CN1058295C - 一种利用基因工程技术制造生技霉素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及利用基因工程技术制造生技霉素的方法，首先将碳霉素产生菌4″异戊酰基转移酶基因克隆至螺旋霉素产生菌，使之表达，所获得的克隆菌株在黄豆饼粉-淀粉斜面培养基上培养，经种子及发酵，从发酵液提取、分离、纯化，得到生技霉素，用此方法生产的生技霉素技术先进，工艺简单，对环境污染少，成本较低，适合于工业化生产，生技霉素为一组4″-酰化螺旋霉素，以4″异戊酰螺旋霉素III，II为主要组分，对革蓝氏阳性细菌有较强的抗菌活性，在动物体内毒性低，其疗效优于红霉素、麦迪霉素和乙酰螺旋霉素。
Description
本发明涉及基因工程技术获得生技霉素的制造方法。生技霉素是一种以异戊酰螺旋霉素为主成分的酰化螺旋霉素，对治疗革兰氏阳性菌感染的效果优于乙酰螺旋霉素。
螺旋霉素由于其组织渗透性好，毒性低，是一类值得重视的抗生素，为进一步改进其疗效，其4”位的酰化是主要方向，目前广泛应用于临床的乙酰螺旋霉素是由化学半合成方法制造的，用化学方法改造螺旋霉素除有环境污染的缺点外，且酰化反应定向差。日本专利(52-82790)曾报导用微生物方法转化螺旋霉素为酰化螺旋霉素。本发明人曾参于利用麦迪霉素产生菌无活性变株对螺旋霉素进行微生物转化获得丙酰螺旋霉素的研究，并获得专利(ZL 87 104409.9)。微生物转化需要先制造螺旋霉素再进行转化，工艺繁琐，且转化率有一定限制。本发明人曾利用基因工程技术研制了4”丙酰螺旋霉素，并获得专利(ZL 90106025.9)。构效关系的研究表明酰化螺旋霉素在体内的疗效与4”位酰基的长度有关，酰基的碳链越长，脂溶性越好，在体内的疗效越好。
本发明的目的在于利用基因工程技术获得直接产生生技霉素的基因工程菌。经发酵生产生技霉素，此方法酰化定向性好，工艺简单，成本较低，并可避免化学方法制造乙酰螺旋霉素所造成的环境污染。初步药效学研究显示生技霉素在动物体内的疗效优于乙酰螺旋霉素，有可能成为良好的药物，创造较好的社会与经济效益。
本发明的内容与要点分述如下：一.生技霉素基因工程菌的构建
利用碳霉素产生菌(Streptomyces thermotoleransATCC11416)4″异戊酰基转移酶基因p66B(来源于美国Wisconsin大学C.R.Hutchinson教授)，其序列发表在(Gene，1989，N.85，p.293-301)，通过DNA转化，转入螺旋霉素产生菌原生质体。原生质体的制备按下述方法进行：首先将螺旋霉素产生菌Str.Spiramyceticus菌种(来源于中国医学科学院医药生物技术研究所菌种保藏室，发表在微生物学报1982，V.22，N.1p.13-16)斜面，挖块接种至培养基(蔗糖10.3％，K2SO4 0.025％，MgCl2·6H2O 1.012％，葡萄糖1.0％，胰胨0.1-0.3％，酪蛋白氨基酸0.05-0.3％，蛋白胨0.2％，酵母浸出物0.2-0.5％，K2HPO4 0.1-0.7％ 10ml/L，三羟甲基氨基甲烷0.1-0.3M(pH6-8)100ml/L，微量元素溶液(ZnCl2 0.04％，FeCl2·6H2O0.02％，CuCl2·2H2O 0.001％，MnCl2·4H2O 0.001％，NaB4O7·10H2O 0.001％)2ml/L，NaOH 0.5-2N 2-10ml/L中，装量为30-50ml/250ml三角瓶，27-32℃培养2-4天。以2.5-10％接种量转种上述同样培养基中，并加入0.1-1％的甘氨酸，在同样条件下培养16-36小时，收集菌体，再用10.3％蔗糖溶液洗涤菌体2-3次，在含溶菌酶0.5-3mg/mlP溶液(三羟甲基氨基甲烷0.25-0.4％ pH8.0，CaCl2·2H2O 0.25-0.4％，MgCl2·6H2O 0.1-0.3％，蔗糖10.3％，葡萄糖1％ pH7.0-8.0)中，28-38℃条件下溶菌15-60分钟，获得原生质体。将4“异戊酰基转移酶基因p66B在浓度为15-50％的PEG媒介下转化原生质体，获得含4”异戊酰基转移酶基因的克隆菌株Streptomycesspiramyceticus p66B-F21，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(螺旋霉素链霉菌Streptomyces spiramyceticusp66B-F21 CGMCC NO.0304)。二.基因工程生技霉素的制造方法：
将上述的含4“异戊酰基转移酶基因的螺旋霉素产生菌克隆菌株Streptomyces spiramyceticus p66B-F21在含5-30ug/ml硫链丝菌素的黄豆饼粉—淀粉斜面培养基上，于25-35℃培养5-14天，挖块法接种于种子培养基(葡萄糖0.5-2％，淀粉2-4％，黄豆饼粉1-3％，NaCl 0.4％，CaCO3 0.3-0.8％)，28℃培养40-80小时，以2.5-10％接种量种入发酵培养基(葡萄糖1-3％，淀粉2-6％，鱼粉1-3％，玉米浆0.5-1.5％，NH4NO3 0.6％，KH2PO4 0.01-0.08％，MgSO4 0.1％，NaCl1.0％，CaCO3 0.3-0.6％)，26-30℃培养72-120小时，发酵液加1％硫酸铝，过滤。滤液用5-10N NaOH调pH至8.5-9.0后，用乙酸丁酯提取，乙酸丁酯提取液用水洗涤后，在pH2.0-2.5转入适量的0.5-1.0％磷酸盐缓冲液，然后，再用2N NaOH调节pH到8.5-9.0，过滤收集形成的沉淀，用水充分洗涤后于50-60℃干燥，即得到生技霉素样品。三.生技霉素的组分及鉴别
生技霉素为一组4″-酰化的螺旋霉素。其样品经两相分配，离心薄层析或真空层析法分离纯化后，经紫外光谱，红外光谱，质谱及1H和13C核磁共振等分析，鉴别其主要组分为4″异戊酰螺旋霉III，II。4″异戊酰螺旋霉素III的分子量为982，分子式C51H86N2O16，UV：λmax(EtOH)230nm(图1)，IR(KBr)：cm-1：3502.3，2936.3，1735.7，1383.8，1164.9，1054.0(图2)。FABMS(m/Z)：983(M+H)+825，740，420，406，229，174，142.1H NMR(500MHz，CDCl3)(图3)，数据见表1.13C NMR(125MHz，CDCl3)(图4)，数据见表2.基于上述光谱数据及对cosy，DEPT，HETCOR谱的仔细分析，4″异戊酰螺旋霉素III的结构见(式1)。4″异戊酰螺旋霉素II的分子量为968，分子式C50H84N2O16，UV：λmax(EtOH)230nm(图5)，IR(KBr)：cm-1：3500.4，2936.3，1734.8，1381.8，1164.9，1054.9(图6)。FABMS(m/Z)：969(M+H)+811，420，392，229，174，142.1H NMR(500MHz，CDCl3)(图7)，数据见表1.13C NMR(125MHz，CDCl3)(图8)，数据见表2.基于上述数据和与4″异戊酰螺旋霉素III光谱数据的比较异戊酰螺旋霉素II的结构见(式1)。四.生技霉素中其他4″-酰化螺旋霉素的鉴别：
生技霉素中除含有异戊酰螺旋霉素III，II组分外，尚含有其它4个组分。这4个组分经与4″-乙酰螺旋霉素及4″-丙酰螺旋霉素用HPLC(Shim-pack CLC ODS柱，甲醇：1％ KH2PO4(48∶52)作流动相，检测波长232nm，流速1ml/min)进行比较对照，这4个组分分别鉴别为4″-乙酰螺旋霉素III，II及4″-丙酰螺旋霉素III，II。五.生技霉素的药效
体外抗菌活性和体内感染小鼠疗效等实验表明，生技霉素不仅对革蓝氏阳性细菌有较强的抗菌活性，而且对部分革蓝氏阴性细菌及厌氧菌有一定的抗菌活性。结果见表3，4，5，6，7.测定了生技霉素小鼠腹腔感染4种菌(肺炎链球菌，肠球菌，溶血性链球菌，金葡菌)的保护效果，实验结果表明，生技霉素在动物体内的疗效优于红霉素、麦迪霉素和乙酰螺旋霉素。结果见表8，9.生技霉素在大鼠组织浓度分布结果见表10，11.
表1 4″-异戊酰螺旋霉素III(1)及II(2)的1HNMR数据(500MHz，CDCl3)
| H | 1 | 2 | |
| δ，ppm；J，Hz | COSY correlaled H | δ，ppm；J，Hz | |
| 2ax2eq34567ax7eq891011121314ax14eq15CH3-1617a17b18CH3-1921a21bCH3-2223 | 2.25，m2.72，dd，J＝11.0，13.35.14，bd，J＝10.83.22，bd，J＝9.13.83，bd，J＝9.12.15，m0.97，m1.45，m1.92，m3,96，dd，J＝3.9，9.65.61，dd，J＝9.6，15.26.56，dd，J＝10.5，15.26.05，dd，J＝10.5，14.75.73，ddd，J＝3.6，11.3，14.72.12，m2.47，m5.01，m1.24，d，J＝6.12.30，m2.79，dd，J＝11.1，18.29.64，s0.97，d，J＝6.52.48(not resolved)2.58，dq，J＝7.5，15.71.20，t，J＝7.53.51，s(OCH3) | 2eq，32ax，32ax，2eq，43，547eq7eq，6，87ax，6，87ax，CH3-19109，1110，1211，1312，14ax，14eq14eq，13，1514ax，13，14ax，CH3-161517eq17ax821b，2221a，2221a，21b | 2.26，bd，J＝13.22.73，dd，J＝11.0，13.25.13，bd，J＝11.03.23，bd，J＝9.13.87，bd，J＝9.12.15，m0.97，m1.45，m1.93，m3.93，dd，J＝4.0，9.75.62，dd，J＝9.7，15.26.55，dd，J＝10.5，15.26.06，dd，J＝10.5，15.05.72，ddd，J＝3.6，11.215.02.12，m2.47，m5.06，m1.25，d，J＝5.52.32，dd，J＝3.0，18.32.82，bdd，J＝11.1，18.9.65，s0.98，d，J＝6.62.27，s(CH3CO)3.52，s(OCH3) |
表1 4″-异戊酰螺旋霉素III(1)及II(2)的1HNMR数据(500MHz，CDCl3)(续)
| H | 1 | 2 | |
| δ，ppm；J，Hz | COSY correlated H | δ，ppm；J，Hz | |
| 1′2′3′4′5′6′7′8′1″2″ax2″eq4″5″CH3-6″CH3-7″9″10″CH3-11″12ax2eq3ax3eq45CH3-678 | 4.40，d，J＝7.83.49，m(over lapped)2.45，m(over lapped)3.25，m3.27，m1.19，d，J＝6.12.50，s[N(CH3)2]5.05，d，J＝3.51.82，dd，J＝4.0，14.11.99，bd，J＝14.14.61，d，J＝10.24.44，dq，J＝6.1，10.21.12，d，J＝6.11.10，s2.29，d，J＝7.52.14，m12″0.96，d，J＝6.64.42，m(over lapped)1.49，m1.85，m1.42，m1.87，m2.27，m3.40，dq，J＝6.2，9.21.21，d，J＝6.22.23，s[N(CH3)2] | 2′1′，3′2′，4′3′6′5′2″ax2″eq，1″2″ax，5″4″，CH3-6″5″10″9″，CH3-11″，12″10″2ax，2eq2eq，1，32ax，1，32eq，3eq，42ax，3ax3ax，54，CH3-65 | 4.42，d，J＝7.53.50，dd，J＝7.5，10.42.46，dd，J＝6.7，10.43.26，m3.28，m1.19，d，J＝6.62.50，s[N(CH3)2]5.06，d，J＝3.51.83，dd，J＝4.0，14.22.00，bd，J＝14.24.61，d，J＝10.24.44，dq，J＝6.2，10.21.13，d，J＝6.21.11，s2.29，d，J＝7.02.14，m0.97，d，J＝6.64.39，bd，J＝9.31.48，m1.84，m1.43，m1.85，m2.25，m3.40，dq，J＝6.2，9.31.20，d，J＝6.22.21，s |
表2 4′-异戊酰螺旋霉素III(1)及II(2)的13CNMR数据(125MHz，CDCl3)
| C | 1 | 2 | C | 1 | 2 |
| δ，ppm(DEPT) | δ，ppm | δ，ppm(DEPT) | δ，ppm | ||
| 12345678910111213141516171819202122231′2′3′4′ | 169.94 (C)37.25 (CH2)69.14 (CH)84.69 (CH)77.71 (CH)28.93 (CH)30.11 (CH2)31.85 (CH)79.78 (CH)126.64 (CH)135.29 (CH)132.18 (CH)131.91 (CH)41.03 (CH2)69.14 (CH)20.31 (CH3)42.46 (CH2)201.28 (CH)15.36 (CH3)173.85 (C)27.64 (CH2)8.94 (CH3)62.39 (CH3)103.88 (CH)71.60 (CH)68.73 (CH)75,90 (CH) | 169.9637.1469.1084.8077.6028.8630.0331.9779.79126.59135.41132.25131.8441.0269.1820.3342.42201.2115.37170.7921.2562.45103.7471.6168.7175.96 | 5′6′7′8′1″2″3″4″5″6″7″8″9″10″11″12″12345678 | 72.97 (CH)19.00 (CH3)41.92 (CH3)41.92 (CH3)97.02 (CH)41.67 (CH2)69.33 (C)77.00 (CH)63.48 (CH)17.81 (CH3)25.32 (CH3)172.92 (C)43.20 (CH2)25.52 (CH)22.36 (CH3)*22.42 (CH3)*100.09 (CH)31.17 (CH2)18.55 (CH2)64.85 (CH)73.61 (CH)18.79 (CH3)40.64 (CH3)40.64 (CH3) | 72.9518.9841.9241.9297.0441.6969.3477.0063.5017.8125.34172.9243.2925.5222.36*22.41*100.2931.2118.4764.8473.7518.7940.6640.66 |
*Data in the same culumn are interchangeable
表3生技霉素的抗菌谱
| 菌 种 | 最低抑菌浓度 MIC μg/ml | |||
| 生技霉素 | 乙酰螺旋霉素 | 红霉素 | 麦迪霉素 | |
| 肺炎链球菌74肺炎链球菌P210肺炎链球菌936甲类链球菌A3甲类链球菌A15甲类链球菌A18溶血性链球菌A10溶血性链球菌9439溶血性链球菌9449肠球菌9426肠球菌9431肠球菌9432金葡菌ATCC25923金葡菌855金葡菌858金葡菌8539金葡菌8551表葡菌8914表葡菌8932表葡菌8943表葡菌8930表葡菌923卡他球菌936卡他球菌939伤寒杆菌921伤寒杆菌922鼠伤寒杆菌931粘质沙雷氏菌931粘质沙雷氏菌932枸橼酸杆菌921枸橼酸杆菌922致病性大肠杆菌44155产毒大肠杆菌44813产气肠杆菌951阴沟气杆菌925肺炎克雷伯氏菌7奇异变形杆菌49005痢疾志贺氏菌51174鲍氏志贺氏菌51265鸡沙门氏菌50770 | 0.50.50.250.010.060.060.120.250.250.50.50.50.50.060.060.060.0310.510.120.25640.25＞64＞64＞64＞64＞64＞6464＞64＞64＞64＞64＞64＞64832＞64 | 110.50.060.060.060.2520.250.50.250.2514816220.520.52321＞64＞64＞64＞64＞64＞64＞64＞64＞64＞64＞64＞64＞641664＞64 | 0.510.50.030.010.010.060.060.121110.54＞128＞1280.06320.060.060.250.06＞64＞64163216＞64＞6464＞64886464＞64＞642216 | 0.510.50.030.060.020.250.5162120.50.12＞1280.50.1210.06121832＞64＞64＞64＞64＞64＞64＞6464＞64＞64＞64＞64＞64264＞64 |
表4生技霉素对22株厌氧菌抗菌作用
| 菌 种 | MIC μg/ml | ||||
| 生技霉素 | 麦迪霉素 | 乙酰螺旋霉素 | 红霉素 | 灭滴灵 | |
| 脆弱类杆菌脆弱类杆菌脆弱类杆菌脆弱类杆菌普通类杆菌普通类杆菌吉氏类杆菌吉氏类杆菌多型类杆菌ATCC29741多型类杆菌口腔普氏杆菌不解糖普氏杆菌消化球菌消化链球菌产气荚膜梭菌ATCC15132产气荚膜梭菌疮疱丙酸杆菌疮疱丙酸杆菌乳杆菌乳杆菌酵母样真菌酵母样真菌 | 0.50.510.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5110.50.50.51＞64＞64 | 11112111111111441111＞64＞64 | 0.50.510.50.50.510.50.50.50.50.50.50.5120.50.50.50.5＞64＞64 | 10.2510.250.250.250.250.250.250.250.250.250.250.50.510.50.250.250.5＞64＞64 | 0.50.250.50.250.250.250.250.250.50.50.250.250.250.50.250.521164＞64＞64 |
表5生技霉素及其它抗菌素对G+菌抗菌活性比较
| 试验菌及株数 | 药 物 | MIC 范围μg/ml | MIC50μg/ml | MIC90μg/ml | |
| 肺炎链球菌(43) | 生技霉素乙酰螺旋霉素红霉素麦迪霉素 | 0.03-640.03-＞640.005-＞640.03-＞64 | 0.120.120.010.12 | 486464 | |
| 溶血性链球菌(55) | 生技霉素乙酰螺旋霉素红霉素麦迪霉素 | 0.12-640.25-＞640.05-＞640.002-＞64 | 0.50.250.120.25 | 16321664 | |
| 金葡菌(产β-内酰胺酶)(86) | 生技霉素乙酰螺旋霉素红霉素麦迪霉素 | 0.06-＞640.5-＞640.12-＞640.12-＞64 | 24641 | ＞64＞64＞64＞64 | |
| 金葡菌(不产β-内酰胺酶)(76) | 生技霉素乙酰螺旋霉素红霉素麦迪霉素 | 0.03-＞640.25-＞640.03-＞640.03-＞64 | 164644 | ＞64＞64＞64＞64 | |
| 表葡菌(产β-内酰胺酶)(59) | 生技霉素乙酰螺旋霉素红霉素麦迪霉素 | 0.5-＞640.5-＞640.03-＞640.06-＞64 | 32323232 | ＞64＞64＞64＞64 | |
| 表葡菌(不产β-内酰胺酶)(67) | 生技霉素乙酰螺旋霉素红霉素麦迪霉素 | 0.03-＞640.12-＞640.03-＞640.06-＞64 | 64646432 | ＞64＞64＞64＞64 | |
表6生技霉素及其它抗菌素对流感杆菌和淋球菌抗菌活性比较
| 试验菌及株数 | 药 物 | MIC 范围μg/ml | MIC50μg/ml | MIC90μg/ml |
| 流感杆菌(30) | 生技霉素乙酰螺旋霉素红霉素麦迪霉素 | 0.03-320.03-＞640.03-＞640.01-＞64 | 0.060.060.060.03 | 4412 |
| 淋球菌(10) | 生技霉素乙酰螺旋霉素红霉素麦迪霉素 | 0.12-160.12-640.12-640.12-64 | 2410.5 | 8882 |
表7生技霉素对临床分离耐红霉素金葡菌和肺炎链球菌抗菌活性
| 试验菌及株数 | 药 物 | MIC 范围μg/ml | MIC50μg/ml | MIC90μg/ml |
| 耐红霉素金葡菌(产β-内酰胺酶)(20) | 生技霉素乙酰螺旋霉素红霉素麦迪霉素 | 0.06＞1281-＞12832-＞1280.12-＞128 | 181280.25 | 16128＞12816 |
| 耐红霉素金葡菌(不产β-内酰胺酶)(13) | 生技霉乙酰螺旋霉素红霉素麦迪霉素 | 0.06-＞1280.25-＞12832-＞1280.5-＞128 | 0.546464 | 16128128128 |
| 耐红霉素肺炎链球菌(11) | 生技霉素乙酰螺旋霉素红霉素麦迪霉素 | 0.5-641-＞6416-＞6416-＞64 | 283232 | 3264＞6464 |
表8生技霉素对小鼠腹腔感染6株G+菌保护效果试验菌 攻击量 药物 ED50(mg/kg)(有效剂量)肺炎链球菌8 7.3×104 生技霉素 12.62
乙酰螺旋霉素 14.10
红霉素 66.48
麦迪霉素 96.19肺炎链球菌18 6.7×103 生技霉素 8.03
乙酰螺旋霉素 11.28
红霉素 30.08
麦迪霉素 55.28溶血性链球菌772 7.2×103 生技霉素 30.08
乙酰螺旋霉素 42.07
红霉素 91.08
麦迪霉素 119.66肠球菌27 7.2×103 生技霉素 47.36
乙酰螺旋霉素 51.27
红霉素 111.94
麦迪霉素 202.24肠球菌32 8.9×104 生技霉素 124.84
乙酰螺旋霉素 145.36
红霉素 152.85
麦迪霉素 208.69金葡菌32 8.9×104 生技霉素 91.08
乙酰螺旋霉素 158.19
麦迪霉素 253.44
表9生技霉素在动物体内的治疗指数溶血性链球菌 生技霉素 76.9
乙酰螺旋霉素 37.1肺炎球菌 生技霉素 700.3
乙酰螺旋霉素 385.5金葡菌 生技霉素 37.2
乙酰螺旋霉素 20.4由表可见生技霉素在体内的安全性和有效性明显优于乙酰螺旋霉素。
表10生技霉素在大鼠组织浓度分布(ug/g)组织 0.5h 1h 1.5h 2.0h 3.0h 4.0h 6.0h 8.0h 12h心 9.18 11.02 8.40 6.78 9.64 11.57 9.72 5.02肺 10.65 10.86 15.17 18.08 8.63 16.26 15.51 6.70肝 6.14 68.96 69.60 100.52 105.86 102.48 86.94 65.24 44.40脾 1.77 17.63 22.54 29.34 40.66 33.58 42.16 39.63 34.44肾 11.28 12.00 11.12 25.44 18.30 42.34 22.92 15.82胃 8.82 16.40 19.19 17.60 11.91 12.20 12.96 10.28 12.02肠 85.69 24.44 38.94 17.82 32.59 25.52 31.70 11.08脂肪 3.04 5.18 4.12 2.28 1.04 2.72 1.66 1.44肌肉 3.37 1.62 1.00 1.22 2.08 1.92 2.60 1.58子宫 3.34血 2.10 1.46 1.28 0.84 18.20 1.33 0.84 0.47
表11生技霉素在大鼠组织浓度分布(ug/g)(续)组织 14h 16h 20h 36h 48h 70h 94h 118h 142h 166h心 4.31 2.90 2.38 4.12 2.06 1.74 0.64肺 8.03 8.46 6.59 5.66 8.32 4.24 2.35 2.47肝 40.15 30.02 24.48 13.25 17.48 13.85 9.10 3.52脾 33.92 32.64 25.81 29.82 25.87 16.64 15.02 5.52 4.46肾 14.66 17.34 13.40 15.41 11.50 10.43 5.66 4.88胃 7.40 6.26 4.75 5.83 5.76 4.08 1.68 1.34肠 10.68 8.82 6.42 9.58 6.92 6.70脂肪 1.54 1.64 1.47 1.14肌肉 1.09 1.11 0.54 0.38子宫 5.16 2.42 2.20 2.22血 0.46 0.32 0.25 0.27
药代动力学研究表明，生技霉素在动物体内比较稳定，能维持较长有效浓度时间。生技霉素Ames(致突)实验结果为阴性。生技霉素的大鼠及小鼠的口服急性毒性(LD50)均为＞4000mg/kg。附图说明：
图1. 4”异戊酰螺旋霉素III的紫外光谱
图2. 4”异戊酰螺旋霉素III的红外光谱
图3. 4”异戊酰螺旋霉素III的1H NMR谱
图4. 4”异戊酰螺旋霉素III的13C NMR谱
图5. 4”异戊酰螺旋霉素II的紫外光谱
图6. 4”异戊酰螺旋霉素II的红外光谱
图7. 4”异戊酰螺旋霉素II的1H NMR谱
图8. 4”异戊酰螺旋霉素II的13C NMR谱
式(1) 4″-异戊酰螺旋霉素III
4″-异戊酰螺旋霉素II
Claims (4)
1.一种利用基因工程技术制造生技霉素的方法，其特征包括如下步骤：A.将碳霉素产生菌4”异戊酰基转移酶基因p66B克隆至螺旋霉素链霉菌，使之表达，获得含4”异戊酰基转移酶基因p66B的螺旋霉素链霉菌(Streptomyces spiramyceticus)p66B-F21 CGMCC No.0304；B.将螺旋霉素链霉菌p66B-F21 CGMCC No.0304在黄豆饼粉—淀粉斜面培养基上培养，经种子及发酵培养，从发酵液提取、分离、纯化，得到生技霉素。
2.如权利要求1所述的一种利用基因工程技术制造生技霉素的方法，其特征在于将碳霉素产生菌4”异戊酰基转移酶基因p66B在15-50％浓度PEG媒介下，转入螺旋霉素链霉菌的原生质体中，获得含有4”异戊酰基转移酶基因p66B的螺旋霉素链霉菌p66B-F21 CGMCC No.0304。
3.如权利要求1所述的一种利用基因工程技术制造生技霉素的方法，其特征在于将所述的含有4”异戊酰基转移酶基因p66B的螺旋霉素链霉菌，在含有5-30ug/ml硫链丝菌素的黄豆饼粉—淀粉斜面培养基上，于25-35℃培养5-14天，挖块法接种于种子培养基，所述的种子培养基含有葡萄糖0.5-2％，淀粉2-4％，黄豆饼粉1-3％，NaCl 0.4％，CaCO3 0.3-0.8％，28℃培养40-80小时，以2.5-10％接种量种入发酵培养基，所述的发酵培养基含有葡萄糖1-3％，淀粉2-6％，鱼粉1-3％，玉米浆0.5-1.5％，NH4NO3 0.6％，KH2PO4 0.01-0.08％，MgSO40.1％，NaCl 1.0％，CaCO3 0.3-0.6％，于26-30℃发酵培养72-120小时，获得发酵液。
4.如权利要求1所述的一种利用基因工程技术制造生技霉素的方法，其特征在于在发酵液中加入1％硫酸铝，过滤，滤液用5-10N NaOH调pH至8.5-9.0后，用乙酸丁酯提取，乙酸丁酯提取液用水洗涤后，在pH2.0-2.5转入适量的0.5-1.0％磷酸盐缓冲液，然后再用2N NaOH调节pH至8.5-9.0，过滤收集形成的沉淀，用水充分洗涤后，于50-60℃干燥，即可得到生技霉素样品。
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