이와 결손이 지적 장애 및 자폐증과 연관된 바 있는 영역에 존재한다(Qiao et al., 2008). FAM120C는 일부 성인과 태아의 조직에서 낮은 수준으로 발현되는 것으로 보인다. 이는 16개의 코딩 엑손으로 구성되며 Xp11.22에 매핑된다. FAM120C 유전자의 5-프라임 말단은 CpG 섬 내부에 위치한다(Holden and Raymond, 2003).
지방산 결합 단백질 7, 뇌(FABP7)
지방산 결합 단백질(FABP)은 세포액의 14 내지 15 kDa 단백질이며, 이는 지방산(FA) 흡수, 운반 및 표적에 관여하는 것으로 생각된다. FABP7은 발육하는 뇌와 망막에서 고도로 발현되며, 그 발현은 성인 CNS에서 상당히 감소한다(Godbout et al., 1998). 시험관 내 결과에 근거하여, FABP7이 발육하는 뇌의 방사성 교모계의 확립에 요구되는 것으로 제안된 바 있다(Mita et al., 2007). 정상 뇌의 경우, FABP7 단백질은 거의 검출되지 않지만, 일부 GBM에서는 중간 내지 강력한 핵 및 세포질 발현을 나타낸다. FABP7형질 주입 세포는 대조 세포보다 5배 많은 이동을 보여준다. 그러므로 특히 교모세포종에서의 FABP7 과발현과 연관 있는 보다 짧은 전체 생존 기간은 주위의 뇌 실질 안으로의 종양 세포의 이동과 침입 증가에 기인할 수 있다(Liang et al., 2005). 성상아교세포종에서 FABP7의 분배에 대한 추가 분석은 종양의 침윤 영역에서 FABP7 농도의 상승을 나타내며, 악성 세포의 주위 뇌 세포로의 침윤을 구동하는데 있어서 FABP7의 중요한 역할을 제안한다(Mita et al., 2007; De et al., 2012). FABP7 프로모터는 GMB에서의 과발현과 일관성 있게 저메틸화된 것으로 나타났다(Etcheverry et al., 2010).
아연 핑거 단백질 3(ZNF3)
ZNF 과는 전사 조절의 다양한 양상에 관여하는 분자로 구성된 대형 군을 대표한다. ZNF3 유전자는 염색체 7q22.1에 대하여 매핑되었다. 다양한 조직 기원의 세포주에서 유래한 mRNA 군에 대한 노던 블롯 분석 결과는 3.5-kb 전사체의 흔한 발현을 보여주었다(Pannuti et al., 1988). ZNF3 등 아연 핑거(ZNF) 패밀리 유전자들에서 다수 돌연변이가 HNSCC(두경부 편평 세포) 암종에서 발견되었다(Nichols et al., 2012; Nichols et al., 2012). HRneg/Tneg 유방암에서는 ZNF3이 조기의 전이 결과에 대한 결과 예측자로서 파악되었다(Yau et al., 2010).
세포질 분열의 헌신자 7(DOCK7)
DOCK7(세포질 분열의 헌신자 7)은 또한 Zir2로도 알려져 있으며, 세포내 신호전달 망에 관여하는 대형(약 240 kDa) 단백질이다. 이는 소형 G 단백질의 활성인자로서 기능하는 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자들(GEFs)의 DOCK 패밀리의 DOCK-C 서브패밀리의 멤버이다.
DOCK7 발현은 신경세포에서 보고된 바 있다(Watabe-Uchida et al., 2006), (Yamauchi et al., 2008). DOCK7은 최종 당화 산물(RAGE)-매개 세포 이동을 위한 수용체의 필수적인 하류 조절인자로서 기능한다(Yamamoto et al., 2013). DOCK7은 또한 ErbB2의 세포간 기질로서 기능하며 슈반(Schwann) 세포 이동을 촉진한다(Yamauchi et al., 2008). 더욱이 DOCK7은 과발현 시 복수의 축삭 형성을 유도하며 억제되면 축삭 형성을 방지한다(Watabe-Uchida et al., 2006). DOCK7과 TACC3의 상호작용은 피질 발육 시 중간기의 핵 이동 및 방사 교모종 전구세포(RGCs)로부터 신경세포의 발생을 제어한다(Yang et al., 2012b).
비특성화 LOC728392(LOC728392)
LOC728392는 염색체 17p13.2에 위치하는 비특성화된 단백질이다(Kim et al., 2006), (Zody et al., 2006). 현재까지 단백질 LOC728392에 대한 더 이상의 특성화는 없었다.
프라자 링 핑거 2, E3 유비퀴틴 단백질 라이게이스(PJA2)
*PJA2는 널리 발현되는 RING(매우 흥미로운 유전자) 단백질이다. RING-핑거 단백질은 시스테인이 풍부한 아연-결합 도메인을 포함하여, 전사 억압과 유비퀴틴화에 중요한 고분자 골격의 형성에 관여한다(Sasaki et al., 2002a). 신경 조직에서, PJA2는 세포질 그물과 골지를 구성하는 막의 세포질 쪽에 및 축삭세포체 시냅스의 시냅스후 치밀질 영역에 주로 분포된다(Nakayama et al., 1995). 인간 GBM 시료에서는, PJA2의 높은 단백질 및 mRNA 발현이 검출된 반면, 인간 성상아교세포종에서의 발현은 낮았다. 이는 PJA2 발현과 악성이 상관관계가 있음을 시사하며, 축적된 PJA2에 의한 하마 종양 억압인자 경로의 저해에 기반한다(Lignitto et al., 2013).
HEAT 반복 보유 1(HEATR1)
인간 HEATR1은 UTP10으로도 불리며 BAP28이라고 하는 비특성화된 단백질로서 동정된 바 있다. 변이체 bap28 대립입자에 대해 동종접합인 제브라피시 배아는 주로 중추신경계에서 과다한 세포사멸을 나타낸다(Azuma et al., 2006). 인간 HEATR1(UTP10)은 염색체 1q43에 매핑되었다. 내인성 인간 UTP10은 재조합 단백질에 반해 상승된 친화도-순화시킨 항체를 갖는 HeLa 세포를 염색하여 밝혀진 바와 같이 핵소체에서 명백히 강화된다. UTP10은 rDNA 반복에 걸쳐 크로마틴에 결합하는 것으로 제안된 바 있다(Prieto and McStay, 2007).
당단백질 M6B(GPM6B)
GPM6B는 단백지질 단백질과에 속하며, 이는 신경세포에서 및 뇌의 핍지교세포종에서 발현된다. 이 단백질과의 생물학적 기능에 관한 지식은 드물며, 대부분의 뇌 영역에서의 발현은 이 단백질들이 막 수송과 세포대세포 통신과 같은 세포의 살림 기능에 관여한다는 가설을 초래한 바 있다(Fjorback et al., 2009). 종합하면 GPM6B는 신경계 발육에 있어서 기능을 갖는 것으로 사료된다(Mobius et al., 2008). GPM6B는 우선 신경세포와 핍지교세포종에서 주로 발현되는 뇌 특이적 단백질로서 설명되지만(Werner et al., 2001; Yan et al., 1993), 일부 최근의 연구에서는 다수의 세포 유형과 조직에 걸쳐 광범위한 분포를 잘 보여준다(Charfi et al., 2011). GPM6B 발현은 일부 종양 객체에서 설명된 바 있다. 예를 들면, 이는 B 백혈병-특이적으로 기대되며, 이러한 종양에서 상당한 과발현을 나타냈다(Charfi et al., 2011). 난소암의 경우, GPM6B는 환자의 혈청에서 검출가능하며, 조기 마커에 대한 가장 유망한 후보에 속한다(Urban et al., 2011).
크럼 호몰로그 1(초파리)(CRB1)
CRB1 유전자는 초파리 크럼 단백질과 유사한 단백질을 인코딩하며 포유동물 광수용체의 내부 단편에 제한된다. 중증 형태의 열성 유전 망막 색소변성증에 관여하는 유전자를 은신시키는 영역인 1q31-q32.1에 매핑된 CRB1(den Hollander et al., 1999). 펠리카(Pellikka) 등(2002)은 CRB1이 광수용체 선단부 원형질막의 상응하는 서브도메인에 국지화됨을 보여주었다(Pellikka et al., 2002). CRB1은 인간 망막에서 세포내 단백질 골격을 조직할 수 있다(den Hollander et al., 2001). CRB1 유전자에서의 돌연변이는 중증 형태의 망막 색소변성증, RP12, 및 레베르 선천 흑암시와 연관이 있다(Coppieters et al., 2010); (Walia et al., 2010); (van de Pavert et al., 2007). 자콥손(Jacobson) 등(2003)은 CRB1 질병 경로가 자연적으로 발생하는 세포사멸을 중단시킴으로써 정상 인간 망막 조직의 발육을 방해한다고 제안했다(Jacobson et al., 2003).
핍지교종세포 직계성 전사 인자 2(OLIG2)
핍지교종세포 직계성 전사 인자 2(OLIG2)는 기초적인 헬릭스-루프-헬릭스 전사인자의 OLIG 패밀리의 멤버이다. 이것은 발육 동안 등쪽 척수에서 핍지교종세포와 운동 신경세포의 세포 운명 특정제에서 중요한 역할을 수행한다(Lu et al., 2000; Takebayashi et al., 2000). OLIG2는 미만 교모종(핍지신경모종, 성상아교세포종, 교모세포종 및 혼합 교모종)의 범용 마커이다(Lu et al., 2001), (Marie et al., 2001). Olig2는 간섭 RNA에 의한 이의 침묵은 종양 전파를 폐지하므로 핍지신경모종의 악성 유지에 엄격히 요구된다(Appolloni et al., 2012). OLIG2 전사 수준은 성상아교세포종의 악성 진행과 상관관계가 있을 수 있다고 제안된 바 있다(Bozinov et al., 2008). 더욱이 OLIG2-양성 교모종-개시 세포가 치료 표적으로 제안되었다(Fu et al., 2013). 최근의 연구에서는 뇌암의 줄기 세포가 동정된 바 있다. 이 연구에서는 성인 뇌의 배아 구역에서 C형 변화증식 세포를 연상시키는 인간 교모종 줄기 및 전구 세포로부터 CNS-제한 전사 요인인 OLIG2의 발현이 관찰되었다. 이러한 발견 내용들은 Olig2-조절 직계성-제한 경로를 정상 및 발종양성 CNS 줄기세포의 증식에 중요하다고 확인하였다(Ligon et al., 2007).
베르시칸(VCAN)
VCAN 유전자는 아그레칸/베르시칸 프로테오글리칸과의 멤버이다. 인코딩되는 단백질은 커다란 황산 콘드로이틴 프로테오글리칸이며, 세포의 기질의 주요 성분이다. 이 단백질은 세포 부착, 증식, 이동 및 혈관형성에 관여하며 조직 형태 발생과 유지에서 중심 역할을 수행한다.
VCAN은 다양한 조직에서 발현된다. 조직 발육의 초기 단계에서 고도로 발현되며, 그 발현은 조직 성숙화 이후 감소한다. 그 발현은 또한 상처 치유와 종양 성장에서 상승한다. 성인 인간 뇌에서, VCAN은 전두엽의 백색질 소뇌, 뇌간 및 척수에서 주로 발현되며 성상아교세포와 핍지교종세포와 밀접한 연관이 있다(Ghosh et al., 2010). VCAN은 흑색종과 전립선 등 다수의 악성 종양에서 발견되었으며, 그 아이소형은 복수의 인간 암에서 차등 발현을 보인 바 있다(Ghosh et al., 2010; Zheng et al., 2004). 주위의 정상 조직보다 종양 조직에서 더 높은 VCAN 발현이 세 가지 고등급 인간 뇌 종양의 분석으로 관찰되었다(Zheng et al., 2004).
스페르민 산화 효소(SMOX)
SMOX는 유발 가능 FAD-의존성 폴리아민 산화효소로서 스페르민을 산화하며 스페르미딘, 과산화수소(H2O2) 및 3-아미노프로판일을 생성한다(Wang et al., 2001). SMOX는 염색체 20p13에 위치하며 몇 가지 스플라이스 변이체를 인코딩한다(Murray-Stewart et al., 2002). SMOX는 유발가능 효소이며, 그 탈조절은 폴리아민 항상성을 변형시킬 수 있고 폴리아민 이화작용의 조절곤란은 흔히 중증의 질병 상태와 연관이 있다. SMOX는 약물 반응, 세포사멸, 스트레스성 자극에 대한 반응 및 암 등 일부 병리학적 상태의 병원학에 참여한다(Cervelli et al., 2012). 상승된 세포의 폴리아민 수준은 GBM 세포 등 암 세포의 공통된 특징으로, 폴리아민 경로는 폴리아민 생합성을 억제하거나 폴리아민 이화작용 억제제를 활성화할 수 있는 치료 표적으로 탐색되어 왔다(Jiang et al., 2007).
세포외낭 복합체 성분 7(EXOC7)
EXOC7은 세포외낭의 구성요소이며, 세포외 배출에 필수적인 진화적으로 보존된 팔황체 단백질 복합체이다(Kee et al., 1997). 세포외낭은 세포 표면 팽창 및 단백질 분비를 위한 형질막의 특이적 도메인에 있는 분비 소포를 표적으로 한다(Zuo et al., 2006). 인간-설치류 잡종 패널의 분석에 대해, 키쿠노(Kikuno) 등(1999)은 염색체 17q25에 대해 EXOC7 유전자를 매핑했다(Kikuno et al., 1999). 세포외낭은 소포 교통 구체적으로 소포 접합 전 후-골지 소포의 형질막에 대한 테더링과 공간 표적화에 관여한다. 이것은 세포외배출 등 다수의 세포 과정 및 세포 이동과 성장에 연관되어 있다(Zuo et al., 2006). 세포외낭은 국소 분해 부위에서 MMP 분비의 매개 및 액틴 역학의 조절을 통해 세포 침입에서 중요한 역할을 수행한다(Liu et al., 2009). EXOC7을 포함하는 14개 유전자의 조합은 조기의 호르몬 수용체-음성 및 삼중-음성 유방암에서 결과 예측자일 수 있다(Yau et al., 2010).
류신 지퍼, 추정 종양 억제제 1(LZTS1)
1999년 아이쉬(Ishii) 등은 FEZ1/LZTS1 유전자를 8p22에 위치한 종양 억제 유전자 후보로서 동정했다(Ishii et al., 1999). LZTS1은 인간 종양 세포주의 성장을 조절하는 것을 보여주었으며, 그러한 상황에서 세포-주기 조절인자와 물리적으로 상호작용한다(Cabeza-Arvelaiz et al., 2001; Ishii et al., 2001; Vecchione et al., 2002). LZTS1을 LZTS1-음성 암 세포에 도입한 결과 종양 발생의 억제와 감소된 세포 성장 및 세포 주기의 S-G2/M 후기에서 세포의 축적을 초래했다(Ishii et al., 2001). FEZ1/LZTS1(FEZ1) 유전자는 인간 암에서 흔히 변경되는데, 전립선암(Hawkins et al., 2002), 폐암(Lin et al., 2013), 방광암(Abraham et al., 2007) 및 유방암(Chen et al., 2009)이 포함된다. 빈번한 발현의 감소 및 빈번하지 않은 돌연변이가 보고되었다. LZTS1 프로모터에서 CpG 섬의 과발현은 빈번한 것으로 나타났으며, 암 세포에서 LZTS1 발현의 감소에 대한 책임 가능성이 있다(Toyooka et al., 2002; Vecchione et al., 2001).
지방산 불포화효소 2(FADS2)
지방산 불포화효소 2(FADS2)는 델타(6) 지방산 불포화효소(D6D)로도 알려져 있으며, 인간에서 FADS2 유전자에 의해 인코딩되는 효소이다. 지방산 불포화효소 2는 지방산 불포화효소(FADS) 유전자과의 멤버이다. 마르콰르트(Marquardt) 등(2000)은 FADS2 유전자를 염색체 11q12-q13.1 상에서 동정했다(Marquardt et al., 2000). FADS2는 장쇄 고도불포화 지방산의 포유동물 합성에서 속도 제한 효소이다(Nwankwo et al., 2003). 암 열점 11q13 유전자 자리에서의 FADS2 기능의 손실은 지질 신호전달 전구체 합성을 특이한 아이코사노이드 지방산으로 전환시킨다(Park et al., 2011). FADS2는 간세포 암종에서 상향조절된다(Muir et al., 2013). FADS2는 유방암(Pender-Cudlip et al., 2013) 의 병생성에 관여할 수 있으며, 델타-6 불포화효소의 발현은 유방암의 공격성과 연관이 있다(Lane et al., 2003). 더욱이 델타-6 불포화효소 활성도를 억제하면 생쥐에서 종양 성장을 억제한다(He et al., 2012).
막횡단 단백질 231(TMEM231)
TMEM231은 막횡단 단백질은 인코딩하며, 섬모와 형질막 사이의 확산 장벽의 형성에 관여하는 B9 복합체의 구성요소이다. TMEM231은 셉틴 2(Sept2)-조절 방식으로 편모 내 운반 이전에, 및 이와 독립적으로 기저 소체에 국한된다(Chih et al., 2012). TMEM231에서의 돌연변이는 여러 섬모 질환을 유발한다. 이는 세포 항상성과 기관 발육에 있어서 필수적인 역할을 수행하는 세포골격의 부속기인 일차 섬모의 기능 이상에 의해 초래되는 다기관 체계 질환들이다(Nigg and Raff, 2009; Hildebrandt et al., 2011). 아주 최근에 3명의 주버트 증후군 환자에서 TMEM231의 두 돌연변이에 대한 복합 이형접합성이 동정되었으며, 이 증후군은 뚜렷한 중간후뇌의 기형, 눈돌림 실행증, 호흡 이상 및 발육 지연으로 특징지워지는 상당한 상염색체 열성 질환이다. JBTS는 유전적으로 이질적이며, 부동 섬모의 형성과 기능에 요구되는 유전자들이 관여한다(Parisi and Glass, 1993; Srour et al., 2012).
아케트-스큐트 복합체 호모로그 1(초파리)(ASCL1)
아케트-스큐트 복합체 호모로그-1(ASCL1; 인간에서는 hASH1로도 불림)은 CNS, 자율 신경계, 부신 수질, 갑상선, 폐와 전립선 등을 포함하는 다수의 조직에서 신경과 신경내분비(NE) 전구 세포의 조기 발육을 위한 기본적 헬릭스-루프-헬릭스 전사 인자이다(Guillemot et al., 1993; Borges et al., 1997; Fode et al., 2000; Ball, 2004; Nakada et al., 2004; Pattyn et al., 2006; Miki et al., 2012; Righi et al., 2012). 이것은 교감 신경계의 조기 발육에 매우 중요하므로, 배아형성 동안 교감 신경모세포에서 일시적으로 발현된다(Soderholm et al., 1999). 더욱이 ASCL1은 비성숙한 후각 신경세포에서 발현되며 그 발육에 요구된다(Carney et al., 1995). ASCL1은 GBM CSC의 유지 및 생체 내 종양발생에 필수적이다(Rheinbay et al., 2013). 교모종으로부터 유도되는 신경세포(iN)는 3가지 전사 인자, Ascl1, Brn2 및 Ngn2(ABN)에 의한 감염으로 효율적으로 생성될 수 있다. 이것은 교모종 세포사, 감소된 종양 성장 및 인간 교모종 세포의 기능성 신경세포로의 전환을 야기한다(Zhao et al., 2012b). 노치 신호전달을 억제하면 진행성 성상아교세포종에서 ASCL1의 상향조절이 수반된다(Somasundaram et al., 2005). ASCL1은 대다수의 원발성 신경모세포종과 신경모세포종 세포주에서 발현된다(Axelson, 2004). 신경모세포종의 분화 시, ASCL1-경로는 IGF2의 상향조절에 대한 책임이 있다(Li et al., 2011b).
Na+/K+ 운반 ATPase 상호작용 1(NKAIN1)/Na+/K+ 상호작용 ATPase 상호작용 2(NKAIN2)/Na+/K+ 운반 ATPase 상호작용 4(NKAIN4)
NKAIN 단백질 1 내지 4는 신경세포에 국한되며 Na,K-ATPase β1 소단위와 상호작용하는 진화적으로 보존된 막횡단 단백질의 과이다. NKAIN2, 3 및 4의 세 가지 스플라이스 변이체가 있는 반면 한 가지 형태의 NKAIN1만이 발견되었다. 네 패밀리 멤버 모두 생쥐 뇌에서 고도로 발견되며 각기 다른 뇌 영역에서 뚜렷하고 중복되는 발현이 있다. 흥미롭게도 NKAIN4의 짧은 스플라이스 변이체는 뇌- 및 고환-특이적이며, 더 기다란 NKAIN4의 스플라이스 변이체는 흔하게 발현된다(Gorokhova et al., 2007). NKAIN1-SERINC2 유전체 영역에는 SNP가 은닉하는데, 이들은 유럽인에서 알코올 의존성과 보통 연관된다(Zuo et al., 2013). NKAIN2 유전자의 파괴는 신경 장애 즉, 발달 지체와 재발하는 감염이 있는 어린이에서 연구된 바 있다(Bocciardi et al., 2005; Yue et al., 2006). 그 밖에 NKAIN2의 SNP는 신경질(Calboli et al., 2010) 및 알코올 의존성(Wang et al., 2011b)과 연관된 바 있다. 인간 NKAIN2는 최초로 유전자로서 동정되었으며, 이는 T 세포 림프균/백혈병 세포주인 HT-1 및 ATN-1에서 변곡점 영역 6q21-22 내에서 파괴된다(Tagawa et al., 2002). 또한 이것은 전립선암의 억압 유전자의 후보일 수 있지만 이러한 사안에 대한 어떠한 기능적 실험 데이터도 없는 상태이다(Mao et al., 2011).
프로토카데린 γ 패밀리(PCDHG-과)
프로토카데린(PCDH)은 중추 신경계에서 주로 발현되는 카데린의 하위군이다(Kallenbach et al., 2003; Hirayama and Yagi, 2006). 이 γ 유전자 군집(PCDHG-)에는 3개의 서브패밀리로 나뉘는 22개의 유전자가 포함된다. γ 유전자 군집은 면역글로불린 군집과 유사하게 조직된다: 엑토도메인(카데린 반복, 막횡단 및 근위 세포 내 도메인)을 인코딩하는 22가지 가변 엑손들 및 세포질 도메인의 원위 모이어티를 인코딩하는 3가지 항상 엑손들은 RNA 스플라이싱에 의해 연결된다(Morishita and Yagi, 2007; Wang et al., 2002). PCDH는 발육 조직의 형태발생 및 시냅스 형성과 조정(Frank and Kemler, 2002) 및 출생후 뇌에서 뇌척수액의 생산에 관여한다(Lobas et al., 2012). 몇몇 PCDHG는 신경세포에서 세포사멸을 매개하는 세포 내 어댑터 단백질인 PDCD10(세포 예정사 10)과 상호작용한다(Lin et al., 2010a). 응집형 후성적 이상은 -예를 들면, 염색체 5(PCDHA, PCDHB 및 PCDHG)에 있는 프로토카데린 유전자 패밀리 군집의- 인간 유방암에서 흔한 사건이다(Novak et al., 2008).
Rho GTPase 활성화 단백질 21(ARHGAP21)
ARHGAP21은 우선적으로 CDC42의 GTPase-활성화 단백질(GAP)로서 기능하며, CDC42 활성도의 제어를 통해 골지에서 ARP2/3 복합체와 F-액틴 역학을 조절한다(Dubois et al., 2005). 몇몇 Rho GTPase-활성화 단백질들(RhoGAPs)은 이들의 Rho GTPase 활성도에 대한 영향을 통해 종양 진행에 연루된다. ARHGAP21은 RhoGAP로서, 두경부 편평세포 암종에서 발현이 증가되며 교모세포종 종양 진행에서 역할이 가능하다(Lazarini et al., 2013). ARHGAP21은 Cdc42 및 FAK 활성도의 제어를 통해 세포 이동을 조정한다(Bigarella et al., 2012). ARHGAP21은 몇몇 교모세포종에서 유래된 세포주의 핵 및 핵주위 영역에서 발현된다. ARHGAP21은 종양 억제 유전자로서 활동할 수 있으며, 각종 종양 유형들의 진행 제어에 있어서 중대한 역할을 함으로써 이동의 주요 조절자일 수 있다(Bigarella et al., 2009).
신생물딸림 Ma 항원 2(PNMA2)
인간 PNMA2는 인간 PNMA 패밀리에 속하는 신생물딸림 항원 Ma2를 인코딩한다(Schuller et al., 2005). 건강한 사람의 경우 PNMA2 발현은 신경세포 조직으로 제한된다. CNS에서 신경 세포는 원자핵내 및 세포질의 분리성 면역염색을 나타낸다(Gultekin et al., 2000; Voltz et al., 1999). 암 조직에서 PNMA2 발현은 고환암(Voltz et al., 1999; Leja et al., 2009), 유방암(Sahashi et al., 2003), 폐암(Barnett et al., 2001), 소장 신경내분비 종양 및 간 전이에서 나타난 바 있다(Leja et al., 2009). PNMA2는 신경내분비 암종 세포에 대한 신규한 표지 유전자로서 파악되었다(Leja et al., 2009). PNMA2-양성 종양 환자는 항-PNMA2 항체를 발육시킬 수 있으며, 이는 방종양성 뇌염(PNE)과 같은 신경계 퇴행성 증후군을 유도한다(Sahashi et al., 2003). PNE의 신경계 증상은 환자의 상태에 강력한 영향을 미치며 치명적일 수 있으므로(Barnett et al., 2001), 그러한 환자에서는 암 치료가 강요되어야 한다(Kraker, 2009).
선종성 결장 폴립증(APC)
선종성 결장 폴립증(APC)은 또한 폴립증 2.5(DP2.5)에서 결손된 것으로 알려져 있으며, 인간에서는 APC 유전자에 의해 인코딩되는 단백질이다. APC 단백질은 세포가 종양으로 발전할 수 있는지를 결정하는 세포 과정에서 중대한 역할을 한다. APC 단백질은 세포 분열의 빈도, 조직 내에서 다른 세포와의 부착 방식 또는 세포가 조직 내부에서 또는 그로부터 멀리 이동하는지의 제어를 돕는다. APC는 Wnt 신호전달 경로에서 전사의 중앙 활성인자인 β-카테닌의 세포질 세포 수준을 제약함으로써 창자 상피 항상성의 게이트키퍼로서 활동하는 주요 종양 억압 유전자이다(Minde et al., 2011). 인간 APC 유전자에서 돌연변이는 가족성 선종 폴립종 및 산발 결장직장 및 위 종양의 진행과 연계된다(Rubinfeld et al., 1993). APC 유전자는 또한 감쇄 폴립종 증후군에 대한 후보 감수성 유전자이다(Zhou et al., 2001). 뇌 종양과 다발 결장직장 선종 사이의 연관은 두 유형의 뚜렷한 배자 계열 결손(APC 유전자의 돌연변이 또는 틀린짝 수복 유전자의 돌연변이)으로부터 초래될 수 있다(Hamilton et al., 1995).
비스코트-올드리치 증후군-유사(WASL)
신경 비스코트-올드리치 증후군 단백질은 인간에서 WASL 유전자에 의해 인코딩되는 단백질이다. 비스코트-올드리치 증후군(WAS) 패밀리의 단백질은 유사한 도메인 구조를 공유하며, 세포 표면의 수용체로부터 액틴 세포골격까지의 신호 도입에 관여한다(Kovacs et al., 2011). WASL은 액틴 필라멘트 형성을 조절하는 것으로 알려진 Cdc42 및 세포 골격 조직 복합체인 Arp2/3과 연관되며, 어디에서나 발현되고 신경 조직에서 가장 높은 발현을 보여준다(Kovacs et al., 2011). WASL 및 arp2/3 복합체는 수상 돌기와 시냅스의 발육에서 액틴의 중요한 조절인자이다(Wegner et al., 2008). Arp2/3과 연관된 단백질 WASL 복합체는 효율적인 3차원 암 세포 이동을 위해 다세대 수지상 돌출을 매개한다(Giri et al., 2013). WASL은 인간의 유방암(Escudero-Esparza et al., 2012) 및 원발성 뇌 종양(Khalil and El-Sibai, 2012)에 관여한다.
용질 운반자 패밀리 1(아교세포 고 친화도 글루탐산 전달체), 멤버 3(SLC1A3)/용질 운반자 패밀리 1(고친화도 아스파라진산/글루탐산 전달체), 멤버 6(SLC1A6)
SLC1A3은 고친화도 글루탐산 전달체 패밀리의 멤버의 멤버를 인코딩한다. SLC1A3은 흔히 글루탐산 아스파라진산 전달체(GLAST) 또는 흥분 아미노산 전달체 1(EAAT1)로도 불린다. GLAST는 주로 형질막에서 발현되어 세포의 공간에서 글루탐산염의 제거를 허용한다(Langley et al., 2009). 다양한 급성 및 만성 뇌 질환은 아교세포 글루탐산 전달체들인 GLAST/EAAT-1 및 GLT-1/EAAT-2의 발현 중단 및 그에 따른 이차 신경 세포사를 초래한다(Unger et al., 2012). 성상아교세포와 미세아교세포에서 글루탐산 전달체들(GLT-1 및 GLAST)의 발현은 신경 손상 이후 차등적으로 조절된다(Xin et al., 2009). 자가항원 특이적 T 세포는 성상아교세포 글루탐산 전달체인 GLAST의 발현을 감소시켜 성상아교세포에서 글루탐산염의 섭취를 저해한다(Korn et al., 2005). SLC1A3은 교모종 세포의 운동성과 연관되어 있을 수 있다(Tatenhorst et al., 2004). 글루탐산 전달체의 저해는 독소루비신의 치료 효능을 강화시킨다(Sugiyama et al., 2001).
글루탐산 전달체 유전자인 SLC1A6은 글루탐산 전달체 EAAT4를 인코딩한다. 일본인 모집단에서는 신경분열증의 하나 이상의 감수성 자리가 SLC1A6의 내부나 근처에 위치할 수 있다고 사료된다(Deng et al., 2007). 더욱이 이는 포유동물의 중추 신경계의 신경세포로 국한되며(Jackson et al., 2001) 또한 주로 소뇌에서 발현된다(Need et al., 2009).
테뉴린 막횡단 단백질 4(TENM4)
테뉴린-4(Ten-4/Odz4)는 CNS에서 고도로 발현되는 제 II형 막횡단 단백질이다. Ten-4는 발육중인 눈과 체절은 물론 꼬리돌기와 사지에서도 발현된다(Tucker and Chiquet-Ehrismann, 2006; Kenzelmann-Broz et al., 2010). Ten-4 발현은 세포질 그물(ER) 스트레스에 반응하여 유도되며(Wang et al., 1998) 또한 Ten-4의 관여가 생쥐 장배형성(Lossie et al., 2005) 및 인간의 양극성 장애(2011)에서 제안된 바 있다. 하지만 Ten-4의 생물학적 기능은 알려진 바 없다. 일부 결과는 테뉴린-4가 핍지교종세포의 신규 조절인자이며 또한 CNS에서 소직경 축삭의 수초화에 있어서 중대한 역할을 수행한다고 시사한다(Suzuki et al., 2012).
아연 핑거 단백질 749(ZNF749)
ZNF749는 염색체 19q13.43에 매핑되었다(Grimwood et al., 2004), (Tsuritani et al., 2007). 이 유전자는 4개의 전사체(스플라이스 변이체)를 갖는다. 오늘날까지 ZNF749는 특성화된 바 없으면, 이 유전자의 기능은 알려진 바 없다.
EF-손 칼슘 결합 도메인 7(EFCAB7)
EFCAB7은 염색체 1p31.3에 매핑되었다(Mehrle et al., 2006; Wiemann et al., 2004). EFCAB7은 생물학적 기능이 알려지지 않은, 특징지워지지 않은 단백질이다.
골형성 단백질 7(BMP7)
BMP7/OP-1은 다른 BMP와 함께 전환 성장 인자(TGF) β 패밀리에 속한다. BMP7은 다면발현성이 높은 성장 인자이다. 골 형성 단백질들(BMPs)은 뼈 형성에서 주요 역할을 수행한다. 최근에 재조합 BMP들 특히 BMP2와 BMP7/OP-1은 큰 뼈 결손 또는 골절 치유의 지연이나 장애가 있는 환자에서 치료를 위해 사용되고 있으며, 이것은 국소적으로 적용된 BMP가 뼈의 회복을 촉진시킬 것이라는 개념에 근거한다(Geesink et al., 1999; Donati et al., 2008; Zimmermann et al., 2006; Garrison et al., 2010). BMP-7은 전환 성장인자 β-유사 사이토카인의 초과에 속하며, 이는 세포유형과 분화에 따라 종양 억제자 또는 종양 프로모터로서 작용할 수 있다. BMP7 발현은 몇몇 암세포의 성장에 관여하는 것으로 보고된 바 있으며, 골육종, 악성 흑색종, 전립선암, 유방암, 신장 세포암, 결장직장암 및 위암 등이 그 예이며, 공격이나 억압의 증가를 야기한다(Motoyama et al., 2008; Kwak et al., 2007; Sulzbacher et al., 2002; Rothhammer et al., 2007; Masuda et al., 2004; Alarmo et al., 2006). 내인성 신경 전구 세포는 줄기-유사 교모세포종 세포의 증식, 자가 재생성을 억압하는 측분비 종양 억압인자로 작용하는 BMP7을 방출하여 어린 뇌를 교모세포종으로부터 보호한다(Chirasani et al., 2010).
인테그린, α 7(ITGA7)
인테그린은 이질이합체 단백질이며 세포와 ECM 또는 다른 세포 사이의 상호작용을 매개한다. ITGA7은 인테그린 β 1 쇄와 이질이합체를 형성하는 인테그린 α 7을 인코딩한다(Vignier et al., 1999). β 1 쇄는 세포골격 성분인 α-액티닌과 상호작용을 하므로 세포골격과 기저판 사이의 신호전달을 보장한다(Otey et al., 1990). ITGA7은 골격과 심장 근육에서 주로 및 풍부하게 발현된다(Pegoraro et al., 2002; Leung et al., 1998). 인간에서 ITGA7의 돌연변이, 결손 또는 감소된 발현은 근육 퇴행위축과 근육병증과 강력한 상관관계가 있다(Pegoraro et al., 2002; Hayashi et al., 1998). ITGA7은 흑색종에서 악성 전환과 연관이 있었다(Kramer et al., 1991b; Kramer et al., 1991a; Kramer et al., 1989). 이와 같은 맥락에서, 혀의 편평 세포 암종에서의 ITGA7 발현 증가는 ITGA7을 전이의 가능한 표지로서 시사한다(Carinci et al., 2005). 일부 결과는 ITGA7의 차단이 발암에서 중요한 단계일 수 있음을 제시한다. 하지만 문헌(Ren et al., 2007)은 종양 성장에서 ITGA7의 역할이 여전히 불확실하며 관여하는 세포 유형에 의존할 수 있음을 주시했다.
리보솜 단백질 L7a(RPL7A)
단백질 합성을 촉매하는 소기관인 세포질 리보솜은 작은 40S 소단위와 큰 60S 소단위로 구성된다. RPL7A 유전자는 60S 소단위의 구성요소인 리보솜 단백질을 인코딩한다. 다수의 리보솜 단백질, 특히 리보솜 단백질 L7a(RPL7a)를 포함하는 골 소단위의 단백질은 rRNA에 결합하는 구형 노출 RNA-결합 도메인으로 구성되어 그 구조를 안정제시킨다. 디코딩 및 펩티드 이전의 중대한 활성도는 rRNA 기반이지만, 리보솜 단백질 또는 단백질 합성의 과정에서 중요한 역할을 수행한다(Wool, 1996). RPL7a는 rRNA에 결합함으로써 리보솜의 안정제에서 중대한 역할을 한다(De et al., 1993; Huxley and Fried, 1990). RPL7a에는 리보솜에서의 기능 뿐만 아니라, 인간 갑상선 호르몬 수용체(THR) 및 레티노산 수용체(RAR) 상호작용을 통해 이 두 가지 핵 호르몬 수용체의 활성도를 저해함으로써 세포 성장과 분화에도 관여할 수 있다(Burris et al., 1995). 골육종의 경우, RPL7a mRNA 및 단백질 발현은 정상 뼈 및 양성 뼈 병변 단편의 샘플과 비교하여 상당히 하향조절 되었으며, 낮은 RPL7A mRNA 발현은 원발성 골육종의 진단 시 고급 병변이 발전된 폐 전이 환자에서 전체 생존에 대한 상당히 불량한 예후 지표였다(Zheng et al., 2009). 반면에 RPL7a는 결장직장암에서 상향조절되는 것으로 보고된다(Wang et al., 2000). RPL7a mRNA의 과발현 또한 전립선암 조직 샘플에서 제자리 부합법에 의해 확인되었다(Vaarala et al., 1998). 더욱이 리보솜 단백질 L7a는 악성 뇌 종양 형성과 연관이 있을 수 있다(Kroes et al., 2000).
헤파란 설페이트 2-O-설포트란스페라제 1(HS2ST1)
헤파란 설페이트 2-O-설포트란스페라제 1은 인체에서 HS2ST1 유전자에 의해 인코딩되는 효소이다. 헤파란 설페이트 생합성 효소들은 복수의 생물학적 활동을 실행하는 무수하고 뚜렷한 헤파란 설페이트 미세 구조를 생성하는데 있어서 주요 구성요소이다. HS2ST1은 황산염을 헤파란 설페이트에서 이두론산 잔기의 2 위치로 이전시킨다. HS2ST1 유전자의 중단은 넉아웃 생쥐에서 신장의 무형성을 초래했으며, 이는 이 효소의 부재가 신장 형성에 요구되는 신호 전달을 방해할 수 있음을 나타낸다(Seki et al., 1997). HS2ST1은 전립선암 세포의 증식, 침입 및 성장 인자 신호전달에 관여한다(Ferguson and Datta, 2011). 정상 혈장 세포에 비해 악성종양에서 HS2ST1의 증가된 유전자 발현은 양호한 예후와 연관이 있었다(Bret et al., 2009).
비멘틴(VIM)
비멘틴은 단백질의 중간 섬유(IF) 패밀리의 주요 성분으로, 정상 중간엽 세포에서 흔히 발현되며, 세포 무결성을 유지하고 스트레스에 대한 내성을 제공하는 것으로 알려져 있다(Schietke et al., 2006). 최근 수년 동안, 비멘틴은 상피-중간엽 세포이행(EMT)에 대한 표지로서 인식되고 있다(Thomson et al., 2005). 다양한 보고서에서 비멘틴이 세포 이동의 중요한 역할을 수행함을 지적하고 있다(Eckes et al., 1998; Eckes et al., 2000; Kang and Massague, 2004). 비멘틴은 또한 세포 생존, 세포 유착 및 지질 운반의 조절에 대해서도 지적된 바 있다(Sarria et al., 1992; McInroy and Maatta, 2007; Mendez et al., 2010). 비멘틴 발현의 증가는 전립선암, 유방암, 자궁내막암, CNS 종양, 악성 흑색종 및 췌장암, 결장직장암 및 간암 등의 위장관 종양을 포함하는 다양한 종양 세포주와 조직에서 보고된 바 있다. 암에서 비멘틴의 과발현은 가속화된 종양 성장, 침입 및 불량한 예후와 상당한 상관관계가 있었다.
비멘틴은 GBM 및 성상아교세포종에 대한 분자 표지로서 사용되고 있다(Shiras et al., 2003; Yang et al., 1994). 더욱이 Vim-TBS.58-81이라 부르는 중간 세사로부터 유래하는 신규 세포-투과 펩티드가 최근에 설명된 바 있다. 문헌(Balzeau et al., 2012)은 이것이 세포내이입을 통해 교모세포종 세포주로부터 세포로 진입하여 세포질과 핵 전체에 분배됨을 보여준다.
편모 내 운반 172 호모로그(클라미도모나스)(IFT172)
IFT172는 선택적 Lim-도메인 결합 단백질(SLB)로도 알려져 있으며, 편모내 운반(IFT) 복합체의 구성요소이다. IFT 시스템의 구성요소들에 영향을 미치는 돌연변이는 섬모의 형성과 기능을 절충하는 것으로 알려져 있다. 섬모는 후각 및 망막 신경세포 및 청각 유모 세포의 분화와 생존에 필수적인 역할을 수행한다(Scholey and Anderson, 2006). IFT172는 복합체 B 소단위이며 IFT-디네인의 편모 진입에 있어 필수적인 역할을 한다(Williamson et al., 2012). 더욱이 IFT172는 중간뇌-후뇌 경계에서의 FGF8의 크기 조절 및 협부 형성체의 유지에 요구될 가능성이 있다(Gorivodsky et al., 2009).
γ-아미노부티르산(GABA) A 수용체, β 1(GABRB1)/γ-아미노부티르산(GABA) A 수용체, β 3(GABRB3)
γ-아미노부티르산 수용체 소단위 β 1은 인간의 경우 GABRB1 유전자에 의해 인코딩되는 단백질이다. γ-아미노부티르산(GABA) A 수용체는 중추 신경계에서 가장 빠른 저해 시냅스 전달을 매개하는 다수 소단위 염소이온 통로이다. 이 유전자는 GABA A 수용체, β 1 소단위를 인코딩한다. 이것은 GABA A 수용체의 α 4, α 2 및 γ 1 소단위를 인코딩하는 유전자의 군집에서 염색체 4p12에 매핑된다. 이 유전자의 변형은 정신분열증의 발생과 연관된다(Vasquez et al., 2013).
γ-아미노부티르산 수용체 소단위 β-3은 인간에서 GABRB3 유전자에 의해 인코딩되는 단백질이다. 이 유전자는 그 패밀리의 관련 소단위들을 인코딩하는 두 유전자의 군집에서 염색체 15의 긴 팔에 위치한다. 이 유전자의 돌연변이는 엥겔만 증후군, 프래더-윌리 증후군 및 자폐증의 발생과 연관이 있을 수 있다(Nurmi et al., 2003).
세포 분열 주기 연관 7-유사(CDCA7L)
세포 분열 주기-연관 7-유사 단백질은 인간에서 CDCA7L 유전자에 의해 인코딩되는 단백질이다(Ou et al., 2006). CDCA7L은 c-Myc와의 핵 공동국소화를 보여주며 시험관 내 및 포유동물 세포에서 c-Myc와 상호작용한다(Huang et al., 2005). CDCA7L은 MAOA 프로모터와 MAOA 효소의 활성도를 저해했으며 세포사멸사 신호전달 경로에서 억제인자로서 활동했다(Ou et al., 2006). CDCA7L은 전이성 수모세포종과 연관있는 Myc 상호작용 물질이다(Zhou et al., 2010).
신호 서열 수용체, α(SSR1)
트란스로콘-연관 단백질 소단위 α는 인간에서 SSR1 유전자에 의해 인코딩되는 단백질이다. 신호 서열 수용체(SSR)는 ER 막에 걸친 단백질 전위와 연관된 당질화 세포질 그물(ER) 막 수용체이다. SSR은 2개의 소단위, 즉, 이 유전자에 의해 인코딩되는 34-kD 당단백질 및 22-kD 당단백질로 구성된다(Hirama et al., 1999). SSR1은 수모세포종의 50% 및 원시 신경외배엽 종양의 78%에서 각각 검출되었다(Johnson et al., 2013).
핵 수용체 서브패밀리 0, 군 B, 멤버 1(NR0B1)
NR0B1(또는 X 염색체 1 상의 용량-민감성 성 역전/부신 저형성증 선천성 주요 부위; DAX1)은 스테로이드 생산의 음성 조절인자로서 작용하며 생식계 및 내분비계에서 발현된다(Niakan and McCabe, 2005). NR0B1은 몇몇 종류의 암에서 고도로 발현되며, 자궁내막 암종(Saito et al., 2005), 난소 암종(Abd-Elaziz et al., 2003), 전립선 암종(Nakamura et al., 2009), 및 유잉 육종(Mendiola et al., 2006; Camoes et al., 2012; Kinsey et al., 2006) 등이다. 폐 선암종에서는, 높은 수준의 NR0B1 발현이 림프절 전이와 재발의 높은 비율과 상관관계가 있었다(Oda et al., 2009).
numb-단백질의 리간드 X 1, E3 유비퀴틴 단백질 연결효소(LNX1)
E3 유비퀴틴 단백질 연결효소 LNX는 인간에서 LNX1 유전자에 의해 인코딩되는 효소이다. 연구의 결과에 의하면, LNX1이 노치 경로와 같은 신호 전달에 참여하며 종양 발생에서 중요한 역할을 할 수 있음이 승인된 바 있다. 일부 결과는 LNX1 β-카테인, MAPK, NFκB, c-Myc-의존 경로의 저해 및 p53, TGF-β-의존 경로의 활성화를 통해 LNX1의 하향조절이 G0/G1기에서 세포 주기 정지를 초래할 수 있음을 시사했다(Zheng et al., 2011). LNX1의 유전자 서열 변형 및 증폭은 인간 교모종의 하위집합에 존재한다(Blom et al., 2008; Holtkamp et al., 2007). 인간 LNX1는 저급 및 고급 등의 교모종에서 하향조절되었다(Chen et al., 2005).
E1A 결합 단백질 p400(EP400)
E1A 결합 단백질 p400은 인간에게서 EP400 유전자에 의해 인코딩되는 단백질이다. p400은 표피 성장 인자 수용체의 및 세포사멸의 E1A-유도된 하향조절에 대한 매개자이다(Flinterman et al., 2007; Samuelson et al., 2005). EP400 유전자의 돌연변이는 반수체 림프모구성 백혈병 환자에 대해 묘사되었다(Chen et al., 2013a). 더욱이 전유전체 siRNA 스크린을 통해 EP400을 인유두종 바이러스 종양유전자 발현의 조절인자로서 동정했다(Smith et al., 2010). p400/Tip60 비율은 대장암 세포의 증식 및 스트레스-반응 경로의 제어를 통한 치료 약물에 대한 반응에 매우 중요하다(Mattera et al., 2009).
키네신 패밀리 멤버 1B(KIF1B)
신경 능선암에서 보통 결손되는 영역인 1p36 상의 KIF1B 유전자는 교감 전구체에 대한 전세포사멸 인자인 것으로 발견되었다. KIF1B β 돌연변이는 두 가지 교감 직계성 종양인 크롬친화 세포종과 신경모세포종에서 검출되었으며, 이는 암에서 이 유전자의 역할을 시사한다(Yeh et al., 2008). KIF1B-관련 경로는 B형 간염 바이러스-관련 간세포 암종의 병발생에 관여할 수 있다(Casper et al., 2011). KIF1B는 높은 병기의 신경모세포종에서 하향조절된다(Caren et al., 2005; Ohira et al., 2000; Nagai et al., 2000). MT1-MMP의 세포 표면 국소화는 KIF1B를 의존하며 이는 결과적으로 위암 침입에서 중대한 역할을 수행한다(Dong et al., 2013). KIF1B는 신경내분비 종양인 크롬친화 세포종과 연관이 있다(Galan and Kann, 2013).
Rho-관련 BTB 도메인 함유 3(RHOBTB3)
Rho-관련 BTB 도메인 함유 단백질 3은 인간에서 RHOBTB3 유전자에 의해 인코딩되는 단백질이다. RHOBTB3은 RhoBTB의 진화적으로 보존된 Rho GTPases 서브패밀리의 멤버이다(Rivero et al., 2001; Boureux et al., 2007). RHOBTB 유전자는 일부 암 세포주에서 상향조절되는데 이는 이 단백질들이 종양발생에 참여할 수 있음을 시사한다(Ramos et al., 2002). 버트홀드(Berthold) 등(2008)은 종양형성에서 RhoBTB 서브패밀리의 가능한 역할도 설명했다(Berthold et al., 2008b). 신장 및 유방 종양 표본에서 RHOBTB 및 CUL3 유전자의 감소된 발현이 관찰되었다(Berthold et al., 2008a).
키네신과 멤버 7(KIF7)
KIF7 유전자는 키네신과에 속하는 섬모-연관 단백질을 인코딩한다. 이 단백질은 GLI 전사인자의 조절을 통해 소닉 헤지혹(SHH) 신호전달 경로에서 역할을 수행한다(Li et al., 2012b). 이것은 리간드의 부재시 GLI2의 부적절한 활성화를 방지함으로써 SHH 경로의 음 조절 인자로서 기능하며, GLI3을 암억제제 형태로의 처리를 방지함으로써 양의 조절인자로서 기능한다. KIF7은 주버트(Joubert), 수두 및 뇌량무형성 증후군 등 다양한 질병에 연루된다. 또한 일차 섬모 형성 및 헤지혹 신호전달 경로에도 관여하며 암에서 역할을 수행할 수 있다(Klejnot and Kozielski, 2012). 헤지혹 신호전달 경로의 이상 활성화는 위암과 췌장암과 같은 다양한 인간 종양에서 병리학적 결과를 초래한다. KIF7은 헤지혹 신호 전달과 연관된다(Katoh and Katoh, 2005).
미토겐-활성화 단백질 키나아제 6(MAPK6)
미토겐-활성화 단백질 키나아제 6(MAPK6, 또는 ERK3로도 불림)은 인간에서 MAPK6 유전자에 의해 인코딩되는 효소이다. MAPK6은 Ser/Thr 단백질 키나아제과의 멤버이며, 미토겐-활성화 단백질 키나아제(MAP 키나아제)와 가장 밀접하게 관련된다. 구강암 조직에서는 건강한 조직에 비해 ERK3 전사체가 증가하고; 결장직장암 조직에서는 주위의 정상 점막보다 ERK3 발현 수준이 더 높았다. ERK3 단백질의 상승된 수준은 위암과도 연관이 있다. 증가된 ERK3 전사체 또는 단백질 수준은 유방암, 흑색종 및 비소세포 폐암에서도 관찰된 바 있다(Kostenko et al., 2012). 일부 관찰 내용은 ERK3은 세포 주기 진행, 세포 증식 및 이동에 대한 분명한 부정적인 조절 영향 등 종양 억제에 있어서 일부 역할을 수행할 수 있음을 시사한다(Cargnello and Roux, 2011).
Asp(이상 스핀들) 호모로그, 소두증 연관(초파리)(ASPM)
이상 스핀들-유사 소두증 연관(ASPM)은 초파리 이상 스핀들(asp)의 인간 상동체(orthologue)이다. ASPM은 스핀들 조직, 스핀들 위치, 유사분열 진행 및 세포질 분열에 연관된 바 있다(Van et al., 2009; Higgins et al., 2010). ASPM 과발현은 다수의 Wnt-활성화 구성요소와 같이 증가된 세포 증식과 종양 발전과 연관이 있으며 증식에 대한 일반적 영향을 지지한다(Lin et al., 2008; Bikeye et al., 2010; Vulcani-Freitas et al., 2011). ASPM의 과발현은 몇몇 종양 세포주에서 관찰되었고 ASPM 수준의 감소는 세포 증식을 저해했으므로, 대부분의 간행물은 ASPM을 암 요법의 신규 표적으로 제안한다. 다형성 교모세포종에서, ASPM은 정상 뇌와 기타 신체 조직에 비해 고도로 발현된다(Horvath et al., 2006). 일부 연구에서는 ASPM 발현 수준은 교모종의 악성 발현형과 WHO 등급에 대해 강한 양의 상관관계가 있음을 발견했는데, 이는 ASPM이 성상아교세포종에 비해 GBM에서 과발현되었으며 재발 시 발현이 증가했기 때문이다(Bikeye et al., 2010; Bikeye et al., 2011; Hagemann et al., 2008; Marie et al., 2008). ASPM은 교모종의 악성 진행에 관여하며 적합한 치료 표적을 나타냈다고 제안되었다. ASPM 발현은 GBM의 임상적 결과와 음의 상관관계가 있다(Horvath et al., 2006; Visnyei et al., 2011).
염색체 4의 구조적 유지(SMC4)
염색체의 구조적 유지(SMC) 단백질은 세균에서 인간에 이르기까지 고도로 보존된 염색체 ATPases이며, 고차 염색체 조직 및 역학의 많은 양태에서 기본적 역할을 수행한다(Losada and Hirano, 2005). SMC4 단백질은 염색질 응축에서 역할을 하는 콘덴신 복합체의 핵심 구성요소이며 또한 핵소체 분리, DNA 복구 및 염색질 골격의 유지와 연관되었다(Cervantes et al., 2006). SMC2 및 SMC4는 염색체 조립과 분리에 필수적인 콘덴신 복합체의 핵심으로 기능한다(Losada and Hirano, 2005). 인간 암 표본에 대한 RT-PCR 연구에 의하면, 인간 유방암, 전립선암, 대장암 및 췌장암 등 다수의 암 세포주와 암 검체에서 고도로 발현됨을 보여준다(Egland et al., 2006).
타이오레독신 2(TXN2)
TXN2는 적은 다기능 산화환원-활성 단백질의 군인 타이오레독스 패밀리의 미토콘드리아 멤버를 인코딩한다. 인코딩된 단백질은 미토콘드리아 막 전위의 조절에서 및 산화제-유도된 세포사멸에 대한 보호에서 중요한 역할을 수행할 수 있다(Tanaka et al., 2002). TXN 및 TXN2는 지방 조직에서 유래된 중간엽 줄기 세포의 증식과 생존을 조절하며, 이러한 과정은 ERK1/2의 활성화에 의해 매개된다(Song et al., 2011). 암 세포 성장의 자극의 역할 때문에 및 세포사멸의 억제제로서, 타이오레독신은 암을 치료하고 예방하는 약물 개발의 표적을 제공한다. 단백질 TXN2는 유방암에 연례되므로(Seibold et al., 2011) 펩티드 서열번호 99는 적응증에도 유용하다.
단백질 CSRP2는 간세포 암종과 연관되므로(Midorikawa et al., 2002), 펩티드 서열번호 1은 이 적응증에도 유용하다.
단백질 ELOVL2는 간세포 암종에 연관되므로(Zekri et al., 2012) 펩티드 식별번호 3은 이 적응증에도 유용하다.
단백질 KIF1A는 두경부 편평 세포 암종(Demokan et al., 2010; Kaur et al., 2010; Loyo et al., 2011; Pattani et al., 2010; Guerrero-Preston et al., 2011), 신경모세포종(Hartomo et al., 2013), 폐암(Loyo et al., 2011), 갑상선암(Brait et al., 2012; Ostrow et al., 2009)과 연관되므로, 펩티드 서열번호 6은 이 적응증들에도 유용하다.
단백질 GRIK3은 횡문근육종/수모세포종, 신경모세포종, 갑상선 암종, 폐암, 성상아교세포종, 다발 골수종, T 세포 백혈병 세포, 유방암 및 대장 선암종(Stepulak et al., 2009)과 연관되므로 펩티드 서열번호 8은 이 적응증들에도 유용하다.
단백질 SEZ6L은 폐암(Raji et al., 2010; Gorlov et al., 2007), 위 암종(Kang et al., 2008), 결장직장암(Suzuki et al., 2002)과 연관되므로 펩티드 서열번호 9는 이 적응증들에도 유용하다.
단백질 KCNJ10은 성상아교세포종과 연관되므로(Tan et al., 2008) 펩티드 서열번호 12는 이 적응증에도 유용하다.
단백질 SCARA3은 난소암(Bock et al., 2012), 전립선암(Zhu et al., 2009)과 연관되므로 펩티드 서열번호 16은 이 적응증에도 유용하다.
단백질 CLU는 원발성 위암(Bi et al., 2010), 난소암(Yang et al., 2009), 유방암(Niu et al., 2012), 폐암(Panico et al., 2013), 간세포 암종(Chen et al., 2012a), 결장직장암(Rodriguez-Pineiro et al., 2012), 전립선암(Ammar and Closset, 2008), 췌장암(Jin et al., 2012)과 연관되므로, 펩티드 서열번호 18은 이 적응증들에도 유용하다.
단백질 CERS1은 두경부 편평 세포 암종과 연관되므로(Senkal et al., 2007), 펩티드 서열번호 19는 이 적응증에도 유용하다.
단백질 SLC35E1은 직장 암종과 연관되므로(Rimkus et al., 2008) 펩티드 서열번호 24는 이 적응증에도 유용하다.
단백질 COL20A1은 유방암과 연관되므로(Huang et al., 2013b), 펩티드 서열번호 24는 이 적응증에도 유용하다.
단백질 EGFR은 신장 세포 암종(Lee et al., 2008b), 전립선암(Wang et al., 2013), 폐암(Bivona et al., 2011), 흑색종(Girotti et al., 2013), 두경부 편평 세포 암종(Deng et al., 2013), 유방암(Li et al., 2009), 대장암(Yokoi et al., 2005)과 연관되므로, 펩티드 서열번호 29는 이 적응증들에도 유용하다.
단백질 WLS는 흑색종(Yang et al., 2012b)과 연관되고, 단백질 MIER1은 유방암(McCarthy et al., 2008)과 연관되므로 펩티드 서열번호 31은 이 적응증들에도 유용하다.
단백질 IRS2는 유방암(Clark et al., 2011), 전립선암(Heni et al., 2012), 위암(Zhao et al., 2012a), 난소암(Meunier et al., 2010), 자궁내막암(Cayan et al., 2010)과 연관되므로 펩티드 서열번호 32는 이 적응증들에도 유용하다.
단백질 TNC는 대장암(De et al., 2013), 선낭암종(Siu et al., 2012), 청소년 비인강 혈관 섬유종(Renkonen et al., 2012), 진행성 흑색종(Fukunaga-Kalabis et al., 2010), 췌장암(Paron et al., 2011)과 연관되므로 펩티드 서열번호 34는 이 적응증들에도 유용하다.
단백질 MAP1B는 신경모세포종(Willoughby et al., 2008)과 연관되므로 펩티드 서열번호 35 및 번호 47은 이 적응증에도 유용하다.
단백질 ADORA3은 전립선암(Jajoo et al., 2009), 간세포 암종(Bar-Yehuda et al., 2008), 원발성 갑상선암(Morello et al., 2008), 대장암종(Gessi et al., 2004), 방광암(Kim et al., 2010)과 연관되므로 펩티드 서열번호 37은 이 적응증에도 유용하다.
단백질 NLGN4X는 위장관 기질 종양(Prakash et al., 2005)과 연관되므로 펩티드 서열번호 37은 이 적응증에도 유용하다.
단백질 DPP3은 원발성 난소 암종(Simaga et al., 2003)과 연관되므로 펩티드 서열번호 41은 이 적응증에도 유용하다.
단백질 USP11은 유방암(Bayraktar et al., 2013), 췌장관 선암종(Burkhart et al., 2013)과 연관되므로 펩티드 서열번호 42는 이 적응증에도 유용하다.
단백질 EIF4E는 유방암(Zindy et al., 2011), 경부암(Wang et al., 2013), 비인두 암종(Wu et al., 2013), 위 분문 선암종(Yang et al., 2013), 간암(Wang et al., 2012b), 후두암종(Yi et al., 2012), 췌장암(Martineau et al., 2013), 흑색종(Populo et al., 2012), 비소세포폐암(NSCLC)(Li et al., 2012a), 두경부 편평 세포 암종(Sunavala-Dossabhoy et al., 2011), 간암(Cillo et al., 2011), 전립선암(Hay, 2010; Furic et al., 2010), 자궁내막암(Choi et al., 2011)과 연관되므로 펩티드 서열번호 43은 이 적응증들에도 유용하다.
단백질 CCT7은 대장암(Nibbe et al., 2009)과 연관되므로 펩티드 서열번호 43은 이 적응증에도 유용하다.
단백질 SOX9는 전이성 흑색종(Rao et al., 2010)과 연관되고, 단백질 SOX10은 흑색종(Mohamed et al., 2012), 침샘암(Ohtomo et al., 2013), 유방 암종(Cimino-Mathews et al., 2013)과 연관되므로 펩티드 서열번호 49는 이 적응증에도 유용하다.
단백질 CDK4는 폐암(Puyol et al., 2010), 구강 편평 세포 암종(Poomsawat et al., 2010), 간세포 암종(Chen et al., 2013b), 유방암(Harrison Pitner and Saavedra, 2013)과 연관되므로 펩티드 서열번호 52는 이 적응증에도 유용하다.
단백질 CDK6은 구강 편평 세포 암종(Poomsawat et al., 2010), 간세포 암종(Chen et al., 2013b)과 연관되므로 펩티드 서열번호 52는 이 적응증에도 유용하다.
단백질 MAGEF1은 폐암(Tsai et al., 2007), 결장직장암 환자(Chung et al., 2010)과 연관되므로 펩티드 서열번호 53은 이 적응증에도 유용하다.
단백질 NLGN4X는 위장관 간질암(Prakash et al., 2005)과 연관되므로 펩티드 서열번호 55는 이 적응증에도 유용하다.
단백질 VPS13B는 위암 및 결장직장암(An et al., 2012)과 연관되므로 펩티드 서열번호 56은 이 적응증에도 유용하다.
단백질 NRCAM은 유두 갑상선 암종(Gorka et al., 2007), 대장암(Chan et al., 2011), 전립선암(Tsourlakis et al., 2013)과 연관되므로 펩티드 서열번호 57은 이 적응증에도 유용하다.
단백질 RAD54B는 식도 편평 세포 암종(Li et al., 2013a)과 연관되므로 펩티드 서열번호 58은 이 적응증에도 유용하다.
단백질 FABP7은 신장 세포 암종(Teratani et al., 2007), 흑색종(Goto et al., 2006), 유방암(Liu et al., 2012a)과 연관되므로 펩티드 서열번호 59 및 번호 80은 이 적응증들에도 유용하다.
단백질 TACC3은 폐암(Jung et al., 2006)과 연관되므로 펩티드 서열번호 62는 이 적응증에도 유용하다.
단백질 IGF2BP3은 위암(Wang et al., 2010; Okada et al., 2012), 간세포 암종(Wachter et al., 2012), 혀 편평 세포 암종(Li et al., 2011a), 구강암(Hwang et al., 2012), 및 신장 세포 암종(Jiang et al., 2006), 간세포 암종(Riener, 2011), 침습성 편평 세포 암종(Lu et al., 2011), 신경모세포종(Chen et al., 2011), 폐의 편평 세포 암종(Kobayashi et al., 2004; Findeis-Hosey and Xu, 2012), 교모세포종(Suvasini et al., 2011), 췌장관 선암종(Yantiss et al., 2008; Schaeffer et al., 2010; Wachter et al., 2011), 유방의 원발성 선낭 암종(Vranic et al., 2011), 전립성 암종(Ikenberg et al., 2010), 갑상선 암종(Jin et al., 2010), 자궁 내막 선암종(Li et al., 2007), 흑색종(Pryor et al., 2008) 및 난소암(Gu et al., 2004)과 연관되므로 펩티드 서열번호 66은 이 적응증들에도 유용하다.
단백질 드로셔는 유방암(Passon et al., 2012), 난소암(Merritt et al., 2008), 자궁내막암(Torres et al., 2011), 경부암(Zhou et al., 2013), 위암(Tchernitsa et al., 2010), 결장직장 암종(Papachristou et al., 2011), 방광암(Han et al., 2013), 식도암(Sugito et al., 2006), 신장 세포 암종(Lin et al., 2010b), 폐암 생존(Rotunno et al., 2010)과 연관되므로 펩티드 서열번호 67은 이 적응증들에도 유용하다.
단백질 ABCA13은 유방 암종(Hlavac et al., 2013), 결장직장 암종(Hlavata et al., 2012)과 연관되므로 펩티드 서열번호 68은 이 적응증에도 유용하다.
단백질 CCNB1은 결장직장 암종(Li et al., 2003), RCC(Tsavachidou-Fenner et al., 2010), 유방암(Aaltonen et al., 2009; Agarwal et al., 2009; Suzuki et al., 2007; Chae et al., 2011), 수모세포종(de et al., 2008), 편평 세포 폐암(Kettunen et al., 2004), 위장관 간질 종양(Koon et al., 2004), 식도 편평 세포 암종(Song et al., 2008), 후두 편평 세포 암종(Dong et al., 2002), 구강 설 편평 세포 암종(Harada et al., 2006), 부신 피질 암종(Soon et al., 2009), 폐 선암종(Wikman et al., 2002), 비소세포 폐암(Cooper et al., 2009), 경부암(Zhao et al., 2006), 유즙 하수체 종양(Raverot et al., 2010) 및 신장 세포 암종(Ikuerowo et al., 2006)과 연관되므로 펩티드 서열번호 69는 이 적응증들에도 유용하다.
단백질 CNOT1은 유방암(Winkler et al., 2006)과 연관되므로 펩티드 서열번호 70은 이 적응증에도 유용하다.
단백질 BIRC5는 유방암(Yamashita et al., 2007; Al-Joudi et al., 2007; Span et al., 2004), 식도암(Sato et al., 2006), 결장직장암(Tan et al., 2005), 투명 세포 신장 세포 암종(Kosari et al., 2005), 췌장암(Mahlamaki et al., 2002), 편평 세포 암종(Lo et al., 2001), 폐암(Krepela et al., 2009) 및 신경모세포종(Lamers et al., 2011)과 연관되므로 펩티드 서열번호 72는 이 적응증들에도 유용하다.
단백질 ZNF3은 두경부 편평 세포 암종(Nichols et al., 2012)과 연관되므로 펩티드 서열번호 81은 이 적응증에도 유용하다.
단백질 PJA2는 갑상선암(Cantara et al., 2012)과 연관되므로 펩티드 서열번호 84는 이 적응증에도 유용하다.
단백질 GPM6B는 난소암(Urban et al., 2011)과 연관되므로 펩티드 서열번호 86은 이 적응증에도 유용하다.
단백질 OLIG2는 유방암(Kamalakaran et al., 2011)과 연관되므로 펩티드 서열번호 91은 이 적응증에도 유용하다.
단백질 VCAN은 난소암(Zhang et al., 2012), 유방암(Nara et al., 1997), 대장암(Yoon et al., 2002), 피부암(Kunisada et al., 2011), 폐암(Rotunno et al., 2011), 신장세포 암종(Dondeti et al., 2012)과 연관되므로 펩티드 서열번호 92는 이 적응증들에도 유용하다.
단백질 SMOX는 전립선암(Goodwin et al., 2008), 유방암(Cervelli et al., 2010)과 연관되므로 펩티드 서열번호 93은 이 적응증에도 유용하다.
단백질 EXOC7은 유방암(Yau et al., 2010)과 연관되므로 펩티드 서열번호 94는 이 적응증에도 유용하다.
단백질 LZTS1은 전립선암(Hawkins et al., 2002), 폐암(Lin et al., 2013), 방광암(Abraham et al., 2007) 및 유방암(Chen et al., 2009)과 연관되므로 펩티드 서열번호 95는 이 적응증에도 유용하다.
단백질 FADS2는 간세포 암종(Muir et al., 2013), 유방암(Pender-Cudlip et al., 2013)과 연관되므로 펩티드 서열번호 96은 이 적응증에도 유용하다.
단백질 ASCL1은 폐암(Borges et al., 1997; Jiang et al., 2004; Osada et al., 2005), 신경모세포종(Singh et al., 2004), 수질 갑상선 암종(Kastan et al., 1990), 유방암(Righi et al., 2012), 전립선암(Rapa et al., 2008), 위장관 NECs(Shida et al., 2005)과 연관되므로 펩티드 서열번호 98은 이 적응증들에도 유용하다.
단백질 NKAIN2는 전립선암에도 연계되므로(Mao et al., 2011) 펩티드 서열번호 100은 이 적응증에도 유용하다.
단백질 PCDHGA12는 방광암(Reinert et al., 2011), 폐암(Lu et al., 2006)과 연관되며, 단백질 PCDHGC3은 결장직장 암종(Dallosso et al., 2012)과 연관되며, 단백질 PCDHGC4는 수모 세포종(Abe et al., 2008)과 연관되며, 단백질 PCDHGB6는 유방암과 연관되므로(Miyamoto et al., 2005), 펩티드 서열번호 101은 이 적응증들에도 유용하다.
단백질 ARHGAP21은 두경부 편평 세포 암종(Lazarini et al., 2013)과 연관되므로 펩티드 서열번호 102는 이 적응증에도 유용하다.
단백질 PNMA2는 고환암(Mathew et al., 2007), 유방암(Sahashi et al., 2003), 폐암(Barnett et al., 2001), 소장 신경내분비 종양 및 간 전이(Leja et al., 2009)와 연관되므로 펩티드 서열번호 103은 이 적응증들에도 유용하다.
단백질 APC는 산발성 결장직장암 및 위암(Rubinfeld et al., 1993), 폐암(Usadel et al., 2002), 유방암(Van, I et al., 2008), 방광암(Ellinger et al., 2008), 전립선암(Richiardi et al., 2013)과 연관되므로 펩티드 서열번호 105는 이 적응증들에도 유용하다.
단백질 WASL은 유방암(Escudero-Esparza et al., 2012), 식도 편평 세포 암종(Li et al., 2013a), 간 세포 암종(Jin et al., 2013)과 연관되므로 펩티드 서열번호 106은 이 적응증들에도 유용하다.
단백질 BMP7은 식도 편평 세포 암종(Megumi et al., 2012), 위암(Aoki et al., 2011), 간세포 암종(Li et al., 2013a), CRC (Motoyama et al., 2008), 폐암(Liu et al., 2012b), 전립선암(Kobayashi et al., 2011), 유방암(Rodriguez-Martinez et al., 2011), 흑색종(Na et al., 2009)과 연관되므로 펩티드 서열번호 112는 이 적응증들에도 유용하다.
단백질 ITGA7은 흑색종(Kramer et al., 1989), 혀의 편평 세포 암종(Carinci et al., 2005), 구강 편평 세포 암종(Richter et al., 2011), 간세포 암종(Ren et al., 2007)과 연관되므로 펩티드 서열번호 113은 이 적응증들에도 유용하다.
단백질 RPL7A는 결장직장암(Wang et al., 2000), 전립선암(Vaarala et al., 1998)과 연관되므로 펩티드 서열번호 114는 이 적응증에도 유용하다.
단백질 HS2ST1은 전립선암(Ferguson and Datta, 2011)과 연관되므로 펩티드 서열번호 115는 이 적응증에도 유용하다.
단백질 VIM은 전립선암(Burch et al., 2013), 위암(Zhao et al., 2013), 식도 편평 세포 암종(Jin et al., 2010), 간 세포 암종(Hu et al., 2004), 결장직장암(Shirahata et al., 2009), 췌장암(Zou et al., 2007), 유방암(Gilles et al., 2003), 흑색종(Hendrix et al., 1992), 폐암(Upton et al., 1986), 자궁경부암(Gilles et al., 1996), 투명 세포 신장 세포 암종(Williams et al., 2009), 일부 유형의 림프종(Gustmann et al., 1991), 유두 갑상선 암종(Yamamoto et al., 1992) 및 자궁내막 암종(Coppola et al., 1998)과 연관되므로 펩티드 서열번호 116은 이 적응증들에도 유용하다.
단백질 CDCA7L은 전이 수모세포종(Zhou et al., 2010)과 연관되므로 펩티드 서열번호 119는 이 적응증에도 유용하다.
단백질 SCARA3은 난소암(Bock et al., 2012)과 연관되므로 펩티드 서열번호 120은 이 적응증에도 유용하다.
단백질 SSR1은 신경외배엽 종양(Johnson et al., 2013)과 연관되므로 펩티드 서열번호 121은 이 적응증에도 유용하다.
단백질 NR0B1은 자궁내막 암종(Saito et al., 2005), 난소 암종(Abd-Elaziz et al., 2003), 전립선 암종(Nakamura et al., 2009), 및 유잉 육종(Mendiola et al., 2006; Camoes et al., 2012; Kinsey et al., 2006), 폐 선암종(Oda et al., 2009)과 연관되므로 펩티드 서열번호 122는 이 적응증들에도 유용하다.
단백질 EP400은 대장암(Mattera et al., 2009)과 연관되므로 펩티드 서열번호 124는 이 적응증에도 유용하다.
단백질 KIF1B는 간세포 암종(Casper et al., 2011), 신경모세포종(Caren et al., 2005; Ohira et al., 2000; Nagai et al., 2000), 위암 침입(Dong et al., 2013)과 연관되므로 펩티드 서열번호 125 및 번호 128은 이 적응증들에도 유용하다.
단백질 RHOBTB3은 신장암 및 유방암(Berthold et al., 2008a)과 연관되므로 펩티드 서열번호 126은 이 적응증들에도 유용하다.
단백질 KIF7은 위암 및 췌장암(Katoh and Katoh, 2005)과 연관되므로 펩티드 서열번호 127은 이 적응증들에도 유용하다.
단백질 MAPK6은 구강암, 결장직장암, 위암, 유방암, 흑색종 및 폐암(Kostenko et al., 2012)과 연관되므로 펩티드 서열번호 129는 이 적응증들에도 유용하다.
단백질 ASPM은 간세포 암종(Lin et al., 2008), 수모세포종(Vulcani-Freitas et al., 2011; Salsano et al., 2012), 폐암(Jung et al., 2009), 난소암(Bruning-Richardson et al., 2011)과 연관되므로 펩티드 서열번호 130은 이 적응증들에도 유용하다.
단백질 SMC4는 유방암, 전립선암, 대장암 및 췌장암(Egland et al., 2006)과 연관되므로 펩티드 서열번호 131은 이 적응증들에도 유용하다.
본 발명에 따른 펩티드, 본 발명에 따른 핵산, TCR, 항체 또는 발현 벡터, 본 발명에 따른 세포 또는 암의 치료를 위해 또는 암에 대한 약제의 제조를 위해 본 발명에 따라 생산된 활성화된 세포독성 T 림프구의 사용은 바람직하고, 상기 약제는 백신으로 바람직하다. 상기 암은 성상아교세포종, 털모양 성상아교세포종, 이형성 배아성 신경상피종, 핍지신경모종, 뇌실막세포종, 다형성 교모세포종, 혼합 교모종, 핍지교성상세포종, 수모세포종, 망막모세포종, 신경모세포종, 종자세포종, 기형종, 신경절교모종, 신경절세포종, 중추 신경절세포종, 원시성 신경외배엽 종양(PNET, 예를 들면 수모상피종, 속질상피종, 신경모세포종, 망막모세포종, 뇌실막모세포종), 송과체 실질의 종양(예를 들면 송과체종, 송과체모세포종), 뇌실막 세포 종양, 맥락 얼기 종양, 불명기원의 신경상피 종양(예를 들면 대뇌 신경아교종증, 성상모세포종), 교모세포종 전립선 종양, 유방암, 식도암, 대장암, 결장직장암, 신장 세포 암종, 투명 세포 신장 세포 암종, 폐암, CNS, 난소, 흑색종, 췌장암, 편평 세포 암종, 백혈병 및 수모세포종 및 서바이빈 및/또는 여기에서 설명한 다른 단백질들의 과발현을 보여주는 기타 종양들이나 암들로부터 선택되는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 양태는, (a) 본 발명에 따른 펩티드, 본 발명에 따른 핵산이나 발현 벡터, 본 발명에 따른 세포 또는 본 발명에 따른 활성화된 세포독성 T 림프구를 포함하는 약학 성분을 용액이나 또는 동결건조된 형태로 포함하는 용기; (b) 임의적으로 동결건조된 배합을 위한 희석제나 재구성 용역을 포함하는 제2 용기; (c) 임의적으로 서열번호 1 내지 131에 따른 펩티드들로 구성되는 군에서 선택된 하나 이상의 펩티드 및 (d) 임의적으로 용액 및/또는 재구성의 사용 및/또는 동결건조된 배합의 사용을 위한 설명을 포함하는 키트에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 HLA-제한 항원과 복합되는 인간 주 조직적합 복합체(MHC) 클래스 I 또는 II에 특이적으로 결합하는 상기 항체를 생산하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 상기 HLA-제한 항원과 복합되는 용해성 형태의 MHC 클래스 I 또는 II 분자로써 상기 인간 주 조직적합 복합체(MHC) 클래스 I 또는 II를 발현하는 세포를 포함하는 유전자 조작된 비인간 포유동물의 면역화; 상기 비인간 포유동물의 세포를 생산하는 항체로부터 mRNA 분자의 단리; 상기 mRNA 분자에 의해 인코딩된 단백질 분자를 표시하는 파지 디스플레이 라이브러리의 생산; 및 상기 파지 디스플레이 라이브러리로부터 하나 이상의 파지의 단리를 포함하며 상기 하나 이상의 파지는 상기 HLA-제한 항원과 복합되는 상기 주 조직적합 복합체(MHC) 클래스 I 또는 II와 특이적으로 결합가능한 상기 항체를 나타낸다.
본 발명의 다른 양태는 본 발명에 따른 펩티드에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것으로 본 발명에 따른 HLA 제한 항원 및/또는 펩티드와 결합하는 인간 주 조직적합 복합체(MHC) 클래스 I 또는 II에 특이적으로 결합하는 것이 바람직하며 이 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및/또는 키메라 항체가 선호된다.
"펩티드"는 α-아미노와 옆 아미노산의 카보닐 기 사이의 펩티드 결합으로 보통 서로 연결되는 아미노산 잔기의 서열을 가리킨다. 이 펩티드는 바람직하게는 길이가 9개 아미노산이지만 8개 아미노산까지 짧을 수도 있고 10, 11, 12, 13 또는 14개 아미노산까지 길 수도 있으며, MHC 클래스 II 펩티드의 경우 그 길이가 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23개의 아미노산일 수 있다.
더욱이 "펩티드"라는 용어는 α-아미노와 옆 아미노산의 카보닐 기 사이의 펩티드 결합으로 보통 서로 연결되는 아미노산 잔기의 서열에 의한 염을 포함한다. 바람직하게는 염은 약학적으로 허용가능한 염이다.
"펩티드"라는 용어는 "올리고펩티드"도 포함한다. 여기에서 "올리고펩티드"라는 용어는 인접 아미노산의 α-아미노 및 카보닐 기 사이에서 일반적으로 펩티드 결합으로 연결되는, 아미노산 잔기를 지정하는 데 사용된다. 본 발명에서 올리고펩티드의 길이는 정확한 항원결정부위 또는 항원결정부위들이 유지되는 이상 중요하지 않다. 올리고펩티드는 일반적으로 30개 아미노산보다 길이가 짧고, 15개 아미노산보다 길다.
"폴리펩티드"라는 용어는 인접 아미노산의 α-아미노 및 카보닐 기 사이에서 일반적으로 펩티드 결합으로 연결되는, 아미노산 잔기를 지정하는 데 사용된다. 본 발명에서 폴리펩티드의 길이는 정확한 항원결정부위들이 유지되는 이상 중요하지 않다. 펩티드 또는 올리고 펩티드와 다르게, 폴리펩티드는 약 30개 아미노산 잔기 이상의 분자를 가지고 있는 것을 말한다.
이런 분자의 펩티드, 올리고펩티드, 단백질, 또는 폴리뉴클레오티드 코딩은 면역 반응을 유도할 수 있으면 "면역원성"(따라서 본 발명에서의 "면역원")이다. 본 발명의 경우, 면역원성은 T 세포 반응을 유도하는 능력으로 특정하게 정의된다. 그러므로, "면역원"은 면역 반응을 유도할 수 있는 분자이고, 본 발명의 경우, T 세포 반응을 유도할 수 있는 분자이다.
클래스 I T 세포 "항원결정부위"는 적당한 친화력을 가진 MHC/펩티드 복합체에 결합하는 T 세포 수용체에 일치하는 T 세포에 의해 인식되는 삼원 복합체(MHC 클래스 I α 쇄, β-2-미세글로블린 및 펩티드)을 생성하는 클래스 I 또는 II MHC 수용체에 결합하는 짧은 펩티드를 필요로 한다. MHC 클래스 I 분자에 결합하는 펩티드는 전형적으로 길이가 8 내지 14개 아미노산이며, 가장 전형적으로 길이가 9개 아미노산이다.
인간에는 MHC 클래스 I 분자를 인코딩하는 세 개의 유전자 좌가 있다(인간의 MCH-분자는 또한 지정된 인간 백혈구 항원이다(HLA)): HLA-A, HLA-B, 및 HLA-C. HLA-A*01, HLA-A*02, 및 HLA-A*07은 유전자 좌에서 발현할 수 있는 다른 MHC 클래스 I 대립형질의 예이다.
치료와 진단 목적을 위해서 적당한 친화력으로 여러 다른 HLA 클래스 수용체 II에 결합하는 펩티드는 굉장히 바람직하다. 몇 개의 다른 HLA 클래스 II 분자에 결합하는 펩티드는 불규칙 결합제라고 불린다.
여기에서 사용되는 것처럼, DNA 배열에 대한 참조는 단일 가닥 및 이중 가닥 DNA를 포함한다. 그러므로, 특정 서열은, 문맥에서 다르게 나타내지 않는 한, 그 서열의 단일 가닥 DNA, 보완이 있는 그런 서열의 양면(이중 가닥 DNA) 및 그런 서열의 보안을 말하는 것이다. 용어 "코딩 영역"은 자연적인 유전체 환경에서 유전자의 발현 생성물을 자연스럽게 또는 정상적으로 코딩하는 유전자의 부분을 말한다, 예를 들면, 유전자의 본래의 발현 생성물을 위한 생체 안 영역 코딩이다.
코딩 영역은 비돌연변이(정상적)이거나 돌연변이 또는 개조된 유전자에 있을 수 있거나, DNA 서열, 또는 실험실에서 DNA 합성의 당업자에게 잘 알려진 방법을 사용해서 실험실에서 전적으로 합성된 유전자에 있을 수 있다.
"뉴클레오티드 서열"이란 용어는 디옥시리보뉴클레오티드의 헤테로중합체를 말한다.
특정 펩티드, 올리고펩티드 또는 폴리펩티드에 대한 뉴클레오티드 서열 코딩은 자연적으로 발생하거나 합성 구축될 수도 있다. 일반적으로, 본 발명의 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질을 인코딩하는 DNA 분절은 cDNA 단편들과 짧은 올리고 뉴클레오티드 링커, 또는 올리고 뉴클레오티드의 연속에서 미생물이나 바이러스 오페론에서 유도된 규제 요소를 가진 재조합 전사 단위에서 발현될 수 있는 합성 유전자를 제공하기 위해서 조립된다.
여기서 사용되는 "펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드"란 용어는 서열을 발현하는 생물학적 체계와 호환가능한 인공(사람이 만든) 시작 및 정지 코돈을 포함하는 펩티드에 대한 뉴클레오티드 서열 코딩을 지칭한다.
용어 "발현 생성물"은 유전자의 자연 이행 제품인 폴리펩티드 또는 단백질 또는 유전적 코딩 퇴화로 인해 결과된 어떤 핵산 서열 코딩과 상응하며 그러므로 같은 아미노산을 코딩한다.
코딩 서열을 말할 때, 용어 "단편"은 발현 제품이 완전한 코딩 영역의 발현 생성물과 같은 생물학적 기능이나 활동을 유지하는 완전한 코딩 영역보다 적은 부분의 DNA를 말한다.
용어 "DNA 분절"은 최소한 하나의 상당히 순수한 형태, 즉, 내생 오염 물질 없이 적어도 1회 단리된 DNA에서 유도된 별도의 단편 또는 큰 DNA 구축물의 구성 요소로서의 형태 및 표준 생화학 방법, 예를 들면, 복제 벡터를 사용하여 분절 또는 그의 구성 요소 뉴클레오티드 서열의 식별, 조작 및 회수를 가능하게 하는 양 또는 농도의 DNA 중합체이다. 그런 분절은 일반적으로 진핵 생물 유전자에 나타나는 내부 비-번역 서열, 또는 인트론에 의해 방해되지 않는 오픈 리딩 프레임의 형태로 제공된다. 비-번역 DNA의 서열은 같은 것이 코딩 영역의 조작이나 발현을 방해 하지 않는 오픈 리딩 프레임의 하단에 나타날 수 있다.
용어 "프라이머"는 한 가닥의 DNA와 짝을 이룰 수 있는 짧은 핵산 서열이며 DNA 폴리머라아제가 디옥시리보뉴클레오티드 쇄의 합성을 시작하는 자유 3'-OH 말단을 제공한다.
용어 "프로모터"는 전사를 시작하기 위한 RNA 폴리머라아제의 결합에 관련된 DNA의 영역을 뜻한다.
용어 "단리"는 물질이 원래의 환경(예를 들면, 자연적으로 발생하는 경우에는 자연 환경)에서 제거되는 것을 뜻한다. 예를 들면, 자연-발생하는 살아 있는 동물에서 나타나는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 단리되지 않지만, 자연계에서 공존하는 물질의 부분 또는 전체에서 단리되는 같은 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 단리된다. 그런 폴리뉴클레오티드는 벡터의 부분일 수 있고/거나 그런 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 구성의 한 부분일 수 있으며, 그런 벡터 또는 구성이 자연 환경의 한 부분이 아닐 때 여전히 단리될 수 있다.
본 발명에 의거해 밝혀지는 폴리뉴클레오티드 및 재조합 또는 면역원성의 폴리펩티드는 "정제" 상태일 수도 있다. 용어 "정제"는 절대 순도를 필요로 하지 않고; 오히려, 그것은 상대적인 정의로 만들어 졌으며, 관련된 당업자들이 이해하는 용어로서 상당히 정제된 제제 또는 오직 부분적으로 정제된 제제를 포함할 수 있다. 예를 들면, cDNA 라이브러리에서 단리된 각각의 클론은 전기 영동 동일성으로 통상적으로 정제된다. 시작 물질 또는 자연 물질의 최소한 10배 이상, 바람직하게 100 또는 1,000배, 더 바람직하게는 10,000 또는 100,000배 정제가 명시적으로 심사 숙고된다. 또한 바람직하게는 99.999 중량%, 또는 최소한 99.99 중량% 또는 99.9 중량%; 및 심지어 99 중량%보다 큰 정제도를 가진 제시된 폴리펩티드는 명시적으로 심사 숙고된다. 폴리펩티드는 수용액 내에 있을 수 있으며, 그 순도는 물과 그 용액에 사용되는 결정인자를 고려하지 않은 채 화합물 순도에 의해 정의된다.
본 발명에서 밝혀진 핵산과 폴리펩티드 발현 생성물뿐만 아니라, 그런 핵산 및/또는 그런 폴리펩티드를 가진 발현 벡터는 "강화된 형태"일 수 있다. 여기에서 사용되는 것처럼, 용어 "강화"는 물질의 농도가 최소한 그것의 자연적 농도의(예를 들면) 최소한 2, 5, 10, 100, 또는 1000 배 정도이고, 유리하게 0.01 중량%, 바람직하게는 최소한 약 0.1 중량% 정도이다. 약 0.5 중량%, 1 중량%, 5 중량%, 10 중량%, 및 20 중량% 강화된 제제도 심사 숙고된다. 서열, 구성, 벡터, 클론, 및 본 발명의 다른 물질들은 유리하게 강화된 또는 단리된 형태가 될 수 있다.
용어 "활성 단편"은 예를 들면 토끼 또는 쥐, 및 인간을 포함한 포유류 같은 동물에게 단독으로 또는 임의적으로 적당한 보조제와 함께 투여했을 때 면역 반응을(즉, 면역원성 활동이 있는) 생성하는 단편이고, 상기 면역 반응은 인간과 같은 수용체 동물 내에서 T 세포 반응을 자극하는 형태로 취한다. 다르게는, "활성 단편"은 또한 시험관 내 T 세포 반응을 유도하기 위해서 사용될 수 있다.
여기에서 사용되는, "부분", "분절", 및 "단편"이라는 용어는, 폴리펩티드와 관련하여 사용될 때, 서열이 더 큰 서열의 하위 집합을 형성하는 아미노산 잔기와 같은 잔기의 연속 서열을 말한다. 예를 들면, 폴리펩티드가 트립신이나 키모트립신 같은 임의의 일반적인 엔도펩티다아제로 치료를 받는 경우, 그런 치료로 인해 생기는 올리고펩티드는 시작하는 폴리펩티드의 부분, 분절 또는 단편을 나타낼 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 관련하여 사용될 때, 그런 용어들은 일반적인 엔도뉴클레아제 중 어떤 것과 함께 상기 폴리뉴클레오티드의 치료에 의해 생성된 생성물을 말한다.
본 발명에 따라, 서열을 말할 때 용어 "백분율 동일성" 또는 "백분율 동일한"은 설명되거나 명시된 서열("기준 서열")에 비교될 서열의 정렬 후("비교 서열") 서열이 명시된 또는 설명된 서열에 비교되는 것을 말한다. 백분율 동일성은 하기 공식에 따라서 결정된다:
백분율 동일성 = 100 [I -(C/R)]
여기서 C는 기준 서열과 비교 서열의 정렬의 길이에 비해 기준 서열과 비교 서열의 차이의 개수이되,
(i) 비교 서열에서 상응하는 정렬된 염기 또는 아미노산이 없는 기준 서열에 각 염기 또는 아미노산,
(ii) 기준 서열의 각 차이, 및
(iii) 비교 서열에서 정렬된 염기 또는 아미노산과 다른 기준 서열에서 각 정렬된 염기 또는 아미노산이 차이를 구성하며; R은 비교 서열과 염기 또는 아미노산으로서 카운팅되는 기준 서열에서 생성된 임의의 갭의 정렬의 길이에 대한 기준 서열에서 염기 또는 아미노산의 수이다.
상기 계산된 비교 서열과 기준 서열 사이의 백분율 동일성이 특정 최소 백분율과 같거나 더 크다면, 상기 계산된 백분율 동일성이 특정 백분율 동일성보다 작은 경우에 정렬이 있더라도 비교 서열은 기준 서열에 대해 최소 백분율 동일성이 있다.
여기에서 밝혀진 본래 펩티드는 달리 언급되지 않는 이상 다른, 아마도 선별적인, 펩티드 쇄의 사이트의 하나 또는 이상의 잔기의 치환에 의해 변형될 수 있다. 바람직하게는 이러한 치환은 아미노산 쇄의 말단에 위치한다. 그런 치환은, 예를 들면, 소수성의 아미노산이 다른 소수성의 아미노산으로 치환되는 것처럼, 보존적일 수 있다. 심지어 더 보존적인 것은 류신이 이소류신으로 치환되는 것 같이, 같거나 비슷한 크기와 화학적 특성을 가진 아미노산으로 치환되는 것이다. 자연적으로 발생하는 동종 단백질의 종족에서의 서열 변화의 연구에서, 특정 아미노산의 치환은 다른 것들보다 더 자주 용납되고 있으며, 이들은 본래의 아미노산과 치환 사이에서 크기, 전하, 극성, 및 소수성이 비슷한 상관관계를 보이며, 이것은 "보존적 치환"을 정의하는데 기본이 된다.
여기서 보존적인 치환은 아래의 다섯 개 그룹 중 하나의 교환으로 정의된다: 그룹 1-작은 지방성, 무극성의 또는 약간 극성의 잔기(Ala, Ser, Thr, Pro, Gly); 그룹 2-극성의, 음성 전하의 잔기와 그들의 아미드(Asp, Asn, Glu, Gln); 그룹 3-극성의, 양성 전하된 잔기(His, Arg, Lys); 그룹 4-큰, 지방성, 무극성 잔기(Met, Leu, Ile, Val, Cys); 및 그룹 5-큰, 방향족 잔기(Phe, Tyr, Trp).
덜 보존적인 치환은 알라닌을 이소류신 잔기로 치환하는 것처럼, 비슷한 성질이지만 크기가 어느 정도 다른 아미노산으로 치환하는 것을 포함한다. 아주 비-보존적인 치환은 산성 아미노산을 극성의, 또는 심지어는 성질이 염기성인 아미노산으로 치환하는 것을 포함할 수도 있다. 그러나, 이런 "라디칼" 치환은 화학적 효과가 완전히 예측 불가능하고 라디칼 치환은 단순한 화학 원리에서 예측 가능하지 않은 뜻밖의 발생이 있을 수 있기 때문에 효과가 없다고 기각할 수는 없다.
물론, 이런 치환은 일반적인 L-아미노산 외 다른 구성을 포함할 수 있다. 그러므로, D-아미노산이 본 발명의 항원 펩티드에서 흔히 발견되지만 여기에서 아직 공개가 되어야하는 L-아미노산을 치환할 수 있다. 또한, 비-표준 R 기를 가지고 있지 않은 아미노산(즉, 자연 단백질의 일반적인 20개 아미노산에서 찾을 수 없는 R 기) 역시 본 발명에 따라 면역원성과 면역원성 폴리펩티드를 생산하기 위해서 치환될 수 있다.
하나 이상의 위치에서 아래에서 정의 된 것과 굉장히 비슷하거나 더 큰 항원 활동을 가진 치환이 발견되면, 그런 치환의 조합은 조합된 치환이 펩티드의 항원성에 더해지거나 시너지 효과의 결과를 내는지 결정하기 위해 시험된다. 최대, 펩티드에서 네 가지 이상의 위치는 치환될 수 없다.
본 발명의 펩티드는 4개까지의 아미노산만큼 신장할 수 있는데 즉, 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산이 4:0과 0:4 사이에서 임의의 조합으로 양쪽 어디로든 추가될 수 있다. 발명에 따른 신장의 조합은 다음 표 3으로부터 묘사할 수 있다:
[표 3]
Figure pat00011
신장을 위한 아미노산은 해당 단백질의 원래 서열의 펩티드나 기타 모든 아미노산일 수 있다. 신장은 펩티드의 안정성이나 용해성 강화를 위해 사용될 수 있다.
용어 "T 세포 반응"은 시험관 내 또는 생체 내 단백질에 의해 유도되는 특이적 증식과 효과기 기능의 활성화를 뜻한다. MHC 클래스 I 제한 CTL에서는, 효과기 기능이 펩티드-펄스, 펩티드-전조 펄스 또는 자연적 펩티드를 나타내는 표적 세포들의 세포 용해, 사이토킨의 분비, 바람직하게는 인터페론-γ, TNF-α의 분비, 또는 펩티드에서 유도되는 IL-2, 효과기 분자의 분비, 바람직하게는 그랜자임의 분자 또는 펩티드에서 유도되는 퍼포린류 또는 탈과립일 수 있다.
바람직하게는, 서열번호 1 내지 서열번호 49, 서열번호 71 및 서열번호 74 내지 서열번호 129의 펩티드에 대한 특이적인 CTL이 치환 펩티드에 대해 시험(비교)될 때, 치환 펩티드가 배경에 대해 상대적으로 세포 용해의 최대 증가의 절반을 달성할 때의 펩티드 농도는 약 1 mM 이하, 바람직하게 약 1 μM 이하, 더 바람직하게 약 1 nM 이하, 여전히 더 바람직하게 약 100 pM 이하, 및 가장 바람직하게는 약 10 pM 이하이다. 치환 펩티드가 하나 이상, 최소 2, 및 바람직하게 3개의 개별의 CTL에 의해 인식되는 것 또한 바람직하다.
따라서, 본 발명의 항원결정부위는 자연적으로 발생하는 종양 관련 또는 종양 특이적 항원결정부위와 동일하거나 실질적으로 동일한 항원적 활성도를 가지고 있는 한, 참조 펩티드로부터 4개 이하의 잔기가 상이한 항원결정부위를 포함한다. 실질적으로 동일한 항원적 활성도란 필적할만한 결합활성, 작용기 또는 기억 표현형, 유사한 반응 패턴 하에서 필적할만한 빈도나 수에 의한 T 세포의 자극을 의미한다.
면역 반응 자극은 숙주 면역계에 의해 외부 항원으로서 인식된 항원의 존재에 의존한다. 종양 특이적 항원 존재의 발견은 숙주 면역계를 이용하여 종양 성장에서 개입하는 가능성을 증가시킨다. 면역계의 체액 및 세포 암을 이용하는 다양한 기전은 현재 암 면역 치료로 탐구된다.
세포 면역 반응의 특이적 요소들은 종양 세포를 특이적으로 인식하고 파괴할 수 있다. 세포독성 T 세포(CTL)의 종양 침투 세포 집단에서의 또는 말초 혈액에서의 단리는 이런 세포들이 암에 대해 자연 면역 방어로써의 중요한 역할을 할 수 있다는 것을 시사한다. 특히 CD8-양성 T 세포는 세포질에 위치한 단백질이나 결손 리보솜 산물들(DRIPS)로부터 유래된 보통 8에서 12개의 주 조직적합 복합체(MHC)-함유 펩티드의 클래스 I 분자를 인지하며, 이 반응에서 중요한 역할을 한다. 인간의 MHC-분자도 인간 백혈구-항원(HLA)로 지정된다
MHC 클래스 I 분자는 주로 내생 단백질, 시토솔 또는 핵 단백질, DRIP 및 더 큰 펩티드의 단백질 가수분해 절단을 야기하는 펩티드가 존재하는 핵을 갖는 대부분의 세포에서 발견될 수 있다. 하지만 엔도솜 구획이나 외인성 출처로부터 유래된 펩티드 또한 MHC 클래스 I 분자에서 종종 발견된다. 이러한 비고전적 방식의 클래스 I 제시를 문헌에서는 교차-제시라고 칭한다.
CD8 및 CD4에 의존하는 두 유형의 반응이 항종양 효과에 협동 및 상승 작용을 통해 기여하므로, CD8-양성 CTL(MHC 클래스 I 분자) 또는 CD4-양성 CTL(MHC 클래스 II 분자)에 의해 인지되는 종양 특이적 항원들의 확인 및 특성화는 종양 백신의 개발에 중요하다. 그러므로 본 발명의 목적은 두 가지 클래스의 MHC 복합체에 결합하는 펩티드를 함유하는 펩티드 조성물을 제공하는 것이다.
암 치료와 관련된 심한 부작용과 비용을 고려할 때 보다 나은 예후 및 진단 방법이 절실히 필요하다. 따라서 일반적으로 암 및 특히 교모세포종을 위한 바이오마커를 대표하는 다른 인자들을 파악할 필요가 있다. 더욱이 일반적으로 암과 특히 교모세포종의 치료에서 사용할 수 있는 인자들의 파악이 필요하다.
본 발명은 본 발명의 펩티드를 과도 또는 배타적으로 제시하는 암/종양, 바람직하게는 뇌암, 보다 더 바람직하게는 교모세포종에 유용한 펩티드를 제공한다. 이 펩티드는 질량 분석법에 의해 원발성 인간 교모세포종 샘플(실시예 1 및 도 1 참고) 상에서 HLA 분자에 의해 자연적으로 제시되는 것으로 나타났다.
펩티드가 유래하는 출처 유전자/단백질("전장 단백질" 또는 "기저 단백질"로도 지정됨)은 출처 유전자에 대한 고도의 종양-연관을 표출하는 정상 조직과 비교해서 교모세포종에서 고도로 과발현되는 것으로 나타났다(교모세포종에 대해 실시예 2 및 도 2 참조). 더욱이 펩티드 자체는 종양 조직에서 강력히 과다제시되지만 정상 조직에서는 그렇지 않다(실시예 1 및 도 3 참조).
HLA-결합된 펩티드는 면역계 특히 T 림프구/T 세포에 의해서 인식될 수 있다. T 세포들은 인식되는 HLA/펩티드 복합물을 제시하는 세포들, 예를 들면, 유도된 펩티드를 제시하는 교모세포종 세포를 파괴할 수 있다.
본 발명의 모든 펩티드는 T 세포 반응을 자극할 수 있고/거나 과다제시되는 것으로 나타났으므로, 본 발명에 따른 항체 및/또는 sTCR의 생산에 사용될 수 있다(실시예 3 및 1, 및 도 4 및 도 3 참조). 그러므로, 이 펩티드는 환자의 종양 세포를 파괴할 수 있는 면역 반응을 생성하는데 유용하다. 환자의 면역 반응은 설명된 펩티드의 직접적인 투여 또는 면역원성을 강화할 수 있는 제제(즉, 보조제)와 섞인 적당한 전조 물질(예를 들면, 연장된 펩티드, 단백질, 또는 이러한 펩티드를 인코딩하는 핵산)을 환자에게 투여하는 것으로 유도될 수 있다. 이런 치료적 백신에서 생긴 면역 반응은 본 발명의 목적 펩티드가 비교가능한 복사수로 정상 조직에서는 나타나지 않고, 환자의 정상 세포에 대한 기피되는 자기 면역 반응의 위험을 배제하기 때문에 종양 세포에 아주 특정할 수 있다.
약학 조성물은 유리 형태 또는 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 된 펩티드를 포함한다. 여기서 사용되는 것처럼, "약학적으로 허용가능한 염"은 펩티드가 산 또는 제제의 염기 염을 만들며 변형되는 공개된 펩티드의 유도체를 말한다. 예를 들면, 산 염은 적당한 산과의 반응을 가진 자유 염기(일반적으로 중성 NH2 기가 있는 약물의 중성 형태)에서 준비된다. 산 염을 준비할 때 적당한 산은 예를 들면, 염산, 브롬화 수소산, 황산, 질산 인산과 같은 같은 무기산 뿐만 아니라 초산, 프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 수산, 말산, 말론산, 호박산, 말레산, 푸마르산, 주석산, 구연산, 벤조산, 계피산, 맨델릭산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 살리실산같은 유기산을 포함한다. 반대로, 펩티드에서 나타날 수 있는 산 잔기의 염기 염의 준비는 수산화 나트륨, 수산화 칼륨, 수산화 암모늄, 수산화 칼슘, 트리메틸아민과 같은 약학적으로 허용가능한 염기를 사용한다.
특별히 바람직한 약학 조성물의 구현은 초산(아세트산염), 삼불화 초산 또는 염산(염화물)의 염으로의 펩티드로 구성된다.
암 치료에 유용함에 덧붙여, 본 발명의 펩티드는 진단으로도 유용하다. 펩티드가 뇌암 세포에서 생성되고 이런 펩티드가 정상 조직에서는 존재하지 않거나 보다 낮은 농도로 존재한다는 것이 결정되었기 때문에 이런 펩티드는 암의 존재의 진단에 사용될 수 있다.
주장되는 펩티드의 조직 생체 검사에서의 존재는 암의 진단 시 병리학자를 도울 수 있다. 항체, 질량 분석, 또는 이 분야에 다른 알려진 방법을 통한 특정 펩티드의 탐지는 조직이 악성 또는 염증이 있는지 또는 일반적으로 병들어 있는지 병리학자에게 알려줄 수 있다. 펩티드의 그룹의 존재는 병든 조직의 분류 또는 하위 분류를 가능하게 한다. 병든 조직 표본의 펩티드의 탐지는 특히 만약 T 림프구가 작용 기전에 참여하는 것으로 알려져 있거나 기대할 때, 면역계를 포함한 치료의 이익에 대한 결정을 내릴 수 있게 한다. MHC 발현의 손실은 감염된 악성 세포가 면역 감시를 탈출하는 데에서 잘 설명되는 기전이다. 펩티드의 존재는 이 기전이 분석된 세포에서 악용되지 않는 것을 보여준다.
본 발명의 펩티드는 펩티드 또는 MHC 분자에 합성된 펩티드에 대한 T 세포 반응 또는 항체 반응 같은 펩티드에 대한 림프구 반응을 분석하는데 사용될 수 있다. 이런 림프구 반응은 추가 치료 단계에서 결정을 내릴 때 전조 마커로 사용될 수 있다. 이런 반응은 또한 림프구 반응을 여러 방법으로, 예를 들면, 단백질 백신, 핵산, 자가 조직 물질, 림프구의 양자 면역 전송을 유도하는 것을 목표로 하는 면역치료의 대리 마커로 사용될 수 있다. 유전자 치료 설정에서, 펩티드에 대한 림프구 반응은 부작용의 평가에서 고려할 수 있다. 림프구 반응의 모니터링은 이식 요법의 후속 시험, 예를 들면, 이식 대 숙주의 감지 및 숙주 대 융합 질병을 위한 중요한 도구가 될 수도 있다.
본 발명의 펩티드는 MHC/펩티드 합성물에 대한 특이적 항체를 생성하고 개발하는데 사용될 수 있다. 이들은 병든 조직에 치료, 독성 물질 표적화 또는 방사능 물질을 위해 사용될 수 있다. 이런 항체의 또 다른 사용은 PET 같은 이미지 목적을 위해 병든 조직에 방사성 핵종을 표적할 수도 있다. 이 사용은 작은 전이를 감지하거나 병든 조직의 크기와 정확한 위치를 결정하는데 도움이 될 수 있다.
그러므로 본 발명의 다른 양태는 HLA-제한 항원과 복합되는 인간 주 조직적합 복합체(MHC) 클래스 I 또는 II와 특이적으로 결합하는 재조합 항체의 생산 방법을 제공하는 것으로, 이 방법은 상기 HLA-제한 항원과 복합되는 용해성 형태의 MHC 클래스 I 또는 II 분자와 상기 인간 주 조직적합 복합체(MHC) 클래스 I 또는 II를 발현하는 세포를 포함하는 유전자 조작된 비인간 포유동물의 면역화; 상기 비인간 포유동물의 세포를 생산하는 항체로부터 mRNA 분자의 단리; 상기 mRNA 분자에 의해 인코딩된 단백질 분자를 표시하는 파지 디스플레이 라이브러리의 생산; 및 상기 파지 디스플레이 라이브러리로부터 하나 이상의 파지의 단리를 포함하며 상기 하나 이상의 파지는 상기 HLA-제한 항원과 복합되는 상기 인간 주 조직적합 복합체(MHC) 클래스 I 또는 클래스 II와 특이적으로 결합하는 상기 항체를 나타낸다.
본 발명의 다른 양태는 HLA 제한 항원과 복합되는 인간 주 조직적합 복합체(MHC) 클래스 I 또는 II에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하는 것으로 이 항체는 바람직하게는 다클론 항체, 단클론 항체, 이중특이성 항체 및/또는 키메라 항체이다.
본 발명의 또 다른 양태는 HLA-제한 항원과 복합되는 인간 주 조직적합 복합체(MHC) 클래스 I 또는 II에 특이적으로 결합하는 상기 항체를 생산하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 상기 HLA-제한 항원과 복합되는 용해성 형태의 MHC 클래스 I 또는 II 분자와 상기 인간 주 조직적합 복합체(MHC) 클래스 I 또는 II를 발현하는 세포를 포함하는 유전자 조작된 비인간 포유동물의 면역화; 상기 비인간 포유동물의 세포를 생산하는 항체로부터 mRNA 분자의 단리; 상기 mRNA 분자에 의해 인코딩된 단백질 분자를 표시하는 파지 디스플레이 라이브러리의 생산; 및 상기 파지 디스플레이 라이브러리로부터 하나 이상의 파지의 단리를 포함하며, 상기 하나 이상의 파지는 상기 HLA-제한 항원과 복합되는 상기 인간 주 조직적합 복합체(MHC) 클래스 I 또는 II와 특이적으로 결합가능한 상기 항체를 나타낸다. 이러한 항체들과 단일 쇄 클래스 I 주 조직적합 복합체를 생산하는 해당 방법들은 물론 이러한 항체의 생산용 도구들은 다음에 소개되어 있다: WO 03/068201, WO 2004/084798, WO 01/72768, WO 03/070752, 및 (Cohen CJ, Denkberg G, Lev A, Epel M, Reiter Y. MHC-제한, 펩티드-특이적, T 세포 수용체-유사 특이성을 갖는 재조합 항체: 항원-제시 및 TCR-펩티드-MHC 상호작용을 연구하는 새로운 도구. J Mol Recognit. 2003 Sep-Oct;16(5):324-32); (Denkberg G, Lev A, Eisenbach L, Benhar I, Reiter Y. 흑색종 분화 항원으로 유도된 TCR-유사 특이성을 갖는 재조합 항체를 사용한 흑색종 및 APC의 선택적인 표적. J Immunol. 2003 Sep 1;171(5):2197-207); 및 (Cohen CJ, Sarig O, Yamano Y, Tomaru U, Jacobson S, Reiter Y. 인간 MHC 클래스 I 항원-제시의 직접적 표현형 분석: 펩티드-특이적 MHC-제한 인간 재조합 항체를 사용하는 인간 바이러스 에피톱의 가시화, 정량화 및 동일 반응계 검출. J Immunol. 2003 Apr 15; 170(8):4349-61), 이는 본 발명의 목적상 그 전체가 참조로서 모두 명시적으로 포함된다.
바람직하게는 항체는 20 나노몰 미만의 바람직하게는 10 나노몰 미만의 결합 친화력으로써 복합체와 결합하는데, 이는 본 발명의 문맥 상 "특이적"으로 간주된다.
본 발명의 다른 양태는 특이적 펩티드-MHC 복합체를 인지하는 용해성 T 세포 수용체의 생산 방법을 제공하는 것이다. 이러한 용해성 T 세포 수용체는 특이적 T 세포 클론으로부터 생성 가능하며, 그 친화력은 상보결정 부위를 표적으로 하는 돌연변이유발성에 의해 증가시킬 수 있다. T 세포 수용체 선택의 목적 상, 파지 디스플레이를 사용할 수 있다(US 2010/0113300, (Liddy N, Bossi G, Adams KJ, Lissina A, Mahon TM, Hassan NJ, et al. 단클론성 TCR-재유도된 종양 세포 사멸. Nat Med 2012 Jun;18(6):980-987)). 파지 디스플레이 동안 T 세포 수용체의 안정제 목적 상 및 약물로서의 실용적인 용도의 경우, α 및 β 쇄로 연결될 수 있으며, 예를 들면 비정상적 이황화 결합, 기타 공유 결합(단일-쇄 T 세포 수용체) 또는 이합체화 도메인에 의해 연결된다((Boulter JM, Glick M, Todorov PT, Baston E, Sami M, Rizkallah P, et al. 결정화를 위한 안정한 용해성 T 세포 수용체 분자 및 치료. Protein Eng 2003 Sep;16(9):707-711); (Card KF, Price-Schiavi SA, Liu B, Thomson E, Nieves E, Belmont H, et al. 용해성 단쇄 T 세포 수용체 IL-2 융합 단백질은 MHC-제한 펩티드의 특이성 및 IL-2 생활성도를 보유한다. Cancer Immunol Immunother 2004 Apr;53(4):345-357); 및 (Willcox BE, Gao GF, Wyer JR, O'Callaghan CA, Boulter JM, Jones EY, et al. 리간드 결합의 생물물리적 분석에 적합한 용해성 αβ T 세포 수용체 이질이합체의 생산. Protein Sci 1999 Nov; 8(11):2418-2423)). T 세포 수용체는 표적 세포에 대한 특정 기능의 실행을 목적으로 독소, 약물, 사이토카인(US 2013/0115191 참고), 항-CD3 도메인과 같은 작용기 세포를 모집하는 도메인 등과 연결될 수 있다. 더욱이 이것은 입양 전달에 사용되는 T 세포에서 발현될 수 있다. 추가 정보는 WO 2004/033685A1 및 WO 2004/074322A1에서 찾을 수 있다. sTCR의 조합은 WO 2012/056407A1에 설명되어 있다. 이 생산에 관한 추가 방법들은 WO 2013/057586A1에 공개되어 있다.
그 밖에 이들은 생검한 샘플에 근거하는 병리학자의 암 진단을 확인하는데 사용될 수 있다.
과도 제시된 펩티드를 선택하기 위해, 중간 샘플 제시는 물론 복제 변이체를 보여주는 제시 프로필이 계산된다. 이 프로필은 관심 대상의 종양 객체 샘플을 정상 조직 샘플의 기준에 병치한다. 다음, 이 프로필 각각은 선형 혼합효과 모형의 p-값을 계산하여 과도-제시 점수에 통합될 수 있으며(J. Pinheiro, D. Bates, S. DebRoy, Sarkar D., R Core team. nlme: 선형 및 비선형 혼합 효과 모형. 2008) 틀린 발견 비율에 의해 다중 검정을 조절한다(Y. Benjamini and Y. Hochberg. 틀린 발견 비율의 통제: 다중 검증에 대한 실효적이고 강력한 접근 방법. Journal of the Royal Statistical Society. Series B(Methodological), Vol.57(No.1):289-300, 1995).
질량 분석에 의한 HLA 리간드의 동정 및 상대적 정량화를 위해, 충격동결된 조직 샘플에서 얻어진 HLA 분자를 정제하고 HLA-연관 펩티드를 단리했다. 단리된 펩티드를 분리하여 그 서열을 온라인 나노-전기분무-이온화(nanoESI) 액체 크로마토그래피-질량 분석(LC-MS) 실험에 의해 식별했다. 교모세포종 샘플로부터 기록된 자연적 TUMAP의 단편 패턴을 동일한 서열을 가진 상응하는 합성 기준 펩티드의 단편 패턴과 비교하여, 얻어진 펩티드 서열을 확인했다. 펩티드는 원발성 종양의 HLA 분자의 리간드로서 직접 식별되기 때문에, 그 결과는 교모종 환자에서 얻어진 원발 종양 조직에 대해 동정된 펩티드의 자연적 처리와 제시에 대한 직접적 증거를 제공한다.
독점적 발견 파이프라인 XPRESIDENT(등록상표) v2.1(예를 들면 미국 특허 번호 13/640,989를 참고)은 몇 가지 다른 비암성 조직 및 기관에 비해 암 조직에 대한 HLA-제한 펩티드 수준의 직접적인 상대적 정량화를 기준으로 관련 있는 과도-제시된 펩티드 백신 후보의 식별과 선정택을 허용한다. 이는 서열 식별, 스펙트럼 집락화, 전화 이온 계수화, 정체 시간 정렬, 상태 디컨볼루션 및 정상화에 필요한 알고리즘을 조합시킨 독점 데이터 분석 파이프라인에 의해 처리하여 획득한 LC-MS 데이터를 사용한 무표지(label-free) 차등 정량화의 개발에 의해 성취되었다.
펩티드와 샘플 각각에 대한 오류 측정치 등 제시 수준이 확립되었다. 종양 조직에 배타적으로 제시된 펩티드 및 종양에서 과도-제시된 펩티드 대비 비암성 조직 및 기관이 식별된 바 있다.
32개의 HLA-A*02-제한 및 13개의 HLA-A*24-제한 충격 동결된 교모세포종 종양 조직 샘플에서 얻어진 HLA-펩티드 복합체를 정제하고 HLA-연관 펩티드를 단리하여 LC-MS로 분석했다.
원발성 교모세포종 종양 샘플에 대한 이러한 접근 방식을 통해 가용한 용도에 포함된 모든 TUMAP를 식별했으며, 원발성 교모세포종에 대한 제시가 확인되었다.
다발성 교모세포종 종양 및 정상 조직에 대해 식별된 TUMAP를 무표지 LC-MS 데이터에 대한 이온-계수화를 사용하여 정량화했다. 이 방법은 펩티드의 LC-MS 신호 영역이 샘플에 존재하는 풍부함과 상관관계가 있음을 가정한다. 다양한 LC-MS 실험에서 펩티드의 모든 정량적 신호들을 LS-MS 실험을 중심 경향에 근거하여 정상화하고 샘플 당 평균화하여 제시프로필이라 부르는 막대 도표에 통합시켰다. 이 제시 프로필은 단백질 데이터베이스 검색, 스펙트럼 군락화, 충전 상태 디컨벌루션(방전) 및 시간 성격 및 정체 정상화와 같은 다른 분석 방법들을 통합시킨다.
그러므로 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 49, 서열번호 71 및 서열번호 74 내지 서열번호 129로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열 또는 서열번호 1 내지 서열번호 49, 서열번호 71 및 서열번호 74 내지 서열번호 129와 적어도 90% 상동성인 이의 변이체 서열 또는 상기 펩티드와 교차반응하는 T 세포를 유도하는 이의 변이체를 포함하는 펩티드에 관한 것으로 상기 펩티드는 전장 폴리펩티드가 아니다.
본 발명은 더욱이 서열번호 1 내지 서열번호 49, 서열번호 71 및 서열번호 74 내지 서열번호 129로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열 또는 서열번호 1 내지 서열번호 49, 서열번호 71 및 서열번호 74 내지 서열번호 129와 적어도 90% 상동성인 이의 변이체 서열을 포함하는 펩티드에 관한 것으로, 상기 펩티드나 변이체는 8에서 100개 사이, 바람직하게는 8에서 30개 사이 및 가장 바람직하게는 8에서 14개 사이의 아미노산인 전장을 갖는다.
본 발명은 더욱이 인간 주조직 적합 복합체(MHC) 클래스 I 또는 II의 분자와 결합하는 능력을 가진 이전에 설명한 펩티드에 관한 것이다.
본 발명은 더욱이 이전에 설명한 펩티드에 관한 것으로 그 펩티드는 서열번호 1 내지 서열번호 49, 서열번호 71 및 서열번호 74 내지 서열번호 129에 따른 아미노산 서열 또는 서열번호 1 내지 서열번호 49, 서열번호 71 및 서열번호 74 내지 서열번호 129와 적어도 90% 상동성인 이의 변이체 서열로 구성되거나 필수적으로 구성된다.
본 발명은 더욱이 이전에 설명한 펩티드에 관한 것으로 그 펩티드는 변형되고/거나 비펩티드 결합을 포함한다.
본 발명은 더욱이 이전에 설명한 펩티드에 관한 것으로, 펩티드는 융합 단백질이며, 특히 HLA-DR 항원-연관 불변쇄(Ii)의 N-말단 아미노산을 포함한다.
본 발명은 더욱이 이전에 설명한 펩티드를 인코딩하는 핵산에 관한 것이되, 상기 펩티드는 완전한 인간 단백질이 아니다.
본 발명은 더욱이 DNA, cDNA, PNA, RNA 또는 이들의 조합인 이전에 설명한 핵산에 관한 것이다.
본 발명은 더욱이 이전에 설명한 핵산을 발현할 수 있는 발현 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 더욱이 의학에서의 사용을 위해 이전에 설명한 펩티드, 이전에 설명한 핵산 또는 이전에 설명한 발현 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 더욱이 이전에 설명한 핵산 또는 전에 설명한 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명은 더욱이 항원-제시 세포인 설명한 바 있는 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명은 더욱이 설명한 바 있는 숙주 세포에 관한 것으로 항원-제시 세포는 수지상 세포이다.
본 발명은 더욱이 설명한 바 있는 펩티드 제조 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 본 발명에 따른 숙주 세포의 배양과 숙주 세포 또는 그 배양 배지로부터 펩티드의 분리를 포함한다.
본 발명은 더욱이 시험관 내에서 세포독성 T 림프구(CTL)를 항원-특이적 방식으로 상기 CTL을 활성화시키기에 충분한 시간 동안 적합한 항원-제시 세포의 표면에 발현된 인간 클래스 I 또는 II MHC 분자가 로딩된 항원과 접촉시키는 것을 포함하는 활성화된 CTL의 시험관 내 제조 방법에 관한 것으로, 상기 항원은 설명한 바 있는 임의의 펩티드이다.
본 발명은 더욱이 설명한 바 있는 방법에 관한 것으로, 충분한 양의 항원을 항원-제시 세포와 접촉시킴으로써 상기 항원이 적절한 항원-제시 세포의 표면에 발현된 클래스 I 또는 II MHC 분자에 로딩된다.
본 발명은 설명한 바 있는 방법에 관한 것으로, 항원-제시 세포가 서열번호 1 내지 서열번호 49, 서열번호 71 및 서열번호 74 내지 서열번호 129를 포함하는 상기 펩티드 또는 서열번호 1 내지 서열번호 49, 서열번호 71 및 서열번호 74 내지 서열번호 129와 적어도 90% 상동성인 이의 변이체 서열 또는 상기 변이체 아미노산 서열을 발현할 수 있는 발현 벡터를 포함한다.
본 발명은 더욱이 설명한 바 있는 방법에 의해 생산된 활성화 세포독성 T 림프구(CTL)에 관한 것으로, 이는 설명된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 이상 발현하는 세포를 선택적으로 인식한다.
본 발명은 더욱이 표적 세포가 설명한 바 있는 임의의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 이상 발현하는 환자에서 그 표적 세포를 죽이는 방법에 관한 것으로, 그 방법은 본 발명에 따른 효과적인 숫자의 세포독성 T 림프구(CTL)를 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
본 발명은 더욱이 설명한 바 있는 임의의 펩티드, 설명한 바 있는 핵산, 설명한 바 있는 발현 벡터, 설명한 바 있는 세포 또는 설명한 바 있는 활성화된 세포독성 T 림프구를 약제로서의 또는 약제의 제조에서의 사용에 관한 것이다.
본 발명은 더욱이 설명한 바 있는 사용에 관한 것으로 그 약제는 백신이다.
본 발명은 더욱이 설명한 바 있는 사용에 관한 것으로 그 약제가 암에 대해 활성을 갖는다.
본 발명은 더욱이 설명한 바 있는 사용에 관한 것으로 상기 암 세포가 교모세포종 또는 다른 뇌종양이다.
더욱이 본 발명은 사전선별된 종양-연관 펩티드들의 창고를 사용하여 바람직하게는 본 발명 및/또는 여기에서 설명된 내용에 따라 개별 환자를 위한 맞춤화된 항암 백신의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명은 더욱이 교모세포종의 예후에 사용할 수 있는 특정한 마커 단백질 및 바이오마커에 관한 것이다.
본 발명은 더욱이 암 치료를 위해 이러한 신규 표적들의 사용에 관한 것이다.
용어 "항체들"은 여기에서 광범위한 의미로 사용되며, 다클론 및 단클론 항체를 둘 다 포함한다. 손상되지 않은 온전한 면역 글로불린 항체 분자 뿐만 아니라, 용어 "항체들"에 포함되어 있는 것은 그런 면역 글로불린 항체 분자와 본 발명에 따른 특성(예를 들면, 교모세포종 마커 폴리펩티드의 특정 결합, 높아진 수준의 교모세포종 마커 유전자를 발현하는 교모세포종 세포에 독성 전달, 및/또는 교모세포종 마커 폴리펩티드의 활동 억제)을 보이는 한 인간화된 버전의 면역 글로불린 항체 분자들의 단편 또는 중합체이다.
가능한 한, 본 발명의 항체는 상용 공급원에서 구입해야 한다. 본 발명의 항체는 잘 알려진 방법을 통해서 생성될 수도 있다. 이 분야의 기술자는 전장 교모세포종 마커 폴리펩티드 또는 그 단편이 발명의 항체를 만드는 데 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 항체를 생성하는 데에 사용될 폴리펩티드는 자연적인 원천에서 부분적으로 또는 완전히 정제될 수 있으며, 또는 재조합 DNA 기술을 이용하여 생성될 수도 있다.
예를 들면 PTPRZ1, BCAN 및 FABP7 또는 서열번호 1 내지 서열번호 49, 서열번호 71 및 서열번호 74 내지 서열번호 129에 따른 다른 모든 폴리펩티드 또는 서열번호 1 내지 서열번호 49, 서열번호 71 및 서열번호 74 내지 서열번호 129와 적어도 90% 상동성인 이의 변이체 서열 또는 그의 단편을 인코딩하는 cDNA는 원핵 세포(예를 들면 박테리아) 또는 진핵 세포(예를 들면 효모, 곤충 또는 포유류 세포)에서 발현될 수 있으며, 재조합 단백질은 그 후 정제되고 본 발명에 따른 항체 생성에 사용되는 교모세포종 마커 폴리펩티드에 특정하게 결합하는 단클론 또는 다클론 항체 제조에 사용될 수 있다.
당해 기술분야의 지식을 가진 자는 두 개 이상의 다른 단클론 또는 다클론 항체의 조합의 생성은 의도하는 사용(예를 들면 ELISA, 면역조직화학, 생체 내 이미징, 면역 독소 요법)에 요구되는 특이성 및 친화성을 갖는 항체의 획득 가능성을 최대화함을 인식할 것이다. 이 항체들은 그 항체들이 사용되는 목적에 의거하여 알려진 방법에 의해 바라는 활성도에 대해 시험된다(예를 들면 ELISA, 면역조직화학, 면역요법 등; 항체의 생성과 시험에 관한 추가 지침은 다음을 참고한다(예를 들면 (Harlow and Lane, 항체: 실험실 매뉴얼, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988)). 예를 들면, 항체는 포르말린 고정 교모세포종이나 동결된 조직 절편의 ELISA 검정, 웨스턴 블롯, 면역조직화학 염색으로 시험할 수 있다. 치료 또는 생체 내 진단용을 위한 항체는 초기의 시험관 내 특성화 이후, 알려진 임상 시험 방법에 따라 시험한다.
"단클론 항체"라는 용어는 여기서 실질적으로 균등질 항체 개체군에서 획득이 된 것을 말한다. 즉, 이 개체군이 포함하는 각각의 항체는 자연적으로 일어날 수 있는 소수의 변이체를 제외하고는 동일하다. 단클론 항체는 여기서 특히 중쇄 및/또는 경쇄의 한 부분이 특정한 종 또는 특정한 항체 클래스 또는 서브클래스에서 유도된 항체의 서열과 상응하거나 일치하고, 쇄의 나머지 부분은 다른 종 또는 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에서 유도된 항체, 및 이러한 항체의 단편의 서열과 상응하거나 일치하고, 희망하는 상반되는 활동성을 보여주는 "키메릭(chimeric)" 항체를 포함한다(미국 특허 번호 4,816,567 전문이 참조로 여기에 포함됨).
본 발명의 단클론 항체는 하이브리도마 방법을 사용하여 준비될 수 있다. 하이브리도마 방법에서는, 생쥐 또는 다른 적당한 숙주 동물이 보통 면역원성을 주는 작용질에 의해 면역되어, 면역원성을 주는 작용질에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하거나 이를 생산할 수 있는 능력을 가지고 있는 림프구를 유도해 낸다. 다른 방법으로는, 림프구가 시험관 내에서 면역될 수 있다.
단클론 항체는 미국 특허 번호 4,816,567에서 묘사된 바 있는 재조합 DNA 방법으로 만들어질 수도 있다. 본 발명의 단클론 항체를 인코딩하는 DNA는 손쉽게 단리되고 전통적인 방법을 사용하여 염기 서열 분석이 가능하다(예를 들면 마우스 유래 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특정하게 결합할 수 있는 능력이 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써).
시험관 내 방법 또한 1가의(monovalent) 항체를 준비하는 데에 적당하다. 이 분야에서 잘 알려진 방법을 사용하여 항체를 절편화시켜 항체의 단편을 특히 여기서는 Fab 단편을 생산할 수 있다. 예를 들면, 파파인을 사용하여 절편화가 이루어질 수 있다. 이 파파인 절편화의 예는 WO 94/29348(1994년 12월 22일 발행) 및 미국 특허 번호 4,342,566에 묘사되어 있다. 항체의 파파인 절편화는 각각 하나의 항원 결합 위치 및 남은 Fe 단편을 포함한 Fab 단편의 동일한 두 개의 항원 결합 단편을 생산한다. 펩신 치료는 두 개의 항원 결합 위치를 가지고 있으며 여전히 교차 결합의 능력을 가지고 있는 단편을 만든다.
항체 단편도, 이가 다른 서열과 붙어 있든 그렇지 않든 간에, 이 단편의 활동력이 변경되지 않은 항체 또는 항체 단편에 비교할 시, 현저하게 바뀌거나 손상되지 않는 한, 삽입, 결실, 치환, 또는 특정한 위치의 또는 특이적 아미노산 잔기의 다른 선택된 변경을 포함할 수 있다. 이러한 변경은 이황화물 결합의 능력이 있는 아미노산의 제거/추가, 생물적 생명의 증가, 분비 특징의 변화 등의 추가적인 특성을 제공할 수 있다. 어떤 경우에도, 항체 단편은 결합성, 결합 도메인에서의 결합 조정 등의 생물작용 성질을 소유하고 있어야 한다. 항체의 기능적인 또는 활동적인 범위는 단백질의 특정한 지역의 돌연변이 생성, 발현 및 이 발현된 폴리펩티드의 실험에 의해 확인될 수 있다. 이러한 방법은 이 분야의 기술자가 손쉽게 알 수 있는 기술이며 이는 항체 단편을 인코딩하는 핵산의 위치-특정 돌연변이 생성을 포함할 수 있다.
본 발명의 항체는 인간화된 항체 또는 인간 항체를 추가로 포함할 수 있다. 인간화된 형태의 비-인간(예를 들면 쥐과 동물) 항체는 최소의 비-인간 면역글로불린 항체에서 유도된 서열을 포함하는 키메릭 면역글로불린항체, 면역글로불린 쇄 또는 이들의 단편(Fv, Fab, Fab' 또는 다른 항체의 항원 결합의 결과)이다. 인간화된 항체는 상보적 결정 영역(complementary determining region(CDR))의 잔기가 생쥐, 쥐 또는 토끼와 같은 비-인간 종(공여 항체)의 CDR의 잔기로 바뀐 요구되는 특이성, 친화력 및 수용력을 가진 인간 면역글로불린(공여 항체)이다. 몇몇의 예에서는, 인간 면역글로불린의 Fv 구조(FR) 잔기가 상응하는 비-인간 잔기로 교체된다. 인간화된 항체는 수용 항체 또는 도입된 CDR 또는 구조 서열의 어디에서도 찾을 수 없는 서열을 포함하기도 한다. 보통, 인간 항체는 가변 도메인을 적어도 하나 또는 거의 대부분 두 개를 포함하며, 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 범위는 비-인간 면역글로불린에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 구조 범위는 인간 면역글로불린 일치 서열이다. 인간화된 항체는 최적으로 적어도 보통 인간 면역 글로불린의 면역글로불린 불변 범위(Fc)의 한 부분 또한 포함할 것이다.
이 분야에서 비-인간 항체를 인간화하는 방법은 잘 알려져 있다. 보통, 인간화된 항체는 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 비-인간 근원에서 이에 도입된다. 이 비-인간 아미노산 잔류들은 종종 "도입" 잔기이라고 일컬어지며, 이는 대개 "도입" 가변 도메인에서 출처한다. 인간화는 본질적으로 설치류의 CDR 또는 상응하는 인간 항체 서열의 CDR 서열을 인간의 것으로 교체하는 것으로 실행될 수 있다. 따라서, 이러한 "인간화된" 항체는 실질적으로 전체보다 적은 인간 변수 도메인이 상응하는 비-인간 종의 서열로 교체가 된, 키메릭 항체(미국 특허 번호 4,816,567)이다. 실제적으로, 인간화된 항체는 보통 몇몇의 CDR 잔기 및 가능하게는 몇몇의 구조 잔기가 이 설치류 항체의 유사한 영역의 잔기에 의해 치환된 인간 항체이다.
면역되었을 때, 내생의 면역글로불린 생성이 없는 중에 전체 인간 항체를 생산할 수 있는 유전자 변형 동물(예를 들면 생쥐)이 사용될 수 있다. 예를 들면, 키메릭 생식 계열 돌연변이 생쥐의 항체의 중쇄 결합 영역 유전자 동형 삭제는 내생 항체 생산의 완전한 억제 결과를 가져온다. 이러한 생식 계열 돌연변이 생쥐로의 인간 생식 계열 면역글로불린 유전자 분석의 이입은 항원이 존재할 때 인간 항체 생산의 결과를 낳을 것이다. 인간 항체는 파지 디스플레이 라이브러리에서도 생산될 수 있다.
본 발명의 항체는 약학적으로 허용가능한 담체에 의해서 피험자에게 투여하는 것이 바람직하다. 보통, 적당한 양의 약학적으로 허용가능한 염이 제형을 등장 상태로 만들기 위해 제형에 사용된다. 약학적으로 허용가능한 담체의 예로는, 링거 용액(Ringer's solution) 및 포도당 용액이 있다. 이 용액의 pH는 바람직하게는 약 5 내지 약 8이며, 더 바람직하게는 약 7 내지 약 7.5이다. 더 많은 담체는 항체를 포함하는 고체 소수성 중합체 반투성의 세포간질과 같은 지속적인 방출 준비를 포함하고, 세포간질은 막, 리포좀 또는 미세입자와 같은 형태로 되어 있다. 예를 들면, 투여 방법 및 투여되는 항체의 농도에 따라 어떤 담체가 더 바람직한지는 이 분야의 당업자에게는 명백할 것이다.
항체는 피험자, 환자 또는 세포에 주사(예를 들면 정맥내, 복강내, 피하, 근육내), 또는 주입과 같은 혈액으로서의 전달이 효율적으로 이루어질 수 있는 다른 방법으로 투여될 수 있다. 항체는 국소뿐만이 아니라 전신의 치료 효과를 얻기 위해 종양 내 또는 종괴 주위의 방법으로도 투여될 수도 있다. 국소 또는 정맥내 주사가 바람직하다.
항체 투여의 효율적인 용량과 스케줄은 경험적으로 결정될 수 있으며, 이러한 결정을 내리는 것은 이 분야의 기술 중의 하나다. 이 분야의 당업자는 투여되는 항체의 용량이 예를 들면 이 항체를 받는 대상, 투여 방법, 사용되는 특정한 항체의 종류 및 투여되는 다른 약들에 따라 달라진다는 것을 이해할 것이다. 단독으로 사용될 시 전형적인 항체의 일일 용량은 1μg/kg/일 내지 100 mg/kg/일로 다를 수 있으며, 위에 언급된 요인을 고려할 때 이보다 더 높을 수도 있다. 교모세포종의 치료를 위한 항체의 투여 후, 이 분야의 기술자들에게 알려진 다양한 방법으로 이 치료 항체의 효능을 평가할 수 있다. 예를 들면, 치료를 받는 피험자에서 교모세포종의 크기, 숫자 및/또는 분포를 표준 종양 영상 기술을 이용하여 모니터할 수 있다. 항체의 투여가 없을 경우 일어날 수 있는 질환의 과정에 비해, 종양의 성장을 정지시켜, 종양을 오그라들게 하거나, 새로운 종양의 성장을 예방하는 치료의 목적으로 투여된 항체는 효과있는 교모세포종의 치료이다.
본 발명의 교모세포종 마커들인 PTPRZ1, BCAN, FABP7 등은 교모세포종 세포에서 고도로 발현되며 정상 세포에서는 극도로 낮은 수준으로 발현되기 때문에, PTPRZ1, BCAN, FABP7 발현 또는 폴리펩티드 활성도의 저해는 교모세포종의 치료나 예방을 위한 임의의 치료 전략에 포함시킬 수 있다.
안티센스 치료의 원리는 유전자 발현(전사 또는 번역을 통한) 서열 특정 억제가 세포내 유전자 DNA 또는 mRNA와 상보적 안티센스 종의 혼성화에 의하여 이루어질 수 있다는 가설에 기반을 둔다. 이러한 하이브리드 핵산 듀플렉스의 형성은 표적 종양 항원 코딩 유전자 DNA의 전사, 처리/운반/번역 및/또는 표적 종양 항원 mRNA의 안정성을 방해한다.
안티센스 핵산은 여러 가지 방법으로 전달될 수 있다. 예를 들면, 안티센스 올리고뉴클레오티도 또는 안티센스 RNA는 종양이 섭취할 수 있도록 대상에게 직접 투여(예를 들면 정맥내 주입)될 수 있다. 다른 방법으로는 안티센스 RNA(또는 RNA 단편)를 인코딩하는 바이러스 또는 플라스미드 벡터가 생체 내에서 세포 안으로 투여될 수 있다. 안티센스 효과는 센스 서열에 의해서 유도될 수도 있으나, 표현형 변화의 정도의 변수가 높다. 효율적인 안티센스 치료로 유도되는 표현형 변화는 예를 들면 표적 mRNA 수준, 표적 단백질 수준 및/또는 표적 단백질 활동 수준의 변화로 평가될 수 있다.
특정한 예로서, 폐종양 마커 기능의 안티센스 유전자 치료로의 억제는 안티센스 폐종양 마커 RNA의 직접적인 대상으로의 투여에 의해서 이루어질 수 있다. 안티센스 종양 마커 RNA는 어떤 기본적인 방법을 통해 생성되고 분리될 수 있지만, 이는 가장 빠르게 안티센스 종양 마커 cDNA를 이용하여 높은 효율성을 갖는 프로모터 조정 아래에서 시험관 내 전사에 의해 얻어질 수 있다(예를 들면 T7 프로모터). 안티센스 종양 마커 RNA의 세포로의 투여는 하기 직접 핵산 투여의 방법으로 이루어질 수 있다.
외생 DNA의 대상의 세포로의 투여와 흡수를 포함하는 위에 묘사된 방법(예를 들면 유전자 전사와 감염)에서, 본 발명의 핵산은 벌거벗은 DNA 또는 벡터 형태의 핵산일 수 있으며, 이는 핵산을 세포로 전달하여 위 종양 마커 단백질 발현의 억제에 사용된다. 벡터는 아데노바이러스 벡터(콴텀 바이오테크놀로지즈 인코포레이티드(Quantum Biotechnologies, Inc.), 캐나다 퀘벡주 라발 소재)와 같이 상용적으로 구입할 수 있다. 핵산 또는 벡터의 세포로서의 전달은 여러 가지의 기전으로 이루어 진다. 하나의 예로서, 이 전달은 리포펙틴(LIPOFECTIN), 리포펙타민(LIPOFECTAMINE)(킵코-25 비알엘 인코포레이티드(GIBCO-25 BRL, Inc.), 미국 메릴랜드주 게이티스버그 소재), 슈퍼펙트(SUPERFECT)(퀴아젠 인코포레이티드(Qiagen, Inc.), 독일 힐덴 소재) 및 트랜스펙탐(TRANSFECTAM)(프로메가 바이오텍 인코포레이티드(Promega Biotec, Inc.), 미국 위스콘신주 매디슨 소재)와 같이 상용적으로 구입이 가능한 리포솜 준비물 또는 이 분야의 기준 방법에 의해서 개발된 다른 리포솜을 사용하여 가능하다. 추가적으로, 본 발명의 핵산 또는 벡터의 생체내 전달은 제네트로닉스 인코포레이티드(Genetronics, Inc.)(미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)와 소노포레이션(SONOPORATION) 기계(이마알엑스 파마슈티칼 코포레이션(ImaRx Pharmaceutical Corp.), 미국 애리조나주 툭손 소재)를 사용한 전기 천공법을 사용하여 이루어질 수 있다.
이 항체들은 생체 내의 진단 분석에 사용될 수도 있다. 보통, 항체는 방사성핵종으로 표지되고(예를 들면 111In, 99Tc, 14C, 131I, 3H, 32P 또는 35S) 면역 섬광 조형술을 사용하여 종양의 위치가 결정될 수 있다. 하나의 구현에서는, 항체 또는 그 단편은 두 개 또는 그 이상의 ABCA13, 항원(항원결정부위) 표적의 세포외 도메인에 결합을 하고 친화성 값(Kd)은 1x10μM 미만이며, 바람직하게는 10-3㎛ 미만이고, 더 바람직하게는 10-6㎛ 미만이다.
진단의 용도로 사용되는 항체는 여러가지의 영상 방법으로 감지될 수 있는 적당한 프로브로 표지될 수 있다. 프로브의 감지 방법은 형광, 광학, 공초점 및 전자 현미경, 자기 공명 단층 촬영 영상 및 분광기 형광 투시법, 전산화 단층 촬영과 양전자 방사 단층 촬영기를 포함하지만 이에 국한되지 않는다. 적당한 프로브는 플루오레세인, 로다민, 에오신과 다른 형광체, 방사성 동위 원소, 금, 가돌리늄과 다른 란탄계열 원소, 상자성체의 이온, 플루오르-18 및 다른 양전자 방출 방사성 핵종 등을 포함하지만, 이에 국한되지 않는 것을 들 수 있다. 또한, 프로브는 두 개의 또는 그 이상의 기능을 가지고 있을 수 있으며, 여기에 나열된 하나 이상의 방법으로 감지될 수 있다. 이러한 항체는 직접적으로 또는 간접적으로 여기에 나열된 프로브로 표지될 수 있다. 이렇게 항체와 프로브를 연결하는 것으로는 이 분야에서 잘 알려진 것들 중에 프로브의 공유원자 연결, 프로브의 항체로의 편입, 및 프로브의 결합을 위한 킬레이트 화합물의 공유원자 연결 등을 들 수 있다. 면역조직 화학을 위해서, 질병 조직 샘플은 신선하거나 냉동되었거나 파라핀에 포매되어 포르말린과 같은 방부제로 고정되어 있을 수 있다. 고정되었거나 포매되어 있는 샘플을 포함하고 있는 조직 절편은 라벨된 1차 항체와 2차 항체와 접촉되며 여기서 항체를 사용하여 펩티드, 폴리펩티드 및/또는 MHC 복합체의 해당 펩티드의 항원결정부위를 제자리에서 검출한다.
그리하여 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 49, 서열번호 71 및 서열번호 74 내지 서열번호 129로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열 또는 서열번호 1 내지 서열번호 49, 서열번호 71 및 서열번호 74 내지 서열번호 129와 적어도 90% 상동성인 이의 변이체 서열 또는 상기 펩티드와 교차반응하는 T 세포를 유도하는 이의 변이체를 포함하는 펩티드를 제공한다.
본 발명의 펩티드는 인간 주 조직적합 복합체(MHC) 클래스 I 및/또는 클래스 II에 결합하는 능력을 갖는다.
본 발명에서, "상동"이라는 용어는 두개의 아미노산 서열, 즉, 펩티드 또는 폴리펩티드 서열 사이의 일치 정도를 일컫는다. 전술한 "상동"은 비교될 두 개의 서열에 대한 최적 상태에서 두 개의 서열을 비교함으로써 결정된다. 여기서 비교한 서열들은 두 서열의 최적 정렬에 있어서 첨가 또는 삭제(예를 들면, 갭 등)를 가질 수 있다. 이러한 서열 상동 관계는 예를 들면 ClustalW 알고리즘을 이용하여 정렬을 만들어 계산할 수 있다. 일반적으로 사용이 가능한 서열 분석 소프트웨어, 더 구체적으로 벡터 NTI, GENETYX 또는 분석 기구 등은 공용 데이터베이스에서 제공된다.
이 분야의 당업자는 특정한 펩티드의 변이체에 의해서 유도된 T 세포가 그 자신의 펩티드와 상호 반응할 수 있을지를 평가할 수 있을 것이다(Fong et al., 2001; Zaremba et al., 1997; Colombetti et al., 2006; Appay et al., 2006).
주어진 아미노산 서열의 "변이체"에 의해, 발명자들은 예를 들면, 하나 또는 두 개의 아미노산의 측쇄가 변경되어 그 펩티드가 여전히 서열번호 1 내지 서열번호 49, 서열번호 71 및 서열번호 74 내지 서열번호 129로 구성된 아미노산 서열 또는 서열번호 1 내지 서열번호 49, 서열번호 71 및 서열번호 74 내지 서열번호 129와 적어도 90% 상동성인 이의 변이체 서열로 구성된 펩티드가 결합하는 것과 같은 방법으로 HLA 분자와 결합할 수 있는 것을 일컷는다(예를 들면 그들을 자연적으로 발생하는 다른 아미노산 잔기 또는 다른 측쇄로 교체함을 말한다). 예를 들면, 펩티드 변경에 의해 이가 HLA-A*02 또는 DR와 같은 적당한 MHC 분자의 결합 홈과 상호작용하는 능력을 적어도 유지하거나 증가시키고 이에 따라 이는 활성화된 CTL의 TCR과 결합할 수 있는 능력을 적어도 유지하거나 증가시키게 된다.
이 CTL은 그 결과로 본 발명의 한 양태에서 정의가 된 바 있는 같은 혈족의 펩티드의 자연 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 발현하는 세포와 상호 반응을 하고 그 세포들을 죽인다. 과학 문헌(Rammensee et al., 1997) 및 데이터베이스(Rammensee et al., 1999)에서 얻을 수 있듯이, HLA 결합 펩티드의 특정한 위치는 전형적으로 HLA 수용기의 결합 모티프에 맞는 핵심 고정 잔기이며 이는 결합 홈을 이루고 있는 폴리펩티드의 극성, 전기 물리성, 소수성 및 공간적 특성에 의해 정의된다. 따라서 이 분야의 당업자는 알려진 고정 잔기를 유지함으로써 서열번호 1 내지 서열번호 49, 서열번호 71 및 서열번호 74 내지 서열번호 129에 정해진 아미노산 서열 또는 서열번호 1 내지 서열번호 49, 서열번호 71 및 서열번호 74 내지 서열번호 129와 적어도 90% 상동성인 이의 변이체 서열을 변경할 수 있으며 또한 이러한 변이체들이 MHC 클래스 I 또는 II 분자와 결합할 수 있는 능력을 유지할 수 있는지를 알 수 있다. 본 발명의 변이체는 활성화된 CTL의 TCR과 결합할 수 있는 능력을 유지하고, 이는 그 결과로 본 발명의 양태에서 같은 혈족의 펩티드라고 정의가 된 자연 아미노산 서열을 포함하고 있는 폴리펩티드를 발현하는 세포와 상호반응을 하고 이들을 죽인다.
T 세포 수용체와 작용하는 데에 실질적으로 기여를 하지 않는 아미노산 잔기들은 이와 결합됨으로써 T 세포의 반응성에 큰 영향을 주지 않고 관련된 MHC와의 결합을 제거하지 않는 다른 아미노산과의 교체에 의해 변형될 수 있다. 따라서, 주어진 조건 외에도, 본 발명의 펩티드는 아미노산 서열 또는 그 한 부분 또는 주어진 변이체를 포함하는(발명자들이 올리고펩티드 또는 폴리펩티드를 포함한다고 일컫는) 임의의 펩티드가 될 수도 있다.
[표 4]
다음 서열번호에 따른 펩티드의 변이체 및 모티프: 1, 2, 4, 51, 56(A*02), 74, 75, 76, 80, 81, 84(A*24)
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더 긴 펩티드도 적합할 수 있다. 또한 대개 길이가 8 내지 11개 아미노산이지만, MHC 클래스 I 항원결정부위가 더 긴 펩티드로부터 처리되는 펩티드 또는 실제 항원결정부위를 포함하는 단백질에 의해 생성될 가능성도 있다. 실제 항원결정부위가 양측에 있는 잔기는 처리 동안 실제 항원결정부위를 노출하는데 필요한 단백질 분해에 의한 분할에 상당한 영향을 주지 못하는 잔기이다.
따라서, 본 발명은 또한 MHC 클래스 I 항원결정부위의 펩티드와 변이체를 제공하며 여기서 펩티드 또는 변이체는 총 길이가 8 내지 100이며, 바람직하게는 8 내지 30이며, 가장 바람직하게는 8 내지 14, 즉, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14개의 아미노산이다. 클래스 II 결합 펩티드의 경우 그 길이는 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23개의 아미노산일 수도 있다.
물론, 본 발명에 따른 펩티드 또는 변이체는 인간 주 조직친화 복합체(MHC) 클래스 I 또는 II와 결합하는 능력을 가지고 있다. 펩티드나 변이체의 MHC에 대한 결합은 업계에서 알려진 방법에 의해 시험할 수 있다.
본 발명의 특히 바람직한 구현에서 그 펩티드는 서열번호 1 내지 서열번호 49, 서열번호 71 및 서열번호 74 내지 서열번호 129에 따른 아미노산 서열 또는 서열번호 1 내지 서열번호 49, 서열번호 71 및 서열번호 74 내지 서열번호 129와 적어도 90% 상동성인 이의 변이체 서열로 구성되거나 본질적으로 구성된다.
"본질적으로 구성되는"이란 본 발명에 따른 펩티드가 서열번호 1 내지 서열번호 49, 서열번호 71 및 서열번호 74 내지 서열번호 129에 따른 서열 또는 서열번호 1 내지 서열번호 49, 서열번호 71 및 서열번호 74 내지 서열번호 129에 적어도 90% 상동성인 이의 변이체 서열 또는 이의 변이체 이외에도, MHC 분자 항원결정부위에 대해 항원결정부위로서 기능하는 펩티드의 일부를 반드시 형성할 필요가 없는 추가의 N- 및/또는 C-말단에 위치하는 아미노산의 길이를 포함하는 것을 의미해야 한다.
그럼에도 불구하고, 이 길이의 아미노산은 본 발명에 따르면 세포 안으로의 효율적인 펩티드의 도입에 중요한 역할을 할 수 있다. 본 발명의 하나의 구현에서는, 펩티드는 예를 들면 NCBI, 젠뱅크(GenBank) 수탁번호 X00497에서 유도된 것처럼 HLA-DR 항원-결합 불변 쇄(p33, 다음의 "Ii")의 80개 N-말단 아미노산을 포함하고 있는 융합 단백질이다.
추가적으로, 펩티드 또는 변이체는 안정성 및/또는 MHC 분자와의 결합성을 높여 더 강한 면역 반응을 일으킬 수 있도록 변형될 수 있다. 펩티드 서열의 최적화를 위한 방법은 이 분야에서 잘 알려져 있으며, 예를 들면 역 펩티드 결합 또는 비-펩티드 결합을 도입하는 것이 있다.
역 펩티드 결합에서는 아미노산 잔기가 펩티드(-CO-NH-) 연결로 결합되어 있지 않으나 펩티드 결합이 반대로 되어있다. 이러한 역-인버소 펩티드 모방형 물질은 이 분야에서 잘 알려진 방법으로 생성될 수 있으며, 이 방법의 예는 이 문헌의 참조 문헌(Meziere et al., 1997) J. Immunol. 159, 3230-3237)에 묘사되어 있는 방법을 들 수 있다. 이 방법은 백본의 변경을 포함하지만, 측쇄의 방향을 바꾸지 않는 유사펩티드를 만드는 것을 포함한다. 메지에르(Meziere) 등(1997)은 MHC 결합과 T 조력 세포 반응에서 이 유사 펩티드가 유용하다는 것을 보여준다. CO-NH 대신에 NH-CO 결합을 포함하고 있는 역-인버스 펩티드는 단백질 가수 분해에 대한 저항력이 훨씬 높다.
비-펩티드 결합의 예는 -CH2-NH, -CH2S-, -CH2CH2-, -CH=CH-, -COCH2-, -CH(OH)CH2-, 및 -CH2SO-이다. 미국 특허 번호 4,897,445는 기본 과정을 거쳐 합성된 폴리펩티드와 아미노 알데하이드와 아미노산을 NaCNBH3 존재 하에 반응을 시켜 생성된 비-펩티드 결합을 포함한 폴리펩티드 쇄의 비-펩티드 결합(-CH2-NH) 고체상 합성의 방법을 제공한다.
위에서 묘사된 서열을 가지고 있는 펩티드는 안정성, 생물가용성, 및/또는 펩티드의 결합을 증가 시키기 위해 추가적인 화학 기를 아미노 및 또는 카복시 말단에 결합할 수도 있다. 예를 들면, 카보벤족실, 단실, 또는 t- 부틸옥시카보닐 기 등의 소수성 기가 펩티드의 아미노 말단에 추가될 수 있다. 비슷하게, 아세틸 기 또는 9-플루오레닐메톡시-카보닐-기가 펩티드의 아미노 말단에 위치할 수도 있다. 또한, 소수성 기, t-부틸옥시카보닐, 또는 아미도 기 또한 펩티드의 카복시 말단에 추가될 수 있다.
또한, 본 발명의 펩티드는 그들의 입체 배치를 변화시키기 위해 생성될 수도 있다. 예를 들면, 펩티드의 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기의 D-이성질체가 보통의 L-이성질체 대신에 사용될 수도 있다. 더 나아가서, 발명의 펩티드의 하나 이상의 아미노산 잔기가 비-자연적으로 일어나는 아미노산 잔기와 치환될 수도 있다. 이와 같은 변화는 안정성, 생물가용성, 및/또는 본 발명의 펩티드의 결합을 증가시킬 수 있다.
유사하게, 본 발명의 펩티드 또는 변이체는 특정한 아미노산을 펩티드 생성 전 또는 후에 반응시킴으로써 화학적으로 변형될 수 있다. 이러한 변형의 예는 이 분야에서 잘 알려져 있으며 예를 들면 이 문헌의 참조 문헌(R. Lundblad, Chemical Reagents for Protein Modification, 3rd ed. CRC Press, 2005)에 잘 묘사되어 있다. 아미노산의 화학 변형은 아실화, 아미딘화, 리신의 피리독실화, 환원성 알킬화 반응, 아미노산의 2,4,6-트리니트로벤젠 설폰화(TNBS)에 의한 트라이 니트로 벤질화, 카복실 기의 아미드 변형 및 퍼포민산에 의한 설피드릴 변형, 시스틴의 시스테릭산으로의 산화, 머큐리얼 유도체 생성, 다른 티올 합성의 다이설피드 생성, 말레이미드와의 반응, 요오드화 아세트산 또는 요오드 아세트 아미드에 의한 카복시메틸레이션 및 사이안산 염에 알칼리성 산도에서의 의한 카바밀화를 포함하지만 이에 국한 되지 않은 변형을 말한다. 이에 관해서, 더 광대한 단백질의 화학 변형에 대한 방법론에 대해서는 당업자는 문헌(Current Protocols In Protein Science, Eds. Coligan et al.(John Wiley & Sons NY 1995-2000)의 15장을 참조하길 바란다.
간단히 말하면, 예를 들면 단백질의 아르기닌 잔기는 흔히 페닐글리옥산, 2,3-부탄디온 및 1,2-사이클로헥산디온과 같은 인접한 디카르보닐 화합물과의 반응에 근거하여 부가물을 형성한다. 다른 예는 메틸글로옥살과 아르기닌 잔기와의 반응이다. 시스테인은 리신과 히스티딘과 같은 다른 친핵성 좌의 동시 변형 없이 변형시킬 수 있다. 그 결과 다수의 시약들이 시스테인 변형에 사용 가능하다. 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)(http://www.sigma-aldrich.com)와 같은 회사들의 웹사이트에서는 특정한 시약에 관한 정보를 제공하고 있다.
단백질에서 이황화 결합의 선택적 환원 또한 흔하다. 단백질에서 이황화 결합은 생물약제의 열 처리 동안 형성되어 산화될 수 있다.
우드워드의 시약 K는 특정 글루탐산 잔기의 변형에 사용될 수 있다. N-(3-디메틸아미노)프로필)-N'-에틸카보디이미드를 사용하여 리신 잔기와 글루탐산 잔기 사이의 분자 내 가교를 형성할 수 있다.
예를 들면 디메틸카보네이트는 단백질에서 히스티딘 잔기의 변형을 위한 시약이다. 히스티딘은 4-하이드록시-2-노네날을 사용하여 변형시킬 수 있다.
리신 잔기와 다른 α-아미노기의 작용은, 예를 들면, 펩티드의 표면으로의 결합 또는 단백질/펩티드들의 가교에 유용하다. 리신은 폴리(에틸렌)글리콜의 부착의 부위이며 단백질의 당화에서 중요 변형 부위이다.
단백질에서 메티오닌 잔기는 예를 들면 요오도아세트아미드, 브로모에틸아민 및 클로르아민 T를 사용하여 변형시킬 수 있다.
테트라니트로메탄 및 N-아세틸이미다졸은 티로신 잔기의 변형에 사용할 수 있다. 디티로신의 형성을 통한 가교 형성은 과산화 수소/구리 이온으로써 성취할 수 있다.
트립토판의 변형에 대한 최근의 연구에서는 N-브로모숙신이미드, 브롬화 2-하이드록시-5-니트로벤질 또는 3-브로모-3-메틸-2-(2-니트로페닐메르캅토)-3H-인돌(BPNS-스카톨)이 사용된 바 있다.
PEG를 이용한 치료 단백질과 펩티드의 성공적인 변환은 하이드로겔 준비시 사용되는 단백질을 글루타르알데하이드, 폴리에틸렌글리콜 디아크릴레이트 및 포름알데하이드와 교차 결합하는 동시 순환 반감기의 증가를 시키는 것과 관련되어 있다. 면역 치료를 위한 알레르겐의 화학적 변형은 종종 칼륨 시안산염의 카바밀화와 관련이 있다.
펩티드 또는 변이체, 여기에서 펩티드는 변환되었거나 비-펩티드 결합을 포함하는 것이 본 발명 구현에서 바람직하다. 보통, 펩티드와 변이체(적어도 펩티드 링크를 아미노산 잔기 사이에 포함하는 것들)는 루(Lu) 등(1981) 및 그 문헌의 참조 자료에서 묘사된 바처럼 고체성 펩티드 생성의 Fmoc-폴리아미드 모드에서 합성될 수 있다. 일시적인 N-말단 기 보호는 9-플루오레닐메틸옥시카보닐(Fmoc)에 의해 제공된다. 이렇게 고도로 염기 불안정한 보호 기의 반복적인 절단은 N,N-디메틸포름아미드의 20% 피페리딘를 이용하여 이루어진다. 측쇄 기능은 부틸 에테르(세린, 트레오닌 및 티로신의 경우), 부틸 에스테르(글루탐산 및 아스파르트산의 경우), 부틸옥시카보닐 변이체(리신과 히스티딘의 경우), 트라이틸 유도체(아르기닌의 경우) 및 4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠술포닐 유도체(아르기닌의 경우)로서 보호될 수 있다. 글루타민 또는 아스파라긴이 C-말단의 잔기인 경우, 4,4'-디메톡시벤즈하이드릴이 사용되어 측쇄 아미도 기능을 보호한다. 고체상 지지는 디메틸아크릴아미드(백본-단량체), 비스아크릴로일에틸렌 디아민(가교 결합) 및 아크 릴로일사르코신 메틸 에스터(기능 작용질)의 3개의 단량체로 만들어진 폴리디메틸-아크릴아미드 중합체에 기반을 둔다. 펩티드 대 레진 절단 가능 연결 작용질로 사용되는 것은 산-불안정 4-하이드록시메틸-페녹시아세트산 유도체이다. 모든 아미노산 유도체는 역 N,N-디사이클로헥실-카보다이이미드/1-하이드록시벤조트리아졸에 의한 커플링 과정에 의해 추가되는 아스파라진과 글루타민을 제외하여 미리 생성된 대칭의 무수물 유도체로서 추가된다. 모든 커플링과 탈보호 반응은 닌하이드린, 트리니트로벤젠 술폰산 또는 이소틴 실험 과정에 의해 모니터링된다. 합성 완성 시에, 펩티드는 레진 기반에서 50% 스캐빈저 믹스를 포함한 95% 트리플루오로아세트산에 의한 측쇄 보호 기 제거와 동시에 절단된다. 일반적으로 사용되는 스캐빈저로는 에탄디티올, 페놀, 아니솔 및 물을 포함하고, 정확한 선택은 합성되는 펩티드에 포함되어 있는 아미노산에 따라 결정된다. 펩티드의 합성에 있어서 고체상과 액체상 방법의 결합 또한 가능하다(예를 들면, 문헌(Bruckdorfer et al. 2004)과 그에 들어 있는 참조 문헌을 참고).
트리플루오로아세트산은 진공 상태에서 증발 및 그 이후 디에틸에테르에 의한 분쇄에 의해 제거되고 조 펩티드를 생성한다. 존재하는 임의의 스캐빈저는 수성상의 냉동건조에 의한 간단한 추출 과정에 의해 제거되며 이는 스캐빈저가 없는 조 펩티드를 생성한다. 펩티드 합성의 시약은 예를 들면 칼바이오켐-노바바이오켐(유케이) 리미티드(Calbiochem-Novabiochem(UK) Ltd)(영국 노팅엄 엔쥐7 2큐제이 소재)과 같은 곳에서 제공된다.
정제는 재결정화, 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및(보통) 예를 들면 아세토니트릴/물 구배 분리를 사용하는 역상 고성능 액체 크로마토그래피 등의 단일 방법 또는 이의 결합 방법에 의해 시행된다.
펩티드의 분석은 박막 크로마토그래피, 전기 이동, 특히 모세관 전기 이동, 고체상 추출(CSPE), 역상 고성능 액체 크로마토그래피, 산 가수분해 후 아미노산 분석 및 고속 원자 폭격(FAB) 질량 분광분석, 및 MALDI와 ESI-QTOF 질량 분광분석 등에 의해 이루어진다.
본 발명의 다른 양태는 본 발명의 펩티드 또는 펩티드 변이체를 인코딩하는 핵산(예를 들면 폴리뉴클레오티드)에 대한 정보를 제공한다. 폴리뉴클레오티드는 예를 들면, DNA, cDNA, PNA, CNA, RNA 또는 이들의 조합일 수 있으며, 한 가닥 및/또는 두 가닥으로 되어 있을 수 있거나, 본래의 형일 수도 또는 예를 들면 포스포로티오에이트 백본을 가지고 있는 폴리뉴클레오티드의 안정제된 형으로 되어 있을 수도 있으며, 펩티드를 코딩하는 한 인트론을 포함할 수도 또는 그렇지 않을 수도 있다. 물론, 단지 자연적으로 일어나는 아미노산 잔기로 이루어진 및 자연적으로 일어나는 펩티드 결합에 의해 결합이 된 펩티드만이 폴리뉴클레오티드에 의해서 인코딩될 수 있다. 본 발명의 또 다른 양태는 본 발명에 따른 폴리펩티드를 발현할 수 있는 발현 벡터에 대한 설명을 제공한다.
특히 DNA와 같은 폴리뉴클레오티드를 예를 들면 상보적 응집성 말단을 이용하여 벡터에 연결하는 여러 가지 방법이 개발되었다. 예를 들면, 상보적 동종중합체 트랙트가 DNA 단편에 추가되어 이를 벡터 DNA에 삽입할 수 있다. 벡터와 DNA 단편은 이후 상보적 동종중합체 꼬리와 함께 수소 결합을 이용하여 재조합 DNA 분자를 생성할 수 있다.
하나 또는 그 이상의 제한 부위를 포함하는 합성된 연결부위는 DNA 단편과 벡터를 결합하는 다른 방법을 제시한다. 여러 가지의 제한 엔도뉴클레아제 부위를 포함하는 합성 연결부위는 상업적으로 인터내셔날 바이오테크놀로지즈 인코포레이티드(International Biotechnologies Inc.)(미국 코네티컷주 뉴헤이븐 소재)를 비롯한 곳에서 구입이 가능하다.
본 발명에서 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA를 변환하는 바람직한 방법은 문헌(Saiki et al., 1988))에 의해 발표된 바 있는 폴리머라아제 연쇄 반응을 이용한다. 이 방법은 예를 들면 적당한 제한 부위를 만들어 적당한 벡터로의 DNA 도입 또는 이 분야에서 알려져 있는 DNA를 다른 용도를 위해 변환하는 데에 사용될 수도 있다. 만약 바이러스 벡터가 사용된다면, 수두- 또는 아데노바이러스 벡터가 바람직하다.
DNA(또는 레트로 바이러스 벡터일 시, RNA)는 그 후 적당한 숙주에서 발현되며 이는 본 발명의 펩티드 또는 변이체를 가지고 있는 폴리펩티드를 생성한다. 따라서, 본 발명의 펩티드 또는 변이체를 인코딩하는 DNA는 알려진 기술과 여기에서 배울 수 있는 것과 함께 적당히 사용되어 적당한 숙주 세포를 본 발명의 폴리펩티드를 발현하고 생성하는 것으로 형질전환을 시키는 데에 사용된다 이러한 기술은 다음에 공개되어 있다: 미국 특허 번호 4,440,859, 4,530,901, 4,582,800, 4,677,063, 4,678,751, 4,704,362, 4,710,463, 4,757,006, 4,766,075 및 4,810,648.
본 발명의 합성물을 만드는 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA(또는 레트로바이러스 벡터일 경우, RNA)는 많은 종류의 다른 DNA 서열과 결합되어, 적당한 숙주로의 도입을 유도할 수 있다. 동반 DNA는 숙주의 특성, DNA를 숙주로 도입하는 방법, 및 에피소말 유지 또는 통합이 필요한 지에 따라 결정될 것이다.
보통, DNA는 발현을 위한 올바른 방향 및 올바른 리딩 프레임에 맞추어 플라스미드와 같은 발현 벡터로 삽입된다. 필요할 경우, DNA는 바람직한 숙주에 의해 인식되는 적당한 전사 및 번역 조절 제어 뉴클레오티드 서열(하지만, 이 제어는 대부분의 경우 발현 벡터 내에 이미 존재한다)에 연결될 수도 있다. 벡터는 그 후 숙주로 기본적인 기술을 통해 도입된다. 보통, 모든 숙주가 벡터에 의해 형질전환되지 않는다. 따라서, 형질전환된 숙주 세포를 선택하는 것이 필요할 것이다. 하나의 선택 기술은 형질전환된 세포에서 선택가능한 특성(예를 들면, 항생제 내성)을 코딩하는 DNA 서열을 필요한 제어 요소와 함께 발현 벡터에 통합시키는 것이다.
다른 방법으로는, 이러한 선택가능한 특성을 위한 유전자가 다른 벡터에 있을 수도 있으며, 이는 바람직한 숙주 세포를 동시-형질전환하는 데에 사용된다.
본 발명의 재조합 DNA에 의해 형질전환된 숙주 세포는 충분한 시간 동안 적당한 상태에서 당업자에 의해서 배양되고 이는 폴리펩티드의 발현을 가능하게 하며, 이는 후에 회복된다.
박테리아(예를 들면, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli)와 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)), 효모(예를 들면 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)), 사상균류(예를 들면 아스퍼길러스 스피시즈(Aspergillus spec.)), 식물 세포, 동물 세포 및 곤충 세포 등의 많은 발현 체계가 알려져 있다. 바람직하게는, 그 체계는 에이티씨씨 셀 바이올로지 콜렉션(ATCC Cell Biology Collection)에서 구할 수 있는 CHO 세포 등의 포유류 세포로 구성될 수 있다.
구조성 발현을 위한 전형적인 포유류 세포 벡터 플라스미드는 CMV 또는 SV40 촉진제와 적당한 폴리 A 꼬리 및 네오마이신과 같은 저항 마커를 포함한다. 하나의 예는, 파마시아(Pharmacia)(미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)에서 구할 수 있는 pSVL이다. 유도가능 포유류 발현 벡터의 예는 pMSG이며 이 또한 파마시아에서 구할 수 있다. 유용한 효소 플라스미드 벡터는 pRS403-406과 pRS413-416이며 이는 대부분 스트라타진 클로닝 시스템스(Stratagene Cloning Systems)(미국 캘리포니아주 라 졸라 소재)에서 구할 수 있다. 플라스미드 pRS403, pRS404, pRS405 및 pRS406은 효소 통합 플라스미드(YIps)이며 이는 효소 선택 마커 HIS3, TRP1, LEU2와 URA3을 통합한다. 플라스미드 pRS413-416은 효소 동원체 플라스미드(Ycps)이다. 예를 들면 시그마-알드리치에서 나오는 CMV 프로모터 기반 벡터는 일시적인 또는 안정된 발현, 세포질 발현 또는 분비, 및 FLAG, 3xFLAG, c-myc 또는 MAT 등의 다양한 합성의 N-말단 또는 C-말단 태깅 등을 제공한다. 이러한 융합 단백질은 재조합 단백질의 감지, 정제와 분석을 가능하게 한다. 이중-태깅된 융합은 감지의 유연성을 제공한다.
강한 인간 사이토메갈로 바이러스(CMV) 프로모터 조절 영역은 구성 단백질 발현 수준을 높게는 COS 세포에서 1mg/L까지 작동한다. 좀 더 효능이 약한 세포주에서는, 단백질 수준이 전형적으로 약 0.1mg/L 정도이다. SV40 복제 원점이 있음으로써 SV40, 복제를 가능하게 하는 COS 세포에서 DNA 복제의 수준이 높은 결과를 낳는다. CMV 벡터는 예를 들면 박테리아 세포에서의 복제를 위한 pMB1(pBR322의 유도체) 원점, 박테리아에서 암피실린 저항 선택을 위한 b-락타마아제 유전자, hGH 폴리 A, 및 f1 원점을 포함할 수 있다. 프리프로트립신 리더(PPT) 서열 포함하는 벡터는 FLAG 융합 단백질을 ANTI-FLAG 항체, 수지 및 플레이트를 사용하여 정제하기 우한 배양 배지로 분비하도록 방향을 정할 수가 있다. 다른 벡터와 발현 체계는 여러 가지의 숙주 세포 사용에 대해 널리 알려져 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드 벡터 구성에 의해 형질전환된 숙주 세포에 관한 것이다. 숙주 세포는 원핵 세포이거나 진핵 세포일 수 있다. 박테리아 세포가 몇몇의 상황에서 바람직한 원핵 숙주 세포일 수 있으며, 보통 베서스다 리서치 래보래토리즈 인코포레이티드(Bethesda Research Laboratories Inc.)(미국 메릴랜드주 베서스다 소재)에서 구할 수 있는 에스케리치아 콜라이 균주 DH5, 및 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection: ATCC; 미국 메릴랜드주 록빌 소재)에서 구할 수 있는 RR1(ATCC 번호 31343)과 같은 에스케리치아 콜라이 균주이다. 바람직한 진핵 숙주 세포는 효모, 곤충, 포유류 세포를 포함하고, 생쥐, 쥐, 원숭이 또는 인간 섬유아세포와 대장 세포주 등의 척추 동물이 바람직하다. 효모 숙주 세포는 YPH499, YPH500 및 YPH501을 포함하며, 이는 대부분 스트라타진 클로닝 시스템스(미국 캘리포니아주 라 졸라 소재)에서 구입가능하다. 바람직한 포유류 숙주 세포는 ATCC에서 구입이 가능한 CCL61로 알려져 있는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, CRL 1658로 알려져 있는 스위스 생쥐 배아 세포 NIH/3T3, ATCC에서 시판 중인 CRL 1650 세포로 알려져 있는 원숭이 신장-유도 COS-1 세포와 293 세포로 알려져 있는 인간 배아 신장 세포를 들 수 있다. 바람직한 곤충 세포는 Sf9 세포이며 이는 배큘로바이러스 발현 벡터에 의해 형질감염될 수 있다. 발현을 위한 적당한 숙주 세포의 선택에 대한 개관은 예를 들면 문헌(Paulina Balbas and Argelia Lorence "Methods in Molecular Biology Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols," Part One, Second Edition, ISBN 978-1- 58829-262-9) 및 당해 분야의 숙련자에게 공지된 문헌에서 찾을 수 있다.
적당한 세포 숙주를 본 발명의 DNA 구성으로 형질전환하는 것은 보통 사용되는 벡터의 유형에 따라 결정되는 잘 알려진 방법으로 완성된다. 원핵 숙주 세포의 형질전환에 대해서는 예를 들면 문헌(Cohen et al., 1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110) 및 (Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)을 참조한다. 효소 세포의 형질전환은 문헌(Sherman et al., 1986) Methods In Yeast Genetics, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY)에 묘사되어 있다. 문헌(Beggs(1978) Nature 275,104-109)에 나와 있는 방법도 유용하다. 척추 동물 세포에 대해서는, 이러한 세포를 감염시키는 시약, 예를 들면 칼슘 인산염과 DEAE-덱스트란 또는 리포좀 제제는 스트라타진 클로닝 시스템스, 또는 라이프 테크놀로지즈 인코포레이티드(Life Technologies Inc.)(미국 메릴랜드주 게이티스버그 소재)에서 입수할 수 있다. 전기 천공법 역시 세포를 형질전환 및/또는 형질감염시키는 데에 유용하며 이는 효모 세포, 박테리아 세포, 곤충세포 및 척추동물 세포의 형질전환에 대해 잘 알려져 있다.
성공적으로 형질전환이 된 세포는, 즉 본 발명의 DNA 구성을 가지고 있는 세포는, 잘 알려진 PCR과 같은 기술로 식별된다. 다른 방법으로는, 상청액에 존재하는 단백질은 항생제를 사용함으로써 감지될 수 있다.
본 발명의 특정한 숙주 세포, 예를 들면 박테리아, 효모 및 곤충 세포와 같은 세포는 본 발명의 펩티드의 준비에 유용하다는 것을 알 수 있을 것이다. 하지만, 다른 숙주 세포 또한 특정한 치료 방법에 유용할 수도 있다. 예를 들면, 수지상 세포와 같은 항원-제시 세포는 적당한 MHC 분자에 적재가 되도록 하는 본 발명의 펩티드를 발현하는 데 유용하게 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
바람직한 구현에서, 숙주 세포는 항원-제시 세포이며, 특히 수지상 세포 또는 항원-제시 세포이다. 전립선 산성 포스파타제(PAP)를 포함하는 재조합된 융합 단백질로 적재된 APC를 현재 전립선 암의 치료 방법에 대해 조사하고 있다(Sipuleucel-T)(Small et al., 2006; Rini et al., 2006).
본 발명의 다른 양태는 펩티드 또는 그의 변이체의 숙주 세포를 배양하고 펩티드를 숙주 세포 또는 배지에서 단리하는 것을 포함한 생산 방법을 제공한다.
펩티드에 대한 다른 구현에서는, 핵산 또는 발명의 벡터 발현이 의학에서 사용된다. 예를 들면, 펩티드 또는 그의 변이체는 정맥 내(i.v.) 투여, 피부 하(s.c.) 투여, 피부 내(i.d.) 투여, 복강 내(i.p.) 투여, 근육 내(i.m.) 투여를 포함한다. 펩티드 투여의 바람직한 방법은 s.c., i.d., i.p., i.m. 및 i.v. 투여를 포함한다. DNA 투여의 바람직한 방법은 i.d., i.m., s.c., i.p. 및 i.v. 투여를 포함한다. 펩티드 또는 DNA의 50 μg 및 1.5 mg, 바람직하게는 125 μg 내지 500 μg 사이의 용량이 각각의 펩티드 또는 DNA에 따라서 투여될 수 있다. 이러한 범위의 용량은 과거의 시험에서 성공적으로 사용되었다(Brunsvig et al., 2006; Staehler et al., 2007).
본 발명의 다른 양태는 활성화된 T 세포와 항원 적재된 적당한 항원-제시 세포의 표면에서 T 세포를 항원이 본 발명의 펩티드라고 할 때 항원-특이적 방식으로서 활성화시키는 데 충분한 시간 동안에 발현되는 인간 클래스 I 또는 II MHC 분자의 접촉을 포함하는 시험관 내의 방법으로 생성하는 방법을 포함한다. 바람직하게는, 충분한 양의 항원이 항원-제시 세포와 함께 사용된다.
바람직하게는, 포유류 세포는 TAP 펩티드 트랜스포터가 결핍되어 있거나, 감소된 수준 또는 기능을 가지고 있다. TAP 펩티드 트랜스포터가 결핍되어 있는 적당한 세포로는 T2, RMA-S 및 초파리 세포를 들 수 있다. TAP이란 항원 처리에 관련된 트랜스포터를 일컷는다.
인간 펩티드 적재 결핍 세포주 T2는 ATCC의 카탈로그 번호 CRL 1992에서 구입이 가능하고, 초파리 세포주 슈나이더(Schneider) 2는 ATCC의 카탈로그 번호 CRL 19863에서 구입이 가능하며, 생쥐 RMA-S 세포주는 문헌(Karre et al., 1985)에서 묘사가 된 바 있다.
바람직하게는, 숙주 세포는 감염전에 대부분 MHC 클래스 I 분자를 발현하지 않는다. 바람직하게는, 또한, 자극 인자는 임의의 B7.1, B7.2, ICAM-1 및 LFA3과 같은 T 세포에 대한 공자극 신호를 제공하기 위한 중요한 분자를 발현한다. 다수의 MHC 클래스 I 분자의 핵산 서열 및 동시자극 분자의 서열은 젠뱅크와 EMBL 데이터베이스에서 공개적으로 제공된다.
MHC 클래스 I 항원결정부위가 항원으로 사용되는 경우, T 세포는 CD8-양성 CTL이다.
만약 항원-제시 세포가 이러한 항원결정부위를 발현하도록 감염되었다면, 바람직하게는 그 세포는 서열번호 1 내지 서열번호 49, 서열번호 71 및 서열번호 74 내지 서열번호 129 또는 서열번호 1 내지 서열번호 49, 서열번호 71 및 서열번호 74 내지 서열번호 129와 상동성이 적어도 90%인 이의 변이체 서열을 포함하는 펩티드를 발현할 수 있는 발현 벡터를 포함한다.
CTL을 시험관 내에서 생성하는 몇몇의 다른 방법도 사용된 바 있다. 예를 들면, 문헌(Peoples et al., 1995) 및 문헌(Kawakami et al., 1992)에서 묘사된 방법은 CTL 생성 시, 자가 조직의 종양-침투 림프구를 사용한다. 문헌(Plebanski et al., 1995)은 자가 조직 말초의 혈액(PLB)을 CTL 준비 시 사용한다. 문헌(Jochmus et al., 1997)은 수지상 세포를 펩티드 또는 폴리 펩티드로 펄스시키거나, 재조합 바이러스에 의한 감염에 의해 자가 조직 CTL의 생성하는 방법을 묘사한다. 문헌(Hill et al., 1995) 및 (Jerome et al., 1993)은 자가 세포 CTL 생성 시 B 세포를 사용한다. 또한, 펩티드 또는 폴리펩티드로 펄스된 또는 재조합된 바이러스에 의해 감염된 대식 세포가 자가 조직 CTL 의 준비 시 사용될 수 있다. 문헌(S. Walter et al., 2003)은 인공 항원-제시 세포(aAPC)를 사용하는 시험관 내 T 세포의 프라이밍을 묘사하며, 이는 역시 선택된 펩티드에 대해 T 세포를 생성하는 적절한 방법일 수 있다. 이 연구에서, aAPC는 미리 생성된 MHC:펩티드 복합체를 포리스티렌 입자(마이크로 비드)의 표면과 커플링을 시키고 바이오틴-스트렙트아비딘을 이용함으로써 생성된다. 이 체계는 aAPC의 정확한 MHC 밀도를 제어할 수 있도록 허용하며, 이는 항원-특이적 T 세포 반응을 혈액 샘플에서 높은 효율성으로 고- 또는 저-결합력을 선택적으로 유도해낼 수 있게 한다. MHC:펩티드 합성체를 제외하고, aAPC는 그들의 표면에 커플된 항-CD28 항원과 같은 동시-자극 활동을 가지고 다른 단백질을 운반해야 한다. 또한 이러한 aAPC-기반 체계는 종종 예를 들면, 인터루킨-12와 같은 사이토카인 등 적당한 용해 요소를 필요로 한다.
동종이계 세포는 T 세포의 준비에 역시 사용될 수 있으며 방법은 WO 97/26328에 더 자세하게 묘사되어 있으며, 여기에 참조 문헌으로 포함되어 있다. 예를 들면, 초파리 세포와 T2 세포에 추가적으로, CHO 세포, 배큘로바이러스-감염 곤충 세포, 박테리아, 효소, 백시니아-감염된 표적 세포 등과 같은 다른 세포들도 항원을 제시하는 데에 사용될 수 있다. 추가적으로 식물 바이러스가 사용될 수도 있다(예를 들면 Porta et al., 1994)를 참조). 이는 외부 펩티드의 제시를 위한 카우피 모자이크바이러스의 높은 수확 체계로서 개발에 대해 묘사한다.
이 실험의 펩티드에 대해 활성화된 T 세포는 치료에서 유용하다. 따라서, 본 발명의 더 나아간 양태는 앞서 말한 발명의 방법으로 획득할 수 있는 활성화된 T 세포에 대한 내용을 제공한다.
위에서 말한 방법으로 생성된 활성화된 T 세포는 서열번호 1 내지 서열번호 49, 서열번호 71 및 서열번호 74 내지 서열번호 129의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 이상 발현하는 세포를 선택적으로 인식한다.
바람직하게는, T 세포는 그의 TCR을 HLA/펩티드-합성체(예를 들면 결합)와 상호작용을 하므로서 이런 세포를 인식한다. 이 T 세포는 효율적인 활성화된 T 세포의 숫자가 투여되었을 시 발명의 아미노산 서열을 가지고 있는 폴리펩티드를 이상 발현하는 환자의 표적 세포를 죽이는 데 유용하다. 환자에게 투여된 T 세포는 위에서 묘사된 바와 같이 환자에게 유도되고 활성화된다(즉, 이는 자가 조직 T 세포이다). 다른 방법으로는, T 세포는 환자에게 유도가 안 되고, 다른 개인에서 유도된다. 물론, 이 개인이 건강한 개인인 것이 바람직하다. 발명자들이 말하는 "건강한 개인"이라고 함은 개인이 전체적으로 좋은 건강을 가지고 있으며, 바람직하게는 충분한 면역 체계를 가지고 있으며, 더 바람직하게는, 손쉽게 실험되고 감지될 수 있는 어떤 질병도 겪고 있지 않다는 것이다.
생체 안에서, 본 발명에 따른 CD8-양성 T 세포의 표적 세포는 종양 세포(이들은 가끔 MHC 클래스 II를 발현하기도 한다)이거나 종양을 감싸고 있는 간질성 세포(종양 세포)(이는 가끔 MHC 클래스 II를 또한 발현하기도 한다(Dengjel et al., 2006)이다.
본 발명의 T 세포는 활성적인 치료 구성의 성분으로 사용될 수도 있다. 따라서, 발명은 본 발명의 아미노산 서열을 가지고 있는 폴리펩티드를 이상 발현하는 환자의 표적 세포를 죽이고 환자에게 상기된 바처럼 효율적인 T 세포의 숫자를 투여하는 방법을 제공한다.
본 발명자는 "이상 발현되는"이라는 구절에 의해, 폴리펩티드가 정상 수준에 비교했을 때 과발현되거나 유전자가 종양이 유도된 조직에서는 침묵적이지만(silent) 종양에서는 발현되는 것을 의미한다. 발명자는 "과발현"이라는 구절에 의해, 폴리 펩티드가 정상 조직에서 존재하는 수준의 적어도 1.2배 이상으로 존재하는 것을 말하고, 바람직하게는 적어도 2배, 더 바람직하게는 적어도 5배 또는 10배로 존재하는 것을 의미한다.
T 세포는 예를 들면 위에서 묘사된 바와 같은 방법으로 얻어질 수 있다.
흔히 T 세포의 입양 전송이라고 불리는 것에 대한 프로토콜은 이 업계에서 잘 알려져 있다. 이에 대한 리뷰는(Gattinoni et al., 2006) 및(Morgan et al., 2006)에 나와 있다.
본 발명의 임의의 분자(즉, 펩티드, 핵산, 발현 벡터, 세포, 활성화된 CTL, T 세포 수용체 또는 이를 인코딩하는 핵산)는 면역 반응을 피할 수 있는 세포에 의해 특징되는 병을 고치는 데에 있어서 유용하다. 따라서 본 발명에 포함되어 있는 어떤 분자든지 약제로 사용되거나 약제를 만드는 데에 사용될 수 있다. 이 분자는 단독으로 사용될 수도 있고, 어떤 알려진 분자와 함께 결합하여 사용될 수도 있다.
바람직하게는, 본 발명의 약제는 백신이다. 이는 환자의 영향을 받은 기관에 직접적으로 투여될 수 있거나 i.d., i.m., s.c., i.p. 및 i.v.로서 전체적으로 투여되거나 환자에게서 또는 나중에 환자에게 투여될 인간 세포주에 생체 외로 적용될 수도 있거나 나중에 환자에게 다시 투여될 선택된 면역 세포의 부분 집단에 시험관 내로 사용될 수도 있다. 만약 핵산이 시험관 내에서 세포에 투여 되면, 인터루킨-2와 같은 면역 자극 사이토카인과 함께 발현되도록 그 세포가 감염되는 것이 유용할 수 있다. 펩티드는 상당히 순도가 높을 수도 있거나, 면역-유도 보조제(아래 참조)와 합성되어 있거나 면역-유도 사이토카인과 함께 합성체로 사용되거나, 리포좀과 같은 적당한 전달 체계와 함께 투여될 수도 있다. 이 펩티드는 또한 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 또는 만난(WO 95/18145 및 문헌(Longenecker (1993)) 참조)과 같은 적당한 담체에 결합될 수도 있다. 펩티드는 표지를 부칠 수도 있으며 융합 단백질일 수 있으며 또한 하이브리드 분자일 수 있다. 본 발명에서 그 서열이 제공된 펩티드는 CD4 또는 CD8 T 세포를 자극할 것으로 기대된다. 하지만 CD8 CTL의 자극은 CD4 T-도움 세포에 의해 제공되는 도움이 존재할 때 더 효율적이다. 그러므로 CD8 CTL을 자극하는 MHC 클래스 I 항원결정부위의 경우, 융합 짝 또는 하이브리드 분자의 섹션은 CD4-양성 T 세포를 자극한다. CD4-와 CD8-유도 항원결정부위는 이 분야에서 잘 알려졌고 본 발명에서 식별된 것들을 포함한다.
다른 양태에서, 이 백신은 서열번호 1 내지 서열번호 49, 서열번호 71 및 서열번호 74 내지 서열번호 129에 명시된 아미노산 서열 또는 서열번호 1 내지 서열번호 49, 서열번호 71 및 서열번호 74 내지 서열번호 129와 적어도 90% 상동성인 이의 변이체 서열을 갖는 하나의 펩티드 및 하나 이상의 추가적인 펩티드는 바람직하게는 2개 내지 50개이고, 더 바람직하게는 2개 내지 25개이며, 보다 더 바람직하게는 2개 내지 20개이고 가장 바람직하게는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18개의 펩티드를 포함한다. 펩티드(들)는 하나 또는 그 이상의 특정한 TAA에서 유도되었고 이는 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 분자에 결합할 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 상당히 순도가 높을 수 있거나, 적당한 벡터 또는 전달 체계에 포함되어 있을 수 있다. 핵산은 DNA, cDNA, PNA, RNA 또는 이들의 조합일 수 있다. 이러한 핵산을 설계하고 도입하는 방법은 이 업계에 잘 알려져 있다. 개요는 예를 들면 문헌(Pascolo et.al. 2005)에 의해 제공된다. 폴리뉴클레오티드 백신은 만들기가 쉽지만, 이들 벡터의 면역 반응을 유도하는 동작 모드는 완전히 이해가 되지 않았다. 적당한 벡터와 전달 체계는 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스 바이러스, 아데노-결합 바이러스 또는 한 개 또는 그 이상의 바이러스를 포함하는 혼성체 등의 바이러스 DNA 및/또는 RNA를 포함한다. 비-바이러스 전달 체계는 양이온 지질과 양이온 중합체를 포함하고 이는 이 DNA 전달 분야에서 잘 알려져 있다. "유전자-총"을 통한 물리적 전달 또한 사용될 수 있다. 펩티드 또는 핵산에 의해 인코딩된 펩티드는 융합 단백질이 될 수도 있고, 예로서는 위에서 언급한 각각의 반대 CDR을 위한 T 세포를 유도하는 항원결정부위를 들 수 있다.
본 발명의 약제는 하나 또는 그 이상의 보조제를 포함할 수 있다. 보조제는 면역 반응을 비-특이적으로 향상시키거나 강력하게 하는 물질을 말한다(예를 들면 CTL과 항원에 대한 조력 T 세포에 의해서 중재된 면역 반응). 따라서 본 발명에서 이는 중요한 약제 구성이라고 할 수 있다. 적당한 보조제는 다음을 포함하지만 이에 국한되지 않는다. 1018 ISS, 알루미늄 염, 암플리박스(Amplivax), AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, 플라젤린 또는 플라젤린에서 유도된 TLR5 리간드, FLT3 리간드, GM-CSF, IC30, IC31, 이미퀴모드(Imiquimod)(알다라(ALDARA)), 이뮤펙트(ImuFact) IMP321, IL-2, IL-13, IL-21과 같은 인터루킨, 인터페론-α 또는 -β, 또는 이들의 페길화된 유도체, IS 패치, ISS, 이스코매트릭스(ISCOMATRIX), 이스콤스(ISCOMs), 주브이뮨(JuvImmune), 리포백(LipoVac), MALP2, MF59, 모노포스포릴 지질 A, 몬타나이드 IMS 1312, 몬타나이드 ISA 206, 몬타나이드 ISA 50V, 몬타나이드 ISA-51, 워터인오일과 오일인워터 에멀전, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, 온택(ONTAK), OspA, 펩텔(PepTel: 등록상표) 벡터 시스템, PLG와 덱스트란 극미립자, 레시퀴모드, SRL172, 비로솜(Virosome) 및 다른 바이러스-유사 입자, YF-17D, VEGF 트랩, R848, β-글루칸, Pam3Cys, 사포닌에서 유도된 아퀼라스 QS21 스틸물론, 마이코박테리아 추출물과 합성 세균의 세포 벽 모방제, 및 다른 리비의 데톡스(Ribi's Detox), 쿠일(Quil), 또는 수퍼포스(Superfos)와 같은 독점 보조제 등이 있다. 플루이드 또는 GM-CSF와 같은 보조제가 바람직하다. 몇몇의 면역적 보조제(예를 들면 MF59)는 수지상 세포에 특정하고 및 그들의 제조 방법은 이전에 묘사된 바 있다(Allison and Krummel, 1995; Allison and Krummel, 1995). 또한, 사이토카인도 사용될 수 있다. 몇몇의 사이토카인은 수지상 세포의 림포이드 조직으로의 이동과 직접적으로 연관된 바 있으며(예를 들면 TNF-α), 이는 수지상 세포의 더 효율적인 T-림프구에 대한 항원-제시 세포로의 성장을 가속시키고(예를 들면 GM-CSF, IL-1 및 IL-4)(미국 특허 번호 5,849,589, 여기에 그 전문이 참조 문헌으로 포함됨) 면역보조제의 역할을 한다(예를 들면 IL-12, IL-15, IL-23, IL-7, IFN-α, IFN-β) [Gabrilovich et al 1996].
CpG 면역자극 올리고뉴클레오티드는 백신 세팅에서 보조제의 효율성을 높이는 것으로 나타났다. 이 이론에 국한하지 않고, CpG 올리고뉴클레오티드는 톨-유사 수용체(TLR), 특히 TLR9를 통해 천성(비-적응) 면역 체계를 활성화시킨다. CpG에 의해 유도된 TLR9의 활성화는 펩티드 또는 단백질 항원, 살아 있거나 죽은 바이러스, 수지상 세포 백신, 자가 세포 백신 및 예방적 및 치료적 백신의 다당류 접합체를 포함한 넓은 종류의 항원에 대한 항원-특이적 체액성 및 세포성 반응을 향상시킨다. 더 중요하게 이는 수지상 세포의 성장 및 차별화를 향상시키고 이는 TH1 세포의 활성화를 향상시키며 강한 세포독성 T-림프구(CTL) 생성을 CD4 T 세포의 도움이 없을 때에도 향상시킨다. TLR9의 유도에 의해 일어난 TH1 바이어스는 보통 TH2 바이어스를 일으키는 alum 또는 비완성된 플루이드 어쥬번트(IFA) 백신 보조제가 존재할 때도 유지된다. CpG 올리고뉴클레오티드는 다른 보조제와 함께 제조되거나 함께 투여될 시 또는 특히 항원이 상대적으로 약할 때 강한 반응을 얻어 내기 위해 필요한 미세입자, 나노입자, 지질 에멀전 또는 비슷한 제약으로 되어 있을 경우 더 큰 보조제 활동을 보인다. 그들은 또한 면역 반응을 가속화시키고, 몇몇의 실험에서 보여진 바 있듯이 CpG가 없을 때 전체 복용량이 일으키는 항체 반응 정도를 일으키기 위한 항원의 복용량을 약 두 배 정도 줄일 수 있도록 한다(Krieg, 2006). 미국 특허 번호 6,406,705 B1은 CpG 올리고뉴클레오티드, 비-핵산 보조제 및 항원-특이적 면역 반응을 일으키는 항원의 결합 사용에 대해 묘사한다. CpG TLR9 길항제는 몰로겐(Mologen)(독일 베를린 소재)에 의해 만들어진 dSLIM(이중 줄기 루프 면역조절자)이며 이는 본 발명의 제약 조성의 바람직한 성분이다. RNA 결합 TLR 7, TLR 8 및/또 는 TLR 9 등의 다른 TLR 결합 분자 또한 사용이 가능하다.
다른 유용한 보조제의 예는 다음을 포함하지만 이에 국한되지 않는다. 화학적으로 변형된 CpGs(예를 들면 CpR, 이데라(Idera)), 폴리(I:C)와 같은 dsRNA 유사체 및 비-CpG 박테리아 DNA 또는 RNA는 물론 면역활성적 작은 분자 및 사이클로포스아미드, 수니티닙, 베바시주맙, 셀레브렉스, NCX-4016, 실데나필, 타달라필, 바르데나필, 소라페닙, 테모졸로마이드, 템시롤리무스, XL-999, CP-547632, 파조파닙, VEGF 트랩, ZD2171, AZD2171, 항-CTLA4 면역계의 주요 구조를 표적으로 하는 기타 항체들(예를 들면 항-CD40, 항-TGEβ, 항-TNFα 수용체) 및 SC58175와 같은 항원을 들 수 있으며 이는 치료적으로 또는 보조제의 역할을 할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 보조제와 첨가제의 양과 농도는 특별히 다른 실험할 필요 없이 기술이 뛰어난 개인에 의해서 쉽게 결정될 수 있다.
바람직한 보조제들은 이미퀴모드, 레시퀴모드, GM-CSF, 사이클로포스파마이드, 수리티닙, 베바시주맙, 인터페론-α, CpG 올리고뉴클레오티드, 폴리-(I:C) 및 PLG 또는 비로솜과의 입자 배합들이다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 바람직한 구현에서, 보조제는 그래뉼로사이트 마크로파지 콜로니 자극 인자(GMCSF, 사르가라모스팀), 이미퀴모드, 레시퀴모드 및 인테페론-α 같은 콜로니-자극 인자로 구성된 군에서 선택된다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 바람직한 구현에서, 보조제는 그래뉼로사이트 마크로파지 콜로니 자극 인자(GM-CSF, 사르가라모스팀), 이미퀴모드, 및 레시퀴모드같은 콜로니-자극 인자로 구성된 군에서 선택된다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 바람직한 구현에서, 보조제는 이미퀴모드 또는 레시퀴모드이다.
이 조성물은 피하, 피부내, 근육내 비경구 투약 또는 경구 투약에 사용된다. 이를 위해, 펩티드 및 임의적으로 다른 분자들을 약학적으로 허용되는, 바람직하게는 수용성 운반체에 용해 또는 현탁한다. 그 밖에, 이 성분은 완충액, 결합제, 폭제, 희석제, 향료, 윤활유 등과 같은 부형제를 포함할 수 있다. 펩티드는 또 사이토카인과 같은 면역 촉진 물질과 함께 투여할 수 있다. 이러한 성분에 사용될 수 있는 방대한 리스트의 부형제들은 예를 들면 다음에서 취할 수 있다(A. Kibbe, 약학적 부형제, 3. Ed. 2000, American Pharmaceutical Association and pharmaceutical press). 이러한 조성물은 선종성 또는 암질병의 예방, 방지 및/또는 치료에 사용될 수 있다. 예시적 배합은 EP 2113253에서 찾을 수 있다.
하지만 본 발명의 펩티드의 숫자와 물리화학적 특성에 따라 펩티드들의 특이적 조합들 특히 12 내지 18개월보다 오래 안정된 펩티드들의 특이적 조합들에 대한 배합의 제공을 위해 더 많은 연구가 필요하다.
본 발명은 암 특히 비소세포 폐 암종, 위암, 신장 세포 암종, 대장암, 선암종, 전립선암, 양성 신생물 및 음성 흑색종의 치료에 유용한 약제를 제공한다.
본 발명은 더욱이 다음을 포함한 키트(kit)를 포함한다:
(a) 위에 설명된 바와 같은 약학 조성물을 용액 또는 동결건조된 형태로 포함하고 있는 용기;
(b) 임의적으로 희석제 또는 동결건조된 배합을 위한 재구성 용액을 포함하는 제2 용기; 및
(c) 임의적으로 (i) 용액의 사용, 또는 (ii) 동결건조된 배합의 재구성 및/또는 사용을 위한 설명서.
이 키트는 (iii) 완충액, (iv) 희석제, (v) 필터, (vi) 주사바늘, 또는 (vii) 주사기 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 그 용기는 바람직하게 병, 바이알, 주사기 또는 시험관이며; 및 다용도 용기일 수 있다. 약학 조성물은 바람직하게는 동결건조된다.
본 발명에 사용되는 키트는 바람직하게는 동결건조되어 있는 약제를 적당한 용기와 이들의 재구성 및/또는 사용에 관한 지침서를 함께 포함한다 적당한 용기는 예를 들면, 병, 바이알(예를 들면 듀얼 챔버 바이알), 주사기(듀얼 챔버 주사기 등) 및 시험관을 포함한다. 용기는 유리나 플라스틱과 같은 다양한 재질로서 형성할 수 있다. 바람직하게는 키트 및/또는 용기는 재구성 및/또는 사용에 대한 사용법을 표시하는 지시 내용을 그 용기 상에 또는 그와 연관하여 포함한다. 예를 들면, 라벨 상에서 동결건조된 배합을 상기 펩티드 농도로 재구성해야 한다고 지시할 수 있다. 라벨은 또한 약제가 피하투여가 가능한지 아니면 유용한지를 보여줄 수도 있다.
배합을 포함한 용기는 재구성된 약제의 반복된 투여를 가능하게 하는 다용도 바이알일 수 있다(예를 들면 약 2 내지 6회의 투여). 키트는 또한 적당한 희석제(예를 들면 중탄산 용액)를 포함하는 제2 용기를 포함할 수도 있다.
희석제와 동결건조된 약제를 섞었을 때, 재구성된 배합의 최종 펩티드 농도가 바람직하게는 적어도 0.15 mg/mL/펩티드(= 75 μg)이며 바람직하게는 3 mg/mL/펩티드(= 1500 μg)를 넘지 않아야 한다. 키트는 다른 완충액, 희석제, 필터, 바늘, 주사기, 및 패키지 삽입 및 사용 설명서 등의 사용자의 입장에서 필요한 것을 더 추가로 포함할 수도 있다.
본 발명의 키트는 본 발명에 따른 약학 조성물을 포함하는 하나의 용기를 다른 제품과 함께 또는 단독으로 포함 하거나(예를 들면 다른 화합물들 또는 이 다른 화합물들의 약학 조성물) 각각의 조성물을 각자 다른 용기에 포함할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 키트는 다음과 같은 제2 화합물 또는 그들의 조성물과 함께 투여될 수 있는 약학 조성물을 포함한다. 보조제(예를 들면 GM-CSF), 화학요법제, 자연 생산품, 호르몬 또는 길항제, 항-혈관신생 제제 또는 억제제, 괴사유도제 또는 킬레이터. 키트의 조성물은 미리 혼합되어 있을 수도 있고 또는 각각의 조성물이 각각 따로 용기에 담겨 있을 수도 있다. 키트의 조성물은 하나 또는 그 이상의 액체 용액에 제공될 수도 있고, 바람직하게는 수용액, 더욱이 바람직하게는 무균 수용액에 제공된다. 키트의 조성물은 적당한 용해제를 첨가함으로써 액체로 바뀔 수 있는 고체로 제공될 수도 있고, 바람직하게는 이는 다른 용기에 담겨 제공된다.
치료 키트의 용기는 바이알, 실험관, 플라스크, 병, 주사기 또는 고체나 액체를 담을 수 있는 다른 어떤 용기 일 수 있다. 보통, 하나 이상의 구축물이 있을 경우, 키트는 제2 물약병 또는 다른 용기를 포함하고, 이는 각각의 복용을 가능하게 한다. 키트는 약학적으로 허용가능한 액체를 포함하고 있는 용기를 포함할 수도 있다. 바람직하게는, 치료 키트는 현재 키트의 조성물인 발명의 제제를 투여할 수 있는 기구를 포함한다(예를 들면 하나 또는 그 이상의 바늘, 주사기, 안약 투입제, 피펫 등).
그렇다면 본 발명의 다른 양태는 진단하려는 피험자의 뇌 또는 다른 종양 검체로부터 얻은 샘플에서 PTPRZ1, BCAN 및/또는 FABP7 발현의 분석을 포함하는 독립적인 또는 여기에서의 방법들에 근거한 요법(예를 들면 모니터링) 외의 교모종을 다른 형태의 암으로부터 구별하는 방법에 관한 것이다. 이를 위해, 본 발명의 다른 양태는 특이적으로 선택된 교모세포종 마커 폴리펩티드를 결합시키는 하나 이상의 항체 또는 특이적으로 PTPRZ1, BCAN 및/또는 FABP7 mRNA와 혼성화하는 하나 이상의 핵산 및 임의적으로 대조(예를 들면 특정 교모세포종 마커 폴리펩티드의 구체적인 수량), 적절한 경우 일차 및 이차 항체 및 임의적으로 검출가능한 성분, 효소 기질 및/또는 착색제와 같은 다른 제제를 포함하는, PTPRZ1, BCAN 및/또는 FABP7의 발현 수준을 교모세포종 마커 유전자(들)로서 측정하는 키트에 관한 것이다.
본 배합은 구강(경구), 비강, 안약 형태의, 피하의, 피내, 근육내, 혈관내 또는 경피 등 어떠한 투여 형태로든 펩티드 투여에 적당한 약제이다l. 바람직한 투여 경로는 피하 경로이고 가장 바람직한 투여 경로는 피부내 경로이다. 주입 펌프에 의해서도 투여가 가능하다.
서열번호 1 내지 서열번호 49, 서열번호 71 및 서열번호 74 내지 서열번호 129로부터 유래한 본 발명의 펩티드들은 교모세포종으로부터 분리되었으므로, 본 발명의 약제는 바람직하게는 교모세포종의 치료에 사용된다.
본 발명은 더욱이, 예를 들면 서열번호 1 내지 서열번호 131에 따른 펩티드들과 같은 사전선별된 TUMAP의 창고에서 선택된 하나 이상의 펩티드 또는 서열번호 1 내지 서열번호 49, 서열번호 71 및 서열번호 74 내지 서열번호 129로부터 유래한 본 발명의 펩티드들 및/또는 기타 적절한 종양-연관된 펩티드들로 이루어진 약학 조성물의 제조를 포함하는 개별 환자를 위한 개인화된 약학 조성물의 생산 방법을 포함하는데, 그 약학 조성물에 사용되는 상기 하나 이상의 펩티드는 개별 환자 또는 환자들의 소그룹에서 적합성을 위해 선택된다. 바람직하게 이 약학 조성물은 백신이다. 이 방법은 TCR 분리와 같은 하류 용도를 위한 T 세포 클론의 생산에도 적응할 수 있다.
"개인화된 약품"이란, 활성적으로 개인화된 암 백신 및 자가 환자 조직을 사용하는 적응적 세포 요법을 포함하는 한 명의 개별 환자나 소그룹의 환자들에서의 치료를 위해서만 사용되는 그러한 개별 환자 또는 환자들의 소그룹(즉, 100명 미만, 바람직하게는 10명 미만, 더욱이 바람직하게는 5명 미만, 가장 바람직하게는 1명)을 위해 구체적으로 맞춤화된 요법을 의미한다.
여기에서 사용되는 용어 "창고"란 특정한 종양 유형이나 종양 유형의 군에서 면역 원성 및 과다제시에 대해 사전선별된 펩티드의 군을 지칭한다. 용어 "창고"는 백신에 포함된 특정 펩티드가 사전 제조되어 물리적 시설에 보관되었음을 함축하는 의도가 아니다(하지만 그러한 가능성은 고려된다). 생산된 각 개인화된 백신을 위해 펩티드들이 새로 제조될 수 있거나 사전 제조되어 저장될 수 있음이 명백히 고려된다.
창고는 바람직하게는 분석된 몇몇 HLA-A*02 또는 HLA-A*24 양성 GBM 환자들의 종양 조직에서 고도로 과발현된 종양 특이적인 펩티드들로 구성된다. 이것은 MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 펩티드를 포함한다. 창고는 몇몇 GBM 조직들로부터 수집된 종양-연관 펩티드 외에도, HLA-A*02 및 HLA-A*24 마커 펩티드를 포함한다. 이 펩티드들은 TUMAP에 의해 유도된 T 세포 면역원성의 크기에 대한 정량적인 비교를 허용하므로 백신의 항종양 반응을 이끌어내는 용량에 관한 중요한 결론을 도출할 수 있다. 둘째, 어떤 환자에서 "자가" 항원으로 유래한 TUMAP에 대한 인체의 백신-유래 T 세포 반응이 관찰되지 않는 경우, 이것은 "비-자기" 항원으로부터 유래한 중요한 양성 대조 펩티드로서 기능한다. 및 셋째로, 이것은 환자군의 면역능력에 대한 결론의 도출을 가능하게 한다.
창고용 HLA 클래스 I 및 II TUMAP는 유전자 발현 분석, 질량 분석 및 T 세포 면역학이 조합된 통합 기능적 유전체 접근방식을 사용하여 동정된다. 이 방법론은 IMA901, IMA910 또는 IMA950에 포함된 TUMAP의 선택에 대한 기본이 되어 왔으며, 이 접근 방식은 정상 조직에서 최소한으로 발현되는 것이 아닌 고비율의 종양에서 진정하게 존재하는 TUMAP만을 추가 분석을 위해 선택됨을 증명한다. 펩티드 선택을 위하여, GBM 환자로부터 외과적으로 제거된 음성 조직에서 얻은 교모세포종 샘플 및 건강한 공여자의 혈액을 다음과 같이 단계적 접근 방식으로 분석했다.
1. 악성 물질의 HLA 리간드를 질량 분석에 의해 동정했다
2. 마이크로어레이에 의한 유전체-전체의 전령 리보헥산(mRNA) 발현 분석을 사용하여, 정상 기관과 조직들의 범위와 비교하여 악성 조직(GBM)에서 과발현된 유전자들을 동정했다
3. 동정된 HLA 리간드들을 유전자 발현 데이터와 비교했다. 그 단계에서 감지된 선택적으로 발현되거나 과발현된 유전자들에 의해 인코딩된 펩티드들은 멀티-펩티드 백신의 적절한 TUMAP 후보로서 간주되었다
4. TUMAP로서 동정된 펩티드의 관련성을 지지하는 추가의 증거를 파악하기 위해 문헌 연구를 수행했다
5. mRNA 수준에서의 과발현의 타당성은 3단계에서 종양 조직으로부터 선택된 TUMAP의 재검출 및 건강한 조직에 대한 검출의 부재(낮은 빈도)에 의해 확인되었다.
6. 선택된 펩티드에 의한 생체 내 T 세포 반응의 유도가 가능한지 여부를 평가하기 위해, 건강한 공여자는 물론 GBM 환자의 인간 T 세포를 사용하여 시험관 내 면역원성 측정을 수행했다.
한 측면에서는, 펩티드들을 창고에 보관하기 전에 면역원성에 대해 사전선별한다. 제한이 아니라 한 예로서, 펩티드/MHC 복합체인 항-CD28 항체가 로딩된 인공 항원-제시 세포를 가진 건강한 공여자의 CD8+ T 세포를 반복적으로 자극하는 시험관 내 T 세포 프라이밍을 포함하는 방법을 사용하여 창고에 포함된 펩티드의 면역원성을 결정하며, 자세한 내용은 다음에 나오는 실시예 3에서 설명된다.
이 방법은 희귀 암과 희귀 발현 프로필을 갖는 환자에 대해 선호된다. 현재 개발되고 있는 고정된 성분을 갖는 멀티-펩티드 칵테일과 대비할 때, 창고는 종양에서 항원의 실제 발현과 백신과의 훨씬 더 높은 정합을 허용한다. 선택된 하나의 또는 몇몇 "재고" 펩티드들의 조합을 다중표적 접근 방식으로 각 환자에 대해 사용한다. 이론상으로, 예를 들면 50개 라이브러리로부터 선택된 5개의 다른 항원 펩티드에 근거한 접근방법은 이미 약 2백만 가지의 가능한 약품(DP) 구성이 나올 수 있다.
HLA 표현형, 전사체학 및 펩티도믹스 데이터는 환자의 종양 물질과 혈액 샘플로부터 수집하여 창고와 환자 고유의 (즉, 돌연변이된) TUMAP를 포함하는 각 환자에 대해 가장 적절한 펩티드를 동정한다. 환자 종양에서 선택적으로 발현되거나 과발현되는 펩티드를 선택하게 되며, 이는 가능한 경우 환자의 개별 PBMC로써 시험했을 때 강한 시험관 내 면역원성을 나타냈다.
한 구현에서 창고는 서열번호 1 내지 131에 따른 펩티드들, 바람직하게는 본 발명에 따른 펩티드들을 포함 및/또는 이로써 구성된다. 개별 환자 또는 소그룹의 환자들의 종양 샘플에 의해 제시된 바람직한 추가의 TUMAP들은, EP 1806358, EP 1806359, EP 1760088, EP 1922335, EP 2135878, EP 2119726, EP 2291395, GB 1313987 및/또는 EP 2138509에서 설명하고 청구된 펩티드들로부터 선택한다.
바람직하게는 백신에 포함된 펩티드는, (a) 개별 환자의 종양 샘플에 의해 제시된 종양-연관 펩티드(TUMAP)의 동정; (b) 상기 (a)에서 동정된 펩티드를 위에 설명된 펩티드들의 창고와 비교; 및 (c) 그 환자에서 동정된 종양 특이적 펩티드와 상관관계가 있는 창고로부터 하나 이상의 펩티드를 선택을 포함하는 방법에 의해 동정된다. 예를 들면, 종양 샘플에 의해 제시된 TUMAP는 다음에 의해 동정된다: (a1) 종양 샘플에서 과발현되거나 이상 발현된 단백질의 파악을 위해 종양 샘플의 발현 데이터를 모양 샘플의 조직 유형에 상응하는 정상 조직의 샘플에서 얻은 발현 데이터와 비교; 및 (a2) 종양에 의해 과발현되거나 이상 발현된 단백질로부터 유래한 MHC 리간드를 파악하기 위해, 발현 데이터를 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 분자에 결합된 MHC 리간드의 서열과 상관관계 결정. 바람직하게는 종양 샘플로부터 분리된 MHC 분자의 결합된 펩티드를 용출시키고 용출된 리간드의 서열결정에 의해 MHC 리간드의 서열을 파악한다. 바람직하게는 종양 샘플과 정상 조직은 같은 환자로부터 얻는다.
펩티드는 면역원성에 근거한 개별 환자의 적합성에 근거하여 백신에 포함시키기 위해 선택되는데, 이 적합성은 펩티드 수준에 대한 과발현의 수준에 근거하거나 펩티드를 인코딩하는 mRNA의 과발현의 수준에 근거하는 시험관 내 면역원성 측정을 포함하는 방법에 의해 결정할 수 있다. 이러한 시험관 내 면역원성은 개별 환자의 세포에 대해 결정하는 것이 바람직하다.
창고 모델을 사용하는 펩티드의 선택 외에 또는 그 대안으로서, TUMAP를 새 환자에서 동정한 다음 백신에 포함시킬 수 있다. 한 예로서, 후보 TUMAP 환자에서, (a1) 종양 샘플에서 과발현되거나 이상 발현된 단백질의 파악을 위해 종양 샘플의 발현 데이터를 모양 샘플의 조직 유형에 상응하는 정상 조직의 샘플에서 얻은 발현 데이터와 비교; 및 (a2) 종양에 의해 과발현되거나 이상 발현된 단백질로부터 유래한 MHC 리간드를 파악하기 위해, 발현 데이터를 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 분자에 결합된 MHC 리간드의 서열과 상관관계의 결정에 의해 동정할 수 있다. 다른 예로서, 개별 환자의 조직에 상응하는 정상 샘플에 대해 종양 샘플에 고유한 돌연변이를 포함하는 단백질을 동정할 수 있으며, 돌연변이를 특이적으로 표적하는 TUMAP를 동정할 수 있다. 예를 들면, 종양 및 상응하는 정상 조직의 유전체에 대한 염기서열은 전체 유전체의 염기서열 결정에 의해 결정할 수 있다. 유전자의 단백질-코딩 영역에서 비동일(non-synonymous) 돌연변이의 발견을 위해, 유전체 DNA 및 RNA를 종양 조직으로부터 추출하고, 정상의 돌연변이 되지 않은 유전체의 종자계 DNA는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 추출한다. 이러한 응용 NGS 접근방법은 단백질 코딩 영역의 염기서열 재결정으로 제한된다(신유전체 염기서열 재결정). 이 목적을 위해, 업체가 공급하는 표적 강화 키트를 사용한 다음 예를 들면 HiSeq2000(일루미나(Illumina))에 의해 염기서열 결정에 의해 인간 샘플의 엑손 DNA를 포착한다. 그 밖에, 유전자 발현의 직접 정량화 및 돌연변위된 유전자가 환자의 종양에서 발현된다는 검증을 위해 종양 mRNA에 대한 염기 서열을 결정한다. 그에 따른 수백만의 서열 판독값은 소프트웨어 알고리즘을 통해 처리된다. 그 출력 목록에는 돌연변이와 유전자 발현이 포함된다. 종양-특이적 체세포 돌연변이는 PBMC-유래 종자계의 변종과 비교하여 결정한 다음 우선순위화 된다. 다음에는 새로 동정된 펩티드를 위에 설명한 창고의 면역원성에 대해 시험할 수 있으며, 적절한 면역원성을 소유하는 후보 TUMAP를 선택하여 백신에 포함시킨다.
하나의 예시적 구현에서, 백신에 포함되는 펩티드는 다음에 의해 동정된다: (a) 개별 환자의 종양 샘플에 의해 제시된 종양-연관 펩티드(TUMAP)를 위에 설명한 방법으로 동정하는 단계; (b) 상기 (a)에서 동정된 펩티드를, 상응하는 정상 조직과 비교하여 종양에서 면역원성 및 과다제시에 대해 사전선별된 펩티드들의 창고와 비교하는 단계; (c) 환자에서 동정된 종양-연관 펩티드와 상관관계가 있는 하나 이상의 펩티드를 상기 창고로부터 선택하는 단계; 및 (d) 임의적으로 상기 (a)에서 새로 동정된 하나 이상의 펩티드를 선택하고 그 면역원성을 확인하는 단계.
하나의 예시적 구현에서, 백신에 포함되는 펩티드는 다음에 의해 동정된다: (a) 개별 환자의 종양 샘플에 의해 제시된 종양-연관 펩티드(TUMAP)를 위에 설명하는 방법으로 동정하는 단계; 및 (b) 상기 (a)에서 새로 동정된 하나 이상의 펩티드를 선택하고 그 면역원성을 확인하는 단계.
펩티드를 선택한 다음, 백신을 제조한다. 백신은 33% DMSO에 용해된 개별 펩티드들로 멤버 액체 배합이다. 제품에 포함되는 펩티드는 각각 DMSO에 용해한다. 단일 펩티드 용액의 농도는 제품에 포함시킬 펩티드의 숫자에 따라 선택해야 한다. 펩티드-DMSO 용액들을 동일한 비율로 혼합하여 제품에 포함시킬 모든 펩티드가 포함된 용액을 만드는데 그 농도는 펩티드 당 약 2.5mg/ml 이하이다. 혼합된 용액을 1:3의 비율로 물로 희석하여 주사제를 만드는데 그 농도는 33% DMSO에서 펩티드 당 0.826mg/ml이다. 희석시킨 용액을 0.22㎛ 멸균 필터를 통해 여과시킨다. 최종 벌크 용액을 얻는다. 최종 벌크 용액을 바이알에 채워 사용 시까지 -20℃에서 보관한다. 1개의 바이알에는 각 펩티드를 0.578mg 포함하는 700㎕ 용액이 들어 있다. 여기서 500㎕(펩티드 당 약 400 μg)를 피하 주사로 투여하게 된다.
본 발명의 바람직한 구현예는 다음과 같다.
[항목 1]
서열번호 1 내지 서열번호 49, 서열번호 71 및 서열번호 74 내지 129의 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 및 서열번호 1 내지 서열번호 49, 서열번호 71 및 서열번호 74 내지 129에 대해 90% 이상 상동성인 이의 변이체 서열을 포함하는 펩티드, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로서, 상기 변이체는 상기 변이체 펩티드와 T 세포 교차 반응을 유도하고, 상기 펩티드는 전장 폴리펩티드가 아닌, 펩티드.
[항목 2]
항목 1에 있어서, 상기 펩티드 또는 이의 변이체가 인간 주 조직적합 복합체(MHC) 클래스 I 또는 II의 분자에 결합하는 능력을 보유하고, 상기 펩티드가 CD4 및/또는 CD8 T 세포를 자극할 수 있는 펩티드 또는 이의 변이체.
[항목 3]
항목 1 또는 2에 있어서, 아미노산 서열이 서열번호 1 내지 서열번호 49, 서열번호 71 및 서열번호 74 내지 129의 군에 따른 아미노산의 연속적인 신장을 포함하는 펩티드.
[항목 4]
항목 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 상기 펩티드 또는 이의 변이체가 8 내지 100개, 바람직하게는 8 내지 30개, 더욱 바람직하게는 8 내지 16개 아미노산의 전체 길이를 갖고, 가장 바람직하게는 펩티드가 서열번호 1 내지 서열번호 49, 서열번호 71 및 서열번호 74 내지 129에 따른 아미노산으로 구성되거나 이로 본질적으로 구성되는, 펩티드.
[항목 5]
항목 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 펩티드가 변형되고/거나 비펩티드 결합을 포함하는 펩티드.
[항목 6]
항목 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 펩티드가 융합 단백질의 일부로서 특히 HLA-DR 항원-연관 불변쇄(Ii)의 N-말단 아미노산을 포함하는 펩티드.
[항목 7]
항목 1 내지 6 중 어느 하나에 따른 펩티드를 인코딩하고 임의적으로 이종 촉진자 서열과 연관된 핵산.
[항목 8]
항목 7에 따른 핵산을 발현시킬 수 있는 발현 벡터.
[항목 9]
의학에서의 사용을 위한, 항목 1 내지 6 중 어느 하나에 따른 펩티드, 항목 7에 따른 핵산, 또는 항목 8에 따른 발현 벡터.
[항목 10]
항목 7에 따른 핵산 또는 항목 8에 따른 발현 벡터를 포함하는, 바람직하게는 항원 제시 세포 또는 수지상 세포인, 숙주 세포.
[항목 11]
항목 1 내지 6 중 어느 하나에 따른 펩티드의 생산 방법으로서, 항목 7에 따른 핵산 또는 항목 8에 따른 발현 벡터를 발현하는 항목 10에 따른 숙주 세포를 배양하고 상기 숙주 세포 또는 이의 배양 배지로부터 펩티드를 단리하는 것을 포함하는, 방법.
[항목 12]
활성화 세포독성 T 림프구(CTL)를 생산하는 시험관 내 방법으로서,
CTL을 적절한 항원-제시 세포 또는 항원-제시 세포를 모방하는 인위적 구축물의 표면에 발현된 항원-로딩된 인간 클래스 I 또는 II MHC 분자와 상기 CTL을 항원 특이적 방식으로 활성화하는데 충분한 시간 동안 시험관 내에서 접촉시키는 것을 포함하고, 상기 항원은 항목 1 내지 9 중 어느 하나에 따른 펩티드인, 방법.
[항목 13]
항목 1 내지 항목 5 중 어느 하나에 따른 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 비정상으로 발현하는 세포를 선택적으로 인식하는, 항목 12에 따른 방법에 의해 생산된 활성화 세포독성 T 림프구(CTL).
[항목 14]
항목 1 내지 5 중 어느 하나에 따른 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 세포를 표적으로 환자에게서 표적 세포를 괴사시키는 방법으로서, 효과적인 수의 항목 13에 정의된 세포독성 T 림프구(CTL)를 상기 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
[항목 15]
항목 1 내지 5 중 어느 하나에 따른 펩티드, 바람직하게는 MHC 분자에 결합된 항목 1 내지 5 중 어느 하나에 따른 펩티드를 특이적으로 인식하는 항체.
[항목 16]
암의 치료 또는 암에 대한 약제, 바람직하게는 백신의 제조를 위한, 항목 1 내지 항목 7 중 어느 하나에 따른 펩티드, 항목 7에 따른 핵산, 항목 8에 따른 발현 벡터, 항목 10에 따른 세포, 항목 13에 따른 활성화 세포독성 T 림프구 또는 제 15항에 따른 항체의 용도.
[항목 17]
항목 16에 있어서, 상기 암이 성상아교세포종, 털모양 성상아교세포종, 이형성 배아성 신경상피종, 핍지신경모종, 뇌실막세포종, 다형성 교모세포종, 혼합 교모종, 핍지교성상세포종, 수모세포종, 망막모세포종, 신경모세포종, 종자세포종, 기형종, 신경절 교모종, 신경절 세포종, 중추 신경절세포종, 원시성 신경외배엽 종양(PNET, 예를 들면 수모상피종, 속질상피종, 신경모세포종, 망막모세포종, 뇌실막모세포종), 송과체 실질의 종양(예를 들면 송과체종, 송과체모세포종), 뇌실막 세포 종양, 맥락 얼기 종양, 불명기원의 신경상피 종양(예를 들면 대뇌 신경아교종증, 성상모세포종), 교모세포종 전립선 종양, 유방암, 식도암, 결장직장암, 투명 세포 신장 세포 암종, 폐암, CNS, 난소암, 흑색종, 췌장암, 편평 세포 암종, 백혈병 수모세포종, 결장 종양, 직장 종양, 위 종양, 신장 종양, 폐 종양, 췌장 종양, 전립선 종양, 피부 종양 및 TPRZ1, BCAN, 및/또는 FABP7 및/또는 서열번호 1 내지 서열번호 49, 서열번호 71 및 서열번호 74 내지 129의 펩티드가 유래하는 또 다른 단백질의 과발현을 보여주는 기타 종양으로부터 선택되는 용도.
[항목 18]
(a) 항목 1 내지 6 중 어느 하나에 따른 펩티드, 항목 7에 따른 핵산, 항목 8에 따른 발현 벡터, 항목 10에 따른 세포, 항목 13에 따른 활성화 세포독성 T 림프구 또는 항목 15에 따른 항체를 용액이나 동결건조된 형태로 포함하는 약학 조성물을 포함하는 용기;
(b) 임의적으로 희석제 또는 동결건조된 배합을 위한 재구성 용액을 포함하는 제 2 용기;
(c) 임의적으로 서열번호 1 내지 서열번호 131로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 펩티드; 및
(d) 임의적으로 (i) 용액의 사용, 또는 (ii) 동결건조된 배합의 재구성 및/또는 사용을 위한 설명서를 포함하는 키트.
[항목 19]
항목 18에 있어서, 하나 이상의 (iii) 완충액, (iv) 희석제, (v) 필터, (vi) 주사바늘, 또는 (v) 주사기를 추가로 포함하는 키트.
[항목 20]
항목 18 또는 19에 있어서, 상기 펩티드가 서열번호 1 내지 19, 서열번호 42 내지 44, 서열번호 50 내지 65, 및 서열번호 71 내지 88로 구성되는 군으로부터 선택되는 키트.
[항목 21]
a) 개별 환자의 종양 샘플에 의해 제시된 종양 특이적 펩티드(TUMAP)를 동정하는 단계;
b) 상응하는 정상 조직과 비교하여 종양에서 면역원성과 과다제시에 대해 사전선별된 펩티드의 창고를 이용하여 상기 단계 a)에서 동정된 펩티드와 비교하는 단계;
c) 환자에서 동정된 종양 특이적 펩티드와 상관관계가 있는 하나 이상의 펩티드를 창고로부터 선택하는 단계; 및
d) 상기 단계 c)에 근거하여 개인화 백신을 제조하는 단계를 포함하는, 개별 환자를 위한 개인화 항암 백신의 생산 방법.
[항목 22]
항목 21에 있어서,
(a1) 종양 샘플의 발현 데이터를 종양 샘플의 조직 유형에 상응하는 정상 조직 샘플의 발현 데이터와 비교하여 종양 샘플에서 과발현되거나 이상 발현된 단백질을 동정하고;
(a2) 종양 샘플에서 발현 데이터와 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 분자에 결합된 MHC 리간드의 서열의 상관관계 결정에 의해 종양에 의해 과발현되거나 이상 발현된 단백질로부터 유래한 MHC 리간드를 동정함으로써 TUMAP를 동정하는, 방법.
[항목 23]
항목 21 또는 22에 있어서, 종양 샘플로부터 단리된 MHC 분자의 결합된 펩티드를 용출시키고, 용출된 리간드를 서열결정하여 MHC 리간드의 서열을 동정하는 방법.
[항목 24]
항목 21 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 종양 샘플의 조직 유형에 상응하는 정상 조직을 환자로부터 얻는 방법.
[항목 25]
항목 21 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 창고에 포함된 펩티드를 하기 단계에 따라 동정하는 방법:
a. 악성 물질의 HLA 리간드를 질량 분석에 의해 동정하는 단계;
b. 마이크로어레이에 의한 유전체-전체의 전령 리보헥산(mRNA) 발현 분석을 사용하여, 정상 기관과 조직들의 범위와 비교하여 악성 조직(GBM)에서 과발현된 유전자를 동정하는 단계;
c. 상기 동정된 HLA 리간드를 유전자 발현 데이터와 비교하는 단계;
d. 상기 단계 b에서 검출된 선택적으로 발현되거나 과발현된 유전자에 의해 인코딩된 펩티드를 선택하는 단계;
e. mRNA 수준에서의 과발현의 타당성을 상기 단계 c에서 종양 조직으로부터 선택된 TUMAP의 재검출 및 건강한 조직에서 검출의 결여 또는 낮은 빈도에 의해 확인하는 단계; 및
f. 선택된 펩티드에 의한 생체 내 T 세포 반응의 유도가 가능한지 여부를 평가하기 위해, 건강한 공여자 또는 GBM 환자의 인간 T 세포를 사용하여 시험관 내 면역원성 검사를 수행하는 단계.
[항목 26]
항목 21 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 창고에 포함된 펩티드의 면역원성을, 시험관 내 면역원성 측정, 개별 HLA 결합에 대한 환자 면역 모니터링, MHC 다합체 염색, ELISPOT 측정 및/또는 세포내 사이토카인 염색을 포함하는 방법으로 결정하는 방법.
[항목 27]
항목 21 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 상기 창고가 서열번호 1 내지 서열번호 131로 구성되는 군으로부터 선택된 다수의 펩티드를 포함하는 방법.
[항목 28]
항목 21 내지 27 중 어느 하나에 있어서, d) 정상의 상응하는 조직에 대해 종양 샘플에 고유한 하나 이상의 돌연변이를 개별 환자로부터 동정하는 단계, 및 상기 돌연변이와 상관관계가 있는 백신에 포함시킬 펩티드를 선택하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
[항목 29]
항목 28에 있어서, 상기 하나 이상의 돌연변이가 전체 유전체 서열 결정에 의해 동정되는 방법.
[항목 30]
서열번호 1 내지 서열번호 49, 서열번호 71 및 서열번호 74 내지 129로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 HLA 리간드에 반응성인 T 세포 수용체.
[항목 31]
항목 30에 있어서, 상기 아미노산 서열이 서열번호 1 내지 서열번호 49, 서열번호 71 및 서열번호 74 내지 129에 대해 90% 이상, 또는 95% 이상 동일한 T 세포 수용체.
[항목 32]
항목 30 또는 31에 있어서, 상기 아미노산 서열이 서열번호 1 내지 서열번호 49, 서열번호 71 및 서열번호 74 내지 129의 어느 것을 포함하는 T 세포 수용체.
[항목 33]
항목 30 내지 32 중 어느 하나에 있어서, 상기 아미노산 서열이 서열번호 1 내지 서열번호 49, 서열번호 71 및 서열번호 74 내지 129의 어느 것으로 구성되는 T 세포 수용체.
[항목 34]
(a) 서열번호 1 내지 서열번호 49, 서열번호 71 및 서열번호 74 내지 129에 대해 80% 이상 동일한 아미노산 서열; 및
(b) HLA-DR 항원-연관 불변쇄(Ii)의 N-말단 아미노산 1 내지 80을 포함하는 융합 단백질.
[항목 35]
항목 34에 있어서, (a)의 상기 아미노산 서열이 서열번호 1 내지 서열번호 49, 서열번호 71 및 서열번호 74 내지 129에 대해 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상 동일한 융합 단백질.
[항목 36]
항목 35에 있어서, (a)의 상기 아미노산 서열이 서열번호 1 내지 서열번호 49, 서열번호 71 및 서열번호 74 내지 129를 포함하는 융합 단백질.
[항목 37]
(a) 항목 1 내지 6 중 어느 하나에 따른 펩티드;
(b) 항목 30 내지 33 중 어느 하나에 따른 T 세포 수용체; 또는
(c) 항목 34 내지 36 중 어느 하나에 따른 융합 단백질을 인코딩하는 핵산.
[항목 38]
항목 37에 있어서, DNA, cDNA, PNA, RNA 또는 이의 조합인 핵산.
[항목 39]
항목 37 또는 38에 따른 핵산을 포함하는 발현 벡터.
[항목 40]
항목 37 또는 38에 따른 핵산, 또는 항목 39에 따른 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
[항목 41]
항목 40에 있어서, 항원 제시 세포, 예를 들면 수지상 세포인 숙주 세포.
[항목 42]
(a) 항목 1 내지 6 중 어느 하나에 따른 펩티드; (b) 항목 30 내지 33 중 어느 하나에 따른 T 세포 수용체; 또는 (c) 항목 34 내지 36 중 어느 하나에 따른 융합 단백질을 생산하는 방법으로,
항목 41에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 상기 펩티드, 상기 T 세포 수용체 또는 상기 융합 단백질을 상기 숙주 세포 및/또는 이의 배양 배지로부터 단리하는 단계를 포함하는 방법.
[항목 43]
활성화 세포독성 T 림프구(CTL)를 생산하는 시험관 내 방법으로서,
CTL을 적절한 항원-제시 세포의 표면에 발현된 항원-로딩된 인간 클래스 I 또는 II MHC 분자와 상기 CTL을 항원 특이적 방식으로 활성화하는데 충분한 시간 동안 시험관 내에서 접촉시키는 것을 포함하고, 상기 항원은 항목 1 내지 6 중 어느 하나에 따른 상기 펩티드인, 방법.
[항목 44]
항목 43에 있어서, 충분한 양의 항원을 항원-제시 세포와 접촉시킴으로써 상기 항원이 적절한 항원-제시 세포의 표면에 발현된 클래스 I 또는 II MHC 분자에 로딩되는 방법.
[항목 45]
항목 44에 있어서, 상기 항원-제시 세포가 항목 1 내지 6 중 어느 하나에 따른 상기 펩티드를 발현할 수 있는 발현 벡터를 포함하는 방법.
[항목 46]
항목 44 내지 46 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 생산되는 활성화 세포독성 T 림프구(CTL).
[항목 47]
환자의 표적 암 세포를 괴사시키는 방법으로서, 효과적인 수의 항목 46에 따른 세포독성 T 림프구(CTL)를 상기 환자에 투여하는 것을 포함하는 방법.
[항목 48]
약제로서 또는 약제의 제조에 있어서, 항목 1 내지 6 중 어느 하나에 따른 펩티드, 항목 30 내지 33 중 어느 하나에 따른 T 세포 수용체, 항목 34 내지 36 중 어느 하나에 따른 융합 단백질, 항목 37 또는 38에 따른 핵산, 항목 39에 따른 발현 벡터, 항목 40 또는 41에 따른 숙주 세포, 또는 항목 46에 따른 활성화 세포독성 T 림프구의 용도.
본 발명은 면역요법 방법에 사용하기 위한 펩티드, 핵산 및 세포에 관한 것이다. 특히 본 발명은 암의 면역요법을 제공한다. 본 발명은 더욱이 항종양 면역 반응을 촉진시키는 백신 조성물의 활성 약학적 성분으로 작용하는 종양-연관 세포독성 T 세포(CTL) 펩티드 항원결정부위 단독 또는 기타 종양-연관 펩티드와의 병용을 제공한다. 본 발명은 항종양 면역 반응을 이끌어내는 백신 조성물에 사용할 수 있는 인간 종양 세포의 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 분자로부터 유래하는 펩티드 서열들 및 이들의 변이체들을 제공한다.
도 1: 원발성 교모세포종 종양 샘플에서의 제시를 나타내는 IGF2BP3-001의 질량 스펙트럼의 예. 나노ESI-LCMS는 교모세포종 샘플 6010에서 용출된 펩티드 풀에서 실행되었다. m/z 536.3229 ±0.001 Da, z=2의 질량 크로마토그램은 정체 시간 48.76분에서 펩티드 피크를 보여준다. B) 질량 크로마토그램에서 48.76분의 검출된 피크는 MS 스펙트럼에서 m/z 536.3229의 신호임을 드러냈다. C) 주어진 정체 시간에 나노ESI-LCMS 실험을 통해 기록한 선택된 전구체 m/z 536.3229의 충돌 유도 감쇠 질량 스펙트럼으로 교모세포종 6010 종양 샘플에서 IGF2BP3-001의 존재가 확인되었다. D) 합성 IGF2BP3-001 참고 펩티드의 분절 패턴을 기록하여 상기 C에 나와 있는 생성된 자연 TUMAP 분절 패턴과 비교하여 서열이 확인되었다.
도 2: 정상 조직 및 22개 교모세포종 암 샘플에서 선택된 단백질의 mRNA 발현 프로필 a) CSRP2(Probeset ID: 211126_s_at); b) PTPRZ1(Probeset ID: 204469_at).
도 3: 선택된 HLA 클래스 I 펩티드의 제시 프로필. 평균 샘플 제시는 물론 복사 변이를 보여주는 각 펩티드의 제시 프로필을 계산했다. 이 프로필은 관심 대상의 종양 객체의 샘플들을 정상 조직 샘플의 기준선에 병치한다. a) CSRP2-001(HLA-A*02); b) PTP-012(HLA-A*02); c) TMEM255A-001(HLA-A*24); d) PJA2-001(HLA-A*24).
도 4: HLA*A02 및 HLA*A24에 대한 클래스 I TUMAP의 시험관 내 면역원성에서 펩티드-특이적 결과의 예. 특이적 CD8+ T 세포를 두 가지 다른 형광색소에 각각 연결된 HLA 다합체로써 염색했다. 점 도표는 자극 펩티드(왼쪽 패널)와 각각의 음성 대조 자극(오른쪽 패널)에 대한 MHC 다합체-이중-양성 모집단을 보여준다.
본 발명은 바람직한 구현을 포함하는 다음의 실시예에서 묘사될 것이나, 이에 국한되지 않는다. 본 발명의 목적상, 여기에 인용된 모든 참조 문헌들은 그 전문이 포함된다.
실시예
실시예 1:
세포 표면에 제시간 종양-연관 펩티드의 동정 및 정량화
조직 샘플:
환자의 종양 조직은 독일 소재 하이델베르크 대학(Universities of Heidelberg) 및 튀빙겐 대학(University of Tubingen) 및 스위스 소재 제네바 대학(University of Geneva)에서 제공했다. 모든 환자의 고지에 의한 동의서가 수술 전에 제출되었다. 조직은 수술 직후 액체 질소에서 충격 동결되었으며 TUMAP의 분리까지 -80℃에서 보관되었다.
조직 샘플에서 HLA 펩티드의 분리
약간 변형된 프로토콜에 따라, 충격 냉동된 조직 샘플의 HLA 펩티드 풀은 고형 조직의 면역 침전에 의해 HLA-A*02-특이 항체 BB7.2 또는 HLA-A, -B, -C-특이적 항체 W6/32, CNBr-활성화 세파로오스, 산성 처리와 한외 여과를 이용해 취득되었다(Falk, K. et al 1991; Seeger, F.H. et al. T 1999).
방법
얻어진 HLA 펩티드 풀은 그들의 소수성에 의해 역상 크로마토그래피를 이용하여 분리되었고(악퀴티(Acquity) UPLC 시스템, 워터스(Waters)) 녹여서 분리하는 펩티드는 ESI 공급원을 갖춘 LTQ-오비트랩 하이브리드 질량 분석기(써모일렉트론(ThermoElectron))에 의해 분석되었다. 펩티드 풀은 분당 400nL의 유량을 적용하여 1.7 μm C18 역상 물질(워터스)로 충전된 합성-실리카 마이크로-모세관 칼럼(75 μm i.d. x 250 mm)에 바로 로딩된다. 이어서, 펩티드는 두-단계 180분-10% 내지 33%의 이진 구배를 이용하여 분리되고, 여기서 유량은 분당 300nL이다. 구배는 용매 A(물의 0.1% 포름산)와 용매 B(아세토니트릴의 0.1% 포름산)로 이루어져 있다. 금이 입혀진 유리 모세관(피코팁(PicoTip), 뉴 옵젝티브(New Objective))이 미세-ESI 공급원로의 도입에 사용되었다. LTQ-오비트랩 질량 분석계가 TOP5 전략을 이용한 데 이터-의존 모드에서 작동되었다. 간략하게, 스캔 사이클은 오비트랩의 높은 질량 정확도(R = 30,000)의 전스캔으로 시작되고, 이후 5개의 가장 많은 이전에 선택한 이온의 동적 배제에 의한 전조 이온에 대한 오비트랩(R = 7500)의 MS/MS 스캔이 이어진다. 탠덤 질량 스펙트럼은 SEQUEST과 추가적인 수동 컨트롤에 의해 해석된다. 동정된 펩티드 서열은 생성된 자연 펩티드 분절 패턴과 합성을 서열-일치 참고 펩티드와의 비교를 통해 보증되었다. 도 1은 UPLC 체계의 MHC 클래스 1과 관련된 IGF2BP3-001 펩티드와 이의 용출 프로필의 예시적 스펙트럼을 보여준다.
비표지 상대적 LC-MS 정량화는 이온 계측 즉, LC-MS 특징의 추출 및 분석에 의해 수행했다(Mueller et al., 2007). 이 방법은 펩티드의 LC-MS 신호 영역이 샘플 내의 풍부함과 상관관계가 있음을 가정으로 한다. 추출된 특징은 전하 상태 디컨블루션 및 정체 시간 정렬에 의해 추가로 처리되었다(Mueller et al., 2007). 마지막으로 모든 LC-MS 특징은 서열 확인 결과와 상호 참조하여 다른 샘플과 조직의 정량 데이터를 펩티드 제시 프로필에 합쳤다. 이 정량 데이터를 중심 경향성에 따라 2단 형태로 정상화함으로써 기술적인 생물학적 복제 내에서의 변동을 고려했다. 그리하여 동정된 펩티드는 하나씩 정량 데이터와 연관시키며 샘플과 조직 사이의 상대적 정량화를 허용할 수 있다. 그 밖에 펩티드 후보로부터 얻어진 모든 정량 데이터를 수동으로 검사하여 데이터 일관성을 보증하고 자동화 분석의 정확성을 확인했다. 펩티드마다 평균 샘플 제시는 물론 복사 변이를 보여주는 제시 프로필을 계산했다. 이 프로필은 아교세포종 샘플을 정상 조직 샘플의 기준선에 병치한다.
예시적인 과다제시된 펩티드의 제시 프로필이 도 3에 나와 있다.
실시예 2
본 발명의 펩티드를 인코딩하는 유전자의 발현 프로필
암 세포의 표면에 MHC 분자에 의해 제시되는 모든 펩티드가 면역 치료에 적당한 것은 아니다. 이는 이 펩티드의 거의 대부분이 많은 세포 유형에서 발현되는 정상 세포 단백질에서 유래된 것이기 때문이다. 아주 적은 몇 개의 펩티드가 암과 관련이 있고, 높은 특수성을 가지고 자기가 유도된 암의 T 세포를 유도할 수 있는 능력을 가지고 있다. 이런 펩티드를 식별하고 백신에 의해서 발생하는 자가면역의 위험을 최소화 하기 위해 발명자들은 정상 조직과 비교했을 때 종양 세포에서 현저히 과발현되는 단백질에 초점을 맞추었다.
이상적인 펩티드는 그 종양에만 고유한 단백질에서 유래하고 다른 어떠한 조직에서도 찾을 수 없는 것이다. 이러한 발현 프로필과 비슷한 것을 가지고 있는 유전자에 의해서 생성되는 펩티드를 식별하기 위하여, 식별된 펩티드는 단백질과 유전자에 할당되었고, 이 유전자들의 발현 프로필이 생성되었다.
RNA 공급원 및 제조
수술로 제거된 조직 표본은 각 환자로부터 서면 동의서를 받은 후 실시예 1에 나열된 몇몇 임상 실험 센터에서 제공되었다(실시예 1 참조). 종양 조직 표본은 액체 질소에 의해 수술 직후 스냅-냉동되었고 절구와 유봉을 이용하여 액체 질소 환경 아래에서 균질화되었다. 총 RNA는 TRIzol(인비트로젠(Invitrogen), 독일 카를르수에 소재)을 이용하여 샘플로부터 준비되었고 이는 RNeasy(퀴아젠, 독일 힐덴 소재)에 의해 청소되었다; 이 두 개의 모든 방법은 제조업체의 설명서에 따라 실행되었다.
건강한 인간 조직의 총 RNA는 상업적으로 얻어졌다(암비온(Ambion), 영국 헌팅톤 소재; 클론테크(Clontech), 독일 하이델베르크 소재; 스트라타진, 네덜란드 암스테르담 소재; 바이오체인(BioChain), 미국 캘리포니아주 헤이워드 소재). 여러 개인에서 얻어진 RNA(2에서 123명의 개인)는 각각의 개인에게 균등 가중치를 두어 섞어졌다.
RNA 샘플의 양과 질은 아질런트 2100 생물분석기(아질런트(Agilent), 독일 발트브론 소재)에 의해 RNA 6000 피코 랩칩(Pico LabChip) 키트(아질런트)를 사용하여 분석되었다.
마이크로어레이 실험
모든 암과 정상 조직 RNA 샘플의 유전자 발현 분석은 어피메트릭스 휴먼 게놈(Affymetrix Human Genome: HG) U133A 또는 HG-U133 플러스 2.0 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이(어피메트릭스(Affymetrix), 미국 캘리포니아주 산타 클라라 소재)에 의해 실행되었다. 모든 단계는 어피메트릭스의 사용설명서에 따라 실행되었다. 간단히, 두 줄기 cDNA는 슈퍼스크립트(SuperScript) RTII(인비트로젠)와 올리고-dT-T7 프라이머(엔더블유쥐 바이오테크(MWG Biotech), 독일 에베르스베르크 소재)를 사용하여 사용설명서에 따라 총 RNA 5 내지 8 μg으로부터 합성되었다. 시험관 내 전사는 U133A 어레이를 위한 바이오어레이 고수율 RNA 전사 표지화 키트(엔조 디아그노스틱스 인코포레이티드(ENZO Diagnostics, Inc.), 미국 뉴욕주 파밍데일 소재) 또는 U133 플러스 2.0 어레이를 위한 유전자칩 IVT 표지화 키트(어피메트릭스)를 사용하여 실행되었다. 이는 cRNA 절단, 교배 및 스트렙트아비딘-피코에리트리틴 및 비오티닐화된 항-스트렙트아비딘 항체로의 염색으로 이어졌다(몰레큘라 프로브스(Molecular Probes), 네덜란드 네이덴 소재). 이미지는 아질런트 2500A 유전자어레이 스캐너(U133A) 또는 어피메트릭스 유전자칩 스캐너 3000(U133 플러스 2.0)을 이용하여 스캔되었고, 데이터는 기본 설정을 이용하여 GCOS 소프트웨어(어피메트릭스)를 통해 분석되었다. 정상화를 위해, 100 어피메트릭스에 의해 제공된 하우스키핑 유전자가 사용되었다. 상대적인 발현 값은 시그널 로그 비율을 통해 계산되었고 정상 샘플의 값은 임의로 1.0으로 정해졌다.
본 발명의 교모세포종에서 고도로 과발현 또는 배타적으로 발현되는 공급원 유전자의 예시적 발현 프로필이 도 2에 나와 있다.
실시예 3
교모세포종 MHC 클래스 I 제시 펩티드의 시험관 내 면역원성
본 발명의 TUMAP의 면역원성에 대한 정보를 얻기 위해, 펩티드/MHC 복합체 및 항-CD28 항체가 로딩된 인공 항원-제시 세포(aAPC)를 갖는 CD8+ T 세포의 반복된 자극을 근거로 시험관 내 T 세포 초회감작을 사용하여 조사를 수행했다. 이 방법으로 지금까지 69 HLA-A*0201 및 58 HLA-A*24 제한된 본 발명의 TUMAP의 면역원성을 보여줄 수 있었으며, 이것은 이 펩티드들이 인간에 존재하는 CD8+ 전구 T 세포에 대한 T 세포 항원결정부위이라는 것을 잘 보여주었다.
CD8+ T 세포의 시험관 내 초회감작
펩티드-MHC 복합체(pMHC) 및 항-CD28 항체가 로딩된 인공 항원-제시 세포에 의한 시험관 내 자극을 수행하기 위해, 독일 소재의 트랜스퓨전 메디슨 튀빙겐(Transfusion Medicine Tuebingen)에서 동의서를 받은 건강한 공여자로부터의 CD8 마이크로비드(밀테니이 바이오텍(Miltenyi Biotec), 독일 베르기슈글라트바흐 소재)를 사용한 양성 선택을 통해 신선한 HLA-A*02 백혈구 성분 채집 산물로부터 CD8+ T 세포를 먼저 분리했다.
분리된 CD8+ 림프구 또는 PBMC는 10% 열 비활성화된 인간 AB 혈청(판-바이오테크(PAN-Biotech), 독일 아이덴바흐 소재), 100 U/ml 페니실린/100 ㎍/ml 스트렙토마이신(캄브렉스(Cambrex), 독일 쾰른 소재), 1 mM 피루브산 나트륨(씨씨 프로(CC Pro), 독일 오베르도르흘라 소재), 20 ㎍/ml 젠타마이신(캄브렉스)으로 보충된 RPMI-글루타맥스(Glutamax)(인비트로젠, 독일 카를스루에 소재)를 포함하는 T 세포 배지(TCM)에서 사용할 때까지 배양했다. 이 단계에서 2.5 ng/ml IL-7(프로모셀(PromoCell), 독일 하이델베르크 소재) 및 10 U/ml IL-2(노바티스 파바(Novartis Pharma), 독일 뉘른베르크 소재) 또한 TCM에 추가했다. pMHC/항-CD28 코팅된 비드의 생성, T 세포 자극 및 판독은 고도로 정의된 시험관 내 체계에서 수행했으며, 자극 조건 당 4가지 다른 pMHC 분자 및 판독 조건 당 8가지 다른 pMHC 분자를 각각 사용했다. aAPC 로딩 및 세포 측정 판독에 사용된 모든 pMHC 복합체는 UV-유도 MHC 리간드 교환을 약간 변형하여 얻었다. 교환에 의해 얻어진 pMHC 단량체의 수량을 결정하기 위해, 스트렙타비딘-기반 샌드위치 ELISA(Rodenko et al., 2006)를 수행했다. 정제된 공동-자극 쥐 IgG2a 항인간 CD28 Ab 9.3(Jung et al., 1987)은 제조사가 권장하는 술폰-N-하이드록시숙신이미도비오틴(퍼바이오(Perbio), 독일 본 소재)을 사용하여 화학적으로 비오틴닐화 했다. 사용된 비드는 스트렙티비딘으로 코팅된 직경 5.6 ㎛의 폴리스티렌 입자(방스 래보래토리즈(Bangs Laboratories), 미국 일리노이주 소재)였다.
높은 면역원성 및 낮은 면역원성자극의 대조로서 사용되는 pMHC는 각각 A*0201/MLA-001(변형된 멜란-A/MART-1의 펩티드 ELAGIGILTV)와 A*0201/DDX5- 001(DDX5 의 YLLPAIVHI)였다.
800.000 비드/200 ㎕는 4 x 12.5 ng의 상이한 비오틴-pMHC 존재 하에 96-웰 플레이트에서 코팅하고 세척한 다음 600 ng 비오틴 항-CD28을 첨가하여 200 ㎕의 부피로 만들었다. 96-웰 플레이트에서 자극을 개시하기 위해 1x106 CD8+ T 세포와 5 ng/ml IL-12(프로모셀)로 보충된 200 ㎕ TCM에서 세척하고 코팅된 2 x 105 비드를 37℃에서 3 내지 4분 동안 공동 배양했다. 다음, 배지의 절반을 80 U/ml IL-2로 보충된 신선한 TCM으로 교환한 다음 배양을 37℃에서 3 내지 4일 계속했다. 이러한 자극 주기를 총 3번 수행했으며 조건 당 12개의 개별 세포가 사용되었다. 조건 당 8가지 다른 pMHC 멀티머 판독을 위해, 이전에 설명된 바 같이(Andersen et al., 2012) 2차원 복합 코딩 접근방법을 사용하였으며, 5개의 다른 형광색소들과의 커플링을 허용하는 약간의 변형이 있었다. 마지막으로 멀티머 분석은 살아있는/죽은 근 IR 염료(인비트로젠, 독일 카를스루에 소재), CD8-FITC 항체 클론 SK1(BD, 독일 하이델베르크 소재) 및 형광 pMHC 멀티머로써 세포를 염색하여 수행했다. 분석에는 적절한 레이저 및 필터가 장착된 BD LSRII SORP 세포측정기를 사용했다. 펩티드 특이적 세포는 총 CD8+ T 세포의 백분율로 계산되었다. 멀티머 분석의 평가는 FCS 익스프레스 소프트웨어(드 노보 소프트웨어)를 사용하여 수행되었다. 특정 멀티머+ CD8+ 림프구의 시험관 내 초기 감작은 적절한 통문과 음성 대조군 자극과 비교함으로써 감지되었다. 주어진 항원의 면역원성은, 건강한 기증자의 최소한 하나의 시험관 내 자극된 평가 가능한 웰이 시험관 내 자극 후 CD8+ T 세포주를 보이면 감지되었다(예를 들면, 이 웰은 CD8+ T 세포 중 최소한 1%의 특정 테트라머+를 가졌으며 특정 테트라머+ 세포의 백분율은 최소한 음성 대조군 자극의 매체보다 10배여야 한다).
교모세포종 펩티드의 시험관 내 면역원성
실험된 HLA 클래스 I 펩티드에서, 시험관 내 면역원성은 펩티드 특이적 T 세포주의 생성에 의해 입증될 수 있었다. 본 발명의 두 개의 펩티드에 대한 TUMAP-특이적 멀티머 염색의 유동세포계측법의 결과 및 상응하는 음성 대조가 도 3에 보여진다. 69 HLA-A*0201 및 58 HLA-A*24 펩티드의 결과는 표 5a 및 5b에 각각 요약된다.
[표 5a]
본 발명의 HLA-A*02 클래스 I 펩티드의 시험관 내 면역원성
본 발명의 펩티드 출원자가 실행한 시험관 내 면역원성 실험의 예시적 결과.
<20% = +; 20% - 49% = ++; 50% - 70%= +++; > 70% = ++++
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[표 5b]
본 발명의 HLA-A*24 클래스 I 펩티드의 시험관 내 면역원성
본 발명의 펩티드 발명자가 실행한 시험관 내 면역원성 실험의 예시적 결과.
<20% = +; 20% - 49% = ++; 50% - 70%= +++; > 70% = ++++
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참조문헌 목록
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Figure pat00096
SEQUENCE LISTING <110> Immatics Biotechnologies GmbH <120> PERSONALIZED IMMUNOTHERAPY AGAINST SEVERAL NEURONAL AND BRAIN TUMORS <130> IPA220768-DE <140> PCT/EP2014/073588 <141> 2014-11-03 <150> US 61/899,680 <151> 2013-11-04 <150> GB 1319446.9 <151> 2013-11-04 <160> 131 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Arg Leu Gly Ile Lys Pro Glu Ser Val 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ala Leu Ala Phe Lys Leu Asp Glu Val 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Tyr Leu Pro Thr Phe Phe Leu Thr Val 1 5 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Gly Leu Pro Ser Gly Ala Pro Pro Gly Val 1 5 10 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Ile Trp Glu His Asn Val Glu Val 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Leu Leu Trp Gly Asn Ala Ile Phe Leu 1 5 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Gly Leu Asp Pro Ser Ser Gly Ala Ile His Val 1 5 10 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Leu Leu Tyr Asp Ala Val His Ile Val 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Leu Leu Leu Gly Ser Pro Ala Ala Ala 1 5 <210> 10 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Ala Leu Gly Asp Ile Arg Glu Val 1 5 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Ser Leu Asp Thr Leu Met Thr Tyr Val 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Ala Leu Ser Val Arg Ile Ser Asn Val 1 5 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Phe Leu Trp Ser Asp Gly Val Pro Leu 1 5 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Ala Val Ala Pro Gly Pro Trp Lys Val 1 5 <210> 15 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Phe Leu Leu Pro Asp Thr Asp Gly Leu Thr Ala Leu 1 5 10 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Ser Leu Gly Leu Phe Leu Ala Gln Val 1 5 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Val Leu Ile Gln Asp Val Pro Thr Leu 1 5 <210> 18 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Lys Leu Phe Asp Ser Asp Pro Ile Thr Val Thr Val 1 5 10 <210> 19 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Phe Leu His Asp Ile Ser Asp Val Gln Leu 1 5 10 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Arg Val Ala Asp Tyr Ile Val Lys Val 1 5 <210> 21 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Ala Leu Phe Asn Lys Gly Gly Ser Val Phe Leu 1 5 10 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Lys Val Phe Asp Glu Val Ile Glu Val 1 5 <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Gly Leu Met Glu Lys Ile Lys Glu Leu 1 5 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Gly Met Met Thr Ala Ile Leu Gly Val 1 5 <210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Phe Leu Tyr Lys Val Ile Leu Ser Leu 1 5 <210> 26 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Ala Leu Thr Thr Leu Met His Gln Leu 1 5 <210> 27 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Glu Ile Leu Asp Tyr Ile Tyr Glu Val 1 5 <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Phe Leu Val Asp Gly Ser Trp Ser Ile 1 5 <210> 29 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Tyr Gln Asp Pro His Ser Thr Ala Val 1 5 <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Lys Leu Thr Asp Ile Gln Ile Glu Leu 1 5 <210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Thr Met Met Ser Arg Pro Pro Val Leu 1 5 <210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Arg Val Ala Ser Pro Thr Ser Gly Val 1 5 <210> 33 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Ser Leu Ala Glu Arg Leu Phe Phe Gln Val 1 5 10 <210> 34 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Ala Met Thr Gln Leu Leu Ala Gly Val 1 5 <210> 35 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Gly Leu Ser Glu Phe Thr Glu Tyr Leu 1 5 <210> 36 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Val Leu Cys Gly Pro Pro Pro Ala Val 1 5 <210> 37 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Ala Leu Ala Asp Ile Ala Val Gly Val 1 5 <210> 38 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Leu Leu Tyr Thr Gly Asp Leu Glu Ala Leu 1 5 10 <210> 39 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Gly Leu Leu Asp Gln Ile Gln Ala Leu 1 5 <210> 40 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Asn Ile Leu Glu Gln Ile Val Ser Val 1 5 <210> 41 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Phe Leu Tyr Asn Glu Ala Leu Tyr Ser Leu 1 5 10 <210> 42 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Met Leu Phe Gly His Pro Leu Leu Val Ser Val 1 5 10 <210> 43 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Arg Leu Ile Ser Lys Phe Asp Thr Val 1 5 <210> 44 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Leu Leu Gln Asp Arg Leu Val Ser Val 1 5 <210> 45 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 Thr Leu Leu Ala Ala Glu Phe Leu Lys Gln Val 1 5 10 <210> 46 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Leu Thr Ala Pro Pro Glu Ala Leu Leu Met Val 1 5 10 <210> 47 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Phe Leu Asp Ser Lys Phe Tyr Leu Leu 1 5 <210> 48 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Lys Leu Cys Glu Gly Phe Asn Glu Val 1 5 <210> 49 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Lys Leu Ala Asp Gln Tyr Pro His Leu 1 5 <210> 50 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Lys Val Phe Ala Gly Ile Pro Thr Val 1 5 <210> 51 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Ala Leu Trp Ala Trp Pro Ser Glu Leu 1 5 <210> 52 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52 Thr Leu Trp Tyr Arg Ala Pro Glu Val 1 5 <210> 53 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 Ile Leu Phe Pro Asp Ile Ile Ala Arg Ala 1 5 10 <210> 54 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54 Ala Ile Ile Asp Gly Val Glu Ser Val 1 5 <210> 55 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Asn Leu Asp Thr Leu Met Thr Tyr Val 1 5 <210> 56 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56 Ser Leu Trp Gly Gly Asp Val Val Leu 1 5 <210> 57 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57 Gly Leu Trp His His Gln Thr Glu Val 1 5 <210> 58 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 58 Ser Leu Tyr Lys Gly Leu Leu Ser Val 1 5 <210> 59 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59 Leu Thr Phe Gly Asp Val Val Ala Val 1 5 <210> 60 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60 Thr Met Leu Ala Arg Leu Ala Ser Ala 1 5 <210> 61 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61 Thr Leu Thr Asn Ile Ile His Asn Leu 1 5 <210> 62 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 62 Lys Leu Val Glu Phe Asp Phe Leu Gly Ala 1 5 10 <210> 63 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 63 Lys Leu Gly Asp Phe Gly Leu Ala Thr Val Val 1 5 10 <210> 64 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 64 Gly Val Leu Glu Asn Ile Phe Gly Val 1 5 <210> 65 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 65 Asn Leu Leu Ala Glu Ile His Gly Val 1 5 <210> 66 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 66 Lys Ile Gln Glu Ile Leu Thr Gln Val 1 5 <210> 67 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 67 Ala Val Val Glu Phe Leu Thr Ser Val 1 5 <210> 68 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 68 Ile Leu Phe Glu Ile Asn Pro Lys Leu 1 5 <210> 69 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 69 Ile Leu Ile Asp Trp Leu Val Gln Val 1 5 <210> 70 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 70 Ser Leu Ala Asp Phe Met Gln Glu Val 1 5 <210> 71 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 71 Val Lys Val Asn Glu Ala Tyr Arg Phe Arg Val Ala Leu Pro Ala Tyr 1 5 10 15 Pro Ala <210> 72 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 72 Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys Asn 1 5 10 15 <210> 73 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 73 Glu Ile Gly Trp Ser Tyr Thr Gly Ala Leu Asn Gln Lys Asn 1 5 10 <210> 74 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 74 Tyr Tyr Pro Gly Val Ile Leu Gly Phe 1 5 <210> 75 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 75 Val Tyr Tyr Phe His Pro Gln Tyr Leu 1 5 <210> 76 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 76 Met Tyr Pro Tyr Ile Tyr His Val Leu 1 5 <210> 77 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 77 Tyr Tyr His Phe Ile Phe Thr Thr Leu 1 5 <210> 78 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 78 Tyr Tyr Thr Val Arg Asn Phe Thr Leu 1 5 <210> 79 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 79 Asn Tyr Thr Ser Leu Leu Val Thr Trp 1 5 <210> 80 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 80 Glu Tyr Met Lys Ala Leu Gly Val Gly Phe 1 5 10 <210> 81 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 81 Lys Tyr Asn Asp Phe Gly Asn Ser Phe 1 5 <210> 82 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 82 Leu Tyr Ile Tyr Pro Gln Ser Leu Asn Phe 1 5 10 <210> 83 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 83 Ile Phe Thr Tyr Ile His Leu Gln Leu 1 5 <210> 84 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 84 Arg Tyr Gln Glu Ser Leu Gly Asn Thr Val Phe 1 5 10 <210> 85 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 85 Lys Tyr Asn Glu Phe Ser Val Ser Leu 1 5 <210> 86 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 86 Thr Tyr Asn Tyr Ala Val Leu Lys Phe 1 5 <210> 87 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 87 Ser Tyr Phe Glu Asn Val His Gly Phe 1 5 <210> 88 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 88 Val Tyr Asp Thr Met Ile Glu Lys Phe 1 5 <210> 89 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 89 Gln Tyr Val Phe Ile His Asp Thr Leu 1 5 <210> 90 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 90 Asn Tyr Thr Ser Leu Leu Val Thr Trp 1 5 <210> 91 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 91 Ile Tyr Gly Gly His His Ala Gly Phe 1 5 <210> 92 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 92 Thr Tyr Val Asp Ser Ser His Thr Ile 1 5 <210> 93 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 93 Val Tyr Asn Leu Thr Gln Glu Phe Phe 1 5 <210> 94 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 94 Tyr Tyr Gln Ile Arg Ser Ser Gln Leu 1 5 <210> 95 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 95 Arg Tyr Ser Asp Gly Leu Leu Arg Phe 1 5 <210> 96 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 96 Gln Tyr Gln Ile Ile Met Thr Met Ile 1 5 <210> 97 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 97 Thr Tyr Ile Pro Pro Leu Leu Val Ala Phe 1 5 10 <210> 98 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 98 Glu Tyr Ile Arg Ala Leu Gln Gln Leu 1 5 <210> 99 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 99 Thr Tyr Ile Ile Lys Ser Val Gly Phe 1 5 <210> 100 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 100 Gln Trp Ala Pro Ile Leu Ala Asn Phe 1 5 <210> 101 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 101 Arg Tyr Gly Pro Gln Phe Thr Leu 1 5 <210> 102 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 102 Arg Tyr Ile Pro Leu Ile Val Asp Ile 1 5 <210> 103 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 103 Ala Tyr Val Leu Arg Leu Glu Thr Leu 1 5 <210> 104 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 104 Pro Tyr Asn His Gln His Glu Tyr Phe 1 5 <210> 105 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 105 Val Leu Pro Asp Ala Asp Thr Leu Leu His Phe 1 5 10 <210> 106 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 106 Phe Tyr Gly Pro Gln Val Asn Asn Ile 1 5 <210> 107 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 107 Lys Tyr Phe Ser Phe Pro Gly Glu Leu 1 5 <210> 108 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 108 Ala Tyr Ser Asp Gly His Phe Leu Phe 1 5 <210> 109 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 109 Arg Tyr Leu Pro Ser Ser Val Phe Leu 1 5 <210> 110 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 110 Val Tyr Leu Thr Ile Lys Pro Leu Asn Leu 1 5 10 <210> 111 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 111 Pro Tyr Leu Asp Lys Phe Phe Ala Leu 1 5 <210> 112 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 112 Val Tyr Gln Val Leu Gln Glu His Leu 1 5 <210> 113 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 113 Ala Phe Ser Pro Asp Ser His Tyr Leu Leu Phe 1 5 10 <210> 114 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 114 Asn Tyr Asn Asp Arg Tyr Asp Glu Ile 1 5 <210> 115 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 115 Lys Tyr Asn Leu Ile Asn Glu Tyr Phe 1 5 <210> 116 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 116 Asn Tyr Gln Asp Thr Ile Gly Arg Leu 1 5 <210> 117 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 117 Ala Tyr Leu Ile Asp Ile Lys Thr Ile 1 5 <210> 118 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 118 Ala Tyr Pro Arg Leu Ser Leu Ser Phe 1 5 <210> 119 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 119 Lys Phe Ala Glu Glu Phe Tyr Ser Phe 1 5 <210> 120 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 120 Tyr Tyr Leu Asp Lys Ser Val Ser Ile 1 5 <210> 121 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 121 Asn Tyr Lys Asp Leu Asn Gly Asn Val Phe 1 5 10 <210> 122 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 122 Ala Tyr Leu Lys Gly Thr Val Leu Phe 1 5 <210> 123 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 123 Asn Tyr Ile Asp Asn Val Gly Asn Leu His Phe 1 5 10 <210> 124 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 124 Pro Phe Ala Lys Pro Leu Pro Thr Phe 1 5 <210> 125 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 125 Val Tyr Leu Lys Glu Ala Asn Ala Ile 1 5 <210> 126 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 126 Lys Tyr Phe Gly Gly Val Leu Glu Tyr Phe 1 5 10 <210> 127 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 127 Lys Tyr Phe Asp Lys Val Val Thr Leu 1 5 <210> 128 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 128 Val Tyr Asn Asp Ile Gly Lys Glu Met Leu Leu 1 5 10 <210> 129 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 129 Thr Tyr Thr Ser Tyr Leu Asp Lys Phe 1 5 <210> 130 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 130 Ser Tyr Asn Pro Leu Trp Leu Arg Ile 1 5 <210> 131 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 131 His Tyr Lys Pro Thr Pro Leu Tyr Phe 1 5

Claims (33)

  1. 최대 16개의 아미노산 길이를 갖고 서열번호: 91과, 서열번호: 1 내지 27, 29 내지 49, 71 내지 90, 및 92 내지 129로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  2. 제1항에 있어서, 상기 펩티드가 인간 주조직적합 복합체 (MHC) 클래스 I 또는 클래스 II 분자에 결합하는 능력을 갖고, 상기 펩티드가 상기 MHC에 결합할 때 CD4 및/또는 CD8 T 세포를 자극할 수 있는, 펩티드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  3. 제1항에 있어서, 펩티드가 서열번호: 91, 1 내지 27, 29 내지 49, 71 내지 90, 및 92 내지 129 중 어느 하나에 따른 아미노산 서열로 구성되는, 펩티드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  4. 제1항에 있어서, 상기 펩티드가 변형되고/되거나 비-펩티드 결합을 포함하는, 펩티드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  5. HLA-DR 항원-연관 불변 쇄 (Ii)의 N-말단 아미노산에 융합되는, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 펩티드를 포함하는 융합 단백질.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 펩티드, 또는 MHC 분자에 결합된 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 펩티드를 특이적으로 인식하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  7. 제6항에 있어서, 단일클론 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 이중-특이적 항체 및/또는 키메라 항체, 또는 이의 항원-결합 단편인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  8. HLA 리간드와 반응성인 T 세포 수용체로서, 상기 리간드가 펩티드-MHC 복합체 내에 포함된 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 펩티드인, T 세포 수용체.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 펩티드; 상기 펩티드 및 HLA-DR 항원-연관 불변쇄 (Ii)의 N-말단 아미노산을 포함하는 융합 단백질; 또는 펩티드-MHC 복합체 내에 포함된 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 펩티드인 HLA 리간드와 반응성인 T 세포 수용체를 인코딩하는 핵산.
  10. 제9항에 있어서, 이종 프로모터 서열에 연계되는, 핵산.
  11. 제9항에 있어서, 핵산이 DNA, cDNA, PNA, RNA, 또는 이들의 조합인, 핵산.
  12. a) 제9항에 따른 핵산;
    b) a)에 따른 핵산으로서 이종 프로모터 서열에 연계된 핵산; 또는
    c) a)에 따른 핵산으로서 DNA, cDNA, PNA, RNA, 또는 이들의 조합인 핵산을 포함하는, 발현 벡터.
  13. a) 제9항에 따른 핵산;
    b) a)에 따른 핵산으로서 이종 프로모터 서열에 연계된 핵산;
    c) a)에 따른 핵산으로서 DNA, cDNA, PNA, RNA, 또는 이들의 조합인 핵산; 또는
    d) 상기 a) 내지 c) 중 어느 하나를 포함하는 발현 벡터를 포함하는, 숙주 세포.
  14. 제13항에 있어서, 상기 숙주 세포가 항원 제시 세포 또는 수지상 세포인, 숙주 세포.
  15. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 펩티드; 상기 펩티드 및 HLA-DR 항원-연관 불변쇄 (Ii)의 N-말단 아미노산을 포함하는 융합 단백질; 또는 펩티드-MHC 복합체 내에 포함된 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 펩티드인 HLA 리간드와 반응성인 T 세포 수용체를 생산하는 방법으로서,
    i) 상기 펩티드, 상기 융합 단백질 또는 상기 T 세포 수용체를 인코딩하는 핵산, 또는 상기 핵산을 포함하는 발현 벡터를 포함하는, 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
    ii) 상기 숙주 세포 및/또는 그의 배양 배지로부터 상기 펩티드, 상기 융합 단백질 또는 상기 T 세포 수용체를 단리하는 단계를 포함하는, 방법.
  16. 활성화된 세포독성 T 림프구 (CTL)를 생산하는 시험관 내 방법으로서,
    CTL을 적합한 항원-제시 세포 또는 항원-제시 세포를 모방하는 인공 구축물의 표면에서 발현된 항원 로딩된 인간 클래스 I 또는 II MHC 분자와 항원 특이적 방식으로 상기 CTL을 활성화시키기에 충분한 기간 동안 시험관 내에서 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 상기 항원이 하기 i) 내지 iii) 중 어느 하나의 펩티드인, 방법:
    i) 최대 16개의 아미노산 길이를 갖고 서열번호: 91과, 서열번호: 1 내지 27, 29 내지 49, 71 내지 90, 및 92 내지 129로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드;
    ii) i)에 따른 펩티드로서, MHC 클래스 I 또는 클래스 II 분자에 결합하는 능력을 갖고, MHC에 결합될 때 CD4 및/또는 CD8 T 세포를 자극할 수 있는 펩티드; 및
    iii) i)에 따른 펩티드로서, 변형되고/되거나 비-펩티드 결합을 포함하는 펩티드.
  17. 제16항에 있어서, 상기 항원이 충분한 양의 항원을 항원-제시 세포와 접촉시킴으로써 적합한 항원-제시 세포의 표면에서 발현된 클래스 I 또는 II MHC 분자 상에 로딩되는, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 항원-제시 세포가 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 펩티드를 발현할 수 있는 발현 벡터를 포함하는, 방법.
  19. 서열번호: 91과, 서열번호: 1 내지 27, 29 내지 49, 71 내지 90, 및 92 내지 129로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 세포를 선택적으로 인식하는, 제16항에 따른 방법에 의해 수득가능한, 활성화된 세포독성 T 림프구 (CTL).
  20. 제19항에 따른 활성화된 세포독성 T 림프구를 포함하는 약제.
  21. 제20항에 있어서, 보조제 (adjuvant)를 추가로 포함하는, 약제.
  22. 암을 가진 환자를 치료하기 위한 조성물로서, 환자에서 표적 암세포를 사멸하는 활성화된 세포독성 T 림프구 (CTL)의 집단을 포함하고, 상기 활성화된 CTL이 서열번호: 91과, 서열번호: 1 내지 27, 29 내지 49, 71 내지 90, 및 92 내지 129로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 세포를 선택적으로 인식하는, 제16항에 따른 방법에 의해 수득가능한 것인, 조성물.
  23. 암을 가진 환자를 치료하기 위한 조성물로서, 환자에서 표적 세포를 사멸하는 활성화된 T 림프구의 집단을 포함하고, 상기 표적 세포가 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 펩티드를 비정상적으로 발현하는 것인, 조성물.
  24. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 상기 펩티드 및 HLA-DR 항원-연관 불변쇄 (Ii)의 N-말단 아미노산을 포함하는 융합 단백질; 상기 펩티드를 특이적으로 인식하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 상기 펩티드와 반응성인 T 세포 수용체; 상기 펩티드, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 상기 T 세포 수용체를 인코딩하는 핵산; 상기 핵산을 포함하는 발현 벡터; 상기 펩티드, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 상기 핵산 또는 상기 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포; 서열번호: 91과, 서열번호: 1 내지 27, 29 내지 49, 71 내지 90, 및 92 내지 129로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 비정상적으로 발현하는 세포를 선택적으로 인식하는, 제16항에 따른 방법에 의해 수득가능한, 활성화된 세포독성 T 림프구 (CTL); 및 상기 CTL을 포함하는 약제로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 활성 성분을 포함하는, 암을 치료 또는 진단하기 위한 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 상기 조성물이 백신인, 조성물.
  26. 제24항에 있어서, 암이 성상아교세포종; 털모양 성상아교세포종; 이형성 배아성 신경상피종; 핍지신경모종; 뇌실막세포종; 다형성 교모세포종; 혼합 교모종; 핍지교성상세포종; 수모세포종; 망막모세포종; 신경모세포종; 종자세포종; 기형종; 신경절교모종; 신경절세포종; 중추 신경절세포종; 원시성 신경외배엽 종양 (PNET), 속질상피종, 신경모세포종, 망막모세포종, 또는 뇌실막모세포종; 송과체 실질의 종양, 송과체종, 또는 송과체모세포종; 뇌실막 세포 종양; 맥락 얼기 종양; 불명기원의 신경상피 종양, 대뇌 신경아교종증, 또는 성상모세포종; 교모세포종 전립선 종양; 유방암; 식도암; 결장직장암; 투명 세포 신장 세포 암종; 폐암; 중추신경계 (CNS) 암; 난소암; 흑색종; 췌장암; 편평 세포 암종; 백혈병 수모세포종; 결장 종양; 직장 종양; 위 종양; 신장 종양; 폐 종양; 췌장 종양; 전립선 종양; 피부 종양; 및 서열번호: 91과, 서열번호: 1 내지 27, 29 내지 49, 71 내지 90, 및 92 내지 129로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드의 과다-제시를 나타내는 기타 종양으로부터 선택되는, 조성물.
  27. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 상기 펩티드 및 HLA-DR 항원-연관 불변쇄 (Ii)의 N-말단 아미노산을 포함하는 융합 단백질; 상기 펩티드를 특이적으로 인식하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 상기 펩티드와 반응성인 T 세포 수용체; 상기 펩티드, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 상기 T 세포 수용체를 인코딩하는 핵산; 상기 핵산을 포함하는 발현 벡터; 상기 펩티드, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 상기 핵산 또는 상기 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포; 및 서열번호: 91과, 서열번호: 1 내지 27, 29 내지 49, 71 내지 90, 및 92 내지 129로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 비정상적으로 발현하는 세포를 선택적으로 인식하는, 제16항에 따른 방법에 의해 수득가능한, 활성화된 세포독성 T 림프구로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 활성 성분을 포함하는, 약학 조성물.
  28. 용액 또는 동결건조 형태로, 제27항에 따른 약학 조성물을 포함하는 용기를 포함하는 키트.
  29. 제28항에 있어서, 다음 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 키트:
    a) 동결건조된 제형을 위한 희석제 또는 재구성 용액을 함유하는 제2 용기,
    b) 서열번호: 1 내지 서열번호: 131로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 펩티드, 및
    c) (i) 완충제, (ii) 희석제, (iii) 필터, (iv) 주사바늘, (v) 주사기, 또는 (vi) 보조제 중 하나 이상.
  30. 다음 단계를 포함하는, 개별 환자를 위한 개인화된 (personalized) 항암 백신 또는 입양 (adoptive) 세포 치료제를 생산하기 위한 방법:
    a) 상기 개인 환자로부터의 종양 샘플에 의해 제시된 종양-연관 펩티드 (TUMAP)를 동정하는 단계;
    b) 단계 a)에서 동정된 펩티드를 상응하는 정상 조직과 비교하여 종양에서 면역원성 및 과다-제시에 대해 사전-선별된 펩티드의 창고 (warehouse)와 비교하는 단계로, 상기 창고가 서열번호: 91, 1 내지 27, 29 내지 49, 71 내지 90, 및 92 내지 129로 구성된 군으로부터 선택되는 펩티드를 포함하는 단계;
    c) 환자의 샘플에서 동정된 TUMAP와 상관관계가 있는 펩티드를 상기 창고로부터 선택하는 단계; 및
    d) 단계 c)에 기반하여 개인화된 백신 또는 입양 세포 치료제를 제조하는 단계.
  31. 제30항에 있어서, 다음 (1) 내지 (5)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 수단을 포함하는, 방법:
    (1) 상기 TUMAP가:
    (a1) 종양 샘플로부터의 발현 데이터를 종양 샘플의 조직 유형에 상응하는 정상 조직의 샘플로부터의 발현 데이터와 비교하여 종양 샘플에서 과다-발현되거나 비정상적으로 발현되는 단백질을 동정하고;
    (a2) 발현 데이터와 종양 샘플에서 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 분자에 결합된 MHC 리간드의 서열과의 상관관계를 결정하여 종양에 의해 과다-발현되거나 비정상적으로 발현된 단백질로부터 유래하는 MHC 리간드를 동정함으로써 식별됨.
    (2) MHC 리간드의 서열이, 종양 샘플로부터 단리된 MHC 분자로부터 결합된 펩티드를 용출하고 용출된 리간드의 서열을 분석함으로써 동정됨;
    (3) 종양 샘플의 조직 유형에 상응하는 정상 조직이 동일한 환자로부터 수득됨;
    (4) 창고에 포함된 펩티드가 다음에 따라 동정됨:
    a) 악성 물질로부터의 HLA 리간드를 질량 분광분석에 의해 동정함;
    b) 마이크로어레이에 의한 유전체-전체의 전령 리보헥산 (mRNA) 발현 분석을 사용하여 정상 기관과 조직들의 범위에 비해 악성 조직 (GBM)에서 과발현된 유전자들을 동정함;
    c) 동정된 HLA 리간드들을 유전자 발현 데이터와 비교함;
    d) 단계 b)에서 검출된 선택적으로 발현되거나 과발현된 유전자들에 의해 인코딩된 펩티드를 선택함;
    e) mRNA 수준에서의 과발현의 관련성을 종양 조직에 대해 단계 c)로부터 선택된 TUMAP의 재검출 및 건강한 조직에 대한 검출의 부재 또는 낮은 빈도에 의해 확인함; 및
    f) 선택된 펩티드에 의한 생체 내 T 세포 반응의 유도가 가능한지 여부를 평가하기 위해, 건강한 공여자 또는 환자로부터의 인간 T 세포를 사용하여 시험관 내 면역원성 측정을 수행함; 및
    (5) 창고에 포함된 펩티드의 면역원성이 시험관 내 면역원성 검정, 개별 HLA 결합에 대한 환자 면역모니터링, MHC 멀티머 염색, ELISPOT 검정 및/또는 세포내 사이토카인 염색을 포함하는 방법에 의해 결정됨.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 개별 환자로부터의 상응하는 정상 조직에 비해 종양 샘플에 고유한 적어도 하나의 돌연변이를 동정하는 단계, 및 백신에 포함시키기 위해 상기 돌연변이와 상관관계가 있는 펩티드를 선택하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 적어도 하나의 돌연변이가 전체 유전체 서열결정에 의해 식별되는, 방법.
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