KR20190130037A - 종양을 치료 및/또는 예방하는 약품 제조에서의 캐리마이신 및 이의 약학적으로 수용 가능한 염의 응용 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 종양 치료용 약물 제조에서의 캐리마이신 및 이의 약학적으로 수용 가능한 염의 응용을 제공한다. 상기 캐리마이신 및 이의 약학적으로 수용 가능한 염은 유방암, 간암, 폐암, 신장암, 뇌종양, 자궁경부암, 전립선암, 췌장암, 식도암, 위선암, 결장암, 림프종 또는 백혈병과 같은 다양한 종양에 비교적 좋은 치료 효과가 있으며, 특히 인체 유방암 세포 MCF-7 및 MDA-MB-231, 인체 간암 세포 HepG2, 인체 비소세포 폐암 세포 A549, 인체 대세포 폐암 세포 H460 및 H1299, 인체 신장 투명세포 선암 세포 786-O, 인체 신장 세포 선암 세포 769-P 및 인체 신경교종 세포 U251 등의 성장에 모두 뚜렷한 억제 작용을 한다.

Description

종양을 치료 및/또는 예방하는 약품 제조에서의 캐리마이신 및 이의 약학적으로 수용 가능한 염의 응용
본 발명은 약물 응용 분야에 관한 것으로, 구체적으로, 종양을 치료 및/또는 예방하는 약품 제조에서의 캐리마이신 및 이의 약학적으로 수용 가능한 염의 응용에 관한 것이다.
종양은 흔하고 자주 발생하는 질병의 일종으로, 체내와 체외의 각종 종양 형성 요인의 장기적인 영향을 받은 신체의 조직 세포에, 유전자 돌연 변이가 발생하여 정상적인 성장과 분화 조절 능력을 상실하고, 클론성 비정상적 증식 및 분화에 의해 형성된 신생물 또는 증식물이다. 종양은 양성 종양 및 악성 종양으로 분류되며, 악성 종양은 또 상피 조직에서 발생하는 암, 간엽 조직에서 발생하는 육종 및 암육종을 포함하여 총 3가지로 세분할 수 있다. 대중들이 말하는 "암"은 일반적으로 모든 악성 종양을 가리킨다.
악성 종양은 인류 건강을 위협하는 주된 악성 질환 중 하나이며, 현재 전세계 인구의 사망 원인 중 1위이다. 최근 통계 데이터에 따르면, 2007년 전세계 약 790만 명이 다양한 유형의 암으로 사망하였고, 이는 총 사망자수의 13%를 차지하며, 1,200만 건을 초과하는 종양 발병 사례가 진단되었고, 여기서 72% 이상의 종양 환자 및 사망 사례가 저개발국가에서 발생하였으며, 지속적으로 증가하는 추세를 보이고 있다. 2015년 전세계 종양 사망자가 900만 명으로 늘어났으며, 2030년에는 1,200만 명을 넘어설 것으로 예상되며; 현재, 중국의 연간 암 발병자는 약 280만 명이며, 그 중 사망자는 40만 명을 초과하여, 중국에서 질병별 사망 원인 중 1위가 되었으며, 지속적으로 증가하는 양상을 보이고 있다. 현대 사회의 생활 리듬이 빨라지고, 경쟁 스트레스가 커지며, 인류 생활 방식 및 환경이 변화함에 따라, 종양의 발병률 및 사망자수는 해마다 증가하고 있으며, 현대 사회에서 흔한 발병과 높은 발병율로, 환자의 삶의 질에 심각한 영향을 줄 뿐만 아니라, 가정과 사회에 무거운 경제적 정신적 부담을 주고 있으며, 전세계를 괴롭히는 중대한 사회적 문제가 되었는바, 암의 치료 및 예방은 전세계적으로 해결이 가장 시급한 문제 중 하나이다. 현재, 화학 약물 치료는 종양을 퇴치하는 가장 주요한 수단이며, 비교적 좋은 치료 효과가 있지만, 골수 억제 및 면역 기능 저하와 같은 부작용을 빈번히 일으켜, 환자가 치료를 지속하기 어려우며, 화학 요법 약물 치료 과정에서 나타나는 약제 내성은 오늘날 임상 치료에서의 하나의 난제이다. 최근 들어, 전세계 항종양 의약품 시장은 빠른 성장세를 보이고 있으며, 미국 FDA 통계 데이터에 따르면, 전세계 함암제 시장의 매출총액은 2004년 240억 달러에서, 2007년 396억 달러로 급증했다. 세계적으로 해마다 새로운 종류의 항종양제가 개발되고 있지만, 아직까지 암을 이겨낼 수 있는 효과적인 수단이 없으며, 새로운 암의 종류가 지속적으로 나타나고 있으며, 종양의 약제 저항성/내성이 발생되고 강화되고 있어, 새로운 종류의 효과적인 항암 약물을 발견하는 것이 특히 절실하다.
캐리마이신(Carrimycin)은 유전자변형 기술에 의해 카보마이신 생성균의 4" 이소발레릴 전이효소 유전자(4"-o-acyl-transferase)를 스피라마이신 생성균에 클론 발현하고, 스피라마이신 4"-OH를 정향 아실화하고, 4"-에 이소발레릴 측쇄를 첨가하여 형성한 4"-이소발레릴 스피라마이신을 주요 조성 성분으로 하는 신형 항생제이다.
캐리마이신은 다양한 스피라마이신 파생물로 조성되며, 주요 활성 성분인 이소발레릴 스피라마이신(I+II+III)의 총함량은 60% 이상이며, 약학적으로 수용 가능한 약학 조성물이다. 중심 구조는 16 원자 락톤 고리이며, 1개의 포로사민(Forosamine) 분자, 1개의 미카미노즈(mycaminose) 분자 및 1개의 미카로즈(Mycarose) 분자와 연결되며, 주요 성분인 이소발레릴 스피라마이신I, II, III의 구조와 스피라마이신 구조의 차이점은 미카로즈 4"-에 연결된 라디칼은 하이드록실이 아닌 이소발레릴인 것에 있다. 상기 약품은 쉔양 통리엔 등이 공동으로 1.1종 신약으로 등록했다.
캐리마이신의 주성분 화학 구조는 다음 식(I)과 같다:
Figure pct00001
식(I)
여기서, R=H, R=COCH2CH(CH3)2일 경우, 이소발레릴 스피라마이신I이고;
R=COCH3, R'=COCH2CH(CH3)2일 경우, 이소발레릴 스피라마이신II이며;
R=COCH2CH3, R'=COCH2CH(CH3)2일 경우, 이소발레릴 스피라마이신III이며;
캐리마이신은 16 원자 마크로라이드계 항생제이며, 자유라디칼인 카르복실기, 알콕시기, 에폭시기, 케톤기, 알데하이드기 및 한쌍의 공액 C=C를 가지며, 분자량은 약 884~982이다. 유사한 화학 구조로 인해, 캐리마이신은 마크로라이드계 항생제와 많은 공통점을 가지며, 에스테르, 아세톤, 클로로포름, 알코올 등과 같은 다수의 유기 용제에 쉽게 용해되고, 석유 에테르에 약간 용해되며, 물에 용해되기 어렵고; 분자 구조에는 2개의 디메틸아민기를 함유하고 있어 약 알칼리성이며, 산성 수용액에 잘 용해되며; 온도가 상승함에 따라 용해도는 감소하는 "음의 용해도" 특성을 가진다. 캐리마이신의 주성분인 이소발레릴 스피라마이신 4"- 탄소 사슬은 비교적 길기 때문에, 친수성이 떨어지고, 이의 수중 용해도는 스피라마이신 및 4" - 아세틸 스피라마이신보다 낮다.
캐리마이신은 백색의 비결정 분말이며, 약간의 흡습성을 지니며, 비선광도는 약 -80.8°이고, 자외선의 최대 흡수 파장은 231~232nm이며, 자체적으로 약간의 형광 발색 라디칼을 가지고 있기 때문에, 진한 황산 또는 염산과 만나면 자색을 보이는 반응이 일어나고, 강한 자색 형광이 나타나며, 231~232nm 지점에서 최대 흡광도를 가진다.
이 약품은 친지성이 좋고, 조직 삼투력이 강하며, 내복 흡수력이 빠르고, 체내에서 유지되는 시간이 길며, 지속적인 항생제 지발효과가 있다. 약효와 화학 배위의 관계에 따르면, 마크로라이드계 항생제 4"-는 아실화된 다음, 이의 친지성 및 체내 활성은 향상되고, 체내 항균 활성과 임상 치료 효과 모두 현저하게 향상되었으며, 체내에서 항생제의 안정성이 4"- 하이드록시 에스테르의 탄소 사슬 증가에 따가 강화되며, 즉 이소발레릴 스피라마이신 ＞ 부티릴 스피라마이신 ＞ 프로피오닐 스피라마이신 ＞ 아세틸 스피라마이신이다.
초보적인 체내 체외 테스트 결과에 따르면, 이 약품은 다수의 G+균에 대해 비교적 좋은 항균 활성을 보일 뿐만 아니라, 일부 G-균에도 일정한 작용을 하며, 각 항 기술적 스펙이 아지트로마이신, 에리트로마이신, 아세틸 스피라마이신 및 메디마이신보다 현저하게 우수하며, 특히 폐렴 마이코프라즈마에 대한 항균 활성이 제일 강하며, 에리트로마이신 약제에 내성이 있는 균, 네이세리아 고노로이애, 폐렴구균, 황색포토상구균, 녹농균, 인플루엔자 바실러스, 헤모필루스 인플루엔자, 박테로이데스 프라길리스, 레지오넬라, 박테로이데스 테타이오타오미크론 및 클로스트리디움 퍼프린젠스에 대해서도 일정한 항균 활성을 가지며, 임상적으로 에리트로마이신에 내성을 가지는 황색포도상구균에 대해서만 극히 적은 교차내성이 있다. 캐리마이신은 주로 그람양성균의 감염성 질병 치료, 특히 기관지 감염 치료에 적용될 것이며, 비뇨기 계통의 감염 등에 사용될 수도 있다.
본 출원인은 최근의 한 연구를 통해, 인체 유방암 세포 MCF-7 및 MDA-MB-231, 인체 간암 세포 HepG2 또는 쥐 간암 세포 H22, 인체 비소세포 폐암 세포 A549, Lewis 폐암 세포, 인체 대세포 폐암 세포 H460 및 H1299, 인체 신장 투명세포 선암 세포 786-O, 인체 신장 선암 세포 769-P, 인체 신경교종 세포 U251, 인체 교모세포종 세포 A172, 인체 조직 림프종 세포 U937, 인체 자궁경부암 세포 HeLa, 인체 전립선암 세포 PC3, 인체 췌장암 세포 PANC-1, 인체 식도암 세포 TE-1, 인체 위선암 세포 SGC7901, 인체 결장암 세포 HT-29, 인체 전골수성 백혈병 세포 HL-60의 캐리마이신에 대한 체외 항증식 활성 평가에서 샘플이 시험된 세포에 대해 모두 양호한 항증식 활성을 나타낸 것을 발견하였으며, 이는 캐리마이신이 종양을 치료하는 새로운 약품이 될 가능성을 시사하며, 따라서 본 발명을 완성했다.
본 발명의 목적은 종양을 치료 및/또는 예방하는 약품 제조에서의 캐리마이신 및 이의 약학적으로 수용 가능한 염의 응용을 제공하는 것에 있다.
상술한 목적을 실현하기 위해, 본 발명은 다음과 같은 기술적 방안을 채용한다:
본 발명은 종양을 치료 및/또는 예방하는 약품 제조에서의 캐리마이신 및 이의 약학적으로 수용 가능한 염의 응용에 관한 것이다.
본 발명에서, 상기 종양은 고형 종양 및 비고형 종양을 포함한다.
구체적으로, 상기 고형 종양은 양성 고형 종양 및 악성 고형 종양을 포함하며;
상기 비고형 종양은 림프종양 또는 백혈병이다.
나아가, 상기 악성 고형 종양은 유방암, 간암, 신장암, 뇌종양, 자궁경부암, 전립선암, 췌장암, 식도암, 위암, 결장암이다.
상기 뇌종양은 신경교종 또는 수막종이며, 상기 위암은 위선암이다.
본 발명에서, 상기 약품은 캐리마이신 및 이의 약학적으로 수용 가능한 염과 약학적으로 수용 가능한 보조재료로 제조된 각종 제형일 수 있다.
본 발명에서, 상기 약품은 캐리마이신 및 이의 약학적으로 수용 가능한 염, 항 종양제, 그리고 약학적으로 수용 가능한 보조재료로 제조된 각종 제형일 수도 있다.
본 발명에서, 캐리마이신 및 이의 약학적으로 수용 가능한 염은 옥살리플라틴 등 종래 기술에서의 항종양제와 함께 약학적으로 수용 가능한 보조재료와 조합하여 다양한 화합물 제제로 제조될 수 있다.
본 발명에서, 상기 약품은 캐리마이신 및 이의 약학적으로 수용 가능한 염을 포함하는 제1 약제와 항종양제를 포함하는 제2 약제의 조합일 수 있다.
본 발명에서, 상기 항종양제는 종래 기술의 공지된 항종양제이며, 종양을 치료할 때, 캐리마이신 및 이의 약학적으로 수용 가능한 염을 포함하는 제1 약제와 이와 같은 항종양제를 결합하여 사용할 수 있다. 복합적으로 종양을 치료할 경우, 캐리마이신 및 이의 약학적으로 수용 가능한 염을 포함하는 제1 약제를 우선 사용할 수 있고, 종래 기술의 공지된 항종양제를 포함하는 제2 약제를 우선 사용할 수도 있으며, 양자를 동시에 사용할 수도 있다.
본 발명에서, 상기 항종양제는 화학 요법, 방사선 요법, 표적 치료 및/또는 면역 치료 약품이다.
본 발명은, 캐리마이신 및 이의 약학적으로 수용 가능한 염을 포함하는 제1 약제는 폐암, 간암, 자궁경부암 등 다양한 암에 대해 우수한 치료 효과를 가지며, 캐리마이신 및 이의 약학적으로 수용 가능한 염을 포함하는 제1 약제에 시클로포스파미드, 클로람부실, 니트로카파네, 로무스틴, 티오테파, 부슬판, 시스플라틴과 같은 종래 기술의 공지된 항종양제를 결합하여 사용할 수 있으며, 시너지 효과를 일으켜, 종양 환자에게 더 좋은 치료 효과가 있다.
악성 종양 환자는 방사선, 화학 요법, 수술, 면역 제제의 반복적인 치료로 인해, 다양한 침습적인 시술과 항종양제 등의 복합적인 공격을 받기 때문에, 신체 면역력이 전체적으로 저하되어, 병원에서 감염 위험성이 높은 그룹이며, 여러 가지 감염으로 이어지기 쉽다. 분석 결과, 종양 환자의 병원 내 감염 발생률은 같은 기간 동안 병원에서 퇴원한 환자보다 훨씬 높았으며, 종양 환자의 병원 내 감염을 일으키는 위험 요인은 주로 고령, 장기 입원, 침습 시술, 방사선 치료 및 화학 요법 등이 있으며, 여기서 방사선 치료 및 화학 요법은 종양 환자의 면역력이 손상되는 중요한 특수 요인이다. 노인 환자는 신체의 조직 기관에 퇴행성 변화가 나타나고, 신체의 면역 방어 기능이 저하되며, 저항력이 떨어지고, 여러 가지 기초적인 질병을 지니고 있기 때문에, 병원 감염이 쉽게 발생한다. 입원 기간과 병원 감염에는 인과관계가 존재하며, 입원 기간이 길어질수록, 감염 가능성도 높아진다.
모든 감염 중에서, 합병성 호흡기 감염이 가장 많고, 다음으로 피부 감염이 많으며, 위장관 감염, 비뇨기 감염, 혈행 감염은 비교적 적지만, 위험성이 더 높고, 사망률이 높다. 종양 발생 부위와 감염률에는 다음과 같은 관계가 있다: 폐, 위, 혈액 종양은 발병률이 높지만 감염률은 20% 정도로 높은 편이 아니며, 췌장, 식도, 간담, 이비인후 등 유형의 종양은 감염 환자가 적지만, 감염률이 40% 이상으로, 비교적 높다. 유방암, 갑상선 등의 감염률은 모두 10% 좌우이며, 비뇨기계 종양은 감염률이 5% 정도로, 가장 낮은 감염률을 보인다.
감염된 병원균은 주로 그람음성균(45~55% 좌우) 감염 및 진균(30% 이상) 감염이며(인후 면봉 및 객담 표본 등을 주요 표본으로 한 결과), 그람음성균에는 주로 장내 대장균, 크레브시엘라 폐렴, 녹농균 및 아시네토박터 바우마니균이 있다. 일부 병원에서는 진균 감염이 가장 많았으며, 이는 악성 종양 자체가 소모성 질병이고, 방사선 치료와 화학 요법 및 침습적인 시술이 골수의 조혈 기능을 억제하고, 신체의 단핵구 식세포 시스템의 방어 능력을 저하시키고 신체의 면역 장벽을 손상시켰기 때문일 수 있다. 또한, 광범위 항생제 및 면역 억제제를 다량으로 사용하면, 인체의 단백질 대사에 영향을 줄 수 있으며, 심지어 간, 신장 및 골수 등 조직 기능에 손상을 줄 수 있으며, 진균이 숙주의 방어를 피하거나 방해하는데 가능성을 제공하며, 이는 악성 종양 환자에게서 진균과 같은 감염이 발생하는 중요한 원인이다.
본 발명의 캐리마이신은 우수한 항감염 효과가 있으며, 환자의 감염을 퇴치하고, 신체 면역 기능의 회복에 도움을 주어, 이 제품을 항종양제와 결합하여 사용할 때 더 좋은 치료 효과를 얻도록 한다.
본 발명에서, 캐리마이신 및 이의 약학적으로 수용 가능한 염을 포함하는 제1 약제는 캐리마이신과 약학적으로 수용 가능한 보조재료로 제조된 약학적으로 수용 가능한 정제, 캡슐, 장용 제제, 주사제 등과 같은 제형이다.
사용된 보조재료 및 각 제형의 제조 방법은 종래 기술을 참조할 수 있다.
나아가, 상기 약품의 용량은 5~1500mg이고; 바람직하게는 50~1000mg이며; 더 바람직하게는 100~400mg이다.
또는, 상기 제1 약제의 용량은 5~1500mg이고; 바람직하게는 50~1000mg이며; 더 바람직하게는 100~400mg이다.
본 발명은 테스트를 통해 캐리마이신 및 이의 약학적으로 수용 가능한 염은 인체 유방암 세포 MCF-7 및 MDA-MB-231, 인체 간암 세포 HepG2 또는 쥐 간암 세포 H22, 인체 비소세포 폐암 세포 A549, 인체 대세포 폐암 세포 H460 및 H1299, 인체 신장 투명세포 선암 세포 786-O, 인체 신장 선암 세포 769-P, 인체 신경교종 세포 U251, 인체 교모세포종 세포 A172, 인체 조직 림프종 세포 U937, 인체 자궁경부암 세포 HeLa, 인체 전립선암 세포 PC3, 인체 췌장암 세포 PANC-1, 인체 식도암 세포 TE-1, 인체 위선암 세포 SGC7901, 인체 결장암 세포 HT-29, 인체 전골수성 백혈병 세포 HL-60 모두에 대해 양호한 항증식 활성을 나타낸 것을 발견하였으며, 따라서 상기 세포로 인한 종양 또는 암 질병의 치료에 캐리마이신을 이용할 수 있음을 증명했다.
본 발명은 나아가 체내 약효 시험을 통해 캐리마이신 및 이의 약학적으로 수용 가능한 염은 인체 유방암 세포 MCF-7 및 MDA-MB-231, 인체 간암 세포 HepG2 또는 쥐 간암 세포 H22, 인체 비소세포 폐암 세포 A549, 인체 대세포 폐암 세포 H460 및 H1299, 인체 신장 투명세포 선암 세포 786-O, 인체 신장 선암 세포 769-P, 인체 신경교종 세포 U251, 인체 교모세포종 세포 A172, 인체 조직 림프종 세포 U937, 인체 자궁경부암 세포 HeLa, 인체 전립선암 세포 PC3, 인체 췌장암 세포 PANC-1, 인체 식도암 세포 TE-1, 인체 위선암 세포 SGC7901, 인체 결장암 세포 HT-29, 인체 전골수성 백혈병 세포 HL-60 모두에 대해 억제 작용이 있음을 증명했다.
또한, 다양한 종양 또는 암을 가진 복수의 환자가 복용해본 바에 의하면, 캐리마이신 및 이의 약학적으로 수용 가능한 염은 폐암, 자궁경부암, 자궁암과 같은 다양한 종양 또는 암에 대해 비교적 우수한 치료 효과를 가진다.
본 발명에서, 상기 약품은 본 분야의 통상적인 방법에 의해 약학적으로 수용 가능한 정제, 캡슐 등 각종 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명에서, 상기 캐리마이신은 다양한 스피라마이신 파생물로 조성되며, 주요 활성 성분은 이소발레릴 스피라마이신I, II 및 III이며, 이의 이소발레릴 스피라마이신(I+II+III)은 60% 이상이어야 한다.
나아가, 본 발명의 캐리마이신에서, 이소발레릴 스피라마이신III은 30% 이상이어야 하고;
더 나아가 본 발명의 캐리마이신에서 아실화 스피라마이신의 총 함량은 80% 이상이어야 하며,
더 나아가, 기타 미지 성분의 총함량은 5.0% 이하여야 한다.
또한 나아가, 본 발명의 캐리마이신에서 스피라마이신III의 양은 1.0% 이하여야 한다.
캐리마이신의 전형적인 크로마토그래피는, 이소발레릴 스피라마이신I, II, III 이외에도 (이소)부티르 스피라마이신II 및/또는 (이소)부티르 스피라마이신III 최고점을 더 포함한다.
바람직하게 캐리마이신의 전형적인 크로마토그래피는 스피라마이신III, 아세틸 스피라마이신II, 아세틸 스피라마이신III, 프로피오닐 스피라마이신II, 프로피오닐 스피라마이신III, (이소)부티르 스피라마이신II, (이소)부티르 스피라마이신III 최고점 중의 1종 이상을 포함한다.
본 발명은 캐리마이신 및 이의 약학적으로 수용 가능한 염에 비교적 좋은 항종양 효과가 있고, 특히 유방암, 간암, 폐암, 신장 투명세포 선암, 신장선암, 뇌종양, 자궁경부암, 전립선암, 췌장암, 식도암, 위선암, 결장암, 림프종 또는 백혈병과 같은 다양한 종양에 비교적 좋은 치료 효과가 있음을 증명하였으며, 항종양 약품 제조에서의 캐리마이신 및 이의 약학적으로 수용 가능한 염의 응용 및 그 임상시험과 대중화에 이론적 근거를 제공했을 뿐만 아니라, 중요한 경제적 이익 효익 및 사회적 효익을 가져온다.
도 1은 인체 비소세포 폐암 누드 마우스 모델에 대한 캐리마이신의 억제 작용에 관한 체내 시험에서의 각 투여군의 종양 이미지이다.
본 발명 실시예의 목적, 기술방안 및 장점을 더 명확하게 설명하기 위해, 이하에서 본 발명의 실시예와 결합하여, 실시예의 기술방안을 명확하고 완정하게 설명하며, 이하 실시예는 본 발명을 설명할 뿐, 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
이하 실시예에서, 사용된 캐리마이신은 다양한 스피라마이신 파생물로 조성되며, 주요 활성 성분은 이소발레릴 스피라마이신I, II, III이며, 이의 이소발레릴 스피라마이신(I+II+III)은 60% 이상이어야 한다.
나아가, 본 발명의 캐리마이신에서, 이소발레릴 스피라마이신III은 30% 이상이어야 하고;
더 나아가 본 발명의 캐리마이신에서 아실화 스피라마이신의 총함량은 80% 이상이어야 하며,
더 나아가, 기타 미지 성분의 총함량은 5.0% 이하여야 한다.
또한 나아가, 본 발명의 캐리마이신에서 스피라마이신III의 양은 1.0% 이하여야 한다.
캐리마이신의 전형적인 크로마토그래피는, 이소발레릴 스피라마이신I, II, III 이외에도, (이소)부티르 스피라마이신II 및/또는 (이소)부티르 스피라마이신III 최고점을 포함한다.
바람직하게 캐리마이신의 전형적인 크로마토그래피는 스피라마이신III, 아세틸 스피라마이신II, 아세틸 스피라마이신III, 프로피오닐 스피라마이신II, 프로피오닐 스피라마이신III, (이소)부티르 스피라마이신II, (이소)부티르 스피라마이신III 최고점 중의 1종 이상을 더 포함한다.
서로 다른 배치의 캐리마이신에 대해 하기 테스트를 진행하였으며, 얻은 결과는 유사하다.
실시예 1. 캐리마이신 정제
규격: 200mg/350mg
정제 핵의 처방:
캐리마이신 200g
아비셀 110g
카르복시메틸스타치나트륨 22g
포비돈 K30(5%) 15g
스테아린산마그네슘 3g
제조 1,000알
코팅액 처방:
오파드라이II 21g
증류수 적당량
제조 105ml
제조공정:
정제 핵의 제조: 주재료와 보조재료를 각각 눈이 100개인 체로 치고, 처방량의 캐리마이신 및 아비셀과 1/2 처방량의 카르복시 메틸 스타치나트륨을 골고루 섞은 다음, 5% 포비돈 K30수용액을 첨가하여 연제를 만들고, 눈이 18개인 체로 알을 만들며, 젖은 입자를 60℃ 통풍 조건 하에서 2h 건조하며; 건조한 다음 눈이 18개인 체로 알을 정리하고, 1/2 처방량의 카르복시 메틸 스타치나트륨과 스테아린산 마그네슘을 골고루 섞어 넣고, 직경 11mm의 얕은 오목형 다이로 정제함으로써, 정제 중량 350mg, 경도 6.5kg의 정제 코어를 얻는다.
코팅액의 제조: 필요한 오파드라이II(백색)의 무게를 단 다음, 필요한 양의 물을 여러 차례 나누어 배액 용기에 붓고, 전부 부은 다음, 교반 속도를 늦추어, 소용돌이가 사라지도록, 계속하여 30min 동안 교반하면 된다.
필름 코팅의 제조: 정제 코어를 코팅 솥에 넣고, 코팅 조건을 확인한 다음, 메인 설비 속도 20r/min, 입풍 온도 40℃, 송풍 온도 30℃, 분사 압력 0.02Mpa, 분사 유량 1ml/min로 코팅하고, 안정된 다음 지속적으로 1.5h 동안 분사 코팅하며, 정제 표면이 매끄럽고, 색갈이 균일하며, 필름 코팅 검수 기준에 부합되면 합격이다. 코팅 후 무게는 5% 정도 증가한다.
실시예 2. 캐리마이신 정제(10,000알로 계산함)
처방:
캐리마이신 원분 1,000g
저치환도 하이드록시프로필셀룰로오스(5%) 92.5g
카르복시메틸스타치나트륨(3%) 55.5g
스테아린산마그네슘(1%) 18.5g
전분 총 중량 - 기타 원료와 보조재료
총 중량 1,850g
제조공정: 적당한 량의 전분을 취하여, 농도 15%로 희석한 후에, 크림처럼 될 때까지 가열하여, 접착제를 만들고; 주재료 캐리마이신, 보조재료 전분, 저치환도 하이드록시프로필셀룰로오스, 카르복시 메틸 스타치나트륨, 스테아린산 마그네슘을 각각 눈이 100개인 체로 친다. 처방량에 따라, 필요한 만큼 주재료와 보조재료를 취하고; 캐리마이신, 전분, 저치환도 하이드록시프로필셀룰로오스를 충분히 골고루 섞은 후, 농도 15%로 희석한 전분 크림에 넣고 연제를 만들며, 눈이 14개인 체로 치고 알을 만들고, 50~60℃ 온도에서 건조하고, 수분은 3~5%로 제한해야 하며, 눈이 14개인 체로 침으로써 알을 정리하고, 카르복시 메틸 스타치나트륨과 스테아린산 마그네슘을 혼합하여, 입자의 함량을 측정하며; 입자의 함량에 따라, 정제의 무게를 측정하며, 정제를 프레스하여(Φ9mm 얕은 오목형 펀치), 정제 중량 차이를 검사하고; 검사 합격한 후 포장한다.
실시예 3. 캐리마이신 캡슐(10,000알로 계산함)
처방:
캐리마이신 원분 1,000g
전분(약용) 1,080 - 캐리마이신 원분 중량
약용 3호 캡슐 1,000알
액체 파라핀 50ml
제조공정: 공정 처방에 따라 주재료 캐리마이신과 보조재료 약용 전분의 무게를 각각 단 다음, 혼합기에 넣어 1.5~2시간을 충분히 혼합하고; 표본을 추출하여 측정한 함량의 수치는 이론수치와 기본적으로 일치해야 하며(캡슐 하나의 내용량은 약 0.105g), 자동 캡슐기기 작동 요구에 따라 검증 합격한 약용 3호 캡슐 및 혼합된 포장을 기다리고 있는 원료를, 각각 포장용 기계에 넣어 충전하며, 충전된 캡슐에 대해 차이를 검증하며(±10%이내，＜0.3g), 용해율은 요구에 부합되어야 하며, 검증 후 요구에 부합되는 캡슐을 폴리싱 머신에 넣고 액체 파라핀을 첨가하여 15~20분간 폴리싱한 다음, 꺼내어 완성품 포장 용기 점검을 진행한다.
실시예 4. 캐리마이신 드라이 시럽(10,000 팩으로 계산함)
처방:
캐리마이신 원분 1,250g
구연산(0.5%) 15g
사카로즈 총 중량 - 기타 원료와 보조재료
총 중량 500g
색소(쿠르쿠민) 약 1g
제조공정: 고속 제트 분쇄기로 캐리마이신 원분, 구연산, 사카로즈를 각각 분쇄하여 알갱이로 만들고, 그 중에 85%는 눈이 300개인 체로 치고, 나머지 15%는 눈이 180개인 체로 치며, 분쇄된 가루를 처방에 따라 무게를 단 후 1~1.5시간 동안 충분히 혼합하여, 그 함량을 측정하고, 팩당 함량을 계산하며(이론적인 팩당 함량은 500mg), 혼합물을 비닐 포장용 기계에 넣고, 알루미늄 박지를 넣은 후, 분리기 제어 요구에 따라 나누어 담되, 팩당 함량 차이는 ±5% 이내로 제한해야 하고, 패킹하고 테스트에 합격하면 겉포장을 한다.
실시예 5. 캐리마이신 과립제(10,000팩으로 계산함)
처방:
캐리마이신 원분 1,250g
슈가파우더 20,000g
덱스트린 9,000g
5%PVP-K30 적당량
제조공정: 캐리마이신, 슈가파우더와 덱스트린을 눈이 120개인 체로 치고, 처방량에 따라 캐리마이신, 슈가파우더와 덱스트린 무게를 단 다음 균일하게 혼합하며, 균일하게 혼합한 상기 재료를 5%PVP-K30의 점액을 이용하여 연제를 만들고, 진동 과립기로 과립을 만들고, 70℃의 온도에서 건조하고, 과립을 정리하여, 테스트에 합격한 후에 분리하여 포장한다.
실시예 6. 캐리마이신 동결건조 주사용 분말
캐리마이신 500mg을 무게를 달아 몰 량이 동일한 아디프산과 균일하게 혼합하여 5ml의 정제수에 용해하여, 담황색 투명액체를 얻되, pH는 4.6~5.6 이어야 한다. 이어서 동결건조 프롭프엔트로 40mg의 마니톨을 넣고, 저온에서 쾌속으로 9h 냉동 후, 동결건조하여, 담황색의 푸석한 덩어리를 얻을 수 있으며, 사용 전에 10ml의 무균수를 사용하여 용해한다.
시험예 1. 항종양 활성에 대한 생물 측정
측정의 목정은 측정된 샘플의 체외 세포 증식에 대한 억제 작용 또는 세포 독성 활성을 평가하는 것이다.
세포주:
인체 유방암 세포 MCF-7 및 MDA-MB-231, 인체 간암 세포 HepG2, 인체 비소세포 폐암 세포 A549, 인체 대세포 폐암 세포 H460 및 H1299, 인체 신장 투명세포 선암 세포 786-O, 인체 신장 선암 세포 769-P, 인체 신경교종 세포 U251, 인체 교모세포종 세포 A172, 인체 조직 림프종 세포 U937, 인체 자궁경부암 세포 HeLa, 인체 전립선암 세포 PC3, 인체 췌장암 세포 PANC-1, 인체 식도암 세포 TE-1, 인체 위선암 세포 SGC7901, 인체 결장암 세포 HT-29, 인체 전골수성 백혈병 세포 HL-60.
시약제:
RPMI 1640 배양액, MEM 배양액, DMEM 저당 배양액, 송아지 태아 혈청은 미국 Gibco사에서 구매하였고, 트립신, 글루타민, 페니실린, 스트렙토 마이신, 디메틸 술폭 시드(DMSO), 메틸 티아졸 테트라졸리움(MTT)은 미국 Sigma사에서 구매하였다.
측정 기구:
이산화탄소 인큐베이터(Sanyo, Japan), 효소 결합 면역 측정기(Tecan, Austria), 96 웰 배양 플레이트(Corning, USA), 도립 현미경(Motic, China).
동작 단계는 다음과 같다:
부착세포:
MCF-7, MDA-MB-231, HepG2, A549, H460, H1299, 786-O, 769-P, U251, A172, HeLa, PC3, PANC-1, TE-1, SGC7901, HT-29는 부착세포이며, 로그 생장기의 종양 부착 세포를 선택하여, 판크레아틴으로 소화한 다음, 10% 송아지 태아 혈청을 포함하는 배양액을 사용하여 4~5Х104/ml의 세포 현탁액을 제조하고, 96 웰 배양 플레이트에 접종하여, 웰당 100μL씩, 37℃, 5％CO2에서 24h 배양한다. 실험군은 상이한 농도의 테스트 대상 샘플을 포함하는 캐리마이신 배양액으로 교체하고, 대조군은 동일 부피의 용매를 포함하는 배양액으로 교체하여, 각 그룹은 3개의 평행 홀을 구비하고, 37℃, 5％CO2에서 48h 배양한다. 상청액을 버리고, PBS를 사용하여 조심스럽게 3번 세척하고, 0.5mg/ml MTT를 함유하는 새로 제조된 배양액 100μL를 각 웰에 첨가하고, 37℃에서 계속하여 4h 배양한다. 상청액을 조심스럽게 버리고, DMSO 150μL를 첨가하고, 마이크로 발진기로 10min 동안 골고루 혼합한 다음, 효소 면역 측정기를 사용하여 492nm에서 광학밀도를 측정한다.
부유세포:
U937, HL-60은 부유 세포이며, 로그 생장기의 세포를 사용하여, 10% 송아지 태아 혈청을 포함하는 RPMI l640 배양액으로 2Х105/ml의 세포 현탁액을 제조하고, 96 웰 배양 플레이트에 접종하여, 웰당 50μL, 37℃, 5％CO2로 24h 배양한다. 실험군에 상이한 농도의 테스트 대상 샘플을 포함하는 캐리마이신 배양액 50μL를 첨가하고, 대조군에는 동일 부피의 용매를 포함하는 배양액을 첨가하며, 각 그룹은 3개의 평행 홀을 구비하고, 37℃, 5％CO2에서 48h 배양하며, 5mg/ml MTT를 함유하는 새로 제조된 배양액 10μL를 각 웰에 첨가하고, 37℃에서 계속하여 4h 배양한다. 삼중용액(SDS 10g, 10M HCl 0.1mL, 이소부틸알콜 5mL를 증류수로 100mL까지 희석함) 100μL를 사용하여 결정을 용해하고, 37℃에서 12h 부화한다. 효소 면역 측정기를 사용하여 492nm에서 광학밀도를 측정한다.
결과 평가:
종양 세포에 대한 약품의 억제율은 하기 식에 따라 계산한다:
종양 세포 성장 억제율(%) = [A492(음성대조군) - A492(투여군)] / A492(음성대조군) Х 100%
이에 근거하여 샘플의 반억제농도(IC50)를 얻는다.
결과:
인체 유방암 세포 MCF-7 및 MDA-MB-231, 인체 간암 세포 HepG2, 인체 비소세포 폐암 세포 A549, 인체 대세포 폐암 세포 H460 및 H1299, 인체 신장 투명세포 선암 세포 786-O, 인체 신장 선암 세포 769-P, 인체 신경교종 세포 U251, 인체 교모세포종 세포 A172, 인체 조직 림프종 세포 U937, 인체 자궁경부암 세포 HeLa, 인체 전립선암 세포 PC3, 인체 췌장암 세포 PANC-1, 인체 식도암 세포 TE-1, 인체 위선암 세포 SGC7901, 인체 결장암 세포 HT-29, 인체 전골수성 백혈병 세포 HL-60.
샘플에 대해 진행한 체외 항증식 활성 평가 결과는 표 1과 같다:
Figure pct00002
결과에 따르면, 샘플은 테스트된 모든 세포에 양호한 항증식 활성을 보인다.
시험예 2. 체내 시험
I. 인체 비소세포 폐암 누드 마우스 모델에 대한 캐리마이신의 억제 작용
마우스 고형 종양 모델의 구축
로그 생장기 A549 세포를 취하고, 트리판 블루 색소 배제 시험 생존 세포가 > 95%이며, 판크레아틴으로 소화한 다음, 원심 분리하고, 상청액을 버리고, matrigel을 사용하여 세포 농도를 1Х107/ml로 조절하며, 누드 마우스의 오른쪽 겨드랑이 피하에 마리당 0.2ml씩 세포를 접종하고, 접종 1일차로 기재한다. 종양이 ≥100mm3까지 성장한 다음, 동물을 그룹 당 6마리씩, 무작위로 5개 그룹으로 나누고: 캐리마이신은 12.5, 25 및 50mg/kg 3개 용량군으로 나눈다. 각 그룹의 동물에게 30일간 지속적으로 위관 투여하며, 투여 부피는 20mg/kg이다. 약을 끊은 이튿날 마우스를 희생하고, 지표를 측정한다. 투약 개시로부터 누드 마우스의 희생 시점까지, 3일마다 종양의 장경, 단경 및 체중을 기록한다.
종양 부피 및 상대 종양 증식률의 계산
3일마다 누드 마우스의 체중 및 이식 종양의 장경(a) 및 단경(b)를 측정하고, 하기 식에 따라 종양 부피(v), 상대 종양 부피(RTV), 상대 종양 증식률(T/C)을 계산하며, 여기서 V = a Х b2 / 2; RTV = V / V0이고(V0은 투약 이전의 종양 부피이고, V는 희생 이전의 종양 부피임), T/C(%) = 치료군 RTV / 모델 대조군 RTV × 100%이다.
종양 성장 억제율의 계산
마우스의 무게를 확인한 후 희생시키고, 종양을 완전한 상태로 적출하며, 혈액 얼룩 및 지방 등 비 종양 조직을 제거하고 종양 무게를 확인한 다음, 종양 성장 억제율을 계산한다. 각 그룹 마우스의 평균 종양 무게를 약효의 지표로 사용한다. 종양 성장 억제율(%) = (1 - 치료군 평균 종양 무게 / 모델군 평균 종양 무게) Х 100%.
테스트 결과는, 대조군에 비해, 각 투여군은 종양 성장 억제율, 종양 부피, 상대 종양 부피 및 상대 종양 증식률에 대해 모두 일정한 억제 작용이 있음으로 나타났다(도 1, 표 2, 표 3).
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 종양 성장 억제율은 각각 54.46%, 66.07% 및 75.89%이다.
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 종양 부피 및 상대 종양 부피는 모델군보다 현저히 낮다(P<0.05).
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 상대 종양 증식률은 각각 54.55%, 45.57% 및 29.21%이다.
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 동물 체중은 모델군에 비해 뚜렷한 변화가 없다.
Figure pct00003
Figure pct00004
* p<0.05 모델군 대비; ** p<0.01 모델군 대비, *** p<0.001 모델군 대비
II. 인체 유방암 누드 마우스 모델에 대한 캐리마이신의 억제 작용
마우스 고형 종양 모델의 구축
로그 생장기 MCF-7 세포를 취하고, 트리판 블루 색소 배제 시험 생존 세포가 > 95%이며, 판크레아틴으로 소화한 다음, 원심 분리하고, 상청액을 버리고, matrigel을 사용하여 세포 농도를 1Х107/ml로 조절하며, 누드 마우스의 오른쪽 겨드랑이 피하에 마리당 0.2ml씩 세포를 접종하고, 접종 1일차로 기재한다. 종양이 ≥ 100mm3까지 성장한 다음, 동물을 그룹 당 6마리씩 5개 그룹: 모델군, 시클로포스파미드군, 캐리마이신 12.5, 25 및 50mg/kg 3개 용량군에 무작위로 나눈다. 각 그룹의 동물에게 30일간 지속적으로 20mg/kg의 부피로 위관 투여한다. 약을 끊은 이튿날 마우스를 희생시켜, 지표를 측정한다. 투약 개시로부터 누드 마우스의 희생 시점까지, 3일마다 종양의 장경, 단경 및 체중을 기록한다.
종양 부피 및 상대 종양 증식률의 계산
3일마다 누드 마우스의 체중 및 이식 종양의 장경(a) 및 단경(b)를 측정하고, 하기 식에 따라 종양 부피(v), 상대 종양 부피(RTV), 상대 종양 증식률(T/C)을 계산하며, 여기서 V = a Х b2 / 2; RTV = V / V0이고(V0은 투약 이전의 종양 부피이고, V는 희생 이전의 종양 부피임), T/C(%) = 치료군 RTV / 모델 대조군 RTV × 100%이다.
종양 성장 억제율의 계산
마우스의 무게를 확인한 후 희생시키고, 종양을 완전한 상태로 적출하며, 혈액 얼룩 및 지방 등 비 종양 조직을 제거하고 종양 무게를 확인한 다음, 종양 성장 억제율을 계산한다. 각 그룹 마우스의 평균 종양 무게를 약효의 지표로 사용한다. 종양 성장 억제율(%) = (1 - 치료군 평균 종양 무게 / 모델군 평균 종양 무게) × 100%.
테스트 결과는, 대조군에 비해, 각 투여군은 종양 성장 억제율, 종양 부피, 상대 종양 부피 및 상대 종양 증식률에 대해 모두 일정한 억제 작용이 있음으로 나타났다(표 4, 표 5).
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 종양 성장 억제율은 각각 11.73%, 25.13% 및 45.55%이다.
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 종양 부피 및 상대 종양 부피는 모델군보다 현저히 낮다(P<0.05).
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 상대 종양 증식률은 각각 57.37%, 47.65% 및 33.46%이다.
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 동물 체중은 모델군에 비해 뚜렷한 변화가 없다.
Figure pct00005
Figure pct00006
III. 인체 림프종 누드 마우스 모델에 대한 캐리마이신의 억제 작용
마우스 고형 종양 모델의 구축
로그 생장기 U937 세포를 취하고, 트리판 블루 색소 배제 시험 생존 세포가 > 95%이며, 판크레아틴으로 소화한 다음, 원심 분리하고, 상청액을 버리고, matrigel을 사용하여 세포 농도를 1Х107/ml로 조절하며, 누드 마우스의 오른쪽 겨드랑이 피하에 마리당 0.2ml씩 세포를 접종하고, 접종 1일차로 기재한다. 종양이 ≥ 100mm3까지 성장한 다음, 동물을 그룹 당 6마리씩 5개 그룹: 모델군, 시클로포스파미드군, 캐리마이신 12.5, 25 및 50mg/kg 3개 용량군에 무작위로 나눈다. 각 그룹의 동물에게 30일간 지속적으로 20mg/kg의 부피로 위관 투여한다. 약을 끊은 이튿날 마우스를 희생시켜, 지표를 측정한다. 투약 개시로부터 누드 마우스의 희생 시점까지, 3일마다 종양의 장경, 단경 및 체중을 기록한다.
종양 부피 및 상대 종양 증식률의 계산
3일마다 누드 마우스의 체중 및 이식 종양의 장경(a) 및 단경(b)를 측정하고, 하기 식에 따라 종양 부피(v), 상대 종양 부피(RTV), 상대 종양 증식률(T/C)을 계산하며, 여기서 V = a Х b2 / 2; RTV = V / V0이고(V0은 투약 이전의 종양 부피이고, V는 희생 이전의 종양 부피임), T/C(%) = 치료군 RTV / 모델 대조군 RTV × 100%이다.
종양 성장 억제율의 계산
마우스의 무게를 확인한 후 희생시키고, 종양을 완전한 상태로 적출하며, 혈액 얼룩 및 지방 등 비 종양 조직을 제거하고 종양 무게를 확인한 다음, 종양 성장 억제율을 계산한다. 각 그룹 마우스의 평균 종양 무게를 약효의 지표로 사용한다. 종양 성장 억제율(%) = (1 - 치료군 평균 종양 무게 / 모델군 평균 종양 무게) × 100%.
테스트 결과는, 대조군에 비해, 각 투여군은 종양 성장 억제율, 종양 부피, 상대 종양 부피 및 상대 종양 증식률에 대해 모두 일정한 억제 작용이 있음으로 나타났다(표 6, 표 7).
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 종양 성장 억제율은 각각 61.08%, 65.94% 및 70.50%이다.
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 종양 부피 및 상대 종양 부피는 모델군보다 현저히 낮다(P<0.05).
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 상대 종양 증식률은 각각 52.37%, 47.31% 및 39.95%이다.
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 동물 체중은 모델군에 비해 뚜렷한 변화가 없다.
Figure pct00007
Figure pct00008
IV. 인체 자궁경부암 누드 마우스 모델에 대한 캐리마이신의 억제 작용
마우스 고형 종양 모델의 구축
로그 생장기 HeLa 세포를 취하고, 트리판 블루 색소 배제 시험 생존 세포가 > 95%이며, 판크레아틴으로 소화한 다음, 원심 분리하고, 상청액을 버리고, matrigel을 사용하여 세포 농도를 1Х107/ml로 조절하며, 누드 마우스의 오른쪽 겨드랑이 피하에 마리당 0.2ml씩 세포를 접종하고, 접종 1일차로 기재한다. 종양이 ≥ 100mm3까지 성장한 다음, 동물을 그룹 당 6마리씩 5개 그룹: 모델군, 시클로포스파미드군, 캐리마이신 12.5, 25 및 50mg/kg 3개 용량군에 무작위로 나눈다. 각 그룹의 동물에게 30일간 지속적으로 20mg/kg의 부피로 위관 투여한다. 약을 끊은 이튿날 마우스를 희생시켜, 지표를 측정한다. 투약 개시로부터 누드 마우스의 희생 시점까지, 3일마다 종양의 장경, 단경 및 체중을 기록한다.
종양 부피 및 상대 종양 증식률의 계산
3일마다 누드 마우스의 체중 및 이식 종양의 장경(a) 및 단경(b)를 측정하고, 하기 식에 따라 종양 부피(v), 상대 종양 부피(RTV), 상대 종양 증식률(T/C)을 계산하며, 여기서 V = a Х b2 / 2; RTV = V / V0이고(V0은 투약 이전의 종양 부피이고, V는 희생 이전의 종양 부피임), T/C(%) = 치료군 RTV / 모델 대조군 RTV × 100%이다.
종양 성장 억제율의 계산
마우스의 무게를 확인한 후 희생시키고, 종양을 완전한 상태로 적출하며, 혈액 얼룩 및 지방 등 비 종양 조직을 제거하고 종양 무게를 확인한 다음, 종양 성장 억제율을 계산한다. 각 그룹 마우스의 평균 종양 무게를 약효의 지표로 사용한다. 종양 성장 억제율(%) = (1 - 치료군 평균 종양 무게 / 모델군 평균 종양 무게) × 100%.
테스트 결과는, 대조군에 비해, 각 투여군은 종양 성장 억제율, 종양 부피, 상대 종양 부피 및 상대 종양 증식률에 대해 모두 일정한 억제 작용이 있음으로 나타났다(표 8, 표 9).
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 종양 성장 억제율은 각각 28.75%, 46.28% 및 56.18%이다.
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 종양 부피 및 상대 종양 부피는 모델군보다 현저히 낮다(P<0.05).
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 상대 종양 증식률은 각각 61.04%, 53.27% 및 40.40%이다.
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 동물 체중은 모델군에 비해 뚜렷한 변화가 없다.
Figure pct00009
Figure pct00010
V. 인체 전립선암 누드 마우스 모델에 대한 캐리마이신의 억제 작용
마우스 고형 종양 모델의 구축
로그 생장기 PC3 세포를 취하고, 트리판 블루 색소 배제 시험 생존 세포가 > 95%이며, 판크레아틴으로 소화한 다음, 원심 분리하고, 상청액을 버리고, matrigel을 사용하여 세포 농도를 1Х107/ml로 조절하며, 누드 마우스의 오른쪽 겨드랑이 피하에 마리당 0.2ml씩 세포를 접종하고, 접종 1일차로 기재한다. 종양이 ≥ 100mm3까지 성장한 다음, 동물을 그룹 당 6마리씩 5개 그룹: 모델군, 시클로포스파미드군, 캐리마이신 12.5, 25 및 50mg/kg 3개 용량군에 무작위로 나눈다. 각 그룹의 동물에게 30일간 지속적으로 20mg/kg의 부피로 위관 투여한다. 약을 끊은 이튿날 마우스를 희생시켜, 지표를 측정한다. 투약 개시로부터 누드 마우스의 희생 시점까지, 3일마다 종양의 장경, 단경 및 체중을 기록한다.
종양 부피 및 상대 종양 증식률의 계산
3일마다 누드 마우스의 체중 및 이식 종양의 장경(a) 및 단경(b)를 측정하고, 하기 식에 따라 종양 부피(v), 상대 종양 부피(RTV), 상대 종양 증식률(T/C)을 계산하며, 여기서 V = a Х b2 / 2; RTV = V / V0이고(V0은 투약 이전의 종양 부피이고, V는 희생 이전의 종양 부피임), T/C(%) = 치료군 RTV / 모델 대조군 RTV × 100%이다.
종양 성장 억제율의 계산
마우스의 무게를 확인한 후 희생시키고, 종양을 완전한 상태로 적출하며, 혈액 얼룩 및 지방 등 비 종양 조직을 제거하고 종양 무게를 확인한 다음, 종양 성장 억제율을 계산한다. 각 그룹 마우스의 평균 종양 무게를 약효의 지표로 사용한다. 종양 성장 억제율(%) = (1 - 치료군 평균 종양 무게 / 모델군 평균 종양 무게) × 100%.
테스트 결과는, 대조군에 비해, 각 투여군은 종양 성장 억제율, 종양 부피, 상대 종양 부피 및 상대 종양 증식률에 대해 모두 일정한 억제 작용이 있음으로 나타났다(표 10, 표 11).
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 종양 성장 억제율은 각각 25.92%, 34.67% 및 60.32%이다.
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 종양 부피 및 상대 종양 부피는 모델군보다 현저히 낮다(P<0.05).
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 상대 종양 증식률은 각각 55.93%, 43.45% 및 30.02%이다.
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 동물 체중은 모델군에 비해 뚜렷한 변화가 없다.
Figure pct00011
Figure pct00012
VI. 인체 결장암 누드 마우스 모델에 대한 캐리마이신의 억제 작용
마우스 고형 종양 모델의 구축
로그 생장기 HT-29 세포를 취하고, 트리판 블루 색소 배제 시험 생존 세포가 > 95%이며, 판크레아틴으로 소화한 다음, 원심 분리하고, 상청액을 버리고, matrigel을 사용하여 세포 농도를 1Х107/ml로 조절하며, 누드 마우스의 오른쪽 겨드랑이 피하에 마리당 0.2ml씩 세포를 접종하고, 접종 1일차로 기재한다. 종양이 ≥ 100mm3까지 성장한 다음, 동물을 그룹 당 6마리씩 5개 그룹: 모델군, 시클로포스파미드군, 캐리마이신 12.5, 25 및 50mg/kg 3개 용량군에 무작위로 나눈다. 각 그룹의 동물에게 30일간 지속적으로 20mg/kg의 부피로 위관 투여한다. 약을 끊은 이튿날 마우스를 희생시켜, 지표를 측정한다. 투약 개시로부터 누드 마우스의 희생 시점까지, 3일마다 종양의 장경, 단경 및 체중을 기록한다.
종양 부피 및 상대 종양 증식률의 계산
3일마다 누드 마우스의 체중 및 이식 종양의 장경(a) 및 단경(b)를 측정하고, 하기 식에 따라 종양 부피(v), 상대 종양 부피(RTV), 상대 종양 증식률(T/C)을 계산하며, 여기서 V = a Х b2 / 2; RTV = V / V0이고(V0은 투약 이전의 종양 부피이고, V는 희생 이전의 종양 부피임), T/C(%) = 치료군 RTV / 모델 대조군 RTV × 100%이다.
종양 성장 억제율의 계산
마우스의 무게를 확인한 후 희생시키고, 종양을 완전한 상태로 적출하며, 혈액 얼룩 및 지방 등 비 종양 조직을 제거하고 종양 무게를 확인한 다음, 종양 성장 억제율을 계산한다. 각 그룹 마우스의 평균 종양 무게를 약효의 지표로 사용한다. 종양 성장 억제율(%) = (1 - 치료군 평균 종양 무게 / 모델군 평균 종양 무게) × 100%.
테스트 결과는, 대조군에 비해, 각 투여군은 종양 성장 억제율, 종양 부피, 상대 종양 부피 및 상대 종양 증식률에 대해 모두 일정한 억제 작용이 있음으로 나타났다(표 12, 표 13).
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 종양 성장 억제율은 각각 40.55%, 60.68% 및 73.16%이다.
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 종양 부피 및 상대 종양 부피는 모델군보다 현저히 낮다(P<0.05).
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 상대 종양 증식률은 각각 49.31%, 42.30% 및 30.96%이다.
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 동물 체중은 모델군에 비해 뚜렷한 변화가 없다.
Figure pct00013
Figure pct00014
VII. 인체 백혈병 누드 마우스 모델에 대한 캐리마이신의 억제 작용
마우스 고형 종양 모델의 구축
로그 생장기 HL-60 세포를 취하고, 트리판 블루 색소 배제 시험 생존 세포가 > 95%이며, 판크레아틴으로 소화한 다음, 원심 분리하고, 상청액을 버리고, matrigel을 사용하여 세포 농도를 1Х107/ml로 조절하며, 누드 마우스의 오른쪽 겨드랑이 피하에 마리당 0.2ml씩 세포를 접종하고, 접종 1일차로 기재한다. 종양이 ≥ 100mm3까지 성장한 다음, 동물을 그룹 당 6마리씩 5개 그룹: 모델군, 시클로포스파미드군, 캐리마이신 12.5, 25 및 50mg/kg 3개 용량군에 무작위로 나눈다. 각 그룹의 동물에게 30일간 지속적으로 20mg/kg의 부피로 위관 투여한다. 약을 끊은 이튿날 마우스를 희생시켜, 지표를 측정한다. 투약 개시로부터 누드 마우스의 희생 시점까지, 3일마다 종양의 장경, 단경 및 체중을 기록한다.
종양 부피 및 상대 종양 증식률의 계산
3일마다 누드 마우스의 체중 및 이식 종양의 장경(a) 및 단경(b)를 측정하고, 하기 식에 따라 종양 부피(v), 상대 종양 부피(RTV), 상대 종양 증식률(T/C)을 계산하며, 여기서 V = a Х b2 / 2; RTV = V / V0이고(V0은 투약 이전의 종양 부피이고, V는 희생 이전의 종양 부피임), T/C(%) = 치료군 RTV / 모델 대조군 RTV × 100%이다.
종양 성장 억제율의 계산
마우스의 무게를 확인한 후 희생시키고, 종양을 완전한 상태로 적출하며, 혈액 얼룩 및 지방 등 비 종양 조직을 제거하고 종양 무게를 확인한 다음, 종양 성장 억제율을 계산한다. 각 그룹 마우스의 평균 종양 무게를 약효의 지표로 사용한다. 종양 성장 억제율(%) = (1 - 치료군 평균 종양 무게 / 모델군 평균 종양 무게) × 100%.
테스트 결과는, 대조군에 비해, 각 투여군은 종양 성장 억제율, 종양 부피, 상대 종양 부피 및 상대 종양 증식률에 대해 모두 일정한 억제 작용이 있음으로 나타났다(표 14, 표 15).
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 종양 성장 억제율은 각각 40.26%, 70.92% 및 83.35%이다.
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 종양 부피 및 상대 종양 부피는 모델군보다 현저히 낮다(P<0.05).
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 상대 종양 증식률은 각각 58.63%, 49.26% 및 38.33%이다.
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 동물 체중은 모델군에 비해 뚜렷한 변화가 없다.
Figure pct00015
Figure pct00016
VIII. 인체 간암 누드 마우스 모델에 대한 캐리마이신의 억제 작용
마우스 고형 종양 모델의 구축
로그 생장기 HepG-2 세포를 취하고, 트리판 블루 색소 배제 시험 생존 세포가 > 95%이며, 판크레아틴으로 소화한 다음, 원심 분리하고, 상청액을 버리고, matrigel을 사용하여 세포 농도를 1Х107/ml로 조절하며, 누드 마우스의 오른쪽 겨드랑이 피하에 마리당 0.2ml씩 세포를 접종하고, 접종 1일차로 기재한다. 종양이 ≥ 100mm3까지 성장한 다음, 동물을 그룹 당 6마리씩 5개 그룹: 모델군, 시클로포스파미드군, 캐리마이신 12.5, 25 및 50mg/kg 3개 용량군에 무작위로 나눈다. 각 그룹의 동물에게 30일간 지속적으로 20mg/kg의 부피로 위관 투여한다. 약을 끊은 이튿날 마우스를 희생시켜, 지표를 측정한다. 투약 개시로부터 누드 마우스의 희생 시점까지, 3일마다 종양의 장경, 단경 및 체중을 기록한다.
종양 부피 및 상대 종양 증식률의 계산
3일마다 누드 마우스의 체중 및 이식 종양의 장경(a) 및 단경(b)를 측정하고, 하기 식에 따라 종양 부피(v), 상대 종양 부피(RTV), 상대 종양 증식률(T/C)을 계산하며, 여기서 V = a Х b2 / 2; RTV = V / V0이고(V0은 투약 이전의 종양 부피이고, V는 희생 이전의 종양 부피임), T/C(%) = 치료군 RTV / 모델 대조군 RTV × 100%이다.
종양 성장 억제율의 계산
마우스의 무게를 확인한 후 희생시키고, 종양을 완전한 상태로 적출하며, 혈액 얼룩 및 지방 등 비 종양 조직을 제거하고 종양 무게를 확인한 다음, 종양 성장 억제율을 계산한다. 각 그룹 마우스의 평균 종양 무게를 약효의 지표로 사용한다. 종양 성장 억제율(%) = (1 - 치료군 평균 종양 무게 / 모델군 평균 종양 무게) × 100%.
테스트 결과는, 대조군에 비해, 각 투여군은 종양 성장 억제율, 종양 부피, 상대 종양 부피 및 상대 종양 증식률에 대해 모두 일정한 억제 작용이 있음으로 나타났다(표 16, 표 17).
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 종양 성장 억제율은 각각 37.79%, 51.92% 및 61.11%이다.
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 종양 부피 및 상대 종양 부피는 모델군보다 현저히 낮다(P<0.05).
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 상대 종양 증식률은 각각 65.55%, 53.58% 및 39.33%이다.
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 동물 체중은 모델군에 비해 뚜렷한 변화가 없다.
Figure pct00017
Figure pct00018
IX. 인체 유방암 누드 마우스 모델에 대한 캐리마이신의 억제 작용
마우스 고형 종양 모델의 구축
로그 생장기 MDA-MB-231 세포를 취하고, 트리판 블루 색소 배제 시험 생존 세포가 > 95%이며, 판크레아틴으로 소화한 다음, 원심 분리하고, 상청액을 버리고, matrigel을 사용하여 세포 농도를 1Х107/ml로 조절하며, 누드 마우스의 오른쪽 겨드랑이 피하에 마리당 0.2ml씩 세포를 접종하고, 접종 1일차로 기재한다. 종양이 ≥ 100mm3까지 성장한 다음, 동물을 그룹 당 6마리씩 5개 그룹: 모델군, 시클로포스파미드군, 캐리마이신 12.5, 25 및 50mg/kg 3개 용량군에 무작위로 나눈다. 각 그룹의 동물에게 30일간 지속적으로 20mg/kg의 부피로 위관 투여한다. 약을 끊은 이튿날 마우스를 희생시켜, 지표를 측정한다. 투약 개시로부터 누드 마우스의 희생 시점까지, 3일마다 종양의 장경, 단경 및 체중을 기록한다.
종양 부피 및 상대 종양 증식률의 계산
3일마다 누드 마우스의 체중 및 이식 종양의 장경(a) 및 단경(b)를 측정하고, 하기 식에 따라 종양 부피(v), 상대 종양 부피(RTV), 상대 종양 증식률(T/C)을 계산하며, 여기서 V = a Х b2 / 2; RTV = V / V0이고(V0은 투약 이전의 종양 부피이고, V는 희생 이전의 종양 부피임), T/C(%) = 치료군 RTV / 모델 대조군 RTV × 100%이다.
종양 성장 억제율의 계산
마우스의 무게를 확인한 후 희생시키고, 종양을 완전한 상태로 적출하며, 혈액 얼룩 및 지방 등 비 종양 조직을 제거하고 종양 무게를 확인한 다음, 종양 성장 억제율을 계산한다. 각 그룹 마우스의 평균 종양 무게를 약효의 지표로 사용한다. 종양 성장 억제율(%) = (1 - 치료군 평균 종양 무게 / 모델군 평균 종양 무게) × 100%.
테스트 결과는, 대조군에 비해, 각 투여군은 종양 성장 억제율, 종양 부피, 상대 종양 부피 및 상대 종양 증식률에 대해 모두 일정한 억제 작용이 있음으로 나타났다(표 18, 표 19).
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 종양 성장 억제율은 각각 46.96%, 58.88% 및 72.55%이다.
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 종양 부피 및 상대 종양 부피는 모델군보다 현저히 낮다(P<0.05).
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 상대 종양 증식률은 각각 59.42%, 48.69% 및 35.78%이다.
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 동물 체중은 모델군에 비해 뚜렷한 변화가 없다.
Figure pct00019
Figure pct00020
Ⅹ. 인체 대세포 폐암 누드 마우스 모델에 대한 캐리마이신의 억제 작용
마우스 고형 종양 모델의 구축
로그 생장기 H460 세포를 취하고, 트리판 블루 색소 배제 시험 생존 세포가 > 95%이며, 판크레아틴으로 소화한 다음, 원심 분리하고, 상청액을 버리고, matrigel을 사용하여 세포 농도를 1Х107/ml로 조절하며, 누드 마우스의 오른쪽 겨드랑이 피하에 마리당 0.2ml씩 세포를 접종하고, 접종 1일차로 기재한다. 종양이 ≥ 100mm3까지 성장한 다음, 동물을 그룹 당 6마리씩 5개 그룹: 모델군, 시클로포스파미드군, 캐리마이신 12.5, 25 및 50mg/kg 3개 용량군에 무작위로 나눈다. 각 그룹의 동물에게 30일간 지속적으로 20mg/kg의 부피로 위관 투여한다. 약을 끊은 이튿날 마우스를 희생시켜, 지표를 측정한다. 투약 개시로부터 누드 마우스의 희생 시점까지, 3일마다 종양의 장경, 단경 및 체중을 기록한다.
종양 부피 및 상대 종양 증식률의 계산
3일마다 누드 마우스의 체중 및 이식 종양의 장경(a) 및 단경(b)를 측정하고, 하기 식에 따라 종양 부피(v), 상대 종양 부피(RTV), 상대 종양 증식률(T/C)을 계산하며, 여기서 V = a Х b2 / 2; RTV = V / V0이고(V0은 투약 이전의 종양 부피이고, V는 희생 이전의 종양 부피임), T/C(%) = 치료군 RTV / 모델 대조군 RTV × 100%이다.
종양 성장 억제율의 계산
마우스의 무게를 확인한 후 희생시키고, 종양을 완전한 상태로 적출하며, 혈액 얼룩 및 지방 등 비 종양 조직을 제거하고 종양 무게를 확인한 다음, 종양 성장 억제율을 계산한다. 각 그룹 마우스의 평균 종양 무게를 약효의 지표로 사용한다. 종양 성장 억제율(%) = (1 - 치료군 평균 종양 무게 / 모델군 평균 종양 무게) × 100%.
테스트 결과는, 대조군에 비해, 각 투여군은 종양 성장 억제율, 종양 부피, 상대 종양 부피 및 상대 종양 증식률에 대해 모두 일정한 억제 작용이 있음으로 나타났다(표 20, 표 21).
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 종양 성장 억제율은 각각 37.79%, 51.92% 및 61.11%이다.
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 종양 부피 및 상대 종양 부피는 모델군보다 현저히 낮다(P<0.05).
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 상대 종양 증식률은 각각 73.83%, 61.83% 및 49.82%이다.
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 동물 체중은 모델군에 비해 뚜렷한 변화가 없다.
Figure pct00021
Figure pct00022
XI. 인체 대세포 폐암 누드 마우스 모델에 대한 캐리마이신의 억제 작용
마우스 고형 종양 모델의 구축
로그 생장기 H1299 세포를 취하고, 트리판 블루 색소 배제 시험 생존 세포가 > 95%이며, 판크레아틴으로 소화한 다음, 원심 분리하고, 상청액을 버리고, matrigel을 사용하여 세포 농도를 1Х107/ml로 조절하며, 누드 마우스의 오른쪽 겨드랑이 피하에 마리당 0.2ml씩 세포를 접종하고, 접종 1일차로 기재한다. 종양이 ≥ 100mm3까지 성장한 다음, 동물을 그룹 당 6마리씩 5개 그룹: 모델군, 시클로포스파미드군, 캐리마이신 12.5, 25 및 50mg/kg 3개 용량군에 무작위로 나눈다. 각 그룹의 동물에게 30일간 지속적으로 20mg/kg의 부피로 위관 투여한다. 약을 끊은 이튿날 마우스를 희생시켜, 지표를 측정한다. 투약 개시로부터 누드 마우스의 희생 시점까지, 3일마다 종양의 장경, 단경 및 체중을 기록한다.
종양 부피 및 상대 종양 증식률의 계산
3일마다 누드 마우스의 체중 및 이식 종양의 장경(a) 및 단경(b)를 측정하고, 하기 식에 따라 종양 부피(v), 상대 종양 부피(RTV), 상대 종양 증식률(T/C)을 계산하며, 여기서 V = a Х b2 / 2; RTV = V / V0이고(V0은 투약 이전의 종양 부피이고, V는 희생 이전의 종양 부피임), T/C(%) = 치료군 RTV / 모델 대조군 RTV × 100%이다.
종양 성장 억제율의 계산
마우스의 무게를 확인한 후 희생시키고, 종양을 완전한 상태로 적출하며, 혈액 얼룩 및 지방 등 비 종양 조직을 제거하고 종양 무게를 확인한 다음, 종양 성장 억제율을 계산한다. 각 그룹 마우스의 평균 종양 무게를 약효의 지표로 사용한다. 종양 성장 억제율(%) = (1 - 치료군 평균 종양 무게 / 모델군 평균 종양 무게) × 100%.
테스트 결과는, 대조군에 비해, 각 투여군은 종양 성장 억제율, 종양 부피, 상대 종양 부피 및 상대 종양 증식률에 대해 모두 일정한 억제 작용이 있음으로 나타났다(표 22, 표 23).
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 종양 성장 억제율은 각각 19.57%, 49.58% 및 59.65%이다.
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 종양 부피 및 상대 종양 부피는 모델군보다 현저히 낮다(P<0.05).
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 상대 종양 증식률은 각각 78.57%, 63.62% 및 49.71%이다.
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 동물 체중은 모델군에 비해 뚜렷한 변화가 없다.
Figure pct00023
Figure pct00024
XII. 인체 신장 투명세포 선암 누드 마우스 모델에 대한 캐리마이신의 억제 작용
마우스 고형 종양 모델의 구축
로그 생장기 786-O 세포를 취하고, 트리판 블루 색소 배제 시험 생존 세포가 > 95%이며, 판크레아틴으로 소화한 다음, 원심 분리하고, 상청액을 버리고, matrigel을 사용하여 세포 농도를 1Х107/ml로 조절하며, 누드 마우스의 오른쪽 겨드랑이 피하에 마리당 0.2ml씩 세포를 접종하고, 접종 1일차로 기재한다. 종양이 ≥ 100mm3까지 성장한 다음, 동물을 그룹 당 6마리씩 5개 그룹: 모델군, 시클로포스파미드군, 캐리마이신 12.5, 25 및 50mg/kg 3개 용량군에 무작위로 나눈다. 각 그룹의 동물에게 30일간 지속적으로 20mg/kg의 부피로 위관 투여한다. 약을 끊은 이튿날 마우스를 희생시켜, 지표를 측정한다. 투약 개시로부터 누드 마우스의 희생 시점까지, 3일마다 종양의 장경, 단경 및 체중을 기록한다.
종양 부피 및 상대 종양 증식률의 계산
3일마다 누드 마우스의 체중 및 이식 종양의 장경(a) 및 단경(b)를 측정하고, 하기 식에 따라 종양 부피(v), 상대 종양 부피(RTV), 상대 종양 증식률(T/C)을 계산하며, 여기서 V = a Х b2 / 2; RTV = V / V0이고(V0은 투약 이전의 종양 부피이고, V는 희생 이전의 종양 부피임), T/C(%) = 치료군 RTV / 모델 대조군 RTV × 100%이다.
종양 성장 억제율의 계산
마우스의 무게를 확인한 후 희생시키고, 종양을 완전한 상태로 적출하며, 혈액 얼룩 및 지방 등 비 종양 조직을 제거하고 종양 무게를 확인한 다음, 종양 성장 억제율을 계산한다. 각 그룹 마우스의 평균 종양 무게를 약효의 지표로 사용한다. 종양 성장 억제율(%) = (1 - 치료군 평균 종양 무게 / 모델군 평균 종양 무게) × 100%.
테스트 결과는, 대조군에 비해, 각 투여군은 종양 성장 억제율, 종양 부피, 상대 종양 부피 및 상대 종양 증식률에 대해 모두 일정한 억제 작용이 있음으로 나타났다(표 24, 표 25).
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 종양 성장 억제율은 각각 30.32%, 47.24% 및 63.71%이다.
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 종양 부피 및 상대 종양 부피는 모델군보다 현저히 낮다(P<0.05).
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 상대 종양 증식률은 각각 80.81%, 67.16% 및 42.82%이다.
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 동물 체중은 모델군에 비해 뚜렷한 변화가 없다.
Figure pct00025
Figure pct00026
XIII. 인체 신장 선암 누드 마우스 모델에 대한 캐리마이신의 억제 작용
마우스 고형 종양 모델의 구축
로그 생장기 769-P 세포를 취하고, 트리판 블루 색소 배제 시험 생존 세포가 > 95%이며, 판크레아틴으로 소화한 다음, 원심 분리하고, 상청액을 버리고, matrigel을 사용하여 세포 농도를 1Х107/ml로 조절하며, 누드 마우스의 오른쪽 겨드랑이 피하에 마리당 0.2ml씩 세포를 접종하고, 접종 1일차로 기재한다. 종양이 ≥ 100mm3까지 성장한 다음, 동물을 그룹 당 6마리씩 5개 그룹: 모델군, 시클로포스파미드군, 캐리마이신 12.5, 25 및 50mg/kg 3개 용량군에 무작위로 나눈다. 각 그룹의 동물에게 30일간 지속적으로 20mg/kg의 부피로 위관 투여한다. 약을 끊은 이튿날 마우스를 희생시켜, 지표를 측정한다. 투약 개시로부터 누드 마우스의 희생 시점까지, 3일마다 종양의 장경, 단경 및 체중을 기록한다.
종양 부피 및 상대 종양 증식률의 계산
3일마다 누드 마우스의 체중 및 이식 종양의 장경(a) 및 단경(b)를 측정하고, 하기 식에 따라 종양 부피(v), 상대 종양 부피(RTV), 상대 종양 증식률(T/C)을 계산하며, 여기서 V = a Х b2 / 2; RTV = V / V0이고(V0은 투약 이전의 종양 부피이고, V는 희생 이전의 종양 부피임), T/C(%) = 치료군 RTV / 모델 대조군 RTV × 100%이다.
종양 성장 억제율의 계산
마우스의 무게를 확인한 후 희생시키고, 종양을 완전한 상태로 적출하며, 혈액 얼룩 및 지방 등 비 종양 조직을 제거하고 종양 무게를 확인한 다음, 종양 성장 억제율을 계산한다. 각 그룹 마우스의 평균 종양 무게를 약효의 지표로 사용한다. 종양 성장 억제율(%) = (1 - 치료군 평균 종양 무게 / 모델군 평균 종양 무게) × 100%.
테스트 결과는, 대조군에 비해, 각 투여군은 종양 성장 억제율, 종양 부피, 상대 종양 부피 및 상대 종양 증식률에 대해 모두 일정한 억제 작용이 있음으로 나타났다(표 26, 표 27).
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 종양 성장 억제율은 각각 38.40%, 53.67 % 및 69.53%이다.
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 종양 부피 및 상대 종양 부피는 모델군보다 현저히 낮다(P<0.05).
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 상대 종양 증식률은 각각 62.29%, 43.16% 및 31.34%이다.
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 동물 체중은 모델군에 비해 뚜렷한 변화가 없다.
Figure pct00027
Figure pct00028
XIV. 인체 신경교종 누드 마우스 모델에 대한 캐리마이신의 억제 작용
마우스 고형 종양 모델의 구축
로그 생장기 U251 세포를 취하고, 트리판 블루 색소 배제 시험 생존 세포가 > 95%이며, 판크레아틴으로 소화한 다음, 원심 분리하고, 상청액을 버리고, matrigel을 사용하여 세포 농도를 1Х107/ml로 조절하며, 누드 마우스의 오른쪽 겨드랑이 피하에 마리당 0.2ml씩 세포를 접종하고, 접종 1일차로 기재한다. 종양이 ≥ 100mm3까지 성장한 다음, 동물을 그룹 당 6마리씩 5개 그룹: 모델군, 시클로포스파미드군, 캐리마이신 12.5, 25 및 50mg/kg 3개 용량군에 무작위로 나눈다. 각 그룹의 동물에게 30일간 지속적으로 20mg/kg의 부피로 위관 투여한다. 약을 끊은 이튿날 마우스를 희생시켜, 지표를 측정한다. 투약 개시로부터 누드 마우스의 희생 시점까지, 3일마다 종양의 장경, 단경 및 체중을 기록한다.
종양 부피 및 상대 종양 증식률의 계산
3일마다 누드 마우스의 체중 및 이식 종양의 장경(a) 및 단경(b)를 측정하고, 하기 식에 따라 종양 부피(v), 상대 종양 부피(RTV), 상대 종양 증식률(T/C)을 계산하며, 여기서 V = a Х b2 / 2; RTV = V / V0이고(V0은 투약 이전의 종양 부피이고, V는 희생 이전의 종양 부피임), T/C(%) = 치료군 RTV / 모델 대조군 RTV × 100%이다.
종양 성장 억제율의 계산
마우스의 무게를 확인한 후 희생시키고, 종양을 완전한 상태로 적출하며, 혈액 얼룩 및 지방 등 비 종양 조직을 제거하고 종양 무게를 확인한 다음, 종양 성장 억제율을 계산한다. 각 그룹 마우스의 평균 종양 무게를 약효의 지표로 사용한다. 종양 성장 억제율(%) = (1 - 치료군 평균 종양 무게 / 모델군 평균 종양 무게) × 100%.
테스트 결과는, 대조군에 비해, 각 투여군은 종양 성장 억제율, 종양 부피, 상대 종양 부피 및 상대 종양 증식률에 대해 모두 일정한 억제 작용이 있음으로 나타났다(표 28, 표 29).
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 종양 성장 억제율은 각각 66.51%, 79.59% 및 81.82%이다.
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 종양 부피 및 상대 종양 부피는 모델군보다 현저히 낮다(P<0.05).
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 상대 종양 증식률은 각각 84.81%, 56.30% 및 35.90%이다.
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 동물 체중은 모델군에 비해 뚜렷한 변화가 없다.
Figure pct00029
Figure pct00030
XV. 인체 교모세포종 누드 마우스 모델에 대한 캐리마이신의 억제 작용
마우스 고형 종양 모델의 구축
로그 생장기 A172 세포를 취하고, 트리판 블루 색소 배제 시험 생존 세포가 > 95%이며, 판크레아틴으로 소화한 다음, 원심 분리하고, 상청액을 버리고, matrigel을 사용하여 세포 농도를 1Х107/ml로 조절하며, 누드 마우스의 오른쪽 겨드랑이 피하에 마리당 0.2ml씩 세포를 접종하고, 접종 1일차로 기재한다. 종양이 ≥ 100mm3까지 성장한 다음, 동물을 그룹 당 6마리씩 5개 그룹: 모델군, 시클로포스파미드군, 캐리마이신 12.5, 25 및 50mg/kg 3개 용량군에 무작위로 나눈다. 각 그룹의 동물에게 30일간 지속적으로 20mg/kg의 부피로 위관 투여한다. 약을 끊은 이튿날 마우스를 희생시켜, 지표를 측정한다. 투약 개시로부터 누드 마우스의 희생 시점까지, 3일마다 종양의 장경, 단경 및 체중을 기록한다.
종양 부피 및 상대 종양 증식률의 계산
3일마다 누드 마우스의 체중 및 이식 종양의 장경(a) 및 단경(b)를 측정하고, 하기 식에 따라 종양 부피(v), 상대 종양 부피(RTV), 상대 종양 증식률(T/C)을 계산하며, 여기서 V = a Х b2 / 2; RTV = V / V0이고(V0은 투약 이전의 종양 부피이고, V는 희생 이전의 종양 부피임), T/C(%) = 치료군 RTV / 모델 대조군 RTV × 100%이다.
종양 성장 억제율의 계산
마우스의 무게를 확인한 후 희생시키고, 종양을 완전한 상태로 적출하며, 혈액 얼룩 및 지방 등 비 종양 조직을 제거하고 종양 무게를 확인한 다음, 종양 성장 억제율을 계산한다. 각 그룹 마우스의 평균 종양 무게를 약효의 지표로 사용한다. 종양 성장 억제율(%) = (1 - 치료군 평균 종양 무게 / 모델군 평균 종양 무게) × 100%.
테스트 결과는, 대조군에 비해, 각 투여군은 종양 성장 억제율, 종양 부피, 상대 종양 부피 및 상대 종양 증식률에 대해 모두 일정한 억제 작용이 있음으로 나타났다(표 30, 표 31).
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 종양 성장 억제율은 각각 46.95%, 66.84% 및 76.26%이다.
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 종양 부피 및 상대 종양 부피는 모델군보다 현저히 낮다(P<0.05).
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 상대 종양 증식률은 각각 68.62%, 55.91% 및 38.53%이다.
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 동물 체중은 모델군에 비해 뚜렷한 변화가 없다.
Figure pct00031
Figure pct00032
XVI. 인체 췌장암 누드 마우스 모델에 대한 캐리마이신의 억제 작용
마우스 고형 종양 모델의 구축
로그 생장기 PANC-1 세포를 취하고, 트리판 블루 색소 배제 시험 생존 세포가 > 95%이며, 판크레아틴으로 소화한 다음, 원심 분리하고, 상청액을 버리고, matrigel을 사용하여 세포 농도를 1Х107/ml로 조절하며, 누드 마우스의 오른쪽 겨드랑이 피하에 마리당 0.2ml씩 세포를 접종하고, 접종 1일차로 기재한다. 종양이 ≥ 100mm3까지 성장한 다음, 동물을 그룹 당 6마리씩 5개 그룹: 모델군, 시클로포스파미드군, 캐리마이신 12.5, 25 및 50mg/kg 3개 용량군에 무작위로 나눈다. 각 그룹의 동물에게 30일간 지속적으로 20mg/kg의 부피로 위관 투여한다. 약을 끊은 이튿날 마우스를 희생시켜, 지표를 측정한다. 투약 개시로부터 누드 마우스의 희생 시점까지, 3일마다 종양의 장경, 단경 및 체중을 기록한다.
종양 부피 및 상대 종양 증식률의 계산
3일마다 누드 마우스의 체중 및 이식 종양의 장경(a) 및 단경(b)를 측정하고, 하기 식에 따라 종양 부피(v), 상대 종양 부피(RTV), 상대 종양 증식률(T/C)을 계산하며, 여기서 V = a Х b2 / 2; RTV = V / V0이고(V0은 투약 이전의 종양 부피이고, V는 희생 이전의 종양 부피임), T/C(%) = 치료군 RTV / 모델 대조군 RTV × 100%이다.
종양 성장 억제율의 계산
마우스의 무게를 확인한 후 희생시키고, 종양을 완전한 상태로 적출하며, 혈액 얼룩 및 지방 등 비 종양 조직을 제거하고 종양 무게를 확인한 다음, 종양 성장 억제율을 계산한다. 각 그룹 마우스의 평균 종양 무게를 약효의 지표로 사용한다. 종양 성장 억제율(%) = (1 - 치료군 평균 종양 무게 / 모델군 평균 종양 무게) × 100%.
테스트 결과는, 대조군에 비해, 각 투여군은 종양 성장 억제율, 종양 부피, 상대 종양 부피 및 상대 종양 증식률에 대해 모두 일정한 억제 작용이 있음으로 나타났다(표 32, 표 33).
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 종양 성장 억제율은 각각 56.27%, 62.66% 및 75.94%이다.
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 종양 부피 및 상대 종양 부피는 모델군보다 현저히 낮다(P<0.05).
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 상대 종양 증식률은 각각 74.10%, 47.01% 및 35.55%이다.
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 동물 체중은 모델군에 비해 뚜렷한 변화가 없다.
Figure pct00033
Figure pct00034
XVII. 인체 식도암 누드 마우스 모델에 대한 캐리마이신의 억제 작용
마우스 고형 종양 모델의 구축
로그 생장기 TE-1 세포를 취하고, 트리판 블루 색소 배제 시험 생존 세포가 > 95%이며, 판크레아틴으로 소화한 다음, 원심 분리하고, 상청액을 버리고, matrigel을 사용하여 세포 농도를 1Х107/ml로 조절하며, 누드 마우스의 오른쪽 겨드랑이 피하에 마리당 0.2ml씩 세포를 접종하고, 접종 1일차로 기재한다. 종양이 ≥ 100mm3까지 성장한 다음, 동물을 그룹 당 6마리씩 5개 그룹: 모델군, 시클로포스파미드군, 캐리마이신 12.5, 25 및 50mg/kg 3개 용량군에 무작위로 나눈다. 각 그룹의 동물에게 30일간 지속적으로 20mg/kg의 부피로 위관 투여한다. 약을 끊은 이튿날 마우스를 희생시켜, 지표를 측정한다. 투약 개시로부터 누드 마우스의 희생 시점까지, 3일마다 종양의 장경, 단경 및 체중을 기록한다.
종양 부피 및 상대 종양 증식률의 계산
3일마다 누드 마우스의 체중 및 이식 종양의 장경(a) 및 단경(b)를 측정하고, 하기 식에 따라 종양 부피(v), 상대 종양 부피(RTV), 상대 종양 증식률(T/C)을 계산하며, 여기서 V = a Х b2 / 2; RTV = V / V0이고(V0은 투약 이전의 종양 부피이고, V는 희생 이전의 종양 부피임), T/C(%) = 치료군 RTV / 모델 대조군 RTV × 100%이다.
종양 성장 억제율의 계산
마우스의 무게를 확인한 후 희생시키고, 종양을 완전한 상태로 적출하며, 혈액 얼룩 및 지방 등 비 종양 조직을 제거하고 종양 무게를 확인한 다음, 종양 성장 억제율을 계산한다. 각 그룹 마우스의 평균 종양 무게를 약효의 지표로 사용한다. 종양 성장 억제율(%) = (1 - 치료군 평균 종양 무게 / 모델군 평균 종양 무게) × 100%.
테스트 결과는, 대조군에 비해, 각 투여군은 종양 성장 억제율, 종양 부피, 상대 종양 부피 및 상대 종양 증식률에 대해 모두 일정한 억제 작용이 있음으로 나타났다(표 34, 표 35).
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 종양 성장 억제율은 각각 46.71%, 61.48% 및 70.41%이다.
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 종양 부피 및 상대 종양 부피는 모델군보다 현저히 낮다(P<0.05).
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 상대 종양 증식률은 각각 64.79%, 46.03% 및 37.02%이다.
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 동물 체중은 모델군에 비해 뚜렷한 변화가 없다.
Figure pct00035
Figure pct00036
XVIII. 인체 위선암 누드 마우스 모델에 대한 캐리마이신의 억제 작용
마우스 고형 종양 모델의 구축
로그 생장기 SGC7901 세포를 취하고, 트리판 블루 색소 배제 시험 생존 세포가 > 95%이며, 판크레아틴으로 소화한 다음, 원심 분리하고, 상청액을 버리고, matrigel을 사용하여 세포 농도를 1Х107/ml로 조절하며, 누드 마우스의 오른쪽 겨드랑이 피하에 마리당 0.2ml씩 세포를 접종하고, 접종 1일차로 기재한다. 종양이 ≥ 100mm3까지 성장한 다음, 동물을 그룹 당 6마리씩 5개 그룹: 모델군, 시클로포스파미드군, 캐리마이신 12.5, 25 및 50mg/kg 3개 용량군에 무작위로 나눈다. 각 그룹의 동물에게 30일간 지속적으로 20mg/kg의 부피로 위관 투여한다. 약을 끊은 이튿날 마우스를 희생시켜, 지표를 측정한다. 투약 개시로부터 누드 마우스의 희생 시점까지, 3일마다 종양의 장경, 단경 및 체중을 기록한다.
종양 부피 및 상대 종양 증식률의 계산
3일마다 누드 마우스의 체중 및 이식 종양의 장경(a) 및 단경(b)를 측정하고, 하기 식에 따라 종양 부피(v), 상대 종양 부피(RTV), 상대 종양 증식률(T/C)을 계산하며, 여기서 V = a Х b2 / 2; RTV = V / V0이고(V0은 투약 이전의 종양 부피이고, V는 희생 이전의 종양 부피임), T/C(%) = 치료군 RTV / 모델 대조군 RTV × 100%이다.
종양 성장 억제율의 계산
마우스의 무게를 확인한 후 희생시키고, 종양을 완전한 상태로 적출하며, 혈액 얼룩 및 지방 등 비 종양 조직을 제거하고 종양 무게를 확인한 다음, 종양 성장 억제율을 계산한다. 각 그룹 마우스의 평균 종양 무게를 약효의 지표로 사용한다. 종양 성장 억제율(%) = (1 - 치료군 평균 종양 무게 / 모델군 평균 종양 무게) × 100%.
테스트 결과는, 대조군에 비해, 각 투여군은 종양 성장 억제율, 종양 부피, 상대 종양 부피 및 상대 종양 증식률에 대해 모두 일정한 억제 작용이 있음으로 나타났다(표 36, 표 37).
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 종양 성장 억제율은 각각 42.51%, 68.92% 및 74.49%이다.
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 종양 부피 및 상대 종양 부피는 모델군보다 현저히 낮다(P<0.05).
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 상대 종양 증식률은 각각 69.12%, 47.88% 및 38.35%이다.
캐리마이신 저용량군, 중용량군, 고용량군 3개 그룹의 동물 체중은 모델군에 비해 뚜렷한 변화가 없다.
Figure pct00037
Figure pct00038
XIX. 마우스 H 22 간암 세포 및 마우스 Lewis 폐암 세포 이종이식 종양에 대한 억제 작용
마우스 고형 종양 모델의 구축
액체 질소에 동결 보존된 H22 세포주를 쿤밍 마우스 체내에 주입하여 소생시키고, 3대 후 복수를 취하여, 50ml 원심 분리 튜브에 넣고, 10ml의 0.9% 생리 식염수를 첨가하고, 1000rpm으로 5min 동안 실온에서 원심 분리하고, 상청액을 버린다. 10ml의 0.9% 생리 식염수를 첨가하고, 취타하여 균일하게 혼합한 다음, 계량하고 생리 식염수를 사용하여 5×106개의 생존 세포/ml가 될 때까지 희석한다. 얼음물에 넣어 저장하고, 75% 에탄올로 마우스의 오른쪽 겨드랑이 피부를 소독한다. 쿤밍 마우스의 오른쪽 앞다리 겨드랑이 피하에 빠르게 접종하며, 한 마리에 0.2ml씩 접종한다.
Lewis 폐암 세포는 10% 송아지 태아 혈청을 포함하는 RPMI 1640 배양액을 사용하여, 37℃, 5％CO2의 인큐베이터에서 배양한다. 로그 생장기의 세포를 취하고, 0.25％ 판크레아틴으로 소화한 다음, 세포를 수집하고, 원심 분리하고, 상청액을 버리고, 멸균 생리 식염수로 2번 세척하며, 세포를 생리 식염수에 현탁시키고, 트리판 블루 색소 배제 시험 생존 세포 분석은 95 %보다 커야 하며, 세포를 통계한다. Lewis 세포 농도를 1Х107/ml로 조절하며, 얼음물에 넣어 저장 한다. 75 % 에탄올로 마우스의 우측 겨드랑이 피부를 소독하고, C57BL/6 마우스의 우측 겨드랑이 피하에 0.2mL를 신속하게 주사한다.
동물 그룹 분류 및 투약 방법
H22 간암 세포 모델에서, 접종 다음날, 종양을 접종한 마우스를 그룹당 10마리씩 무작위로 분류한다. 그룹에는: 모델 대조군, 양성 약물 시클로포스파미드 대조군(CTX, 26mg/kg), 캐리마이신 13, 26, 53mg/kg 3개 용량군이 포함된다. 각 그룹의 동물에게 7일간 지속적으로 위관 투여하며, 투약 부피는 20mg/kg이다.
Lewis 폐암 모델에서, 접종 다음날, 종양을 접종한 마우스를 그룹당 10마리씩 무작위로 분류한다. 그룹에는: 모델 대조군, 양성 약물 시클로포스파미드 대조군(CTX, 30mg/kg), 캐리마이신 13, 26, 53mg/kg 3개 용량군이 포함된다. 각 그룹의 동물에게 지속적으로 15일간 위관 투여하며, 투약 부피는 20mg/kg이다.
종양 억제율의 계산:
종양 마우스에 마지막으로 투약한 이튿날 마우스의 무게를 확인한 후 희생시키고, 피하 종양 덩어리를 제거하여 무게를 달고, 각 그룹 암의 평균 무게를 확인하여, 종양 억제율을 계산한다.
종양 억제율 = (1－T/C)Х100%
T: 약물 투여 그룹의 평균 종양 무게; C: 블랭크 대조군의 평균 종양 무게.
결과:
1. 마우스 H 22 간암 이종이식 종양에 대한 캐리마이신의 억제 작용
표 38에서 보다시피, 양성 대조약 시클로포스파미드의 쿤밍 마우스 H22 간암에 대한 억제율은 47.25%이다. 캐리마이신 26, 52mg/kg은 마우스 H22 간암의 성장에 모두 뚜렷한 억제 작용이 있으며, 종양 억제율은 각각 50.67% 및 79.50%이며, 캐리마이신 52mg/kg 용량군의 종양 억제율은 양성대조군보다 현저히 낮다(P<0.05).
정상 대조군에 비해 양성 대조약 시클로포스파미드군의 체중은 약간 줄었다. 캐리마이신 각 약물 투여군의 동물 체중은 약물 투여 전에 비해 모두 증가 하였으며, 모델 대조군에 비해 뚜렷한 차이가 없다.
Figure pct00039
2. 마우스 Lewis 폐암 이종이식 종양에 대한 캐리마이신의 억제 작용
표 39에서 보다시피, 양성 대조약 시클로포스파미드의 쿤밍 마우스 Lewis 폐암에 대한 억제율은 49.14%이다. 캐리마이신 13, 26, 52mg/kg은 마우스 Lewis 폐암의 성장에 모두 뚜렷한 억제 작용이 있으며, 종양 억제율은 각각 50.30%, 55.88% 및 76.23%이며, 캐리마이신 52mg/kg 용량군의 종양 억제율은 양성대조군보다 현저히 낮다(P<0.05). 캐리마이신 각 약물 투여군의 동물 체중은 약물 투여 전에 비해 모두 증가 하였으며, 모델 대조군에 비해 뚜렷한 차이가 없다.
Figure pct00040
XX. 종양 마우스의 면역 기능에 대한 캐리마이신의 영향
방법
1. 종양 마우스의 흉선 지수 및 비장 지수에 대한 영향
종양 마우스를 희생시킨 다음, 비장과 흉선을 취하여 무게를 달고, 비장 지수 및 흉선 지수를 계산한다.
2. 종양 마우스의 림프 세포 증식 활성 및 자연 살해(NK) 세포 활성에 대한 영향
2.1 비장 림프 세포의 제조
무혈청 RPMI 1640 배양액을 접시에 넣고, 얼음 위에 놓고, 무균 상태에서 비장을 취하고, 멸균 유리 슬라이드로 비장을 부드럽게 분쇄하여, 단일 세포 현탁액을 제조한다. 이중층 멸균 거즈로 여과하고, 무혈청 RPMI 1640 배양액으로 2회 세척하고, 1,500rpm으로 5min 동안 원심 분리하고, 상청액을 제거한다. 2mL의 적혈구 가수분해 용액을 첨가하고, 2min 동안 그대로 둔 다음, RPMI 1640 배양액 8mL를 첨가하여, 1,500rpm으로 5min 동안 원심 분리하고, 상청액을 제거하고, RPMI 1640 배양액으로 2회 세척한다. 트리판 블루 색소 배제 시험 생존 세포를 계산하고, 생존 세포는 >95%여야 한다. 부피율 10%인 송아지 태아 혈청을 포함하는 RPMI 1640 배양액을 사용하여 단일 세포 현탁액을 제조한다.
2.2 비장 림프 세포의 증식 활성 테스트
비장 세포 현탁액을 취하고, 세포 밀도를 1×107/mL로 조절한다. 각 마우스에 하기 웰을 조성한다: A. 대조군 웰: 100μL의 RPMI 1640 배양액 첨가; B. 콘카나발린A(ConA) 자극 웰: 콘카나발린A(ConA) 용액 100μL(10mg/L) 첨가; C. 세균내독소(LPS) 자극 웰: 세균내독소(LPS) 용액 100μL(20mg/L) 첨가. 상기 세포를 96웰 플레이트에 첨가한 다음, 상기 각 웰에 100μL의 비장 세포 현탁액을 첨가한다. 배양 플레이트를 부피율 5％인 CO2, 37℃, 포화 습도 조건에서 72h 부화한 다음, 각 웰에 MTT 용액(5g/L) 10μL를 첨가하고, 동일 조건으로 계속하여 4h 부화한 다음 배양을 마친다. 삼중용액(SDS 10g, 10M HCl 0.1mL, 아이소부틸알콜 5mL를, 증류수로 100mL까지 희석함) 100μL를 첨가하고, 10min 동안 진동시키고, 결정을 충분히 용해하고, 570nm 지점에서 각 웰의 흡광도(OD) 값을 테스트하고, 림프 세포 증식률을 계산한다. 림프 세포 증식률(%) = [(T-C)/C] Х100%이고, 식에서 T는 자극군 웰의 흡광도 값이고, C는 대조군 웰의 흡광도 값이다.
2.3 자연 살해(NK) 세포의 활성 테스트
비장 세포 현탁액을 취하고, 세포 밀도를 1×107/mL로 조절한다(작동세포). K562 세포 현탁액을 제조하고, 세포 밀도를 1×105/mL로 조절한다(표적세포). 각 마우스에 하기 웰을 조성한다: A. 작동세포: 표적세포 웰(수량 비율은 20:1), 20μL의 세포 현탁액 및 100μL의 K562 세포 현탁액 첨가; B. 작동세포 대조군 웰, 100μL의 비장 세포 현탁액 및 100μL의 RPMI 1640 배양액 첨가; C. 표적세포 대조군 웰, 100μL의 K562 세포 현탁액 및 100μL의 RPMI 1640 배양액 첨가. 상기 세포를 96웰 플레이트에 첨가한 다음, 배양 플레이트를 부피율 5％인 CO2, 37℃, 포화 습도 조건에서 22h 배양한 다음, 각 웰에 MTT 용액(5g/L) 10 μL를 첨가하고, 동일 조건으로 계속하여 4h 부화한 다음 배양을 마친다. 삼중용액(SDS 10g, 10M HCl 0.1mL, 아이소부틸알콜 5mL를, 증류수로 100mL까지 희석함) 100μL를 첨가하고, 10min 동안 진동시키고, 결정을 충분히 용해하고, 490nm 지점에서 각 웰의 흡광도 값을 테스트하고, NK 세포 활성을 계산한다. NK 세포 활성(%) = [TO-(S-E)]/TO×100%, 식에서 TO는 목표세포 대조군 웰의 흡광도 값이고, S는 작동세포 대조군 웰의 흡광도 값이며, E는 작동세포의 흡광도 값이다.
결과
1. H 22 간암 종양 마우스의 흉선 지수 및 비장 지수에 대한 영향
표 40의 결과에서 보다시피, 양성 대조약 시클로포스파미드군의 동물 흉선 지수 및 비장 지수는 대조군에 비해 현저하게 떨어졌다(P<0.01). 캐리마이신 13, 26, 52mg/kg군의 동물 흉선 지수는 대조군에 비해 뚜렷한 변화가 없으며, 52mg/kg군의 동물 비장 지수는 대조군에 비해 뚜렷하게 증가했다(P<0.05).
Figure pct00041
2. Lewis 폐암 종양 마우스의 흉선 지수 및 비장 지수에 대한 영향
표 41의 결과에서 보다시피, 양성 대조약 시클로포스파미드군의 동물 비장 지수는 대조군에 비해 현저하게 떨어졌다(P<0.01). 캐리마이신 13, 26, 52mg/kg군의 동물 비장 지수 및 흉선 지수는 대조군에 비해 뚜렷한 변화가 없다.
Figure pct00042
3. Lewis 폐암 종양 마우스의 NK 세포 활성에 대한 영향
표 42의 결과에서 보다시피, 양성 대조약 시클로포스파미드군의 동물 NK 세포 활성 지수는 대조군에 비해 현저하게 떨어졌다(P<0.05). 캐리마이신 13, 26mg/kg군의 동물 NK 세포 활성은 대조군에 비해 현저하게 증가했다(P<0.01).
Figure pct00043
4. Lewis 폐암 종양 마우스의 림프 세포 증식 활성에 대한 영향
표 43의 결과에서 보다시피, 양성 대조약 시클로포스파미드군의 동물 림프 세포 활성은 뚜렷하게 억제된다(P<0.05). 캐리마이신 13, 26mg/kg군의 동물 림프 세포 활성은 대조군에 비해 현저하게 증가했다(P<0.05, P<0.01).
Figure pct00044
5. A549 폐암 종양 마우스의 비장 지수에 대한 영향
표 44의 결과에서 보다시피, 양성 대조약 시클로포스파미드군의 동물 비장 지수는 대조군에 비해 현저하게 떨어졌다(P<0.01). 캐리마이신 13, 26, 52mg/kg군의 동물 비장 지수는 대조군에 비해 뚜렷한 변화가 없다.
Figure pct00045
시험예 3. 임상 시험
본 발명은 복수 개의 임상 발병 사례를 수집하였으며, 일부 환자는 유방암 환자로, 통증이 심했다. 캐리마이신 정제(실시예 1에서 제조)를 배합하여 2개 치료 과정(1개 치료 과정은 30일이며, 하루 2알씩, 경구 투여한다)을 복용한 다음, 주치의가 종양 덩어리가 작아 졌다는 진단을 내렸다. 환자도 통증 완화를 느꼈으며, 컨디션도 아주 좋아졌다.
일부 환자는 신장 투명세포 선암 환자로, 신장 그림자를 촬영해보면, 신장 종양이 왼쪽 신장 부위의 2/3를 차지하며, 병리학 결과는 신장 투명 세포 선암 초기였다. 캐리마이신 정제(실시예 1에서 제조)를 배합하여 2개 치료 과정(1개 치료 과정은 30일이며, 하루 2알씩, 경구 투여한다)을 복용한 다음, 주치의가 신장 종양 면적이 작아 졌다는 진단을 내렸으며, 환자도 통증 완화를 느꼈으며, 현저히 개선됐다.
일부 환자는 신경교종 환자로, 뇌조직이 침윤 파괴된 것이 진단되었으며, 주위의 뇌수종도 뚜렷하고, 두통, 시력감퇴 등 증상이 있었다. 캐리마이신 정제(실시예 1에서 제조)를 배합하여 2개 치료 과정(1개 치료 과정은 30일이며, 하루 2알씩, 경구 투여한다)을 복용한 다음, 주치의가 수종이 경감되었다는 진단을 내렸으며, 환자도 증상이 경감되고, 현저히 호전된 것을 느꼈다.
일부 환자는 림프종 환자로, 경부 림프절이 비대하고, 대추 모양이며, 중간 경도로, 비교적 팽팽했다. 캐리마이신 정제(실시예 1에서 제조)를 배합하여 3개 치료 과정(1개 치료 과정은 30일이며, 하루 2알씩, 경구 투여한다)을 복용한 다음, 주치의가 림프절 비대 증상이 경감되고, 대두 콩 크기로 줄어들었다는 진단을 내렸으며, 환자도 증상이 경감되고, 종양이 더 이상 많이 딱딱하지 않고, 현저히 호전된 것을 느꼈다.
일부 환자는 결장암 환자로, 종양 또는 망막, 주변 조직으로 침윤된 종양으로 진단되었으며, 단단한 조직이며, 형체가 불규칙적이었다. 캐리마이신 정제(실시예 1에서 제조)를 배합하여 1개 치료 과정(1개 치료 과정은 30일이며, 하루 2알씩, 경구 투여한다)을 복용한 다음, 주치의는 종양 덩어리가 감소하였다고 진단하였으며, 환자도 현저히 호전된 것을 느꼈다.
일부 환자는 백혈병 환자로, 상이한 정도로 빈혈, 출혈, 감염 발열 및 간, 비장, 림프절 비대 및 골격 통증이 있었다. 캐리마이신 정제(실시예 1에서 제조)를 배합하여 3개 치료 과정(1개 치료 과정은 30일이며, 하루 2알씩, 경구 투여한다)을 복용한 다음, 주치의가 증상이 경감되었다는 진단을 내렸으며, 환자도 현저히 호전된 것을 느꼈다.
일부 환자는 위선암 환자로, 위가 살살 아프고, 위 속에서 음식물이 발효되는 느낌이 있으며, 팽만감이 있고, 위산이 가끔씩 목구멍으로 역류하여, 목이 뜨겁고 매우 메스꺼우며, 몸에서 열과 식은 땀이 나는 증상이 있었으며, 병원에서 검사한 결과 위선암 진단을 받았다. 캐리마이신 정제(실시예 1에서 제조)를 배합하여 3개 치료 과정(1개 치료 과정은 30일이며, 하루 2알씩, 경구 투여한다)을 복용한 다음, 주치의가 증상이 경감되었다는 진단을 내렸으며, 환자도 현저히 호전된 것을 느꼈다.
일부 환자는 식도암 환자이며, 식도 바륨 복용 후 X선 촬영에서, 식도 협착, 식도벽 거침, 점막 파괴를 발견하였으며, 환자가 삼키는데 어려움을 느꼈다. 캐리마이신 정제(실시예 1에서 제조)를 배합하여 2개 치료 과정(1개 치료 과정은 30일이며, 하루 2알씩, 경구 투여한다)을 복용한 다음, 주치의가 증상이 경감되었다는 진단을 내렸으며, 환자도 현저히 호전된 것을 느꼈다.
일부 환자는 췌장암이 진단되었으며, 사지가 나른하고, 식욕 부진에 구역, 구토, 설사 증상이 있었다. 캐리마이신 정제(실시예 1에서 제조)를 배합하여 2개 치료 과정(1개 치료 과정은 30일이며, 하루 2알씩, 경구 투여한다)을 복용한 다음, 주치의가 증상이 경감되었다는 진단을 내렸으며, 환자도 현저히 호전된 것을 느꼈다.
일부 환자는 전립선암이 진단되었으며, 점차 증대된 전립선 선체가 환자의 요로를 압박하여 배뇨의 어려움을 야기하며, 이는 소변 줄기가 가늘고, 멀리 나가지 않으며, 배뇨 속도가 느리고, 간헐뇨, 배뇨 후 방울 흐름, 잔뇨감, 배뇨 어려움 등으로 나타나며, 이외에도 빈뇨, 급박뇨, 야간 빈뇨, 심지어 요실금 등 증상이 나타날 수 있다. 종양이 직장을 압박하면 배변 어려움 또는 장경색을 일으킨다. 캐리마이신 정제(실시예 1에서 제조)를 배합하여 2개 치료 과정(1개 치료 과정은 30일이며, 하루 2알씩, 경구 투여한다)을 복용한 다음, 주치의가 증상이 경감되었다는 진단을 내렸으며, 환자도 현저히 호전된 것을 느꼈다.
일부 환자는 폐암, 간암, 골암 말기로 이전된 환자로, 구토, 기침, 뼈아픔으로 입원하였고, 캐리마이신 정제(실시예 1에서 제조) 4박스를 복용한 다음, 폐 종양이 석회화되어, 폐 종양이 사라진 것을 발견했다.
일부 환자는 폐암 환자이며, 우측 폐 상엽에 병변이 있었으며, 호흡 곤란, 심한 기침으로 인해 병원을 방문했다. CT 검사: 우측 상엽 주변에 병변이 있으며, 4.3*4.6 원형 덩이리 그림자가 촬영되었으며; 이어서 진행한 증강 CT에서 종양 덩어리는 4.0*4.4였으며, 나머지는 큰 변화가 없었다. 그 후 캐리마이신을 복용하였으며, 캐리마이신을 하루에 2알(실시예 1에서 제조)씩 14일간 복용한 다음, 하루 1알씩 테스트일까지 복용하였으며; 보조로 송아지 티모신을 하루에 6알씩 복용했다. 그 후 CT 검사 결과, 원형 종양 덩어리 그림자가 현저하게 줄었으며, 환자의 컨디션이 양호하고, 불편함이 없었다.
일부 환자는 자궁경부암 환자이며, 이미 폐, 뼈, 장과 같은 기타 부위로 전이되었으며, CT 검사 결과 폐에 흉수액 및 복수 개의 결절이 있었으며, 호흡 곤란과 발열이 있었고, 이미 화학 요법과 방사선 치료를 마쳤으며, 그 후 캐리마이신 정제(실시예 1에서 제조)를 2개 치료 과정 복용하고, CT 재검사에서 흉수액이 사라지고, 결절이 작아졌다.
시험예 4. 독리학 시험
1. 급성 독성 시험
1.1 시험 목적
캐리마이신을 1회 복용한 강아지의 독성 반응 심각 정도, 사망상황 및 반수 치사 농도 LD50을 측정하여, 장기 독성 시험에 기준을 제공한다.
1.2 시험 대상 약품
명칭: 캐리마이신
역가: 927U/mg
제조방법: 적당량을 취하여 무게를 달고 분말로 연마하고, 적당량의 0.5% 카르복시메틸셀룰오스 용액을 첨가하고, 계속하여 골고루 교반하여, 100mg/ml를 경구 투여한다.
용제: 0.5% 카르복시메틸셀룰오스 용액
1.3 동물: 강아지
출처: 중국 의료 과학원 푸와이 심혈관 병원 동물 사육장
견종: 잡종
승인번호: 베이징 동물 관리 견자(犬字) (96) 제024호
무게: 15~20kg
성별: 수컷
공복시간: 12시간
그룹 당 동물 수: 1~2마리
1.4 시험 방법
예비시험에서, 강아지에게 2,000mg/kg 및 3,000mg/kg을 위관영양 투여하여 동물 사망이 발생하지 않았으며, 심각한 독성 반응이 일어나지 않았다. 신약 가이드라인에 따라, 약물 양을 50% 증가하여, 4,500mg/kg 투여하였고, 몸무게에 따라 캐리마이신의 용량을 취하고, 0.5% CMC와 충분히 현탁시키고, 위관영양 투여하고(시험 전날 저녁에 금식한다), 약물 투여 후 1주일 동안 독성 반응 및 사망 상황을 관찰한다.
1.5 강아지 경구 투여 후 급성 독성
1.5.1 독성 반응
예비시험의 용량은 2,000mg/kg 및 3,000mg/kg이며, 1차 위관 투여 후, 잠시 구토 반응이 있었을 뿐이며, 약물 찌꺼기, 위액 및 식물 찌꺼기를 뱉어냈다. 구토 반응 이외에, 기타 독성 반응을 보이지 않았다. 실제 시험에서, 강아지 두 마리에게 각각 4,500mg/kg을 투여하였고, 나타난 독성 반응은 여전히 구토 등 소화기관 증상이며, 설사 또는 묽은 변을 보이지 않았으며, 구토 반응 이후에, 기타 뚜렷한 독성 증상이 나타나지 않았다.
1.5.2 반수치사량
두 차례 예비시험의 위관 투여 용량은 2,000mg/kg 및 3,000mg/kg이며, 구토 등 소화기관 증상만 나타났다. 신약 심사 가이드라인의 원칙에 근거하여, 50% 체증법 요구에 따라, 실제 시험에서 투여 용량은 4,500mg/kg이었다. 위관 약물 투여 후, 강아지 두 마리 모두 구토 반응이 있었으며, 기타 독성 반응을 보이지 않았다. 강아지의 캐리마이신 경구 투약에서 LD50＞4500mg/kg이다.
Figure pct00046
2. 설치류 동물에 대한 캐리마이신의 소핵검사
2.1 시험 목적
포유류 동물의 체세포에 대한 약물의 돌연변이 유발 가능성을 테스트하고, 임상 약물 사용에 근거를 제공한다.
2.2 시험 대상 약품
명칭: 캐리마이신
함량: 역가 927U/mg
제조방법: 용량 크기에 따라 적정량의 캐리마이신 미세 분말을 취하여 페슬로 갈아서, 적정량의 0.5% 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨 용액을 첨가하여, 현탁액을 제조하고, 냉장고에 4
Figure pct00047
의 온도로 저장한다. 음성대조군은 동일한 양의 0.5% 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨 용액을 사용한다. 양성대조군은 적정량의 주사용 시클로포스파미드를 취하고, 사용 직전에 생리식염수에 용해시켜 60mg/kg의 용액을 제조한다.
용매, 부형제: 생리식염수, 0.5% 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨 용액
대조품: 양성대조군: 60mg/kg의 시클로포스파미드 용액
음성대조군: 0.5% 카르복시메틸셀룰로오스나트륨
2.3 동물
중국 제약 및 생물학적 제품 검정 연구소에서 제공한, 성적으로 성숙한 수컷 NIH 마우스를 사용한다.
2.4 시험 방법
그룹 당 마우스 6마리 사용. 예비시험에서 용량, 투여 횟수, 골수 샘플링 시간을 선택한다.
Figure pct00048
용량은 1/2LD50을 기준으로 점차 감소하며, 약물 투여는 한 번 진행하며, 예비시험 결과에 따라 골수 샘플링 시간은 24시간으로 선택한다.
2.4.1 용량
최소 3개의 용량 그룹은 각각: 2000mg/kg, 1000mg/kg, 500mg/kg
희석단계: 0.5
투여횟수: 한 번에 경구 투여
2.4.2 경로
경구 (위관) 투여
2.4.3 골수 샘플링 시간: 투여 후 24시간
2.4.4 샘플 제조: 동물 희생, 도말, 고정, 염색
2.4.5 방법:
경추 탈골법으로 마우스를 희생시키고, 흉골을 채취하고, 근육을 제거하고, 부착물을 거즈로 깨끗하게 닦는다. 골수를 직접 절제하여, 흉골체를 절단하고, 골수강을 노출시키고, 골수를 사전에 송아지 혈청을 준비해둔 글라스 슬라이드에 놓고 골고루 혼합하여 도말한다. 건조 후 메탄올에 10분간 넣어 고정하고, 건조한 다음, Giemsa 염색한다. 현미경으로 각각의 마우스에서 적혈구 윤곽이 온전한 1,000개 정도의 다염성 적혈구를 검사하고, 소핵이 나타난 빈도 및 적혈구에서의 다염성 적혈구 비율을 계산한다.
2.5 마우스 다염성 적혈구 소핵시험에서의 캐리마이신 시험결과는 다음 표와 같다.
2.5.1 다염성 적혈구의 소핵 발생률
Figure pct00049
2.5.2 다염성 적혈구와 정상 적혈구의 비율
Figure pct00050
2.5.3 마우스 골수의 다염성 적혈구 중 소핵에 대한 캐리마이신의 영향
Figure pct00051
Heddle 등은 16종의 마우스 골수 다염성 적혈구의 자발적 소핵 비율은 3.1%라고 보도했으며, 본 연구에서, 음성대조군의 평균 값은 2.63‰이고, 캐리마이신 약물의 3가지 용량군은 음성대조군에 비해, 다염성 적혈구 소핵 비율은 뚜렷하게 증가하지 않았다(P＞0.05). 다염성 적혈구와 정상 적혈구의 비율은 크게 감소하지 않았으며, 변동은 정상 범위에 있다. 시클로포스파미드 음성대조군에 비해 양성대조군의 다염성 적혈구 소핵은 매우 뚜렷하게 증가했으며(P＜0.01), 이의 소핵 비율은 양성대조군의 16.85배이다.
2.6 결론
상기 결론은, 캐리마이신은 염색체 절단제가 아님을 나타낸다. 사용된 용량에서, 세포의 정상적인 유사 분열에 영향을 미치지 않으며 골수에 대해 억제 작용을 일으키지 않는다.
상기 내용은 본 발명의 비교적 바람직한 실시예일 뿐, 어떠한 형식으로든 본 발명을 한정하는 것은 아니며, 본 발명은 비교적 바람직한 실시예를 들어 상기와 같이 공개했지만, 본 발명을 한정하는 것은 아니며, 본 발명을 익숙히 아는 기술자가 본 발명의 기술 방안을 벗어나지 않는 범위 내에서, 상기 제시된 기술 내용을 적용하여 일부를 변경하거나 동등한 변화를 주는 동등한 실시예로 수정할 경우, 본 발명의 기술 방안의 내용을 벗어나지 않는 한, 본 발명의 기술적 본질에 근거하여 상기 실시예에 대해 임의의 간단한 수정, 동등한 변화 및 수정을 할 경우, 모두 본 발명의 방안에 포함된다.

Claims (10)

  1. 종양을 치료 및/또는 예방하는 약품 제조에서의 캐리마이신 및 이의 약학적으로 수용 가능한 염의 응용.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 종양은 고형 종양 및 비고형 종양을 포함하는 것을 특징으로 하는 응용.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 고형 종양은 양성 고형 종양 및 악성 고형 종양을 포함하고; 상기 비고형 종양은 림프종 또는 백혈병인 것을 특징으로 하는 응용.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 악성 고형 종양은 유방암, 간암, 폐암, 신장암, 뇌종양, 자궁경부암, 전립선암, 췌장암, 식도암, 위암 또는 결장암이며;
    바람직하게, 상기 뇌종양은 신경교종 또는 수막종이고, 상기 위암은 위선암인 것을 특징으로 하는 응용.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약물은 캐리마이신 및 이의 약학적으로 수용 가능한 염과 약학적으로 수용 가능한 보조재료로 제조된 각종 제형인 것을 특징으로 하는 응용.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약물은 캐리마이신 및 이의 약학적으로 수용 가능한 염, 항종양 약물과 약학적으로 수용 가능한 보조재료로 제조된 각종 제형인 것을 특징으로 하는 응용.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약물은 캐리마이신 및 이의 약학적으로 수용 가능한 염의 제1 약제와 항종양 약물을 포함하는 제2 약제의 조합인 것을 특징으로 하는 응용.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서,
    상기 항종양 약물은 화학 요법, 방사선 요법, 표적 치료 및/또는 면역 요법 치료 약물인 것을 특징으로 하는 응용.
  9. 제5항 또는 제6항에 있어서,
    상기 약물의 용량은 5~1500mg이고; 바람직하게는 50~1000mg이며; 더 바람직하게는 100~400mg인 것을 특징으로 하는 응용.
  10. 제5항 또는 제6항에 있어서,
    상기 제1 약제의 용량은 5~1500mg이고; 바람직하게는 50~1000mg이며; 더 바람직하게는 100~400mg인 것을 특징으로 하는 응용.
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