KR20190092372A - 트레프로스티닐 프로드럭 - Google Patents

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Abstract

트레프로스티닐의 신규한 프로드럭뿐 아니라, 이들 프로드럭을 제조하는 방법 및 사용하는 방법이 제공된다.

Description

트레프로스티닐 프로드럭
본 발명은 일반적으로 프로스타사이클린, 특히 트레프로스티닐(treprostinil)의 프로드럭(prodrug) 및 이러한 프로드럭을 제조 및 사용하는 방법에 관한 것이다.
관련 출원
본 발명은 그 전체가 본원에 참고문헌으로 원용되는 2016년 9월 26일자로 출원된 미국 가특허출원 제62/399,737호를 우선권으로 주장한다.
배경
폐고혈압은 폐 혈관구조에서의 압력 증가가 특징인, 진행성이며 생명을 위협하는 질환이며, 특히 심부전을 야기할 수 있다.
폐고혈압(PH)은 이전에 원발성(특발성) 또는 속발성으로 분류되어 왔다. 세계 보건 기구(WHO)는 폐고혈압을 5개 그룹으로 분류하여 왔다:
그룹 1: 폐동맥 고혈압(pulmonary arterial hypertension)(PAH);
그룹 1': 폐 정맥폐색 질환(Pulmonary veno-occlusive disease)(PVOD) 및/또는 폐 모세혈관 혈관종증(pulmonary capillary haemangiomatosis)(PCH)
그룹 2: 좌심 질환이 있는 PH;
그룹 3: 폐질환 및/또는 저산소증이 있는 PH;
그룹 4: 만성 혈전증 및/또는 색전증 질환으로 인한 PH; 및
그룹 5: 다양한 병태; 불확실한 다인성 메커니즘(예를 들어, 사르코이드증, 조직구증 X, 림프관종증 및 폐혈관의 압박).
현재 그룹 1(PAH)을 포함하여, 폐고혈압의 특정 유형에 대한 다수의 승인된 제품이 있다. 이러한 제품은 활성 성분으로서 트레프로스티닐을 함유하는 제품, 예컨대 Remodulin® 트레프로스티닐 주사를 포함한다. 그러나, 트레프로스티닐은 때때로 피하로 투여될 때 부위 통증과 관련된다. 따라서, 부위 통증을 야기하지 않으면서 트레프로스티닐을 투여할 필요성이 존재한다.
요약
일 실시양태는, 질환 또는 병태를 앓고 있으며 트레프로스티닐 또는 이의 약학적 염의 피하 투여시 부위 통증을 겪었던 환자를 선택하는 것, 및 트레프로스티닐 프로드럭의 유효량을 상기 환자에게 피하로 투여하는 것을 포함하되, 상기 질환 또는 병태는 폐고혈압, 울혈성 심부전, 말초 혈관 질환, 레이노 증후군(Raynaud's phenomenon), 피부경화증, 신부전증, 말초 신경병증, 손가락 궤양, 간헐성 파행증, 허혈성 사지 질환, 말초 허혈성 병변, 폐섬유증 및 천식으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 질환 또는 병태인, 질환 또는 병태를 치료하는 방법이다.
다른 실시양태는 트레프로스티닐 프로드럭의 유효량을 폐고혈압을 앓고 있는 환자에게 피하로 투여하는 것을 포함하는, 폐고혈압을 치료하는 방법이다.
또 다른 실시양태는 하기 화학식 중 하나를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이다:
Figure pct00001
;
Figure pct00002
;
Figure pct00003
;
Figure pct00004
;
Figure pct00005
;
Figure pct00006
;
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Figure pct00008
;
Figure pct00009
;
Figure pct00010
;
Figure pct00011
; 또는
Figure pct00012
.
도 1은 사이클로펜틸 고리 카바메이트 프로드럭 I의 합성을 나타내는 반응식이다.
도 2는 측쇄 카바메이트 프로드럭 II의 합성을 나타내는 반응식이다.
도 3은 사이클로펜틸 고리 카보네이트 프로드럭 III의 합성을 나타내는 반응식이다.
도 4는 측쇄 카보네이트 프로드럭 IV의 합성을 나타내는 반응식이다.
도 5는 아세테이트 아미드 프로드럭 VII의 합성을 나타내는 반응식이다.
도 6은 핵심 출발 물질의 합성을 나타내는 반응식이다.
도 7은 선택된 프로드럭의 화학식을 나타낸다.
도 8은 Remodulin 및 트레프로스티닐 프로드럭의 혈장 농도를 시간의 함수로서 나타내는 플롯이다. 정맥내 및 피하 Remodulin에 대해 나타낸 데이터 포인트(각각 도면에서 "IV" 및 "SQ"로서 나타냄)를 폐고혈압을 앓고 있는 환자와 관련된 임상 시험으로부터 수득하여, 피하로 투여된 트레프로스티닐이 정맥내로 투여된 트레프로스티닐과 생물학적-동등성이었음을 나타내었다. "상한" 및 "하한"으로 표시된 플롯은 피하 Remodulin과 생물학적-동등성의 범위를 반영한다. 트레프로스티닐 프로드럭에 대한 플롯("프로드럭"으로 표시됨)은 피하로 투여된 Remodulin의 플롯과 비슷할 수 있는 데이터 포인트의 하나의 가능한 세트를 나타내는데, 여기서 프로드럭은 생체내(in vivo)에서 트레프로스티닐 유리 산으로 전환되었으며, 혈장 내 유리 산 트레프로스티닐의 양이 플롯팅되어 있다.
도 9는 하기 중 하나가 투여된 시험된 래트에서의 부위 통증으로 인한 회피 시간(withdrawal time)을 보고하되, 여기서 수직 막대는 제형의 투여 후 t=0, 15분 및 90분에서 열 자극에 대한 반응으로 시험된 래트가 그것의 발을 얼마나 빨리 피하는지를 나타낸다: a) 식염수, b) 시트레이트 완충제, 염화나트륨 및 m-크레졸을 함유하지만 트레프로스티닐을 함유하지 않은 (Remodulin) 위약 제형; c) 트레프로스티닐, 시트레이트 완충제, 염화나트륨 및 m-크레졸을 함유한, 1㎍/mL의 트레프로스티닐 농도를 갖는 제1 Remodulin 제형; d) 트레프로스티닐, 시트레이트 완충제, 염화나트륨 및 m-크레졸을 함유한, 100㎍/mL의 트레프로스티닐 농도를 갖는 제2 Remodulin 제형.
도 10a-d는 선택된 프로드럭을 나타낸다.
도 11은 ACE Excel 2 C18 컬럼을 사용한 트레프로스티닐 및 8종의 선택된 프로드럭의 크로마토그래피 오버레이를 나타낸다. 특이성 연구의 결과는 트레프로스티닐이 공동-용리되는 프로드럭 XIV를 제외한 모든 프로드럭으로부터 잘 분리된다는 것을 나타낸다.
도 12는 Waters BEH C18 컬럼을 사용한 트레프로스티닐 및 8종의 선택된 프로드럭의 크로마토그래피 오버레이를 나타낸다.
도 13은 ACE Excel 2 C18-AR 컬럼(C18-페닐 상)을 사용한 트레프로스티닐 및 8종의 선택된 프로드럭의 크로마토그래피 오버레이를 나타낸다.
도 14는 Waters CSH 페닐 헥실 컬럼을 사용한 트레프로스티닐 및 8종의 선택된 프로드럭의 크로마토그래피 오버레이를 나타낸다.
도 15는 선택된 프로드럭에 대한 반감기 값을 요약한다.
도 16은 실시예 9 및 11에 사용되는 발바닥 내 모델 도입 및 처치의 도식적 표현이다. 열 시험은 본 프레이(Von Frey) 시험 직후(10분 이내의 차이) 수행하였다.
도 17은 사이클 1의 본 프레이 반응 시험에 대한 결과(g)를 나타낸다. 작은 힘은 큰 민감도를 나타낸다. 기준선, 15분 및 90분 시험 시점 각각의 경우에, 컬럼은 좌에서 우로 다음을 나타낸다: 식염수(그룹 1), PBS(그룹 2), 트레프로스티닐 100㎍/mL(그룹 3), 프로드럭 I 100㎍/mL(그룹 4), 프로드럭 II 100㎍/mL(그룹 5), 프로드럭 VII 100㎍/mL(그룹 6), 프로드럭 VIII 100㎍/mL(그룹 7).
도 18은 사이클 2의 본 프레이 반응 시험에 대한 결과(g)를 나타낸다. 작은 힘은 큰 민감도를 나타낸다. 기준선, 15분 및 90분 시험 시점 각각의 경우에, 컬럼은 좌에서 우로 다음을 나타낸다: 식염수(그룹 8), PBS(그룹 9), 트레프로스티닐 1㎍/mL(그룹 10), 프로드럭 I 1㎍/mL(그룹 11), 프로드럭 II 1㎍/mL(그룹 12), 프로드럭 VII 1㎍/mL(그룹 13), 프로드럭 VIII 1㎍/mL(그룹 14).
도 19는 사이클 1의 열 반응 시험에 대한 결과(초)를 나타낸다. 짧은/빠른 시간은 큰 민감도를 나타낸다. 기준선, 15분 및 90분 시험 시점 각각의 경우에, 컬럼은 좌에서 우로 다음을 나타낸다: 식염수(그룹 1), PBS(그룹 2), 트레프로스티닐 100㎍/mL(그룹 3), 프로드럭 I 100㎍/mL(그룹 4), 프로드럭 II 100㎍/mL(그룹 5), 프로드럭 VII 100㎍/mL(그룹 6), 프로드럭 VIII 100㎍/mL(그룹 7).
도 20은 사이클 2의 열 반응 시험에 대한 결과(초)를 나타낸다. 짧은/빠른 시간은 큰 민감도를 나타낸다. 기준선, 15분 및 90분 시험 시점 각각의 경우에, 컬럼은 좌에서 우로 다음을 나타낸다: 식염수(그룹 8), PBS(그룹 9), 트레프로스티닐 1㎍/mL(그룹 10), 프로드럭 I 1㎍/mL(그룹 11), 프로드럭 II 1㎍/mL(그룹 12), 프로드럭 VII 1㎍/mL(그룹 13), 프로드럭 VIII 1㎍/mL(그룹 14).
도 21은 사이클 1의 평균 임상 점수(포인트)를 나타낸다. 증가된/높은 점수는 더 많은 부작용의 관찰을 나타낸다. 15분 및 90분 시험 시점 각각의 경우에, 데이터는 좌에서 우로 다음을 나타낸다: 식염수(그룹 1), PBS(그룹 2), 트레프로스티닐 100㎍/mL(그룹 3), 프로드럭 I 100㎍/mL(그룹 4), 프로드럭 II 100㎍/mL(그룹 5), 프로드럭 VII 100㎍/mL(그룹 6), 프로드럭 VIII 100㎍/mL(그룹 7). 15분 시점에 대해, 0 점이 아닌(non-zero) 관찰은 좌에서 우로 다음을 나타낸다: 트레프로스티닐 100㎍/mL(그룹 3), 프로드럭 I 100㎍/mL(그룹 4), 프로드럭 II 100㎍/mL(그룹 5), 프로드럭 VII 100㎍/mL(그룹 6), 프로드럭 VIII 100㎍/mL(그룹 7). 90분 시점에 대해, 0 점이 아닌 관찰은 좌에서 우로 다음을 나타낸다: 트레프로스티닐 100㎍/mL(그룹 3), 프로드럭 I 100㎍/mL(그룹 4), 프로드럭 II 100㎍/mL(그룹 5), 프로드럭 VII 100㎍/mL(그룹 6).
도 22는 사이클 2의 평균 임상 점수(포인트)를 나타낸다. 증가된/높은 점수는 더 많은 부작용의 관찰을 나타낸다. 15분 및 90분 시험 시점 각각의 경우에, 데이터는 좌에서 우로 다음을 나타낸다: 식염수(그룹 8), PBS(그룹 9), 트레프로스티닐 1㎍/mL(그룹 10), 프로드럭 I 1㎍/mL(그룹 11), 프로드럭 II 1㎍/mL(그룹 12), 프로드럭 VII 1㎍/mL(그룹 13), 프로드럭 VIII 1㎍/mL(그룹 14). 15분 및 90분 시험 시점 각각의 경우에, 0 점이 아닌 관찰은 트레프로스티닐 1㎍/mL(그룹 10)에 해당한다.
도 23은 실시예 10에 사용되는 발바닥 내 모델 도입 및 처치의 도식적 표현이다.
도 24는 본 프레이 반응 시험에 대한 결과(g)를 나타낸다. 작은 힘은 큰 민감도를 나타낸다. 기준선, 15분 및 90분 시험 시점 각각의 경우에, 컬럼은 좌에서 우로 다음을 나타낸다: 포스페이트 완충제(그룹 1), 트레프로스티닐 100㎍/mL(그룹 2), 트레프로스티닐 1㎍/mL(그룹 3), 프로드럭 VII 100㎍/mL(그룹 4), 프로드럭 VII 1㎍/mL(그룹 5), 프로드럭 XV 100㎍/mL(그룹 6), 프로드럭 XV 1㎍/mL(그룹 7).
도 25는 열 반응 시험에 대한 결과(초)를 나타낸다. 짧은/빠른 시간은 큰 민감도를 나타낸다. 기준선, 15분 및 90분 시험 시점 각각의 경우에, 컬럼은 좌에서 우로 다음을 나타낸다: 포스페이트 완충제(그룹 1), 트레프로스티닐 100㎍/mL(그룹 2), 트레프로스티닐 1㎍/mL(그룹 3), 프로드럭 VII 100㎍/mL(그룹 4), 프로드럭 VII 1㎍/mL(그룹 5), 프로드럭 XV 100㎍/mL(그룹 6), 프로드럭 XV 1㎍/mL(그룹 7).
도 26은 사이클 1의 평균 임상 점수(포인트)를 나타낸다. 증가된/높은 점수는 더 많은 부작용의 관찰을 나타낸다. 15분 및 90분 시험 시점 각각의 경우에, 데이터는 다음을 좌에서 우로 나타내었다: 포스페이트 완충제(그룹 1), 트레프로스티닐 100㎍/mL(그룹 2), 트레프로스티닐 1㎍/mL(그룹 3), 프로드럭 VII 100㎍/mL(그룹 4), 프로드럭 VII 1㎍/mL(그룹 5), 프로드럭 XV 100㎍/mL(그룹 6), 프로드럭 XV 1㎍/mL(그룹 7). 15분 및 90분 시점 각각의 경우에, 포스페이트 완충제에 대해 0 점이 관찰되었다. 따라서, 좌측으로부터 첫번째인 0 점이 아닌 컬럼은 트레프로스티닐 100㎍/mL(그룹 2)를 나타낸다.
도 27은 사이클 1의 본 프레이 반응 시험에 대한 결과(g)를 나타낸다. 작은 힘은 큰 민감도를 나타낸다. 기준선, 15분 및 90분 시험 시점 각각의 경우에, 컬럼은 좌에서 우로 다음을 나타낸다: 포스페이트 완충제(그룹 1), 트레프로스티닐 100㎍/mL(그룹 2), 프로드럭 VII 100㎍/mL(그룹 3), 프로드럭 III 100㎍/mL(그룹 4), 프로드럭 IV 100㎍/mL(그룹 5), 프로드럭 XIV 100㎍/mL(그룹 6).
도 28은 사이클 2의 본 프레이 반응 시험에 대한 결과(g)를 나타낸다. 작은 힘은 큰 민감도를 나타낸다. 기준선, 15분 및 90분 시험 시점 각각의 경우에, 컬럼은 좌에서 우로 다음을 나타낸다: 포스페이트 완충제(그룹 7), 트레프로스티닐 1㎍/mL(그룹 8), 프로드럭 VII 1㎍/mL(그룹 9), 프로드럭 III 1㎍/mL(그룹 10), 프로드럭 IV 1㎍/mL(그룹 11), 프로드럭 XIV 1㎍/mL(그룹 12).
도 29는 사이클 1의 열 반응 시험에 대한 결과(초)를 나타낸다. 짧은/빠른 시간은 큰 민감도를 나타낸다. 기준선, 15분 및 90분 시험 시점 각각의 경우에, 컬럼은 좌에서 우로 다음을 나타낸다: 포스페이트 완충제(그룹 1), 트레프로스티닐 100㎍/mL(그룹 2), 프로드럭 VII 100㎍/mL(그룹 3), 프로드럭 III 100㎍/mL(그룹 4), 프로드럭 IV 100㎍/mL(그룹 5), 프로드럭 XIV 100㎍/mL(그룹 6).
도 30은 사이클 2의 열 반응 시험에 대한 결과(초)를 나타낸다. 짧은/빠른 시간은 큰 민감도를 나타낸다. 기준선, 15분 및 90분 시험 시점 각각의 경우에, 컬럼은 좌에서 우로 다음을 나타낸다: 포스페이트 완충제(그룹 7), 트레프로스티닐 1㎍/mL(그룹 8), 프로드럭 VII 1㎍/mL(그룹 9), 프로드럭 III 1㎍/mL(그룹 10), 프로드럭 IV 1㎍/mL(그룹 11), 프로드럭 XIV 1㎍/mL(그룹 12).
도 31은 사이클 1의 평균 임상 점수(포인트)를 나타낸다. 증가된/높은 점수는 더 많은 부작용의 관찰을 나타낸다. 15분 및 90분 시험 시점 각각의 경우에, 데이터는 다음을 좌에서 우로 나타내었다: 포스페이트 완충제(그룹 1), 트레프로스티닐 100㎍/mL(그룹 2), 프로드럭 VII 100㎍/mL(그룹 3), 프로드럭 III 100㎍/mL(그룹 4), 프로드럭 IV 100㎍/mL(그룹 5), 프로드럭 XIV 100㎍/mL(그룹 6). 15분 및 90분 시점 각각에서, 포스페이트 완충제에 대해 0 점이 관찰되었다. 따라서, 좌측으로부터 첫번째인 0 점이 아닌 컬럼은 트레프로스티닐 100㎍/mL(그룹 2)를 나타낸다.
도 32는 사이클 2의 평균 임상 점수(포인트)를 나타낸다. 증가된/높은 점수는 더 많은 부작용의 관찰을 나타낸다. 15분 및 90분 시험 시점 각각의 경우에, 데이터는 다음을 좌에서 우로 나타내었다: 포스페이트 완충제(그룹 7), 트레프로스티닐 1㎍/mL(그룹 8), 프로드럭 VII 1㎍/mL(그룹 9), 프로드럭 III 1㎍/mL(그룹 10), 프로드럭 IV 1㎍/mL(그룹 11), 프로드럭 XIV 1㎍/mL(그룹 12). 15분 및 90분 시점 각각에서, 포스페이트 완충제에 대해 0 점이 관찰되었다. 따라서, 좌측으로부터 첫번째인 0 점이 아닌 컬럼은 트레프로스티닐 1㎍/mL(그룹 8)를 나타낸다.
도 33은 심박수에 대한 전파 원격 측정 데이터의 요약을 나타낸다. 데이터는 평균±SEM으로서 나타내었다.
도 34는 수축기 혈압에 대한 전파 원격 측정 데이터의 요약을 나타낸다. 데이터는 평균±SEM으로서 나타내었다.
도 35는 확장기 혈압에 대한 전파 원격 측정 데이터의 요약을 나타낸다. 데이터는 평균±SEM으로서 나타내었다.
도 36은 평균 동맥압에 대한 전파 원격 측정 데이터의 요약을 나타낸다. 데이터는 평균±SEM으로서 나타내었다.
도 37은 맥압에 대한 전파 원격 측정 데이터의 요약을 나타낸다. 데이터는 평균±SEM으로서 나타내었다.
도 38은 체온에 대한 전파 원격 측정 데이터의 요약을 나타낸다. 데이터는 평균±SEM으로서 나타내었다.
도 39는 프로드럭 VIII의 합성을 위한 반응식을 도식적으로 나타낸다.
상세한 설명
달리 명시되지 않는 경우, 단수형은 하나 이상을 지칭한다.
Remodulin®에서의 활성 성분인 트레프로스티닐(주사용 또는 정맥내 트레프로스티닐), Tyvaso®(흡입용 트레프로스티닐), 및 Orenitram®(트레프로스티닐의 경구 고체 투여 형태)은 미국 특허 제4,306,075호에 기재되었다. 트레프로스티닐 및 다른 프로스타사이클린 유도체를 제조하는 방법은 예를 들어, Moriarty, et al., J. Org. Chem. 2004, 69, 1890-1902, Drug of the Future, 2001, 26(4), 364-374, 미국 특허 제6,441,245호, 제6,528,688호, 제6,700,025호, 제6,809,223호, 제6,756,117호, 제8,461,393호, 제8,481,782호; 제8,242,305호, 제8,497,393호, 제8,940,930호, 제9,029,607호, 제9,156,786호 및 제9,388,154호, 제9,346,738호; 미국 특허출원 공보 제2012-0197041호, 제2013-0331593호, 제2014-0024856호, 제2015-0299091호, 제2015-0376106호, 제2016-0107973호, 제2015-0315114호, 제2016-0152548호, 및 제2016-0175319호; PCT 공보 제WO2016/0055819호 및 제WO2016/081658호에 기재되어 있다.
트레프로스티닐의 다양한 용도 및/또는 다양한 형태는 예를 들어, 미국 특허 제5,153,222호, 제5,234,953호, 제6,521,212호, 제6,756,033호, 제6,803,386호, 제7,199,157호, 제6,054,486호, 제7,417,070호, 제7,384,978호, 제7,879,909호, 제8,563,614호, 제8,252,839호, 제8,536,363호, 제8,410,169호, 제8,232,316호, 제8,609,728호, 제8,350,079호, 제8,349,892호, 제7,999,007호, 제8,658,694호, 제8,653,137호, 제9,029,607호, 제8,765,813호, 제9,050,311호, 제9,199,908호, 제9,278,901호, 제8,747,897호, 제9,358,240호, 제9,339,507호, 제9,255,064호, 제9,278,902호, 및 제9,278,903호, 미국 특허출원 공보 제2009-0036465호, 제2008-0200449호, 제2008-0280986호, 제2009-0124697호, 제2014-0275616호, 제2014-0275262호, 제2013-0184295호, 제2014-0323567호, 제2016-0030371호, 제2016-0051505호, 제2016-0030355호, 제2016-0143868호, 제2015-0328232호, 제2015-0148414호, 제2016-0045470호, 및 제2016-0129087호, 및 PCT 공보 제WO00/57701호, 제WO20160105538호, 및 제WO2016038532호에 개시되어 있다.
트레프로스티닐은 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00013
.
본 발명가들은 트레프로스티닐의 특정 프로드럭을 주사, 예컨대 피하 투여에 의해 투여하는 것이, 트레프로스티닐 또는 트레프로스티닐의 염, 예컨대 트레프로스티닐 나트륨을 동일한 농도로 동일한 투여 경로를 통해 투여하는 것에 비해, 통증을 덜 야기하거나 야기하지 않을 수 있다는 것을 발견하였다.
일 실시양태는 트레프로스티닐 프로드럭의 유효량을 환자에게 투여함으로써 치료될 수 있는 질환 또는 병태를 치료하는 방법일 수 있다. 병태는 폐고혈압일 수 있으며, 환자는 인간일 수 있다. 투여는 주사, 예컨대 피하 주사에 의해 발생할 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로드럭은 주로, 예컨대 적절한 펌프를 사용하는 것에 의해 환자에게 실질적으로 연속적으로 투여될 수 있다.
다른 실시양태는, 질환 또는 병태를 앓고 있으며 트레프로스티닐 또는 트레프로스티닐의 염, 예컨대 트레프로스티닐 나트륨을 투여시 부위 통증을 겪었던 환자를 선택하는 것, 및 트레프로스티닐 프로드럭의 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 트레프로스티닐에 의해 치료될 수 있는 질환 또는 병태를 치료하는 방법일 수 있다. 병태는 폐고혈압일 수 있으며, 환자는 인간일 수 있다. 투여는 주사, 예컨대 피하 주사에 의해 발생할 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로드럭은 주로, 예컨대 적절한 펌프를 사용하는 것에 의해, 환자에게 실질적으로 연속적으로 투여될 수 있다.
트레프로스티닐에 의해 치료될 수 있는 질환/병태는, 비제한적으로, 폐동맥 고혈압(PAH) 및 만성 혈전색전성 폐고혈압을 포함한 폐고혈압; 심부전, 예컨대 울혈성 심부전; 허혈성 질환, 예컨대 말초 혈관 질환, 레이노 증후군, 레이노병, 버거씨병(Buerger's disease), 피부경화증, 신부전증, 간헐성 파행증, 허혈성 사지 질환, 말초 허혈성 병변; 당뇨병성 신경병증을 포함한 말초 신경병증; 허혈성 질환, 예컨대 말초 혈관 질환, 레이노 증후군, 레이노병, 버거씨병, 피부경화증, 간헐성 파행증, 허혈성 사지 질환에 의해, 및/또는 말초 신경병증, 예컨대 당뇨병성 신경병증에 의해 야기될 수 있거나 야기되지 않을 수 있는 말단 병변 및/또는 궤양, 예컨대 족부 궤양 및/또는 손가락 궤양(손가락 및/또는 발가락 둘 다); 폐섬유증, 낭포성 섬유증; 천식; 폐, 간, 뇌, 췌장, 신장, 전립선, 유방, 결장 및 두경부 암으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 암일 수 있는 암을 포함한다.
일부 실시양태에서, 트레프로스티닐 또는 트레프로스티닐의 염을 투여하는 것에 비해, 트레프로스티닐 프로드럭을 투여하는 것과 연관된 적은 통증 또는 무통은 많은 이득을 갖는다. 예를 들어, 트레프로스티닐과 연관된 통증을 참을 수 없는 환자는 프로드럭을 투여받는 것에 의해 트레프로스티닐 치료의 이점을 얻을 수 있다. 시각적 아날로그 점수(visual analogue score)(VAS 점수)는 주입, 예컨대 피하 주입의 기간에 걸쳐 환자로부터 연속적으로 수집될 수 있다. 그다음, VAS 점수는 시간의 함수로서 플롯팅되어, 통증 곡선하면적(area-under-curve)(AUC)을 계산할 수 있다. 트레프로스티닐 프로드럭을 투여함으로써 달성될 수 있는 것으로서, 트레프로스티닐 또는 트레프로스티닐의 염, 예컨대 트레프로스티닐 나트륨을 투여하는 것에 비해 적은 통증 또는 무통은, 트레프로스티닐 또는 트레프로스티닐의 염, 예컨대 트레프로스티닐 나트륨에 비해 트레프로스티닐 프로드럭의 경우의 낮은 통증 AUC를 의미할 수 있다. VAS 점수 방법은 단지 통증 강도 이상의 정량화를 가능하게 하는데, 그 이유는 이것이 강도의 적분 뿐만 아니라, 시간에 따른 강도의 변화를 모니터링하게 할 수도 있기 때문이다. VAS 점수 방법은 예를 들어, Lydick E, et al. Quality of Life Research. 1995; 4:41-45; 및 Van Wijk AJ et al. Eur J Pain. 2013; 17:394-401에 개시되어 있다.
용어 "유효량"은 질환 또는 병태를 치료하기 위해 필요할 수 있는, 트레프로스티닐 프로드럭의 양을 의미할 수 있다. 일부 실시양태에서, 트레프로스티닐 프로드럭의 유효량은 동일한 질환 또는 병태를 치료하기 위한 트레프로스티닐의 유효량과 동일하거나 유사할 수 있다. 일부 실시양태에서, 트레프로스티닐 프로드럭의 유효량은 동일한 질환 또는 병태를 치료하기 위한 트레프로스티닐의 유효량과 상이할 수 있다. 당업자는 예를 들어, 관련 질환 또는 병태, 상기 질환 또는 병태를 치료, 완화, 또는 예방하는 것으로 알려진 트레프로스티닐의 양, 및 프로드럭이 생체내에서 트레프로스티닐로 전환되는 속도에 기초하여, 트레프로스티닐 프로드럭의 "유효량"을 결정할 수 있을 것이다.
일부 실시양태에서, 프로드럭은 그 전체가 본원에 참고문헌으로 인용되는 미국 특허 제7,384,978호, 제7,417,070호, 제7,544,713호, 제8,252,839호, 제8,410,169호, 제8,536,363호, 제9,050,311호, 제9,199,908호, 제9,278,901호, 제9,422,223호 및 제9,624,156호에 개시된 프로드럭일 수 있다.
일부 실시양태에서, 프로드럭은 그 전체가 본원에 참고문헌으로 인용되는 미국 특허 제9,371,264호, 제9,394,227호, 제9,505,737호, 및 제9,643,911호에 개시된 프로드럭일 수 있다.
일부 실시양태에서, 프로드럭은 하기에 논의되는 프로드럭 중 하나일 수 있다.
예를 들어, 일부 실시양태에서, 프로드럭은 하기 화학식을 갖는 화합물 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염일 수 있다:
Figure pct00014
상기 식에서,
X는 OR9 또는 NR1R6이고;
R9는 H 또는 임의로 말단 하이드록시기 또는 카복시기로 치환될 수 있는 C1-C4 알킬이며;
R1은 H 또는 C1-C4 알킬이고 R6은
Figure pct00015
또는
Figure pct00016
이거나, R1 및 R6은 NR1R6이 아미노산의 아미드이도록 하며;
R7은 H, 또는 말단 하이드록시기 또는 카복시기로 치환될 수 있는 C1-C4 알킬이고;
R8은 H, 또는 C1-C4 알킬이며;
각각의 R2 및 R3은 독립적으로 H, C1-4 알킬,
Figure pct00017
, 포스페이트, 및 OR2 또는 OR3이 아미노산의 에스테르를 형성하는 기 중에서 선택되고;
Y는 OR4 또는 NR4R5이며, 각각의 R4 및 R5는 독립적으로 H 및 C1-4 알킬 중에서 선택되고;
단, R9, R2 및 R3은 모두 H가 아니다.
일부 실시양태에서, 프로드럭은 하기 화학식을 갖는 화합물 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염일 수 있다:
Figure pct00018
상기 식에서,
X는 OH 또는 NR1R6이며,
R1은 H 또는 C1-C4 알킬이고 R6은
Figure pct00019
또는
Figure pct00020
이거나, R1 및 R6은, NR1R6이 아미노산의 아미드이도록 하며;
R7은 H, 또는 말단 하이드록시기 또는 카복시기로 치환될 수 있는 C1-C4 알킬이고,
R8은 H 또는 C1-C4 알킬이며,
각각의 R2 및 R3은 독립적으로 H, C1-4 알킬, 또는
Figure pct00021
중에서 선택되고,
Y는 OR4 또는 NR4R5이며,
각각의 R4 및 R5는 독립적으로 H 및 C1-4 알킬 중에서 선택되고;
단, X가 OH일 때, R2 및 R3은 모두 H가 아니다.
일부 실시양태에서, 프로드럭은 하기 화학식의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이다:
Figure pct00022
상기 식에서,
X는 OH 또는
Figure pct00023
일 수 있고,
R1은 H 또는 알킬, 예컨대 C1-C4 알킬이며;
각각의 R2 및 R3은 독립적으로 H, C1-4 알킬,
Figure pct00024
중에서 선택될 수 있고,
Y는 OR4 또는 NR4R5일 수 있으며,
각각의 R4 및 R5는 독립적으로 H 및 C1-4 알킬 중에서 선택되고,
단, X가 OH일 때, R2 및 R3은 모두 H가 아니다.
C1-4 알킬의 예는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, n-부틸, sec-부틸, 이소부틸 또는 t-부틸을 포함할 수 있다.
말단 하이드록시기로 치환된 C1-4 알킬의 예는 하이드록시메틸; 하이드록시에틸; 하이드록시프로필; 4-하이드록시부틸; 2-메틸-3-하이드록시프로필을 포함할 수 있다.
말단 카복시기로 치환된 C1-4 알킬의 예는 카복시메틸, 카복시에틸, 카복시 프로필, 4-카복시부틸, 2-메틸-3-카복시프로필을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, X는 OH일 수 있다. 이러한 경우에, 특정 실시양태에서, 각각의 R2 및 R3은 각각 독립적으로 C1-4 알킬 중에서 선택될 수 있다. R2 및 R3은 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 경우에, R2 및 R3은 동일할 수 있다. 예를 들어, R2 및 R3은 모두 에틸일 수 있다. 또 일부 다른 경우에, R2 및 R3은 상이할 수 있다. 예를 들어, R2는 메틸이고 R3은 에틸이거나 그 반대일 수 있다.
일부 실시양태에서, X가 OH일 때, 각각의 R2 및 R3은 독립적으로 H 및
Figure pct00025
중에서 선택될 수 있다. 일부 경우에, R2 및 R3 중 하나는
Figure pct00026
일 수 있는 한편, 나머지는 H일 수 있다. 또 일부 다른 경우에, R2 및 R3은 모두
Figure pct00027
로 표현될 수 있는 한편, 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, Y는 OR4일 수 있다. 이러한 경우에, R4는 H 또는 C1-4 알킬, 예컨대 메틸일 수 있다. 일부 경우에, Y는 NR4R5일 수 있다. 이러한 경우에, 각각의 R4 및 R5는 독립적으로 H 및 C1-4 알킬, 예컨대 메틸 중에서 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, R4 및 R5는 동일할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, R4 및 R5는 모두 H이거나 R4 및 R5는 모두 메틸일 수 있다. 또 일부 실시양태에서, R4 및 R5는 상이할 수 있다. 예를 들어, R4 및 R5 중 하나는 H일 수 있는 한편, 나머지는 메틸일 수 있다.
일부 실시양태에서, X가 OH일 때, R2 및 R3 중 적어도 하나는 포스페이트일 수 있다. 특정 경우에, R2 및 R3은 모두 포스페이트일 수 있다. 특정 다른 경우에, R2 및 R3 중 하나는 포스페이트일 수 있고 나머지는 H일 수 있다.
일부 실시양태에서, X가 OH일 때, R2 및 R3 중 적어도 하나는 OR2(또는 OR3)가 아미노산의 에스테르를 형성하는 기일 수 있다. 특정 실시양태에서, R2 및 R3 중 하나는 OR2(또는 OR3)가 아미노산의 에스테르를 형성하는 기일 수 있는 한편, 나머지는 H일 수 있다. 예를 들어, OR2는 아미노산의 에스테르를 형성할 수 있는 한편, R3은 H이거나; 또는 OR3은 아미노산의 에스테르를 형성할 수 있는 한편, OR2는 H이다. 특정 실시양태에서, R2 및 R3은 OR2 및 OR3이 각각 아미노산의 에스테르를 형성할 수 있다. 특정 경우에, OR2 및 OR3은 동일한 아미노산의 에스테르를 형성할 수 있다. 또 특정 경우에, OR2는 제1 아미노산의 에스테르를 형성할 수 있는 한편, OR3은 제1 아미노산과 상이한 제2 아미노산의 에스테르를 형성할 수 있다.
아미노산(들)은 D-이성질체 아미노산 또는 L-이성질체 아미노산일 수 있다. 특정 실시양태에서, 아미노산은 자연 발생 아미노산일 수 있다. 또 일부 실시양태에서, 아미노산은 인공 아미노산일 수 있다. 아미노산의 예는, 비제한적으로, 카르밤산, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 티로신, 시스테인, 라이신, 아르기닌, 히스티딘, 아스파르트산, 글루탐산을 포함한다. OR2(OR3)가 아미노산의 에스테르를 형성할 때, R2(R3)는
Figure pct00028
(여기서, R4 및 R5는 상기 정의된 바와 같다) 또는
Figure pct00029
(여기서, R10은 아미노산 측쇄로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, R11 및 R12는 H일 수 있다)를 가질 수 있다. 아미노산이 프롤린인 실시양태에서, R11은 R10과 함께 피롤리딘 고리 구조를 형성하는 한편, R12는 H이다. R10은 예를 들어, 하나의 자연 발생 아미노산 측쇄, 예를 들어 -CH3(알라닌), --(CH2)3HCNH2NH(아르기닌), --CH2CONH2(아스파라긴), --CH2COOH(아스파르트산), --CH3SH(시스테인), --(CH2)2CONH2(글루타민), --(CH2)2COOH(글루탐산), --H(글리신), --CHCH3CH2CH3(이소류신), --CH2CH(CH3)2(류신), --(CH2)4NH2(라이신), --(CH2)2SCH3(메티오닌), --CH2Ph(페닐알라닌), --CH2OH(세린), --CHOHCH3(트레오닌), --CH(CH3)2(발린),
Figure pct00030
(히스티딘),
Figure pct00031
(트립토판), 및
Figure pct00032
(티로신), -(CH2)3NHCONH2(시트룰린) 또는 -(CH2)3NH2(오르니틴)일 수 있다. Ph는 페닐기를 표시한다.
일부 실시양태에서, 각각의 R2 및 R3은 H이다. 이러한 경우에, 특정 실시양태에서, X는 NR1R6일 수 있다. R1은 H 또는 C1-C4 알킬일 수 있다. R6은
Figure pct00033
또는
Figure pct00034
일 수 있다. R7은 H, 또는 임의로 말단 하이드록시기 또는 카복시기로 치환될 수 있는 C1-C4 알킬일 수 있다. R8은 H, 또는 C1-C4 알킬일 수 있다. 특정 실시양태에서, R1 및 R6은 NR1R6이 아미노산의 아미드를 형성할 수 있도록 한다.
특정 실시양태에서, R1은 H일 수 있다. 이러한 경우에, 일부 실시양태에서, R6은
Figure pct00035
일 수 있으며, 상기 식에서 R7은 H, 또는 임의로 말단 하이드록시기 또는 카복시기로 치환될 수 있는 C1-C4 알킬일 수 있다.
특정 실시양태에서, R1은 H일 수 있고 R6은
Figure pct00036
일 수 있으며, 여기서 R8은 H 또는 C1-C4 알킬, 예컨대 메틸 또는 에틸일 수 있다.
특정 실시양태에서, R2 및 R3이 각각 H일 때, NR1R6은 상기 논의된 아미노산일 수 있는 아미노산의 아미드를 형성할 수 있다. NR1R6은 예를 들어,
Figure pct00037
또는
Figure pct00038
일 수 있다. 특정 경우에, R1은 H일 수 있으며, R10은 상기 정의된 바와 같을 수 있다. 프롤린이 아미노산인 경우에, R1 및 R10은 함께 피롤리딘 고리 구조를 형성할 수 있다.
특정 경우에, R2 및 R3은 각각 H이고, X는 OR9일 수 있으며, R9는 임의로 말단 하이드록시기 또는 카복시기로 치환될 수 있는 C1-C4 알킬일 수 있다. R9가 말단 카복시기로 치환된 C1-C4 알킬일 때, R9는 카복시메틸, 카복시에틸, 카복시프로필, 4-카복시부틸, 2-메틸-3-카복시 프로필일 수 있다.
일부 실시양태에서, 프로드럭은 하기 화학식 중 하나를 갖는 화합물일 수 있다:
Figure pct00039
(프로드럭 I);
Figure pct00040
(프로드럭 II);
Figure pct00041
(프로드럭 III);
Figure pct00042
(프로드럭 IV);
Figure pct00043
(프로드럭 V);
Figure pct00044
(프로드럭 VI);
Figure pct00045
(프로드럭 VII);
Figure pct00046
(프로드럭 VIII);
Figure pct00047
(프로드럭 IX);
Figure pct00048
(프로드럭 X);
Figure pct00049
(프로드럭 XI);
Figure pct00050
(프로드럭 XII);
Figure pct00051
(프로드럭 XIII);
Figure pct00052
(프로드럭 XIV);
Figure pct00053
(프로드럭 XV).
이들 프로드럭은 트레프로스티닐 또는 이의 염의 투여에 비해 부위 통증의 감소 이외에 또는 그 대신에, 트레프로스티닐에 비해 하나 이상의 이점을 가질 수 있다. 예를 들어, 이들 프로드럭 중 일부는 적어도 일부 환자 집단에서 개선된 안정성 또는 더 큰 내성(torelance)을 가질 수 있다.
이들 프로드럭 중 적어도 일부는 인간 혈장에서 150분 미만 또는 120분 미만 또는 90분 미만 또는 60분 미만 또는 50분 미만 또는 45분 미만 또는 40분 미만 또는 30분 미만 또는 20분 미만 또는 15분 미만 또는 12분 미만 또는 약 10분의 반감기를 가질 수 있다.
특정 실시양태에서, 트레프로스티닐의 프로드럭은 1mg/mL 이상, 또는 2mg/mL 이상 또는 3mg/mL 이상 또는 4mg/mL 이상 또는 5mg/mL 이상 또는 6mg/mL 이상의 평형 수 용해도(equilibrium water solubility)를 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, 트레프로스티닐의 프로드럭은, 3 내지 40mg/mL, 또는 3 내지 35mg/mL, 또는 5 내지 15mg/mL, 또는 이들 범위 내의 임의의 값 또는 하부범위의 평형 수 용해도를 가질 수 있다. 프로드럭의 용해도는 pH가 용해도 측정에 사용된 비히클에서 증가되는 경우 및/또는 하나 이상의 염이 비히클로부터 제거되는 경우 더 클 수 있다.
Remodulin®은 피하 투여에 대해 FDA에 의해 승인되었으나, 일부 환자는 이러한 투여의 결과로서 부위 통증을 경험한다. 본 발명은 임의의 특정 이론에 구애되지 않으나, 이 부위 통증은 비활성 성분, 예컨대 m-크레졸보다는 트레프로스티닐 자체의 존재 또는 임의의 비활성 성분과 조합된 트레프로스티닐의 존재의 결과일 수 있다. 도 9는 래트가 하기 중 하나를 투여받은, 래트 발 통증 모델을 사용하여 시험된 래트의 부위 통증으로 인한 t=0, 15분 및 90분에서의 회피 시간을 보고한다: a) 식염수, b) 시트레이트 완충제, 염화나트륨, 및 m-크레졸을 함유하지만, 트레프로스티닐은 함유하지 않은 위약 제형(도 9에서 "Remodulin 위약"으로 나타냄); c) 트레프로스티닐, 시트레이트 완충제, 염화나트륨 및 m-크레졸을 함유하면서 1㎍/mL의 트레프로스티닐 농도를 갖는 Remodulin 제형(도 9에서 "트레프로스티닐 1㎍/mL"로 나타냄); 및 d) 트레프로스티닐, 시트레이트 완충제, 염화나트륨 및 m-크레졸을 함유하면서 100㎍/mL의 트레프로스티닐 농도를 갖는 Remodulin 제형(도 9에서 "트레프로스티닐 100㎍/mL"로 나타냄). 도 9의 수직 막대는, 제형의 투여 후 t=0, 15분 및 90분에서 열 자극에 대한 반응으로 시험된 래트가 그것의 발을 얼마나 빨리 피하는지를 나타낸다. 데이터는, 트레프로스티닐을 함유한 제형의 경우에, 시험된 래트가 열 자극에 더 민감하고 그들의 발을 더 빨리 피하는 반면, Remodulin 위약(Remodulin의 비활성 성분은 함유하지만 트레프로스티닐을 함유하지 않음)은 이들의 민감도를 증가시키지 않았다는 것을 나타낸다.
본 발명은 이의 작동 원리에 의해 제한되지 않지만, 피하 투여 동안의 부위 통증은 주사 부위에서 IP, DP 또는 EP 수용체 중 하나 이상에 대한 트레프로스티닐 결합으로 인한 것일 수 있다. 트레프로스티닐은, 분자 상의 3개의 하이드록시기에 상응하는 3개의 기능적 위치에서 이들 수용체에 결합할 수 있으며, 예를 들어 Tsai and Wu, Eicosanoids, 2(3): 131-43 (1989)을 참조한다. 따라서, 트레프로스티닐의 하이드록시기(들)에 부착된 하나 이상의 기를 갖는 트레프로스티닐의 프로드럭, 또는 이들 수용체에 대한 결합을 감소시키는 다른 변형체는 트레프로스티닐에 비해 투여 부위에서 국소적으로 수용체에 대해 덜 친화도를 가질 수 있다.
본원에 사용되는 어구 "트레프로스티닐의 프로드럭"(문맥에 따라 "트레프로스티닐 프로드럭" 또는 단지 "프로드럭"으로도 지칭됨)은, 투여 후 생체내에서 전체적으로 또는 부분적으로 트레프로스티닐로 전환되는 트레프로스티닐의 임의의 유도체를 지칭한다. 트레프로스티닐의 프로드럭은 트레프로스티닐에 비해 주사 부위에서 국소적으로 IP, DP 또는 EP 수용체 중 하나 이상에 대해 감소된 친화도를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, "트레프로스티닐의 프로드럭"은 트레프로스티닐에 비해, IP, DP 또는 EP 수용체 중 하나 이상에 대해 감소된 친화도를 갖도록 변형된 트레프로스티닐 구조의 하나 이상의 하이드록시기를 갖는 트레프로스티닐 유도체일 수 있지만, 이는 피하 투여 및 후속적인 혈액으로의 확산 후 생체내에서 활성 트레프로스티닐로 전환될 수 있다. 일부 실시양태에서, 트레프로스티닐의 프로드럭은 피하 공간 외부에서, 예컨대 혈류에서 완전히 또는 실질적으로 트레프로시티닐로 생체내에서 전환된다. 바람직한 프로드럭은 상기 화학식 I의 화합물을 포함한다. 트레프로스티닐의 다른 바람직한 프로드럭은 트레프로스티닐의 아미드, 카보네이트, 또는 카바메이트 에스테르를 포함한다. 일부 실시양태에서, 트레프로스티닐 프로드럭은 투여 후 생체내에서 50%, 75%, 85%, 90%, 95%, 또는 98% 초과의 트레프로스티닐로의 전환을 갖는다. 일부 실시양태에서, 이 전환은 투여 후 15분, 30분, 45분, 1 시간, 2 시간, 또는 3 시간 내에 발생한다. 트레프로스티닐의 프로드럭은 이러한 프로드럭의 약학적으로 허용가능한 염을 포함한다.
바람직하게는, 트레프로스티닐의 프로드럭은 저장 동안, 예를 들어 투여 전 또는 최초 주사 동안 및 주사 부위에서 용액에서 자발적으로 트레프로스티닐로 가수분해되지 않음으로써, 안정적이다. 바람직하게는, 본 발명의 프로드럭 제형에는 트레프로스티닐이 없거나 유리 산 형태의 트레프로스티닐이 실질적으로 없다. 일부 실시양태에서, 10%, 5%, 2%, 1%, 또는 0.1% 미만의 트레프로스티닐의 프로드럭이 한정된 저장 기간 동안 트레프로스티닐로 전환된다. 일부 실시양태에서, 상기 한정된 저장 기간은 1, 2, 3, 6, 또는 12 개월일 수 있다.
바람직하게는, 트레프로스티닐의 프로드럭은, 피하로 투여되었을 때 Remodulin의 피하 투여와 생물학적-동등성이다. 일 실시양태에서, 투여된 프로드럭은 피하 Remodulin에 대해 80-125%의 Cmax 및 AUC인 트레프로스티닐의 혈장 농도를 제공한다. 예를 들어, http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/UCM377465.pdf를 참조한다. 다른 실시양태에서, Cmax 및 AUC 값은 피하 Remodulin Cmax 및 AUC 수준의 95% 내지 105%이다. Remodulin은 1.25 ng/kg/분으로 피하로 바람직하게 주입되지만, 이 초기 용량이 부작용으로 인해 참을 수 없다면, FDA 승인된 라벨(label)은 0.625 ng/kg/분으로의 주입 속도 감소를 제공한다.
도 8은 트레프로스티닐의 혈장 농도를 시간의 함수로서 나타낸다. 도 8에서의 하한 및 상한은 각각 피하로 투여된 Remodulin에 대한 75% 및 125%의 혈장 농도에 상응하고, 이는 본 발명의 프로드럭을 사용시에 목표로 삼는 생물학적-동등성 혈장 농도의 하나의 바람직한 범위를 나타낸다. 도 8은 트레프로스티닐의 하나의 가능한 피하로 투여되는 프로드럭 제형에 대한 플롯을 나타내는데, 이는 하한 및 상한 사이에 맞추어지므로, 특정 기간에 걸쳐 측정된 트레프로스티닐의 혈장 농도 측면에서 피하로 투여되는 Remodulin과 생물학적-동등성이다.
개시된 트레프로스티닐 프로드럭, 예컨대 아미드, 카바메이트, 및 카보네이트 프로드럭은, 특히 피하 투여를 포함한 비경구 투여를 위한 일반적인 에스테르 프로드럭에 비해, 하나 이상의 이점을 가질 수 있다. 예를 들어, 개시된 트레프로스티닐 프로드럭, 예컨대 아미드, 카바메이트 및 카보네이트 프로드럭은, 소망하지 않을 때, 예를 들어 용액 내에서 또는 주사 부위에서 가수분해되어 트레프로스티닐로 이르게 전환되는 경향이 있을 수 있는 일반 에스테르 프로드럭에 비해 더욱 안정적일 수 있다.
"약학적으로 허용가능한 염"은 무기 염기, 유기 염기, 무기산, 유기산, 또는 염기성 또는 산성 아미노산과의 염을 포함한다. 무기 염기의 염은 알칼리 금속, 예컨대 나트륨 또는 칼륨의 염; 알칼리 토금속, 예컨대 칼슘 및 마그네슘 또는 알루미늄의 염; 및 암모니아의 염일 수 있다. 유기 염기의 염은 예를 들어, 트리메틸아민, 트리에틸아민, 피리딘, 피콜린, 에탄올아민, 디에탄올아민, 및 트리에탄올아민일 수 있다. 무기산의 염은 예를 들어, 염산의 염, 하이드로붕산의 염, 질산의 염, 황산의 염, 또는 인산의 염일 수 있다. 유기산의 염은 예를 들어, 하기 산 중 하나의 염일 수 있다: 포름산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 푸마르산, 옥살산, 락트산, 타르타르산, 말레산, 시트르산, 숙신산, 말산, 메탄설폰산, 벤젠설폰산, 및 p-톨루엔설폰산. 염기성 아미노산의 염은 예를 들어, 아르기닌, 라이신 또는 오르니틴의 염일 수 있다. 산성 아미노산의 염은 예를 들어, 아스파르트산 또는 글루탐산의 염일 수 있다.
"폐고혈압"은 폐고혈압의 모든 형태인, WHO 그룹 1-5를 지칭한다. PAH로도 지칭되는 폐동맥 고혈압은 WHO 그룹 1 폐고혈압을 지칭한다. PAH는 특발성, 유전성, 약물- 또는 독소-유도성, 및 신생아 폐고혈압 지속증(persistent pulmonary hypertension of the newborn)(PPHN)을 포함한다.
본 발명의 트레프로스티닐 프로드럭은 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 결합제, 희석제 등을 포함할 수도 있는 약학 조성물의 형태로 제공될 수 있다. 이러한 약학 조성물은 당업계에 알려진 방법, 예컨대 그 중에서 과립화, 혼합, 용해, 캡슐화, 동결건조, 유화 또는 가루화(levigating) 과정에 의해 제조될 수 있다. 조성물은 예를 들어, 과립, 분말, 정제, 캡슐, 시럽, 좌약, 주사제, 에멀전, 엘릭시르, 현탁액 및 용액의 형태로 있을 수 있다. 조성물은 다수의 상이한 경로를 위해, 예컨대 경구 투여, 점막경유 투여, 직장 투여, 경피 또는 피하 투여뿐 아니라, 척추강내, 정맥내, 근육내, 복강내, 비강내, 안내 또는 심실내 주사를 위해 제형화될 수 있다. 트레프로스티닐 프로드럭은 상기 경로 중 임의의 것에 의해, 예를 들어 주사제 또는 서방성 제형을 비롯해, 전신 투여보다는 국소로 투여될 수 있다.
일 실시양태에서, 약학 조성물은 트레프로스티닐의 프로드럭 및 담체, 예컨대 멸균수를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 트레프로스티닐의 프로드럭은 피하 투여를 위해 제형화되며, 이러한 제형은 m-크레졸 또는 다른 보존제를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
경구, 구강, 및 설하 투여를 위해, 분말, 현탁액, 과립, 정제, 알약, 캡슐, 젤캡, 및 당의정이 고체 투여 형태로서 허용가능할 수 있다. 이들은 예를 들어, 하나 이상의 트레프로스티닐 프로드럭, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 적어도 하나의 첨가제 또는 부형제, 예컨대 전분 또는 다른 첨가제와 혼합하는 것에 의해 제조될 수 있다. 적합한 첨가제 또는 부형제는 수크로오스, 락토오스, 셀룰로오스 당, 만니톨, 말티톨, 덱스트란, 소르비톨, 전분, 한천, 알지네이트, 키틴, 키토산, 펙틴, 트라가칸트 검, 아라비아 고무, 젤라틴, 콜라겐, 카세인, 알부민, 합성 또는 반-합성 중합체 또는 글리세리드, 메틸 셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸-셀룰로오스, 및/또는 폴리비닐피롤리돈일 수 있다. 선택적으로, 경구 투여 형태는 투여를 돕기 위한 다른 성분, 예컨대 비활성 희석제, 또는 윤활제, 예컨대 마그네슘 스테아레이트, 또는 보존제, 예컨대 파라벤 또는 소르브산, 또는 항산화제, 예컨대 아스코르브산, 토코페롤 또는 시스테인, 붕해제, 결합제, 증점제, 완충제, 감미제, 향미제 또는 방향제를 함유할 수 있다. 또한, 염료 또는 안료가 식별을 위해 첨가될 수 있다. 정제는 당업계에 알려진 적합한 코팅 물질로 추가로 처리될 수 있다.
경구 투여를 위한 액체 투여 형태는 비활성 희석제, 예컨대 물을 함유할 수 있는 약학적으로 허용가능한 에멀전, 시럽, 엘릭시르, 현탁액, 슬러리 및 용액의 형태일 수 있다. 약학 제형은 멸균액, 예컨대, 비제한적으로, 오일, 물, 알코올, 및 이들의 조합을 사용하여 액체 현탁액 또는 용액으로서 제조될 수 있다. 약학적으로 적합한 계면활성제, 현탁화제, 유화제가 경구 또는 비경구 투여를 위해 첨가될 수 있다.
상기 언급한 바와 같이, 현탁액은 오일을 포함할 수 있다. 이러한 오일은, 비제한적으로, 땅콩유, 참기름, 면실유, 옥수수유 및 올리브유를 포함한다. 현탁액 제제는 또한 지방산의 에스테르, 예컨대 에틸 올리에이트, 이소프로필 미리스테이트, 지방산 글리세리드 및 아세틸화 지방산 글리세리드를 함유할 수 있다. 현탁액 제형은 알코올, 예컨대, 비제한적으로, 에탄올, 이소프로필 알코올, 헥사데실 알코올, 글리세롤 및 프로필렌 글리콜을 포함할 수 있다. 에테르, 예컨대, 비제한적으로, 폴리(에틸렌글리콜), 석유계 탄화수소, 예컨대 미네랄 오일 및 페트롤라텀; 및 물이 또한 현탁액 제형에서 사용될 수 있다.
주사가능한 투여 형태는 일반적으로 적합한 분산제나 습윤제, 및 현탁화제를 사용하여 제조될 수 있는 수성 현탁액 또는 오일 현탁액을 포함한다. 주사가능한 형태는 용매 또는 희석제로 제조되는 용액상 또는 현탁액의 형태로 있을 수 있다. 허용가능한 용매 또는 비히클은 멸균수, 링거액(Ringer's solution), 또는 등장성 수성 식염수를 포함한다. 대안적으로, 멸균 오일이 용매 또는 현탁화제로서 사용될 수 있다. 바람직하게는, 오일 또는 지방산은 비-휘발성이며, 천연 또는 합성 오일, 지방산, 모노-, 디- 또는 트리-글리세라이드를 포함한다.
주사를 위해, 약학 제형은 상기 기재된 바와 같은 적절한 용액과 함께 재구성을 위해 적합한 분말일 수 있다. 이들의 예는, 비제한적으로, 동결 건조, 회전 건조 또는 분무 건조 분말, 비결정 분말, 과립, 침전물, 또는 입자를 포함한다. 주사를 위해, 제형은 임의로 안정제, pH 개질제, 계면활성제, 생체이용률 개질제 및 이들의 조합을 함유할 수 있다. 화합물은 주사, 예컨대 볼루스 주사 또는 연속 주입에 의한 비경구 투여를 위해 제형화될 수 있다. 주사를 위한 단위 투여 형태는 앰플 또는 다중-용량 용기 내에 있을 수 있다.
상기 기재된 이러한 대표적인 투여 형태 이외에, 약학적으로 허용가능한 부형제 및 담체가 당업자에게 일반적으로 알려져 있으므로, 본 발명에 포함된다. 이러한 부형제 및 담체는 예를 들어, 본원에 참고문헌으로 인용되는 "Remingtons Pharmaceutical Sciences" Mack Pub. Co., New Jersey (1991)에 기재되어 있다.
트레프로스티닐 프로드럭은 비경구 투여를 위해 적합한 제형으로 제형화될 수 있으며, 상기 제형은 트레프로스티닐 프로드럭, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 멸균 수성 제제를 포함할 수 있는데, 상기 제제는 의도된 수령인(recipient)의 혈액과 등장성일 수 있다. 이들 제제는 피하 주사의 수단에 의해 투여될 수 있으나, 투여는 또한 정맥내로 또는 근육내 또는 피내 주사의 수단에 의해 영향을 받을 수 있다. 이러한 제제는 화합물을 물 또는 글리신 또는 시트레이트 완충제와 혼합하고 생성된 용액을 살균하고 혈액과 등장성이 되게하는 것에 의해 편리하게 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 주사가능한 제형은 프로드럭 내의 트레프로스티닐의 중량에 기초하여 0.1 내지 5% w/v를 함유할 수 있으며, 0.1 mL/분/kg의 속도로 투여될 수 있다. 대안적으로, 본 발명은 프로드럭 내의 트레프로스티닐의 중량에 기초하여 0.625 내지 50 ng/kg/분의 속도로 투여될 수 있다. 대안적으로, 본 발명은 프로드럭 내의 트레프로스티닐의 중량에 기초하여 10 내지 15 ng/kg/분의 속도로 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 비경구 투여, 예컨대 정맥내 주입 또는 피하 주입(연속 피하 주입을 포함함)을 위한 제형 내의 트레프로스티닐 프로드럭의 농도는 0.0005 내지 30mg/mL 또는 0.0007 내지 50mg/mL 또는 0.001 내지 15mg/mL 또는 이들 범위 내의 임의의 값 또는 하부범위일 수 있다. 예시적 농도는 0.1mg/mL, 1mg/mL, 2.5mg/mL, 5mg/mL 또는 10mg/mL를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 비경구 투여, 예컨대 정맥내 주입 또는 피하 주입(연속 피하 주입을 포함함)을 위한 트레프로스티닐 프로드럭의 제형은, 프로드럭을 비히클, 예컨대 완충제와 혼합하는 것에 의해 제조될 수 있다. 특정 실시양태에서, 비히클은 포스페이트 함유 비히클, 즉 예를 들어, 이염기 포스페이트, 예컨대 나트륨 이염기 포스페이트 또는 칼륨 이염기 포스페이트, 또는 삼염기 포스페이트, 예컨대 나트륨 삼염기 포스페이트 또는 칼륨 포스페이트일 수 있는 적어도 하나의 포스페이트 염일 수 있다. 특정 실시양태에서, 비히클은 또한 예를 들어, 염화나트륨 또는 염화칼륨일 수 있는, 클로라이드 염과 같은 할로겐 염을 함유할 수 있다. 할로겐 염, 예컨대 염화나트륨은 비히클의 긴장성(tonicity)을 조정하기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 포스페이트 및 할로겐 염은 동일한 양이온을 갖는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 포스페이트가 나트륨 포스페이트, 예컨대 나트륨 삼염기 포스페이트 또는 나트륨 삼염기 포스페이트일 때, 할로겐 염은 나트륨 할로겐 염, 예컨대 염화나트륨일 수 있다. 유사하게는, 포스페이트가 칼륨 포스페이트, 예컨대 칼륨 삼염기 포스페이트 또는 칼륨 삼염기 포스페이트일 때, 할로겐 염은 칼륨 할로겐 염, 예컨대 염화칼륨일 수 있다. 비히클 내의 용매는 물을 함유할 수 있다. 특정 실시양태에서, 물은 비히클 내의 유일한 용매일 수 있다. 또 특정 실시양태에서, 비히클은 물과 함께 하나 이상의 추가 용매를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 추가 용매는 보존제, 예컨대 m-크레졸일 수 있다.
바람직하게는, 비히클은 환자, 예컨대 인간의 혈액과 등장성이다. 용어 "등장성"은 비히클의 삼투압 및 이온 농도가 환자, 예컨대 인간의 것과 부합한다는 것을 의미할 수 있다. 비히클의 비제한적 예는 디나트륨 하이드로젠 포스페이트, 염화나트륨 및, 일부 제형에서, 염화칼륨 및 칼륨 디하이드로젠 포스페이트를 함유하는 수계 염 용액인 포스페이트-완충 식염수를 포함한다. 다른 예는 20 mM 이염기 나트륨 포스페이트와 125 mM 염화나트륨을 함유하는 비히클, 및 15 mM 나트륨 포스페이트 삼염기, 125 mM 염화나트륨 및 0.3% w/w m-크레졸을 함유하는 비히클을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 트레프로스티닐 프로드럭은 피하로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 피하 투여는 연속 피하 주입, 예컨대 바람직하게는 휴대가능하거나 이식가능한 주입 펌프에 의한 연속 피하 주입일 수 있다.
일부 실시양태에서, 트레프로스티닐 프로드럭은 프로드럭 내의 트레프로스티닐의 중량에 기초하여 0.1 내지 100 ng/kg/분 또는 0.2 내지 70 ng/kg/분 또는 0.3 내지 50 ng/kg/분 또는 0.6 내지 10 ng/kg/분 또는 이들 범위 내의 임의의 값 또는 하부범위의 속도(용량)로 피하로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 주입은 초기 속도(용량)로 출발할 수 있으며, 이는 초기 속도(용량)에 대한 환자의 반응에 기초하여 차후에 증가되거나 감소될 수 있다. 예를 들어, 초기 속도(용량)는 1.25 ng/kg/분일 수 있으며, 이는 환자의 내성에 따라 주당 1.25 ng/kg/분 또는 주당 2.5 ng/kg/분의 증분으로 증가될 수 있다. 환자가 예를 들어, 부작용(예를 들어, 경증 내지 중간의 간부전 및/또는 두통일 수 있음)으로 인해 초기 속도(용량)를 참지 못하는 경우, 초기 속도(용량)는 0.625 ng/kg/분으로 감소될 수 있다. 환자가 낮은 속도(용량)에 대한 내성을 발달시킨 후에, 속도(용량)는 증가될 수 있다.
트레프로스티닐 프로드럭은 트레프로스티닐이 유용한 것으로 알려진 동일한 목적 중 하나 이상을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 트레프로스티닐 프로드럭은 트레프로스티닐로 치료될 수 있는 질환 또는 장애, 예컨대 폐동맥 고혈압 및 만성 혈전색전성 폐고혈압을 포함한 폐고혈압을 치료하기 위해, 대상체, 예컨대 인간에게 투여하기 위해 사용될 수 있다. 폐고혈압을 치료하는 것과 같은 치료 목적을 위해, 트레프로스티닐 프로드럭은, 트레프로스티닐로 치료될 수 있는 질환 또는 장애, 예컨대 폐고혈압의 하나 이상의 증상을 개선하기에 충분한 트레프로스티닐 프로드럭의 양일 수 있는 치료 유효량으로, 대상체, 예컨대 인간에게 투여될 수 있다.
트레프로스티닐 프로드럭은 세포보호(cytoprotection), 세포 증식 감소, 혈관확장 촉진 및/또는 혈소판 응집 억제 등에 치료적으로 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 트레프로스티닐 프로드럭은 혈관 질환, 예컨대 폐고혈압, 심부전(울혈성 심부전을 포함함), 또는 말초 혈관 질환의 치료에 사용될 수 있다. 트레프로스티닐 프로드럭은 혈관확장 효과를 가질 수 있어, 이들은 예를 들어, 결합 조직 질환의 하나 이상의 형태, 예컨대 루푸스, 피부경화증 또는 혼합 결합 조직 질환으로부터 야기될 수 있는 폐고혈압을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
트레프로스티닐 프로드럭은 또한 암, 혈액응고 장애, 및 염증성 질환에 사용될 수 있다. 암 세포의 전이를 억제하기 위한 트레프로스티닐의 용도는, 둘 다가 그 전체가 본원에 인용되는 US 2003-0108512호 및 미국 특허 제6,803,386호에 개시되어 있다.
트레프로스티닐 프로드럭은 도 1-6에 도시하고 하기 실시예에서 설명되는 바와 같은 방법에 따라 제조될 수 있다.
반응식 2는 아세테이트 아미드 프로드럭 VII의 합성을 나타낸다. 이 합성은 트레프로스티닐이 NH2CH2COOBn과 반응함으로써 출발하여, 하기 화학식의 보호된 아세타토 아미드 화합물을 형성할 수 있다:
Figure pct00054
. 일부 실시양태에서, 알킬, 예컨대 C1-C4 알킬, 예를 들어 메틸 또는 에틸이 벤질 대신에 사용될 수 있다. 이러한 경우에, NH2CH2COOBn 대신에 NH2CH2COOR4(여기서, R4는 알킬이다)가 트레프로스티닐과 반응하여 보호된 아세타토 아미드 화합물을 형성하기 위해 사용될 수 있다.
보호된 아세타토 아미드 화합물은 그다음 아세타토 아미드 프로드럭 VII으로 전환될 수 있다. Bn의 경우에, 이러한 반응은 Pd/C 및 H2 사용을 동반할 수 있다. 알킬, 예컨대 메틸 또는 에틸의 경우에, 보호된 아세타토 아미드 화합물은 염기, 예컨대 NaOH 또는 KOH와 반응하여, 아세타토 아미드 프로드럭 VII으로 전환될 수 있다.
도 6은 하기 화학식의 출발 화합물의 합성을 나타낸다:
Figure pct00055
상기 식에서, P1은 하이드록시 보호기, 예컨대 2-테트라하이드로피라닐(THP) 또는 실릴 보호기, 예컨대 tert-부틸디메틸실릴 에테르(TBDMS/TBS), 트리메틸실릴(TMS), 트리에틸실릴(TES), tert-부틸디페닐실릴(TBDPS), 트리이소프로필실릴(TIPS)일 수 있다. 이 화합물은 몇몇의 트레프로스티닐 프로드럭을 합성하기 위한 중요한 출발 화합물로서 사용될 수 있다. 도 6에서의 과정은 그 전체가 본원에 인용될 수 있는 미국 특허 제8,940,930호의 반응식 2의 첫번째 5개 반응에 해당한다. 도 6에 개시된 과정 이외에, 출발 화합물은 또한 예를 들어, 미국 특허 제6,756,117호 및 제6,809,223호에 개시된 방법을 사용하여 합성될 수 있다. 출발 화합물의 합성은 하기 화학식의 화합물로부터 출발할 수 있다:
Figure pct00056
상기 식에서, P0는 하이드록시 보호기, 예컨대 벤질 또는 치환된 벤질이다. 치환된 벤질기는 임의로 하나 이상의 메타, 오쏘 또는 파라 자리에서 --NO2, --CN, 할로겐(예를 들어, --F, --Cl, --Br 또는 --I), (C1-C3)알킬, 할로(C1-C3)알킬, (C1-C3)알콕시 및 할로(C1-C3)알콕시로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택될 수 있는 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있다. 이 화합물
Figure pct00057
은 (+)-N-메틸에페드린, Zn(OTf2)/Et3N의 존재 하에서 또는 (1S,2S)-3-(tert-부틸디메틸실릴옥시)-2-N,N-디메틸아미노-L-(파라-니트로페닐)-프로판-1-올을 사용하여
Figure pct00058
와 반응하여, 하기 화학식의 화합물을 형성할 수 있다:
Figure pct00059
. 이 화합물은 그다음 미국 특허 제6,940,930호에 개시된 반응을 사용하여 중요 출발 화합물로 전환될 수 있다.
화학식
Figure pct00060
의 출발 화합물이 트레프로스티닐의 사이클로펜틸 고리 프로드럭, 즉 X가 OH이고 R3이 H인 화합물, 또는 트레프로스티닐의 측쇄 프로드럭, 즉 X가 OH이고 R2가 H인 화합물을 합성하기 위해 사용될 수 있다. 사이클로펜틸 고리 프로드럭의 합성은 도 1 및 3에 나타내는 한편, 측쇄 프로드럭의 합성은 도 2 및 4에 나타낸다.
사이클로펜틸 고리 프로드럭의 합성을 위해, 화학식
Figure pct00061
의 출발 화합물이 하기 화학식의 이중-보호된 화합물로 전환될 수 있다:
Figure pct00062
상기 식에서, P0는 하이드록시 보호기, 예컨대 벤질, 치환된 벤질 또는 알킬, 예컨대 메틸 및 에틸을 포함하는 C1-C4 알킬이다. 예를 들어, 화학식
Figure pct00063
의 중간 화합물은
Figure pct00064
와 반응하여, 이중 보호된 화합물
Figure pct00065
을 형성할 수 있다. 이중 보호된 화합물
Figure pct00066
은 화학식
Figure pct00067
(상기 식에서, R2는
Figure pct00068
일 수 있고, 여기서 Y는 OR4 또는 NR4R5이며 각각의 R4 및 R5는 독립적으로 H 및 C1-4 알킬 중에서 선택되거나, Y는 Cl, Br 또는 OCCl3이다)의 이중 보호된 프로드럭 화합물로 전환될 수 있다. 이는 이중 보호된 화합물을
Figure pct00069
(여기서, Z는 Cl, Br 또는 OCCl3이다)와 반응시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, R2가
Figure pct00070
일 때, 이중 보호된 화합물은
Figure pct00071
와 반응하여, 각각 이중 보호된 프로드럭 화합물을 형성할 수 있다. R2가
Figure pct00072
일 때, 이중 보호된 화합물은
Figure pct00073
또는 Cl3CO-C(=O)-OCCl3/HN(CH3)-CH3의 혼합물과 반응하여, 각각 이중 보호된 프로드럭 화합물을 형성할 수 있다.
각각의 P0 및 P1 보호기는, 그다음 H로 치환되어 카복시기의 하이드록시 및 측쇄의 하이드록시를 탈보호시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 도 1에 나타낸 것과 같이, 카복시기의 하이드록시 및 측쇄의 하이드록시의 탈보호(P0 및 P1 각각의 대체)는 단일 반응에서 수행될 수 있다. 또 일부 다른 실시양태에서, 카복시기의 하이드록시 및 측쇄의 하이드록시의 탈보호는 2개의 개별적인 반응에서 수행될 수 있다. 일부 경우에, 도 3에 나타낸 바와 같이, 측쇄의 하이드록시기가 먼저 탈보호되고, 카복시기의 하이드록시의 탈보호가 이어질 수 있다. 심지어 일부 다른 경우에, 카복시기의 하이드록시기가 먼저 탈보호되고, 측쇄의 하이드록시의 탈보호가 뒤따를 수 있다. 측쇄의 하이드록시의 탈보호는 루이스 산, 예컨대 MgBr2, 구리의 염, 예컨대 황산구리, 산성 수지, 예컨대 암벨리스트(amberlyst), 무기산, 예컨대 HCl 및 H2SO4의 존재 하에서 수행될 수 있다. 하이드록시 보호기의 탈보호는 "Green's protecting groups in organic synthesis" ISBN 978-0-471-69754-1, 4th edition, 2007, page 62; John Wiley and Sons)에 개시되어 있다. 카복시기의 하이드록시의 탈보호는 예를 들어, 팔라듐 탄소 촉매, 백금 산화물 및 수소 가스 중 하나 이상의 존재 하에서 수행될 수 있다.
측쇄 프로드럭을 합성하기 위해, 출발 화합물
Figure pct00074
은 하기 화학식의 삼중 보호된 트리올 화합물로 전환될 수 있다:
Figure pct00075
상기 식에서, P'0 및 P2는 동일하거나 상이한 하이드록시 보호기일 수 있으며, 이는 예를 들어, 실릴 보호기, 예컨대 tert-부틸디메틸실릴 에테르(TBDMS/TBS), 트리메틸실릴(TMS), 트리에틸실릴(TES), tert-부틸디페닐실릴(TBDPS), 트리이소프로필실릴(TIPS)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 동일한 P'0 및 P2를 갖는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 도 2 및 4에서, 중요 중간 화합물은 TBDMSCl과 반응하여, P'0 및 P2 둘 다가 TBDMS인 삼중 보호된 트리올 화합물을 형성한다.
삼중 보호된 트리올 화합물은, 그다음 공액된 고리의 하이드록시를 탈보호시킴으로써 화학식
Figure pct00076
의 이중 보호된 트리올 화합물로 전환될 수 있다. 이러한 전환은 Li 함유 화합물, 예컨대 LiOAc 또는 LiOH의 존재 하에서 수행될 수 있다. 이중 보호된 트리올 화합물은, 그다음 하기 화학식의 삼중 보호된 카복시산 화합물로 전환될 수 있다:
Figure pct00077
상기 식에서, P0는 하이드록시 보호기, 예컨대 벤질 또는 치환된 벤질이다.
이중 보호된 트리올 화합물은
Figure pct00078
와 반응함으로써 삼중 보호된 카복시산 화합물로 전환될 수 있다.
삼중 보호된 카복시산 화합물은 그다음 측쇄의 하이드록시기를 탈보호시킴으로써 하기 화학식의 이중 보호된 카복시산 화합물로 전환될 수 있다:
Figure pct00079
. 측쇄의 하이드록시의 탈보호는 루이스 산, 예컨대 MgBr2, 구리의 염, 예컨대 황산구리, 산성 수지, 예컨대 암벨리스트, 무기산, 예컨대 HCl 및 H2SO4의 존재 하에서 수행될 수 있다. 하이드록시 보호기의 탈보호는 "Green's protecting groups in organic synthesis" ISBN 978-0-471-69754-1, 4th edition, 2007, page 62; John Wiley and Sons에 개시되어 있다.
이중 보호된 카복시산 화합물은 그다음 하기 화학식의 이중 보호된 프로드럭 화합물로 전환될 수 있다:
Figure pct00080
상기 식에서, R3은
Figure pct00081
일 수 있고, 여기서 Y는 OR4 또는 NR4R5이며 각각의 R4 및 R5는 독립적으로 H 및 C1-4 알킬 중에서 선택되거나, Y는 Cl, Br 또는 OCCl3이다. 이는 이중 보호된 카복시산 화합물을
Figure pct00082
(여기서, Z는 Cl, Br 또는 OCCl3이다)와 반응시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, R3이
Figure pct00083
일 때, 이중 보호된 카복시산 화합물은
Figure pct00084
와 반응하여, 각각 이중 보호된 프로드럭 화합물을 형성할 수 있다. R3이
Figure pct00085
일 때, 이중 보호된 화합물은
Figure pct00086
또는 Cl3CO-C(=O)-OCCl3/HN(CH3)-CH3의 혼합물과 반응하여, 각각 이중 보호된 프로드럭 화합물을 형성할 수 있다.
이중 보호된 프로드럭 화합물은 사이클로펜틸 고리의 하이드록시 및 카복시기의 하이드록시를 탈보호시킴으로써 하기 측쇄 프로드럭으로 전환될 수 있다:
Figure pct00087
. 사이클로펜틸 고리의 하이드록시 및 카복시기의 하이드록시의 탈보호는 단일 반응 또는 2개의 개별적인 반응에서 수행될 수 있다. 후자의 경우에, 사이클로펜틸 고리의 하이드록시의 탈보호는 카복시기의 하이드록시의 탈보호에 이어지거나 앞설 수 있다. 도 2 및 4에서, 사이클로펜틸 고리의 하이드록시의 탈보호 및 카복시기의 하이드록시의 탈보호는 전자에 이어 후자가 수행되는 2개의 개별적인 반응으로서 수행된다. 카복시기의 하이드록시의 탈보호는 팔라듐, 카보(carbo), 백금 산화물 및 수소 가스 중 하나 이상의 존재 하에서 수행될 수 있다. 사이클로펜틸 고리의 하이드록시의 탈보호는 테트라-n-부틸암모늄 플루오라이드(TBAF 및 n-Bu4NF) 또는 무기산, 예컨대 HCl 또는 H2SO4의 존재 하에서 수행될 수 있다.
트레프로스티닐 아미노산 아미드 프로드럭, 예컨대 프로드럭 J, K, L 또는 M은, 트레프로스티닐을, 카복시기의 수소가 하이드록시 보호기, 예컨대 벤질로 치환된 아미노산인 보호된 아미노산과 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 이러한 반응의 결과로서, 보호된 아미노산 아미드 프로드럭이 형성될 수 있다. 하이드록시 보호기는, 그다음 보호된 아미노산 아미드 프로드럭으로부터 제거되어, 트레프로스티닐 아미노산 아미드 프로드럭, 예컨대 프로드럭 J, K, L 또는 M을 형성할 수 있다.
본원에 기재된 실시양태는 하기 실시예에 의해 추가로 설명되지만, 이에 제한되지 않는다.
실시예
실시예 1
트레프로스티닐 카바메이트 프로드럭의 합성
Figure pct00088
[반응식 1] 트레프로스티닐 카바메이트 프로드럭의 합성
트레프로스티닐 모노-TES 벤질 에스테르(2a 및 2b)의 합성:
Figure pct00089
디클로로메탄(DCM)(200mL) 중 트레프로스티닐 벤질 에스테르(1)(100g, 20.80mmol)의 용액에 이미다졸(1.41g, 20.80mmol) 및 4-디메틸아미노피리딘(0.25g, 2.08mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물에, 교반하면서, 클로로트리에틸실란(3.5mL, 20.80mmol)을 아르곤 대기 하에서 주사기를 사용하여 첨가하였다. 1시간 후에, TLC(주석1)에 근거하여 반응이 완료되었음을 확인하였다. 반응물을 물(150mL)로 급랭(quenching)시키고, 유기층을 분리하고, 식염수(100mL)로 세척하고, 나트륨 설페이트 상에서 건조시키고, 진공 하에서 증발시켜 조질의 생성물을 수득하였다. 조질의 물질을 이동상으로서 에틸 아세테이트:헥산(0 내지 11%)을 사용하여 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여, 수율 54.04%로 모노-보호된 화합물2a(RD-UT-1160-185-I, 6.68g), 및 수율 3.88%로 모노-보호된 화합물2b(RD-UT-1160-185-III, 0.48g) 둘 다를 수득하였다. 순수한 생성물은 1H NMR에 의해 특징화되었다.
주석 1: 실리카겔 TLC를 사용하되, 이동상으로서 20% EtOAc:헥산을 사용하여 반응의 진행을 모니터링하였다.
측쇄 카바메이트 트레프로스티닐 프로드럭(5a)의 합성에 대한 실험
TES 측쇄 카바메이트 벤질 에스테르(3a)의 합성:
Figure pct00090
톨루엔 15mL 중 트레프로스티닐 모노-TES 벤질 에스테르(2a)(0.5g, 0.841mmol) 용액에 피리딘(0.14mL, 1.682mmol)을 첨가하고 아르곤 하에서 교반하였다. 여기에 톨루엔(12mL) 중 트리포스겐(0.37g, 1.261mmol)의 찬 용액을 0.5시간에 걸쳐 적가하였다. 추가로 0.5시간 동안 교반한 후에, TLC(주석 1)에 근거하여 반응이 완료되었음을 확인하였다. 적하 깔때기에 디메틸아민 용액(THF 중 2.0M)(6.0mL)을 채우고 0.5시간 동안 반응 혼합물에 첨가하였다. 추가로 1시간 동안 교반한 후에, TLC(주석 1)에 근거하여 반응이 완료되었음을 확인하였다. 반응물을 물(20mL)로 급랭시켰다. 유기층을 분리하고, 수성층을 MTBE(2 x 20mL)로 추출하였다. 혼합된 유기층을 식염수(100mL)로 세척하고, 나트륨 설페이트 상에서 건조시키고, 진공 하에서 증발시켜 조질의 생성물을 수득하였다. 이를, 이동상으로서 에틸 아세테이트:헥산(0 내지 12%)를 사용하여 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여, 총 수율 93.4%로, 순수한 TES 측쇄 카바메이트 벤질 에스테르(3a)(RD-UT-1160-188, 0.32g) 및 불순물(RD-UT-1160-188-Fr-22-23, 0.20g)을 수득하였다. 순수한 생성물은 1H NMR에 의해 특징화되었다.
주석 1: 실리카겔 TLC를 사용하되, 이동상으로서 30% EtOAc:헥산을 사용하여 반응의 진행을 모니터링하였다.
측쇄 카바메이트 벤질 에스테르(4a)의 합성:
Figure pct00091
THF(20mL) 및 물(4mL) 중 TES 측쇄 카바메이트 벤질 에스테르(3a)(0.295g, 0.443mmol)의 용액에 2N HCl 수용액(0.22mL, 0.443mmol)을 첨가하였다. 이를 주위 온도에서 1시간 동안 교반하였고 이에 대해 TLC가 반응의 완료를 나타냈다(주석 1). 이 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(2 x 40mL)로 추출하고 혼합된 유기층을 물(20mL), 식염수(20mL)로 세척하고, 나트륨 설페이트 상에서 건조시키고, 진공 하에서 증발시켜 조질의 물질을 수득하였다. 이를, 이동상으로서 에틸 아세테이트:헥산(0 내지 40%)를 사용하여 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여, 수율 106.5%로 순수한 측쇄 카바메이트 벤질 에스테르(4a)(RD-UT-1160-194, 0.26g)를 (잔류용매와 함께) 수득하였다. 순수한 생성물은 1H NMR 및 13C NMR에 의해 특징화되었다.
주석 1: 실리카겔 TLC를 사용하되, 이동상으로서 60% EtOAc:헥산을 사용하여 반응의 진행을 모니터링하였다.
측쇄 카바메이트 트레프로스티닐 프로드럭(5a)의 합성:
Figure pct00092
에틸 아세테이트(15mL) 중 측쇄 카바메이트 벤질 에스테르(4a)(0.25g, 0.443mmol)의 용액에 탄소 상 팔라듐(25mg)을 첨가하고, 진공을 사용하여 반응 시스템을 배기시키고, 풍선 압력 하에서 수소 기체로 대체하였다. 이를, 실온에서 6시간 동안 교반하고 TLC(주석1)에 근거하여 반응이 완료되었음을 확인하였다. 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고, 여액을 진공 하에 증발시켜 수율 86.1% 및 화학적 순도(HPLC) 98.62%로 측쇄 카바메이트 트레프로스티닐 프로드럭(5a)(0.18g)(RD-UT-1160-198)을 수득하였다. 생성물은 1H NMR, 13C NMR, IR 및 LC-MS에 의해 특징화되었다.
주석 1: 실리카겔 TLC를 사용하되, 이동상으로서 60% EtOAc:헥산을 사용하여 반응의 진행을 모니터링하였다.
사이클로펜틸 카바메이트 트레프로스티닐 프로드럭(5b)의 합성에 대한 실험
TES 사이클로펜틸 카바메이트 벤질 에스테르(3b)의 합성:
Figure pct00093
톨루엔(15mL) 중 트레프로스티닐 모노-TES 벤질 에스테르(2b)(0.45g, 0.757mmol)의 용액에 피리딘(0.12mL, 1.513mmol)을 첨가하고 아르곤 하에서 교반 하였다. 여기에 톨루엔(15mL) 중 트리포스겐(0.33g, 1.135mmol)의 찬 용액을 1시간에 걸쳐 적가하였다. 추가로 1시간 동안 교반한 후에, TLC(주석 1)에 근거하여 반응이 완료되었음을 확인하였다. 적하 깔때기에 디메틸아민 용액(THF 중 2.0M)(6.0mL)을 채우고 0.5시간에 걸쳐 반응 혼합물에 첨가하였다. 추가로 1시간 동안 교반한 후에, TLC(주석 1)에 근거하여 반응이 완료되었음을 확인하였다. 반응물을 물(20mL)로 급랭시켰다. 유기층을 분리하고, 수성층을 MTBE(2 x 20mL)로 추출하였다. 혼합된 유기층을 식염수(20mL)로 세척하고, 나트륨 설페이트 상에서 건조시키고, 진공 하에서 증발시켜 조질의 생성물을 수득하였다. 이를, 이동상으로서 에틸 아세테이트:헥산(0 내지 14%)을 사용하는 컬럼 크로마토그래피로 정제하여, 수율 87.5%로 순수한 TES 사이클로펜틸 카바메이트 벤질 에스테르(3b)(RD-UT-1160-195, 0.44g)를 수득하였다. 순수한 생성물은 1H NMR에 의해 특징화하였다.
주석 1: 실리카겔 TLC를 사용하되, 이동상으로서 30% EtOAc:헥산을 사용하여 반응의 진행을 모니터링하였다.
사이클로펜틸 카바메이트 벤질 에스테르(4b)의 합성:
Figure pct00094
THF(12mL) 및 물(3mL) 중 TES 사이클로펜틸 카바메이트 벤질 에스테르(3b)(0.42g, 0.631mmol)의 용액에 2N HCl 수용액(0.31mL, 0.631mmol)을 첨가하였다. 이를 주위 온도에서 1시간 동안 교반하여, TLC이 반응의 완료를 나타냈다(주석 1). 이 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(2 x 30mL)로 추출하고 혼합된 유기층을 식염수(20mL)로 세척하고, 나트륨 설페이트 상에서 건조시키고, 진공 하에서 증발시켜 조질의 물질을 수득하였다. 이를, 이동상으로서 에틸 아세테이트:헥산(0 내지 40%)을 사용하는 컬럼 크로마토그래피로 2회 정제하여, 수율 93.4%로 순수한 사이클로펜틸 카바메이트 벤질 에스테르(4b)(RD-UT-1160-205, 0.32g)를 수득하였다. 순수한 생성물은 1H NMR, 13C NMR에 의해 특징화되었다.
주석 1: 실리카겔 TLC를 사용하되, 이동상으로서 60% EtOAc:헥산을 사용하여 반응의 진행을 모니터링하였다.
사이클로펜틸 카바메이트 트레프로스티닐 프로드럭(5b)의 합성:
Figure pct00095
에틸 아세테이트 15mL 중 사이클로펜틸 카바메이트 벤질 에스테르(4b)(0.31g, 0.562mmol)의 용액에 탄소 상 팔라듐(30mg)을 첨가하고 진공을 사용하여 반응 시스템을 배기시키고 풍선 압력 하에서 수소 기체로 대체하였다. 이를 실온에서 6시간 동안 교반하고, TLC(주석1)에 근거하여 반응이 완료되었음을 확인하였다. 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고, 진공 하에서 증발시켜 수율 92.6% 및 화학적 순도(HPLC) 99.39%로 사이클로펜틸 카바메이트 트레프로스티닐 프로드럭(5b)(0.24g)(RD-UT-1160-198)을 수득하였다. 생성물은 1H NMR, 13C NMR, IR 및 LC-MS에 의해 특징화되었다.
주석 1: 실리카겔 TLC를 사용하되, 이동상으로서 60% EtOAc:헥산을 사용하여 반응의 진행을 모니터링하였다.
실시예 2
트레프로스티닐 글리콜아미드 프로드럭(프로드럭 VII)의 합성
Figure pct00096
논의:
글리콜아미드 프로드럭(반응식 2)의 합성을 위한 두 가지 방법을 연구하였다: 첫째로, 트레프로스티닐(UT-15) 및 글리신 메틸 에스테르의 반응을 통해 아미드 중간체 아미드 I을 수득한 다음, NaOH 가수분해하였다; 둘째로, UT-15와 글리신 벤질 에스테르 p-톨루엔설폰산의 반응을 통해 아미드 중간체 아미드 II를 형성시킨 다음, 수소화시켰다. 첫 번째 경로는 가수분해 단계를 위한 강한 염기 조건을 포함하고, 에스테르 결합과 아미드 결합 둘 다의 가수분해를 야기하여 UT-15의 형성을 유도하였다. 두 번째 경로는 아미드 II의 탈벤질화를 위한 비-염기성 수소화 분해를 포함하고, 어떠한 아미드 결합 절단 없이 깨끗한 목적하는 생성물을 제공하고 UT-15의 형성을 유도하지 않았다. 최종적으로, 두 번째 경로를 사용하여 트레프로스티닐의 글리콜아미드 프로드럭(프로드럭 Ⅶ)을 제조하였다.
Figure pct00097
[반응식 2] 글리콜아미드 프로드럭의 합성
단계 1: 아미드 II의 합성
Figure pct00098
마그네틱 교반 봉(magnetic stir bar)이 구비된 50ml 둥근 바닥 플라스크를 아르곤 하에서 무수 DCM(20ml) 중 UT-15(0.5g, 1.28mmol)의 용액으로 채웠다. 이 용액에 아르곤 하에서 실온에서 Bop-Cl(0.49g, 1.92mmol)을 첨가한 다음, 글리신 벤질 에스테르 p-톨루엔설폰산(0.43g, 1.28mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 20분 동안 교반한 후에, 트리에틸아민(0.39g, 3.84mmol)을 첨가하였다. 반응이 완료될 때까지 반응 혼합물을 밤새 교반하였다. 반응의 진행은 tlc로 확인하였다. 반응물을 0.1N HCl(10ml)로 급랭시키고, DCM 층을 분리시키고, 10% NaHCO3(10ml), 물(10ml) 및 식염수(10ml)로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에서 농축시켜, 조질의 생성물(0.9g, RD-UT-1161-101)을 수득하였다. 조질의 생성물을 헥산 중 30 내지 60% EtOAc의 구배 용매를 사용하여 실리카겔 상에서 정제하여 순수한 생성물(아미드 II)(0.396g, RD-UT-1161-101B)을 수득하였다. 이 화합물은 1H NMR에 의해 특징화되었다.
단계 2: 글리콜아미드 프로드럭(프로드럭 VII)의 합성
Figure pct00099
마그네틱 교반 봉이 구비된 50ml 둥근 바닥 플라스크에 에탄올(30.0mL) 중 아미드 II(250mg, 0.465mmol)의 용액을 채웠다. 반응 혼합물을 아르곤으로 3회 공기를 배기시킨 후에, 5% Pd-C(75mg)를 첨가하고 아르곤을 H2로 3회 대체하였다. 반응 혼합물을 풍선을 사용하여 H2로 가압하고 실온에서 방치하였다. 반응 혼합물을 1시간 동안 교반하고, 반응의 진행을 tlc(EtOAc)로 확인하였다. 반응 혼합물은 셀라이트 패드를 통해 통과시키고, 셀라이트 패드를 에탄올(50ml)로 세척하였다. 혼합된 에탄올 용액을 진공 하에서 농축시켜, 생성물 글리콜아미드(191mg, RD-UT-1161-121)를 백색 발포체(foam)로 수득하였다. 화합물은 1H NMR, 13C NMR, IR 및 MS에 의해 특징화되었다. HPLC 순도는 98.77%이었고 어떠한 유리 UT-15도 관찰되지 않았다.
실시예 3
트레프로스티닐의 프로드럭: 트레프로스티닐의 측쇄 및 사이클로펜틸 메틸 카보네이트의 제조
Figure pct00100
트레프로스티닐의 측쇄 메틸 카보네이트 프로드럭(왼쪽) 및 트레프로스티닐의 사이클로펜틸 메틸 카보네이트(오른쪽)가 상기에 제시되어 있다.
Figure pct00101
[반응식 3] 트레프로스티닐의 측쇄 메틸 카보네이트(6)의 합성
Figure pct00102
[반응식 4] 트레프로스티닐의 사이클로펜틸 메틸 카보네이트(9)의 합성
실험:
모노-TES 보호된 트레프로스티닐 벤질 에스테르(2 및 3)의 합성
Figure pct00103
무수 디클로로메탄(100mL) 중 트레프로스티닐 벤질 에스테르(1)(5.06g, 10.53mmol)의 용액에 이미다졸(0.72g, 10.57mmol) 및 4-(디메틸아미노)피리딘(DMAP)(0.13g, 1.06mmol)을 실온에서 첨가하였다. 이 투명한 용액에 무수 디클로로메탄(30mL) 중 클로로트리에틸실란(1.59g, 1.77mL, 10.55mmol)의 용액을 아르곤 하에서 실온에서 1시간에 걸쳐 적가하였다. 첨가를 완료한 후에, 반응 혼합물을 4.5시간 동안 교반하고, tlc(EtOAc/헥산, 1:4)를 확인하였다. 반응 혼합물을 물(50mL)로 급랭시키고, 디클로로메탄 층을 분리하였다. 디클로로메탄 층을 물(1 x 50mL), 식염수(1 x 20mL)로 세척하고, 건조시키고(Na2SO4), 여과하고, 진공 하에서 농축시켜 연황색 점성 액체(6.95g)(로트번호 D-1166-160)를 얻었다. 조질의 생성물을 헥산 중 에틸 아세테이트(2 내지 20%)를 사용하는 실리카 겔(265g) 컬럼 상에서 크로마토그래피하여, 디-TES 보호된 트레프로스티닐 벤질 에스테르(1.59g, 로트번호 D-1166-160-A), 사이클로펜틸-TES 보호된 트레프로스티닐 벤질 에스테르(2)(2.95g, 로트번호 D-1166-160-B) 및 측쇄-TES 보호된 트레프로스티닐 벤질 에스테르(3)(0.55g, 로트번호 D-1166-160-D)를 얻었다. 모노-TES 보호된 화합물(2 및 3) 모두는 스펙트럼 데이터(IR, 1H NMR 및 MS)에 의해 특징화되었다.
사이클로펜틸-TES 측쇄 메틸 카보네이트 트레프로스티닐 벤질 에스테르(4)의 합성
Figure pct00104
무수 피리딘(4.0mL) 중 사이클로펜틸-TES 보호된 트레프로스티닐 벤질 에스테르(2)(0.84g, 1.41mmol)의 용액에 무수 디클로로메탄(4.0mL) 중 메틸 클로로포르메이트(1.33g, 1.09mL, 14.1mmol)의 용액을 0℃ 내지 5℃에서 아르곤 하에서 5분에 걸쳐 적가하였다. 첨가를 완료한 후에, 반응 혼합물을 0℃ 내지 실온에서 밤새 교반하였다. 20시간 후에, 반응 혼합물을 tlc(EtOAc/헥산, 1:4)로 확인하였고 반응을 완료하였다. 혼합물을 물(20mL)로 처리한 후에 디클로로메탄(3 x 25mL)으로 추출하였다. 혼합된 디클로로메탄 추출물을 물(1 x 20mL), 식염수(1 x 10mL)로 세척하고, 건조시키고(Na2SO4), 여과하고, 진공 하에서 농축시켜, 조질의 생성물을 연 분홍색의 점성 액체(0.88g)(로트번호 D-1166-189)로서 얻었다. 조질의 생성물을 헥산(2 내지 10%) 중 에틸 아세테이트를 사용하여 실리카 겔(35g) 컬럼 상에서 크로마토그래피하여, 사이클로펜틸-TES 측쇄 메틸 카보네이트 트레프로스티닐 벤질 에스테르(4)를 옅은 황색 점성 액체(0.69g)(로트번호 D-1166-189-B)로서 얻었다. 순수한 화합물은 스펙트럼 데이터(IR, 1H NMR, 13C NMR 및 MS) 및 HPLC에 의한 순도(94.58%, AUC)에 의해 특징화되었다.
측쇄 메틸 카보네이트 트레프로스티닐 벤질 에스테르(5)의 합성
Figure pct00105
테트라하이드로퓨란(10mL) 및 물(2mL)의 혼합물(THF:H2O = 5:1의 비율) 중 사이클로펜틸-TES 측쇄 메틸 카보네이트 트레프로스티닐 벤질 에스테르(4)(0.307g, 0.470mmol)의 용액에 1N 염산(0.71mL, 0.71mmol)을 실온에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하고, tlc(EtOAc/헥산, 3:7)를 확인하였다. 반응이 완료되었고 혼합물을 포화된 나트륨 바이카보네이트(1mL)를 사용하여 pH 7 내지 8로 중화시킨 후에 물(10mL)로 희석하였다. 혼합물을 MTBE(3 x 15mL)로 추출하였다. 혼합된 MTBE 추출물을 물(2 x 10mL), 식염수(1 x 10mL)로 세척하고, 건조시키고(Na2SO4), 여과하고, 진공 하에서 농축시켜 투명한 점성 액체(0.37g)(로트번호 D-1166-203)를 얻었다. 다른 반응으로부터의 조질의 생성물(0.031g)(로트번호 D-1166-201)을 정제를 위해 이 로트와 혼합하였다. 혼합된 조질의 생성물을 헥산 중 에틸 아세테이트(5 내지 30%)를 사용하여 실리카 겔(16g) 컬럼 상에서 크로마토그래피하여, 측쇄 메틸 카보네이트 트레프로스티닐 벤질 에스테르(5)를 투명한 점성 액체(0.252g)(로트번호 D-1166-203-B)로서 얻었다. 순수한 화합물은 스펙트럼 데이터(IR, 1H NMR, 13C NMR 및 MS) 및 HPLC에 의한 순도(99.83%, AUC)에 의해 특징화되었다.
트레프로스티닐의 측쇄 메틸 카보네이트(6)의 합성
Figure pct00106
에틸 아세테이트(10mL) 중 측쇄 메틸 카보네이트 트레프로스티닐 벤질 에스테르(5)(0.23g, 0.427mmol)의 용액에 탄소 상 팔라듐(5 중량%, 50% 습윤)(0.12g)을 첨가하였다. 혼합물을 교반하고 실내 진공 하에서 배기시키고, (풍선 내에 충전된) 수소로 대체하였다. 이 과정을 3회 반복하였다. 혼합물을 실온에서 수소 대기 하에서 2시간 동안 교반하고, tlc(EtOAc/헥산, 3:7, 및 EtOAc, 100%)를 확인하였다. 반응이 완료되었다. 반응 혼합물을 셀라이트(1.0g)로 처리하고, 와트만 필터 No. 50을 갖는 일회용 폴리에틸렌 프리츠(frit) 중 셀라이트 패드(2.0g)를 통해 여과하고, 고체를 에틸 아세테이트(3 x 10mL)로 세척하였다. 혼합된 에틸 아세테이트 여액을 진공 하에서 증발시켜, 트레프로스티닐의 측쇄 메틸 카보네이트(6)를 회백색 발포성 고체(0.188g)(로트번호 D-1166-206)로서 얻었다. 화합물은 스펙트럼 데이터(IR, 1H NMR, 13C NMR, 및 MS) 및 HPLC에 의한 순도(99.64%, AUC)에 의해 완전히 특징화되었다.
측쇄-TES 사이클로펜틸 메틸 카보네이트 트레프로스티닐 벤질 에스테르(7)의 합성
Figure pct00107
무수 피리딘(2.0mL) 중 측쇄-TES 보호된 트레프로스티닐 벤질 에스테르(3) (0.28g, 0.47mmol)의 용액에 무수 디클로로메탄(2.0mL) 중 메틸 클로로포르메이트(0.44g, 0.36mL, 4.66mmol)의 용액을 0℃ 내지 5℃에서 아르곤 하에서 5분에 걸쳐 적가하였다. 첨가를 완료한 후에, 반응 혼합물을 0℃ 내지 실온에서 밤새 교반하였다. 17시간 후에, 반응 혼합물을 tlc(EtOAc/헥산, 1:4)로 확인하였고 반응이 완료되었다. 혼합물을 물(10mL) 및 MTBE(15mL)로 처리하였다. 유기층을 분리하고, 물(2 x 15mL), 5% 시트르산(2 x 10mL), 물(1 x 10mL), 식염수(1 x 5mL)로 세척하고, 건조시키고(Na2SO4), 여과하고, 진공 하에서 농축시켜, 측쇄-TES 사이클로펜틸 메틸 카보네이트 트레프로스티닐 벤질 에스테르(7)를 옅은 황색 점성 액체(0.285g)(로트번호 D-1166-187)로서 얻었다. 화합물은 스펙트럼 데이터(IR, 1H NMR, 13C NMR 및 MS) 및 HPLC에 의한 순도(74.27%, AUC)에 의해 특징화되었다.
사이클로펜틸 메틸 카보네이트 트레프로스티닐 벤질 에스테르(8)의 합성
Figure pct00108
테트라하이드로푸란(10mL) 및 물(2mL)의 혼합물(THF:H2O = 5:1의 비율) 중 측쇄-TES 사이클로펜틸 메틸 카보네이트 트레프로스티닐 벤질 에스테르(7)(0.27g, 0.413mmol)의 용액에 1N 염산(0.62mL, 0.62mmol)을 실온에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 20분 동안 교반하고, tlc(EtOAc/헥산, 1:4 및 3:7)를 확인하였다. 반응이 완료되었고 혼합물을 포화된 나트륨 바이카보네이트(1mL)를 사용하여 pH 7 내지 8로 중화시킨 후에 물(10mL)로 희석하였다. 혼합물을 MTBE(3 x 15mL)로 추출하였다. 혼합된 MTBE 추출물을 물(2 x 10mL), 식염수(1 x 10mL)로 세척하고, 건조시키고(Na2SO4), 여과하고, 진공 하에서 농축시켜 투명한 점성 액체(0.24g)(로트번호 D-1174-001)를 얻었다. 조질의 생성물을 헥산 중 에틸 아세테이트(5 내지 30%)를 사용하여 실리카 겔(18g) 컬럼 상에서 크로마토그래피하여, 사이클로펜틸 메틸 카보네이트 트레프로스티닐 벤질 에스테르(8)를 투명한 점성 액체/백색 반고체(로트번호 D-1174-001-B)(0.19g)로서 얻었다. 순수한 화합물은 스펙트럼 데이터(IR, 1H NMR, 13C NMR 및 MS) 및 HPLC에 의한 순도(98.45%, AUC)에 의해 특징화되었다.
트레프로스티닐의 사이클로펜틸 메틸 카보네이트(9)의 합성
Figure pct00109
에틸 아세테이트(10mL) 중 사이클로펜틸 메틸 카보네이트 트레프로스티닐 벤질 에스테르(8)(0.16g, 0.297mmol)의 용액에 탄소 상 팔라듐(5 중량%, 50% 습윤)(0.08g)을 첨가하였다. 혼합물을 교반하고 실내 진공 하에서 배기시키고 (풍선 내에 충전된) 수소로 대체하였다. 이 과정을 3회 반복하였다. 혼합물을 실온에서 수소 대기 하에서 2시간 동안 교반하고, tlc(EtOAc/헥산, 3:7, 및 EtOAc, 100%)를 확인하였다. 반응이 완료되었다. 반응 혼합물을 셀라이트(1.0g)로 처리하고 와트만 필터 No. 50을 갖는 일회용 폴리에틸렌 프리츠 중 셀라이트 패드(2.0g)를 통해 여과하고, 고체를 에틸 아세테이트(3 x 10mL)로 세척하였다. 혼합된 에틸 아세테이트 여액을 진공 하에서 증발시켜, 트레프로스티닐의 사이클로펜틸 메틸 카보네이트(9)를 백색 점성 액체/반고체(0.138g)(로트번호 D-1174-004)로서 얻었다. 화합물은 스펙트럼 데이터(IR, 1H NMR, 13C NMR 및 MS) 및 HPLC에 의한 순도(98.97%, AUC)에 의해 완전히 특징화되었다.
실시예 4
트레프로스티닐 및 이의 프로드럭의 시험관내(in vitro) 수용체 활성
트레프로스티닐 뿐만 아니라 프로드럭 I, II, III, IV, VII 및 IX(구조에 대해서는 도 7 및 39 참조)를 3종의 G-단백질-결합 수용체(G-protein-coupled receptor(GPCR)), 즉, DP1, EP2 및 IP에 대해, 사이클린 아데노신 모노포스페이트(cAMP) 검정을 사용하여 시험하였다.
재료. 세포 및 조절 작용제: 연구에 사용된 세포 및 조절 작용제는 표 1에 요약되어 있다.
Figure pct00110
연구에 사용된 세포주 및 조절 작용제
화합물은 분말 형태로 제공되었다. 상기 화합물을 DMSO 중에서 10mM의 농도로 재구성하였다.
사이클릭 AMP 검정 키트: HTRF cAMP HiRange 키트(CisBio, 카탈로그 번호 62AM6PEC).
기기: FlexStation III(몰레큘라 디바이스(Molecular Devices)).
방법
사이클릭 AMP(cAMP) 검정: cAMP 검정은 CisBio의 HTRF cAMP HiRange 키트를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 수행되었다. 작용제 모드에서 Gs 경로 검정을 위해, 세포를 384 웰 플레이트에서 화합물과 함께 37℃에서 20분 동안 항온처리하였다. 상기 반응은 D2-표지된(labeled) cAMP 및 크립테이트-표지된 항-cAMP 항체를 용균 완충액에 순차적으로 첨가함으로써 종결시켰다. 그다음, 플레이트를, FlexStation III(몰레큘라 디바이스)에서 314nm에서 여기시켜 620nm 및 668nm에서 형광 발광을 판독하기 전에, 실온에서 60분 동안 항온처리하였다.
데이터 분석
사이클릭 AMP(cAMP) 검정: 사이클릭 AMP 검정 결과는 "비율 668/620 x 10,000"(668nm 및 620nm에서의 형광 비율 x 10,000)로 도시된다. 그래프의 데이터는 평균±SD로 표시되었다. 투여량-의존적 반응은 GraphPad Prism 버전 4, 5 또는 6(Graphpad Prism)을 사용하여 가변적 기울기를 허용하는 S 자형 투여량-반응 곡선에 맞춰졌다.
결과
모든 화합물 및 조절 작용제는 DP1, EP2 및 IP1 수용체 발현 세포에서 투여량 반응 활성을 나타냈다. 투여량-의존적 반응으로부터 측정된 EC50(최대 반응값의 1/2를 나타내는 약물 농도) 값을 표 2에 제시하였다.
Figure pct00111
트레프로스티닐 및 이의 프로드럭에 대한 수용체 활성(EC50, M)
표 2의 데이터는 각각의 연구된 프로드럭이 DP1, EP2 및 IP1에 대하여 트레프로티닐보다 현저하게 효력(potent)이 약하다는 것을 입증한다. 본 발명은 이의 작용 원리에 의해 제한되지 않지만, 트레프로스티닐의 피하 투여 중에 관찰된 부위 통증은, 피하 조직 내 IP 수용체, DP 수용체 및 EP 수용체 중 하나 이상에 영향을 미치는 트레프로스티닐 때문일 수 있다. 연구된 프로드럭은 트레프로스티닐보다 IP 수용체, DP 수용체 및 EP 수용체 각각에 대해 효력이 약하기 때문에 이들 프로드럭은 피하 투여시 부위 통증을 덜 일으킬 수 있다.
실시예 5
인간 G 단백질 커플링 수용체에 대한 프로드럭 XV의 평가
트레프로스티닐 뿐만 아니라 프로드럭 XV(구조에 대해서는 도 10 참조)를 3종의 G-단백질 커플링 수용체(GPCR), 즉, DP1, EP2 및 IP에 대해, 사이클릭 아데노신 모노포스페이트(cAMP) 검정을 사용하여 시험하였다.
재료. 세포 및 조절 작용제: 연구에 사용된 세포 및 조절 작용제는 표 1에 요약되어 있다.
화합물은 분말 형태의 2종의 화합물로 제공되었다. 상기 화합물들을 DMSO 중에서 10 mM의 농도로 재구성하였다.
사이클릭 AMP 검정 키트 : Multiscreen™ TR-FRET cAMP 1.0 No Wash 검정 키트(Multispan, Inc., 카탈로그 번호 MSCM01-25) 및 HTRF cAMP HiRange 키트(CisBio, 카탈로그 번호 62AM6PEC). 기기: FlexStation III(몰레큘라 디바이스).
방법
사이클릭 AMP(cAMP) 검정: Multiscreen™ TR-FRET cAMP 1.0 No Wash 검정 키트 또는 HTRF cAMP HiRange 키트를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 cAMP 검정을 수행하였다. 작용제 모드 시험을 위해, 세포를 포스콜린(forskolin) 첨가 전에 실온에서 5분 동안 커스터머(customer) 화합물과 함께 예비항온처리한 다음, 플레이트를 37℃에서 20분 동안 항온처리하였다. 반응은 trFluor™ Eu-표지된(labeled) cAMP 및 trFluor™ 650-표지된 항-cAMP 항체, 또는 D2-표지된 cAMP 및 크립테이트-표지된 항-cAMP 항체를 용균 완충액에 순차적으로 첨가함으로써 종결시켰다. 그다음, 플레이트를, FlexStation III(몰레큘라 디바이스)에서 314nm에서 여기시켜 620nm, 및 665nm 또는 668nm에서 형광 발광을 판독하기 전에, 실온에서 60분 동안 항온처리하였다.
데이터 분석:
사이클릭 AMP(cAMP) 검정: 사이클릭 AMP 검정 결과는 "비율 665/620 x 10,000"(665nm 및 620nm에서의 형광 비율 x 10,000) 또는 "비율 668/620 x 10,000"(668nm 및 620nm에서의 형광 비율 x 10,000)로 도시된다. 그래프의 데이터는 평균±SD로 표시되었다. 투여량-의존적 반응은 GraphPad Prism 버전 4, 5 또는 6을 사용하여 가변적 기울기를 허용하는 S 자형 투여량-반응 곡선에 맞춰졌다.
결과 및 논의
3종의 GPCR 모두에 대한 조절 작용제는 예상되는 EC50b(최대 반응값의 1/2를 나타내는 약물 농도) 값을 갖는 수용체 발현 세포에 투여량-의존적 자극을 나타냈다. 모든 화합물 및 조절 작용제는 DP1, EP2 및 IP1 수용체 발현 세포에서 투여량 반응 활성을 나타냈다. 투여량-의존적 반응으로부터 측정된 EC50 값을 표 3에 제시하였다.
Figure pct00112
결론
표 3의 데이터는 프로드럭 XV가 DP1, EP2 및 IP1에 대하여 트레프로티닐 보다 현저하게 효력이 약하다는 것을 입증한다. 본 발명은 이의 작용 원리에 의해 제한되지 않지만, 트레프로스티닐의 피하 투여 중에 관찰된 부위 통증은 피하 조직에서 IP 수용체, DP 수용체 및 EP 수용체 중 하나 이상에 영향을 미치는 트레프로스티닐 때문일 수 있다. 프로드럭 XV는 트레프로스티닐보다 각각의 IP 수용체, DP 수용체 및 EP 수용체에 대해 효력이 약하기 때문에, 이는 피하 투여시 부위 통증을 덜 일으킬 수 있다.
실시예 6
인간 G 단백질 커플링 수용체에 대한 프로드럭 XIV의 평가
트레프로스티닐 뿐만 아니라 트레프로스티닐 프로드럭 XIV(구조에 대해서는 도 10 참조)을 3종의 G-단백질 커플링 수용체(GPCR), 즉, DP1, EP2 및 IP에 대해, 사이클린 아데노신 모노포스페이트(cAMP) 검정을 사용하여 시험하였다.
재료. 세포 및 조절 작용제: 연구에 사용된 세포 및 조절 작용제는 표 1에 요약되어 있다.
화합물은 분말 형태의 2종의 화합물로 제공되었다. 상기 화합물들을 DMSO 중에서 10mM의 농도로 재구성하였다.
사이클릭 AMP 검정 키트: Multiscreen™ TR-FRET cAMP 1.0 No Wash 검정 키트(멀티스팬 인포레이티드(Multispan, Inc.), 카탈로그 번호 MSCM01-25) 및 HTRF cAMP HiRange 키트(시스바이오(CisBio), 카탈로그 번호 62AM6PEC). 기기: FlexStation III(몰레큘라 디바이스).
방법
사이클릭 AMP (cAMP) 검정: Multiscreen™ TR-FRET cAMP 1.0 No Wash 검정 키트 또는 HTRF cAMP HiRange 키트를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 cAMP 분석을 수행하였다. 작용제 모드 시험을 위해, 세포를 포스콜린 첨가 전에 실온에서 5분 동안 커스터머 화합물과 함께 예비항온처리한 후에, 플레이트를 37℃에서 20분 동안 항온처리하였다. 반응은 trFluor™ Eu-표지된 cAMP 및 trFluor™ 650-표지된 항-cAMP 항체, 또는 D2-표지된 cAMP 및 크립테이트-표지된 항-cAMP 항체를 용균 완충액에 순차적으로 첨가함으로써 종결시켰다. 그다음, 플레이트를, FlexStation III(몰레큘라 디바이스)에서 314nm에서 여기시켜 620nm, 및 665nm 또는 668nm에서 형광 발광을 판독하기 전에, 실온에서 60분 동안 항온처리하였다.
데이터 분석:
사이클릭 AMP(cAMP) 검정: 사이클릭 AMP 검정 결과는 "비율 665/620 x 10,000"(665nm 및 620nm에서의 형광 비율 x 10,000) 또는 "비율 668/620 x 10,000"(668nm 및 620nm에서의 형광 비율 x 10,000)로 도시된다. 그래프의 데이터는 평균±SD로 표시되었다. 투여량-의존적 반응은 GraphPad Prism 버전 4, 5 또는 6(Graphpad Prism)을 사용하여 가변적 기울기를 허용하는 S 자형 투여량-반응 곡선에 맞춰졌다.
결과 및 논의
3종의 GPCR 모두에 대한 조절 작용제는 예상되는 EC50(최대 반응값의 1/2를 나타내는 약물 농도) 값을 갖는 수용체 발현 세포에서 투여량-의존적 자극을 나타냈다. 모든 화합물 및 조절 작용제는 DP1, EP2 및 IP1 수용체 발현 세포에서 투여량 반응 활성을 나타냈다. 투여량-의존적 반응으로부터 측정된 EC50 값을 표 4에 제시하였다.
Figure pct00113
결론
표 4의 데이터는 프로드럭 XIV이 DP1, EP2 및 IP1에 대하여 트레프로스티닐 보다 현저하게 효력이 약하다는 것을 입증한다. 본 발명은 이의 작용 원리에 의해 제한되지 않지만, 트레프로스티닐의 피하 투여 중에 관찰된 부위 통증은 피하 조직 내 IP 수용체, DP 수용체 및 EP 수용체 중 하나 이상에 영향을 미치는 트레프로스티닐 때문일 수 있다. 프로드럭 XIV은 트레프로스티닐보다 각각의 IP 수용체, DP 수용체 및 EP 수용체에 대해 효력이 약하기 때문에, 이는 피하 투여시 부위 통증을 덜 일으킬 수 있다.
실시예 7
HPLC 분석 방법의 개발 및 선택된 비히클 중 트레프로스티닐의 8종의 프로 드럭에 대한 평형 용해도 및 용액 안정성의 측정
1. 목적 및 요약
이 연구의 목적은 트레프로스티닐의 다수의 프로드럭 분석에 적합한 분석 방법을 개발하고 선택된 비히클(125mM 염화나트륨를 함유한 20mM 이염기 나트륨 포스페이트) 중 8종 프로드럭의 평형 용해도 및 용액 안정성을 측정하는 것이다.
프로드럭 III, IV, VIII, X, XI, XII, XIII 및 XIV를 포함하는 트레프로스티닐의 8종 프로드럭이 이 연구에 사용되었다. 프로드럭 VII에 대해 이전에 개발된 분석 방법은 특이성(specificity)을 개선하기 위하여, 방법 매개변수의 약간의 변경 후에 다른 프로드럭에 이용되었다. 일단 적절한 특이성이 달성되면, 각각의 프로드럭에 대한 평형 용해도 연구를 수행하였다. 용해도 연구는 다중 시점에서 평가되어 선택된 비히클 중 프로드럭의 용액 안정성을 평가하였다.
2. 실험
2.1 설비
모든 연구는 포토다이오드 검정 검출기(PDA)가 구비된 Waters UPLC H-Class 시스템에서 수행되었다. 평가된 모든 컬럼은 2.1x100mm, 1.7μm이었다.
2.2 방법 조건의 개발
2.2.1 프로드럭 VII 방법 조건의 평가
트레프로스티닐 프로드럭 VII에 대해 이전에 개발된 분석 방법은 프로드럭 III, IV, VIII, X, XI, XII, XIII, 및 XIV의 크로마토그래피 특이성에 대한 조건을 개발하기 위한 출발점이다. 프로드럭 VII 방법 조건은 표 5에 제공되어 있다.
방법 최적화를 위한 공칭 시작 조건
매개변수 최종 방법 조건
검출 UV @ 217 nm (4.8 nm 분해능)
샘플링 속도: 5 pts/s
유속 0.4mL/분
컬럼 ACE 엑셀 2 C18, 2.1x100mm 1.7μm
컬럼 온도 40℃
샘플 농도 1mg/mL
희석액 50:50 아세토니트릴: 20mM 나트륨 포스페이트 완충액 pH 6.2
주입 부피 1.0㎕
컬럼 온도: 40℃
실행 시간 20분
시간, 분 MPA%
(H2O 중 0.1% 인산)		 MPB%
(아세토니트릴)
0.0 70 30
0.50 70 30
14.0 25 75
16.0 5 95
17.0 5 95
17.1 70 30
20.0 70 30
특이성 연구의 목표는 트레프로스티닐로부터 각각의 프로드럭을 분해(resolve)하는 단일 크로마토그래피 조건을 달성하는 것이다. 각각의 프로드럭을 개별적으로 준비한 후에, 특이성을 평가하기 위해 10%의 공칭 트레프로스티닐을 개별적으로 섞었다. 프로드럭 VII 분석 방법에 의해 분석된 프로드럭들 및 트레프로스티닐의 크로마토그래피 오버레이(overlay)를 도 11에 제공하고 있다.
프로드럭 VII 방법을 사용한 특이성 연구의 결과는, 트레프로스티닐이, 함께 용리되는 프로드럭 XIV를 제외한 모든 프로드럭들로부터 잘 분리됨을 나타낸다.
프로드럭 VII 방법 조건을 사용하여 프로드럭의 특이성을 평가하기 위해 3종의 추가 컬럼을 스크리닝하였다. Waters BEH C18 컬럼 상의 트레프로스티닐 및 8종 프로드럭들의 크로마토그래피 오버레이가 도 12에 제공되어 있다. ACE C18-AR 컬럼 상의 트레프로스티닐 및 8종 프로드럭의 크로마토그래피 오버레이가 도 13에 제공되어 있다. Waters CSH 페닐 헥실 컬럼 상의 트레프로스티닐 및 8종 프로드럭의 크로마토그래피 오버레이가 도 14에 제공되어 있다.
컬럼 스크리닝의 결과는, 프로드럭 XIV를 포함하는 모든 프로드럭들이 ACE 엑셀 2 C18-AR 컬럼(Rs = 2.8, 결과 ID 2949) 또는 Waters CSH 페닐 헥실 컬럼(Rs = 2.9, 결과 ID 3028) 상에서 트레프로스티닐로부터 적절히 분해될 수 있음을 나타낸다. 분해능(resolution)은 컬럼 간에 본질적으로 동일했지만, CSH 페닐 헥실 컬럼이 평형 용해도 및 용액 안정성 연구를 위해 선택되었다.
3. 평형 용해도 및 용액 안정성
3.1. 연구 설계
각각의 프로드럭을 125mM 염화나트륨와 함께 20mM 나트륨 포스페이트 이염기를 함유하는 비히클에 용해시켰다. 프로드럭은, 30mg/mL의 공칭 포화 농도를 달성하기 위해, 프로드럭 15 내지 30mg을 4mL 투명 유리 바이알에서 계량하고, 적당한 부피(0.5 내지 1.0mL)의 비히클에 용해시킴으로써, 포화 농도로 제조되었다. 상기 용액을 회전 혼합기에서 23시간 동안 혼합하였다. 프로드럭 XIV를 제외한 모든 용액은 혼합 후에 고체를 나타냈다. 생성된 상청액을, 15000 RPM에서 15분 동안 원심 분리하여 용해되지 않은 프로드럭으로부터 단리하였다. 상청액을 투명한 유리 바이알에 옮기고 실온에서 보관하였다. 용해도 및 용액 안정성을 평가하기 위해, 상청액 15㎕를 마이크로 바이알에 옮기고 희석액(25:75 아세토니트릴: 20mM 나트륨 포스페이트 pH 6.2) 210㎕ 및 아세토니트릴 100㎕를 첨가함으로써, 21.7배 희석하였다. 생성된 샘플을 트레프로스티닐에 대해 검정하여 프로드럭 농도를 측정하였다. 각각의 시험 간격(0, 24, 72시간)에서, 상청액을 프로드럭 농도 및 면적%에 의한 순도에 대하여 검정하였다.
3.2. 연구 결과
3종의 안정성 시험 간격에 걸친 평형 용해도 연구의 결과는 표 6에 요약되어있다. 프로드럭에 대한 용액 안정성의 결과는 표 7 및 표 8에 요약되어 있다.
Figure pct00114
125mM 염화나트륨와 함께 20mM 나트륨 포스페이트 이염기를 함유하는 비히클에서 72시간에 걸쳐 평가된, 트레프로스티닐의 평형 용해도
Figure pct00115
125mM 염화나트륨와 함께 20mM 나트륨 포스페이트 이염기를 함유하는 비히클 중 프로드럭의 용액 안정성(면적% 순도)
Figure pct00116
125mM 염화나트륨와 함께 20mM 나트륨 포스페이트 이염기를 함유하는 비히클 중 프로드럭의 용액 안정성(잔류 트레프로스티닐 면적%)
3.3. 논의
트레프로스티닐의 8종 프로드럭에 대한 평형 용해도 연구는 선택된 비히클 중 화합물에 대해 광범위한 용해도를 나타낸다. 프로드럭 XIII은 가장 용해도가 낮았으며(대략 3.5mg/mL), 프로드럭-N이 가장 용해도가 높았다(대략 30mg/mL). 상기 프로드럭들은, 프로드럭 순도 및 잔류 트레프로스티닐 둘 다에서 변화가 전혀 없거나 약간 변화있게 72시간까지 비히클 내에서 안정하다는 것이 입증되었다. 프로드럭 XIV는 평가된 모든 프로드럭에 걸쳐 비히클 중에서 최대 트레프로스티닐 형성을 보였으나, 이 프로드럭의 경우에 72시간 동안 단지 0.15% 만이 형성되었다.
4. 결론
분석 방법은 UPLC-UV에 의해 트레프로스티닐의 8종 프로드럭을 평가하기 위해 개발되었다. 프로드럭 VII 방법 조건은 방법 최적화 약간의 변경을 위한 출발점으로서 사용되어, 컬럼 화학적 성질(ACE 엑셀 2 C18 대신에 Waters CSH 페닐 헥실)을 변화시켰다. 트레프로스티닐로부터 각각의 프로드럭을 적절히 분해하기 위해 변화가 요구되었다. 평형 용해도 연구는 8종의 화합물에 걸쳐서 선택된 비히클 중 프로드럭에 대한 광범위한 용해도를 나타낸다. 8종 프로드럭 중 6종은 6 내지 13mg/mL의 비히클 중 용해도를 보이는 반면에, 1종의 낮은 용해도 프로드럭(프로드럭-M, 대략 3.5mg/mL)이 관찰되었고, 하나의 고 용해도 프로드럭(프로드럭-N, 대략 30㎎/㎖)이 관찰되었다. 도시된 모든 프로드럭은 트레프로스티닐의 최소 형성 및 면적% 순도에서의 약간의 변화에 기초할 때 비히클 내에서 72시간까지는 안정하였다.
실시예 8
목적 및 요약
이 연구의 목적은 인간, 비글 개(Beagle dog), 및 스프라그 다울리 래트(Sprague Dawley rat)의 간 마이크로솜에서의 9종 프로드럭(III, IV, VII, VIII, X, XI, XII, XIII 및 XIV), 뿐만 아니라 시노몰거스 원숭이(Cynomolgus monkey)의 간 마이크로솜에서의 4종 프로드럭(III, IV, VII 및 XIV)의 시험관내 물질대사 안정성을 측정하는 것이다. 또 다른 목표는 시간 경과에 따라 모 화합물(트레프로스티닐)의 방출을 연구하는 것이다.
시험 품목을, NADPH의 존재 및 부재 하에서 간 마이크로솜과 함께 항온처리하였다. 선택된 시점에서, 항온처리 반응물의 분취량을 회수하고, 급랭시키고, 액체 크로마토그래피 직렬 질량분석기(LC-MS/MS)를 사용하여 분석하였다. 프로드럭 및 트레프로스티닐 농도 모두가 측정되었고, 프로드럭의 반감기가 계산되었다.
프로드럭의 반감기는 도 15에 표로 작성되었다. 시험 기간(120분)의 3배가 넘는 반감기는 "> 360"으로 기록하였다.
재료
SigmaFAST™ 프로테아제 억제제 칵테일 정제(시그마-알드리치 P/N: S8830); HPLC Water(피셔); 아세토니트릴, HPLC 등급(피셔); 포름산, 최적의 LCMS 등급(피셔 P/N: A117); 디메틸 설폭사이드(피셔 P/N D159-4); 인간 간 마이크로솜, 혼합 성별, 50 풀(제노텍(XenoTech) P/N: H0610); 개 간 마이크로솜, 비글, 수컷, 8 풀(제노텍 P/N: D1000); 쥐 간 마이크로솜, 스프라그 다울리, 수컷, 500 풀(제노텍 P/N: R1000); 원숭이 간 마이크로솜, 시노몰거스, 수컷, 12 풀(제노텍 P/N: P2000, 로트번호 1110090); 매트릭스 튜브, 1.4ml(피셔 P/N 50823825); 매트릭스 튜브 랙(피셔 P/N 50823921); 매트릭스 튜브용 세프라씰 캡(sepraseal cap)(피셔 P/N NC9995413).
설비
AB SCIEX API 4000™ LC-MS/MS 시스템; 애질런트(Agilent) 1100 바이너리 HPLC 펌프, 모델 G1312A; 저온 스택(stack)을 구비한 Leap HTS PAL 오토샘플러; Ascentis Express® 페닐 헥실 2.7μm 컬럼, 100mm x 3mm(시그마-알드리치 P/N: 53345-U); Ascentis Express® 페닐 헥실 2.7μm 가드 카트리지, 5mm × 3mm(시그마-알드리치 P/N: 53526-U); Ascentis Express® 가드 카트리지 홀더(시그마-알드리치 P/N: 53500-U); 아쿠아실(Aquasil) C18 Dash HTS 컬럼, 5μm, 20 x 2.1mm(써모 P/N: 77505-022150); 벡크만(Beckman) Allegra 25R 원심 분리기(P/N 36934); 레이닌 피펫: 0.2 내지 2㎕, 2 내지 20㎕, 10 내지 100㎕, 20 내지 200㎕, 및 100 내지 1000㎕; 리피터(에펜도르프(Eppendorf)); 레이닌 멀티채널 피펫: 1 내지 20㎕, 20 내지 200㎕, 및 100 내지 1000㎕.
항온처리
프로드럭 III, IV, VII, VIII, X, XI, XII, XIII, 및 XIV의 투여 용액은 20 mM 이염기 칼륨 포스페이트에서 제조되었다. 프로드럭의 농도는 5mM이었다.
간 마이크로솜(제노텍)을 성분(100mM 칼륨 포스페이트(pH 7.4), 5mM 마그네슘 클로라이드(MgCl2), 및 1mM β-니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 2'-포스페이트(NADPH))와 함께 완충액 중 0.5mg/mL의 최종 단백질(효소) 농도로 희석하였다. 마이크로솜 용액을 유리 튜브에 분취하고 37℃에서 약 3분 동안 항온처리하였다. 각 화합물의 분취량을 예열된 마이크로솜 용액에서 50배로 희석하고 혼합하여 반응을 개시시켰다. 항온처리 용액 중 프로드럭의 최종 농도는 100μM이었다.
첫 번째 검정에서, 인간, 비글 개 및 스프라그 다울리 래트의 간 마이크로솜에서 모든 9종 프로드럭(III, IV, VII, IX, X, XI, XII, XIII 및 XIV)을 시험하였다. 두 번째 검정에서, 4종 프로드럭(III, IV, VII 및 XIV)을 시노 원숭이 간 마이크로솜에서 시험하였다.
시험 화합물 이외에, 3종의 품질 관리 화합물(7-에톡시쿠마린, 프로프라놀롤, 및 베라파밀)을 포함시켜, 마이크로솜이 활성 상태임을 확인하였다. 최종 항온처리 용액의 농도는 500nM이었지만, 품질 관리 화합물 스톡 용액은 25% 메탄올 중 25μM으로 제조하였다.
네가티브 대조군도 또한 포함되었다; 이 반응은 NADPH를 제외한 상기 열거된 모든 구성 요소를 포함하였다.
모든 시험은 2쌍씩 수행되었다. 모든 반복 시험은 개별적인 반응 바이알에서 시험하였다.
0, 15, 30, 60 및 120분의 시점은 전술한 +NADPH 조건으로 평가한 반면에, 0 및 120분의 시점은 -NADPH 조건으로 평가하였다. 지정된 시점에서, 각 반응의 100㎕ 분취량을 반응물로부터 회수하고, 깊은 96-웰 플레이트 중 200㎕의 찬 아세토니트릴에 첨가하였다. 이 단계는 LC/MS/MS 분석을 위해 반응을 중지시키고 제제 중 단백질을 침전시켰다. 시간 경과가 완료되면, 플레이트를 밀봉하고, 혼합하고, 4500g 및 4℃에서 15분 동안 원심분리하였다. 생성된 상청액 200㎕를, 분석할 때까지 -80℃의 매트릭스 튜브에서 동결시켰다.
생물분석적 제조 과정
시험 품목
용액 제조. 프로드럭 III, IV, VII, IX, X, XI, XII, XIII 및 XIV, 및 트레프로스티닐의 1차 스톡 용액은 90% DMSO 중에 제조하였다. 9종 프로드럭 스톡 용액을 혼합하고, 9-in-1 표준 섞음 용액(standard spike-in solution) 및 9-in-1 QC 섞음 용액으로 계대 희석하였다. 반면에, 트레프로스티닐 스톡 용액은 트레프로스티닐 표준 섞음 용액 및 QC 섞음 용액으로 계대 희석하였다. 준비 후에, 모든 용액을 4℃에서 보관하였다. 희석 QC(QC-dilu)는 개별 화합물에 대해 시험하여, 화합물이 크로스토크(crosstalk)되지 않음을 보장하였다. 프로드럭 및 트레프로스티닐의 개별적인 1차 스톡 용액이 QC-dilu를 위한 섞음 용액으로 사용되었다.
블랭크(blank) 매트릭스. 블랭크 매트릭스는, 간 마이크로솜 용액(100mM 칼륨 포스페이트 완충액 pH 7.4, 5mMmgCl2, 0.5mg/ml 효소, 1mM NADPH)을 준비한 다음, 5분 동안 끓는 물 욕(bath)에서 열-불활성화시킴으로써, 제조하였다. 미지 샘플은 다른 종들에 대해 개별적으로 분석되었다. 블랭크 매트릭스의 준비에 사용된 간 마이크로솜의 종은 미지 샘플과 동일하였으며, 예컨대, 인간 간 마이크로솜을 사용하여 인체 샘플의 분석을 위한 블랭크 매트릭스를 준비하였다.
블랭크 추출물. 블랭크 추출물은 2 부피의 아세토니트릴 및 1 부피의 블랭크 매트릭스를 혼합함으로써 제조하였다. 이 후, 혼합물을 4000g에서 원심분리하고 상청액을 얻었다.
표준, QC 및 희석되지 않은 미지 샘플. 샘플은 단백질 침전 절차를 이용하여 추출하였다. 표준 또는 QC(QC-dilu 포함) 섞음 용액 5㎕를 깊은 웰 플레이트의 블랭크 매트릭스 95㎕에 섞은 다음, 아세토니트릴 200㎕를 첨가하였다. (실온에서 해동되고 잘 혼합된) 희석되지 않은 미지 샘플을 깊은 웰 플레이트에 첨가한 다음, 아세토니트릴 200㎕를 첨가하였다. 그다음, 표준/QC 및 희석되지 않은 샘플 플레이트를 밀봉하고, 혼합하고, 5500g 및 4℃에서 15분 동안 원심분리하였다. (QC-dilu 제외한) 상청액 100㎕를 내부 표준 작업 용액(ISWS, 물 중 20ng/ml d4-트레프로스티닐) 100㎕와 최종 미량정량판에 혼합하였다.
희석 QC 추가 단계. 단백질 침전 및 원심분리 후에, 상청액 10㎕를 블랭크 추출물(10x 희석) 90㎕가 로딩(loading)된 중간 행(row)에 첨가하고, 피펫으로 혼합한 후에, 희석된 샘플 10㎕를 블랭크 추출물(또다른 10x 희석) 90㎕가 로딩된 최종 미량정량판의 행에 첨가하였다. ISWS 100㎕를 첨가하였다.
희석된 미지 샘플. 미지 샘플 10㎕를 블랭크 추출물(10x 희석) 90㎕가 로딩된 중간 플레이트에 첨가하고, 피펫으로 혼합한 후에, 희석된 샘플 10㎕를 블랭크 추출물(또 다른 10x 희석) 90㎕가 로딩된 최종 미량정량판에 첨가하였다. ISWS 100㎕를 첨가하였다.
이중 블랭크. 블랭크 추출물 100㎕를 물 100㎕와 혼합하였다.
모든 플레이트를 밀봉하고, 혼합하고, 5500g 및 4℃에서 5분 동안 원심분리하고, LC-MS/MS를 준비하였다.
품질 관리 화합물
미지 샘플. 모든 품질 관리 화합물 샘플을 실온에서 해동시키고 잘 혼합하였다. 샘플 60㎕를 물 120㎕ 및 ISWS(메탄올 중 50ng/ml 라베탈롤) 40㎕가 로딩된 미량정량판에 첨가하였다.
이중 블랭크. 블랭크 추출물(시험 품목 수행으로부터의 블랭크 추출물이 사용됨) 60㎕을 물 120㎕ 및 메탄올 40㎕와 혼합하였다. 각 종마다 별도의 이중 블랭크를 제조하였다.
플레이트를 밀봉하고, 혼합하고, 5000g 및 10℃에서 10분 동안 원심 분리하고, LC-MS/MS를 준비하였다
LC-MS/MS
LC-MS/MS 시스템은 Leap HTS PAL 오토샘플러, Agilent 1100 시리즈 액체 크로마토그래피 펌프, 및 3중 4극자 모드로 작동하는 Sciex API4000 질량 분석기로 구성되었다. Acentis Express® 페닐 헥실 컬럼(2.7μm, 100mm x 3mm) 또는 아쿠아실 C18 Dash HTS 컬럼(5μm, 20 x 2.1mm)을, 40℃에서 0.1% 포름산인 이동상 A 및 순수한 아세토니트릴인 이동상 B와 함께 사용하였다.
질량 분석기(MS)는 다중반응탐색법(Multiple Reaction Monitoring(MRM))을 이용하여 네가티브 또는 포지티브의 Turbo IonSpray™ 모드에서 작동되었다. MS 매개 변수는 또한 부록 2에 나타나 있다.
정량화
시험 품목
미지 샘플 중 프로드럭 및 트레프로스티닐을 정량화하기 위해, 모든 미지 샘플은 별도의 배치에서 9-in-1 프로드럭 및 트레프로스티닐의 검량선을 따랐다.
자동 적분 알고리즘을 사용하여 크로마토그래피 피크를 적분하였다. 적분은 모든 표준물질, 품질 관리, 및 실행 중인 샘플에 대해 적분이 일관되게 유지할 수 있도록 필요한 경우에만 조정되었다.
피크 면적 비율을 계산하였다(분석물 피크 면적을 내부 표준물질 피크 면적으로 나눔). 표준 곡선은 피크 면적 비율 대비 공칭 농도의 최소 제곱법 피팅 플롯(plot)을 생성함으로써 작성되었다. 샘플 농도는 최소 제곱법 피팅의 결과로부터 계산되었다. 계산된 샘플 농도가 LLOQ(정량 하한치)보다 낮으면, "BQL"(정량 한계치 미만)이 기록된다.
허용 기준: 역계산된 정확도는 모든 표준물질의 75% 이상에 대해 공칭 농도의 ± 20% 이내이어야 한다. 모든 품질 관리 샘플의 2/3 이상의 정확도는 공칭 농도의 ± 20% 이내이어야 하고, 각 레벨에서의 50% 이상이 상기 기준을 충족해야만 한다. 최종 곡선의 상관 계수는 ≥0.99 이어야만 한다.
1/(x2) 가중된 2차 또는 선형 회귀가 사용되었다. 역계산된 정확도에 대한 허용기준을 충족시키지 않는 보정기준은 제거되었다.
시험 주입은 대표 샘플의 농도를 추정하기 위해 제조되었으며, 희석되거나 희석되지 않은 샘플이 정식 배치에 포함될 것인지 여부를 결정하기 위해 이것이 사용되었다. 희석되지 않은 샘플 또는 희석된 샘플의 계산된 농도는 시험 범위 내에 있어야만 한다; 그렇지 않으면, LLOQ(정량 하한치)보다 낮은 농도의 샘플은 BQL(정량 한계치 미만)으로 기록되는 반면에, ULOQ(정량 상한치)보다 높은 농도의 샘플은 높은 희석 인자로 재시험되었다.
품질 관리 화합물
시간 0에서 피크 면적 비율을 100%로 설정하고 나머지 시점에서의 잔여 백분율을 계산하였다. 잔여 백분율 대 시간의 플롯을 궁극적으로 사용하여, 각 화합물에 대한 t1/2 값을 계산하였다.
동역학적 분석
속도 상수(k): k = - β
여기서, β는 시간에 대한 농도의 쎄미-로그 플롯을 피팅하여 구한 기울기이다. 품질 관리 화합물의 경우, 농도를 사용할 수 없는 경우 잔여 %가 대신 사용된다.
반감기(t1/2):
Figure pct00117
결과
시험 품목
프로드럭의 반감기는 표 9에 작성하였다.
품질 관리 화합물
품질 관리 화합물의 반감기는 표 9에 작성하였다.
Figure pct00118
품질 관리 화합물의 반감기
품질 관리 화합물은 과거 데이터에 필적할 만한 t1/2 값을 갖고, 이는 이 시험에 사용된 마이크로솜이 활성임을 나타냈다.
논의
초기 수용액 안정성 연구에 따르면, 모든 프로드럭은 125mM NaCl를 함유한 20mM 나트륨 포스페이트 이염기 중에서 포화 농도(3 내지 30mg/ml)에서 안정하다. 또한, 방법 개발 연구에서, 가장 불안정한 프로드럭 III, IV, 및 XIV는 200mM 칼륨 포스페이트 완충액(pH 7.4) 중 1μM의 낮은 농도에서 안정한 것으로 관찰되었다. 이는 본 연구에서의 프로드럭의 물질대사가 화학적 또는 수용액 불안정성으로 인한 것이 아니라는 것을 제안한다.
일부 경우에서 반감기가 NADPH가 있든 없든 유사하다는 것이 관찰되었다. 이는 일부 NADPH-독립 효소, 예컨대, 에스테라제 및 아미다제가 주로 프로드럭의 물질대사를 담당할 수 있음을 나타낸다. 다른 경우에, NADPH가 있을 때의 반감기가 NADPH가 없을 때의 반감기보다 훨씬 짧은 경우, 반응은 사이토크롬 P450 효소에 의해 매개될 (또는 부분적으로 매개될) 가능성이 높다.
결론
프로드럭의 안정성은 종-의존적이며, IV, III 및 XIV는 모든 종에 걸쳐 가장 안정성이 떨어진다.
실시예 9
래트 발바닥 내 주사 모델에서의 트레프로스티닐 프로드럭의 평가
1. 요약:
합성 프로스타사이클린 유사체인 트레프로스티닐은 Remodulin의 활성 약학 성분이다. 트레프로스티닐의 피하 투여는 주사 부위의 통증과 관련되며 본 연구의 목적은 래트의 발 통증 모델에서 통증 반응(pain response)을 평가하기 위해서 트레프로스티닐의 대체 프로드럭을 평가하는 것이었다.
수컷 스프라그 다울리 래트(n = 112)를 그룹 당 8 마리 동물로 구성된 14 개 그룹으로 나누었다. 이 연구는 2 사이클로, 연속적인 날에 사이클 당 7개의 그룹으로 실시되었다. 각 사이클은 식염수 그룹, 대조군으로서 작용하는 PBS 그룹, 및 100㎍/mL 또는 1㎍/mL의 투여량의 트레프로스티닐로 구성된다. 또한, 시험 품목들인, 모두 PBS 중에 제형화된 트레프로스티닐 고리 카바메이트(프로드럭 Ⅰ), 트레프로스티닐 측쇄 카바메이트(프로드럭 II), 트레프로스티닐 아미드(프로드럭 VII) 및 트레프로스티닐 메틸 에테르(프로드럭 Ⅷ)를 2종의 투여량(100㎍/mL 또는 1㎍/mL, 사이클 당 1 회 투여)으로 시험하였다.
시간 0에 발 패드(발바닥 내 주사)에 피하 주사함으로써 0.1mL의 시험 물질을 동물에게 투여하였다. 동물은 주사 후 15분 및 90분에, 기계적 자극(본 프라이 필라멘트(von Frey filament)) 및 열적 자극에 대한 응답에 대해 후속적으로 평가되었다. 본 프라이 시험은 열 시험 이전에 수행되었으며, 각 동물의 경우에 수 분 내에 즉시 시험을 받았다. 또한, 주사에 대한 동물의 반응의 임상 관찰 점수화가 수행되었다. 도 16은 연구 설계를 개략적으로 보여준다.
1.1 본 프라이 시험을 사용함에 의한 기계적 통증 민감도의 측정(도 17 및 18):
기계적 통증 민감도는 동물의 회피 힘(withdrawal force) 임계값을 측정하는 본 프라이 시험을 사용한다. 적용되는 힘이 적을수록 자극에 대한 보다 큰 민감도를 나타낸다. 본 프라이 시험은 시험 품목 주사 후 15분 및 90분 후에 수행되었다.
1㎍/mL 또는 100㎍/mL의 투여량의 트레프로스티닐로 처치된 동물은 주사 후 15분 및 90분에 감소된 회피 힘 임계값(보다 높은 민감도)을 나타냈다. 이 증가된 민감도는 PBS-처치 그룹보다 통계적으로 유의하게 더 컸다(p<0.05).
트레프로스티닐 측쇄 카바메이트(프로드럭 II) 또는 트레프로스티닐 메틸 에테르(프로드럭 VIII)로 처치된 동물은, 둘 다의 투여량에서, 주사 후 두 시점 모두에서 PBS-처치 그룹에 비해 통계적으로 유의한 차이를 나타내지 않았다.
1㎍/mL의 투여량의 트레프로스티닐 고리 카바메이트(프로드럭 I)로 처치된 동물은 주사 후 두 시점에서 PBS-처치 그룹에 비해 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았다. 100㎍/mL의 트레프로스티닐 고리 카바메이트(프로드럭 I)로 처치된 동물은, 주사 후 15분에서 PBS-처치 그룹에 비해 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았다. 그러나, 주사 후 90분에서 PBS-처치 그룹에 비해 통계적으로 유의한 증가된 민감도가 관찰되었다.
1㎍/mL의 투여량의 트레프로스티닐 아미드(프로드럭 VII)로 처치된 동물은 주사 후 두 시점에서 PBS-처치 그룹에 비해 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았다. 100㎍/mL 투여량의 트레프로스티닐 아미드(프로드럭 VII)로 처치된 동물은 주사 후 두 시점에서 PBS-처치 그룹에 비해 통계적으로 유의하게 민감도가 증가되었다.
1.2 열 통증(thermal pain) 민감도의 측정(도 19 및 도 20):
열 통증 자극에 대한 동물의 민감도를 본 프라이 시험 이후에 즉각적으로 평가하였다. 우측 주사맞은 다리가 열원으로부터 빠져 나갈 때까지의 시간을 측정하였고, 반응 시간이 짧을 수록(빠를 수록) 자극에 대한 민감도가 더 높음을 나타낸다. 시험은 시험 품목 주사 후 15분 및 90분 후에 수행되었다.
1㎍/mL 또는 100㎍/mL의 투여량의 트레프로스티닐로 처치된 동물은, 투여 후 15분에서 PBS-처치 그룹에 비해 통계적으로 유의하게 보다 빠른 회피 시간(증가된 민감도)을 가졌다(p <0.05).
투여량 둘 다의 모든 전구 약물로 처치된 동물은 PBS 그룹에 비해 열 자극에 대한 응답에서 통계적으로 유의한 어떠한 차이도 나타내지 않았다. 그러나, 100㎍/mL의 투여량의 프로드럭 트레프로스티닐 아미드(프로드럭 VII) 또는 둘 다의 투여량의 프로드럭 트레프로스티닐 메틸 에테르(프로드럭 VIII)로 처치된 동물은, 어떠한 통계적 유의성도 없지만 둘 다의 시점에서의 PBS 그룹에 비해 반응 시간의 감소 경향을 보였다.
1.3 임상 관찰 점수(도 21 및 22):
적색, 부종 및 발 배치를 평가함으로써 임상 관찰 점수를 매겼다.
1㎍/mL 또는 100㎍/mL의 투여량의 트레프로스티닐로 처치하면, PBS 처치 그룹에 비해 주사 후 15분 및 90분에서 임상 점수가 통계적으로 유의하게 증가하였다(p <0.05).
모든 프로드럭을 1㎍/mL의 투여량으로 처치하면, 두 시점 모두에서 PBS 그룹과 유사한 어떠한 임상 점수도 나타내지 않았다. 100㎍/mL의 투여량에서, 프로드럭인 트레프로스티닐 측쇄 카바메이트(프로드럭 II) 또는 트레프로스티닐 메틸 에테르(프로드럭 Ⅷ)로 처치된 동물은 두 시점 모두에서 PBS 그룹과 통계적으로 유의한 차이가 없었다. 100㎍/mL의 투여량의 프로드럭 트레프로스티닐 고리 카바메이트(프로드럭 Ⅰ)로 처치된 동물은 주사 후 90분에 PBS 그룹에 비해 임상 점수에서 통계적으로 유의한 증가를 보였다. 100㎍/mL의 투여량의 프로드럭 트레프로스티닐 아미드(프로드럭 VII)로 처치된 동물은, 주사 후 두 시점 모두에서 PBS 그룹에 비해 임상 점수 측면에서 통계적으로 유의한 증가를 보였다.
2. 결론:
이 연구의 조건에서 얻어지고 생전(in-life) 데이터에 국한된 발견을 보면, 트레프로스티닐의 대체 프로드럭의 투여는, 개별적인 프로드럭들 사이에서 및 상이한 시험들 사이에서 일부 차이가 확인되었지만, 유사한 투여량의 트레프로스티닐에 비해 감소된 통증 반응을 나타냈다.
예를 들어, 트레프로스티닐 측쇄 카바메이트(프로드럭 II) 또는 트레프로스티닐 메틸 에테르(프로드럭 VIII)는, 둘 다의 투여량 및 둘 다의 시점에서, 유사한 투여량의 트레프로스티닐에 비해 기계적 자극에 대한 통계적으로 유의하게 감소된 민감도 및 감소된 임상 점수와 일반적으로 관련되었다.
반면, 프로드럭 트레프로스티닐 고리 카바메이트(프로드럭 I) 및 트레프로티닐 아미드(프로드럭 VII)는, 유사한 투여량의 트레프로스티닐에 비해, 1㎍/mL 투여량에서만 주사 후 두 시점 모두에서, 기계적 자극에 대한 동물의 감소된 민감도 및 감소된 임상 점수와 일반적으로 연관되었다.
또한, 모든 프로드럭은 유사한 투여량의 트레프로스티닐에 비해 둘 다의 투여량에서 및 둘 다의 시점에서 열 자극에 대한 감소된 민감도를 보였다.
실시예 10
래트 발바닥 주사 모델에서의 트레프로스티닐 프로드럭의 평가
1. 요약:
합성 프로스타사이클린 유사체인 트레프로스티닐은 Remodulin의 활성 약학 성분이다. 트레프로스티닐의 피하 투여는 주사 부위 통증과 관련되며 본 연구의 목적은 래트의 발 통증 모델에서 통증 반응을 평가하기 위해 트레프로스티닐의 대체 프로드럭을 평가하는 것이었다.
수컷 스프라그 다울리 래트(n = 56)를 1 그룹 당 8 마리의 동물로 구성된 7개의 그룹으로 나누었다. 동물들은 트레프로스티닐을 100㎍/mL 또는 1㎍/mL의 투여량으로 처치하거나, 시험 품목인 프로드럭 VII 및 프로드럭 XV를 둘 다의 투여량으로 처치하였다. 각 그룹은 대조군(그룹 1)으로 작용하는, 포스페이트 완충제(50mM 염화나트륨을 포함하는 50mM 포스페이트 완충제, pH = 7.4) 처치 그룹과 비교되었다.
0 시간에 발 패드(발바닥 내 주사)에 피하 주사함으로써 0.1mL의 시험 물질을 동물에게 투여하였다. 그 다음, 동물은 주사 후 15분 및 90분에 기계적 자극(본 프라이 필라멘트) 및 열 자극에 대한 응답에 대해 후속적으로 평가하였다. 본 프라이 시험은 열 시험 이전에 수행되었으며, 각 동물의 경우 수 분 내에 즉시 시험을 받았다. 또한, 주사에 대한 동물 반응의 임상 관찰 점수화가 수행되었다. 도 23은 연구 설계를 개략적으로 보여준다.
1.1 본 프라이 시험을 사용함에 의한 기계적 통증 민감도의 측정(도 24):
기계적 통증 민감도는 동물의 회피 힘 임계값을 측정하는 본 프라이 시험을 사용하여 시험되었다. 적용되는 힘이 작을수록 자극에 대한 보다 큰 민감도를 나타낸다. 본 프라이 시험은 시험 품목 주사 후 15분 및 90분 후에 수행되었다.
1㎍/mL 또는 100㎍/mL의 투여량의 트레프로스티닐로 처치된 동물은 주사 후 15분 및 90분에 감소된 회피 힘 임계값(보다 큰 민감도)을 나타냈다. 이 증가된 민감도는 포스페이트 완충제 그룹보다 통계적으로 유의하게 보다 컸다(각각 p<0.001 및 p<0.0001).
1㎍/mL 또는 100㎍/mL의 투여량의 프로드럭 VII 또는 프로드럭 XV로 처치된 동물은 또한 주사 후 15분 및 90분에 감소된 회피 힘 임계값(보다 큰 민감도)를 나타냈다. 이 증가된 민감도는 포스페이트 완충제 그룹보다 통계적으로 유의하게 보다 컸다(p <0.001 또는 p <0.0001). 트레프로스티닐 처치 그룹에 비해, 시험 품목 처치 그룹에서 회피 힘 역치값의 어떠한 차이도 발견되지 않았다.
1.2 열 통증 민감도의 측정(도 25):
열 통증 자극에 대한 동물의 민감도를 본 프라이 시험 이후에 즉각적으로 평가하였다. 우측 주사맞은 다리가 열원으로부터 빠져 나갈 때까지의 시간을 측정하였고, 반응 시간이 짧을 수록(빠를 수록) 자극에 대한 민감도가 더 높음을 나타낸다. 시험은 시험 품목 주사 후 15분 및 90분 후에 수행되었다.
1㎍/mL 또는 100㎍/mL의 투여량의 트레프로스티닐로 처치된 동물은, 투여 후 15분에서 포스페이트 완충제-처치 그룹에 비해 통계적으로 유의하게 보다 빠른 회피 시간(증가된 민감도)을 가졌다(p <0.0001). 시험 품목 주사 후 90분에, 보다 높은 투여량의 트레프로스티닐(100㎍/mL)로 처치된 동물(그룹 2)만이, 비히클(포스페이트 완충제) 그룹에 비해, 열 자극에 대한 민감도가 통계적으로 유의하게 증가했음을 보여주었다.
100㎍/mL의 투여량의 프로드럭 VII로 처치된 동물 또는 투여량(1㎍/mL 또는 100㎍/mL)의 프로드럭 XV로 처치된 동물은, 투여 후 15분에 포스페이트 완충제 처치 그룹에 비해 통계적으로 유의하게 보다 빠른 회피 시간(증가된 민감도)을 가졌다(p <0.01 또는 p <0.001 또는 p <0.0001).
흥미롭게, 1㎍/mL의 투여량의 프로드럭 VII로 처치된 동물(그룹 5)은 15분 투여 후에 기준선에 유사한 반응 시간을 가졌다.
1.3 임상 관찰 점수(도 26):
적색, 부종 및 발 배치를 평가함으로써 임상 관찰 점수를 매겼다.
1㎍/mL 투여량의 프로드럭 VII로 처치된 그룹 5에서의 동물들을 제외하고는, 모든 처치된 동물은, 포스페이트 완충제 처치 그룹에 비해, 주사 후 15분에서, 임상 점수 측면에서 통계적으로 유의한 증가를 나타냈다. 90분의 시점에서, 단지 둘 다의 투여량의 트레프로스티닐로 처치된 동물 및 보다 높은 투여량(100㎍/mL)의 둘 다의 시험 품목으로 처치된 처치된 동물이 동일한 효과를 나타냈다(p<0.0001).
2. 결론:
이 연구의 조건에서 얻어지고 생전 데이터에 국한된 결과를 보면, 트레프로스티닐의 대체 프로드럭의 투여는 유사한 투여량의 트레프로스티닐에 비해, 통증 반응 감소 측면에서 유의한 효과를 나타내지 않았다. 그러나, 1μg/mL의 투여량의 시험 품목 프로드럭 VII로 처치하면, 투여 후 둘 다의 시점에서, 온도 자극에 대한 민감도 감소 및 임상 점수의 보다 낮은 값을 유발하였다.
실시예 11
래트 발바닥 내 주사 모델에서의 트레프로스티닐 프로드럭의 평가
연구 설계는 도 16에 개략적으로 도시한다. 도 27 및 도 28은 각각 사이클 1 및 2의 본 프라이 응답 시험의 결과를 보여준다. 도 29 및 30은 각각 사이클 1 및 2의 열적 반응 시험의 결과를 보여준다. 도 31 및 32는 각각 사이클 1 및 2의 평균 임상 점수를 보여준다.
실시예 12
프로드럭 VII 및 트레프로스티닐: 스프라그 다울리 래트로의 피하 주사 이후의 심혈관 평가
1. 목적
이 연구의 목적은, 전파 원격 측정 송신기(radiotelemetry transmitter)가 장착된, 의식있는(conscious) Crl:CD(SD) 래트에 피하 주사한 후 심박수, 혈압(수축기, 이완기 및 평균) 및 체온에 대한 프로드럭 VII 또는 트레프로스티닐(프로스타사이클린 유사체)의 잠재적 급성 영향을 평가하는 것이었다.
2. 방법론
비히클(포스페이트 완충된 식염수[PBS] 1X) 중 트레프로스티닐 또는 비히클(125 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM 포스페이트 완충제) 중 프로드럭 VII는, 투여량 단계적-증가 설계(dose escalation design)(상향/하향 절차)에 따라 4마리의 숫컷 스프라그 다울리 래트/그룹 중 9개의 그룹(그룹 1 내지 0)에 단일 투여량을 피하 주사하였다. 연구 설계는 하기 표 10에 도시한다.
Figure pct00119
a = 체중으로부터 계산된 투여량.
b = 동일한 4 마리 동물들은 약 3일 동안 투여 사이에 처치를 각각 받았다.
c = 동일한 4 마리 동물들은 약 3일 동안 투여 사이에 처치를 각각 받았다.
d = 그룹 4 투약 섹션 동안 숫컷 번호 1172의 탐침 실패로 인하여, 스톡 콜로니로부터 추가 동물을 선택하고 이 투여량 수준에서 평가하였다.
e = 3마리 동물들이 그룹 4에서 성공적으로 평가되었고 스톡 콜로니로부터의 추가 동물들은 이러한 투여량 수준에서 평가하였다.
트레프로스티닐 또는 프로드럭 VII의 투약 전 적어도 2시간 동안, 및 투약 후 적어도 24 시간 동안 연속적으로 심장 박동, 동맥압(수축기, 이완기 및 평균 동맥압), 맥압 및 체온을 수집하였다. 임상 관찰은 투약 6 시간 전, 투약 완료시 및 투약 후 약 4 시간에 수행되었다.
3. 결과
3.1. 임상 관찰
0.1mg/kg과 0.3mg/kg 트레프로스티닐의 투여 후에, 투약 후 약 4 시간에 상기된(flushed) 사지의 임상 관찰이 몇몇의 동물에서 나타났다. 상기된 신체 및/또는 사지, 입모, 저활동성, 붉어진 앞다리 및/또는 뒷다리, 비뇨생식기 구역 및 복부 동맥 상의 습윤성 황색 물질, 및 코 주위의 건조된 적색 물질의 임상 관찰이 3, 10, 또는 30mg/kg 프로드럭 VII의 투여 후 약 4시간에서 일부 동물에게 나타났다.
3.2. 혈역학적 데이터
3.2.1. 심박수(도면 33)
트레프로스티닐과 프로드럭 Ⅶ의 투여 후에 보다 높은 심장 박동이 관찰되었다.
트레프로스티닐 그룹(0.030mg/kg 이상)의 경우에는 변화의 크기가 일반적으로 유사하였지만, 투여량의 증가에 따라 변화의 기간이 길어졌다. 심박수 변화는 투약 후 약 5 시간에서야 해결된 것으로 간주되었다.
1 및 3mg/kg 프로드럭 VII 투여 후 유사한 크기의 보다 높은 심박수가 관찰되었고; 10 및 30mg/kg 프로드럭 VII의 경우에는, 각각 10 및 30mg/kg에서 약간 보다 높은 심박수가 관찰되었다. 심박수의 변화는 트레프로스티닐 그룹에 비해 오래 지속되었으며, 투약 후 약 19 내지 20 시간에서 관찰된 모든 그룹에서 (투약 전 기준선에 비해) 회복되었다.
트레프로스티닐 또는 프로드럭 VII의 투여 후의 심박수 증가는 전신 혈압 감소에 대한 반응에서의 일시적 증가인 것으로 고려되었다.
3.2.2. 수축기 혈압(도 34)
0.03mg/kg의 트레프로스티닐 투여 후 미미하게 보다 낮은 수축기 혈압이 관찰되었지만, 0.030mg/kg 이하의 트레프로스티닐 투여 후에는 수축기 혈압에서의 어떠한 의미있는 변화도 관찰되지 않았다. 유의하게 낮은 수축기 혈압은 0.1mg/kg 및 30mg/kg의 트레프로스티닐의 투여 후 10분 시점에서 관찰되었고, 투약 후 30분 및 20분에서 최하부(nadir)였고, 투약 후 90분 및 120분까지 지속되었다.
0.1mg/kg 프로드럭 Ⅶ의 투여 후 수축기 혈압에서의 어떠한 의미있는 변화도 관찰되지 않았다. 3mg/kg 프로드럭 Ⅶ의 투여 후, 미미하게 보다 낮은 수축기 혈압이 나타났고, 50 분에서 최하부였다. 10 및 30 ㎎/㎏의 투여 후 20 분 시점에서 유의하게 낮은 수축기 혈압이 관찰되었고, 40 분에서 최하부였고, 약 4 시간 및 6 시간 동안 각각 저혈압이 지속되었다.
3.2.3. 이완기 혈압(도 35)
이완기 혈압의 변화는 주로 수축기 혈압의 변화를 반영한다.
0.03mg/kg의 트레프로스티닐 투여 후 미미하게 보다 낮은 이완기 혈압이 관찰되었지만, 0.030mg/kg 이하의 트레프로스티닐 투여 후에는 이완기 혈압의 어떠한 의미있는 변화도 관찰되지 않았다. 유의하게 낮은 이완기 혈압은 0.1mg/kg과 0.3mg/kg의 트레프로스티닐의 투여 후 10분 시점에서 관찰되었고, 30분 및 20분에서 최하부였고, 투약 후, 각각 90분 및 180 분까지 지속되었다.
0.1mg/kg 프로드럭 Ⅶ의 투여 후, 이완기 혈압에서의 어떠한 의미있는 변화도 관찰되지 않았다. 3mg/kg 프로드럭 Ⅶ의 투여 후, 미미하게 보다 낮은 이완기 혈압이 관찰되었고, 50 분에서 최하부였고, 80 분 동안 지속되었다. 10 및 30 ㎎/㎏의 투여 후 20 분 시점에서 유의하게 보다 낮은 이완기 혈압이 관찰되었고, 40 분에서 최하부였고, 약 4 시간 및 7 내지 8 시간 동안 각각 저혈압이 지속되었다.
3.2.4. 평균 동맥압(도 36)
평균 동맥압에서의 관찰된 경향은, 수축기 혈압과 이완기 혈압의 관찰된 변화의 크기 및 지속성을 반영하였다. 도 36은 프로드럭 VII의 경우에 효능의 약 100배 감소, 및 초기 및 최대 혈관 확장 효과에 대한 10-20 분의 지연을 도시하며, 이는 트레프로스티닐로의 프로드럭 VII의 전환이 이들의 혈관 확장성을 지배한다는 점을 제안할 수 있다. 또한, 약 2-6 시간에 걸쳐 프로드럭 VII의 지속적인 혈관 수축 반응(트레프로스티닐의 1-2시간와 비교함)은 트레프로스티닐의 약동학적 농도로의 지속적인 전환을 제안한다.
0.03mg/kg의 트레프로스티닐 투여 후 미미하게 보다 낮은 평균 혈압이 관찰되었고, 30분에 최하부였지만, 0.030mg/kg 이하의 트레프로스티닐 투여 후에는 평균 혈압의 어떠한 의미있는 변화도 관찰되지 않았다. 유의하게 보다 낮은 평균 혈압은 0.1mg/kg 및 30mg/kg의 트레프로스티닐의 투여 후 10분 시점에서 관찰되었고, 투약 후 30분 및 20분에서 최하부였고, 투약 후 90분 및 180분 분까지 지속되었다.
0.1mg/kg 프로드럭 Ⅶ의 투여 후 평균 혈압에서의 어떠한 의미있는 변화도 관찰되지 않았다. 3mg/kg 프로드럭 Ⅶ의 투여 후, 미미하게 보다 낮은 평균 혈압이 관찰되었고, 50 분에서 최하부였다. 10 및 30 ㎎/㎏의 투여 후 유의하게 낮은 평균 혈압이 나타났고, 40 분에서 최하부였고, 약 4 시간 및 7 내지 8 시간 동안 각각 저혈압이 지속되었다.
3.2.5. 맥압(도 37)
맥압의 변화는 가변적이고 반응의 일관된 방향과 크기가 부족하였으며 추가로 투여량 반응 관계가 부족하였다.
0.3mg/kg의 트레프로스티닐의 투여 후에 20 내지 40 분 사이에 미미하게 보다 낮은 맥압이 관찰되었다. 조사된 어떠한 다른 투여량 수준에서 트레프로스티닐 투여 후 관찰된 어떠한 다른 일관된 경향도 없었다.
10mg/kg의 프로드럭 VII의 투여 후에 미미하게 보다 높은 맥압이 나타났다. 어떠한 다른 투여량의 프로드럭 VII 이후에 어떠한 다른 일관된 경향도 관찰되지 않았다.
맥압은 수축기 및 이완기 혈압의 함수입니다. 수축기와 이완기의 변화의 크기와 방향이 유사하기 때문에, 전체적인 순 변화(수축기와 이완기 사이의 차이)는 크게 변하지 않았다.
3.2.6. 체온(도 38)
0.000125mg/kg 또는 0.00125mg/kg 트레프로스티닐의 투여 후에 체온에서의 어떠한 유의한 변화도 관찰되지 않았다. 0.1mg/kg 트레프로스티닐 이후에 미미하게 보다 낮은 체온이 관찰되었다. 이러한 변화는 투여 후 약 3시간 동안 지속되었다. 0.1 및 0.3mg/kg 트레프로스티닐의 투여 후 유의한 낮아진 체온이 관찰되었다. 이러한 변화는 투여 후 각각 약 3 및 4시간에 해소된 것으로 고려되었다.
1mg/kg 프로드럭 VII의 투여 후, 체온의 어떠한 유의한 변화도 관찰되지 않았다. 3, 10, 및 30mg/kg의 투여 후 유의하게 보다 낮은 체온이 관찰되었다. 저체온의 반응은, 각각 3 및 10mg/kg의 투여 후 4시간 및 11 내지 12시간에 걸쳐서 지속되었다. 체온은 30mg/kg 프로드럭 VII의 투여 후 24 시간 이내에 회복되지 않았다.
체온의 변화는 혈압의 변화에 대해 부수적인 것이었다. 체온의 감소는 혈관 확장과 직접 관련이 있었다.
4. 결론
트레프로스티닐의 투여는, 보다 높은 심박수(모든 투여량), 유의적으로 보다 낮은 수축기, 이완기, 평균 동맥압(0.1mg/kg 이상) 및 체온(0.030mg/kg 이상)을 유발하였다. 프로드럭 VII의 투여로 보다 높은 심박수(모든 투여량), 및 유의적으로 보다 낮은 수축기, 이완기, 평균 동맥압 및 체온(3mg/kg 이상)이 유발되었다.
실시예 13
트레프로스티닐의 디메틸 에테르(프로드럭 IX)의 합성:
논의:
트레프로스티닐(1)의 디메틸 에테르의 합성은 실온에서 THF 중 메틸 요오다이드 및 NaH를 사용함에 의한 O-메틸화에 의해 달성되었다. 상기 방법은 프로드럭 IX를 수득하기 위해 연구된 다른 반응 조건에 비해 짧은 반응 시간 및 간단한 후처리를 동반하였다.
Figure pct00120
실험 절차:
50-ml들이의 둥근 바닥 플라스크를 나트륨 하이드라이드(0.61g, 15.36mmol, 광유 중 60%)로 채우고 이것을 헥산(2 x 20mL)으로 세척하여 광유를 제거하였다. 이 고형 NaH에, 수성 THF(10mL)를 첨가하고 아르곤 하에서 주위 온도에서 교반하였다. 이 현탁액에, THF(5.0mL) 중 트레프로스티닐(1)(0.5g, 1.26mmol)을 적가하고, 그다음 메틸 요오다이드(3.0mL)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 5시간 동안 교반하고, 반응의 진행을 TLC(DCM/메탄올, 9:1)로 모니터링하였다. 반응을 NH4Cl 수용액(1.0mL)으로 급랭시키고, 물(10.0mL)로 희석하였다. 2N HCl를 사용하여 pH를 1 내지 2로 조절하였다. 유기층을 분리하고 수성 층을 EtOAc(3 x 20mL)로 추출하였다. 추출액을 모아 Na2SO4 상에 건조시켰다. 용매를 진공 하에서 제거하여 조질의 생성물을 수득하였다. 조질의 생성물은 구배 용매(DCM 중 0-10% 메탄올)를 사용하여 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 생성물인 트레프로스티닐의 디메틸 에테르(프로드럭 IX)(230mg)을 수득하였다.
실시예 14
트레프로스티닐 모노메틸 카바메이트(프로드럭 VIII)의 합성:
트레프로스티닐 모노메틸 카바메이트(프로드럭 VIII)(5)는 모노-TES 트레프로스티닐 벤질 에스테르(1)로부터 합성되었다. 모노-TES 트레프로스티닐 벤질 에스테르(1)를 p-니트로페닐 클로로포르메이트로 처리하여 p-니트로페닐의 카보네이트(2)를 생성하였다. 상기 카보네이트(2)를, 단리시키지 않은 채, 테트라하이드로푸란 중 메틸아민으로 처리하여, 양호한 수율로 TES 트레프로스티닐 벤질 모노메틸 카바메이트(3)를 수득하였다. 수성 테트라하이드로푸란 중 염화수소산에 의한 화합물(3)의 탈실릴화는 트레프로스티닐 벤질 에스테르 모노메틸 카바메이트(4)를 제공하였다. 수소 대기 하에서 탄소상 팔라듐으로 순수한 카바메이트(4)를 탈벤질화함으로써, 트레프로스티닐 모노메틸 카바메이트를 제공하였다.
트레프로스티닐 모노메틸 카바메이트(프로드럭 VIII)(5)의 합성:
Figure pct00121
실험:
TES-트레프로스티닐 벤질 에스테르 모노메틸 카바메이트(3)의 합성:
Figure pct00122
무수 테트라하이드로푸란(12mL) 중 모노-TES-트레프로스티닐 벤질 에스테르 (1)(1.11g, 1.87mmol)의 용액에, 아르곤 하에서 실온에서 피리딘(0.44g, 0.45mL, 5.56mmol)을 첨가하였다. 투명한 용액을 0℃(얼음/물 욕)으로 냉각하고 그다음 아르곤 하에서 5℃ 미만의 온도로 유지하면서 5분 동안 무수 테트라하이드로푸란(4mL) 중 4-니트로페닐 클로로포르메이트(0.56g, 2.78mmol)의 용액을 적가하였다. 완전히 첨가한 후, 반응 혼합물(백색 혼탁물)을 0℃ 내지 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 2시간 이후에, 반응 혼합물을 tlc(EtOAc/헥산, 1:4)에 의해 확인하고 반응을 종료하였다. 반응 혼합물을 0℃로 냉각하고, 그다음 3분 동안 테트라하이드로푸란(2.0 M)(3.8mL, 7.60mmol) 중 메틸아민의 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 1시간 동안 0℃에서 교반하고 tlc(EtOAc/헥산, 1:4)를 확인하였다. 반응이 완료되었다. 혼합물을 여과하고 황색 고형물을 MTBE(2 x 20mL)로 세척하였다. 여액을 진공 하에서 농축시켜 연황색 점성의 액체(1.70g)를 수득하였다. 5-15% EtOAc/헥산을 사용하는 실리카 겔(31g) 컬럼 상에서의 조질 생성물의 크로마토그래피는 순수한 TES-트레프로스티닐 벤질 에스테르 모노메틸 카바메이트(3)(1.17g)를 제공하였다.
트레프로스티닐 벤질 에스테르 모노메틸 카바메이트(4)의 합성
Figure pct00123
테트라하이드로푸란(20mL) 및 물(4mL)의 혼합물 중 TES-트레프로스티닐 벤질 에스테르 모노메틸 카바메이트(3)(1.10g, 1.69mmol)의 용액에, 아르곤 하 및 실온에서 염화수소산 용액(2 N)(0.85mL, 1.70mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 2시간 동안 실온에서 교반하였고 tlc(EtOAc/헥산, 1:1)로 확인하였다. 반응이 완료되었다. 반응 혼합물을 트리에틸아민(0.25mL)에 의해 중화하고, 그다음 모든 유기 휘발성 물질을 증류 제거하고, 잔류물을 EtOAc(25mL)에 용해시키고, 물(2 x 20mL), 식염수(1 x 10mL)로 세척하고, 건조시키고(Na2SO4), 여과하고, 진공 하에서 농축시켜 투명한 점성 액체(1.07g)를 수득하였다. 조질의 생성물을, 5-70% EtOAc/헥산을 사용하여 실리카 겔(30g)에서 크로마토그래피하여 순수한 트레프로스티닐 벤질 에스테르 모노메틸 카바메이트(4)를 무색 점성 액체(0.90g)로서 수득하였다.
트레프로스티닐 모노메틸 카바메이트(5)의 합성
Figure pct00124
에틸 아세테이트(13mL) 중 트레프로스티닐 벤질 에스테르 모노메틸 카바메이트(4)(0.84g, 1.56mmol)의 용액에 탄소 상 팔라듐(5중량%, 50% 물)(0.15g)을 첨가하였다. 혼합물을 교반하고 하우스 진공(house vacuum) 하에서 배기시키고(evacuate) 수소(풍선에 충전된 상태)로 대체하였다. 공정을 3회 반복하였다. 혼합물을 16시간 동안 수소의 대기 하에서 실온에서 교반하고 tlc(EtOAc/헥산, 1:1)를 확인하였다. 반응이 완료되었다. 반응 혼합물을 일회용 폴리에틸렌 필터 깔때기 내 셀라이트 패드(1.0g)를 통해 여과하고, 고형물을 에틸 아세테이트(3 x 10mL)로 세척하였다. 여액을 진공 하에서 30℃(수욕 온도)에서 농축시켜 트레프로스티닐 모노메틸 카바메이트(프로드럭 VIII)(5)를 회백색 발포성 고형물(0.71g)로서 수득하였다.
실시예 15
트레프로스티닐 아미노산 아미드 프로드럭의 합성:
논의:
트레프로스티닐을 커플링제를 사용하여 다양한 아미노산에 의한 아미드화에 적용하여 하기 반응식에서 도시한 바와 같이 프로드럭으로서 트레프로스티닐을 형성하였다.
트레프로스티닐 알라닌 아미드(프로드럭 X)의 합성:
Figure pct00125
단계 1:
디클로로메탄(30mL) 중 트레프로스티닐(1)(1.0g, 2.561mmol) 및 L-알라닌 벤질 에스테르 p-톨루엔설폰산 염(0.9g, 2.561mmol)의 현탁액에 트리에틸아민(0.89mL, 6.401mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물에, 1-에틸-3-(3'-디메틸아미노프로필)카보디이미드 하이드로클로라이드(EDCI)(0.59g, 3.073mmol) 및 1-하이드록시벤조트리아졸 수화물(0.42g, 3.073mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 2.5 시간 동안 아르곤 하에서 주위 온도에서 교반하였다. TLC(용리액: 에틸 아세테이트)에 기초하여, 반응이 완료된 것으로 밝혀졌다. 반응 혼합물을 물(30mL)로 급랭시키고 유기층을 분리하고, 나트륨 설페이트 상에서 건조시키고, 진공 하에서 증발시켜 조질의 생성물을 수득하였다. 조질의 생성물은 헥산 중 0-70% 에틸 아세테이트를 사용하여 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 정제하여 순수한 트레프로스티닐 알라닌 아미드 벤질 에스테르(2)(1.34g, 97.8% 수율)를 수득하였다.
단계 2:
에틸 아세테이트 중 트레프로스티닐 알라닌 아미드 벤질 에스테르(2)(1.3g)의 용액에 탄소 상 5% 팔라듐(50% w/w 물)(130mg)을 첨가하였다. 이것을, 진공을 사용하여 3회 배기하고, 수소 가스로 대체하고, 수소 대기 하에서 1.5 시간 동안 교반하였다. TLC(용리액: 에틸 아세테이트)에 기초하여, 반응이 완료된 것으로 밝혀졌다. 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하여 탄소 상 팔라듐을 제거하였다. 여액을 진공 하에서 증발시켜 트레프로스티닐 알라닌 아미드 프로드럭(프로드럭 X)(1.03g, 91.7% 수율)을 수득하였다.
트레프로스티닐 발린 아미드(프로드럭 XI)의 합성:
Figure pct00126
단계 1:
디클로로메탄(30mL) 중 트레프로스티닐(1)(1.0g, 2.561mmol) 및 L-발린 벤질 에스테르 p-톨루엔설폰산 염(0.97g, 2.561mmol)의 현탁액에 트리에틸아민(0.89mL, 6.401mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물에, 1-에틸-3-(3'-디메틸아미노프로필)카보디이미드 하이드로클로라이드(EDCI)(0.59g, 3.073mmol) 및 1-하이드록시벤조트리아졸 수화물(0.42g, 3.073mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을, 2시간 동안 아르곤 하에서 주위 온도에서 교반하였다. TLC(용리액: 에틸 아세테이트)에 기초하여, 반응이 완료된 것으로 밝혀졌다. 반응 혼합물을 물(30mL)로 급랭시키고 15분 동안 교반하였다. 유기 층을 분리하고, 나트륨 설페이트 상에서 건조시키고, 진공 하에서 증발시켜 조질의 생성물을 수득하였다. 조질의 생성물을, 헥산 중 0-50% 에틸 아세테이트를 사용하는 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 정제하여 순수한 트레프로스티닐 발린 아미드 벤질 에스테르(2)(1.3g, 90.3% 수율)를 수득하였다
단계 2:
에틸 아세테이트(15mL) 중 트레프로스티닐 발린 아미드 벤질 에스테르(2)(1.3g)의 용액에 탄소 상 5% 팔라듐(50% w/w 물)(130mg)을 첨가하였다. 이것을 진공을 사용하여 3회 배기하고, 수소 가스로 대체하고, 2시간 동안 수소 대기 하에서 교반하였다. TLC(용리액: 에틸 아세테이트)에 기초하여, 반응이 완료된 것으로 밝혀졌다. 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하여 탄소 상 팔라듐을 제거하였다. 여액을 진공 하에서 증발시켜 트레프로스티닐 발린 아미드 프로드럭(프로드럭 XI)(1.1g, 잔류 용매와 함께 97.1% 수율)을 수득하였다.
트레프로스티닐 아스파르트산 아미드(프로드럭 XII)의 합성:
Figure pct00127
단계 1:
디클로로메탄(30mL) 중 트레프로스티닐(1)(1.0g, 2.561mmol) 및 L-아스파르트산 디벤질 에스테르 p-톨루엔설폰산 염(1.24g, 2.561mmol)의 현탁액에 트리에틸아민(0.89mL, 6.401mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물에, 1-에틸-3-(3'-디메틸아미노프로필)카보디이미드 하이드로클로라이드(EDCI)(0.59g, 3.073mmol) 및 1-하이드록시벤조트리아졸 수화물(0.42g, 3.073mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을, 2시간 동안 아르곤 하에서 주위 온도에서 교반하였다. TLC(용리액: 에틸 아세테이트)에 기초하여, 반응이 완료된 것으로 밝혀졌다. 반응 혼합물을 물(30mL)로 급랭시키고 15분 동안 교반하였다. 유기 층을 분리하고, 나트륨 설페이트 상에서 건조시키고, 진공 하에서 증발시켜 조질의 생성물을 수득하였다. 조질의 생성물은 이동상으로서 0-50% 에틸 아세테이트 및 헥산을 사용하여 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 정제하여 순수한 트레프로스티닐 아스파르트산 아미드 벤질 에스테르(2)(1.63g, 97.6% 수율)를 수득하였다.
단계 2:
에틸 아세테이트(20mL) 중 트레프로스티닐 아스파르트산 아미드 벤질 에스테르(2)(0.57g)의 용액에 탄소 상 5% 팔라듐(50% w/w 물)(57mg)을 첨가하였다. 이것을 진공을 사용하여 3회 배기하고, 수소 가스로 대체하고, 5시간 동안 수소 대기 하에서 교반하였다. TLC(용리액: 에틸 아세테이트)에 기초하여 반응이 완료된 것으로 밝혀졌다. 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하여 탄소 상 팔라듐을 수득하였다. 여액을 진공 하에서 증발시켜 트레프로스티닐 아스파르트산 아미드 프로드럭(프로드럭 XII)(0.4g, 90.9% 수율)을 수득하였다.
트레프로스티닐 세린 아미드(프로드럭 XIII)의 합성:
Figure pct00128
단계 1:
디클로로메탄(30mL) 중 트레프로스티닐(1)(1.0g, 2.561mmol) 및 L-세린 벤질 에스테르 벤젠설폰산 염(0.9g, 2.561mmol)의 현탁액에 트리에틸아민(0.89mL, 6.401mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물에 1-에틸-3-(3'-디메틸아미노프로필)카보디이미드 하이드로클로라이드(EDCI)(0.59g, 3.073mmol) 및 1-하이드록시벤조트리아졸 수화물(0.42g, 3.073mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을, 2시간 동안 아르곤 하에서 주위 온도에서 교반하였다. TLC(용리액: 에틸 아세테이트)에 기초하여 반응이 완료된 것으로 밝혀졌다. 반응 혼합물을 물(30mL)로 급랭시키고 15분 동안 교반하였다. 유기 층을 분리하고, 나트륨 설페이트 상에서 건조시키고, 진공 하에서 증발시켜 조질의 생성물을 수득하였다. 이것을, 이동상으로서 0-100% 에틸 아세테이트 및 헥산을 사용하여 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 정제하여 순수한 트레프로스티닐 세린 아미드 벤질 에스테르(2)(0.62g, 49.3% 수율)를 수득하였다..
단계 2:
에틸 아세테이트(120mL) 중 트레프로스티닐 세린 아미드 벤질 에스테르(2)(0.57g)의 용액에 탄소 상 5% 팔라듐(50% w/w 물)(57mg)을 첨가하였다. 이것을 진공을 사용하여 3회 배기하고, 수소 가스로 대체하고, 2시간 동안 수소 대기 하에서 교반하였다. TLC(용리액: 에틸 아세테이트)에 기초하여, 반응이 완료된 것으로 밝혀졌다. 반응 후 용액 중에서 화합물을 부쉈다. 탄소 상 팔라듐으로부터 생성물을 용해 및 단리하기 위해서 이소프로필 알콜(30mL)을 첨가하였다. 그다음, 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하여 탄소 상 팔라듐을 제거하였다. 여액을 진공 하에서 증발시켜 트레프로스티닐 세린 아미드 프로드럭(프로드럭 XIII)(0.54g, 100% 수율)을 수득하였다.
실시예 16
트레프로스티닐 메탄설폰아미드(프로드럭 XIV)의 합성
트레프로스티닐 메탄설폰아미드(프로드럭 XIV)(7)를 벤즈인덴 트리올(1)로부터 합성하였다. 트레프로스티닐 벤질 에스테르(2)는 트리올(1)로부터 제조하였다. 에스테르(2)를 tert-부틸디메틸 트리플루오로메탄설폰아미드(TBDMSOTf)로 실릴화하여 di-TBDMS 트레프로스티닐 벤질 에스테르(3)를 수득하였다. 수소 대기에서 탄소 상 5% 팔라듐에 의해 에틸 아세테이트 중 화합물(3)을 탈벤질화하여 디-TBDMS 트레프로스티닐(4)을 제공하였다. CDI에 의해 산(4)을 활성화하고 그다음 DBU의 존재 하에서 메탄설폰아미드와 반응시켜 디-TBDMS 트레프로스티닐 메탄설폰아미드(6)를 수득하고, 실리카 겔 컬럼으로 정제화하였다. 메탄올 중 염화수소를 사용하여 설폰 아미드(6)로부터 TBDMS를 탈양성자화하여 목적하는 트레프로스티닐 메탄설폰아미드(프로드럭 XIV)(7)를 수득하였다.
트레프로스티닐 메탄설폰아미드(프로드럭 XIV)의 합성
Figure pct00129
실험:
트레프로스티닐 벤질 에스테르(2)의 합성
Figure pct00130
실온 및 아르곤 하에서 아세톤(3.0 L) 중 벤즈인덴 트리올(1)(240.0g, 0.72 mol)의 용액에 분말화된 칼륨 카보네이트(199.5g, 1.44 mol) 및 브로모 벤질아세테이트(190.2g, 0.83 mol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 교반하고 반응의 진행을 tlc에 의해 모니터링하였다. 72시간 이후에 반응이 완료되었다. 반응 혼합물을 여과하고, 여액을 진공 하에서 증발시켜 트레프로스티닐 벤질 에스테르(2)(346.0g, 99%)를 회백색 고형물로서 수득하였다.
디-TBDMS 트레프로스티닐 벤질 에스테르(3)의 합성
Figure pct00131
무수 디클로로메탄(150mL) 중 트레프로스티닐 벤질 에스테르(2)(15.26g, 31.75mmol)의 용액에, 실온에서 2,6-루티딘(13.61g, 14.75mL, 127.01mmol)을 첨가하였다. 투명한 용액을 0℃(얼음/물 욕)으로 냉각시키고 그다음 20분에 걸쳐 무수 디클로로메탄(30mL) 중 tert-부틸디메틸 트리플루오로메탄설폰산(TBDMSOTf)(20.98g, 18.23mL, 79.37mmol)의 용액을, 아르곤 하에서 상기 온도를 5 ℃ 미만으로 유지하면서 첨가하였다. 첨가를 완료한 후, 반응 혼합물을 2시간 동안 0-5 ℃에서 교반하였다. 2시간 후, 반응 혼합물을 tlc(EtOAc/헥산, 1:4)로 확인하였고 반응이 완료되었다. 혼합물을 헥산(360mL, 사용된 디클로로메탄의 체적의 2배)으로 처리하고 실온에서 10분 동안 교반하였다. 혼합물을 실리카 겔(230-400 메쉬)(293g) 컬럼을 통해 통과시키고 화합물을 헥산 중 에틸 아세테이트(2-6%)로 용리하여 순수한 디-TBDMS 트레프로스티닐 벤질 에스테르(3)(21.7g, 96.4%)를 제공하였다.
디-TBDMS 트레프로스티닐(4)의 합성
Figure pct00132
에틸 아세테이트(320mL) 중 디-TBDMS 트레프로스티닐 벤질 에스테르(3)(21.6g, 30.46mmol)의 용액에 탄소 상 팔라듐(5중량%, 50% 물)(2.16g)을 첨가하였다. 혼합물을 교반하고 하우스 진공 하에서 배기시키고 수소(풍선에 충전된 상태)로 대체하였다. 공정을 3회 반복하였다. 혼합물을 2시간 동안 수소의 대기 하에서 실온에서 교반하고 tlc(EtOAc/헥산, 1:4 및 EtOAc, 100%)를 확인하였다. 반응이 완료되었다. 반응 혼합물을 셀라이트(7.0g)로 처리하고 일회용 폴리에틸렌 필터 깔때기에서 실리카 겔의 패드(22g)를 통해 여과하고, 고형물을 에틸 아세테이트(3 x 50mL)로 세척하였다. 여액이 일부 탄소 입자들을 함유하여서 여액을 셀라이트 패드(10.0g)를 통해 다시 여과하여 맑은 여액을 취하였다. 맑은 여액을 실리카 겔(30g) 컬럼을 통해 통과시키고 상기 실리카 겔을 에틸 아세테이트(2 x 70mL)로 세척하였다. 여액이 맑았고 여액을 진공에서 30℃(수욕 온도)에서 농축시켜 디-TBDMS 트레프로스티닐(4)을 무색 점성 액체(18.6g, 98.7%)로서 수득하였다.
디-TBDMS 트레프로스티닐 메탄설폰아미드(6)의 합성
Figure pct00133
무수 테트라하이드로푸란(190mL) 중 디-TBDMS 트레프로스티닐(4)(18.5g, 29.88mmol)의 용액에 아르곤 하에서 실온에서 한번에 1,1'-카보닐디이미다졸(CDI)(7.27g, 44.83mmol)을 첨가하였다. 맑은 반응 혼합물을 30분 동안 실온에서 교반하고, 그다음 75℃(오일욕 온도)에서 30분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각하였다. 이 동일반응계에서 발생된 디-TBDMS 트레프로스티닐의 CDI 중간체(5)에 메탄설폰아미드(8.53g, 89.68mmol)를 한번에 첨가하고 맑은 용액이 수득될 때까지 10분 동안 실온에서 교반하였다. 이 맑은 용액에, 아르곤 하에서 무수 테트라하이드로푸란(40mL) 중 1,8-디아자비사이클로[5.4.0]운데크-7-엔(DBU)(22.74g, 149.37mmol)의 용액을 첨가하였다. 첨가를 완료한 후, 반응 혼합물을 실온에서 교반하고 tlc(EtOAc, 100% 및 MeOH/CH2Cl2, 1:9)에 의해 모니터링하였다. 2시간 후에, 반응이 완료되었다. 혼합물을 물(200mL)로 급랭시키고 그다음 EtOAc(1 x 200mL), (2 x 100mL)로 추출하였다. 모은 EtOAc 추출액을 물(3 x 100mL), 식염수(1 x 30mL)로 세척하고, 건조시키고(Na2SO4), 여과하고, 진공 하에서 농축시켜 회백색 거품형 고체(21.44g)를 수득하였다. 조질의 생성물은 실리카겔(230-400 메쉬)(296g) 상에서 CH2Cl2 및 1-30% MeOH/CH2Cl2를 사용하여 크로마토그래피하여 디-TBDMS 트레프로스티닐 메탄설폰아미드(6)를 백색 거품형 고형물(15.4g, 74.0%)로서 수득하였다.
트레프로스티닐 메탄설폰아미드(7)의 합성
Figure pct00134
무수 메탄올(135mL) 중 디-TBDMS 트레프로스티닐 메탄설폰아미드(6)(13.4g, 19.25mmol)의 용액을 0 내지 5℃(얼음/물 욕)로 냉각시켰다. 이 찬 용액에, 아르곤 하에서 3분에 걸쳐 무수 메탄올(135mL) 중 메탄올 중 염화수소(1.25 M)(38.5mL, 48.13mmol)의 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 0 내지 5℃(얼음/물 욕)에서 30분 동안 교반하고 tlc(MeOH/CH2Cl2, 1:9)를 확인하였다. 5분 동안 0 내지 5℃에서 반응 혼합물을 통해 아르곤을 서서히 버블링하여 과량의 염화수소를 제거하였다. 그다음, 반응 혼합물을 진공 하에서 25℃(수욕 온도)에서 증발시켜 유기 휘발물을 제거하여 조질의 설폰아미드 생성물(7)을 연황색 거품형 고형물(11.03g)로서 수득하였다. 이 화합물을 다른 조질의 생성물(0.80g)과 조합하여 11.83g의 총 중량을 수득하였다. 조질의 생성물을 모아 실리카 겔(175g) 컬럼 상에서 25-100% EtOAc/헥산 및 1-20% MeOH/EtOAc를 사용하여 크로마토그래피하여 순수한 트레프로스티닐 메탄설폰아미드(7)를 회백색 거품형 고형물(6.28g)로서 수득하였다.
실시예 17
다양한 프로드럭을 위해 요구되는 출발물질인 트레프로스티닐 모노-TES 벤질 에스테르(2a)의 합성:
Figure pct00135
아세톤(200mL) 중 트레프로스티닐 벤질 에스테르(1)(100g, 20.80mmol)의 용액에 이미다졸(1.41g, 20.80mmol) 및 4-디메틸아미노피리딘(0.25g, 2.08mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물에, 교반하면서, 아르곤 대기 하에서 주사기를 사용하여 클로로트리에틸실란(3.5mL, 20.80mmol)을 첨가하였다. 1시간 후, TLC(용리액: 20% 에틸 아세테이트/헥산)에 기초할 때, 반응이 완료된 것으로 밝혀졌다. 반응물을 물(150mL)로 급랭시키고 유기 층을 분리하고, 식염수(100mL)로 세척하고, 나트륨 설페이트 상에서 건조시키고, 진공 하에서 증발시켜 조질의 생성물을 수득하였다. 조질의 물질을 이동상으로서 에틸 아세테이트:헥산(0-11 %)을 사용하여 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 54.04 % 수율의 모노-보호된 화합물(2a)(6.68g) 및 3.88 % 수율의 모노-보호된 화합물(2b)(0.48g) 둘 다를 수득하였다.
실시예 18
프로드럭 I, II, III 및 XV의 단일 투여 후의 수컷 스프라그 다울리 래트에서의 평균 대사산물-대-모체의 비를 표 11에 나타냈다.
Figure pct00136
NC= 계산되지 않음.
a= 동물에게 100mg/kg 투여하였다.
b= 동물에게 200mg/kg 투여하였다.
부가적인 실시양태
1. 하기 화학식의 화합물 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염:
Figure pct00137
상기 식에서,
X는 OH 또는
Figure pct00138
이되, 여기서 R1은 H 또는 C1-C4 알킬이고;
각각의 R2 및 R3은 독립적으로 H, C1-4 알킬, 또는 중에서 선택되되, 여기서 Y는 OR4 또는 NR4R5이며, 각각의 R4 및 R5는 독립적으로 H 및 C1-4 알킬 중에서 선택되되, 단 X가 OH이면, R2 및 R3은 모두 H가 아니다.
2. X가 OH인, 실시양태 1의 화합물.
3. 각각의 R2 및 R3이 독립적으로 C1-4 알킬 중에서 선택되는, 실시양태 2의 화합물.
4. 각각의 R2 및 R3이 메틸인, 실시양태 2의 화합물.
5. 각각의 R2 및 R3이 독립적으로 H, 및
Figure pct00140
중에서 선택되는, 실시양태 2의 화합물.
6. R2 및 R3 중 하나가
Figure pct00141
이고 R2 및 R3 중 나머지가 H인, 실시양태 5의 화합물.
7. Y가 OR4인, 실시양태 6의 화합물.
8. R4가 메틸 또는 H인, 실시양태 7의 화합물.
9. Y가 NR4R5인, 실시양태 6의 화합물.
10. 각각의 R4 및 R5가 독립적으로 H 또는 메틸 중에서 선택되는, 실시양태 9의 화합물.
11. R4 및 R5가 모두 H 또는 메틸인, 실시양태 9의 화합물.
12. (A) 실시양태 1 내지 11 중 어느 하나의 화합물 및 (B) 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 약학 조성물.
13. 경구 약학 조성물인, 실시양태 12의 약학 조성물.
14. 피하 약학 조성물인, 실시양태 12의 약학 조성물.
15. 실시양태 1 내지 11 중 어느 하나의 화합물의 유효량을, 폐고혈압 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 폐고혈압을 치료하는 방법.
16. 투여가 경구로 수행되는, 실시양태 15의 방법.
17. 대상체가 인간인, 실시양태 15의 방법.
18. 투여가 주사에 의해 수행되는, 실시양태 15의 방법.
19. 투여가 피하로 수행되는, 실시양태 18의 방법.
20. 상기 투여가 연속 피하 투여인, 실시양태 19의 방법.
21. 상기 투여가 트레프로스티닐을 투여하는 것에 비해 주사 부위에 통증을 야기하지 않거나 적은 통증을 야기하는, 실시양태 18의 방법.
22. 트레프로스티닐 프로드럭의 유효량을, 폐고혈압을 앓는 환자에게 피하로 투여하는 것을 포함하는, 폐고혈압을 치료하는 방법.
23. 트레프로스티닐 또는 그의 약학적 염의 피하 투여시 부위 통증을 겪었던 환자를 선택하는 단계; 및 트레프로스티닐 프로드럭의 유효량을 폐고혈압을 앓는 환자에게 피하로 투여하는 단계를 포함하는, 폐고혈압을 치료하는 방법.
* * *
전술한 바는 특정한 바람직한 실시양태를 언급하고 있지만, 본 발명은 이에 한정되지 않음을 이해할 것이다. 개시된 실시양태에 대한 다양한 개질이 이루어질 수 있다는 점 및 이러한 개질이 본 발명의 범위 내에 있음이 당업자들에게 자명할 것이다.
본 명세서에 인용된 모든 간행물, 특허 출원 및 특허는 그 전체가 본원에 참고문헌으로 인용된다.

Claims (51)

  1. 트레프로스티닐(treprostinil) 프로드럭의 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자에서의 질환 또는 병태를 치료하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    질환 또는 병태가 폐고혈압인 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    질환 또는 병태가 폐고혈압, 울혈성 심부전, 말초 혈관병, 레이노 증후군(Raynaud's phenomenon), 피부경화증, 신부전증, 말초 신경병증, 손가락 궤양, 간헐성 파행증, 허혈성 사지 질환, 말초 허혈성 병변, 폐섬유증 및 천식으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상인 방법.
  4. 트레프로스티닐 프로드럭의 유효량을 폐고혈압을 앓고 있는 환자에게 피하로 투여하는 것을 포함하는, 폐고혈압을 치료하는 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 투여가 연속 피하 투여인 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 투여가 트레프로스티닐을 투여하는 것에 비해 주사 부위에 통증을 야기하지 않거나 적은 통증을 야기하는 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    프로드럭이 하기 화학식을 갖는 화합물 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염인 방법:
    Figure pct00142

    상기 식에서,
    X가 OR9 또는 NR1R6이고;
    R9가 H 또는 임의로 말단 하이드록시기 또는 카복시기로 치환될 수 있는 C1--C4 알킬이며;
    R1이 H 또는 C1-C4 알킬이고 R6이
    Figure pct00143
    또는
    Figure pct00144
    이거나, R1 및 R6은 NR1R6이 아미노산의 아미드이도록 하며;
    R7이 H, 또는 말단 하이드록시기 또는 카복시기로 치환될 수 있는 C1--C4 알킬이고;
    R8이 H 또는 C1-C4 알킬이며;
    각각의 R2 및 R3이 독립적으로 H, C1-4 알킬,
    Figure pct00145
    , 포스페이트, 및 OR2 또는 OR3이 아미노산의 에스테르를 형성하는 기 중에서 선택되고;
    Y가 OR4 또는 NR4R5이며,
    각각의 R4 및 R5가 독립적으로 H 및 C1-4 알킬 중에서 선택되고;
    단, R9, R2 및 R3은 모두 H가 아니다.
  8. 제1항에 있어서,
    프로드럭이 하기 화학식을 갖는 화합물 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염인 방법:
    Figure pct00146

    상기 식에서,
    X가 OH 또는 NR1R6이며,
    여기서, R1이 H 또는 C1-C4 알킬이고 R6이
    Figure pct00147
    또는
    Figure pct00148
    이거나, R1 및 R6은 NR1R6이 아미노산의 아미드이도록 하며;
    R7이 H, 또는 말단 하이드록시기 또는 카복시기로 치환될 수 있는 C1--C4 알킬이고,
    R8이 H 또는 C1-C4 알킬이며,
    각각의 R2 및 R3이 독립적으로 H, C1-4 알킬, 또는
    Figure pct00149
    중에서 선택되고,
    Y가 OR4 또는 NR4R5이며,
    각각의 R4 및 R5가 독립적으로 H 및 C1-4 알킬 중에서 선택되고;
    단, X가 OH일 때, R2 및 R3은 모두 H가 아니다.
  9. 제8항에 있어서,
    X가 OH 또는
    Figure pct00150
    인 방법.
  10. 제7항에 있어서,
    X가 OH인 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    각각의 R2 및 R3이 독립적으로 C1-4 알킬 중에서 선택되는 방법.
  12. 제10항에 있어서,
    각각의 R2 및 R3이 메틸인 방법.
  13. 제10항에 있어서,
    각각의 R2 및 R3이 독립적으로 H, 및
    Figure pct00151
    중에서 선택되는 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    R2 및 R3 중 하나가
    Figure pct00152
    이고 R2 및 R3 중 나머지가 H인 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    Y가 OR4인 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    R4가 메틸 또는 H인 방법.
  17. 제14항에 있어서,
    Y가 NR4R5인 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    각각의 R4 및 R5가 독립적으로 H 또는 메틸 중에서 선택되는 방법.
  19. 제17항에 있어서,
    R4 및 R5가 모두 H 또는 메틸인 방법.
  20. 제18항에 있어서,
    R4 및 R5 중 하나가 메틸이고 나머지가 H인 방법.
  21. 제10항에 있어서,
    R2 및 R3 중 적어도 하나가 포스페이트인 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    각각의 R2 및 R3이 포스페이트인 방법.
  23. 제21항에 있어서,
    R2 및 R3 중 하나가 포스페이트이고 나머지가 H인 방법.
  24. 제10항에 있어서,
    적어도 R2 및 R3은, OR2 또는 OR3이 아미노산의 에스테르를 형성하는 기인 방법.
  25. 제24항에 있어서,
    R2 및 R3 중 하나는 H이고 나머지는 OR2 또는 OR3이 아미노산의 에스테르를 형성하는 기인 방법.
  26. 제7항에 있어서,
    X가 NR1R6이고 각각의 R2 및 R3이 H인 방법.
  27. 제26항에 있어서,
    R1이 H인 방법.
  28. 제27항에 있어서,
    R6이
    Figure pct00153
    인 방법.
  29. 제28항에 있어서,
    R7이 H인 방법.
  30. 제28항에 있어서,
    R7이 임의로 말단 히드록시기 또는 카복시기로 치환될 수 있는 C1-C4 알킬인
    방법.
  31. 제27항에 있어서,
    R6이
    Figure pct00154
    인 방법.
  32. 제31항에 있어서,
    R8이 H 또는 메틸인 방법.
  33. 제26항에 있어서,
    NR1R6이 아미노산의 아미드인 방법.
  34. 제7항에 있어서,
    X가 OR9이고, R9가 임의로 말단 하이드록시기 또는 카복시기로 치환될 수 있는 C1-C4 알킬이며, R2 및 R3이 각각 H인 방법.
  35. 제34항에 있어서,
    R9가 말단 하이드록시기로 치환된 C1--C4인 방법.
  36. 제1항에 있어서,
    프로드럭이 하기 화학식 중 하나를 갖는 방법:
    Figure pct00155
    ;
    Figure pct00156
    ;
    Figure pct00157
    ;
    Figure pct00158
    ;
    Figure pct00159
    ;
    Figure pct00160
    ;
    Figure pct00161
    ;
    Figure pct00162
    ;
    Figure pct00163
    ;
    Figure pct00164
    ;
    Figure pct00165
    ;
    Figure pct00166
    ;
    Figure pct00167
    ;
    Figure pct00168
    ; 및
    Figure pct00169
    .
  37. 하기 화학식 중 하나를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
    Figure pct00170
    ;
    Figure pct00171
    ;
    Figure pct00172
    ;
    Figure pct00173
    ;
    Figure pct00174
    ;
    Figure pct00175
    ;
    Figure pct00176
    ;
    Figure pct00177
    ;
    Figure pct00178
    ;
    Figure pct00179
    ;
    Figure pct00180
    ; 또는
    Figure pct00181
    .
  38. (A) 제36항의 화합물 및 (B) 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
  39. 제38항에 있어서,
    경구 약학 조성물인 약학 조성물.
  40. 제38항에 있어서,
    피하 약학 조성물인 약학 조성물.
  41. 제37항의 화합물의 유효량을, 폐고혈압 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 폐고혈압을 치료하는 방법.
  42. 제41항에 있어서,
    투여가 경구로 수행되는 방법.
  43. 제41항에 있어서,
    대상체가 인간인 방법.
  44. 제41항에 있어서,
    투여가 주사에 의해 수행되는 방법.
  45. 제44항에 있어서,
    투여가 피하로 수행되는 방법.
  46. 제45항에 있어서,
    상기 투여가 연속 피하 투여인 방법.
  47. 제45항에 있어서,
    상기 투여가 트레프로스티닐을 투여하는 것에 비해 주사 부위에 통증을 야기하지 않거나 적은 통증을 야기하는 방법.
  48. 제1항에 있어서,
    환자가 인간이되, 상기 프로드럭이 120분 미만의 반감기를 갖는 방법.
  49. 제48항에 있어서,
    프로드럭이 60분 미만의 반감기를 갖는 방법.
  50. 제49항에 있어서,
    상기 프로드럭이 혈장에서 30분 미만의 반감기를 갖는 방법.
  51. 제50항에 있어서,
    상기 프로드럭이 혈장에서 15분 미만의 반감기를 갖는 방법.
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