KR101990054B1 - 로손을 유효성분으로 포함하는 항암 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 로손을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 로손을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 개선용 식품 조성물 및 사료 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 로손 (lawson, 2-hydroxy-1,4-naphthoquinone; HNQ)은 HeLa 자궁경부암 세포의 생존력을 감소시키고, 세포 독성에 의한 세포 사멸을 유도하며, 세포주기 정지 및 노화를 야기하고, 세포 사멸 경로를 유도한다. 로손이 이종 이식 누드 마우스 내에서 종양 형성을 감소하는 효과를 나타내었다.
이에, 본 발명에 따른 로손은 암, 특히 자궁경부암 치료에 효과적인 천연물 치료제로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

로손을 유효성분으로 포함하는 항암 조성물 {Anti-cancer Composition Comprising Lawsone}

본 발명은 로손을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 로손을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 개선용 식품 조성물 및 사료 조성물에 관한 것이다.

자궁경부암은 젊은 여성에게 심각한 우려를 낳고 있으며, 매년 전세계적으로 자경경부암에 의한 약 20 만 명의 사망과 50 만명의 발병이 확인된다. 초기 단계 암의 대략 80-90%는 수술 및 화학요법으로 치료할 수 있으나, 재발 및 전이성 질환의 가능성은 여전히 주요 관심사에 해당한다. 자궁경부암의 주요 원인은 인간 유두종 바이러스 (human papillomavirus, HPV)이다. HPV는 성적으로 전염되며 고위험군의 만성 감염은 자궁경부암을 일으킬 수 있다. HPV 감염에서 자궁경부암에 이르기까지 보통 10년에서 20년이 소요된다. 결과적으로, 자궁경부암 환자는 이미 치료가 어려운 진행 단계에 들어간 경우에만 탐지된다. 그러나 전신 화학 요법과 방사선 요법 모두 심각한 부작용과 관련성이 높다. 따라서 조기에 암을 치료하기 위해서는 새로운 진단, 치료 및 예방 방법이 시급히 필요하다.

나프토퀴논(naphthoquinone)의 항종양 활성은 종양 세포에서 확인된 바 있다. 또한, 나프토퀴논이 산화 스트레스를 일으켜 산화 환원 신호 전달에 영향을 줄 수 있다는 것 역시 보고된 바 있다. 특히, CHNQ와 같은 1,4-나프토퀴논은 산화 환원 순환을 통해 하나 또는 두 개의 전자를 받아들여 음이온 또는 이음이온(di-anion) 종을 형성 할 수 있는 퀴논기를 2 개 함유하고 있다.

이것은 산소로의 전자(들) 전달을 통하여 초과산화물 (superoxide)을 생성하는 ROS (reactive oxygen species)의 생성을 유도할 수 있으며, 이는 NADPH-cytochrome-P-450 환원 효소와 같은 플라보효소 (flavoenzyme)에 의해 촉매된다. 인간 신생아 섬유아세포에 CHNQ를 처리하면, ROS가 생성된다는 것이 종래 연구에 보고된 바 있다. 향상된 ROS 생성으로 세포주기를 정지시키고, 뒤이어 암세포에서 산화 스트레스와 관련된 자가 포식 세포사멸을 유발한다. 이는 농도 의존적인 증식의 감소 및 세포 독성의 향상을 동반하였다. 이러한 현상은 LC3, Beclin-1, Bax, caspase-3 등의 자식작용 또는 세포사멸 마커의 증가를 동반하였다. 따라서 항암제 잠재력을 가진 식물 화합물을 발견하는 것이 중요하다.

천연물은 항암제의 주요 공급원이다. 천연물은 최근 화학 요법의 독성을 고려하여 암에 대한 치료제로서 널리 보급되고 있다. 천연물은 안전성이 보장되며, 정상 세포의 돌연변이 유발성을 감소시키는 능력을 가지는 것이 밝혀진바 있다.

일반적으로 헤나(henna)라고 불리는 Lawsonia inermis L. (동의어 Lawsonia alba)는 Lythraceae 속에 속하며 해당 속 중 유일한 종이다. 그것은 나무처럼 작은 관목으로 높이 2 ~ 6m이며, 가시가 있는 작은 가지를 갖는다.

따라서 본 연구의 목적은 자궁 경부암 세포주인 HeLa에 대한 HNQ (Lawsone)의 자가포식 (Autophagy) 및 세포자멸 효과를 조사하는 것이다.

이에 본 발명자들은 헤나 유래의 로손 (lawson, 2-hydroxy-1,4-naphthoquinone; HNQ)의 HeLa 자궁 경부암 세포에 대한 효과를 확인하였으며, 그 결과, 로손이 HeLa 자궁 경부암 세포의 생존력을 감소시키고, 세포 독성에 의한 세포 사멸을 유도하며, 세포주기 정지 및 노화를 야기하고, 세포 사멸 경로를 유도함을 확인하였다. 또한, 로손이 이종 이식 누드 마우스 내에서 종양 형성을 감소하는 효과가 있음을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

이에 본 발명의 목적은, 로손을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 로손을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 개선용 식품 조성물 및 사료 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 로손을 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 로손을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 개선용 식품 조성물 및 사료 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, 로손 (lawson, 2-hydroxy-1,4-naphthoquinone; HNQ)은 HeLa 자궁 경부암 세포의 생존력을 감소시키고, 세포 독성에 의한 세포 사멸을 유도하며, 세포주기 정지 및 노화를 야기하고, 세포 사멸 경로를 유도한다. 로손이 이종 이식 누드 마우스 내에서 종양 형성을 감소하는 효과를 나타내었다.

이에, 본 발명에 따른 로손은 자궁경부암 치료에 효과적인 천연물 치료제로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1에서,
(A) HNQ의 대표적인 구조을 나타낸 도이다.
(B) HeLa 자궁 경부암 세포 (0-100 μm)에 HNQ의 MTT 분석결과를 나타낸 도이다.
(C) HeLa 세포에서 형태학적 변화와 GFP LC3 puncta 발현이 농도 의존적으로 증가함을 확인한 결과이다.
(D) HNQ의 존재 하에서 클론원성 형성 (Clonogenic formation)을 확인한 결과이다.
모든 실험은 3 번 반복실험하였으며, 막대 그래프의 각 값은 3개의 독립적 인 실험의 평균 ±SD를 나타낸다. 값은 대조군에 대하여, *** p <0.001, ** p <0.01이다.
그림 2에서,
(A) 상측은 DAPI, GFP-LC3 염색과 GFP-LC3 puncta 병합한 도로서, 농도의존적으로 증가한 것을 확인할 수 있다. 현미경 영상은 scale bar 0.1mm에서 20x에서 촬영한 이미지이다.
하측은 아크리딘 오렌지 산성 액포가 용량 의존적으로 상승되는 것을 나타낸 도이다. 스케일 바 = 0.1mm로 40x에서 촬영한 이미지이다.
(B) 자가포식 (autophagy) 마커를 면역블롯팅을 이용하여 평가하였다. LC3, ATG5, ATG7, 4EBP-1, APOL-1, Beclin-1, p-mTOR, p-AKT은 β-액틴으로 정규화 하였다. 모든 실험은 3 회 반복하였다.
그림 3에서
(A) SA-β-gal (Senescence-associated β-galactosidase) 활성을 염색한 결과이다. HeLa 세포에 HNQ를 처리 한 후 SA-β galactosidase는 의존적으로 증가하는 것으로 나타났다. 40X 배율로 촬영한 현미경 이미지 (scale bar = 0.1mm).
(B) 세포주기 정지 마커 Cdk5, Cdk4, 사이클린 D1 발현을 확인하였으며, 이를 β-액틴과 비교하였다. 모든 실험은 3 회 반복하였다.
도 4에서
(A) 상부은 AO/PI을 통하여 생존/사멸 염색을 수행한 도이다. 여기서 녹색은 생존한 세포를 나타내고 빨간색은 사멸 세포를 나타낸다. Scale bar = 0.1 mm로 20x에서 찍은 현미경 사진이다. 하부의 DCHFDA 염색에 따른 ROS 염색결과는 농도 의존적으로 ROS 생산량이 증가된 것을 나타낸다. Scale bar = 0.1 mm로 20x에서 찍은 현미경 사진이다.
(B) 면역블롯팅을 통하여 세포사멸 (apoptotic) 마커에 대한 HNQ의 효과를 나타낸 도이다. Bax, Bcl2, Cleaved caspase-3, p53, p-p38, JNK, Caspase-9은 β- 액틴으로 정규화하였으며, 모든 실험은 3 회로 반복되었다.
도 5에서,
(A) HeLa 이종 이식 모델에서 50 및 100 mg/kg HNQ를 4 주 동안 처리한 후 대조군과 비교한 결과를 나타낸 도이다. (B) 처리 후, 종양 부피 및 처리 후의 기간경과를 표시한 도이다. 종양 사이즈는 HNQ 처리 후 감소함을 확인하였다. (C) HNQ로 처리한 후에 체중이 정상에 가까워졌음을 확인한 도이다. 모든 실험은 3 회 반복되었다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명은 로손을 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 로손 (2-hydroxy-1,4-naphthoquinone)은 빨간색-오렌지 염료로서 헤나 식물(Lawsonia inermis)뿐만 아니라 부레옥잠의 꽃 등으로부터 추출할 수 있다. 해당 로손은 상기 화합물을 포함하고 있는 다양한 식물로부터 추출할 수 있으며, 그 식물의 종류를 제한하지 않는다.

본 발명의 로손은 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산, 아인산 등과 같은 무기산류, 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류 등과 같은 무독성 유기산, 아세트산, 안식향산, 구연산, 젖산, 말레인산, 글루콘산, 메탄설폰산, 4-톨루엔설폰산, 주석산, 푸마르산 등과 같은 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염의 종류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트, 만델레이트 등을 포함한다.

본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법으로 제조할 수 있으며, 예를 들면 로손 또는 로손 유도체를 메탄올, 에탄올, 아세톤, 메틸렌클로라이드, 아세토니트릴 등과 같은 유기용매에 녹이고 유기산 또는 무기산을 가하여 생성된 침전물을 여과, 건조시켜 제조하거나, 용매와 과량의 산을 감압 증류한 후 건조시켜 유기용매 하에서 결정화시켜셔 제조할 수 있다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 음염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.

나아가, 본 발명은 상기 로손 및 이의 약학적으로 허용가능한 염뿐만 아니라, 이로부터 제조될 수 있는 용매화물, 광학 이성질체, 수화물 등을 모두 포함한다.

또한, 상기 로손은 화학적, 또는 생물학적으로 합성될 수 있으며, 그 합성 방법을 제한하지 않는다.

본 발명에서 암은 고형암 또는 비고형암일 수 있다. 고형암은 예를 들어 간, 폐, 유방, 피부 등 장기에 암 종양이 발생한 것을 말한다. 비고형암은 혈액 내에서 발생한 암이고, 혈액암으로도 불린다. 상기 암은 암종 (carcinoma), 육종(sarcoma), 조혈세포 유래의 암, 배세포 종양(germ cell tumor), 또는 모세포종(blastoma)일 수 있다. 암종은 상피세포(epithelial cells) 유래의 암일 수 있다. 육종은 각 조직이 골수 밖의 중간엽 세포(mesenchymal cell)에서 유래된 세포로부터 발생된 것일 수 있는 결합 조직(즉, 뼈, 연골, 지방, 및 신경)으로부터 유래된 암일 수 있다. 조혈세포 유래의 암은 골수를 떠나 림프절 및 혈액에서 성숙하는 경향이 있는 조혈 세포로부터 유래할 수 있다. 배세포 종양은 다능성 세포(pluripotent cell)로부터 유래된 암일 수 있다. 상기 다능성 세포는 정소 또는 난소에 종종 존재할 수 있다. 모세포종은 미성숙 전구 세포 또는 배아 조직으로부터 유래할 수 있다. 상기 암은 흑색종, 뇌척수종양, 두경부암, 폐암, 유방암, 흉선종, 중피종, 식도암, 위암, 대장암, 간암, 췌장암, 담도암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 생식세포종, 갑상선암, 난소암, 자궁 경부암, 자궁 내막암, 림프종, 골수형성이상 증후군(myelodysplastic syndromes: MDS), 골수섬유증(myelofibrosis), 급성 백혈병, 만성 백혈병, 다발성 골수종, 육종, 및 피부암으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.

특히 상기 암은 자궁경부암일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어인 용어 "예방"은 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 암을 억제하거나 암의 발병을 지연시키는 모든 행위를 말한다. 상기 용어 "치료"는 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 암의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다.

본 발명에서 로손 (lawson, 2-hydroxy-1,4-naphthoquinone; HNQ)은 HeLa 자궁 경부암 세포의 생존력을 감소시키고 (실시예 1), 세포 독성에 의한 세포 사멸을 유도하며 (실시예 2), 세포주기 정지 및 노화를 야기하고(실시예 3), 세포 사멸 경로를 유도한다(실시예 4). 또한, 로손은 이종 이식 누드 마우스 내에서 종양 형성을 감소하는 효과를 나타낸다 (실시예 5).

본 발명에서, 상기 약학 조성물은 암의 예방 또는 치료방법에 이용될 수 있으며, 구체적으로 상기 예방 또는 치료방법은 암이 발병되거나 또는 발병될 것으로 예상되는 개체에 투여하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 용어 "투여"란, 적절한 방법으로 개체에게 상기 조성물을 도입하는 것을 의미한다.

본 발명의 용어 "개체"란, 암이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 동물을 의미하고, 구체적인 예로, 인간을 포함한 포유동물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명의 용어, "약학적으로 유효한 양"이란, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 예를 들면, 상기 조성물은 유효성분으로 1일 0.01 내지 500 mg/kg으로, 구체적으로 10 내지 100 mg/kg의 용량으로 투여할 수 있으며, 상기 투여는 하루에 한 번 또는 수회 나누어 투여할 수도 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 본 발명의 로손을 0.001 내지 50% 중량 백분율로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 상기 기재한 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의 상기 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 구체적으로, 제형화할 경우 통상 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제 등도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 첨가하여 조제될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제를 포함한다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 상기 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명은 로손을 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어, "개선"이란, 상기 조성물의 투여로 암이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 용어 "식품"은 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료, 비타민 복합제, 건강 기능 식품 및 건강 식품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.

상기 건강 기능(성) 식품(functional food)이란, 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)과 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미한다. 여기서 "기능(성)"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조 가능하며, 상기 제조시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 상기 식품의 제형 또한 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고 휴대성이 뛰어나므로, 본 발명의 식품은 암의 예방 또는 개선의 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.

상기 건강 식품(health food)은 일반식품에 비해 적극적인 건강유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품(health supplement food)은 건강 보조 목적의 식품을 의미한다. 경우에 따라, 건강 기능 식품, 건강 식품, 건강 보조 식품의 용어는 혼용될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 암의 예방 또는 개선에 대하여 높은 효과를 기대할 수 있으므로, 매우 유용하게 사용될 수 있다.

상기 식품 조성물은 생리학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는데, 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다.

또한, 상기 식품 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu), 크륨(Cr) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다.

또한, 상기 식품 조성물은 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 포함할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.

본 발명의 로손은 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 식품 조성물은 식품 또는 음료에 대하여 50 중량부 이하, 구체적으로 20 중량부 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 장기간 섭취할 경우에는 상기 범위 이하의 함량을 포함할 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물의 일 예로 건강음료 조성물로 사용될 수 있으며, 이 경우 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드; 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강음료 조성물 100 mL 당 일반적으로 약 0.01 ∼ 0.04 g, 구체적으로 약 0.02 ∼ 0.03 g이 될 수 있다.

상기 외에 건강음료 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산, 펙트산의 염, 알긴산, 알긴산의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 또는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일주스, 과일주스 음료, 또는 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강음료 조성물 100 중량부당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명의 식품 조성물은 암의 예방 또는 개선 효과를 나타낼 수 있다면 다양한 중량%로 포함할 수 있으나, 구체적으로 본 발명의 로손을 식품 조성물의 총 중량 대비 0.00001 내지 100 중량% 또는 0.01 내지 80 중량%로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 로손을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다.

상기 사료는 가축에 급여되는 일반적인 사료로, 용어 "가축"은 집에서 기르는 짐승, 즉 포유류, 가금류 등을 의미하는 것이다. 본 발명에서 상기 포유류는 개, 고양이, 소, 돼지, 염소, 양, 말 등을 예로 들 수 있으며, 가금류로는 닭, 오리, 칠면조 등을 예로 들 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 사료 조성물은 가축의 종류에 따라 급여되는 일반적인 기초사료들을 포함할 수 있다. 이러한 기초사료들은 가축의 종류에 따라서 그 필요한 성분 및 조성 그리고 적합한 조성 비율이 모두 당업계에 공지되어 있으며, 또한 시판되고 있기 때문에 당업자라면 누구나 매우 용이하게 이를 제조 또는 구입하여 사용할 수 있을 것이다.

구체적으로 기초사료로는 가축의 종류에 따라 적합한 전분함유 물질, 단백질 함유 물질, 지방 함유 물질, 비타민 함유 물질, 무기질 함유 물질, 산화 방지 물질, 항생제 등의 일부 또는 전부를 포함하여 구성될 수 있다.

상기 전분 함유 물질은 그것이 사육동물의 성장을 유지할 수 있는 한 모두 사육동물의 기초사료에 포함될 수 있는데, 이러한 전분 함유 물질은 일반적으로 옥수수, 콩, 밀, 수수, 보리, 귀리 등으로부터 얻어진다. 적합한 전분 함유 물질로서는 옥수수 분쇄물이나 분말, 귀리 분쇄물이나 분말, 콩 분쇄물이나 분말, 밀 분쇄물이나 분말 등을 들 수 있다. 바람직한 적합한 전분 함유 물질은 귀리 분말, 옥수수 분쇄물, 밀 분쇄물, 콩 분말 등이다. 이러한 전분 함유 물질은 사육동물의 성장을 효과적으로 유지할 수 있다면, 그 농도는 특별히 제한되지 않는다. 일반적으로 전분 함유 물질은 약 30~80중량%의 범위로 기초사료에 포함될 수 있다.

단백질 함유 물질도 사육동물의 성장을 유지시킬 수 있는 한, 가축의 기초사료에 포함될 수 있다. 경제적인 이유로 어분, 콩 분말 등과 같은 단백질 함유 물질이 사용되고 있는데, 다른 것들로서는 콩 단백질 농축물, 혈분, 혈장 단백질, 탈지유 건체물, 유(乳) 단백질 농축물, 옥수수 글루텐(Gluten) 분말, 밀 글루텐 분말, 이스트, 해바라기씨 분말 등을 들 수 있다. 바람직한 단백질 함유 물질은 어분, 혈분, 혈장 단백질, 콩 분말 등이다. 단백질 함유 물질도 사육동물의 성장을 효과적으로 유지할 수 있는 한, 사육동물의 기초사료에 포함되는 그것의 농도는 중요하지 않다. 일반적으로, 단백질 함유 물질은 약 10~50중량%의 범위로 기초사료에 포함될 수 있다.

상기 지방 함유 물질로는 라드(Lard), 우지, 콩기름, 레시틴, 코코넛유 등을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 지방 함유 물질 또한 사육동물의 성장을 유지할 수 있는 한 그 농도는 제한되지 않으며, 일반적으로 약 2~20중량의 범위로 기초사료에 포함될 수 있다.

또한 기초사료에는 수용성, 지용성 비타민과 미량의 무기물이 포함될 수 있다. 상기 비타민으로는 비타민 A, 비타민 D, 비타민 E, 비타민 K, 리보플라빈, 판토텐산(Pantothenic Acid), 나이아신, 비타민 B12, 엽산, 비오틴, 비타민 C 등이 사용될 수 있다. 미량의 무기물로서는 구리, 아연, 요오드, 셀렌, 망간, 철, 코발트 등이 사용될 수 있다. 여기서 "미량"이 의미하는 바는 가축의 기초사료에 사용된 이들 성분들의 양이 다른 성분들의 양보다 실질적으로 적은 것을 의미한다. 일반적으로, 비타민이나 무기질이 미량으로 기초사료에 포함될 경우에 조성물 총 중량에 약 0.0001~5중량%로 포함될 수 있다.

또한 기초사료에는 BHT(Butylated Hydroxytoluene), BHA(Butylated Hydroxyanisole), 비타민 E, 아스코르브산 등의 산화방지물질이 포함될 수 있으며, 이들 산화방지물질은 약 0.0001~1중량%의 극소량으로 포함될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실험예

실험예 1: 시약 및 화학물질

시약 및 HNQ를 포함하는 모든 화학물질은 Sigma-Aldrich USA에서 구매하였다. β-actin, BAX, caspase-3, caspase-9, Bcl-2 등의 대부분의 항체는 Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, USA)로부터 구매하였다. BECN-1 및 ATG5는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)로부터 구매하였다. LC3는 Abcam (Cambridge, MA, USA)으로부터 구매하였다. 웨스턴 블롯을 위한 HRP (Horseradish peroxidase)-컨쥬게이트 제2 항체는 Santa Cruz Biotechnology로부터 구매하였다.

실험예 2: 세포 독성 및 형태학적 평가

HNQ의 세포 독성 효과는 MTT 분석으로 먼저 결정하였다.

5 ×10⁴ HeLa세포/웰을 25, 50 및 100 μM 농도의 HNQ의 존재하에 37℃에서 24시간동안 CO₂ 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 MTT 용액 (5 mg/ml)으로 처리하여 진한 파란색의 포르마잔 결정체를 제조하고, 이를 DMSO 50 μl에 용해시켰다. 마지막으로 마이크로 플레이트 리더 (Bio-Tek instrument Co., WA, USA)에서 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

또한, HNQ (25, 50 및 100μM)에 노출시킨 후 HeLa 세포의 형태학적 변화를 역상 현미경 (Nikon Eclipse TS200, Nikon Corp., Tokyo, Japan)을 사용하여 확인하였다.

실험예 3: 클론원성 ( Clonogenic ) 어세이

총 5⁴ 세포/웰을 12-웰 배양 플레이트에 접종하고 24시간 동안 부착시킨 후, HNQ (25, 50 및 100μM)를 투여하고 세포를 7일 동안 CO₂ 인큐베이터에서 37℃에서　인큐베이션하였다．마지막으로, 세포를 PBS로 세척하고 0.5 % 수정 자색으로 염색하였다.

실험예 4: SA-β-gal (Senescence-associated b- galactosidase ）활성　측정

세포를 HNQ와 함께 24 시간동안 배양하고, HNQ 제거 후 7 일째에 SA-b-gal 활성을 측정하였다．

실험예 5: 세포사멸적 　형태학적　변화의　결정

세포를 12-웰 플레이트에 접종하고 24시간 동안 부착시킨 다음, ２４새간　동안　추가로　HNQ (25, 50 및 100μM)를　처리하였다． 인큐베이션　후, 세포사멸을　검출하기　위하여　ＡＯ　（acridine orange）및　ＰＩ　（propidium iodide） 염색을 수행하였다．　부착 된 세포를 24시간　동안 상이한 농도의 HNQ로 처리 한 후 AO/PI (1 : 1)로 염색시켰다. 마지막으로 형광 이미지를 EPI 형광 현미경 (Nikon, Japan)으로 촬영하였다.

실험예 6: 세포 내 ROS 수준의 결정

HNQ에 반응하는 ROS（reactive oxygen species) 생산은 H₂DCFDA형광 염색을 사용하여 결정하였다. 세포를 12-웰 배양 플레이트에 접종하고 24 시간동안 부착시킨 후 HNQ (25, 50 및 100μM)를 처리하였다. 처리 24 시간 후, 세포를 PBS로 세척한 후, 30 분 동안 20μM H₂DCFDA염료와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 PBS로 2 회 세척하고, EPI 형광 현미경 (Nikon, Japan)을 사용하여 ROS 형성을 즉시 검출하였다. 형광 강도는 Image-J 소프트웨어를 사용하여 정량화하였다.

실험예 7: 면역 블롯 분석법( Immunoblot analysis)

HeLa 세포를 24 시간동안 다양한 농도의 HNQ (25, 50 및 100μM)로 처리 한 후, RIPA 용해 완충액을 사용하여 단백질을 분리하였다. 동일한 양의 단백질 용해물 (각 레인 당 50μg)을 환원성 폴리아크릴아미드 겔에서 분리하고 전기 블로팅 (electroblotting)을 이용하여 PVDF (polyvinyldenefluoride) 막 (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA)으로 이동시켰다. 이어서, 1차 항체 및 HRP (horseradish peroxidase)-결합된 2차 항체로 탐침하고, 권장 절차 (Amersham Pharmacia, Piscataway, New Jersey)에 따라 ECL (enhanced chemiluminescence)으로 시각화하였다.

실험예 8: In vivo 동물 실험

HeLa 세포를 4 주령의 BALB/cnu/nu 수컷 마우스에 피하주사하였다 (1x10⁶ cell/ml).종양 의 부피가 50 mm³에 도달 했을 때, 비히클 대조군 (5% DMSO) 또는 15 mg/kg HNQ을 무작위로 마우스에 할당하였다. 약물은 i.p.를 통하여 30일 동안, 주 3회 주사하였다. 종양의 성장을 격일로 측정하였으며, 종양 부피는 다음 공식을 이용하여 계산하였다 : 부피 = (폭²×길이)/2. 30일 후, 마우스를 희생시키고 이종 이식편을 IHC 및 웨스턴 블롯팅 분석을 위해 제거하였다.

실험예 9: 통계학적 분석

값을 3회의 독립적인 실험의 평균±로 표시하였다. 통계적 유의성은 Student's t-test로 결정하였다. #는 p <0.05, ##는 p <0.01, ###는 p <0.001을 나타낸다.

실시예

실시예 1: HNQ가 HeLa 자궁경부암 세포의 생존력을 감소시키는 것을 확인

HeLa 세포에 대한 HNQ의 항암 활성 (도 1A)을 조사하기 위해, MTT 어세이를 통하여 자궁 경부암 세포의 증식에 대한 다양한 농도의 HNQ (25, 50 및 100μM)의 영향을 측정하였다.

그 결과 자궁경부암 세포주의 세포 생존력은 HNQ의 노출에 의하여 농도 의존적으로 감소함을 확인하였다 (도 1B). IC₅₀은 100 μM이었다.

HNQ로 처리한 자궁경부암 세포의 광학 현미경 관찰은 다양한 형태학적 변화를 나타내었으며, 예를 들어, GFP-tag LC3 puncta 발현 (도 1C)뿐만 아니라 죽어가는 세포의 특성인, 낮은 농도에서의 세포질의 공포변성 (cytoplasmic vacuolation), 및 높은 농도에서의 세포 수축 (shrinkage)을 나타내었다 (도 1C). 또한, 콜로니 형성 분석은 in vitro에서 HNQ 처리가 HeLa 암 세포의 증식률을 감소 시켰다는 것을 나타냈다 (도 1D).

실시예 2: HNQ가 자궁 경부암 세포에서 세포 독성에 의한 세포 사멸을 유도함을 확인

최근에, 자가포식 (autophagy)이 세포사멸의 새로운 형태로써 세포를 죽도록 유도하는 또 다른 방식임이 밝혀진 바 있다. 이에, 암세포에서 자가포식 세포사멸(autophagic cell death)을 유도하는 것은 종양 치료에 유용 할 수 있다.

GFP-LC3 puncta의 형성 및 면역블롯팅(immunoblotting)은 오토파고좀(autophagosome)을 영상화하는 수단이다. 이에 따라, 본 발명자는 자가포식 (autophagy)를 분석하기 위해 상기 두 가지 방법을 사용하였다.

도 2a에 도시된 바와 같이, HNQ는 HeLa 세포 및 blue nucleus에서 자가포식 (autophagy) 및 많은 수의 자가포식체(autophagy body) (녹색)를 유도할 수 있다. 아크리딘오렌지 염색 현미경을 사용하여, HNQ로 처리된 HeLa 세포에서 자가포식체 (autophagy body)과 오토파지-리소좀 (autophagy-lysosome)을 모니터링하였다 (그림 2A).

다음으로, 자가포식 마커인 LC3가 막에 결합된 형태인, LC3-II의 발현을 측정하였다 (도 2B). 마지막으로, LC3-II 수준의 용량 의존적인 증가가 HNQ 처리 된 HeLa 세포에서 관찰되었다 (도 2B).

이러한 결과는 HNQ가 HeLa 세포에서 자식작용을 유도함을 나타낸다. 또한 ATG5, ATG7, 4EBP-1, APOL1, Beclin-1, p-mTOR, p-AKT와 같은 다른 자가포식 마커의 변화가 관찰되었으며, 이는 HNQ가 자가포식을 유도한다는 것을 시사한다.

실시예 3: 자궁 경부암 세포에서 HNQ가 세포주기 정지 및 노화를 야기한다는 것을 확인

세포주기 및 세포 사멸 분석은 면역 블롯팅을 사용하여 수행하였다. 또한, HNQ로 처리한 후에 증가된 세포 노화를 관찰하였다 (도 3A). 24 시간 동안 일련의 HNQ로 처리한 후, HeLa 세포는 용량 의존적으로 CDK5, CDK4, Cyclin D1 및 p21과 같은 세포주기 정지 마커의 증가를 보였다 (도 3B). HNQ는 용량 의존적으로 SA-β-gal 양성 세포의 증가된 수준을 유도한다.

실시예 4: 자궁 경부암 세포에서 HNQ가 세포 사멸 경로를 유도함을 확인

AO / PI 염색을 통하여 검출한 결과 HNQ는 용량의존적으로 생존 자궁경부암 세포 수를 감소시킨다. 녹색의 AO 흡수는 용량의존적으로 감소하는 반면, 죽은 세포를 염색하는 붉은색은 증가하였다. 또한, 세포 사멸과 관련이 있는 ROS도 상승되는 것을 확인하였다.

산화 스트레스 후, Bax, Bcl2, caspase-3, p53 및 phospho-p38과 같은 세포 사멸 마커에 대한 HNQ의 효과를 평가했다. 그 결과, Bax, cleaved caspase-3, p53 및 phospho-p38과 같은 세포사멸 마커의 증가와 Bcl2 단백질의 감소가 관찰된다는 것을 확인하였다 (도 4B). JNK는 자가포식(autophagy)과 세포사멸(apoptosis) 유도 모두에 이중 역할을 수행한다. 본 발명의 결과에서, 발명자는 JNK가 HNQ 처리 후에 과발현됨을 발견하였다. 이는 JNK가 자가포식 및 세포 사멸 매개 세포 죽음에 결정적인 역할을 할 수 있음을 나타낸다.

실시예 5: 누드 마우스에서 HNQ의 종양 형성 감소효과 확인

생체 내에서 HNQ의 항종양 활성을 연구하기 위해, HeLa 이종 이식 BALB/c 누드 마우스를 50 mg/kg 및 100 mg/kg 투여량의 HNQ 또는 비히클을 처리 하였다. 처리 뒤 24 일 후, 비히클과 비교하여 HNQ가 종양 진행을 억제하는데 중요한 항 종양 활성을 나타낸다는 것을 확인하였다. HNQ는 100 mg/kg의 투여량에서 43.9%의 항종양률을 나타내며 HeLa 종양 성장을 유의하게 억제하였다(도 5A).

한편, 전체 실험을 통해 3 일에 한 번 마우스의 체중을 모니터링하였다. 도 5B에 나타낸 바와 같이, HNQ 처리간에 유의한 차이는 보이지 않았지만, 비히클 군에서는 체중이 현저히 감소하였다. HNQ 그룹에서는 피부 궤양이나 독성 사망과 같은 다른 부작용이 관찰되지 않았다. 이 데이터는 종양 성장의 억제가 전신 독성에 기인 한 것이 아니라는 것을 확인한 것이다.

Claims (6)

1. 로손을 유효성분으로 포함하는, 자궁경부암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
2. 삭제
3. 청구항 1에 있어서, 상기 로손은 암세포 또는 암조직의 사멸, 암세포 주기 정지 또는 암세포 또는 암조직의 노화를 유도하는 것인, 약학적 조성물.
4. 청구항 1에 있어서, 상기 로손은 자가포식 세포 사멸을 유도하는 것인, 약학적 조성물.
5. 로손을 유효성분으로 포함하는, 자궁경부암의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
6. 로손을 유효성분으로 포함하는 자궁경부암의 예방 또는 개선용 사료 조성물.
   

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