KR20200028378A - 모린을 유효성분으로 포함하는 패혈증 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

모린을 유효성분으로 포함하는 패혈증 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 모린을 유효성분으로 포함하는 패혈증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 모린을 유효성분으로 포함하는 패혈증의 예방 또는 개선용 식품 조성물 및 사료 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 모린 또는 모린 수화물은 패혈성 동물모델에서 체중과 생존율을 향상시키고, RBCs/WBCs 손상을 회복하며, 대식세포의 세포 생존율을 향상시키고, 혈청 내 파라미터 또는 조직병리학적으로 간손상을 억제한다. 또한, 본 발명에 따른 모린 또는 모린 수화물은 항산화 방어시스템을 활성화 하고, 세포에서의 ROS를 낮춘다. 또한, 모린 또는 모린 수화물은 염증을 감소시키며, AKT 신호 전달을 통한 세포 생존을 약화시키고 NF-κB 복합체의 활성화를 유도하고, caspase-1 매개 경로를 통하여 파이롭토시스(pyroptosis)를 활성화시킨다. 이에, 본 발명에 따른 모린 또는 모린 수화물은 패혈증 또는 패혈성 쇼크의 치료 또는 예방에 효과적인 천연물 치료제로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

모린을 유효성분으로 포함하는 패혈증 예방 또는 치료용 조성물 {Composition for preventing or treating sepsis Comprising Morin}
본 발명은 모린을 유효성분으로 포함하는 패혈증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 모린을 유효성분으로 포함하는 패혈증의 예방 또는 개선용 식품 조성물 및 사료 조성물에 관한 것이다.
패혈증(sepsis)은 병원성 그람 음성 세균이 생체에 감염된 경우 세포벽 성분인 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS)가 독소로 작용하여 생체의 면역체계가 과도하게 활성화됨으로써 유발되는 염증 반응으로서, 전신에 감염증을 일으키거나 증상이 심할 경우 쇼크를 동반하기도 한다. 구체적으로 패혈증은 악성종양, 폐렴, 백혈병, 악성림프종, 후천성면역부전증후군(AIDS), 교원병, 신부전, 간질환, 뇌혈관장해, 당뇨병 등의 기초질환을 가진 환자나 고령자, 미숙아 같은 체액성면역부전 또는 세포성면역부전을 가진 저항력이 약한 숙주가 부신스테로이드나 항종양제의 화학요법, 코발트 조사 등의 방사선치료 또는 유치카테테르, 혈액투석, 장기이식, 심장수술 등의 처치, 수술을 받은 경우에 주로 발병한다. 패혈증은 병원 중환자 병동에 입원한 환자가 사망하는 주요한 원인이 되며, 이에 의한 치사율이 보통 30% 이상인 매우 심각한 질병이다. 의학기술의 발전에도 불구하고 아직도 전 세계적으로 수술 후유증으로 감염이 되어 패혈증이 발생하는 경우가 많으며, 신생아나 노인들과 같이 체내의 면역력이 약한 사람이 감염되었을 경우 패혈증으로 진행되는 경우도 많다. 대표적으로, 신생아 패혈증의 경우 만삭아 1,000명 중 3명 정도가 발생하는 것으로 알려져 있고, 미숙아는 발병률이 3 내지 4배 증가하는 것으로 알려져 있다. 패혈증에 걸렸을 경우 대게 항생제 치료를 받게 되지만, 적절한 처치가 늦어져 균들이 많이 증식했을 경우나 항생제에 내성이 강한 균주에 의해 감염이 되었을 경우에는 항생제만으로는 효과적인 치료를 할 수 없으며, 다양한 항생제에 대한 내성을 갖는 병원균이 점차 증가하고 있어 새로운 패혈증 치료제의 개발이 시급하다.
Klebsiella species, Escherichia coli 및 기타 장내 세균을 포함한 ESBL (Extended-spectrum β-lactamase)-생산 미생물이 패혈증의 병원균일 수 있다. 이 중 ESBL-생산 E. coli는 항균제에 대한 다약제 내성을 부여하는 CTX-M β-lactamase 변이와 관련된 감염의 중요한 원인이다. 최근 ESBL 관련 감염의 발병률이 세계적으로 크게 증가하였다.
모린 수화물(Morin Hydrate) (3,5,7,2', 4'-pentahydroxyflavone)은 폴리페놀 화합물로서, Maclura pomifera, Maclura tinctoria, Morus alba 및 Psidium guajava의 식물에서 분리되었다. 항산화, 항암 등의 다양한 약리학적 활성을 나타내는 것으로 보고되고 있다. 모린 수화물은 당뇨병, 간 손상, 산화 스트레스를 예방하고 항-돌연변이 및 항-염증 활성을 위하여 이용되는 가장 일반적인 플라보노이드 중 하나이다.
그러나 모린 수화물이 EBSL의 제거 (clearance)에 미치는 영향은 아직 밝혀지지 않았다.
이에 따라, 본 발명자들은 in vitro 및 in vivo 동물 모델에서 ESBL가 유발된 조건에서 모린 수화물 (Morin hydrate, MH)의 전처리 효과를 평가하고, in vivo 동물모델에서 패혈증 유발 후 생존률에 대한 모린 수화물의 후처리 효과를 확인하였다.
이에 본 발명의 목적은, 모린(Morin, 2-(2,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxychromen-4-one), 이의 염 또는 모린 수화물(Morin hydrate)을 유효성분으로 포함하는 패혈증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 모린(Morin, 2-(2,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxychromen-4-one), 이의 염 또는 모린 수화물(Morin hydrate)을 유효성분으로 포함하는 패혈증의 예방 또는 개선용 식품 조성물 및 사료 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 모린(Morin, 2-(2,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxychromen-4-one), 이의 염 또는 모린 수화물(Morin hydrate)을 유효성분으로 포함하는, 패혈증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 패혈증은 ESBL (Extended-Spectrum Beta-Lactamase) 생산균에 의하여 발병된 것일 수 있다.
또한, 상기 모린(Morin, 2-(2,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxychromen-4-one), 이의 염 또는 모린 수화물(Morin hydrate)은 AKT의 발현을 활성화시키고, 내성 인자 Myd88 및 NF-κB 매개 염증 반응을 억제하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 모린(Morin, 2-(2,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxychromen-4-one), 이의 염 또는 모린 수화물(Morin hydrate)을 유효성분으로 포함하는 패혈증 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
더욱이 본 발명은 모린(Morin, 2-(2,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxychromen-4-one), 이의 염 또는 모린 수화물(Morin hydrate)을 유효성분으로 포함하는 패혈증 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 모린 또는 모린 수화물은 패혈증 동물모델에서 체중과 생존율을 향상시키고, RBCs/WBCs 손상을 회복하며, 대식세포의 세포 생존율을 향상시키고, 혈청 내 파라미터 또는 조직병리학적으로 간손상을 억제한다. 또한, 본 발명에 따른 모린 또는 모린 수화물은 항산화 방어시스템을 활성화 하고, 세포에서의 ROS를 낮춘다. 또한, 모린 또는 모린 수화물은 염증을 감소시키며, AKT 신호 전달을 통한 세포 생존을 약화시키고 NF-κB 복합체의 활성화를 유도하고, caspase-1 매개 경로를 통하여 파이롭토시스(pyroptosis)를 활성화시킨다. 이에, 본 발명에 따른 모린 또는 모린 수화물은 패혈증 또는 패혈성 쇼크의 치료 또는 예방에 효과적인 천연물 치료제로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 ESBL로 유도된 랫트의 패혈증에 대하여 MH의 투여가 질병률 및 사망률을 향상시킨다는 것을 나타낸 도이다.
(A) 1.6X108 CFU/ml의 ESBL 균주로 유도된 랫트의 생론율을 10일간 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
(B) 10일간 체중의 변화를 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
(C) ESBL에 감염된 혈액을 사용하여 초기 3 시간 동안 수행된 RBC 및 WBC 염색의 현미경 사진을 나타낸 도이다.
유의한 차이를 p<0.05로 나타내었다.
도 2는 ESBL-유도된 패혈증에서 RAW 264.7 대식세포에서 모린 수화물이 세포 생존을 유도한다는 것을 나타낸 도이다.
(A) RAW 264.7에 대한 감염 다중도 (multiplicity of infection, MOI) 효과를 나타낸 도이다.
(B) MTT 결과를 나타낸 도이다.
(C) LDH 결과를 나타낸 도이다. ESBL-유도 패혈증에서 모린은 세포 생존을 증가시킨다.
(D) 폐, 신장 및 간 조직의 조직 절편을 관찰한 도이다 (scale bar 0.1mm).
유의한 차이는 대조군 vs ESBL으로 p <0.0001 = *, p <0.001 = θ; ESBL 대 MH 전처리 군은 p <0.0001 = #, p <0.001 = , p <0.05 = φ이다.
그림 3. MH로 전처리한 RAW 264.7 세포의 MDA, MPO 활성 및 세포 내 ROS 수준에 대한 ESBL의 영향을 평가한 결과이다.
(A) MDA 활성을 나타낸 도이다.
(B) MPO 활성은 혈청, 폐, 신장 및 간에서 측정한 결과를 나타낸 도이다.
(C) ROS 수준의 양을 H2DCFDA 염색에 의해 분석하고, 평균 형광 강도를 ImageJ 소프트웨어 (scale bar 0.1mm)로 분석하였다.
유의한 차이는 대조군 vs ESBL은 p <0.0001 = *, p <0.001 = θ; ESBL vs MH 전처리 군은 p <0.0001 = #, p <0.001 = , p <0.05 = φ이다.
도 4는 ESBL-유도된 패혈증에서 상이한 항산화 효소의 발현 양상을 나타낸 도이다.
(A) RAW 264.7; (B) 폐; (C) 신장; (D) 간.
웨스턴 블롯 결과는 전체 항산화 효소에 대한 상이한 발현 양상을 나타낸다. β-actin은 내부 대조군으로 사용되었다.
결과는 세 번의 독립적인 실험의 평균 ±SD를 나타내었다. 유의한 차이는 대조군 vs ESBL p <0.0001 = *, p <0.001 = θ; ESBL vs MH 전처리 군은 p <0.0001 = #, p <0.001 = , p <0.05 = φ이다.
도 5는 ESBL-유도된 패혈증에서, 아질산염 생산, 염증 및 DNA 손상 마커에 대한 모린의 효과를 나타낸 도이다.
(A) 아질산염 생산; (B) RAW 264.7; (D) Lung; (F) 신장; (H) 간.
모든 웨스턴 블롯은 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 농도계 분석에 의해 분석되었다. β-actin은 내부 대조군으로 사용되었다. 결과는 세 번의 독립적인 실험의 평균 ±SD를 나타낸다. 유의한 차이는 대조군 vs ESBL p <0.0001 = *, p <0.001 = θ; ESBL vs MH 전처리 군은 p <0.0001 = #, p <0.001 = , p <0.05 = φ이다.
도 6은 AKT 신호 전달을 활성화 하며, TLR / NF-kβ 발현을 통한 ESBL-유도된 패혈증 억제로 세포 생존이 증가함을 확인한 결과이다.
모든 웨스턴 블롯은 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 농도계 분석에 의해 분석되었다. β-actin은 내부 대조군로 사용되었다. 결과는 세 번의 독립적인 실험의 평균 ±SD를 나타낸다. 유의한 차이는 대조군 vs ESBL p <0.0001 = *, p <0.001 = θ; ESBL vs MH 전처리 군은 p <0.0001 = #, p <0.001 = , p <0.05 = φ이다.
도 7은 ESBL-유도된 패혈증에서 모린에 의한 염증성 사이토카인 및 염증의 억제효과를 나타낸 도이다.
(A) IL-1β의 수준을 RAW 264.7 세포 및 다른 기관에서 결정하였다.
(B) qRT-PCR을 이용하여 IL-1β 수준의 상대 배수 변화를 확인하였다.
(C) 주요 항 염증 마커 Caspase-1에 대한 웨스턴 블롯 및 농도계 분석 결과이다. 카스파제 1의 상대적 배수 변화를 qRT-PCR을 사용하여 확인하였다.
결과는 세 번의 독립적인 실험의 평균 ±SD를 나타낸다. 유의한 차이는 대조군 vs ESBL p <0.0001 = *, p <0.001 = θ; ESBL vs MH 전처리 군은 p <0.0001 = #, p <0.001 = , p <0.05 = φ이다. qRT-PCR의 유의성은 p <.05 = *.
도 8은 패혈증 유도 후 MH 투여에 의한 생존율을 나타낸 도이다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 모린(Morin, 2-(2,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxychromen-4-one), 이의 염 또는 모린 수화물(Morin hydrate)을 유효성분으로 포함하는 패혈증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
모린(Morin, 2-(2,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxychromen-4-one), 이의 염 또는 모린 수화물(Morin hydrate, 3,5,7,2', 4'-pentahydroxyflavone))은 Maclura pomifera (Osage orange), Maclura tinctoria (old fustic), Morus alba (Mulberry) 또는 Psidium guajava (common guava)의 열매, 잎 등에서 추출한 것일 수 있으며, 상기 모린 또는 모린 수화물은 다양한 식물로부터 추출할 수 있으며, 그 식물의 종류를 제한하지 않는다.
본 발명의 모린은 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산, 아인산 등과 같은 무기산류, 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류 등과 같은 무독성 유기산, 아세트산, 안식향산, 구연산, 젖산, 말레인산, 글루콘산, 메탄설폰산, 4-톨루엔설폰산, 주석산, 푸마르산 등과 같은 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염의 종류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트, 만델레이트 등을 포함한다.
본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법으로 제조할 수 있으며, 예를 들면 모린 유도체를 메탄올, 에탄올, 아세톤, 메틸렌클로라이드, 아세토니트릴 등과 같은 유기용매에 녹이고 유기산 또는 무기산을 가하여 생성된 침전물을 여과, 건조시켜 제조하거나, 용매와 과량의 산을 감압 증류한 후 건조시켜 유기용매 하에서 결정화시켜셔 제조할 수 있다.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 음염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.
나아가, 본 발명은 상기 모린 및 이의 약학적으로 허용가능한 염뿐만 아니라, 이로부터 제조될 수 있는 용매화물, 광학 이성질체, 수화물 등을 모두 포함한다.
또한, 상기 모린 또는 모린 수화물은 화학적, 또는 생물학적으로 합성될 수 있으며, 그 합성 방법을 제한하지 않는다.
본 발명에서 패혈증은 미생물에 감염되어 전신에 심각한 염증 반응이 나타나는 상태를 말한다. 체온이 38도 이상으로 올라가는 발열 증상 혹은 36도 이하로 내려가는 저체온증, 호흡수가 분당 24회 이상으로 증가(빈호흡), 분당 90회 이상의 심박수(빈맥), 혈액 검사상 백혈구 수의 증가 혹은 현저한 감소 중 두 가지 이상의 증상을 보이는 경우, 이를 전신성 염증 반응 증후군(systemic inflammatory response syndrome; SIRS)이라고 부른다. 이러한 전신성 염증 반응 증후군이 미생물의 감염에 의한 것일 때 패혈증이라고 한다. 신체의 감염병소에서 병원균이 지속적 또는 단속적으로 혈류에 들어와 여러 장기조직에 정착하여 병소를 만들고 심한 전신 증상을 보이는 것이다. 원인균으로는 포도상구균, 연쇄상구균, 대장균, 녹농균, 결핵균, 폐렴간균, 진균, 혐기성균 등이 있다.
본 발명에서 패혈증은 패혈증 또는 패혈성 쇼크로부터 유도된 다양한 합병증을 모두 포함하는 개념이다.
본 발명에서 사용되는 용어인 용어 "예방"은 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 패혈증을 억제하거나 패혈증의 발병을 지연시키는 모든 행위를 말한다. 상기 용어 "치료"는 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 패혈증의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다.
본 발명에서 모린 또는 모린 수화물은 패혈성 랫트에서 체중과 생존율을 향상시키고 (실시예 2), RBCs/WBCs 손상을 회복하며 (실시예 3), 대식세포의 세포 생존율을 향상시키고 (실시예 4), 혈청 내 파라미터 또는 조직병리학적으로 간손상을 억제한다 (실시예 5, 및 6). 또한, 본 발명에 따른 모린 또는 모린 수화물은 항산화 방어시스템을 활성화 하고, 세포에서의 ROS를 낮춘다 (실시예 7 및 8). 또한, 모린 또는 모린 수화물은 in vitro 및 in vivo 에서 염증을 감소시키며 (실시예 9), AKT 신호 전달을 통한 세포 생존을 약화시키고 NF-κB 복합체의 활성화를 유도하고 (실시예 10), caspase-1 매개 경로를 통하여 파이롭토시스(pyroptosis)를 활성화시킨다 (실시예 11).
본 발명에서, 상기 약학 조성물은 패혈증의 예방 또는 치료방법에 이용될 수 있으며, 구체적으로 상기 예방 또는 치료방법은 패혈증이 발병되거나 또는 발병될 것으로 예상되는 개체에 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 "투여"란, 적절한 방법으로 개체에게 상기 조성물을 도입하는 것을 의미한다.
본 발명의 용어 "개체"란, 패혈증이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 동물을 의미하고, 구체적인 예로, 인간을 포함한 포유동물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명의 용어, "약학적으로 유효한 양"이란, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 예를 들면, 상기 조성물은 유효성분으로 1일 0.01 내지 500 mg/kg으로, 구체적으로 10 내지 100 mg/kg의 용량으로 투여할 수 있으며, 상기 투여는 하루에 한 번 또는 수회 나누어 투여할 수도 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 본 발명의 모린 또는 모린 수화물을 0.001 내지 50% 중량 백분율로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 패혈증의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 상기 기재한 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 상기 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 구체적으로, 제형화할 경우 통상 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제 등도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 첨가하여 조제될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제를 포함한다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 상기 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명은 모린(Morin, 2-(2,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxychromen-4-one), 이의 염 또는 모린 수화물(Morin hydrate)을 유효성분으로 포함하는, 패혈증의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어, "개선"이란, 상기 조성물의 투여로 패혈증이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 용어 "식품"은 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료, 비타민 복합제, 건강 기능 식품 및 건강 식품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.
상기 건강 기능(성) 식품(functional food)이란, 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)과 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미한다. 여기서 "기능(성)"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조 가능하며, 상기 제조시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 상기 식품의 제형 또한 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고 휴대성이 뛰어나므로, 본 발명의 식품은 패혈증의 예방 또는 개선의 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.
상기 건강 식품(health food)은 일반식품에 비해 적극적인 건강유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품(health supplement food)은 건강 보조 목적의 식품을 의미한다. 경우에 따라, 건강 기능 식품, 건강 식품, 건강 보조 식품의 용어는 혼용될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 패혈증의 예방 또는 개선에 대하여 높은 효과를 기대할 수 있으므로, 매우 유용하게 사용될 수 있다.
*상기 식품 조성물은 생리학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는데, 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다.
또한, 상기 식품 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu), 크륨(Cr) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다.
또한, 상기 식품 조성물은 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 포함할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.
본 발명의 모린 또는 이의 염, 또는 모린 수화물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 식품 조성물은 식품 또는 음료에 대하여 50 중량부 이하, 구체적으로 20 중량부 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 장기간 섭취할 경우에는 상기 범위 이하의 함량을 포함할 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물의 일 예로 건강음료 조성물로 사용될 수 있으며, 이 경우 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드; 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강음료 조성물 100 mL 당 일반적으로 약 0.01 ∼ 0.04 g, 구체적으로 약 0.02 ∼ 0.03 g이 될 수 있다.
상기 외에 건강음료 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산, 펙트산의 염, 알긴산, 알긴산의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 또는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일주스, 과일주스 음료, 또는 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강음료 조성물 100 중량부당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명의 식품 조성물은 패혈증의 예방 또는 개선 효과를 나타낼 수 있다면 다양한 중량%로 포함할 수 있으나, 구체적으로 본 발명의 모린 또는 이의 염, 또는 모린 수화물을 식품 조성물의 총 중량 대비 0.00001 내지 100 중량% 또는 0.01 내지 80 중량%로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 모린(Morin, 2-(2,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxychromen-4-one), 이의 염 또는 모린 수화물(Morin hydrate)을 유효성분으로 포함하는 패혈증의 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다.
상기 사료는 가축에 급여되는 일반적인 사료로, 용어 "가축"은 집에서 기르는 짐승, 즉 포유류, 가금류 등을 의미하는 것이다. 본 발명에서 상기 포유류는 소, 돼지, 염소, 양, 말 등을 예로 들 수 있으며, 가금류로는 닭, 오리, 칠면조 등을 예로 들 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 사료 조성물은 가축의 종류에 따라 급여되는 일반적인 기초사료들을 포함할 수 있다. 이러한 기초사료들은 가축의 종류에 따라서 그 필요한 성분 및 조성 그리고 적합한 조성 비율이 모두 당업계에 공지되어 있으며, 또한 시판되고 있기 때문에 당업자라면 누구나 매우 용이하게 이를 제조 또는 구입하여 사용할 수 있을 것이다.
구체적으로 기초사료로는 가축의 종류에 따라 적합한 전분함유 물질, 단백질 함유 물질, 지방 함유 물질, 비타민 함유 물질, 무기질 함유 물질, 산화 방지 물질, 항생제 등의 일부 또는 전부를 포함하여 구성될 수 있다.
상기 전분 함유 물질은 그것이 사육동물의 성장을 유지할 수 있는 한 모두 사육동물의 기초사료에 포함될 수 있는데, 이러한 전분 함유 물질은 일반적으로 옥수수, 콩, 밀, 수수, 보리, 귀리 등으로부터 얻어진다. 적합한 전분 함유 물질로서는 옥수수 분쇄물이나 분말, 귀리 분쇄물이나 분말, 콩 분쇄물이나 분말, 밀 분쇄물이나 분말 등을 들 수 있다. 바람직한 적합한 전분 함유 물질은 귀리 분말, 옥수수 분쇄물, 밀 분쇄물, 콩 분말 등이다. 이러한 전분 함유 물질은 사육동물의 성장을 효과적으로 유지할 수 있다면, 그 농도는 특별히 제한되지 않는다. 일반적으로 전분 함유 물질은 약 30~80중량%의 범위로 기초사료에 포함될 수 있다.
단백질 함유 물질도 사육동물의 성장을 유지시킬 수 있는 한, 가축의 기초사료에 포함될 수 있다. 경제적인 이유로 어분, 콩 분말 등과 같은 단백질 함유 물질이 사용되고 있는데, 다른 것들로서는 콩 단백질 농축물, 혈분, 혈장 단백질, 탈지유 건체물, 유(乳) 단백질 농축물, 옥수수 글루텐(Gluten) 분말, 밀 글루텐 분말, 이스트, 해바라기씨 분말 등을 들 수 있다. 바람직한 단백질 함유 물질은 어분, 혈분, 혈장 단백질, 콩 분말 등이다. 단백질 함유 물질도 사육동물의 성장을 효과적으로 유지할 수 있는 한, 사육동물의 기초사료에 포함되는 그것의 농도는 중요하지 않다. 일반적으로, 단백질 함유 물질은 약 10~50중량%의 범위로 기초사료에 포함될 수 있다.
상기 지방 함유 물질로는 라드(Lard), 우지, 콩기름, 레시틴, 코코넛유 등을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 지방 함유 물질 또한 사육동물의 성장을 유지할 수 있는 한 그 농도는 제한되지 않으며, 일반적으로 약 2~20중량의 범위로 기초사료에 포함될 수 있다.
또한 기초사료에는 수용성, 지용성 비타민과 미량의 무기물이 포함될 수 있다. 상기 비타민으로는 비타민 A, 비타민 D, 비타민 E, 비타민 K, 리보플라빈, 판토텐산(Pantothenic Acid), 나이아신, 비타민 B12, 엽산, 비오틴, 비타민 C 등이 사용될 수 있다. 미량의 무기물로서는 구리, 아연, 요오드, 셀렌, 망간, 철, 코발트 등이 사용될 수 있다. 여기서 "미량"이 의미하는 바는 가축의 기초사료에 사용된 이들 성분들의 양이 다른 성분들의 양보다 실질적으로 적은 것을 의미한다. 일반적으로, 비타민이나 무기질이 미량으로 기초사료에 포함될 경우에 조성물 총 중량에 약 0.0001~5중량%로 포함될 수 있다.
또한 기초사료에는 BHT(Butylated Hydroxytoluene), BHA(Butylated Hydroxyanisole), 비타민 E, 아스코르브산 등의 산화방지물질이 포함될 수 있으며, 이들 산화방지물질은 약 0.0001~1중량%의 극소량으로 포함될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실험예 1: 시약 및 항체
모린 수화물 (MH), Griess reagent, Leishman’stain, Giemsa stain, 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetra-zolium bromide (MTT)를 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)로부터 구매하였다. 소태아혈청은 미국 Gibco에서 공급 받았다.
Anti-β-actin, anti-Akt, anti-catalase, anti-SOD-1, anti-SOD-2, anti-Trx, anti-Prx, anti-glutathione reductase (GR), anti-HO-1, anti-p50, 및 anti-Myd88 항체는 Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, USA)로부터 구입하였다. Anti-iNOS, anti-eNOS, anti-PARP-1 및 anti-caspase-1 항체는 Abcam (Cambridge, MA, USA)에서 입수 하였다. Anti-COX-2 및 anti-p65 항체는 Cell Signaling Technology, Inc. (Beverly, MA, USA)에서 입수했다. 웨스턴 블롯 분석을 위한 HRP-결합 2차 항체는 Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, USA)로부터 구입하였다. 다른 모든 화학 물질은 달리 명시되지 않는 한 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA에서 구입하였다.
실험예 2: 박테리아 균주, 배양, 세포, 동물 및 처리
ESBL (extended-spectrum beta-lactamases) 균주 3347은 2016년 대구에 소재한 경북대학교 병원으로부터 수득하였다. RAW 264.7, 쥐의 대식세포 세포주 (ATCC TIB-71)는 American Type Culture Collection (Manassas, VA)에서 구입하였다. 5 % CO2에서 37 ℃ 조건하에서, 10 % (v / v) 우태아혈청과 1 % 페니실린/스트렙토 마이신 (Invitrogen, Carlsbad, CA)가 보충된 DMEM (Sigma, St. Louis, MO, USA)에서 세포를 유지시켰다.
동물 실험은 Wister 수컷 랫트 (4 주령, 225-230 g)로 수행하였다. 동물은 인공 주-야 사이클, 적합한 온도 (22~24 ℃) 및 습도 하에 유지되었다. 랫트는 표준식이 및 물을 자유식이 하였다. 동물은 7 일 동안 실험실 조건에 적응하도록 하였다. 모든 기술은 국립 보건원 (National Institutes of Health)에 의해 출판된 실험실 동물의 관리 및 사용 안내서에 따라 수행하였다. 건강격리 기간 후, 전처리 실험을 위해 랫트를 무작위로 하기와 같이 5 개 그룹으로 나누고 각 그룹을 6 마리의 동물로 구성하였다:
Group I: 대조군 (control);
Group II: ESBL (1.6 x 108)로 처리;
Group III: MH (20 mg/kg per body weight)로 전처리(15일) 후 ESBL (1.6 x 108)로 처리;
Group IV: MH (40 mg/kg per body weight)로 전처리(15일) 후 ESBL (1.6 x 108)로 처리;
Group V: MH (40 mg/kg per body weight)로 전처리(15일)한 음성대조군.
후처리 실험을 위하여, 랫트를 7개의 그룹으로 분리하였으며, ESBL 유도 후 24시간 후 투여를 시작하였다. 구체적인 그룹은 하기와 같다;
Group I: 대조군 (n=8),
Group II: ESBL 처리 (n=8),
Group III: MH (20 mg/kg per body weight) 처리 (n=8),
Group IV: MH (40mg/kg per body weight) 처리 (n=8),
Group V: MH60mg/kg per body weight) 처리 (n=8),
Group VI: MH80mg/kg per body weight) 처리 (n=8)
Group VII: MH100mg/kg per body weight) 처리 (n=8).
실험예 3: 적혈구 및 백혈구 형태학적 평가
ESBL (1.6 x 108) 및 MH의 20 및 40 mg / kg의 MH 처리 후, 0 h에서 3 h동안 1 시간 간격으로 모든 그룹에서 RBC및 WBC의 형태학적 변화를 평가하였다. 복합 현미경(Nikon Eclipse TS200, Nikon Corp., Tokyo, Japan)하에서 슬라이드를 100 배 확대하여 관찰하였다.
실험예 4: 세포 생존을 위한 MTT 분석
세포 생존은 수용성 황색 염료 MTT의 불용성 청색 포르마잔으로의 환원으로 평가 하였다. 세포를 1x106세포/웰의 밀도로 96-웰 넓적바닥 마이크로타이터 플레이트에 접종하고 24 시간동안 점착시켰다. ESBL과 함께 인큐베이션하기 전, 세포를 다양한 농도의 MH (20 mg/kg 및 40 mg/kg)로 처리하였다.
질병 조건의 유도를 위하여, RAW 264.7 세포를 MOI 1:5로 ESBL와 함께 3 시간 동안 인큐베이션하였다. ESBL 처리 후, PBS에 용해 된 MTT 워킹 솔루션 (5 mg / ml) 10 μl를 4 시간 동안 각 웰에 첨가하였다. 배지를 흡인한 후 생성된 포르마잔 결정을 30 분 동안 50㎕ DMSO에 완전히 용해시키고, ELISA 플레이트 판독기를 사용하여 540nm에서 흡광도를 판독하였다. 세포 증식의 백분율은 다음과 같이 계산하였다: (처리 된 세포의 흡광도/대조군 세포의 흡광도) ×100.
실험예 5: LDH (Lactate dehydrogenase) 어세이
LDH 어세이는 RAW 264.7 세포에서의 ESBL의 독성 영향에 대한 MH의 세포 보호 활성을 측정하기 위해 수행하였다. LDH 분석 키트 (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)는 LDH에 의한 NAD (nicotinamide adenine dinucleotide)의 감소를 기반으로 하며, 이는 배지에 방출된 세포질 LDH 양의 함수로서 세포의 막 무결성을 결정한다. ESBL로 후-처리 한 직후, 배지를 수집하고 추가 절차를 제조자의 프로토콜에 따라 수행하였다. 생성된 적색 포르마잔 생성물을 490 nm 및 630 nm에서 샘플의 흡광도를 측정함으로써 방출된 총 LDH로서 정량화하였다 (Bio-Tek Instrument Co., WA, USA).
실험예 6: 조직병리학적 평가
MH (20 mg / kg)와 MH (40 mg / kg)를 15 일간 쥐 에게 복강 내 (IP) 투여한 다음 IP를 통해 ESBL 1.6 x 108세포를 감염시켰다. 폐, 신장 및 간 조직을 수집하고 4 % 중성-완충된 포르말린 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)에 고정시키고 파라핀 왁스에 매립시켰다. 5 마이크로미터 두께의 절편을 슬라이스하고 헤마톡 실린 (hematoxylin) 및 에오신 (heosin, HE)으로 염색하여 복합 현미경(Nikon Eclipse TS200, Nikon Corp., Tokyo, Japan)하에서 400 배 확대하여 조직 병리학적 상태를 평가하였다. (니콘 이클립스 TS200, 니콘 코포레이션, 도쿄, 일본).
실험예 7: ROS (reactive oxygen species) 탐지
세포내 ROS 생성을 확인하기 위해 RAW 264.7 세포를 30분 동안 10 μM의 과산화물에 민감한 H2DCFDA형광 프로브 용액과 함께 인큐베이션하였다. 상기와 같이 처리 후, H2DCFDA는 세포 내 H2O2의 생성으로 인하여, 불침투성 형광성 2’7’디클로로플루오레세인 (dichlorofluorescein)으로 전환된다. ROS 생산은 형광 현미경 (Nikon Eclipse TS200, Nikon Corp., Tokyo, Japan)에서 400x 배율로 분석하였다. 배경 노이즈 보정 후 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 평균 형광 강도를 정량화하였다.
실험예 8: MDA 어세이를 통한 지질 과산화 (lipid peroxidation) 분석
MDA (Malondialdehyde)는 산화 스트레스에 의한 지질 과산화의 가장 보편적인 부산물 중 하나이다. 간, 폐 및 신장으로부터 분리된 혈청 및 단백질을 이 분석에 사용하였다. 샘플을 10 % TCA 및 67 % TBA와 혼합하고 90 ℃에서 20 분 동안 인큐베이션하였다. 배양 후, 혼합물을 5000xg에서 5 분간 원심 분리 하였다. 혼합물의 흡광도를 분광 광도계로 540 nm에서 측정하였다.
실험예 9: Myeloperoxidase (MPO) 활성 분석
MPO는 5개 그룹 모두에서 수집한 혈청 및 조직 단백질 샘플 모두를 사용하여 수행하였다. 96-웰 플레이트에서 각 샘플을 0.75 mM 과산화수소 및 TMB 용액과 혼합하고 37 ℃에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 반응을 멈추기 위해 2M 황산을 시료 혼합물에 첨가하고 흡광도를 450nm에서 측정하였다.
실험예 10: 단백질 추출
특정 시간 동안 ESBL 처리 후, 전체 세포 용해물이 분리되었다. 배지를 플레이트에서 제거하고 세포를 차가운 PBS로 세척하였다. 세포 용해 (lysis)는 얼음 위에서 RIPA 완충액에서 수행하였다. 총 단백질 함량은 4 ℃에서 15 분간 12,000 rpm으로 원심 분리한 후 수득하였다. Bradford 방법을 사용하여 단백질 추정을 수행하였고 595 nm에서 흡광도를 판독하였다.
실험예 11: NO 측정
아질산염 농도는 Griess 반응 (Griess et al., 1879)에 따라 측정하였고 계산된 농도는 NO 생성의 지표로 사용하였다. NO는 모든 실험군에 대해 혈청 샘플 및 조직 단백질에서 측정하였다. 각각의 상등액 100㎕를 Griess 시약 (5% 인산 중 1% 설파 닐아미드 및 물 중 0.1 % 나프틸에틸렌디아민 디하이드로클로라이드) 100㎕와 혼합하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 분광 광도계로 540 nm에서의 혼합물의 흡광도를 측정하였다. 표준 곡선을 생성하기 위해 아질산나트륨을 사용하였다.
실험예 12: 웨스턴 블롯 분석
웨스턴 블롯 분석을 위해 동량의 단백질(각 레인당 50 μg)을 SDS-폴리아크릴아미드겔에서 전기 영동한 후 192 mM 글리신 및 20% (vol/vol) 메탄올을 함유하고 있는 25 mM Tris 완충액 (pH 7.4)에서 전기 브롯팅을 통해 PVDF (polyvinyldenefluoride) 멤브레인 (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA)으로 이동시켰다. 막을 실온에서 2 시간 동안 5 % 무지방 우유로 브로킹하였다. 블롯을 4℃에서 밤새 1 차 항체로 탐침한 다음, HRP-접합된 2차 항체의 희석액과 함께 인큐베이션하였다. 마지막으로, 권장된 절차 (Amersham Pharmacia, Piscataway, New Jersey)에 따라 WEST-ZOLTM Plus ECL (enhanced chemiluminescene)을 사용하여 단백질 밴드를 검출하였다.
실험예 13: 사이토카인 측정을 위한 ELISA
RAW 264.7 세포 단백질 및 조직 (간, 폐 및 신장) 단백질을 RIPA(radio immunoprecipitation assay) 완충액을 포함하는 추출용액에서 균질화시켰다. 사이토 카인 (IL-1β)의 농도는 ELISA (Koma Biotech)를 통해 결정하였다. 모든 샘플 (처리되지 않은 대조군, ESBL 처리, MH20 + ESBL, MH40 + ESBL 및 MH40 단독)을 이중으로 검정하였다. 제조업체의 프로토콜에 따라 추가 절차가 수행하였다. 흡광도는 450 nm 파장의 마이크로타이터 플레이트 판독기 (Bio-Tek Instrument Co., WA, USA)에서 판독하였다.
실험예 14: RNA 분리 및 정량 실시간 PCR 분석
특정 기간 동안의 ESBL 처리 후, RNA-spinTMTotalRNA추출 키트를 사용하여 제조사의 프로토콜 (Intron Biotechnology, Korea)에 따라 총 RNA를 분리하였다. Qubit 2.0 형광 측정기 RNA 분석 키트 (Life Technologies, USA)를 사용하여 RNA 농도를 측정하였다. Maxime RT Premix cDNA 합성 키트 (Intron Biotechnology, Korea)를 사용하여 cDNA를 제조하였다. qRT-PCR은 ABI 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems)을 사용하여 수행하였다. 사용된 프라이머 목록을 표 1에 나타내었다. 모든 반응은 3회 수행하였고 표적 유전자 발현은 2 ΔΔCT 방법을 사용하여 계산 하였다. IL-1β 및 Caspase-1에 대한 표적 유전자 발현을 대조 유전자 β-액틴으로 정규화된 fold change 및 미처리 된 대조군 샘플과 비교하였다.
Gene Forward primer Reverse primer
β-actin 5'-AATCTTCCGCCTTAATACTTC-3' 5'-TTCTTGGTTAGTTCCTTTGTA-3'
IL-1β 5'-TCAACAAGATAGAAGTCAAGAG-3' 5'-CTTTAGGAAGACACGGATTC-3'
Caspase-1 5'-ATGAAAGAATATGCCTGGTC-3' 5'-AGAATGAACTGGATTCTTCG-3'
qRT-PCR수행을 위한 프라이머 세트
실험예 15: 통계 분석
모든 실험 데이터는 평균±표준 편차로 표시하고 실험 수와 함께 표시하였다. in vitro 및 in vivo 데이터의 경우, one-way ANOVA과 Dunnetts post-hoc test를 사용하여 통계 분석을 실시하였고, 유의차는 대조군 vs ESBL p <0.0001 = *, p <0.001 = θ; ESBL vs MH 전처리군은 p <0.0001 = #, p <0.001 = , p <0.05 = φ이다.
실험예 16: 질병의 발병과 MH의 투여
ESBL (1.6x108CFU/mL)를 통하여 패혈증을 유발하였다. 24 시간 동안 질병을 유도 한 후 다음, 10일 동안 하루에 한 번씩 다른 용량의 MH (20 mg/kg~100 mg/kg)를 동물에게 투여하였으며, 체중, 체온 및 사망을 기록하였다.
실험예 17: 통계 분석
생존 곡선의 비교는 Log-rank (Mantel-Cox) Test를 사용하여 GraphPad 프리즘 소프트웨어를 사용하여 계산하였다. 유의성은 p <0.0001로 계산하였다.
실시예
실시예 1: ESBL 용량 결정
1.4x108에서 2.0x109CFU/mL범위의 다양한 ESBL 용액의 효과를 평가하였다. 1.4x108세포의 용액은 100 % 동물을 치사하지 못하였다. 2.4x108,1.4x109및 2.0x 109CFU/mL의 용액은 100 % 동물에서 치사하였다. MH 20 mg/kg과 40 mg/kg가 전처리된 랫트에서 ESBL 치사량 (2.4x108,1.4x109및 2.0 x 109CFU/mL)은 사망률에 아무런 영향을 미치지 않았다. 그러나 1.6x108세포의 경우 20 mg/kg 및 20 mg/kg 의 ESBL 용액이 전처리된 랫트의 사망률에 영향을 미치고 20일 이상 수명이 연장되었다 (도 1A). 이에 따라, 본 연구에서는 1.6x108세포수의 ESBL 용액을 사용하여 쥐의 질병 상태를 발전시켰다.
실시예 2: 패혈성 랫트에서 체중과 생존율에 대한 MH의 효과
관찰된 MH의 예방 효과를 도 1에 나타내었다. 처음에는, 다양한 CFU/mL (1.4 x 108, 2.0x109및 2.4x108)의 ESBL 단독이 28시간 동안 쥐에게 심각한 치사를 나타냄을 확인하였다. 반면, 랫트에서 20 및 40 mg / kg MH의 전-처리는 상기 나타낸 CFU/mL에 노출시킨 후 생존율에 유의적인 차이를 나타내었다. 20 및 40 mg/kg에서의 MH 처리는 1.6x108 CFU/ml에 의하여 감염된 랫트의 수명을 10 일 이상으로 유의하게 증가시켰다 (도 1A). 이에 따라, 해당 CFU 농도를 이후 실험에 이용하였다. 도 1B에 나타난 바와 같이, ESBL 대조군과 비교하여, MH 전처리된 랫트에서 체중 증가가 나타났으며, 이는 패혈증 상태에서 MH의 투여가 수명을 증가시킬 수 있음을 나타낸다.
*
실시예 3: 패혈증 랫트에서 RBCs/WBCs 손상에 대한 MH의 효과
MH가 순환 혈액에서 박테리아 감염을 감소시키는지 여부를 결정하기 위해 Leishman으로 염색한 후 패혈성 랫트에서 혈액 세포의 형태학적 변화를 조사했다 (도 1C).
결과는 시간 의존적으로 ESBL 단독 처리군에서 기형의 WBC와 함께 심각한 용혈이 유발됨을 확인하였다. 반면에, MH 40mg/kg의 전처리군에서는 ESBL에 노출된 후에 유의하게 회복됨을 확인하였다. 이 결과는 순환 혈액에서의 MH의 세균 제거 능력을 나타낸다.
실시예 4: ESBL 유도 세포 독성에 대한 RAW 264.7 세포의 MH의 보호 효과
ESBL 유도 세포 독성에 대한 RAW 264.7 대식세포에서의 MH의 세포보호 효과를 평가하기 위해, in vitro 실험에서의 ESBL의 투여량을 결정하기 위하여 1:1부터 1:20 (RAW 264.7: ESBL)까지의 다양한 MOI의 ESBL로 MTT 어세이를 수행하였다 (도 2A). MOI 1:5, 1:10 및 1:20에서 거의 유사한 영향이 관찰되었다. 따라서 MOI 1:5 in vitro 실험에 이용하였다.
미처리 세포와 비교하여 ESBL 처리된 세포에서 세포 생존력의 현저한 감소가 관찰되었다. 그러나, MH 20μM 및 MH 40μM의 전처리는 용량 의존적으로 세포 생존력을 실질적으로 증가시켰다 (도 2B).
MH의 보호 효과를 추가로 확인하기 위해, LDH 분석을 세포생존능력의 다른 측정법으로 수행하였다. 배양된 세포로부터의 LDH 활성은 죽은 세포에서만 유래되기 때문에 LDH는 세포 무결정을 확인하기 위한 일반적인 마커로 이용되는 세포내 효소이다.
도 2C에 나타난 바와 같이, 본 발명자들은 RAW 264.7 세포에서의 ESBL 단독 및 MH (MH 20μM + ESBL 및 MH 40μM + ESBL)의 시너지 세포 독성 효과를 평가 하였다. ESBL 처리된 RAW 264.7 세포에서 LDH 수준의 유의적인 (p <0.001) 증가가 확인되었다. 반면, 결과는 MH가 LDH 방출을 감소시킴으로써 ESBL에 의한 세포 독성을 약화시켰다는 것을 나타내었다. MH의 보호 효과는 용량 의존적이었고, 최대 효과는 40μM의 농도에서 관찰되었다.
Parameters Control ESBL MH20+ESBL MH40+ESBL MH40
Na (mmol/L) 141.25 152.985 151.75 149.65 145.6
K (mmol/L) 12.9 33.845 25.2 21.95 11.5
Cl (mmol/L) 95.6 108.83± 107.1 103.5 100.65
ALB (g/dL) 3.8 5.75 4.385 3.75 3.5
BUN (mg/dL) 19.05 58.07 48.75 36.4 19.85
CREA (mg/dL) 0.475± 1.465 0.885 0.715 0.45
TG (mg/dL) 32.39± 157.645 87.5 49.375 34.85
ALP (U/L) 994.89 1381.71 1358.5 1138.5 1032
AST (U/L) 108.245 2569.6 2402 2267.5 163
ALT (U/L) 33.85± 2511 1588.5 1382 49.5
랫트의 희생 후, 상이한 다른 실험 그룹에서 혈청 매개 변수의 농도 (평균 ±표준 편차)
실시예 5: 혈청 생화학적 파라미터에 대한 MH의 영향
*혈청을 모든 실험군으로부터 수집하여 병리학적 마커의 수준을 확인하였다. 표 2는 상이한 혈청 파라미터의 평균±데이터를 나타낸 것이다. 혈청 생화학 파라미터 결과의 비교는 그룹간에 유의한 차이를 나타내었다. 전해질 중 나트륨, 칼륨 및 염소 농도는 대조군과 MH 전처리 군에 비해 ESBL 군에서 2 배 이상 높았다. 모든 혈청 파라미터의 수준은 대조군에서 가장 낮은값을 나타내며, 이로부터 가장 가까운 것은 MH40군에서 확인되었다. 혈액내 COP (colloid osmotic pressure, COP)을 확인하기 위해, 알부민 수치를 확인하였으며, ESBL 군에서 유의하게 높음을 확인하였다. 간손상을 확인하기 위하여 AST, ALP 및 ALT의 수준을 확인하였다. 모든 효소에 대한 최대 농도는 ESBL 그룹에서 나타났으며, 이는 MH 전처리 그룹에서 감소된 것을 확인하였다. 해당 마커 수치의 증가는 질병으로의 중대한 간손상을 나타낸다.
실시예 6: 조직병리학에서의 MH의 영향
다음으로 호중구 침윤 및 기타 형태학적 변화를 관찰하기 위하여, 폐, 신장 및 간 조직으로 Hematoxylin과 eosin (H & E) 염색을 시행하였다. 결과는 패혈증 유도 후 다양한 기관에서 다양한 정도의 병원성을 나타내었다. ESBL 치료군의 폐조직 절편은 증가된 염증의 표지인 폐포 벽의 출혈과 확장을 포함한 손상을 나타냈다 (도2D).
폐포 모세 혈관에서의 다양한 호중구 축적과 상피 세포의 확대도 관찰되었다. 결과는 MH20 및 MH40 투여가 ESBL 처리군에서 관찰 된 것과 비교하여 염증을 감소시키는 것을 나타내었다. 신장에서는, ESBL 처리군에서 림 (limb), 근위 과립 세뇨관 및 신장 캡슐에서 형태학적 변화가 관찰되었다 (도 2D). 피질-수질 접합부(cortico-medullary junction)의 비대화, 관상 세포의 팽창 및 손실 역시 관찰되었으며, 이는 ESBL 군에서 세포 사멸을 유도하였다. 이러한 형태학적 변화는 MH 전처리 군에서 용량 의존적으로 역전되는 것으로 나타났다. AST, ALP 및 ALT의 증가된 수준 (표 2)은 간손상 및 간 기능의 조절 장애를 나타낸다. 능동적인 간염의 지표로서 액포화(vacuolization), 세포 괴사 및 만성 주변 염증 세포 침윤을 포함한 담즙 정체성 황달 및 만성염증의 증상이 ESBL 그룹에서 명확하게 나타났다 (도 2D). III 및 IV 군 (MH로 전처리)에서 얻은 간 절편은 II 군에 비해 병리학적 변화가 적었다. 이러한 결과는 MH 투여가 염증을 감소시킴으로써 ESBL 감염 동안 호중구 침윤을 투여량-의존적으로 감소시키는 것을 의미한다.
실시예 7: MDA 및 MPO의 수준 변화에 대한 MH의 전처리 효과
패혈증은 산화적 스트레스와 밀접한 관계가 있기 때문에 MH 전처리는 항산화 방어 시스템을 활성화시킬 수 있다고 가정하였다. 이에 따라, MDA와 MPO와 같은 항산화 효소의 측면에서 산화 스트레스와 MH 보충의 영향을 조사 하였다. 패혈성 랫트는 대조군 동물과 비교했을 때 혈청, 폐, 신장 및 간에서 MDA와 MPO 활성이 유의하게 (p <0.0001) 증가함을 보였다 (도 3A 및 B). MH 전처리는 이 활동을 기초 수준으로 낮추었다.
실시예 8: MH의 항산화 효소 유도 및 세포 보호 효과 확인
패혈증에 의한 감염이 세포 내 ROS 축적에 의해 산화 스트레스를 촉진한다는 것이 종래 문헌에 의하여 보고된 바 있다. 이를 바탕으로 본 발명자는 H2DCFDA염색 분석을 사용하여 ESBL 유도 산화 스트레스에 대한 MH의 보호 효과를 유도하는 메커니즘을 탐구하였다 (도 3C).
결과에서, 자극하지 않은 RAW 264.7 세포는 낮은 수준의 기초 ROS를 생성하는 것으로 밝혀졌으며, 이를 다른 그룹에서의 결과와 비교하기 위한 기준으로 사용하였다. ESBL은 ROS 생성에 있어서, 대조군 100에 비해 464.89±11.98으로 유의적인 증가를 나타냈다. MH의 전처리는 ROS 수준을 낮추는데에 효과적인 것으로 나타났습니다. 대조군에 비해 MH20 + ESBL (219.88 ±9.53) 및 MH40 + ESBL (122.96 ±13.633)이었다 (도 3D).
실시예 9: in vitro 및 in vivo 에서 MH의 처리가 염증을 감소시킴을 확인
NO는 고도로 분산된 소수성 분자이며, 이에 따라 염증-유발 질환에서 중요한 신호 분자이다. RAW 264.7 세포, 폐, 신장 및 간에서 ESBL에 의해 자극된 NO (아질산염), 및 iNOS, eNOS 및 Cox-2의 단백질 발현 수준을 측정 하였다.
도 5A에 나타난 바와 같이, 대식 세포를 배지 단독에 노출시키거나, MH40으로 처리 하였을 때 최소량의 NO가 방출되었다. ESBL 처리는 대조군에 비해 유의하게 (p <0.0001) NO 생성을 증가시켰다.
in vitro 및 in vivo 모두에서 증가된 농도의 MH 전처리가 NO의 생성을 억제하였으며, 또한 MH는 활성화 된 대식세포, 폐, 신장 및 간에서 농도의존적으로 iNOs, eNOS 및 Cox-2의 발현을 억제하였다 (도 5B 내지 I).
이러한 결과는 MH가 in vitro 및 in vivo에서 항염증 활성을 가질 수 있음을 시사한다. NO 생성은 DNA 손상을 일으키고 단백질 구조/기능을 변형시킨다. 이에 따라, DNA 손상 보호 효소인 PARP-1의 발현 수준을 분석하였다. PARP-1의 발현 수준은 모든 조직에서 in vitro 및 in vivo 내에서 유의하게 증가되었다. MH 전처리는 PARP-1 발현의 증가를 역전시켰으며, 수준은 거의 기초 수준으로 되돌아 갔다.
실시예 10: MH 처리가 AKT 신호 전달을 통한 세포 생존을 약화시키고 NF - κB 복합체의 활성화를 유도함을 확인
Myd88 (Myeloid differentiation primary response 88)는 숙주 방어를 유지하고 해로운 염증 반응을 예방한다. 이에 따라 본 발명에서 웨스턴 블롯을 이용하여 Myd88 유전자의 발현 정도를 평가하였다.
H&E 염색 및 NO 수준을 통하여 증가된 염증 수준이 관찰을 확인한 바와 같이, 대조군 및 MH 전처리 군과 비교하여 ESBL 처리 군에서 Myd88의 수준이 더 높게 나타났음을 확인하였다 (도 6). 활성화된 후, Myd88은 세포 생존에 필수적인 역할을 하는 일련의 상호 작용하는 단백질을 활성화시키는 분자를 자극한다. 또한, AKT 및 p-AKT를 통한 세포 생존을 측정하였다. RAW 264.7 대식세포와 다른 조직 모두에서 MH 전처리는 비처리 대조군과 ESBL 군과 비교하여 p-AKT 발현을 유의하게 증가시켰다 (도 6). 그러나, AKT의 수준은 대조군과 MH40 전처리 군에서 변화가 없으며, 이는 MH에 의해 유도된 세포 생존의 증가가 AKT 활성화에 의해 강화될 수 있음을 나타낸다. AKT는 IKKα의 인산화를 통하여, NF-κB 전사인자의 핵으로의 이동을 활성화시키고 이는 다시 IκB를 인산화시켜 프로테아좀 분해를 유도한다는 것이 종래 알려진 바 있다. 이에 본 발명자는 NF-κB 복합체 서브유닛 p50 및 p65의 발현 분석을 수행하였다. 둘 다 RAW 264.7 대식세포 및 간에서 ESBL 처리 군에 비해 MH 전처리 군에서 유의하게 낮은 발현을 보였다 (도 6A 및 D). 그러나, p50의 발현은 폐 및 신장에서 MH 전처리 된 그룹과 비교하여 ESBL 처리 된 그룹에서 하향 조절되는 것으로 밝혀졌다 (도 6B & C).
실시예 11: MH 투여가 caspase -1 매개 경로를 통하여 파이롭토시스(pyroptosis)를 활성화함을 확인
우리는 ELISA와 qRT-PCR를 통하여 패혈증 랫트의 혈청, 폐, 신장 및 간에서의 전-염증성 사이토카인 IL-1β의 수준을 평가하였다. IL-1β의 혈청 농도는 ESBL 처리 동물에서 증가하였고 비처리 대조군 및 MH 전처리군에서 농도 의존적으로 감소하는 것으로 나타났다. 유사한 결과가 폐, 신장 및 간에서 발견되었다 (도 7A 및 B). 또한, caspase-1의 mRNA 및 단백질 발현 분석을 통하여 염증에 의한 폐사를 확인하였다. 패혈증 랫트는 caspase-1의 활성화를 나타내었으며, MH 전처리된 그룹은 감소된 활성을 보였다 (도 7C & D).
실시예 12: MH의 후투여(Post-administration)는 패혈증 랫트의 생존율을 증가시킴을 확인
MH의 치유 효과를 평가하기 위해 표준화된 ESBL 용량 (1.6x108)을 사용하여 동물에서 패혈증을 유도하였다. ESBL 감염 24 시간 후, 10일 동안 하루에 한번 20mg/kg, 40mg/kg, 60mg/kg, 80mg/kg 및 100mg/kg의 상이한 농도로 MH를 투여하였다.
생존율을 MH 투여 10일 후에 계산하였으며 생존율은 용량 의존적으로 변화하였다. 생존율의 회복은 100 % 인 대조군 (n-8, p <0.0001)과 비교하여 60mg/kg (n = 8, p <0.0001)에서 약 22.83%, 80mg/kg (n = 8, p < 0.0001)에서 약 35%, 100mg/kg (n = 8, p <0.0001)에는 40 %였다 (도 8).

Claims (7)

  1. 모린(Morin, 2-(2,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxychromen-4-one), 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 모린 수화물(Morin hydrate)을 유효성분으로 포함하는, ESBL (Extended-Spectrum Beta-Lactamase) 생산균 감염에 의해 발병된 패혈증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, ESBL (Extended-Spectrum Beta-Lactamase) 생산균 감염은 항균제에 대한 다약제 내성을 부여하는 CTX-M β-lactamase 변이와 관련된 감염인, 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 내성 인자 Myd88 및 NF-κB 매개 염증 반응을 억제하는 것인, 약학적 조성물.
  4. 모린(Morin, 2-(2,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxychromen-4-one), 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 모린 수화물(Morin hydrate)을 유효성분으로 포함하는, ESBL (Extended-Spectrum Beta-Lactamase) 생산균 감염에 의해 발병된 패혈증 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  5. 제4항에 있어서, ESBL (Extended-Spectrum Beta-Lactamase) 생산균 감염은 항균제에 대한 다약제 내성을 부여하는 CTX-M β-lactamase 변이와 관련된 감염인, 식품 조성물.
  6. 모린(Morin, 2-(2,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxychromen-4-one), 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 모린 수화물(Morin hydrate)을 유효성분으로 포함하는, ESBL (Extended-Spectrum Beta-Lactamase) 생산균 감염에 의해 발병된 패혈증 예방 또는 개선용 사료 조성물.
  7. 제6항에 있어서, ESBL (Extended-Spectrum Beta-Lactamase) 생산균 감염은 항균제에 대한 다약제 내성을 부여하는 CTX-M β-lactamase 변이와 관련된 감염인, 사료 조성물.
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