CN110678174A - 曲前列环素的前药 - Google Patents

Abstract

本发明提供了曲前列环素的新型前药，以及制备及使用这些前药的方法。

Description

曲前列环素的前药

相关专利申请的交叉引用

本申请要求2016年9月26日提交的美国临时申请序列号62/399,737的优先权，其全文通过引用并入本文。

技术领域

本发明通常涉及环前列腺素，更具体地涉及曲前列环素的前药以及制备和使用该前药的方法。

背景技术

肺动脉高压症(Pulmonary hypertension)是一种进行性的并危及生命的疾病，其特点是肺血管压力升高，尤其可导致心力衰竭。

肺动脉高压症(PH)曾经被分为原发性的(先天的)或继发性的。世界卫生组织(WHO)将肺动脉高压症分为五组：

第1组：动脉性肺动脉高压症(pulmonary arterial hypertension，PAH)；

第1’组：肺静脉闭塞症(Pulmonary veno-occlusive disease，PVOD)和/或肺毛细血管瘤(pulmonary capillary haemangiomatosis，PCH)

第2组：PH伴左心疾病；

第3组：PH伴肺部疾病和/或低氧血症；

第4组：慢性血栓和/或梗塞病变引起的PH；和

第5组：各种复杂情况；多因素机制不明(例如结节病、细胞组织增生症X、淋巴管瘤病和肺血管受压)。

目前有多种获批产品用于包括第1组(PAH)在内的某些肺动脉高压症。这些产品包括使用曲前列环素作为有效成分的产品，例如

曲前列环素注射剂。然而曲前列环素在皮下施用时，有时与局部疼痛有关。因此，有必要在不引起局部疼痛的情况下施用曲前列环素。

发明内容

概要

一个实施例是一种治疗一种疾病或病症的方法，其包含选择一个患者，其患有所述疾病或病症且曾有经皮下施用曲前列环素或其药学上可接受的盐后有局部疼痛，并对所述患者经皮下施用有效量的曲前列环素的前药，其中所述疾病或病症选自肺动脉高压病、充血性心力衰竭、外周血管疾病、雷诺现象、硬皮病、肾功能不全、周围神经病变、指溃疡、间歇性跛行、缺血性肢体疾病、外周缺血性病变、肺纤维化和哮喘的一种或多种。

另一个实施例为一种治疗肺动脉高压症的方法，其包含向患有肺动脉高压症的患者经皮下施用有效量的曲前列环素的前药。

另一个实施例为一种化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物的结构式为下式之一：

附图说明

图

图1为合成环戊环氨基甲酸酯前药I的图示。

图2为合成侧链氨基甲酸酯前药II的图示。

图3为合成环戊环氨基甲酸酯前药III的图示。

图4为合成侧链氨基甲酸酯前药IV的图示。

图5为合成醋酸酰胺前药VII的图示。

图6为合成关键起始原料的图示。

图7为选定前药的化学式。

图8为Remodulin和曲前列环素的前药的血浆浓度随时间变化的曲线图。静脉内和皮下施用Remodulin(在图中对应的表示为“在图中和““图中)的数据点来自于涉及到患有肺动脉高压症的患者的临床试验，以证明皮下施用曲前列环素与静脉内施用曲前列环素为生物等效的。标记了“上限”和“下限”的曲线图反映了皮下施用Remodulin的生物等效范围。曲前列环素的前药的曲线图(表示为“前药”)代表一组可能的数据点，其可近似为皮下施用Remodulin(前药在体内已被转化为曲前列环素游离酸)的曲线，以及曲前列环素游离酸在血浆中的量的曲线。

图9报道了受试大鼠局部疼痛导致的收回时间，其施用了下列中的一种：a)盐水，b)(Remodulin)的安慰剂制剂，其包含了柠檬酸盐缓冲剂、氯化钠和间甲酚，但不含有曲前列环素；c)第一种Remodulin制剂，包含浓度为1度g/mL的曲前列环素，其中含有曲前列环素、柠檬酸盐缓冲剂、氯化钠和间甲酚；d)第二种Remodulin制剂，包含浓度为100μg/mL的曲前列环素，其中含有曲前列环素、柠檬酸盐缓冲剂、氯化钠和间甲酚，垂直条表示了在施药后t＝0、15分钟和90分钟后受试大鼠在收到热刺激时收回爪子作为回应的快速程度。

图10A-D显示了选定的前药。

图11所示的是曲前列环素与选出的八种前药使用ACE Excel C18柱得到的色谱覆盖图。此特别研究的结果显示曲前列环素除了与前药XIV共洗脱外，与其他前药都能很好的分离。

图12所示的是曲前列环素与选出的八种前药使用Waters BEH C18柱得到的色谱覆盖图。

图13所示的是曲前列环素与选出的八种前药使用ACE Excel 2C18-AR柱(C18-苯基相)得到的色谱覆盖图。

图14所示的是曲前列环素与选出的八种前药使用Waters CSH苯基己基柱得到的色谱覆盖图。

图15总结了所选定前药的半衰期值。

图16为实施例9和11中所用的足底注射模型诱导与治疗的图示。热力测试在VonFrey测试后(最多10分钟时间差)立即进行。

图17表示的是循环1(g)的Von Frey反应测试结果。更小的力代表了更高的灵敏度。对于每个基准线来说，15分钟和90分钟的测试点，纵列代表如下的从左至右：盐水(组1)、PBS(组2)、曲前列环素100μg/mL(组3)、前药I 100μg/mL(组4)、前药II 100μg/ml(组5)、前药VII 100μg/mL(组6)、前药VIII 100μg/mL(组7)。

图18表示的是循环2(g)的Von Frey相应测试结果。更小的力代表了更高的灵敏度。对于每个基准线来说，15分钟和90分钟的测试点，纵列代表如下的从左至右：盐水(组8)、PBS(组9)、曲前列环素1μg/mL(组10)、前药I 1μg/mL(组11)、前药II 1μg/mL(组12)、前药VII 1μg/mL(组13)、前药VIII 1μg/mL(组14)。

图19表示的是循环1(sec)的热力响应测试结果。更慢/更快的时间代表了更高的灵敏度。对于每个基准线来说，15分钟和90分钟的测试点，纵列代表如下的从左至右：盐水(组1)、PBS(组2)、曲前列环素100μg/mL(组3)、前药I 100μg/mL(组4)、前药II100μg/mL(组5)、前药VII 100μg/mL(组6)、前药VIII 100μg/mL(组7)。

图20表示的是循环2(sec)的热力响应测试结果。更慢/更快的时间代表了更高的灵敏度。对于每个基准线来说，15分钟和90分钟的测试点，纵列代表如下的从左至右：盐水(组8)、PBS(组9)、曲前列环素1μg/mL(组10)、前药I 1μg/mL(组11)、前药II1μg/mL(组12)、前药VII 1μg/mL(组13)、前药VIII 1μg/mL(组14)。

图21表示的是循环1(点)平均临床分数。增加的/更高的得分代表了更多不良事件的观测。对于15分钟和90分钟的测试时间点，数据代表从左至右的：盐水(组1)、PBS(组2)、曲前列环素100μg/mL(组3)、前药I 100μg/mL(组4)、前药II 100μg/mL(组5)、前药VII 100μg/mL(组6)、前药VIII 100μg/mL(组7)。对于15分钟时间点来说，非零的观测为如下从左到右：曲前列环素100μg/mL(组3)、前药I 100μg/mL(组4)、前药II 100μg/mL(组5)、前药VII100μg/mL(组6)、前药VIII 100μg/mL(组7)。对于90分钟的时间点，非零的观测为如下从左至右：曲前列环素100μg/mL(组3)、前药I 100μg/mL(组4)、前药II 100μg/mL(组5)、前药VII100μg/mL(组6)。

图22表示的是循环2(点)的平均临床分数。增加的/更高的得分代表了更多不良事件的观测。对于15分钟和90分钟的测试时间点，数据代表从左至右的：盐水(组8)、PBS(组9)、曲前列环素1μg/mL(组10)、前药I 1μg/mL(组11)、前药II 1μg/mL(组12)、前药VII 1μg/mL(组13)、前药VIII 1μg/mL(组14)。对于15分钟和90分钟测试时间点来说，唯一的非零观测对应的为曲前列环素1μg/mL(组10)。

图23为实施例10中所用的足底注射模型诱导与治疗的图示。

图24表示的是Von Frey响应测试(g)的结果。更小的力代表了更高的灵敏度。对于每个基准线来说，15分钟和90分钟的测试点，纵列代表如下的从左至右：磷酸盐缓冲液(组1)、曲前列环素100μg/mL(组2)、曲前列环素1μg/mL(组3)、前药VII 100μg/mL(组4)、前药VII 1μg/mL(组5)、前药XV 100μg/mL(组6)、前药XV 1μg/mL(组7)。

图25表示的是热力学测试(秒)结果。更慢/更快的时间代表了更高的灵敏度。对于每个基准线来说，15分钟和90分钟的测试点，纵列代表如下的从左至右：磷酸盐缓冲液(组1)、曲前列环素100μg/mL(组2)、曲前列环素1μg/mL(组3)、前药VII 100μg/mL(组4)、前药VII 1μg/mL(组5)、前药XV 100μg/mL(组6)、前药XV 1μg/mL(组7)。

图26表示的是循环1(点)的平均临床分数。增加的/更高的得分代表了更多不良事件的观测。对于15分钟和90分钟的测试时间点，数据代表从左至右的：磷酸盐缓冲液(组1)、曲前列环素100μg/mL(组2)、曲前列环素1μg/mL(组3)、前药VII 100μg/mL(组4)、前药VII 1μg/mL(组5)、前药XV 100μg/mL(组6)、前药XV 1μg/mL(组7)。磷酸盐缓冲液在每个15分钟和90分钟时间点的观测均为零分。因此，左侧第一个非零纵列代表的是曲前列环素100μg/mL(组2)。

图27表示的是循环1(g)的Von Frey响应测试结果。更小的力代表了更高的灵敏度。对于每个基准线来说，15分钟和90分钟的测试点，纵列代表如下的从左至右：磷酸盐缓冲液(组1)、曲前列环素100μg/mL(组2)、前药VII 100μg/mL(组3)、前药III 100μg/mL(组4)、前药IV 100μg/mL(组5)、前药XIV 100μg/mL(组6)。

图28表示的是循环2(g)的Von Frey响应测试结果。更小的力代表了更高的灵敏度。对于每个基准线来说，15分钟和90分钟的测试点，纵列代表如下的从左至右：磷酸盐缓冲液(组7)、曲前列环素1μg/mL(组8)、前药VII 1μg/mL(组9)、前药III 1μg/mL(组10)、前药IV 1μg/mL(组11)、前药XIV 1μg/mL(组12)。

图29表示的是循环1(秒)的热力学测试结果。更慢/更快的时间代表了更高的灵敏度。对于每个基准线来说，15分钟和90分钟的测试点，纵列代表如下的从左至右：磷酸盐缓冲液(组1)、曲前列环素100μg/mL(组2)、前药VII 100μg/mL(组3)、前药III 100μg/mL(组4)、前药IV 100μg/mL(组5)、前药XIV 100μg/mL(组6)。

图30表示的是循环2(秒)的热力学测试结果。更慢/更快的时间代表了更高的灵敏度。对于每个基准线来说，15分钟和90分钟的测试点，纵列代表如下的从左至右：磷酸盐缓冲液(组7)、曲前列环素1μg/mL(组8)、前药VII 1μg/mL(组9)、前药III 1μg/mL(组10)、前药IV 1μg/mL(组11)、前药XIV 1μg/mL(组12)。

图31表示的是循环1(点)平均临床分数。增加的/更高的得分代表了更多不良事件的观测。对于15分钟和90分钟的测试时间点，数据代表从左至右的：磷酸盐缓冲液(组1)、曲前列环素100μg/mL(组2)、前药VII 100μg/mL(组3)、前药III 100μg/mL(组4)、前药IV 100μg/mL(组5)、前药XIV 100μg/mL(组6)。磷酸盐缓冲液的每个15分钟和90分钟点观测均为零分。因此左侧第一个不为零的纵列代表的是曲前列环素100μg/mL(组2)。

图32表示的是循环2(点)的平均临床分数。增加的/更高的得分代表了更多不良事件的观测。对于15分钟和90分钟的测试时间点，数据代表从左至右的：磷酸盐缓冲液(组7)、曲前列环素1μg/mL(组8)、前药VII 1μg/mL(组9)、前药III 1μg/mL(组10)、前药IV 1μg/mL(组11)、前药XIV 1μg/mL(组12)。因此，左侧第一个不为零的纵列代表的为曲前列环素1μg/mL(组8)。

图33表示的是心率的无线电遥测数据总结。数据表示为平均值±SEM。

图34表示的是收缩压的无线电遥测数据总结。数据表示为平均值±SEM。

图35表示的是舒张压的无线电遥测数据总结。数据表示为平均值±SEM。

图36表示的是平均动脉血压的无线电遥测数据总结。数据表示为平均值±SEM。

图37表示的是平均脉压的无线电遥测数据总结。数据表示为平均值±SEM。

图38表示的是体温的无线电遥测数据总结。数据表示为平均值±SEM。

图39为制备前药VIII的合成路线图示。

具体实施方式

详细说明

除非有特别说明，“一”指的是一或多。

曲前列环素是(注射或静脉注射曲前列环素)，

(吸入曲前列环素)，和

(口服固体制剂形式的曲前列环素)的活性成分，其记载于美国专利第4,306,075号。曲前列环素和其他前列环素衍生物的制备记载于例如Moriarty,et al.,J.Org.Chem.2004,69,1890-1902,Drug of the Future,2001,26(4),364-374,美国专利号6,441,245、6,528,688、6,700,025、6,809,223、6,756,117、8,461,393、8,481,782、8,242,305、8,497,393、8,940,930、9,029,607、9,156,786和9,388,154、9,346,738；美国专利公开申请号2012-0197041、2013-0331593、2014-0024856、2015-0299091、2015-0376106、2016-0107973、2015-0315114、2016-0152548和2016-0175319；PCT公开号No.WO2016/0055819和WO2016/081658。

多种曲前列环素的用途和形式公开于，例如，美国专利申请号5,153,222、5,234,953、6,521,212、6,756,033、6,803,386、7,199,157、6,054,486、7,417,070、7,384,978、7,879,909、8,563,614、8,252,839、8,536,363、8,410,169、8,232,316、8,609,728、8,350,079、8,349,892、7,999,007、8,658,694、8,653,137、9,029,607、8,765,813、9,050,311、9,199,908、9,278,901、8,747,897、9,358,240、9,339,507、9,255,064、9,278,902和9,278,903，美国专利公开申请号2009-0036465、2008-0200449、2008-0280986、2009-0124697、2014-0275616、2014-0275262、2013-0184295、2014-0323567、2016-0030371、2016-0051505、2016-0030355、2016-0143868、2015-0328232、2015-0148414、2016-0045470和2016-0129087，和PCT公开号WO00/57701、WO20160105538和WO2016038532。

曲前列环素的化学式如下：

本发明公开了通过注射例如皮下施药，施用某些曲前列环素的前药，与通过相同给药途径施用相同浓度的曲前列环素或其盐(例如曲前列环素钠)相比，可能导致较轻或不导致疼痛。

一个实施例可为一种治疗可通过向患者施用有效量的曲前列环素的前药来治疗的疾病或病症的方法。所述病症可为肺动脉高压症，所述患者可以是人。施药过程可以通过注射(例如皮下注射)。在一些实施例中，所述前药可以大体连续的施用给患者，例如通过使用合适的泵送。

另一个实施例可为一种治疗患有可通过曲前列环素治疗的疾病或病症的患者的方法，其包括选择一个患者，其患有所述疾病或病症并有施用曲前列环素或其曲前列环素的盐(例如曲前列环素钠)之后有局部疼痛经历，并向所述患者施用有效量的曲前列环素的前药。所述病症可为肺动脉高压症，所述患者可以是人。施药过程可以通过注射(例如皮下注射)。在一些实施例中，所述前药可以大体连续的施用给患者，例如通过使用合适的泵送。

可被曲前列环素治疗的疾病/病症包括但不限于，肺动脉高压症，包含动脉性肺动脉高压症和慢性血栓栓塞性肺动脉高压症；心力衰竭，如充血性心力衰竭；缺血性疾病，如外周血管疾病、雷诺现象、雷诺氏病、伯格氏病、硬皮病、肾功能不全、间歇性跛行、缺血性肢体疾病、外周缺血性病变；周围神经病变，包括糖尿病神经病变；四肢病变和/或溃疡，如足和/或手指溃疡，溃疡(手指和/或脚趾)，其可由或不由缺血性疾病引起，如外周血管疾病、雷诺氏现象、雷诺氏病、伯格氏病、硬皮病、间歇性跛行、缺血性肢体疾病和/或周围神经病变，如糖尿病神经病变；肺纤维化、囊性纤维化；哮喘；癌症，其可以是选自肺癌、肝癌、脑癌、胰腺癌、肾癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌和头颈癌中的一种或多种的癌症。

在一些实施例中，与施用曲前列环素或曲前列环素的盐相比，与施用曲前列环素的前药相关的较轻或没有疼痛有许多优点。例如，不能承受曲前列环素导致的疼痛的患者可以通过使用前药获得曲前列环素治疗的益处。视觉模拟评分(VAS评分)可以通过患者整个输注(例如皮下输注)过程连续收集。VAS评分可以接着绘制为时间函数方程从而计算曲线下疼痛面积(AUC)。通过施用去前列环素的前药达成的与施用曲前列环素或曲前列环素的盐(例如曲前列环素钠)相比更少或没有疼痛可意味着曲前列环素前药与曲前列环素或曲前列环素盐(列入曲前列环素钠)相比有更低的疼痛AUC。VAS评分方法的评定可能包括不止疼痛强度，其还可包含强度的整合以及监控强度随时间的变化。VAS评分方法记载于，例如，Lydick E,et al.Quality of Life Research.1995；4:41-45；and Van Wijk AJ etal.Eur J Pain.2013；17:394-401.

术语“有效量”可意味着一定量的曲前列环素的前药，其可为治疗疾病或病症所必需。在一些实施例中，曲前列环素的前药的有效量可以与治疗相同疾病或病症的曲前列环素的有效量相同或相近。在一些实施例中，曲前列环素的前药的有效量可以与治疗相同疾病或病症的曲前列环素的有效量不同。本领域的普通技术人员可以基于例如相关施用曲前列环素来治疗、改善或预防疾病或病症的剂量来决定曲前列环素的前药的“有效量”和所述前药在体内转化为曲前列环素的比率。

在一些实施例中，所述前药可以为美国专利号7,384,978、7,417,070、7,544,713、8,252,839、8,410,169、8,536,363、9,050,311、9,199,908、9,278,901、9,422,223和9,624,156中记载的前药，其全文通过引用全部并入本文。

在一些实施例中，所述前药可以为美国专利号9,371,264、9,394,227、9,505,737和9,643,911中记载的前药，其全文通过引用全部并入本文。

在一些实施例中，所述前药可为以下讨论的前药中的一种。

例如，在一些实施例中，所述前药可为具有下式的化合物：

其中X是OR₉或NR₁R₆；其中R₉为H或C₁-C₄的烷基，其可任选地被末端羟基或羧基取代；其中R₁为H或C₁-C₄的烷基且R₆为

或其中R₁和R₆使NR₁R₆成为氨基酸的氨基；R₇为H或C₁-C₄的烷基，其可被末端羟基或羧基取代；R₈为H或C₁-C₄的烷基；R₂和R₃各自独立地选自H、C₁-C₄的烷基、

磷酸基和其中OR₂或OR₃形成氨基酸的酯的基团；Y是OR₄或NR₄R₅，R₄和R₅各自独立地选自H和C₁-C₄的烷基；条件为R₉、R₂和R₃都不为H；或

一种所述化合物药学上可接受的盐。

在一些实施例中，所述前药可为具有下式的化合物：

其中X为OH或NR₁R₆，其中R₁为H或C₁-C₄的烷基且R₆为

或其中R₁和R₆使NR₁R₆成为氨基酸的氨基；R₇为H或C₁-C₄的烷基，其可被末端羟基或羧基取代；R₈为H或C₁-C₄的烷基；R₂和R₃各自独立地选自H、C₁-C₄的烷基、或

其中Y是OR₄或NR₄R₅，R₄和R₅各自独立地选自H和C₁-C₄的烷基；条件为当X为OH时，R₂和R₃都不为H；或

一种所述化合物药学上可接受的盐。

在一些实施例中，所述前药可为具有下式的化合物：

其中：

X可为OH或

R₁为H或烷基，例如C₁-C₄的烷基；

R₂和R₃可各自独立地选自H、C₁-C₄的烷基、

其中Y是OR₄或NR₄R₅，R₄和R₅各自独立地选自H和C₁-C₄的烷基，条件为当X为OH时，R₂和R₃都不为H；或一种其药学上可接受的盐。

C₁-C₄的烷基的示例可包括甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基或叔丁基。

末端羟基取代的C₁-C₄的烷基的示例可包括羟甲基；羟乙基；羟丙基；4-羟基丁基；2-甲基-3-羟基丙基。

末端羧基取代的C₁-C₄的烷基的示例可包括羧甲基、羧乙基、羧丙基、4-羧基丁基、2-甲基-3-羧基丙基。

在一些实施例中，X可为OH。在这种情况下，一些实施例中，R₂和R₃可各自独立地选自C₁-C₄的烷基。R₂和R₃可相同或不同。在一些情况下，R₂和R₃可以相同。例如，R₂和R₃都为乙基。同时在另一些情况下，R₂和R₃可能不同。例如，R₂可为甲基，R₃可为乙基，反之亦然。

在一些实施例中，当X为OH，R₂和R₃可各自独立地选自H和

在一些情况下，R₂和R₃中的一个可为同时另一个为H。在另一些情况下，R₂和R₃都可为相同或不同的

在一些实施例中，Y可为OR₄。在这种情况下，R₄可为H或C₁-C₄的烷基，例如甲基。在一些实施例中，Y可为NR₄R₅。在这种情况下，R₄和R₅可各自独立地选自H和C₁-C₄的烷基，例如甲基。在一些实施例中，R₄和R₅可以相同。例如，在一些实施例中，R₄和R₅都可为H或R₄和R₅都可为甲基。在一些实施例中，R₄和R₅可以不同。例如，R₄和R₅中的一个为H，而另一个为甲基。

在一些实施例中，当X为OH，R₂和R₃中的至少一个可为磷酸基。在一些情况下，R₂和R₃都可为磷酸基。在另一些情况下，R₂和R₃中的一个可为磷酸基而另一个为H。

在一些实施例中，当X为OH，R₂和R₃中的至少一个可为其中OR₂(或OR₃)形成氨基酸的酯的基团。在一些实施例中，R₂和R₃中的一个可为其中OR₂(或OR₃)形成氨基酸的酯的基团，而另一个可为H。例如OR₂可为形成氨基酸的酯，而R₃为H；或OR₃可为形成氨基酸的酯，而R₂为H。在一些实施例中，R₂和R₃可都为可形成氨基酸的酯。在一些情况下，OR₂和OR₃可为形成相同氨基酸的酯。在另一些情况下，OR₂为形成第一种氨基酸的酯，而OR₃为形成第二种氨基酸的酯，其与第一种氨基酸不同。

氨基酸可以为D-异构体氨基酸或L-异构体氨基酸。在一些实施例中，氨基酸可以为自然来源的氨基酸。在另一些实施例中，氨基酸可以为人造氨基酸。氨基酸的实施例包含但不限于氨基甲酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。当OR₂(OR₃)形成了氨基酸的酯，R₂(R₃)可有(R₄和R₅如上所定义)或

其中R₁₀选自氨基酸侧链基团，R₁₁和R₁₂可为H。在其中氨基酸为脯氨酸的实施例中，R₁₁和R₁₀一同形成了吡咯烷环结构，而R₁₂为H。R₁₀可为，例如，一种天然存在的氨基酸侧链，例如-CH₃(丙氨酸)、-(CH₂)₃HCNH₂NH(精氨酸)、-CH₂CONH₂(天冬酰胺)、-CH₂COOH(天冬氨酸)、-CH₂SH(半胱氨酸)、-(CH₂)₂CONH₂(谷氨酰胺)、-(CH₂)₂COOH(谷氨酸)、-H(甘氨酸)、-CHCH₃CH₂CH₃(异亮氨酸)、-CH₂CH(CH₃)₂(亮氨酸)、-(CH₂)₄NH₂(赖氨酸)、-(CH₂)₂SCH₃(甲硫氨酸)、-CH₂Ph(苯丙氨酸)、-CH₂OH(丝氨酸)、-CHOHCH₃(苏氨酸)、-CH(CH₃)₂(缬氨酸)，

-(CH₂)₃NHCONH₂(瓜氨酸)或-(CH₂)₃NH₂(鸟氨酸)。Ph表示苯基。

在一些实施例中，R₂和R₃各自为H。在这些情况下，一些实施例中，X可能为NR₁R₆。R₁可为H或C₁-C₄的烷基。R₆可为

R₇可为H或C₁-C₄的烷基，其可任选地被末端羟基或羧基取代，R₈可为H或C₁-C₄的烷基。在一些实施例中，R₁和R₆为使NR₁R₆为氨基酸的氨基。

在一些实施例中，R₁可为H。在这样的情况下,在一些实施例中，R₆可为

其中R₇可为H或C₁-C₄的烷基，其可任选地被末端羟基或羧基取代。

在一些实施例中，R₁可为H且R₆可为

其中R₈可为H或C₁-C₄的烷基，例如甲基或乙基。

在一些实施例中，当R₂和R₃各自为H时，NR₁R₆可形成为氨基酸的氨基，氨基酸可为如上讨论的氨基酸。NR₁R₆可为，例如，或在一些情况下，R₁可为H且R₁₀可为如上定义。当氨基酸为脯氨酸时，R₁和R₁₀可同时形成一个吡咯烷环结构。

在一些情况下，当R₂和R₃各自为H时，X可为OR₉，R₉可为C₁-C₄的烷基，其可任选地被末端羟基或羧基取代。当R₉为被末端羧基取代的C₁-C₄的烷基时，R₉可为羧甲基、羧乙基、羧丙基、4-羧基丁基和2-甲基-3-羧基丙基。

在一些实施例中，所述前药可为具有下式之一的化合物

与曲前列环素相比，除了或替代与施用曲前列环素或其盐相比减轻了局部疼痛以外，这些前药可能具有一种或多种优势。例如，这些前药中的一些可改善稳定性或在一些患者中有更大的耐受性。

以上前药中的至少一些在人体血浆中的半衰期可为150分钟以下或120分钟以下或90分钟以下或60分钟以下或50分钟以下或45分钟以下或40分钟以下或30分钟以下或20分钟以下或15分钟以下或12分钟以下或10分钟以下。

在一些实施例中，曲前列环素的前药具有的水溶解度平衡可为至少1mg/mL，或至少2mg/mL，或至少3mg/mL，或至少4mg/mL，或至少5mg/mL或至少6mg/mL。在一些实施例中，曲前列环素的前药具有的水溶解度平衡可为3至40mg/mL或3至35mg/mL或5至15mg/mL或任何在以上范围内的值或子范围。当测量溶解度的载体中的pH增加和/或一种或多种盐从载体中移除时，前药的溶解度会更大。

尽管FDA允许通过皮下施用

一些患者在施用后依旧会有局部疼痛的经历。尽管本发明没有与任何特定理论绑定，局部疼痛可能是由于曲前列环素本身存在于例如间甲酚的非活性成分，或曲前列环素与其他非活性成分结合造成的结果。图9报道了使用大鼠爪痛模型，t＝0、15分钟和90分钟由于局部疼痛受试大鼠的收回时间，其中大鼠被施用了下列中的一种：a)盐水，b)(Remodulin)的安慰剂制剂，其包含了柠檬酸盐缓冲剂，氯化钠和间甲酚，但不含有曲前列环素(在图9中以“以“前列环素(在图安慰剂”表示)；c)一种含Remodulin的制剂，包含的曲前列环素浓度为1μg/mL，其中含有曲前列环素、柠檬酸盐缓冲剂、氯化钠和间甲酚(在图9中以“曲前列环素浓1μg/mL”表示)；d)一种Remodulin的制剂，包含的曲前列环素浓度为100μg/mL，其中含有曲前列环素、柠檬酸盐缓冲剂、氯化钠和间甲酚(在图9中以“曲前列环素浓100μg/mL”表示)。图9中的竖形条表示了在施药后t＝0、15分钟和90分钟后受试大鼠在收到热刺激时收回爪子作为回应的快速程度。这些数据证明了受试大鼠对热刺激更敏感并且在制剂中含有曲前列环素的情况下更快的收回爪子，而Remodulin安慰剂(含有Remodulin的非活性成分而不含有曲前列环素)并没有提高他们的敏感度。

尽管本发明不受其操作理论的限制，但皮下给药期间的局部疼痛可能是由曲前列环素在注射部位与IP、DP和EP受体中的一个或多个结合导致的。曲前列环素可在三个功能位点与这些受体结合，其对应于分子上的三个羟基，参见例如Tsai and Wu,Eicosanoids,2(3):131-43(1989)。因此，曲前列环素的前药具有与曲前列环素的羟基结合的一或多个基团，或具有其他减少其与这些受体结合的改造，可以使其在施药部位对这些受体的吸引力低于曲前列环素的吸引力。

术语“曲前列环素的前药”(也可根据上下文称为“曲前列环素前药”或仅为“前药”)在本文中指的是所有施用后在人体内全部或部分转化为曲前列环素的曲前列环素的衍生物。曲前列环素的前药与曲前列环素相比可以降低在注射部位对IP、DP和EP受体的吸引力。在一些实施例中，“曲前列环素的前药”可以为曲前列环素衍生物，其具有一个或多个羟基的结构改造以使其与曲前列环素相比更低的对IP、DP和EP受体中的一种或多种的吸引力，而其在皮下施用和扩散至血液后在体内转化为活性曲前列环素。在一些实施例中，曲前列环素的前药完全或大体上在体内皮下空间以外，例如血流中，转化为曲前列环素。优选的前药包含以上式I所示的化合物。其他优选的曲前列环素前药包含曲前列环素的酰胺，碳酸酯或氨基甲酸酯。在一些实施例中，曲前列环素的前药施用后在体内超过50％、75％、85％、90％、95％、或98％转化为曲前列环素。在一些实施例中，转化在施用后15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、或3小时后发生。曲前列环素的前药包含这些前药药学上可接受的盐。

优选地，曲前列环素的前药在储存期间是稳定的，例如，通过在施用之前或初注射在注射部位时不在溶液中自发的水解为曲前列环素。优选地，本发明的前药制剂不含有曲前列环素或基本上不含游离酸形式的曲前列环素。在一些实施例中，少于10％、5％、2％、1％、或0.1％的曲前列环素的前药在定义的储存期间转化为曲前列环素。在一些实施例中，定义的储存期间可为1、2、3、6、或12个月。

曲前列环素前药在皮下施用时优选为与皮下施用Remodulin生物等效的。在一个实施例中，施用的前药提供的曲前列环素血浆浓度为皮下Remodulin的C_max和AUC的80-125％之间。参见例子http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/UCM377465.pdf.在另一个实施例中，C_max和AUC的值为皮下Remodulin的C_max和AUC水平的95％至105％。Remodulin优选以1.25ng/kg/min皮下注入，但是如果此初始计量由于副作用而不能被忍受，FDA批准的标签提供了降低输注速率至0.625ng/kg/min。

图8表示的是曲前列环素的血浆浓度的时间函数曲线。图8中的上下限分别对应的是75％和125％皮下施用Remodulin的血浆浓度，其代表了一个本发明前药靶向的生物等效血浆浓度优选的范围。图8为一种可能的皮下施用曲前列环素前药制剂的图，其符合在上下限，因此与皮下施用Remodulin的血浆浓度和一定时间范围内的曲前列环素血浆浓度生物等效。

公开的曲前列环素前药，例如酰胺、氨基甲酸酯和碳酸酯前药，可能具有一种或多种相对于常见酯类前药的优点，特别是在肠胃外施用包括皮下施用时。例如，公开的曲前列环素前药，例如酰胺、氨基甲酸酯和碳酸酯前药，可能相比常见酯类前药更稳定，后者可能具有水解倾向，从而在不期望时过早地转化为曲前列环素，例如在溶液里或在注射部位。

“药学上可接受的盐”包含了具有无机碱、有机碱、无机酸、有机酸或碱性或酸性氨基酸的盐。无机碱盐可以是钠或钾等碱金属盐；碱土金属盐如钙、镁、铝和氨盐。有机碱的盐可以是例如三甲胺、三乙胺、吡啶、甲基吡啶、乙醇胺、二乙醇胺和三乙醇胺。无机酸盐可以是例如盐酸盐、氢硼酸盐、硝酸盐、硫酸盐或磷酸盐。有机酸盐可以是例如下列酸之一的盐：甲酸、乙酸、三氟乙酸、富马酸、草酸、乳酸、酒石酸、马来酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸、甲磺酸、苯磺酸和对甲苯磺酸。碱性氨基酸的盐可以是例如精氨酸、赖氨酸或鸟氨酸的盐。酸性氨基酸的盐可以是例如天冬氨酸或谷氨酸的盐。

“肺动脉高压症”是指所有形式的肺动脉高压症，WHO第1-5组。动脉性肺动脉高压症也称为PAH，是指WHO第1组肺动脉高压症。PAH包括自发性的、遗传性的、药物或毒素诱导的和持续的新生儿肺动脉高压症(PPHN)。

本发明的曲前列环素前药可以以药物组合物的形式提供，其还可以包含药学上可接受的载体、赋形剂、粘合剂、稀释剂等。这种药物组合物可以通过本领域已知的方法制备，例如制粒、混合、溶解、包封、冻干、乳化或研磨过程等。组合物可以是例如颗粒、粉末、片剂、胶囊、糖浆、栓剂、注射剂、乳剂、酏剂、悬浮液和溶液的形式。该组合物可以配制成许多不同的施用途径，例如口服施用、透粘膜施用、直肠施用、透皮或皮下施用，以及鞘内、静脉内、肌肉内、腹膜内、鼻内、眼内或心室内注射。曲前列环素前药可以通过任何上述途径施用，例如以局部施用而不是全身施用，包括作为注射剂或作为持续释放制剂。

在一个实施例中，药物组合物可以包含曲前列环素的前药和载体，例如无菌水。在一些实施例中，曲前列环素的前药配制用于皮下施用，并且此类制剂可以包含或不包含间甲酚或另一种防腐剂。

对于口服、口腔和舌下施用，粉末、悬浮液、颗粒、片剂、丸剂、胶囊、软胶囊和囊片可作为固体剂型是可接受的。这些可以通过例如将一种或多种曲前列环素前药或其药学上可接受的盐与至少一种添加剂或赋形剂如淀粉或其它添加剂混合来制备。合适的添加剂或赋形剂可以是蔗糖、乳糖、纤维素糖、甘露醇、麦芽糖醇、葡聚糖、山梨糖醇、淀粉、琼脂、藻酸盐、几丁质、脱乙酰壳多糖、果胶、黄蓍胶、阿拉伯树胶、明胶、胶原蛋白、酪蛋白、白蛋白、合成或半合成聚合物或甘油酯、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素和/或聚乙烯吡咯烷酮。任选地，口服剂型可含有其它有助于给药的成分，例如无活性稀释剂，或润滑剂如硬脂酸镁，或防腐剂如对羟基苯甲酸酯或山梨酸，或抗氧化剂如抗坏血酸、生育酚或半胱氨酸、崩解剂、粘合剂、增稠剂、缓冲剂、甜味剂、调味剂或芳香剂。另外，可以添加染料或颜料用于识别。片剂可以用本领域已知的合适涂层材料进一步处理。

用于口服给药的液体剂型可以是药学上可接受的乳液、糖浆、酏剂、悬浮液、浆液和溶液的形式，其可以含有惰性稀释剂，例如水。药物制剂可以使用无菌液体制备成液体悬浮液或溶液，所述无菌液体例如但不限于油、水、醇和这些的组合。可以加入药学上合适的表面活性剂、悬浮剂、乳化剂用于口服或肠胃外给药。

如上所述，悬浮液可包括油类。这种油类包括但不限于花生油、芝麻油、棉籽油、玉米油和橄榄油。悬浮液制剂还可含有脂肪酸酯例如油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、脂肪酸甘油酯和乙酰化脂肪酸甘油酯。悬浮制剂可包括醇类例如但不限于乙醇、异丙醇、十六烷醇、甘油和丙二醇。醚类例如但不限于聚(乙二醇)、石油烃类如矿物油和凡士林；水也可用于悬浮液配方中。

可注射剂型通常包括含水悬浮液或油悬浮液，其可使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂制备。可注射形式可以是溶液相或悬浮液形式，可用溶剂或稀释剂制备。可接受的溶剂或载体包括无菌水、林格氏溶液或等渗盐水溶液。或者，无菌油也可用作溶剂或悬浮剂。优选地，油或脂肪酸是非挥发性的，包括天然或合成油、脂肪酸、甘油单酯、甘油二酯或甘油三酯。

对于注射剂，药物制剂可以是适合用如上所述的适当溶液重构的粉末。这些实施例包括但不限于冷冻干燥、旋转干燥或喷雾干燥的粉末，无定形粉末，颗粒，沉淀物或颗粒。对于注射剂，制剂可任选地含有稳定剂、pH调节剂、表面活性剂、生物利用度调节剂及其组合。可以配制化合物用于通过注射(例如通过推注或连续输注)进行肠胃外给药。用于注射的单位剂型可以是安瓿或多剂量容器。

除了上述那些代表性剂型外，药学上可接受的赋形剂和载体通常是本领域技术人员已知的，因此包括在本发明中。此类赋形剂和载体描述于例如，"RemingtonsPharmaceutical Sciences"Mack Pub.Co.,New Jersey(1991)中，其内容通过引用并入本文。

曲前列环素前药可以配制成适于胃肠外给药的制剂，其可以包含曲前列环素前药的无菌含水制剂或其药学上可接受的盐，其中制剂可以与预期接受者的血液等渗。这些制剂可以通过皮下注射给药，但也可以静脉内给药或通过肌肉内或皮内注射给药。这些制剂可以方便地通过将化合物与水或甘氨酸或柠檬酸盐缓冲液混合并使得到的溶液与血液无菌等渗来制备。本发明的可注射制剂基于前药中曲前列环素的重量可以含有0.1至5％w/v，并且可以以0.1ml/min/kg的速率施用。或者，基于前药中曲前列环素的重量本发明可以0.625至50ng/kg/min的速率给药。或者，基于前药中曲前列环素的重量本发明可以10至15ng/kg/min的速率给药。

在一些实施例中，用于肠胃外施用的制剂中曲前列环素前药的浓度，例如静脉内输注或皮下输注(包括连续皮下输注)，可以是0.0005至30mg/mL或0.0007至50mg/mL或来自0.001至15mg/mL或这些范围内的任何值或子范围。示例性浓度可包括0.1mg/mL、1mg/mL、2.5mg/mL、5mg/mL或10mg/mL。

在一些实施例中，用于肠胃外给药的曲前列环素前药制剂，例如静脉内输注或皮下输注(包括连续皮下输注)，可以通过将前药与载体(例如缓冲液)混合来制备。在某些实施例中，载体可以是含磷酸盐的载体，即至少一种磷酸盐，其可以是例如二元磷酸盐如磷酸氢二钠或磷酸氢二钾，或三元磷酸盐例如磷酸三钠或磷酸三钾。在某些实施例中，载体还可含有卤盐，例如氯盐，其可以是例如氯化钠或氯化钾。卤素盐如氯化钠可用于调节载体的张力。在某些实施方案中，优选磷酸盐和卤素盐具有相同的阳离子。例如，当磷酸盐是磷酸钠，例如磷酸三钠或磷酸三钠时，卤盐可以是钠卤素盐，例如氯化钠。类似地，当磷酸盐是磷酸钾，例如磷酸三钾或磷酸三钾时，卤素盐可以是钾卤化物盐，例如氯化钾。载体中的溶剂可含有水。在某些实施例中，水可以是载体中的唯一溶剂。然而在某些实施例中，除水之外，载体可以含有一种或多种另外的溶剂。在一些实施例中，另外的溶剂可以是防腐剂，例如间甲酚。

优选地，载体与例如人的患者的血液等渗。术语等渗可以意味着载体的渗透压和离子浓度与患者(例如人)的渗透压和离子浓度相匹配。载体的非限制性实施例包括磷酸盐缓冲盐水，其是含有磷酸氢二钠、氯化钠和在一些制剂中的氯化钾和磷酸二氢钾的水基盐溶液。其他实施例可包括含有20mM磷酸二钠和125mM氯化钠的载体和含有15mM磷酸三钠、125mM氯化钠和0.3％w/w间甲酚的载体。

在某些实施例中，可以皮下施用曲前列环素前药。在一些实施例中，皮下施用可以是连续皮下输注，例如通过输注泵连续皮下输注，其优选为便携式或可植入的。

在一些实施例中，曲前列环素前药可以基于前药中曲前列环素的重量以0.1至100ng/kg/min或0.2至70ng/kg/min或0.3至50ng/kg/min或0.6至10ng/的速率(剂量)皮下施用，或这些范围内的任何值或子范围。在一些实施例中，输注可以以初始速率(剂量)开始，其可以基于患者对初始速率(剂量)的响应而稍后增加或减少。例如，初始速率(剂量)可以是1.25ng/kg/min，其可以根据患者的耐受性以每周1.25ng/kg/min或每周2.5ng/kg/min的增量增加。如果患者由于例如副作用，例如，轻度至中度肝功能不全和/或头痛，而不能耐受初始速率(剂量)，则初始速率(剂量)可降低至0.625ng/kg/min。在患者对较低速率(剂量)产生耐受性之后，可以增加速率(剂量)。

曲前列环素前药可用于已知曲前列环素有效的一种或多种相同用途。例如，曲前列环素前药可用于给予受试者例如人，用于治疗可用曲前列环素治疗的疾病或病症，例如肺动脉高压症，包括动脉性肺动脉高压症和慢性血栓栓塞性肺动脉高压症。出于治疗目的，例如治疗肺动脉高压症，曲前列环素前药可以以治疗有效量给予受试者例如人，其为足够改善一种或多种可以用曲前列环素治疗的(例如肺动脉高压症)疾病或病症的症状。

曲前列环素前药可以用于治疗，包括细胞保护、减少细胞增殖、促进血管舒张和/或抑制血小板聚集。在一些实施例中，曲前列环素前药可用于治疗血管疾病，例如肺动脉高压症、心力衰竭(包括充血性心力衰竭)或外周血管疾病。曲前列环素前药可具有血管舒张作用，因此它们可用于治疗肺动脉高压症，其可以例如，由一种或多种形式的结缔组织疾病引起，例如狼疮、硬皮病或混合结缔组织疾病。

曲前列环素前药也可用于癌症、凝血障碍和炎性疾病。使用曲前列环素来抑制癌细胞的转移公开于US 2003-0108512和美国专利号6,803,386中，其均通过引用完全并入本文。

曲前列环素前药可根据图1-6中所示的方法制备，如下文实施例中所示。

反应式2说明了乙酰胺前药VII的合成。该合成可以从曲前列环素与NH₂CH₂COOBn反应形成受保护的如式

的醋酸合酰胺化合物开始。在一些实施例中，烷基例如C₁-C₄烷基(如甲基或乙基)，可以用于替代苄基。在这种情况下，其中R₄为烷基的NH₂CH₂COOR₄而非NH₂CH₂COOBn可用于与曲前列环素反应，同时形成受保护的醋酸合酰胺化合物。

然后可将受保护的醋酸合酰胺化合物转化为乙酰胺前药VII。在Bn的情况下，这种反应可能涉及使用Pd/C和H₂。在烷基(例如甲基或乙基)的情况下，受保护的醋酸合酰胺化合物可以与碱(例如NaOH或KOH)反应，以转化为乙酰胺前药VII。

图6说明了下式的起始化合物的合成：

其中P₁可以是羟基保护基，如2-四氢吡喃基(THP)或甲硅烷基保护基，如叔丁基二甲基甲硅烷基酯(TBDMS/TBS)、三甲基甲硅烷基(TMS)、三乙基甲硅烷基(TES)、叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)和三异丙基甲硅烷基(TIPS)。该化合物可用作合成几种曲前列环素前药的重要起始化合物。图6中的方法对应于美国专利号8,940,930中的反应式2的前五个反应，其全文并入本文。除了图6中公开的方法之外，起始化合物也可以通过例如使用美国专利号6,756,117和6,809,223中公开的方法合成。起始化合物的合成可以开始于下式的化合物：

其中P₀是羟基保护基，如苄基或取代的苄基。取代的苄基可以在一个或多个间位，邻位或对位被一个或多个取代基任选取代，所述取代基可以独立地选自-NO₂、-CN、卤素(例如-F、-Cl、-Br或-I)、(C₁-C₃)烷基、卤代(C₁-C₃)烷基、(C₁-C₃)烷氧基和卤代(C₁-C₃)烷氧基。此化合物可以与

在(+)-N-甲基麻黄碱或Zn(OTf₂)/Et₃N存在下反应，或者使用(1S,2S)-3-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)-2-N,N-二甲基氨基-L-(对硝基苯基)-丙烷-1-醇形成下式的化合物

然后可以使用美国专利号6,940,930中公开的反应将该化合物转化为关键的起始化合物。

下式的起始化合物

可用于合成曲前列环素的环戊基环前药，即X为OH且R₃为H的化合物，或曲前列环素的侧链前药，即X为OH且R₂为H的化合物。环戊基环前药的合成如图1和3所示，侧链前药的合成如图2和4所示。

用于合成环戊基环前药的起始化合物如下式

可以转化为下式的双重保护化合物：

其中P₀是羟基保护基，如苄基、取代的苄基或烷基，如C₁-C₄烷基，包括甲基和乙基。例如，下式的中间体化合物

可以与

反应而生成双重保护化合物

双重保护化合物

可以转化为双重保护前药化合物如下式其中R₂可以为

其中Y为OR₄或NR₄R₅，R₄和R₅都各自独立地选自H和C_1-4烷基，或Y为Cl、Br或OCCl₃。可通过将双重保护化合物与

反应来实现，其中Z为Cl、Br或OCCl₃。例如，当R₂为

时，双重保护的化合物可以与

反应而生成对应的双重保护的前药化合物。当R₂为

时，双重保护的化合物可以与

或混合物Cl₃CO-C(＝O)-OCCl₃/HN(CH₃)-CH₃反应而生成对应的双重保护前药化合物。

之后P₀和P₁保护基均可用H代替以使羧基的羟基和侧链的羟基脱保护。在一些实施例中，例如图1中所示的实施例，羧基的羟基和侧链的羟基的脱保护(P₀和P₁各自地取代)可以在单一反应中进行。然而在一些其他实施例中，羧基的羟基和侧链的羟基在两个单独的反应中脱保护。在某些情况下，如图3所示，可以首先将侧链的羟基脱保护，然后对羧基的羟基进行脱保护。然而在一些其他情况下，羧基的羟基可首先脱保护，然后侧链羟基脱保护。侧链羟基的脱保护可以在路易斯酸(例如MgBr₂)、铜盐(例如硫酸铜)、酸性树脂(例如琥珀酸)、无机酸(例如HCl和H₂SO₄)的存在下进行。羟基保护基团的脱保护公开于《Green’sprotecting groups in organic synthesis》ISBN 978-0-471-69754-1,4th edition,2007,page 62；John Wiley and Sons)。羧基的羟基的脱保护可以通过例如在钯碳催化剂、氧化铂和氢气中的一种或多种的存在下进行。

用于合成侧链前药的起始化合物

可以转化为下式的三重保护的三醇化合物

其中P'₀和P₂可以是相同或不同的羟基保护基，其可以是例如甲硅烷基保护基例如叔丁基二甲基甲硅烷基酯(TBDMS/TBS)、三甲基甲硅烷基(TMS)、三乙基甲硅烷基(TES)、叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)、三异丙基甲硅烷基(TIPS)。在一些实施例中，可优选使P'₀和P₂相同。例如，在图2和4中，关键中间体化合物与TBDMSCl反应形成三重保护的三醇化合物，P'₀和P₂均为TBDMS。

之后可通过使共轭环的羟基脱保护将三重保护的三醇化合物转化为下式的双重保护的三醇化合物

这种转化可以在含Li化合物的存在下进行，例如LiOAc或LiOH。

之后可将双保护的三醇化合物转化为下式的三重保护的羧酸化合物

其中P₀为羟基保护基团，例如苄基或取代的苄基。双重保护的三醇化合物可以通过与反应而转化为三重保护的羧酸化合物。

然后可将三重保护的羧酸化合物通过侧链羟基脱保护转化为下式的双重保护的羧酸化合物：

侧链羟基的脱保护可以在路易斯酸(例如MgBr₂)、铜盐(例如硫酸铜)、酸性树脂(例如琥珀酸)、无机酸(例如HCl和H₂SO₄)的存在下进行。羟基保护基团的脱保护在《Green's organic groups in organic synthesis》ISBN978-0-471-69754-1,4^th edition,2007,page 62；John Wiley and Sons中公开。

然后可将双重保护的羧酸化合物转化为下式的双重保护的前药化合物：

其中R₃可为

其中Y为OR₄或NR₄R₅，R₄和R₅都各自独立地选自H和C_1-4烷基，或Y为Cl、Br或OCCl₃。其可以通过使双重保护的羧酸化合物与

反应完成，其中Z为Cl、Br或OCCl₃。例如，当R₃为

时，双重保护的羧酸化合物可以与

反应而生成对应的双重保护前药化合物。当R₃为

时，双重保护的化合物可以与或混合物Cl₃CO-C(＝O)-OCCl₃/HN(CH₃)-CH₃反应而生成对应的双重保护前药化合物。

双重保护的前药化合物可以通过环戊基环的羟基和羧基的羟基的脱保护转化为侧链前药

环戊基环的羟基和羧基的羟基的脱保护可以在单个反应或两个单独的反应中进行。在后一种情况下，环戊基环的羟基的脱保护可以在羧基的羟基的脱保护之后或之前进行。在图2和4中，环戊基环的羟基的脱保护和羧基的羟基的脱保护作为两个单独的反应进行，后者在前者之后。羧基的羟基的脱保护可以在钯、碳、铂的氧化物和氢气中的一种或多种的存在下进行。环戊基环的羟基的脱保护可以在四正丁基氟化铵(TBAF和n-Bu₄NF)或无机酸如HCl或H₂SO₄的存在下进行。

曲前列环素氨基酸酰胺前药例如前药J、K、L或M，可以通过使曲前列环素与受保护的氨基酸反应来制备，所述受保护的氨基酸是其羧基中的氢被例如苄基的羟基保护基团取代的氨基酸。作为这种反应的结果，可以形成受保护的氨基酸酰胺前药。然后可以从受保护的氨基酸酰胺前药中除去羟基保护基团，形成曲前列环素氨基酸酰胺前药，例如前药J、K、L或M。

本文描述的实施例通过以下加工实施例进一步说明，但决不限于此。

加工实施例

实施例1

氨基甲酸酯类曲前列环素前药的合成

反应式1：氨基甲酸酯类曲前列环素前药的合成

单-TES苄酯曲前列环素的合成(2a和2b)

向曲前列环素苄酯(1)(100g，20.80mmol)在二氯甲烷(DCM)(200mL)的溶液中加入咪唑(1.41g，20.80mmol)和4-二甲基氨基吡啶(0.25g，2.08mmol)。在氩气环境下边搅拌边使用注射器向混合物中加入氯硅烷(3.5mL，20.80mmol)。一小时后用TLC(注1)检验反应完成。反应用水(150mL)淬灭，分离有机层，用盐水洗涤(100mL)，硫酸钠干燥然后真空浓缩，得到粗产物。粗产物用乙酸乙酯：己烷(0-11％)作为流动相，通过柱色谱法纯化，得到单保护化合物2a(RD-UT-1160-185-I，6.68g)产率54.04％，与2b(RD-UT-1160-185-III，0.48g)产率3.88％。纯产物用¹H NMR表征。

注1：使用硅胶TLC监控反应进程，20％乙酸乙酯:己烷作为流动相。

合成侧链氨基甲酸酯曲前列环素前药的实验(5a)

TES侧链氨基甲酸酯苄酯(3a)的合成：

向在15mL甲苯中的曲前列环素单-TES苄基酯(2a)(0.5g，0.841mmol)溶液中加入吡啶(0.14mL，1.682mmol)并在氩气下搅拌。在0.5小时内向其中逐滴加入冰冷的三光气溶液(0.37g，1.261mmol)的甲苯(12mL)溶液。继续搅拌0.5小时后，用TLC检验反应完成(注1)。将滴液漏斗中装入二甲胺溶液(2.0M的THF溶液)(6.0mL)并在0.5小时内加入到反应液中。继续搅拌1小时后，用TLC检验反应完成(注1)。用水(20mL)淬灭反应。分离有机层，水层用MTBE(2TBE应。)萃取。合并有机层，用盐水洗涤(20mL)，硫酸钠干燥，真空浓缩后得到粗产物。用乙酸乙酯：己烷(0-12％)作为流动相，通过柱色谱法纯化，得到纯的TES侧链氨基甲酸苄酯(3a)(RD-UT-1160-188,0.32g)和不纯产物(RD-UT-1160-188-Fr-22-23,0.20g)，总产率93.4％。纯产物用¹H NMR表征。

注1：使用硅胶TLC监控反应进程，30％乙酸乙酯:己烷作为流动相。

侧链氨基甲酸苄酯(4a)的合成：

向TES侧链氨基甲酸苄酯(3a)(0.295g,0.443mmol)在THF(20mL)和水(4mL)的溶液中加入2N HCl溶液(0.22mL,0.443mmol)。将其在室温下搅拌1小时，直到TLC检测反应的完成(注1)。此反应液用乙酸乙酯(2x40mL)萃取之后合并有机层，用水(20mL)和盐水(20mL)洗涤，用硫酸钠干燥并真空旋干，得到粗产物。用使用乙酸乙酯:己烷(0-40％)作为流动相，通过柱色谱法分离纯化得到侧链氨基甲酸苄酯(4a)(RD-UT-1160-194，0.26g)，产率为106.5％(含有溶剂残留)。纯产物用¹H NMR和¹³C NMR表征。

注1：使用硅胶TLC监控反应进程，60％乙酸乙酯:己烷作为流动相。

侧链氨基甲酸苄酯曲前列环素前药(5a)的合成：

向侧链氨基甲酸酯苄酯(4a)(0.25g，0.443mmol)的乙酸乙酯(15mL)溶液中加入钯碳(25mg)，用真空抽空反应体系，并在气囊压力下用氢气置换。将其在室温下搅拌6小时，用TLC检验反应完成(注1)。将反应液通过硅藻土过滤，并将滤液真空浓缩，得到侧链氨基甲酸酯曲前列环素前药(5a)(0.18g)(RD-UT-1160-198)，产率86.1％，化学纯度98.62％(HPLC)。纯产物用¹HNMR、¹³CNMR、IR和LC-MS表征。

注1：使用硅胶TLC监控反应进程，60％乙酸乙酯:己烷作为流动相。

合成环戊基氨基甲酸酯曲前列环素前药(5b)的实验

TES环戊基氨基甲酸酯苄酯(3b)的合成：

向曲前列环素单-TES苄基酯(2b)(0.45g，0.757mmol)的甲苯(15mL)溶液中加入吡啶(0.12mL，1.513mmol)并在氩气下搅拌。在1小时内向其中逐滴加入冰冷的三光气溶液(0.33g，1.135mmol)的甲苯(15mL)溶液。再搅拌1小时后，用TLC检验反应完成(注1)。将滴液漏斗中装入二甲胺溶液(2.0M的THF溶液)(6.0mL)并在0.5小时内加入到反应液中。再搅拌1小时后，用TLC检验反应完成(注1)。用水(20mL)淬灭反应。分离有机层，水层用MTBE(2TBE应。)萃取。合并的有机层用盐水洗涤(20mL)，用硫酸钠干燥和真空浓缩得到粗产物。用乙酸乙酯：己烷(0-14％)作为流动相，通过柱色谱法纯化，得到纯TES环戊基氨基甲酸酯苄酯(3b)(RD-UT-1160-195,0.44g)，产率为87.5％。纯产物用¹H NMR表征。

注1：使用硅胶TLC监控反应进程，30％乙酸乙酯:己烷作为流动相。

环戊基氨基甲酸苄酯(4b)的合成：

向TES环戊基氨基甲酸酯苄基酯(3b)(0.42g，0.631mmol)的THF(12mL)和水(3mL)溶液中加入2N HCl水溶液(0.31mL，0.631mmol)。将其在室温下搅拌1小时，直到TLC显示反应完成(注1)。将该反应液用乙酸乙酯(2。将该反应)萃取，并将合并的有机层用盐水洗涤(20mL)，用硫酸钠干燥和真空浓缩得到粗产品。用乙酸乙酯：己烷(0-40％)作为流动相，通过柱色谱法纯化两次，得到纯的环戊基氨基甲酸酯苄酯(4b)(RD-UT-1160-205，0.32g)产率为93.4％。纯产物用¹H NMR和¹³C NMR表征。

注1：使用硅胶TLC监控反应进程，60％乙酸乙酯:己烷作为流动相。

环戊基氨基甲酸酯曲前列环素前药的合成(5b)

向环戊基氨基甲酸酯苄酯(4b)(0.31g，0.562mmol)在15mL乙酸乙酯中的溶液中加入钯碳(30mg)，用真空抽空反应体系，并在气囊压力下用氢气置换。将其在室温下搅拌6小时，用TLC检验反应完成(注1)。将反应液通过硅藻土过滤和真空浓缩，得到环戊基氨基甲酸酯曲前列环素前药(5b)(0.24g)(RD-UT-1160-198)产率92.6％，化学纯度99.39％(HPLC)。纯产物用¹H NMR、¹³C NMR、IR和LC-MS表征。

注1：使用硅胶TLC监控反应进程，60％乙酸乙酯:己烷作为流动相。

实施例2

羟基乙酰胺曲前列环素前药(前药VII)的合成

讨论：

已开发出了两种合成羟基乙酰胺曲前列环素前药的方法(反应式2)：第一种，通过曲前列环素(UT-15)和甘氨酸甲酯的反应，得到酰胺中间体酰胺I，然后进行NaOH水解；第二种，通过UT-15与甘氨酸对甲苯磺酸苄基酯反应形成酰胺中间体酰胺II，然后氢化。第一种途径涉及水解步骤的强碱性条件，并引起酯键和酰胺键的水解，从而导致UT-15的形成。第二种途径涉及到用于酰胺II的脱苄基化的非碱性氢解，并提供没有任何酰胺键裂解的纯净的所需产物，并且不会导致UT-15形成。最后，第二种途径用于制备曲前列环素的羟基乙醇酰胺前药(前药VII)。

反应式2：羟基乙酰胺前药的合成

步骤1：酰胺II的合成

在氩气下向装有磁力搅拌棒的50mL圆底烧瓶中加入UT-15(0.5g，1.28mmol)的无水DCM(20mL)溶液。在室温和氩气下向该溶液中加入Bop-Cl(0.49g，1.92mmol)，接着加入甘氨酸对甲苯磺酸苄基酯(0.43g，1.28mmol)。将反应液搅拌20分钟，然后加入三乙胺(0.39g，3.84mmol)。将反应液搅拌过夜直至反应完成。使用TLC检查反应进程。用0.1N HCl(10mL)淬灭反应，分离DCM层，用10％NaHCO₃(10mL)、水(10mL)和盐水(10mL)洗涤，用无水Na₂SO₄干燥，过滤并真空浓缩得到粗产物(0.9g，RD-UT-1161-101)。在硅胶上使用30-60％乙酸乙酯/己烷的梯度溶剂纯化粗产物，得到纯产物(酰胺II)(0.396g，RD-UT-1161-101B)。用¹H NMR表征该化合物。

步骤2：羟基乙酰胺前药的合成(前药VII)

向装有磁力搅拌棒的50mL圆底烧瓶中加入酰胺II(250mg，0.465mmol)的乙醇(30.0mL)溶液。将反应液用氩气抽空三次，然后加入5％Pd-C(75mg)并用H₂置换氩气三次。用气囊将反应液用H₂加压并在室温下放置。将反应液搅拌1小时，使用TLC(EtOAc)检查反应进程。使反应液通过硅藻土垫，并用乙醇(50mL)洗涤。将合并的乙醇溶液真空浓缩，得到产物羟基乙酰胺(191mg，RD-UT-1161-121)，为白色泡沫。通过¹H NMR，¹³C NMR，IR和MS表征该化合物。HPLC纯度为98.77％，未观察到游离的UT-15。

实施例3

曲前列环素前药：侧链和环戊基甲基碳酸酯曲前列环素的合成

侧链甲基碳酸酯曲前列环素前药(左)和环戊基甲基碳酸酯曲前列环素(右)如上所示。

反应式3：侧链甲基碳酸酯曲前列环素(6)的合成

反应式4：环戊基甲基碳酸酯曲前列环素(9)的合成

实验：

单-TES保护的曲前列环素苄酯(2和3)的合成

在室温下，向曲前列环素苄酯(1)(5.06g，10.53mmol)的无水二氯甲烷(100mL)溶液中加入咪唑(0.72g，10.57mmol)和4-(二甲基氨基)吡啶(DMAP)(0.13g，1.06mmol)。在氩气下，在1小时内向该澄清溶液中滴加三乙基氯硅烷(1.59g，1.77mL，10.55mmol)的无水二氯甲烷(30mL)溶液。滴加完成后，将反应物搅拌4.5小时，用TLC检测(乙酸乙酯/己烷，1：4)。反应液用水(50mL)淬灭，分离出二氯甲烷层。二氯甲烷层用水(1淬灭，mL)和盐水洗涤(1和盐水洗涤)，干燥(Na₂SO₄)，过滤并真空浓缩，得到浅黄色粘稠液体(6.95g)(批号D-1166-160)。粗产物在硅胶(265g)上用己烷中的乙酸乙酯(2-20％)色谱分离得到二-TES保护的曲前列环素苄酯(1.59g，批号D-1166-160-A)、环戊基-TES保护的曲前列环素苄酯(2)(2.95g，批号D-1166-160-B)和侧链-TES保护的曲前列环素苄酯(3)(0.55g，批号D-1166-160-D)。两种单-TES保护的化合物(2和3)通过光谱数据(IR，¹H NMR和MS)表征。

环戊基-TES侧链甲基碳酸酯曲前列环素苄酯(4)的合成

在氩气下，向环戊基-TES保护的曲前列环素苄酯(2)(0.84g，1.41mmol)的无水吡啶(4.0mL)溶液中在0℃至5℃下经5分钟的时间滴加氯甲酸甲酯(1.33g，1.09mL，14.1mmol)的无水二氯甲烷溶液(4.0mL)。加完后，将反应液在0℃至室温下搅拌过夜。20小时后，通过TLC(EtOAc/己烷，1：4)检查反应液并完成反应。将混合物用水(20mL)处理，然后用二氯甲烷(3处理，然后)萃取。合并的二氯甲烷萃取液用水(1萃取。合并)，盐水(1，盐水(并)洗涤，干燥(Na₂SO₄)，过滤并真空浓缩，得到粗产物，为浅粉红色粘稠液体(0.88g)(批号#D-1166-189)。将粗产物在硅胶(35g)柱上色谱分离，用乙酸乙酯的己烷溶液(2-10％)洗脱，得到环戊基-TES侧链甲基碳酸酯曲前列环素苄酯(4)，为淡黄色粘稠液体(0.69g)(批号#D-1166-189-B)。纯化合物通过光谱数据(IR，¹H NMR，¹³C NMR和MS)表征，其纯度(94.58％，AUC)通过HPLC测定。

侧链甲基碳酸酯曲前列环素苄酯的合成(5)

向环戊基-TES侧链甲基碳酸酯曲前列环素苄酯(4)(0.307g，0.470mmol)在四氢呋喃(10mL)和水(2mL)的混合物中的溶液(THF：H₂O＝5：1)在室温下加入1N盐酸(0.71mL，0.71mmol)。将反应液在室温下搅拌30分钟并用TLC检测(EtOAc/己烷，3：7)。反应完成后将混合物用饱和碳酸氢钠(1mL)中和至pH 7-8，然后用水(10mL)稀释。用MTBE(3TBE用()萃取混合物。将合并的MTBE萃取液用水(2取液用水()和盐水(1水(用水()洗涤，干燥(Na₂SO₄)，过滤并真空浓缩，得到澄清的粘稠液体(0.37g)(批号#D-1166-203)。将来自其他反应的粗产物(0.031g)(批号#D-1166-201)与该批次合并用于纯化。将合并的粗产物用乙酸乙酯的己烷溶液(5-30％)在硅胶(16g)柱上色谱分离，得到侧链甲基碳酸酯曲前列环素苄酯(5)，为透明粘稠液体(0.252g)(批号#D-1166-203-B)。纯净化合物通过光谱数据(IR，¹H NMR，¹³CNMR和MS)和HPLC测量的纯度(99.83％，AUC)表征。

侧链甲基碳酸酯曲前列环素的合成(6)

向侧链甲基碳酸酯曲前列环素苄酯(5)(0.23g，0.427mmol)的乙酸乙酯(10mL)溶液中加入钯碳(5wt％，50％湿度)(0.12g)。将混合物搅拌并在室内真空下抽空，用(气囊中的)氢气代替。该过程重复三次。在氢气环境下，将混合物在室温搅拌2小时并用TLC检测(EtOAc/己烷，3：7和EtOAc，100％)。反应完成。将反应液用硅藻土(1.0g)处理，并在一次性聚乙烯玻璃料的No.50Whatman过滤器中通过硅藻土垫(2.0g)过滤，并用乙酸乙酯(3过滤，并用)洗涤固体。将合并的乙酸乙酯滤液真空浓缩，得到侧链甲基碳酸酯曲前列环素(6)，为灰白色泡沫状固体(0.188g)(批号#D-1166-206)。化合物被光谱数据(IR，¹H NMR，¹³C NMR和MS)和HPLC测量的纯度(99.64％，AUC)充分表征。

侧链-TES环戊基甲基碳酸酯曲前列环素苄酯的合成(7)

在0℃至5℃的氩气下，5分钟内向侧链-TES保护的曲前列环素苄酯(3)(0.28g，0.47mmol)的无水吡啶(2.0mL)溶液中滴加氯甲酸甲酯(0.44g，0.36mL，4.66mmol)的无水二氯甲烷溶液(2.0mL)。完成滴加后，将反应液从0℃搅拌至室温过夜。17小时后，使用TLC(EtOAc/己烷，1：4)检查反应液与反应完成。将混合物用水(10mL)和MTBE(15mL)处理。分离有机层并用水(2处理。分离)，5％柠檬酸(2柠檬酸(离)，水(1，水((离)，盐水(1，盐水()洗涤，干燥(Na₂SO₄)，过滤并真空浓缩，得到侧链-TES环戊基甲基碳酸酯曲前列环素苄酯(7)，为浅黄色粘稠液体(0.285g)(批号#D-1166-187)。化合物用光谱数据(IR，¹H NMR，¹³C NMR和MS)和HPLC测得的纯度(74.27％，AUC)表征。

环戊基甲基碳酸酯曲前列环素苄酯的合成(8)

向侧链-TES环戊基甲基碳酸酯曲前列环素苄酯(7)(0.27g，0.413mmol)在四氢呋喃(10mL)和水(2mL)(THF：H₂O＝5：1)中的溶液在室温下加入1N盐酸(0.62mL，0.62mmol)。将反应液在室温下搅拌20分钟并TLC检测(EtOAc/己烷，1：4和3：7)。反应完成后将混合物用饱和碳酸氢钠(1mL)中和至pH 7-8，然后用水(10mL)稀释。用MTBE(3TBE用()萃取混合物。将合并的MTBE萃取液用水(2取液用水()，盐水(1，盐水(()洗涤，干燥(Na₂SO₄)，过滤并真空浓缩，得到澄清的粘稠液体(0.24g)(批号D-1174-001)。将粗产物用乙酸乙酯的己烷溶液(5-30％)在硅胶(18g)柱上色谱分离，得到环戊基甲基碳酸酯曲前列环素苄酯(8)，为透明粘稠液体/白色半固体(0.19g)(批号#D-1174-001-B)。化合物用光谱数据(IR，¹H NMR，¹³C NMR和MS)和HPLC测得的纯度(98.45％，AUC)表征。

环戊基甲基碳酸酯曲前列环素的合成(9)

向环戊基甲基碳酸酯曲前列环素苄酯(8)(0.16g，0.297mmol)的乙酸乙酯(10mL)溶液中加入钯碳(5wt％，50％湿)(0.08g)。将混合物搅拌并在室内真空下抽空后用(气囊中的)氢气代替。该过程重复三次。将混合物在室温下在氢气环境下搅拌2小时并检查TLC(EtOAc/己烷，3：7和EtOAc，100％)。反应完成。将反应液用硅藻土(1.0g)处理，并在一次性聚乙烯玻璃料的No.50Whatman过滤器中通过硅藻土垫(2.0g)过滤，并用乙酸乙酯(3并用乙酸乙)洗涤固体。将合并的乙酸乙酯滤液真空浓缩，得到环戊基甲基碳酸盐曲前列环素(9)，为白色粘稠液体/半固体(0.138g)(批号#D-1174-004)。化合物被光谱数据(IR，¹H NMR，¹³CNMR和MS)和HPLC测量的纯度(98.97％，AUC)充分表征。

实施例4

曲前列环素及其前药的体外受体活性

使用细胞周期蛋白(cyclin adenosine)一磷酸腺苷(cAMP)测定法测试前药I、II、III、IV、VII和IX(其结构参见图7和39)以及曲前列环素的3G-蛋白偶联受体(GPCR)，即DP1、EP2和IP。

材料。细胞和对照激动剂：研究中使用的细胞和对照激动剂总结于表1中。

物种	对象	亲本	编录#	测定	对照激动剂
						人类	DP1	HEK293T	C1200	cAMP	PGD2
人类	EP2	HEK293T	C1202	cAMP	伊洛前列素
						人类	IP1	CHO-K1	C1206-1	cAMP	伊洛前列素

表1：研究中所用的细胞系及对照激动剂

化合物以粉末形式提供。将化合物在DMSO中以10mM的浓度重建。

环AMP测定试剂盒：HTRF cAMP HiRange试剂盒(CisBio，Cat#62AM6PEC)。

仪器：FlexStation III(Molecular Devices)。

方法

环AMP(cAMP)测定：使用CisBio的HTRF cAMP HiRange Kit，根据制造商的方案进行cAMP测定。对于激动模式的Gs通路测定，将细胞与化合物在384孔板中于37℃温育20分钟。通过在裂解缓冲液中依次加入D2标记的cAMP和穴状化合物标记的抗cAMP抗体终止反应。然后将板在室温下温育60分钟，然后在620nm和668nm使用FlexStation III(MolecularDevices)读取314nm激发的荧光辐射。

数据分析

环AMP(cAMP)测定：环AMP测定结果展示在“比率668/620“比率Devic(668nm和620nm20“比率De的荧光比)。图中的数据以平均值±荧光表示。剂量依赖性反应符合S形剂量-反应曲线，使用GraphPad Prism版本4,5或6(Graphpad Prism)的可以改变斜率。

结果

所有化合物和对照激动剂在DP1、EP2和IP1受体表达细胞中显示出剂量反应活性。由剂量依赖性反应确定的EC₅₀(得到反应最大值一半的药物浓度)值列于表2中。

表2：对于曲前列环素和其前药的受体活性(EC₅₀，M)

表2中的数据表明，每种研究中的前药对于DP1、EP2和IP1的影响明显低于曲前列环素。尽管本发明不受其操作理论的限制，但在皮下施用曲前列环素期间观测到的局部疼痛可能是由于曲前列环素影响皮下组织中的IP受体、DP受体和EP受体一种或多种。由于研究中的前药对于每种IP受体、DP受体和EP受体的影响都不如曲前列环素有效，这些前药在皮下给药时可引起较少的局部疼痛。

实施例5

前药XV作用于人类G蛋白偶联受体的评测

使用细胞周期蛋白(cyclin adenosine)一磷酸腺苷(cAMP)测定法测试前药XV(其结构参见图10)以及曲前列环素的3G-蛋白偶联受体(GPCR)，即DP1，EP2和IP。

材料。细胞和对照激动剂：研究中使用的细胞和对照激动剂总结于表1中。

化合物为以粉末形式提供的2种化合物。化合物在DMSO中以10mM的浓度重建。

环AMP测定试剂盒：Multiscreen^TMTR-FRET cAMP 1.0无洗涤测定试剂盒(Multispan，Inc.，Cat#MSCM01-25)和HTRF cAMP HiRange试剂盒(CisBio，Cat#62AM6PEC)。仪器：FlexStation III(Molecular Devices)。

方法

环AMP(cAMP)测定：使用Multiscreen^TMTR-FRET cAMP 1.0无洗涤测定试剂盒或HTRF cAMP HiRange Kit，根据制造商的方案进行cAMP测定。对于激动模式测试，在加入毛喉素之前，将细胞与客体化合物在室温下预孵育5分钟，然后将培育板在37℃下孵育20分钟。通过向裂解缓冲液中依次添加trFluor^TMEu标记的cAMP和trFluor^TM650标记的抗cAMP抗体或D2标记的cAMP和穴状化合物标记的抗cAMP抗体终止反应。然后将培育板在室温下温育60分钟，然后在620nm和665或668nm使用FlexStation III(Molecular Devices)读取在314nm激发的荧光辐射。

数据分析

环状AMP(cAMP)测定：环状AMP测定结果在“比率665/620x10,0000(665nm和620nm的荧光比率×荧光比000)或“比率668/620x10,000s(668nm和620nm的荧光比率×荧光比率20)中表示。图中的数据以平均值±图中表示。剂量依赖性反应符合S形剂量-反应曲线，使用GraphPad Prism版本4,5或6(Graphpad Prism)可变斜率。

结果和讨论

所有3种GPCR的对照激动剂具有预期的EC50b(得到反应最大值一半的药物浓度)值，在受体表达细胞中显示出剂量依赖性刺激。所有化合物和对照激动剂在表达DP1、EP2和IP1受体的细胞中显示出剂量反应活性。由剂量依赖性反应决定的EC50值示于表3中。

表3

化合物	IP受体	EP受体	DP受体
				曲前列环素	7.79X10<sup>-11</sup>	5.37X10<sup>-10</sup>	7.80X10<sup>-11</sup>
前药XV	4.28X10<sup>-9</sup>	4.15X10<sup>-8</sup>	6.99X10<sup>-9</sup>

总结

表3中的数据表明，前药XV对DP1、EP2和IP1的效力对比曲前列环素显著降低。尽管本发明不受其操作理论的限制，但在皮下施用曲前列环素期间观察到的局部疼痛可能是由曲前列环素对皮下组织中的IP受体、DP受体和EP受体的一种或多种的影响引起的。因为前药XV对于IP受体、DP受体和EP受体各自地效力低于曲前列环素，所以当皮下给药时它可能引起较少的局部疼痛。

实施例6

前药XIV作用于人类G蛋白偶联受体的评测

使用细胞周期蛋白(cyclin adenosine)一磷酸腺苷(cAMP)测定法测试曲前列环素前药XIV(其结构参见图10)以及曲前列环素的3G-蛋白偶联受体(GPCR)，即DP1，EP2和IP。

材料。细胞和对照激动剂：研究中使用的细胞和对照激动剂总结于表1中。

化合物为粉末形式提供的两种化合物。化合物在DMSO中以10mM的浓度重建。

环AMP测定试剂盒：Multiscreen^TMTR-FRET cAMP 1.0无洗涤测定试剂盒(Multispan，Inc.，Cat#MSCM01-25)和HTRF cAMP HiRange试剂盒(CisBio，Cat#62AM6PEC)。仪器：FlexStation III(Molecular Devices)。

方法

环AMP(cAMP)测定：使用Multiscreen^TMTR-FRET cAMP 1.0No Wash Assay Kit或HTRF cAMP HiRange Kit，根据制造商的方案进行cAMP测定。对于激动模式测试，在加入毛喉素之前，将细胞与客体化合物在室温下预孵育5分钟，然后将板在37℃下孵育20分钟。通过依次将trFluor^TMEu标记的cAMP和trFluor^TM650标记的抗cAMP抗体或D2标记的cAMP和穴状化合物标记的抗cAMP抗体添加到裂解缓冲液中来终止反应。然后将培育板在室温下温育60分钟，然后在620nm和665或668nm使用FlexStation III(Molecular Devices)读取314nm激发的荧光辐射。

数据分析

环状AMP(cAMP)测定：环状AMP测定结果显示为“比率665/620x10,000s(665nm和620nm的荧光比率×荧光比率×光)或“比率668/620x10,000s(荧光比率为668)nm和620nm为0x10)。图中的数据以平均值±。图表示。剂量依赖性反应符合S形剂量-反应曲线，使用GraphPad Prism版本4,5或6(Graphpad Prism)可变斜率。

结果讨论

所有3种GPCR的对照激动剂具有预期的EC50(得出半数最大反应的药物浓度)值，在表达受体的细胞中显示出剂量依赖性刺激。所有化合物和对照激动剂在表达DP1、EP2和IP1受体的细胞中显示出剂量反应活性。由剂量依赖性反应确定的EC50值示于表4中。

表4

化合物	IP受体	EP受体	DP受体
				曲前列环素	1.69X10<sup>-11</sup>	2.35X10<sup>-10</sup>	2.77X10<sup>-10</sup>
前药XIV	3.33X10<sup>-9</sup>	6.70X10<sup>-8</sup>	3.88X10<sup>-8</sup>

总结

表4中的数据表明，前药XIV对曲前列环素的抗DP1、EP2和IP1的效力显著降低。尽管本发明不受其操作理论的限制，但在皮下施用曲前列环素期间观察到的局部疼痛可能是由曲前列环素对皮下组织中的IP受体、DP受体和EP受体的一种或多种的影响引起的。因为前药XIV对于每种IP受体、DP受体和EP受体的效力低于曲前列环素，所以当皮下给药时它可能引起较少的局部疼痛。

实施例7

HPLC分析方法的开发及八种前列环素前药在所选载体中的平衡溶解度和溶液稳定性的

测定

1.目标和概要

本研究的目的是开发适用于分析曲前列环素多种前药的分析方法，并确定8种前药在所选载体(20mM磷酸氢二钠和125mM氯化钠)中的平衡溶解度和溶液稳定性。

包括前药III、IV、VIII、X、XI、XII、XIII和XIV的八种曲前列环素前药用于本研究。之前为前药VII开发的分析方法在经对方法参数进行微小修改以改善特征后用于其他前药。一旦达到足够的特征，平衡溶解度研究会用于每种前药进行。在多个时间点进行溶解度研究以评定前药在所选载体中的溶液稳定性。

2实验

2.1器材

所有研究均在配备有光电二极管阵列检测器(PDA)的Waters UPLC H-Class系统上进行。所有评估的柱均为2.1x100mm，1.7x1。

2.2方法条件的开发

2.2.1前药VII方法条件的评估

之前开发的曲前列环素前药VII的分析方法是开发前药III、IV、VIII、X、XI、XII、XIII和XIV色谱特征的开发条件的起始位置。表5中提供了前药VII方法条件。

表5.方法优化的标称起始条件

特征研究的目标是实现从曲前列环素中解析每种前药的单一的色谱条件。独立制备每种前药，然后分别加入标称10％的曲前列环素以评测其特征。图11中提供了通过前药VII分析方法分析的前药和曲前列环素的色谱覆盖图。

使用前药VII方法的特征研究结果表明曲前列环素与所有前药完全分离，除了共洗脱的前药XIV。

使用前药VII方法条件筛选额外三个柱以评估前药的特征。图12中提供了曲前列环素和八种前药于Waters BEH C18柱的色谱覆盖图。图13中提供了曲前列环素和八种前药于ACE C18-AR柱的色谱覆盖图。曲前列环素和八种前药于Waters CSH苯基己基柱的色谱覆盖图如图14所示。

柱筛选的结果表明，包括前药XIV的所有前药均可通过ACE Excel 2C18-AR柱(Rs＝2.8，结果ID 2949)或Waters CSH苯基己基柱(Rs＝2.9，结果ID3028)从曲前列环素中充分分离。虽然在柱之间的分辨率基本相同，但选择CSH苯基己基柱用于平衡溶解度和溶液稳定性研究。

3.平衡溶解度和溶液稳定性

3.1实验设计

将前药各自溶于含有20mM磷酸氢二钠和125mM氯化钠的载体中。通过将15-30mg前药加入4mL透明玻璃瓶中并溶解在适当体积的载体(0.5-1.0mL)中以得到30mg/mL的标称饱和浓度来准备饱和浓度下的前药。将溶液在旋转混合器上混合23小时。除了前药XIV之外的所有溶液在混合后都呈现为固体。通过以15000RPM离心15分钟，从未溶解的前药中分离所得上清液。将合成上清液转移到透明玻璃瓶中并在室温下储存。为了评测溶解度和溶液稳定性，将15μL上清液转移至微量瓶中并加入210μL稀释剂(25:75乙腈：20mM磷酸钠pH 6.2)和100μL乙腈将上清液稀释21.7倍。针对曲前列环素测定所得样品以确定前药浓度。在每个测试间隔(0、24、72小时)，以面积％测定上清液的前药浓度和纯度。

3.2研究结果

表6总结了三个稳定性测试间隔的平衡溶解度研究结果。前药的溶液稳定性结果总结在表7和表8中。

表6.在含有20mM磷酸氢二钠和125mM氯化钠的载体中72小时内曲前列环素前药的平衡溶解度的评测

表7.含有20mM磷酸氢二钠和125mM氯化钠的载体中前药的溶液稳定性(面积％纯度)

化合物	T0小时纯度(％面积)	T24小时纯度(％面积)	T72小时纯度(％面积)
				前药III	94.48	94.31	94.61
前药IV	99.19	99.02	99.15
				前药VIII	96.41	96.40	96.34
前药X	96.59	96.32	96.54
				前药XI	99.49	99.39	98.92
前药XII	98.70	98.68	98.58
				前药XIII	97.66	97.81	97.58
前药XIV	94.20	94.25	94.56

表7.含有20mM磷酸氢二钠和125mM氯化钠的载体中前药的溶液稳定性(面积％残留曲前列环素)

3.3讨论

八种曲前列环素前药的平衡溶解度研究表明所选载体中化合物的溶解度范围很宽。前药XIII溶解性最小(约3.5mg/mL)，前药-N最可溶(约30mg/mL)。前药被证明在载体中稳定长达72小时，前药纯度和残留的曲前列环素有很小或没有变化。在所有评测的前药中，前药XIV在载体中显示出最大的曲前列环素形成，然而在72小时内该前药仅形成了0.15％。

4.总结

开发出了一种通过使用UPLC-UV评测八种曲前列环素的前药的分析办法。前药VII方法条件用作改变柱化学的较小修改(使用Waters CSH苯基己基而不是ACE Excel 2 C18)的方法优化的初始点。所述改变需要可以从曲前列环素中充分地分辨每种前药。平衡溶解度研究表明，前药的八种化合物在所选载体中具有广泛的溶解度。八种前药中的六种在载体中具有6-13mg/mL的溶解度，同时观察到一种低溶解度前药(前药-M，约3.5mg/mL)和一种高溶解度前药(前药-N，约30mg/mL)。所有前药显示在载体中稳定长达72小时，基于曲前列环素的最小形成和面积％纯度的微小变化。

实施例8

目标和概要

本研究的目标是确定九种前药(III、IV、VII、VIII、X、XI、XII、XIII和XIV)在人类、小猎犬和斯普拉-道来氏大鼠肝微粒体中以及四种前药(III、IV、VII和XIV)在食蟹猴肝微粒体中的体外代谢稳定性。另一个目标是研究母体化合物(曲前列环素)在时间过程中的释放。

在存在和不存在NADPH的情况下，将测试制品与肝微粒体一起温育。在选定的时间点取出孵育反应的等分试样，淬灭，并使用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)分析。测定前药和曲前列环素浓度，并计算前药的半衰期。

图15中为前药的半衰期。半衰期长于3倍测试时间(120分钟)的都被表示为“的360”。

材料

SigmaFAST^TM蛋白酶抑制剂混合物片剂(Sigma-Aldrich P/N：S8830)；HPLC水(Fisher)；乙腈，HPLC级，(Fisher)；甲酸，Optima LCMS等级，(Fisher P/N：A117)；二甲基亚砜(Fisher P/N D159-4)；人肝微粒体，混合性别，50份(XenoTech P/N：H0610)；Dog肝微粒体，小猎犬，雄性，8份(XenoTech P/N：D1000)；大鼠肝微粒体，斯普拉-道来氏，雄性，500份(XenoTech P/N：R1000)；猴肝微粒体，食蟹猴，雄性，12份(XenoTech P/N：P2000；批号#1110090)；矩阵管，1.4毫升(Fisher P/N 50823825)；矩阵管架(Fisher P/N 50823921)；用于基质管的Sepraseal Caps(Fisher P/N NC9995413)

器材

AB SCIEX API4000^TMLC-MS/MS系统；Agilent 1100二元HPLC泵，型号G1312A；LeapHTSPAL自动进样器配备冷堆；

苯基己基2.7μm柱，100mmx3mm(Sigma-Aldrich P/N：53345-U)；Ascentis

苯基己基2.7μm保护柱，5mm，ess(Sigma-Aldrich P/N：53526-U)；Ascentis

保护盒支架，(Sigma-Aldrich P/N：53500-U)；Aquasil C18DashHTS柱，5μm，20shHTSl(Thermo P/N：77505-022150)；Beckman Allegra25R离心机(P/N 36934)；Rainin移液器：0.2-2μL，2-20μL，10-100μL，20-200μL和100-1000μL；中继器(Eppendorf)；Rainin多通道移液器：1-20μL，20-200μL和100-1000μL

孵育

前药III、IV、VII、VIII、X、XI、XII、XIII和XIV的给药溶液在20mM磷酸氢二钾中制备。前药的浓度为5mM。

将肝微粒体(Xenotech)稀释于最终蛋白质(酶)浓度为0.5mg/mL的缓冲液中，缓冲液含有以下成分：100mM磷酸钾(pH 7.4)、5mM氯化镁(MgCl₂)和1mMβ烟酰胺腺嘌呤二核苷酸2'-磷酸(NADPH)。将微粒体溶液等分到玻璃管中并在37℃下孵育约3分钟。将化合物各自地等分试样稀释50倍至预热的微粒体溶液中并混合以起始反应。孵育溶液中前药的最终浓度为100μM。

在第一个测定中，在人类、小猎犬和斯普拉-道来氏大鼠肝微粒体中测试了所有九种前药(III、IV、VII、IX、X、XI、XII、XIII和XIV)。在第二次测定中，在食蟹猴肝微粒体中测试了四种前药(III、IV、VII和XIV)。

除测试化合物外，还包括三种质量控制化合物(7-乙氧基香豆素、普萘洛尔和维拉帕米)以确保微粒体具有活性。质量控制化合物储备溶液在25μM的25％甲醇中制备，而最终孵育溶液中的浓度为500nM。

还包括阴性对照；这些反应包含除NADPH外上面列出的所有组分。

所有测试均一式两份进行。所有重复试验于单独的反应瓶中。

用上述+NADPH条件评测0、15、30、60和120分钟的时间点，用-NADPH条件评测0和120分钟的时间点。在指定的时间点，从反应中取出每个反应100μL的等分试样，并加入到深96孔板中的200μL冰冷的乙腈中。在该步骤淬灭反应并沉淀蛋白质以准备LC/MS/MS分析。当时间进程完成时，将板密封、混合，并在4500g和4℃下离心15分钟。将200μL所得上清液在-80℃下在基质管中冷冻直至分析。

生物分析制备过程

试验样品

溶液制备。前药III、IV、VII、IX、X、XI、XII、XIII和XIV以及曲前列环素的初步储备溶液在90％DMSO中制备。将9种前药储备溶液合并后连续稀释至9合1标准标定溶液和9合1QC标定溶液。另一方面，将曲前列环素储备溶液连续稀释至曲前列环素标准标定溶液和QC标定溶液。制备后，将所有溶液储存在4℃。独立测试稀释液QC(QC-稀释)的各个化合物以确保化合物不会发生串扰。前药和曲前列环素的单独初步储备溶液用作QC-稀释的标定溶液。

空白模型。通过制备肝微粒体溶液(100mM磷酸钾缓冲液pH7.4,5mM MgCl₂,0.5mg/ml酶，1mM NADPH)制备空白模型，然后在沸水浴中热灭活5分钟。针对不同物种分别分析未知样品。用于制备空白模型的肝微粒体的种类与未知样品相同，例如，人肝微粒体用于制备仅用于分析人样品的空白模型。

空白提取物。空白提取物通过组合两体积的乙腈和一体积的空白模型制备。然后将混合物在4000g下离心并取出上清液。

标准的，QC和未稀释的未知样品。使用蛋白质沉淀过程提取样品。将5μL标准或QC(包括QC-稀释)标定溶液掺入深孔板中的95μL空白模型中，然后加入200μL乙腈。将未稀释的未知样品(在室温下解冻并充分混合)加入深孔板中，然后加入200μL乙腈。然后将标准/QC和未稀释的样品板密封、混合并在5500g和4℃下离心15分钟。将100μL上清液(不包括QC-稀释)与100μL内标工作溶液(ISWS，20ng/ml d₄-曲前列环素在水中)在最终微量滴定板上混合。

稀释QC附加步骤。在蛋白质沉淀和离心后，将10μL上清液加入到装有90μL空白提取物(10x稀释)的中间行中，用移液管混合，然后将10μL稀释的样品加入到装有90μL空白提取物(另外10倍稀释)的一排最终微量滴定板中。添加100μL ISWS。

稀释的未知样品。将10μL未知样品加入装有90μL空白提取物(10x稀释)的中间板中，用移液管混合，然后将10μL稀释的样品加入到装有90μL空白提取物(另外10x稀释)的最终微量滴定板中。添加100μL ISWS。

双份空白组。100μL空白提取物与100μL水合并。

将所有板密封、混合、在5500g和4℃下离心5分钟，并准备用于LC-MS/MS。

化合物的质量控制

未知样品。将所有质量控制的化合物样品在室温下解冻并充分混合。将60μL样品加入到装有120μL水和40μL ISWS(50ng/mL甲醇中的拉贝洛尔)的微量滴定板中。

双份空白组。60μL空白提取物(使用进行物品测试的空白提取物)与120μL水和40μL甲醇合并。为每个物种分别制作双份空白对照。

将所有板密封、混合、在5500g和4℃下离心5分钟，并准备用于LC-MS/MS。

LC-MS/MS

LC-MS/MS系统由Leap HTS PAL自动进样器、Agilent 1100系列液相色谱泵和以三重四极杆模式操作的Sciex API4000质谱仪组成。在40℃下使用

苯基己基柱(2.7μm，100mmx3mm)或Aquasil C18Dash HTS柱(5μm，20x2.1mm)，使用0.1％甲酸作为流动相A和纯乙腈作为流动相B.

质谱仪(MS)在具有多反应监测(MRM)的负或正Turbo IonSpray TM模式下操作。MS参数也显示在附录2中。

定量

测试物品

为了量化未知样品中的前药和曲前列环素，所有未知样品均以不同批次的9合1前药和曲前列环素的校准曲线运行。

自动积分算法用于积分色谱峰。仅在需要时对积分进行调整以确保在一次运行中的积分与所有标准、质量控制和样品一致。

计算峰面积比(分析物峰面积除以内标峰面积)。标准曲线通过生成峰面积比与标称浓度的最小二乘拟合图来创建。从最小二乘法拟合的结果计算样品浓度。当计算的样品浓度低于LLOQ(定量下限)时，表示为“示为下限(低于定量限)。

验收标准：对于至少75％的标准来说，反算精度应在标称浓度的±在标％范围内。所有质量控制样品中至少三分之二的准确度应在标称浓度的±范围％范围内，各自水平下的至少50％必须符合上述标准。最终曲线的相关系数必须≥必须符合。

使用1/(x²)加权、二次或线性回归。删除不符合反算精度验收标准的校准用标准。

进行测试注射以判断代表性样品的浓度，并且这用于确定稀释或未稀释的样品是否将包括在正式批次中。未稀释样品或稀释样品的计算的浓度必须在测试范围内；否则，浓度低于LLOQ(定量下限)的样品报告为BQL(低于定量限)，而浓度高于ULOQ(定量上限)的样品则用更高的稀释倍数进行重新测试。

质量控制化合物

将0时的峰面积比设定为100％，计算剩余时间点的剩余百分比。剩余百分比与时间的曲线最终用于计算每种化合物的t_1/2值。

动力学分析

速率常数(k)：k＝-β

其中β是通过拟合浓度对时间的半对数图得到的斜率。对于质量控制化合物，当浓度不可用时时，使用％剩余量。

半衰期(t_1/2):

结果

测试物

前药的半衰期在表9中列出。

质量控制化合物

质量控制化合物的半衰期在表9中列出。

表9.质量控制化合物的半衰期。

质量控制化合物具有与以往数据相当的t1/2值，表明在这些测试中使用的微粒体是活跃的。

讨论

根据之前的水溶液稳定性研究，在饱和浓度(3-30mg/mL)所有前药在含有125mMNaCl的20mM磷酸氢二钠中是稳定的。此外，在方法开发工作中，还观察到最不稳定的前药III、IV和XIV在1μM的低浓度时，在200mM磷酸钾缓冲液(pH 7.4)中是稳定的。这些表明本研究中前药的代谢不是由于化学或水溶液的不稳定性。

据观察，在某些情况下，在NADPH存在或不存在情况下半衰期相似。这表明一些不依赖NADPH的酶，例如酯酶和酰胺酶，可能主要负责前药的代谢。在其他情况下，当有NADPH的半衰期远短于没有NADPH的半衰期时，该反应可能由细胞色素P450酶介导(或部分介导)。

总结

前药的稳定性与物种有关，其中前药IV、III和XIV在所有物种中均为最不稳定的。

实施例9

曲前列环素前药在大鼠足底注射模型下的评测

1.总结

曲前列环素是一种合成的前列环素类似物，是Remodulin中的活性药物成分。曲前列环素的皮下施用与注射部位的疼痛相关，并且本研究的目的是评测曲前列环素的替代前药以评估大鼠爪痛模型中的疼痛反应。

将雄性斯普拉格-杜勒鼠(n＝112)分成14组，每组8只。该研究分两个周期进行，连续几天，每个周期7组。每个循环由盐水组、PBS组(用作对照)和曲前列环素(100环g/mL或1μg/mL)组成。此外、测试项目曲前列环素环氨基甲酸酯(前药I)、曲前列环素侧链氨基甲酸酯(前药II)、曲前列环素酰胺(前药VII)和曲前列环素甲酯(前药VIII)都在PBS中配制，以2剂量(100μg/mL或1μg/mL，每个循环一剂)进行测试。

通过在0时给动物皮下注射到爪垫(足底内注射)施用0.1mL测试物。随后在注射后15和90分钟评估动物对机械刺激(von Frey细丝)和热刺激的反应。在热测试之前进行vonFrey测试，热测试在von Frey测试后几分钟后立刻进行。另外，进行动物对注射反应的临床观察评分。图16为研究设计的图示。

1.1使用von Frey测试机械疼痛敏感度(图17和18)

用von Frey测试机械疼痛敏感度，其测试使动物抽出的力的临界值。施加的力越小表示对刺激的敏感度越高。Von Frey测试在测试物品注射后15和90分钟进行。

以1μg/mL或100μg/mL的剂量用曲前列环素处理的动物在注射后15和90分钟抽出的力的临界值降低(更高的灵敏度)。在统计学上这种敏感度的增加显著高于PBS处理组(p<0.05)。

用曲前列环素侧链氨基甲酸酯(前药II)或曲前列环素甲酯(前药VIII)这两种给药处理的动物在注射后的两个时间点与PBS处理组相比没有显示出统计学上的显著差异。

以1μg/mL的剂量用曲前列环素环氨基甲酸酯(前药I)处理的动物在注射后的两个时间点与PBS处理组相比没有显示出统计学上显著的差异。用100μg/mL曲前列环素环氨基甲酸酯(前药I)处理的动物在注射后15分钟与PBS处理组相比没有显示出统计学上的显著差异。然而，其在注射后90分钟与PBS处理组相比，观察得到统计学上显著增加的灵敏度。

以1μg/mL的剂量用曲前列环素酰胺(前药VII)处理的动物在注射后的两个时间点与PBS组相比没有显示出统计学上的显著差异。以100μg/mL的剂量用曲前列环素酰胺(前药VII)处理的动物在注射后两个时间点与PBS处理组相比具有统计学上显著的增加的敏感性。

1.2热痛敏感度的测量(图19和20)

在von Frey试验后立即评估动物对热痛刺激的敏感性。测量从热源收回注射后的右腿的时间，并且响应时间越少(越快)表示对刺激敏感性更高。在测试物注射后15和90分钟进行测试。

在施用后15分钟与PBS处理组相比，以1μg/mL或100μg/mL的剂量用曲前列环素处理的动物在统计学上显著的更短的缩爪时间(更高的灵敏度)(p<0.05)。

与PBS组相比，在两种剂量下用所有前药处理的动物对热刺激的反应没有显示出统计学上的显著差异。然而，尽管没有统计学上的意义，与PBS组相比，用两种剂量的曲前列环素酰胺前药(前药VII)在以100μg/mL的剂量或用曲前列环素甲酯前药(前药VIII)处理的动物均显示出响应时间减少的趋势。

1.3临床观察得分(图21和22)

通过评估发红，肿胀和爪子放置来评定临床观察得分。

与PBS处理组相比，用1μg/mL或100μg/mL剂量的曲前列环素治疗导致注射后15和90分钟的临床评分在统计学上显著增加(p<0.05)。

在两个时间点与PBS组相似，以1μg/mL剂量所有药物进行的处理表现出没有临床得分。用前药曲前列环素侧链氨基甲酸酯(前药II)或曲前列环素甲酯(前药VIII)以100μg/mL的剂量治疗的动物在两个时间点与PBS组没有统计学显著差异。以100μg/mL的剂量用前药曲前列环素环氨基甲酸酯(前药I)治疗的动物在注射后90分钟与PBS组相比显示出统计学上临床评分的显著增加。以100μg/mL的剂量用前药曲前列环素酰胺(前药VII)处理的动物在注射后的两个时间点与PBS组相比显示出统计学上临床评分的显著增加。

2.总结

鉴于在本研究的条件下获得的结果，仅限于生命数据的情况下，尽管在独立的前药和不同试验间存在一些差异，但与相似剂量的曲前列环素相比，施用曲前列环素的替代前药显示出疼痛反应的减少。

例如，与类似剂量的曲前列环素相比，曲前列环素侧链氨基甲酸酯(前药II)或曲前列环素甲酯(前药VIII)在两种剂量下和在两个时间点时，都通常地与统计学上动物对机械刺激的显著的敏感性降低和临床评分降低有关。

而与相似剂量的曲前列环素相比，前药曲前列环素环氨基甲酸酯(前药I)和曲前列环素酰胺(前药VII)通常与动物对机械刺激的敏感性和临床得分的降低相关，并且在注射后的两个时间点仅以1μg/mL剂量使用。

此外，与类似剂量的曲前列环素相比，所有前药在两种剂量和注射后两个时间点都显示出对热刺激的敏感性的降低。

实施例10

曲前列环素前药在大鼠足底注射模型中的评测

1.总结

曲前列环素是一种合成的前列环素类似物，是Remodulin中的活性药物成分。曲前列环素的皮下施用与注射部位的疼痛相关，并且本研究的目的是评测曲前列环素的替代前药以评估大鼠爪痛模型中的疼痛反应。

将雄性斯普拉格-杜勒鼠(n＝56)分成7组，每组8只。动物曲前列环素(100μg/mL或1μg/mL)处理，或使用两种剂量下的前药VII和前药XV处理。每组都与作为对照组的磷酸盐缓冲液(50-mM磷酸盐缓冲液和50-mM氯化钠，PH＝7.4)处理后的组进行对比(组1)。通过在0时给动物皮下注射到爪垫(足底内注射)施用0.1mL测试物。随后在注射后15和90分钟评估动物对机械刺激(von Frey细丝)和热刺激的反应。在热测试之前进行von Frey测试，热测试在von Frey测试后几分钟后立刻进行。另外，进行动物对注射反应的临床观察评分。图23为研究设计的图示。

1.1使用von Frey测试机械疼痛敏感度(图24)

用von Frey测试机械疼痛敏感度，其测试使动物抽出的力的临界值。施加的力越小表示对刺激的敏感度越高。Von Frey测试在测试物品注射后15和90分钟进行。

以1μg/mL或100μg/mL的剂量用曲前列环素处理的动物在注射后15和90分钟抽出的力的临界值降低(更高的灵敏度)。在统计学上这种敏感度的增加显著高于磷酸盐缓冲液处理组(相应的p<0.001和p<0.0001)。

以1μg/mL或100μg/mL的剂量用前药VII或前药XV处理的动物在注射后15和90分钟同样显示出抽出的力的临界值降低(更高的灵敏度)。在统计学上这种敏感度的增加显著高于磷酸盐缓冲液处理组(相应的p<0.001和p<0.0001)。与曲前列环素处理的组相比测试物处理的组没有在抽出的力的临界值的变化。

1.2热痛敏感度的测量(图25)

在von Frey试验后立即评估动物对热痛刺激的敏感性。测量从热源收回注射后的右腿的时间，并且响应时间越少(越快)表示对刺激敏感性更高。在测试物注射后15和90分钟进行测试。

在施用后15分钟与磷酸盐缓冲液处理组相比，以1μg/mL或100μg/mL的剂量用曲前列环素处理的动物在统计学上显著的更短的缩爪时间(更高的灵敏度)(p<0.0001)。与载体(磷酸盐缓冲液)组相比，在注射测试物90分钟后，仅用高剂量(100μg/mL；组2)的曲前列环素处理的动物显示出统计学上对热刺激的敏感度的显著增加；p<0.05。

在施用后15分钟，使用以100μg/mL剂量的前药VII和两种剂量(1μg/mL和100μg/mL)的前药XV处理的动物与磷酸盐缓冲液处理组相比，有统计学上显著的缩爪时间减少(更高的敏感度)(p<0.01或p<0.001或p<0.0001)。

有趣的是，施用后15分钟后，使用前药VII以1μg/mL剂量(组5)处理的动物组与基线相比有更类似的反应时间。

1.3临床观察得分(图26)

通过评估发红，肿胀和爪子放置来评定临床观察得分。

注射后15分钟，与磷酸盐缓冲液处理组相比，除了组5中用前药VII以1μg/mL处理的所有动物都在统计学上有显著的临床得分提高(p<0.0001)。在90分钟时间点，仅在两种计量下用曲前列环素处理的动物与用两种测试物在高剂量(100μg/mL)处理的动物显示出相似的影响(p<0.0001)

2.总结

鉴于在本研究的条件下获得的结果，仅限于生命数据的情况下，施用替代曲前列环素前药和相似剂量的曲前列环素相比在减轻疼痛反应时没有显著影响。然而值得被提起的是，在以1μg/mL施用测试物前药VII的治疗中，在施用后两个时间点都有对热刺激的敏感度降低和临床分数值的降低。

实施例11

曲前列环素前药在大鼠足底注射模型中的评测

研究设计图示在图16中。图27和28展示了Von Frey反应测试循环1和2对应的结果。图29和30展示了热反应测试循环1和2对应的结果。图31和32展示了循环1和2的临床分数。

实施例12

前药VII和曲前列环素：对斯普拉格-杜勒鼠皮下注射后的心血管评测

1.目标

本研究的目标是评估前药VII或曲前列环素(前列环素类似物)在对清醒的装有无线电遥测仪器的Crl：CD(SD)大鼠皮下注射后心率、血压(收缩压，舒张压和平均值)和体温的潜在急性影响。

2.方法学

载体中的曲前列环素(磷酸盐缓冲盐水[PBS]1X)或载体中的前药VII(含有125mM氯化钠的20mM磷酸盐缓冲液)根据剂量递增设计(上/下程序)通过皮下注射以单剂量施用于9组(第1组至第9组)，每组4只的雄性斯普拉格-杜勒鼠。研究设计如表10所示。

表10

a＝根据体重计算的剂量。

b＝相同的4只动物接受每次治疗，给药间隔约3天。

c＝相同的4只动物接受每次治疗，给药之间约3天。

d＝由于在第4组给药期间雄性1172号的探针失败，选择并在该剂量水平下评测来自储备群的另外一只动物。

e＝在第4组中成功评测的3只动物和在该剂量水平下评测的来自储备群的另外一只动物。

在施用曲前列环素或前药VII之前至少2小时和给药后至少24小时连续收集心率、动脉血压(收缩压、舒张压和平均动脉压)。临床观察在给药前约6小时、给药完成时和给药后约4小时进行。

3.结果

3.1临床观察

施用0.1和0.3mg/kg曲前列环素后约4小时记下一些动物四肢发红的临床观察。在施用3、10或30mg/kg前药VII后大约4小时记下身体和/或肢体冲洗、立毛、活动减退、前肢和/或后肢变红、尿殖区和腹侧躯干上的湿黄色物质以及鼻子周围干燥的红色物质的临床观察。

3.2血液动力学数据

3.2.1心率(图33)

施用曲前列环素和前药VII后观察到更高的心率。

虽然曲前列环素组的变化幅度大致相似(≥然曲前列环素组/kg)，但变化的持续时间随着剂量的增加而增加。在给药后约5小时心率变化认为被调节正常。

分别施用1和3mg/kg、10和30mg/kg前药VII后观察到相似的较高心率，其中施用10和30mg/kg时心率略高。与曲前列环素组相比，所有组在给药后的心率的变化持续更长时间，其在给药后约19至20小时观察到恢复(与给药前基线相比)。

施用曲前列环素或前药VII后心率增加被认为是对全身血压降低的补偿性增加。

3.2.2收缩压(图34)

尽管在施用0.03mg/kg曲前列环素后观察到略微降低的收缩压，施用≤前列环素后观察到略微曲前列环素后未观察到收缩压的有意义变化。早在施用0.1和0.3mg/kg曲前列环素后10分钟时间点观察到显著较低的收缩压，最低点在30和20分钟，并且分别在给药后持续90和120分钟。

施用0.1mg/kg前药VII后未观察到收缩压的有意义变化。在施用3mg/kg前药VII后观察到收缩压降低，最低点在50分钟。早在施用10和30mg/kg后20分钟时间点，记载了收缩压显著降低，最低点在40分钟，低血压持续分别持续约4和6小时。

3.2.3舒张压(图35)

舒张压的变化很大程度上反映了观察到的收缩压的变化。

尽管在施用0.03mg/kg曲前列环素后观察到略微降低的舒张压，施用≤前列环素后观察到略微曲前列环素后观察到的舒张压没有显著的改变。早在施用0.1和0.3mg/kg曲前列环素后10分钟时间点观察到显著较低的舒张压，最低点在30和20分钟，并且分别在给药后90和180分钟持续存在。

施用0.1mg/kg前药VII后未观察到舒张压的有意义变化。在施用3mg/kg前药VII后观察到略低的舒张压，最低点在50分钟并持续80分钟。早在施用10和30mg/kg后的20分钟时间点就记载到显着降低的舒张压，最低点在40分钟，低血压持续分别持续约4和7至8小时。

3.2.4平均动脉血压(图36)

观察到的平均动脉压趋势反应了观察到的收缩压和舒张压变化的持续时间和幅度。图36显示了前药VII的效力降低约100倍和初始和最大血管舒张效应延迟10-20分钟，这可能表明前药VII转化为曲前列环素可控制其血管舒张特性。此外，前药VII在约2-6小时内持续的血管加压反应(与曲前列环素1-2小时相比)表明曲前列环素的药效浓度的转化维持。

尽管在施用0.03mg/kg曲前列环素后观察到平均血压略低，最低点在30分钟，施用≤钟，施用≤观察到平均曲前列环素后观察到的平均血压没有显着变化。早在施用0.1和0.3mg/kg曲前列环素后10分钟时间点，观察到了显著降低的平均血压，最低点在30和20分钟，并且分别在给药后90和180分钟持续存在。

施用0.1mg/kg前药VII后，未观察到平均血压的有意义变化。在施用3mg/kg前药VII后观察到平均血压略微降低，最低点在50分钟。施用10和30mg/kg后记载了显著降低的平均血压，最低点在40分钟，低血压持续分别持续约4和7至8小时。

3.2.5脉压(图37)

脉压的变化是可变的，缺乏一致的反应方向和幅度，并且进一步缺乏剂量反应关系。

在施用0.3mg/kg曲前列环素后，在给药后20至40分钟观察到略微降低的脉压。在研究的任何其他剂量水平下施用曲前列环素后没有观察到其他一致的趋势。

在施用10mg/kg前药VII后，注意到有略微升高的脉压。在任何其他剂量的前药VII之后没有观察到其他一致的趋势。

脉压是收缩压和舒张压的函数。由于收缩压和舒张压的变化幅度和方向相似，因此整体净变化(收缩压和舒张压之间的差异)大体上不变。

3.2.6体温(图38)

施用0.000125mg/kg或0.00125mg/kg曲前列环素后未观察到体温的显着变化。在0.1mg/kg曲前列环素后观察到体温略微下降。这种变化在给药后约3小时持续存在。施用0.1和0.3mg/kg曲前列环素后，观察到体温显著降低。这些变化分别在给药后约3小时和4小时认为是被调节正常的。

施用1mg/kg前药VII后未观察到体温的显着变化。在施用3、10和30mg/kg后观察到体温显著降低。施用3和10mg/kg后，低温反应分别持续4小时和11至12小时。施用30mg/kg前药VII后24小时内体温未恢复。

体温的变化继发于血压的变化。体温下降与血管舒张直接相关。

4.总结

给予曲前列环素会导致更高的心率(所有剂量)、并显着降低收缩压、舒张压、平均动脉血压(≥予曲前列环素会导)和体温(≥和体温(≥素会导致更)。施用前药VII导致更高的心率(所有剂量)、并且显着降低收缩压、舒张压、平均动脉压和体温(≥致更高的心率)。

实施例13

二甲酯曲前列环素(前药IX)的合成

讨论

二甲酯曲前列环素(1)的合成通过在室温下使用NaH和在THF中的甲基碘进行O-甲基化来实现。与为获得前药IX而研究的其他反应条件相比，该方法涉及到短的反应时间和简单的后处理。

实验步骤

向50毫升圆底烧瓶中加入氢化钠(0.61g，15.36mmol，60％，在矿物油中)，用己烷(2，在矿mL)洗涤，除去矿物油。向该固体NaH中加入无水THF(10mL)并在室温和氩气下搅拌。向该悬浮液中滴加曲前列环素(1)(0.5g，1.26mmol)的THF(5.0mL)溶液，然后滴加碘甲烷(3.0mL)。将反应液搅拌5小时，并通过TLC(DCM/甲醇，9：1)监测反应进程。用饱和NH₄Cl溶液(1.0mL)溶液淬灭反应，用水(10.0mL)稀释。用2N HCl将pH调节至1-2。分离有机层，水层用EtOAc(3tOAcL)萃取。合并萃取物，用Na₂SO₄干燥。真空除去溶剂，得到粗产物。使用梯度溶剂(0-10％甲醇的DCM溶液)，通过硅胶色谱法纯化粗产物，得到产物二甲酯曲前列环素(前药IX)(230mg)。

实施例14

单甲基氨基甲酸酯曲前列环素(前药VIII)的合成

单甲基氨基甲酸酯曲前列环素(前药VIII)(5)由单-TES曲前列环素苄酯(1)合成。用对硝基苯基氯甲酸酯处理单-TES曲前列环素苄酯(1)以产生对硝基苯基(2)的碳酸酯。将未经分离的碳酸酯(2)用甲胺的四氢呋喃溶液处理，得到TES曲前列环素苄基单甲基氨基甲酸酯(3)，收率良好。用盐酸在四氢呋喃水溶液中将化合物(3)去甲硅烷基化，得到曲前列环素苄基酯单甲基氨基甲酸酯(4)。在氢气下用钯碳对纯氨基甲酸酯(4)进行脱苄基化，得到单甲基氨基甲酸酯曲前列环素(前药VIII)(5)。

单甲基氨基甲酸酯曲前列环素(前药VIII)(5)的合成

实验：

TES-曲前列环素苄基酯单甲基氨基甲酸酯的合成(3)

在室温和氩气下，向单-TES-曲前列环素苄酯(1)(1.11g，1.87mmol)的无水四氢呋喃(12mL)溶液中加入吡啶(0.44g，0.45mL，5.56mmol)。在氩气下将澄清溶液冷却至0℃(冰/水浴)，然后在5分钟内滴加氯甲酸4-硝基苯酯(0.56g，2.78mmol)的无水四氢呋喃(4mL)溶液，保持温度低于5℃。加完后，将反应液(白色混浊)在0℃至室温下搅拌2小时。2小时后，反应液通过TLC(EtOAc/己烷，1：4)检测，反应完成。将反应液冷却至0℃，然后在3分钟内加入甲胺的四氢呋喃(2.0M)溶液(3.8mL，7.60mmol)。将反应液在0℃搅拌1小时并用TLC(EtOAc/己烷，1：4)检测。反应完成。过滤混合物，用MTBE(2×20mL)洗涤黄色固体。将滤液真空浓缩，得到浅黄色粘稠液体(1.70g)。使用5-15％EtOAc/己烷在硅胶(31g)柱上对粗产物进行色谱分离，得到纯的TES-曲前列环素苄基酯单甲基氨基甲酸酯(3)(1.17g)。

曲前列环素苄基酯单价及氨基甲酸酯(4)的合成

在室温和氩气下，向TES-曲前列环素苄基酯单甲基氨基甲酸酯(3)(1.10g，1.69mmol)在四氢呋喃(20mL)和水(4mL)的混合物中的溶液中加入盐酸溶液(2N)(0.85mL，1.70mmol)。将反应液在室温下搅拌2小时并用TLC(EtOAc/己烷，1：1)检测。反应完成。将反应液用三乙胺(0.25mL)中和，然后蒸发掉所有有机挥发物，将残余物溶于EtOAc(25mL)中，用水(2中，用水()，盐水(1水(用水()洗涤，干燥(Na₂SO₄)，过滤并真空浓缩，得到澄清的粘稠液体(1.07g)。将粗产物用5-70％EtOAc/己烷在硅胶(30g)柱上色谱分离，得到纯的曲前列环素苄基酯单甲基氨基甲酸酯(4)，为无色粘性液体(0.90g)。

曲前列环素单甲基氨基甲酸酯(5)的合成

向曲前列环素苄基酯单甲基氨基甲酸酯(4)(0.84g，1.56mmol)的乙酸乙酯(13mL)溶液中加入钯碳(5wt％，50％水)(0.15g)。将混合物搅拌并抽空，并用氢气置换(填充在气球中)。该过程重复三次。将混合物在室温氢气氛围下搅拌16小时并用TLC(EtOAc/己烷，1：1)检测。反应完成。将反应液通过一次性聚乙烯过滤漏斗中的硅藻土垫(1.0g)过滤，并用乙酸乙酯(3乙酸乙酯()洗涤固体。将滤液在30℃(水浴温度)下真空浓缩，得到曲前列环素单甲基氨基甲酸酯(前药VIII)(5)，为灰白色泡沫状固体(0.71g)。

实施例15

曲前列环素氨基酸酰胺前药的合成

讨论

使用偶联剂将曲前列环素经过多种氨基酸酰胺化而形成曲前列环素酰胺的前药，如以下方案所示。

曲前列环素丙氨酸酰胺(前药X)的合成

步骤1：

向曲前列环素(1)(1.0g，2.561mmol)和对甲苯磺酸L-丙氨酸酯(0.9g，2.561mmol)的二氯甲烷(30mL)悬浮液中加入三乙胺(0.89mL，6.401mmol)。向该混合物中加入1-乙基-3-(3'-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)(0.59g，3.073mmol)和1-羟基苯并三唑水合物(0.42g，3.073mmol)。将反应液在室温和氩气下搅拌2.5小时。基于TLC(洗脱液：乙酸乙酯)检测，反应完成。将反应液用水(30mL)淬灭，分离有机层，经硫酸钠干燥并真空浓缩得到粗产物。使用0-70％乙酸乙酯的己烷硅胶柱色谱法纯化粗产物，得到纯的曲前列环素丙氨酸酰胺苄基酯(2)(1.34g，97.8％产率)。

步骤2：

向曲前列环素丙氨酸酰胺苄基酯(2)(1.3g)的乙酸乙酯溶液中加入5％钯碳(50％w/w水)(130mg)。将其抽真空三次并用氢气置换，在氢气下搅拌1.5小时。基于TLC(洗脱液：乙酸乙酯)检测，反应完成。将反应液通过硅藻土过滤以除去钯碳。将滤液真空浓缩，得到曲前列环素丙氨酸酰胺前药(前药X)(1.03g，91.7％收率)。

曲前列环素缬氨酸酰胺(前药XI)的合成

步骤1：

向曲前列环素(1)(1.0g，2.561mmol)和L-缬氨酸苄基酯对甲苯磺酸盐(0.97g，2.561mmol)的二氯甲烷(30mL)悬浮液中加入三乙胺(0.89mL，6.401mmol)。向该混合物中加入1-乙基-3-(3'-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)(0.59g，3.073mmol)和1-羟基苯并三唑水合物(0.42g，3.073mmol)。将反应液在室温和氩气下搅拌2小时。基于TLC(洗脱液：乙酸乙酯)检测，反应完成。将反应液用水(30mL)淬灭并搅拌15分钟。分离有机层，用硫酸钠干燥并真空浓缩，得到粗产物。使用己烷中的0-50％乙酸乙酯通过硅胶柱色谱法纯化粗产物，得到纯的曲前列环素缬氨酸酰胺苄基酯(2)(1.3g，90.3％产率)。

步骤2：

向曲前列环素缬氨酸酰胺苄酯(2)(1.3g)的乙酸乙酯(15mL)溶液中加入5％钯碳(50％w/w水)(130mg)。将其抽真空三次并用氢气置换，然后在氢气下搅拌2小时。基于TLC(洗脱液：乙酸乙酯)检测，反应完成。将反应液通过硅藻土过滤以除去钯碳。将滤液真空浓缩，得到曲前列环素缬氨酸酰胺前药(前药XI)(1.1g，计算残留溶剂产率97.1％)。

曲前列环素天冬氨酸酰胺(前药XII)的合成

步骤1

向曲前列环素(1)(1.0g，2.561mmol)和L-天冬氨酸二苄基酯对甲苯磺酸盐(1.24g，2.561mmol)的二氯甲烷(30mL)悬浮液中加入三乙胺(0.89mL，6.401mmol)。向该混合物中加入1-乙基-3-(3'-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)(0.59g，3.073mmol)和1-羟基苯并三唑水合物(0.42g，3.073mmol)。将反应液在室温和氩气下搅拌2小时。基于TLC(洗脱液：乙酸乙酯)检测，反应完成。将反应液用水(30mL)淬灭并搅拌15分钟。分离有机层，用硫酸钠干燥并真空浓缩后得到粗产物。使用0-50％乙酸乙酯和己烷作为流动相的硅胶柱色谱法纯化粗产物，获得纯的曲前列环素天冬氨酸酰胺苄酯(2)(1.63g，97.6％产率)。

步骤2：

向曲前列环素天冬氨酸酰胺苄酯(2)(0.57g)的乙酸乙酯(20mL)溶液中加入5％钯碳(50％w/w水)(57mg)。将其抽真空三次并用氢气置换，然后在氢气下搅拌5小时。基于TLC(洗脱液：乙酸乙酯)检测，反应完成。将反应液通过硅藻土过滤以除去钯碳。将滤液真空浓缩，得到曲前列环素天冬氨酸酰胺前药(前药XII)(0.4g，90.9％产率)。

曲前列环素丝氨酸酰胺(前药XIII)的合成：

步骤1：

向曲前列环素(1)(1.0g，2.561mmol)和L-丝氨酸苄基酯苯磺酸盐(0.9g，2.561mmol)的二氯甲烷(30mL)悬浮液中加入三乙胺(0.89mL，6.401mmol)。向该混合物中加入1-乙基-3-(3'-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)(0.59g，3.073mmol)和1-羟基苯并三唑水合物(0.42g，3.073mmol)。将反应液在室温和氩气下搅拌2小时。基于TLC(洗脱液：乙酸乙酯)检测，反应完成。将反应液用水(30mL)淬灭并搅拌15分钟。分离有机层，用硫酸钠干燥并真空浓缩后得到粗产物。使用0-100％乙酸乙酯和己烷作为流动相的硅胶柱色谱法纯化粗产物，得到纯的曲前列环素丝氨酸酰胺苄基酯(2)(0.62g，49.3％产率)。

步骤2：

向曲前列环素丝氨酸酰胺苄酯(2)(0.57g)的乙酸乙酯(120mL)溶液中加入5％钯碳(50％w/w水)(57mg)。将其抽真空三次并用氢气置换，然后在氢气下搅拌2小时。基于TLC(洗脱液：乙酸乙酯)检测，反应完成。反应后化合物从溶液中析出。加入异丙醇(30mL)使产物溶解后与钯碳分离。然后将反应液通过硅藻土过滤以除去钯碳。将滤液真空浓缩，得到曲前列环素丝氨酸酰胺前药(前药XIII)(0.54g，100％产率)。

实施例16

曲前列环素甲磺酰胺(前药XIV)的合成

曲前列环素甲磺酰胺(前药XIV)(7)由苯并茚三醇(1)合成。曲前列环素苄酯(2)由三醇(1)制备。将酯(2)用叔丁基二甲基三氟甲磺酰胺(TBDMSOTf)甲硅烷基化，得到二-TBDMS曲前列环素苄酯(3)。化合物(3)在含有5％钯碳的乙酸乙酯中在氢气下脱苄基化，得到二-TBDMS曲前列环素(4)。用CDI活化酸(4)，然后在DBU存在下与甲磺酰胺反应后得到二-TBDMS曲前列环素甲磺酰胺(6)，并用硅胶柱纯化。使用甲醇中的氯化氢使TBDMS从磺酰胺(6)中脱保护，得到所需的曲前列环素甲磺酰胺(前药XIV)(7)。

曲前列环素甲磺酰胺(前药XIV)的合成

实验

曲前列环素苄基酯(2)的合成

在室温和氩气下，向苯并茚三醇(1)(240.0g，0.72mol)的丙酮(3.0L)溶液中加入粉末状碳酸钾(199.5g，1.44mol)和溴代苯基乙酸酯(190.2g，0.83mol)。将反应液在室温下搅拌并通过TLC监控反应进程。72小时后反应完成。过滤反应液，真空浓缩滤液，得到曲前列环素苄基酯(2)(346.0g，99％)，为灰白色固体。

二-TBDMS曲前列环素苄酯(3)的合成

在室温下向曲前列环素苄酯(2)(15.26g，31.75mmol)的无水二氯甲烷(150mL)溶液中加入2,6-二甲基吡啶(13.61g，14.75mL，127.01mmol)。将该澄清溶液冷却至0℃(冰/水浴)，然后在氩气下保持温度低于5℃，在20分钟内滴加三氟甲磺酸叔丁基二甲基酯(TBDMSOTf)(20.98g，18.23mL，79.37mmol)的无水二氯甲烷(30mL)溶液。加完后，将反应液在0-5℃下搅拌2小时。2小时后，反应液用TCL(EtOAc/己烷，1：4)检测，反应完成。将混合物用己烷(360mL，使用的二氯甲烷的两倍体积)处理，并在室温下搅拌10分钟。将混合物通过硅胶(230-400目)(293g)柱，用乙酸乙酯的己烷溶液(2-6％)洗脱，得到纯的二-TBDMS曲前列环素苄酯(3)(21.7g，96.4％)。

二-TBDMS曲前列环素(4)的合成

向二-TBDMS曲前列环素苄酯(3)(21.6g，30.46mmol)的乙酸乙酯(320mL)溶液中加入钯碳(5wt％，50％水)(2.16g)。将混合物搅拌并抽空，并用氢气置换(填充在气球中)。该过程重复三次。将混合物在室温下在氢气下搅拌2小时并用TLC(EtOAc/己烷，1：4和EtOAc，100％)检测。反应完成。将反应液用硅藻土(7.0g)处理，并在一次性聚乙烯过滤漏斗中通过硅胶垫(22g)过滤，并用乙酸乙酯(3过滤，并用)洗涤固体。滤液含有一些碳颗粒，因此将滤液再次通过硅藻土垫(10.0g)过滤，得到澄清的滤液。将澄清滤液通过硅胶(30g)柱并用乙酸乙酯(2柱并用乙酸)洗涤硅胶。滤液澄清并将滤液在30℃(水浴温度)下真空浓缩，得到二-TBDMS曲前列环素(4)，为无色粘性液体(18.6g，98.7％)。

二-TBDMS曲前列环素甲磺酰胺(6)的合成

在室温氩气下，向二-TBDMS曲前列环素(4)(18.5g，29.88mmol)的无水四氢呋喃(190mL)溶液中一次性加入1,1'-羰基二咪唑(CDI)(7.27g，44.83mmol)。将澄清的反应液在室温下搅拌30分钟，然后在75℃(油浴温度)下搅拌30分钟。将反应液冷却至室温。向该原位产生的二-TBDMS曲前列环素(5)的CDI中间体一次性加入甲磺酰胺(8.53g，89.68mmol)并在室温下搅拌10分钟直至得到澄清溶液。在氩气下向该澄清溶液中加入1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)(22.74g，149.37mmol)的无水四氢呋喃(40mL)溶液。加完后，将反应液在室温下搅拌并用TLC(EtOAc，100％和MeOH/CH2Cl2,1：9)检测。2小时后，反应完成。将混合物用水(200mL)淬灭，然后用EtOAc(1×200mL)，(2×100mL)萃取。将合并的EtOAc萃取液用水(3×100mL)，盐水(1×30mL)洗涤，干燥(Na₂SO₄)，过滤并真空浓缩，得到灰白色泡沫状固体(21.44g)。将粗产物在硅胶(230-400目)(296g)上使用CH₂Cl₂和1-30％MeOH/CH₂Cl₂进行色谱分离，得到二-TBDMS曲前列环素甲磺酰胺(6)，为白色泡沫状固体(15.4g，74.0％)。

曲前列环素甲磺酰胺(7)的合成

将二-TBDMS曲前列环素甲磺酰胺(6)(13.4g，19.25mmol)的无水甲醇(135mL)溶液冷却至0-5℃(冰/水浴)。在氩气下3分钟内向该冷溶液中加入氯化氢甲醇(1.25M)(38.5mL，48.13mmol)的无水甲醇(135mL)溶液。将反应液在0至5℃(冰/水浴)下搅拌30分钟并用TLC(MeOH/CH₂Cl₂，1：9)检测。在0至5℃下用氩气缓慢鼓泡反应液5分钟以除去过量的氯化氢以得到磺酰胺产物(7)。然后，将反应液在25℃(水浴温度)下真空浓缩除去有机挥发物，得到磺酰胺粗产物(7)，为浅黄色泡沫状固体(11.03g)。将该化合物与其他粗产物(0.80g)合并，得到总重11.83g。将合并的粗产物用25-100％EtOAc/己烷和1-20％MeOH/EtOAc在硅胶(175g)柱上色谱分离，得到纯的曲前列环素甲磺酰胺(7)，为灰白色泡沫状固体(6.28g)。

实施例17

原料的合成：多种前药所需的曲前列环素单-TES苄酯(2a)：

向曲前列环素苄酯(1)(100g，20.80mmol)的丙酮(200mL)溶液中加入咪唑(1.41g，20.80mmol)和4-二甲基氨基吡啶(0.25g，2.08mmol)。在氩气下使用注射器向该混合物中边搅拌边加入三乙基氯硅烷(3.5mL，20.80mmol)。1小时后，用TLC(洗脱液：20％乙酸乙酯/己烷)检测，反应完成。用水(150mL)淬灭反应，分离有机层，用盐水(100mL)洗涤，经硫酸钠干燥并真空浓缩后得到粗产物。使用乙酸乙酯：己烷(0-11％)作为流动相通过柱色谱法纯化粗物质，得到单保护的化合物2a(6.68g)，产率54.04％，和化合物2b(0.48g)，产率3.88％。

实施例18

单次施用前药I、II、III和XV后雄性斯普拉格-杜勒鼠中的平均代谢物-亲本比率示于表11中。

表11

NC＝没有计算

a＝动物被给药100mg/kg。

b＝动物被给药200mg/kg。

附加实施例

1.一种具有下式的化合物：

其中：

X为OH或

其中R₁为H或C₁-C₄的烷基；并且

R₂和R₃都各自独立地选自H、C₁-C₄的烷基或

其中Y为OR₄或NR₄R₅，其中R₄和R₅都各自独立地选自H和C₁-C₄的烷基；条件为X为OH，R₂和R₃都不为H；或一种所述化合物药学上可接受的盐。

2.实施例1中的化合物，其中X为OH。

3.权利要求2的实施例，其中R₂和R₃都各自独立地选自C₁-C₄的烷基。

4.实施例2中的化合物，其中R₂和R₃各自都为甲基。

5.实施例2中的化合物，其中R₂和R₃都各自独立地选自H和

6.实施例5中的化合物，其中R₂和R₃中的一个为

而R₂和R₃中的另一个为H。

7.实施例6中的化合物，其中Y为OR₄。

8.实施例7中的化合物，其中R₄为甲基或H。

9.实施例6中的化合物，其中Y为NR₄R₅。

10.实施例9中的化合物，其中R₄和R₅各自独立地选自H或甲基。

11.实施例9中的化合物，其中R₄和R₅都为H或甲基。

12.一种药物组合物，期包含(A)如实施例1-11中的任意一种化合物和(B)一种药学上可接受的载体。

13.实施例12中的药物组合物，其为口服药物组合物。

14.实施例12中的药物组合物，其为皮下施用药物组合物。

15.一种治疗肺动脉高压症的方法，其包括向有此需要的受试者施用有效量的实施例1-11中的任意一种化合物。

16.实施例15中的方法，其中施用方式为口服。

17.实施例15中的方法，其中受试者为人类。

18.实施例15中的方法，其中施用方式为注射。

19.实施例18中的方法，其中施用方式为皮下施用。

20.实施例19中的方法，其中所述施用为连续皮下施用。

21.实施例18中的方法，其中与施用曲前列环素相比，所述施用导致在注射点为无痛或减少疼痛的。

22.一种治疗肺动脉高压症的方法，其包括向患有肺动脉高压症的患者皮下施用有效量的曲前列环素的前药。

23.一种治疗肺动脉高压症的方法，其包括选择皮下施用曲前列环素或其药学上可接受的盐后有过局部疼痛经历的患者并向患有肺动脉高压症的患者皮下施用有效量的曲前列环素的前药。

***

尽管前面提到了特别优选的实施例，但应该理解的是本发明不限于此。本领域普通技术人员可以想到，可以对所公开的实施例进行多种修改，并且这些修改落入本发明的范围内。

本说明书中引用的所有出版物、专利申请和专利均通过引用整体并入本文。

Claims (51)

1.一种治疗患者疾病或病症的方法，其包括给患者施用有效量的曲前列环素的前药。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述疾病或病症是肺动脉高压症。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述疾病或病症选自肺动脉高压症，充血性心力衰竭、外周血管疾病、雷诺现象、硬皮病、肾功能不全、周围神经病变、指溃疡、间歇性跛行、缺血性肢体疾病，外周缺血性病变，肺纤维化和哮喘的一种或多种。

4.一种治疗肺动脉高压症的方法，其包括皮下给予患有肺动脉高压症的患者有效量的曲前列环素的前药。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述给药是连续皮下给药。

6.如权利要求1所述的方法，其中与施用曲前列环素相比，所述施用导致注射位点为无痛或较少疼痛。

7.如权利要求1所述的方法，其中所述前药为具有下式的化合物：

其中X是OR₉或NR₁R₆；其中R₉为H或C₁-C₄的烷基，其可以任选地被末端羟基或羧基取代；其中R₁为H或C₁-C₄的烷基且R₆为

或其中R₁和R₆使NR₁R₆成为氨基酸的氨基；R₇为H或C₁-C₄的烷基，其可被末端羟基或羧基取代；R₈为H或C₁-C₄的烷基；R₂和R₃各自独立地选自H、C₁-C₄的烷基、

磷酸基和其中OR₂或OR₃形成氨基酸的酯的基团；Y是OR₄或NR₄R₅，R₄和R₅各自独立地选自H和C₁-C₄的烷基；条件为R₉、R₂和R₃都不为H；或

一种所述化合物药学上可接受的盐。

8.如权利要求1所述的方法，其中所述前药为具有下式的化合物：

其中X为OH或NR₁R₆，其中R₁为H或C₁-C₄的烷基且R₆为

或其中R₁和R₆使NR₁R₆成为氨基酸的氨基；R₇为H或C₁-C₄的烷基，其可被末端羟基或羧基取代；R₈为H或C₁-C₄的烷基；R₂和R₃各自独立地选自H、C₁-C₄的烷基、或其中Y是OR₄或NR₄R₅，其中R₄和R₅各自独立地选自H和C₁-C₄的烷基；条件为当X为OH时，R₂和R₃都不为H；或

一种所述化合物药学上可接受的盐。

9.如权利要求8所述的方法，其中：

X为OH或

10.如权利要求7所述的方法，其中X为OH。

11.如权利要求10所述的方法，其中R₂和R₃各自独立地选自C_1-4烷基。

12.如权利要求10所述的方法，其中R₂和R₃各自为甲基。

13.如权利要求10所述的方法，其中R₂和R₃各自独立地选自H，和

14.如权利要求13所述的方法，其中R₂和R₃其中之一为

而R₂和R₃中的另一个为H。

15.如权利要求14所述的方法，其中Y为OR₄。

16.如权利要求15所述的方法，其中R₄为甲基或H。

17.如权利要求14所述的方法，其中Y为NR₄R₅。

18.如权利要求17所述的方法，其中R₄和R₅各自独立地选自H或甲基。

19.如权利要求17所述的方法，其中R₄和R₅都为H或甲基。

20.如权利要求18所述的方法，其中R₄和R₅其中之一为甲基而另一个为H。

21.如权利要求10所述的方法，其中R₂和R₃中至少一个为磷酸基。

22.如权利要求21所述的方法，其中R₂和R₃都为磷酸基。

23.如权利要求21所述的方法，其中R₂和R₃其中之一为磷酸基，另一个为H。

24.如权利要求10所述的方法，其中R₂和R₃中的至少一个为其中OR₂或OR₃形成了氨基酸的酯的基团。

25.如权利要求24所述的方法，其中R₂和R₃其中之一为H，而另一个为其中OR₂或OR₃形成了氨基酸的酯的基团。

26.如权利要求7所述的方法，其中X为NR₁R₆且R₂和R₃各自为H。

27.如权利要求26所述的方法，其中R₁为H。

28.如权利要求27所述的方法，其中R₆为

29.如权利要求28所述的方法，其中R₇为H。

30.如权利要求28所述的方法，其中R₇为C₁-C₄烷基，其可任选地被末端羟基或羧基取代。

31.如权利要求27所述的方法，其中R₆为

32.如权利要求31所述的方法，其中R₈为H或甲基。

33.如权利要求26所述的方法，其中NR₁R₆为氨基酸的氨基。

34.如权利要求7所述的方法，其中X为OR₉，R₉为C₁-C₄烷基，其可任选地被末端羟基或羧基取代，R₂和R₃各自为H。

35.如权利要求34所述的方法，其中R₉为被末端羟基取代的C₁-C₄。

36.如权利要求1所述的方法，其中所述前药具有下式中之一：

37.一种化合物或其药学上可接受的盐，其中化合物具有下式中之一：

38.一种药物组合物，其包含(A)如权利要求36所述的化合物和(B)一种药学上可接受的载体。

39.如权利要求38所述的药物组合物，其为口服药物组合物。

40.如权利要求38所述的药物组合物，其为皮下施用药物组合物。

41.一种治疗肺动脉高压症的方法，其包括向有此需要的受试者施用有效量的如权利要求37所述的化合物。

42.如权利要求41所述的方法，其中所述施用为口服。

43.如权利要求41所述的方法，其中所述受试者为人类。

44.如权利要求41所述的方法，其中所述施用为注射。

45.如权利要求44所述的方法，其中所述施用为皮下施用。

46.如权利要求45所述的方法，其中所述施用为连续皮下施用。

47.如权利要求45所述的方法，其中与施用曲前列环素相比，所述施用导致在注射位点为无痛或较少疼痛。

48.如权利要求1中所述的方法，其中所述患者为人，其中所述前药的半衰期为小于120分钟。

49.如权利要求48所述的方法，其中所述前药的半衰期为小于60分钟。

50.如权利要求49所述的方法，其中所述前药在血浆中的半衰期小于30分钟。

51.如权利要求50所述的方法，其中所述前药在血浆中的半衰期小于15分钟。

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